WO2005108482A1

WO2005108482A1 - 多糖／カーボンナノチューブ複合体

Info

Publication number: WO2005108482A1
Application number: PCT/JP2005/008352
Authority: WO
Inventors: Masami Mizu; Seiji Shinkai; Teruaki Hasegawa; Munenori Numata; Tomohisa Fujisawa; Kazuo Sakurai
Original assignee: Japan Science And Technology Agency; Mitsui Sugar Co., Ltd.
Priority date: 2004-05-07
Filing date: 2005-05-06
Publication date: 2005-11-17
Also published as: JPWO2005108482A1; EP1749854A1; US7935683B2; EP1749854B1; EP1749854A4; JP4406007B2; US20080242854A1

Abstract

　単糖またはオリゴ糖の残基が主鎖の側部に導入された修飾多糖とカーボンナノチューブとから構成される多糖／カーボンナノチューブ複合体が開示されている。多糖としてはβ－1,3－グルカンが好ましい。該複合体は、非プロトン性極性溶媒または強アルカリ性溶液に溶解した修飾多糖とカーボンナノチューブの分散水溶液とを混合した後、インキュベートすることによって調製される。

Description

明細書

多糖 Zカーボンナノチューブ複合体

技術分野

[0001] 本発明は、生体適合性などの特性を有する新規な多糖/カーボンナノチューブ複合体に関する。

背景技術

[0002] これまで用いられてきたリソグラフ法が限界を迎えるにつれ、近年、低分子の自己組織化を基にしてマイクロ電子回路を作成しょうとする試みが盛んに行われてきている。たとえば、導電性を有することが明らかにされた核酸二重鎖を分子サイズ導線と考え、相補核酸同士の複合体形成能を利用して組織化することによるマイクロ電子回路作成の試みが行われてレ、る。

[0003] この流れの中で、ダイヤモンド、グラフアイト、フラーレンに次ぐ第四の炭素同素体としてカーボンナノチューブが注目されている。グラフエンシートが筒状に卷いた構造として定義できるカーボンナノチューブには、その筒の卷き方によって多層カーボンナノチューブと単層カーボンナノチューブに大別されるが、これらカーボンナノチューブ類力数々の興味ある性質を示すことがわ力つてきた。

非特許文献 1 : P. M.Ajayan, Chem. Rev. 1999， 99， 1787

非特許文献 2 : Υ.-Ρ· Sun'K. Fu, Y. Lin, W. Huang, Acc. Chem. Res. 2002, 35， 1096 非特許文献 3 : S. Niyogi, M. A. Hamon, H. Hu， B. Zhao, P. Bhowmik, R. Sen, M. E.Itkis, R. C. Haddon, Acc. Chem. Res. 2002, 35, 1105.

[0004] たとえば単層カーボンナノチューブはその直径分布が 0.8-1.4nm付近に集中しており、量子サイズの非常に細い剛直な直線状分子であるといえる力このようなごく微細な直径にも関わらず、単層カーボンナノチューブの引っ張り強度は、数十 GPa程度と非常に強い。また、どんどん引っ張っていっても破断せずに、ネッキングを起こして最後は両端がつながった一炭素原子列になるという理論予測がなされている。また、曲げ応力に関しても単層カーボンナノチューブが非常に強い物性を示すことがわかつてきた。たとえばカーボンファイバーや金属は曲げ応力をカ卩えると、弾性限界を超えたところで破断するのに対し、単層カーボンナノチューブは圧縮側にうねり構造をとりながら変形していくことが透過電子顕微鏡観察などにより判明した。また変形しても復元することも大きな特徴である。以上のことから単層カーボンナノチューブは破断しにく柔軟性に富んでいることが分かる。

[0005] また、単層カーボンナノチューブの密度は 1.33〜1.40gん m³という非常に小さい値を示す。これは単層カーボンナノチューブが中空構造をとることに起因しており、現在の軽量 '高強度材料の代表格であるアルミニウムの密度が 2.7gん m³であることと比べても圧倒的に軽い。その機械的強度を考慮すると、単層カーボンナノチューブは、軽量 ·超強度が求められる分野においてかなり理想的な素材といえる。

[0006] このように機械的に優れた特性を有するだけでなぐカーボンナノチューブは π— 電子雲がつながった構造を有することから導電性があることがわかってきた。たとえば単層カーボンナノチューブはその構造の違いによりジグザグ型、カイラル型、アームチェア型の三種の異性体が存在し、微妙な構造の違いによって金属的または半導体的な導電性を示すことが知られている。

[0007] さらに最近、単層カーボンナノチューブの内孔を介して物質の輸送が可能であることや、単層カーボンナノチューブが細胞内への薬物送達キャリアーとなりうることが示されている。

非特霄午文献 4 : D.Pantarotto, J. -P. Briand, M. Prato, A. Bianco, Chem. Commun. 2004, 16.

[0008] 以上の諸性質より、カーボンナノチューブには単なる次世代微少電子回路の導電物質としてだけでなぐ生物化学を含んだ幅広い分野で応用可能な新規材料としての期待がかかっている。

[0009] たとえば、単層カーボンナノチューブの導電性は周囲の環境、たとえば単層カーボンナノチューブに対する二原子分子やタンパク質の吸着などにより、劇的に変化することが示されており、その現象を利用して目的物質の存在を検出するためのセンサーとしての利用が期待されてレ、る。

特霄午文献 5 : S. Santucci, S. Picozzi, F. Di Gregorio, L. Lozzi, C. Cantalini, L.Valentini, J. M. Kenny, B. Delley, J. Chem. Phys. 2003， 119, 10904. 非特許文献 6 : R. J. Chen, S. Bangsaruntip, K. A. Drouvalakis, N. W. S. Kam, M.Shim, Y. M. Li,， W. Kim, P. J. Utz, H. J. Dai, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003, 100， 4984.

