CZ2002300A3 - Konjugáty pro transport molekul přes biologickou membránu, způsob přípravy konjugátů a farmaceutický přípravek obsahující konjugáty - Google Patents

Description

Konjugáty pro transport molekul přes biologickou membránu, způsob přípravy konjugátů a farmaceutický přípravek obsahující konjugáty

Oblast techniky

Předmětem předkládaného vynálezu jsou konjugáty, způsob jejich výroby a použití těchto konjugátů pro transport nízkomolekulárních sloučenin a makromolekul přes biologické membrány, zejména pro transport molekul do buňky. Předmětem předkládaného vynálezu jsou také léčivé přípravky a diagnostické přípravky včetně diagnostických souprav, které obsahují konjugáty podle vynálezu.

Dosavadní stav techniky

Omezujícím faktorem terapeutického použití molekul, které působí uvnitř buňky, je často jejich nedostatečný buněčný příjem a nepříznivé intracelulární rozdělení. Typickým příkladem jsou makromolekuly jako jsou např. nukleové kyseliny, které se sekvenčně specifickým způsobem váží na buněčnou DNA nebo RNA a tím způsobují inhibici genové exprese. Antisense oligonukleotidy jsou krátké jednořetězcové nukleové kyseliny, které se na principu Watson-Crickova párování baží váží na komplementární mRNA, čímž má být inhibována translace odpovídajícího proteinu. Oligonukleotidy vytvářející triplex (trojšroubovici) se váží na principu tzv. Hoogsteenova párování baží ve velkých žlábcích DNA-dvojšroubovice a vytvářejí tak troj šroubovíci, čímž je specificky inhibována transkripce genu. Další intracelulárně působící ·· ϊ • · · • · · · ι • t

I · · · · jsou např. tzv. vějičkové (decoy) které obsahuj í vazebné úseky pro faktory. Prostřednictvím věj íčkových oligonukleotidy oligonukleotidy, transkripční oligonukleotidů je možné sekvenčně specificky vychytat určitý transkripční faktor a tím zabránit aktivaci transkripce. Další skupina intracelulárně působících oligonukleotidů, tzv. chiméraplasty, je určena k cílené opravě genů (Cole-Strauss et al. , Science 273 (1996) 1386-1389). Také pro tyto genové opravy je naprosto nezbytný dobrý příjem tzv. chiméraplastoligonukieotidů buňkou. Příkladem dalších intracelulárně působících nukleových kyselin jsou takové nukleové kyseliny, které interagují s buněčnými enzymy, zejména telomerázou (Norton et al. Nátuře Biotechn. (1996) 14, 615). Další třída nukleových kyselin, výhodně dvoj řetězcové DNA, kóduje určitý protein, který je intracelulárně exprimován pro genovou terapii.

Příjem oligonukleotidů buňkou in vitro po jednoduchém přidání oligonukleotidů do kultivačního média je relativně neúčinný proces, kdy se do buňky dostane jen malá část z celkového množství oligonukleotidů skutečně dostane do buňky. Proces příjmu do buňky trvá mnoho hodin a většinou je dosaženo plato fáze až po 8 až 16 hodinách. Má se za to, že oligonukleotidy jsou buňkou přijímány v procesu typu endocytózy. Obecným problémem příjmu endocytózou je to, že většina oligonukleotidů není volně k dispozici v cytoplazmě, ale je uzavřena v některých buněčných strukturách jako jsou např. lysosomy a endosomy. Takové bodové rozdělení fluorescenčně značených oligonukleotidů je možné pozorovat

Vzhledem k vesikulární koncentrace volného pomocí fluorescenční mikroskopie, lokalizaci je výrazně snížena oligonukleotidů, který je k dispozici pro hybridizaci s mRNA. Kromě toho v závislosti na buněčném typu a předchozích « · • · · · :

• · · « · · • · · • · · · • 4 podmínkách přijímá oligonukleotid jen určitá frakce buněk. Tudíž se obecně pro účinné vnášení antisense oligonukleotidů užívají směsi s činidlem zesilujícím penetraci, např. s kationtovými lipidy (Bennett et al. mol. Pharmacol. 41 (1992) 1023) .

Cílem předkládaného vynálezu proto bylo zlepšit buněčný příjem molekul, zejména makromolekul jako jsou např. oligonukleotidy .

Výzkum buněčného příjmu oligonukleotidů se obecně provádí buďto pomocí radioaktivně značených nebo fluorescenčně značených oligonukleotidů. Fluorescenční značení oligonukleotidů se provádí např. nahrazením aminozbytku v oligonukleotidů fluoresceinisothiokyanátem (FITC). Tak např. fluorescein se může vnést na 3'-konec oligonukleotidů prostřednictvím komerčně dostupné fluoresceinem derivátizovaného pevného nosiče nebo se může vnést na 5'-konec oligonukleotidů prostřednictvím fluorescein-fosfitylačního činidla.

oligonukleotidů vázaný fluorescein k derivátu kyseliny uhličité negativně nabitý strukturní element, který vykazuje silnou fluorescenci.

komerčně dostupného V každém případě na představuje vzhledem

FDA-zbytek (F3)

Fluorescein-zbytek (F0) • · « » · · • · · ι : · • * • · · ·

Naproti tomu fluoresceindiacetát (FDA) je neutrální vitální barvivo, které se přeměňuje na fluorescein teprve po rozštěpení obou esterových zbytek a otevřeni laktonového kruhu, avšak v formě laktonu nevykazuje žádnou fluorescenci.

Je známo, že FDA (označovaný také jako „F3) proniká do živých buněk pasivní difúzí jakožto neutrální nefluoreskující molekula a uvnitř buňky je esterázami štěpen na fluoreskující fluorescein (Breeuwer et al. Appl. Environ. Microbiol. (1995) 61, 1614; Maeda et al. Cell Struct. Funct. (1982) 7, 177). Dosud byly popsány jen takové deriváty FDA, které obsahují amin-reaktivní zbytek u jako např. isothiokyanát-FDA deriváty byly použity k barvení intracelulárních proteinů nebo buněčných komponent. Nebyly dosud popsány žádné konjugáty FDA s jinými molekulami a tudíž nebyly dosud popsány ani FDAznačené oligonukleotidy (tj. konjugáty tvořené FDA a oligonukleotidem).

V cytoplazmě je FDA štěpen esterázou, pomocí FDA-značení oligonukleotidů je tudíž možné určit podíl volného oligonukleotidů, tzn. Kolik oligonukleotidů je v cytoplazmě a je k dispozici pro hybridizaci, v poměru k podílu oligonukleotidů, který je ve vesikulech (tzv. uzavřený oligonukleotid), který není dostupný pro hybridizaci. Vzhledem k celkem vysokému počtu negativních nábojů v oligonukleotidů u také skutečnosti, že FDA-značený a fluoresceinem značený oligonukleotid (v případě, že oligonukleotidy samotné jsou shodné) se liší jen čistým nábojem, bylo možné očekávat, že FDA-značené a fluoresceinem značené oligonukleotidy budou vykazovat velmi podobný buněčný příjem a rozdělení v buňce.

Překvapivě však bylo zjištěno, že FDA-značené a fluoresceinem značené oligonukleotidy se výrazně liší pokud jde o jejich příjem buňkou a tudíž také pokud jde o trvání a účinnost příjmu oligonukleotidů, a taktéž pokud jde i :

4· 4444 oligonukleotid značený radioaktivně značeného a o lokalizaci přijatého oligonukleotidu v buňce.

FDA-značený oligonukleotid je přijímán buňkou mnohem rychleji než odpovídající fluoresceinem. Zatímco příjem fluoresceinem značeného oligonukleotidu trvá i několik hodin, byl prokázán příjem FDA-značeného oligonukleotidu buňkou po jednoduché inkubaci, např. s humánními buňkami, v průběhu 5 minut. Překvapivé bylo zjištění, že FDA-značené oligonukleotidy byly přijaty téměř všemi buňkami (>90 %) , zatímco příjem oligonukleotidu, popřípadě polynukleotídu dosud popsanými metodami je podstatně nižší, často jen 30 až 60% buněk obsahuje oligonukleotid. Výhodné je také intracelulární rozdělení FDA-značeného oligonukleotidu, které je mnohem rovnoměrnější. Toto rovnoměrnější intracelulární rozdělení znamená, že větší část oligonukleotidu nebí, jak bylo zmíněno výše, uzavřena ve vesikulech (např. endosomech nebo lysosomech), ale naopak je rozdělena po celé buňce, tj . je v cytosolu i v jádru, což je indikací toho, že většiny oligonukleotidu je v podobě volného oligonukleotidu. Právě jen tyto volné oligonukleotid jsou k dispozici pro navázání na cíl (cílovou molekulu, cílovou nukleovou kyselinu) nebo jako účinná látka. Další výhodou je to, že při použití FDAznačených oligonukleotidů nebylo pozorováno žádné poškození buněk, ke kterému naopak často vede použití lipokationtových činidel zesilujících penetraci, kdy jsou poškozeny buněčné membrány. Díky těmto neočekávaným vlastnostem mají FDA-značené oligonukleotidy ve srovnání s dosud popsanými metodami přenosu oligonukleotidů, popřípadě polynukleotidů, do buněk, rozhodující výhodu, a sice že jsou účinněji přijímány buňkou a v buňce jsou lépe využitelné. Tudíž vykazují FDA-značené oligonukleotidy výrazně lepší biologickou účinnost. A vzhledem k lepší biologické účinnosti je možné užít menší množství oligonukleotidu. Tudíž vzhledem ke skutečnosti, že FDA-značené oligonukleotidy jsou účinněji, jak z hlediska množství tak i z časového hlediska, přijímány buňkou, jsou redukovány i nežádoucí vedlejší (případně toxické) účinky.

Překvapivě bylo zjištěno, že výhodné vlastnosti nejsou omezeny jen na FDA-značené oligonukleotidy, ale týká se molekuly, která pomocí FDA-značení, tj .

resp. konjugací, s přenášenou molekulu je účinně přenášena do buňky (přijímána buňkou), popřípadě transportována přes biologické membrány. Dále bylo zjištěno, že tento princip není omezen jen na FDA-konjugáty, ale týká se všech arylesterovych konjugátu, které vykazují určitou chemickou strukturu. Předkládaný vynález se proto týká nového principu pro transport molekul přes biologické membrány. Jelikož taková spojení nebyla dosud až na výjimky ve stavu techniky popsána, předmětem prakticky každé navázáním FDA, (FDA-konj ugát), předkládaného vynálezu jsou konjugát arylesteru majícího s transportovanou molekulou.

odpovídající konjugáty, tj . určitou chemickou strukturu

Tyto konjugáty nemohou být představuj í

Bioorganic sloučeniny, připraveny známými způsoby, proto je předmětem předkládaného vynálezu způsob přípravy těchto konjugátu.

Známé jsou bioreverzibilní O-acylaryl-konjugáty, které předléčivo oligonukleotidů (Lyer et al. , & Med. Chem. Lett. 7 (1997) 871-876). Tyto v případě že arylový zbytek je aromatický

6-členný kruh, jsou svou chemickou strukturou podobné konjugátům podle vynálezu. U bioreverzibilních O-acylarylkonjugátů působí hydrolýza esteru destabilizaci vazby mezi arylový, zbytkem a fosfotriesterem oligonukleotidu, takže se bioreverzibilní O-acylaryl-konjugát rozštěpí na své součásti, tj. volný oligonukleotid a O-acylarylový zbytek. Tento koncept předléčiva slouží k tomu, aby byl maskován negativní náboj • · · · ♦ · • ·

I • · 4 · « · · • » » · fl internukleotidového fosfátového můstku a tak byl usnadněn příjem oligonukleotidů buňkou. Proti konjugátům podle předkládaného vynálezu neprojevují tato zmíněná předléčiva urychlený příjem oligonukleotidů do buňky ani žádné změněné intracelulární rozdělení oligonukleotidů. Kromě toho nebylo zveřejněno nic o příjmu oligonukleotidů jinými organismy. Naproti tomu u konjugátů podle vynálezu konjugát zachovává vazbu mezi arylovým zbytkem a oligonukleotidem při příjmu buňkou, takže příjem kovalentních vazeb mezi arylovým zbytkem a oligonukleotidem může být snadno detekován pomocí fluorescenční mikroskopie, jestliže aromatická jednotka, jako např. FDA, vykazuje flourescenci teprve po naštěpení esteru.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je konjugát sestávající z alespoň jedné přenášené (transportované) molekuly a alespoň jednoho arylového zbytku podle vzorce I:

Aryl

R1 (i) přičemž v tomto vzorci aryl označuje skupinu, která obsahuje alespoň jeden kruh aromatického charakteru,

X je 0 nebo N, výhodně X = 0,

Y je 0, S nebo NH-R² , výhodně Y = O

R¹ je substituovaná nebo nesubstituovaná alkylová skupina obsahující 1 až 23 atomů uhlíku, která je přímá nebo rozvětvená a může obsahovat dvojné a/nebo trojné vazby, příkladem je arylalkylová skupina, • ·

• « « * « » · • « 4 • · · • · · · · ·

- 8 R² je substituovaná nebo nesubstituovaná alkylová skupina obsahující 1 až 18 atomů uhlíku, která je přímá nebo rozvětvená a může obsahovat dvojné a/nebo trojné vazby, n je celé číslo rovné nebo větší než 1, přitom arylovy zbytek je vázán k transportované molekule buďto přímo chemickou vazbou nebo nepřímo prostřednictvím chemické skupiny, přičemž chemická skupina není CH2-S-zbytek, když je vazba na transportovanou molekulu uskutečněna prostřednictvím internukleotidové fosfodiesterové vazby.

