RU2275936C2 - Конъюгаты и способ их получения, а также их применение для транспорта молекул через биологические мембраны - Google Patents
Конъюгаты и способ их получения, а также их применение для транспорта молекул через биологические мембраны Download PDFInfo
- Publication number
- RU2275936C2 RU2275936C2 RU2002105016/15A RU2002105016A RU2275936C2 RU 2275936 C2 RU2275936 C2 RU 2275936C2 RU 2002105016/15 A RU2002105016/15 A RU 2002105016/15A RU 2002105016 A RU2002105016 A RU 2002105016A RU 2275936 C2 RU2275936 C2 RU 2275936C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- oligonucleotide
- group
- cell
- conjugate
- molecule
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 239000012528 membrane Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims abstract description 74
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 claims abstract description 4
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 claims abstract description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 216
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 108
- -1 α-hydroxysuccinimide carboxylic acid Chemical class 0.000 claims description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 21
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 20
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 13
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 10
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 10
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 10
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 10
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical group ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 6
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 claims description 6
- ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N isothiocyanate group Chemical group [N-]=C=S ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 5
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 claims description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N Pyrrole Chemical compound C=1C=CNC=1 KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 4
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 4
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 claims description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 3
- WLODWTPNUWYZKN-UHFFFAOYSA-N 1h-pyrrol-2-ol Chemical compound OC1=CC=CN1 WLODWTPNUWYZKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003678 cyclohexadienyl group Chemical group C1(=CC=CCC1)* 0.000 claims description 2
- 125000000596 cyclohexenyl group Chemical group C1(=CCCCC1)* 0.000 claims description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000002541 furyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 2
- IQPQWNKOIGAROB-UHFFFAOYSA-N isocyanate group Chemical group [N-]=C=O IQPQWNKOIGAROB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 claims description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000000168 pyrrolyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000001544 thienyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims 2
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims 1
- LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N spironolactone Chemical compound C([C@@H]1[C@]2(C)CC[C@@H]3[C@@]4(C)CCC(=O)C=C4C[C@H]([C@@H]13)SC(=O)C)C[C@@]21CCC(=O)O1 LXMSZDCAJNLERA-ZHYRCANASA-N 0.000 claims 1
- 229960002256 spironolactone Drugs 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 abstract description 3
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 abstract description 3
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 abstract 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 87
- CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N (6'-acetyloxy-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl) acetate Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1OC1=CC(OC(=O)C)=CC=C21 CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 61
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 51
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 49
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 17
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 13
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N hydrogen carbonate;triethylazanium Chemical compound OC(O)=O.CCN(CC)CC AFQIYTIJXGTIEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 9
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 8
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 8
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 8
- YBANXOPIYSVPMH-UHFFFAOYSA-N 3-[[di(propan-2-yl)amino]-[6-[[(4-methoxyphenyl)-diphenylmethyl]amino]hexoxy]phosphanyl]oxypropanenitrile Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(NCCCCCCOP(OCCC#N)N(C(C)C)C(C)C)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 YBANXOPIYSVPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 7
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 7
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 6
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- JUDOLRSMWHVKGX-UHFFFAOYSA-N 1,1-dioxo-1$l^{6},2-benzodithiol-3-one Chemical compound C1=CC=C2C(=O)SS(=O)(=O)C2=C1 JUDOLRSMWHVKGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 5
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol Substances OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 4
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 4
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 4
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 4
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000009096 Proto-Oncogene Proteins c-myb Human genes 0.000 description 4
- 108010087776 Proto-Oncogene Proteins c-myb Proteins 0.000 description 4
- 239000012317 TBTU Substances 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 4
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 4
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 4
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 4
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 4
- 239000012070 reactive reagent Substances 0.000 description 4
- FSQUSPTZKDKHDU-UHFFFAOYSA-N 2-acetyloxynaphthalene-1-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=CC2=C(C(O)=O)C(OC(=O)C)=CC=C21 FSQUSPTZKDKHDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102100023471 E-selectin Human genes 0.000 description 3
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 3
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 101001113506 Rattus norvegicus Proliferating cell nuclear antigen Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- AUZONCFQVSMFAP-UHFFFAOYSA-N disulfiram Chemical compound CCN(CC)C(=S)SSC(=S)N(CC)CC AUZONCFQVSMFAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 3
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 3
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 3
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 3
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 3
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 3
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 3
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GDBUZIKSJGRBJP-UHFFFAOYSA-N 4-acetoxy benzoic acid Chemical compound CC(=O)OC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 GDBUZIKSJGRBJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JGNJMKMDYGWGPZ-UHFFFAOYSA-N 4-acetyloxy-2-oxochromene-3-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=CC2=C1OC(=O)C(C(O)=O)=C2OC(=O)C JGNJMKMDYGWGPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 5,6-dihydrouracil Chemical compound O=C1CCNC(=O)N1 OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PNWOYKVCNDZOLS-UHFFFAOYSA-N 6-amino-5-chloro-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1Cl PNWOYKVCNDZOLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 2
- 102000008130 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010049894 Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 2
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 2
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 2
- 108010017642 Integrin alpha2beta1 Proteins 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 2
- 102100036691 Proliferating cell nuclear antigen Human genes 0.000 description 2
- 102100024924 Protein kinase C alpha type Human genes 0.000 description 2
- 101710109947 Protein kinase C alpha type Proteins 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- 108060006706 SRC Proteins 0.000 description 2
- 102000001332 SRC Human genes 0.000 description 2
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 2
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010013985 adhesion receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000019997 adhesion receptor Human genes 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 150000007860 aryl ester derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000017455 cell-cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 125000002668 chloroacetyl group Chemical group ClCC(=O)* 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 2
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 2
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229960004903 invert sugar Drugs 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 102000027450 oncoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003961 penetration enhancing agent Substances 0.000 description 2
- RDOWQLZANAYVLL-UHFFFAOYSA-N phenanthridine Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C=NC2=C1 RDOWQLZANAYVLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical compound C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 2
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- LMHFFSQJPBXLLK-YNEHKIRRSA-N (2r,3s,5r)-5-(6-anilinopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-ol Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(NC=3C=CC=CC=3)=C2N=C1 LMHFFSQJPBXLLK-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 1
- IMAXLNCKOJCLPF-NGJCXOISSA-N (2r,4r,6s)-6-(hydroxymethyl)oxane-2,4-diol Chemical compound OC[C@@H]1C[C@@H](O)C[C@H](O)O1 IMAXLNCKOJCLPF-NGJCXOISSA-N 0.000 description 1
- 125000006702 (C1-C18) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004178 (C1-C4) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004209 (C1-C8) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006736 (C6-C20) aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- VFNKZQNIXUFLBC-UHFFFAOYSA-N 2',7'-dichlorofluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Cl)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(Cl)C(O)=C1 VFNKZQNIXUFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 2,3-dihydroxybutanedioic acid (2S,3S)-3,4-dimethyl-2-phenylmorpholine Chemical compound OC(C(O)C(O)=O)C(O)=O.C[C@H]1[C@@H](OCCN1C)c1ccccc1 VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 0.000 description 1
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 4',5'-Dihydropsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OCC2 VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical group C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SSRFBERYIRRDJN-MWKWWEEBSA-N 4-amino-1-[(2s,3r,4s,5r)-2-benzoyl-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@]1(C(=O)C=2C=CC=CC=2)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SSRFBERYIRRDJN-MWKWWEEBSA-N 0.000 description 1
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- BISHACNKZIBDFM-UHFFFAOYSA-N 5-amino-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound NC1=CNC(=O)NC1=O BISHACNKZIBDFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JDBGXEHEIRGOBU-UHFFFAOYSA-N 5-hydroxymethyluracil Chemical compound OCC1=CNC(=O)NC1=O JDBGXEHEIRGOBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVKLKDEXOWFSL-UHFFFAOYSA-N 6-amino-5-bromo-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1Br QFVKLKDEXOWFSL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XYVLZAYJHCECPN-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexyl phosphate Chemical group NCCCCCCOP(O)(O)=O XYVLZAYJHCECPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010060263 Adenosine A1 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000030814 Adenosine A1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010060261 Adenosine A3 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000008161 Adenosine A3 Receptor Human genes 0.000 description 1
- 206010001557 Albinism Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000010183 Bradykinin receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050001736 Bradykinin receptor Proteins 0.000 description 1
- IVKFXQAMRRFBOR-UHFFFAOYSA-N CC(O)=O.CC(O)=O.OC1CC(=O)NC1=O Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.OC1CC(=O)NC1=O IVKFXQAMRRFBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 0 CC(Oc1ccc(C=C(*=O)C(O2)=O)c2c1)=O Chemical compound CC(Oc1ccc(C=C(*=O)C(O2)=O)c2c1)=O 0.000 description 1
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010031896 Cell Cycle Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000005483 Cell Cycle Proteins Human genes 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 108090000259 Cyclin D Proteins 0.000 description 1
- 102000003910 Cyclin D Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 101100481408 Danio rerio tie2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010024212 E-Selectin Proteins 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108091011114 FK506 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102100039788 GTPase NRas Human genes 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 102400001369 Heparin-binding EGF-like growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800001649 Heparin-binding EGF-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101000744505 Homo sapiens GTPase NRas Proteins 0.000 description 1
- 101001050288 Homo sapiens Transcription factor Jun Proteins 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N IMP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102000000521 Immunophilins Human genes 0.000 description 1
- 108010016648 Immunophilins Proteins 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 108010058398 Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100028123 Macrophage colony-stimulating factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101100344182 Mus musculus Lox gene Proteins 0.000 description 1
- 101100481410 Mus musculus Tek gene Proteins 0.000 description 1
- 102100034681 Myeloblastin Human genes 0.000 description 1
- 108090000973 Myeloblastin Proteins 0.000 description 1
- 102000055056 N-Myc Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700026495 N-Myc Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 description 1
- PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N Phenazine Natural products C1=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3N=C21 PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 208000012641 Pigmentation disease Diseases 0.000 description 1
- 102000011653 Platelet-Derived Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 208000008691 Precursor B-Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004079 Prolyl Hydroxylases Human genes 0.000 description 1
- 108010043005 Prolyl Hydroxylases Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 102000002727 Protein Tyrosine Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000004053 Proto-Oncogene Proteins c-ets Human genes 0.000 description 1
- 108010018070 Proto-Oncogene Proteins c-ets Proteins 0.000 description 1
- 108010029869 Proto-Oncogene Proteins c-raf Proteins 0.000 description 1
- 102100033479 RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 102000018679 Tacrolimus Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000005610 Thyroid Hormone Receptors alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010045070 Thyroid Hormone Receptors alpha Proteins 0.000 description 1
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 description 1
- 101710132316 Transactivation protein Proteins 0.000 description 1
- 102100023132 Transcription factor Jun Human genes 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000015098 Tumor Suppressor Protein p53 Human genes 0.000 description 1
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 description 1
- DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N Uridinemonophosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108700022715 Viral Proteases Proteins 0.000 description 1
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 description 1
- FPQVGDGSRVMNMR-JCTPKUEWSA-N [[(z)-(1-cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidene)amino]oxy-(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium;tetrafluoroborate Chemical compound F[B-](F)(F)F.CCOC(=O)C(\C#N)=N/OC(N(C)C)=[N+](C)C FPQVGDGSRVMNMR-JCTPKUEWSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229950006790 adenosine phosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-MBMOQRBOSA-N alpha-D-arabinopyranose Chemical compound O[C@@H]1CO[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-MBMOQRBOSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 150000004054 benzoquinones Chemical class 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-KKQCNMDGSA-N beta-D-xylofuranose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-KKQCNMDGSA-N 0.000 description 1
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001818 capillary gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N cytidine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 IERHLVCPSMICTF-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000035614 depigmentation Effects 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- HBGGXOJOCNVPFY-UHFFFAOYSA-N diisononyl phthalate Chemical compound CC(C)CCCCCCOC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)OCCCCCCC(C)C HBGGXOJOCNVPFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000001941 electron spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N flucytosine Chemical compound NC1=NC(=O)NC=C1F XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004413 flucytosine Drugs 0.000 description 1
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 150000002634 lipophilic molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 125000004573 morpholin-4-yl group Chemical group N1(CCOCC1)* 0.000 description 1
- NCGWKCHAJOUDHQ-UHFFFAOYSA-N n,n-diethylethanamine;formic acid Chemical compound OC=O.OC=O.CCN(CC)CC NCGWKCHAJOUDHQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BNXBRFDWSPXODM-BPGGGUHBSA-N n-[1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-2-oxopyrimidin-4-yl]benzamide Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)N=C(NC(=O)C=2C=CC=CC=2)C=C1 BNXBRFDWSPXODM-BPGGGUHBSA-N 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 238000005731 phosphitylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229950010765 pivalate Drugs 0.000 description 1
- IUGYQRQAERSCNH-UHFFFAOYSA-N pivalic acid Chemical compound CC(C)(C)C(O)=O IUGYQRQAERSCNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 108020000494 protein-tyrosine phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 102000027483 retinoid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008679 retinoid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000029305 taxis Effects 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea group Chemical group NC(=S)N UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N uridine 5'-monophosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 description 1
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 description 1
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины и касается конъюгатов, состоящих из транспортируемой через биологические мембраны молекулы, представляющей собой биополимер, пептид-нуклеиновую кислоту или полиамид, и арильного остатка, используемых для лечения заболеваний, обусловленных сверхпродуцированием определенных генов, способа их получения, способа транспорта молекулы через биологическую мембрану, лекарственного средства, способа получения лекарственного средства, диагностического средства и тест-набора на основе указанного конъюгата. 9 н. и 12 з.п. ф-лы, 9 ил., 6 табл.
Description
Объектами настоящего изобретения являются конъюгаты, способ их получения и применение этих конъюгатов для транспорта низкомолекулярных соединений и макромолекул через биологические мембраны, в особенности для транспорта молекул в клетки. Объектами настоящего изобретения являются также лекарственное и диагностическое средства, а также тест-наборы, в которых находятся или, соответственно, используются, эти конъюгаты.