非特許文献 7 : K. Besteman, J. Lee, F. G. M. Wiertz, H. A. Heering, C. Dekker, Nano Lett. 2003, 3， 727.

[0010] し力ながら、カーボンナノチューブは炭素のみから構成されることから非常に自己凝集性が高ぐ水や一般有機溶媒を含むあらゆる媒体に不溶である。またカーボンナノチューブには分子認識基が存在しないことから、特定分子種のみとは選択的に相互作用しない。

[0011] カーボンナノチューブの溶媒に対する分散性の向上およびカーボンナノチューブを基にしたセンサーシステム開発のため、カーボンナノチューブの直接化学修飾による分子認識部位の導入に関する研究が盛んに行われてきた。たとえば単層カーボンナノチューブを混酸中超音波処理することでカーボンナノチューブを酸化し、生じたカルボキシル基に対してアミド化を行うことにより、ポリエーテル基やペプチド、糖鎖などが導入されている。

非特許文献 8： Matsuura, K. Hayashi, N. Kimizuka, Chem. Lett. 2003， 32, 212.

[0012] また、混酸処理を経ずに環化付カ卩反応を経て直接カーボンナノチューブを修飾する方法も盛んに行われてレ、る。

非特許文献 9 : D. M. Guldi, M. Marcaccio, D. Paolucci, F. Paolucci'N.

Tagmatarchis, D. Tasis, E. Vazquez, M. Prato, Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42,4206.

非特許文献 10 : A. Bianco, M. Prato, Adv. Mater. 2003, 15, 1765

[0013] このようにカーボンナノチューブの直接化学修飾法は大きな発展を遂げつつあるものの、化学修飾の際に必然的にカーボンナノチューブの π—電子系を乱すことから、カーボンナノチューブが本来有してレ、た導電性 ·剛直性 ·直線性などの諸性質の低下を招くことが避けられなかった。また、修飾率を高めるほどカーボンナノチューブの導電性が大幅に低下することから、直接化学修飾法による高密度機能性基導入はきわめて困難であった。これらの問題を解決するため、簡便で一般的、かつカーボンナノチューブの電気化学特性を損なわない非破壊的な機能化方法の開発が望まれている。

[0014] 一方、カーボンナノチューブの可溶化の観点から、これまで様々な被覆剤が研究されてきた。たとえばアミノ基を有するピレン系化合物はピレンとカーボンナノチューブとの相互作用によりカーボンナノチューブ表面に吸着し、アミノ基由来のカチオン性によりカーボンナノチューブを水溶化することが報告されている。

非特許文献 11 : A. B. Artyukhin, 0. Bakajin, P. Stroeve, A. Noy, Langmuir 2004, 20, 1442.

[0015] 同様にカチオン性ピレン含有ポリアクリルアミドは、ピレンとカーボンナノチューブとの間の強い相互作用によってカーボンナノチューブに吸着し、ポリマー鎖中の負電荷によりカーボンナノチューブを水溶化する事が示されている。

非特許文献 12 : P. Petrov, F. Stassm, C. Pagnoulle, R. Jerome, Chem.し ommun. 2003, 2904.

[0016] さらに天然多糖であるアミロースも単層カーボンナノチューブと複合化し、それを可溶化することがわかってきた。

非特許文献 13 : A. Star, D. W. Steuerman, J. R. Heath, J. F. Stoddart,Angew.

Chem. Int. ed. 2002， 41 , 2508.

非特許文献 14 : 0. -K. Kim, J. Je, J. W. Baldwin, S. Kooi, P. E.Pehrsson,し J. Buckley, J. Am. Chem.Soc. 2003, 125, 4426.

非特許文献 15 : C. Lii,し Stobinski, P. Tomasik, C. Liao, Carbohydr. Polym. , 2003, 51 , 93.

[0017] しかし、これらの被覆剤とカーボンナノチューブとの相互作用は、カーボンナノチューブの可溶化のみに研究の重点が置かれ、被覆現象を利用してカーボンナノチューブ表面に分子認識能や電子機能を有する機能性基を集積させる試みは全くなされていない。

[0018] 近年本発明者らは天然の j3—1 ,3—グノレカンであるシゾフィランやカードランがらせん状にカーボンナノチューブを被覆する興味ある現象を発見した。シゾフィラン力ァミロースなどの他の天然多糖と比べ、より多くのカーボンナノチューブを長時間水溶媒へ分散できることもわかっており、我々はこのシゾフィラン等の β -1，3-グルカン類を用いた可溶化方法を新規カーボンナノチューブ可溶化法として特許出願した。無毒の天然多糖でカーボンナノチューブを被覆することでカーボンナノチューブ（特に単層カーボンナノチューブ）の生体内利用への応用が期待できる。

非特許文献 16 : M. Numata, M. Asai, K. Kaneko, T. Hasegawa, N. Fujita'Y. Kitada, K. Sakurai, S. Shinkai, Chem.Lett. 2004, 33,232.