Transportovanou molekulou může být v podstatě jakákoliv molekula. Výhodně je to molekula s molekulovou hmotností > 350 (Dalton). Výhodným provedením vynálezu je konjugát, kde transportovaná molekula je makromolekula s molekulovou hmotností > 500 (Dalton), výhodně > 1000 (Dalton), zvláště výhodně > 2000 (Dalton) nebo větší. Transportovaná molekula může být také nízkomolekulární sloučenina, např.

s molekulovou hmotností < 500 (Dalton), výhodně s molekulovou hmotností 350 až 500 (Dalton). Takovou nízkomolekulární sloučeninou je např. mononukleotid.

Transportovaná molekula může být molekula z různých tříd chemických sloučenin, např. to může být biopolymer jako je např. polynukleotid, výhodně oligonukleotid, polypeptid, výhodně peptid nebo protein, peptidová nukleová kyselina (PNA) nebo polyamid, který obsahuje tři aromatické kruhy, a sice imidazolový, pyrolový a hydroxypyrolový kruh (Kielkopf et al. Science 282, 111-115 (1998)) nebo polysacharid, výhodně oligosacharid nebo jeho derivát.

Transportovaná molekula může být také peptidomimetikum.

Polynukleotidy, oligonukleotidy u mononukleotidy jsou buďto v přírodě se vyskytující nukleové kyseliny nebo jejich známé deriváty. Deriváty se rozumí kromě jiného od • » transportované molekuly, popřípadě jejího konjugátu, odvozené soli, zejména její fyziologicky přijatelné soli, a také např. modifikované, popřípadě stabilizované nukleové kyseliny.

Transportovaná molekula může být např. inhibitor transkripčních faktorů, např. NF-κΒ, c-fos nebo c jun, proteinů buněčného cyklu jako cyklin D, kináz jako jsou např. c-Src-, tyrosin- nebo MAP-kinázy; intracelulárních iontových kanálů, imunofilinů jako např. FK506 vazebný protein, prolyl4-hydroxylázy, topoisomerázy, virových proteáz, proteinu multilékové rezistence (Multiple Drug Resistance), a nebo fosfatázy jako např. proteintyrosinfosfatázy.

Transportovaná molekula je konjugována s jedním nebo více arylovými zbytky, např. dvěma, třemi, čtyřmi, pěti, šesti, sedmi, osmi, devíti, deseti, patnácti nebo dvaceti i více arylovými zbytky.

Arylový zbytek (jde zejména o arylový zbytek vzorce I a/nebo vzorce II) může být navázán na transportovanou molekulu jedenkrát nebo vícekrát, přičemž vazby mohou být lokalizovány v různých pozicích arylových zbytků. Když je na transportovanou molekulu navázáno více arylových zbytků, pak mohou být shodné nebo různé.

Arylový zbytek obsahuje arylovou skupinu (označena jako „aryl ve vzorcích I a II) ; která může sestávat z jednoho nebo více kruhů, přičemž však alespoň jeden kruh má aromatický charakter. Arylová zbytek a může také obsahovat heterocyklické kruhy, které současně mají aromatický charakter. Arylová zbytek a např. obsahuje 1 až 8 nebo i více kruhů (označované kruhový systém) , výhodně 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 nebo 8 kruhů. Jednotlivé kruhy jsou 3- až 7-členné kruhy, výhodně 5- až 6členné kruhy. Příkladem kruhových systémů jsou fenylové kruhy, pyridinylové kruhy, pyrimidinylové kruhy, pyrolylové kruhy, furanylové kruhy, thiofenylové kruhy, 5-členný laktonový

0 0 0 * 0 0 * * r

: .

- 10 kruh, 6-členný laktonový kruh, spirolaktonový kruh, benzochinonové kruhy, cyklohexadienylové kruhy a cyklohexenylové kruhy. Tyto kruhové systémy mohou mít arylové skupiny popřípadě jednotlivé kruhy arylové skupiny jedenkrát nebo vícekrát substituované. Výhodně je alespoň na jeden kruh arylové skupiny navázán acylový zbytek.

Arylová skupina má např. jeden ze vzorců Fl¹ , F2, F3', F4 ¹ , F6 ' , F7 ' , F8 ' , F9 ' , F10 ' , Fll¹ , které jsou uvedeny na obr. 1.

Arylový zbytek je navázán na transportovanou molekulu buďto přímo nebo prostřednictvím chemické skupiny. Předmětem předkládaného vynálezu je proto konjugát, kde tato chemická skupina společně s arylovým zbytkem má vzorec II:

Y u

-R3—Aryl+X R1 (Π) kde Aryl, X, Y a R1 jsou jak byly definovány v předchozím vzorci, a

R³ je chemická skupina, např. skupina C(=O)- nebo skupina -NHC(=S)-.

K příkladům arylového zbytku vzorce II patří arylové zbytky, které mají vzorce Fl, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9,

F10 a Fll; které jsou uvedeny na obr. 2a a 2b.

Ve zvláště výhodném provedení předkládaného vynálezu transportovaná molekula oligonukleotid. Oligonukleotid může být sestaven plně z nukleotidů jako je adenosinfosfát, guanosinfosfát, inosinfosfát, cytidinfosfát, uridinfosfát a thymidinfosfát. V jiném provedení vynálezu oligonukleotid současně obsahuje jednu nebo více modifikací, např. chemické ««φ · φ φ · · * · φφφ φφφφ φφφφ φφφ ·« · φφ · ♦ΦΦΦΦφΦ Φ · 9 9 9 9 » φφ· φφφ φ··φ Φ Φ Φ «Φ· ·· 9 99 9

- 11 modifikace. Jeden oligonukleotid může obsahovat více shodných a/nebo různých modifikací.

Příklady chemických modifikací jsou odborníkům známy a byly popsány např. v publikacích E. Uhlmann a A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543, Protocols for Oligonucleotides and Analogs Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993, J. Hunziker a C. Leumann 'Nucleic Acid Analogs: Sythesis and Properties' in Modem Synthetic Methods (Ed. Beat Ernst und C. Leumann) Verlag Helvetica Chimica Acata, Basel, S 331-417.

Chemické modifikace oligonukleotidů jsou např. následuj ící:

a) úplná nebo částečná náhrada fosfodiesterových můstků např. fosforothioátovým, fosforodithioátovým, NR1R1'-fosforamidátovým nebo boranofosfátovým můstkem, fosfát-O-alkylesterovým můstkem s alkylovou skupinou obsahující 1 až 21 atomů uhlíku, fosfát(aryl-O-alkyl)esterovým můstkem s arylovou skupinou obsahující 6 až 12 atomů uhlíku a alkylovou skupinou obsahující 1 až 21 atomů uhlíku, alkylfosfonátovým můstkem s alkylovou skupinou obsahující 1 až 8 atomů uhlíku a/nebo arylfosfonátovým můstek s arylovou skupinou obsahující 6 až 12 atomů uhlíku, přičemž

R¹ a R¹' jsou navzájem nezávisle atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 18 atomů uhlíku, arylová skupina obsahující 6 až 20 atomů uhlíku, arylalkylová skupina obsahující v arylové skupině 6 až 14 atomů uhlíku a v alkylové skupině 1 až 8 atomů uhlíku, výhodně atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 8 atomů uhlíku a/nebo methoxyethylová skupina, nebo

R¹ a R¹' společně s atomem dusíku, který je nese, vytvářejí 5- nebo 6-členný heterocyklický kruh, který navíc •4 · ► « 4 · 4 ♦ 44444

4 · 4 ♦ i *

4 < 4

4« ···♦

- 12 3'-thioskupina, a/nebo může obsahovat další heteroatom vybraný ze skupiny O, S a N.

b) Úplná nebo částečná náhrada fosfodiesterového můstku nacházejícího se na 3'- a/nebo 5'-konci nukleosidu defosfomůstkem (defosfomůstek byl popsán např. v Uhlmann, E. a Peyman, A. Methods in Molecular Biology, Band 20, Protocols for oligonucleotides and Analogs, S. Agrawal, Hrsg., Humana Press, Totowa 1993, Kapitola 16, 355ff), přičemž příkladem defosfomůstku je formacetálová, formacetálová, methylhydroxylaminová a oximová methylendimethylhydrazoskupina, dimethylensulfonová silylová skupina.

c) Úplná nebo částečná náhrada cukr-fosfátové jednotky z cukr-fosfátové kostry například:

morfolinovým oligomerem (popsán např. v E. P. Stirchak et al., Nucieic Acids Res. 17 (1989) 6129), nebo polyamid-nukleovou kyselinou (PNA) (např. popsanou v P.E. Nielsen et al. , Bioconj . Chem. 5 (1994) 3 a EP 0672677

A2), nebo nukleovou kyselinou s monoesterem fosfonové kyseliny (PHONA) (popsána např. v Peyman et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35 (1996) 2632-2638).

d) Úplná a/nebo částečná náhrada β-ϋ-2'-deoxyribózové jednotky modifikovanou cukernou jednotkou vybranou např. ze skupiny obsahující následující cukry:

a-D-2¹-deoxyribóza, L-2¹-deoxyribóza, 2'-F-2¹-deoxyribóza, 2'-O-alkylribóza, kde alkylová skupina obsahuje 1 až 6 atomů uhlíku, přičemž výhodná 2'-O-alkylribóza je 2'-O-methylribóza, 2¹-O-alkenylribóza, kde alkenylová skupina obsahuje 2 až 6 atomů uhlíku, 2'-[O-alkyl-O-alkyl]ribóza, kde každá alkylová skupina obsahuje 1 až 6 atomů uhlíku, 2 ' -NH₂-2'-deoxyribóza, β-D-xylofuranóza, a-arabinofuranóza, 2,4-dideoxy~P-D-erythrohexopyranóza a konformačně omezené analogy cukrů jako « Φ • 9 · 9 φ »<·»*«

9 » **·· 9

- 13 LNA (blokované nukleové kyseliny, Locked nucleic acids; Singh et al. , Chem. Commun. 4 (1998) 455; Singh et al. Chem.

Commun. 12 (1998) 1247), karbocyklické analogy cukrů (viz

např. Froehler, J	. Am.	Chem. Soc.	114 (1992)	8320)	a/nebo
cukerné analogy	s	otevřeným	řetězcem	(viz	např.
Vandendriessche et	al. ,	Tetrahedron	49 (1993)	7223)	a/nebo
bicyklické cukerné	analogy (viz např.	M. Tarkov	et al.	, Helv.

Chim. Acta 76 (1993) 481) .

e) Modifikace úplnou nebo částečnou náhradou přírodní nukleosidové báze např. modifikovanou nukleosidovou bází vybranou ze skupiny obsahující: 5-(hydroxymethyl)uráčil, 5-aminouracil, pseudouracil, pseudoisocytosin, dihydrouracil, 5-alkyluracil s alkylovou skupinou obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, 5-aklenyluracil s alkenylovou skupinou obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, 5-alkinyluracil s alkinovu skupinou obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, 5-alkylcytosin s alkylovou skupinou obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, 5-alkenylcytosin s alkenylovou skupinou obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, 5-alkinylcytosin s alkinovu skupinou obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, 5-fluoruracil, 5-fluorcytosin, 5-chloruracil, 5-chlorcytosin, 5-bromuracil, 5-bromcytosin a 7-deaza-7-substituovaný purin.

Další chemickou modifikací oligonukleotidu je navázání oligonukleotidu na jednu nebo více molekul, které ovlivňují vlastnosti oligonukleotidu (např. stabilita vůči nukleázám, afinita k cílové sekvenci, farmakokinetika oligonukleotidu, např. se takovou vazbou nebo zesítěním dosáhne hybridizace s cílovou sekvencí). Příkladem takové molekuly je polylysin, interkalační (vmezeřující se) činidla jako je např. pyren, akridin, fenazin nebo fenanthridin, fluorescenční činidla jako je fluorescein, zesilovací činidla jako je psoralen nebo azidoproflavin, lipofilní molekuly jako je alkylová skupina obsahující 12 až 20 atomů uhlíku, lipidy jako je «« * ► · · konj ugovány na modifikovaných mohou být přípravy

1,2-dihexadecyl-rac-glycerin, steroidy jako je cholesterin nebo testosteron, vitamíny jako je vitamín E, póly- nebo oligoethylenglykol, alkylfosfátdiester s alkylovou skupinou obsahující 12 až 18 atomů uhlíku, výhodně alkylfosfátdiester s alkylovou skupinou obsahující 14 až 18 atomů uhlíku a -O-CH₂-CH(OH)-O-alkylové skupiny s alkylovou skupinou obsahující 12 až 18 atomů uhlíku, výhodně -O-CH₂-CH(OH)-O-alkylové skupiny s alkylovou skupinou obsahující 12 až 16 atomů uhlíku. Tyto další molekuly mohou být vneseny na 5'-konec a/nebo 3'-konec a/nebo dovnitř sekvence, např.

nukleosidovou bázi. Způsoby oligonukleotidů jsou odborníkům známy a byly popsány např. v publikaci Uhlmann, E. & Peyman, A., Chem. Rev. 90 (1990) 543,

M. Manoharan in Antisense Research and Applications, Crooke a Lebleu, Ed. , CRC Press, Boča Raton, 1993, Kapitola 17, S. 303ff, a EP-A 0 552 766.

V dalším zvláštním provedení vynálezu oligonukleotid vykazuje 3'-3'- a/nebo 5'-5'-inverzi vnesenou na 3'- a/nebo 5'-konec oligonukleotidů. Tento způsob chemické modifikace je odborníkovi znám a byl popsán např. v publikaci M. Koga et al., J. Org. Chem. 56 (1991) 3757.