Лимитирующим фактором для терапевтического использования молекул, место воздействия которых находится внутри клетки, часто является их недостаточное проникновение в клетку и неблагоприятное внутриклеточное распределение. Типичными примерами являются макромолекулы, как нуклеиновые кислоты, которые специфическим к последовательности образом связываются с клеточными ДНК или РНК и благодаря этому вызывают ингибирование экспрессии генов. Антисмысловые олигонуклеотиды представляют собой короткие одноцепочечные нуклеиновые кислоты, которые через пары оснований, согласно модели Уотсона-Крика, связываются с комплементарной мРНК, трансляцию которой в соответствующем протеине нужно ингибировать. Триплексобразующие олигонуклеотиды за счет так называемого "спаривания оснований по Hoogsteen" связываются в большую "борозду" двойной спирали ДНК с образованием тройной спирали, благодаря чему специфически к последовательности ингибируется транскрипция генов. Другими внутриклеточно действующими олигонуклеотидами являются, например, так называемые "Decoy"-олигонуклеотиды, которые имитируют места связывания факторов транскрипции. Путем обработки с помощью Decoy-олигонуклеотидов специфически к последовательности можно улавливать определенные факторы транскрипции и благодаря этому можно предотвращать активацию транскрипции. Другую группу внутриклеточно действующих олигонуклеотидов, химерапластов, используют для направленной коррекции генов (Cole-Strauss и др., Science, 273, 1386-1389 (1996)). Также для этой коррекции генов существенным является проникновение химерапласт-олигонуклеотида в клетку. Примерами других внутриклеточно действующих нуклеиновых кислот являются такие, которые взаимодействуют с клеточными ферментами, в особенности с теломеразами (Norton и др., Biotechn., 14, 615 (1996)). Следующим классом нуклеиновых кислот являются нуклеиновые кислоты, предпочтительно двухцепочечные ДНК, которые могут кодировать определенные протеины, внутриклеточно экспрессирующиеся с точки зрения генной терапии.
Например, проникновение олигонуклеотида in vitro в клетку, например, путем простого добавления олигонуклеотида в среду клеточной культуры, представляет собой относительно неэффективный процесс, так как фактически только небольшая часть добавленного олигонуклеотида проникает в клетку. Процесс проникновения длится многие часы и чаще всего лишь спустя 8-16 часов достигается "плато"-фаза. Считают, что проникновение олигонуклеотидов подобно процессу эндоцитоза. Общая проблема проникновения через эндоцитоз заключается, однако, в том, что большая часть олигонуклеотидов присутствует не в свободном состоянии в цитоплазме, а находится включенной в определенные клеточные структуры, лизосомы и эндосомы. Это распределение в виде точки в случае флуоресцентномаркированных олигонуклеотидов также можно в самом деле наблюдать флуоресцентномикроскопически. За счет этой везикулярной локализации концентрация свободного олигонуклеотида, который фактически доступен для гибридизации с мРНК, сильно снижена. Кроме того, в зависимости от типа клетки и имеющихся условий, вообще только определенная доля клеток "захватывает" олигонуклеотид. Поэтому для эффективного использования антисмысловых олигонуклеотидов их применяют в общих смесях с усилителями пенетрации, как, например, катионные липиды (Bennet и др., Mol. Pharmacol., 41, 1023 (1992)).
Задача настоящего изобретения состоит в увеличении проникновения в клетки молекул, в особенности макромолекул, как, например, олигонуклеотида.
Исследование проникновения в клетки олигонуклеотидов осуществляют, в общем, либо с помощью радиоактивномеченых, либо флуоресцентномаркированных олигонуклеотидов. Флуоресцентную маркировку олигонуклеотида осуществляют, например, путем введения во взаимодействие аминогруппы олигонуклеотида с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC). Флуоресцеин можно вводить, например, в 3'-конец олигонуклеотида с помощью коммерчески доступного, дериватизированного флуоресцеином твердофазного носителя или в 5'-конец с помощью коммерчески доступного реагента флуоресцеинфосфитилирования. Во всех случаях связанный с олигонуклеотидом флуоресцеин благодаря карбоксильной группе находится в виде отрицательно заряженного структурного элемента, который является сильно флуоресцирующим.
В противоположность флуоресцеину флуоресцеиндиацетат (FDA) представляет собой нейтральный витальный краситель, который только после расщепления обеих сложноэфирных групп и раскрытия лактонового кольца превращается в флуоресцирующий флуоресцеин, который, однако, в форме лактона еще не обладает никакой флуоресценцией.
Известно, что FDA (ниже называемый также как "F3") в виде нейтральной нефлуоресцирующей молекулы проникает в живые клетки за счет пассивной диффузии и внутриклеточно расщепляется эстеразами с образованием флуоресцирующего флуоресцеина (Breeuwer и др., Appl. Environ. Microbiol., 61, 1614 (1995); Maeda и др., Cell Struct. Funct., 7, 111 (1982)). До сих пор описаны только FDA-производные, которые содержат реакционноспособную аминогруппу, как, например, изотиоцианатную группу; эти FDA-производные используют для окрашивания внутриклеточных протеинов или клеточных компонентов. Сверх того, до сих пор не описаны никакие конъюгаты FDA с другими молекулами, соответственно, до сих пор также не описаны маркированные с помощью FDA олигонуклеотиды (конъюгаты из FDA и олигонуклеотида).
В цитоплазме FDA расщепляется эстеразами за счет маркировки с помощью FDA олигонуклеотида, поэтому можно определять долю "свободного" олигонуклеотида, то есть, сколько олигонуклеотида находится в цитоплазме и сколько доступно для гибридизации, по отношению к доле олигонуклеотида, который находится в везикулах ("включенный" олигонуклеотид) и поэтому недоступен для гибридизации. Вследствие, в целом, большого количества отрицательных зарядов в олигонуклеотиде и того факта, что маркированные с помощью FDA и маркированные флуоресцеином олигонуклеотиды (в случае, когда олигонуклеотид является одним и тем же) различаются только нетто-зарядом, можно было ожидать, что маркированные с помощью FDA и маркированные флуоресцеином олигонуклеотиды обладают очень похожим проникновением в клетку и распределением.
Однако, неожиданно показано, что маркированные с помощью FDA и маркированные флуоресцеином олигонуклеотиды отчетливо различаются в отношении их проникновения в клетки, а именно как в отношении продолжительности, так и в отношении эффективности проникновения олигонуклеотидов, и, сверх того, также в отношении локализации проникших олигонуклеотидов в клетке. Маркированный с помощью FDA олигонуклеотид проникает в клетки намного быстрее, чем соответствующий, маркированный флуоресцеином олигонуклеотид. В то время как проникновение радиоактивномеченых и маркированных флуоресцеином олигонуклеотидов требует нескольких часов, маркированные с помощью FDA олигонуклеотиды после ординарной инкубации, например, с человеческими клетками, уже спустя пять минут обнаруживают внутри клеток. Неожиданным также оказалось то, что маркированные с помощью FDA олигонуклеотиды проникают почти во все клетки (>90% клеток), в то время как в случае до сих пор описанных методов введения олигонуклеотидов или полинуклеотидов в клетки скорость проникновения, в общем, значительно ниже; часто там только примерно 30-60% клеток нагружаются олигонуклеотидами. Предпочтительным также является внутриклеточное распределение маркированных с помощью FDA олигонуклеотидов, которое намного равномернее. Это более равномерное распределение указывает на то, что олигонуклеотиды не находятся, как описано выше, большей частью в везикулах (например, в эндосомах, лизосомах), а распределены по всей клетке, то есть, находятся в цитозоли и в ядре; это является косвенным доказательством того, что большая часть находится в виде "свободного" олигонуклеотида. Только эти "свободные" олигонуклеотиды доступны для связывания с мишенью (молекула-мишень, нуклеиновая кислота-мишень) или в виде биологически активного вещества. Преимуществом также является то, что при использовании маркированных с помощью FDA олигонуклеогидов не наблюдают никакого повреждения клеток; в противоположность этому использование липокатионных усилителей пенетрации часто приводит к повреждениям клеточных мембран. Вследствие этих неожиданных свойств маркированные с помощью FDA олигонуклеотиды, по сравнению с до сих пор описанными методами введения в клетки олигонуклеотидов, соответственно, полинуклеотидов, обладают основным преимуществом, заключающимся в том, что они эффективнее могут проникать в клетки и там также лучше доступны. Благодаря этому маркированные с помощью FDA олигонуклеотиды обладают отчетливо повышенной биологической активностью. Благодаря повышенной биологической активности нужно использовать меньше олигонуклеотида. Благодаря этому и на основании того факта, что маркированный с помощью FDA олигонуклеотид эффективнее как в количественном отношении, так и по времени проникновения в клетку, снижаются (токсичные) побочные действия.
Неожиданно показано, что полезные свойства не ограничены маркированными с помощью FDA олигонуклеотидами, а практически каждая молекула за счет маркировки с помощью FDA, то есть благодаря тому, что транспортируемая молекула связана или конъюгирована с FDA ("FDA-конъюгат"), может эффективно проникать в клетку или транспортироваться через биологическую мембрану. Далее показано, что этот принцип не ограничен FDA-конъюгатами, а распространяется на все конъюгаты сложных ариловых эфиров, которые обладают определенной химической структурой. Настоящее изобретение, таким образом, относится к новому принципу транспорта молекул через биологические мембраны. Так как эти соединения до сих пор в уровне техники практически не описаны, объектом настоящего изобретения также являются соответствующие конъюгаты - транспортируемая молекула, связанная или, соответственно, конъюгированная со сложным ариловым эфиром определенной химической структуры. Эти конъюгаты нельзя получать известными способами; объектом настоящего изобретения поэтому является также способ получения конъюгатов.
Известны биообратимые O-ациларил-конъюгаты, которые предложены в качестве пролекарств на основе олигонуклеотидов (lyer и др., Bioorganic and Med. Chem. Lett., 7, 871-876 (1997)). Эти соединения - в случае, когда арильный остаток представляет собой шестичленное ароматическое кольцо - по своей химической структуре подобны предлагаемым согласно изобретению конъюгатам. В случае биообратимых O-ациларил-конъюгатов, гидролиз сложного эфира, однако, вызывает дестабилизацию связи между арильным остатком и фосфотриэфиром олигонуклеотида, так что биообратимый O-ациларил-конъюгат расщепляется на свои составные части, то есть на свободный олигонуклеотид и O-ациларильный остаток. Эта пролекарственная концепция служит для того, чтобы маскировать отрицательный заряд межнуклеотидфосфатного мостика и благодаря этому облегчать проникновение олигонуклеотида в клетку. В противоположность предлагаемым согласно изобретению конъюгатам, в случае этих пролекарств, однако, не установлено никакого ускоренного проникновения олигонуклеотидов в клетки и также никакого измененного внутриклеточного распределения олигонуклеотидов. Далее не сообщается о проникновении олигонуклеотидов в другие организмы. В противоположность этому в случае предлагаемых согласно изобретению конъюгатов сохраняется ковалентная связь между арильным остатком и олигонуклеотидом при проникновении в клетку; образование ковалентной связи между арильным остатком и олигонуклеотидом можно легко установить флуоресцентномикроскопически, а ароматическое звено, как, например, в случае FDA, лишь после расщепления сложного эфира обладает флуоресценцией.
Объектом настоящего изобретения является конъюгат, который состоит по меньшей мере из одной транспортируемой молекулы и по меньшей мере одного арильного остатка формулы (I):
причем
арил означает группу, которая содержит по меньшей мере один ароматический цикл;
Х означает О или N; предпочтительно Х=О;
Y означает O, S или NH-R2; предпочтительно Y=О;
R1 означает замещенный или незамещенный (С1-С23)-алкильный остаток, который может быть линейным или разветвленным и может содержать двойные и/или тройные связи, например арилалкил;
R2 означает замещенный или незамещенный (C1-C18)-алкильный остаток, который может быть линейным или разветвленным и может содержать двойные и/или тройные связи; и
n означает целое число, больше или равное 1,
причем арильный остаток связан с транспортируемой молекулой либо непосредственно через химическую связь, либо опосредованно через химическую группу; причем химическая группа не является СН2-S-группой, когда связывание транспортируемой молекулы происходит через межнуклеотидфосфодиэфирную связь.
Транспортируемой молекулой может быть любая молекула. Транспортируемая молекула предпочтительно имеет молекулярную массу = 350 Дальтон. Одна форма осуществления изобретения относится к конъюгатам, в случае которых транспортируемой молекулой является макромолекула, например, с молекулярной массой = 500 Дальтон, предпочтительно >1000 Дальтон, особенно предпочтительно >2000 Дальтон или больше. Транспортируемая молекула может представлять собой также низкомолекулярное соединение, например, с молекулярной массой <500 Дальтон, предпочтительно с молекулярной массой от 350 до 500 Дальтон. Низкомолекулярное соединение может представлять собой мононуклеотид.
Транспортируемая молекула может относиться к различным химическим классам веществ, например, она может представлять собой биополимер, например полинуклеотид, предпочтительно олигонуклеотид, полипептид, предпочтительно пептид или протеин, пептид-нуклеиновую кислоту (PNA) или полиамид, который содержит три ароматических цикла: имидазол, пиррол и гидроксипиррол (Kielkopf и др., Science, 282, 111-115 (1998)), или полисахарид, предпочтительно олигосахарид, или одно из производных указанных выше соединений. Транспортируемая молекула может быть пептидным миметиком.
Полинуклеотиды, олигонуклеотиды и мононуклеотиды являются либо встречающимися в природе нуклеиновыми кислотами, либо их известными производными. Под производными понимают, в частности, производимые от транспортируемой молекулы, или конъюгата, соли, в особенности их физиологически приемлемые соли, и также, например, модифицированные, или соответственно, стабилизированные нуклеиновые кислоты.
Транспортируемая молекула может представлять собой ингибитор факторов транскрипции, как, например, NF-KВ, c-fos или c-jun; протеинов клеточного цикла, как, например, циклин D; киназ, как c-Src, тирозин- или МАР-киназы; внутриклеточных ионных каналов; иммунофилинов, как, например, протеины связывания FK506, пролил-4-гидроксилаза; топоизомераз, вирусных протеаз, протеинов устойчивости к многочисленным лекарственным средствам, фосфатаз, как, например, протеин-тирозин-фосфатаза.
Транспортируемая молекула может быть конъюгирована с одним или несколькими арильными остатками, например с двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью, десятью, пятнадцатью, двадцатью или более арильными остатками.
Арильный остаток ("арильный остаток" означает в особенности арильный остаток формулы (I) и/или арильный остаток формулы (II)) может быть однократно или многократно связан с транспортируемой молекулой, причем связи могут быть локализованы в разных положениях арильного остатка. Если с транспортируемой молекулой связаны несколько арильных остатков, то они могут быть одинаковыми или различными.