特許文献 1：特願 2003 - 339569

[0019] -1,3-グルカンであるシゾフィランとカーボンナノチューブとの複合体が、 α -1,4- グルカンであるアミロースをもちいた系に比べ非常に安定であるという点、および、ァミロースが体内のグノレカナーゼ類に容易に加水分解されることと比べ、人体がシゾフイランを含む β -1,3-グノレカン類を加水分解するための酵素、すなわち β -1,3-ダルカナーゼ類を持たない点において、このシゾフィランを用いた被覆法は生体内および生物化学の分野での利用に適した可溶化系である。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0020] 本発明の目的は、カーボンナノチューブが本来有している特性を損うことなぐ例えば、特定のタンパク質や細胞と選択的に相互作用するなどの機能を呈することのできる、カーボンナノチューブ由来の新しい有用材料を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0021] 本発明は、多糖の側部に細胞またはタンパク質を認識する糖の残基を導入し、この修飾多糖でカーボンナノチューブを被覆 (包接)することに基づくものである。

力べして、本発明に従えば、単糖またはオリゴ糖の残基が主鎖の側部に導入された修飾多糖とカーボンナノチューブとから構成されることを特徴とする複合体が提供される。

図面の簡単な説明

[0022] [図 1]本発明で用いられる修飾多糖の合成スキームを例示する。

[図 2]本発明で用いられる修飾多糖の別の合成スキームを例示する。 [図 3]ラタトース修飾シゾフィランの UVスペクトル（実線、実施例 6)およびフエノール硫酸法による発色処理後の UVスペクトル (破線、実施例 6)を示す。

[図 4]単層カーボンナノチューブの原子間力顕微鏡写真 (実施例 8)を示す。

[図 5]ラタトース修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体の原子間力顕微鏡写真 (実施例 8)を示す。

[図 6]表面プラズモン共鳴に基づいた（1)単層カーボンナノチューブ、（2)シゾフィラン /単層カーボンナノチューブ複合体、（3)ラタトース修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体のレクチン固定化金基盤表面に対する結合挙動（実施例 9)を示す。

[図 7]表面プラズモン共鳴の基づいたマンノース修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体のレクチン固定化金基盤表面に対する結合挙動（実施例 9)を示す。

[図 8]RCA レクチンとインキュベーションした後の、ラタトース修飾シゾフィラン/単層

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カーボンナノチューブ複合体の原子間力顕微鏡写真 (実施例 10)を示す。

[図 9]PNAレクチンとインキュベーションした後の、ラタトース修飾シゾフィラン/単層力一ボンナノチューブ複合体の原子間力顕微鏡写真 (実施例 10)を示す。

[図 10]ConAレクチンとインキュベーションした後の、ラタトース修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体の原子間力顕微鏡写真 (実施例 10)を示す。

[図 11]WGAレクチンとインキュベーションした後の、ラタトース修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体の原子間力顕微鏡写真 (実施例 10)を示す。

[図 12]FITC_RCA レクチンとインキュベーションした後の、ラタトース修飾シゾフィラ

120

ン /単層カーボンナノチューブ複合体の原子間力顕微鏡写真：（左上)蛍光像、（右上)透過光像および (左下）両者の重ね合わせ図（実施例 11)を示す。

[図 13]FITC-ConAレクチンとインキュベーションした後の、マンノース修飾シゾフィラン /単層カーボンナノチューブ複合体の原子間力顕微鏡写真：（左上)蛍光像、（右上)透過光像および (左下）両者の重ね合わせ図（実施例 11)を示す。

[図 14]本発明に従う複合体の熱質量分析の結果を示す。

発明を実施するための最良の形態

本発明の複合体を構成する修飾多糖とは、主鎖の側部に外部から単糖またはオリゴ糖の残基が導入された多糖を意味する。

出発物質となる多糖としては、その主鎖の側部に単糖またはオリゴ糖を導入することができ、且つ、カーボンナノチューブと複合体を形成し得るものであれば、基本的にはいずれの多糖も適用可能であり、例えば、 /3 _ 1，3—キシランやひ一 1，4—グノレカン (例えばアミロース）などが使用できる力特に好ましい多糖は j3—1,3—グノレカンである。

[0024] β _ 1,3—グルカンは、カーボンナノチューブと、特に安定で溶解性の良好な複合体を形成する。また、 β—1,3—グノレカンの一つであるシゾフィランは筋肉内注射薬として 20年以上の使用実績があり安全性が確認されている。

[0025] β—1,3—グルカンは、よく知られているように、多糖の主鎖が β 1→3ダルコシド結合に結合された多糖である。側鎖にグルコース (残基）を有しないカードラン、少量のグルコースを有するパーキマンなどの — 1,3—グルカンも知られており、これらも本発明に使用できるが、好ましいのは、側鎖に適当な数のグルコースを有するシゾフィラン、レンチナンまたはスクレログルカンであり、特に好ましいのはシゾフィランである。これらは、後述するように、主鎖の側部に外部から単糖またはオリゴ糖を容易に導入することができる点において有利である。 β—1,3—グノレカンの分子量に関しては、ある程度の長さは必要である力 2000程度以上あれば充分使用可能である。

[0026] よく知られているように、カーボンナノチューブには、単層カーボンナノチューブと多層カーボンナノチューブがあり、本発明の原理は、それらのカーボンナノチューブの混合物を含むいずれのタイプのカーボンナノチューブにも適用可能であるが、実用的な意義から、本発明の方法は、単層カーボンナノチューブ（本明細書では SWNT sと略称していることがある）に好ましく適用される。以下の説明も主として SWNTsに本発明を適用する場合に沿って行なっている。

[0027] 本発明において上述したように j3 _ 1, 3—ダルカンに代表される多糖の主鎖の側部に導入される単糖またはオリゴ糖とは、細胞を認識する糖として、前述した文献等に記載されている各種の糖であり、好ましい例として、ガラクトース、 N—ァセチルガラタトサミン、マンノース、 N—ァセチルダルコサミン、グルコース、フコース、シアル酸、ラクトース等より選択された単糖および該単糖を含むオリゴ糖が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