U konjugátu, který sestává z jednoho nebo více oligonukleotidů a jednoho nebo více arylových zbytků, výhodně podle vzorce I nebo II, se arylové zbytky mohou navázat (konjugovat) na 5'-konec (A) nebo na 3¹-konec (F) oligonukleotidů, na heterocyklickou bázi (E a G) , na cukr (C) nebo na internukleosidový můstek (B) oligonukleotidů. Navázání může být provedeno také např. na jiný než nukleotidový stavební element, jak je ukázáno např. v případě (D) . Všechny tyto příklady jsou uvedeny na obr. 3.

Uvedené modifikace mohou být odpovídajícím způsobem aplikovány také na delší polynukleotidy a vhodné mono- , «· 9 ·· * • · 9 4 9 *9

9 4 9 * ♦

999*49 9 *

9 9 9 9 •499 4 94 449

- 15 popřípadě dinukleotidy, popřípadě -nukleosidy.

Oligonukleotidy mají například délku 8 až 50 nukleotidů, výhodně 10 až 2 0 nukleotidů. Vhodné jsou také delší oligonukleotidy, oligo- popřípadě polynukleotidy, např. mající délku 50 až 10000 nukleotidů, výhodně 100 až 1000 nukleotidů, které mohou být eventuálně také ve formě dvouřetězce.

Oligonukleotid podle vynálezu může mít jakoukoliv vhodnou sekvenci. V závislosti na vybraném cíli se vybere nebo navrhne vhodná sekvence, např. v případě, že cílem je nukleová kyselina, pak v závislosti na této sekvenci, v případě, že cílem je protein, pak v závislosti na sekvenci, která tento protein kóduje. Pokud je cílem např. virus, a sice např. CMV, HIV, HSV-1, HSV-2, virus chřipky, VSV, virus hepatitidy B nebo Papilloma Virus, pak může mít oligonukleotid podle vynálezu jednu z následujících sekvencí:

a) proti CMV

SEKVENCE ID. Č. 12: 5'-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG

b) proti HIV

SEKVENCE ID. Č. 13: 5'-ACACCCAATTCTGAAAATGG-3' nebo

SEKVENCE ID. Č. 14 : 5'-AGGTCCCTGTTCGGGCGCCA-3' nebo

c) proti HSV-1

SEKVENCE ID. Č.15: 5'-GCGGGGCTCCATGGGGGTCG-3'.

Cílem může být např. protein, který se podílí na vzniku rakoviny, např. je zodpovědný za nádorový růst. K příkladům takových cílů patří:

1) jaderné onkoproteiny jako je např. c-myc, N-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, PCNA, pl20,

2) onkoproteiny asociované s cytoplazmatickou membránou

9 ·»♦»

44 4 » ♦ « » « ·

4 4

9 9 9

4 4

4 9 9 4 ·

- 16 jako je např. EJ-ras, cHa-ras, N-ras, rrg, bcl-2, cdc-2, craf-1, c-mos, c-src, c-abl, c-ets,

3) buněčné receptory jako je receptor EGF, Her-2, c-erbA, receptor VEGF (KDR-1), retinoidové receptory, regulační podjednotky proteinkináz, c-fms, Tie-2, c-raf-1 kináza, PKC-alfa, proteinkináza A (R1 alfa),

4) cytokiny, růstové faktory, extracelulární matrix, jako např. CSF-1, IL-la, IL-lb, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, bFGF, VEGF, myeloblastin, fibronektin.

Oligonukleotidy namířené proti takovým cílům mohou mít např. následující sekvence bází:

a) proti	c-Ha-ras
SEKVENCE	ID.	c.	16 :	5'-CAGCTGCAACCCAGC-3' nebo
SEKVENCE	ID.	c.	17 :	5'-TATTCCGTCAT-3' nebo
SEKVENCE	ID.	č.	18 :	5'-TTCCGTCATCGCTCCTCAGGGG-3
b) bFGF
SEKVENCE	ID.	v c.	19 :	5'-GGCTGCCATGGTCCC-3'
c) c-myc
SEKVENCE	ID.	sz c.	20 :	5'-GGCTGCTGGAGCGGGGCACAC-31
SEKVENCE	ID.	\z c.	21 :	5'-AACGTTGAGGGGCAT-3'
d) c-myb
SEKVENCE	ID.	v c.	22 :	5'-GTGCCGGGGTCTTCGGGC-3'
e) c-fos
SEKVENCE	ID.	č.	23 :	5'-CGAGAACATCATCGTGG-3’
SEKVENCE	ID.	v c.	24 :	5 ' -GGAGAACATCATGGTCGAAAG-3 1
SEKVENCE	ID.	č.	25:	5'-CCCGAGAACATCATGGTCGAAG-3
SEKVENCE	ID,	č.	26:	5'-GGGGAAAGCCCGGCAAGGGG-3'

·· · ·* * ·· ·· » · ♦ · · · · » · » · • · · «9 · · · * ·»···«* · · » * · · · · 9 · 9 · · ···· · ·· ··· ·♦ «···

f) ρ!20	Č.	27 :	5'-CACCCGCCTTGGCCTCCCAC-3'
SEKVENCE	ID.
g) receptor	EGF
SEKVENCE	ID.	V c.	28 :		5'-GGGACTCCGGCGCAGCGC-31
SEKVENCE	ID.	v c.	29	5	'-GGCAAACTTTCTTTTCCTCC-3'
h) nádorový	supresorový gen p53
SEKVENCE	ID.	Č.	30 :	5	'-GGGAAGGAGGAGGATGAGG-3'
SEKVENCE	ID.	c.	31 :	5	'-GGCAGTCATCCAGCTTCGGAG-3'
i) bcl-2
SEKVENCE	ID.	\z c.	32 :	5	'-TCTCCCAGCGTGCGCCAT
k) VEGF
SEKVENCE	ID.	č.	33 :	5	'-GCGCTGATAGACATCCATG
SEKVENCE	ID.	č.	34 :	3	'- CCAGCCCGGAGG -5, 5’-GGAGGCCCGACC-3'
SEKVENCE	ID.	\z c.	35 :	3	CGGAGGCTTTGG -5, 5'-GGTTTCGGAGGC-3'
SEKVENCE	ID.	č.	36 :	3	1 - GATGGAGGTGGT -5', 5'-TGGTGGAGGTAG-3'
SEKVENCE	ID.	e.	37:	3	'- GGAGGTGGTACG -5', 5'-GCATGGTGGAGG-3'
SEKVENCE	ID.	c.	38 :	3	GGTGGTACGGTT -5', 5'-TTGGCATGGTGG-3'
SEKVENCE	ID.	c.	39 :	3	CACCAGGGTCCG -5', 5'-GCCTGGGACCAC-3'
SEKVENCE	ID.	č.	40:	3	'- CCAGGGTCCGAC -51, 5'-CAGCCTGGGACC-31
SEKVENCE	ID.	\z c.	41 :	3	'- AGGGTCCGACGT-5, 5'-TGCAGCCTGGGA-3'
SEKVENCE	ID.	\s c.	42 :	3	GGGTCCGACGTG -5', 5'-GTGCAGCCTGGG-3'
SEKVENCE	ID.	č.	43 :	3	'- GGTCCGACGTGG -5, 5'-GGTGCAGCCTGG-31
SEKVENCE	ID.	\z c.	44 :	3	'- CCGACGTGGGTA-5, 5'-ATGGGTGCAGCC-3'
SEKVENCE	ID.	v c.	45 :	3	GTAGAAGTTCGG -5', 5'-GGCTTGAAGATG-3'
SEKVENCE	ID.	č.	46 :	3	ACGCCCCCGACG -5, 5'-GCAGCCCCCGCA-3'
nebo
SEKVENCE	ID.	č.	47 :		3'- CCCCCGACGACG -5', 5'-GCAGCAGCCCCC-3

l) c-raf kináza SEKVENCE ID. Č. 48:

m) PKC-alfa SEKVENCE ID. Č. 49:

5'- TCCCGCCTGTGACATGCATT

5¹-GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA

n) proteinkináza A SEKVENCE ID. Č. 50:

5'-GCGTGCCTCCTCACTGGC

V případě, že cílem je např. integrin nebo receptor účastnící se adheze buňka-buňka, jako je např. VLA-4., VLA-2, ICAM, VCAM nebo ELÁM, pak může mít oligonukleotid podle vynálezu jednu z následujících sekvencí:

a) VLA-4
SEKVENCE ID.	sz C.	51 :		5'-GCAGTAAGCATCCATATC-3'
b) ICAM-1
SEKVENCE ID.	č.	52 :	5 '	-GCCCAAGCTGGCATCCGTCA
SEKVENCE ID.	\z c.	53 :	5 '	-CCCCCACCACTTCCCCTCTC-3'
SEKVENCE ID.	č.	54 :	5 '	-CTCCCCCACCACTTCCCCTC-3'
SEKVENCE ID.	\z c.	55 :	5 '	-GCTGGGAGCCATAGCGAGG-3'
c) ELAM-1
SEKVENCE ID.	v c.	56 :	5 1	-ACTGCTGCCTCTTGTCTCAGG-31
SEKVENCE ID.	\z c.	57 :	5 1	-CAATCAATGACTTCAAGAGTTC-3
d) integrin	alfa (V)
SEKVENCE ID.	v c.	58 :	5 1	'-GCGGCGGAAAAGCCATCG

Jestliže cílem je protein, který je zodpovědný za proliferaci nebo migraci, nebo se případně na těchto procesech ♦ ·

999 9 9 99 9

9 · 9 9 · 9 9 9

9999 999 9999 9

9 9 9 9 9 9 9

9999 9 99 999 99 9999

- 19 podílí, jako je např.

1) jaderné transaktivační proteiny a cykliny, např. c-myc, c-myb, cfos, c-fos/jun, cyklin a cdc2-kináza,

2) mitogeny nebo růstové faktory jako např. PDGF, bFGF, VEGF, EGF, HB-EGF a TGF-β;

3) buněčné receptory jako je např. receptor bFGF, receptor EGF a receptor PDGF, pak oligonukleotid podle vynálezu může mít např. jednu z následujících sekvencí baží:

a) c-myb

SEKVENCE	ID.	Č.	59 :	5 '	-GTGTCGGGGTCTCCGGGC-3
b) c-myc
SEKVENCE	ID.	Č.	60 :	5 '	-CACGTTGAGGGGCAT-3'
c) cdc2-kináza SEKVENCE ID. Č.	61 :	5 '	-GTCTTCCATAGTTACTCA-3

d) PCNA (jádrový antigen proliferující buňky potkana)

SEKVENCE ID. Č. 62: 5'-GATCAGGCGTGCCTCAAA-3'.

Pokud jsou cílem např. adenosin-Al-receptor, adenosin-A3receptor, receptor bradikininu, nebo IL-13, pak je možná např. následující sekvence baží:

SEKVENCE ID. Č. 63: 5'-GATGGAGGGCGGCATGGCGGG.

Byly připraveny následující oligonukleotidy (5'->3'):

ONI: 5'-d(G*C G A C*G C*C A T*G A C*G*G) SEKVENCE ID. Č. 1 0N2: 5'-d(C*G A C*G C*C A T*G*A*C) SEKVENCE ID. Č. 2 0N3 : 5'-d(A*T*G A C*G G A A*T*T*C) SEKVENCE ID. Č. 3

				• · t · · • · 4 · · • ······ · • » · · 4 44 4 4 44
		- 20	-
0N4 :	5' d(TATTCCGTCAT), SEKVENCE	ID. Č. 4
0N5 :	5'-(dA)20	SEKVENCE ID. Č. 5
0N6 :	5 1 - (dA) 50	SEKVENCE ID. Č. 6
0N7 :	5 ' - (dA) 80	SEKVENCE ID. Č. 7
0N8 :	5 i_t*T*C	C*A T*G G*T G*G*C	SEKVENCE	ID. Č. 8
0N9 :	5 i_t*T*C	A*C T*G T*G G*G*C	SEKVENCE	ID. Č. 9
ONIO	: 5'-T*G*G	C*G C*C G*G G*C*C	SEKVENCE	ID. Č. 10
ONU	: 51-T*G*C	C*G G*C C*G G*G*C	SEKVENCE	ID. Č. 11,

přičemž * označuje pozici, kde byl fosfodiesterový můstek nahrazen fosforothioátovým můstkem.

Tyto sekvence byly v reakcích převedeny na následující konjugáty (KO):

KO_1 :	F3-Lil-ONI
KO_2 :	FO-Lil-ONl
KO_3 :	F3-LÍ1-ON2
KO_4 :	FO-LÍ1-ON2
KO_5 :	F3-LÍ1-ON3
KO_6 :	F9-LÍ1-ON3
KO_7 :	F2-LÍ-1ON3
KO_8 :	FO-LÍ1-ON3
KO_9:	F3-Lil-ON3-rhodamin
KO_10:	F9-Lil-ON3-rhodamin
KO_11:	F6-Li1-ON3-rhodamin
KO_12:	F 0 -Li1-ON3 -rhodamin
KO_13:	F3-LÍ1-ON4
K0__14 :	F3-LÍ1-ON5
KO_15:	F3-LÍ1-ON6
KO_16:	F3-LÍ1-ON7
KO_17:	F3-LÍ1-ON8
KO_18:	F3-LÍ1-ON9
KO_19:	F3-LÍ1-ON10

4 4 • 4 • 4 »04 44 4 • 44 » 4 4 4

4 « 4 4 β • 44···· · · • 4 4 4 4 • •44 · 44 44

ΚΟ_20: F3-LÍ1-0N11

Κ0_21: F7-LÍ1-ON3 přičemž

Fl až Fll jsou arylové zbytky vzorců Fl až Fll (uvedeny na obr. 2),

Lil je 6-aminohexylfosfátovy zbytek, který je vázán na 5'-konec oligonukleotidů (viz obr. 4),

ONI až ONU představují výše popsané oligonukleotidy mající sekvence uvedené zde jako SEKVENCE ID. Č. 1 až 11, a rhodamin znamená použití rhodaminového značení na 3'-konci oligonukleotidů .