Арильный остаток содержит арильную группу (в формулах (I) и (II) обозначается как "арил"); арильная группа может состоять из одного или нескольких циклов, причем, однако, по меньшей мере один из циклов имеет ароматическую природу. Арильная группа также может содержать гетероциклы, которые могут быть ароматическими. Арильная группа содержит, например, 1-8 или более циклов ("циклическая система"), предпочтительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 циклов. Отдельные циклы являются 3-7-членными, предпочтительно 5-6-членными. Примерами циклических систем являются фенильные, пиридинильные, пиримидинильные, пирролильные, фуранильные, тиофенильные циклы, 5-членные лактоны, 6-членные лактоны, спиролактоны, бензохиноны, циклогексадиенилы и циклогексенилы. Эти циклические системы, арильная группа или, соответственно, отдельные циклы арильной группы могут быть однократно или многократно замещены. По меньшей мере один из циклов арильной группы предпочтительно связан с ацильным остатком.
Арильная группа может отвечать, например, одной из формул: F1', F2', F3', F4', F6', F7', F8', F9', F10', F11'. Эти формулы представлены на фиг.1.
Арильный остаток может быть связан с транспортируемыми молекулами непосредственно или через химическую группу. Объектом изобретения является конъюгат, причем химическая группа вместе с арильным остатком отвечает формуле (II):
причем арил, X, Y и R1 имеют указанное выше значение и
R3 означает химическую группу, причем R3 предпочтительно означает группу -С(=O) или группу -NH-C(=S).
Примерами арильных остатков формулы (II) являются арильные остатки формул F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9, F10 и F11; эти формулы представлены на фиг.2а и на фиг.2b.
Согласно особой форме выполнения транспортируемой молекулой является олигонуклеотид. Олигонуклеотид может быть сконструирован, например, полностью из нуклеотидов, как аденозинфосфат, гуанозинфосфат, инозинфосфат, цитидинфосфат, уридинфосфат и тимидинфосфат. Согласно другим формам осуществления изобретения олигонуклеотид, в случае необходимости, может содержать одну или несколько модификаций, например химические модификации. Олигонуклеотид может обладать несколькими одинаковыми и/или разными модификациями.
Примеры химических модификаций известны специалисту и описаны, например, в работах: Е.Uhlmann и A.Peyman, Chemical Reviews, 90, 543 (1990); "Protocols for Oligonukleotides and Analogs" Synthesis and Properties and Synthesis and Analytical Techniques, ред. S. Agrawal, изд. Humana Press, Totowa, США, 1993 г., и Hunziker и С. Leumann "Nucleic Acid Analogs: Synthesis and Properties" в книге "Современные методы синтеза" (ред. Beat Ernst и С. Leumann), изд. Helvetica Chimica Acta, Базель, с.331-417.
Химическая модификация олигонуклеотида, например, может включать:
а) полную или частичную замену диэфирных мостиков фосфорной кислоты, например, фосфортиоатными, фосфордитиоатными, NR1R'-фосфорамидатными, боранофосфатными, фосфат-(C1-C21)-O-алкилэфирными, фосфат-[(C6-C12)-арил-(C1-C21)-O-алкил]эфирными, (С1-С8)-алкилфосфонатными и/или (C6-C12)-арилфосфонатными мостиками, причем
R1 и R', независимо друг от друга, означают атом водорода, (C1-C18)-алкил, (С6-С20)-арил, (C6-C20)-арил-(C1-C8)-алкил, предпочтительно атом водорода, (C1-C8)-алкил и/или метоксиэтил, особенно предпочтительно атом водорода, (C1-C4)-алкил и/или метоксиэтил;
или
R1 и R' вместе с соединенным с ними атомом азота образуют 5-6-членный гетероцикл, который дополнительно может содержать другой гетероатом из ряда О, S, N;
b) полную или частичную замену 3'- и/или 5'-диэфирных мостиков фосфорной кислоты "дефосфо"-мостиками (описано, например, Е.Uhlmann и A.Peyman в книге " Methods in Molecular Biology", том 20, "Protocols for Oligonukleotides and Analogs", ред S. Agrawal, изд. Humana Press, Totowa, 1993, глава 16, с.355 и последующие), например, формацетальными, 3'-тиоформацетальными, метилгидроксиламиновыми, оксимными, метилендиметилгидразо-, диметиленсульфоновыми и/или силильными группами;
c) полное или частичное восстановление группы (Rückgrat) фосфата сахара, например, "морфолино"-олигомерами (описано, например, Е.Р. Stirchak и др., Nucleic Acids Res., 17, 6129 (1989); и J.Summerton и D. Weller, Antisence and Nucleic Acid Drug Dev., 1, 187-195 (1997)) и/или полиамиднуклеиновыми кислотами ("PNA") (описано, например, Р.Е. Nielson и др., Bioconj. Chem., 5, 3 (1994)) и/или фосфомоноэфирами нуклеиновых кислот ("PHONA") (описано, например, Peyman и др., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 35, 2632-2638 (1996));
d) полную и/или частичную замену β-D-2'-дезоксирибозных единиц, например, α-D-2'-дезоксирибозой, L-2'-дезоксирибозой, 2'-F-2'-дезоксирибозой, 2'-О-(С1-С6)-алкилрибозой, 2'-O-(C2-С6)-алкенилрибозой, 2'-[О-(C1-C6)-алкил-O-(C1-C6)-алкил]рибозой, 2'-NH2-2'-дезоксирибозой, β-D-ксилофуранозой, α-арабинозой, 2,4-дидезокси-β-D-эритрогексопиранозой, конформационно ограниченными аналогами сахара, как LNA (пространственно затрудненные нуклеиновые кислоты; Singh и др., Chem. Commun., 4, 455 (1998); Singh и др., Chem. Commun., 12, 1247 (1998)) и карбоциклическими (описано, например, Froehler, J. Am. Chem. Soc., 114, 8320 (1992)) и/или аналогами сахара с открытой цепью (описано, например, Vandendriessche и др.. Tetrahedron, 49, 7223 (1993)), и/или бициклическими аналогами сахара (описано, например, М. Tarkov и др., Helv. Chim. Acta, 76, 481 (1993));
е) модификацию или соответственно полную или частичную замену природных нуклеозидных оснований, например, 5-(гидроксиметил)урацилом, 5-аминоурацилом, псевдоурацилом, псевдоизоцитозином, дигидроурацилом, 5-(C1-C6)-алкилурацилом, 5-(С2-С6)-алкенилурацилом, 5-(С2-С6)-алкинилурацилом, 5-(C1-C6)-алкилцитоэином, 5-(С2-С6)-алкенилцитозином, 5-(С2-С6)-алкинилцитозином, 5-фторурацилом, 5-фторцитозином, 5-хлорурацилом, 5-хлорцитозином, 5-бромурацилом, 5-бромцитозином или 7-деаза-7-замещенными пуринами.
Химическая модификация олигонуклеотида включает, далее, связывание олигонуклеотида с одной или несколькими другими молекулами, которые благоприятно влияют на особые свойства олигонуклеотида, как, например, стабильность нуклеазы, сродство к последовательности-мишени и фармакокинетика, например, при гибридизации модифицированного олигонуклеотида с последовательностью-мишенью они действуют путем связывания и/или поперечной сшивки. Примерами таких других молекул являются поли-L-лиэин; интеркаляторы, как пирен, акридин, феназин и фенантридин; флуоресцирующие соединения, как флуоресцеин; кросс-линкеры, как псорален и азидопрофлавин; липофильные молекулы, как (C12-C20)-алкильные группы, предпочтительно (C12-C20)-алкильные группы; липиды, как 1,2-дигексадецил-гас-глицерин; стероиды, как холестерин или тестостерон; витамины, как витамин Е; поли- или олигоэтиленгликоль, (C12-C18)-алкилфосфатные диэфиры, предпочтительно (C14-C18)-алкилфосфатные диэфиры, и -O-CH2-СН (ОН)-О-(C12-C18)-алкильные группы, предпочтительно -O-CH2-СН (ОН)-О-(C12-C18)-алкильные группы. Эти другие молекулы могут быть конъюгированы с 5'- и/или 3'-концом и/или с внутренней частью последовательности, например, с нуклеозидным основанием. Способы получения такого рода модифицированных олигонуклеотидов известны специалистам в данной области и описаны, например, Е.Uhlmann и A.Peyman, Chem. Rev., 90, 543 (1990) и/или М. Manoharan "Antisense Research and Applications", ред. Crooke и Lebleu, CRC Press, Boca Raton, 1993, глава 17, с.303 и последующие; и/или в заявке ЕР-А-0552766.
Далее, согласно особой форме осуществления изобретения, олигонуклетид на 3'- и/или 5'-конце может обладать 3'-3'- и/или 5'-5'-инверсиями. Этот тип химической модификации известен специалистам в данной области и описан, например, М. Кода и др., J. Org. Chem., 56, 3757 (1991).
В случае конъюгата, который состоит из одного или нескольких олигонуклеотидов и одного или нескольких арильных остатков, предпочтительно формулы (I) или формулы [II), связывание (конъюгацию) арильных остатков с олигонуклеотидом можно осуществлять, например, по 5'-концу (А), по 3'-концу (F), по гетероциклическому основанию (Е и G), по сахару (С) или по межнуклеозидному мостику (В) олигонуклеотида. Связывание, например можно, однако, также осуществлять через ненуклеотидные структурные элементы, например случай (D). Эти примеры представлены на фиг.3.
Указанные модификации, соответственно, можно также конечно использовать в случае более длинных полинуклеотидов и, в общем и целом, в случае пригодных моно-, или соответственно, динуклеотидов, или соответственно, -нуклеозидов.
Олигонуклеотиды имеют длину, например, от 8 до 50 нуклеотидов, предпочтительно 10-20 нуклеотидов. Однако, также пригодны более длинные олигонуклеотиды, или соответственно, полинуклеотиды, например, длиной 50-10000 нуклеотидов, предпочтительно 100-1000 нуклеотидов, которые, в случае необходимости, могут быть также двухцепочечными.
Олигонуклеотиды могут иметь любую последовательность. Последовательность олигонуклеотида выбирают, или соответственно, обозначают, в зависимости от выбранной мишени, то есть, в случае, если мишенью является нуклеиновая кислота, то в зависимости от ее последовательности, или в случае, если мишенью является протеин, то в зависимости от нуклеотидной последовательности, которая кодирует этот протеин-мишень. Если, например, мишенью является вирус, например вирус цитомегалий (CMV), ВИЧ, вирус гепреса человека 1 (HSV-1), вирус герпеса человека 2 (HSV-2), вирус гриппа, VSV, вирус гепатита В или вирус папилломы, тогда олигонуклеотид может иметь, например, одну из следующих последовательностей:
a) против вируса цитомегалии:
последовательность №12: 5'-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3'
b) против ВИЧ, например:
последовательность №13: 5'-ACACCCAATTCTGAAAATGG-3' или
последовательность №14: 5'-AGGTCCCTGTTCGGGCGCCA-3' или
c) против вируса герпеса человека 1, например, последовательность №15: 5'-GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3'
Мишенью может быть, например, протеин, который принимает участие в возникновении рака, или является ответственным за рост раковой опухоли. Примерами таких мишеней являются:
1) нуклеарные онкопротеины, как, например, c-myc, N-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, PCNA, p120;
2) цитоплазматические/ассоциированные с мембраной онкопротеины, как, например, EJ-ras, c-Ha-ras, N-ras, rrg, bcl-2, cdc-2, c-raf-1, c-mos, c-src, c-abl, c-ets;
3) клеточные рецепторы, как, например, EGF-рецептор, Her-2, с-erbA, VEGF-рецептор (KDR-1), ретиноидные рецепторы, протеинкиназная регуляторная субъединица, c-fms, Tie-2, c-raf-1-киназа, РКС-альфа, протеинкиназа А (R1-альфа);
4) цитокины, факторы роста, внеклеточные матрицы, как, например, CSF-1, IL-6, IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, bFGF, VEGF, миелобластин, фибронектин.
Олигонуклеотиды, которые направлены против таких мишеней, могут иметь, например, следующую последовательность оснований:
a) против c-Ha-ras, например:
последовательность №16: 5'-CAGCTGCAACCCAGC-3' или
последовательность №17: 5'-TATTCCGTCAT-S' или
последовательность №18: 5'-TTCCGTCATCGCTCCTCAGGGG-3'
b) против bFGF, например:
последовательность №19: 5'-GGCTGCCATGGTCCC-3'
c) против с-myc, например:
последовательность №20: 5'-GGCTGCTGGAGCGGGGCACAC-3'
последовательность №21: 5'-AACGTTGAGGGGCAT-3'
d) против c-myb, например:
последовательность №22: 5'-GTGCCGGGGTCTTCGGGC-3'
e) против c-fos, например:
последовательность №23: 5'-CGAGAACATCATCGTGG-3'
последовательность №24: 5'-GGAGAACATCATGGTCGAAAG-3'
последовательность №25: 5'-CCCGAGAACATCATGGTCGAAG-3'
последовательность №26: 5'-GGGGAAAGCCCGGCAAGGGG-3'
f) против р120, например:
последовательность №27: 5f-CACCCGCCTTGGCCTCCCAC-3'
g) против EGF-рецептора, например:
последовательность №28: 5'-GGGACTCCGGCGCAGCGC-3'
последовательность №29: 5'-GGCAAACTTTCTTTTCCTCC-3'
h) против супрессора опухоли р53, например:
последовательность №30: 5'-GGGAAGGAGGAGGATGAGG-3'
последовательность №31: 5'-GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG-3'
i) против bcl-2
последовательность №32: 5'-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3'
k) против VEGF
последовательность №33: 5'-GCGCTGATAGACATCCATG
последовательность №34: 3'-CCAGCCCGGAGG-5',5'-GGAGGCCCGACC-3'
последовательность №35: 3'-CGGAGGCTTTGG-5',5'-GGTTTCGGAGGC-3'
последовательность №36: 3'-GATGGAGGTGGT-5',5'-TGGTGGAGGTAG-3'
последовательность №37: 3'-GGAGGTGGTACG-5',5'-GCATGGTGGAGG-3'
последовательность №38: 3'-GGTGGTACGGTT-5',5'-TTGGCATGGTGG-3'
последовательность №39: 3'-CACCAGGGTCCG-5',5'-GCCTGGGACCAC-3'
последовательность №40: 3'-CCAGGGTCCGAC-5',5'-CAGCCTGGGACC-3'
последовательность №41; 3'-AGGGTCCGACGT-5',5'-TGCAGCCTGGGA-3'
последовательность №42; 3'-GGGTCCGACGTG-5',5'-GTGCAGCCTGGG-3'
последовательность №43: 3'-GGTCCGACGTGG-5',5'-GGTGCAGCCTGG-3'
последовательность №44: 3'-CCGACGTGGGTA-5',5'-ATGGGTGCAGCC-3'
последовательность №45; 3'-GTAGAAGTTCGG-5',5'-GGCTTGAAGATG-3'
последовательность №46: 3'-ACGCCCCCGACG-5',5'-CCAGCCCCCGCA-3'
или
последовательность №47: 3'-CCCCCGACGACG-5',5'-GCAGCAGCCCCC-3'
l) против c-raf-киназы
последовательность №48: 5'-TCCCGCCTGTGACATGCATT
m) против РКС-альфа
последовательность №49: 5'-GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA
n) против протеинкиназы А
последовательность №50: 5'-GCGTGCCTCCTCACTGGC
Если мишенью является интегрин или рецептор адгезии клетка-клетка, как, например, VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM или ELAM, то олигонуклеотид может иметь, например, одну из следующих последовательностей:
a) VLA-4, например:
последовательность №51: 5'-GCAGTAAGCATCCATATC-3'
b) ICAM-1, например:
последовательность №52: 5'-GCCCAAGCTGGCATCCGTCA
последовательность №53: 5'-СССССАССАСТТССССТСТС-3'
последовательность №54: 5'-СТСССССАССАСТТССССТС-3'
последовательность №55: 5'-GCTGGGAGCCATAGCGAGG-3'
c) ELAM-1, например:
последовательность №56: 5'-ACTGCTGCCTCTTGTCTCAGG-3'
последовательность №57: 5'-CAATCAATGACTTCAAGAGTTC-3'
d) альфа-интегрин (V)
последовательность №58: 5'-GCGGCGGAAAAGCCATCG
Если мишень представляет собой протеин, который является ответственным за пролиферацию или миграцию, или соответственно, принимает участие в этих процессах или этом процессе, как, например:
1) нуклеарные трансактиваторные протеины и циклины, как, например, c-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, циклины и cdc-2-киназа;
2) митогены или факторы роста, как, например, PDGF, bFGF, VEGF, EGF, HB-EGF и TGF-β;
3) клеточные рецепторы, как, например, bFGF-рецептор, EGF-рецептор и PDGF-рецептор,
тогда олигонуклеотид может иметь, например, одну из следующих последовательностей оснований:
a) c-myb
последовательность №59: 5'-GTGTCGGGGTCTCCGGGC-3'
b) c-myc
последовательность №60: S'-CACGTTGAGGGGCAT-3'
c) cdc-2-киназа
последовательность №61: 5'-GTCTTCCATAGTTACTCA-3'
d) PCNA (нуклеарный антиген пролиферирующей клетки крысы)
последовательность №62: S'-GATCAGGCGTGCCTCAAA-3'
Если мишенью является, например, аденозин-А1-рецептор, аденозин-А3-рецептор, брадикинин-рецептор или IL-13, то возможна, например, последовательность оснований:
последовательность №63: 5'-GATGGAGGGCGGCATGGCGGG.
