JP2012516156A - ポリヌクレオチドアプタマー系架橋物質体およびその使用 - Google Patents
ポリヌクレオチドアプタマー系架橋物質体およびその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2012516156A JP2012516156A JP2011548253A JP2011548253A JP2012516156A JP 2012516156 A JP2012516156 A JP 2012516156A JP 2011548253 A JP2011548253 A JP 2011548253A JP 2011548253 A JP2011548253 A JP 2011548253A JP 2012516156 A JP2012516156 A JP 2012516156A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- conjugate
- substance
- insulin
- glucose
- aptamer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 0 CC(C)(CC(*)(C(C)(C)**)C(*)=O)N(*)CI=C Chemical compound CC(C)(CC(*)(C(C)(C)**)C(*)=O)N(*)CI=C 0.000 description 4
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
- A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
- C12N2310/51—Physical structure in polymeric form, e.g. multimers, concatemers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一態様において、本開示により、標的分子に結合する多価ポリヌクレオチドアプタマー;およびコンジュゲート枠組構造に結合された2つ以上の個別の親和性リガンドを含むコンジュゲートを含む架橋物質体であって、該2つ以上の親和性リガンドは、該アプタマーとの結合に関して該標的分子と競合し、異なるコンジュゲート上の親和性リガンドと該アプタマー間の非共有結合性相互作用の結果、該物質体内で該コンジュゲートが架橋される、架橋物質体を提供する。このような物質体は、所望の濃度の標的分子に応答した量のコンジュゲートを放出するように設計される。また、最終適用用途に応じて、種々の実施形態において、該コンジュゲートは、薬物および/または検出可能な標識を含むものであってもよい。薬物、検出可能な標識および親和性リガンドは、コンジュゲート枠組構造に、共有結合されていても、非共有結合で結合されていてもよい。
Description
政府実施許諾権
米国政府は、本発明において支払い済みの実施許諾を有し、米国国立衛生研究所によって与えられたDK072774およびDK077292の条件によって示される合理的な条件で他者に実施許諾を行なうことを特許権所有者に要求する権利を限定された状況において有する。
米国政府は、本発明において支払い済みの実施許諾を有し、米国国立衛生研究所によって与えられたDK072774およびDK077292の条件によって示される合理的な条件で他者に実施許諾を行なうことを特許権所有者に要求する権利を限定された状況において有する。
関連出願
本出願は、2009年1月28日に出願された米国特許仮出願第61/147,878号、2009年3月12日に出願された米国特許仮出願第61/159,643号、2009年3月20日に出願された米国特許仮出願第61/162,107号、2009年3月20日に出願された米国特許仮出願第61/162,053号、2009年3月20日に出願された米国特許仮出願第61/162,092号、2009年3月20日に出願された米国特許仮出願第61/162,105号、2009年3月25日に出願された米国特許仮出願第61/163,084号、2009年6月24日に出願された米国特許仮出願第61/219,897号、2009年7月7日に出願された米国特許仮出願第61/223,572号、および2009年10月19日に出願された米国特許仮出願第61/252,857号に対する優先権を主張するものであり、これらの内容は各々、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2009年1月28日に出願された米国特許仮出願第61/147,878号、2009年3月12日に出願された米国特許仮出願第61/159,643号、2009年3月20日に出願された米国特許仮出願第61/162,107号、2009年3月20日に出願された米国特許仮出願第61/162,053号、2009年3月20日に出願された米国特許仮出願第61/162,092号、2009年3月20日に出願された米国特許仮出願第61/162,105号、2009年3月25日に出願された米国特許仮出願第61/163,084号、2009年6月24日に出願された米国特許仮出願第61/219,897号、2009年7月7日に出願された米国特許仮出願第61/223,572号、および2009年10月19日に出願された米国特許仮出願第61/252,857号に対する優先権を主張するものであり、これらの内容は各々、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
先行技術(例えば、Searsに対する米国特許第4,145,410号、これには、酵素的に不安定なカプセル剤からの薬物放出が記載されている)において知られた「制御放出」薬物送達系の大部分は、薬物を、ヒト体内に存在する分子インジケータ(例えば、代謝産物)の量に正比例する間隔および濃度で放出することができない。したがって、このような先行技術の系での薬物の送達または放出は、文字通りの「制御された」ものでなく、外的または内的要因とは無関係の単なる低速放出である。
インスリン注射による真性糖尿病の処置は、インスリンの制御されていない低速放出が望ましくない周知かつ充分研究された一例である。実際、ホルモンの単純な補充は、この疾患と関連する病的続発症の予防に充分でないことが明らかである。このような続発症の発生は、患者体内での血中グルコースの濃度変動に合わせた外因性インスリンを提供ができていないことを反映していると考えられる。この問題を解決するため、より生理学的なインスリン送達系を開発するためのいくつかの生物学的なバイオエンジニアリングアプローチが提案されている(例えば、Brownleeらに対する米国特許第4,348,387号;Taylorらに対する米国特許第5,830,506号、同第5,902,603号、および同第6,410,053号、ならびにZionに対する米国特許出願公開公報第2004−0202719号らを参照のこと)。
Zionの系の一部の特定の実施形態では、多価のグルコース結合分子を、グリコシル化ポリマー−インスリンコンジュゲートと合わせる。このグリコシル化ポリマーは多数の糖結合基を含み、グルコース結合分子の存在下で不溶性のヒドロゲルまたは粒子を形成する。このゲルは、グルコース濃度の増大に応答してグリコシル化ポリマー−インスリンコンジュゲートを放出する。Zionの系では、例示的な多価グルコース結合分子としてレクチンコンカナバリンA(Con A)の使用が示されている。残念ながら、Con Aおよびその他の容易に入手可能なレクチンの多くは、リンパ球の増殖を刺激する可能性を有する。特定の型のリンパ球の表面上の炭水化物受容体に結合することにより、このようないわゆる「マイトジェン」レクチンは、リンパ球の有糸分裂を誘導し、それによりリンパ球の増殖を引き起こし得る可能性がある。Con Aを含むほとんどのマイトジェンレクチンは、選択的T細胞マイトジェンである。いくつかのレクチンは選択性が低く、T細胞とB細胞の両方を刺激する。マイトジェンレクチンに対する局所的または全身性のインビボ曝露により、炎症、細胞傷害、マクロファージ消化、およびアレルギー反応(例えば、アナフィラキシー)がもたらされ得る。また、植物レクチンは、特に免疫原性であり、高力価の抗レクチン特異的抗体の生成をもたらすことがわかっている。したがって、マイトジェンレクチンは、その放出が抑制されるように充分配慮しなければ、天然形態ではインビボでの方法およびデバイスに使用できないことは認識されよう。例えば、米国特許第5,830,506号において、Taylorは、Con Aの使用に関わる毒性リスクを明らかにし、グルコースとインスリン分子がデバイス内外で自由に拡散することも同時に求められる薬物送達デバイスにCon Aを含めることの重要性と困難さを強調している。
レクチンのこのようなおよび他のインビボ使用に関わるリスクと困難さは、代替的な多価グルコース結合分子が提供されれば、有意に減弱され得よう。しかしながら、好適な代替物は、有用な濃度の標的分子に応答するZionの系において、架橋剤としての機能も果たすことができるものでなければならない。
一態様において、本開示により、標的分子に結合する多価ポリヌクレオチドアプタマーと;およびコンジュゲート枠組構造に結合された2つ以上の個別の親和性リガンドを含むコンジュゲートとを含む架橋物質体であって、該2つ以上の親和性リガンドは、該アプタマーとの結合に関して該標的分子と競合し、異なるコンジュゲート上の親和性リガンドと該アプタマー間の非共有結合性相互作用の結果、該物質体内で該コンジュゲートが架橋される、架橋物質体を提供する。このような物質体は、所望の濃度の標的分子に応答した量のコンジュゲートを放出するように設計される。最終適用用途に応じて、種々の実施形態において、該コンジュゲートはまた、薬物および/または検出可能な標識も含む。薬物、検出可能な標識および親和性リガンドは、コンジュゲート枠組構造に、共有結合されていても、非共有結合で結合されていてもよい。また、本開示により、このような物質体の使用方法およびこのような物質体の作製方法を提供する。別の態様において、本開示により、レクチン(Con Aなど)の代わりにグルコース応答性物質体に使用するための例示的なアプタマーを提供する。
定義
本明細書全体を通して用いる具体的な官能基、化学用語および一般用語の定義を、より詳細に以下に記載する。本発明の解釈上、化学元素は、Handbook of Chemistry and Physics、第75版の内表紙記載の元素周期表(CAS版)に従って特定されるものであり、具体的な官能基は上記文献に概ね定義されている。さらに、有機化学の一般原則ならびに具体的な官能性部分および反応性は、Organic Chemistry、Thomas Sorrell、University Science Books、Sausalito、1999;Smith and March March’s Advanced Organic Chemistry、第5版、John Wiley & Sons,Inc.、New York、2001;Larock、Comprehensive Organic Transformations、VCH Publishers,Inc.、New York、1989;Carruthers、Some Modern Methods of Organic Synthesis、第3版、Cambridge University Press、Cambridge、1987に記載されている。
本明細書全体を通して用いる具体的な官能基、化学用語および一般用語の定義を、より詳細に以下に記載する。本発明の解釈上、化学元素は、Handbook of Chemistry and Physics、第75版の内表紙記載の元素周期表(CAS版)に従って特定されるものであり、具体的な官能基は上記文献に概ね定義されている。さらに、有機化学の一般原則ならびに具体的な官能性部分および反応性は、Organic Chemistry、Thomas Sorrell、University Science Books、Sausalito、1999;Smith and March March’s Advanced Organic Chemistry、第5版、John Wiley & Sons,Inc.、New York、2001;Larock、Comprehensive Organic Transformations、VCH Publishers,Inc.、New York、1989;Carruthers、Some Modern Methods of Organic Synthesis、第3版、Cambridge University Press、Cambridge、1987に記載されている。
アシル−本明細書で用いる場合、用語「アシル」は、一般式−C(=O)RX1、−C(=O)ORX1、−C(=O)−O−C(=O)RX1、−C(=O)SRX1、−C(=O)N(RX1)2、−C(=S)RX1、−C(=S)N(RX1)2、および−C(=S)S(RX1)、−C(=NRX1)RX1、−C(=NRX1)ORX1、−C(=NRX1)SRX1、および−C(=NRX1)N(RX1)2(式中、RX1は水素;ハロゲン;置換もしくは非置換のヒドロキシル;置換もしくは非置換のチオール;置換もしくは非置換のアミノ;置換もしくは非置換のアシル;環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐の脂肪族;環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐のヘテロ脂肪族;環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐のアルキル;環式もしくは非環式、置換もしくは非置換、分岐もしくは非分岐のアルケニル;置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアリール、置換もしくは非置換のヘテロアリール、脂肪族オキシ、ヘテロ脂肪族オキシ、アルキルオキシ、ヘテロアルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、脂肪族チオキシ、ヘテロ脂肪族チオキシ、アルキルチオキシ、ヘテロアルキルチオキシ、アリールチオキシ、ヘテロアリールチオキシ、モノ−もしくはジ脂肪族アミノ、モノ−もしくはジヘテロ脂肪族アミノ、モノ−もしくはジアルキルアミノ、モノ−もしくはジヘテロアルキルアミノ、モノ−もしくはジアリールアミノ、またはモノ−もしくはジヘテロアリールアミノであるか;または2つのRX1基が一緒になって5〜6員の複素環式の環を形成している)を有する基をいう。例示的なアシル基としては、アルデヒド(−CHO)、カルボン酸(−CO2H)、ケトン、アシルハライド、エステル、アミド、イミン、カーボネート、カルバメート、および尿素が挙げられる。アシル置換基としては、限定されないが、安定な部分(例えば、脂肪族、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロ脂肪族、複素環式、アリール、ヘテロアリール、アシル、オキソ、イミノ、チオオキソ、シアノ、イソシアノ、アミノ、アジド、ニトロ、ヒドロキシル、チオール、ハロ、脂肪族アミノ、ヘテロ脂肪族アミノ、アルキルアミノ、ヘテロアルキルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アルキルアリール、アリールアルキル、脂肪族オキシ、ヘテロ脂肪族オキシ、アルキルオキシ、ヘテロアルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、脂肪族チオキシ、ヘテロ脂肪族チオキシ、アルキルチオキシ、ヘテロアルキルチオキシ、アリールチオキシ、ヘテロアリールチオキシ、アシルオキシなど、これらは各々、さらに置換されていてもよく、そうでなくてもよい)の形成をもたらす本明細書に記載の任意の置換基が挙げられる。
脂肪族−本明細書で用いる場合、用語「脂肪族」または「脂肪族基」は、直鎖(すなわち、非分岐)、分岐または環式(「炭素環式」)であり得、完全飽和であってもよく、または1つ以上の不飽和単位を含んでいてもよいが、芳香族ではない、任意選択で置換されている炭化水素部分を表す。特に記載のない限り、脂肪族基は1〜12個の炭素原子を含む。一部の実施形態では、脂肪族基は1〜6個の炭素原子を含む。一部の実施形態では、脂肪族基は1〜4個の炭素原子を含むものであり、また他の実施形態では、脂肪族基は1〜3個の炭素原子を含む。好適な脂肪族基としては、限定されないが、線状または分岐のアルキル、アルケニルおよびアルキニル基、ならびにそのハイブリッド((シクロアルキル)アルキル、(シクロアルケニル)アルキルまたは(シクロアルキル)アルケニルなど)が挙げられる。
アルケニル−本明細書で用いる場合、用語「アルケニル」は、少なくとも1つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分枝鎖の脂肪族部分から1個の水素原子の除去によって誘導される、任意選択で置換されている一価の基を表す。一部の特定の実施形態では、本発明において使用されるアルケニル基は、2〜6個の炭素原子を含む。一部の特定の実施形態では、本発明において使用されるアルケニル基は、2〜5個の炭素原子を含む。一部の実施形態では、本発明において使用されるアルケニル基は、2〜4個の炭素原子を含む。別の実施形態では、使用されるアルケニル基は2〜3個の炭素原子を含む。アルケニル基としては、例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル、1−メチル−2−ブテン−1−イルなどが挙げられる。
アルキル−本明細書で用いる場合、用語「アルキル」は、1〜6個の炭素原子を含む脂肪族部分から1個の水素原子の除去によって誘導される、任意選択で置換されている直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素原子団をいう。一部の実施形態では、本発明において使用されるアルキル基は1〜5個の炭素原子を含む。別の実施形態では、使用されるアルキル基は1〜4個の炭素原子を含む。さらに他の実施形態では、アルキル基は1〜3個の炭素原子を含む。また別の実施形態では、アルキル基は1〜2個の炭素を含む。アルキル原子団の例としては、限定されないが、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチル、イソ−ブチル、sec−ブチル、sec−ペンチル、イソ−ペンチル、tert−ブチル、n−ペンチル、ネオペンチル、n−ヘキシル、sec−ヘキシル、n−ヘプチル、n−オクチル、n−デシル、n−ウンデシル、ドデシルなどが挙げられる。
アルキニル−本明細書で用いる場合、用語「アルキニル」は、少なくとも1つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分枝鎖の脂肪族部分から1個の水素原子の除去によって誘導される任意選択で置換されている一価の基をいう。一部の特定の実施形態では、本発明において使用されるアルキニル基は2〜6個の炭素原子を含む。一部の特定の実施形態では、本発明において使用されるアルキニル基は2〜5個の炭素原子を含む。一部の実施形態では、本発明において使用されるアルキニル基は2〜4個の炭素原子を含む。別の実施形態では、使用されるアルキニル基は2〜3個の炭素原子を含む。代表的なアルキニル基としては、限定されないが、エチニル、2−プロピニル(プロパギル)、1−プロピニルなどが挙げられる。
アリール−本明細書で用いる場合、単独または、「アラルキル」、「アラルコキシ」もしくは「アリールオキシアルキル」などのより大きな部分の一部として使用される用語「アリール」は、合計5〜10個の環構成員を有し、系内の少なくとも1つの環は芳香族であり、系内の各環は3〜7個の環構成員を含む、任意選択で置換されている単環式および二環式の環系をいう。用語「アリール」は、用語「アリール環」と互換的に用いていることがあり得る。本発明の一部の特定の実施形態では、「アリール」は、限定されないが、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラシルなどが挙げられ、1つ以上の置換基を有していてもよい芳香族環系をいう。
アリールアルキル−本明細書で用いる場合、用語「アリールアルキル」は、アリール基(例えば、芳香族またはヘテロ芳香族基)で置換されているアルキル基をいう。
二価の炭化水素鎖−本明細書で用いる場合、用語「二価の炭化水素鎖」(「二価のアルキレン基」ともいう)は、ポリメチレン基、すなわち−(CH2)Z−であり、式中、zは、1〜30、1〜20、1〜12、1〜8、1〜6、1〜4、1〜3、1〜2、2〜30、2〜20、2〜10、2〜8、2〜6、2〜4、または2〜3の正の整数である。好適な置換基としては、置換されている脂肪族基について後述するものが挙げられる。
カルボニル−本明細書で用いる場合、用語「カルボニル」は、炭素−酸素二重結合を含む一価または二価の部分をいう。カルボニル基の非限定的な例としては、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、エノン、アシルハライド、無水物、尿素、カルバメート、カーボネート、チオエステル、ラクトン、ラクタム、ヒドロキサメート、イソシアネート、およびクロロホルメートが挙げられる。
脂環式−本明細書で用いる場合、用語「脂環式」、「炭素環」、または「炭素環式」は、単独またはより大きな部分の一部として使用され、3〜10員を有する本明細書に記載の、任意選択で置換されている飽和または部分不飽和の、環式の脂肪族の単環式または二環式の環系をいう。脂環式基としては、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロヘプテニル、シクロオクチル、シクロオクテニル、およびシクロオクタジエニルが挙げられる。一部の実施形態では、シクロアルキルは3〜6個の炭素を有する。
ハロゲン−本明細書で用いる場合、用語「ハロ」および「ハロゲン」は、フッ素(フルオロ、−F)、塩素(クロロ,−Cl)、臭素(ブロモ,−Br)、およびヨウ素(ヨード,−I)から選択される原子をいう。
ヘテロ脂肪族−本明細書で用いる場合、用語「ヘテロ脂肪族」または「ヘテロ脂肪族基」は、炭素原子に加えて1〜5個のヘテロ原子を有し、直鎖(すなわち、非分岐)であっても、分岐であっても環式(「複素環式」)であってもよく、完全飽和であってもよく、1つ以上の不飽和単位を含んでいてもよいが、芳香族ではない、任意選択で置換されている炭化水素部分を表す。特に記載のない限り、ヘテロ脂肪族基は1〜6個の炭素原子を含み、1〜3個の炭素原子が、任意選択で独立して、酸素、窒素およびイオウから選択されるヘテロ原子で置き換えられている。一部の実施形態では、ヘテロ脂肪族基は1〜4個の炭素原子を含み、1〜2個の炭素原子が、任意選択で独立して、酸素、窒素およびイオウから選択されるヘテロ原子で置き換えられている。また他の実施形態では、ヘテロ脂肪族基は1〜3個の炭素原子を含み、1個の炭素原子が、任意選択で独立して、酸素、窒素およびイオウから選択されるヘテロ原子で置き換えられている。好適なヘテロ脂肪族基としては、限定されないが、線状または分岐のヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、およびヘテロアルキニル基が挙げられる。
ヘテロアラルキル−本明細書で用いる場合、用語「ヘテロアラルキル」は、ヘテロアリールで置換されているアルキル基をいい、アルキル部分およびヘテロアリール部分は、独立して、任意選択で置換されている。
ヘテロアリール−本明細書で用いる場合、単独または、例えば、「ヘテロアラルキル」もしくは「ヘテロアラルコキシ」など、より大きな部分の一部として使用される用語「ヘテロアリール」は、5〜10個の環内原子、好ましくは5、6または9個の環内原子を有し;環式アレイ内で共有される6、10または14個のπ原子を有し;炭素原子に加えて1〜5個のヘテロ原子を有する、任意選択で置換されている基をいう。ヘテロアリール基としては、限定されないが、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、およびプテリジニルが挙げられる。また、用語「ヘテロアリール」および「ヘテロアル(heteroar−)」には、本明細書で用いる場合、ヘテロ芳香族環が1つ以上のアリール、炭素環式または複素環式の環に縮合され、その結合原子団または結合点が該ヘテロ芳香族環上にある基が包含される。非限定的な例としては、インドリル、イソインドリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンズチアゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、4H−キノリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、テトラヒドロキノリニル、およびテトラヒドロイソキノリニルが挙げられる。ヘテロアリール基は単環式であっても二環式であってもよい。用語「ヘテロアリール」は、用語「ヘテロアリール環」、「ヘテロアリール基」、または「ヘテロ芳香族」(これらの用語はいずれも任意選択で置換されている環を包含する)と互換的に用いることがある。
ヘテロ原子−本明細書で用いる場合、用語「ヘテロ原子」は窒素、酸素またはイオウをいい、窒素またはイオウの任意の酸化形態、および塩基性窒素の任意の第4級化形態を包含する。また、用語「窒素」は、置換されている窒素を包含する。
複素環式−本明細書で用いる場合、用語「複素環」、「ヘテロシクリル」、「複素環式の原子団」、および「複素環式の環」は互換的に用い、任意選択で置換されている、安定な5〜7員の単環式または7〜10員の二環式の複素環式部分であって、飽和または部分不飽和のいずれかであり、炭素原子に加えて1つ以上の上記に定義したヘテロ原子を有するものをいう。複素環式の環は、その懸垂基に、安定な構造がもたらされる任意のヘテロ原子または炭素原子で結合され得、任意の環内原子は任意選択で置換されていてもよい。かかる飽和または部分不飽和の複素環式の原子団の例としては、限定されないが、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、モルホリニル、およびキヌクリジニルが挙げられる。用語「複素環」、「ヘテロシクリル」、「ヘテロシクリル環」、「複素環式基」、「複素環式部分」、および「複素環式の原子団」は、本明細書において互換的に用い、また、ヘテロシクリル環が1つ以上のアリール、ヘテロアリールまたは炭素環式の環(インドリニル、3H−インドリル、クロマニル、フェナントリジニルまたはテトラヒドロキノリニルなど)に縮合されており、その結合原子団または結合点が該ヘテロシクリル環上にある基を包含する。ヘテロシクリル基は単環式であっても二環式であってもよい。用語「ヘテロシクリルアルキル」はヘテロシクリルで置換されているアルキル基をいい、アルキル部分およびヘテロシクリル部分は、独立して、任意選択で置換されている。
不飽和−本明細書で用いる場合、用語「不飽和」は、ある部分が1つ以上の二重結合または三重結合を有することを意味する。
部分不飽和−本明細書で用いる場合、用語「部分不飽和」は、少なくとも1つの二重結合または三重結合を含む環部分をいう。用語「部分不飽和」は、多数の不飽和部位を有する環を包含することを意図するが、本明細書で定義したアリール部分またはヘテロアリール部分を含むことは意図しない。
任意選択で置換されている(置換されていてもよい)−本明細書に記載のように、本発明の化合物は、「任意選択で置換されている」部分を含んでいてもよい。一般に、用語「置換されている」は、前に用語「任意選択で」があってもなくても、表示された部分の1つ以上の水素が適当な置換基で置き換えられていることを意味する。特に記載のない限り、「任意選択で置換されている」基は、該基の各置換可能な位置に適当な置換基を有していてもよく、任意の所与の構造内の1つより多くの位置が、指定された群から選択される1つより多くの置換基で置換され得る場合、該置換基は、1つ1つの位置において同じであるか、異なるかのいずれかであり得る。本発明で想定される置換基の組合せは、好ましくは、安定な、または化学的に実現可能な化合物の形成をもたらすものである。用語「安定な」は、本明細書で用いる場合、生成、検出、ならびに一部の特定の実施形態では回収、精製、および本明細書に開示した目的の1つ以上のための使用を可能にする条件に供されたときに、実質的に改変されない化合物をいう。
「任意選択で置換されている」基の置換可能な炭素原子上の好適な一価の置換基は、独立して、ハロゲン;−(CH2)0〜4R°;−(CH2)0〜4OR°;−O−(CH2)0〜4C(O)OR°;−(CH2)0〜4CH(ORo)2;−(CH2)0〜4SR°;−(CH2)0〜4Ph(R°で置換されていてもよい);−(CH2)0〜4O(CH2)0〜1Ph(R°で置換されていてもよい);−CH=CHPh(R°で置換されていてもよい);−NO2;−CN;−N3;−(CH2)0〜4N(R°)2;−(CH2)0〜4N(R°)C(O)R°;−N(R°)C(S)R°;−(CH2)0〜4N(R°)C(O)NR°2;−N(R°)C(S)NR°2;−(CH2)0〜4N(Ro)C(O)ORo;−N(R°)N(R°)C(O)R°;−N(R°)N(R°)C(O)NR°2;−N(R°)N(R°)C(O)OR°;−(CH2)0〜4C(O)R°;−C(S)R°;−(CH2)0〜4C(O)OR°;−(CH2)0〜4C(O)SR°;−(CH2)0〜4C(O)OSiR°3;−(CH2)0〜4OC(O)R°;−OC(O)(CH2)0〜4SR、−SC(S)SR°;−(CH2)0〜4SC(O)R°;−(CH2)0〜4C(O)NR°2;−C(S)NR°2;−C(S)SR°;−SC(S)SR°、−(CH2)0〜4OC(O)NR°2;−C(O)N(OR°)R°;−C(O)C(O)R°;−C(O)CH2C(O)R°;−C(NOR°)R°;−(CH2)0〜4SSR°;−(CH2)0〜4S(O)2R°;−(CH2)0〜4S(O)2OR°;−(CH2)0〜4OS(O)2R°;−S(O)2NR°;−(CH2)0〜4S(O)R°;−N(R°)S(O)2NR°2;−N(R°)S(O)2R°;−N(OR°)R°;−C(NH)NR°2;−P(O)2R°;−P(O)R°2;−OP(O)R°2;−OP(O)(OR°)2;SiR°3;−(C1〜4直鎖もしくは分枝鎖のアルキレン)O−N(R°)2;または−(C1〜4直鎖もしくは分枝鎖のアルキレン)C(O)O−N(R°)2であり、式中、各R°は、以下に定義するとおりに置換されていてもよく、独立して、水素、C1〜6脂肪族、−CH2Ph、−O(CH2)0〜1Ph、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される0〜4個のヘテロ原子を有する5〜6員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環であるか、あるいは、上記の定義に関わらず、独立して存在する2つのR°が、その介在原子(1つもしくは複数)を一緒になって、独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される0〜4個のヘテロ原子を有し、以下に定義するとおりに置換されていてもよい、3〜12員の飽和、部分不飽和またはアリール単環式または二環式の環を形成している。
R°(または2つの独立して存在するR°がその介在原子と一緒になって形成される環)上の好適な一価の置換基は、独立して、ハロゲン、−(CH2)0〜2R●、−(ハロR●)、−(CH2)0〜2OH、−(CH2)0〜2OR●、−(CH2)0〜2CH(OR●)2;−O(ハロR●)、−CN、−N3、−(CH2)0〜2C(O)R●、−(CH2)0〜2C(O)OH、−(CH2)0〜2C(O)OR●、−(CH2)0〜2SR●、−(CH2)0〜2SH、−(CH2)0〜2NH2、−(CH2)0〜2NHR●、−(CH2)0〜2NR● 2、−NO2、−SiR● 3、−OSiR● 3、−C(O)SR●、−(C1〜4直鎖もしくは分枝鎖のアルキレン)C(O)OR●、または−SSR●であり、式中、各R●は非置換であるか、もしくは前に「ハロ」がある場合は1つ以上のハロゲンでのみ置換されており、独立して、C1〜4脂肪族、−CH2Ph、−0(CH2)0〜1Ph、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される0〜4個のヘテロ原子を有する5〜6員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環から選択される。R°の飽和炭素原子上の好適な二価の置換基としては、=Oおよび=Sが挙げられる。
「任意選択で置換されている」基の飽和炭素原子上の好適な二価の置換基としては、以下のもの:=O、=S、=NNR* 2、=NNHC(O)R*、=NNHC(O)0R*、=NNHS(O)2R*、=NR*、=N0R*、−O(C(R* 2))2〜30−、または−S(C(R* 2))2〜3S−が挙げられ、ここで、独立して存在するR*は各々、水素、以下に定義するとおりに置換されていてもよいC1〜6脂肪族、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される0〜4個のヘテロ原子を有する非置換の5〜6員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環から選択される。「任意選択で置換されている」基の置換可能なビシナル炭素に結合された好適な二価の置換基としては:−0(CR* 2)2〜3O−(式中、独立して存在するR*は各々、水素、以下に定義するとおりに置換されていてもよいC1〜6脂肪族、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される0〜4個のヘテロ原子を有する非置換の5〜6員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環から選択される)が挙げられる。
R*の脂肪族基上の好適な置換基は、ハロゲン、−R●、−(ハロR●)、−OH、−OR●、−O(ハロR●)、−CN、−C(O)OH、−C(O)OR●、−NH2、−NHR●、−NR● 2、または−NO2(式中、各R●は非置換であるか、もしくは前に「ハロ」がある場合は1つ以上のハロゲンでのみ置換されており、独立して、C1−4脂肪族、−CH2Ph、−O(CH2)0〜1Ph、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される0〜4個のヘテロ原子を有する5〜6員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環である)である。
「任意選択で置換されている」基の置換可能な窒素上の好適な置換基としては、−R†、NR† 2、−C(O)R†、−C(O)OR†、−C(O)C(O)R†、−C(O)CH2C(O)R†、−S(O)2R†、−S(O)2NR† 2、−C(S)NR† 2、−C(NH)NR† 2、または−N(R†)S(0)2R†が挙げられ;式中、各R†は、独立して、水素、以下に定義するとおりに置換されていてもよいC1〜6脂肪族、非置換の−OPh、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される0〜4個のヘテロ原子を有する非置換の5〜6員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環であるか、あるいは、上記の定義に関わらず、独立して存在する2つのR†が、その介在原子(1つもしくは複数)と一緒になって、独立して窒素、酸素またはイオウから選択される0〜4個のヘテロ原子を有する非置換の3〜12員の飽和、部分不飽和またはアリールの単環式または二環式の環を形成している。
R†の脂肪族基上の好適な置換基は、ハロゲン、−R●、−(ハロR●)、−OH、−OR●、−O(ハロR●)、−CN、−C(O)OH、−C(O)OR●、−NH2、−NHR●、−NR● 2、または−NO2(式中、各R●は非置換であるか、もしくは前に「ハロ」がある場合は1つ以上のハロゲンでのみ置換されており、独立して、C1〜4脂肪族、−CH2Ph、−O(CH2)0〜1Ph、または独立して窒素、酸素もしくはイオウから選択される0〜4個のヘテロ原子を有する5〜6員の飽和、部分不飽和もしくはアリール環である)である。
好適な保護基−本明細書で用いる場合、用語「適当な保護基」は、化合物内の位置に応じたアミノ保護基またはヒドロキシル保護基をいい、Protecting Groups in Organic Synthesis、T.W.GreeneおよびP.G.M.Wuts、第3版、John Wiley & Sons、1999に詳細に記載されているものが挙げられる。
好適なアミノ保護基としては、メチルカルバメート、エチルカルバメート、9−フルオレニルメチルカルバメート(Fmoc)、9−(2−スルホ)フルオレニルメチルカルバメート、9−(2,7−ジブロモ)フルオロエニルメチルカルバメート、2,7−ジ−t−ブチル−[9−(10,10−ジオキソ−10,10,10,10−テトラヒドロチオキサンチル)]メチルカルバメート(DBD−Tmoc)、4−メトキシフェンアシルカルバメート(Phenoc)、2,2,2−トリクロロエチルカルバメート(Troc)、2−トリメチルシリルエチルカルバメート(Teoc)、2−フェニルエチルカルバメート(hZ)、1−(1−アダマンチル)−1−メチルエチルカルバメート(Adpoc)、1,1−ジメチル−2−ハロエチルカルバメート、1,1−ジメチル−2,2−ジブロモエチルカルバメート(DB−t−BOC)、1,1−ジメチル−2,2,2−トリクロロエチルカルバメート(TCBOC)、1−メチル−1−(4−ビフェニルyl)エチルカルバメート(Bpoc)、1−(3,5−ジ−t−ブチルフェニル)−1−メチルエチルカルバメート(t−Bumeoc)、2−(2’−および4’−ピリジル)エチルカルバメート(Pyoc)、2−(N,N−ジシクロヘキシルカルボキサミド)エチルカルバメート、t−ブチルカルバメート(BOC)、1−アダマンチルカルバメート(Adoc)、ビニルカルバメート(Voc)、アリルカルバメート(Alloc)、1−イソプロピルアリルカルバメート(Ipaoc)、シンナミルカルバメート(Coc)、4−ニトロシンナミルカルバメート(Noc)、8−キノリルカルバメート、N−ヒドロキシピペリジニルカルバメート、アルキルジチオカルバメート、ベンジルカルバメート(Cbz)、p−メトキシベンジルカルバメート(Moz)、p−ニトロベンジルカルバメート、p−ブロモベンジルカルバメート、p−クロロベンジルカルバメート、2,4−ジクロロベンジルカルバメート、4−メチルスルフィニルベンジルカルバメート(Msz)、9−アントリルメチルカルバメート、ジフェニルメチルカルバメート、2−メチルチオエチルカルバメート、2−メチルスルホニルエチルカルバメート、2−(p−トルエンスルホニル)エチルカルバメート、[2−(1,3−ジチアニル)]メチルカルバメート(Dmoc)、4−メチルチオフェニルカルバメート(Mtpc)、2,4−ジメチルチオフェニルカルバメート(Bmpc)、2−ホスホニオエチルカルバメート(Peoc)、2−トリフェニルホスホニオイソプロピルカルバメート(Ppoc)、1,1−ジメチル−2−シアノエチルカルバメート、m−クロロ−p−アシルオキシベンジルカルバメート、p−(ジヒドロキシボリル)ベンジルカルバメート、5−ベンゾイソオキサゾリルメチルカルバメート、2−(トリフルオロメチル)−6−クロモニルメチルカルバメート(Tcroc)、m−ニトロフェニルカルバメート、3,5−ジメトキシベンジルカルバメート、o−ニトロベンジルカルバメート、3,4−ジメトキシ−6−ニトロベンジルカルバメート、フェニル(o−ニトロフェニル)メチルカルバメート、フェノチアジニル−(10)−カルボニル誘導体、N’−p−トルエンスルホニルアミノカルボニル誘導体、N’−フェニルアミノチオカルボニル誘導体、t−アミル、チオカルバミン酸S−ベンジルカルバメート、p−シアノベンジルカルバメート、シクロブチルカルバメート、シクロヘキシルカルバメート、シクロペンチルカルバメート、シクロプロピルメチルカルバメート、p−デシルオキシベンジルカルバメート、2,2−ジメトキシカルボニルビニルカルバメート、o−(N,N−ジメチルカルボキサミド)ベンジルカルバメート、1,1−ジメチル−3−(N,N−ジメチルカルボキサミド)プロピルカルバメート、1,1−ジメチルプロピニルカルバメート、ジ(2−ピリジル)メチルカルバメート、2−フラニルメチルカルバメート、2−ヨードエチルカルバメート、イソボルニル(borynl)カルバメート、イソブチルカルバメート、イソニコチニルカルバメート、p−(p’−メトキシフェニルアゾ)ベンジルカルバメート、1−メチルシクロブチルカルバメート、1−メチルシクロヘキシルカルバメート、1−メチル−1−シクロプロピルメチルカルバメート、1−メチル−1−(3,5−ジメトキシフェニル)エチルカルバメート、1−メチル−1−(p−フェニルアゾフェニル)エチルカルバメート、1−メチル−1−フェニルエチルカルバメート、1−メチル−1−(4−ピリジル)エチルカルバメート、フェニルカルバメート、p−(フェニルアゾ)ベンジルカルバメート、2,4,6−トリ−t−ブチルフェニルカルバメート、4−(トリメチルアンモニウム)ベンジルカルバメート、2,4,6−トリメチルベンジル、ホルムアミド、アセトアミド、クロロアセトアミド、トリクロロアセトアミド、トリフルオロアセトアミド、フェニルアセトアミド、3−フェニルプロパンアミド、ピコリンアミド、3−ピリジルカルボキサミド、N−ベンゾイルフェニルアラニル誘導体、ベンズアミド、p−フェニルベンズアミド、o−ニトロフェニルアセトアミド、o−ニトロフェノキシアセトアミド、アセトアセトアミド、(N’−ジチオベンジルオキシカルボニルアミノ)アセトアミド、3−(p−ヒドロキシフェニル)プロパンアミド、3−(o−ニトロフェニル)プロパンアミド、2−メチル−2−(o−ニトロフェノキシ)プロパンアミド、2−メチル−2−(o−フェニルアゾフェノキシ)プロパンアミド、4−クロロブタンアミド、3−メチル−3−ニトロブタンアミド、o−ニトロシンナミド、N−アセチルメチオニン誘導体、o−ニトロベンズアミド、o−(ベンゾイルオキシメチル)ベンズアミド、4,5−ジフェニル−3−オキサゾリン−2−オン、N−フタルイミド、N−ジチアスクシンイミド(Dts)、N−2,3−ジフェニルマレイミド、N−2,5−ジメチルピロール、N−1,1,4,4−テトラメチルジシリルアザシクロペンタン付加物(STABASE)、5−置換1,3−ジメチル−1,3,5−トリアザシクロヘキサン−2−オン、5−置換1,3−ジベンジル−1,3,5−トリアザシクロヘキサン−2−オン、1−置換3,5−ジニトロ−4−ピリドン、N−メチルアミン、N−アリルアミン、N−[2−(トリメチルシリル)エトキシ]メチルアミン(SEM)、N−3−アセトキシプロピルアミン、N−(1−イソプロピル−4−ニトロ−2−オキソ−3−ピロリン(pyroolin)−3−イル)アミン、第4級アンモニウム塩、N−ベンジルアミン、N−ジ(4−メトキシフェニル)メチルアミン、N−5−ジベンゾスベリルアミン、N−トリフェニルメチルアミン(Tr)、N−[(4−メトキシフェニル)ジフェニルメチル]アミン(MMTr)、N−9−フェニルフルオレニルアミン(PhF)、N−2,7−ジクロロ−9−フルオレニルメチレンアミン、N−フェロセニルメチルアミノ(Fcm)、N−2−ピコリルアミノN’−オキシド、N−1,1−ジメチルチオメチレンアミン、N−ベンジリデンアミン、N−p−メトキシベンジリデンアミン、N−ジフェニルメチレンアミン、N−[(2−ピリジル)メシチル]メチレンアミン、N−(N’,N’−ジメチルアミノメチレン)アミン、N,N’−イソプロピリデンジアミン、N−p−ニトロベンジリデンアミン、N−サリチリデンアミン、N−5−クロロサリチリデンアミン、N−(5−クロロ−2−ヒドロキシフェニル)フェニルメチレンアミン、N−シクロヘキシリデンアミン、N−(5,5−ジメチル−3−オキソ−1−シクロヘキセニル)アミン、N−ボラン誘導体、N−ジフェニルボリン酸誘導体、N−[フェニル(ペンタカルボニルクロム−またはタングステン)カルボニル]アミン、N−銅キレート、N−亜鉛キレート、N−ニトロアミン、N−ニトロソアミン、アミンN−オキシド、ジフェニルホスフィンアミド(Dpp)、ジメチルチオホスフィンアミド(Mpt)、ジフェニルチオホスフィンアミド(Ppt)、ジアルキルホスホルアミデート、ジベンジルホスホルアミデート、ジフェニルホスホルアミデート、ベンゼンスルフェンアミド、o−ニトロベンゼンスルフェンアミド(Νps)、2,4−ジニトロベンゼンスルフェンアミド、ペンタクロロベンゼンスルフェンアミド、2−ニトロ−4−メトキシベンゼンスルフェンアミド、トリフェニルメチルスルフェンアミド、3−ニトロピリジンスルフェンアミド(Νpys)、p−トルエンスルホンアミド(Ts)、ベンゼンスルホンアミド、2,3,6,−トリメチル−4−メトキシベンゼンスルホンアミド(Mtr)、2,4,6−トリメトキシベンゼンスルホンアミド(Mtb)、2,6−ジメチル−4−メトキシベンゼンスルホンアミド(Pme)、2,3,5,6−テトラメチル−4−メトキシベンゼンスルホンアミド(Mte)、4−メトキシベンゼンスルホンアミド(Mbs)、2,4,6−トリメチルベンゼンスルホンアミド(Mts)、2,6−ジメトキシ−4−メチルベンゼンスルホンアミド(iMds)、2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−6−スルホンアミド(Pmc)、メタンスルホンアミド(Ms)、β−トリメチルシリルエタンスルホンアミド(SES)、9−アントラセンスルホンアミド、4−(4’、8’−ジメトキシナフチルメチル)ベンゼンスルホンアミド(DΝMBS)、ベンジルスルホンアミド、トリフルオロメチルスルホンアミド、ならびにフェンアシルスルホンアミドが挙げられる。