Předmětem vynálezu jsou také způsoby výroby konjugátu podle vynálezu. Vynález se týká způsobu výroby konjugátu, který obsahuje transportovanou molekulu a alespoň jeden arylový zbytek, výhodně mající vzorec I nebo II , přičemž se

a) připraví transportovaná molekula, která obsahuje reaktivní skupinu v pozici, na kterou má být navázán arylový zbytek,

b) připraví se arylový zbytek, a

c) transportovaná molekula s arylovým zbytek je přeměněna na konj ugát.

Výhodně je reaktivní skupina např. aminoskupina, merkaptoskupina, chloracetylová skupina, isokyanátová skupina, isothiokyanátová skupina, karbonylová skupina,

N-hydroxysukcinimidová skupina nebo karbonylchloridová skupina. Reakce transportované molekuly s arylovým zbytkem se provádí při pH < 7,5, výhodně při pH < 7,3, zvláště výhodně při pH hodnotě 7,0 nebo nižší, např. pH <7, výhodně pH < 6,5. Při takové kondenzační reakci musejí být všechny ostatní reaktivní skupiny chráněny pomocí chránících skupin, které jsou odborníkovi známy. Ve zvláště výhodném provedení vynálezu jě transportovaná molekula polynukleotid, «44 4* 4 4« 44

4 4 4 4 «1 4 4 4 4 • 4« 4« 4 44 4

4444 444 4444 4

4 444 444

4444 4 44 444 44 4444

- 22 mohou být j ak byly oligonukleotid nebo mononukleotid.

Způsob přípravy zahrnuje v prvním kroku přípravu transportované molekuly. V tomto ohledu se předkládaný vynález týká také způsobu výroby oligonukleotidů. Oligonukleotidy připraveny pomocí různých chemických metod, např. popsány v publikaci Eckstein, F. (1991)

Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, IRL Press, Oxford. Oligonukleotidy mohou být také připraveny metodami, které obsahují jeden nebo více enzymatických kroků. Výroba oligonukleotidových konjugátů je v principu popsána v odborné literatuře (J. Goodchild, Bioconjugate Chem. 1 (1990) 165; S. Beaucage and R. lyer, Tetrahedron 49 (1993)

1925; S. Agrawal Methods in

Protocols for oligonucleotide Press).

Molecular Biology Vol. 26 Conj ugates (1994) Humana

Při syntéze oligonukleotidového konjugátu podle vzorce I je třeba mít na zřeteli, že se může rozkládat v alkalickém médiu. Proto není syntéza FDA-značených oligonukleotidů možná běžnými metodami na syntetizátoru oligonukleotidů, kdy by se hydrolyzovala esterová skupina FDA při působení amoniaku, který je nezbytný k odštěpění oligonukleotidů z nosiče a odštěpení amino-ochranných skupin heterocyklických bází.

Proto se nejdříve připraví oligonukleotid v nechráněné formě jako předstupeň a teprve v posledním kroku se kondenzuje se skupinou vzorce I (obr. 5) . Předstupeň oligonukleotidů má reaktivní, popřípadě aktivovatelnou skupinu, která se nakonec derivatizuje postupem, který je odborníkovi znám, pomocí činidla, zachovává skupinu vzorce I podle vynálezu. Jako reaktivní, popřípadě aktivovatelná skupina, přichází v úvahu aminoskupina, merkaptoskupina, chloracetylová skupina, isokyanátová skupina, isothiokyanátová skupina a karbonylová skupina. Zvláště snadno se do ·· 44 • ·· 4 4 4 4

4 4 « ·

4 4 4 4 4

4 4 4 4

444 *4 44 · 4

4 ·* • · 4 ·

4« 4 • · 4 4 · 4 · • 4 4 •4*4 4 44 oligonukleotidů vnášejí tzv. amino-spojky (amino-linkery) pomocí komerčně dostupných reagencií. Aminolinkeroligonukleotidy se pak pomocí reaktivních činidel obsahujících skupinu podle vzorce I přemění. K takovým reaktivním činidlům patří např. odpovídající isothiokyanáty. Skupiny vzorce I je v tomto případě navázaná prostřednictvím thiomočovinové skupiny (viz obr. 4) . K dalším reaktivním skupinám patří např. karbony1chloridová skupina. Mírným reaktivním činidlem je např. N-hydroxysukcinimid odpovídající karbonylové kyseliny. Aktivovatelná činidla jsou např. odpovídající karbonylové kyseliny, které je možné kondenzovat pomocí činidel pro kondenzaci peptidů jako je HBTU, TBTU nebo TOTU. V tomto případě je skupiny podle vzorce I navázána prostřednictvím amidové skupiny. V principu je možné vnést skupinu podle vynálezu vzorce I na libovolnou pozici oligonukleotidu. Výhodné jsou však pozice ukázané na obr. 3.

Syntéza modifikovaného oligonukleotidu se provádí výstavbou oligonukleotidového řetězce standardním způsobem, jako je např. syntéza na pevné fázi fosforamiditovou metodou a derivatizace 5'-konců komerčně dostupným modifikačním činidlem C6 (např. od firmy Eurogentec, Seraing, Belgien).

5'-aminomodifikátor C6 (Mmt = monomethoxytritylová skupina) *· « 99

9 9 9 9

9 9 9 9

9999 9 9 » • 9 9 9

9999 9 99

9 9 ·

9 9 9

9 9 9 9

9 9 9

999 99 9999 ··

- 24 Po odštěpení oligonukleotidového derivátu z nosiče a odstranění bazicky labilních ochranných skupin působením amoniaku se monomethoxytritylová skupina odštěpí působením 80% kyseliny octové při teplotě místnosti. Získá se tak oligonukleotid modifikovaný 5'-aminohexylfosfátem. Aminoskupina tohoto oligonukleotidového derivátu pak reaguje s FDA-isothiokyanátem ve 0,2M triethylamoniumbikarbonátovém pufru (TBK pufr) pH 7/DMF. Již asi za dvě až tři hodiny byla reakce aminolinker-oligonukleotidu s požadovaným FDA-derivátem ukončena (obr. 4) . Reakce s fluorescein-isothiokyanátem se normálně provádějí při pH 8. Při tomto pH je ovšem diacetát ve skupině FDA hydrolyzován.

Přirozeně se mohou užít i jiná aminolinkerová činidla, jako např. 5'-aminomodifikační činidlo C3 , 5'-aminomodifikační činidlo C12, 5¹-aminomodifikační činidlo 5 nebo 5¹-thiolmodifkační činidlo C5 (všechna činidla od firmy Eurogentec).

Užitím vsázky pevné fáze s 3¹-aminomodifikačním činidlem, např. 3'-aminomodifikátorem C3 CPG (od firmy Eurogenmtec) mohou být připraveny oligonukleotidové deriváty s 3'-aminoalkýlovou skupinou, které pak v reakci s FDA-isothiokyanátem poskytnou oligonukleotidové deriváty, které obsahují 3¹-vázanou skupinu vzorce I podle vynálezu.

Fmoc-HN

O-Dmt

I ^succinyl-CPG

3¹-aminomodifikátor C3 CPG (Fmoc = fluorenylmethoxykarbonyl) ·· · *· • · · · >

• · e 9 1 «··· · < » • · * · ···· « ·· ·· ·· • 9 9 9

9 9

9 9 1 • 99 •9 ·*··

Pro vnesení konjugátu na heterocyklickou bázi nukleosidu se při syntéze oligonukleotidu ušije místo normálních fosforamiditových stavebních kamenů odpovídající aminomodifikátor C6 dT (od firmy Eurogentec), který je odvozený z thymidinu. Na konci syntézy oligonukleotidu se pak trifluoracetylová chránící skupina odštěpí působením amoniaku a volné aminoskupiny se nechají reagovat v roztoku s FDAisothiokyanátem.

nh-co-cf₃

Obdobným způsobem se mohou skupiny vzorce I podle vynálezu vnést na libovolnou pozici oligonukleotidu. Je zřejmé, že je možné vícenásobné vnesení stejných nebo různých skupin.

Ve způsobu přípravy konjugátu, kde je transportovanou molekulou peptid-nukleová kyselina (PNA), se např. primární aminoskupina aminoethylové skupiny nechá reagovat s FDA-isothiokyanátem. Ve způsobu přípravy konjugátu, kde je ··· ·«·· · · · * ··· · · · · · · ······· · · · · · · • · ··· · · · ···· · ·· ··· ·· ····

- 26 transportovanou molekulou polypeptid, se např. využije aminokonec polypeptidu nebo aminoskupina postranního řetězce lysinu pro reakci s FDA-isothiokyanátem.

Předmětem předkládaného vynálezu je také použití konjugátu, zejména takové použití, které je založeno na výhodných vlastnostech konjugátu podle vynálezu. Zvláště výhodné provedení vynálezu se týká použití konjugátu pro transport molekul přes biologické membrány. Vynález se také týká použití arylových zbytků, výhodně podle vzorce I nebo II, pro transport molekul, na které jsou tyto arylové zbytky navázány, přes biologické membrány. Výhodně jde o biologické membrány, které jsou součástí buněk, vesikulů nebo organel.

Předmět předkládaného vynálezu jsou také způsoby transportu molekul přes membránu, kdy se

a) připraví konjugát, kde je transportovaná molekula navázána na alespoň jeden arylový zbytek vzorce I nebo II, a

b) inkubuje konjugát membránou.

Zvláště způsob transportu molekul v buňce, kdy se

a) připraví konjugát, kde je transportovaná molekula navázána na alespoň jeden arylový zbytek vzorce I nebo II,

b) inkubuje konjugát s buňkou, a

c) konjugát je přenesen do buňky, aniž by došlo k odštěpení arylového zbytku.

Vynález se týká zejména způsobů, kdy buňka je eukaryotická nebo prokaryotická buňka, např. bakteriální buňka, buňka kvasinky nebo buňka savce, výhodně buňka člověka.

Ve zvláště výhodném provedení je buňka patologicky změněná buňka, např. nádorová buňka.

Zlepšený buněčný příjem konjugátu byl prokázán nejen u buněk savců, ale také pro buňky jiných ukaryot a také prokaryotické buňky.

Konjugáty podle vynálezu byly zkoumány z hlediska jejich • · · · • · ·

- 27 příjmu živými buňkami. Pro tento účel byla zkoumána buněčná průchodnost FDA-značených oligonukleotidů KO_1 a K0_3. Jako sloučeniny známé ze stavu techniky byly užity fluoresceinem značené oligonukleotidy K0_2 a K0_4. Všechny zkoumané živé kultury živočišných buněk přijímaly KO_1 a K0_3 (FDA-konjugát) během 5 až 10 minut, zatímco KO_2 a K0_4 (fluoresceinkonjugát) nebyly po této době ve vitálních buňkách vůbec patrné (viz tabulka 1).

Jelikož příjem v bakteriích a kvasinkách probíhá mnohem pomaleji než v savčích buňkách, po dvou hodinách probíhal byl ještě příjem oligonukleotidu podle vynálezu v části buněk, zatímco normální fluoresceinem značené oligonukleotidy nebyly za těchto podmínek buňkami vůbec přijímány. Je překvapivé, že v principu všechny dosud zkoumané organizmy přijímaly oligonukleotidy podle vynálezu lépe než známé oligonukleotidové deriváty. K těmto organismům patřily mj . živočišné buňky, bičíkovci, kvasinky, houby a baktérie (viz tabulka 3).

Dále se ukázalo, že nádorové buňky zvláště dobře přijímaly oligonukleotidy. Proto je použití oligonukleotidů podle vynálezu zvláště výhodné při terapii nádorů. FDAznačený antisense oligonukleotid KO_1, namířený proti eg5, inhiboval po přidání do média proliferaci buněk A549, zatímco odpovídající nemodifikovaný antisense oligonukleotid ONI a fluoresceinem značený oligonukleotid K0_2 inhibovaly proliferaci nádorových buněk až po formulaci s činidlem zvyšujícím penetraci jako je např. CellFectin.

Předkládaný vynález se dále týká použití konjugátu, kde je transportovanou molekulou oligonukleotid, pro hybridizaci s jednořetězcovou a/nebo dvoj řetězcovou nukleovou kyselinou, např. DNA (genomovou DNA, cDNA) a/nebo RNA (pre-mRNA, mRNA). Tyto konjugáty se mohou sekvenčně specificky vázat na

- 28 intracelulární proteiny jako jsou enzymy, např. polymeráza nebo telomeráza, nebo na transkripční faktory, pro modulaci nebo částečnou či úplnou inhibici exprese určitého cílového genu, např. k úplné nebo částečné inhibici transkripce a/nebo translace. Vynález se týká také použití takových konjugátů jako antisense oligonukleotidů, ribozymů, sense oligonukleotidů, oligonukleotidů vytvářejících trojšroubovici, chiméraplastů a/nebo vějičkových oligonukleotidů. Proto se mohou konjugáty podle vynálezu využít jako pomocná činidla v molekulární biologii.

Dále se popřípadě dostupnost

Vynález se dále týká použití oligonukleotidů jakožto léčiva a/nebo diagnostického činidla, případně také použití oligonukleotidů pro výrobu léčiva a/nebo diagnostického činidla. Oligonukleotidy podle vynálezu se mohou užít zejména v léčivech pro prvenci nebo léčení nemocí, které jsou způsobeny expresí, popřípadě nadměrnou expresí určitého genu.

mohou oligonukleotidy využít pro diagnostiku, časné rozpoznání takových nemocí. Jelikož je oligonukleotidů podle vynálezu pro buňku velmi dobrá, mohou se užít i pro in vivo, např. pro hybridizaci v celých orgánech nebo intaktním organismu.

