RS51447B - Konjugati i postupci za njihovu proizvodnju, i njihova upotreba za transport molekula kroz biološke membrane - Google Patents

Abstract

Upotreba aril radikala formula F1 i F3 do F11,za koji je vezan molekul koji treba transportovati, a odabran je iz grupe koju čine polinukleotid, oligonukleotid i mononukleotida, za transport molekula kroz biološke membrane in vitro.Prijava sadrži još 8 patentnih zahteva.

Description

Predmet pronalaska je upotreba aril-radikala koji su vezani za polinukleotid, oligonukleotid ili mononukleoitid (konjugat) za transprot ovih molekula kroz biološke membrane in vitro, kao i dobijanje leka za prevenciju i/ili lečenje oboljenja povezanih sa ekrpesijom ili prekomernom ekspresijom određenih gena i/ili dijagnostičkog agensa za dijagnozu odnosno rano prepoznavanje bolesti. Predmet pronalaska je takođe i postupak za transport molekula u ćeliju, in vitro, pri čemu se aril radikal inkubira sa ćelijom, gde se konjugat transportuje u ćeliju, i dati aril ostatak se, pri tome, neće otcepiti.

Ograničavajući faktor za terapeutsku primenu molekula, čiji se cilj nanalzi unutar

ćelije, često leži u njihovoj ćelijskoj resorpciji i nepovoljnoj distribuciju unutar ćelije. Tipični primeri su makromolekuli kao nukleinske kiseline, koji se na način specifičan za sekvencu, vezuju za ćelijsku DNK ili RNK i tako inhibiraju ekspresiju gena. Antisens oligonikleotidi su kratke jednolančane nukleinske kiseline, koji se preko baznih parova Watson-Crick-a vezuju na komplementarnu mRNK, pri čemu treba da se inhibira njena translacija u odgovarajući protein. Oligonukleidi koji formiraju triplekse vezuju se preko tzv. "Hoogsteen baznog sparivanja" u veliku brazdu dvostrukog heliksa DNK uz stvaranje trostrukog heliksa, inhibirajući tako transkripciju gena sputava na sekvenca-specifični način. Drugi oligonukleotidi koji deluju unutar ćelija su, na pr, tzv. "decoy"-oligonukleotidi, koji podražavaju regione vezivanjaza faktore transkripcije. Tretiranjem decoy-oligonukleotidima mogu se prekinuti sekvenca-specifični način i tako inhibira aktivacija transkripcije. Dodatna grupa oligonukleotida, koji deluju unutar ćelija, himeraplasti, upotrebljavaju se za ciljnu korekciju gena (Cole-Strauss et al., Science 273 (1996) 1386-1389). I za ovu korekciju gena je suštinski važna resorpcija himeraplast-oligonukleotida u ćeliju. Primeri za neke druge nukleinske kiseline, koje deluju unutar ćelije su oni, koje interaguju sa čelijskim enzimima, posebno sa tolemerasenom (Norton et al., Nat.Biotechn.,(1996) 14, 615). Druga klasa nukleinskih kiselina, poželjno dvoiančana DNK, mogu da kodiraju određene proteine, koji se eksprimiraju intracelularno u smislu genske terapije.

Tako, resorpcija jednog oligonukleotidain vitrou ćeliju, npr. jednostavnim dodavanjem oligonukleotida i čelijski medijum za gajenje, je relativno neefikasan postupak, jer se samo mali deo dodatog oligonukleotida resorbuje u ćeliji. Proces resorpcije traje više sati i najčešće tek posle 8 do 16 sati se dostiže faza platoa. Pretpostavlja se da se oligonukleotidi resorbuju u okviru endocitoza-sličnom procesu. Opšti problem resoprcije preko endocitoze sastoji se, međutim u tome, što se veći deo oligonukleotida ne nalazi slobodan u citoplazmi, već u određenim ćelijskim strukturama, tj. lizozomima i endozomima. Ovakva lokalizovana podela može se zapaziti fluorescentnim mikroskopom u slučaju oligoinukleotida označenih fluorosecencijom. Ovom vezikularnom lokalizacijom veoma se snižava koncentracija slobodnog oligonukleotida, koji je u stavni dostupan za hibridizaciju mRNK. Osim toga, u zavisnosti od tipa ćelija i primenjenim uslovima, samo određena frakcija ćelija resorbuje oligonukleotid. Stoga za efikasnu upotrebu antisens oligonukleotida, generalno se koriste smešamrsa pojačavačima penetracije, kao npr. Katjonski lipidi (Bennet et al., Mol.Pharmacol. 41 (1992) 1023).

WO 95/06659 opisuje aminoalkil derivate oligonukleotida sa poboljšanom ćelijskom permeabilnosti. EP 0 962 497 opisuje derivate Rhodamina i njihovu upotrebu u dijagnostici sistema i VVhittemore, N.A. et al (1999) Bioconjugate Chem., 10, 261-270 opisuje konjugate antrahinon-oligodezoksinukleotida.

Jedan od zadataka predmetnog pronalaska sastojao je da se poboljša celularna resorpcija molekula, posebno makromolekula, kao npr. oligonukleotida.