[0028] これらの糖は生体に存在する糖類の主要な構成糖であり、生体内において受精や分化、細胞接着や細胞間情報伝達などの様々な分子認識現象に関わっていることが示されている。また、これら構成糖の多くは毒素やウィルスがそのホスト細胞にとりつくときの、細胞表面における認識部位としても知られている。たとえばインフルェンザウィルスはシアル酸を強く認識し、ヒトの気管支細胞などにとりつく。

[0029] 単糖またはオリゴ糖の残基が導入された修飾多糖と、カーボンナノチューブとから構成される本発明の複合体はきわめて簡単な方法で製造することができる。すなわち、如上の修飾多糖 (好ましくは —1,3 グノレカン）を非プロトン性極性溶媒または強アルカリ性溶液に溶解した溶液とカーボンナノチューブの分散水溶液とを混合した後、インキュベートする（但し、強アルカリ性溶液を用いた場合には、一旦、中和した後、インキュベートする）だけで当該複合体が得られる。非プロトン極性溶媒の好ましい例は、ジメチルスルホキシド（DMSO)である力これに限定されるものではない。強アルカリ性溶液の好ましレ、例は、苛性ソーダ水溶液であるが、これに限定されるものではない。また、インキュベーションは、一般に、 50°C前後の温度で 2日間程度実施するのが好ましい。

[0030] β 1,3 グルカンは、天然の状態では 3重螺旋構造をとっていることは知られている。そして、本発明者らは、非プロトン性極性溶媒 (例えば、 DMSO)中や強アルカリ性の溶液 (例えば、苛性ソーダ水溶液）中では、 β—1,3—グノレカンは 1本鎖に解離されるとともに、それを中性の水中に移すと 3重螺旋状態に再び戻り、その際、共存物が存在すると、その共存物への j3—1,3 グノレカンの巻き付き 'ラッピングが起こり当該共存物を /3 _ 1，3—グルカンの疎水空間内に取り込み被覆し得ることを見出している。

非特霄午文献 21 : M. Numata, T. Hasegawa, T. Fujisawa, K. SaKurai, S.Shinkai, Org. Lett. 6(24), 4447-4450(2004)

非特許文献 22 : C丄 i， M. Numata, Ah- Hyun Bae, K. Sakurai, S. Shinkai, J. Am. Chem.Soc, 127, 4548-4549(2005).

非特許文献 23 : M Numata, M. Asai, K.Kaneko, T. Hasegawa, K. Sakurai, S. ShinkaiJ. Am. Chem. Soc, 127(16), 5875-5884(2005)

[0031] 本発明に従う複合体の上記製法は、このような現象に基づくものである。力べして、本発明の修飾多糖/カーボンナノチューブ複合体は、カーボンナノチューブが修飾多糖の内部空間内に取り込まれて該多糖の主鎖と疎水性相互作用を介して結合することにより形成されており、そして、カーボンナノチューブを包接した多糖の外部表面にたんぱく質や細胞を認識し得る単糖やオリゴ糖が存在しているものと理解される。本発明の複合体においては、カーボンナノチューブに直接的な化学修飾は全く行なわれていない。

[0032] 本発明の複合体を構成する修飾多糖を得るために、多糖の主鎖の側部に、所望の単糖またはオリゴ糖を導入するには、既知の種々の反応を利用することができる。図 1 (図 1A〜図 1E)および図 2 (図 2A〜図 2E)には、例として単糖またはオリゴ糖としてラタトースまたはガラクトースを導入する場合の反応スキームが示されてレ、る。なお、多糖の主鎖に対して、導入される単糖またはオリゴ糖の残基が直接結合している場合は、多糖/カーボンナノチューブ複合体のタンパク質や細胞膜の認識能は比較的弱くなる。したがって、単糖またはオリゴ糖の残基と多糖との間には、つなぎとしてのリンカーが存在するように単糖またはオリゴ糖の残基を導入することが好ましい。図中、 Lとして示しているのは、それぞれ、リンカ一となる原子団である。

[0033] 図 1は、多糖として、 β _ 1, 3—グルカンの 1種であるシゾフィランを例に、基体の多糖に元々付いている側鎖のグルコースを利用し、過ヨウ素酸酸化と、その後の還元ァミノ化により、単糖またはオリゴ糖を導入する方法を示す。この方法は、主鎖のダルコシド結合に影響を与えず、比較的簡単に単糖やオリゴ糖を導入することができる点において、修飾多糖を調製するのに特に好ましい。例えば、まず、側鎖のグルコースの少なくとも一部を過ヨウ素酸ナトリウムを用いて酸化し、開環してアルデヒドをつくる（図 1 A、 lb)。それに導入する糖のアミン誘導体（図 1B、 Ic：アミノエチルラタトシド）を反応させ、水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤を用いて還元アミノ化することにより、糖 (ラタトース)含有側鎖を導入できる（実施例 2、図 1Bの!^)。別の方法として、過ヨウ素酸酸化後のシゾフィラン (Ik)に対してまずアンモニア水を用いた還元アミノ化を行なってアミノ基を有するシゾフィランに変換した後、ラタトンを有する糖誘導体（図 1C の Is)と反応させることでアミドをリンカ一として有するシゾフィラン誘導体を得ることができる（図 1Cの_f)。さらに、過ヨウ素酸酸化後のシゾフィラン誘導体とアミノォキシ基を有する糖誘導体（図 1Dの )やヒドラゾン基を有する糖誘導体（図 IEの li)とを反応させることでも糖を側鎖に有するシゾフィラン誘導体 (それぞれ、図 1Dの U、および図 lE( Ik)を得ることもできる。

