JP2000501414A

JP2000501414A - 生体分子の細胞取り込みを高めるリガンド

Info

Publication number: JP2000501414A
Application number: JP9521121A
Authority: JP
Inventors: ツオ、ポール・オー・ピー; ハンゲランド、ジョン・ジェイ; リー、ユアン・シー
Original assignee: ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー
Priority date: 1995-11-22
Filing date: 1996-11-22
Publication date: 2000-02-08
Also published as: EP0862439A4; EP0862439A1; CN1120707C; CN1211923A; TW520293B; AU1039397A; CA2238379A1; WO1997020563A1; US5994517A

Abstract

(57)【要約】生物学的に安定な非イオン性オリゴデオキシヌクレオシド類縁体を組織特異的に細胞にデリバリーするための、メチルホスホン酸オリゴデオキシヌクレオシド・ネオグリコペプチド複合体および関連化合物。

Description

【発明の詳細な説明】生体分子の細胞取り込みを高めるリガンド〔発明の背景〕１．発明の分野本発明は、生分解に抵抗する均一なのオリゴヌクレオシド複合体を、リガンド指向性経路、レセプター媒介性経路、エンドサイトーシス経路を介した組織特異的な方法で細胞に導入するためのデリバリーシステムに関する。２．背景情報ドラッグデザインのためのアンチセンス（アンチコード）またはアンチ遺伝子戦略は、合成オリゴデオキシヌクレオチド（オリゴｄＮ）およびその類縁体による、標的ｍＲＮＡまたは標的ゲノムＤＮＡへの結合およびそのマスキングに起因したタンパク合成の配列特異的阻害に基づいている(１)。この戦略における意味は、オリゴ−ｄＮｓが、細胞膜を通過することによりそれらの標的を含む細胞コンパートメントにアクセスする能力があり、またこれら標的に結合するための十分な量でアクセスする能力を有するということである。アンチセンスとして適用するための多くのオリゴ−ｄＮ類縁体の中で、非イオン性のメチルホスホン酸オリゴヌクレオシド類（オリゴ−ＭＰｓ）が広範に研究されている(２)。オリゴ −ＭＰｓは、全体的にヌクレアーゼ分解に対して抵抗性であり(３)、１型単純ヘルペスウイルス(４)、水疱性口内炎ウイルス（５）およびヒト免疫不全ウイルス（６）に対するインビトロ活性が証明され、且つras p21の発現を阻害できる有効なアンチセンス剤である。しかし、アンチセンス活性を示すオリゴ−ＭＰｓの場合、これらは 100μＭ以下の濃度で細胞外媒質中に存在しなければならない( ４−７)。治療目的のためにこれらの濃度を達成し且つ維持することは、費用、オリゴＭＰの非特異的結合によって起こり得る副作用および免疫原性を含む多くの困難を伴う。これらの困難は、下記の二つの方法によって回避することができる。 (１) 標的細胞株の膜を通過するオリゴ−ＭＰの輸送を高めることにより、オリゴ−ＭＰの局部的な高濃度を達成すること。 (２) 標的細胞株のみに特異的にデリバリーすることによって、他の組織に対する有害な副作用を回避する。上記戦略は両者共に、アンチセンス効果を生じるために必要なオリゴ−ＭＰの濃度を大きく低減するように働き、また組織特異性をもって有害な副作用を回避するように作用する。外因性ＤＮＡの細胞内媒質中へのデリバリーは、その取り込みをレセプター媒介性のエンドサイトーシスにカップリングさせることよって大きく向上する。ウー(Ｗu)およびウーによるパイオニア的な研究によって、アシアロオロソムコイドに結合したポリ−Ｌ−リジンに静電気的に複合体化された、外来遺伝子（８ａ）またはオリゴ−ｄＢｓ（８ｄ）は、アシアロ糖タンパク受容体との直接的相互作用を介して、ヒト肝細胞カルチノーマ（Ｈep Ｇ2）細胞に取り込まれることが示された。この初期の研究以来、テトラ−アンテナ状ガラクトースネオグリコペプチド・ポリ−Ｌ−リジン複合体(９)、トリガラクトシル化ビスアクリジン複合体(１０)、葉酸複合体(１１)、抗体複合体(１２)、トランスフェリン複合体(１３)、およびジスルフィド結合を介してアンチセンスオリゴ−ｄＮｓに結合された６−ホスホマンノシル化タンパク（１４）を含む、ＤＮＡの受容体媒介性デリバリーの他の例が明らかになってきた。最近になって、トリ−アンテナ状Ｎ−アセチルガラクトサミンネオグリコペプチド、ヒト血清アルブミン（これはポリ− Ｌ−リジンに結合される）に結合したＹＥＥ（ah-ＧalＮＡＣ）₃はＤＮＡを効果的にＨep Ｇ2細胞の中にデリバーすることが示された。改善されてはいるものの、これらのデリバリー方は幾つかの欠点を有している：（１）出発物質（例えばポリ−Ｌ−リジンまたはウシ血清アルブミンが最も多い）の構造的不均一性および使用する合成戦略のために、これらの出発材料から誘導される糖複合体は機能的に均等であるが、構造的には不均一であり、従って、それらの物理的および生物学的特性は完全に定義することが困難である；（２）ポリカチオン性化合物（例えばポリ−Ｌ−リジンまたはウシ血清アルブミン）は、ＤＮＡおよびオリゴ− ｄＮｓのデリバリーに用いられるインビトロ濃度およびおそらくはインビボの濃度において有毒である；（３）カチオン性複合体に対するオリゴ−ｄＮまたはＤＮＡの比率は、夫々の場合に実験的に決定しなければならない。オリゴｄＮのデリバリーのための多くの合成物が報告されているが、これらは複合体の不均一な混合物である。ボンフィルズ等(Ｂonfils et al.)は、例えば、６−ホスホマンノシル化タンパクとオリゴヌクレオシドとの間の複合体の形成を記載しているが、この方法ではタンパクの修飾およびジスルフィド結合の形成が位置化学的に制御されないので、機能的には関連しているが構造的には異なった分子を生じる。幾つかの研究によって、生分解性のヌクレオチド間ホスホジエステル結合を含む、オリゴデオキシヌクレオチドまたはＤＮＡの細胞内デリバリーが報告されている。このため、それらは細胞内において比較的短い半減期を有し、結果的に効果は低減されるであろう。例えば、ホスホジエステル１６量体、即ち、ｄ（Ｔ）₁₆ は、細胞内において僅か２時間後に徹底的に分解されるであろう。オリゴｄＮｓおよびＤＮＡのこの欠点は、アンチセンスの世界ではよく知られている。本発明は、ここに説明するデリバリー戦略を用いて、生物学的に安定なオリゴＭＰｓ、他のオリゴデオキシ核酸類縁体（表１参照）および他の生物学的に安定なプロドラッグのデリバリーを可能にする。アンチセンス剤の濃度の更なる低下は、その生物学的安定性の結果として理解することができる。メルウイン等(Ｍerwin et al.)は、複合体を、ネオグリコペプチドであるＹＥＥ(al-ＧalＮＡc)₃を用いて合成することを記載している。それらのデリバリー系は不均一であり、ポリ−Ｌ−リジンを含み、ＤＮＡを静電気的に複合体に結合させるように働く。このデリバリー戦略の欠点は、その構造が不均一であること；そのポリカチオン性電荷に起因した毒性を有する可能性があること；および最適なデリバリーのためのオリゴ−ｄＮまたはＤＮＡに対するカチオン性キャリアの比率を経験的に決定する必要があるため、形成が困難なことである。本発明のデリバリー戦略は、化学的に定義され、構造的に均一で、且つ生物学的に安定なアンチセンス剤および他の生物学的に安定なプロドラッグをデリバリーすることを目的とするから、これらの困難をすべて排除するものである。従って、オリゴｄＮおよびオリゴｄＮ類縁体をその細胞内標的に向けてデリバリーするためにこれまで入手可能な複合体は、不均一性および／または迅速な生分解という欠点を有しており、その結果として、最も有効な化合物が、無効および／または有害な可能性のある異質の化合物と共に、希薄溶液の形で標的に対してデリバーされている。〔発明の概要〕本発明の目的は、非生分解性のヌクレオチド間メチルホスホン酸結合を含む、均一なメチルホスホン酸オリゴデオキシヌクレオシド複合体を提供することである。これは、生物学的に安定な非イオン性オリゴデオキシヌクレオシド類縁体の細胞内へのデリバリーを可能にする。本発明の更なる目的は、全ての２´−Ｏ−メチルリボースヌクレオシド類およびホスホン酸メチルとホスホジエステルとの間で交互に代わるヌクレオチド間結合を含む、オリゴデオキシヌクレオシドキメラ類または他の何れかの生物学的に安定なオリゴマー類の複合体を合成する方法を提供することである。このような生物学的に安定なオリゴマーには、全ての２´−デオキシリボースヌクレオシド類、およびチオ燐酸とホスホン酸メチルとの間で交互に代わるヌクレオチド間結合；全ての２´−デオキシリボースヌクレオシド類およびヌクレオチド間チオ燐酸結合；全ての２´−Ｏ−メチルリボースおよびヌクレオチド間チオ燐酸結合を含むオリゴデオキシヌクレオチド類縁体が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の更なる目的は、生物学的に非分解性の（または加水分解酵素に対して抵抗性の）複合体であって、細胞膜を効率的に通過して、原形質にアクセスすることができるオリゴｄＮおよび／またはオリゴｄＮ類縁体を有する複合体を提供することである。ここで用いる「効率的に」の用語は、例えば、当該複合体が細胞外媒質中に存在するときには、37℃で24時間インキュベーションすると、細胞内濃度が細胞外濃度の少なくとも略３倍、好ましくは略10倍になることを意味するものである。本発明の更なる目的は、構造的に定義され且つ化学的に均一な「デリバリーアセンブリー」であって、組織タイプ／細胞タイプに特異的な、リガンド指向性、レセプター媒介性のエンドサイトーシス性デリバリーのためのリガンド／リンカー／プロドラッグからなる、標的細胞／組織において生分解しない薬物のためのデリバリーアセンブリーを提供することである。リガンドとプロドラッグとの間の結合は共有結合性であり、リガンドおよびプロドラッグとの間に共有結合を形成できる架橋剤によって形成される。リガンドおよびプロドラッグに存在する種々の官能基と反応して、多くの化学的に異なった結合を形成できる広範な架橋剤が入手可能である。例えば、リガンドであるＹＥＥ(al-ＧalＮＡc)₃（図１参照）は、そのアミノ末端に有利のアミノ基を含んでいる。それはヘテロ２官能性の架橋剤であるＳＭＣＣ（エントリー３；表４）と位置特異的に反応して、アミド結合を形成するであろう。プロドラッグは、遊離のスルフヒドリル基を含むように化学修飾すれば(例えば表２のエントリー9-14を参照のこと)、ＳＭＣＣと化学的に結合してチオエーテル結合を形成する。この例において、リガンドとプロドラッグとの間に形成された結合は、アミド／チオエーテルとして要約できるであろう。全ての可能な組み合わせによりリガンド、架橋剤およびプロドラッグを組み合わせることによって（表１〜４および図１に示した）、数百の構造を形成できることは明らかである。従って、他の結合には、アミド／アミド、チオエーテル／アミド、ジスルフィド／アミド、アミド／チオエーテル、アミド／ジスルフィドが含まれるが、これに限定されるものではない。この結合は更に、生物学的に安定なもの（チオエーテル、アミン）、生物学的に幾分安定なもの（アミド）および生物学的に不安定なもの（ジスルフィド）に分類することができる。従って、このデリバリーシステムは、細胞外および細胞内の媒質中で遭遇する種々の化学的環境で機能するように、構造的に修飾することができる。このデリバリーシステムのためのリガンドには、図１に示すものが含まれるが、これに限定されるものではない。ここで用いる「付着基」の用語は、これらのリガンド類を意味する。リガンド類は、合成の、化学的に定義された、構造的に均一なオリゴペプチド基部(scaffold)であり、これは多くの糖残基（グルコース；Ｎ−アセチルグルコサミン；ガラクトース；Ｎ−アセチルガラクトサミン；マンノース；および不コースが含まれるが、これらに限定されない）の何れかでグリコシル化される。ここで用いる「ネオグリコペプチド」の用語は、これらの構造および同様の構造を言う。加えて、これらのオリゴペプチドは、葉酸と共に多価リガンドを構築するためのフレームワークを提供する。ここで用いる「プロドラッグ」の用語は、特定の化学結合の加水分解または生体内還元に際し、当該複合体から放出されて活性になるか、または複合体一部に含まれているときよりも活性になる化合物を言う。ここで用いる「化学的に均一な」の用語は、当該デリバリーアセンブリーの少なくとも95％、最も好ましくは99％が、組成および結合性の両方において単一種であることを意味する。化学的均一性の決定は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、逆相高速液体クロマトグラフィー、核磁気共鳴、質量スペクトルおよび化学分析によって行われる。「化学的に定義され、且つ構造的に均一な」の語句は、「化学的に均一な」の語句と互換的に用いられる。ここで用いられる「遺伝子特異的」の用語は、プロドラッグが、当該複合体によってターゲッティングされる組織タイプまたは細胞タイプに存在する遺伝子の一部またはｍＲＮＡの一部に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオシド（特にメチルホスホン酸オリゴヌクレオチドまたはその類縁体）であることを意味する。遺伝子特異的なプロドラッグと標的ｍＲＮＡとの間の配列特異的な二本鎖の形成によって、該ｍＲＮＡの発現の抑制が導かれるであろう。〔図面の簡単な説明〕図１：化学的に均一な複合体のための付着基。ｎの値は0〜10（0および10 を含む）である。図２：ネオグリコペプチドであるＹＥＥ(al-ＧalＮＡc)₃（５）およびオリゴ-ＭＰＵ^mpＴ ₇（６）および５´−エチレンジアミンキャップされたオリゴ-ＭＰＵ^mpＴ ₇（１１）の構造。図３：［ＹＥＥ(al-ＧalＮＡc)₃］-ＳＭＣＣ-ＡＥＴ-pＵmpＴ ₇（１０）の合成のための反応スキーム。図４：複合体１０の合成における中間体のＰＡＧＥ分析(15％ポリアクリルアミド、４Ｖ/cm、２ｈ)。レーン１、[5'−³²Ｐ]でラベルされた６（バンドＡ）: レーン２、[5'−³²Ｐ]−シスタミン付加物および対応するチミジン−ＥＤＴＡ付加物（バンドＣ）: レーン３、[5'−³²Ｐ]−チオール５（バンドＤ）および対応するチミジン−ＥＤＴＡ付加物（バンドＥ）: レーン４、[5'−³²Ｐ] −複合体１０（バンドＦ）および対応するチミジン−ＥＤＴＡ付加物（バンドＧ）図５：１μＭの複合体１０およびオリゴ−ＭＰ１１の、単独（白丸、白三角）および100当量の遊離の５の存在下（黒丸および黒三角）における、Ｈep Ｇ細胞による取り込みの経時変化。実験の部に記載したようにして、細胞を37℃で０、１および２時間インキュベートし、サンプルを採取した。夫々のデータ点は、３回の試験の平均±１標準偏差を表している。図６：Ｈep Ｇ2細胞による複合体１０の取り込みの24時間の経時変化である。実験の部に記載したようにして、細胞を37℃でインキュベートし、細胞を採取した。夫々のデータ点は、３回の実施例の平均±１標準偏差である。図７：Ｈep Ｇ2、ＨＬ-60およびＨＴ 1080細胞による、複合体の組織特異的な取り込み。細胞を採取し、夫々の細胞株について、３時間および24時間の時点で[³²Ｐ]の量を決定した。実験を３回行ない、データを平均±標準偏差で表した。図８：複合体１０、およびＮアセチルグルコサミダーゼで複合体１０の末端ＧalＮＡc残基を除去することにより製造される複合体１２の組織分布。パネルＡ：１グラム当たりの初期投与パーセント vs複合体１０注射後の時間。パネルＢ：１グラム当たりの初期投与パーセント vs複合体１２注射後の時間。図９：トレーサー、３´複合体の構造。図１０：５´−チオール修飾剤を用いた自動合成のための反応スキーム。図１１：１ｃの合成のための反応スキーム。図１２Ａ：１０の構造。複合体は、オリゴＭＰ部分の５´−ＯＨに位置する放射性リン酸で合成される。矢印は、¹²Ｐラベルの位置を示している。図１２Ｂ：省略形で記載した１０の構造。構造１２および３〜６はＰＡＧＥ分析によって同定された代謝物の提案構造である。構造１２および３〜６は、１０を夫々Ｎ−アセチルグルコサミン、キモトリプシンまたは0.1 ＨＣlで処理することにより得られる。図１３：Ｈep Ｇ2細胞内での１０の代謝物のオートラジオグラフィー分析。レーン１、１；レーン２、Ｎ−アセチルグルコサミダーゼで処理された１；レーン３、キモトリプシンで処理した１；レーン４〜８、１と共に夫々２、４、８、16および24時間インキュベートした後のＨep Ｇ2細胞抽出物。図１４：マウス肝臓内での１０の代謝物のオートラジオグラフィー分析。レーン１、１；レーン２、Ｎ−アセチルグルコサミダーゼで処理された１；レーン３、キモトリプシンで処理した１；レーン４、0.1 ＨＣlで処理：レーン５〜９、注射後２時間、１時間および15分の肝臓ホモジネート抽出物。なお、レーン５および６は、レーン７および８と同様に複製である。図１５：マウス尿における１０の代謝物のオートラジオグラフ。レーン１、１；レーン２、Ｎ−アセチルグルコサミダーゼで処理された１；レーン３、キモトリプシンで処理された１；レーン４、0.1 ＨＣlで処理：レーン５〜９、注射後２時間、１時間および15分の尿抽出物。なお、レーン５および６は複製である。〔発明の詳細な説明〕＜略語＞便宜のため、以下の略語を使用した：ＡＥＴ、２−アミノメルカプトエタノール（アミノエタンチオール）；ＡＴＰ、アデノシン三リン酸；ＢＡＰ、細菌性アルカリホスファターゼ；ＣＰＧ、制御された細孔性ガラス支持体；ＤＩＰＥＡ、ジイソプロピルエチルアミン；Ｄ−ＭＥＭ、ダルベッコの修飾イーグル培地；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；Ｄ−ＰＢＳ、ダルベッコのリン酸塩緩衝食塩水；ＤＴＴ、ジチオトレイトール；ＥＤＡＣ、１−エチル−３−［３ −（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド；ＥＤＴＡ、エチレンジアミン四酢酸；ＦＣＳ、ウシ胎児血清；ＧalＮＡc、Ｎ−アセチルグルコサミン；ＭＥＭ、アールの塩を含む最小必須培地、；ＳＭＣＣ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル４−（Ｎ−メチルマレイミド）シクロヘキシル−１−カルボキシレート；トリス、トリス（ヒドロキシメチル）アミン。 [5'-³²Ｐ]-[ＹＥＥ(ah-ＧalＮＡc)₃]-ＳＭＣＣ-ＡＥＴ-pＵ^mpＴ ₇（１０）の合成材料メチルホスホンアミダイトシントンは、ＪＢＬサイエンティフィック社から惜しみなく贈与され、更にこれは商業的に利用可能である。これらは、当業者によって確立された手順に従ってヌクレオシドから容易に合成することができきる。Ｕ^mpＴ₇の自動合成用の他の全ての試薬を、グレン・リサーチ社から購入した。ハイトラップ（ＨiＴrap）Ｑアニオン交換カラムは、ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジーから購入した。逆相高速液体クロマトグラフィーは、レイニンインスツルメント社(Ｒainin Ｉnstrument Ｃo.，Ｉnc.)から購入したミクロソルブＣ−１８カラムを使用して行った。シスタミン塩酸塩、１−エチル−３−［３− （ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド(ＥＤＡＣ)、１−メチルイミダゾール、及び無水ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、ジチオトレイトール(ＤＴＴ) 、エルメンズ試薬は、アルドリッチから購入し、更に精製することなく使用した。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）はアルドリッチから購入し、使用の前に水素化カルシウムから再蒸留した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４ −（Ｎ−メチルマレイミド）シクロヘキシルカルボキシレート(ＳＭＣＣ)は、ピアス(Ｐierce)から購入した。