Předmětem vynálezu jsou také léčivé přípravky, které obsahují jeden nebo více konjugátů podle vynálezu. Předmět vynálezu jsou také diagnostické přípravky, které obsahují jeden nebo více konjugátů podle vynálezu. Předmětem vynálezu je dále diagnostická souprava (kit), která obsahuje jeden nebo více konjugátů podle vynálezu.

Vynález se týká také použití oligonukleotidů pro detekci, separaci a amplifikaci nukleových kyselin a jejich analogů. Konjugáty jsou vhodné zejména k průkazu nukleových kyselin v buňkách, zejména v živých buňkách. Může se jednat • · · · · 4 • · · * · · 4 • · · · 4 · • ······ · · • · · 4 4 ••44 · ·4 ···

- 29 o buňky humánního nebo živočišného původu. Konjugáty jsou zvláště určeny pro organizmy uvedené v tabulce 3, zejména k prokázání patogenních organizmů. Oligonukleotidy podle vynálezu mohou být užity v jakékoliv známé technické variantě amplifikace nukleových kyselin, zejména LMPCR (ligaci zprostředkovaná polymerázová řetězová reakce) , v Invader Assay (ochranná známka Third Wave Technologies, lne., Wisconsin), v systému TaqMan (ochranná známka) nebo při multiplexovém genotypování. Výhodné je také použití oligonukleotidů pro amplifikaci nukleových kyselin pomocí světelných cyklerů, které umožňují stanovení míry amplifikace v reálném čase. Detekce na principu molekulárních světelných signálů, kdy fluorescenční barvivo v nenavázaném stavu nefluoreskuje, neboř fluorescence je jinou skupinou v oligomeru zhášena, je další možností využití oligonukleotidů podle vynálezu. Např. se může kombinovat FDA-derivát (např. na 5'-konci oligonukleotidů) s Dabcylovým zbytkem (např. konjugovaným na 3¹-konci), který po přeměně FDA-derivátu na fluorescein-derivát fluorescenční signál v nenavázaném stavu zháší. Takové FDA-modifikované světelné signály teprve po vstupu do buňky a hybridizaci s cílovou mRNA vysílají fluorescenční signál.

Vynález se týká také použití oligonukleotidů, popřípadě léčiva, které obsahuje tento oligonukleotid, k léčení nemocí, jejichž příčinou je nadměrná exprese definovaného genu.

Léčivo podle vynálezu se může užít např. k léčení nemocí, které jsou způsobeny viry, jako je CMV, HIV, HSV-1, HSV-2, virus chřipky, VSV, virus hepatitidy B nebo Papilloma virus. Léčivo podle vynálezu se může užít také k léčení rakoviny. Léčivo podle vynálezu je dále zvláště vhodné k léčení nemocí, které jsou ovlivňovány integriny nebo adhezními receptory buňka-buňka, např. VLA-4., VLA-2, 1CAM, VCAM nebo ELÁM. Léčivo

- 30 podle vynálezu je dále vhodné např. k zabránění restenózy, k léčení vitiliga a dalšícjh depigmentačních nemocí nebo poruch (např. kůže, vlasů, očí) jako je např. albinismus, lupénka, a také k léčení astmatu.

Lék je farmaceutický přípravek, který se podává a) perorálně, např. ve formě tablet, dražé, tvrdých nebo měkkých tobolek, roztoků, emulzí nebo suspenzí, nebo b) rektálně, např. ve formě čípků, nebo c) parenterálně, např. ve formě injekčního roztoku. Pro výrobu léku může být konjugát např. zapracován do terapeuticky inertního organického a/nebo anorganického nosiče, např. jako nosiče pro tablety, dražé a tvrdé želatinové tobolky lze laktózu, kukuřičný škrob a jeho deriváty, mastek, kyselinu stearovou a její soli. Jako nosič pro roztoky se užívá voda, polyoly, sacharóza, invertní cukr, glukóza, pro injekční roztoky je to voda, alkoholy, polyoly, glycerol a rostlinné oleje, pro čípky jsou to rostlinné a ztužené oleje, vosky, tuky a polotekuté polyoly. Lék může navíc obsahovat konzervační činidla, rozpouštědla, stabilizační činidla, zesífovací činidla, emulgátory, sladidla, barviva, ochucující přísady, soli ovlivňující osmotický tlak, pufry, potahovací činidla, antioxidanty, a také další terapeuticky účinné látky. Výhodně je lék aplikován lokálně nebo topicky, např. pomocí katétru nebo inhalátoru, nebo pomocí injekce či infúze. Pro injekci je konjugát výhodně formulován v tekutém roztoku, výhodně ve fyziologicky přijatelném pufru jako je např. Hankův roztok nebo Ringerův roztok. Konjugát může být formulován i do tuhé lékové formy, a před použitím rozpuštěn nebo resuspendován. Pro systémové podávání je výhodná denní dávka přibližně 0,01 mg/kg až přibližně 50 mg/kg tělesné hmotnosti.

Konjugáty a/nebo jejich fyziologicky přijatelné soli se mohou podávat zvířatům a zejména člověku jakožto léčiva, ·· · • · ······· · · * · · · • · · · · · · · ···· · ·· ··· ·· ···

- 31 a sice samotné nebo ve směsích nebo ve formě farmaceutického přípravku, který je vhodný pro topické, perkutánní, parenterální nebo enterální podávání, a který kromě obvyklých farmaceutických pomocných látek obsahuje jako hlavní účinnou složku účinnou dávku alespoň jednoho konjugátu podle vynálezu. Farmaceutický přípravek obvykle obsahuje přibližně 0,1 až 90 % (hmot.) terapeuticky účinné sloučeniny. Pro léčení kožních onemocnění, jako je např. lupénka nebo vitiligo, je výhodné topické podávání přípravku např. ve formě masti, locionu nebo tinktury, emulze či suspenze. Výroby farmaceutického přípravku se provádí způsoby, které jsou odborníkům známy (viz např. Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publ. Co., Easton, PA.), při kterých se užívají anorganické a/nebo organické nosiče. Pro výrobu pilulek, tablet, dražé a tvrdých želatinových tobolek lze užít jako nosiče např. laktózu, kukuřičný škrob a jeho deriváty, mastek, kyselinu stearovou a její soli. Jako nosič pro čípky jsou to rostlinné a ztužené oleje, vosky, tuky a polotekuté polyoly. Jako nosič pro výrobu roztoků a sirupů se užívá voda, polyoly, sacharóza, invertní cukr, glukóza. Pro výrobu injekčních roztoků je to voda, alkoholy, polyoly, glycerol a rostlinné oleje. Jako nosiče pro výrobu mikrotobolek, implantátů a/nebo tyčinek se užívají směsné polymery kyseliny glykolové a kyseliny mléčné. Kromě toho jsou vhodné liposomové přípravky, které jsou odborníkům známy (N. Weiner, Drug Develop Ind Pharm 15 (1989)

1523; Liposome Dermatics, Springer Veriag 1992), např. liposomy HVJ (Hayashi, Gene Therapy 3 (1996) 878) .

Lék kromě účinné látky a nosiče může obsahovat ještě další pomocné látky jako plnidla, rozvolňovadla, pojidla, kluzná činidla, zesíúovací činidla, stabilizátory, emulgátory, konzervační činidla, sladidla, barviva, ochucující přísady, zahušůovadla, ředidla, pufry, potahovací činidla, ·· · · • φ ·

• φ ·· · • φ φ · φφφφ

- 32 a rozpouštědla a/nebo rozpouštění usnadňující činidla a/nebo prostředky k dosažení depotního účinku jako jsou soli ovlivňující osmotický tlak, potahovací látky a antioxidanty. Přípravky mohou také obsahovat dva nebo více různých oligonukleotidů a/nebo jejich fyziologicky přijatelných solí podle vynálezu a vedle alespoň jednoho oligonukleotidu jednu nebo více dalších terapeuticky účinných látek. Velikost dávky leží v širokém rozmezí a musí být vždy v každém jednotlivém případě určena individuálně.

Popis obrázků

Obrázek 1: Obrázek ukazuje příklady arylových zbytků vzorce (I) ·

Obrázek 2a a b: Obrázek ukazuje příklady arylových zbytků vzorce (II).

Obrázek 3: Obrázek ukazuje různé příklady (A, B, C, D, E, F, G) konjugátů transportované molekuly (v tomto úřípadě jde o oligonukleotid a arylového zbytku vzorce (I) . „R označuje zbytek vzorce (I); „B označuje heterocyklickou bázi.

Obrázek 4: Obrázek ukazuje možnost přípravy konjugátu podle vynálezu (v tomto případě sestávajícího z FDA-isothiokyanátu a oligonukleotidu).

Obrázek 5: Obrázek ukazuje časový průběh příjmu konjugátu K0_5 z média buňkami REH, kdy bylo použito médium bez séra (♦) a médium se šerem (). Buněčný příjem byl sledován pomocí FACS.

♦ 4 • · 4 4 4 4 44

4 4 · 4 ·· 4 • •4 44 4 44 4 • 444444 4 4 44 4 4

4 444 444

4444 4 44 444 44 4444

- 33 Obrázek 6: Stanovení příjmu KO_1 (FDA-konjugát; ♦) a K0_2

(FITC-oligomer;	) pomocí FACS.	Počáteční	koncentrace
extracelulárního	oligonukleotidu byla	1 μΜ; O a	□ označují
kontroly.
Obrázek 7: Závislost transfekce	REH buněk	na délce
FDA-konj ugovaného	polyAnukleotidu.

Obrázek 8: Srovnání buněčného příjmu fluorescein-diacetátového a fluorescein-dipivalátového konjugátu oligonukleotidu

- K39: karboxyfluorescein-diacetát (F3 je FDA) z příkladu 15

- K41: karboxyfluorescein-dipivalát (F2) z příkladu 10.

Obrázek 9: Vyšetření buněčného příjmu dvojnásobně značeného Cy3-oligonukleotid-F3-konjugátu [1 μΜ] při inkubaci s buňkami REH fluorescenční mikroskopií. Příjem po 4 hodinách: Vlevo fluorescenční značení. Uprostřed: kyaninové barvivo. Vpravo: Snímek ve fázovém kontrastu, nahoře: oligonukleotid K33, dole: oligonukleotid K34.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Syntéza oligonukleotidů

Oligonukleotidy byly syntetizovány pomocí

DNA-syntetizátoru (Applied Biosystems model 380B nebo 394) standardním postupem fosforamiditové chemie s oxidací jódem (F. Eckstein, Ed Oligonukleotides and Analogues, A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1991). K vnesení

« ·

- 34 fosforothioátových můstků ve míšených fosforothioátových a fosfodiesterových oligonukleotidech byl k oxidaci místo jódu užit TETD (tetraethylthiuramdisulfid) nebo Beaucageho činidlo. Po odštěpení pevného nosiče (CPG nebo Tentagel) a odstranění chránících skupin působením koncentrovaného NH₃ při 55°C po 18 hodin byly oligonukleotidy nejdříve přečištěny vysrážením v butanolu (Sawadogo, Van Dyke, Nucl. Acids Res. 19 (1991)

674) . Dále byly oligonukleotidy čištěny preparativní gelovou elektroforézou nebo pomocí FLPC. A nakonec byla získána jejich sodná sůl vysrážením 0,5M NaCl roztoku užitím 2,5 objemů ethanolu.

Oligonukleotidy byly analyzovány následujícími postupy:

a) Analytická gelová elektroforéza ve 20% akrylamidu obsahujícím 8M močovinu ve 454mM trisborátovém pufru, pH 7,0, a/nebo

b) Analýza HPLC: Kolona Waters GenPak FAX, gradient CH₃CN (400 ml), H₂0 (1,6 1), NaH₂P0₄ (3,1 g) , NaCl (11,7 g) , pH 6,8 (O,1M pro NaCl) na CH₃CN (400 ml), H₂0 (1,6 1), NaH₂PO₄ (3,1 g), NaCl (17,53 g), pH 6,8 (1,5M pro NaCl) a/nebo

c) Kapilární gelová elektroforéza užitím gelové kapilární kolony Beckmann eCAP™ U100P, délka 65 cm, vnitřní průměr 100 mm, okénko 15 cm od jednoho konce, pufr je 140 μΜ Tris, 360mM borát a 7M močovina a/nebo

d) Elektronsprejová hmotová spektroskopie.

Tyto analýzy oligonukleotidů ukázaly, že byly získány v čistotě vyšší než 90%, většinou vyšší než 95%.

• 4 9 99 4 ·· ·· •44 · · 99 9 9 9 9 • 94 ·· · 99 ·

99*9999 9 9 99 9 9 • 9 ··· ···

- 35 Příklad 2

Vnesení 5'-amino-linkeru do oligonukleotidu

Oligonukleotidy byly syntetizovány postupem popsaným v příkladu 1. Po kondenzaci posledního nukleotidu byla odštěpena dimethyloxytritylová skupina na 5'-konci. Volná hydroxylová skupina se pak nechala reagovat s komerčně dostupným 5'-aminomodifikátorem C6 (od firmy Eurogentec, Seraing, Belgie) při katalýze tetrazoliem, a pak oxidovat jódovou vodou. Pak byl oligonukleotid odštěpen od nosiče působením amoniaku při 50 °C přes noc a všechny bazicky labilní chránící skupiny na internukleosidových skupinách a aminoskupinách heterocyklických baží byly odštěpeny. V posledním kroku byla odštěpena monomethoxytritylová ohraničí skupina působením 80% kyseliny octové po 3 hodiny při teplotě místnosti. Výsledný oligonukleotid byl analyzován stejně jako bylo pospáno v příkladu 1.