図 2は、本発明で用いられる修飾多糖を得るための別の方法として、本来的に側鎖を有しない多糖の主鎖のダルコシド結合に直接、単糖またはオリゴ糖の残基を導入する反応スキームを、カードランを例にして示す。この場合は、カードラン（図 2Aの )のブロモ化およびアジド化によって得られるアジド化カードラン（図 2Aの Ik)を水素添加することによって得られるアミノ化カードラン（図 2Aの M)とラタトンを有する糖誘導体（図 2Bの )、またはブモロ基を有する糖誘導体（図 2Cの )と反応させることで糖修飾カードラン（それぞれ、図 2Βの II_f、および図 2Cの通）を得ることができる。またチオールを有する糖誘導体（図 2Dの辺）とブロモカードラン（図 2Aの )を反応させることによって、糖修飾カードラン（図 2Dの ίϋ)を得ることもできる。さらに、チオールを有するカードラン（図 2Eの血)と活性ジスルフイドを有する糖誘導体（図 2Eの Ho)との反応によっても糖修飾カードラン（図 2Εの血)を得ること力 Sできる。

なお、以上のようにして多糖の主鎖の側部に導入される単糖またはオリゴ糖の割合は、多糖の主鎖を構成するグノレコースの数 (総数）に対して、一般に、 2〜10%とするのが好ましい。

実施例 1

3重螺旋構造のシゾフィランを文献記載の定法に従って製造した。すなわち、 ATCし (Amsncan

Type Culture し ollection)力ら入手しに Schizophyllum

commune. Fries (ATCC 44200)を、最小培地を用いて 7日間静置培養した後、細胞成分および不溶残渣を遠心分離して得られた上清を超音波処理して分子量 45万の 3重螺旋シゾフィランを得た。

^特 3午文献 17： Lrregory u. Martin, Michael F. Richardson, uordon し. Gannon andCharles L. McCormick, Am. Chem. Soc.Poly. Prep. 1997, 38, 253.

非特許文献 18 : Kengo Tabata, Wataru Ito, Takemasa Kojima, Shozo Kawabata and

Akira Misaki, Carbohydrate Res. 1981， 89, 121.

実施例 2

[0036] 糖修飾シゾフィランの合成

糖修飾シゾフィランは図 1に示す反応スキームに従って合成した。例としてアミノエチルラタトシドを用いたラタトース修飾シゾフィランの合成法を示している力 S、同様の合成法はすべての糖類（単糖、オリゴ糖）のアミノエチル体に適用することが可能である。以下にラタトース修飾シゾフィランについての具体的な合成法を述べる。まず実施例 1にて調製された分子量 45万のシゾフィラン 234mgを蒸留水 234mlに溶解させた。過ヨウ素酸ナトリウム 23.7mg (側鎖グルコースに対して 0.3当量)を少量の蒸留水に溶解させ、 4°Cにて冷却攪拌しながらゆっくりと加えた。反応溶液を透析膜 (排除限界 : 8000)で透析後、反応溶液にアミノエチルラタトシド 0.64gをカ卩え、 2日間室温で攪拌した。反応溶液をそのまま凍結乾燥させ、得られた白色固体をジメチルスルホキシド 35mlに溶解させた。反応溶液にさらにアミノエチルラタトシド（合成法については Sun らの方法参照） 0.45g、少量の炭酸カリウムを加え、 2日間攪拌した。水素化ホウ素ナトリウムを加え、 2日間攪拌後、反応溶液をエタノール 500mlにて再沈殿操作を行った。生成した沈殿を濾別し、メタノールとアセトンで洗浄を繰り返した。沈殿を蒸留水に懸濁させた後、不溶物を濾別した。溶液を透析膜 (排除限界: 8000)で透析した後、凍結乾燥し、ラタトース修飾シゾフィランを得た。

非特許文献 19： Sun, Xue-Long;Faucher, Keith M. ; Houston, Michelle; Grande, Daniel; Chaikof, Elliot L. J. Am. Chem. Soc. 2002， 124, 7258.

実施例 3

[0037] 糖修飾シゾフィランのキャラクタリゼーシヨン実施例 2にて得られた糖修飾シゾフィランをゲル排除クロマトグラフィー（カラム： TSKgel— a -4000,溶離液： [LiBr] = 20mM/DMF)により分子量を測定したところ、糖修飾シゾフィランのサンプルは、化学修飾前のシゾフィランとほぼ同じ分子量を示し、化学修飾にともなって主鎖切断等がほとんど起こっていないことが認められた。また、各糖修飾シゾフィランの糖の導入率 (n)は元素分析における窒素含有率 (X)から算出され、以下の式に基づき糖導入率（ n)はいずれも 0.14であることが明らかとなった。

なお、シゾフィランにおいて主鎖のグルコース 3個ごとに 1個存在する側鎖のダルコースがどれだけの割合で修飾糖に置換されたかの割合を示す糖の導入率 (n)と窒素含有率 (X)の関係は、実施例 2の場合、次式で表される。式中の N, C, Hおよび〇は窒素、炭素、水素および酸素の原子量を示す。また、 n値は図 1Bの化合物における nに相当する。

X=2XNXn/{(24XC + 40XH + 20XO)(l-n) + (52XC + 92XH + 2XN + 40 XO)n}

この式を nで解レ、た式に整理し、得られた糖修飾シゾフィランのサンプルの元素分析による窒素含有率 (X:質量分率)および原子量の値を代入することによって、糖の導入率 (n)は 0.14(14mol%)であることが計算された。

n=-(24XC + 40XH + 20XO)XX/(28XCXX+52XHXX-2XNXX-2X N + 20XOXX)