好適なヒドロキシル保護基としては、メチル、メトキシルメチル(MOM)、メチルチオメチル(MTM)、t−ブチルチオメチル、(フェニルジメチルシリル)メトキシメチル(SMOM)、ベンジルオキシメチル(BOM)、p−メトキシベンジルオキシメチル(PMBM)、(4−メトキシフェノキシ)メチル(p−A0M)、グアヤコールメチル(GUM)、t−ブトキシメチル、4−ペンテニルオキシメチル(POM)、シロキシメチル、2−メトキシエトキシメチル(MEM)、2,2,2−トリクロロエトキシメチル、ビス(2−クロロエトキシ)メチル、2−(トリメチルシリル)エトキシメチル(SEMOR)、テトラヒドロピラニル(THP)、3−ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、1−メトキシシクロヘキシル、4−メトキシテトラヒドロピラニル(MTHP)、4−メトキシテトラヒドロチオピラニル、4−メトキシテトラヒドロチオピラニルS,S−ジオキシド、1−[(2−クロロ−4−メチル)フェニル]−4−メトキシピペリジン−4−イル(CTMP)、1,4−ジオキサン−2−イル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、2,3,3a,4,5,6,7,7a−オクタヒドロ−7,8,8−トリメチル−4,7−メタノベンゾフラン−2−イル、1−エトキシエチル、1−(2−クロロエトキシ)エチル、1−メチル−1−メトキシエチル、1−メチル−1−ベンジルオキシエチル、1−メチル−1−ベンジルオキシ−2−フルオロエチル、2,2,2−トリクロロエチル、2−トリメチルシリルエチル、2−(フェニルセレニル)エチル、t−ブチル、アリル、p−クロロフェニル、p−メトキシフェニル、2,4−ジニトロフェニル、ベンジル、p−メトキシベンジル、3,4−ジメトキシベンジル、o−ニトロベンジル、p−ニトロベンジル、p−ハロベンジル、2,6−ジクロロベンジル、p−シアノベンジル、p−フェニルベンジル、2−ピコリル、4−ピコリル、3−メチル−2−ピコリルN−オキシド、ジフェニルメチル、p,p’−ジニトロベンズヒドリル、5−ジベンゾスベリル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル、p−メトキシフェニルジフェニルメチル、ジ(p−メトキシフェニル)フェニルメチル、トリ(p−メトキシフェニル)メチル、4−(4’−ブロモフェンアシルオキシフェニル)ジフェニルメチル、4,4’,4”−トリス(4,5−ジクロロフタルイミドフェニル)メチル、4,4’,4”−トリス(レブリノイルオキシフェニル)メチル、4,4’,4”−トリス(ベンゾイルオキシフェニル)メチル、3−(イミダゾル−1−イル)ビス(4’,4”−ジメトキシフェニル)メチル、1,1−ビス(4−メトキシフェニル)−1’−ピレニルメチル、9−アントリル、9−(9−フェニル)キサンテニル、9−(9−フェニル−10−オキソ)アントリル、1,3−ベンゾジチオラン−2−イル、ベンゾイソチアゾリルS,S−ジオキシド、トリメチルシリル(TMS)、トリエチルシリル(TES)、トリイソプロピルシリル(TIPS)、ジメチルイソプロピルシリル(IPDMS)、ジエチルイソプロピルシリル(DEIPS)、ジメチルテキシルシリル、t−ブチルジメチルシリル(TBDMS)、t−ブチルジフェニルシリル(TBDPS)、トリベンジルシリル、トリ−p−キシリルシリル、トリフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル(DPMS)、t−ブチルメトキシフェニルシリル(TBMPS)、ホルメート、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、ジクロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、フェノキシアセテート、p−クロロフェノキシアセテート、3−フェニルプロピオネート、4−オキソペンタノエート(レブリネート)、4,4−(エチレンジチオ)ペンタノエート(レブリノイルジチオアセタール)、ピバロエート、アダマントエート、クロトネート、4−メトキシクロトネート、ベンゾエート、p−フェニルベンゾエート、2,4,6−トリメチルベンゾエート(メシトエート)、アルキルメチルカーボネート、9−フルオレニルメチルカーボネート(Fmoc)、アルキルエチルカーボネート、アルキル2,2,2−トリクロロエチルカーボネート(Troc)、2−(トリメチルシリル)エチルカーボネート(TMSEC)、2−(フェニルスルホニル)エチルカーボネート(Psec)、2−(トリフェニルホスホニオ)エチルカーボネート(Peoc)、アルキルイソブチルカーボネート、アルキルビニルカーボネートアルキルアリルカーボネート、アルキルp−ニトロフェニルカーボネート、アルキルベンジルカーボネート、アルキルp−メトキシベンジルカーボネート、アルキル3,4−ジメトキシベンジルカーボネート、アルキルo−ニトロベンジルカーボネート、アルキルp−ニトロベンジルカーボネート、アルキルS−ベンジルチオカーボネート、4−エトキシ−1−ナフチルカーボネート、メチルジチオカーボネート、2−ヨードベンゾエート、4−アジドブチレート、4−ニトロ−4−メチルペンタノエート、o−(ジブロモメチル)ベンゾエート、2−ホルミルベンゼンスルホネート、2−(メチルチオメトキシ)エチル、4−(メチルチオメトキシ)ブチレート、2−(メチルチオメトキシメチル)ベンゾエート、2,6−ジクロロ−4−メチルフェノキシアセテート、2,6−ジクロロ−4−(1,1,3,3−テトラメチルブチル)フェノキシアセテート、2,4−ビス(1,1−ジメチルプロピル)フェノキシアセテート、クロロジフェニルアセテート、イソブチレート、モノスクシネート(succinoate)、(E)−2−メチル−2−ブテノエート、o−(メトキシカルボニル)ベンゾエート、α−ナフトエート、ナイトレート、アルキルN,N,N’,N’−テトラメチルホスホロジアミデート、アルキルN−フェニルカルバメート、ボレート、ジメチルホスフィノチオイル、アルキル2,4−ジニトロフェニルスルフェネート、スルフェート、メタンスルホネート(メシレート)、ベンジルスルホネート、およびトシレート(Ts)が挙げられる。1,2−または1,3−ジオールを保護するには、保護基として、メチレンアセタール、エチリデンアセタール、1−t−ブチルエチリデンケタール、1−フェニルエチリデンケタール、(4−メトキシフェニル)エチリデンアセタール、2,2,2−トリクロロエチリデンアセタール、アセトニド、シクロペンチリデンケタール、シクロヘキシリデンケタール、シクロヘプチリデンケタール、ベンジリデンアセタール、p−メトキシベンジリデンアセタール、2,4−ジメトキシベンジリデンケタール、3,4−ジメトキシベンジリデンアセタール、2−ニトロベンジリデンアセタール、メトキシメチレンアセタール、エトキシメチレンアセタール、ジメトキシメチレンオルトエステル、1−メトキシエチリデンオルトエステル、1−エトキシエチリジンオルトエステル、1,2−ジメトキシエチリデンオルトエステル、α−メトキシベンジリデンオルトエステル、1−(N,N−ジメチルアミノ)エチリデン誘導体、α−(N,N’−ジメチルアミノ)ベンジリデン誘導体、2−オキサシクロペンチリデンオルトエステル、ジ−t−ブチルシリレン基(DTBS)、1,3−(1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサニリデン)誘導体(TIPDS)、テトラ−t−ブトキシジシロキサン−1,3−ジイリデン誘導体(TBDS)、環式のカーボネート、環式のボロネート、エチルボロネート、およびフェニルボロネートが挙げられる。
アプタマー−本明細書で用いる場合、用語「アプタマー」または「ポリヌクレオチドアプタマー」は、標的分子に特異的に結合するポリヌクレオチドをいう。一般に、アプタマーは、検出可能なレベルで標的分子と会合するが、同様の条件下で、無関連な分子存在体(例えば、標的分子と共通の構造的特徴を共有していない分子)とは検出可能に会合しない場合、標的分子に「特異的に結合する」といわれる。標的分子とアプタマー間の特異的会合は、典型的には、アプタマーによって認識されるエピトープなどの、標的分子の特定の構造的特徴の有無に依存する。一般的に、アプタマーがエピトープAに特異的である場合、遊離の標識エピトープAおよびこれに対するアプタマーの両方を含む反応液中におけるエピトープA含有分子の存在または遊離の非標識エピトープAの存在により、アプタマーに結合する標識エピトープAの量は低減される。一般に、特異性は絶対的である必要はないことが理解されよう。実際、アプタマーが、標的エピトープに加えて他のエピトープと交差反応することがあり得ることは当該技術分野で周知である。かかる交差反応性は、アプタマーが使用される適用用途によっては許容される場合があり得る。したがって、アプタマーの特異性の度合は、これが使用されている状況に依存する。また、特異性は、非標的分子に対するアプタマーの親和性対標的分子に対するアプタマーの親和性など、さらなる要素との関連において評価され得ることも理解されよう。
生物分解性の−本明細書で用いる場合、用語「生物分解性の」は、生理学的条件下またはエンドソーム条件下で分解される(すなわち、その共有結合性の構造の少なくとも一部が失われる)分子をいう。生物分解性の分子は、必ずしも加水分解的に分解可能である必要はなく、分解に酵素の作用を必要としてもよい。
生体分子−本明細書で用いる場合、用語「生体分子」は、天然に存在するものであっても人工的に作出されたものであっても(例えば、合成もしくは組換えによる方法)、細胞内および組織内に一般的に見られる分子(例えば、ポリペプチド、アミノ酸、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、多糖類、糖類、脂質、核タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ステロイド類、代謝産物など)をいう。生体分子の具体的な類型としては、限定されないが、酵素、受容体、神経伝達物質、ホルモン、サイトカイン、細胞応答修飾因子(増殖因子および化学走化性因子など)、抗体、ワクチン、ハプテン、毒素、インターフェロン、リボザイム、アンチセンス剤、プラスミド、DNA、およびRNAが挙げられる。
薬物−本明細書で用いる場合、用語「薬物」は、生物学的事象を改変するか、阻害するか、活性化させるか、あるいは影響を及ぼす小分子または生体分子をいう。例えば、薬物としては、限定されないが、抗AIDS物質、抗癌物質、抗生物質、抗糖尿物質、免疫抑制薬、抗ウイルス物質、酵素阻害薬、神経毒、オピオイド、催眠薬、抗ヒスタミン薬、潤滑薬(lubricant)、精神安定薬、鎮痙薬、筋弛緩薬ならびに抗パーキンソン物質、鎮痙薬および筋肉収縮剤(muscle contractant)(チャネル遮断薬、縮瞳薬および抗コリン作用薬など)、抗緑内障化合物、抗寄生虫および/または抗原虫化合物、細胞−細胞外マトリックス相互作用の調節薬(細胞増殖阻害薬および抗接着分子など)、血管拡張剤、DNA、RNAもしくはタンパク質の合成阻害薬、抗高血圧薬、鎮痛薬、解熱薬、ステロイド系および非ステロイド系抗炎症剤、抗血管形成因子、抗分泌因子、抗凝固薬および/または抗血栓剤、局所麻酔薬、眼科用薬、プロスタグランジン、抗鬱薬、抗精神病物質、制吐薬、ならびにイメージング剤が挙げられ得る。本発明における使用に適した例示的な薬物のより完全な列挙は、「Pharmaceutical Substances:Syntheses,Patents,Applications」(Axel KleemannおよびJurgen Engelによる)、Thieme Medical Publishing、1999;「Merck Index:An Encyclopedia of Chemicals,Drugs,and Biologicals」、Susan Budavariら編、CRC Press、1996、およびUnited States Pharmacopeia−25/National Formulary−20、United States Pharmcopeial Convention,Inc.出版、Rockville MD,2001を見るとよい。好ましくは(必ずしもそうでないが)、薬物は、適切な政府機関または行政団体によって、既に使用が安全かつ有効であるとみなされているものである。例えば、FDAによって21 C.F.R.§§ 330.5,331〜361、および440〜460にリストアップされたヒトに使用するための薬物;FDAによって21 C.F.R.§§ 500〜589にリストアップされた獣医学的使用のための薬物はすべて、本発明による使用に許容され得るとみなす。
超分岐−本明細書で用いる場合、「超分岐」構造は、少なくとも1つの分岐した分岐を含む共有結合性の構造(例えば、デンドリマー構造)である。超分岐構造は、ポリマー基礎構造および/または非ポリマー基礎構造を含むものであり得る。
パーセント相同性−本明細書で用いる場合、用語「パーセント相同性」は、本開示において定義する最適アラインメント後の2つの配列間の配列同一性の割合をいう。例えば、2つのヌクレオチド配列は、以下に論考するように一致が最大となるようにアラインメントしたときに該2つの配列内のヌクレオチドの配列が同じである場合、「同一」であるという。2つのヌクレオチド配列間の配列の比較は、典型的には、2つの最適にアラインメントされた配列の配列を、領域または「比較域」において比較し、配列が類似している領域を特定および比較することにより行なわれる。比較のための配列の最適アラインメントは、SmithおよびWaterman、Ad.App.Math.2:482(1981)の局所相同性アルゴリズム、NeddlemanおよびWunsch、J.Mol.Biol.48:443(1970)の相同性アラインメントアルゴリズム、PearsonおよびLipman、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)の類似性検索方法、このようなアルゴリズムのコンピュータでの実行、または目視検査によって行なわれ得る。
配列同一性の割合−「配列同一性の割合」は、2つの最適にアラインメントされた配列を比較域において比較することにより判定され、この場合、ヌクレオチド配列の比較域内の部分には、2つの配列の最適アラインメントのための参照配列(これは付加または欠失を含まない)と比較したとき、付加または欠失(すなわち、ギャップ)が含まれ得る。この割合は、両方の配列に同一のヌクレオチド残基が存在している位置の数を求め、マッチングした位置の数を得、マッチングした位置の数を比較域内の位置の総数で除算し、結果に100を乗算して配列同一性の割合を得ることにより計算される。上記に示すこの配列同一性の定義は、当業者によって使用されているものであり得る定義である。この定義自体に、アルゴリズムの補助はなんら必要とされない。アルゴリズムは、配列同一性を計算するものではなく、配列の最適アラインメントを容易にするのに役立つものにすぎない。この定義から、2つの比較対象配列間の配列同一性には明確な1つだけの値が存在することになり、この値は、最適アラインメントで得られる値に対応する。
ポリマー−本明細書で用いる場合、「ポリマー」または「ポリマー構造」は、共有結合された一連のモノマーを含む構造である。ポリマーは、1つの型のモノマーで構成されたものであってもよく、1種類より多くの型のモノマーで構成されたものであってもよい。したがって、用語「ポリマー」は、コポリマー(例えば、ポリマー全体において異なる型のモノマーが個々の集団で存在しているブロックコポリマー)を包含する。ポリマーは線状であっても分岐型であってもよい。
ポリヌクレオチド−本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドのポリマーである。用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に用いていることがあり得る。該ポリマーは、天然ヌクレオシド(すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン)、ヌクレオシド類似体(例えば、2−アミノアデノシン、2−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、3−メチルアデノシン、5−メチルシチジン、C5−ブロモウリジン、C5−フルオロウリジン、C5−ヨードウリジン、C5−プロピニル−ウリジン、C5−プロピニル−シチジン、C5−メチルシチジン、7−デアザアデノシン、7−デアザグアノシン、8−オキソアデノシン、8−オキソグアノシン、O(6)−メチルグアニン、4−アセチルシチジン、5−(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン、ジヒドロウリジン、メチルプソイドウリジン、1−メチルアデノシン、1−メチルグアノシン、N6−メチルアデノシン、および2−チオシチジン)、化学修飾塩基、生物学的に修飾塩基(例えば、メチル化塩基)、介在(ntercalated)塩基、修飾糖類(例えば、T−フルオロリボース、リボース、2’−デオキシリボース、2’−O−メチルシチジン、アラビノース、およびヘキソース)、または修飾リン酸基(例えば、ホスホロチオエートおよび5’−N−ホスホルアミダイト結合)を含むものであり得る。
ポリペプチド−本明細書で用いる場合、「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマーである。用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、「オリゴペプチド」、および「ペプチド」は、互換的に用いていることがあり得る。ポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸(すなわち、天然には存在しないが、ポリペプチド鎖内に組み込まれ得る化合物)および/または当該技術分野で知られているようなアミノ酸類似体を含むものであり得る。また、ポリペプチドのアミノ酸残基の1つ以上が、例えば、糖鎖基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化または他の修飾のためのリンカーなどの化学的存在体の付加によって修飾されていてもよい。このような修飾としては、ペプチドの環化、D−アミノ酸の組込みなどが挙げられ得る。
多糖−本明細書で用いる場合、「多糖」は、糖質のポリマーである。用語「多糖」、「糖鎖」、および「オリゴ糖」は、互換的に用いていることがあり得る。 該ポリマーは、天然糖質(例えば、アラビノース、リキソース、リボース、キシロース、リブロース、キシルロース、アロース、アルトロース、ガラクトース、グルコース、グロース、イドース、マンノース、タロース、フルクトース、プシコース、ソルボース、タガトース、マンノヘプツロース、セドヘプツロース、オクツロース(octolose)、およびシアロース(sialose))および/または修飾糖質(例えば、2’−フルオロリボース、2’−デオキシリボース、およびヘキソース)を含むものであり得る。例示的な二糖としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ゲンチオビオース、イソマルトース、コージビオース、ラミナリビオース、マンノビオース、メリビオース、ニゲロース、ルチノース、およびキシロビオースが挙げられる。
小分子−本明細書で用いる場合、用語「小分子」は、天然に存在するものであっても、人工的に作出されたものであっても(例えば、化学合成によって)、比較的低い分子量を有する分子をいう。典型的には、小分子は単量体であり、約1,500Da未満の分子量を有する。
処置する−本明細書で用いる場合、用語「処置する」(または「処置すること」、「処置された」、「処置」など)は、病状(例えば、糖尿病)、病状の症状(1つまたは複数)(例えば、高血糖症)、病状に対する素因を軽減する、緩和する、改変する、改善する、好転させる、または影響を及ぼす目的で、処置を必要とする被検体への本開示の物質体の投与をいう。
本出願書類では、特許文献および非特許文献を含むいくつかの文献に言及している。これらの各文献は、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
一態様では、図5に示すように、本開示により、標的分子に結合する多価ポリヌクレオチドアプタマー30;およびコンジュゲート枠組構造に結合された2つ以上の個別の親和性リガンド40を含むコンジュゲート20を含む架橋物質体10であって、該2つ以上の親和性リガンド40は、アプタマー30との結合に関して該標的分子と競合し、異なるコンジュゲート20上の親和性リガンド40とアプタマー30間の非共有結合性相互作用の結果、該物質体10内でコンジュゲート20が架橋される、架橋物質体10を提供する。
このような物質体は、所望の濃度の標的分子に応答した量のコンジュゲートを放出するように設計される。最終適用用途に応じて、種々の実施形態において、該コンジュゲートはまた、薬物および/または検出可能な標識も含む。薬物、検出可能な標識および親和性リガンドは、コンジュゲート枠組構造に、共有結合されていても、非共有結合で結合されていてもよい。また、本開示により、このような物質体の使用方法およびこのような物質体の作製方法を提供する。別の態様では、本開示により、レクチン(Con Aなど)の代わりにグルコース応答性物質体に使用するための例示的なアプタマーを提供する。
アプタマーは、標的分子(例えば、限定されないが、グルコース、ラクテート、ホルモンなど)に結合し、多価である。コンジュゲートは、アプタマーとの結合に関して標的分子と競合する2つ以上の個別の親和性リガンドを有するコンジュゲート枠組構造を含む。アプタマーとコンジュゲートを標的分子の非存在下で合わせると、非共有結合性架橋物質体が形成される。該物質体を遊離標的分子の存在下に入れると、該分子は、アプタマーとコンジュゲート間の相互作用に関して競合する。ある一定濃度より上の遊離標的分子では、競合レベルは、コンジュゲートが放出されることにより、該物質体が分解され始めるようなものになる。その結果、コンジュゲートは該物質体から、標的分子の局所濃度に直接関連する様式で放出される。
ポリヌクレオチドアプタマー
ポリヌクレオチドアプタマーは標的分子に結合し、多価である(すなわち、1つより多くの標的分子に結合し得る)。本開示は、なんら特定の標的分子に限定されない。したがって、種々の実施形態において、標的分子は、代謝産物(例えば、限定されないが、グルコース、葉酸類、乳酸類、グルタミン酸類、グルタミン、ピルビン酸類、クエン酸類、リンゴ酸類、アミノ酸、脂質など)であり得る。他の実施形態において、標的分子は、ホルモン(ペプチド系であっても非ペプチド系であってもよい)、例えば、アドレナリン、ノルアドレナリン、アンギオテンシン、アトリオペプチン、アルドステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、テストステロン、ジヒドロテストステロン、カルシトニン、カルシトリオール、カルシジオール、コルチコトロピン、コルチゾール、ドパミン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、エリトロポイエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒスタミン、ヒト胎盤性ラクトゲン、インスリン、インスリン様増殖因子、成長ホルモン、インヒビン、レプチン、ロイコトリエン、リポトロピン、メラトニン、オレキシン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロゲステロン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、プロスタグランジン(prostglandin)、レニン、セロトニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、サイロキシン、トリヨードサイロニン、バソプレシンなどを含むものであり得る。
ポリヌクレオチドアプタマーは標的分子に結合し、多価である(すなわち、1つより多くの標的分子に結合し得る)。本開示は、なんら特定の標的分子に限定されない。したがって、種々の実施形態において、標的分子は、代謝産物(例えば、限定されないが、グルコース、葉酸類、乳酸類、グルタミン酸類、グルタミン、ピルビン酸類、クエン酸類、リンゴ酸類、アミノ酸、脂質など)であり得る。他の実施形態において、標的分子は、ホルモン(ペプチド系であっても非ペプチド系であってもよい)、例えば、アドレナリン、ノルアドレナリン、アンギオテンシン、アトリオペプチン、アルドステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、テストステロン、ジヒドロテストステロン、カルシトニン、カルシトリオール、カルシジオール、コルチコトロピン、コルチゾール、ドパミン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、エリトロポイエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒスタミン、ヒト胎盤性ラクトゲン、インスリン、インスリン様増殖因子、成長ホルモン、インヒビン、レプチン、ロイコトリエン、リポトロピン、メラトニン、オレキシン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロゲステロン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、プロスタグランジン(prostglandin)、レニン、セロトニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、サイロキシン、トリヨードサイロニン、バソプレシンなどを含むものであり得る。
一般に、まず、一価のアプタマーを、その標的分子に対する結合特性に基づいて作製する。当該技術分野で周知のように、さまざまな標的分子に対するアプタマーが、インビトロ選択プロセスによって作製され得る。例示的な方法を以下の実施例3に記載する。EllingtonおよびSzostak(1990)Nature 346:818;TuerkおよびGold(1990)Science 249:505;ならびに米国特許第5,582,981号も参照のこと。
典型的には、このプロセスは、プライマーとしての機能を果たす一定の5’末端と3’末端にフランキングされた固定長のランダムに作製したポリヌクレオチド配列からなるライブラリーの合成から始める。一部の特定の実施形態では(例えば、アプタマーを最適化する場合)、標的分子に結合することがわかっている配列から始め、出発配列からの限定的な範囲の変化を示すポリヌクレオチドの集合体(例えば、単一変異のランダムな組)を含むライブラリーを作製してもよい。次いで、ライブラリー内の配列は標的分子に曝露され、標的に結合しないものは除去される(例えば、アフィニティクロマトグラフィーによって)。次いで、結合した配列を溶出させ、後続の選択ラウンドの準備のために増幅し(例えば、クローニングの後、転写によって、またはPCRによって)、該選択ラウンドでは、所望の結合親和性および/または特異性を有する配列が同定されるように溶出条件のストリンジェンシーを増大または変更する。Jaroschら(2006)Nucleic Acids Res.34:86には、該プロセスを、該一定のプライマー領域なしで行なうことが可能な方法が記載されている。
種々の実施形態において、該選択プロセスは、標的分子に対して高い親和性を有するアプタマーを選択するために、溶出条件のストリンジェンシーを徐々に増大させる工程を伴うものであり得る。
種々の実施形態において、該選択プロセスは、標的分子に対して所望の特異性を有するアプタマーを選択するために、溶出条件を変更する工程を伴うものであり得る(例えば、異なるアフィニティカラムの使用によって)。
種々の実施形態において、該選択プロセスは、各々が標的分子に対して同様の親和性および/または特異性を有するアプタマーを含む下位ライブラリー(または「プール」)の集合体を作製するものであり得る。種々の実施形態において、該選択プロセスは、単一のアプタマー配列(または「モノクローナル」)を作製するものであり得る。種々の実施形態において、アプタマーはDNA系である。種々の実施形態において、アプタマーはRNA系である。種々の実施形態において、アプタマーは、混合型RNA/DNAアプタマーである。
多価のアプタマーは、2つ以上のこのような一価のアプタマーを共有結合または非共有結合により連結し、単一の構築物にすることにより作製され得る。例示的な方法を以下の実施例4に記載する。典型的には、2つ以上のアプタマー(同じ配列を有するものであっても異なる配列を有するものであってもよい)は、互いに直接結合され得るか(例えば、カップリング剤によって)、または独立した枠組構造を介して間接的に連結され得る。種々の実施形態において、2、3、4、5、6、7または8個のアプタマーが単一の構築物に結合され得る。種々の実施形態において、2、3、4、5、6、7または8個のアプタマーは、同じ配列を有するものであり得る。このようなアプローチのいずれか1つにおいて、カップリング前に、アプタマーを化学修飾することが必要な場合があり得る(例えば、反応性懸垂基を含めるため)ことは認識されよう。また、本開示のアプタマーは、特定のカップリング反応または枠組構造に限定されない(例えば、該アプタマーは、ポリマー構造および/または非ポリマー構造を含む枠組構造を用いて調製されるものであってもよい)ことも認識されよう。さらに、枠組構造は線状、分岐、樹枝状および/またはこれらの組合せであり得ることが認識されよう。例示的な枠組構造およびカップリング化学反応を、以下に、該コンジュゲートとの関連において記載する。
種々の実施形態において、アプタマーが互いに、または枠組構造に共有結合される。かかる実施形態において、アプタマーは、直接結合されていてもよく(すなわち、介在化学基なしで)、スペーサー(例えば、アプタマー同士、またはアプタマーと枠組構造との間に、ある程度の物理的隔離をもたらすカップリング剤または共有結合鎖)を介して間接的に結合されていてもよい。以下に、該コンジュゲートとの関連において論考するように、アプタマーは互いに、または枠組構造に、任意の数の化学結合、例えば限定されないが、アミド、エステル、エーテル、イソ尿素およびイミン結合によって共有結合され得ることは理解されよう。
種々の実施形態において、2つ以上のアプタマーが互いに、または枠組構造に非共有結合される。一部の特定の実施形態では、ヒト血清中での該非共有結合の解離定数(Kd)が1pmol/L未満である。例えば、該タンパク質は互いに、または枠組構造に、当該技術分野でよく知られた非共有結合性のリガンド−受容体ペア(例えば、限定されないが、ビオチン−アビジン系ペア)によって非共有結合され得る。かかる実施形態では、リガンド受容体ペアの一方の構成員が一方のアプタマーに共有結合され、該ペアの他方の構成員が他方のアプタマーまたは枠組構造に共有結合される。アプタマー(またはアプタマーと枠組構造)を合わせると、リガンドとその受容体間の強力な非共有結合性相互作用によって、アプタマーが互いに(または枠組構造に)非共有結合で結合された状態になる。典型的なリガンド/受容体ペアとしては、タンパク質/補因子および酵素/基質のペアが挙げられる。よく使用されるビオチン/アビジンペアの他に、このようなペアとしては、限定されないが、ビオチン/ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン/抗ジゴキシゲニン、FK506/FK506結合タンパク質(FKBP)、ラパマイシン/FKBP、シクロフィリン/シクロスポリン、およびグルタチオン/グルタチオントランスフェラーゼのペアが挙げられる。他にも適当なリガンド/受容体ペア、例えば、限定されないが、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、c−myc、FLAG(登録商標)、さらには、Kessler pp.105−152、Advances in Mutagenesis」Kessler編、Springer−Verlag,1990;「Affinity Chromatography:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)」、Pascal Baillon編、Humana Press、2000;およびHermansonらによる「Immobilized Affinity Ligand Techniques」、Academic Press,1992に記載のものなどのエピトープタグとのペアでのモノクローナル抗体が当業者に認識され得よう。
種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号1、2、3、4、5、6または7の少なくとも40、50、60、70または80個の連続するヌクレオチドを含む(図2参照)。種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号1、2、3、4、5、6または7の少なくとも40、50、60、70または80個の連続するヌクレオチドと少なくとも70%の相同性を有する1つ以上の領域を含む。種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号1、2、3、4、5、6または7の少なくとも40、50、60、70または80個の連続するヌクレオチドと少なくとも80%の相同性を有する1つ以上の領域を含む。種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号1、2、3、4、5、6または7の少なくとも40、50、60、70または80個の連続するヌクレオチドと少なくとも90%の相同性を有する1つ以上の領域を含む。種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号1、2、3、4、5、6または7の少なくとも40、50、60、70または80個の連続するヌクレオチドと少なくとも95%の相同性を有する1つ以上の領域を含む。一部の特定の実施形態では、多価アプタマーは、前述のヌクレオチド配列のいずれか1つを2コピー以上含むものであってもよい。
種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号8、9または10のヌクレオチド配列を含む。
配列番号8は、配列番号2、3、5、7の各中央(すなわち、非プライマー)領域を主体とするコンセンサス配列である(図2参照)。配列番号9は、配列番号4の中央領域が主体である。配列番号10は、配列番号6の中央領域が主体である。一部の特定の実施形態では、多価アプタマーは、配列番号8、9または10のヌクレオチド配列を2コピー以上含むものであってもよい。
一部の特定の実施形態では、該ヌクレオチド配列はRNA配列であり、N=Uである。一部の特定の実施形態では、該ヌクレオチド配列はDNA配列であり、N=Tである。
一部の特定の実施形態では、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、Y=U/Tである配列番号8のヌクレオチド配列を含む。一部の特定の実施形態では、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、Y=Cである配列番号8のヌクレオチド配列を含む。一部の特定の実施形態では、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、Y(6)=U/TおよびY(17−18)=Cである配列番号8のヌクレオチド配列を含む。一部の特定の実施形態では、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、R=Aである配列番号8のヌクレオチド配列を含む。一部の特定の実施形態では、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、R=Gである配列番号8のヌクレオチド配列を含む。
種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号8、9または10の少なくとも30個の連続するヌクレオチドと少なくとも70%の相同性を有する1つ以上の領域を含む。種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号8、9または10の少なくとも30個の連続するヌクレオチドと少なくとも80%の相同性を有する1つ以上の領域を含む。種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号8、9または10の少なくとも30個の連続するヌクレオチドと少なくとも90%の相同性を有する1つ以上の領域を含む。種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号8、9または10の少なくとも30個の連続するヌクレオチドと少なくとも95%の相同性を有する1つ以上の領域を含む。
種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号8、9または10と少なくとも70%の相同性を有する1つ以上の領域を含む。種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号8、9または10と少なくとも80%の相同性を有する1つ以上の領域を含む。種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号8、9または10と少なくとも90%の相同性を有する1つ以上の領域を含む。種々の実施形態において、本開示の多価アプタマーはグルコースに結合し、配列番号8、9または10と少なくとも95%の相同性を有する1つ以上の領域を含む。
種々の実施形態において、本開示により、グルコースに結合し、各々、独立して、配列番号8、9または10の少なくとも30個の連続するヌクレオチドと少なくとも70%の相同性を有する領域を含む一価アプタマーのプールを提供する。種々の実施形態において、本開示により、グルコースに結合し、各々、独立して、配列番号8、9または10の少なくとも30個の連続するヌクレオチドと少なくとも80%の相同性を有する領域を含む一価アプタマーのプールを提供する。種々の実施形態において、本開示により、グルコースに結合し、各々、独立して、配列番号8、9または10の少なくとも30個の連続するヌクレオチドと少なくとも90%の相同性を有する領域を含む一価アプタマーのプールを提供する。種々の実施形態において、本開示により、グルコースに結合し、各々、独立して、配列番号8、9または10の少なくとも30個の連続するヌクレオチドと少なくとも95%の相同性を有する領域を含む一価アプタマーのプールを提供する。一部の特定の実施形態では、該プールは、10個より多く、20個より多く、50個より多く、または100個より多くの一価アプタマーを含むものである。
種々の実施形態において、本開示により、グルコースに結合し、各々、独立して、配列番号8、9または10と少なくとも70%の相同性を有する領域を含む一価アプタマーのプールを提供する。種々の実施形態において、本開示により、グルコースに結合し、各々、独立して、配列番号8、9または10と少なくとも80%の相同性を有する領域を含む一価アプタマーのプールを提供する。種々の実施形態において、本開示により、グルコースに結合し、各々、独立して、配列番号8、9または10と少なくとも90%の相同性を有する領域を含む一価アプタマーのプールを提供する。種々の実施形態において、本開示により、グルコースに結合し、各々、独立して、配列番号8、9または10と少なくとも95%の相同性を有する領域を含む一価アプタマーのプールを提供する。一部の特定の実施形態では、該プールは、10個より多く、20個より多く、50個より多く、または100個より多くの一価アプタマーを含むものである。
コンジュゲート
該コンジュゲートは、コンジュゲート枠組構造に結合された個別の親和性リガンドを2つ以上含む。該2つ以上の個別の親和性リガンドは、アプタマーとの結合に関して標的分子と競合する。また、最終適用用途に応じて、該コンジュゲートは、治療用薬剤および/または検出可能な標識を含むものであってもよい。親和性リガンド、薬物、および/または検出可能な標識は、コンジュゲート枠組構造に、共有結合されていても、非共有結合で結合されていてもよい。
該コンジュゲートは、コンジュゲート枠組構造に結合された個別の親和性リガンドを2つ以上含む。該2つ以上の個別の親和性リガンドは、アプタマーとの結合に関して標的分子と競合する。また、最終適用用途に応じて、該コンジュゲートは、治療用薬剤および/または検出可能な標識を含むものであってもよい。親和性リガンド、薬物、および/または検出可能な標識は、コンジュゲート枠組構造に、共有結合されていても、非共有結合で結合されていてもよい。
親和性リガンド
2つ以上の個別の親和性リガンドは、同じ化学構造を有するものであっても、異なる化学構造を有するものであってもよい。2つ以上の個別の親和性リガンドは、標的分子自体と同じ化学構造を有するものであっても、標的分子の化学的に関連した種であってもよい。唯一の要件は、該リガンドが、アプタマーとの結合に関して標的分子と競合することである。一部の特定の実施形態では、アプタマーに対する該コンジュゲートおよび標的分子の相対親和性は、1:1〜100:1の範囲である(この場合、100:1の相対親和性は、コンジュゲート、標的分子およびアプタマーの平衡混合物において(pH7のHEPES緩衝生理食塩水中、37Cで)、標的分子の濃度がコンジュゲートの濃度の100倍である場合、アプタマーが、ほぼ等モル量のコンジュゲートおよび標的分子に結合することを意味する)。一部の特定の実施形態では、この相対親和性は1:1〜50:1、1:1〜10:1、1:1〜5:1または1:1〜2:1の範囲である。種々の実施形態において、例えば、該コンジュゲートおよび標的分子に対するアプタマーの相対親和性を微調整するために、親和性リガンドが標的分子と異なる化学構造を有することが好都合な場合がある。例えば、標的分子がグルコースである場合、1つ以上の該親和性リガンドとして糖質または多糖が使用され得る。例えば、標的分子がグルコースである場合、親和性リガンドとしては、糖が挙げられ得る。したがって、一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは、本開示のアプタマーに対する結合に関してグルコースと競合し得るものである。
2つ以上の個別の親和性リガンドは、同じ化学構造を有するものであっても、異なる化学構造を有するものであってもよい。2つ以上の個別の親和性リガンドは、標的分子自体と同じ化学構造を有するものであっても、標的分子の化学的に関連した種であってもよい。唯一の要件は、該リガンドが、アプタマーとの結合に関して標的分子と競合することである。一部の特定の実施形態では、アプタマーに対する該コンジュゲートおよび標的分子の相対親和性は、1:1〜100:1の範囲である(この場合、100:1の相対親和性は、コンジュゲート、標的分子およびアプタマーの平衡混合物において(pH7のHEPES緩衝生理食塩水中、37Cで)、標的分子の濃度がコンジュゲートの濃度の100倍である場合、アプタマーが、ほぼ等モル量のコンジュゲートおよび標的分子に結合することを意味する)。一部の特定の実施形態では、この相対親和性は1:1〜50:1、1:1〜10:1、1:1〜5:1または1:1〜2:1の範囲である。種々の実施形態において、例えば、該コンジュゲートおよび標的分子に対するアプタマーの相対親和性を微調整するために、親和性リガンドが標的分子と異なる化学構造を有することが好都合な場合がある。例えば、標的分子がグルコースである場合、1つ以上の該親和性リガンドとして糖質または多糖が使用され得る。例えば、標的分子がグルコースである場合、親和性リガンドとしては、糖が挙げられ得る。したがって、一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは、本開示のアプタマーに対する結合に関してグルコースと競合し得るものである。
(式中:
各R1は、独立して、水素、−ORy、−N(Ry)2、−SRy、−O−Y、−G−Z、または−CH2Rxであり;
各Rxは、独立して、水素、−ORy、−N(Ry)2、−SRy、または−O−Yであり;
各Ryは、独立して、−R2、−SO2R2、−S(O)R2、−P(O)(OR2)2、−C(O)R2、−CO2R2、または−C(O)N(R2)2であり;
各Yは、独立して、単糖、二糖または三糖であり;
各Gは、独立して、共有結合であるか、または任意選択で置換されているC1〜9アルキレンであり、ここで、Gの1つ以上のメチレン単位は、任意選択で、−O−、−S−、−N(R2)−、−C(O)−、−OC(O)−、−C(O)O−、−C(O)N(R2)−、−N(R2)C(O)−、−N(R2)C(O)N(R2)−、−SO2−、−SO2N(R2)−、−N(R2)SO2−、または−N(R2)SO2N(R2)−で置き換えられており;
各Zは、独立して、ハロゲン、−N(R2)2、−OR2、−SR2、−N3、−C≡CR2、−CO2R2、−C(O)R2、または−OSO2R2であり;
各R2は、独立して、水素であるか、またはC1〜6脂肪族、フェニル、窒素、酸素もしくはイオウから選択される1〜2個のヘテロ原子を有する4〜7員の複素環式の環、または窒素、酸素もしくはイオウから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する5〜6員の単環式のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換されている基である)のものである。
各R1は、独立して、水素、−ORy、−N(Ry)2、−SRy、−O−Y、−G−Z、または−CH2Rxであり;
各Rxは、独立して、水素、−ORy、−N(Ry)2、−SRy、または−O−Yであり;
各Ryは、独立して、−R2、−SO2R2、−S(O)R2、−P(O)(OR2)2、−C(O)R2、−CO2R2、または−C(O)N(R2)2であり;
各Yは、独立して、単糖、二糖または三糖であり;
各Gは、独立して、共有結合であるか、または任意選択で置換されているC1〜9アルキレンであり、ここで、Gの1つ以上のメチレン単位は、任意選択で、−O−、−S−、−N(R2)−、−C(O)−、−OC(O)−、−C(O)O−、−C(O)N(R2)−、−N(R2)C(O)−、−N(R2)C(O)N(R2)−、−SO2−、−SO2N(R2)−、−N(R2)SO2−、または−N(R2)SO2N(R2)−で置き換えられており;
各Zは、独立して、ハロゲン、−N(R2)2、−OR2、−SR2、−N3、−C≡CR2、−CO2R2、−C(O)R2、または−OSO2R2であり;
各R2は、独立して、水素であるか、またはC1〜6脂肪族、フェニル、窒素、酸素もしくはイオウから選択される1〜2個のヘテロ原子を有する4〜7員の複素環式の環、または窒素、酸素もしくはイオウから選択される1〜4個のヘテロ原子を有する5〜6員の単環式のヘテロアリール環から選択される、任意選択で置換されている基である)のものである。
一部の特定の実施形態では、式(IVa)または(IVb)の親和性リガンドは単糖である。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは二糖である。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは三糖である。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは四糖である。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは、4個以下の糖質部分を含むものである。
上記に一般的に定義したように、各R1は、独立して、水素、−ORy、−N(Ry)2、−SRy、−O−Y、−G−Z、または−CH2Rxである。一部の特定の実施形態では、R1は水素である。一部の特定の実施形態では、R1は−OHである。他の実施形態では、R1は−NHC(O)CH3である。一部の特定の実施形態では、R1は−O−Yである。一部の特定の他の実施形態では、R1は−G−Zである。一部の実施形態では、R1は−CH2OHである。他の実施形態では、R1は−CH2−O−Yである。また他の実施形態では、R1は−NH2である。当業者には、式(IVa)または(IVb)における各R1置換基が(R)または(S)の立体化学構造であり得ることが認識されよう。
上記に一般的に定義したように、各Rxは、独立して、水素、−ORy、−N(Ry)2、−SRy、または−O−Yである。一部の実施形態では、Rxは水素である。一部の特定の実施形態では、Rxは−OHである。他の実施形態では、Rxは−O−Yである。
上記に一般的に定義したように、各Ryは、独立して、−R2、−SO2R2、−S(O)R2、−P(O)(OR2)2、−C(O)R2、−CO2R2、または−C(O)N(R2)2である。一部の実施形態では、Ryは水素である。他の実施形態では、Ryは−R2である。一部の実施形態では、Ryは−C(O)R2である。一部の特定の実施形態では、Ryはアセチルである。他の実施形態では、Ryは、−SO2R2、−S(O)R2、−P(O)(OR2)2、−CO2R2、または−C(O)N(R2)2である。
上記に一般的に定義したように、Yは単糖、二糖または三糖である。一部の特定の実施形態では、Yは単糖である。一部の実施形態では、Yは二糖である。他の実施形態では、Yは三糖である。一部の実施形態では、Yは、マンノース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラムノース、またはキシロピラノースである。一部の実施形態では、Yは、スクロース、マルトース、ツラノース、トレハロース、セロビオース、またはラクトースである。一部の特定の実施形態では、Yはマンノースである。一部の特定の実施形態では、YはD−マンノースである。当業者には、糖Yが、−O−Yの酸素基にアノマー炭素を介して結合され、グリコシド結合を形成していることが認識されよう。グリコシド結合は、α立体配置であってもβ立体配置であってもよい。