ウォータスのセプパック（ＳepＰak）Ｃ−１８カートリッジをミリポア社から購入した。ＹＥＥ(ah-ＧalＮＡc)₃を、Ｌeeら（１５ａ）に従って合成し、水溶液として４℃で保存した。アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及び［γ−³²Ｐ］−ＡＴＰは、Ｐ−Ｌバイオケミカルズ社及びアマーシャムからそれぞれ購入した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を、１５％ポリアクリルアミド、０．０８９Ｍトリス、０．０８９Ｍホウ酸、０．２ｍＭＥＤＴＡ（１×ＴＢＥ）及び７Ｍ尿素を含有する２０cm×２０cm×０．７５mmのゲルで行った。サンプルを、９０％ホルムアミド、１０％１×ＴＢＥ、０．２％ブロモフェノールブルー及び０．２％キシレンブルーを含有する導入用バッファーに溶解した。例１Ｕ^mpＴ₇の合成（６）オリゴデオキシヌクレオシドメチルホスホネートを、５’−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−メチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホンアミダイトチミジンを用いて制御された細孔性ガラス支持体（ＣＰＧ）上で合成し、確立された方法に従って脱保護した（１７）。その５’−末端でオリゴマーに取り込まれた最終シントンは、５’−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−３ ’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホロアミダイトウリジンである。最終カップリングステップで、５’末端ヒドロキシル基とバクテリオファージＴ４ポリヌクレオチドキナーゼのホスホリル化を可能にし、２’− Ｏ−メチル基の存在により、ホスホジエステルの安定性を保証する、末端の５’ ヌクレオシドと隣接するヌクレオシドの間にホスホジエステル結合を形成する。粗製８−ｍｅｒをハイトラップＱアニオン交換クロマトグラフィー(＜２５％アセトニトリルを含有するバッファーで導入し、０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ５．８で溶出した。)、及び、直線勾配（溶媒Ａ：５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．８、２％アセトニトリル；溶媒Ｂ：５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．８、５０％アセトニトリル。勾配：３０分で０〜６０％Ｂ）を用いる分取用逆相クロマトグラフィー（ミクロソルブＣ−１８）で精製した。このようにして精製されたオリゴマーは、分析用のＨＰＬＣで約９７％純度であり、少量のｎ−１種が不純物として含まれているのみである。例２［５’−³²Ｐ］−５’−Ｏ−[（Ｎ−２−チオエチル）ホスホロアミデート]− Ｕ^mpＴ ₇（９）の合成精製したオリゴマー(１６８nmol)、ＡＴＰ(１６０nmol)、Ｈ₂Ｏ(７５μＬ)、１０×ＰＮＫバッファー(５ｍＭＤＴＴ、５０ｍＭトリス・ＨＣｌ、５っっＭｇＣｌ₂、ｐＨ７．６；１０μＬ)、［γ−³²Ｐ］−ＡＴＰ(３０００Ｃi/mmol、１００μＣi、１０μＬ)、及びＰＮＫ（５μＬで１５０Ｕ）を混合し、３７℃で１６時間インキュベートし、乾燥するまで蒸発させた。残渣を、０．３ＭＥＤＡＣ（１００μＬ）を含有する０．２Ｍ１−メチルイミダゾール、ｐＨ７．０（１００μＬ）及び１．０Ｍシスタミン塩酸、ｐＨ７．２に溶解し、５０℃で２時間加熱した（１８）。過剰の試薬をセプパックで除去した(５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．８、５％アセトニトリルで導入し、５％アセトニトリル水溶液で洗浄し、５０％アセトニトリル水溶液で溶出した。)。溶媒を減圧下に蒸発させ、粗製シスタミン付加物を１０ｍＭリン酸塩含有５０ｍＭＤＴＴ（２００mＬ）に再溶解し、３７℃で１時間加熱した。バッファー塩及び過剰の還元剤を上記のように反応混合物から除去し、粗生成物を減圧下で乾燥した。表題化合物（９）を、６から５７％の収率で得た。これを更に精製することなく、次のステップで使用した。例３ [5'-³²Ｐ]-[ＹＥＥ(ah-ＧalＮＡc)₃]-ＳＭＣＣ-ＡＥＴ-pＵ^mpＴ ₇（１０）の合成ネオグリコペプチド５（３３６nmol）を無水ＤＭＳＯ（４０μＬ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（３３６nmol）及びＳＭＣＣ（３３６nmol）で処理した。反応物を、室温で４時間放置し、次いで新たに調製したチオール９を加えた。反応混合物を脱気し、減圧下、室温でゆっくり濃縮した。粗製の１０をホルムアミド導入用バッファー（１００μＬ）に溶解し、ＰＡＧＥ（４Ｖ/cm、１．５時間）で精製し、粉砕及び浸漬法（５０％アセトニトリル水溶液）によって回収した。純粋な１０の全収率は２５％であった。１０は、０．１ＮＨＣｌとの処理で、Ｐ−Ｎ結合を加水分解することで［５'−³²Ｐ］−ホスホリル化された６を生じる。しかし、６は、ＤＴＴ(５０ｍＭ、ｐＨ８、３７℃、１時間)、３−マレイミドプロピオン酸(５０ｍＭ、ｐＨ８、３７℃、１時間)、エルマンズ試薬（５０ｍＭ、ｐＨ８、３７℃、１時間）及びＢＡＰ（７０Ｕ、６５ ℃、１時間）に対しては非反応性であった。引き続き、１０を０．１ＮＨＣｌ及びＢＡＰで処理すると、予想したように、［³²Ｐ］−標識の完全な消失を起こした。同一の方法で調製した１０の標識されていないサンプルの化学量論的分析で、提案された構造と一致して、これが１molの複合体について、３molのＮ−アセチルガラクトサミンを含有することが示された。（Ｕ^mpＴ ₇のモル吸光率は、この構造に含まれる各ヌクレオシドに対するモル吸光率の値の合計をとることによって、５９，７５０Ｌ/mol-cmであると計算された。この値は、複合体に含まれることがわかっているＧalＮＡcのモル数とよく一致している。）空気添加電子スプレー質量スペクトル法（Ｐneumatically assisted electrospray mass spec trometry）で、Ｍ／Ｚ４０８０（計算質量：４０８０．７）の親ピークを得た。細胞取り込み試験材料Ｌ−グルタミンを添加したアールの塩を含む最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコの修飾イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）、Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ培地１６４０(ＲＰＭＩ)、ダルベッコのリン酸塩緩衝食塩水(Ｄ−ＰＢＳ)、ウシ胎児血清(ＦＣＳ)、ピルビン酸ナトリウム(１００ｍＭ)、非必須アミノ酸(１０ｍＭ)、重炭酸ナトリウム水溶液(７．５％)、及びトリプシン（０．２５％；１．０ｍＭＥＤＴＡを用いてＨＢＳＳ中で調製した。）を、ギブコＢＲＬ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）から購入した。ヒト肝細胞カルチノーマ(Ｈep Ｇ2)、ヒト繊維肉腫( ＨＴ 1080)、及びヒト前骨髄性白血病（ＨＬ-60）細胞をＡＴＣＣから得、１０％ＦＣＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び０．１ｍＭ非必須アミノ酸を添加した１×ＭＥＭ(Ｈep-Ｇ2)、１０％ＦＣＳを添加した１×Ｄ−ＭＥＭ(ＨＴ-1080 )、又は１０％ＦＣＳを添加した１× ＲＰＭＩ（ＨＬ-60）中で維持した。シリコンオイルは、ゼネラルエレクトリック（製品番号ＳＦ１２５０）から贈与された。細胞をコールター細胞カウンターを用いて計数した。例４Ｈep Ｇ2細胞又はＨＴ-1080を用いた取り込み試験細胞を２cmのウェルに通し、ウェルあたり約１０⁵細胞の濃度まで適切な培地で育成した。保持培地を吸引し、細胞を、２％ＦＣＳを含む０．５mＬの培地を用いて３７℃でインキュベートし、［５’−³²Ｐ］標識した１０中で１μＭにした。指示した時間が経過した後、５μＬアリコートの培地をシンチレーションカウント用に保存し、残りをウェルから吸引した。細胞をＤ−ＰＢＳ（２×０．５ mＬ）で洗浄し、０．２５％トリプシンで処理し(３７℃、２分)、１０％ＦＣＳを含有する新鮮な成長培地に懸濁した。この懸濁された細胞を、１．７mＬの円錐型のミクロ遠心管中でシリコンオイル（０．５mＬ）上に層状に重ね、１４，０００rpm（１２，０００ｇ）で３０秒間遠心することによってペレット化した。上清を注意深くデカンテーションし、細胞ペレットを１００μＬの、０．５％ＮＰ４０、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１４ｍＭトリス・ＨＣｌ及び３０％アセトニトリルを含有する溶液で溶解させた。放射能の量を、細胞溶解物に結合した１０の量を推測することによって、シンチレーションカウントで決定した。例５ＨＬ-60細胞を用いた取り込み試験２％ＦＣＳを添加し、［γ−³²Ｐ］−１０中で１μＭにしたＲＰＭＩ培地を、７．５×１０⁶のＨＬ-60細胞と、室温で５分間前処理した。細胞を遠心（５分）で除去した。この培地（３１ｍＬ）をデカンテーションし、７．５×１０⁶の新たなＨＬ-60細胞を加えた。この細胞を均一に懸濁し、細胞懸濁液を０．４ｍＬづつ６つに分割した。残りは捨てた。この細胞を、遠心（５分）で集め０．５ｍＬのＤ−ＰＢＳに再懸濁し、１．７ｍＬの円錐型ミクロ遠心管中でシリコンオイル上に層状に重ねた。細胞を遠心（１２，０００ｇ、３０秒）によってペレット化し、溶解し、細胞に結合された［³²Ｐ］−標識物質の量をシンチレーションカウントによって決定した。例６追加の複合体の合成方法本発明の方法は、非常に広範囲の有用な複合体を合成するのに使用されうる。