= -(24X 12.01+40 X 1.008 + 20 X 16.00) X 0.005218569/(28 X 12.01 X

0.005218569 + 52 X 1.008 X 0.005218569— 2 X 14.01 X 0.005218569— 2 X 14.01 + 20 X 16.00X0.005218569)

= 0.138(ca.0.14)

シゾフィランにおいては、主鎖のグルコース 3個ごとに 1個のグルコース側鎖が存在し、該側鎖の 13.8%にラタトースが導入されたので、多糖の主鎖を構成するグルコースの総数に対するラタトースの導入率は 13.8/3%、すなわち、 4.6%となる。

実施例 4

糖修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ襍合体の調製

使用したカーボンナノチューブは次のように前処理した： Carbon Nanotechnologies Inc. (Texas, USA)製の単層ナノチューブ (SWNTs)lOmgに 50mlの混酸（硝酸：硫酸 =1 :3(v/v))を加え、超音波 (50kHz)を 2〜3時間照射した。この液をろ過し、残さに 10mM 水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和後、ろ液が中性になるまで蒸留水で十分に洗浄した。乾燥しきらないうちに残さを回収し、 10mlの蒸留水に分散させた。この分散液を、 20°Cで 1時間、遠心分離（13900回転 Z分)し、上澄み液を除いた。沈殿物に蒸留水 10mlを加え再び遠心分離操作を行った。得られたナノチューブを、さらに水 10mlに分散させ、今度は 2780回転 Z分で 10分間、遠心操作にかけて、分散しないナノチューブを沈殿物として取り除いた。その上層液をカーボンナノチューブの分散液として次の実験に用いた。なお、分散液中のナノチューブは、 UV/visスペクトルにより約 O.lmg/mlの濃度であること、また、顕微鏡観察により l _3 z mの長さであることが認められた。

以上のように前処理した単層カーボンナノチューブ分散水溶液（0.1mg/ml、 250 μ 1 )を糖修飾シゾフィランのジメチルスルホキシド溶液（5mg/ml、 50 μ 1)と混合し、そのまま 50°Cにて 2日間インキュベートした。この際、糖修飾シゾフィランが単層カーボンナノチューブに対して大過剰であることが重要である。二日後、糖修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体を遠心分離（7000r.p.m.、 60min)によって黒色沈殿として回収し、上澄みに含まれる余剰の糖修飾シゾフィランを取り除いた。同様の操作を三回繰り返し、糖修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体を精製した。実施例 5

[0039] UV-visスペクトルによる糖修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体形成の確認

実施例 4の遠心分離により得られた黒色沈殿を脱イオン水（3500ml)に溶解させ、 UV-visスペクトルを測定した。測定波長全域（700_200nm)でカーボンナノチューブに由来する散乱光が観察されると共に、短波長領域 (280nm)にカーボンナノチューブの芳香環に由来する吸収帯が確認でき、えられた黒色沈殿中にカーボンナノチューブが含まれていることが明らかとなった。実際に得られたスペクトルとして、ラタトース修飾シゾフィラン/カーボンナノチューブ複合体について図 3中に実線として示す。実施例 6

[0040] フエノール硫酸法による糖修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体形成の確認

実施例 4の遠心分離により得られた黒色沈殿を脱イオン水（500 u 1)に分散させた。

5%フエノール水溶液（500 μ 1)および濃硫酸（2500 μ 1)を順次加えたのち、室温にて 20分以上静置し、糖鎖部分を発色させた。得られた溶液の UVスペクトルを測定したところ、 490nm付近に特徴的な鋭い吸収帯が確認された。この 490nmの吸収帯は糖成分がフエノール硫酸法によって発色した際に観察される特徴的な吸収帯であることから、得られた黒色沈殿中に糖鎖由来の成分が含まれていることが明らかとなった。実施例 5の結果と併せて考えると、黒色沈殿が糖鎖とカーボンナノチューブ両者から構成されていることがわかった。実際に得られたスペクトルとして、ラタトース修飾シゾフイラン/カーボンナノチューブ複合体について図 3中に破線として示す。

非特許文献 20 : Hodge, J. E. andHofreiter, B. T.， Method in Carbohydrate

Chemistry, 1， 338 (1962)

実施例 7

[0041] 熱誓最分析による複合体形成の確認

実施例 4の遠心分離により得られた黒色沈殿を熱質量分析により分析したところ、糖鎖成分に由来した質量減少とカーボンナノチューブ成分に由来した質量減少がともに確認でき、得られた黒色沈殿が糖鎖とカーボンナノチューブ両者から構成されてレ、ることが再度確認できた。

DTAZTG分析の結果を図 14に示す。昇温速度は 5°CZ分とした。 1段目の減量（ 273°C付近）が修飾シゾフィランの分解に由来し、 2段目の減量 (371°C付近から始まる緩和な減少）がカーボンナノチューブの分解に由来するものである。

実施例 8

[0042] 原子間力顕微鏡による複合体形成の確認

実施例 4の遠心分離により得られた黒色沈殿の水溶液を石英基盤にキャストし、原子間力顕微鏡による直接観察をおこなった。まず、遊離のカーボンナノチューブを観察したところその表面は非常に平滑であり、特徴的な構造体は何一つ観察できなかつた（図 4)。その一方でラタトース修飾シゾフィラン/カーボンナノチューブ複合体を観察したところ、カーボンナノチューブ表面にカーボンナノチューブの長軸に対して横向きに走る特徴的な筋状模様が観察された（図 5)。なお、図 5については、理解を容易にするため、顕微鏡写真の像を手でなぞった図を併せて示している。この筋状模様は未修飾のシゾフィランを用いたカーボンナノチューブ可溶化系でも観察されており（特許文献 1 )、カーボンナノチューブをシゾフィラン誘導体がらせん状にラッピングしてレ、ることを示す結果である。同様の筋状模様はマンノース修飾シゾフィランを用いたカーボンナノチューブ被覆の際にも確認できた。