Příklad 3

Konjugace oligonukleotidu opatřeného amino-linkerem s isothiokyanátem

OD (260) oligonukleotidu opatřeného 5'-amino-linkerem z příkladu 2 bylo rozpuštěno v 0,2 M triethylamoniumbikarbonátovém pufru (TBK) a smícháno se 125 μΐ dimethylformamidu (DMF). K této směsi bylo přidáno 1,5 mg FDA-isothiokyanátu a směs se třepala 3 hodiny za vyloučení světla. Úspěšnost reakce byla vyhodnocena pomocí HPLC. Pak se přidala kyselina octová a směs se koncentrovala pod vakuem.

······· · * ·· · · • · ♦ · · · · · ·«·· · ·· ··· ·· ··*·

- 36 Nakonec byl produkt přečištěn butanolovou precipitací. Pomoci ESI-hmotové spektroskopie byla stanovena správná molekulová hmotnost. Sondy byly získány při pH nižším než 7, takže nedošlo k hydrolýze aromatických esterů.

Příklad 4

Syntéza KO_1 (G*CGAC*GC*CAT*GAC*G*G-3', F3 = FDA)

Oligonukleotid byl získán z CPG nosiče s 1 μιτηοΐ 3¹-koncově vázaného desoxyguanosinu, jak bylo popsáno v příkladu 1. V pozicích označených * byla provedena oxidace s Beaucageho činidlem, aby se na tato místa vnesly fosforothioátové můstky. Pak byl kondenzován 5'-aminomodifi kátor stejně jako v příkladu 2. Po odstranění chránících skupin koncentrovaným amoniakem a 80% kyselinou octovou se získalo 96 OD (260) 5¹-aminolinker- G*CGAC*GC*CAT*GAC*G*G-3'.

OD (260) 5'-aminolinker-oligonukleotidu se ponechalo reagovat s FDA-isothiokyanátem, stejně jak bylo popsáno v příkladu 3. Po butanolové precipitací se získalo 8,4 OD (260) požadovaného FDA-značeného oligonukleotidu ESI-MS pro disodnou sůl: 5395,93 (výpočet pro disodnou sůl: 5395,09)

Příklad 5

Syntéza K0_13 (5'-F3-TATTCCGTCAT-3')

Oligonukleotid byl získán z CPG nosiče s 1 μπιοί 3'-koncově vázaného thymidinu, jak bylo popsáno v příkladu 1. Všechny oxidace byly provedeny jódovou vodou. Pak byl kondenzován 5'-aminomodifikátor C6 stejně jako v příkladu 2. Po odstranění chránících skupin koncentrovaným amoniakem a 80% kyselinou octovou se získalo 72 OD (260) 5'-aminolinkerTATTCCGTCAT-3'. Po vyčištění na preparátivním polyakrylamidovém gelu se získalo 43 OD (260).

OD (260) 5'-aminolinker-oligonukleotidu se ponechalo stejně jako v příkladu 3 reagovat s FDA-isothiokyanátem. Po butanolové precipitaci se získalo 9,1 OD (260) požadovaného FDA-značeného oligonukleotidů. ESI-MS: 3934,1 (vypočtená m.h. 3933,8).

Příklad 6

Syntéza KO_21 (5'-F7-A*T*G A C*G G A A*T*T*C)

Oligonukleotid byl získán z CPG nosiče nesoucího 1 μιηοΐ 3¹-koncově vázaného N6-benzoylcytidinu, jak bylo popsáno v příkladu 1. Všechny oxidace byly provedeny jódovou vodou. Pak byl kondenzován 5'-aminomodifikátor C6 stejně jako v příkladu 2. Po odstranění chránících skupin koncentrovaným amoniakem a 80% kyselinou octovou se získalo 145 OD (260) 5'-aminolinker- A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3'.

OD (260) 5'-aminolinker-oligonukleotidu se rozpustilo v 16 μΐ 0,2M TBK pufru a 95 μΐ DMF a pak se ponechalo reagovat s 30 μΐ předem připraveného aktivního esteru kyseliny acetoxybenzoové. Aktivní ester se připravil tak, se smíchalo 50 μΐ 0,2M p-acetoxybenzoové kyseliny s 50 μΐ 0,3M TBTU, taktéž v DMF, 1 hodinu při teplotě místnosti. Po 4 hodinách reakce aminolinker-oligonukleotidu s aktivním esterem se přidaly 2 μΐ semikoncetrované kyseliny octové a reakce se

44 44 «444 • 4 4 4

4 4 4 4

4 4 4

444 4« 4444 • 4 4 4· • 4 4 4 4 • 4 4 4 4 ««···· 4 • 4 4 4 «444 4 4« zakoncentrovala ve vakuu. Přebytečné reagencie se odstranily precipitací butanolem. Získalo se 10,7 OD (260) požadovaného oligonukleotidového konjugátu. ESI-MS: 4109,2 (vypočtená m.h. 4108,2).

Příklad 7

Výzkum buněčného příjmu oligonukleotidových konjugátů ml ΙμΜ roztoku bylo provedeno

Pro výzkum buněčného příjmu byl 1 ml buněčné suspenze v kultivačním médiu (nebo po promytí v PBS v případě média s vlastní fluorescencí) přenesen pod mikroskopem do Bachoferovy komůrky a byl přidán 1 oligonukleotidového konjugátu, přičemž promíchání pipetou a pak ještě protřepáním komůrky. Mikroskop byl pomocí zařízení Zeiss Axiovert 135 TV (lOOx Plan-Neofluar) upraven pro pozorování ve fázovém kontrastu. Jako fluorescenční filtr sloužil filtr 09 (450-4901 FT 510/LP 520)/HBO 59W. Jako referenční vzorek sloužil 2,4 μΜ roztok FDA (Aldrich Chem. Co, m.h. 416.39) v acetonu/PBS (1:1000; objem:objem) . V případě FDA konjugátu se po příjmu do buňky dá sledovat fluorescence, která je důsledkem rozštěpení esterové vazby fluoescein-ligandu. V případě nefluorescenčních ligandů, jako je acetoxynaftalenkarbonylová kyselina, se navíc užije vhodná fluorescenční značka (FITC, rhodamin, kyaninová barviva jako Dy 3 nebo Dy5) . Dvojité značení, jaké je např. u KO_9, slouží k tomu, aby se prokázalo, že FDA se z oligonukleotidu neodštěpuje. Jednotlivé sondy byly hodnoceny 2 až 120 minut po přidání oligonukleotid-konjugátu. U buněk REH byla fluorescence po 5 až 10 minutách zřetelně rozpoznatelná, u buněk K562 a adherentních buněk a u hmyzích buněk určitý • 9 1 9« • 9 · 9 9 9 • · · · » • 4449 4 » ·

4 4 4

44 β · « · ·

9 9 9 • 99 •9 99*9 příjem probíhal až do 60 minut po přidání. U volných protozoí trval příjem až 1 hodinu. U kvasinek byl příjem patrný až po delším čase a nebyl homogenní u všech buněk. Spory hub přijímaly FDA-oligonukleotidové konjugáty než hyfové buňky. Výsledky jsou shrnuty v tabulkách 1 až 3.

Příklad 8

Výzkum antiproliferativniho účinku oligonukleotidového konjugátu

Buňky REH (humánní Pre-B-leukemické buňky, DSM ACC 22) nebo nádorové buňky A549 byly kultivovány v médiu OptiMEM (Gibco BRL) s 10% fetálním telecím sérem (FKS, GIBCO-BRL) při 37 °C v 5% CO₂. V den pokusu byly buňky přeočkovány tak, aby po 24 hodinách byla dosažena hustota buněk přibližně 1 x 10⁶/ml. Oligonukleotidy, popřípadě jejich konjugáty, byly naředěny v destilované vodě na lmM zásobní roztoky, které byly uchovávány v mrazícím boxu při -20 °C. Zaočkování buněk: 1 x 10⁶ buněk/ml v médiu OptiMEM s 10% FKS bylo provedeno na 24jamkové destičce. Pro experiment byly oligonukleotidové deriváty naředěny na 2 μΜ (v médiu OptiMEM bez FKS) . V každé jamce bylo smíchání 100 μΐ roztoku oligonukleotidu a 100 μΐ buněčné suspenze (celkový objem 200 μΐ na jamku, koncentrace oligonukleotid 1 μΜ, koncentrace séra 5 %, koncentrace buněk 0,5 x 10⁶/ml) . Po 4hodinové inkubaci při 37 °C v 5% CO2 bylo přidáno do každé jamky 800 μΐ média OptiMEM s 11% FKS (nyní byla koncentrace buněk 1 x 10⁵/ml, koncentrace séra 10 %) a inkubace pokračovala dále. Po 96hodinové inkubaci při 37 °C v 5% CO2 byla změřena hustota buněk na zařízení Časy 1 (Schárfe) .

Kvůli tomu byly buňky v každé jamce dobře promíchány lOx opakovaným nasátím ΙΟΟΟμΙ pipetou a ihned naředěny 1:100 (při rychlém růstu buněk 1:200) pomocí Casyton. Střední hodnota hustoty buněk byla určena ze tří jednotlivých jamek s přidanou stejnou oligonukleotidovou sondou.

Příklad 9

Syntéza 5'-F4'(CO-NH)-A*T*G A C*G G A A*T*T*C

Oligonukleotid byl získán z CPG nosiče nesoucího 1 μιηοΐ 3'-koncové vázaného N4-benzoylcytidinu, jak bylo již popsáno v příkladu 1. Všechny oxidace byly provedeny jódovou vodou, popřípadě pomocí Beaucageho činidla, aby byly vneseny do sekvence fosforothiátové vazby (označeny *) . Pak byl kondenzován 5'-aminomodifikátor C6 stejně jako v příkladu 2. Po odstranění chránících skupin koncentrovaným amoniakem a 80% kyselinou octovou se získalo 145 OD (260) 5'-aminolinkerA*T*GAC*GGAA*T*T*C-3'.

OD (260) 5¹-aminolinker-oligonukleotidu se rozpustilo v 16 μΐ 0,2M TBK pufru a 95 μΐ DMF a pak se ponechalo reagovat s 12,5 μΐ dichlorfluoresceindiacetát-hydroxysukcinimidu (m.h. 626,36). Po 3 hodinách reakce aminolinker-oligonukleotidu s hydroxysukcinimidem se přidaly 2 μΐ semikoncetrované kyseliny octové a reakce se zakoncentrovala ve vakuu. Po vysolení na koloně NAP™ (Pharmacia) se provedla precipitace butanolem. Získalo se tak 2,8 OD (260) požadovaného oligonukleotiddichlorfluoresceindiacetát-konjugátu. ESI-MS: 4403,3 (vypočtená m.h. 4403,2).

- 41 Příklad 10

Syntéza 5'-F2'-(CO-NH)-A*T*G A C*G G A A*T*T*C

Oligomer 5'-aminolinker-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-3' byl syntetizován jak bylo popsáno v příkladu 9.

OD (260) 5'-aminolinker-oligonukleotidu se rozpustilo v 16 μΐ 0,2M TBK pufru a 95 μΐ DMF a pak se ponechalo reagovat s 12,5 μΐ dichlorfluoresceindiacetát-hydroxysukcinimidu (m.h. 641,64). Po 2 hodinách reakce aminolinker-oligonukleotidu s hydroxysukcinimidem se přidalo dalších 12,5 μΐ hydroxysukcinimidu a reakce pokračovala další 2 hodiny. Pak se přidaly 2 μΐ semikoncetrované kyseliny octové a reakce se zakoncentrovala ve vakuu. Po vysolení na koloně NAP™ (Pharmacia) se provedla precipitace butanolem. Získalo se tak 8,1 OD (260) požadovaného oligonukleotid-fluoresceindipivalátkonjugátu. ESI-MS: 4472,9 (vypočtená m.h. 4471,6).

Příklad 11

Syntéza 5'-F9-A*T*G A C*G G A A*T*T*C

Oligomer 5¹-aminolinker-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3' byl připraven jak bylo popsáno v příkladu 9.

OD (260) 5¹-aminolinker-oligonukleotidu se rozpustilo v 16 μΐ 0,2M TBK pufru a 95 μΐ DMF a pak se ponechalo reagovat s 25 μΐ předem připraveného aktivního esteru kyseliny acetoxynaftylkarbonylové. Aktivní ester se připravil tak, se smíchalo 12,5 μΐ 0,2M acetoxynaftylkarbonylové kyseliny

- 42 (2,5 mg v 50 μΐ DMF) s 12,5 μΐ TBTU (4 mg v 50 μΐ DMF) v lhodinové reakci při teplotě místnosti. Po 17 hodinách reakce aminolinker-oligonukleotidu s aktivním esterem se přidaly 2 μΐ semikoncetrované kyseliny octové a reakce se zakoncentrovala ve vakuu. Po vysolení na koloně NAP™ (Pharmacia) se provedla precipitace butanolem. Získalo se tak 8,5 OD (260) požadovaného oligonukleotid-acetonaftyl-konjugátu. ESI-MS: 4158,2 (vypočtená m.h. 4157,2).

Příklad 12

Syntéza 5'-F8-A*T*G A C*G G A A*T*T*C

Oligomer 5¹-aminolinker-A*T*GAC*GGAA*T*T*C-3' byl připraven jak bylo popsáno v příkladu 9.

OD (260) 5'-aminolinker-oligonukleotidu se rozpustilo v 16 μΐ 0,2M TBK pufru a 95 μΐ DMF a pak se ponechalo reagovat s 25 μΐ předem připraveného aktivního esteru kyseliny acetoxykumarinkarbonylové. Aktivní ester se připravil tak, se smíchalo 12,5 μΐ 0,2M acetoxykumarinkarbonylové kyseliny (2,7 mg v 50 μΐ DMF) s 12,5 μΐ TBTU (4 mg v 50 μΐ DMF) v lhodinové reakci při teplotě místnosti. Po 17 hodinách reakce aminolinker-oligonukleotidu s aktivním esterem se přidaly 2 μΐ semikoncetrované kyseliny octové a reakce se zakoncentrovala ve vakuu. Po vysolení na koloně NAP™ (Pharmacia) se provedla precipitace butanolem. Získalo se tak 8,0 OD (260) požadovaného oligonukleotid-acetokumarin-konjugátu. ESI-MS: 4178,5 (vypočtená m.h. 4175,2).