１４例のオリゴヌクレオシド類似体を表１に示した。表２には、３’−及び５’ −ホスフェート修飾（これは、更なる反応のための１°アミン又はチオールを提供する。）の１４例を列記した。表３は、Ｎ−末端アミノ基を含むネオグリコペプチド、及びチオールを提供するための、アミンを修飾する４種類の方法を示す。最後に、表４には、リガンドにプロドラッグを結合するのに使用されうる、幾つかの異種二官能性交差結合剤及びカテプシンＤ感受性オリゴペプチドが列記されている。適切な多くの他の試薬を利用しうることが容易にわかるであろう。一般に、オリゴマーとネオグリコペプチドを共有結合させるのに使用されうる２つの反応スキームがある。第一は、異種二官能性交差結合剤を用いて、オリゴマーとネオグリコペプチドをカップリングすることを必要とし、これは３成分反応に分類されうる。以下と同様の結合を有する複合体が得られるであろう。この他には、ネオグリコペプチドを表３、エントリー２〜５に示すように修飾することができる。チオールの活性化は、例えば２，２’−ジピリジルジスルフィドを用いて達成されうる。活性化されたチオールと３’又は５’がチオールで修飾されたオリゴマー（表１、エントリー９〜１４）の何れかとの反応は、以下に示すように、オリゴマーとネオグリコペプチドとの間にジスルフィド結合をもたらす。この第二のスキームでは、商業的に利用可能な交差結合剤（表４、エントリー４〜６参照）を用いた場合には影響されない硫黄原子の周りの立体的込み合いを変化させて、ジスルフィド結合へ接近させることができる。概念的には、この反応スキームは、２成分反応に分類される。この場合、複合体の一方の「半分」が修飾され、次いで他の半分が反応のための活性化される。議論［ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）₃］−ＳＭＣＣ−ＡＥＴ−ｐＵ^mｐＴ ₇（１０）の合成ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）₃（５）（１５ａ）及びＵ^mｐＴ ⁷（６）（１７）の合成及び精製は、確立された手法により行った。５と６の間に共有結合を形成するために、６の５’末端は、Ｏｒｇｅｌ（１８）の方法を用いて修飾された。これにより、オリゴ−ＭＰにジスルフィドを導入し、次いでそれは、ＤＴＴにより還元され、５‘−チオールが得られる。ネオグリコペプチド５は、５のＮ末端アミノ基と結合し得るヘテロ二官能性架橋剤であるＳＭＣＣを用いて補足的様式に修飾された。ＳＭＣＣにより導入されたマレイミド基と修飾されたオリゴ− ＭＰの５’−チオールとのカップリングにより、代謝的に安定なチオエーテルを介してオリゴ−ＭＰとネオグリコペプチドとが結合される（図２）。合成を開始するために、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び０．９５当量のＡＴＰを用いて６をホスホリル化した。このような末端標識化反応のフォーミュレーションは、［³²Ｐ］−ＡＴＰの有効利用を可能にしつつ、約９０％のＡＴＰが消費され、複合体を放射能標識することを保証する。５’ホスフェートの修飾は、２工程で達成される。末端標識されたオリゴ−ＭＰを０．１５ＭのＥＤＡＣの存在下に０．１Ｍ１−メリルイミダゾールを含有する緩衝液中でｐＨ７．２において０．５Ｍシスタミンと５０℃でインキュベートし、６５％の収量でホスホルアミダイト５ ’シスタミンが得られる。この反応中に、チミジン修飾されたオリゴ−ＭＰが３５％まで生成し、反応条件を修飾する試み（例えば、温度の低下及びＥＤＡＣ濃度の低減）にもかかわらず、その生成を排除し得なかった。この副生成物は、ＥＤＡＣがチミジンのＮ−３と反応し、チミジン−ＥＤＡＣ付加物（１９）が形成されるために生じるようである。前記ジスルフィドを５０ｍＭのＤＴＴによりｐＨ８において還元することは、定量的である。この例において、チオールがオリゴ−ＭＰ上に合成後に導入され、部分的に、５’末端において³²Ｐが酵素的に導入され得るが、複合体のこの構築は、オリゴ−ＭＰの固相合成中に、例えば、Ｇ len Ｒesearchから商業的に入手し得る６−(トリチルチオ)ヘキシルホスホルアミダイト（１９）を用いてチオールリンカーを導入することにより容易に行い得る。別反応において、５は、無水ＤＭＳＯ中で各々当量のＳＭＣＣ（７）及びＤＩＰＥＡと合わされ、室温でインキュベートされる。この反応混合物とチオール９の結合は、９上に反応基があるので、５によりＳＭＣＣが完全に消費されることなく行われ、７と９が位置特異的に結合される。このスキームに従えば、２当量のネオグリコペプチド５が用いられた場合、９は完全に１０へ変換される。複合体１０の総収量は、オリゴ６に基づいて２４％（３合成の平均）であった。細胞取込み実験ＨｅｐＧ２細胞を用いて複合体１０の細胞連結を、複合体単独及び１００当量の遊離ネオグリコピプチド５の存在下の両者で試験し、細胞による取込が、１０のネオグリコペプチド残基が肝臓の炭水化物受容体へ結合する結果であることを示した。対照として、５’末端をエチレンジアミンにより修飾されたオリゴーＭＰ（１１；図２）も、同一条件下にＨｅｐＧ２細胞とともにインキュベートした。エチレンジアミンによる５’−ホスフェートの修飾は、５’−ホスホリル化された２を０．１ＭのＥＤＡＣとともに０．１Ｍイミダゾールを含有する緩衝液中でｐＨ７、３７℃において２時間インキュベートし、次いで、ｐＨ７．０に緩衝された０．３Ｍエチレンジアミン・塩酸塩水溶液とともに一晩インキュベートすることにより達成された（Ｍiller，Ｐ.Ｓ.; Ｌevis，Ｊ.Ｔ.、未公開結果）。この修飾により、細胞性ホスファターゼ活性による５’−ホスフェートの除去が妨げられる。いずれの場合も、修飾オリゴ−ＭＰは、２％子牛胎児血清（ＦＣＳ）を含有するメジウム中に１μＭの濃度に存在し、インキュベーションは、３７℃において行われた。複合体は、単独でインキュベートされた場合、細胞と迅速に連結し、わずか２時間後に１０⁶細胞当たり７．８ｐｍｏｌまで細胞に載荷している（図５）。これに対して、１００倍過剰量の遊離の５が１μＭの複合体とともに存在する場合、１０の連結は、１０⁶細胞当たり僅かに０．４２ｐｍｏｌであり、対照のオリゴ−ＭＰ１１により得られた値（１０⁶細胞当たり０．４９ｐｍｏｌ）と実質的に同一であった。追加の対照としてＨｅｐＧ２細胞を、１０倍過剰量の５の存在下に１１と共にインキュベートし、５と１１の間に共有結合が存在しないにもかかわらず、５がＨｅｐＧ２細胞による１１の取込みを引起こし得る可能性を評価した。２時間インキュベーションの後の細胞に結合した結合１１の量は、１０⁶細胞当たり僅かに０．６０ｍｍｏｌであり、複合体１０において見出されたものよりも顕著に少なかった。更に、より長時間のＨｅｐＧ２細胞による１０の取込みを試験し（１μＭ複合体、３７℃）、約２４時間までは直線的であり、１０⁶細胞当たり２６．６ｐｍｏｌの値に到達することが分かった（図６）。これらの実験の結果は、（１）複合体１０は、アシアログリコプロテイン受容体(asialoglycoprotein receptor)へ特異的に結合することによりＨｅｐＧ２細胞と連結し；（２）オリゴ−ＭＰとネオグリコペプチドの間の共有結合は、オリゴ−ＭＰのＨｅｐＧ２細胞との連結を有意に高めるために必須であり；及び（３）ＨｅｐＧ２細胞による１０の取込みは、この研究において用いられた条件下では２４時間までは飽和しないようであることを示している。前記化合物の細胞型特異性もまた試験した。アシアログリコプロテイン受容体は、肝細胞の表面上に見出され、各種の治療剤（２１）の配達に対してこの組織を選択的に標的とするための効率的な手段であることを表している。組織特異性は、３種のヒト細胞株であるＨｅｐＧ２、ＨＬ−６０及びＨＴ１０８０を、１μＭの複合体１０及び２％ＦＣＳを含有するメジウム中で３７℃において３及び２４時間インキュベートすることにより試験した。１０を顕著に取込んだ細胞株は、ＨｅｐＧ２のみであった。３及び２４時間のインキュベーションの後、１０⁶細胞当たりそれぞれ８．５及び２６．７ｐｍｏｌが細胞と連結した（図７）。これに対して、２４時間後、１０⁶細胞当たり僅か０．１０及び０．５３ｐｍｏｌがそれぞれＨＬ−６０細胞及びＨＴ１０８０細胞に連結した。この結果は、複合体ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡＣ）₃−ＨＳＡ−ポリ−Ｌ−リジンがＤＮＡをマウスの肝臓へ第一に配達することを示す、先の知見（１６）と一致する。新規なオリゴ−ＭＰネオグリコピプチド複合体[ＹＥＥ(ａｈ−ＧａｌＮＡＣ)₃ ]−ＳＭＣＣ−ＡＥＴ−ｐＵｍｐＴ７（１０）の細胞性連結及び細胞型特異性を、３種のヒト細胞株を用いて試験した。ＨｅｐＧ２細胞による１０の細胞性連結は、顕著に効率的であり、２４時間まで直線的に１０⁶細胞当たり２６ｐｍｏｌの最大レベルにまで到達する。１０⁶細胞が１μＬの体積を表すとの近似法を用いると、この複合体の細胞内濃度は、２６μＭまで高くなり得る。更に、ほとんどの複合体がＨＬ−６０又はＨＴ１０８０細胞と連結せず、ネオグリコピプチド５が、肝細胞へオリゴ−ＭＰ６を高選択性的に配達し得ることを示している。全動物生体分布(whole animal biodistribution)及び薬物速度論［ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡＣ）₃］−ＳＭＣＣ−ＡＥＴ−［³²Ｐ］−ｐＵ^mｐＴ ₇ （１０）及び［ＹＥＥ（ａｈ）₃］−ＳＭＣＣ−ＡＥＴ−［³²Ｐ］−ｐＵ^mｐＴ ₇ （１２）簡潔には、親オリゴデオキシヌクレオシドメチルホスホネート(オリゴ−ＭＰ) 、Ｕ^mｐＴ ₇は、［γ³²Ｐ］−ＡＴＰ及びＡＴＰにより５’末端標識され、比活性３００μＣｉ／１４ｎｍｏｌを有するｐ＊Ｕ^mｐＴ ₇が得られた（＊は、放射能核の位置を示す）。５’ホスフェートは、１−メチルイミダゾール及び水溶性カルボジイミドの存在下にシスタミンにより修飾された。得られたジスルフィドを過剰のジチオスレイトールにより還元し、ヘテロ二官能性架橋剤ＳＭＣＣを用いてリガンドであるＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）₃と結合させた。