Были получены следующие олигонуклеотиды (5'→3'):
ON1: 5'-d(G*CGAC*GC*CAT*GAC*G*G) последовательность №1
ON2: 5'-d(C*GAC*GC*CAT*G*A*C) последовательность №2
ON3: 5'-d(A*T*GAC*GGAA*T*T*C) последовательность №3
ON4: 5'-d(TATTCCGTCAT) последовательность №4
ON5: 5'-(dA)20 последовательность №5
ON6: 5'-(dA)50 последовательность №6
ON7: 5'-(dA)80 последовательность №7
ON8: 5'-T*T*CC*AT*GG*TG*G*C последовательность №8
ON9: 5'-T*T*CA*CT*GT*GG*G*C последовательность №9
ON10: 5'-T*G*GC*GC*CG*GG*C*C последовательность №10
ON11: 5'-T*G*CC*GG*CC*GG*G*C последовательность №11
причем знак * указывает положения, в которых фосфодиэфирный мостик заменен фосфортиоатным межнуклеозидным мостиком.
Эти последовательности были превращены в следующие конъюгаты (КО):
KO_1: FS-Li1-ON1
KO_2: F0-Li1-ON1
KO_3: F3-Li1-ON2
KO_4: F0-Li1-ON2
KO_5: F3-Li1-ON3
KO_6: F9-Li1-ON3
KO_7: F2-Li1-ON3
KO_8: F0-Li1-ON3
KO_9: F3-Li1-ON3-родамин
KO_10: F9-Li1-ОN3-родамин
KO_11: F6-Li1-ОN3-родамин
KO_12: F0-Li1-ОN3-родамин
KO_13: F3-Li1-ON4
KO_14: F3-Li1-ON5
KO_15: F3-Li1-ON6
KO_16: F3-Li1-ON7
KO_17: F3-Li1-ON8
KO_18: F3-Li1-ON9
KO_19: F3-Li1-ON10
KO_20: F3-Li1-ON11
KO_21: F7-Li1-ON3
причем
"F1-F1" означают арильные остатки формул F1-F11 (см., например, фиг.2);
"Li1" означает 6-аминогексилфосфатный остаток, который связан с 5'-концом олигонуклеотида (см., например, Приложение 4);
"ON1-ON11" означают описанные олигонуклеотиды с последовательностями от последовательности №1 до последовательности №11;
и "родамин" означает обнаруживаемую наряду с флуоресцеином родаминовую маркировку на 3'-конце олигонуклеотида.
Объектом изобретения также является способ получения предлагаемых согласно изобретению конъюгатов. Изобретение относится к способу получения конъюгата, который содержит транспортируемую молекулу и по меньшей мере один арильный остаток, предпочтительно формул (I) или (II), причем:
a) получают транспортируемую молекулу, которая содержит реакционноспособную функциональную группу в положении, с которым должен быть связан арильный остаток;
b) получают арильный остаток и
c) транспортируемую молекулу вводят во взаимодействие с арильным остатком до получения конъюгата.
Реакционноспособной функциональной группой предпочтительно является аминогруппа, меркаптогруппа, хлорацетильная группа, изоцианатная группа, изотиоцианатная группа, карбоксильная группа, N-гидроксисукцинимидная группа или хлорангидридная группа карбоновой кислоты. Взаимодействие транспортируемой молекулы с арильным остатком осуществляют при значении рН≤7,5, особенно предпочтительно при значении рН≤7,3, более предпочтительно при значении рН около 7 или при более низком значении рН, например, при значении рН≤7, предпочтительно при значении рН≤6,5. В случае этих реакций сочетания все другие реакционноспособные группы перед реакцией нужно защищать с помощью известных специалистам в данной области защитных групп.
Согласно особой форме осуществления способа транспортируемой молекулой является полинуклеотид, олиногуклеотид или мононуклеотид.
Способ получения включает на первой стадии получение транспортируемой молекулы. В этой связи изобретение относится также к способу получения олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды можно получать с помощью различных известных химических способов, как, например, описано F.Eckstein "Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach", изд. IRL Press, Оксфорд. Олигонуклеотиды можно также получать способами, которые включают, в случае необходимости, одну или несколько ферментативных стадий. Получение олигонуклеотидных конъюгатов в принципе описано в литературе (J.Goodchild, Bioconjugate Chem., 1, 165 (1990); S. Beaucage и R. lyer, Tetrahedron, 49, 1925 (1993); S. Agrawal "Methods in Molecular Biology", том 26: "Protocols for oligonucleotide Conjugates", (1994), Humana Press).
При синтезе олигонуклеотидных конъюгатов согласно формуле (I), однако, нужно обращать внимание на то, что они могут разлагаться в щелочной среде. Поэтому, например, при использовании общепринятых методов невозможен синтез маркированных с помощью FDA олигонуклеотидов в синтезаторе олигонуклеотидов, так как сложноэфирные группы FDA-группы уже гидролизовались бы при обработке аммиаком, которая необходима для отщепления олигонуклеотида от носителя и отщепления аминозащитных групп гетероциклических оснований. Поэтому олигонуклеотид сначала получают в незащищенной форме в виде предшественника и на последней стадии конденсируют с группой согласно формуле (I) (фиг.5). Предшественник олигонуклеотида обладает реакционноспособной или активируемой функциональной группой, которую затем дериватизируют известными специалисту способами с помощью реагента, который содержит предлагаемую согласно изобретению группу согласно формуле (I). В качестве реакционноспособных или, соответственно, активируемых функциональных групп используют, например, аминогруппы, меркаптогруппы, хлорацетильные группы, изо(тио)цианатные группы и карбоксильные группы.
Особенно легко можно вводить в олигонуклеотиды так называемые аминолинкеры с помощью коммерчески доступных реагентов. Аминолинкер-олигонуклеотиды затем, например, вводят во взаимодействие с реакционноспособными реагентами, которые содержат группу согласно формуле (I). Такими реакционноспособными реагентами являются, например, соответствующие изотиоцианаты. Группа согласно формуле (I) в этом случае связана через тиомочевинную группу (Приложение 4). Другими реакционноспособными реагентами являются, например, хлорангидриды карбоновых кислот. Мягкими реакционноспособными реагентами являются, например, N-гидроксисукцинимиды соответствующих карбоновых кислот. Активируемыми реагентами являются, например, соответствующие карбоновые кислоты, которые могут связывать с пептидными реагентами сочетания, как HBTU, TBTU или TOTU. В этом случае группа согласно формуле (I) связана через амидную функциональную группу. В принципе предлагаемые согласно изобретению группы формулы (I) можно вводить в любые положения олигонуклеотида. Предпочтительны указанные на фиг.3 положения.
Синтез модифицированных олигонуклеогидов осуществляют путем конструирования олигонуклеотидной цепи стандартными методами, как твердофазный синтез по фосфорамидитному способу, и дериватизации 5'-конца с помощью коммерчески доступного 5'-амино-модификатора С6 (например, фирма Eurogentec, Seraing, Бельгия).
5'-Амино-модификатор С6 (Mmt = 4-монометокситритил)
После отщепления олигонуклеотидного производного от носителя и удаления всех основных лабильных защитных групп путем обработки аммиаком, монометокситритильную группу отщепляют путем обработки с помощью 80%-ной уксусной кислоты при температуре окружающей среды. Получают 5'-аминогексилфосфат-модифицированный олигонуклеотид. Аминогруппу этого олигонуклеотидного производного затем вводят во взаимодействие с FDA-изотиоцианатом в 0,2 М триэтиламмонийбикарбонатном буфере (ТВК-буфер) при рН=7 в диметилформамиде. Уже спустя примерно от двух до трех часов аминолинкер-олигонуклеотид полностью превращается в желательное FDA-производное (фиг.4). Взаимодействия с флуоресцеинизотиоцианатом обычно осуществляют при рН 8. При этом значении рН, однако, гидролизуется диацетат FDA-группы.
Естественно, также можно использовать другие аминолинкерные реагенты, как, например, 5'-амино-модификатор С3, 5'-амино-модификатор С12, 5'-амино-модификатор 5 или 5'-тиол-модификатор С6 (все выпускаются фирмой Eurogentec).
За счет использования твердых фаз 3'-амино-модификатора, как, например, 3'-амино-модификатор С3 CPG (фирма Eurogentec) можно получать олигонуклеотидные производные с 3'-аминоалкильной группой, которые затем вводят во взаимодействие с FDA-изотиоцианатом. Получают олигонуклеотидное производное, которое содержит связанную с 3'-концом предлагаемую согласно изобретению группу формулы (I).
3'-амино-модификатор С3 CPG (Fmoc = флуоренилметоксикарбонил)
Для введения конъюгата в гетероциклическое основание нуклеозида можно использовать соответствующий амино-модификатор С6 dT (фирма Eurogentec), который производится из тимидина, в синтезе вместо обычного фосфорамидитного структурного элемента. По окончании синтеза олигонуклеотида трифторацетильную защитную группу отщепляют путем обработки аммиаком и свободную аминогруппу в растворе вводят во взаимодействие с FDA-изотиоцианатом.
Амино-модификатор С6 dT
Подобным образом можно вводить предлагаемые согласно изобретению группы формулы (I) в любые положения олигонуклеотидов. Видно, что также возможно многократное введение одинаковых или различных групп.
Согласно способу получения конъюгатов, в котором транспортируемой молекулой является пептиднуклеиновая кислота (PNA), первичную аминогруппу аминоэтильной группы можно вводить во взаимодействие с FDA-изотиоцианатом. Согласно способу получения конъюгатов, в которых транспортируемой молекулой является полипептид, концевую аминогруппу полипептида или аминогруппы лизиновой боковой цепи можно использовать для введения во взаимодействие с FDA-изотиоцианатом.
Объектом настоящего изобретения является также применение конъюгатов, в особенности применение, которое основано на описанных полезных свойствах конъюгатов. Особой формой осуществления изобретения является применение конъюгатов для транспорта молекулы через биологическую мембрану. Изобретение относится также к применению арильных остатков, предпочтительно формул (I) или (II), для транспорта молекулы, с которой связан этот арильный остаток, для транспорта этой молекулы через биологическую мембрану. Биологическая мембрана предпочтительно является составной частью клетки, везикулы или органеллы.
Объектом настоящего изобретения является также способ транспорта молекулы через мембрану, причем:
a) получают конъюгат, в случае которого транспортируемая молекула связана по меньшей мере с одним арильным остатком формулы (I) или формулы (II), и
b) конъюгат инкубируют с мембраной.
В особенности, способ транспорта молекулы в клетку представляет собой способ, согласно которому:
a) получают конъюгат, в котором транспортируемая молекула связана по меньшей мере с одним арильным остатком формул (I) или (II), и
b) конъюгат инкубируют с клеткой,
после чего
c) конъюгат транспортируется в клетку без отщепления арильного остатка.
Это относится в особенности к способам, в которых клетка является эукариотной или прокариотной клеткой, например бактериальная клетка, дрожжевая клетка или клетка млекопитающего, предпочтительно клетка человека. Согласно особым формам осуществления клетка является патологически измененной клеткой, например опухолевой клеткой.
Повышенное проникновение в клетку конъюгатов наблюдали не только в случае клеток млекопитающих, но и также в случае других эукариот и даже прокариот.
Предлагаемые согласно изобретению конъюгаты исследовали с помощью микроскопа в отношении проникновения в живые клетки. Сначала исследовали маркированные с помощью FDA олигонуклеотиды на клеточную доступность KO_1 и KO_3. В качестве известных из уровня техники соединений использовали соответствующие маркированные с помощью флуоресцеина олигонуклеотиды KO_2 и KO_4. KO__1 и KO_3 (FDA-конъюгаты) в течение 5-10 минут проникали во все исследованные живые клеточные культуры животных, в то время как KO_2 и KO_4 (флуоресцеиновые конъюгаты) спустя это время не были обнаружены в живых клетках (таблица 1).