上記に一般的に定義したように、各Gは、独立して、共有結合であるか、または任意選択で置換されているC1〜9アルキレンであり、ここで、Gの1つ以上のメチレン単位は、任意選択で、−O−、−S−、−N(R2)−、−C(O)−、−OC(O)−、−C(O)O−、−C(O)N(R2)−、−N(R2)C(O)−、−N(R2)C(O)N(R2)−、−SO2−、−SO2N(R2)−、−N(R2)SO2−または−N(R2)SO2N(R2)−で置き換えられている。一部の実施形態では、Gは二重結合である。一部の特定の実施形態では、Gは−O−C1〜8アルキレンである。一部の特定の実施形態では、Gは−OCH2CH2−である。
上記に一般的に定義したように、各Zは、独立して、ハロゲン、−N(R2)2、−OR2、−SR2、−N3、−C≡CR2、−CO2R2、−C(O)R2、または−OSO2R2である。一部の実施形態では、Zは、ハロゲンまたは−OSO2R2である。他の実施形態では、Zは、−N3または−C≡CR2である。一部の特定の実施形態では、Zは、−N(R2)2、−OR2、または−SR2である。一部の特定の実施形態では、Zは−SHである。一部の特定の実施形態では、Zは−NH2である。一部の特定の実施形態では、−G−Zは−OCH2CH2NH2である。
(式中、R1、GおよびZは、本明細書において定義および記載のとおりである)の化合物が得られる。
(式中、R1、Rx、GおよびZは、本明細書において定義および記載のとおりである)のものである。
例えば、一部の特定の実施形態では、以下:グルコース、スクロース、マルトース、マンノース、これらの誘導体(例えば、グルコサミン、マンノサミン、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコース、エチルマンノースなど)および/またはこれらの高次の組合せ(例えば、ビマンノース、線状および/または分岐のトリマンノースなど)の1種類以上を含む親和性リガンドが使用され得る。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは単糖を含む。一部の特定の実施形態では、親和性リガンド二糖を含む。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは三糖を含む。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは多糖を含む。一部の実施形態では、親和性リガンドは糖と1つ以上のアミン基を含む。一部の実施形態では、親和性リガンドはアミノエチルグルコース(AEG)である。一部の実施形態では、親和性リガンドはアミノエチルマンノース(AEM)である。一部の実施形態では、親和性リガンドはアミノエチルビマンノース(AEBM)である。一部の実施形態では、親和性リガンドはアミノエチルトリマンノース(AETM)である。一部の実施形態では、親和性リガンドはβ−アミノエチル−N−アセチルグルコサミン(AEGA)である。一部の実施形態では、親和性リガンドはアミノエチルフコース(AEF)である。他の実施形態では、親和性リガンドはD−グルコサミン(GA)である。一部の特定の実施形態では、糖リガンドはD立体配置である。他の実施形態では、糖リガンドはL立体配置である。以下に、本発明らは、これらの例示的な親和性リガンドの構造を示す。他の例示的な親和性リガンドは、当業者に認識されよう。
種々の実施形態において、該親和性リガンドは、多糖、糖ペプチドまたは糖脂質である。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドは、2〜10個の糖質部分、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の該部分を含む。多糖、糖ペプチドまたは糖脂質の末端および/または内部残基は、対象とするアプタマーの糖特異性に基づいて選択され得る(例えば、Goldsteinら、Biochem.Biophys.Acta 317:500−504、1973およびLisら、Ann.Rev.Biochem.55:35−67、1986を参照のこと)。
種々の実施形態において、特定のコンジュゲート/アプタマーの組合せに対する親和性リガンドは、実験に基づいて選択され得る。かかる実施形態によれば、1つ以上の親和性リガンドが、グルコースと比較したときのアプタマーに対する相対結合親和性に基づいてスクリーニングされる。一部の特定の実施形態では、糖質および/または多糖類のライブラリーが、この様式でスクリーニングされる。適当な親和性リガンドは、グルコースとの検出可能なレベルの競合を示すが、アプタマーとグルコース間の結合を完全に妨げるほど強くは競合しない。
他の例示的な標的分子/親和性リガンドの組合せは当業者に認識されよう。一般に、親和性リガンドは、標的分子自体を用いて、および/または標的分子の誘導体を作製することにより(例えば、標的分子に対して化学修飾および/または立体化学修飾を行ない、次いで、得られた誘導体を、対象とするアプタマーに対する相対親和性に関してスクリーニングすることにより)、任意の標的分子に対して作製され得る。
より詳細に以下に論考するように、親和性リガンドは、コンジュゲートの枠組構造内に天然に存在するものであってもよい(例えば、ポリマー主鎖の一部として、またはモノマーの側鎖基として)。択一的に(または付加的に)、親和性リガンドは、コンジュゲートの枠組構造内に人工的に組み込まれたものであってもよい(例えば、コンジュゲートの枠組構造に合成的に付加された化学基の形態で)。一部の特定の実施形態では、コンジュゲートは、5個以上、10個以上、20個以上、25個以上、50個以上、または100個以上の親和性リガンドを含む枠組構造を含むものであり得る。一部の特定の実施形態では、コンジュゲートは、2〜5、2〜10、2〜20、2〜25、2〜50または2〜100個の親和性リガンドを含む枠組構造を含むものであり得る。一部の特定の実施形態では、コンジュゲートは、わずか2、3または4個程度の個別の親和性リガンドを含む枠組構造を含むものであり得る。
親和性リガンドをコンジュゲート枠組構造にコンジュゲートさせるための方法は、より詳細に以下に論考する。一部の特定の実施形態では、親和性リガンドが糖を含む場合、コンジュゲーション(直接であれ間接であれ)には、糖のC1、C2またはC6位が関与する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲーションはC1位が関与するものである。C1位は、アノマー炭素とも称され、コンジュゲートの枠組構造に、αまたはβコンホメーションで連結され得る。一部の特定の実施形態では、C1位はαアノマーとして構成される。他の実施形態では、C1位はβアノマーとして構成される。
薬物
上記のように、種々の実施形態において、コンジュゲートは薬物を含むものであり得る。例えば、薬物は、該物質体が治療目的に使用される場合、例えば、薬物を患者に制御可能に送達するために含まれ得る。コンジュゲートには任意の薬物が含まれ得ることは理解されよう。コンジュゲートは、同じ薬物を1コピーより多く含むものであり得、および/または1種類より多くの型の薬物を含むものであり得る。コンジュゲートは、いかなる特定の薬物にも限定されず、小分子薬または生体分子薬を含むものであってもよい。一般に、使用される薬物(1種類または複数種)は、処置対象の疾患または障害に依存する。
上記のように、種々の実施形態において、コンジュゲートは薬物を含むものであり得る。例えば、薬物は、該物質体が治療目的に使用される場合、例えば、薬物を患者に制御可能に送達するために含まれ得る。コンジュゲートには任意の薬物が含まれ得ることは理解されよう。コンジュゲートは、同じ薬物を1コピーより多く含むものであり得、および/または1種類より多くの型の薬物を含むものであり得る。コンジュゲートは、いかなる特定の薬物にも限定されず、小分子薬または生体分子薬を含むものであってもよい。一般に、使用される薬物(1種類または複数種)は、処置対象の疾患または障害に依存する。
例えば、限定されないが、種々の実施形態において、コンジュゲートは、以下の薬物:ジクロフェナク、ニフェジピン、リバスチグミン、メチルフェニデート、フルオキセチン、ロシグリタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、コデイン、エチルモルヒネ、デキストロメトルファン、ノスカピン、ペントキシベリン(pentoxiverine)、アセチルシステイン、ブロムヘキシン、エピネフリン、イソプレナリン、オルシプレナリン、エフェドリン、フェノテロール、リミテロール、イプラトロピウム、コリンテオフィリネート、プロキシフィリン、ベクロメタゾン、ブデソニド、デスラノシド、ジゴキシン、ジギトキシン、ジソピラミド、プロスシラリジン、キニジン、プロカインアミド、メキシレチン、フレカイニド、アルプレノロール、プロプラノロール(proproanolol)、ナドロール、ピンドロール、オクスプレノロール、ラベタロール、チモロール、アテノロール、四硝酸ペンタエリスリトール、硝酸イソソルビド、イソソルビドモノニトラート、ニフェジピン、フェニルアミン、ベラパミル、ジルチアゼム、シクランデラール(cyclandelar)、ニコチニルアルコール、ニコチン酸イノシトール、アルプロスタジル(alprostatdil)、エチレフリン、プレナルテロール、ドブタミン、ドパミン、ジヒドロエルゴタミン、グアネチジン、ベタニジン、メチルドパ、レセルピン、グアンファシン、トリメタファン、ヒドララジン、ジヒドララジン、プラゾシン、ジアゾキサイド、カプトプリル、ニフェジピン、エナラプリル、ニトロプルシド、ベンドロフルメチアジド、ヒドロクロロチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、クロルタリドン、シネタゾン、クロパミド、メフルシド、メトラゾン、ブメタニド、エタクリナシド、スピロノラクトン、アミロリド、クロフィブラート、ニコチン酸、ニケリトロール(nicheritrol)、ブロモフェニルアミン、シンナリジン、デキシクロルフェニラミン、クレマスチン、アンタリン、シプロヘプタジン、プロメタジン(proethazine)、シメチジン、ラニチジン、スクラルファート、パパベリン、モキサベリン、アトロピン、ブチルスコポラミン、エメプロン、グルコピロン、ヒヨスチアミン、メペンソラール、メチルスコポラミン、オキシフェンサイクリミン、プロバンテリン、テロジリン、センナグリコシド、サグラダエキストラクト、ダントロン、ビサコジル、ピコスルファートナトリウム、エチュロス、ジフェノキシレート(diphenolxylate)、ロペラミド、サラゾスルファピリジン、ピルヴィン、メベンダゾール、ジメチコン、フェロフマレート、フェロサクシネート、フェリテトラセミナトリウム、シアノコバラミン、葉酸ヘパリン、ヘパリン補因子、ジクルマロール、ワルファリン、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、第VIII因子、第IX因子、ビタミンK、チオテパ、ブスルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、カルムスチン、メルカプトプリン、チオグアニン、アザチオプリン、シタラビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、プロカルバジン、ダカルバジン、ロムスチン、エストラムスチン、テニポシド、エトポシド、シスプラチン、アムサクリン、アミノグルテチミド、ホスフェストロール、メドロキシプログレステロン(medroxiprogresterone)、ヒドロキシプロゲステロン、メゲステロール、ノレチステロン、タモキシフェン、シクロスポリン、スルフィソミジン、ベンシルペニシリン、フェノキシメチルペニシリン、ジクロキサシリン、クロキサシリン、フルクロキサシリン、アンピシリン、アモキシリン、ピバンピシリン、バカンピシリン、ピペラシリン、メジオシリン、メシリナム、ピブメシリナム、セファロチン、セファレキシン、セフラジン、セファドロキシル、セファクロル、セフロキシム、セフォタキシム、セフタジジム、セフォキシチン、アズトレオナム、イミペネム、シラスタチン、テトラサイクリン、リメサイクリン、デメクロサイクリン、メタサイクリン、オキシテトラサイクリン、ドキシサイクリン、クロルアンフェニコール、スピラマイシン、フシジン酸、リンコマイシン、クリンダマイシン、スペクチノマイシン、リファンピシン、アンフォテリシンB、グリセオフルビン、ニスタチン、バンコマイシン、メトロニダゾール、チニダゾール、トリメトプリム、ノルフロキサシン、サラゾスルファピリジン、アミノサリル、イソニアジド、エタンブトール(etambutol)、ニトロフラントイン、ナリジクス酸、メテナミン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、チニダゾール、ケトコナゾール、アシクロビル、インターフェロン、イドクスウリジン、レチノール、チアミン、デキスパンテノール、ピリドキシン、葉酸、アスコルビン酸、トコフェロール、フィトミナジオン、フェンフルナミン、コルチコトロピン、テトラコサクチド、チロトロピン、ソマトトロピン、ソマトレム、バソプレシン、リプレシン、デスモプレシン、オキシトシン、クロリオンゴナドトロピン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、フルドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、フルオキシメステロン、メステロロン、ナンドロロン、スタノゾロール、オキシメトロン、シプロテロン、レボチロキシン、リオチロニン、プロピルチオウラシル、カルビマゾール、チアマゾール、ジヒドロタキステロール、アルファカルシドール、カルシチロール、インスリン、トルブタミド、クロルプロパミド、トラズアミド、グリピジド、グリベンクラミド、フェノバルビタール、メチプリロン、ピリチルジオン、メプロバメート、クロルジアゼポキシド、ジアゼパム、ニトラゼパム、バクロフェン、オキサゼパム、クロラゼプ酸二カリウム(dikaliumclorazepat)、ロラゼパム、フルニトラゼパム、アルプラゾラム、ミダゾラム、ヒドロキシジン、クロメチアゾール、プロピオンマジン、アリメマジン、クロルプロマジン、レボメプロマジン、アセトフェナジン、フルフェナジン、ペルフェナジン、プロクロルペナジン、トリフルオペラジン、ジキシラジン、チオリダジン(thiodirazine)、ペリシアジン、クロプロチキセン(chloprothixene)、チザニジン、ザレプロン、ズクロペンチゾール、フルペンチゾール、チチキセン、ハロペリドール、トリミプラミン、オピプラモール、クロミプラミン、デシプラミン、ロフェプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、マプトロチリン、カフェイン、シンナリジン、サイクリジン、メンヒドリナート(dimenhydinate)、メクロジン、プロメタジン、チエチルペラジン、メトクロプラミド、スコポラミン、フェノバルビタール、フェニトイン、エトスクシミド、プリミドン、カルバマゼピン、クロナゼパム、オルフェナドリン、アトロピン、ベンサトロピン、ビペリデン、メチキセン、プロシリジン、レボドパ、ブロモクリプチン、アマンタジン、アンベノン、ピリドスチグミン、シンスチグミン、ジスルフィラム、モルヒネ、コデイン、ペンタゾシン、ブプレノルフィン、ペチジン、フェノペリジンフェンタニル、メタドン、ピリトラミド、デキストロプロポキシフェン、ケトベミドン、アセチルサリチル酸、セレコキシブ、フェナゾン、フェニルブタゾン、アザプロパゾンピロキシカム、エルゴタミン、ジヒドロエルゴタミン、シプロヘプタジン、ピジチフェン、フルメドロキソン、アロプリノール、プロベネシド、金チオリンゴ酸ナトリウム、アウラノフィン(auronofin)、ペニシラミン、エストロジオール、吉草酸エストラジオール、エストリオール、エチニルエストラジオール、ジヒドロゲステロン、リネストレノール、メドロキシプログレステロン、ノルエチステロン、シクロフェニル、クロミフェン、レボノルゲストレル、メストラノール、オルニダゾール、チニダゾール、エコナゾール、クロトリマゾール、レボノルゲストレル、メストラノール、オルニダゾール、チニダゾール、エコナゾール、クロトリマゾール、ナタマイシン、ミコナゾール、スルベンチン、メチルエルゴタミン、ジノプロスト、ジノプロストン、ゲメプロスト、ブロモクリプチン、フェニルプロパノールアミン、クロモグリク酸ナトリウム、アセタゾラミド、ジクロフェナミド、ベータカロテン、ナロキソン、ホリナートカルシウム、特にクロニジン、テオフィリン、ジピラダモール、ヒドロクロルチアジド、スコポルアミン、インドメタシン、フロセミド、塩化カリウム、モルヒネ、イブプロフェン、サルブタモール、テルブタリンカルシトニンなどのいずれか1つを含むものであり得る。この列挙は例示を意図していること、および既知のものであれ、後に見い出されるものものであれ、任意の薬物が本開示のコンジュゲートに使用され得ることは理解されよう。
種々の実施形態において、コンジュゲートは、ホルモン薬(ペプチド系であっても非ペプチド系であってもよい)、例えば、アドレナリン、ノルアドレナリン、アンギオテンシン、アトリオペプチン、アルドステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、テストステロン、ジヒドロテストステロン、カルシトニン、カルシトリオール、カルシジオール、コルチコトロピン、コルチゾール、ドパミン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、エリトロポイエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒスタミン、ヒト胎盤性ラクトゲン、インスリン、インスリン様増殖因子、インヒビン、レプチン、ロイコトリエン、リポトロピン、メラトニン、オレキシン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロゲステロン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、プロスタグランジン(prostglandin)、レニン、セロトニン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン(または甲状腺刺激ホルモン)、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、サイロキシン、トリヨードサイロニン、バソプレシンなどであり得る。一部の特定の実施形態では、ホルモンは、グルカゴン、インスリン、インスリン様増殖因子、レプチン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン(または甲状腺刺激ホルモン)、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、サイロキシン、およびトリヨードサイロニンから選択され得る。この列挙は例示を意図していること、および既知のものであれ、後に見い出されるものであれ、任意のホルモン薬が本開示のコンジュゲートに使用され得ることは理解されよう。
種々の実施形態において、コンジュゲートは甲状腺ホルモンを含むものであり得る。
種々の実施形態において、コンジュゲートは抗糖尿病薬(すなわち、糖尿病に苦しむ患者に対して有益な効果を有する薬物)を含むものであり得る。
種々の実施形態において、コンジュゲートはインスリン分子を含むものであり得る。「インスリン分子」により、本発明者らは、生理活性である(すなわち、インビボで投与したとき、検出可能なグルコースの低減を引き起こし得る)限り、野生型インスリンおよび修飾型インスリンのどちらも包含することを意図する。野生型インスリンとしては、精製型であれ、合成型であれ、組換え型であれ、任意の種由来のインスリンが挙げられる(例えば、ヒトインスリン、ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、ヒツジインスリンなど)。これらのいくつかは市販されており、例えばSigma−Aldrich(St.Louis、MO)から入手可能である。さまざまな修飾型インスリンが当該技術分野で知られている(例えば、CrottyおよびReynolds、Pediatr.Emerg.Care.23:903−905、2007、ならびにGerich、Am.J.Med.113:308〜16,2002、ならびにそこに挙げられた参考文献を参照のこと)。修飾型インスリンは、化学修飾されたもの(例えば、PEG基もしくは後述する脂肪族アシル鎖などの化学部分の付加によって)および/または変異されたもの(すなわち、1つ以上のアミノ酸の付加、欠失もしくは置換によって)であり得る。一般に、生理活性のある変異型形態のインスリンは、典型的には、野生型インスリンと1〜10(例えば、1〜5または1〜2)個のアミノ酸の置換、付加または欠失により異なる。ヒトインスリンの野生型配列(A鎖およびB鎖)を、以下の説明および図6に示す。
A−鎖(配列番号:11):GIVEQCCTSICSLYQLENYCN
B−鎖(配列番号:12):FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT
ヒトインスリンは、ウサギ、ブタ、ウシ、およびヒツジインスリンとアミノ酸A8、A9、A10、およびB30のみが異なる(以下の表を参照のこと)。
種々の実施形態において、本開示のインスリン分子は、Bペプチド配列のB28位および/またはB29位が変異されたものである。例えば、インスリンリスプロ(HUMALOG(登録商標))は、BペプチドのC末端の最後から2番目のリジンとプロリン残基が逆転した速効性インスリン変異型(LysB28ProB29−ヒトインスリン)である。この修飾により、インスリン多量体の形成がブロックされる。インスリンアスパルト(NOVOLOG(登録商標))は、B28位のプロリンがアスパラギン酸で置換された別の速効性インスリン変異型(AspB28−ヒトインスリン)である。この変異型も多量体の形成を抑制する。一部の実施形態では、B28位および/またはB29位の変異は、インスリンポリペプチド内の別の箇所に1つ以上の変異を伴う。例えば、インスリングルリジン(APIDRA(登録商標))は、B3位のアスパラギン酸がリジン残基で置き換えられ、B29位のリジンがグルタミン酸残基で置き換えられた、また別の速効性インスリン変異型(LysB3GluB29−ヒトインスリン)である。
B−鎖(配列番号:12):FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT
ヒトインスリンは、ウサギ、ブタ、ウシ、およびヒツジインスリンとアミノ酸A8、A9、A10、およびB30のみが異なる(以下の表を参照のこと)。
種々の実施形態において、本開示のインスリン分子は、ヒトインスリンと比べてシフトした等電点を有する。一部の実施形態では、等電点のシフトは、インスリンAペプチドのN末端および/またはインスリンBペプチドのC末端に1つ以上のアルギニン残基を付加することによりなされる。かかるインスリンポリペプチドの例としては、ArgA0−ヒトインスリン、ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、GlyA21ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、ArgA0ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、およびArgA0GlyA21ArgB31ArgB32−ヒトインスリンが挙げられる。さらなる一例として、インスリングラルギン(LANTUS(登録商標))は、AspA21がグリシンで置き換えられ、2つのアルギニン残基がBペプチドのC末端に付加された例示的な長期作用性インスリン変異型である。これらの変更の効果は、等電点がシフトしてpH4で完全に可溶性の溶液が得られることである。したがって、一部の実施形態では、本開示のインスリン分子は、A21がGlyであるAペプチド配列と、B31がArg−ArgであるBペプチド配列とを含むものである。本開示は、本明細書に記載したこれらの変異および任意の他の変異(例えば、GlyA21−ヒトインスリン、GlyA21ArgB31−ヒトインスリン、ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、ArgB31−ヒトインスリン)の単独および多くの組合せをすべて包含することは理解されよう。
種々の実施形態において、本開示のインスリン分子は切断型である。例えば、一部の特定の実施形態では、本開示のインスリンポリペプチドのBペプチド配列は、Bl、B2、B3、B26、B27、B28、B29および/またはB30がないものである。一部の特定の実施形態では、本開示のインスリンポリペプチドのBペプチド配列に残基の組合せがない。例えば、Bペプチド配列は、残基B(1〜2)、B(1〜3)、B(29〜30)、B(28〜30)、B(27〜30)および/またはB(26〜30)がないものであり得る。一部の実施形態では、これらの欠失および/または切断は、前記の任意のインスリン分子に適用される(例えば、限定されないが、des(B30)−インスリンリスプロ、des(B30)−インスリンアスパルト、des(B30)−インスリングルリジン、des(B30)−インスリングラルギンなどを作製するため)。
一部の実施形態では、インスリン分子は、AまたはBペプチド配列のN−またはC末端にさらなるアミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、A0、A21、B0および/またはB31位に1つ以上のアミノ酸残基が存在する。一部の実施形態では、A0位に1つ以上のアミノ酸残基が存在する。一部の実施形態では、A21位に1つ以上のアミノ酸残基が存在する。一部の実施形態では、B0位に1つ以上のアミノ酸残基が存在する。一部の実施形態では、B31位に1つ以上のアミノ酸残基が存在する。一部の特定の実施形態では、インスリン分子は、A0、A21、B0またはB31位に、さらなるアミノ酸残基を全く含まない。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、1つ以上のアミド化アミノ酸が酸性形態で置き換えられるように変異されている。例えば、アスパラギンは、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えられ得る。同様に、グルタミンは、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えられ得る。特に、AsnA18、AsnA21、またはAsnB3、またはこれらの残基の任意の組合せが、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えられ得る。GlnA15またはGlnB4またはこれらの両方が、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置き換えられ得る。一部の特定の実施形態では、インスリン分子は、A21位にアスパラギン酸、またはB3位にアスパラギン酸、またはこれら両方を有する。
当業者には、生物学的活性を保持したまま、インスリン分子内のまた別のアミノ酸を変異させることも可能であることが認識されよう。例えば、限定されないが、以下の修飾:B10位のヒスチジン残基のアスパラギン酸での置き換え(HisB10→AspB10);Bl位のフェニルアラニン残基のアスパラギン酸での置き換え(PheB1→AspB1);B30位のトレオニン残基のアラニンでの置き換え(ThrB30→AlaB30);B26位のチロシン残基のアラニンでの置き換え(TyrB26→AlaB26);およびB9位のセリン残基のアスパラギン酸での置き換え(SerB9→AspB9)も当該技術分野で広く認められている。
種々の実施形態において、本開示のインスリン分子は、持続性の作用プロフィールを有するものである。したがって、一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、脂肪酸でアシル化されたものであり得る。すなわち、インスリン分子上のアミノ基と脂肪酸のカルボン酸基との間にアミド結合が形成される。アミノ基は、インスリン分子のN末端アミノ酸のα−アミノ基であってもよく、インスリン分子のリジン残基のε−アミノ基であってもよい。本開示のインスリン分子は、野生型インスリンに存在する3つのアミノ基の1つ以上がアシル化されたものであり得るか、または野生型配列に導入されたリジン残基がアシル化されたものであり得る。一部の特定の実施形態では、インスリン分子はB1位がアシル化されたものであり得る。一部の特定の実施形態では、インスリン分子はB29位がアシル化されたものであり得る。一部の特定の実施形態では、脂肪酸は、ミリスチン酸(C14)、ペンタデシル酸(C15)、パルミチン酸(C16)、ヘプタデシル酸(C17)およびステアリン酸(C18)から選択される。例えば、インスリンデテミル(LEVEMIR(登録商標))は、ThrB30が欠失しており、C14脂肪酸鎖(ミリスチン酸)がLysB29に結合された長期作用性インスリン変異型である。
(式中、RFは、水素またはC1〜30アルキル基である)の脂肪酸部分に共有結合されている。一部の実施形態では、RFは、C1〜20アルキル基、C3〜19アルキル基、C5〜18アルキル基、C6〜17アルキル基、C8〜16アルキル基、C10〜15アルキル基、またはC12〜14アルキル基である。一部の特定の実施形態では、インスリンポリペプチドは該部分に、A1位でコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、インスリンポリペプチドは該部分に、B1位でコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、インスリンポリペプチドは該部分に、B29位のLysのε−アミノ基でコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、インスリン分子のB28位がLysであり、LysB28のε−アミノ基が脂肪酸部分にコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、インスリン分子のB3位がLysであり、LysB3のε−アミノ基が脂肪酸部分にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、脂肪酸鎖は8〜20炭素長である。一部の実施形態では、脂肪酸は、オクタン酸(C8)、ノナン酸(C9)、デカン酸(C10)、ウンデカン酸(C11)、ドデカン酸(C12)、またはトリデカン酸(C13)である。一部の特定の実施形態では、脂肪酸は、ミリスチン酸(C14)、ペンタデカン酸(C15)、パルミチン酸(C16)、ヘプタデカン酸(C17)、ステアリン酸(C18)、ノナデカン酸(C19)、またはアラキジン酸(C20)である。例えば、インスリンデテミル(LEVEMIR(登録商標))は、ThrB30が欠失しており、C14脂肪酸鎖(ミリスチン酸)がLysB29に結合された長期作用性インスリン変異型である。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:LysB28ProB29−ヒトインスリン(インスリンリスプロ)、AspB28−ヒトインスリン(インスリンアスパルト)、LysB3GluB29−ヒトインスリン(インスリングルリジン)、ArgB31ArgB32−ヒトインスリン(インスリングラルギン)、NεB29−ミリストイル−des(B30)−ヒトインスリン(インスリンデテミル)、AlaB26−ヒトインスリン、AspB1−ヒトインスリン、ArgA0−ヒトインスリン、AspB1GluB13−ヒトインスリン、GlyA21−ヒトインスリン、GlyA21ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、ArgA0ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、ArgA0GlyA21ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、des(B30)−ヒトインスリン、des(B27)−ヒトインスリン、des(B28−B30)−ヒトインスリン、des(B1)−ヒトインスリン、des(B1−B3)−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB29−パルミトイル−ヒトインスリン、NεB29−ミリストイル(myrisotyl)−ヒトインスリン、NεB28−パルミトイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−ミリストイル−LysB28ProB29−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB29−パルミトイル−des(B30)−ヒトインスリン、NεB30−ミリストイル−ThrB29LysB30−ヒトインスリン、NεB30−パルミトイル−ThrB29LysB30−ヒトインスリン、NεB29−(N−パルミトイル−γ−グルタミル)−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−(N−リトコリル−γ−グルタミル)−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−(ω−カルボキシヘプタデカノイル)−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−(ω−カルボキシヘプタデカノイル)−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB29−オクタノイル−ヒトインスリン、NεB29−ミリストイル−GlyA21ArgB31ArgB31−ヒトインスリン、NεB29−ミリストイル−GlyA21GlnB3ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB29−ミリストイル−ArgA0GlyA21ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB29−ArgA0GlyA21GlnB3ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB29−ミリストイル−ArgA0GlyA21AspB3ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB29−ミリストイル−ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB29−ミリストイル−ArgA0ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB29−オクタノイル−GlyA21ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB29−オクタノイル−GlyA21GlnB3ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB29−オクタノイル−ArgA0GlyA21ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB29−オクタノイル−ArgA0GlyA21GlnB3ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB29−オクタノイル−ArgB0GlyA21AspB3ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB29−オクタノイル−ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB29−オクタノイル−ArgA0ArgB31ArgB32−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリンポリペプチド:NεB28−ミリストイル−GlyA21LysB28ProB29ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB28−ミリストイル−GlyA21GlnB3LysB28ProB30ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB28−ミリストイル−ArgA0GlyA21LysB28ProB29ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB28−ミリストイル−ArgA0GlyA21GlnB3LysB28ProB29ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB28−ミリストイル−ArgA0GlyA21AspB3LysB28ProB29ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB28−ミリストイル−LysB28ProB29ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB28−ミリストイル−argA0LysB28ProB29ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB28−オクタノイル−GlyA21LysB28ProB29ArgB31ArgB32−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB28−オクタノイル−GlyA21GlnB3LysB28ProB29ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB28−オクタノイル−ArgA0GlyA21LysB28ProB29ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB28−オクタノイル−ArgA0GlyA21GlnB3LysB28ProB29ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB28−オクタノイル−ArgA0GlyA21AspB3LysB28ProB29ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB28−オクタノイル−LysB28ProB29ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB28−オクタノイル−ArgA0LysB28ProB29ArgB31ArgB32−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB29−トリデカノイル−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−テトラデカノイル−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−デカノイル−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−ドデカノイル−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−トリデカノイル−GlyA21−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−テトラデカノイル−GlyA21−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−デカノイル−GlyA21−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−ドデカノイル−GlyA21−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−トリデカノイル−GlyA21GlnB3−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−テトラデカノイル−GlyA21GlnB3−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−デカノイル−GlyA21−GlnB3−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−ドデカノイル−GlyA21−GlnB3−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−トリデカノイル−AlaA21−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−テトラデカノイル−AlaA21−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−デカノイル−AlaA21−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−ドデカノイル−AlaA21−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−トリデカノイル−AlaA21−GlnB3−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−テトラデカノイル−AlaA21GlnB3−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−デカノイル−AlaA21GlnB3−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−ドデカノイル−AlaA21GlnB3−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−トリデカノイル−GlnB3−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−テトラデカノイル−GlnB3−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−デカノイル−GlnB3−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−ドデカノイル−GlnB3−des(B30)−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB29−トリデカノイル−GlyA21−ヒトインスリン、NεB29−テトラデカノイル−GlyA21−ヒトインスリン、NεB29−デカノイル−GlyA21−ヒトインスリン、NεB29−ドデカノイル−GlyA21−ヒトインスリン、NεB29−トリデカノイル−AlaA21−ヒトインスリン、NεB29−テトラデカノイル−AlaA21−ヒトインスリン、NεB29−デカノイル−AlaA21−ヒトインスリン、NεB29−ドデカノイル−AlaA21−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB29−トリデカノイル−GlyA21GlnB3−ヒトインスリン、NεB29−テトラデカノイル−GlyA21GlnB3−ヒトインスリン、NεB29−デカノイル−GlyA21GlnB3−ヒトインスリン、NεB29−ドデカノイル−GlyA21GlnB3−ヒトインスリン、NεB29−トリデカノイル−AlaA21GlnB3−ヒトインスリン、NεB29−テトラデカノイル−AlaA21GlnB3−ヒトインスリン、NεB29−デカノイル−AlaA21GlnB3−ヒトインスリン、NεB29−ドデカノイル−AlaA21GlnB3−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB29−トリデカノイル−GlnB3−ヒトインスリン、NεB29−テトラデカノイル−GlnB3−ヒトインスリン、NεB29−デカノイル−GlnB3−ヒトインスリン、NεB29−ドデカノイル−GlnB3−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB29−トリデカノイル−GluB30−ヒトインスリン、NεB29−テトラデカノイル−GluB30−ヒトインスリン、NεB29−デカノイル−GluB30−ヒトインスリン、NεB29−ドデカノイル−GluB30−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB29−トリデカノイル−GlyA21GluB30−ヒトインスリン、NεB29−テトラデカノイル−GlyA21GluB30−ヒトインスリン、NεB29−デカノイル−GlyA21GluB30−ヒトインスリン、NεB29−ドデカノイル−GlyA21GluB30−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB29−トリデカノイル−GlyA21GlnB3GluB30−ヒトインスリン、NεB29−テトラデカノイル−GlyA21GlnB3GluB30−ヒトインスリン、NεB29−デカノイル−GlyA21GlnB3GluB30−ヒトインスリン、NεB29−ドデカノイル−GlyA21GlnB3GluB30−ヒトインスリン、NεB29−トリデカノイル−AlaA21GluB30−ヒトインスリン、NεB29−テトラデカノイル−AlaA21GluB30−ヒトインスリン、NεB29−デカノイル−AlaA21GluB30−ヒトインスリン、NεB29−ドデカノイル−AlaA21GluB30−ヒトインスリン、NεB29−トリデカノイル−AlaA21GlnB3GluB30−ヒトインスリン、NεB29−テトラデカノイル−AlaA21GlnB3GluB30−ヒトインスリン、NεB29−デカノイル−AlaA21GlnB3GluB30−ヒトインスリン、NεB29−ドデカノイル−AlaA21GlnB3GluB30−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB29−トリデカノイル−GlnB3GluB30−ヒトインスリン、NεB29−テトラデカノイル−GlnB3GluB30−ヒトインスリン、NεB29−デカノイル−GlnB3GluB30−ヒトインスリン、NεB29−ドデカノイル−GlnB3GluB30−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB29−ホルミル−ヒトインスリン、NαB1−ホルミル−ヒトインスリン、NαA1−ホルミル−ヒトインスリン、NεB29−ホルミル−NαB1−ホルミル−ヒトインスリン、NεB29−ホルミル−NαA1−ホルミル−ヒトインスリン、NαA1−ホルミル−NαB1−ホルミル−ヒトインスリン、NεB29−ホルミル−NαA1−ホルミル−NαB1−ホルミル−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB29−アセチル−ヒトインスリン、NαB1−アセチル−ヒトインスリン、NαA1−アセチル−ヒトインスリン、NεB29−アセチル−NαB1−アセチル−ヒトインスリン、NεB29−アセチル−NαA1−アセチル−ヒトインスリン、NαA1−アセチル−NαB1−アセチル−ヒトインスリン、NεB29−アセチル−NαA1−アセチル−NαB1−アセチル−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB29−プロピオニル−ヒトインスリン、NαB1−プロピオニル−ヒトインスリン、NαA1−プロピオニル−ヒトインスリン、NεB29−アセチル−NαB1−プロピオニル−ヒトインスリン、NεB29−プロピオニル−NαA1−プロピオニル−ヒトインスリン、NαA1−プロピオニル−NαB1−プロピオニル−ヒトインスリン、NεB29−プロピオニル−NαA1−プロピオニル−NαB1−プロピオニル−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB29−ブチリル−ヒトインスリン、NαB1−ブチリル−ヒトインスリン、NαA1−ブチリル−ヒトインスリン、NεB29−ブチリル−NαB1−ブチリル−ヒトインスリン、NεB29−ブチリル−NαA1−ブチリル−ヒトインスリン、NαA1−ブチリル−NαB1−ブチリル−ヒトインスリン、NεB29−ブチリル−NαA1−ブチリル−NαB1−ブチリル−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB29−ペンタノイル−ヒトインスリン、NαB1−ペンタノイル−ヒトインスリン、NαA1−ペンタノイル−ヒトインスリン、NεB29−ペンタノイル−NαB1−ペンタノイル−ヒトインスリン、NεB29−ペンタノイル−NαA1−ペンタノイル−ヒトインスリン、NαA1−ペンタノイル−NαB1−ペンタノイル−ヒトインスリン、NεB29−ペンタノイル−NαA1−ペンタノイル−NαB1−ペンタノイル−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB29−ヘキサノイル−ヒトインスリン、NαB1−ヘキサノイル−ヒトインスリン、NαA1−ヘキサノイル−ヒトインスリン、NεB29−ヘキサノイル−NαB1−ヘキサノイル−ヒトインスリン、NεB29−ヘキサノイル−NαA1−ヘキサノイル−ヒトインスリン、NαA1−ヘキサノイル−NαB1−ヘキサノイル−ヒトインスリン、NεB29−ヘキサノイル−NαA1−ヘキサノイル−NαB1−ヘキサノイル−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB29−ヘプタノイル−ヒトインスリン、NαB1−ヘプタノイル−ヒトインスリン、NαA1−ヘプタノイル−ヒトインスリン、NεB29−ヘプタノイル−NαB1−ヘプタノイル−ヒトインスリン、NεB29−ヘプタノイル−NαA1−ヘプタノイル−ヒトインスリン、NαA1−ヘプタノイル−NαB1−ヘプタノイル−ヒトインスリン、NεB29−ヘプタノイル−NαA1−ヘプタノイル−NαB1−ヘプタノイル−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NαB1−オクタノイル−ヒトインスリン、NαA1−オクタノイル−ヒトインスリン、NεB29−オクタノイル−NαB1−オクタノイル−ヒトインスリン、NεB29−オクタノイル−NαA1−オクタノイル−ヒトインスリン、NαA1−オクタノイル−NαB1−オクタノイル−ヒトインスリン、NεB29−オクタノイル−NαA1−オクタノイル−NαB1−オクタノイル−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB29−ノナノイル−ヒトインスリン、NαB1−ノナノイル−ヒトインスリン、NαA1−ノナノイル−ヒトインスリン、NεB29−ノナノイル−NαB1−ノナノイル−ヒトインスリン、NεB29−ノナノイル−NαA1−ノナノイル−ヒトインスリン、NαA1−ノナノイル−NαB1−ノナノイル−ヒトインスリン、NεB29−ノナノイル−NαA1−ノナノイル−NαB1−ノナノイル−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB29−デカノイル−ヒトインスリン、NαB1−デカノイル−ヒトインスリン、NαA1−デカノイル−ヒトインスリン、NεB29−デカノイル−NαB1−デカノイル−ヒトインスリン、NεB29−デカノイル−NαA1−デカノイル−ヒトインスリン、NαA1−デカノイル−NαB1−デカノイル−ヒトインスリン、NεB29−デカノイル−NαA1−デカノイル−NαB1−デカノイル−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB28−ホルミル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαB1−ホルミル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαA1−ホルミル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−ホルミル−NαB1−ホルミル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−ホルミル−NαA1−ホルミル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαA1−ホルミル−NαB1−ホルミル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−ホルミル−NαA1−ホルミル−NαB1−ホルミル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB29−アセチル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαB1−アセチル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαA1−アセチル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−アセチル−NαB1−アセチル−LysB28ProB29−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB28−アセチル−NαA1−アセチル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαA1−アセチル−NαB1−アセチル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−アセチル−NαA1−アセチル−NαB1−アセチル−LysB28ProB29−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB28−プロピオニル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαB1−プロピオニル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαA1−プロピオニル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−プロピオニル−NαB1−プロピオニル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−プロピオニル−NαA1−プロピオニル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαA1−プロピオニル−NαB1−プロピオニル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−プロピオニル−NαA1−プロピオニル−NαB1−プロピオニル−LysB28ProB29−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB28−ブチリル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαB1−ブチリル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαA1−ブチリル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−ブチリル−NαB1−ブチリル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−ブチリル−NαA1−ブチリル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαA1−ブチリル−NαB1−ブチリル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−ブチリル−NαA1−ブチリル−NαB1−ブチリル−LysB28ProB29−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB28−ペンタノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαB1−ペンタノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαA1−ペンタノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−ペンタノイル−NαB1−ペンタノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−ペンタノイル−NαA1−ペンタノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαA1−ペンタノイル−NαB1−ペンタノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−ペンタノイル−NαA1−ペンタノイル−NαB1−ペンタノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB28−ヘキサノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαB1−ヘキサノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαA1−ヘキサノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−ヘキサノイル−NαB1−ヘキサノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−ヘキサノイル−NαA1−ヘキサノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαA1−ヘキサノイル−NαB1−ヘキサノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−ヘキサノイル−NαA1−ヘキサノイル−NαB1−ヘキサノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB28−ヘプタノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαB1−ヘプタノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαA1−ヘプタノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−ヘプタノイル−NαB1−ヘプタノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−ヘプタノイル−NαA1−ヘプタノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαA1−ヘプタノイル−NαB1−ヘプタノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−ヘプタノイル−NαA1−ヘプタノイル−NαB1−ヘプタノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB28−オクタノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαB1−オクタノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαA1−オクタノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−オクタノイル−NαB1−オクタノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−オクタノイル−NαA1−オクタノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαA1−オクタノイル−NαB1−オクタノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−オクタノイル−NαA1−オクタノイル−NαB1−オクタノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB28−ノナノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαB1−ノナノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαA1−ノナノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−ノナノイル−NαB1−ノナノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−ノナノイル−NαA1−ノナノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαA1−ノナノイル−NαB1−ノナノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−ノナノイル−NαA1−ノナノイル−NαB1−ノナノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB28−デカノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαB1−デカノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαA1−デカノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−デカノイル−NαB1−デカノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−デカノイル−NαA1−デカノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NαA1−デカノイル−NαB1−デカノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリン、NεB28−デカノイル−NαA1−デカノイル−NαB1−デカノイル−LysB28ProB29−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のインスリン分子は、以下のインスリン分子:NεB29−ペンタノイル−GlyA21ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NαB1−ヘキサノイル−GlyA21ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NαA1−ヘプタノイル−GlyA21ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB29−オクタノイル−NαB1−オクタノイル−GlyA21ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB29−プロピオニル−NαA1−プロピオニル−GlyA21ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NαA1−アセチル−NαB1−アセチル−GlyA21ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB29−ホルミル−NαA1−ホルミル−NαB1−ホルミル−GlyA21ArgB31ArgB32−ヒトインスリン、NεB29−ホルミル−des(B26)−ヒトインスリン、NαB1−アセチル−AspB28−ヒトインスリン、NεB29−プロピオニル−NαA1−プロピオニル−NαB1−プロピオニル−AspB1AspB3AspB21−ヒトインスリン、NεB29−ペンタノイル−GlyA21−ヒトインスリン、NαB1−ヘキサノイル−GlyA21−ヒトインスリン、NαA1−ヘプタノイル−GlyA21−ヒトインスリン、NεB29−オクタノイル−NαB1−オクタノイル−GlyA21−ヒトインスリン、NεB29−プロピオニル−NαA1−プロピオニル−GlyA21−ヒトインスリン、NαA1−アセチル−NαB1−アセチル−GlyA21−ヒトインスリン、NεB29−ホルミル−NαA1−ホルミル−NαB1−ホルミル−GlyA21−ヒトインスリン、NεB29−ブチリル−des(B30)−ヒトインスリン、NαB1−ブチリル−des(B30)−ヒトインスリン、NαA1−ブチリル−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−ブチリル−NαB1−ブチリル−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−ブチリル−NαA1−ブチリル−des(B30)−ヒトインスリン、NαA1−ブチリル−NαB1−ブチリル−des(B30)−ヒトインスリン、NεB29−ブチリル−NαA1−ブチリル−NαB1−ブチリル−des(B30)−ヒトインスリンのうちの1つの変異および/または化学修飾を含む。
また、本開示は、前記の変異および/または化学修飾のいずれか1つを含む非ヒトインスリン(例えば、ブタインスリン、ウシインスリン、ウサギインスリン、ヒツジインスリンなど)の修飾型も包含する。
これらおよび他の修飾インスリン分子は、米国特許第6,906,028号;同第6,551,992号;同第6,465,426号;同第6,444,641号;同第6,335,316号;同第6,268,335号;同第6,051,551号;同第6,034,054号;同第5,952,297号;同第5,922,675号;同第5,747,642号;同第5,693,609号;同第5,650,486号;同第5,547,929号;同第5,504,188号;同第5,474,978号;同第5,461,031号;および同第4,421,685号;ならびに米国特許第7,387,996号;同第6,869,930号;同第6,174,856号;同第6,011,007号;同第5,866,538号;および同第5,750,497号に詳細に記載されており、その全開示内容は、引用により本明細書に組み込まれる。
種々の実施形態において、本開示のインスリン分子は、3つの野生型ジスルフィド結合(すなわち、A鎖の7位とB鎖の7位間に1つ、A鎖の20位とB鎖の19位間に2つ目、およびA鎖の6位と11位間に3つ目)を含む。
インスリン分子を含む薬物をコンジュゲートさせるための方法を以下に記載する。一部の特定の実施形態では、インスリン分子はコンジュゲートの枠組構造に、A1アミノ酸残基を介してコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、A1アミノ酸残基はグリシンである。しかしながら、本開示はN末端コンジュゲーションに限定されないこと、および一部の特定の実施形態では、インスリン分子は、非末端A鎖アミノ酸残基を介してコンジュゲートされてもよいことは理解されよう。特に、本開示は、A鎖内の任意の位置に存在するリジン残基(野生型または部位特異的変異誘発によって導入されたもの)のε−アミン基を介したコンジュゲーションを包含する。A鎖上のコンジュゲーション位置が異なると、異なるインスリン活性の低下がもたらされ得ることは認識されよう。一部の特定の実施形態では、インスリン分子はコンジュゲートの枠組構造に、B1アミノ酸残基を介してコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、B1アミノ酸残基はフェニルアラニンである。しかしながら、本開示はN末端コンジュゲーションに限定されないこと、および一部の特定の実施形態では、インスリン分子は、非末端B鎖アミノ酸残基を介してコンジュゲートされてもよいことは理解されよう。特に、本開示は、B鎖内の任意の位置に存在するリジン残基(野生型または部位特異的変異誘発によって導入されたもの)のε−アミン基を介したコンジュゲーションを包含する。例えば、一部の特定の実施形態では、インスリン分子はB29リジン残基を介してコンジュゲートされ得る。インスリングルリジンの場合では、B3リジン残基を介したコンジュゲート枠組構造に対するコンジュゲーションが使用され得る。B鎖上のコンジュゲーション位置が異なると、異なるインスリン活性の低下がもたらされ得ることは認識されよう。
一部の特定の実施形態では、リガンドは、インスリン分子などの薬物1つより多くのコンジュゲーション点にコンジュゲートされる。例えば、インスリン分子は、A1のN末端とB29リジンの両方にコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、炭酸緩衝液中でアミドコンジュゲーションが起こり、B29位とAl位にコンジュゲートされるが、B1位にはコンジュゲートされない。他の実施形態では、インスリン分子は、A1のN末端、B1のN末端、およびB29リジンにコンジュゲートされ得る。また他の実施形態では、保護基が、コンジュゲーションがB1位とB29位またはBl位とAl位で起こるように使用される。インスリン分子上のコンジュゲーション点の任意の組合せが使用され得ることは認識されよう。一部の実施形態では、コンジュゲーション点の少なくとも1つは変異リジン残基、例えばLysA3である。
種々の実施形態において、コンジュゲートはインスリン感受性改善薬(すなわち、インスリンの作用を増強する薬物)を含むものであり得る。インスリンの効果を増強する薬物としては、ビグアニド(例えば、メトホルミン)およびグリタゾンが挙げられる。最初のグリタゾン薬はトログリタゾンであったが、これは重度の副作用を有することが判明した。第2世代のグリタゾンとしてはピオグリタゾンおよびロシグリタゾンが挙げられ、これらは耐容性がより良好であるが、ロシグリタゾンは、一部の治験において有害な心血管事象と関連していた。
種々の実施形態において、コンジュゲートはインスリン分泌促進薬(すなわち、膵臓のβ細胞によるインスリンの分泌を刺激する薬物)を含むものであり得る。例えば、種々の実施形態において、コンジュゲートはスルホニル尿素を含むものであり得る。スルホニル尿素は、膵臓のβ細胞によるインスリンの分泌を、該細胞をグルコースの作用に対して感作することにより刺激する。さらに、スルホニル尿素はグルカゴンの分泌を抑止し、標的組織をインスリンの作用に対して感作し得る。第1世代のスルホニル尿素としては、トルブタミド、クロルプロパミドおよびカルブタミドが挙げられる。より低い用量で活性な第2世代のスルホニル尿素としては、グリピジド、グリベンクラミド、グリクラジド、グリボルヌリドおよびグリメピリドが挙げられる。種々の実施形態において、コンジュゲートはメグリチニドを含むものであり得る。好適なメグリチニドとしては、ナテグリニド、ミチグリニドおよびレパグリニドが挙げられる。これらの血糖降下作用は、スルホニル尿素のものより速いが短い。他のインスリン分泌促進薬としては、グルカゴン様ペプチド1(GLP−1)およびGLP−1類似体(すなわち、GLP−1様生理活性を有し、GLP−1とは1〜10個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失および/または化学修飾によって異なるペプチド)が挙げられる。GLP−1は、中枢作用によって胃内容物排出を抑止して満腹感を増大させることにより、およびグルカゴンの放出を抑制することにより食物摂取量を低減させる。GLP−1は、膵島細胞の増殖を増大させ、摂食後のインスリン生成を増大させることにより血漿グルコースレベルを低下させる。GLP−1は、例えば、そのインビボ半減期を長くするため、リラグルチドの場合のように脂質のコンジュゲーションによって化学修飾され得る。また他のインスリン分泌促進薬としては、エキセンジン−4およびエキセンジン−4類似体(すなわち、エキセンジン−4様生理活性を有し、エキセンジン−4とは1〜10個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失および/または化学修飾によって異なるペプチド)が挙げられる。エキセンジン−4は、アメリカドクトカゲ(Gila Monster)に毒中に見られ、GLP−1様生理活性を示す。これは、GLP−1よりもずっと長い半減期を有し、GLP−1とは異なり、生理活性を失うことなく、N末端の8個のアミノ酸残基が切断され得る。GLP−1およびエキセンジン−4のN末端領域は、ほぼ同一であり、有意な差は2番目のアミノ酸残基、GLP−1ではアラニン、エキセンジン−4ではグリシンであり、これにより、エキセンジン−4に、インビボ消化に対する抵抗性が付与される。また、エキセンジン−4はGLP−1と比較すると、C末端に、さらに9個のアミノ酸残基も有する。MannらによるBiochem.Soc.Trans.35:713−716、2007およびRungeらによるBiochemistry 46:5830−5840、2007には、本開示のコンジュゲートに使用され得るさまざまなGLP−1およびエキセンジン−4類似体が記載されている。GLP−1の短い半減期は、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP−IV)による酵素的消化に起因する。一部の特定の実施形態では、内因性GLP−1の効果は、DPP−IV阻害薬(例えば、ビルダグリプチン、シタグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチンまたはアログリプチン)の投与によって増強され得る。
種々の実施形態において、コンジュゲートはアミリンまたはアミリン類似体(すなわち、アミリン様生理活性を有し、アミリンとは1〜10個のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失および/または化学修飾によって異なるペプチド)を含むものであり得る。アミリンは、グルコースの調節に重要な役割を果たしている(例えば、EdelmanおよびWeyer、Diabetes Technol.Ther.4:175〜189、2002を参照のこと)。アミリンは、食物摂取量に応答して膵臓のβ細胞によってインスリンとともに共分泌される神経内分泌ホルモンである。インスリンは血流からのグルコースの消失を調節する働きをするが、アミリンは、胃および肝臓から血流中へのグルコースの出現の調節を補助する働きをする。酢酸プラムリンチド(SYMLIN(登録商標))は例示的なアミリン類似体である。天然ヒトアミリンはアミロイド形成性であるため、プラムリンチドを設計するためのストラテジーは、ある特定の残基を、アミロイド形成性でないラットアミリン由来の残基で置換することを伴うものであった。特に、プロリン残基は構造破壊性残基であることがわかっており、そのため、該残基は、ラット配列からヒト配列に直接グラフトされた。また、Glu−10もアスパラギンで置換された。
種々の実施形態において、プレコンジュゲート薬物は、1つ以上の反応性部分(例えば、カルボキシルまたは反応性エステル、アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、スルフヒドリル、マレイミジル、アルキニル、アジドなどの部分)を含むものであり得る。以下に論考するように、このような反応性部分により、一部の特定の実施形態では、コンジュゲーションプロセスが助長され得る。具体例としては、α末端アミンおよび/またはε−アミンリジン基を有するペプチド薬が挙げられる。このような反応性部分はいずれも、既に存在するものでない場合は、既知の薬物に人工的に付加され得ることは認識されよう。例えば、ペプチド薬の場合、適当なアミノ酸(例えば、リジン)が、アミノ酸配列に付加されるか、または該配列内で置換され得る。また、より詳細に以下に論考するように、コンジュゲーションプロセスは、コンジュゲーション前に特定の反応性部分を選択的にブロックすることにより制御され得ることは認識されよう。
上記に論考したように、本開示は、なんら特定の薬物/標的分子の組合せに限定されない。
種々の実施形態において、本開示の物質体は、天然のフィードバック機構を操作するために利用され得る。例えば、2種類の内因性物質のレベル相互に関連している(例えば、グルコースおよびインスリン、この場合、グルコースレベルが増大するにつれてインスリンレベルが増大し、インスリンレベルが増大するにつれてグルコースレベルが減少する)多くの天然フィードバック機構が存在する(例えば、ほとんどのホルモン性制御機構)。かかる実施形態では、内因性物質の一方が標的分子(例えば、グルコース)となり得、他方が薬物(例えば、インスリン)となる。あるいはまた、種々の実施形態において、薬物は、(a)他方の内因性物質と同じ機能を有する(例えば、グルコースレベルを低減させる)、(b)他方の内因性物質の生成を刺激する、および/または(c)他方の内因性物質の効果(1つもしくは複数)を増強する分子であり得る。例えば、グルコースが標的分子である場合、薬物としてインスリンの代わりに、インスリン分泌促進薬またはインスリン感受性改善薬を使用してもよい。
人工的なフィードバック系の他の非限定的な例としては、高レベルのインスリンに応答してグルカゴンコンジュゲートを放出する物質体、血栓症インジケータに応答して抗凝固薬コンジュゲート(例えば、クマリン(ワルファリン、アセノクマロール、フェンプロクモンおよびフェニンジオンなど)、ヘパリン、直接トロンビン阻害剤(アルガトロバン、レピルジン、ビバリルジン、およびダビガトランなど)など)を放出する物質体;乳酸レベルの増大に応答して乳酸降下性薬物コンジュゲート(例えば、ジクロロアセテート)を放出する物質体;などが挙げられる。
種々の実施形態において、該物質体は、標的分子に直接関係しない機能を有する薬物を含むコンジュゲートを放出するように設計され得る。限定されないが、食後に濃度が増大する標的分子(例えば、グルコース)に応答する物質体は、食事中に長期間の薬物投薬をもたらすために使用され得る。定期的に、および/または食物とともに投与する必要がある任意の薬物が、かかる送達系の恩恵を被り得る。当該技術分野で周知のように、多くの従来の薬物は、食物とともに、または食事の際に投与される必要があるものである。例えば、脂肪の吸収を抑止する薬物(例えば、オルリスタット)は、食事中に存在するのが好都合である。同様に、脂質レベルを降下させる薬物(例えば、ロバスタチン、アトルバスタチン、もしくはシンバスタチン)、またはトリグリセリドレベルを降下させる薬物(例えば、ゲムフィブロジル)も、食事の際に放出されるのが好都合であり得る。
検出可能な標識
上記のように、種々の実施形態において、コンジュゲートは、検出可能な標識を含むものであり得る。例えば、該コンジュゲートがセンサーなどに使用される場合、生物体、組織または細胞内のコンジュゲートの位置を検出するために、検出可能な標識が含められ得る。コンジュゲートは、当該技術分野で知られた任意の検出可能な標識を含むものであり得ることは理解されよう。コンジュゲートは、同じ標識を1コピーより多く含むものであり得る、および/または1種類より多くの型の標識を含むものであり得る。一般に、使用される標識(1種類または複数種)は、最終適用用途および検出に使用される方法に依存する。
上記のように、種々の実施形態において、コンジュゲートは、検出可能な標識を含むものであり得る。例えば、該コンジュゲートがセンサーなどに使用される場合、生物体、組織または細胞内のコンジュゲートの位置を検出するために、検出可能な標識が含められ得る。コンジュゲートは、当該技術分野で知られた任意の検出可能な標識を含むものであり得ることは理解されよう。コンジュゲートは、同じ標識を1コピーより多く含むものであり得る、および/または1種類より多くの型の標識を含むものであり得る。一般に、使用される標識(1種類または複数種)は、最終適用用途および検出に使用される方法に依存する。
検出可能な標識は直接検出可能なものであってもよく、または、例えばシグナル生成系の1種類以上のさらなる構成員との複合作用によって間接的に検出可能なものであってもよい。直接検出可能な標識の例としては、放射性、常磁性、蛍光性、光散乱性、吸光性および比色分析用の標識が挙げられる。フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリンフィコシアニン、アロフィコシアニン、γ−フタルアルデヒド、フルオレスカミンなどはすべて、例示的な蛍光標識である。化学発光性標識、すなわち、二次基質を発色性生成物に変換させ得る標識は、間接的に検出可能な標識の一例である。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−V−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、エクオリンなどはすべて、例示的なタンパク質系化学発光性標識である。ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウム(theromatic acridinium)エステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステルなどは、例示的な非タンパク質系化学発光性標識である。間接的に検出可能な標識の別の非限定的で一般的に使用されている一例は、親和性リガンド、すなわち、それ自体が直接または間接的に検出可能であり得る二次結合パートナー(例えば、抗体またはアプタマー)に対して強い親和性を有する標識である。
一般に、検出可能な標識は、さまざまな様式で可視化または検出され得、特定の検出様式は特定の検出可能な標識に基づいて選択されるが、ここで、代表的な検出手段としては、例えば、シンチレーション計数、オートラジオグラフィー、常磁性の測定、蛍光測定、光吸収測定、光散乱の測定などが挙げられる。
種々の実施形態において、プレコンジュゲート標識は、1つ以上の反応性部分(例えば、カルボキシルまたは反応性エステル、アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、スルフヒドリル、マレイミジル、アルキニル、アジドなどの部分)を含むものであり得る。以下に論考するように、このような反応性部分により、一部の特定の実施形態では、コンジュゲーションプロセスが助長され得る。具体例としては、α末端アミンおよび/またはε−アミンリジン基を有するペプチド標識が挙げられる。このような反応性部分はいずれも、既に存在するものでない場合は、既知の標識に人工的に付加され得ることは認識されよう。例えば、ペプチド標識の場合、適当なアミノ酸(例えば、リジン)が、アミノ酸配列に付加されるか、または該配列内で置換され得る。また、より詳細に以下に論考するように、コンジュゲーションプロセスは、コンジュゲーション前に特定の反応性部分を選択的にブロックすることにより制御され得ることは認識されよう。
コンジュゲートの枠組構造
コンジュゲートは、親和性リガンドを天然に含む枠組構造から調製され得るもの(例えば、グリコゲンおよびデキストランなどの多糖類は、グルコース親和性リガンドを天然に含む)、および/または親和性リガンドを、天然もしくは合成の枠組構造内に人工的に組み込むことにより調製され得るものである。本開示のコンジュゲートは特定の枠組構造に限定されないことは理解されよう。例えば、コンジュゲートは、ポリマー構造および/または非ポリマー構造を含む枠組構造を用いて調製され得る。また、コンジュゲートの枠組構造は、線状、分岐、超分岐型および/またはこれらの組合せであり得ることも理解されよう。以下のセクションに、いくつかの例示的なコンジュゲート枠組構造を示す。
コンジュゲートは、親和性リガンドを天然に含む枠組構造から調製され得るもの(例えば、グリコゲンおよびデキストランなどの多糖類は、グルコース親和性リガンドを天然に含む)、および/または親和性リガンドを、天然もしくは合成の枠組構造内に人工的に組み込むことにより調製され得るものである。本開示のコンジュゲートは特定の枠組構造に限定されないことは理解されよう。例えば、コンジュゲートは、ポリマー構造および/または非ポリマー構造を含む枠組構造を用いて調製され得る。また、コンジュゲートの枠組構造は、線状、分岐、超分岐型および/またはこれらの組合せであり得ることも理解されよう。以下のセクションに、いくつかの例示的なコンジュゲート枠組構造を示す。
種々の実施形態において、コンジュゲートは、ポリマー構造を含む枠組構造から調製され得る。例えば、反応性懸垂基(例えば、カルボキシルまたは反応性のエステル、アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、スルフヒドリル、マレイミジル、アルキニル、アジドなど)を有するポリマーが使用され得る。異なる懸垂基が単一の枠組構造内で混合されていてもよいことは認識されよう(例えば、適切なモノマーを所望の比率で共重合させることにより、ポリマー枠組構造を得る)。以下に論考するように、このような反応性基は、親和性リガンド、薬物および/または検出可能な標識を枠組構造に結合させるために使用され得る。また、異なる枠組構造のコポリマー、混合物および付加物も使用され得る。かかる組合せは、物質体の機械的および化学的特性を最適化するのに有用であり得る。
種々の実施形態において、カルボキシル(または反応性のエステル)懸垂基を有する枠組構造(−COOH含有枠組構造、またはCBF)が使用され得る。かかる枠組構造は、カルボキシル基を天然に含むものであってもよく、カルボキシル基を含むように修飾されたものであってもよい。例示的なポリマーCBFとしては、限定されないが、カルボキシル化多糖類(CPS)、例えば、アルギネート(Ag)、カルボキシメチル化−D−マンノ−D−グルカン(CMMG、Daiichi Pharmaceutical Co.から入手可能)、カルボキシメチルデキストラン(CMDex)、カルボキシメチルキチン(CMCh,Katakura Chikkalin Co.から入手可能)、N−脱硫酸化N−アセチル化ヘパリン(DSH)、およびヒアルロン酸(HA)などが挙げられる。DSHおよびCMDexは、Sugaharaら、Biol.Pharm.Bull,24,535−543(2001)に従って合成され得る。一般に、ヒドロキシル化枠組構造は、塩基性条件下でのクロロ酢酸との反応によってカルボキシル化され得る。ポリマー枠組構造の場合、モノマーに対するカルボキシル置換の度合は、1〜100mol%の間で異なり得る。天然に存在するカルボキシル化ポリマーとしては、限定されないが、ポリ−L−グルタメートおよびポリ−L−アスパルテートなどのカルボキシル化ポリ(アミノ酸)(CPAA)が挙げられる。カルボキシレート含有量は、カルボキシル化アミノ酸(例えば、ポリマー主鎖の一部となるカルボキシル基に加えてカルボキシル基を有するアミノ酸)と、非カルボキシル化アミノ酸(例えば、カルボキシル基のみがポリマー主鎖の一部となるアミノ酸)を共重合させることにより、1〜100%mol COOH/mol AA残基の間で変動させ得る。
種々の実施形態において、アミン懸垂基を有する枠組構造(−NH2含有枠組構造、またはNBF)が使用され得る。かかる枠組構造は天然に存在するものであってもよく、第1級アミンを含むように化学修飾されたものであってもよい。後者としては、限定されないが、ポリマー枠組構造、例えば、アミン懸垂多糖類(NPS)(脱アセチル化キトサン(Ch)(Sigma Aldrich,Milwaukee,Wis.)など)およびジエチルアミノエチルエーテルデキストラン(DEAEDex)、MW 500,000g/mol(Polysciences,Warrington,Pa.)が挙げられる。かかるポリマー枠組構造の場合、モノマーに対するアミン置換の度合は、1〜100mol%の間で異なり得る。他の好適なNBFとしては、限定されないが、2’位がプリン塩基の1つ以上でアミン基で誘導体化されたポリヌクレオチドが挙げられる。天然に存在するアミン化ポリマーとしては、限定されないが、ポリ−L−リジン(PLL)およびそのエナンチオマーなどのポリ(アミノ酸)が挙げられる。アミン含有量は、アミン化アミノ酸(例えば、最終的にポリマー主鎖の一部となるアミン基に加えてアミンを有するアミノ酸)と、非アミン化アミノ酸(例えば、アミンのみが最終的にポリマー主鎖の一部となるアミノ酸)を共重合させることにより、1〜100%mol NH2/mol アミノ酸残基の間で変動させ得る。
種々の実施形態において、ヒドロキシル懸垂基を有するポリマー(−OH含有枠組構造、またはOBF)が使用され得る。かかる枠組構造は、天然にヒドロキシル化されたものであってもよく、ヒドロキシル基を含むように化学修飾されたものであってもよい。デキストランに加えて、天然に存在するポリマーOBFとしては、限定されないが、酵母マンナン(Mn)、プルラン(Pl)、アミロース(Am)、アミロペクチン(AmP)、グリコゲン(Gl)、セルロース(Cl)、ヒアルロネート(Hy)、コンドロイチン(ChD)、およびデキストリン(Dx)(これらはすべて、Sigma Aldrichから市販品として入手され得る)などの多糖類が挙げられる。また、ポリ(セリン)、ポリ(トレオニン)、ポリ(チロシン)、およびポリ(4−ヒドロキシプロリン)などのポリ(アミノ酸)も、ヒドロキシル化ポリマーとして使用され得る。ポリ(アミノ酸)のヒドロキシル含有量は、ヒドロキシル化アミノ酸を非ヒドロキシル化アミノ酸と共重合させることにより、1〜100%mol −OH/mol アミノ酸残基の間で変動させ得る。もちろん、カルボキシル(または反応性のエステル)、アミノ、およびヒドロキシル懸垂基は、適切なアミノ酸を所望の比率で共重合させることにより、単一のポリマー内で混合されていてもよい。
種々の実施形態において、スルフヒドリル懸垂基を有する枠組構造(−SH含有枠組構造、またはSBF)が使用され得る。SBFは、天然にスルフヒドリル化されたものであってもよく、スルフヒドリル基を含むように標準的な有機化学手法を用いて化学修飾されたものであってもよい。他の実施形態では、アルデヒド、マレイミジル、アルキニル、アジドなどの懸垂基を有する枠組構造が使用され得る。
前述の類型の枠組構造に加えて、使用され得る一部の例示的なポリマーとしては、ポリ(乳酸)(PLA)、ポリ(グリコール酸)(PGA)、PLA−PGAコポリマー(PLGA)、ポリ(無水物)、ポリ(ヒドロキシ酸)、ポリ(オルトエステル)、ポリ(プロピルフマレート)、ポリ(カプロラクトン)、ポリアミド、ポリアセタール、生物分解性ポリシアノアクリレートおよび生物分解性ポリウレタンが挙げられる。
式(I)のコンジュゲートの種々の実施形態を実施例12に詳細に記載するが、一般に、
Rxは、水素または任意選択で置換されているC1〜6アルキルであり;
Z1は、任意選択で置換されている二価のC1〜10炭化水素鎖であり、ここで、Z1の1、2、3、4または5個のメチレン単位は、任意選択で独立して、−S−、−O−、−NRa−、−(C=NRa)−、−(C=O)−、−(S=O)−、−S(=O)2−、−(CRb=CRb)−、−(N=N)−、任意選択で置換されているアリーレン部分または任意選択で置換されているヘテロアリーレン部分から選択される1つ以上の基で置き換えられており、式中、Raは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、または適当なアミノ保護基であり、Rbは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、または任意選択で置換されているヘテロアリールであり;
存在するX1は各々、独立して、−ORCまたは−N(Rd)2であり、式中、Rcは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、適当なヒドロキシル保護基、カチオン基、または親和性リガンドであり、各Rdは、独立して、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、適当なアミノ保護基、または親和性リガンドであるが、存在するX1の少なくとも2つは親和性リガンドを含むものとし;
Y1は、水素、ハロゲン、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−OReまたは−SReであり、式中、Reは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、または任意選択で置換されているヘテロアリールであり;
rは、5〜25(両端を含む)の整数であり;
W1は、薬物であり;
Rxは、水素または任意選択で置換されているC1〜6アルキルであり;
Z1は、任意選択で置換されている二価のC1〜10炭化水素鎖であり、ここで、Z1の1、2、3、4または5個のメチレン単位は、任意選択で独立して、−S−、−O−、−NRa−、−(C=NRa)−、−(C=O)−、−(S=O)−、−S(=O)2−、−(CRb=CRb)−、−(N=N)−、任意選択で置換されているアリーレン部分または任意選択で置換されているヘテロアリーレン部分から選択される1つ以上の基で置き換えられており、式中、Raは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、または適当なアミノ保護基であり、Rbは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、または任意選択で置換されているヘテロアリールであり;
存在するX1は各々、独立して、−ORCまたは−N(Rd)2であり、式中、Rcは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、適当なヒドロキシル保護基、カチオン基、または親和性リガンドであり、各Rdは、独立して、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、適当なアミノ保護基、または親和性リガンドであるが、存在するX1の少なくとも2つは親和性リガンドを含むものとし;
Y1は、水素、ハロゲン、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−OReまたは−SReであり、式中、Reは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、または任意選択で置換されているヘテロアリールであり;
rは、5〜25(両端を含む)の整数であり;
W1は、薬物であり;
は、共有結合性の単結合または二重結合に相当する
ことを理解されたい。
ことを理解されたい。
(式中:[(A−T)]は各々、該コンジュゲート内の存在し得る分岐部を表し;
(A−T)は各々、該コンジュゲートの分岐内の存在し得る反復部を表し;
−A−は各々、独立して、共有結合、炭素原子、ヘテロ原子、またはアシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環式からなる群より選択される任意選択で置換されている基であり;
Tは各々、独立して、共有結合であるか、または二価の直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の任意選択で置換されているC1〜30炭化水素鎖であり、ここで、Tの1つ以上のメチレン単位は、任意選択で独立して、−O−、−S−、−N(R)−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−S(O)−、−S(O)2−、−N(R)SO2−、−SO2N(R)−、複素環式基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられており;
Rは各々、独立して、水素、適当な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分もしくはヘテロ脂肪族部分であり;
−Bは、−T−LB−Xであり;
Xは各々、独立して、親和性リガンドであり;
LBは各々、独立して、共有結合であるか、またはTとXとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基であり;
−Dは、−T−LD−Wであり;