複合体（１）は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、ゲルから抽出し、ＳepＰakカートリッジを用いて脱塩した。純粋な複合体は、酵素的及び化学的に特長づけられた。複合体の一部分をＮ−アセチルグルコサミダーゼにより処理し、ＧａｌＮＡｃ残基（１２）を完全に除去した。１０及び１２の両者は、ＰＡＧＥ分析により判定し、＞９９％純粋であった。複合体を含有する溶液を全動物生体分布及び薬物速度論実験のために準備された滅菌条件下に凍結乾燥された滅菌試験管に入れた。全動物生体分布及び薬物速度論複合体１０及び１２を滅菌水に溶解した。０．１１μＣｉ（７ｐｍｏｌ）の複合体１０及び０．０３６μＣｉ（１．２ｐｍｏｌ）の１２を、尾への静脈注射により各々のマウスに投与した。逐次血液、膀胱／尿及び組織試料（肝臓、脾臓、腎臓及び筋肉）を、注射後１５、３０、６０、１２０及び１４４０分後に採取した。各々の時点で３匹のマウスを用い、全部で３０匹を用いた。サンプリング時に頸部切断によりマウスを殺した。全ての湿組織をシンチレーションバイアル中で秤量し、ＮＣＳ可溶化剤により５０℃で消化した。試料を脱色し、シンチレーションカクテルに溶解し、シンチレーションカウントにより放射能のレベルを測定した。生データを組織１グラム当たりの開始投与量百分率に変換した。ただし、膀胱から得られたデータは、これらの組織を傷つけずに入手することが困難なため、１組織試料当たりの開始投与量百分率として表した（図８参照）。１５分の時点において、複合体１０の組織１グラム当たりの開始投与量の３７％が肝臓と連結したのに対して、より少ない量の１１％及び２．４％がそれぞれ膀胱／尿及び腎臓に連結した。肝臓が平均で１．４ｇの重量を有することを考慮すると、開始投与量の約５２％が注射後１５分後に肝臓と連結した。試験した別の組織は、１５分後に開始投与量の＜１．２％を含有していた。肝臓に連結した放射能は、より長い時点で確実に減少し、最終的に、２４時間後には２．３％のレベルに到達した。これに対して、複合体の量は、膀胱及び尿において１５分と３０分との間に増加し、次いで、同様のレベルに低下した。複合体１２は、３つのＧａｌＮＡｃ残基を欠如するが、膀胱／尿と迅速に、腎臓とより低い程度に連結し、肝臓に対して特異性を示さなかった。例えば、３０分の時点で、組織１グラム当たりの開始投与量の百分率は、膀胱／尿、腎臓及び肝臓に対して、それぞれ４０％、５．０％及び１．１％であった。これらのデータから、（１）複合体１０は、肝臓と特異的に連結し；（２）複合体１０の連結はリガンド上のＧａｌＮＡｃ残基の存在に完全に従属し；（３）複合体１０又はより確実的には、その代謝生成物は、２４時間以内に肝臓から取除かれ、腎臓を経由してマウスから除去され、よって、膀胱及び尿へと導かれることが明らかである。更に、肝臓に連結した放射能が大量であるのに対して血液中に見出される放射能が低レベルであるので、複合体１０は、肝臓と間隙空間内において単純に連結するというよりもむしろ、肝細胞内へ配達されるとの結論に達することができる。化合物１ｂ及び１ｃの合成方法本発明の化合物の追加例を表５に示す。配列１〜３は、以下に示す合成方法を用いて表５の下部にオリゴヌクレオチドａ〜ｅとして示す置換基と結合することができ、本発明の化合物のさらなる例を形成する。例えば、１ｂは、本発明に従う置換基であるＣ６−チオール−ｐｓ、Ｏ^-、ＣＨ₃及び３’−複合体を有する配列１からなる（その構造を図９に示す）。１ｂにより示される構造の化合物（化合物１３）及び１ｃにより示される構造の化合物（化合物１４）は、例８及び９に詳細に示されるように、図３に示すスキームに従い合成された。出発物質を適切に置換し、合成において他の組み合わせを変更することにより、同様にして合成され得ることが明らかであろう。例７ＳＭＣＣ−ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）₃（８）の合成（代替方法）約１〜２μｍｏｌのＹＥＥ(ａｈ−ＧａｌＮＡｃ)₃を１ｍＬガラスＲeacti-via l中に乾燥した。この溶液に、無水ＤＭＳＯ(２５０μＬ)及び無水ＤＩＰＥＡ（３μＬ）を添加し、次いで、無水ＤＭＳＯ中で真空乾燥したＳＭＣＣ（６ｍｇ）を含有する溶液１５０μＬにより処理した。混合物を短時間撹拌し、室温に２時間放置した。逆相ｈｐｌｃを用いた分析は、出発物質ＹＥＥ(ａｈ−ＧａｌＮＡｃ)₃（溶出時間７．３分）が、完全に所望の生成物ＳＭＣＣ(溶出時間：７．３分)に転換したことを示した。次いで、反応混合物を、２％ＣＨ₃ＣＮを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．８）により１０ｍＬに希釈し、Ｓep-Ｐak カートリッジ上に負荷した。２％ＣＨ₃ＣＮを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ５．８)１０ｍＬによりカートリッジを洗浄し、生成物を１０ｍＬの２５％ＣＨ₃ＣＮ／Ｈ₂Ｏにより溶出した。生成物をＳpeed-vac内で減圧下に濃縮し、半分取逆相Ｃ１８カラム上で更に精製した。純粋なＳＭＣＣ−ＹＥＥ（ａｈＧＡｌＮＡｃ）₃を含有する分画をプールし、Ｓep-Ｐak上で脱塩した。生成物の最終収量：１．８９°Ｄ₂₇₆又は１．３５μｍｏl。例８チオール修飾オリゴヌクレオチド（例えば、表５の化合物１ｂ）の製造新規な型のオリゴマー、ａランダム（表５、配列１）、抗−ＨＢＶ（表５、配列２）及びコア（表５、配列３）であって、交互するホスホジエステル及びメチルホスホネートのヌクレオチド間結合を有する２’−Ｏ−メチルリボースを含有するものをこの研究で用いた。還元され、ネオグリコペプチドと結合するためのチオール基を生成し得る５’−ジスルフィドリンカーが、ホスホルアミダイトシントンを介して導入された。最後に、ホスホリル化し得る３’末端を用いて放射性³²Ｐ標識を導入できるように、３’−複合体の形態にあるオリゴヌクレオチドトレーサー単位もこの研究で用いた。これらの修飾オリゴマーは、商業的発売元（Ｇlen Ｒesearch）からの、対応するホスホルアミダイト及びメチルホスホルアミダイトを用いて固相ＤＮＡシンセサイザー上で合成した。前記トレーサーは、ｄＴ−５’−Ｌｃａａ−ＣＰＧを固相として用い、Ｇlen Ｒesearchから商業的に入手可能であるｄＴ−５’−ＣＥホスホルアミダイト、５’−ＤＭＴ−５− ［Ｎ（トルフルオロアセチル）ヘキシル−３−アクリルイミド］−２’−デオキシウリビン、３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）］ホスホルアミダイトを用いて製造した（図１０）。Ｃ６ジスルフィドシアノエチルホスホルアミダイトシントン（Ｇlen Ｒesearch）を固相合成の最終カップリング工程においてカップリングすることにより、５’−ジスルフィドリンカーをこれらのオリゴマー中に導入した。必要に応じて、Ｂeaucage試薬（Ｇlen Ｒesear ch）を低水分酸化剤に置換え、標準の確立された手順に従い、ホスファイトのスルフリル化を行い、ホスホロチオエートが得られる。オリゴマーは、Ｇentaワンポット法の下に脱保護され、trityl-on手順により精製された。最終精製は、分取逆相Ｃ１８カラムを用いて行われた。ジスルフィド残基のチオールへの還元は、５’−ジスルフィド含有オリゴマーをＤＴＴにより処理することにより行われた。すなわち、２．５ＯＤ₂₆₀（〜１６ｎｍｏｌｅ）ジスルフィドオリゴマーを新鮮に調製され、脱ガスされた、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８）中の５０ｍＭのＤＴＴ溶液４００μＬ中に溶解した。混合物を３７℃で２時間インキュベートした。チオールオリゴマーが親ジスルフィドオリゴマーよりも早く溶出することを示す逆相ＨＰＬＣ分析により定量的還元が確認された。次いで、Ｓephadex Ｇ-25カラム（１０×３００ｍｍ）上でチオールオリゴマーを精製し、ＤＴＴ及び塩を除去した。カラム充填及び試料溶出は、脱ガスされた２０％エタノール−水を用いることにより行われた。純粋なチオールオリゴマーを含有するＧ-25分画は、直ちに次の反応に用いられ、所望しない酸化を最小にした。例９ＳＭＣＣ−ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）₃−含有オリゴヌクレオチド（表５に１ｃとして示す化合物１４）の合成１．８ＯＤ₂₅₀（１２ｎｍｏｌｅ）の純粋なチオールオリゴマー（１ｂ）を含有する前記Ｇ-25分画を、回収された直後のＳＭＣＣ−ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）₃（５０ｎｍｏｌｅ）と混合した。混合物をspeed-vacにおいて濃縮乾燥した。残渣を、０．１Ｍリン酸（ｐＨ７）を含有する脱ガスされた５０％ＣＨ₃ＣＮ１００μＬに溶解した。溶液をspeed-vac中で約５分間真空にすることによりさらに脱ガスした。次いで、溶液に堅く蓋をし、室温で一晩インキュベートし、結合を完成させた。結合の収量を測定するために、［γ³²Ｐ］−ＡＴＰ及びＰＮＫを用いて、反応液の０．５μＬ部分をホスホリル化し、２０％変性ＰＡＧＥにより分析した。この結果は、チオールオリゴマーのネオグリコペプチドとの定量的結合を示した。複合体は、キモトリプシン消化されると顕著なゲル移動性を示すことにより、及びＤＴＴ処理されると移動し得ないことにより確認した。最後に、複合体は、２０％エタノールを用いて溶出するＳephadex Ｇ-25カラムにより精製し、次いで、更なる研究に供した。例１０ Hep G2 2.2.15における細胞取り込み実験 Hep G2 2.2.15[ヒトB型肝炎ウイルスDNA(22)を安定してトランスフェクションしたヒト肝細胞性癌細胞株]はDr.G.Y.Wuからの贈与物であった。その他の適切な細胞株は、当業者に公知であり、例えば、PLC/PRF/5(Alexander cells)[B型肝炎表面抗原分泌性ヒト肝細胞癌：文献(23)に記述され、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能]が挙げられる。 