実施例 9

[0043] 表面プラズモン共鳴法による糖修飾シゾフィラン/カーボンナノチューブ-レクチン間のネ目互ィ乍 ¼

糖修飾シゾフィラン/カーボンナノチューブとレクチン類との相互作用を、レクチン修飾金基盤を用いた表面プラズモン共鳴法（SPR)により評価した。市販の SPR用チップ (Sensor

Chip SA、 BIACORE)を BIACORE biosensorにセットし、トリス塩酸緩衝液（lmM、 PH7.2)をもちいて数分間洗浄した。このセンサーチップ表面にはカルボキシメチルデキストランを介してアビジンが固定化されている。流路にビォチンでラベルした各種レクチンのトリス塩酸緩衝溶液を流し、これらのレクチンを強固なアビジン-ピオチン相互作用を介してセンサーチップ表面に固定化した。これらのレクチン修飾金基盤を用レ、て、後述の結合試験をおこなった。今回、レクチンとして RCA ( β -ガラタトシド選

120

択的）、 WGA ( β -Ν -ァセチルダルコサミニド選択的）、 ConA ( α -マンノシド、 a -グルコシド選択的）、 LCA ( a -マンノシド、 a -ダルコシド選択的）、 DBA (N-ァセチルガラタトサミニド選択的）、 PHA-E4 (N-ァセチルガラタトサミニド選択的）、 UAE-I ( a -フコシド選択的）の 7種を用いた。

[0044] まず遊離のカーボンナノチューブ（SWNT)をトリス塩酸緩衝液に懸濁させて流路に流した場合（図 6 ( 1 ) )、用いたすべてのレクチン修飾金基盤に対して非特異的に単層カーボンナノチューブの結合が見られた。結合した単層カーボンナノチューブのレクチン固定化金基盤表面からの脱離実験を行ったところ、酸性'塩基性緩衝液や、塩酸グァニジン含有緩衝液を流しても単層カーボンナノチューブの脱離は観察できなかった。し力界面活性剤を含む緩衝液を流した場合に限って単層カーボンナノチューブの脱離が確認され、このレクチンへの非特異結合が疎水性相互作用によるものであることが確認できた。単層カーボンナノチューブは非常に疎水性が高ぐレクチンの疎水性部位と相互作用したものと結論づけられる。 [0045] 次に、シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体（SPG/SWNT)の場合（図 6 (2

) )、すべてのレクチンに対しほとんど結合は確認されな力つた。シゾフィランによるポリマーラッピングにより単層カーボンナノチューブの疎水性表面が被覆され、疎水性相互作用による非特異吸着が完全にブロックされたものと考えることができる。このようなタンパク質の非特異吸着の抑制は、今後単層カーボンナノチューブの生体内利用を図る上で非常に重要である。

[0046] 最後に、ラタトース修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体（

SPG-Lac/SWNT)の場合（図 6 (3) )、 RCA 修飾金基盤に対してのみ強固な結合が

120

確認され、そのほかのレクチンには全く結合しなかった。 RCA はラタトース残基と選

120

択的に相互作用するレクチンであることからラタトース修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブは複合体内のラタトース残基と RCA との間の特異的な相互作用により

120

、金基盤表面に結合することが明らかとなった。つまりラタトース修飾シゾフィランでポリマーラッピングすることで、本来レクチン認識能をもたない単層カーボンナノチューブに、特定レクチンのみと選択的に結合する能力を付与できたと結論づけられる。同様にマンノース修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体の場合、特異的レクチンである ConAのみと選択的に相互作用し、 RCA とは相互作用しな力た（図

120

7)。

[0047] 以上の結果から、糖修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体を用いることによって、その糖鎖を認識するレクチンがカーボンナノチューブ複合体に選択的に結合することが示された。近年カーボンナノチューブをセンサー素子に用いようとする試みが盛んになされており、たとえばカーボンナノチューブで電極間を架橋したセンサー素子は、カーボンナノチューブの電気抵抗値がカーボンナノチューブへの物質吸着 (NOなど）によって大きく変化することが報告されてレ、る（非特許文献 5)。今回得られたカーボンナノチューブ複合体の特異的なタンパク質認識能を利用すれば、糖認識性のタンパク質やウィルス、毒素などを特異的に検出するセンサーの構築が期待できる。

実施例 10

[0048] 原子間力顕微鏡を用いたラクトース修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ襍合体とレクチンとの相互作用の直接観察

糖修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体とレクチンとの相互作用の様子を、原子間力顕微鏡 (AFM)を用いて直接観察した。 Tris-HCl緩衝液中（lmM、 pH7.2、 [CaCl ]

2

and [MnCl ]=10 μ M)、糖修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体を様々

2

なレクチンとインキュベーション（室温、 15min)させた。遠心分離（7000r.p.m.、 2times) により結合していないレクチンを除去し、糖修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体のみを回収した。以下にラタトース修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチユーブ複合体にっレ、て具体例を示す。回収したラタトース修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体を原子間力顕微鏡 (AFM)によって観察したところ、 RCA

120 や PNAといったラタトース認識レクチンを用いたときのみ、ラタトース修飾シゾフィラン/ 単層カーボンナノチューブ複合体表面に小さな球状物体が密集している様子が観察された（図 8および 9)。これらラタトース認識レクチン力 Sラタトース修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体表面のラタトース残基を認識して複合体表面に高密度に結合した結果、本来ラタトース修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体が有していた縞状模様が隠されたと考えるのが妥当である。ラタトース認識性ではない ConAや WGAを用いたときではこのようなタンパク質の密集は確認できず（図 10 および 11)、 RCA や PNAで見られたレクチンの結合力確かに選択的な糖鎖 -レク