Wは各々、独立して、薬物または検出可能な標識であり;
LDは各々、独立して、共有結合であるか、またはTとWとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基であり;
kは、2〜11(両端を含む)の整数であり、該コンジュゲート内にk−分岐部が少なくとも2つあることを規定し;
qは、1〜4(両端を含む)の整数であり;
k+qは、3〜12(両端を含む)の整数であり;
pは各々、独立して、1〜5(両端を含む)の整数であり;
nは各々、独立して、0〜5(両端を含む)の整数であり;
mは各々、独立して、1〜5(両端を含む)の整数であり;
vは各々、独立して、0〜5(両端を含む)の整数であるが、各k−分岐部において、存在する少なくとも1つのnは≧1であり、存在する少なくとも1つのvは≧1であるものとする)。
(A−T)は各々、該コンジュゲートの分岐内の存在し得る反復部を表し;
−A−は各々、独立して、共有結合、炭素原子、ヘテロ原子、またはアシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環式からなる群より選択される任意選択で置換されている基であり;
Tは各々、独立して、共有結合であるか、または二価の直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の任意選択で置換されているC1〜30炭化水素鎖であり、ここで、Tの1つ以上のメチレン単位は、任意選択で独立して、−O−、−S−、−N(R)−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−S(O)−、−S(O)2−、−N(R)SO2−、−SO2N(R)−、複素環式基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられており;
Rは各々、独立して、水素、適当な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分もしくはヘテロ脂肪族部分であり;
−Bは、−T−LB−Xであり;
Xは各々、独立して、親和性リガンドであり;
LBは各々、独立して、共有結合であるか、またはTとXとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基であり;
−Dは、−T−LD−Wであり;
Wは各々、独立して、薬物または検出可能な標識であり;
LDは各々、独立して、共有結合であるか、またはTとWとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基であり;
kは、2〜11(両端を含む)の整数であり、該コンジュゲート内にk−分岐部が少なくとも2つあることを規定し;
qは、1〜4(両端を含む)の整数であり;
k+qは、3〜12(両端を含む)の整数であり;
pは各々、独立して、1〜5(両端を含む)の整数であり;
nは各々、独立して、0〜5(両端を含む)の整数であり;
mは各々、独立して、1〜5(両端を含む)の整数であり;
vは各々、独立して、0〜5(両端を含む)の整数であるが、各k−分岐部において、存在する少なくとも1つのnは≧1であり、存在する少なくとも1つのvは≧1であるものとする)。
一般式(II)(および本明細書における他の式)には、1つ1つの水素を明示していないことは理解されよう。例えば、中央の−A−がC6アリール基であり、k+q<6である場合、C6アリール環上の空き位置(1つまたは複数)には水素が含まれることは認識されよう。一般に、−A−は各々、存在し得る分岐部節を表すこと、ならびに各節の分岐の数は、中央の−A−のkの値と中央でない−A−の存在のnの値によって決定されることは認識されよう。k≧2であるため、該コンジュゲートは常に少なくとも2つのk−分岐部を含む。当業者には、各nの存在が0〜5の整数であり得るため、本開示において、このようなコンジュゲートでは、分岐実施形態と超分岐(例えば、デンドリマー様)実施形態の両方が想定されることが認識されよう。各k−分岐部において、存在する少なくとも1つのnが≧1であり、存在する少なくとも1つのvが≧1であることを必要とする条件により、どのコンジュゲートも、B(すなわち、親和性リガンド)の存在を伴う少なくとも2つの個別のk−分岐部を含むことが確実になる。
一部の特定の実施形態では、p−括弧部分内に存在する−A−は各々、n≧1の値に該当する数のn−括弧部分で置換されている。例えば、両方のk−分岐部においてk=2およびp=2である場合、該コンジュゲートは、式(IIa):
のものであり得る。
他の実施形態では、p−括弧部分内の末端に存在する−A−のみが、n≧1の値に該当する数のn−括弧部分で置換されている。例えば、両方のk−分岐部においてk=2およびp=2である(ならびに両方のk−分岐部内の最初のp−括弧部分はn=0である)場合、該コンジュゲートは、式(IIb):
のものであり得る。
一部の特定の実施形態では、m−括弧部分内に存在する−A−は各々、v≧1の値に該当する数のB部分で置換されている。例えば、k=2、存在する各p=1、および存在する各m=2である場合、該コンジュゲートは、式(IIc):
のものであり得る。
他の実施形態では、m−括弧部分内の末端に存在する−A−のみが、v≧1の値に該当する数のB部分で置換されている。例えば、k=2、存在する各p=1、および存在する各m=2である(ならびに各n−分岐部内の第1のm−括弧部分についてv=0である)場合、該コンジュゲートは、式(IId):
のものであり得る。
種々の実施形態において、本開示により、また、コンジュゲートの枠組構造に非共有結合で結合された親和性リガンドおよび/または薬物もしくは検出可能な標識を含むコンジュゲートが提供される。
例えば、一部の実施形態では、本開示により、前述の任意の式:
(式中:−A−、T、D、k、q、k+q、p、n、mおよびvは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し;
−Bは、−T−LRPB−Xであり;
存在するXは各々、独立して、親和性リガンドであり;
存在するLRPBは各々、独立して、TとX間に非二重結合を形成するリガンド−受容体ペアであり、ヒト血清中の解離定数が1pmol/L未満である)
のコンジュゲートが提供される。
(式中:−A−、T、D、k、q、k+q、p、n、mおよびvは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し;
−Bは、−T−LRPB−Xであり;
存在するXは各々、独立して、親和性リガンドであり;
存在するLRPBは各々、独立して、TとX間に非二重結合を形成するリガンド−受容体ペアであり、ヒト血清中の解離定数が1pmol/L未満である)
のコンジュゲートが提供される。
また他の実施形態では、本開示により、前述の任意の式:
(式中:−A−、T、B、k、q、k+q、p、n、mおよびvは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し;
−Dは、−T−LRPD−Wであり;
存在するWは各々、独立して、薬物または検出可能な標識であり;
存在するLRPDは各々、独立して、TとW間に非二重結合を形成するリガンド−受容体ペアであり、ヒト血清中の解離定数が1pmol/L未満である)
のコンジュゲートが提供される。
(式中:−A−、T、B、k、q、k+q、p、n、mおよびvは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し;
−Dは、−T−LRPD−Wであり;
存在するWは各々、独立して、薬物または検出可能な標識であり;
存在するLRPDは各々、独立して、TとW間に非二重結合を形成するリガンド−受容体ペアであり、ヒト血清中の解離定数が1pmol/L未満である)
のコンジュゲートが提供される。
他の実施形態では、本開示により、前述の任意の式:
(式中:−A−、T、k、q、k+q、p、n、mおよびvは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し;
−Bは、−T−LRPB−Xであり;
存在するXは各々、独立して、親和性リガンドであり;
存在するLRPBは各々、独立して、TとXの間に非二重結合を形成するリガンド−受容体ペアであり、ヒト血清中の解離定数が1pmol/L未満であり;
−Dは、−T−LRPD−Wであり;
存在するWは各々、独立して、薬物または検出可能な標識であり;
存在するLRPDは各々、独立して、TとW間に非二重結合を形成するリガンド−受容体ペアであり、ヒト血清中の解離定数が1pmol/L未満である)
のコンジュゲートが提供される。
(式中:−A−、T、k、q、k+q、p、n、mおよびvは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し;
−Bは、−T−LRPB−Xであり;
存在するXは各々、独立して、親和性リガンドであり;
存在するLRPBは各々、独立して、TとXの間に非二重結合を形成するリガンド−受容体ペアであり、ヒト血清中の解離定数が1pmol/L未満であり;
−Dは、−T−LRPD−Wであり;
存在するWは各々、独立して、薬物または検出可能な標識であり;
存在するLRPDは各々、独立して、TとW間に非二重結合を形成するリガンド−受容体ペアであり、ヒト血清中の解離定数が1pmol/L未満である)
のコンジュゲートが提供される。
種々の実施形態において、本開示のコンジュゲートは、一般式(III):
(式中、−A−、B、T、D、v、m、nおよびpは本明細書において定義および記載のとおりであり、kは、1〜11(両端を含む)の整数であり、jは、2〜4(両端を含む)の整数である)を有するものであり得る。式(III)のコンジュゲートは、薬物に対するリガンドのコンジュゲーション部位を多数有するものであり得る。qが1である場合、式中、jが2、3または4である式(III)のコンジュゲートに対して、当業者には、上記のもの(式(IIa)〜(IIf))に対して示される類似した亜属が想定され得ることは認識されよう。
例示の目的で、および混乱の回避のため、式(III)のコンジュゲート内に存在する−A−D−A−(すなわち、jが2である場合)を、−A−T−LD−W−LD−T−A−(薬物がコンジュゲートの枠組構造に共有結合されている場合)または−A−T−LRPD−W−LRPD−T−A−(薬物がコンジュゲートの枠組構造に非共有結合されている場合)で表すことがあり得ることを理解されたい。
例示的な基の説明
−A−(節)
一部の特定の実施形態では、−A−は各々、独立して、アシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環式からなる群より選択される、任意選択で置換されている基である。一部の実施形態では、各−A−は同じである。一部の実施形態では、中央の−A−は、他のすべての−A−と異なる。一部の特定の実施形態では、−A−はすべて、中央の−A−以外、同じである。一部の実施形態では、−A−は、任意選択で置換されているアリールまたはヘテロアリール基である。一部の実施形態では、−A−は6員のアリールである。一部の特定の実施形態では、−A−はフェニルである。一部の特定の実施形態では、−A−は、N、OまたはSから選択されるヘテロ原子である。一部の実施形態では、−A−は窒素原子である。一部の実施形態では、−A−は酸素原子である。一部の実施形態では、−A−はイオウ原子である。一部の実施形態では、−A−は炭素原子である。
−A−(節)
一部の特定の実施形態では、−A−は各々、独立して、アシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環式からなる群より選択される、任意選択で置換されている基である。一部の実施形態では、各−A−は同じである。一部の実施形態では、中央の−A−は、他のすべての−A−と異なる。一部の特定の実施形態では、−A−はすべて、中央の−A−以外、同じである。一部の実施形態では、−A−は、任意選択で置換されているアリールまたはヘテロアリール基である。一部の実施形態では、−A−は6員のアリールである。一部の特定の実施形態では、−A−はフェニルである。一部の特定の実施形態では、−A−は、N、OまたはSから選択されるヘテロ原子である。一部の実施形態では、−A−は窒素原子である。一部の実施形態では、−A−は酸素原子である。一部の実施形態では、−A−はイオウ原子である。一部の実施形態では、−A−は炭素原子である。
T(スペーサー)
一部の特定の実施形態では、存在するTは各々、独立して、二価の直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の、任意選択で置換されているC1〜20炭化水素鎖であり、Tの1つ以上のメチレン単位は、任意選択で独立して、−O−、−S−、−N(R)−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−S(O)−、−S(O)2−、−N(R)SO2−、−SO2N(R)−、複素環式基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Tの1、2、3、4または5個のメチレン単位が、任意選択で独立して置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Tは、C1〜10、C1〜8、C1〜6、C1〜4、C2〜12、C4〜12、C6〜12、C8〜12、またはC10〜12炭化水素鎖で構築されており、ここで、Tの1つ以上のメチレン単位は、任意選択で独立して、−O−、−S−、−N(R)−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−S(O)−、−S(O)2−、−N(R)SO2−、−SO2N(R)−、複素環式基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられている。一部の実施形態では、Tの1つ以上のメチレン単位が複素環式基で置き換えられている。一部の実施形態では、Tの1つ以上のメチレン単位がトリアゾール部分で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Tの1つ以上のメチレン単位が−C(O)−で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Tの1つ以上のメチレン単位が−C(O)N(R)−で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Tの1つ以上のメチレン単位が−O−で置き換えられている。
一部の特定の実施形態では、存在するTは各々、独立して、二価の直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の、任意選択で置換されているC1〜20炭化水素鎖であり、Tの1つ以上のメチレン単位は、任意選択で独立して、−O−、−S−、−N(R)−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−S(O)−、−S(O)2−、−N(R)SO2−、−SO2N(R)−、複素環式基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Tの1、2、3、4または5個のメチレン単位が、任意選択で独立して置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Tは、C1〜10、C1〜8、C1〜6、C1〜4、C2〜12、C4〜12、C6〜12、C8〜12、またはC10〜12炭化水素鎖で構築されており、ここで、Tの1つ以上のメチレン単位は、任意選択で独立して、−O−、−S−、−N(R)−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−S(O)−、−S(O)2−、−N(R)SO2−、−SO2N(R)−、複素環式基、アリール基、またはヘテロアリール基で置き換えられている。一部の実施形態では、Tの1つ以上のメチレン単位が複素環式基で置き換えられている。一部の実施形態では、Tの1つ以上のメチレン単位がトリアゾール部分で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Tの1つ以上のメチレン単位が−C(O)−で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Tの1つ以上のメチレン単位が−C(O)N(R)−で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Tの1つ以上のメチレン単位が−O−で置き換えられている。
である。
である。
である。
である。
である。
である。
一部の特定の実施形態では、存在する各Tは同じである。
(式中、−A−、B、D、v、m、n、p、kおよびjは、それぞれ、式(II)または(III)で定義および記載のとおりである)のものである。
(式中、−A−、B、D、v、m、n、p、kおよびjは、それぞれ、式(II)または(III)で定義および記載のとおりである)のものである。
式(VII)の一部の特定のかかる実施形態では、k=2およびq=1である。
他の実施形態では、k=3およびq=1である。
他の実施形態では、k=2およびq=2である。
式(VIII)の一部の特定のかかる実施形態では、k=1およびj=2である。
他の実施形態では、k=2およびj=2である。
他の実施形態では、k=3およびj=2である。
他の実施形態では、k=1およびj=3である。
他の実施形態では、k=2およびj=3である。
他の実施形態では、k=3およびj=3である。
(式中、WおよびXは、本明細書において定義および記載のとおりである)のコンジュゲートが提供される。
(式中、BおよびDは、本明細書において定義および記載のとおりである)のコンジュゲートが提供される。
(式中、WおよびXは、本明細書において定義および記載のとおりである)のコンジュゲートが提供される。
(式中、BおよびDは、本明細書において定義および記載のとおりである)のコンジュゲートが提供される。
(式中、WおよびXは、本明細書において定義および記載のとおりである)のコンジュゲートが提供される。
式中、jが2、3または4である式(VIII)のコンジュゲートに対して、当業者には、式(VIIa)、(VIIb)および(VIIc)のものならびにその一種に類似した亜属が想定され得ることは認識されよう。例えば、jが2である場合、一部の特定の実施形態では、本開示により、式:
(式中、B、Dは、本明細書において定義および記載のとおりである)のコンジュゲートが提供される。
(式中、W、Xおよびjは、本明細書において定義および記載のとおりである)のコンジュゲートが提供される。
B(リガンド)
種々の実施形態において、−Bは、−T−LB−Xであり、式中、Xはリガンドであり;LBは、共有結合であるか、またはXとTとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基である。例示的なリガンドおよびその糖質成分は上記のとおりであった。
種々の実施形態において、−Bは、−T−LB−Xであり、式中、Xはリガンドであり;LBは、共有結合であるか、またはXとTとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基である。例示的なリガンドおよびその糖質成分は上記のとおりであった。
D(薬物)
種々の実施形態において、−Dは−T−LD−Wであり、式中、Wは薬物であり、LDは共有結合であるか、またはWとTとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基である。例示的な薬物は上記のとおりであった。
種々の実施形態において、−Dは−T−LD−Wであり、式中、Wは薬物であり、LDは共有結合であるか、またはWとTとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基である。例示的な薬物は上記のとおりであった。
D(検出可能な標識)
上記のように、種々の実施形態において、D内のWは検出可能な標識である。例えば、該コンジュゲートがセンサーなどに使用される場合、生物体、組織または細胞内のコンジュゲートの位置を検出するために、検出可能な標識が含められ得る。コンジュゲートは、当該技術分野で知られた任意の検出可能な標識を含むものであり得ることは理解されよう。コンジュゲートは、1コピーより多くの同じ標識を含むものであり得る、および/または1種類より多くの型の標識を含むものであり得る。一般に、使用される標識(1種類または複数種)は、最終適用用途および検出に使用される方法に依存する。
上記のように、種々の実施形態において、D内のWは検出可能な標識である。例えば、該コンジュゲートがセンサーなどに使用される場合、生物体、組織または細胞内のコンジュゲートの位置を検出するために、検出可能な標識が含められ得る。コンジュゲートは、当該技術分野で知られた任意の検出可能な標識を含むものであり得ることは理解されよう。コンジュゲートは、1コピーより多くの同じ標識を含むものであり得る、および/または1種類より多くの型の標識を含むものであり得る。一般に、使用される標識(1種類または複数種)は、最終適用用途および検出に使用される方法に依存する。
検出可能な標識は直接検出可能なものであってもよく、または、例えばシグナル生成系の1種類以上のさらなる構成員との複合作用によって間接的に検出可能なものであってもよい。直接検出可能な標識の例としては、放射性、常磁性、蛍光性、光散乱性、吸光性および比色分析用の標識が挙げられる。フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリンフィコシアニン、アロフィコシアニン、γ−フタルアルデヒド、フルオレスカミンなどはすべて、例示的な蛍光標識である。化学発光性標識、すなわち、二次基質を発色性生成物に変換させ得る標識は、間接的に検出可能な標識の一例である。例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−V−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、エクオリンなどはすべて、例示的なタンパク質系化学発光性標識である。ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウム(theromatic acridinium)エステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステルなどは、例示的な非タンパク質系化学発光性標識である。間接的に検出可能な標識の別の非限定的で一般的に使用されている一例は、親和性リガンド、すなわち、それ自体が直接または間接的に検出可能であり得る二次結合パートナー(例えば、抗体またはアプタマー)に対して強い親和性を有する標識である。
一般に、検出可能な標識は、さまざまな様式で可視化または検出され得、特定の検出様式は特定の検出可能な標識に基づいて選択されるが、ここで、代表的な検出手段としては、例えば、シンチレーション計数、オートラジオグラフィー、常磁性の測定、蛍光測定、光吸収測定、光散乱の測定などが挙げられる。
種々の実施形態において、プレコンジュゲート標識は、1つ以上の反応性部分(例えば、カルボキシルまたは反応性エステル、アミン、ヒドロキシル、アルデヒド、スルフヒドリル、マレイミジル、アルキニル、アジドなどの部分)を含むものであり得る。以下に論考するように、このような反応性部分により、一部の特定の実施形態では、コンジュゲーションプロセスが助長され得る。具体例としては、α末端アミンおよび/またはε−アミンリジン基を有するペプチド標識が挙げられる。このような反応性部分はいずれも、既に存在するものでない場合は、既知の標識に人工的に付加され得ることは認識されよう。例えば、ペプチド標識の場合、適当なアミノ酸(例えば、リジン)が、アミノ酸配列に付加されるか、または該配列内で置換され得る。また、より詳細に以下に論考するように、コンジュゲーションプロセスは、コンジュゲーション前に特定の反応性部分を選択的にブロックすることにより制御され得ることは認識されよう。
LBおよびLD(共有結合性コンジュゲーション)
当業者には、さまざまなコンジュゲーション化学反応が、XとTおよび/またはWとT(包括的には、「構成要素」)の共有結合性コンジュゲーションに使用され得ることが認識されよう。かかる手法は当該技術分野で広く知られており、例示的な手法を以下に論考する。該構成要素は、直接結合されていてもよく(すなわち、介在化学基なしで)、スペーサー(例えば、コンジュゲート要素とコンジュゲートの枠組構造の残部との間に、ある程度の物理的隔離をもたらすカップリング剤または共有結合鎖)を介して間接的に結合されていてもよい。該構成要素はコンジュゲート枠組構造に、任意の数の化学結合(例えば、限定されないが、アミド、アミン、エステル、エーテル、チオエーテル、イソ尿素、イミンなどの結合)によって共有結合され得ることは理解されよう。一部の特定の実施形態では、LBおよび/またはLD(一般的に、このセクションでの解釈上では「L」)は二重結合である。一部の実施形態では、Lは、Tの任意選択で置換されているカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性、またはヒドロキシル反応性の部分を、XまたはWのカルボキシル、チオール、アミンまたはヒドロキシル基とコンジュゲートさせることに由来する任意選択で置換されている部分である。一部の実施形態では、Lは、XまたはWの任意選択で置換されているカルボキシル反応性、チオール反応性、アミン反応性、またはヒドロキシル反応性の部分を、Tのカルボキシル、チオール、アミンまたはヒドロキシル基とコンジュゲートさせることに由来する任意選択で置換されている部分である。一部の実施形態では、Lは、
当業者には、さまざまなコンジュゲーション化学反応が、XとTおよび/またはWとT(包括的には、「構成要素」)の共有結合性コンジュゲーションに使用され得ることが認識されよう。かかる手法は当該技術分野で広く知られており、例示的な手法を以下に論考する。該構成要素は、直接結合されていてもよく(すなわち、介在化学基なしで)、スペーサー(例えば、コンジュゲート要素とコンジュゲートの枠組構造の残部との間に、ある程度の物理的隔離をもたらすカップリング剤または共有結合鎖)を介して間接的に結合されていてもよい。該構成要素はコンジュゲート枠組構造に、任意の数の化学結合(例えば、限定されないが、アミド、アミン、エステル、エーテル、チオエーテル、イソ尿素、イミンなどの結合)によって共有結合され得ることは理解されよう。一部の特定の実施形態では、LBおよび/またはLD(一般的に、このセクションでの解釈上では「L」)は二重結合である。一部の実施形態では、Lは、Tの任意選択で置換されているカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性、またはヒドロキシル反応性の部分を、XまたはWのカルボキシル、チオール、アミンまたはヒドロキシル基とコンジュゲートさせることに由来する任意選択で置換されている部分である。一部の実施形態では、Lは、XまたはWの任意選択で置換されているカルボキシル反応性、チオール反応性、アミン反応性、またはヒドロキシル反応性の部分を、Tのカルボキシル、チオール、アミンまたはヒドロキシル基とコンジュゲートさせることに由来する任意選択で置換されている部分である。一部の実施形態では、Lは、
である。一部の実施形態では、Lはスクシンイミド部分である。
種々の実施形態において、該構成要素はコンジュゲート枠組構造に、当該技術分野で知られた「クリックケミストリー」反応を用いて共有結合され得る。該反応としては、例えば、付加環化反応、求核性開環反応、および炭素−炭素多重結合に対する付加が挙げられる(例えば、KolbおよびSharpless、Drug Discovery Today 8:1128−1137、2003ならびにそこに挙げられた参考文献ならびにDondoni,Chem.Asian J.2:700−708、2007、ならびにそこに挙げられた参考文献を参照のこと)。上記に論考したように、種々の実施形態において、該構成要素はコンジュゲート枠組構造に、天然の、または化学的に付加した懸垂基を介して結合され得る。一般に、1対の反応性基の第1と第2の構成員(例えば、反応してアミド結合をもたらすカルボキシル基とアミン基)は、該構成要素と枠組構造のいずれか一方に存在し得る(すなわち、2つの構成員の相対位置は、これらが反応してコンジュゲートが得られる限り重要でない)ことは認識されよう。例示的な結合は、より詳細に以下に論考する。種々の実施形態において、カルボキシル(または反応性エステル)含有構成要素が、−OH含有枠組構造(OBF)に、KimらによるBiomaterials 24:4843−4851(2003)に概要が示された手順を用いてコンジュゲートされ得る。簡単には、OBFをDMSOに、カルボキシル含有構成要素とともに溶解させ、触媒としてのN’,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)および4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)によって、乾燥雰囲気下で反応させる。カルボキシル含有構成要素は、−NH2含有枠組構造(NBF)に、カルボジイミド(EDAC)カップリング手順を用いてコンジュゲートされ得る。この手順を使用し、カルボキシル含有構成要素を、pH5の緩衝液中、EDACとの反応によって官能化した後、NBFに付加する。このような場合(および以下の任意の場合)ではいずれも、得られた生成物は、当業者に利用可能な任意の数の手段によって、例えば限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、シリカゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過、および選択的沈殿によって精製され得る。
種々の実施形態において、アミン含有構成要素は−COOH含有枠組構造(CBF)にカップリングされ得る。CBFには、活性化型エステル部分が使用されている(例えば、Hermanson in Bioconjugate Techniques、第2版、Academic Press、2008およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと)。簡単には、末端活性化カルボン酸エステル(例えば、−NHS、−SSC、−NPCなど)を有するCBFを、無水有機溶媒(DMSOまたはDMFなど)に溶解させる。次いで、所望の当量数のアミン含有構成要素を添加し、室温で数時間混合する。また、アミン含有構成要素は、Baudysら、Bioconj.Chem.9:176−183、1998に記載のように、安定なアミド結合を得るためにCBFにコンジュゲートされ得る。この反応は、トリブチルアミン(TBA)とクロロギ酸イソブチルを、CBFとアミン含有構成要素のジメチルスルホキシド(DMSO)溶液に、無水条件下で添加することにより行なわれ得る。あるいはまた、アミン含有構成要素をOBFに、限定されないが、臭化シアン(CNBr)、N−シアノトリエチルアンモニウムテトラフルオロボレート(CTEA)、1−シアノ−4−(ジメチルアミノ)−ピリジニウムテトラフルオロボレート(fluorborate)(CDAP)、およびp−ニトロフェニルシアネート(pNPC)などの試薬を用いるシアノ化(cyanalation)によってカップリングさせてもよい。CNBr反応は、水溶液中で弱塩基性pHにて行なわれ得る。CDAP反応は、DMSOと水の混合物中で弱塩基性pHにて、触媒としてトリエチルアミン(TEA)を用いて行なわれる。一部の特定の実施形態では、アミン含有構成要素はNBFに、例えば、ピリジンを含む水性緩衝溶液中でのグルタルアルデヒドカップリング後、グリシンでのクエンチングによってコンジュゲートされ得る。一部の特定の実施形態では、アミン含有構成要素はアルデヒド含有枠組構造に、シッフ塩基カップリング手順の使用後、還元することによりコンジュゲートされ得る(例えば、Hermanson、Bioconjugate Techniques、第2版、Academic Press、2008およびそこに挙げられた参考文献、ならびにMeiら、Pharm.Res.16:1680−1686、1999およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと)。簡単には、末端活性化型アルデヒド(例えば、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒドなど)を有する枠組構造を、中性またはそれより低いpHを有する(好ましくないアルデヒドの加水分解を抑制するため)水性緩衝液に溶解させる。次いで、所望の当量数のアミン含有構成要素を添加し、室温で混合した後、過剰の適当な還元剤(例えば、水素化ホウ素ナトリウム、ナトリウムシアノボロヒドリド、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリドピリジンボラン、トリエチルアミンボランなど)を添加する。
種々の実施形態において、ヒドロキシル含有構成要素はOBFに、ジビニルスルホン(DVS)手順に従ってコンジュゲートされ得る。この手順を使用し、OBFをpH11.4の重炭酸緩衝液に添加し、DVSで活性化させ、続いてヒドロキシル含有構成要素を添加した後、グリシンを添加して反応液を中和およびクエンチする。また、ヒドロキシル含有構成要素をOBFに、エステル結合をもたらす上記の活性化型エステル部分を用いてカップリングさせてもよい。
種々の実施形態において、スルフヒドリル含有構成要素がマレイミド含有枠組構造(MBF)に、チオエーテル結合をもたらす比較的穏和な手順を用いてカップリングされ得る(例えば、Hermanson、Bioconjugate Techniques、第2版、Academic Press、2008およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと)。マレイミド基は活性化型エステルよりもはるかに加水分解されにくいため、反応を水性条件下で行なってもよい。簡単には、MBFをpH6.5〜7.5の緩衝水溶液に溶解させた後、所望の当量数のスルフヒドリル含有構成要素を溶解させる。室温で数時間混合した後、チオエーテルカップリングコンジュゲートは精製され得る。スルフヒドリル含有構成要素を、Thomaら、J.Am.Chem.Soc.121:5919−5929、1999に記載の方法に従ってNBFにコンジュゲートさせてもよい。この反応は、NBFを無水ジメチルホルムアミド(DMF)に懸濁させた後、2,6−ルチジンと酸無水物を添加し、続いて反応性の中間体を精製することを伴う。次いで、スルフヒドリル含有構成要素を該中間体のDMF溶液(トリエチルアミンを含む)に添加する。
種々の実施形態において、アジド含有構成要素をアルキン含有枠組構造(ABF)に、銅(I)触媒型の現代版Huisgen型アジド−アルキン付加環化を用いてカップリングさせると、1,4−ジ−置換1,2,3−トリアゾールを得ることができる(例えば、Dondoni,Chem.Asian J.2:700−708,2007およびそこに挙げられた参考文献、ならびにDedolaら、Org.Biomol.Chem.5:1006−1017,2007を参照のこと)。この反応は、一般的に「クリック」反応と称され、例えば、無希釈THF中で、触媒系としてN,N−ジイソプロピルエチルアミンとCu(PPh3)3Brを用いて行なわれ得る(例えば、Wuら、Chem.Commun.5775−5777、2005を参照のこと)。また、この反応は、3:1(THF:水)混合物中、触媒系としてアスコルビン酸ナトリウムとCuSO4・5H2Oを用いて行なわれ得る(例えば、Wuら、上掲を参照のこと)。いずれの場合も、アジド含有構成要素をABFに所望の当量数で添加した後、室温で12〜48時間混合する。あるいはまた、アルキン含有構成要素をアジド含有枠組構造に、上記のものと厳密に同じ条件を用いてコンジュゲートさせてもよい。
一部の特定の該構成要素は、天然で、1つより多くの同じ化学反応性部分を有するものであり得る。一部の例では、該構成要素が該部位のうちの唯一の部位で選択的に反応するように化学反応型および条件を選択することが可能である。例えば、インスリンが反応性アミンを介してコンジュゲートされている場合、一部の特定の実施形態では、N末端α−Phe−B1は、インスリン生理活性を保持するのに、N末端α−Gly−A1およびε−Lys−B29よりも好ましい結合部位である(例えば、Meiら、Pharm.Res.16:1680−1686、1999およびそこに挙げられた参考文献、ならびにTsaiら、J.Pharm.Sci.86:1264−1268,1997を参照のこと)。インスリンとヘキサデセナール(末端がアルデヒドの分子)との例示的な反応において、研究者らにより、この2つの構成要素を、ナトリウムシアノボロヒドリドの存在下、54%イソプロパノールを含む1.5MのpH6.8のサリチル酸ナトリウム水溶液中で、1:6(インスリン:アルデヒドmol/mol)の比で一晩混合すると、単一置換Phe−B1第2級アミンコンジュゲート生成物への80%を超える変換がもたらされることが見出された(Meiら、Pharm.Res.16:1680−1686、1999)。彼らの研究により、溶媒、pH、およびインスリン:アルデヒド比の選択はすべて、反応の選択性および収率に影響を及ぼすことが示された。しかしながら、ほとんどの場合、化学反応条件の選択によって選択性を得ることは困難である。したがって、一部の特定の実施形態では、反応に所望される1つの部位以外すべての部位の該構成要素(例えば、インスリン)を選択的に保護し、続いて、物質体を反応させ、精製した後、脱保護工程を行なうことが好都合な場合があり得る。例えば、文献にて入手可能なインスリンのアミン基の選択的保護の例は数多くあり、酸性(BOC)、弱酸性(無水シトラコン酸)、および塩基性(MSC)条件下で脱保護され得るものが挙げられる(例えば、Tsaiら、J.Pharm.Sci.86:1264−1268、1997;Dixonら、Biochem.J.109:312−314、1968;およびSchuettlerら、D.Brandenburg Hoppe Seyler’s Z.Physiol.Chem.360:1721、1979を参照のこと)。一例では、Gly−A1とLys−B29のアミンがtert−ブトキシカルボニル(BOC)基で選択的に保護され得、次いで、この基は、90%トリフルオロ酢酸(TFA)/10%アニソールの溶液中、4Cで1時間のインキュベーションによるコンジュゲーション後に除去される。一実施形態では、インスリンの乾燥粉末を無水DMSOに溶解させた後、過剰のトリエチルアミンを溶解させる。この溶液に、ほぼ2当量の重炭酸ジ−tert−ブチル溶液(THF中)をゆっくり添加し、溶液を30〜60分間混合する。反応後、粗製溶液を過剰のアセトンに注入した後、希HClを滴下し、反応したインスリンを沈殿させる。この沈殿物を遠心分離し、アセトンで洗浄し、真空下で完全に乾燥させる。所望のジ−BOC保護生成物は、未反応インスリン、所望でないジ−BOC異性体、ならびにモノ−BOCおよびトリ−BOC副生成物から、分取用逆相HPLCまたはイオン交換クロマトグラフィーを用いて分離され得る(例えば、Tsaiら、J.Pharm.Sci.86:1264−1268、1997を参照のこと)。逆相HPLCの場合、粗製生成物の70%水/30%アセトニトリル溶液(0.1%のTFA含有)をC8カラムに負荷し、アセトニトリル漸増勾配により溶出させる。所望のジ−BOCピークを収集し、回転濃縮してアセトニトリルを除去し、凍結乾燥させて純粋な生成物を得る。
LRPBおよびLRPD(非共有結合性コンジュゲーション)
当業者には、さまざまなコンジュゲーション化学反応が、XとTおよび/またはWとT(包括的には、「構成要素」)の非共有結合性コンジュゲーションに使用され得ることが認識されよう。かかる手法は当該技術分野で広く知られており、例示的な手法を以下に論考する。一部の特定の実施形態では、ヒト血清中での該非共有結合の解離定数(Kd)が1pmol/L未満である。例えば、該構成要素はコンジュゲート枠組構造に、当該技術分野でよく知られた非共有結合性のリガンド−受容体ペア(例えば、限定されないが、ビオチン−アビジン系ペア)によって非共有結合され得る。かかる実施形態では、リガンド受容体ペアの一方の構成員が該構成要素に共有結合され、該ペアの他方の構成員がコンジュゲートの枠組構造に共有結合される。該構成要素とコンジュゲート枠組構造を合わせると、リガンドとその受容体間の強力な非共有結合性相互作用によって、該構成要素がコンジュゲートの枠組構造に非共有結合で結合された状態になる。典型的なリガンド/受容体ペアとしては、タンパク質/補因子および酵素/基質のペアが挙げられる。よく使用されるビオチン/アビジンペアの他に、このようなペアとしては、限定されないが、ビオチン/ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン/抗ジゴキシゲニン、FK506/FK506結合タンパク質(FKBP)、ラパマイシン/FKBP、シクロフィリン/シクロスポリン、およびグルタチオン/グルタチオントランスフェラーゼのペアが挙げられる。他にも適当なリガンド/受容体ペア、例えば、限定されないが、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、c−myc、FLAG(登録商標)、さらには、Kessler pp.105−152、Advances in Mutagenesis」、Kessler編、Springer−Verlag、1990;「Affinity Chromatography:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)」、Pascal Baillon編、Humana Press、2000;およびHermansonらによる「Immobilized Affinity Ligand Techniques」、Academic Press、1992に記載のものなどのエピトープタグとのペアでのモノクローナル抗体が当業者に認識され得よう。
当業者には、さまざまなコンジュゲーション化学反応が、XとTおよび/またはWとT(包括的には、「構成要素」)の非共有結合性コンジュゲーションに使用され得ることが認識されよう。かかる手法は当該技術分野で広く知られており、例示的な手法を以下に論考する。一部の特定の実施形態では、ヒト血清中での該非共有結合の解離定数(Kd)が1pmol/L未満である。例えば、該構成要素はコンジュゲート枠組構造に、当該技術分野でよく知られた非共有結合性のリガンド−受容体ペア(例えば、限定されないが、ビオチン−アビジン系ペア)によって非共有結合され得る。かかる実施形態では、リガンド受容体ペアの一方の構成員が該構成要素に共有結合され、該ペアの他方の構成員がコンジュゲートの枠組構造に共有結合される。該構成要素とコンジュゲート枠組構造を合わせると、リガンドとその受容体間の強力な非共有結合性相互作用によって、該構成要素がコンジュゲートの枠組構造に非共有結合で結合された状態になる。典型的なリガンド/受容体ペアとしては、タンパク質/補因子および酵素/基質のペアが挙げられる。よく使用されるビオチン/アビジンペアの他に、このようなペアとしては、限定されないが、ビオチン/ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン/抗ジゴキシゲニン、FK506/FK506結合タンパク質(FKBP)、ラパマイシン/FKBP、シクロフィリン/シクロスポリン、およびグルタチオン/グルタチオントランスフェラーゼのペアが挙げられる。他にも適当なリガンド/受容体ペア、例えば、限定されないが、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、c−myc、FLAG(登録商標)、さらには、Kessler pp.105−152、Advances in Mutagenesis」、Kessler編、Springer−Verlag、1990;「Affinity Chromatography:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)」、Pascal Baillon編、Humana Press、2000;およびHermansonらによる「Immobilized Affinity Ligand Techniques」、Academic Press、1992に記載のものなどのエピトープタグとのペアでのモノクローナル抗体が当業者に認識され得よう。
kおよびq
一般式(II)のコンジュゲートでは、kは2〜11(両端を含む)の整数であり、該コンジュゲート内にk−分岐部が少なくとも2つあることを規定する。一部の特定の実施形態では、k=2または3である。qは1〜4(両端を含む)の整数であり、中央の−A−基に結合されたD基の数を規定する。一部の特定の実施形態では、q=1である。一部の実施形態では、q=2である。k+qは3〜6(両端を含む)の整数である。一部の特定の実施形態では、k+q=3または4である。
一般式(II)のコンジュゲートでは、kは2〜11(両端を含む)の整数であり、該コンジュゲート内にk−分岐部が少なくとも2つあることを規定する。一部の特定の実施形態では、k=2または3である。qは1〜4(両端を含む)の整数であり、中央の−A−基に結合されたD基の数を規定する。一部の特定の実施形態では、q=1である。一部の実施形態では、q=2である。k+qは3〜6(両端を含む)の整数である。一部の特定の実施形態では、k+q=3または4である。
一般式(III)のコンジュゲートでは、jが2、3または4のとき、kは、1〜11(両端を含む)の整数である。一部の特定の実施形態では、kは1、2または3である。qは1〜4(両端を含む)の整数であり、中央の−A−基に結合されたD基の数を規定する。一部の特定の実施形態では、q=1である。一部の実施形態では、q=2である。k+qは3〜6(両端を含む)の整数である。一部の特定の実施形態では、k+q=3または4である。
pおよびm
存在するpは各々、独立して1〜5(両端を含む)の整数である。一部の特定の実施形態では、存在する各pは同じである。一部の特定の実施形態では、p=1、2または3である。一部の特定の実施形態では、p=1である。
存在するpは各々、独立して1〜5(両端を含む)の整数である。一部の特定の実施形態では、存在する各pは同じである。一部の特定の実施形態では、p=1、2または3である。一部の特定の実施形態では、p=1である。
存在するmは各々、独立して1〜5(両端を含む)の整数である。一部の特定の実施形態では、存在する各mは同じである。一部の特定の実施形態では、m=1、2または3である。一部の特定の実施形態では、m=1である。
nおよびv
存在するnは各々、独立して0〜5(両端を含む)の整数であるが、各k−分岐部において、存在するnの少なくとも1つは≧1であるものとする。所与のk−分岐部内の分岐を、本明細書ではn−分岐部と称する。
存在するnは各々、独立して0〜5(両端を含む)の整数であるが、各k−分岐部において、存在するnの少なくとも1つは≧1であるものとする。所与のk−分岐部内の分岐を、本明細書ではn−分岐部と称する。
一部の特定の実施形態では、p−括弧部分内に存在する−A−は各々、n≧1の値に該当する数のn−括弧部分で置換されている(例えば、上記式(IIa)を参照のこと)。一部のかかる実施形態では、該コンジュゲート内に存在する各nは同じである。このような実施形態の一部において、n=1または2である。
他の実施形態では、p−括弧部分内の末端に存在する−A−のみが、n≧1の値に該当する数のn−括弧部分で置換されている(例えば、上記の式(IIb)を参照のこと)。一部の特定の実施形態では、各k−分岐部に含まれるn≧1の存在は1つだけである(すなわち、存在する他のすべてのn=0)。一部のかかる実施形態では、該コンジュゲート内に存在する各nは同じである。このような実施形態の一部において、n=1または2である。