Hep G2 2.2.15細胞を、10％ウシ胎児血清を補った１Xダルベッコ改変イーグル培地中に保持した。その他の全材料は、上記の細胞取り込みの項で引用されたものと同じものを使用した。 Hep G2 2.2.15細胞を、２cm²ウェルに播種し 10％FCS 含有１X DMEM中で10⁵ce ll／ウェルの密度になるまで培養した。維持培地を吸引し、細胞を、2％FCS含有 0.5mlのDMEMを用いて37℃でインキュベートし、1c、1dまたは1eと共に[5'³²P]中に1uMに調製した。その他の全方法は、例４に示した方法と同じものを用いた。 1cの流入を測定するために、HepG2 2.2.15細胞を播種し、上述の通りに、1uM のオリゴマー複合体と共に24時間インキュベートした。そして、培地に含有されるオリゴマーを吸引し、細胞を2回洗浄し、次に0.5mlの維持培地中でインキュベートした。任意の時間で細胞を回収し、暫定的な適用の細胞取り込みの項において記述した通りに、その細胞を溶解した。流入は、放射能活性量のモニタリングおよび細胞溶解物中のオリゴマー複合体の濃度を推論することによって決定した。考察上述した細胞取り込み実験は、1dの細胞結合をHep G2 2.2.15を用いて試験することにまで及んだ。オリゴ-mpの場合、１の³²Pでラベルした5’末端をエチレンジアミンで修飾して調製することにより、コントロールである1eを得た。この実験の結果は、修飾オリゴ-mpで得られた結果と非常に類似するものであった。2時間のインキュベートの後に、２'OMe改変オリゴマー複合体（1d）は、H epG2 2.2.15細胞により、7.7pmoles/10⁶cellsの程度にまで直線的に取り込まれた(表６)。取り込みは、3時間で14.2pmoles/10⁶cellsまで増加し、24時間のインキュベーション後に、 28.5pmoles/10⁶cellsのピーク値を迎えた。対照的に、EDA修飾オリゴマー（1e）は、2時間のインキュベーション後では 0.275pmoles/10⁶cellsの程度で、3時間のインキュベーションの後では0.978pmoles/10⁶cellsの程度で、そして24時間のインキュベーション後では0.385pmoles/10⁶cellsの程度でHep G2 2.2.15細胞と結合した(表６)。更なる修飾、即ち1dに対する、3'末端へのホスホロチオエート保護[³²P]標識トレーサー（phosphorothioate protected[³²P]labeled tracer）の添加により1 cを得た。このオリゴマー複合体（1c）の取り込みは、1dにより示された結果と非常に類似したものであった。細胞結合は、12時間のインキュベーションの後で 18.6pmoles/10⁶にまで直線的に生じ、24時間のインキュベーションの後で、28.9 7pmoles/10⁶cellsのピーク値に達した(表７)。また、その後、細胞に結合した1cの流出率も評価した。Hep G2 2.2.15細胞内の2'OMe改変オリゴマー複合体の濃度は、処理を除いた24時間後に、12.45pmoles /10⁶cellsの値にまで連続的に減少すること示された(表８)。上記の実験は、ネオグリコペプチド５が、生体安定性(biostable)のオリゴマー[全2'-O-メチルリボースヌクレオシド類と、交互のメチルホスホネートおよびホスホジエステル・ヌクレオチド間結合（phsphodiester internucleotide link ages）からなる]を高効率的に肝細胞に、輸送することが可能であることを示している。加えて、オリゴマー複合体（1c）の3'末端でホスホロチオエート保護したトレーサーの配置は、細胞取り込みにける顕著な効果を持ってはいない。また更に、これらの研究は、処理終了の24時間後に５８％の取り込みピーク値に達している細胞から、取り込まれたオリゴマーが流出することも示している。例１１合成オリゴ-MPsを特異的にマウスの肝臓に輸送ことに対する、本発明のアシアログリコプロテインリガンド[asialoglycoprotein ligand：³²Pで放射性標識したYEE(ah-GalNAc)₃]を含む輸送ベヒクルの能力を試験するため、更に、単離Hep G2細胞内およびインビボ（マウス肝臓中および尿中）における本複合体の代謝的な運命を試験するために、動物実験(whole animalを用いる)を行った。また、比較のために、3つの末端Gal Nac残基を欠いた複合体も合成した。この糖鎖を欠いた複合体は、マウスにおけるリガンド(GalNac)特異的な取り込みを試験するために、コントロールとして用いた。材料および方法例１２組織分布およびクリアランスの経時的変化体重22gから35gの雄性CD-1マウス(Charles River)に、0.2mLの生理食塩水中に含有した7-30ピコモルの[³²P]-[YEE(ah-GalNAc)₃]-SMCC-AET-pU^mpT₇(10)または７pmoleの[³²P]-[YEE(ah)₃]SMCC-AET-pU^mpT₇(12)を、尾静脈注射により単回投与した。マウスは、15、30および60分、2、4、6および24時間で頚椎脱臼により屠殺した。血液、肝臓、腎臓、脾臓、筋、上部胃腸管、下部胃腸管および糞を回収し、重量を測定した。これらの臓器および組織から、代表するサンプルについて重量測定し、ガラス瓶に入れた。尿を回収するするために(投与の2時間後)、短時間のエーテル麻酔下で、マウスの外部尿道(external urethra)を結紮し、屠殺のあと、膀胱を摘出してガラス瓶に入れた。Solvables^R(NEN；1mL)をそれぞれのサンプルに添加した。それからサンプルをスライド加熱器の上におき、一晩消化し、翌朝加熱器から降ろし冷却した。消化したサンプルは、３から7滴のH₂O₂(30 ％ w/v)を用いて脱色し、10mLのフォーミュラ９８９(NEN)シンチレーションカクテルを添加した。放射能活性量は、シンチレーションカウンティング(パッカード 1900TR；＜3％エラー)により決定した。投与用量の等量をサンプルと一緒にカウントし、臓器またはグラム組織当たりのパーセント用量を計算した。例１３ Hep G2細胞から単離した代謝産物の分析細胞(約 10⁵)を1μM の[³²P]標識１を含有した培地中で、２、４、８、１６、および２４時間インキュベートし、PBS(２X)で洗浄し、シリコンオイルを介してペレット化し、溶解(0.5％ NP 40、100mM 塩化ナトリウム、14mMトリス-HCl pH7 .5、30％ ACN)した。溶解物を50％のアセトニトリル水溶液(v/v)により2回抽出した。その抽出物を凍結乾燥し、ホルムアミド負荷緩衝液に再溶解し、PAGEにより分析した(15％、２V/cm、30分)。例１４複合体代謝の分析雄性 CD-1 マウス(体重22から35g)に、40pmoleの[³²P]-[YEE(ah-GalNAc)₃]SMC C-AET-pU^mpT₇(10)を尾静脈注射により単回投与した。動物は、15、60および120 分後に屠殺した。肝臓および膀胱を前記の通り回収し、プラスチック瓶に収め、直ちに凍結(80℃)した。肝臓のサンプルは0℃に温め、重量を測定した(平均質量 0.25g)。組織は、アセトニトリル／水(１：１)の4体積中でホモジネート(ポリトロン、PCU-2-110組織ホモジナイザー)した。組織デブリスを遠心(10,000g、20分、0℃；Sorval Model RC-5B冷却高速遠心機)により除去した。上清を除去し、抽出操作を繰り返した。脱色したホモジネート物および上清の等量との比較により判定したところ、肝臓サンプルからの放射活性物の典型的な回収は³90％であった。上清の一部は、セントリコンフィルタ(Centricon filter：30,000MWC；20分、0℃、10,000g；Herml Z 360 K冷却マイクロ遠心機)を介して濾過し、凍結乾燥した。残渣をポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE；15％、20 X 20 X 0.75cm 、２V/cm、45分)による分析のための調製液である、ホルムアミド負荷緩衝液(90 ％ホルムアミド、10％ 1X TBE、0.2%ブロモフェノールブルー、および0.2%キシレンブルー)の10mL中に再溶解した。尿は、0℃に戻した膀胱から回収し、エタノール(1:2 v/v)を用いて0℃、30分間除タンパクした。沈殿したタンパクを遠心(16,000g、20分、0℃)により除去した。放射活性の回収は、上清およびタンパクペレットの等量との比較により、³90％であると評価した。上清部分は、凍結乾燥し、ホルムアミド負荷緩衝液に再溶解し、PAGE(15％、20 X 20 X 0.75cm、2 V/cm、45cm)により分析した。標準物質は、完全長の複合体(10)と、50ｍMクエン酸ナトリウム中のN-アセチルグルコサミダーゼ(pH5.0)、200mM KCl含有 10ｍMトリス・HCl 中のキモトリプシン(pH8.0)、および0.1N HClとの各々別途の反応を伴った、37℃、30分間のインキュベーションにより調製した。例１５組織分布と動態（肝取り込みと肝クリアランス）インビボにおける、複合体10の組織分布と臓器分布についての調査のために、マウスに上述の放射能標識化複合体を尾静脈注射により投与し、各々の臓器についての放射能活性量を、シンチレーションカウンティングにより決定した。表９は、複合体が、肝臓と最も高程度で結合していることを示しており、その程度は、投与後15分で、投与用量の69.9％の値にまで達している。投与後15分後で測定した他の組織における総放射能活性のランキングは、減少していく順に、筋＞腎臓＞血液＞脾臓である。尿の放射能活性のピーク値は、投与用量の28％であり、30 分後にこの値に到達した。腎臓および血液に関する放射能活性量は、時間と共に減少した。なお、肝臓で生成した複合体の代謝産物は、胆汁排泄を介して胃腸管に堆積することが予想されるが、殆どの放射能活性は、胆嚢、上部および下部胃腸管、糞便には結合しなかったことに留意すべきである(表９)。