• · * • · • ·

- 43 Příklad 13

Syntéza 5'-F3-(dA)n dA*dA*dA ( n= 17, 47 a 77; F3 = FDA)

Oligonukleotid byl získán z CPG nosiče, který byl derivatizován 3¹-koncově vázaným N6-benzoyl-2'-deoxyadenosinem, jak bylo již popsáno v příkladu 1. Oxidace po obou prvních kondenzacích byly provedeny pomocí Beaucageho činidla, aby byly vneseny do sekvence fosforothiátové vazby (označeny *) , všechny ostatní oxidace byly proveden pomocí jódové vody. Pak byl kondenzován 5'-aminomodifikátor C6 stejně jako v příkladu 2. Po odstranění chránících skupin koncentrovaným amoniakem a 80% kyselinou octovou a po přečištění na preparativním polyakrylamidovém gelu se získalo 2,95 OD (260) 5 '-aminolinker-(dA) ₁₇ dA*dA*dA, 4,9 OD (260) 5'-aminolinker(dA)₄₇ dA*dA*dA a 5 OD (260) 5 '-aminolinker-(dA) ₇₇ dA*dA*dA.

5¹-aminolinker-oligonukleotidy se rozpustily v 8 μΐ 0,2M TBK pufru a 62 μΐ DMF a pak se ponechaly reagovat s 1,6 μπιοί FDA. Po 3 hodinách reakce se přidal další FDA-isothiokyanát a reakce probíhala další 2 hodiny. Pak se přidaly 2 μΐ semikoncetrované kyseliny octové a reakce se zakoncentrovala ve vakuu. Po vysolení na koloně NAP™ (Pharmacia) se provedla precipitace butanolem. Získalo se tak:

1,5	OD	(260)	5 '	-F3-(dA)	17	dA*dA*dA,
2,2	OD	(260)	5 '	-F3-(dA)	47	dA*dA*dA a
0,9	OD	(260)	5 '	-F3-(dA)	77	dA*dA*dA.

• ·

- 44 Příklad 14

Syntéza dvojitě značeného oligonukleotidu 5'-Cy3-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-C6-F3; F3=FDA

5'-konec (od firmy

Oligonukleotid byl získán z CPG nosiče, který umožňuje vnesení aminolinkeru C6 na 3¹-konec (Petrie et al. (1992)

Bioconjugate Chem. 3, 85-87), jak bylo již popsáno v příkladu

1. Oxidace byly provedeny pomocí jódové vody, popřípadě pomocí Beaucageho činidla, aby byly vneseny do sekvence fosforothiátové vazby (označeny *). Po odštěpení poslední dimethoxytritylové chránící skupiny se nechal oligonukleotidu reagovat s Cy3-CE fosforamiditem

Glen Research, Sterlin, VA; Katalog-Nr. 10-5913-xx) a pak byl oxidován jódovou vodou. Po odstranění chránících skupin koncentrovaným amoniakem (2 hodiny při 70 °C) se získalo 64 OD (260) surového produktu. Po přečištění na preparativním polyakrylamidovém gelu se získalo 3,8 OD (260) 5'-Cy3-A*T*G A

C*G G A A*T*T*C-C6-aminolinker-3' . Z toho se 3,5 OD (260) rozpustilo v 8 μΐ 0,2M TBK pufru a 62 μΐ DMF a pak se ponechalo reagovat s 1,6 μτηοΐ FDA. Po 3,5 hodinové reakci se přidaly 2 μΐ semikoncetrované kyseliny octové a reakce se zakoncentrovala ve vakuu. Po vysolení na koloně NAP™ (Pharmacia) se provedla precipitace butanolem. Získalo se tak 3,5 OD (260) požadovaného dvojitě značeného oligonukleotidu 5'-Cy3-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-C6-F3. ESI-MS: 4926,2 (vypočtená m.h. 4927,1).

Příklad 15

Syntéza 5'-F3-A*T*G A C*G G A A*T*T*C, F3 = FDA

Oligomer 5¹-aminolinker-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-3' byl připraven stejně jak bylo popsáno v příkladu 9.

OD (260) 5'-aminolinker-oligonukleotidu se rozpustilo v 16 μΐ 0,2M TBK pufru a 95 μΐ DMF a pak se ponechalo reagovat s 25 μΐ FDA-isothiokyanátu (5 mg ve 100 μΐ) . Po 3 hodinové reakci se přidal ještě znovu 5 μΐ isothiokyanátu a reakce probíhala další dvě hodiny.

semikoncetrované kyseliny octové ve vakuu. Po vysolení na koloně NAP™ (Pharmacia) se provedla precipítace butanolem. Získalo se tak 8,5 OD (260) požadovaného konjugátu oligonukleotid-fluoresceindiacetát. ESI-MS: 4418,4 (vypočtená m.h. 4418,5).

Pak se přidaly 2 μΐ a reakce se zakoncentrovala

Příklad 16

Srovnání buněčného příjmu oligonukleotidových konjugátů různých délek 5'-F3-(dA)n dA*dA*dA ( n= 17, 47 a 77, F3 =

FDA)

Stanovení buněčného příjmu konjugátů různých délek a molekulových hmotností z příkladu 12 bylo v principu provedeno stejně jako bylo popsáno v příkladu 7 s buňkami REH. Kvantifikace byla provedena pomocí průtokového cytometru. Po 60 minutách byly měřené relativní hodnoty fluorescence pro 5 '-F3-(dA) i₇dA*dA*dA (A20), 5 '-F3 - (dA) ₄₇dA*dA*dA (A50) a ¹-F3-(dA) ₇₇dA*dA*dA (A80) rovné 49, 34 a 91, v uvedeném pořadí. FDA-konjugát s nejdelší oligonukleotidovou částí sestávající celkem z 80 nukleotidů byl překvapivě přijímán buňkami REH nejúčinněji.

Příklad 17

Srovnání buněčného příjmu různě derivátizovaných oligonukleotidových konjugátů

Vazbě fluorescein-diacetát (FDA) je příbuzná vazba fluorescein-dipivalát, která se vyznačuje zvýšenou stabilitou esterových skupin. Odpovídající oligonukleotidové konjugáty byly průtokový cytometrií zkoumány z hlediska jejich buněčného příjmu. Zvýšená stabilita pivalátu vůči alkalickému prostředí a esterázám vedla k malému příjmu odpovídajících oligonukleotidových konjugátů. Takže naměřená relativní fluorescence pro konjugát s fluorescein-diacetátem po 60 minutách byla 195, zatímco pro odpovídající konjugát s fluorescein-dipivalátem byla jen 55.

Příklad 18

Výzkum buněčného příjmu dvojitě značeného oligonukleotidového konjugátu 5'-Cy3-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-C6-FDA z příkladu 13

Podle analýzy FACS vykazoval Cy3-oligonukleotid-F3konjugát rychlý příjem do buněk REH. Ošetření buněk komplexem oligonukleotid-konjugát/Cellfectin vedlo k podobnému, avšak zřetelně nesrovnatelnému příjmu. Přitom účinek FDA-konjugátu výrazně překonal účinek komplexu Cellfectin/oligonukleotid.

Dále se zkoumala ko-lokalizace obou odlišných markérů na » 9 ώ · · · · · ···· · «· β·· ·· ····

- 47 oligonukleotidů při inkubaci s buňkami, aby se dalo uzavřít, že měřená fluorescence pochází jen z rozštěpeného FDA, popřípadě fluoresceinu. Cy3-oligonukleotid-F3-konjugát obsahoval kovalentně navázané kyaninové barvivo na 5'-konci a FDA na 3'-konci. Obrázek 9 ukazuje zelenou a červenou fluorescenci po 4hodinové inkubaci REH buněk s Cy3-oligonukleotid-F3-konjugátem. Aby se dala pozorovat ko-lokalizace obou markérů v buňkách, musí se vyjít z toho, že oligonukleotid je přijímán v intaktní formě. Bohužel acetylová skupina FDA koncové části byla hydrolyzována, pravděpodobně esterázami, které nefluorescenční FDA-zbytek často přeměňují na fluorescenční fluoresceinový zbytek. Příjem Cy3/FDAkonjugátu probíhal velmi rychle, takže oba markéry mohly být detekovány již 7 minut po přidání do média.

Oligonukleotid-FDA-konjugát KO_1 z příkladu 4 byl testován při čtyřech koncentracích na antiproliferativní účinek na nádorové buňky A549. Inhiboval proliferaci bez přidání činidla zesilujícího penetraci. Odpovídající oligonukleotid bez F3-konjugátu (ONI) inhiboval proliferaci jen po vytvoření komplexu s činidlem zesilujícím penetraci (CellFectin od firmy GibcoBRL). Výsledky jsou shrnuty v tabulce 4.

· * · 4 · · · » « · 4 · 4 4 · « · ♦ » · « «Μ · 4 4 4 ······· · 9 44 9 4

4 4 9 9 4 4 4 9 Λ 4 · ♦ · · ·

Tabulka 1

Vyšetření příjmu FDA-značených oligonukleotidů (konjugátů FDA-oligonukleotid) do savčích buněk pomocí fluorescenční mikroskopie

Linie savčích buněk	Fluorescence po 5 minutách	Fluorescence po 20 minutách	Fluorescence po 60 minutách	Fluorescence po 120 minutách
A	B	A	A	A	B	A	B
REH	+	—	+	-	+ +	-	+ +	*
K562			( + )		+		+
Lul8					( + )		+
KB3-1					+		+
Pk2					( + )		+

A: Inkubace s FDA-značenými oligonukleotidy KO_1 a K0_3

33: Inkubace s fluoresceinem značenými oligonukleotidy K0_2 a K0_4 ( + ) slabý příjem + středně silný příjem ++ velmi silný příjem

- žádný příjem * příjem jen poškozenými buňkami

Tabulka 2

Vyšetření příjmu FDA-značených oligonukleotidů (konjugátů FDA-oligonukleotid) do hmyzích buněk pomocí fluorescenční mikroskopie (legenda shodná s tabulkou 1)

Hmyzí	Fluorescence po	Fluorescence po	Fluorescence po
buňky	20 minutách	60 minutách	120 minutách
	A	A	A	B	A	B
SF9	+	—	++		++	—

• · ·

Tabulka 3 «III «4 44 * t * ♦ % * » í 4

4 4 « · 4*44

- 49 Vyšetření příjmu FDA-značených oligonukleotidů (konjugátů FDA-oligonukleotid) do buněk různých organizmů pomocí fluorescenční mikroskopie (legenda shodná s tabulkou 1)

Organizmus	Fluorescence po 20 min.	Fluorescence po 60 min.	Fluorescence po 120 min.
A	B	A	B	A	B
Bac. subtilis 6633 #	-	-	-	—	+	-
L. bulgaricus #	-	—	+	—	+
E. coli (K12) #	—	—	+	—	+	—
Yarrowia lipolytica # (divoká forma H 222)					+
Saccaromyces cerevisiae #	—	—	—		+	—
Fusarium culmorum - spory (JP15, houba)	(+)		+		+
Eeticulomyxa fi losa cysty (sladkovodní měňavka)			+ + hlavně jádro		+ +
Haematococcus pluvialis (sněhová řasa, bičíkovec)			+		+
Chlorogonium sp. (zelená řasa, bičíkovec)			+		+
Dunaliella šalina (mořská rozsivka)			+		+

A: Inkubace s FDA-značenými oligonukleotidy KO_1 a K0_3

B: Inkubace s fluoresceinem značenými oligonukleotidy K0_2 a K0_4 (vyhodnocení viz legenda u tabulky 1) # příjem jen u části buněk rychle se dělícího organizmu • · • « ♦ *

4··» · ♦ · ·

Tabulka 4

- 50 Výsledky z příkladu 8

Látka	Hustota buněk	% inhibice
bez	5,96
FDA	6,05	-1,5
100 nM K0 l	5,65	5,2
200 nM K0 l	5,3	11,1
500 nM KO 1	5,03	15,6
1000 nM KO 1	4,16	30,2

Tabulka 5

Transfekce FDA-konjugátu v závislosti na jeho délce (A20, A50, A80 z příkladu 15).