Хотя проникновение в бактерии и дрожжи происходит намного медленнее, чем в клетки млекопитающих, спустя два часа все-таки произошло проникновение предлагаемых согласно изобретению олигонуклеотидов в часть клеток, в то время как обычные, маркированные с помощью флуоресцеина олигонуклеотиды в этих условиях не проникли. Удивительно, что предлагаемые согласно изобретению олигонуклеотиды, в принципе, во все до сих пор исследованные организмы проникали лучше, чем известные олигонуклеотидные производные. Организмы охватывают, в частности, клетки животных, жгутиконосцы, дрожжи, грибки и бактерии (таблица 3).
Далее оказалось, что раковые клетки особенно хорошо "поглощают" олигонуклеотиды. Поэтому применение предлагаемых согласно изобретению олигонуклеотидов особенно пригодно для лечения опухолей. Маркированный с помощью FDA антисмысловой олигонуклеотид KO_1, который направлен против еg5, ингибировал пролиферацию клеток А549 уже путем добавки в среду, в то время как соответствующий немодифицированный антисмысловой олигонуклеотид ON 1 и маркированный флуоресцеином олигонуклеотид KO_2 ингибировали пролиферацию раковых клеток только после переведения в лекарственную форму с усилителями пенетрации, как клеточный фектин.
Изобретение относится к применению конъюгатов, в которых транспортируемой молекулой является олигонуклеотид, для гибридизации с одноцепочечными и/или двухцепочечными нуклеиновыми кислотами, например, ДНК (например гены, кДНК) и/или РНК (например, пре-мРНК, мРНК). Эти конъюгаты могут связываться также специфически к последовательности с внутриклеточными протеинами, как ферменты, например, полимеразы или теломеразы, или с факторами транскрипции. Изобретение относится, далее, к применению таких конъюгатов для модуляции, а также для полного или частичного ингибирования экспрессии определенных генов-мишеней, например, для полного или частичного ингибирования транскрипции и/или трансляции. Изобретение относится также к применению таких конъюгатов в качестве антисмысловых олигонуклеотидов, рибозимов, смысловых олигонуклеотидов, образующих тройную спираль олигонуклеотидов, химерапластов и/или Decoy-олигонуклеотидов. Сверх того, эти конъюгаты можно применять в качестве вспомогательных средств в молекулярной биологии.
Изобретение относится, далее, к применению олигонуклеотидов в качестве лекарственных и/или диагностических средств или, соответственно, к применению олигонуклеотидов для получения лекарственных и/или диагностических средств. Олигонуклеотиды в особенности можно использовать в лекарственных средствах, которые предназначены для профилактики и/или лечения заболеваний, протекающих с экспрессией, или соответственно, сверхпродуцированием определенных генов. Далее олигонуклеотиды можно использовать для диагноза, или соответственно, раннего распознавания таких заболеваний. Так как клеточная доступность для предлагаемых согласно изобретению олигонуклеотидов является очень хорошей, их можно использовать для диагностики in vivo, например, для гибридизации in situ с целыми органами или с интактным организмом.
Объектом изобретения является также лекарственное средство, которое содержит один или несколько конъюгатов согласно изобретению. Объектом изобретения является также диагностическое средство, которое содержит один или несколько конъюгатов согласно изобретению. Объектом изобретения является также тест-набор, который содержит один или несколько конъюгатов согласно изобретению.
Изобретение относится также к применению олигонуклеотидов для детектирования, разделения и амплификации нуклеиновых кислот и их аналогов. Конъюгаты особенно пригодны для обнаружения нуклеиновых кислот в клетках, в особенности в живых клетках. Эти клетки могут быть человеческого или животного происхождения. Конъюгаты особенно пригодны также для указанных в таблице 3 организмов, в особенности для обнаружения патогенных организмов. Предлагаемые согласно изобретению олигонуклеотиды можно использовать в известных технических вариантах амплификации нуклеиновых кислот, в особенности в LMPCR (опосредованная лигированием полимеразная цепная реакция), в "Invader Assay" (товарный знак, Third Wave technologies. Inc., Wisconsin), в TaqMan-системе (товарный знак) и во множественном генотипировании. Предпочтительным также является применение олигонуклеотидов для амплификации нуклеиновых кислот с помощью светоблока для проведения реакций (Light-Cycler), который позволяет осуществлять определение реального времени амплификации. Детектирование по принципу молекулярных "маяков", в случае которых флуоресцентный краситель в несвязанном состоянии не флуоресцирует, так как он "гасится" второй группой в олигомере, представляет собой дальнейшую возможность использования предлагаемых согласно изобретению олигонуклеотидов. Можно, например, FDA-производное (например, на 5'-конце олигонуклеотида) комбинировать с Dabcyl-остатком (например, конъюгированным на 3'-конце), который также после превращения FDA-производного в флуоресцеиновое производное гасит сигнал флуоресценции в несвязанном состоянии. Эти модифицированные с помощью FDA "маяки" посылали бы сигнал флуоресценции лишь после проникновения в клетку и гибридизации с мРНК-мишенью.
Изобретение относится также к применению олигонуклеотидов, соответственно, лекарственных средств, которые содержат эти олигонуклеотиды, для лечения заболеваний, в случае которых причиной являются или принимают участие определенные гены за счет сверхпродуцирования.
Лекарственные средства согласно настоящему изобретению можно применять, например, для лечения заболеваний, вызываемых вирусами, например вирусом цитомегалии, ВИЧ, вирусом герпеса 1, вирусом герпеса 2, вирусом гриппа, VSV, вирусом гепатита В или вирусом папилломы. Лекарственные средства согласно настоящему изобретению пригодны, например, также для лечения рака. Далее лекарственные средства согласно настоящему изобретению пригодны, например, для лечения заболеваний, на которые оказывают влияние интегрины или рецепторы адгезии клетка-клетка, например VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM или ELAM. Лекарственные средства согласно настоящему изобретению также пригодны, например, для предотвращения рестеноза, для лечения витилиго и других заболеваний, связанных с депигментацией или нарушением пигментации (например, кожи, волос, глаз), например альбинизма и псориаза; астмы.
К лекарственным средствам относятся, например, фармацевтические препараты, которые можно вводить
а) перорально, например, в форме таблеток, драже, твердых и мягких желатиновых капсул, растворов, эмульсий или суспензий;
b) ректально, например, в форме суппозиториев, или
с) парентерально, например, в виде растворов для инъекций.
Для приготовления лекарственных средств конъюгаты, например, можно вводить в терапевтически инертные органические и/или неорганические носители; например, в качестве носителей для таблеток, драже и твердых желатиновых капсул можно использовать лактозу, кукурузный крахмал или его производные, жир и стеариновую кислоту или ее соли. В качестве носителей для растворов пригодны вода, многоатомные спирты, сахароза, инвертный сахар и глюкоза; для растворов для инъекций пригодны вода, спирты, многоатомные спирты, глицерин и растительные масла; для суппозиториев пригодны растительные и отвержденные масла, воски, жир и полужидкие многоатомные спирты. Лекарственные средства, кроме того, могут содержать консерванты, растворители, стабилизаторы, смачиватели, эмульгаторы, подслащивающие вещества, красители, вкусовые вещества, соли для изменения осмотического давления, буферы, покровные средства, антиоксиданты, а также, в случае необходимости, другие терапевтические биологически активные вещества.
Лекарственные средства предпочтительно применяют топически или локально, как, например, с помощью катетера или путем ингаляции, или вводят путем инъекций или инфузий. Для инъекции на основе конъюгата приготовляют лекарственную форму в виде жидкого раствора, предпочтительно в физиологически приемлемом буфере, как, например, раствор Хэнка или раствор Рингера. Конъюгат, однако, также можно использовать для получения твердой лекарственной формы и перед употреблением ее растворять или суспендировать. Для систематического введения дозировки предпочтительно составляют от примерно 0,01 мг/кг до примерно 50 мг/кг массы тела и в сутки.
Конъюгаты и/или их физиологически приемлемые соли можно вводить животному, предпочтительно млекопитающему, и в особенности человеку, в качестве лекарственного средства индивидуально, в виде смесей друг с другом или в виде фармацевтических композиций, которые применяют локально, чрескожно, парентерально или энтерально и которые в качестве активного компонента содержат эффективное количество по меньшей мере одного конъюгата, наряду с обычными, фармацевтически приемлемыми носителями и добавками. Композиции обычно содержат примерно от 0,1 масс.% до примерно 90 масс.% терапевтически эффективного соединения. Для лечения кожных заболеваний, как, например, псориаз или витилиго, предпочтительно локальное применение, например, в виде мазей, лосьонов или настоек, эмульсий, суспензий. Лекарственное средство получают само по себе известным образом (см., например, Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publ. Co., Eastin, PA), причем используют фармацевтически инертные неорганические и/или органические носители. Для приготовления пилюль, таблеток, драже и твердых желатиновых капсул можно использовать, например, лактозу, кукурузный крахмал и/или его производные, тальк, стеариновую кислоту и/или ее соли и т.д. Носителями для мягких желатиновых капсул и/или суппозиториев являются, например, жиры, воски, полутвердые и жидкие многоатомные спирты, природные и/или отвержденные масла и т.д. В качестве носителей для приготовления растворов и/или сиропов пригодны, например, вода, сахароза, инвертный сахар, глюкоза, многоатомные спирты и т.д. В качестве носителей для приготовления растворов для инъекций пригодны вода, спирты, глицерин, многоатомные спирты, растительные масла и т.д. В качестве носителей для микрокапсул, имплантатов и/или "палочек" пригодны сополимеры гликолевой кислоты и молочной кислоты. Сверх того пригодны липосомные лекарственные формы, которые известны специалистам в данной области (N. Weiner, Drug Develop. Ind. Pharm., 15, 1523 (1989); "Liposome Dermatics", изд. Springer, 1992), например, HVJ-липосомы (Hayashi, Gene Therapy, 3, 878 (1996)).
Наряду с биологически активными веществами и носителями лекарственное средство может содержать еще добавки, как, например, наполнители, расширители, порофоры, связующие, смазки, смачиватели, стабилизаторы, эмульгаторы, консерванты, подслащивающие вещества, красители, вкусовые вещества или ароматизаторы, загустители, разбавители, буферные вещества, далее растворители, и/или агенты растворения, и/или средства для достижения депо-эффекта, а также соли для изменения осмотического давления, покровные средства и/или антиоксиданты. Они могут также содержать два или несколько различных олигонуклеотидов и/или их физиологически приемлемых солей, а также, далее, наряду по меньшей мере с одним олигонуклеотидом они могут также содержать одно или несколько других терапевтически активных веществ. Дозу можно изменять в широких пределах и в каждом отдельном случае ее нужно приспосабливать к индивидуальным данным.
Описание чертежей
Фиг.1: представлены примеры арильных остатков формулы (I).
Фиг.2а и 2b: представлены примеры арильных остатков формулы (II).
Фиг.3: представлены различные примеры (А, В, С, D, Е, F, G) конъюгации между транспортируемой молекулой (здесь олигонуклеотид) и арильными остатками формулы (I); "R" означает остаток формулы (I); "В" означает гетероциклическое основание.
Фиг.4: показана возможность получения предлагаемого согласно изобретению конъюгата (здесь состоящего из FDA-изотиоцианата и олигонуклеотида).
Фиг.5: показано протекающее во времени проникновение конъюгата KO_5 в REH-клетки из среды, причем была использована один раз среда без сыворотки и один раз среда с сывороткой . Проникновение в клетку определяли с помощью клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (FACS).
Фиг.6: представлено определение проникновения в клетку КО_1 (FDA-конъюгат; ) и KO_2 (FITC-олигомер; ) путем измерения с помощью FACS. Начальная концентрация внеклеточного олигонуклеотидного конъюгата составляет 1 мкМ; О и означают контроли.
Фиг.7: зависимость от длин (олигонуклеотидов) трансфекции FDA-конъюгированных polyA-нуклеотидов в REH-клетки.
Фиг.8: сравнение проникновения в клетку конъюгатов флуоресцеин-диацетат-олигонуклеотид и флуоресцеин-дипивалат-олигонуклеотид;
К39: карбоксифлуоресцеиндиацетат (F3 равен FDA) из
примера 15
К41: карбоксифлуоресцеиндипивалат (F2) из примера
10.
Фиг.9: флуоресцентномикроскопическое исследование проникновения в клетку двукратно маркированного Су3-олигонуклеотид-F3-конъюгата [1 мкМ] при инкубации с REH-клетками. Проникновение спустя 4 часа: слева: флуоресцентная маркировка; в середине: цианиновый краситель; справа: фазово-контрастный снимок; вверху: олигонуклеотид К3; внизу: олигонуклеотид К34.
Примеры
Пример 1 Синтез олигонуклеотидов
Олигонуклеотиды синтезировали в автоматизированном ДНК-синтезаторе (Applied Biosystems, модель 380В или 394) при применении стандартной фосфорамидитной химии и окисления с помощью иода (F. Eckstein (ред.) "Oligonukleotides and Analogues, A Pratical Approach", IRL Press, Оксфорд, 1991). Для введения фосфортиоатных мостиков в смешанные фосфортиоат- и фосфодиэфир-олигонуклеотиды вместо иода окисляли с помощью TETD (тетраэтилтиурамдисульфид) или реагента Beaucage. После отщепления от твердого носителя (CPG или тентагель) и удаления защитных групп с помощью концентрированного раствора NH3 при температуре 55°С в течение 18 часов олигонуклеотиды сначала очищали путем осаждения бутанолом (Sawadogo, Van Dyke, Nucl. Acids Res., 19, 674 (1991)). Олигонуклеотиды очищали путем препаративного гель-электрофореза или FPLC. Затем получали натриевую соль путем осаждения из 0,5 М раствора NaCl с помощью 2,5 объемных частей этанола.
Анализ олигонуклеотидов осуществляли путем:
a) аналитического гель-электрофореза в: 20% акриламида, 8 М мочевины, 45 М трис-боратного буфера, рН 7,0; и/или
b) анализа путем высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ): Waters GenPak FAX, градиент: СН3CN (400 мл), H2O (1,6 л), NaH2PO4 (3,1 г), NaCl (11,7 г), рН 6,8 (0,1 М NaCl), затем CH3CN (400 мл), Н2O (1,61 л), NaH2PO4 (3,1 г), NaCl (175,3 г), рН 6,8 (1,5 М NaCl); и/или
c) капиллярного гель-электрофореза (Beckmann Kapillare еСАР™, колонка с гелем U100P, длина 65 см, внутренний диаметр 100 мм, "окно" на расстоянии 15 см от одного конца; буфер: 140 мкМ Трис, 360 мМ борной кислоты, 7М мочевины; и/или
d) масс-спектрометрии с ионизацией электронным распылением.