表１１は、３つの末端GalNac残基を欠いた複合体12が、次の順に分布していたことを示している：筋＞血液＞腎臓＞肝臓＞脾臓。筋および肝臓の放射能活性量は、一定値を維持しているように見えたが、血液および腎臓に関しては、24時間に亘る試験においては減少していた。尿における放射能活性のピーク値は、投与後30分における39.9％であった。コントロールとして、複合体10について同様の実験を行った(表１１)。組織分布のランキングは、放射能活性量の減少する順に：肝臓＞＞筋＞腎臓＞血液＞脾臓であった。投与後30分後には、尿は、投与用量の17％を含んでいた。例１６抱合体10の代謝のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析図13は、ＨepＧ2細胞とともに2-24時間インキュベーションした後の抱合体10 の代謝をＰＡＧＥ分析した結果を示す。対照反応に対する電気泳動上の移動度によって、三つのクラスの代謝物が同定されている（図13ではI-IIIと表記）。クラスＩは四つの化学的に異なる分子種からなるように思われ、１と２が全ての時点で顕著である。最も初期の時点で１と２の分布は、約1:1であるが、インキュベーションの時間が長くなると、２が顕著となる。該クラスの第三の代謝物（3, 図 12b）は、１をキモトリプシン消化することによって産生される物質とともに移動し、各時点において観察される。この分子種の相対量は、最終段階（24時間）（殆ど残っていない）までほぼ一定である。未同定の第四の分子種は、３に比べて若干遅い移動度であり、最後の時点を除き、全ての時点で見られる。全てのクラスＩ代謝物の量は、最終時点までに、徐々に減少するようである。クラスII 代謝物は、クラスＩ分子種に比べて、はるかに大きい電気泳動上の移動度を示す放射性標識を有する分子種からなる。少なくとも五つのバンドが観察されるが、それらの全てが各時点で存在するわけではない。例えば、最大および最小の移動度に位置するバンドは、16時間までは増加し、その後24時間までは徐々に減少するようである。主要な分子種についても同様の変化が観察される。８時間の時点で、該バンドは最大強度を示し、その後24時間まで漸減する。クラスＩ代謝物に見られたように、全てのクラスIIの代謝物の量も24時間の時点までには減少するようである。クラスIII代謝物は、ゲルマトリックス中では殆ど動かず、従って、殆どはポリアクリルアミドゲルのウェルの中に保持されている。該バンドの強度は、時間とともに増加し、24時間で最大値に達する。同様の様式で、生きたマウス肝臓中における10の代謝の経過を分析した。図14 は、［³²P］でラベルした抱合体10を投与したマウスの肝臓サンプルから得た肝臓のホモジネートの抽出物をＰＡＧＥ分析した結果を示している。投与15分後には、抱合体10（クラスＩ代謝物、図13参照）は、かなりの量が元通りのまま残っている。ゲルの分離度は、二つの分子種の識別を可能にするほどには十分ではない。該サンプル中に残存している放射性標識を有する分子種は、１と２に比べて、顕著に速く移動し、どの対照とも移動度が一致しない。これらの代謝物は、移動度の幅が広いようであり、最も遅いものは、ＨepＧ2細胞（クラスI I'）を用いて同定したクラスII代謝物よりも、有意に移動度が小さい。さらに時間が経過すると、元の10および12は殆ど全て消失するが、クラスII'代謝物の量は増加するようである。図15は放射線標識した抱合体10を静脈内投与した後のマウス尿中に観察される代謝物のパターンを示している。クラスＩの代謝物が、検出された唯一の放射線標識された分子種である。該抱合体の殆どは、元のままだが、少量ではあるが、無視し得ない量の物質が二つの分子種に転換される。どちらの分子種も、どの対照とも移動度が異なる。各々の相対量は、実験の間一定に保たれるようである。マウスの尿中には、クラスII、II'またはIII代謝物は全く観察されない。考察本明細書に示した証拠は、化学的に特定され、且つ均一な［³²Ｐ］標識された抱合体10は、リガンド特異的且つ細胞のタイプに特異的な態様で、ＨepＧ2細胞の細胞膜を通過し得ることを示している。これらの研究結果の論理的な拡張は、インビボにおける１の組織分布を決定し、インビトロおよびインビボにおける10 の代謝経過を比較し、三つの末端ＧalＮＡc残基を欠いた抱合体12を用いて得られたデータと該データを比較することがであった。インビボの組織分布データは、培養ヒト細胞を用いて得た結果を裏付ける。極めて選択性の高いオリゴデオキシヌクレオシドメチルフォスフォネートの肝臓へのターゲッティング（投与量（ i.d.）の70±10％）は、オリゴマーにアシアロ糖タンパク質受容体(ＡＳＧＰ)リガンドであるＹＥＥ(ah-ＧalＮＡc)₃を共有結合させることによって効果的に実現される。実際に、肝臓中の抱合体濃度は、血液中に比べて25倍高く、組織全体の測定に基づく筋肉中濃度に比べても約10倍高い（表９）。これらの結果は、アシアロ糖タンパク質-ポリ-Ｌ-リシン抱合体と複合体化することによって、他の臓器に比べて、ラット肝臓への［³²Ｐ］標識されたアンチセンスオリゴ-dＮの輸送が増大するというＬuらの報告（Ｌu etal.,1994）した同様の実験結果とほぼ一致し、ある点ではさらに優れている。しかし、著者らが指摘するように、脾臓、肺および腎臓も放射線標識を有するオリゴ-dＮを蓄積するので（例えば、投与5分後の各組織への分布は、グラム当たりで投与量の約6、4、2および 2％であったので（Ｌuら、1994）、肝臓に対する該複合体の選択性はそれほど高くなかった。低脂血剤アナマイシン（anamycin）単独および別のトリアンテナのＡＳＧＰリガンド、Ｎ-［トリス［b-Ｄ-ガラクトピラノシロシ］メチル］-メチル］-Ｎ^a-（アセチル）グリシナミド（トリス−ガルアセテート）に共有結合したアナマイシン）の生体分布および肝臓の取り込み速度をラットで決定した、Ｅichlerら(199 2)が報告した結果と我々の結果を比較するとさらに興味深い。著者は、肝臓への取り込みが、遊離の薬物と抱合体でほぼ同じであることを報告しており、トリアンテナのＡＳＧＰリガンドは、ラットの肝臓による該薬物の取り込みを増大させないと結論づけている。この結果は、リガンドＹＥＥ(ah.ＧalＮＡc)₃が共有結合することによって、マウス肝細胞による取り込みが大幅に促進されるという我々の観察と対照をなす。対照として、三つの末端ＧalＮＡc残基を欠き、それ故ＡＳＧＰ受容体に認識されないはずである抱合体12をマウスに投与した。予想通り、肝臓には殆ど放射能が検出されず、その他の臓器に、より多くの放射能が存在した（表II）。この結果は、放射線標識されたオリゴ−ＭＰが肝臓にターゲッティングされるのは、それがリガンドに共有結合していたためであるという我々の以前の発見を拡張した。無糖鎖リガンドとオリゴマーの抱合体の結果は、別途報告した他の結果と極めてよく似ている。5'末端のホスホジエステル結合以外は、全てメチルホスホネート骨格からなるトリチウム標識した12量体（d-Ｔp^*ＴＣＣＴＣＣＴＧＣＧＧ）をマウスに単回静脈内投与した。薬物投与後2,5,10,30,60および 120分後に臓器を集めた。該データは、放射能が肝臓、肺、筋肉または脾臓に分配されておらず、即座に血漿から腎臓および尿中へと消失することを示している。ＨＰＬＣによる研究から、元の12量体が、末端ヌクレオチドの酵素的切除によって11量体に代謝され、静脈内投与後両者ともに迅速に尿中へ排出されることが示された。このように本明細書に報告した結果は、以前の結果と非常によく一致し、オリゴマー抱合体の肝臓中への取り込みを誘導する上で、ＧalＮＡc末端が重要であることを実証している。インビトロおよびインイボにおける抱合体10の代謝経過についての洞察を得るために、我々は培養して増殖させたＨepＧ2細胞、並びにマウスの肝臓および尿から得た抽出物をＰＡＧＥ分析によって調べた。我々は、ＨepＧ2細胞内およびマウス肝臓内では、三つのクラスの代謝物（クラスI-III）が産生されているのに対して、マウス尿中からはクラスＩ代謝物のみが単離されることに気付いた。クラスＩの代謝物は、リガンドの崩壊によって生じるようであった。これらの分子種の産生をモデル化するために、二つの酵素反応（Ｎ-アセチルグルコサミダーゼおよびキモトリプシン）を用いた。前者の処理によって、三つの末端ＧalＮＡ c残基の喪失から生じる僅かな質量の減少のために、１よりも僅かに速く移動する２が産生された。リガンドの大部分が失われ、且つ全電荷が-1から-2に増加したことに由来するかなりの移動度の増大が、後者の処理によってもたらされた（図12）。これら二つのモデル反応によって、元の放射線標識されたオリゴＭＰが共有結合で残存している、修飾されたリガンドを有する化合物が産生された。それ故、ゲルの同一領域に移動している他の分子種は、１の中の他の切断されやすい部位の結合が切除されたから生じたのではなく、リガンドの分解から生じたものであると結論するのが妥当である。例えば、アミノヘキシル側鎖のアミド結合を一つ加水分解すると、２と３の中間の重量を有する５（図12b）が生じ、負の電荷が-1から-2に増加するであろう。この例では、２と３の間の移動度を有する分子種が、ＰＡＧＥ分析によって見出されるであろう。クラスII代謝物は、クラスＩで同定された代謝物に比べて、かなり速く移動する。我々は、オリゴ−ＭＰの5'末端に位置するホスホジエステル結合の一つが、予期せぬ加水分解を受けることにより、それらが生じることを提案する。ヘビ毒のホスホジエステラーゼで行ったモデル反応では、全く切断が見られなかったことに基づいて、該部位は、エンドヌクレアーゼ活性による切断に対して安定である（Sproatら、1989）と思われた。該部位での切断によって、１の残り部分からオリゴ−ＭＰの７個の末端ヌクレオチドが分離され、最も重要なことであるが、放射線標識されたフォスフェートを含有する単一のヌクレオチドを有する相対的に低分子量の分子種が産生されるであろう（6、図12b）。さらに、リガンドの分解により、クラスII代謝物として同定された複数の分子種が生成されるであろう。