120

チン相互作用に基づいていることが確認できた。なお、図 10および図 11については

、理解を容易にするため顕微鏡写真の像を手でなぞった図を併せて示している。実施例 11

共焦点レーザー顕微鑌を用いた糖修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体泶光ラベル化レクチンの相互作用の直接観,

共焦点レーザー顕微鏡観察によっても、糖修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体の特異的なレクチン認識能を確認することができた。前述の AFM用サンプル作成と同条件でフルォレセインイソチオシァネート（FITC)標識レクチン類と相互作用させ、遠心分離により糖修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体のみを回収した。以下にラタトース修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体について具体例を示す。共焦点レーザー顕微鏡をもちいてえられたラタトース修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体を観察した結果、レクチンとして

FITC-RCA120を用いたとき、透過光像（図 12右上）で確認できたラタトース修飾シゾフイラン/単層カーボンナノチューブ複合体と蛍光像（図 12左上）で確認できた

FITC-RCA120の存在位置が両者の重ね合わせ図（図 12左下）で完全に重なり、ラタトース修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体と FITC-RCA120が結合していることが示された。 FITC-ConAを用いたときでは蛍光像自体がほとんど観察されず、 SPG-Lac/SWNTs複合体とも全く重ならなかった。マンノース修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体を用いたときは透過光像で確認できたマンノース修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体と蛍光像で確認できた FITC-ConA の存在位置が完全に重なり、マンノース修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体と FITC-ConAが選択的に相互作用していることが示された（図 13)。

実施例 12

共焦点レーザー顕微鏡を用いたローダミン修飾シゾフィラン/糖修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ三元複合体とレクチン修飾ァガロースゲルビーズとの相互作用の直接観察

糖修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ複合体が細胞表面に存在するタンパク質との相互作用によって細胞を認識するか否かを、レクチン修飾ァガロースゲルビーズを用いて評価した。レクチン修飾ァガロースゲルビーズは細胞と同様のサイズを持ち特定の糖認識タンパク質をその表面に有することから、近年細胞ミミックとして分子認識アツセィに多用されている人工細胞である。本アツセィにおいてはローダミン修飾シゾフィラン/糖修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ三元複合体を用レ、てアツセィを行った。本複合体は糖修飾シゾフィランに基づくレクチン認識能とローダミン修飾シゾフィランに基づく蛍光を有するカーボンナノチューブ複合体である。

RCA120レクチン修飾ァガロースゲルビーズと三元複合体をトリス緩衝液中で相互作用させ、その後 RCA120レクチン修飾ァガロースゲルビーズを繰り返しトリス緩衝液中で洗浄した。共焦点レーザー顕微鏡観察によって、 RCA120レクチン修飾ァガロースゲルビーズ表面に粒子状の蛍光体が確認でき、三元複合体が RCA120レクチン修飾ァガロースゲルビーズ表面に結合することが示された。 ConA修飾ァガロースゲルビーズを用いた同様の実験ではゲルビーズ表面に蛍光体は確認できず、三元複合体が特異的な糖-レクチン相互作用によってゲル表面に結合することが分かった。これの人工細胞を用いたアツセィにより、糖修飾シゾフィラン/単層カーボンナノチューブ三元複合体が細胞表面の糖認識タンパク質と特異的に相互作用することによって特定細胞を認識する可能性が強く示唆された。

産業上の利用可能性

本発明によれば、カーボンナノチューブの特性を損なうことなぐ多糖とカーボンナノチューブとから構成される多糖/カーボンナノチューブ複合体が得られる。本発明の複合体は、多糖に基づく生体適合性を有するとともに特定のタンパク質や細胞との選択的な結合能を有するものとして、例えば、レクチンのようなタンパク質や毒素（ 0157産出毒素であるべ口トキシンやコレラ菌の産出するコレラトキシンなど）やインフルェンザウィルスなどを検出するセンサー素子への利用などが期待される。

Claims

請求の範囲

[1] 単糖またはオリゴ糖の残基が主鎖の側部に導入された修飾多糖と、カーボンナノチユーブとから構成されることを特徴とする複合体。

[2] 多糖が β -1,3-グルカンであることを特徴とする請求項 1に記載の複合体。

[3] -1,3-グルカンがシゾフィラン、レンチナンまたはスクレログルカン力選ばれたものであることを特徴とする請求項 2記載の複合体。

[4] カーボンナノチューブが単層カーボンナノチューブであることを特徴とする請求項 1 〜3のいずれかに記載の複合体。

[5] 単糖またはオリゴ糖が、ガラクトース、 Ν-ァセチルガラタトサミン、 Ν -ァセチルダルコサミン、マンノ-ス、グルコース、フコース、シアル酸およびラタトースより選ばれたものであることを特徴とする、請求項 1〜4のいずれかに記載の複合体。

[6] 細胞またはタンパク質を認識するセンサー素子として使用されることを特徴とする請求項 1〜5のいずれかに記載の複合体。

[7] タンパク質がレクチンであることを特徴とする請求項 6に記載の複合体。

[8] 単糖またはオリゴ糖の残基が主鎖の側部に導入された修飾多糖と、カーボンナノチユーブとから構成される複合体を製造する方法であって、非プロトン性極性溶媒または強アルカリ性溶液に溶解した修飾多糖とカーボンナノチューブの分散水溶液とを混合した後、インキュベートする工程を含むことを特徴とする方法。