Анализ олигонуклеотида показал, что он, в каждом случае, имеет чистоту выше 90%, чаще всего, однако, выше 95%.
Пример 2
Введение 5'-аминолинкера в олигонуклеотид
Олигонуклеотид конструировали как описано в примере 1. После присоединения последнего нуклеотида отщепляли диметокситритильную группу от 5'-конца. Свободную гидроксильную группу вводили во взаимодействие с коммерчески доступным 5'-амино-модификатором С6 (фирма Eurogentec, Seraing, Бельгия) при катализе с помощью тетразола, окисляли йодной водой. Затем олигонуклеотид отщепляли от носителя путем обработки с помощью концентрированного раствора аммиака при температуре 50°С в течение ночи и отщепляли все основные лабильные защитные группы в межнуклеозидных группах и аминогруппах гетероциклических оснований. На последней стадии отщепляли монометокситритильную защитную группу путем обработки в течение 3 часов с помощью 80%-ной уксусной кислоты при температуре окружающей среды. Полученный в результате олигонуклеотид анализировали, как описано в примере 1.
Пример 3
Конъюгация аминолинкер-олигонуклеотида с FDA-изотиоцианатом
10 OD (260) 5'-Аминолинкер-олигонуклеотида из примера 2 растворяли в 16 мкл 0,2 М триэтиламмонийбикарбонатного (ТВК) буфера и смешивали со 125 мкл диметилформамида (ДМФА). К этой смеси добавляли 1,5 мг FDA-изотиоцианата и смесь затем встряхивали в течение 3 часов в отсутствие света. Достижение превращения определяли путем анализа с помощью ВЭЖХ, затем добавляли 2 мкл 80%-ной уксусной кислоты и концентрировали в вакууме. После этого продукт очищали путем осаждения бутанолом. С помощью масс-спектрометрии с ионизацией электронным распылением устанавливали соответствующую молекулярную массу. Образцы всегда хранили при рН ниже 7, в связи с чем не происходило никакого гидролиза ароматического сложного эфира.
Пример 4
Синтез KO_1 (5'-F3-G*CGAC*GC*CAT*-GAC*G*G-3'; F3=FDA)
Олигонуклеотид конструировали исходя из CPG-носителя, который содержал связанным через 3'-конец 1 мкмоль дезоксигуанозина, как описано в примере 1. В обозначенных знаком * положениях окисление осуществляли с помощью реагента Beaucage, чтобы ввести фосфортиоатный мостик. Затем присоединяли 5'-амино-модификатор С6, как описано в примере 2. После удаления защитных групп с помощью концентрированного раствора аммиака и 80%-ной уксусной кислоты получали 96 OD (260) 5'-аминолинкер-G*CGAC*GC*CAT*GAC*G*G-3'.
10 OD (260) 5'-аминолинкер-олигонуклеотида затем, как описано в примере 3, вводили во взаимодействие с FDA-изотиоцианатом. После осаждения бутанолом получали 8 OD (260) желательного, маркированного с помощью FDA олигонуклеотида.
Масс-спектрометрия (ионизация электронным распылением) для динатриевой соли: 5395,93 (рассчитано для динатриевой соли: 5395,09).
Пример 5
Синтез KO_13 (5'-F3-TATTCCGTCAT-3')
Олигонуклеотид конструировали исходя из CPG-носителя, который содержал связанным через 3'-конец 1 мкмоль тимидина, как описано в примере 1. Все окисления осуществляли с помощью йодной воды. Затем присоединяли 5'-амино-модификатор С6, как описано в примере 2. После удаления защитных групп с помощью концентрированного раствора аммиака и 80%-ной уксусной кислоты получали 72 OD (260) 5'-аминолинкер-TATTCCGTCAT-3'. После очистки путем препаративного электрофореза в полиакриламидном геле получали 43 OD (260).
10 OD (260) 5'-аминолинкер-олигонуклеотида затем, как описано в примере 3, вводили во взаимодействие с FDA-изотиоцианатом. После осаждения бутанолом получали 9,1 OD (260) желательного, маркированного с помощью FDA олигонуклеотида.
Масс-спектрометрия (ионизация электронным распылением): 3934,1 (рассчитанная молекулярная масса: 3933,8).
Пример 6
Синтез KO_21 (5'-F7-A*T*GAC*GGAA*T*T*C)
Олигонуклеотид конструировали исходя из CPG-носителя, который содержал связанным через 3'-конец 1 мкмоль бензоилцитидина, как описано в примере 1. Все окисления осуществляли с помощью йодной воды. Затем присоединяли 5'-амино-модификатор С6, как описано в примере 2. После удаления защитных групп с помощью концентрированного раствора аммиака и 80%-ной уксусной кислоты получали 145 OD (260) 5'-аминолинкер-А*Т*GAC*GGAA*Т*Т*С-3'.
10 OD (260) 5'-аминолинкер-олигонуклеотида затем растворяли в 16 мкл 0,2 М ТВК-буфера, 95 мкл диметилформамида и вводили во взаимодействие с 30 мкл предварительно полученного активного сложного эфира п-ацетоксибензойной кислоты. Активный сложный эфир получали путем смешения 50 мкл 0,2 М раствора п-ацетоксибензойной кислоты с 50 мкл 0,3 М TBTU, соответственно, в диметилформамиде, и реакцию проводили в течение 1 часа при температуре окружающей среды. После протекания в течение 4 часов реакции аминолинкер-олигонуклеотида с активным сложным эфиром добавляли 2 мкл полуконцентрированной уксусной кислоты и концентрировали в вакууме. Избыточный реагент удаляли путем осаждения бутанолом. Получали 10,7 OD (260) желательного олигонуклеотидного конъюгата.
Масс-спектрометрия (ионизация электронным распылением): 4109,2 (рассчитанная молекулярная масса; 4108,2).
Пример 7
Исследование проникновения в клетки олигонуклеотидных конъюгатов
Для исследования проникновения в клетки 1 мл суспензии клеток в камере Bachofer в культуральной среде (или после промывки в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) в случае сред с собственной флуоресценцией) при контроле с помощью микроскопа смешивали с 1 мл 1 мкМ раствора олигонуклеотидного конъюгата, причем смешивание осуществляли с помощью пипетки и путем встряхиваний камеры. Микроскопию осуществляли с помощью прибора Zeiss Axiovert 135 TV (100 × Plan-Neofluar) по способу фазового контраста. В качестве флуоресцентного фильтра служили фильтры 09 (450-490/FT 510/LP 520)/HBO 59 W. В качестве стандарта использовали 2,4 мкМ раствор FDA (Aldrich Chem. Co., FW.416.39) в смеси ацетон/ PBS-буффер (1:100; объем/объем). В случае FDA-конъюгатов после проникновения можно прослеживать собственную флуоресценцию образовавшегося за счет расщепления сложного эфира флуоресцеинового лиганда. В случае нефлуоресцирующих лигандов, как ацетоксинафталинкарбоновая кислота, к олигонуклеотиду дополнительно присоединяли пригодную флуоресцентную метку (FITC, родамин, цианиновый краситель Dy 3 или Dy 5). Двойная маркировка, как в KO_9, служила для того, чтобы показать, что FDA не отщеплен от олигонуклеотида. Отдельные образцы оценивали спустя 2-120 минут после добавления олигонуклеотидного конъюгата. В случае REH-клеток флуресценцию отчетливо распознавали спустя 5-10 минут, в случае К562 и адгезивных клеток, а также клеток насекомых, происходило некоторое увеличение еще вплоть до 60 минут после добавления. В случае свободноживущих простейших проникновение продолжалось вплоть до 1 часа. В случае дрожжей проникновение происходило лишь после более продолжительного периода времени и негомогенно во все клетки. В споры грибков FDA-олигонуклеотидные конъюгаты проникали лучше, чем в клетки гиф. Результаты представлены в таблицах 1-3.
Пример 8
Исследование антипролиферативного действия олигонуклеотидных конъюгатов
REH-клетки (человеческая пре-В-клеточная лейкемия, DSM АСС 22) или опухолевые клетки А549 культивировали в оптимальной минимальной поддерживающей среде (OptiMEM) с 10% фетальной телячьей сыворотки (FKS; GIBCO-BRL) при температуре 37°С в присутствии 5% CO2. За день до начала опыта клетки пересевали таким образом, что спустя 24 часа могли достигать концентрации клеток примерно 1×106/мл. Олигонуклеотиды, соответственно, их конъюгаты, растворяли в дистиллированной воде с получением 1 мМ исходных растворов и хранили в холодильнике при температуре -20°С. Осуществляли посев клеток (1×106 клеток/мл в OptiMEM с 10% FKS) в 24-луночные планшеты. Для исследования олигонуклеотидные производные разводили до концентрации 2 мкМ (в OptiMEM без FKS). На одну лунку смешивали 100 мкл раствора олигонуклеотида и 100 мкл суспензии клеток (общий объем 200 мкл на лунку; концентрация олигонуклеотида 1 мкМ; концентрация сыворотки 5% FKS; концентрация клеток 0,5×106 клеток на мл). После инкубации в течение 4 часов при температуре 37°С и в присутствии 5% СО2 на лунку добавляли 800 мкл OptiMEM с 11% FKS (концентрация клеток теперь 1×105 клеток/мл; концентрация сыворотки теперь 10% FKS) и инкубировали дальше. После инкубации в течение 96 часов при температуре 37°С и в присутствии 5% CO2 определяли концентрацию клеток в Сазу 1 (фирма Schärfe). Для этого клетки в каждой лунке перемешивали путем 10-кратного всасывания и выдувания с помощью пипетки (1000 er) и тотчас разводили в соотношении 1:100 (при более сильном росте клеток в соотношении 1:200) с помощью Casyton. Определение средней величины плотности клеток осуществляли, соответственно, из трех идентично составленных образцов тестируемой смеси.
Пример 9
Синтез 5'-F4'(CO-NH)-A*T*GAC*GGAA*T*T*C
Олигонуклеотид конструировали исходя из CPG-носителя, который содержал связанным через 3'-конец 1 мкмоль N4-бензоилцитидина, как описано в примере 1. Окисления осуществляли с помощью йодной воды, соответственно, реагента Beaucage, для введения фосфортиоатного остатка (когда имеется знак * в последовательности). Затем присоединяли 5'-амино-модификатор С6, как описано в примере 2. После удаления защитных групп с помощью концентрированного раствора аммиака и 80%-ной уксусной кислоты получали 145 OD (260) 5'-аминолинкер-А*Т*GAC*GGAA*Т*Т*С-3'.
10 OD (260) 5'-аминолинкер-олигонуклеотида затем растворяли в 16 мкл 0,2 М ТВК-буфера, 95 мкл диметилформамида и вводили во взаимодействие с 12,5 мкл дихлорфлуоресцеиндиацетатгидроксисукцинимида (молекулярная масса: 626,36). После протекания в течение 3 часов реакции аминолинкер-олигонуклеотида с гидроксисукцинимидом добавляли 2 мкл полуконцентрированной уксусной кислоты и концентрировали в вакууме. После обессоливания через NAP-колонку™ (Pharmacia) осуществляли осаждение бутанолом. Получали 2,8 OD (260) желательного конъюгата олигонуклеотид-дихлорфторфлуоресцеиндиацетат.
Масс-спектрометрия (ионизация электронным распылением): 4403,3 (рассчитанная молекулярная масса: 4403,2).
Пример 10
Синтез 5'-F2'-(CO-NH)-A*T*GAC*GGAA*T*T*C
Олигомер 5'-аминолинкер-А*Т*GAC*ССАА*Т*Т*С-3' получали, как описано в примере 9. 10 OD (260) 5'-аминолинкер-олигонуклеотида растворяли в 16 мкл 0,2 М ТВК-буфера, 95 мкл диметилформамида и вводили во взаимодействие с 12,5 мкл карбоксифлуоресцеиндипивалатгидроксисукцинимида (молекулярная масса: 641,64). После протекания в течение 2 часов реакции аминолинкер-олигонуклеотида с гидроксисукцинимидом добавляли еще раз 12,5 мкл гидроксисукцинимида и оставляли реагировать в течение следующих двух часов. Затем добавляли 2 мкл полуконцентрированной уксусной кислоты и концентрировали в вакууме. После обессоливания через NAP-колонкуTM (Pharmacia) осуществляли осаждение бутанолом. Получали 8,1 OD (260) желательного конъюгата олигонуклеотид-флуоресцеиндипивалат.
Масс-спектрометрия (ионизация электронным распылением): 4472,9 (рассчитанная молекулярная масса: 4471,6).
Пример 11
Синтез 5'-F9-A*T*GAC*GGAA*T*T*C
Олигомер 5'-аминолинкер-А*Т*GAC*GGAA*T*T*C-3' получали, как описано в примере 9. 10 OD (260) 5'-аминолинкер-олигонуклеотида растворяли в 16 мкл 0,2 М ТВК-буфера, 95 мкл диметилформамида и вводили во взаимодействие с 25 мкл активного эфира ацетоксинафтилкарбоновой кислоты. Активный сложный эфир получали путем смешения 12,5 мкл 0,2 М раствора ацетоксинафтилкарбоновой кислоты (2,5 мг в 50 мкл диметилформамида) с 12,5 мкл TBTU (4 мг в 50 мкл диметилформамида) и реакцию проводили в течение 1 часа при температуре окружающей среды. После протекания в течение 17 часов реакции аминолинкер-олигонуклеотида с активным сложным эфиром добавляли 2 мкл полуконцентрированной уксусной кислоты и концентрировали в вакууме. После обессоливания через NAP-колонкуTM (Pharmacia) осуществляли осаждение бутанолом. Получали 8,5 OD (260) желательного олигонуклеотид-ацетоксинафтильного конъюгата.
Масс-спектрометрия (ионизация электронным распылением): 4158,2 (рассчитанная молекулярная масса: 4157,2).
Пример 12
Синтез 5'-F8-A*T*GAC*GGAA*T*T*C
Олигомер 5'-аминолинкер-А*Т*GAC*GGAA*Т*Т*С-3' получали, как описано в примере 9. 10 OD (260) 5'-аминолинкер-олигонуклеотида растворяли в 16 мкл 0,2 М ТВК-буфера, 95 мкл диметилформамида и вводили во взаимодействие с 25 мкл активного эфира ацетоксикумаринкарбоновой кислоты. Активный сложный эфир получали путем смешения 12,5 мкл 0,2 М раствора ацетоксикумаринкарбоновой кислоты (2,7 мг в 50 мкл диметилформамида) с 12,5 мкл TBTU (4 мг в 50 мкл диметилформамида) и реакцию проводили в течение 1 часа при температуре окружающей среды. После протекания в течение 17 часов реакции аминолинкер-олигонуклеотида с активным сложным эфиром добавляли 2 мкл полуконцентрированной уксусной кислоты и концентрировали в вакууме. После обессоливания через NAP-колонкуTM (Pharmacia) осуществляли осаждение бутанолом. Получали 8,0 OD (260) желательного олигонуклеотид-ацетоксикумаринового конъюгата.