Čas	Fluorescence
A20	A50	A80
0	0,0103	0,0103	0,0103
10	11,71	8,9	43,31
20	39,68	28,06	88,36
30	48,59	34,38	91,28
40	54,7	38,75	92,35
50	58,66	41,64	93,19
60	62,13	44,33	93,62

Tabulka 6

- 51 Srovnání buněčného příjmu konjugátu s fluorescein-diacetátem a fuorescein-dipivalátem (viz příklad 16 a obrázek 8)

Čas	Fluorescence
K3 9	K41
0	2,66	2,75
10	72,37	8,49
20	112,34	18,17
30	142,97	28,67
40	164,64	38,34
50	184,96	46,62
60	195,57	55,26
70
80	218,12	68,02
90
100	231,04	83,7
110
120	253,84	97

* ♦ φ·

SEZNAM SEKVENCI

<160> 63
<170>	Patentln Ver. 2.
<210>	1
<211>	16
<212>	DNA
<213>	Umělá sekvence

<220>

<223> Popis umělé sekvence: modifikovaný oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1) . . (16) <400> 1 dgcgacgcca tgacgg <210> 2 <211> 13 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: modifikovaný oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti ♦« 9

« 9 • 909 ·

• 999 <222> (1) · . (13) <400> 2 dcgacgccat gac <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: modifikovaný oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1) .. (13) <400> 3 datgacggaa ttc <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1) . . (12) <400> 4 dtattccgtc at <210> 5 <211> 2 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid • · «

4 4 4 • 4 « • * <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1).·(2) <400> 5 da <210> 6 <211> 2 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1) . . (2) <400> 6 <210> 7 <211> 2 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> {1)..(2) <400> 7 <210> 8 <211> 12 <212> DNA <213> Umělá sekvence

	• · 9	• 9 9 9
	• 9 ·	9 9·
- 55 -	• 9999	9 9 9 ·
• 9	9 9 9
<220>	• 999 9	99 99
<223> Popis umělé sekvence: modifikovaný <220> <221> Různé vlastnosti <222> (1) . - (12)	oligonukleotid
<400> 8
ttccatggtg gc <210> 9 <211> 12 <212> DNA <213> Umělá sekvence		12
<220>
<223> Popis umělé sekvence: modifikovaný <220> <221> Různé vlastnosti <222> (1)..(12)	oligonukleotid
<400> 9
ttcactgtgg gc <210> 10 <211> 12 <212> DNA <213> Umělá sekvence		12
<220>
<223> Popis umělé sekvence: modifikovaný <220> <221> Různé vlastnosti <222> (1)..(12)	oligonukleotid
<400> 10
tggcgccggg cc		12

<210> 11 <211> 12 <212> DNA <213> Umělá sekvence ♦ ··· • · 9·9·

·· 00 * Φ0 0 « 0 0 • 00 0*0

0000 <220>

<223> Popis umělé sekvence: modifikovaný oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(12) <400> 11 tgccggccgg gc <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)-.(21) <400> 12 gcgtttgctc ttcttcttgc g <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)-. (20) <400> 13 acacccaatt ctgaaaatgg • · · φφφφ · · φ · « • · · • · φ φ* φφφφ <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)-·(20) <400> 14 aggtccctgt tcgggcgcca <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(20) <400> 15 gcggggctcc atgggggtcg <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(15)

4444 »4 · • ♦ 4 4 •44 · ♦ 9 · · · 9 · • 4 4 ··*· 4 <400> 16 cagctgcaac ccagc <210> 17 <211> 11 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid

<220> <221> Různé vlastnosti
<222>	(1) - · (ID
<400> 17 tattccgtca t	11

<210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)··(22) <400> 18 22 ttccgtcatc gctcctcagg gg <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti • ♦ · · · φ · « · φ « φφφφ · · · • φφφ φφφφ · φφ • · · φ φ φ φ φφφ φ • φ φ φ φφ φφφφ <222> (1) .· 115) <400> 19 ggctgccatg gtccc <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1) - - (21) <400> 20 ggctgctgga gcggggcaca c <210> 21 <211> 15 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1) . · (15) <400> 21 aacgttgagg ggcat <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid

- 60 • ···· · <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(18) <400> 22 gtgccggggt cttcgggc <210> 23 <211> 17 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1) . . (17) <400> 23 cgagaacatc atcgtgg <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(21) <400> 24 ggagaacatc atggtcgaaa g <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence • · ··♦ · <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(22) <400> 25 cccgagaaca tcatggtcga ag <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(20) <400> 26 ggggaaagcc cggcaagggg <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)··(20) <400> 27 cacccgcctt ggcctcccac <210> 28 • « *· <211> 18 <212 > DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(18) <400> 28 gggactccgg cgcagcgc <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223 > Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(20) <400> 29 ggcaaacttt cttttcctcc <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(19) <400> 30 gggaaggagg aggatgagg

4S* • · • · • · ···· ···· ·· ·· * · • « • · t

9 ·♦ • · •

99· <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(21) <400> 31 ggcagtcatc cagcttcgga g <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213 > Umělá sekvence <22 0 >

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1) .. (18) <400> 32 tctcccagcg tgcgccat <210> 33 <211> 19 <212 > DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(19) ·« • « ·· • · <

• »··· ···· ··· ·· 4» • · a · • · <

• · 4 • · · ·« ·«·· <400> 33 gcgctgatag acatccatg <210> 34 <211> 12 <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <221> misc_feature <222> (1).·(12) <400> 34 ggaggcccga cc <210> 35 <211> 12 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1).·(12) <400> 35 ggtttcggag gc <210> 36 <211> 12 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(12) <400> 36 tggtggaggt ag <210> 37 <211> 12 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(12) <400> 37 gcatggtgga gg <210> 38 <211> 12 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(12) <400> 38 ttggcatggt gg <210> 39 <211> 12 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

• ·

- 66 <223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)-· (12) <400> 39 gcctgggacc ac <210> 40 <211> 12 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223 > Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(12) <400> 40 cagcctggga cc <210> 41 <211> 12 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(12) <400> 41 tgcagcctgg ga <210> 42 <211> 12 <212> DNA

Ó7 • · · · · · • · · · <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1) · - (12) <400> 42 gtgcagcctg gg <210> 43 <211> 12 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1) . . (12) <400> 43 ggtgcagcct gg <210> 44 <211> 12 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220> .

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1) . . (12) <400> 44 atgggtgcag cc

<210> 45	• ·· · ·
<211> 12
<212> DNA
<213> Umělá sekvence

<220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastností <222> (1)·.(12) <400> 45 ggcttgaaga tg <210> 46 <211> 12 <212 > DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)··(12) <400> 46 gcagcccccg ca <210> 47 <211> 12 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)·.(12) <400> 47

gcagcagccc cc <210> 4a <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(20) <400> 48 tcccgcctgt gacatgcatt 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(20) <400> 49 gttctcgctg gtgagtttca 20 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti

9

9

9 <222> (1)..(18) • · · <· «··» <400> 50 gcgtgcctcc tcactggc <210> 51 <211> 18 <212 > DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(18) <400> 51 gcagtaagca tccatatc <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(20) <400> 52 gcccaagctg gcatccgtca <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid • 4 • · • · · • · • · • 4 <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1) · · (20) <400> 53 cccccaccac ttcccctctc <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(20) <400> 54 ctcccccacc acttcccctc <210> 55 <211> 19 <212 > DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(19) <400> 55 gctgggagcc atagcgagg <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence

- 72 <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(21) <400> 56 actgctgcct cttgtctcag g <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1) . . (22) <400> 57 caatcaatga cttcaagagt tc <210> 58 <211> 18 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1) . . (18) <400> 58 gcggcggaaa agccatcg <210> 59 <211> 18 • 9 99 * ·

9999 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1) ·· (18) <400> 59 gtgtcggggt ctccgggc <210> 60 <211> 15 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(15) <400> 60 cacgttgagg ggcat <210> 61 <211> 18 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1).·(18) <400> 61 gtcttccata gttactca

<s

0 • 0 0 0

	<210> 62
	<211> 18
	<212> DNA
	<213> Umělá sekvence

<220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)..(18) <400> 62 ¹⁸ gatcaggcgt gcctcaaa <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: oligonukleotid <220>

<221> Různé vlastnosti <222> (1)·.(21) <400> 63 gatggagggc ggcatggcgg g

9

9

4444

Τ’/ &0Í· - &Μ

4944 4 ·

Claims (26)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Konjugát sestávající z transportované molekuly a alespoň jednoho arylového zbytku vzorce I:

   Y

   R1 (i) kde

   Aryl označuje skupinu, která obsahuje alespoň jeden kruh, který má aromatický charakter,

   X j e O nebo N,

   Y je 0, S nebo skupina NH-R²,

   R¹ je substituovaný nebo nesubstituovaný alkylový zbytek obsahující 1 až 23 atomů uhlíku, který je přímý nebo rozvětvený a může obsahovat dvojné a/nebo trojné vazby,

   R² je substituovaný nebo nesubstituovaný alkylový zbytek obsahující 1 až 18 atomů uhlíku, který je přímý nebo rozvětvený a může obsahovat dvojné a/nebo trojné vazby, a n je celé číslo větší nebo rovné 1, přičemž arylový zbytek je k přenášené molekule vázán přímo prostřednictvím chemické vazby nebo nepřímo prostřednictvím chemické skupiny, přičemž je-li vazba uskutečněna internukleotidovou fosfodiesterovou vazbou přenášené molekuly, pak chemická skupina není CH₂-S-skupina.
2. 2. Konjugát podle nároku 1, kde přenášená molekula je makromolekula s molekulovou hmotností vyšší než 500 (Dalton).
3. 3. Konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 a 2, kde přenášená molekula je polynukleotid, polypeptid nebo polysacharid.

   ·· ♦ · ·· ♦ • « ····

   - 76
4. 4. Konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kde přenášená molekula je oligonukleotid.
5. 5. Konjugát podle nároku 4, kde oligonukleotid je modifikován.
6. 6. Konjugát podle nároku 1, kde přenášená molekula je nízkomolekulární sloučenina s molekulovou hmotností nižší než 500 (Dalton).
7. 7. Konjugát podle nároku 1, kde nízkomolekulární sloučenina je mononukleotid.
8. 8. Konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kde chemická skupina společně s arylovym zbytkem tvoří skupinu vzorce II:

   •R3—ArylR1 J n (H) kde

   Aryl, X, Y a R¹ jsou jak byly definovány výše a

   R³ je chemická skupina, přičemž R3 je výhodně skupina -C(=O)nebo -NH-C(=S)-.
9. 9. Konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, kde chemická skupina a arylový zbytek společně tvoří skupinu vzorce FI až Fll, kde FI až Fll jsou následující:

   (F5) • 4 · • 4 · ♦ · · • 44·· · • · ···· ·

   44 >4 * 4· • 4

   44 · 4 (F7) (F6)

   O^CH₃ (F8) (F9)
10. 10. Konjugát sestávající z

    a) polynukleotidu, oligonukleotidů nebo mononukleotidu a

    b) jednoho nebo více arylových zbytků vzorce I, přičemž arylový zbytek nebo zbytky jsou navázány přímo prostřednictvím chemické vazby nebo nepřímo prostřednictvím ·· · « * · • · • · · · ···· · · · • · · chemické skupiny na

    5¹-konec a/nebo 3'-konec a/nebo jednu nebo více nukleobazí a/nebo jeden nebo více cukerných zbytků a/nebo jednu nebo více internukleosidových vazeb, přičemž je-li vazba uskutečněna internukleotidovým fosfodiesterovým můstkem, pak chemická skupina není CH₂-Sskupina.
11. 11. Způsob výroby konjugátu obsahujícího přenášenou molekulu a alespoň jeden arylový zbytek vyznačující se tím, že

    a) vyrobí se přenášená molekula, která má reaktivní skupinu v poloze, kde má být navázán arylový zbytek,

    b) vyrobí se arylový zbytek a

    c) přenášená molekula s arylovým zbytkem se nechá zreagovat na konjugát.
12. 12. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že reaktivní skupina je aminoskupina, merkaptoskupina, chloracetylová skupina, isokyanátová skupina, isothiokyanátová skupina, karbonylová skupina, N-hydroxysukcinimidová skupina nebo karbonylchloridová skupina.
13. 13. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 11 až 12 vyznačující se tím, že reakce přenášené molekuly s arylovým zbytkem se provádí při pH nižším nebo rovném 7,5.
14. 14. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 11 až 13 vyznačující se tím, že reakce přenášené molekuly s arylovým zbytkem se provádí při pH 7,0.

    «· φ» • φ • * ♦ φ • · φ » ··♦·-• · φ « « • φ φ φ φφφφ

    - 80
15. 15. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 11 až 14 vyznačující se tím, že přenášená molekula je polynukleotid, oligonukleotid nebo mononukleotid.
16. 16. Použití arylového zbytku vzorce I nebo II, který je navázán na přenášenou molekulu, k přenesení této molekuly přes biologickou membránu.
17. 17. Způsob přenosu molekuly přes membránu vyznačující se tím, že

    a) vyrobí se konjugát, ve kterém je na přenášenou molekulu navázán alespoň jeden arylový zbytek vzorce I nebo II a

    b) konjugát se inkubuje s membránou.
18. 18. Způsob přenosu molekuly do buňky vyznačuj ící se t í m, že

    a) vyrobí se konjugát, ve kterém je na přenášenou molekulu navázán alespoň jeden arylový zbytek vzorce I nebo II a

    b) konjugát se inkubuje s buňkou a

    c) konjugát se přenese do buňky, aniž by byl odštěpen arylový zbytek.
19. 19. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že buňka je eukaryotická nebo prokaryotická buňka.
20. 20. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 18 až 19 vyznačující se tím, že buňka je bakteriální buňka, kvasinková buňka nebo buňka savce.
21. 21. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 18 až vyznačující se tím, že buňka je humánní buňka.

    ♦ « · nároků 18 až 21 že buňka je nádorová * ·

    9 9 9 • ···· • Φ »· • · · ·

    9 9 ·

    9 9 9

    9 9 9

    99 9999

    - 81
22. 22. Způsob podle kteréhokoliv z vyznačující se tím, buňka.
23. 23. Způsob výroby léku, vyznačující se tím, že

    a) vyrobí se farmaceutická účinná látka, nebo její derivát, která má alespoň jednu reaktivní skupinu v poloze, na kterou se má navázat arylový zbytek,

    b) vyrobí se arylový zbytek vzorce I nebo II,

    c) farmaceutická účinná látka, nebo její derivát, se nechá reagovat s arylovým zbytkem na konjugát, a k tomuto konjugátu se případně

    d) přidají pomocné látky a/nebo nosiče.
24. 24. Lék vyznačující se tím, že obsahuje konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10.
25. 25. Diagnostický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10.
26. 26. Testovací souprava vyznačující se tím, že že obsahuje konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10.