存在するvは各々、独立して0〜5(両端を含む)の整数であるが、各k−分岐部において、存在するvの少なくとも1つは≧1であるものとする。
一部の特定の実施形態では、m−括弧部分内に存在する−A−は各々、v≧1の値に該当する数のB部分で置換されている(例えば、上記式(IIc)を参照のこと)。一部のかかる実施形態では、該コンジュゲート内に存在する各vは同じである。このような実施形態の一部において、v=1または2である。
他の実施形態では、m−括弧部分内の末端に存在する−A−のみが、v≧1の値に該当する数のB部分で置換されている(例えば、上記式(IId)を参照のこと)。一部の特定の実施形態では、各k−分岐部は、含まれるv≧1の存在が1つだけである(すなわち、存在する他のすべてのv=0)。一部のかかる実施形態では、該コンジュゲート内に存在する各vは同じである。このような実施形態の一部において、v=1または2である。一部の特定の実施形態では、各n−分岐部は、含まれるv≧1の存在が少なくとも1つである。一部の特定の実施形態では、各n−分岐部は、含まれるv≧1の存在が1つだけである(すなわち、存在する他のすべてのv=0)。一部のかかる実施形態では、該コンジュゲート内に存在する各vは同じである。このような実施形態の一部において、v=1または2である。
j
式(III)のjは1〜4(両端を含む)の整数であり、D基へのコンジュゲーションの数を規定する。一部の特定の実施形態では、j=1である。一部の特定の実施形態では、j=2である。一部の実施形態では、j=3である。他の実施形態では、j=4である。
式(III)のjは1〜4(両端を含む)の整数であり、D基へのコンジュゲーションの数を規定する。一部の特定の実施形態では、j=1である。一部の特定の実施形態では、j=2である。一部の実施形態では、j=3である。他の実施形態では、j=4である。
負荷レベル
一般に、コンジュゲートに負荷される薬物(または検出可能な標識)の数は、該薬物(または検出可能な標識)の分子量に依存し、コンジュゲートの枠組構造の分子量および/または化学的活性化(すなわち、懸垂基を枠組構造に付加した場合)のレベルを調整することにより制御され得る。種々の実施形態において、薬物および/または検出可能な標識の負荷レベルは、コンジュゲート(例えば、薬物など)に対して薬物および/または検出可能な標識が5〜99%w/wの範囲であり得る。種々の実施形態において、50〜99%のより狭い範囲内(例えば、80〜99%の範囲)の負荷レベルが使用され得る。
一般に、コンジュゲートに負荷される薬物(または検出可能な標識)の数は、該薬物(または検出可能な標識)の分子量に依存し、コンジュゲートの枠組構造の分子量および/または化学的活性化(すなわち、懸垂基を枠組構造に付加した場合)のレベルを調整することにより制御され得る。種々の実施形態において、薬物および/または検出可能な標識の負荷レベルは、コンジュゲート(例えば、薬物など)に対して薬物および/または検出可能な標識が5〜99%w/wの範囲であり得る。種々の実施形態において、50〜99%のより狭い範囲内(例えば、80〜99%の範囲)の負荷レベルが使用され得る。
その他
種々の実施形態において、生物分解性の枠組構造が使用され得る。種々の実施形態において、例えば、生物分解性が適用用途に関係がない場合、および/または得られた枠組構造もしくはコンジュゲートが充分に良好に排出され、生物分解性が必要でない場合は、非生物分解性の枠組構造が使用され得る。種々の実施形態において、コンジュゲートの枠組構造(またはスペーサー(例えば、薬物と枠組構造の間に存在する場合))は、酵素による消化に感受性である。種々の実施形態において、酵素は投与部位に存在する。当業者には、コンジュゲート枠組構造を切断することがあり得るいくつかの酵素が患者に存在することが認識されよう。限定されないが、このようなものとしては、サッカリダーゼ、ペプチダーゼ、およびヌクレアーゼが挙げられる。例示的なサッカリダーゼとしては、限定されないが、マルターゼ、スクラーゼ、アミラーゼ、グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、およびデキストラナーゼが挙げられる。例示的なペプチダーゼとしては、限定されないが、ジペプチジルペプチダーゼ−IV、プロリルエンドペプチダーゼ、プロリダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、およびグリシルグリシンジペプチダーゼが挙げられる。例示的なヌクレアーゼとしては、限定されないが、デオキシリボヌクレアーゼI、リボヌクレアーゼA、リボヌクレアーゼ(ribonucelase)T1、およびヌクレアーゼSlが挙げられる。
種々の実施形態において、生物分解性の枠組構造が使用され得る。種々の実施形態において、例えば、生物分解性が適用用途に関係がない場合、および/または得られた枠組構造もしくはコンジュゲートが充分に良好に排出され、生物分解性が必要でない場合は、非生物分解性の枠組構造が使用され得る。種々の実施形態において、コンジュゲートの枠組構造(またはスペーサー(例えば、薬物と枠組構造の間に存在する場合))は、酵素による消化に感受性である。種々の実施形態において、酵素は投与部位に存在する。当業者には、コンジュゲート枠組構造を切断することがあり得るいくつかの酵素が患者に存在することが認識されよう。限定されないが、このようなものとしては、サッカリダーゼ、ペプチダーゼ、およびヌクレアーゼが挙げられる。例示的なサッカリダーゼとしては、限定されないが、マルターゼ、スクラーゼ、アミラーゼ、グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、およびデキストラナーゼが挙げられる。例示的なペプチダーゼとしては、限定されないが、ジペプチジルペプチダーゼ−IV、プロリルエンドペプチダーゼ、プロリダーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、およびグリシルグリシンジペプチダーゼが挙げられる。例示的なヌクレアーゼとしては、限定されないが、デオキシリボヌクレアーゼI、リボヌクレアーゼA、リボヌクレアーゼ(ribonucelase)T1、およびヌクレアーゼSlが挙げられる。
また、当業者には、酵素の選択によっては、酵素的切断に感受性であるコンジュゲート枠組構造がいくつか存在することが認識されよう。例えば、サッカリダーゼ分解が所望される場合、多糖類を含む枠組構造が使用され得る(例えば、限定されないが、1,4−結合α−D−グルコース残基の反復鎖を含む多糖を含むコンジュゲートは、α−アミラーゼによって分解される)。限定されないが、好適な多糖類としては、任意の数の供給源、例えば限定されないが、スイートコーン、牡蠣、肝臓(ヒト、ウシ、ウサギ、ラット、ウマ)、筋肉(ウサギ脚部、ウサギ腹部、魚、ラット)、ウサギの毛、フナガイ(slipper limpet)、パン酵母、および真菌由来のグリコゲンおよび部分消化グリコゲンが挙げられる。使用され得る他の多糖ポリマーおよびスペーサーとしては、カルボキシル化多糖類、−NH2懸垂多糖類、ヒドロキシル化多糖類、アルギネート、コラーゲン−グリコサミノグリカン、コラーゲン、マンナン、アミロース、アミロペクチン、セルロース、ヒアルロネート、コンドロイチン、デキストリン、キトサンなどが挙げられる。ペプチダーゼ切断が所望される場合、切断酵素によって認識されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが使用され得る(例えば、限定されないが、[−グリシン−プロリン−]配列を含むコンジュゲートは、プロリダーゼによって分解される)。一部の特定の実施形態では、アミン化アミノ酸と非アミン化アミノ酸のコポリマー、ヒドロキシル化アミノ酸と非ヒドロキシル化アミノ酸のコポリマー、カルボキシル化アミノ酸と非カルボキシル化アミノ酸のコポリマー、上記のもののコポリマーまたは上記のものの付加物が使用され得る。ヌクレアーゼ分解が所望される場合、ポリヌクレオチドが使用され得る(例えば、限定されないが、連続アデノシン残基のオリゴマーを含むポリヌクレオチドを含むコンジュゲートは、リボヌクレアーゼAによって分解される)。
種々の実施形態において、コンジュゲート(すなわち、コンジュゲート型薬物および/または化学的もしくは酵素的分解によってコンジュゲートから放出された薬物)の薬物動態的および/または薬力学的挙動は、対応する非コンジュゲート薬物と実質的に同じであり得る(例えば、ともに、皮下投与した場合)。例えば、薬物動態的(PK)見地から、血清濃度曲線は、同等量の非コンジュゲート薬物を投与した場合と実質的に同じであり得る。付加的または択一的に、血清T最大、血清C最大、平均血清滞留時間(MRT)、平均血清吸収時間(MAT)および/または血清半減期は、非コンジュゲート薬物を投与した場合と実質的に同じであり得る。薬力学的(PD)見地からは、該コンジュゲートは、体内物質に対して、非コンジュゲート薬物と実質的に同様に作用し得る。例えば、インスリンコンジュゲートの場合、該コンジュゲートは、血中グルコースレベルに対して非コンジュゲートインスリンと実質的に同様の影響を及ぼし得る。この場合、実質的に同様の薬力学的挙動は、最小血中グルコース濃度(T底)に達するまでの時間、血中グルコースレベルが初期値の一定の割合より下(例えば、初期値の70%またはT70%BGL)の状態に維持される持続時間など比較することにより観察され得る。このようなPKおよびPD特性は、公開された任意のさまざまな薬物動態的および薬力学的方法に従って測定され得ることは認識されよう(例えば、皮下送達に適した方法については、Baudysら、Bioconjugate Chem.9:176−183、1998を参照のこと)。
一実施形態において、コンジュゲート(すなわち、アプタマーなしの単離された形態)では、非コンジュゲート薬物で測定される値の40%以内である薬物動態的(PK)パラメータ(最大血清薬物濃度に達する時間(T最大)、平均薬物滞留時間(MRT)、血清半減期、および平均薬物吸収時間(MAT)など)が得られる。種々の実施形態において、コンジュゲートでは、非コンジュゲート薬物で得られるものの35%、30%、25%、20%、15%以内、あるいはさらに10%以内であるPKパラメータが得られる。一部の実施形態では、コンジュゲートでは、非コンジュゲート薬物で得られるものの20%以内であるPKパラメータが得られる。例えば、皮下送達のためのインスリンコンジュゲートに関する実施形態では、コンジュゲートで、15〜30分のインスリンT最大、50分未満の平均インスリン滞留時間(MRT)、または40分未満の平均インスリン吸収時間(MAT)が得られ得、これらはすべて、ヒト組換えインスリン処置群で測定される値の20%以内である。一部の特定の実施形態では、コンジュゲートで、20〜25分のインスリンT最大、45分未満の平均インスリン滞留時間(MRT)、および35分未満の平均インスリン吸収時間(MAT)が得られ得る。一部の特定の実施形態では、コンジュゲートで、120分未満、例えば、100分未満の血清半減期が得られ得る。
一実施形態において、本発明のコンジュゲートでは、物質の最小/最大血中濃度に達する時間(T底/T最大)または物質の血中レベルが初期値の70%より下/130%より上の状態に維持される持続時間(T70%BL/T130%AL)などの薬力学的(PD)パラメータが得られる。例えば、皮下送達のためのインスリンコンジュゲートに関する実施形態では、コンジュゲートで、45〜60分のグルコースT底および180分未満のグルコースT70%BLが得られ得、これらはどちらも、ヒト組換えインスリン処置群で測定される値の20%以内である。一部の特定の実施形態では、コンジュゲートで、50〜55分のグルコースT底および160分未満のグルコースT70%BGLが得られ得る。種々の実施形態において、コンジュゲートで、非コンジュゲート薬物で得られるものの40%、35%、30%、25%、20%、15%以内、あるいはさらに10%以内であるPDパラメータが得られる。一部の実施形態では、コンジュゲートで、非コンジュゲート薬物で得られるものの20%以内であるPDパラメータが得られる。
コンジュゲートの調製のための中間体
一態様において、本発明は、本開示のコンジュゲートを調製するための試薬を提供する。したがって、種々の実施形態において、一般式(II):
(式中、−A−、T、D、k、q、k+q、p、n、mおよびvは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し;
Bは、−T−LB’であり;
存在するLB’は各々、独立して、水素、アルキン含有部分、アジド含有部分、または任意選択で置換されているカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性、もしくはヒドロキシル反応性部分である)の化合物が提供される。
一態様において、本発明は、本開示のコンジュゲートを調製するための試薬を提供する。したがって、種々の実施形態において、一般式(II):
(式中、−A−、T、D、k、q、k+q、p、n、mおよびvは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し;
Bは、−T−LB’であり;
存在するLB’は各々、独立して、水素、アルキン含有部分、アジド含有部分、または任意選択で置換されているカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性、もしくはヒドロキシル反応性部分である)の化合物が提供される。
他の実施形態では、一般式(II):
(式中、−A−、T、B、k、q、k+q、p、n、mおよびvは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し;
Dは、−T−LD’であり;
存在するLD’は各々、独立して、水素、アルキン含有部分、アジド含有部分、または任意選択で置換されているカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性、もしくはヒドロキシル反応性部分である)の化合物が提供される。
(式中、−A−、T、B、k、q、k+q、p、n、mおよびvは各々、上記および本明細書において記載のとおりに定義し;
Dは、−T−LD’であり;
存在するLD’は各々、独立して、水素、アルキン含有部分、アジド含有部分、または任意選択で置換されているカルボニル反応性、チオール反応性、アミン反応性、もしくはヒドロキシル反応性部分である)の化合物が提供される。
コンジュゲートの調製方法
本発明者らは、例示的な薬物としてインスリン、ならびに例示的な親和性リガンドとしてアミノエチルグルコース(AEG)、アミノエチルマンノース(AEM)、アミノエチルビマンノース(AEBM)、および/またはアミノエチルトリマンノース(AETM)を使用し、前記コンジュゲートの調製方法の例を示した。限定されないが、2つの親和性リガンドと1つの薬物分子を有し、すべての枠組構造の構成要素間の距離が短いコンジュゲートは、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris)、Tris−スクシンイミジルアミノトリアセテート(TSAT)、tris−スクシンイミジル−1,3,5−ベンゼントリカルボキシレート(TSB)、およびベンゼン−1,3,5−トリカルボキシ−(N−4−酪酸−NHS−エステル)アミド(TSB−C4)をコンジュゲート枠組構造として用いて調製され得る。枠組構造の構成要素間にさらなる間隔が所望される場合は、スクシンイミジル(6−アミノカプロイル)アミノトリアセテート(TSAT−C6)、スクシンイミジル(6−アミノ(PEO−6))アミノトリアセテート(TSAT−PEO−6)、ベンゼン−1,3,5−トリカルボキシ−(N−6−アミノカプロン酸−NHSエステル)アミド(TSB−C6)、およびベンゼン−1,3,5−トリカルボキシ−(N−−10−アミノデカン酸−NHSエステル)アミド(TSB−C10)が使用され得る。TSAT−C6スペーサーアームの化学的性質はTSAT−PEO−6と比べ、該コンジュゲートに対して、より疎水性の性質を付与する。
本発明者らは、例示的な薬物としてインスリン、ならびに例示的な親和性リガンドとしてアミノエチルグルコース(AEG)、アミノエチルマンノース(AEM)、アミノエチルビマンノース(AEBM)、および/またはアミノエチルトリマンノース(AETM)を使用し、前記コンジュゲートの調製方法の例を示した。限定されないが、2つの親和性リガンドと1つの薬物分子を有し、すべての枠組構造の構成要素間の距離が短いコンジュゲートは、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris)、Tris−スクシンイミジルアミノトリアセテート(TSAT)、tris−スクシンイミジル−1,3,5−ベンゼントリカルボキシレート(TSB)、およびベンゼン−1,3,5−トリカルボキシ−(N−4−酪酸−NHS−エステル)アミド(TSB−C4)をコンジュゲート枠組構造として用いて調製され得る。枠組構造の構成要素間にさらなる間隔が所望される場合は、スクシンイミジル(6−アミノカプロイル)アミノトリアセテート(TSAT−C6)、スクシンイミジル(6−アミノ(PEO−6))アミノトリアセテート(TSAT−PEO−6)、ベンゼン−1,3,5−トリカルボキシ−(N−6−アミノカプロン酸−NHSエステル)アミド(TSB−C6)、およびベンゼン−1,3,5−トリカルボキシ−(N−−10−アミノデカン酸−NHSエステル)アミド(TSB−C10)が使用され得る。TSAT−C6スペーサーアームの化学的性質はTSAT−PEO−6と比べ、該コンジュゲートに対して、より疎水性の性質を付与する。
例えば、例示の目的で、一実施形態において、親和性リガンド(例えば、AEG、AEM、AEMBおよびAETM)とインスリンの両方を、TSAT−C6枠組構造に対して、末端活性化型エステルを介して反応させると、インスリン−TSAT−C6−AEG−2、インスリン−TSAT−C6−AEM−2、インスリン−TSAT−C6−AEMB−2、およびインスリン−TSAT−C6−AETM−2 コンジュゲートが得られ得る。本実施例に論考しているように、種々の親和性リガンドを事前に合成する。また、インスリンのA1およびB29アミノ基は、本実施例に記載のようにして、各インスリンがPhe−B1 α−アミノ基でのみ反応し得るようにBOC−保護する。ほぼ1当量のBOC−インスリンを、40〜50mg/mlのDMSO溶液として、室温で、過剰のトリエチルアミンを含有する50mg/mlのTSAT−C6のDMSO溶液に添加し、ほぼ1時間反応させる。次に、過剰のAEG、AEM、AEBMおよび/またはAETM(2〜10当量)を100mg/mlのDMSO溶液として添加し、さらに2時間反応させる。反応後、このDMSO溶液をpH5の生理食塩水緩衝液中で10倍に超希釈した後、pHを8.0に調整し、溶液をBiogel P2カラムに通して低分子量反応体および塩類を除去する。ボイド画分中に溶出された物質を、3K限外濾過装置を用いて濃縮した後、これを、分取規模の逆相HPLCカラム(C8,0.1%のTFAを含むアセトニトリル/水移動相)にインジェクションし、所望の生成物を未反応BOC2−インスリンから精製する。所望の溶出ピークを収集し、プールし、回転濃縮してアセトニトリルを除去した後、凍結乾燥して乾燥粉末を得る。最後に、この凍結乾燥粉末を90%TFA/10%アニソールに4Cで1時間溶解させた後、0.150M NaClを含むHEPES緩衝液(pH8.2)中で10倍超希釈することにより、BOC保護基を除去する。NaOH溶液を用いてpHを7.0〜8.0に調整した後、この物質をBiogel P2カラムに通して、アニソール、BOC、および他の混入塩を除去する。脱保護した精製コンジュゲートの水溶液を、次いで、所望のレベルまで濃縮し、必要時まで4Cで保存する。
この例示的な手順を使用し、TSAT−C6枠組構造を異なる枠組構造(後述)で置き換えることにより、親和性リガンドと薬物が異なる、コンジュゲーション化学反応が異なる、枠組構造の構成要素間の間隔が異なる、および/または結合価が異なる他のコンジュゲートが作製され得ることは認識されよう。
例えば、枠組構造の構成要素間にさらなる距離が必要とされる場合、および/またはコンジュゲーション部位に保存電荷が必要とされる場合は、適切なサイズのアミン含有ジエチルアセタール(例えば、アミノプロピオンアルデヒドジエチルアセタール(APDA)またはアミノブチルアルデヒドジエチルアセタール(ABDA))を、本明細書に記載の該枠組構造上の反応性基の1つにコンジュゲートさせた後、残りの反応性基と対象の親和性リガンド(例えば、AEM、AEBM、またはAETM)との反応を完了させてもよい。次いで、酸性条件下で該ジエチルアセタールから反応性アルデヒド基を顕在化させた後、インスリンとの還元的アミノ化を行なうと、薬物コンジュゲーション工程が完了し得、次いで、ABDA−TSAT、ABDA−LCTSATなどが使用され得る。
また別の例では、テトラキス−(N−スクシンイミジルカルボキシプロピル)ペンタエリトリトール(TSPE)を使用し、多価性の増大のために3つの親和性リガンドと1つ薬物分子が結合され得る。また、上記のいずれかの教示を用いて、さらに高次の結合価を有する超分岐(例えば、デンドリマー様)コンジュゲートが作製され得ることは当業者に認識されよう。例えば、RoeckendorfおよびLindhorstにより、Topics in Current Chemistry.217:202−238、2001に、超分岐構造を作製するための現行のアプローチの包括的な概説が示されている。
さらに、既に所定の多価性度合を含むリガンドを、上記の手順に従って再度反応させ、さらに高次のリガンド多重性を得てもよい。例えば、反応性末端アミンを含む二価のAEM−2、AEBM−2、またはAETM−2分子は、2つの各親和性リガンドを、反応性アミンもコンジュゲートされる適当な枠組構造にコンジュゲートさせることにより調製され得る。反応性末端アミンを含む三価のAEM−3、AEBM−3、またはAETM−3分子は、3つの各親和性リガンドを、反応性アミンもコンジュゲートされる適当な枠組構造にコンジュゲートさせることにより調製され得る。NH2−二価糖類を上記のものと同じ枠組構造と反応させると、薬物分子1つあたり4〜6個のリガンドを有する薬物コンジュゲートが得られ得る。NH2−三価糖類を上記のものと同じ枠組構造と反応させると、薬物分子1つあたり6〜9個のリガンドを有する薬物コンジュゲートが得られ得る。
すべての場合において、異なるリガンドの混合物は同じ薬物に、多価枠組構造の化学的性質、結合価、およびリガンド:該枠組構造の化学量論性を調整することにより該枠組構造を介してコンジュゲートされ得ることを認識されたい。例えば、インスリン−AEM−1−AEBM−1、インスリン−AEBM−1−AETM−1、インスリンAEM−2−AETM−2、およびインスリンAEM−1−AETM−2はすべて、この混合型リガンド法に従って合成され得る。
最後に、一部の場合では、親和性リガンドを枠組構造に、薬物とは異なる手段によってコンジュゲートさせることが望ましい場合があり得る。例えば、二価マレイミド/活性(activate)一価エステル官能化枠組構造(例えば、スクシンイミジル−3,5−ジマレイミドフェニルベンゾエート(SDMB))は、2つのスルフヒドリル官能化親和性リガンドと、1つのアミン官能化薬物を個別の工程でコンジュゲートさせるために使用され得る。例えば、インスリンまたは別のアミン含有薬物が枠組構造の活性化型エステル部分に、本明細書に記載の方法を用いてコンジュゲートされ得る。別工程で、アミノエチル糖類(AEM、AEBM、AETM)を、4−イミノチオランを用いた反応によって、末端スルフヒドリル含有リガンドに変換させてもよい。最後に、枠組構造−ジ−マレイミド−インスリンコンジュゲートを、過剰のスルフヒドリル官能化糖類と混合すると、二価糖類−インスリンコンジュゲートの生成がもたらされ得る。
架橋物質体
コンジュゲートと架橋剤を標的分子の非存在下で合わせると、非共有結合性架橋物質体が形成される。種々の実施形態において、該物質体は、水溶液中で、アプタマーとコンジュゲートの溶液を混合することにより自己集合によって調製され得る。種々の実施形態において、逆乳化によって該物質体の粒子が調製され得る。より詳細に米国特許出願公開公報第2004−0202719に記載されているように、これは、前記水溶液を、疎水性液と界面活性剤の混合物に添加し、混合物を撹拌することにより行なわれ得る。
コンジュゲートと架橋剤を標的分子の非存在下で合わせると、非共有結合性架橋物質体が形成される。種々の実施形態において、該物質体は、水溶液中で、アプタマーとコンジュゲートの溶液を混合することにより自己集合によって調製され得る。種々の実施形態において、逆乳化によって該物質体の粒子が調製され得る。より詳細に米国特許出願公開公報第2004−0202719に記載されているように、これは、前記水溶液を、疎水性液と界面活性剤の混合物に添加し、混合物を撹拌することにより行なわれ得る。
架橋物質体は、形成されたら、さまざまな適用用途に使用され得る。該物質体を遊離標的分子の存在下に入れると、該分子は、架橋剤とコンジュゲート間の相互作用に関して競合する。ある一定濃度より上の遊離標的分子では、競合レベルは、コンジュゲートが表面から放出されることにより、該物質体が分解され始めるようなものになる。種々の実施形態において、放出の程度および/または速度は、標的分子の濃度が増大するにつれて増大する。その結果、コンジュゲートは該物質体から、標的分子の局所濃度に直接関連する様式で放出される。
一般に、該物質体の放出特性は、アプタマー、コンジュゲート、標的分子の性質および条件(例えば、pH、温度など)に依存する。アプタマーの親和性が、標的分子に対するよりもコンジュゲートに対する方がずっと大きい場合、該物質体は、高い標的分子濃度でコンジュゲートのみを放出する。コンジュゲートに対するアプタマーの相対親和性が減少するにつれて、該物質体からのコンジュゲートの放出は、より低い標的分子濃度で起こる。また、該物質体の放出特性は、コンジュゲートに対するアプタマーの相対量を変更することにより調整され得る。コンジュゲートに対するアプタマーの比率が高いほど、より高い標的分子濃度でコンジュゲートを放出する物質体がもたらされる。コンジュゲートに対するアプタマーの比率が低いほど、より低い標的分子濃度でコンジュゲートを放出する物質体がもたらされる。適用用途に応じて、このような変更により、多種多様な標的分子濃度に応答する物質体を作製することが可能なことは認識されよう。
種々の実施形態において、架橋物質体は、37CでpH7のHEPES緩衝生理食塩水(150mMのNaClを含む25mMのHEPES)に入れたとき不溶性である。種々の実施形態において、標的分子を該緩衝液に、セットポイントと称される閾値濃度まで添加したとき、架橋物質体は実質的に不溶性のままである。セットポイントより上では、架橋物質体は、コンジュゲートの放出の程度および速度の増大を示す。この遷移は、急激に起こることもあり、セットポイント近くの一連の濃度にわたって緩徐に起こり得ることは認識されよう。一般に、所望のセットポイントおよび遷移は、標的分子の性質および該物質体の意図される適用用途に依存する。特に、該物質体を、特定の標的分子のレベルの増大に応答するように設計した場合、所望のセットポイントは、標的分子の通常の生理学的濃度範囲に基づいて決定される。患者内に存在する標的分子の量は、内的および/または外的要因に基づいて変動し得ることは理解されよう。例えば、一部の特定の実施形態では、標的分子の量は、例えば、ホルモン性サイクルまたは代謝経路の変化(耐久事象の際に増大する乳酸など)に応答して経時的に自然に変動し得る。一部の特定の実施形態では、該変動は、外的事象、例えば、食後のグルコースの増大に起因するものであり得る。種々の実施形態において、外的要因は、本開示の物質体からのコンジュゲートの放出を人工的に誘発するために使用され得る。例えば、コンジュゲートの放出がグルコースの増加に感受性である場合、コンジュゲートは、高グルコース飲料の摂取により、短期間で人工的に放出され得る。
種々の実施形態において、標的分子はグルコースである。ヒトの通常のグルコースの生理学的濃度範囲は60〜200mg/dLである。60mg/dL未満のグルコース濃度を低血糖とみなす。200mg/dLより高いグルコース濃度を高血糖とみなす。種々の実施形態において、本開示の物質体は、50rpmでUSP溶出試験法IIを使用し、20、30、40、50、60、70、80、90または100mg/dLのグルコースを含む37CでpH7のHEPES緩衝生理食塩水に6時間入れたとき、実質的に不溶性のままであり得る。種々の実施形態において、50rpmでUSP溶出試験法IIを使用し、20、30、40、50、60、70、80、90または100mg/dLのグルコースを有する37CでpH7のHEPES緩衝生理食塩水に6時間入れたとき、溶解する物質体は1、2、4、6、8または10%未満である。種々の実施形態において、50rpmでUSP溶出試験法IIを使用し、100、150、200、250、300、350または400mg/dLのグルコースを有する37CでpH7のHEPES緩衝生理食塩水に6時間入れたとき、本開示の物質体の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90または100%が溶解する。
以下の表に、他の例示的な標的分子の通常の生理学的範囲を示す。
これらおよび他の標的分子に対する所望のセットポイントは、さまざまな異なる適用用途に対して容易に決定され得ることは認識されよう。また、セットポイントは、特定の患者(例えば、患者の性別、患者が異常に低い、もしくは高レベルの標的分子を有することなどに基づいて)または適用用途(例えば、高頻度基準で放出するように設計された薬物送達系は、低頻度で放出するように設計された系よりも低い閾値濃度を必要とし得る)に対して調整する必要があり得ることも認識されよう。
所望のセットポイントを有する物質体は、本明細書に記載の材料および方法を用いて、常套的な実験手法によって作製され得ることは認識されよう。例えば、同じアプタマーとコンジュゲートを組み合わせて、コンジュゲートに対するアプタマーの比(w/w)を漸増させた一連の物質体を作製することができる。このような物質体は、ある範囲のセットポイントをカバーする。適当なセットポイントを有するリード物質体が特定されたら、最適化物質体を得るために、より精密な解像を用いて該プロセスを繰り返してもよい。択一的に(または付加的に)、同じコンジュゲートを、該コンジュゲートに対して親和性を漸増させた複数の異なるアプタマーと組み合わせてもよい。これにより、ある範囲のセットポイントを有する複数の物質体が得られ、これを、さらに精密化してもよい(例えば、コンジュゲートに対するアプタマーのw/w比を変更することにより)。あるいはまた、同じアプタマーを複数の異なるコンジュゲートと組み合わせることにより該プロセスを開始してもよい。種々の実施形態において、該コンジュゲートは、該アプタマーに対して種々の親和性を有するものであり得る(例えば、異なる親和性リガンドを含めた結果として)。種々の実施形態において、該コンジュゲートは、同じ親和性リガンドを含むが、異なる分子量を有するものであり得る(例えば、コンジュゲート枠組構造が異なる結果として)。
使用
別の態様では、本開示により、該物質体の使用方法を提供する。一般に、該物質体は、標的分子に応答して該コンジュゲートを制御可能に放出させるために使用され得る。以下に論考するように、該物質体は標的分子と、インビトロで接触させてもよく、インビボで接触させてもよい。
別の態様では、本開示により、該物質体の使用方法を提供する。一般に、該物質体は、標的分子に応答して該コンジュゲートを制御可能に放出させるために使用され得る。以下に論考するように、該物質体は標的分子と、インビトロで接触させてもよく、インビボで接触させてもよい。
種々の実施形態において、該物質体は、インビトロまたはインビボ化学センサーの構成要素として使用され得る。この態様を以下に、グルコースセンサーとの関連において説明するが、前述のことから、単に異なる標的分子を使用することで、他の化学センサーが作製され得ることは認識されよう。
例えば、種々の実施形態において、本開示の物質体は、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)に基づいたグルコースセンサーに使用され得る。FRETは、2種類の異なるフルオロフォアが互いに近づくと、これにより、この2種類のフルオロフォア間でのエネルギー転移が可能になり、一方または両方のフルオロフォアの蛍光の減少(蛍光の消光と称される)がもたらされることに基づいている(Ballerstadtら、Anal.Chim.Acta 345:203−212、1997)。例えば、一部の特定の実施形態において、グルコースの非存在下では、蛍光標識アプタマーと蛍光標識コンジュゲートの混合物が不溶性の架橋物質体を形成し、近隣のフルオロフォアがFRETを受ける。グルコースの存在下では、蛍光標識アプタマーと蛍光標識コンジュゲート間の平均距離が増大して、FRETレベルの減少が引き起こされ、それにより、個々の蛍光シグナルの増大がもたらされる。そのため、蛍光レベルはグルコースレベルと直接相関し得る。蛍光標識ペアの代わりに、近接すると測定可能な応答をもたらす択一的な標識ペアを使用してもよいことは理解されよう。したがって、一部の特定の実施形態では、本発明は、(I)(a)グルコースに対する結合部位を少なくとも2つ有する多価ポリヌクレオチドアプタマーであって、第1の標識を含む多価ポリヌクレオチドアプタマーと、(b)親和性リガンドおよび第2の標識を含むコンジュゲートと、を混合する工程、ここで、第1の標識は、第2の標識に近接していると、測定可能な応答をもたらす;(II)試料を、該多価ポリヌクレオチドアプタマーと該コンジュゲートの混合物に曝露する工程、ここで、(a)グルコースが試料中に存在しない場合、該コンジュゲートは該ポリヌクレオチドアプタマーと、該ポリヌクレオチドアプタマーに対する親和性結合によって架橋物質体を形成し、測定可能な応答をもたらし、(b)グルコースが試料中に存在する場合、試料由来のグルコースが該コンジュゲートと、該ポリヌクレオチドアプタマー上の結合部位に関して競合する結果、該架橋物質体の形成が抑止されるため応答が低減される;ならびに(III)試料中のグルコースの存在および任意選択で量を測定するセンサーにより該応答を検出し、任意選択で該応答を測定する工程を含む方法を提供する。一部の特定の実施形態では、第1および第2の標識は蛍光標識であり、応答は蛍光シグナルである。
一部の特定の実施形態では、2つの標識(例えば、蛍光標識)は、同じポリヌクレオチドアプタマーに結合することにより近接する異なる分子上に配置され得る。したがって、一部の特定の実施形態では、本発明は、(I)(a)グルコースに対する結合部位を少なくとも2つ有する多価ポリヌクレオチドアプタマーと、(b)親和性リガンドおよび第1の標識を含む第1の分子群と、(c)親和性リガンドおよび第2の標識を含む第2の分子群と、を混合する工程、ここで、第1の標識は、第2の標識に近接していると測定可能な応答をもたらす、(II)試料を、該多価ポリヌクレオチドアプタマーと第1の分子群および第2の分子群との混合物に曝露する工程、ここで、(a)グルコースが試料中に存在しない場合、第1の分子群および第2の分子群の構成員は、該多価ポリヌクレオチドアプタマーに対する親和性結合によって近接し、結合複合体および測定可能な応答をもたらし、(b)グルコースが試料中に存在する場合、試料由来のグルコースが、第1および第2の分子と、該多価ポリヌクレオチドアプタマー上の結合部位に関して競合する結果、前記結合複合体の形成が少なくなるため応答が低減される;ならびに(III)試料中のグルコースの存在および任意選択で量を測定するセンサーにより該応答を検出し、任意選択で該応答を測定する工程を含む方法を提供する。一部の特定の実施形態では、第1および第2の標識は蛍光標識であり、応答は蛍光シグナルである。
他の例示的な実施形態において、本開示の物質体は、粘度系グルコースセンサーに使用され得る(例えば、米国特許第6,267,002号;同第6,477,891号;および同第6,938,463号を参照のこと)。この場合も、コンジュゲートとアプタマーを合わせると架橋物質体が形成される。次に、該物質体にグルコースを添加すると、測定可能な(例えば、円錐平板型構造のマイクロビスコメータ機構を使用し、剪断速度の関数として)粘度の濃度依存的低下が引き起こされる。そのため、試料の粘度は、グルコースレベルと直接相関し得る。これらの2つの例示的なグルコースセンサーは、該コンジュゲート内になんら薬物の存在を必要としないことは認識されよう。また、該粘度系センサーは、該コンジュゲート内に検出可能な標識の存在を必要としないことも認識されよう。
一部の特定の実施形態では、本発明は、(I)(a)複数の親和性リガンドを含むコンジュゲートと、(b)グルコースに対する結合部位を少なくとも2つ有する多価ポリヌクレオチドアプタマーを準備する工程;(II)該コンジュゲートと該ポリヌクレオチドアプタマーを混合する工程、ここで、得られた混合物の粘性は、該コンジュゲートと該ポリヌクレオチドアプタマー間の結合によるものである;(III)該混合物を、グルコースを含む試料と接触させる工程、これにより、該コンジュゲートが該ポリヌクレオチドアプタマーから外れ、濃度依存性の粘性の低下が引き起こされる;ならびに(IV)生じた粘性の変化を検出し、任意選択で該変化を測定し、試料中のグルコースの存在および任意選択で量を測定する工程を含む方法を提供する。
種々の実施形態において、該物質体は、患者に薬物を制御可能に送達するために使用され得る。本発明は、本開示の物質体を投与することによる疾患または病状の処置を包含する。該物質体は、任意の患者(例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、マウスなど)の処置に使用され得るが、ヒトの処置に最も好ましく使用される。該物質体は、患者に任意の経路によって投与され得る。一般に、最も適切な投与経路は、さまざまな要素、例えば、処置対象の疾患または病状の性質、薬物の性質、標的分子の性質、患者の体調などに依存する。一般に、本開示は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、皮下、脳室内、経皮、経直腸、膣内、腹腔内、経表面(粉剤、軟膏もしくは滴剤により)、口腔内による投与、または経口もしくは経鼻スプレー剤もしくはエーロゾル剤としての投与を包含する。このような種々の経路のための医薬組成物の製剤化および製造における一般的な考慮事項は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第19版、Mack Publishing Co.,Easton、PA、1995に記載されている。
種々の実施形態において、該物質体は、例えば注射によって皮下投与され得る。該物質体を、送達を容易にするための担体に溶解させてもよい。例えば、担体は、水溶液、限定されないが、例えば滅菌水、生理食塩水または緩衝生理食塩水であり得る。一般に、コンジュゲート形態の薬物の治療有効量が投与される。薬物の「治療有効量」により、妥当な便益/リスク比(これは、薬物の有効性と毒性の均衡が関与する)で疾患または病状を処置するのに(例えば、その症状が改善される、進行が遅延される、再発が抑制される、発症が遅延されるなどに)充分な薬物の量を意図する。一般に、治療有効性と毒性は、標準的な薬理学的手順によって、細胞培養物において、または実験動物を用いて、例えば、ED50(処置した被検体の50%において治療上有効である用量)およびLD50(処置した被検体の50%に対して致死性の用量)を計算することにより判定され得る。ED50/LD50は薬物の治療指数を表す。一般に、当該技術分野で周知のように、大きな治療指数を有する薬物が好ましいが、重篤な疾患または病状の場合、特に、択一的な治療選択肢がない場合は、小さい治療指数が許容され得る。ヒトに対する投与のための適切な最終選択用量範囲は、臨床試験の過程で決定される。
種々の実施形態において、薬物はインスリンであり、インスリンの平均日用量は10〜200U、例えば、25〜100Uの範囲である(ここで、インスリン1単位は約0.04mgである)。一部の特定の実施形態では、このようなインスリン用量を伴う量の該物質体が、1日単位で投与される。一部の特定の実施形態では、このようなインスリン用量の5〜10倍の用量を伴う量の該物質体が、1週間単位で投与される。一部の特定の実施形態では、このようなインスリン用量の10〜20倍の用量を伴う量の該物質体が、隔週単位で投与される。一部の特定の実施形態では、このようなインスリン用量の20〜40倍の用量を伴う量の該物質体が、月単位で投与される。当業者には、この同じアプローチを、用量範囲が既知の承認された他の薬物(例えば、本明細書に記載の承認されたインスリン感受性改善薬およびインスリン分泌促進薬のいずれか)に当てはめてもよいことは認識されよう。
任意の所与の患者に対する薬物の1日の総使用量は、担当医師によって妥当な医学的判断の範囲内で決定されることは理解されよう。任意の特定の患者に対する具体的な治療有効量は、さまざまな要素、例えば、処置対象の疾患または病状;使用される具体的な薬物の活性;使用される具体的な組成物;患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事;使用される具体的な薬物の投与期間、投与経路および排出速度;処置の持続時間;使用される具体的な薬物と併用して、または同時に使用されている薬物;ならびに医学分野で周知の同様の要素に依存する。種々の実施形態において、本開示の物質体は、1回より多くの場合で投与され得る。例えば、本開示は、具体的に、該物質体が患者に皮下注射によって、連続的スケジュール(例えば、1日1回、2日に1回、週1回、2週間に1回、月1回など)で投与される方法を包含する。
一部の特定の実施形態では、本開示の物質体は、患者(例えば、哺乳動物患者)の高血糖症を処置するために使用され得る。一部の特定の実施形態では、患者は糖尿病である。しかしながら、本発明の方法は糖尿病患者の処置に限定されない。例えば、一部の特定の実施形態では、該物質体は、血糖コントロールの障害に関連する感染を有する患者の高血糖症を処置するために使用され得る。一部の特定の実施形態では、該物質体は糖尿病を処置するために使用され得る。
種々の実施形態において、本開示の物質体は、少なくとも1種類のさらなる治療薬を受けている患者に投与され得る。種々の実施形態において、該少なくとも1種類のさらなる治療法は、投与される該物質体と同じ疾患または障害の処置を意図するものである。種々の実施形態において、該少なくとも1種類のさらなる治療法は、主薬の副作用の処置を意図するものである。この2種類以上の治療法は、患者が両方の治療法の恩恵を受けている間中、同じ時間枠で投与しても、重複する時間枠で投与しても、重複しない時間枠で投与してもよい。この2種類以上の治療法は、患者が両方の治療薬の恩恵を受けている間中、同じスケジュールで投与しても、異なるスケジュールで投与してもよい。一部の特定の実施形態では、本開示の単独の物質体は、同じ疾患または障害を処置するための薬物を1種類より多く含むものであり得る。一部の特定の実施形態では、同じ疾患または障害を処置するための異なる薬物を含む本開示の2種類以上の別個の物質体が投与され得る(混合物として、または別々に)。一部の特定の実施形態では、非コンジュゲート型の二次薬物を本開示の物質体に含めてもよい(すなわち、該物質体の成分と単に混合されるだけで、該架橋物質体に共有結合されない薬物)。例えば、一部の特定の実施形態では、このようなアプローチのいずれかを用いて、1種類より多くの抗糖尿病薬が被検体に投与され得る。この本発明のアプローチの一部の特定の例示的な実施形態をインスリン関連治療との関連において、より詳細に以下に記載するが、前述のことから、他の治療法のかかる併用アプローチの恩恵を受けることは認識されよう。
インスリン感受性改善薬(例えば、メトホルミン、グリタゾンなどのビグアニド)は、所与の量のインスリンに対する患者の応答を増大させることにより作用する。したがって、インスリン感受性改善薬を受けている患者に必要とされる、本開示のインスリン系物質体の用量は、該改善薬を受けていない同一の患者よりも少ない。したがって、一部の特定の実施形態では、インスリンコンジュゲートを含む該物質体が、インスリン感受性改善薬での処置も受けている患者に投与され得る。種々の実施形態において、本開示の物質体は、インスリン感受性改善薬の非存在下で必要とされる通常の用量の75%までで投与され得る。種々の実施形態において、該通常の用量の50、40、30または20%までが投与され得る。
インスリン抵抗性は、通常のインスリン量が、正常なインスリン応答をもたらすのに不充分な障害である。例えば、インスリン抵抗性患者には、その抵抗性を克服し、充分なグルコース降下効果をもたらすために、高用量のインスリンが必要とされ得る。このような場合、抵抗性が低い患者においては、通常、低血糖が誘導され得るインスリン用量では、高度に抵抗性の患者において同等のグルコース降下効果は奏されない。同様に、本開示の物質体は、適当な時間枠で高レベルのインスリン−コンジュゲートが放出される場合、このサブクラスの患者に対してのみ有効である。一部の特定の実施形態では、このサブクラスの患者の処置は、該2つのアプローチを併用することにより助長され得る。したがって、一部の特定の実施形態では、従来のインスリン系治療剤を用いてインスリンのベースラインレベルを得、患者の必要時に、本発明の物質体を投与してインスリン補充の制御をもたらす。したがって、一部の特定の実施形態では、インスリンコンジュゲートを含む物質体が、インスリンでの処置も受けている患者に投与され得る。種々の実施形態において、インスリンは、本開示の物質体の非存在下で必要とされる通常の用量の75%までで投与され得る。種々の実施形態において、該通常の用量の50、40、30または20%までが投与され得る。この併用アプローチは、インスリン分泌促進薬(例えば、スルホニル尿素、GLP−1、エキセンジン−4など)および/またはインスリン感受性改善薬(例えば、メトホルミン、グリタゾンなどのビグアニド)を受けているインスリン抵抗性患者でも使用され得ることは認識されよう。
キット
別の態様において、本開示により、アプタマーとコンジュゲートと、物質体を調製するための他の試薬とを含むキットを提供する。例えば、キットは、複数のコンジュゲートおよび複数のアプタマーを内包する個別の容器を含むものであり得る。キットのコンジュゲートとアプタマーを混合すると、架橋物質体が形成される。種々の実施形態において、該物質体は皮下送達用に設計され、キットはシリンジを含む。種々の実施形態において、キットは、架橋物質体が予め充填されたシリンジを含むものであり得る。また、キットに、該コンジュゲートとアプタマーを混合して架橋物質体を得るための使用説明書を含めてもよい。
別の態様において、本開示により、アプタマーとコンジュゲートと、物質体を調製するための他の試薬とを含むキットを提供する。例えば、キットは、複数のコンジュゲートおよび複数のアプタマーを内包する個別の容器を含むものであり得る。キットのコンジュゲートとアプタマーを混合すると、架橋物質体が形成される。種々の実施形態において、該物質体は皮下送達用に設計され、キットはシリンジを含む。種々の実施形態において、キットは、架橋物質体が予め充填されたシリンジを含むものであり得る。また、キットに、該コンジュゲートとアプタマーを混合して架橋物質体を得るための使用説明書を含めてもよい。
また別の態様において、本開示により、コンジュゲートおよび/またはアプタマーのライブラリーを提供する。このようなライブラリーは、所望のセットポイントを有する物質体の作製に特に有用であり得る。種々の実施形態において、ライブラリーは、同じコンジュゲートで異なるセットポイントをもたらす複数のアプタマーを含むものであり得る。種々の実施形態において、ライブラリーは、さらに、ライブラリー内のアプタマーと架橋物質体を形成する1種類以上のコンジュゲートを含むものであり得る。ライブラリーが1種類より多くのかかるコンジュゲートを含む場合、異なるコンジュゲートは、異なる分子量、コンジュゲート分子1つあたり異なる数の親和性リガンドおよび/または異なる親和性リガンドを有するものであり得る。種々の実施形態において、ライブラリーは、1種類より多くの型の親和性リガンドを含むコンジュゲートを1つ以上含むものであり得る。種々の実施形態において、ライブラリーは、同じアプタマーで異なるセットポイントをもたらす複数のコンジュゲートを含むものであり得る。種々の実施形態において、ライブラリーは、さらに、ライブラリー内でコンジュゲートとともに架橋物質体を形成する1種類以上のアプタマーを含むものであり得る。