Масс-спектрометрия (ионизация электронным распылением): 4178,5 (рассчитанная молекулярная масса: 4175,2).
Пример 13
Синтез 5'-F3-(dA)ndA*dA*dA (n=17, 47 и 77; F3=FDA)
Олигонуклеотиды конструировали исходя из CPG-носителя, который был дериватизирован по 3'-концу с помощью N6-бензолил-2'-дезоксиаденозина, как описано в примере 1. Окисления после первых обоих связываний осуществляли с помощью реагента Beaucage для введения фосфортиоатных остатков (в последовательности обозначено меткой *), все остальные окисления осуществляли с помощью йодной воды. Затем присоединяли 5'-амино-модификатор С6, как описано в примере 2. После удаления защитных групп с помощью концентрированного раствора аммиака и 80%-ной уксусной кислоты и очистки путем препаративного электрофореза в полиакриламидном геле получали 2,95 OD (260) 5'-аминолинкер-(dA)17dA*dA*dA, 4,9 OD (260) 5'-аминолинкер-(dA)47dA*dA*dA и 5 OD (260) 5'-аминолинкер-(dA)77dA*dA*dA.
5'-Аминолинкер-олигонуклеотиды, соответственно, растворяли в 8 мкл 0,2 М ТВК-буфера, 62 мкл диметилформамида и вводили во взаимодействие с 1,6 мкл FDA-изотиоцианата. После протекания в течение 3 часов реакции добавляли дальнейший FDA-изотиоцианат и оставляли реагировать еще в течение 2 часов. Затем добавляли 2 мкл полуконцентрированной уксусной кислоты и концентрировали в вакууме. После обессоливания через NAP-колонкуTM (Pharmacia) осуществляли осаждение бутанолом. Получали 1,5 OD (260) 5'-F3-(dA)17dA*dA*dA, 2,2 OD (260) 5'-F3-(dA)47dA*dA*dA и 0,9 OD (260) 5'-F3-(dA)77dA*dA*dA.
Пример 14
Синтез двукратно маркированного олигонуклеотида 5'-Сy3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-C6-F3 (F3=FDA)
Олигонуклеотид конструировали исходя из CPG-носителя, который позволяет вводить С6-аминолинкер в 3'-конец (Petrie и др., Bioconjugate Chem., 3, 85-87 (1992)), как описано в примере 1. Окисления осуществляли с помощью йодной воды, соответственно, реагента Beaucage, для введения фосфортиоатного остатка (когда в последовательности имеется метка *). После отщепления последней диметокситритильной защитной группы 5'-конец олигонуклеотида вводили во взаимодействие с Су3-СЕ-фосфорамидитом (фирма Glen Research, Sterlin, VA; номер по каталогу 10-5913-хх) и окисляли с помощью йодной воды. После удаления защитных групп с помощью концентрированного раствора аммиака (2 часа при температуре 70°С) получали 64 OD (260) сырого продукта. После очистки путем препаративного электрофореза в полиакриламидном геле получали 3,8 OD 5'-Сy3-А*Т*GAC*GGAA*Т*Т*С-С6-аминолинкер-3'. Из них 3,5 OD (260) растворяли в 8 мкл 0,2 М ТВК-буфера, 62 мкл диметилформамида и вводили во взаимодействие с 1,6 мкмоль FDA-изотиоцианата. После реакции в течение 3,5 часов аминолинкер-олигонуклеотида с гидроксисукцинимидом добавляли 1 мкл полуконцентрированной уксусной кислоты и концентрировали в вакууме. После обессоливания через NAP-колонкуTM (Pharmacia) осуществляли осаждение бутанолом. Получали 3,5 OD (260) желательного, двукратно маркированного олигонуклеотида 5'-Cy3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-C6-F3.
Масс-спектрометрия (ионизация электронным распылением): 4926,2 (рассчитанная молекулярная масса: 4927,1).
Пример 15
Синтез 5'-F3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C (F3=FDA)
Олигомер 5'-аминолинкер-А*Т*GAC*GGAA*Т*Т*С-3' получали, как описано в примере 9. 10 OD (260) 5'-аминолинкер-олигонуклеотида растворяли в 16 мкл 0,2 М ТВК-буфера, 95 мкл диметилформамида и вводили во взаимодействие с 25 мкл FDA-изотиоцианата (5 мг в 100 мкл диметилформамида). После протекания в течение 3 часов реакции аминолинкер-олигонуклеотида с изотиоцианатом добавляли еще раз 5 мкл изотиоцианата и оставляли реагировать в течение следующих двух часов. Затем добавляли 2 мкл полуконцентрированной уксусной кислоты и концентрировали в вакууме. После обессоливания через NAP-колонкуTM (Pharmacia) осуществляли осаждение бутанолом. Получали 8,5 OD (260) желательного конъюгата олигонуклеотид-флуоресцеиндиацетат.
Масс-спектрометрия (ионизация электронным распылением): 4418,4 (рассчитанная молекулярная масса: 4418,5).
Пример 16
Сравнение проникновения в клетки олигонуклеотидных конъюгатов различной длины 5'-F3-(dA)ndA*dA*dA (n=17, 47 и 77; F3=FDA)
Определение проникновения в клетки конъюгатов различной длины и различной молекулярной массы, полученных согласно примеру 12, осуществляли, в принципе, как описано в примере 7 с REH-клетками. Определение количества осуществляли с помощью проточного цитометра. Спустя 60 минут относительные сигналы флуоресценции: для 5'-F3-(dA)17dA*dA*dA ("А20") равен 49; для 5'-F3-(dA)47dA*dA*dA ("А50") равен 34; и для 5'-'F3-(dA)77dA*dA*dA ("А80") равен 91. FDA-Конъюгат с самой большой олигонуклеотидной частью, состоящей из, в целом, 80 нуклеотидов, неожиданно наиболее эффективно проникал в REH-клетки.
Пример 17
Сравнение проникновения в клетки олигонуклеотидных конъюгатов с различной дериватизацией
Родственным флуоресцеиндиацетату (FDA) соединением является флуоресцеиндипивалат, который отличается повышенной устойчивостью сложноэфирных групп. Соответствующие олигонуклеотидные конъюгаты исследовали в проточном цитометре в отношении их проникновения в клетки. Более высокая устойчивость пивалата по отношению к щелочам и эстеразам приводит к уменьшенному проникновению в клетки соответствующего олигонуклеотидного конъюгата. Так, измеренная относительная флуоресценция для флуоресцеиндиацетатного конъюгата спустя 60 минут равна 195, в то время как для соответствующего флуоресцеиндипивалатного конъюгата она составляет только 55.
Пример 18
Исследование проникновения в клетки двукратно маркированного олигонуклеотидного конъюгата 5'-Cy3-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-C6-FDA, полученного в примере 13
При исследовании в клеточном сортере с возбуждением флуоресценции (FACScan) обнаружено быстрое проникновение Сy3-олигонуклеотид-F3-конъюгата в REH-клетки. Обработка клеток с помощью комплекса олигонуклеотидный конъюгат/клеточный фектин приводит к подобному, однако, отчетливо более неравномерному проникновению. При этом на эффект FDA-конъюгата отчетливо накладывается эффект комплекса клеточный фектин-олигонуклеотид.
Далее нужно было исследовать совместную локализацию обоих различных групп маркеров в олигонуклеотиде при инкубации с клетками, чтобы исключить, что измеренная флуоресценция основана только на отщепленном FDA, соответственно, флуоресцеине. Сy3-Олигонуклеотид-F3-конъюгат содержал ковалентно связанными с 5'-концом цианиновый краситель и с 3'-концом FDA. На фиг.9 показана зеленая и красная флуоресценция после инкубации в течение 4 часов REH-клеток с Сy3-олигонуклеотид-F3-конъюгатом. Так как нужно наблюдать совместную локализацию обоих маркеров в клетках, нужно исходить из того, что олигонуклеотид проник в интактной форме. Гидролизу подверглись только ацетильные группы FDA-части, вероятно, с помощью эстераз, так как нефлуоресцирующий FDA-остаток, очевидно, превратился в флуоресцирующий флуоресцеиновый остаток. Проникновение Сy3/FDA-конъюгата произошло очень быстро, так как оба маркера смогли обнаружить уже спустя 7 минут после добавления.
Олигонуклеотид-FDA-конъюгат KO_1 из примера 4 тестировали при четырех концентрациях на антипролиферативное действие в отношении опухолевых клеток А549. Пролиферацию ингибировали без добавления усилителя пенетрации. Соответствующий олигонуклеотид без F3-конъюгата (ON1) ингибирует пролиферацию только после комплексообразования с усилителем пенетрации (клеточный фектин, фирма Gibco-BRL). Результаты представлены в таблице 4.
Таблица 1 | ||||||||
Флуоресцентномикроскопическое исследование проникновения маркированных с помощью FDA олигонуклеотидов (конъюгат олигонуклеотид-FDA) в клетки млекопитающих | ||||||||
Клетки млекопитающих: название линии клеток | Флуоресценция спустя 5 минут | Флуоресценция спустя 20 минут | Флуоресценция спустя 60 минут | Флуоресценция спустя 120 минут | ||||
А | В | А | В | А | В | А | В | |
REH | + | - | + | - | ++ | - | ++ | * |
K562 | (+) | + | + | |||||
Lu 18 | (+) | + | ||||||
КВ3-1 | + | + | ||||||
Ptk 2 | (+) | 4- |
где:
А: инкубация с маркированными с помощью FDA олигонуклеотидами KO_1 и KO_3
В: инкубация с маркированными флуоресцеином олигонуклеотидами KO_2 и KO_4
(+) слабое проникновение
+ средней силы проникновение
++ очень сильное проникновение
- никакого проникновения
* проникновение только в поврежденные клетки
Таблица 2 | ||||||
Флуоресцентно-микроскопическое исследование проникновения маркированных с помощью FDA олигонуклеотидов в клетки насекомых (пояснение см. таблицу 1) | ||||||
Клетки насекомых | Флуоресценция спустя 20 минут | Флуоресценция спустя 60 минут | Флуоресценция спустя 120 минут | |||
А | В | А | В | А | В | |
Клетки SF9 | + | - | ++ | - | ++ | - |
Таблица 5 | |||
Зависимость от длин (олигонуклеотидов) трансфекции FDA-конъюгатов (А20, А50, А80 из примера 15) | |||
Время (минуты) | Флуоресценция А20 | Флуоресценция А50 | Флуоресценция А80 |
0 | 0,0103 | 0,0103 | 0,0103 |
10 | 11,71 | 8,9 | 43,31 |
20 | 39,68 | 28,06 | 88,36 |
30 | 48,59 | 34,38 | 91,28 |
40 | 54,7 | 38,75 | 92,35 |
50 | 58,66 | 41,64 | 93,19 |
60 | 62,13 | 44,33 | 93,62 |
Таблица 6 | ||
Сравнение проникновения в клетки конъюгатов флуоресцеиндиацетат-олигонуклеотид и флуоресцеиндипивалат-олигонуклеотид (пример 16, фиг.8) | ||
Время (минуты) | Флуоресценция К39 | Флуоресценция К41 |
0 | 2,66 | 2,75 |
10 | 72,37 | 8,49 |
20 | 112,34 | 18,17 |
30 | 142,97 | 28,67 |
40 | 164,64 | 38,34 |
50 | 184,96 | 46,62 |
60 | 195,57 | 55,26 |
70 | ||
80 | 218,12 | 68,02 |
90 | ||
100 | 231,04 | 83,7 |
110 | ||
120 | 253,84 | 97 |
Claims (21)
1. Конъюгат, состоящий из транспортируемой через биологические мембраны молекулы и по меньшей мере одного арильного остатка формулы (I)
причем арил означает фенил, пиридил, пиримидил, пирролил, фуранил, тиофенил, 5-членный лактон, 6-членный лактон, спиролактон, бензохинон, циклогексадиенил или циклогексенил или циклическую систему, состоящую из 1-8 циклов;
Х означает О или N;
Y означает О, S или NH-R2;
R1 означает замещенный или незамещенный (С1-С23)-алкильный остаток, который может быть линейным или разветвленным и может содержать двойные и/или тройные связи;
R2 означает замещенный или незамещенный (C1-C18)-алкильный остаток, который может быть линейным или разветвленным и может содержать двойные и/или тройные связи; и
n 1 или 2,
при этом транспортируемая молекула представляет собой биополимер или пептид-нуклеиновую кислоту, или полиамид, который содержит три ароматических цикла: имидазол, пиррол и гидроксипиррол, с молекулярной массой ≤500 Дальтон или представляет собой мононуклеотид или олигонуклеотид с молекулярной массой ≤500 Дальтон,
причем арильный остаток связан с транспортируемой молекулой либо непосредственно через химическую связь, либо опосредованно через химическую группу; причем химическая группа не является СН2-S-группой, когда связывание транспортируемой молекулы происходив через межнуклеотидфосфодиэфирную связь.
2. Конъюгат по п.1, отличающийся тем, что транспортируемой молекулой является олигонуклеотид, полинуклеотид, пептид, полипептид, протеин, олигосахарид или полисахарид или их производное, представляющее собой их соли, в частности их физиологически приемлемые соли и модифицированные или стабилизированные нуклеиновые кислоты.
3. Конъюгат по п.2, отличающийся тем, что транспортируемой молекулой является олигонуклеотид.
4. Конъюгат по п.3, отличающийся тем, что олигонуклеотид является модифицированным.
7. Конъюгат, состоящий из:
a) полинуклеотида, олигонуклеотида или мононуклеотида и
b) одного или нескольких арильных остатков формулы (I), где арильный остаток (арильные остатки) либо непосредственно через химическую связь, либо опосредованно через химическую группу связан (связаны) с 5'-концом, и/или 3'-концом, и/или одни-м или несколькими нуклеозидными основаниями, и/или одним или несколькими остатками сахаров, и/или одним или несколькими межнуклеозидными связями, причем химическая группа не является CH2-S-группой, если связывание происходит через межнуклеотидфосфодиэфирную связь.