ＨepＧ2細胞中だけに見られたクラスIII代謝物は、ゲル中では短い距離を移動する、放射性のリンを含有した高分子量の分子種であるように思われる。１から放射性フォスフェートが放出され、その後高分子量の細胞構造体（核酸またはタンパク質）中に取り込まれると考えれば、このバンドが説明できるであろう。エンドソーム区画は成熟するにつれて酸性になり、リソゾームと融合する前にはpＨ5.5にまで達することはよく知られている（Ｓchwartzら、1985）。さらに、リガンドにオリゴ −ＭＰを結合させているフォスホルアミデート結合は、酸性条件下で加水分解を受けて４を与える（図12b）。エンドソーム区画の酸性化によって、Ｐ-Ｎ結合が加水分解されるという可能性を試験するために、50mＭのクエン酸ナトリウムpＨ 5.5および6.0の中で１を37℃でインキュベートした。我々は、１はpＨ6では安定であるが、pH5.5では24時間後にかなり（＞50％）４に加水分解され、ＰＡＧＥ分析によって決定したところによれば（データは示されていない）、加水分解はフォスホルアミデートのＰ-Ｎ結合で特異的に生じることが観察された。このように、細胞構造物中への放射性フォスフェートの取り込みは、１を含有しているエンドソーム区画が酸性化されることによるＰ-Ｎ結合の加水分解によって起こり、フォスファターゼ活性によって末端フォスフェートが細胞環境（cellular m illeau）中に放出されると結論づけるのが妥当である。ＨepＧ2細胞からの抽出物中に観察される代謝物のプロフィールには、各クラスの代謝物が含まれる。初期の時点では、放射能の大部分はクラスＩ分子種（主として1,2）の中に含有されている。後には、代謝物の分布はクラスＩからクラスIIおよびIIIへ移行し、サンプリングした最後の時点では、放射性のリンの大部分はクラスIII代謝物に存在しており、Ｐ-Ｎ結合の加水分解が、実験中に相当起こったことを示している。ＨepＧ2細胞の中に一度取り込まれると、１が相当代謝されることはきわめて明白であり、該方法によって、細胞内に、アンチセンスオリゴ−ＭＰまたはその他の薬剤を輸送できることを示唆している。Ｎ-Ｐ結合のリンだけが³²Ｐで標識されている事実によれば、オリゴヌクレオチド類縁体の代謝経過を測定するということはできない。オリゴヌクレオチドの代謝が過度であると、細胞内の相補的な核酸配列と特異的に相互作用する能力に悪影響を与えるので、他の部位を標識したオリゴヌクレオチド配列を用いて、さらに実験を行う必要がある。マウス肝臓および尿から得た抽出物のＰＡＧＥ分析の結果は、マウス肝臓中での代謝物の産生は、ＨepＧ2細胞で見られたものと二つの点で異なることを示している。第一に、肝臓内でクラスII'を産生する１の分解がはるかに速く、すでに一時間後には、放射能の大部分がこれらの分子種の中に見出された。第二に、肝臓中のクラスII'代謝物の移動度およびプロフィールは、培養細胞中のクラスII代謝物とは異なっており、マウス肝臓内とＨepＧ2細胞では、１が遭遇する酵素活性は異なることを示唆している。二時間の間には、クラスIII代謝物は殆ど、または全く産生されず、ＨepＧ2細胞の結果と一致している。マウス肝臓では１が大量に分解されるのに対して、尿中の代謝物パターンの方が複雑ではなく、専らクラスＩ代謝物からなるようである。肝臓と尿では異なる代謝物パターンが見られたことは、臓器の間質部だけに留まっていたのではなく、肝細胞内に輸送されたことを示唆している。結論化学的に特定され、構造的に均一なネオグリコペプチド−オリゴデオキシヌクレオシドメチルフォスフォネート抱合体(10)のインビボでの分布および代謝によって、該抱合体の輸送が極めて効率的であり、投与量の約70％のレベルが投与後 15分で肝臓に達することが実証されている。該リガンドが迅速且つ完全に分解されることと併せて、これらの結果は、アンチセンス剤（メチルフォスフォネートまたは他の類縁体の何れか）および他の治療的に有用な薬剤を輸送するための該方法が、極めて有用であることを示している。さらに、これらの結果は、アンチセンス部分の核酸の特異性の結果生じるリガンドの組織特異性を利用した診断用イメージング操作に対する可能性を実証し、これまで達成されなかった特異性により、インビボでの細胞機能の局所的な異常を測定する手段を提供する。本明細書に記載されている方法、特に表1-4に詳述されている試薬および化合物を用いて、種々の有用な化合物を合成できることが理解されるであろう。本例は、限定を意図するものではなく、単なる例示にすぎない。様々な修正を行うことができるのは明らかであるが、それらはすべて本発明の請求の範囲の中に含まれるものである。本明細書で引用した参照文献のリストを便宜のために掲げる。これらは参照文献として本明細書に取り込まれる。 1．Mirabelli，C K.; Crooke，S.T.（1993）Antisense oligonucleosid es in the context of modern molecular drug discovery and development，in Antisenese research and applications（Crooke，S.T.，and LeBleu，B．Ed. ）CRC Press，Boca Raton，pp．7-35. 2．Ts'o，P.O.P.; Aurelian，L.; Chang，E.; Miller，P.S.（1992）No nionic oligodeoxynucleotide analogs（Matagen^TM）as anticodic agents in d uplex and triplex formation．Ann．NY Acad．Sci．600，159-177. 3．Miller，P.S.; McParland，K.B.; Javaraman，K.; Ts'o，P.O.P.（1 981）Biochemical and biological effects of nonionic nucleic acid methylp 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using specific receptors and ligands，Marcel Dekker， Inc.，New York. 22．Sells，M.A.; Chen,M.L.; and Acs,G.（1987），Production of he patitis B virus particles in HepG2 cells transfected with cloned hepatit is B virus DNA.Proc.Natl.Acad.Sci．84,1005-1009. 23．Jacinta，Skelly，et al.（1979）Nature 282:617-618.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ハンゲランド、ジョン・ジェイアメリカ合衆国、ペンシルバニア州 19067、モリスビル、ルイーズ・ドライブ 234 (72)発明者リー、ユアン・シーアメリカ合衆国、メリーランド州 21218、ボルチモア、ノース・チャールズ・ストリート 3400

Claims

【特許請求の範囲】１．次式で表される化学的に均一な複合体Ａ−Ｌ−Ｐここで、Ａは、付着基を表し、Ｐは、特定の化学結合の加水分解または還元に続いて前記複合体から放出されることにより活性化し、または前記複合体の一部として含まれているときよりも活性になる生物学的に安定なプロドラッグを表し、Ｌは、前記付着基およびプロドラッグと位置特異的に化学的結合して、化学的に均一な複合体を与える２官能性のリンカーであり、Ａ、ＬおよびＰは共有結合している。２．請求項１に記載の複合体であって、Ａ、は特定の組織に固有の細胞表面レセプターに特異的に結合することにより、前記プロドラッグの組織特異的または細胞特異的なターゲッティングするための手段を提供する複合体。３．請求項１に記載の複合体であって、Ａは、細胞表面レセプターに特異的に結合し、これによって前記レセプターを有する細胞への該複合体の導入を促進するリガンドである複合体。４．請求項１に記載の複合体であって、Ａはネオグリコペプチドである複合体。５．請求項１に記載の複合体であって、Ａは図１の化合物群から選択される複合体。６．請求項１に記載の複合体であって、Ｐは、酵素的加水分解または生分解に対して抵抗性のヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオシドである複合体。７．請求項６に記載の複合体であって、Ｐは、表１に列記した化合物群から選択される複合体。８．請求項６に記載の複合体であって、Ｐは、デオキシリボシド、リボシド、２´−Ｏ−メチルリボシドまたは他のヌクレオシドおよびこれらの混合物からなる群から選択される複合体。９．請求項６に記載の複合体であって、Ｐは、ホスホジエステル、チオリン酸ジエステルおよびホスホン酸メチル結合、並びに酵素的加水分解または生分解に抵抗性である他の結合からなる群から選択される複合体。１０．請求項１に記載の複合体であって、Ｌは表４の架橋剤の産物である複合体。１１．請求項２に記載の複合体であって、前記組織は肝臓である複合体。１２．メチルホスホン酸オリゴデオキシヌクレオシド・ネオグリコペプチドであるＹＥＥ(al-ＧalＮＡc)₃-ＳＭＣＣ-ＡＥＴ-Ｕ^mpＴ ₇。１３．図１０および図１１に示した構造の、ヌクレオシド間のジエステル結合およびメチルホスホン酸エステル結合を有するオリゴ２´−Ｏ−メチルリボシド・ネオグリコペプチド複合体であって、前記構造は、異なった塩基および糖からなるこっらおりごまーのファミリーを表す複合体。１４．組織特異的デリバリーのためのオリゴマーおよびネオグリコペプチドを含む化学的に均一なデリバリーアセンブリーであって、前記オリゴマーはメチルホスホン酸オリゴデオキシヌクレオシドまたはその類縁体であり、前記オリゴマーおよび前記ネオグリコペプチドは共有結合されている複合体。１５．遺伝子特異的な、請求項１４のデリバリーシステム。１６．配列特異的な、請求項１５に記載のデリバリーシステム。１７．前記組織が肝臓である、請求項１６に記載のデリバリーシステム。