また別の態様において、本開示により、(a)第1の標識を含むアプタマーを含む第1容器と、(b)第2の標識を含むコンジュゲートを含む第2容器を備えており、第1の標識は、第2の標識に近接していると測定可能な応答をもたらすキットを提供する。
また別の態様において、本開示により、(a)アプタマーを含む第1容器と、(b)親和性リガンドおよび第1の標識を含む第1の分子群を含む第2容器と、(c)親和性リガンドおよび第2の標識を含む第2の分子群を含む第3容器とを備えており、第1の標識は、第2の標識に近接していると測定可能な応答をもたらすキットを提供する。一部の特定の実施形態では、第1および第2の分子は同じ容器内に存在している。
他の実施形態
本発明の他の実施形態は、本明細書の検討または本明細書に開示した発明の実施により、当業者に自明となろう。本明細書および実施例は単なる例示とみなし、本発明の真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲に示されていることを意図する。
本発明の他の実施形態は、本明細書の検討または本明細書に開示した発明の実施により、当業者に自明となろう。本明細書および実施例は単なる例示とみなし、本発明の真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲に示されていることを意図する。
実施例
実施例1−単量体型グルコース結合アプタマー
<50mg/dLのグルコース濃度の固定化したグリコゲンに結合し、広い漸増グルコース濃度範囲で溶出されるヌクレアーゼ抵抗性RNA配列を同定した。T7プロモーター領域、続いて20塩基対(bp)の5’プライマー、40bpのランダム領域、および20bpの3’プライマー部位で構成された配列を有するDNAオリゴヌクレオチドの1015〜1016個の配列の最初のライブラリーを、確立された方法に従って構築した。臭化シアン架橋型牡蠣グリコゲン(MW=500,000g/mol、Sigma Aldrich)を結合固定相として使用したSELEXプロセスに用いた修飾型RNAアプタマーを転写するため、T7 RNAポリメラーゼを、2’−フルオロ−2’−デオキシピリミジン5’−三リン酸(2’−F−CTPおよび2’F−UTP)とともに使用した。
実施例1−単量体型グルコース結合アプタマー
<50mg/dLのグルコース濃度の固定化したグリコゲンに結合し、広い漸増グルコース濃度範囲で溶出されるヌクレアーゼ抵抗性RNA配列を同定した。T7プロモーター領域、続いて20塩基対(bp)の5’プライマー、40bpのランダム領域、および20bpの3’プライマー部位で構成された配列を有するDNAオリゴヌクレオチドの1015〜1016個の配列の最初のライブラリーを、確立された方法に従って構築した。臭化シアン架橋型牡蠣グリコゲン(MW=500,000g/mol、Sigma Aldrich)を結合固定相として使用したSELEXプロセスに用いた修飾型RNAアプタマーを転写するため、T7 RNAポリメラーゼを、2’−フルオロ−2’−デオキシピリミジン5’−三リン酸(2’−F−CTPおよび2’F−UTP)とともに使用した。
6回の選択ラウンド後、いくらかのグリコゲンビーズ結合親和性を有するバイアブルなモノクローナルの配列が1つ(30106K1)見い出された。30106Klを、既存の方法論(下記参照)に従って逆転写し、変異させ、グリコゲン固定相に対する可逆的結合に必要な最小限の配列モチーフを見い出すために、配列が相同なアプタマーファミリーを得る試みにおいて、グリコゲンビーズ結合およびグルコース溶出選択方法論を用いて、新たなプールを再選択した。
変異誘発後、2回以上の選択ラウンドを行ない、得られた混合物を試験してモノクローナルを得、次いで、これを配列決定して28個のモノクローナルを得、そのうち7個は特殊であった。これらの配列のうちいくつかは大いに相同性を有したが、配列1、4および6は、他のものと相当異なっていた。
グリコゲンレジンに対するモノクローナル結合親和性の違いを調べるため、グリコゲンビーズを小型カラムに添加し、充分に洗浄した。モノクローナルを結合させ、次いで、結合工程により溶出した後、結合バッファーでの3回の洗浄工程を行なった。次に、カラムを、400、800、1600、および3200mg/dLのグルコースで溶出し、各工程で260nmにおける光学密度を測定し、最初のアプタマーストック濃度の関数としてプロットした(図1参照)。モノクローナルはすべて、グリコゲンビーズに対して親和性を有し、広いグルコース値範囲にわたって、すべてカラムから溶出された。しかしながら、結合した3つの配列1、4および6は、グルコースゼロであっても、大部分(全体の>50%)がビーズから洗い流された。さらに、>90%は800mg/dLまでにカラムから溶出されたが、モノクローナル2、3、5および7では、グルコースが3,200mg/dlであっても、結合した全体量の<60%がグリコゲンレジンから洗い流された。計算による二次構造と配列相同構造との比較(図2)により、モノクローナルグリコゲンビーズ結合試験の結果との強い相関性が示された。したがって、この二組のモノクローナルにより、低親和性から高親和性に及ぶグリコゲン結合アプタマーの2つの相違するプールが得られ、これらは、一連のグリコゲン結合親和性を有するアプタマーを作製するための出発点として使用され得る。
配列間の構造に関する相同性は、上記のモノクローナルの考えられ得る二次構造の推定を補助する自由エネルギー最小化シミュレータであるMfold(商標)ソフトウェアを用いて調べた。
構造に関する結果により、この新たなアプタマープールは、多数の6bpループおよび8bpループを含む分岐型構造に片寄っていることが示唆された。モノクローナル2、3および7は、ほぼ同一のフォールド構造を含み、モノクローナル5は2、3および7と、ある程度の類似性を含む。モノクローナルの配列(図2)の再検討により、40bpランダム領域が2、3、5および7間で非常に相同性が高いこと、ならびにそれらの配列のわずかな違いは、推定されるフォールド構造に影響しないようであることを示す。モノクローナル4および6は、他方の84bpアプタマーと配列構造が劇的に異なる。しかしながら、特に注目すべきは、4および6の推定されるフォールド構造が、2、3および7のものと類似した特徴を共有していることである。
実施例2−単量体型グルコース結合アプタマーの多量体への自己集合性
本発明の物質体に使用されるグルコース結合分子に対する重要な設計パラメータは、該分子が多量体でなければならず、それにより、該コンジュゲートと非共有結合性の架橋を形成できることである。天然Con Aは、生理学的温度およびpHでは四量体であり、ペグ化Con Aは少なくとも二量体型である。したがって、RNAアプタマーが本発明の物質体との関連において有用であるためには、該アプタマーを多量体型にしなければならない。
本発明の物質体に使用されるグルコース結合分子に対する重要な設計パラメータは、該分子が多量体でなければならず、それにより、該コンジュゲートと非共有結合性の架橋を形成できることである。天然Con Aは、生理学的温度およびpHでは四量体であり、ペグ化Con Aは少なくとも二量体型である。したがって、RNAアプタマーが本発明の物質体との関連において有用であるためには、該アプタマーを多量体型にしなければならない。
多量体型構築物を作製するための慣用的な方法の一例は、アビジン−ビオチン親和性タグ系の使用である。アビジンは、生理学的pHで天然四量体であり、各々がビオチンに対する結合部位を1つ含む4つの単量体で構成されている。ビオチンとアビジン間の結合定数は極めて大きい(1015M−1)。
より化学合成が容易な配列を作製するため、モノクローナルの配列3を切断した(塩基15〜65、N40領域全体を含む)。修飾型2’−フルオロ−ピリミジンRNAアプタマーは、3’から5’端へとDharmacon,Inc.によって合成されたものであり、ビオチンタグを配列の末端の5’端に共有結合した。この配列は、製造業者によって脱塩、HPLCおよびゲル精製されており、配列1モルあたり平均1モルのビオチンタグを有することがわかった。使用前、本発明者らは、アビジン−ビオチニルアプタマー混合物により、多量体型構築物が得られるであろうことを確認しようとした。1.1mg/mlのアビジンを、定濃度で、ビオチニル−アプタマーの連続希釈物に、アビジン−ビオチニルRNAのモル比が1:2、1:4、1:8、1:16となるように添加した。これらの試料を、対照レーンとともに、臭化エチジウム1%アガロースゲル上に負荷し、電気泳動させると、アビジン−ビオチニルアプタマーの方がMWが高い複合体が得られることが示された。このゲルを図3に示す。切断型ビオチニル(非結合)配列は、100bp標準のところで溶出されるが、多量体型アビジン:アプタマー複合体は、400bpラダー付近に溶出される。レーン4および5は、多量体型複合体の形成がビオチンの存在下で抑止されるため、結合の特異性が、具体的には、アビジン−ビオチン相互作用によるものであることを示す。また、アビジン高含有比率では(1:2,レーン5)、100bp標準のところに泳動しているバンドがあるため、「ビオチニル−アプタマー」の一部分はビオチニル化されていないようである。
切断型のビオチニル化配列を、アビジンの存在下および非存在下での結合特性について、グリコゲンビーズ親和性カラムにおいて評価した。カラム溶出を260nmにおける光学密度によって測定し、ビオチニルアプタマー配列の結合プロフィールを、グリコゲンビーズカラムにて、天然Con Aおよびペグ化Con Aと比較した(タンパク質は280nmにおいて測定)。また、固定相への結合がない場合を示すために、ポリアクリルアミドビーズで構成した対照カラムを使用した。結果を図4に示す。
Con Aおよび単量体型ビオチニル−アプタマーは、ポリアクリルアミドカラムからは即時に溶出され、グリコゲンカラムからは、広いグルコース値範囲にわたって、ゆっくり溶出される。モル比4:1のアプタマー−アビジン混合物の多量体(図3参照)は、グリコゲンカラムに対して向上した親和性を示し、単量体型ビオチニル−アプタマーよりも高いグルコースレベルを必要とする。カラムとのアプタマーの相互作用がグルコース/グリコゲンに特異的であることを示すため、単量体型ビオチニル−アプタマー(アビジンなし)の負荷前に、別の新たなグリコゲンカラムを1600mg/dlのグルコースで平衡化させた。負荷前にグルコースで平衡化すると、より低いグルコース値で、より多くのアプタマーの溶出がもたらされるが、これは、ビオチニルアプタマー−グリコゲンビーズ相互作用が、高濃度のグルコースの存在によって阻害され得る高度に特異的なものであることを示す。
実施例3−種々のコンジュゲート結合親和性を有する単量体型アプタマープール
結合剤の多様なプールを個々に作製するためのモノクローナルの変異
マンガン塩を用いて、PCRにおいて6uLの10×PCRバッファー、6uLのdNTP 2mM、24uLの各5’および3’プライマー、6uLのTaqポリメラーゼを混合することによりcDNAモノクローナルを作製し、PCRチューブの容積の残部にMnCl2および蒸留脱イオンH2Oを2mM〜0625mMのMnCl2の連続希釈液で満たし、適正な濃度のMnCl2を見い出す(アガロースゲル電気泳動で測定)。次いで、PCRを、95℃で45秒、53℃で45秒、および72℃で1分間を1サイクルとして30サイクル行なう。
結合剤の多様なプールを個々に作製するためのモノクローナルの変異
マンガン塩を用いて、PCRにおいて6uLの10×PCRバッファー、6uLのdNTP 2mM、24uLの各5’および3’プライマー、6uLのTaqポリメラーゼを混合することによりcDNAモノクローナルを作製し、PCRチューブの容積の残部にMnCl2および蒸留脱イオンH2Oを2mM〜0625mMのMnCl2の連続希釈液で満たし、適正な濃度のMnCl2を見い出す(アガロースゲル電気泳動で測定)。次いで、PCRを、95℃で45秒、53℃で45秒、および72℃で1分間を1サイクルとして30サイクル行なう。
SELEXプロトコル
変異型修飾RNAプールをタンパク質無含有牡蠣グリコゲン(II型、Sigma Aldrich)と混合し、37Cで15分間平衡化させる。この期間後、100ulのグリコゲン/修飾RNA溶液を、37Cで平衡化させた1mL容のP−100スピンカラム上に負荷し、試料を遠心分離すると、未結合オリゴヌクレオチドが除去され、一方、グリコゲン−アプタマー複合体は通過する。低濃度のグルコースをグリコゲン−アプタマー混合物に添加し、これを、再度、新たなP−100スピンカラムに通す。今回は、一部のアプタマー−グリコゲン複合体はグルコースによって阻止され、スピンカラム内に滞留し得るが、グリコゲンは除去される。この時点でグリコゲンを含まないスピンカラムの内容物は、3×100ulの結合バッファーでの洗浄により簡単に溶出される。このプロセスをさまざまなグルコース濃度で繰り返し、多様な複数のグルコースプールを得る。得られた配列(1つまたは複数)をcDNAに逆転写し、次の転写/選択ラウンドのために増幅する。数回の選択ラウンド後、モノクローナルの配列が得られ得る。成功の基準としては、グルコースの関数としての、グリコゲン−アプタマー複合体のA260の測定が挙げられる。プールが高グルコース値に向かって富化されている場合、より多くのアプタマーがグリコゲンに結合されるはずであり、それによりグリコゲン結合アプタマー複合体溶液のOD260値は測定可能に高くなる。
変異型修飾RNAプールをタンパク質無含有牡蠣グリコゲン(II型、Sigma Aldrich)と混合し、37Cで15分間平衡化させる。この期間後、100ulのグリコゲン/修飾RNA溶液を、37Cで平衡化させた1mL容のP−100スピンカラム上に負荷し、試料を遠心分離すると、未結合オリゴヌクレオチドが除去され、一方、グリコゲン−アプタマー複合体は通過する。低濃度のグルコースをグリコゲン−アプタマー混合物に添加し、これを、再度、新たなP−100スピンカラムに通す。今回は、一部のアプタマー−グリコゲン複合体はグルコースによって阻止され、スピンカラム内に滞留し得るが、グリコゲンは除去される。この時点でグリコゲンを含まないスピンカラムの内容物は、3×100ulの結合バッファーでの洗浄により簡単に溶出される。このプロセスをさまざまなグルコース濃度で繰り返し、多様な複数のグルコースプールを得る。得られた配列(1つまたは複数)をcDNAに逆転写し、次の転写/選択ラウンドのために増幅する。数回の選択ラウンド後、モノクローナルの配列が得られ得る。成功の基準としては、グルコースの関数としての、グリコゲン−アプタマー複合体のA260の測定が挙げられる。プールが高グルコース値に向かって富化されている場合、より多くのアプタマーがグリコゲンに結合されるはずであり、それによりグリコゲン結合アプタマー複合体溶液のOD260値は測定可能に高くなる。
実施例4−化学合成された多量体型アプタマー
実施例3で同定されたモノクローナルを配列決定し、製造業者により化学合成装置を用いて小規模で、または大規模(>2mg規模)で化学合成する。これを、最終ラウンドの化学基剤合成時に、ビオチンホスホルアミダイト(Glen Research,Sterling,VA)を用いて、5’−チオールで共有結合により標識する。
実施例3で同定されたモノクローナルを配列決定し、製造業者により化学合成装置を用いて小規模で、または大規模(>2mg規模)で化学合成する。これを、最終ラウンドの化学基剤合成時に、ビオチンホスホルアミダイト(Glen Research,Sterling,VA)を用いて、5’−チオールで共有結合により標識する。
次いで、この修飾型チオール化RNAアプタマーを、同じく該結合バッファー中に溶解させた極わずかだけモル過剰(1.05:1)の二量体型、三量体型または四量体型マレイミド官能化分子と、修飾型結合バッファー(50mM HEPES、pH6.8〜7.0、100mM NaCl(1mM MgCl2含有))中で反応させる。このマレイミドは、室温で数分以内に5’修飾アプタマーと容易に反応を行ない、アプタマーと多量体型スペーサー分子間に安定なチオエーテル結合をもたらす。二量体が所望される場合は、ビス−マレイミドヘキサン(Pierce,Rockford,IL)が使用され、あるいは、三量体型アプタマーが望ましい場合は、トリス−(2−マレイミドエチル)アミンが使用され、アプタマースルフヒドリルと容易に反応する。
この種々の単量体型モノクローナルグリコゲン結合親和性は、二量体または三量体として形成される場合、グリコゲンまたは他の薬物−コンジュゲートと架橋ヒドロゲルを形成し得るはずである。次いで、得られた物質体のグルコース応答性が試験され得る。
実施例5−アプタマー−薬物−コンジュゲートのグルコース応答性のインビトロ速度論の最適化
この実施例は、実施例4に概要を示した薬物−コンジュゲートおよび対応する多価アプタマーを用いたヒドロゲルの合成を伴う。
この実施例は、実施例4に概要を示した薬物−コンジュゲートおよび対応する多価アプタマーを用いたヒドロゲルの合成を伴う。
ゲルの架橋実験およびコンジュゲート放出速度論の測定
実施例4で作製した各多量体型アプタマーを、50mg/mlで、10mM MgCl2および100mM NaClを含有する50mMのHEPESバッファー(pH=7.4)に溶解させる。各薬物−コンジュゲート溶液を、同じバッファーにて100mg/mlで調製する。次いで、薬物−コンジュゲート溶液を、同じバッファーを用いて50mg/mlから6.25mg/mlまで2倍希釈する。次いで、50μLの薬物−コンジュゲート溶液を、250ml容円錐形遠心チューブに添加した後、等容量の多量体型アプタマー溶液を添加し、得られた溶液をすばやく混合する。この溶液を1時間放置した後、残留凝集体(あれば)を360×gで10分間の遠心分離(Allegra 21R,Beckman Coulter,Fullerton,CA)によって単離する。上清みを除去し、薬物測定アッセイのために保存する。次いで、各実験の架橋効率(XCL)を、架橋凝集体の分離前後での薬物含有量の差から求める。次いで、内蔵型ゲルをもたらした製剤に、バッファーによる15分間の洗浄を3回行った後、360×gで10分間遠心分離する。最後の洗浄液を除去した後、ゲルを4Cで一晩維持し、続いて、速度論試験に使用する。
実施例4で作製した各多量体型アプタマーを、50mg/mlで、10mM MgCl2および100mM NaClを含有する50mMのHEPESバッファー(pH=7.4)に溶解させる。各薬物−コンジュゲート溶液を、同じバッファーにて100mg/mlで調製する。次いで、薬物−コンジュゲート溶液を、同じバッファーを用いて50mg/mlから6.25mg/mlまで2倍希釈する。次いで、50μLの薬物−コンジュゲート溶液を、250ml容円錐形遠心チューブに添加した後、等容量の多量体型アプタマー溶液を添加し、得られた溶液をすばやく混合する。この溶液を1時間放置した後、残留凝集体(あれば)を360×gで10分間の遠心分離(Allegra 21R,Beckman Coulter,Fullerton,CA)によって単離する。上清みを除去し、薬物測定アッセイのために保存する。次いで、各実験の架橋効率(XCL)を、架橋凝集体の分離前後での薬物含有量の差から求める。次いで、内蔵型ゲルをもたらした製剤に、バッファーによる15分間の洗浄を3回行った後、360×gで10分間遠心分離する。最後の洗浄液を除去した後、ゲルを4Cで一晩維持し、続いて、速度論試験に使用する。
速度論アッセイを使用し、1.0mlの50、100、200および400mg/dlのD−グルコースを、Multiwell(商標)24ウェルプレート(Becton Dickson)の4×3mlの各ウェルに添加する。次いで、この溶液に各ゲルを添加し、マイクロプレートインキュベータ/振盪機(「Jitterbug」、Boekel Instruments)を用いて37Cで撹拌する。例えば、インスリンアッセイでは、まず、125ulの放出媒体を15分毎に取り出し、その後、実験の最初の1時間後からは半時間毎に取り出す。各時点で、放出媒体に0.125mlの同濃度のグルコースを補給する。このプロセスを少なくとも6時間繰り返す。次いで、各時点での薬物−コンジュゲートの溶解をELISA(ALPCO Diagnostics)によって測定し、薬物の累積放出を、各濃度において、時間の関数としてプロットする。各グルコース濃度の放出曲線の初期傾斜に直線をフィットさせることにより、R50、R100、R200、およびR400値が容易に得られる。
実施例6−空腹時および食事時間グルコースコントロールのための至適単回用量製剤
アプタマー系物質体の至適投薬量の配合および容量は、STZ誘導型糖尿病ラットにおいて、血中グルコースレベルの低減および血清インスリン−コンジュゲート濃度の増大の程度および持続時間を評価することにより決定される。ラット(n=6)を6時間絶食させ(この間、水分は随意に与える)、その後、血中グルコースレベルを測定する。各投与においてインスリン許容量は限定的であるため、各製剤の「寿命」を確立するために、空腹時血中グルコースレベルを高血糖への戻りが観察されるまで測定する。また、空腹時グルコースレベルを少なくとも3日間低減させ得る単回用量製剤を、実験の1日目および2日目に施与した腹腔内耐糖能試験(IPGTT)に対抗(confront)できる能力について評価する。
アプタマー系物質体の至適投薬量の配合および容量は、STZ誘導型糖尿病ラットにおいて、血中グルコースレベルの低減および血清インスリン−コンジュゲート濃度の増大の程度および持続時間を評価することにより決定される。ラット(n=6)を6時間絶食させ(この間、水分は随意に与える)、その後、血中グルコースレベルを測定する。各投与においてインスリン許容量は限定的であるため、各製剤の「寿命」を確立するために、空腹時血中グルコースレベルを高血糖への戻りが観察されるまで測定する。また、空腹時グルコースレベルを少なくとも3日間低減させ得る単回用量製剤を、実験の1日目および2日目に施与した腹腔内耐糖能試験(IPGTT)に対抗(confront)できる能力について評価する。
SDラット(200〜250g)へのSTZ−糖尿病の誘導は、27ゲージの1インチ針を取り付けた1ml容のシリンジを使用し、60mg/kgのSTZ(0.1Mクエン酸バッファー中4%w/v)のi.p.注射を用いて行なう。STZ注射後5日目と6日目に、6時間の絶食後の血中グルコースレベルを測定する。>350mg/dlの空腹時グルコースレベルを連続2日間有するラットのみを、後続の試験に使用する。血中グルコースレベルは、一般に、テストストリップ(Precision QID)およびMediSense血糖測定器を用いて、尾静脈から抜き取ったほぼ20μlの血液で測定する。
血清インスリン−コンジュゲートレベルは、市販のヒトインスリンELISAキット(Alpco Diagnostics,Windham,NH)を用いて測定する。血清濃度測定用の試料を得るため、250〜500μLの血液を尾静脈から抜き取り、遠心分離し、血清から細胞を分離し、ELISAまで−20Cで保存する。腹腔内耐糖能試験(IPGTT)は、絶食ラットにおいて、1g/kgのD−グルコース用量での45%w/v D−グルコース溶液(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)のi.p.注射によって行なう。実験全体を通して、血液試料(500μL)は尾静脈から、t=−10、−5、0、5、10、15、20、25、30、40、50、60、75、90、120および180分の時点で採取し、血中グルコースと血清インスリン−コンジュゲートレベルの両方を測定する。ピークグルコース濃度(Gmax)、ピークグルコース濃度までの時間(TGmax)、および空腹時血中グルコースレベルに戻るまでの時間(Tfast)を比較し、種々の製剤がグルコース負荷に対抗できる能力を調べる。正常な非糖尿病ラット(n=6)を、全薬力学的パラメータの比較対照として使用する。
各グルコース応答性製剤の注射の1日前に、血中グルコースレベルを減少させるため、長期作用性インスリンサプリメント(Lantus(登録商標)、Aventis Pharmaceuticals、2U)を、STZ−ラットにs.c.注射によって与える。実験動物のうち6匹に「空の」製剤(すなわち、コンジュゲート型インスリンなし)を与え、6匹に対照として1×PBS溶液を与える。残りのラットにはグルコース感受性ゲル注射を与える。インスリン−デキストランコンジュゲートおよびインスリン−グリコゲンコンジュゲートの両方(G10%〜50mg/dlおよび100mg/dl)から構築したグルコース応答性ゲルを、異なる2つの投薬量レベル(0.20mlおよび0.40mlバッチサイズ)で注射する。また、異なる2つのインスリン−コンジュゲート負荷量を、(i)100%インスリン−コンジュゲートおよび(ii)50%インスリン−コンジュゲートと50%非コンジュゲートポリマーを有するゲルを合成することにより評価する。
投薬頻度は、至適製剤の注射容量と空腹時血中グルコースレベルのコントロールの持続時間との間に線形相関性があると仮定して決定する。次いで、投薬容量の規模を、1日間の空腹時血中グルコースコントロールが得られるものに戻す。この容量(V)、Vの80%、およびVの120%を、STZ誘導型糖尿病ラット(n=6)に毎朝1回s.c.注射し、空腹時血中グルコースおよび血清インスリンレベルを毎日、合計7日間測定する。1週間にわたって最も安定な(増大または減少が最小限の)空腹時血中グルコースおよび血清インスリンレベルをもたらす容量を、グルコースセットポイントの精密化およびインスリン−コンジュゲート負荷実験に使用する。
最大コントロールのためのグルコース感受性の調整は、インスリン−コンジュゲートに対するアプタマーの比率を調整することによってグルコースセットポイント(GSP)アッセイのセットポイントを増大させることによりなされる。先の投薬量の配合、容量および頻度実験の結果に応じて、ゲルを至適な容量および投薬量レベルで使用する。75、90、105、120および135mg/dlのG10%を有する製剤をSTZ誘導型糖尿病ラット(n=6)に、毎朝1回、連続7日間注射する。各セットポイントでは、インスリン−コンジュゲート負荷量を50%、75%および100%に設定し、最も適切なインスリン−コンジュゲート濃度をさらに最適化して、低血糖を抑制するとともに高血糖を最小限にする。毎日、空腹時血中グルコースと血清インスリンレベルを測定した後、IPGTTを上記のようにして行なう。
平均空腹時血中グルコース濃度ならびにIPGTTの平均Gmax、TGmax、およびTfastを、グルコースセットポイントおよび注射した各製剤のインスリン負荷量に相関させる。より高いグルコースセットポイントを有する物質体では、経時的に、より低いグルコース濃度で溶解するようにプログラムしたものよりも高いグルコース濃度がもたらされるはずである。
実施例7−アプタマーの血清半減期の増大の確認
2’−フルオロ−ピリミジンから構築したオリゴヌクレオチドでは、インビトロで、数時間よりも長いヌクレアーゼ安定性半減期が示されている(例えば、Douganら、Extending the lifetime of anticoagulant oligodeoxynucleotide aptamers in blood.Nucl Med Biol 2000、27、(3)、289−97;Beigelmanら、Chemical modification of hammerhead ribozymes.Catalytic activity and nuclease resistance.J Biol Chem 1995、270、(43)、25702−8;およびScaringeら、Chemical synthesis of biologically active oligoribonucleotides using beta−cyanoethyl protected ribonucleoside phosphoramidites.Nucleic Acids Res 1990、18、(18)、5433−41参照)。
2’−フルオロ−ピリミジンから構築したオリゴヌクレオチドでは、インビトロで、数時間よりも長いヌクレアーゼ安定性半減期が示されている(例えば、Douganら、Extending the lifetime of anticoagulant oligodeoxynucleotide aptamers in blood.Nucl Med Biol 2000、27、(3)、289−97;Beigelmanら、Chemical modification of hammerhead ribozymes.Catalytic activity and nuclease resistance.J Biol Chem 1995、270、(43)、25702−8;およびScaringeら、Chemical synthesis of biologically active oligoribonucleotides using beta−cyanoethyl protected ribonucleoside phosphoramidites.Nucleic Acids Res 1990、18、(18)、5433−41参照)。
したがって、このような修飾基剤から構築した遊離アプタマーは、24時間の投与サイクルの間中、存在し続けられ得ないであろう。それでもなお、本発明者らは、アプタマーは、本発明の物質体内に封入されている間は、立体障害に基づき、ヌクレアーゼ分解に対してさらにいっそう抵抗性であると予測する。したがって、日投薬量の寿命の間、本発明の物質体の過剰なヌクレアーゼ分解を抑制するには、ts>300分で充分なはずである。この実施例では、ヌクレアーゼの存在下での本発明の物質体由来の薬物−コンジュゲート結合の程度を測定することにより、この予測を確認するために使用され得る実験を示す。
アプタマーのインビトロ安定性は、0.02μCiの精製[125I]標識アプタマーを、20μlの適切な液−ヒト血清、ヒト血漿、ラット血清およびラット血漿(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)中に分散させることにより測定される(例えば、Douganら(上掲)参照)。次いで、試料を37℃でインキュベートし、2μlのアリコートを30秒〜72時間の時間間隔で抜き取る(例えば、Beigelmanら(上掲)参照)。アリコートを、20μlの95%ホルムアミド、0.5×TBE(50mM Tris、50mMホウ酸塩、ImM EDTA)の添加によってクエンチし、ゲル負荷前に凍結させる。最後に、各時点の試料を、20%ポリアクリルアミド上での変性ゲル電気泳動によって分画した後、AutoRadiographerを用いて画像形成する。各アプタマーのインビトロ安定性半減期(ts)を、インキュベーション時間に対するインタクトなアプタマーの割合のプロットの指数関数フィットから計算する(例えば、Beigelmanら(上掲)参照)。
インビボ排出半減期を、変形した薬物動態学的解析手順を用いて求める(例えば、Douganら;Scaringeら(ともに上掲);ならびにSantulli−Marottoら、Multivalent RNA aptamers that inhibit CTLA−4 and enhance tumor immunity.Cancer Res.63:7483−7489、2003参照)。簡単には、雄Sprague−Dawleyラット(Taconic,Germantown,NY)(体重200〜250g)に、静脈内(i.v.,n=6)および皮下(s.c,n=6)の両方で、[125I]標識アプタマーの滅菌1×PBS溶液(10μCiを含有する0.25ml)を注射する。実験全体を通して、血液試料(300μl)は尾静脈から、t=0、5、15、60、120、240、480、960および1440分の時点で採取し、10,000gで4℃にて1分間遠心分離し、血漿を収集し、シンチレーションカウンターを用いて放射能について解析するまで−20℃で保存する。各アプタマーのインビボ排出半減期(t1/2)は、時間に対する血漿濃度の曲線の末端直線部分からの概算によって計算する。この実験の目的のため、i.v.注射は、27ゲージ、1/2インチ針により尾静脈内に投与し、s.c.注射は、27ゲージ、1/2インチ針により首後部に投与する。
実施例8−グルコース依存性薬物−コンジュゲートの放出の評価
この実施例では、グルコースの存在下での本発明の物質体からの薬物−コンジュゲートの放出の程度を評価するために使用され得るインビトロ方法およびインビボ方法を記載する。
この実施例では、グルコースの存在下での本発明の物質体からの薬物−コンジュゲートの放出の程度を評価するために使用され得るインビトロ方法およびインビボ方法を記載する。
血清におけるインビトログルコースセットポイント
グルコースセットポイント(GSP)アッセイは、各グルコースインキュベーション段階で、PBSの代わりにヒトおよびラットの血清を用いて行なう。まず、50mg/dlのD−グルコースを含有する1.0mlの血清を、Multiwell(商標)24ウェルプレート(Becton Dickson)の各ウェルに24×3mlで添加する。この溶液に各ゲル(蛍光コンジュゲートから調製)を添加し、マイクロプレートインキュベータ/振盪機(「Jitterbug」、Boekel Instruments)を用いて37℃で1時間撹拌する。1時間後、0.5mlの放出媒体を除去し、蛍光について解析する(λeX=485nm;λem=538nm)。次いで、放出媒体に、150mg/dlのグルコースを含有する0.5mlの血清を補給して100mg/dl溶液とし、ゲルをさらに1時間撹拌する。このプロセスを、200、400、800および1600mg/dlの放出媒体グルコース濃度に対して合計6つの濃度で6時間にわたって繰り返す。次いで、累積コンジュゲート溶解を、放出媒体中のコンジュゲートの累積濃度を100%溶解で放出された濃度で標準化することにより計算する。G10%およびG50%を、累積放出をグルコース濃度の関数としてプロットし、それぞれ、コンジュゲートの10%および50%が放出されるグルコース濃度を推定することにより求める。
グルコースセットポイント(GSP)アッセイは、各グルコースインキュベーション段階で、PBSの代わりにヒトおよびラットの血清を用いて行なう。まず、50mg/dlのD−グルコースを含有する1.0mlの血清を、Multiwell(商標)24ウェルプレート(Becton Dickson)の各ウェルに24×3mlで添加する。この溶液に各ゲル(蛍光コンジュゲートから調製)を添加し、マイクロプレートインキュベータ/振盪機(「Jitterbug」、Boekel Instruments)を用いて37℃で1時間撹拌する。1時間後、0.5mlの放出媒体を除去し、蛍光について解析する(λeX=485nm;λem=538nm)。次いで、放出媒体に、150mg/dlのグルコースを含有する0.5mlの血清を補給して100mg/dl溶液とし、ゲルをさらに1時間撹拌する。このプロセスを、200、400、800および1600mg/dlの放出媒体グルコース濃度に対して合計6つの濃度で6時間にわたって繰り返す。次いで、累積コンジュゲート溶解を、放出媒体中のコンジュゲートの累積濃度を100%溶解で放出された濃度で標準化することにより計算する。G10%およびG50%を、累積放出をグルコース濃度の関数としてプロットし、それぞれ、コンジュゲートの10%および50%が放出されるグルコース濃度を推定することにより求める。
インビボ空腹時血中グルコースレベル
ゲル(G10%〜50mg/dlおよび100mg/dl)を雄Sprague−Dawleyラット((体重200〜250g)(n=6)の首後部に、0.2mgインスリン/kg体重の用量で、27ゲージ1/2インチ針を用いて皮下注射する。また、陰性対照には、滅菌1×PBS溶液を皮下注射する(n=6)。次いで、実験群および対照群を6時間絶食させ(この間、水分は随意に与える)、その後、血中グルコースレベルを測定する。次いで、空腹時血中グルコースレベルを、テストストリップ(Precision QID)およびMediSense血糖測定器を用いて、尾静脈から抜き取った約20μlの血液で測定する。
ゲル(G10%〜50mg/dlおよび100mg/dl)を雄Sprague−Dawleyラット((体重200〜250g)(n=6)の首後部に、0.2mgインスリン/kg体重の用量で、27ゲージ1/2インチ針を用いて皮下注射する。また、陰性対照には、滅菌1×PBS溶液を皮下注射する(n=6)。次いで、実験群および対照群を6時間絶食させ(この間、水分は随意に与える)、その後、血中グルコースレベルを測定する。次いで、空腹時血中グルコースレベルを、テストストリップ(Precision QID)およびMediSense血糖測定器を用いて、尾静脈から抜き取った約20μlの血液で測定する。
実施例9−皮下注射の適合性の定量
本発明の物質体の皮下による生体適合性を、急性炎症応答および全身性抗体生成によって評価する。各ゲルを、注射部位で炎症を誘発する能力について評価する。各場合において、物質体は、6匹の正常SDラット(200〜250gの体重)の右後四半身の皮下に、27ゲージ1/2インチ針を取り付けた0.5ml容シリンジを用いて注射する。
本発明の物質体の皮下による生体適合性を、急性炎症応答および全身性抗体生成によって評価する。各ゲルを、注射部位で炎症を誘発する能力について評価する。各場合において、物質体は、6匹の正常SDラット(200〜250gの体重)の右後四半身の皮下に、27ゲージ1/2インチ針を取り付けた0.5ml容シリンジを用いて注射する。
個々の各物質体の評価では、ラットに注射して急性免疫応答が発現するのに充分な時間置いた後、二酸化炭素チャンバ内に5日間で安楽死させる。有害な急性炎症応答を示す組織はいずれも、組織学的検査のために、同等の大きさの反対側の対照試料とともに切除する(Advanced Microscopy Lab、Joslin Diabetes Center,Boston,MA)。次いで、試料を4%パラホルムアルデヒド中に3日間のうち1分間固定し、エタノール中で脱水させ、次いでキシレン中で清浄化する(例えば、The and Feltkamp、Immunology 18:875−81、1970参照)。固定後、組織を、真空下でパラフィン中に包埋し、12μm厚平面の切片に分ける。ヘマトキシリンとエオシンでの組織学的染色を使用し、線維性被膜および壊死組織の厚さを調べる。また、EDlでの免疫化学的標識を使用し、マクロファージの密度を評価する。最後に、トルイジンブルーを使用し、顆粒球およびリンパ球の浸潤を評価する(例えば、The and Feltkamp、Immunology 18:865−73、1970参照)。各切片に対する組織学的スコアを示し、スチューデントのt−検定(p<0.05)を用いて、局在するリンパ球およびマクロファージの密度における差が対照ラット母集団の10%未満であることを確認する。
本発明の系の存在下で全身のコンジュゲート−またはアプタマー−特異的抗体のレベルが上昇するかどうかを調べるため、標準的な免疫処置プロトコルを各ゲル製剤に対して行なう。各場合において、物質体は、1、14および28日目に、6匹の正常SDラット(体重200−250g)の首後部の皮下に、27ゲージ1/2インチ針を取り付けた0.5ml容シリンジを用いて注射する。血液試料(500μl)は、実験前と28日目および35日目に採取する。各試料を10,000gで4℃にて1分間遠心分離し、血清を収集し、抗体濃度について解析するまで−20℃で保存する。この実験では、1×PBS溶液(n=6)を陰性対照とし、フロイント完全アジュバント(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)+コンジュゲート(n=6)およびアプタマー(n=6)を陽性対照とする。
該アプタマーおよびコンジュゲート(ProteoCell Biotechnologies,Inc.,Quebec,Canada)に対する特注の酵素免疫測定法(ELISA)を用いて、陰性対照に対する特異的IgG、IgA、IgMおよびIgE−クラス抗体の濃度を測定する。簡単には、各ウェルを100μlの1〜10μg/mlの溶液とともにインキュベートした後、ブロックバッファーを添加し、洗浄し、乾燥させ、4℃で保存することにより、対象の物質体を96ウェルプレートの表面に吸着させる。適切に希釈した血清溶液を添加してインキュベーションさせた後、抗体−HRPコンジュゲート(抗IgG、IgA、IgMおよびIgEを添加した後、TMB基質および停止溶液(すべて市販のキット(Alpha Diagnostics、San Antonio、Texas)のもの)を添加する)。得られた黄色の着色の強度を、450nmにおいて、UV−可視光吸光度プレートリーダー(SpectraMax、Molecular Devices、Sunnyvale,CA)を用いて読み取り、抗体の相対濃度に相関させる。
実施例10−糖尿病ラットにおける30日間のHbA1cレベルの低下
HbA1cレベルの低下を、実施例6の最適化された1日1回製剤について調べ、長期作用性Lantus(登録商標)(Aventis Pharmaceuticals,Bridgewater,NJ)の毎日注射ならびに徐放埋没薬(Linplant(登録商標)、LinShin Canada Inc.,1.5個の埋没薬、3U/日持続放出)と比較する。HbA1cレベルは20μLの血液を用いて測定し、該血液はキャピラリーホルダー上に配置し、続いてこれを試薬カートリッジ内に挿入し、HbA1c血中グルコースメーター(DCA 2000(登録商標)Analyzer、Bayer Healthcare LLC,Elkhart,IN)を用いて解析する。
HbA1cレベルの低下を、実施例6の最適化された1日1回製剤について調べ、長期作用性Lantus(登録商標)(Aventis Pharmaceuticals,Bridgewater,NJ)の毎日注射ならびに徐放埋没薬(Linplant(登録商標)、LinShin Canada Inc.,1.5個の埋没薬、3U/日持続放出)と比較する。HbA1cレベルは20μLの血液を用いて測定し、該血液はキャピラリーホルダー上に配置し、続いてこれを試薬カートリッジ内に挿入し、HbA1c血中グルコースメーター(DCA 2000(登録商標)Analyzer、Bayer Healthcare LLC,Elkhart,IN)を用いて解析する。
各実験群(本発明の系、Lantus(登録商標)、およびLinplant(登録商標))は、12匹のSTZ誘導型糖尿病ラットからなる。ラットには毎朝、連続60日間注射する。実験過程全体を通して3日毎に、血中グルコースおよび血清インスリンレベルを午前と午後に測定する。HbA1cレベルは、処置の14日後と30日後に測定し、処置の型と相関させる。HbA1cレベルの0.5%(p<0.05)以上の低下の絶対値により、本発明者らの最適化製剤が、s.c.注射として毎日投与された場合に有意に良好な血糖コントロールをもたらす能力が確認される。
実施例11−材料および方法
この実施例では、先の実施例に使用される材料および方法の一例を記載する。
この実施例では、先の実施例に使用される材料および方法の一例を記載する。
放射性標識アプタマー
これは、1,000〜2,000 Ci/mmolの比活性で、先に公開された方法に従って(例えば、Douganら(上掲)参照)、[125I]NaI含有0.1N NaOHを用いて調製される(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。放射活性アプタマーは、市販のCentri−Spin−10サイズ排除カラムを、供給業者の使用説明書(Princeton Separations,Adelphia,NJ)に従って使用し、ナトリウム塩として容易に調製される。
これは、1,000〜2,000 Ci/mmolの比活性で、先に公開された方法に従って(例えば、Douganら(上掲)参照)、[125I]NaI含有0.1N NaOHを用いて調製される(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。放射活性アプタマーは、市販のCentri−Spin−10サイズ排除カラムを、供給業者の使用説明書(Princeton Separations,Adelphia,NJ)に従って使用し、ナトリウム塩として容易に調製される。
インスリン−グリコゲンコンジュゲート
これは、変形臭化シアン(CNBr)カップリング反応を用いて合成される(例えば、KagedalおよびAkerstrom、Acta.Chem.Scand.25:1855−159、1974参照)。簡単には、500mgのグリコゲンを50mlの脱イオン水に溶解させる。得られた溶液に56mgの固体CNBrを添加し、5N水酸化ナトリウム(NaOH)溶液を用いて、pHを10.7+/−0.2に一定に維持する。15分間撹拌後、さらに56mgの固体CNBrを添加し、撹拌しながら45分間、pHを10.7+/−0.2の一定に維持する。次いで、この溶液に、50〜250mgのヒト組換えインスリン(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)を添加し、固体の重炭酸ナトリウムを用いてpHを9.15に調整する。この溶液を一晩撹拌し、10K MWCOポリエーテルスルホンディスク膜フィルター(Millipore,Bedford,MA)を用いて脱イオン水に対して徹底的に限外濾過し、凍結乾燥させる。次いで、得られた粉末を非コンジュゲート型インスリンから、Superdex(商標)75(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)充填カラムでの高速液体クロマトグラフィー(Waters、Milford、MA)(1Mの酢酸移動相を使用)によって精製する。次いで、接合画分を凍結乾燥させ、コンジュゲートを純粋な白色粉末として得る。インスリンのコンジュゲーション度合を、UV分光分析およびアミノ酸解析(UCLA Biopolymers Laboratory)によって測定する。
これは、変形臭化シアン(CNBr)カップリング反応を用いて合成される(例えば、KagedalおよびAkerstrom、Acta.Chem.Scand.25:1855−159、1974参照)。簡単には、500mgのグリコゲンを50mlの脱イオン水に溶解させる。得られた溶液に56mgの固体CNBrを添加し、5N水酸化ナトリウム(NaOH)溶液を用いて、pHを10.7+/−0.2に一定に維持する。15分間撹拌後、さらに56mgの固体CNBrを添加し、撹拌しながら45分間、pHを10.7+/−0.2の一定に維持する。次いで、この溶液に、50〜250mgのヒト組換えインスリン(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)を添加し、固体の重炭酸ナトリウムを用いてpHを9.15に調整する。この溶液を一晩撹拌し、10K MWCOポリエーテルスルホンディスク膜フィルター(Millipore,Bedford,MA)を用いて脱イオン水に対して徹底的に限外濾過し、凍結乾燥させる。次いで、得られた粉末を非コンジュゲート型インスリンから、Superdex(商標)75(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)充填カラムでの高速液体クロマトグラフィー(Waters、Milford、MA)(1Mの酢酸移動相を使用)によって精製する。次いで、接合画分を凍結乾燥させ、コンジュゲートを純粋な白色粉末として得る。インスリンのコンジュゲーション度合を、UV分光分析およびアミノ酸解析(UCLA Biopolymers Laboratory)によって測定する。
化学的架橋グリコゲン