8. Способ получения конъюгата, содержащего транспортируемую через биологические мембраны молекулу по пп.1-4 и по меньшей мере один арильный остаток формулы (I), заключающийся в том, что транспортируемую молекулу, которая содержит реакционноспособную функциональную группу в положении, по которому должен быть связан арильный остаток, подвергают взаимодействию с реагентом, содержащим арильный остаток, при значении рН≤7,5 с образованием конъюгата, при этом реакционноспособной функциональной группой является аминогруппа, меркаптогруппа, хлорацетильная группа, изоцианатная группа, изотиоцианатная группа, карбоксильная группа, N-гидроксисукцинимидная группа или хлорангидридная группа карбоновой кислоты и реагентом, содержащим арильный остаток, является изотиоцианат, хлорангидрид карбоновой кислоты или α-гидроксисукцинимид карбоновой кислоты, каждый из которых содержит арильный остаток формулы 1.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что взаимодействие транспортируемой молекулы с арилсодержащим реагентом проводят при значении рН 7,0.
10. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что транспортируемой молекулой является полинуклеотид, олигонуклеотид или мононуклеотид.
11. Способ транспорта молекулы через биологическую мембрану, заключающийся в том, что конъюгат по одному из пп.1-7 инкубируют с мембраной.
12. Способ транспорта молекулы в клетку, заключающейся в том, что конъдгат по одному из пп.1-7 инкубируют с клеткой, после чего конъюгат транспортируется в клетку без отщепления арильного остатка.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что клеткой является эукариотная или прокариотная клетка.
14. Способ по одному из п.12 или 13, отличающийся тем, что клеткой является бактериальная клетка, дрожжевая клетка или клетка млекопитающего.
15. Способ по одному из пп.12-14, отличающийся тем, что клеткой является клетка человека.
16. Способ по одному из пп.12-15, отличающийся тем, что клеткой является опухолевая клетка.
17. Способ получения лекарственного средства, заключающийся в том, что фармацевтическое активное вещество или его производное, содержащее, по меньшей мере, одну реакционноспособную функциональную группу в положении, по которому должен быть связан арильный остаток, подвергают взаимодействию с реагентом, содержащим арильный остаток, с образованием конъюгата, и конъюгат смешивают с добавками и/или носителями, причем реакционноспособная функциональная группа определена в п.8, а реагентом, содержащим арильный остаток, является изотиоцианат, хлорангидрид карбоновой кислоты или α-гидроксисукцинимид карбоновой кислоты, каждый из которых содержит арильный остаток формулы I или II.
18. Лекарственное средство, содержащее конъюгат по одному из пп.1-7 или 17 для лечения заболеваний, обусловленных сверхпродуцированием определенных генов.
19. Лекарственное средство по п.18 для лечения опухолей.
20. Диагностическое средство, содержащее конъюгат по одному или нескольким пп.1-7 для диагностики заболеваний, обусловленных сверхпродуцированием определенных генов.
21. Тест-набор, содержащий конъюгат по одному или нескольким пп.1-7 для диагностики заболеваний, обусловленных сверхпродуцированием определенных генов.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19935302.6 | 1999-07-28 | ||
DE19935302A DE19935302A1 (de) | 1999-07-28 | 1999-07-28 | Konjugate und Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung zum Transport von Molekülen über biologische Membranen |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2002105016A RU2002105016A (ru) | 2003-11-10 |
RU2275936C2 true RU2275936C2 (ru) | 2006-05-10 |
Family
ID=7916258
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2002105016/15A RU2275936C2 (ru) | 1999-07-28 | 2000-07-20 | Конъюгаты и способ их получения, а также их применение для транспорта молекул через биологические мембраны |
Country Status (33)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8420396B2 (ru) |
EP (1) | EP1204430B1 (ru) |
JP (1) | JP4791665B2 (ru) |
KR (1) | KR100721696B1 (ru) |
CN (1) | CN1227035C (ru) |
AR (1) | AR029385A1 (ru) |
AT (1) | ATE447413T1 (ru) |
AU (1) | AU776114B2 (ru) |
BR (1) | BR0012757A (ru) |
CA (1) | CA2377977C (ru) |
CY (1) | CY1109744T1 (ru) |
CZ (1) | CZ2002300A3 (ru) |
DE (2) | DE19935302A1 (ru) |
DK (1) | DK1204430T3 (ru) |
EE (1) | EE05303B1 (ru) |
ES (1) | ES2335741T3 (ru) |
HK (1) | HK1047042A1 (ru) |
HR (1) | HRP20020074B1 (ru) |
HU (1) | HUP0201995A3 (ru) |
IL (2) | IL147527A0 (ru) |
ME (1) | MEP56408A (ru) |
MX (1) | MXPA01013114A (ru) |
NO (1) | NO334155B1 (ru) |
NZ (1) | NZ516838A (ru) |
PL (1) | PL202881B1 (ru) |
PT (1) | PT1204430E (ru) |
RS (2) | RS20100249A (ru) |
RU (1) | RU2275936C2 (ru) |
SI (1) | SI1204430T1 (ru) |
SK (1) | SK287654B6 (ru) |
TR (4) | TR201109491T2 (ru) |
WO (1) | WO2001008707A2 (ru) |
ZA (1) | ZA200200657B (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2582235C2 (ru) * | 2010-12-29 | 2016-04-20 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Низкомолекулярные конъюгаты для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот |
RU2739987C2 (ru) * | 2014-05-23 | 2020-12-30 | Джензим Корпорейшн | Множественные олигонуклеотидные фрагменты на пептидном носителе |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030129251A1 (en) * | 2000-03-10 | 2003-07-10 | Gary Van Nest | Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof |
US7026166B2 (en) * | 2002-01-22 | 2006-04-11 | Chiron Corporation | Fluorogenic dyes |
US7704756B2 (en) | 2003-01-21 | 2010-04-27 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Fluorogenic dyes |
WO2005024033A2 (en) * | 2003-09-11 | 2005-03-17 | Universitätsklinikum Schleswig-Holstein Campus Lübeck | Nucleotide sequences promoting the trans-membrane transport of nucleic acids |
JP4989225B2 (ja) * | 2003-09-25 | 2012-08-01 | コーリー ファーマシューティカル グループ,インコーポレイテッド | 核酸親油性接合体 |
EP1645288A1 (en) * | 2004-10-07 | 2006-04-12 | CTG Pharma S.r.l. | New nuclear transcription factors regulators |
KR100690199B1 (ko) * | 2006-04-20 | 2007-03-12 | 이화여자대학교 산학협력단 | 구리 이온 선택성을 갖는 플루오레세인 유도체, 이의제조방법 및 이를 이용한 생체 내 구리 이온 검출방법 |
RU2010112771A (ru) * | 2007-10-09 | 2011-11-20 | Коули Фармасьютикал ГмбХ (DE) | Иммуностимулирующие аналоги олигонуклеотидов, содержащие модифицированные сахарные группировки |
US20180036312A1 (en) * | 2016-08-02 | 2018-02-08 | ISI Life Sciences Inc. | Novel Scaffolds for Intracellular Compound Delivery for the Detection of Cancer Cells |
WO2018026965A1 (en) | 2016-08-02 | 2018-02-08 | Isi Life Sciences, Inc. | Compositions and methods for detecting cancer cells in a tissue sample |
US10753942B2 (en) | 2017-05-15 | 2020-08-25 | Indicator Systems International, Inc. | Methods to detect remnant cancer cells |
US10539567B2 (en) * | 2017-05-15 | 2020-01-21 | Indicator Systems International, Inc. | Biopsy methods and devices |
KR20230096856A (ko) | 2021-12-22 | 2023-06-30 | 한국과학기술연구원 | 신규 펩타이드-올리고뉴클레오티드 접합체 및 이의 용도 |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE8801070D0 (sv) * | 1988-03-23 | 1988-03-23 | Pharmacia Ab | Method for immobilizing a dna sequence on a solid support |
WO1995006659A1 (en) * | 1992-07-01 | 1995-03-09 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides |
US6228982B1 (en) * | 1992-05-22 | 2001-05-08 | Benget Norden | Double-stranded peptide nucleic acids |
US6335434B1 (en) * | 1998-06-16 | 2002-01-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc., | Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates |
NZ245720A (en) | 1992-01-22 | 1995-12-21 | Hoechst Ag | Oligonucleotide analogues; use as gene expression inhibitor or dna probe |
US6033909A (en) * | 1992-01-22 | 2000-03-07 | Hoechst Aktiengesellschaft | Oligonucleotide analogs, their preparation and use |
US5633360A (en) * | 1992-04-14 | 1997-05-27 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation |
US5820873A (en) * | 1994-09-30 | 1998-10-13 | The University Of British Columbia | Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof |
DE19502912A1 (de) * | 1995-01-31 | 1996-08-01 | Hoechst Ag | G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide |
US5698411A (en) * | 1995-05-18 | 1997-12-16 | Coulter Corporation | Method for determining activity of enzymes in metabolically active whole cells |
WO1998020887A1 (en) * | 1996-11-14 | 1998-05-22 | Brigham And Women's Hospital, Inc. | Polyphosphoinositide binding peptides for intracellular drug delivery |
GB9809084D0 (en) | 1998-04-28 | 1998-06-24 | Nycomed Imaging As | Improvements in or relating to diagnostic/therapeutic agents |
DE19824535A1 (de) * | 1998-06-03 | 1999-12-09 | Roche Diagnostics Gmbh | Neue Rhodamin-Derivate und deren Verwendung |
US6335432B1 (en) | 1998-08-07 | 2002-01-01 | Bio-Red Laboratories, Inc. | Structural analogs of amine bases and nucleosides |
US6080580A (en) * | 1998-10-05 | 2000-06-27 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense oligonucleotide modulation of tumor necrosis factor-α (TNF-α) expression |
DK1189971T3 (da) | 1999-06-17 | 2005-07-11 | Univ Gent | Funktionelle poly-alpha-aminosyrederivater der er egnede til modificering af biologisk aktive materialer, samt anvendelse deraf |
-
1999
- 1999-07-28 DE DE19935302A patent/DE19935302A1/de not_active Ceased
-
2000
- 2000-07-20 ES ES00956220T patent/ES2335741T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-20 KR KR1020027001122A patent/KR100721696B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-07-20 CZ CZ2002300A patent/CZ2002300A3/cs unknown
- 2000-07-20 PT PT00956220T patent/PT1204430E/pt unknown
- 2000-07-20 RU RU2002105016/15A patent/RU2275936C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-07-20 PL PL353069A patent/PL202881B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2000-07-20 AT AT00956220T patent/ATE447413T1/de active
- 2000-07-20 WO PCT/EP2000/006936 patent/WO2001008707A2/de active Application Filing
- 2000-07-20 TR TR2011/09491T patent/TR201109491T2/xx unknown
- 2000-07-20 CN CNB008091757A patent/CN1227035C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-07-20 AU AU68252/00A patent/AU776114B2/en not_active Ceased
- 2000-07-20 TR TR2002/00222T patent/TR200200222T2/xx unknown
- 2000-07-20 HU HU0201995A patent/HUP0201995A3/hu unknown
- 2000-07-20 JP JP2001513437A patent/JP4791665B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-07-20 RS RSP-2010/0249A patent/RS20100249A/en unknown
- 2000-07-20 NZ NZ516838A patent/NZ516838A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-07-20 MX MXPA01013114A patent/MXPA01013114A/es active IP Right Grant
- 2000-07-20 DE DE50015781T patent/DE50015781D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-20 IL IL14752700A patent/IL147527A0/xx active IP Right Grant
- 2000-07-20 EP EP00956220A patent/EP1204430B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-20 EE EEP200200035A patent/EE05303B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-07-20 SI SI200031052T patent/SI1204430T1/sl unknown
- 2000-07-20 TR TR2011/09493T patent/TR201109493T2/xx unknown
- 2000-07-20 RS YUP-903/01A patent/RS51447B/sr unknown
- 2000-07-20 SK SK117-2002A patent/SK287654B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-07-20 CA CA2377977A patent/CA2377977C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-07-20 ME MEP-564/08A patent/MEP56408A/xx unknown
- 2000-07-20 BR BR0012757-4A patent/BR0012757A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-07-20 DK DK00956220.8T patent/DK1204430T3/da active
- 2000-07-20 TR TR2007/06709T patent/TR200706709T2/xx unknown
- 2000-07-26 AR ARP000103870A patent/AR029385A1/es unknown
-
2002
- 2002-01-08 IL IL147527A patent/IL147527A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-01-23 NO NO20020367A patent/NO334155B1/no not_active IP Right Cessation
- 2002-01-24 ZA ZA200200657A patent/ZA200200657B/en unknown
- 2002-01-25 HR HR20020074A patent/HRP20020074B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2002-11-29 HK HK02108623A patent/HK1047042A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-01-11 US US11/622,156 patent/US8420396B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-01-20 CY CY20101100058T patent/CY1109744T1/el unknown
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2582235C2 (ru) * | 2010-12-29 | 2016-04-20 | Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг | Низкомолекулярные конъюгаты для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот |
RU2629957C2 (ru) * | 2010-12-29 | 2017-09-05 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Низкомолекулярные конъюгаты для внутриклеточной доставки биологически активных соединений |
US9968647B2 (en) | 2010-12-29 | 2018-05-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Small molecule conjugates for intracellular delivery of biologically active compounds |
RU2739987C2 (ru) * | 2014-05-23 | 2020-12-30 | Джензим Корпорейшн | Множественные олигонуклеотидные фрагменты на пептидном носителе |
US11103587B2 (en) | 2014-05-23 | 2021-08-31 | Genzyme Corporation | Multiple oligonucleotide moieties on peptide carrier |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8420396B2 (en) | Conjugates and processes for their preparation and their use for transporting molecules across biological membranes | |
JP4643906B2 (ja) | 遺伝子発現の標的化阻害のための合成二本鎖オリゴヌクレオチド | |
JP4118348B2 (ja) | Gキャプ安定化したオリゴヌクレオチド | |
US6348312B1 (en) | Stabilized oligonucleotides and their use | |
JP2000501414A (ja) | 生体分子の細胞取り込みを高めるリガンド | |
JP2002510319A (ja) | オリゴヌクレオチドの消化管を介したデリバリーのための組成物及び方法 | |
HRP20020075A2 (en) | Oligonucleotides for inhibiting the expression of human eg5 | |
EP1100894A2 (en) | Short oligonucleotides for the inhibition of vegf expression | |
EP1276760B1 (de) | Polyamidnukleinsäure-derivate, mittel und verfahren zur ihrer herstellung | |
EP1282639B1 (de) | Peptidnukleinsaure-derivate mit negativer ladung, mittel und verfahren zu ihrer herstellung | |
JP4690649B2 (ja) | 標的化された遺伝子発現阻害のための新規なオリゴリボヌクレオチド誘導体 | |
US6673912B1 (en) | 2′-O-aminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140721 |