これは、変形CNBrカップリング手順を用いて合成され、アプタマー選択固定相を提供する。簡単には、2gのグリコゲンを50mlの脱イオン水に溶解させる。得られた溶液に225mgの固体CNBrを添加し、5N水酸化ナトリウム(NaOH)溶液を用いてpHを10.7+/−0.2に一定に維持する。15分間撹拌後、さらに225mgの固体CNBrを添加し、撹拌しながら45分間、pHを10.7+/−0.2の一定に維持する。次いで、固体の重炭酸ナトリウムを用いてpHを9.15に調整し、得られた懸濁液を一晩撹拌する。次いで、架橋されたグリコゲンを3,000×gで10分間遠心分離し、1×PBSと、続いてアプタマー結合バッファー(50mM HEPES、pH7.4、100mM NaCl、10mM MgCl2)で徹底的に洗浄する。粒状物を必要時まで4℃に維持する。
これは、変形CNBrカップリング手順を用いて合成され、アプタマー選択固定相を提供する。簡単には、2gのグリコゲンを50mlの脱イオン水に溶解させる。得られた溶液に225mgの固体CNBrを添加し、5N水酸化ナトリウム(NaOH)溶液を用いてpHを10.7+/−0.2に一定に維持する。15分間撹拌後、さらに225mgの固体CNBrを添加し、撹拌しながら45分間、pHを10.7+/−0.2の一定に維持する。次いで、固体の重炭酸ナトリウムを用いてpHを9.15に調整し、得られた懸濁液を一晩撹拌する。次いで、架橋されたグリコゲンを3,000×gで10分間遠心分離し、1×PBSと、続いてアプタマー結合バッファー(50mM HEPES、pH7.4、100mM NaCl、10mM MgCl2)で徹底的に洗浄する。粒状物を必要時まで4℃に維持する。
ペグ化Con A
これは、500mgのCon Aを、1.0MのNaCl、1mMのCa2+およびMn2+を含有する50mlの100m(pH7.4)のBESバッファーに溶解させることにより調製される。所望量のペグ化剤(例えば、PEG−SMB−5k、Nektar Therapeutics、Huntsville、AL)を小容量の反応バッファーに溶解させ、Con A溶液にゆっくり添加する。得られた溶液を室温で一晩反応させた後、カットオフが50kDaのタンジェンシャルフロー膜(Millipore,Billerica,MA)によって徹底的に濾過する。遊離PEG試薬を精製したら、限外濾過セル(Amicon,Millipore,Billerica,MA)内で、吸光度を280nmでアッセイすることにより濃度が100mg/ml Con A当量になるまで溶液を濃縮する。278nmにおける1mg/ml溶液の吸光度を非修飾Con Aのものに標準化することによって、また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によってペグ化%を測定する。
これは、500mgのCon Aを、1.0MのNaCl、1mMのCa2+およびMn2+を含有する50mlの100m(pH7.4)のBESバッファーに溶解させることにより調製される。所望量のペグ化剤(例えば、PEG−SMB−5k、Nektar Therapeutics、Huntsville、AL)を小容量の反応バッファーに溶解させ、Con A溶液にゆっくり添加する。得られた溶液を室温で一晩反応させた後、カットオフが50kDaのタンジェンシャルフロー膜(Millipore,Billerica,MA)によって徹底的に濾過する。遊離PEG試薬を精製したら、限外濾過セル(Amicon,Millipore,Billerica,MA)内で、吸光度を280nmでアッセイすることにより濃度が100mg/ml Con A当量になるまで溶液を濃縮する。278nmにおける1mg/ml溶液の吸光度を非修飾Con Aのものに標準化することによって、また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によってペグ化%を測定する。
グルコース応答性ゲル
これは、0.100mlの100mg/mlアプタマー(またはCon A)溶液を、0.100mlの5〜100mg/mlコンジュゲート溶液と、デュアルシリンジ装置からの共注入によって合わせることにより合成される。インビトロ試験のため、得られたゲルを1.5ml容遠心チューブ内に1時間堆積させた後、得られたゲルを上清みから分離し、1mlの脱イオン水で2回、次いで1mlの1×PBSで2回洗浄した後、GSPまたは速度論試験用に2〜8Cで保存する。
これは、0.100mlの100mg/mlアプタマー(またはCon A)溶液を、0.100mlの5〜100mg/mlコンジュゲート溶液と、デュアルシリンジ装置からの共注入によって合わせることにより合成される。インビトロ試験のため、得られたゲルを1.5ml容遠心チューブ内に1時間堆積させた後、得られたゲルを上清みから分離し、1mlの脱イオン水で2回、次いで1mlの1×PBSで2回洗浄した後、GSPまたは速度論試験用に2〜8Cで保存する。
のいくつかの例示的なコンジュゲートを記載する。
このコンジュゲートのまた他の実施形態ならびにこのコンジュゲートの中間体および作製方法は、米国特許仮出願第61/162,105号(2009年3月20日出願)および対応PCT出願(2010年1月27日出願)を見るとよい。これらの関連出願の全内容は、引用により本明細書に組み込まれる。
一部の特定の実施形態では、式(I)のコンジュゲートは、下記の例示的な基の1つ以上を含むものであり得る。
Rx
一部の特定の実施形態では、Rxは水素である。一部の特定の実施形態では、Rxは、任意選択で置換されているC1〜6アルキルである。一部の特定の実施形態では、Rxは、任意選択で置換されているC1〜3アルキルである。一部の特定の実施形態では、Rxは、任意選択で置換されているメチルである。一部の特定の実施形態では、Rxは−CH3である。
一部の特定の実施形態では、Rxは水素である。一部の特定の実施形態では、Rxは、任意選択で置換されているC1〜6アルキルである。一部の特定の実施形態では、Rxは、任意選択で置換されているC1〜3アルキルである。一部の特定の実施形態では、Rxは、任意選択で置換されているメチルである。一部の特定の実施形態では、Rxは−CH3である。
Z1
一部の特定の実施形態では、Z1は、任意選択で置換されている二価のC1〜10、C1〜8、C1〜6、C1〜4またはC1〜2の炭化水素鎖である。一部の特定の実施形態では、Z1は、−(CH2)−、−(CH2CH2)−、−(CH2CH2CH2)−、−(CH2CH2CH2CH2)−、−(CH2CH2CH2CH2CH2)−、または−(CH2CH2CH2CH2CH2CH2)−である。一部の特定の実施形態では、Z1は、−(CH2)−または−(CH2CH2)−である。一部の特定の実施形態では、Z1は、−(CH2)−である。一部の特定の実施形態では、Z1は、−(CH2CH2)−である。一部の特定の実施形態では、Z1は、−(CH2CH2CH2)−である。一部の特定の実施形態では、Z1は、−(CH2CH2CH2CH2)−である。
一部の特定の実施形態では、Z1は、任意選択で置換されている二価のC1〜10、C1〜8、C1〜6、C1〜4またはC1〜2の炭化水素鎖である。一部の特定の実施形態では、Z1は、−(CH2)−、−(CH2CH2)−、−(CH2CH2CH2)−、−(CH2CH2CH2CH2)−、−(CH2CH2CH2CH2CH2)−、または−(CH2CH2CH2CH2CH2CH2)−である。一部の特定の実施形態では、Z1は、−(CH2)−または−(CH2CH2)−である。一部の特定の実施形態では、Z1は、−(CH2)−である。一部の特定の実施形態では、Z1は、−(CH2CH2)−である。一部の特定の実施形態では、Z1は、−(CH2CH2CH2)−である。一部の特定の実施形態では、Z1は、−(CH2CH2CH2CH2)−である。
一部の特定の実施形態では、Z1は、任意選択で置換されている二価のC1〜10の炭化水素鎖であって、Z1の1、2または3個のメチレン単位が、任意選択で独立して、−S−、−O−、−NRa−、−(C=NRa)−、−(C=O)−、−(S=O)−、−S(=O)2−、−(CRb=CRb)−、−(N=N)−、任意選択で置換されているアリーレン部分または任意選択で置換されているヘテロアリーレン部分から選択される1つ以上の基で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Z1は、任意選択で置換されている二価のC1〜10炭化水素鎖であって、Z1の1、2または3個のメチレン単位が、任意選択で独立して、−S−、−O−、−NRa−、−(C=NRa)−、または−(C=O)−から選択される1つ以上の基で置き換えられている。一部の特定の実施形態では、Z1は、−CH2CH2NH(C=O)C(CH3)2−、−CH2CH2N(C=NH)(CH2)3S−、−CH(Rf)2、−CH2CH(Rf)2、−CH2CH2CH(RV、−CH2S−、または−CH2CH2S−であり、式中、Rfは、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリールである(例えば、一部の特定の実施形態では、Rfは、任意選択で置換されているアリールであり;一部の特定の実施形態では、Rfはフェニルである)。一部の特定の実施形態では、Z1は、−CH2CH2NH(C=O)C(CH3)2−または−CH2CH2N(C=NH)(CH2)3S−である。一部の特定の実施形態では、Z1は、−CH2CH2NH(C=O)C(CH3)2−である。一部の特定の実施形態では、Z1は、−CH2CH2N(C=NH)(CH2)3S−である。
Y1
一部の特定の実施形態では、Y1は、フリーラジカル開始剤の断片である。かかる断片は、ハロゲン、−ORe、−SRe、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、および任意選択で置換されているヘテロアリール部分を含むものであり得るため、Y1の定義に包含される。
一部の特定の実施形態では、Y1は、フリーラジカル開始剤の断片である。かかる断片は、ハロゲン、−ORe、−SRe、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、および任意選択で置換されているヘテロアリール部分を含むものであり得るため、Y1の定義に包含される。
一部の特定の実施形態では、Y1は、水素、ハロゲン、または開始剤の断片である。一部の特定の実施形態では、Y1は、水素またはハロゲンである。一部の特定の実施形態では、Y1は、水素または臭素である。
X1
一部の特定の実施形態では、X1は−ORCである。一部の特定の実施形態では、X1は、−ORCと−N(Rd)2の混合物である。一部の特定の実施形態では、X1は、−N(Rd)2である。
一部の特定の実施形態では、X1は−ORCである。一部の特定の実施形態では、X1は、−ORCと−N(Rd)2の混合物である。一部の特定の実施形態では、X1は、−N(Rd)2である。
は共有結合性の単結合である。
一部の特定の実施形態では、W1はポリマーに、アミノ基によって共有結合されている。一部の特定の実施形態では、W1はポリマーに、第1級アミノ基によって共有結合されている。
に相当し、式中、[薬物−NH−]基または[薬物−N=]基は、第1級アミノ基によって共有結合により直接コンジュゲートされた薬物である。他の実施形態では、薬物は、懸垂アミノ基を末端とするスペーサー基(例えば、アルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、エステル結合、アミド結合など)を含むものであり得る。後者の実施形態により、薬物の活性部分とポリマーとの間隔を大きくすることが可能になる。
r
一部の特定の実施形態では、rは10〜25(両端を含む)の整数である。一部の特定の実施形態では、rは15〜25(両端を含む)の整数である。一部の特定の実施形態では、rは20〜25(両端を含む)の整数である。一部の特定の実施形態では、rは5〜20(両端を含む)の整数である。一部の特定の実施形態では、rは10〜20(両端を含む)の整数である。一部の特定の実施形態では、rは15〜20(両端を含む)の整数である。一部の特定の実施形態では、rは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25である。一部の特定の実施形態では、rは5である。一部の特定の実施形態では、rは10である。一部の特定の実施形態では、rは15である。一部の特定の実施形態では、rは20である。一部の特定の実施形態では、rは25である。
一部の特定の実施形態では、rは10〜25(両端を含む)の整数である。一部の特定の実施形態では、rは15〜25(両端を含む)の整数である。一部の特定の実施形態では、rは20〜25(両端を含む)の整数である。一部の特定の実施形態では、rは5〜20(両端を含む)の整数である。一部の特定の実施形態では、rは10〜20(両端を含む)の整数である。一部の特定の実施形態では、rは15〜20(両端を含む)の整数である。一部の特定の実施形態では、rは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25である。一部の特定の実施形態では、rは5である。一部の特定の実施形態では、rは10である。一部の特定の実施形態では、rは15である。一部の特定の実施形態では、rは20である。一部の特定の実施形態では、rは25である。
(式中、(g+t)の和はrに等しい)の混合物に相当する。一部の特定の実施形態では、各場合のgとtは、独立して、1〜24(両端を含む)の整数であるが、(g+t)の和は5以上25以下であるものとする。一部の特定の実施形態では、gとtは、約1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、または1:1(g:t)の比率で存在する。一部の特定の実施形態では、gとtは、約1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、または1:2(g:t)の比率で存在する。
のコンジュゲートが使用され得る。
のコンジュゲートが使用され得る。
のコンジュゲートが使用され得る。
のコンジュゲートが使用され得る。
のコンジュゲートが使用され得る。
のコンジュゲートが使用され得る。
(式中、それぞれ、(g+t)の和はrに等しい)の混合物に相当する。一部の特定の実施形態では、rは10である。一部の特定の実施形態では、rは20である。
コンジュゲートの特性評価
該コンジュゲートは、任意の解析方法、例えば、核磁気共鳴(例えば、1H NMR);分子量と多分散性はゲル透過クロマトグラフィー(GPC);および鎖1本あたりの酸基の数の測定はフーリエ変換赤外分光分析(FTIR)または酸滴定によって特性評価することができる。
該コンジュゲートは、任意の解析方法、例えば、核磁気共鳴(例えば、1H NMR);分子量と多分散性はゲル透過クロマトグラフィー(GPC);および鎖1本あたりの酸基の数の測定はフーリエ変換赤外分光分析(FTIR)または酸滴定によって特性評価することができる。
一部の特定の実施形態では、コンジュゲートの枠組構造(すなわち、親和性リガンド、薬物または検出可能な標識を含まない)は、10,000Da未満、例えば約100〜約10,000Daの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約300〜約5,000Daの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約500〜約2,500Daの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約1,000〜2,000Daの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約200〜1,000Daの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約300〜800Daの範囲の分子量を有する。
一部の特定の実施形態では、コンジュゲートの混合物を作製する。該コンジュゲートは、この混合物において、同じ分子量を有するものであっても異なる分子量を有するものであってもよい。一実施形態において、混合物の多分散性は1.5未満である。一実施形態において、混合物の多分散性は1.25未満である。
のいくつかの例示的なコンジュゲートを記載する。
このコンジュゲートのまた他の実施形態ならびにこのコンジュゲートの中間体および作製方法は、米国特許仮出願第61/147,878号(2009年1月28日出願)、米国特許仮出願第61/159,643号(2009年3月12日出願)、米国特許仮出願第61/162,107号(2009年3月20日出願)、米国特許仮出願第61/163,084号(2009年3月25日出願)、米国特許仮出願第61/219,897号(2009年6月24日出願)、米国特許仮出願第61/223,572号(2009年7月7日出願)、米国特許仮出願第61/252,857号(2009年10月19日出願)、および対応PCT出願(2010年1月27日出願)を見るとよい。これらの関連出願の全内容は、引用により本明細書に組み込まれる。
のコンジュゲートが提供される。
のコンジュゲートが提供される。
のコンジュゲートが提供される。
のコンジュゲートが提供される。
のコンジュゲートが提供される。
のコンジュゲートが提供される。
コンジュゲートの特性評価
該コンジュゲートは、任意の解析方法、例えば、核磁気共鳴(例えば、1H NMR);分子量と多分散性はゲル透過クロマトグラフィー(GPC);およびフーリエ変換赤外分光分析(FTIR)などよって特性評価することができる。
該コンジュゲートは、任意の解析方法、例えば、核磁気共鳴(例えば、1H NMR);分子量と多分散性はゲル透過クロマトグラフィー(GPC);およびフーリエ変換赤外分光分析(FTIR)などよって特性評価することができる。
一部の特定の実施形態では、コンジュゲートの枠組構造(すなわち、親和性リガンド、薬物または検出可能な標識を含まない)は、10,000Da未満、例えば約100〜約10,000Daの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約300〜約5,000Daの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約500〜約2,500Daの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約1,000〜2,000Daの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約200〜1,000Daの範囲の分子量を有する。一部の特定の実施形態では、コンジュゲート枠組構造は約300〜800Daの範囲の分子量を有する。
他の実施形態
本発明の他の実施形態は、本明細書の検討または本明細書に開示した発明の実施により、当業者に自明となろう。本明細書および実施例は単なる例示とみなし、本発明の真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲に示されていることを意図する。
本発明の他の実施形態は、本明細書の検討または本明細書に開示した発明の実施により、当業者に自明となろう。本明細書および実施例は単なる例示とみなし、本発明の真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲に示されていることを意図する。
Claims (55)
- 標的分子に結合する多価ポリヌクレオチドアプタマー;および
コンジュゲート枠組構造に結合された2つ以上の個別の親和性リガンドを含むコンジュゲートを含む架橋物質体であって、
該2つ以上の親和性リガンドは、該アプタマーとの結合に関して該標的分子と競合し、異なるコンジュゲート上の親和性リガンドと該アプタマー間の非共有結合性相互作用の結果、該物質体内で該コンジュゲートが架橋される、
架橋物質体。 - 該コンジュゲートが、さらに、その枠組構造に結合された薬物を含む、請求項1に記載の物質体。
- 該コンジュゲートが、さらに、その枠組構造に結合された検出可能な標識を含む、請求項1に記載の物質体。
- 標的分子がグルコースである、請求項1に記載の物質体。
- 該コンジュゲートの親和性リガンドが糖質を含む、請求項4に記載の物質体。
- 該コンジュゲートの親和性リガンドが、グルコース、マンノース、グルコサミン、マンノサミン、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコース、およびエチルマンノースから選択される糖質を含む、請求項5に記載の物質体。
- 該コンジュゲートの親和性リガンドがビマンノース(bimmanose)またはトリマンノースを含む、請求項5に記載の物質体。
- 該コンジュゲートの親和性リガンドが、アミノエチルグルコース(AEG)、アミノエチルマンノース(AEM)、アミノエチルビマンノース(AEBM)またはアミノエチルトリマンノース(AETM)を含む、請求項5に記載の物質体。
- 該コンジュゲートの親和性リガンドが糖質とリンカーを含み、該糖が該リンカーにアノマー炭素を介して共有結合されている、請求項5に記載の物質体。
- アノマー炭素がαアノマーである、請求項9に記載の物質体。
- 150mMのNaClを含み、標的分子を含まない37CでpH7の25mMのHEPES緩衝液に入れたとき不溶性である、請求項1に記載の物質体。
- 該コンジュゲートが該物質体から、標的分子の濃度に依存性の速度で、または標的分子の濃度に依存性の程度まで放出される、請求項11に記載の物質体。
- 標的分子がグルコースである、請求項12に記載の物質体。
- 50rpmでUSP溶出試験法IIを使用し、37Cで150mMのNaClおよび100mg/dLのグルコースを含むpH7の25mMのHEPES緩衝液に6時間入れたとき、実質的に不溶性のままである、請求項13に記載の物質体。
- 50rpmでUSP溶出試験法IIを使用し、37Cで150mMのNaClおよび100mg/dLのグルコースを含むpH7の25mMのHEPES緩衝液に6時間入れたとき、10%未満の物質体が溶解する、請求項13に記載の物質体。
- 50rpmでUSP溶出試験法IIを使用し、37Cで150mMのNaClおよび400mg/dLのグルコースを含むpH7の25mMのHEPES緩衝液に6時間入れたとき、少なくとも50%の物質体が溶解する、請求項13に記載の物質体。
- 50rpmでUSP溶出試験法IIを使用し、37Cで150mMのNaClおよび400mg/dLのグルコースを含むpH7の25mMのHEPES緩衝液に6時間入れたとき、100%の物質体が溶解する、請求項13に記載の物質体。
- 該コンジュゲートが、さらに、その枠組構造に結合された薬物を含む、請求項13に記載の物質体。
- 薬物が抗糖尿病薬である、請求項18に記載の物質体。
- 薬物がインスリン分子である、請求項18に記載の物質体。
- 薬物がインスリン感受性改善薬である、請求項18に記載の物質体。
- 薬物がインスリン分泌促進薬(secretatogue)である、請求項18に記載の物質体。
- コンジュゲート枠組構造がポリマー系である、請求項1に記載の物質体。
- コンジュゲート枠組構造がポリマー系でない、請求項1に記載の物質体。
- コンジュゲート枠組構造が分岐型または超分岐型である、請求項1に記載の物質体。
- コンジュゲートの枠組構造が多糖を含む、請求項1に記載の物質体。
- 該コンジュゲートが、式:
Rxは、水素または任意選択で置換されているC1〜6アルキルであり;
Z1は、任意選択で置換されている二価のC1〜10炭化水素鎖であり、ここで、Z1の1、2、3、4または5個のメチレン単位は、任意選択で独立して、−S−、−O−、−NRa−、−(C=NRa)−、−(C=O)−、−(S=O)−、−S(=O)2−、−(CRb=CRb)−、−(N=N)−、任意選択で置換されているアリーレン部分または任意選択で置換されているヘテロアリーレン部分から選択される1つ以上の基で置き換えられており、式中、Raは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、または適当なアミノ保護基であり、Rbは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、または任意選択で置換されているヘテロアリールであり;
存在するX1は各々、独立して、−ORCまたは−N(Rd)2であり、式中、Rcは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、適当なヒドロキシル保護基、カチオン基、または親和性リガンドであり、各Rdは、独立して、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、適当なアミノ保護基、または親和性リガンドであるが、存在するX1の少なくとも2つは親和性リガンドを含むものとし;
Y1は、水素、ハロゲン、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、任意選択で置換されているヘテロアリール、−OReまたは−SReであり、式中、Reは、水素、任意選択で置換されている脂肪族、任意選択で置換されているヘテロ脂肪族、任意選択で置換されているアリール、または任意選択で置換されているヘテロアリールであり;
rは、5〜25(両端を含む)の整数であり;
W1は、薬物または検出可能な標識であり;
の構造を含む、請求項1に記載の物質体。 - 該コンジュゲートが、式:
存在する[(A−T)]は各々、該コンジュゲート内の存在し得る分岐部を表し;
存在する(A−T)は各々、該コンジュゲートの分岐内の存在し得る反復部を表し;
存在するA−T
は各々、独立して、共有結合、炭素原子、ヘテロ原子、またはアシル、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリールおよび複素環式からなる群より選択される任意選択で置換されている基であり;
存在するTは各々、独立して、共有結合であるか、または二価の直鎖もしくは分枝鎖の飽和もしくは不飽和の任意選択で置換されているC1〜30炭化水素鎖であり、ここで、Tの1つ以上のメチレン単位は、任意選択で独立して、−O−、−S−、−N(R)−、−C(O)−、−C(O)O−、−OC(O)−、−N(R)C(O)−、−C(O)N(R)−、−S(O)−、−S(O)2−、−N(R)SO2−、−SO2N(R)−、複素環式基、アリール基またはヘテロアリール基で置き換えられており;
存在するRは各々、独立して、水素、適当な保護基、またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分もしくはヘテロ脂肪族部分であり;
−Bは、−T−LB−Xであり;
存在するXは各々、独立して、親和性リガンドであり;
存在するLBは各々、独立して、共有結合であるか、またはTとXとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基であり;
−Dは、−T−LD−Wであり;
存在するWは各々、独立して、薬物または検出可能な標識であり;
存在するLDは各々、独立して、共有結合であるか、またはTとWとの共有結合性コンジュゲーションに由来する基であり;
kは、2〜11(両端を含む)の整数であり、該コンジュゲート内にk−分岐部が少なくとも2つあることを規定し;
qは、1〜4(両端を含む)の整数であり;
k+qは、3〜12(両端を含む)の整数であり;
存在するpは各々、独立して、1〜5(両端を含む)の整数であり;
存在するnは各々、独立して、0〜5(両端を含む)の整数であり;
存在するmは各々、独立して、1〜5(両端を含む)の整数であり;
存在するvは各々、独立して、0〜5(両端を含む)の整数であるが、各k−分岐部において、存在する少なくとも1つのnは≧1であり、存在する少なくとも1つのvは≧1であるものとする)
の構造を含む、請求項1に記載の物質体。 - XおよびWがそれぞれ存在しない該コンジュゲートの分子量が10,000Da未満である、請求項27または28に記載の物質体。
- XおよびWがそれぞれ存在しない該コンジュゲートの分子量が約300〜約5,000Daの範囲である、請求項29に記載の物質体。
- XおよびWがそれぞれ存在しない該コンジュゲートの分子量が約300〜約800Daの範囲である、請求項29に記載の物質体。
- 存在するXの少なくとも2つが糖質を含む親和性リガンドを含む、請求項29に記載の物質体。
- 存在するXの少なくとも2つが、グルコース、マンノース、グルコサミン、マンノサミン、メチルグルコース、メチルマンノース、エチルグルコース、およびエチルマンノースからなる群より選択される糖質を含む親和性リガンドを含む、請求項29に記載の物質体。
- 存在するXの少なくとも2つが、ビマンノース(bimmanose)またはトリマンノースを含む親和性リガンドを含む、請求項29に記載の物質体。
- 存在するXの少なくとも2つが、アミノエチルグルコース(AEG)、アミノエチルマンノース(AEM)、アミノエチルビマンノース(AEBM)およびアミノエチルトリマンノース(AETM)から選択される親和性リガンドを含む、請求項29に記載の物質体。
- 存在するXの少なくとも2つが、糖質とリンカーを含む親和性リガンドを含み、該糖が該リンカーにアノマー炭素を介して共有結合されている、請求項29に記載の物質体。
- アノマー炭素がαアノマーである、請求項36に記載の物質体。
- 多価アプタマーが、配列番号1、2、3、4、5、6または7の少なくとも40個の連続するヌクレオチドを含む、請求項4に記載の物質体。
- 多価アプタマーが、配列番号1、2、3、4、5、6または7の少なくとも40個の連続するヌクレオチドと少なくとも70%の相同性を有する1つ以上の領域を含む、請求項4に記載の物質体。
- 多価アプタマーが、配列番号8、9または10のヌクレオチド配列を含む、請求項4に記載の物質体。
- 多価アプタマーが、配列番号8、9または10の少なくとも30個の連続するヌクレオチドと少なくとも70%の相同性を有する1つ以上の領域を含む、請求項4に記載の物質体。
- 多価アプタマーが、配列番号8、9または10と少なくとも70%の相同性を有する1つ以上の領域を含む、請求項4に記載の物質体。
- 請求項1〜42のいずれか一項に記載の物質体を患者に投与することを含む方法。
- 該物質体が皮下注射によって投与される、請求項43に記載の方法。
- 該コンジュゲートが、該枠組構造に結合されたインスリン分子を含む、請求項43に記載の方法。
- 患者が糖尿病である、請求項45に記載の方法。
- 該物質体が、インスリン分子の平均日用量が10〜200Uの範囲となるように投与される、請求項46に記載の方法。
- 該物質体が毎日投与される、請求項47に記載の方法。
- 該物質体が毎月投与される、請求項47に記載の方法。
- 該物質体が毎月投与される、請求項47に記載の方法。
- 患者がインスリン感受性改善薬も受けている、請求項47に記載の方法。
- 患者がインスリン分泌促進薬も受けている、請求項47に記載の方法。
- (I)(a)グルコースに対する結合部位を少なくとも2つ有する多価ポリヌクレオチドアプタマーであって、第1の標識を含む多価ポリヌクレオチドアプタマーと、
(b)親和性リガンドおよび第2の標識を含むコンジュゲートと、
を混合する工程
ここで、第1の標識は、第2の標識に近接していると、測定可能な応答をもたらす;
(II)試料を、該多価ポリヌクレオチドアプタマーと該コンジュゲートの混合物に曝露する工程、ここで、
(a)グルコースが試料中に存在しない場合、該コンジュゲートは該ポリヌクレオチドアプタマーと、該ポリヌクレオチドアプタマーに対する親和性結合によって架橋物質体を形成し、測定可能な応答をもたらし、
(b)グルコースが試料中に存在する場合、試料由来のグルコースが該コンジュゲートと、該ポリヌクレオチドアプタマー上の結合部位に関して競合する結果、該架橋物質体の形成が抑止されるため応答が低減される;ならびに
(III)試料中のグルコースの存在および任意選択で量を測定するセンサーにより該応答を検出し、任意選択で該応答を測定する工程
を含む方法。 - (I)(a)グルコースに対する結合部位を少なくとも2つ有する多価ポリヌクレオチドアプタマーと、
(b)親和性リガンドおよび第1の標識を含む第1の分子群と、
(c)親和性リガンドおよび第2の標識を含む第2の分子群と、
を混合する工程、
ここで、第1の標識は、第2の標識に近接していると測定可能な応答をもたらす、
(II)試料を、該多価ポリヌクレオチドアプタマーと第1の分子群および第2の分子群との混合物に曝露する工程、ここで、
(a)グルコースが試料中に存在しない場合、第1の分子群および第2の分子群の構成員は、該多価ポリヌクレオチドアプタマーに対する親和性結合によって近接し、結合複合体および測定可能な応答をもたらし、
(b)グルコースが試料中に存在する場合、試料由来のグルコースが、第1および第2の分子と、該多価ポリヌクレオチドアプタマー上の結合部位に関して競合する結果、前記結合複合体の形成が少なくなるため応答が低減される;ならびに
(III)試料中のグルコースの存在および任意選択で量を測定するセンサーにより該応答を検出し、任意選択で該応答を測定する工程
を含む方法。 - (I)(a)複数の親和性リガンドを含むコンジュゲートと、
(b)グルコースに対する結合部位を少なくとも2つ有する多価ポリヌクレオチドアプタマー
を準備する工程;
(II)該コンジュゲートと該ポリヌクレオチドアプタマーを混合する工程、
ここで、得られた混合物の粘性は、該コンジュゲートと該ポリヌクレオチドアプタマー間の結合によるものである;
(III)該混合物を、グルコースを含む試料と接触させる工程、
これにより、該コンジュゲートが該ポリヌクレオチドアプタマーから外れ、濃度依存性の粘性の低下が引き起こされる;ならびに
(IV)生じた粘性の変化を検出し、任意選択で該変化を測定し、試料中のグルコースの存在および任意選択で量を測定する工程
を含む方法。
Applications Claiming Priority (21)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US14787809P | 2009-01-28 | 2009-01-28 | |
US61/147,878 | 2009-01-28 | ||
US15964309P | 2009-03-12 | 2009-03-12 | |
US61/159,643 | 2009-03-12 | ||
US16209209P | 2009-03-20 | 2009-03-20 | |
US16210509P | 2009-03-20 | 2009-03-20 | |
US16210709P | 2009-03-20 | 2009-03-20 | |
US16205309P | 2009-03-20 | 2009-03-20 | |
US61/162,105 | 2009-03-20 | ||
US61/162,107 | 2009-03-20 | ||
US61/162,053 | 2009-03-20 | ||
US61/162,092 | 2009-03-20 | ||
US16308409P | 2009-03-25 | 2009-03-25 | |
US61/163,084 | 2009-03-25 | ||
US21989709P | 2009-06-24 | 2009-06-24 | |
US61/219,897 | 2009-06-24 | ||
US22357209P | 2009-07-07 | 2009-07-07 | |
US61/223,572 | 2009-07-07 | ||
US25285709P | 2009-10-19 | 2009-10-19 | |
US61/252,857 | 2009-10-19 | ||
PCT/US2010/022237 WO2010088276A2 (en) | 2009-01-28 | 2010-01-27 | Polynucleotide aptamer-based cross -linked materials and uses thereof |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2012516156A true JP2012516156A (ja) | 2012-07-19 |
Family
ID=42396318
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011548253A Pending JP2012516156A (ja) | 2009-01-28 | 2010-01-27 | ポリヌクレオチドアプタマー系架橋物質体およびその使用 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8603529B2 (ja) |
EP (1) | EP2391380A4 (ja) |
JP (1) | JP2012516156A (ja) |
AU (1) | AU2010208295A1 (ja) |
CA (1) | CA2750245A1 (ja) |
WO (1) | WO2010088276A2 (ja) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9050370B2 (en) | 2009-01-28 | 2015-06-09 | Smartcells, Inc. | Conjugate based systems for controlled drug delivery |
WO2010088268A1 (en) | 2009-01-28 | 2010-08-05 | Smartcells, Inc. | Exogenously triggered controlled release materials and uses thereof |
AU2010208305A1 (en) | 2009-01-28 | 2011-09-08 | Smartcells, Inc. | Synthetic conjugates and uses thereof |
US9095623B2 (en) | 2009-03-20 | 2015-08-04 | Smartcells, Inc. | Terminally-functionalized conjugates and uses thereof |
CA2754950A1 (en) | 2009-03-20 | 2010-09-23 | Smartcells, Inc. | Terminally-functionalized conjugates and uses thereof |
WO2010111466A1 (en) | 2009-03-27 | 2010-09-30 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Aptamer-mediated drug release |
CA2806399A1 (en) | 2010-07-28 | 2012-02-02 | Smartcells, Inc. | Recombinantly expressed insulin polypeptides and uses thereof |
CA2805902A1 (en) | 2010-07-28 | 2012-02-02 | Smartcells, Inc. | Recombinant lectins, binding-site modified lectins and uses thereof |
JP2013542915A (ja) * | 2010-07-28 | 2013-11-28 | スマートセルズ・インコーポレイテツド | 薬物−リガンドコンジュゲート、その合成およびその中間体 |
CA2924743A1 (en) | 2013-10-04 | 2015-04-09 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Glucose-responsive insulin conjugates |
WO2017150785A1 (ko) * | 2016-03-04 | 2017-09-08 | 주식회사 넥스모스 | 항산화물질의 산화방지 방법, 그 물질 및 그 용도 |
US11850285B2 (en) | 2017-03-07 | 2023-12-26 | North Carolina State University | Insulin-responsive glucagon delivery patch |
JP6954152B2 (ja) * | 2018-01-25 | 2021-10-27 | 王子ホールディングス株式会社 | 分析用基板 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004056311A2 (en) * | 2002-12-17 | 2004-07-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Stimuli-responsive systems for controlled drug delivery |
US20070099820A1 (en) * | 2005-10-19 | 2007-05-03 | Smartcells, Inc. | Polymer-drug conjugates |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9313484D0 (en) * | 1993-06-30 | 1993-08-11 | Univ Montfort | Drug system ii |
JP2000501414A (ja) | 1995-11-22 | 2000-02-08 | ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー | 生体分子の細胞取り込みを高めるリガンド |
US20110131679A2 (en) | 2000-04-19 | 2011-06-02 | Thomas La Rosa | Rice Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement |
AU2001280552A1 (en) * | 2000-07-13 | 2002-01-30 | The Ohio State University Research Foundation | Multimeric biopolymers as structural elements, sensors and actuators in microsystems |
ATE516366T1 (de) * | 2002-07-25 | 2011-07-15 | Archemix Corp | Regulierte aptamer-therapeutika |
WO2005052121A2 (en) * | 2003-11-21 | 2005-06-09 | Archemix Corp. | Multivalent aptamers |
US20050282190A1 (en) * | 2004-04-09 | 2005-12-22 | Hua Shi | Modular design and construction of nucleic acid molecules, aptamer-derived nucleic acid constructs, RNA scaffolds, their expression, and methods of use |
WO2005108482A1 (ja) * | 2004-05-07 | 2005-11-17 | Japan Science And Technology Agency | 多糖/カーボンナノチューブ複合体 |
EP2052088A2 (en) | 2006-08-02 | 2009-04-29 | Genizon Biosciences | Genemap of the human genes associated with psoriasis |
-
2010
- 2010-01-27 JP JP2011548253A patent/JP2012516156A/ja active Pending
- 2010-01-27 WO PCT/US2010/022237 patent/WO2010088276A2/en active Application Filing
- 2010-01-27 CA CA2750245A patent/CA2750245A1/en not_active Abandoned
- 2010-01-27 AU AU2010208295A patent/AU2010208295A1/en not_active Abandoned
- 2010-01-27 EP EP10736343.4A patent/EP2391380A4/en not_active Withdrawn
- 2010-01-27 US US13/145,531 patent/US8603529B2/en active Active - Reinstated
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004056311A2 (en) * | 2002-12-17 | 2004-07-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Stimuli-responsive systems for controlled drug delivery |
US20070099820A1 (en) * | 2005-10-19 | 2007-05-03 | Smartcells, Inc. | Polymer-drug conjugates |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2750245A1 (en) | 2010-08-05 |
WO2010088276A2 (en) | 2010-08-05 |
US20110281939A1 (en) | 2011-11-17 |
US8603529B2 (en) | 2013-12-10 |
EP2391380A4 (en) | 2015-05-13 |
WO2010088276A3 (en) | 2011-01-27 |
EP2391380A2 (en) | 2011-12-07 |
AU2010208295A1 (en) | 2011-08-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9745355B2 (en) | Binding-site modified lectins and uses thereof | |
US8603529B2 (en) | Polynucleotide aptamer-based cross-linked materials and uses thereof | |
JP6040301B2 (ja) | 制御された薬物送達のための複合体に基づくシステム | |
US9114176B2 (en) | Exogenously triggered controlled release materials and uses thereof | |
US8940690B2 (en) | Synthetic conjugates and uses thereof | |
US9068013B2 (en) | Recombinant lectins, binding-site modified lectins and uses thereof | |
US8623345B2 (en) | Terminally-functionalized conjugates and uses thereof | |
US9095623B2 (en) | Terminally-functionalized conjugates and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20121120 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140507 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20150113 |