Ispitivanje celularne resoprcije oligonukleotida vrši se u opštem slučaju uz pomoć radioaktivno obeležnih ili fluoresecentno obeieženih oligonukleotida. Fluoresecentno obeležavanje oligonukleotida izvodi se, na pr., reakcijom aminofunkcionalne grupe oligonukleotida sa fluoresecin izotiocijanatom (FITC). Na pr., fluoresecin se može uvesti na 3'-kraj oligonukleotida preko komercijalno dostupnog fluoresecin-derivatizovanog nosača čvrstih faza ili na 5' kraj pomoću komercijalno dostupnog fluorescein-fosforilujućeg reagensa. U svim slučajevima fluoroscein, zbog toga stoje vezan za oligonukleotid preko karboksilnu funkcionalnu grupu, je prisutan kao negativno naelektiran strukturni element koji intenzivno fiuorescira.

Nasuprot fluoresceinu, diacetat fluoresceina (FDA) je neutralno važno sredstvo za bojenje/obeležavanje, koje prelazi u fluorescientni fluorescein samo posle uklanjanja obe estarske grupe i otvaranja laktonskog prstena, ali koji u obliku laktona nije fluorescenscentan.

Poznato je da FDA (u daljem tekstu označen sa "F3") kao neutralni, nefluorescentni molekul, resorbuju žive ćelije pasivnom difuzijom, bez fluorescencije i čepa intracelularno esterazama dajući fluorescentni fluorescein (Breeuwer et al., Appl.Environ.Microbiol.-(1995) 61, 1614 ; Maeda etal, Cell.Struct.Funct. (1982) 7, 177). Do sada su opisivani samo derivati FDA, sa amino-reaktivnom grupom, kao na pr., izotiocijanat; ovi FDA-derivati primenjuju se za bojenje intraćelijskih proteina ili komponenata ćelija. Osim toga, do sada nisu opisivani konjugati FDA sa drugim molekulima, prema tome do sada nisu opisivani ni FDA -označeni oligonukleotidi (konjugati FDA i oligonukleotida).

U citoplazmi se FDA čepa pomoću esteraza ; prema tome, moguće je odrediti, označavanjem oligonukleotida sa FDA, udeo "slobodnog" oligonukleotida, tj. koliko oligonukleotida ima u citoplazmi - i stoji na raspolaganju za hibridizaciju - u odnosu na udeo oligonikleotida, koji se nalazi u vezikulama ("uhvaćeni" oligonukleotid) - i stoga nije na raspolaganju za hibridizaciju. Zbog ukupno velikog broja negativnih nalektrisanja u oligonukleotidu, i činjenice da se oligonukleotidi označeni sa FDA i fluorescinom razlikuju samo jednim neto naelektrisanjem (sa slučaj da oligonukleotid identičan), moglo se očekivati, da oligonukleotidi označeni sa FDA i sa fiuorescinom pokazuju vrlo sličnu ćelijsku resoprciju i distribuciju.

Međutim, neočekivano je otkriveno, da se oligonukelotidi označeni sa FDA i fiuorescinom jasno razlikuju po svojoj resoprciji u ćelije tj. u pogledu na trajanje i na efikasnost resoprcije oligonukleotida i, dodatno i u pogledu lokalizacije resorbovanih oligonukleotida u ćeliji. FDA označeni nukleotid j mnogo brže resoprbovan od strane ćelija od odgovarajućeg oligonukleotida, označenog fiuorescinom. Dok resoprcija radioaktivno označenih i fiuorescinom označenih oligonukleotida zahteva nekoliko sati, dotle FDA označeni oligonukleotidi posle jednostavne inkubacije, npr. sa humanim ćelijama, se mogu detektovati u ćelijama već posle pet minutaeočekivano je i to, da su FDA označeni oligonukleotidi resorbovani u skoro sve ćelije (> 90% ćelija), dok je resoprcija oligonukleotida odn. polinukleotida prema dosadašnjim postupcima bilo značajno manja, često se u tim slučajevima samo oko 30 do 60% ćelija je apsorbovalo oligonukleotide. Takođe je pogodna i intracelularna distribucija FDA označenih oligonukleotida, koja je daleko uniformnija. Ova uniformnija raspodela ukazuje na to da oligonukleotidi nisu - kako je gore opisano - većim delom zatvoreni u vezikule (npr. endozome, lizozome), već su distribuirani u celoj ćeliji - tj. citosolu i jezgru -, ovo je pokazatelj za to, da postoji veliki udeo "slobodnog" oligonukleotida. Samo ovi "slobodni" oligonukleotidi du dostupni za vezivanje za cilj (ciljni molekul, ciljnu nukleinsku kiselinu) ili kao aktivno jedinjenje. Sledeća prednost je, što nisu primećena oštećenja ćelija kada su upotrebljeni FDA-označeni oligonukleotidi, nasuprot tome upotreba lipokatjonskih pojačavača penetracije često dovodi do oštećenja ćelijskih membrana. Usled ovih neočekivanih osobina FDA-označeni oligonukleotidi poseduju, nasuprot postupcimaopisanim za uvođenje oligonukleotida ili polinukelotida u ćelije, prednost u tome što se mogu unositi u ćelije delotvornije i da su tamo i bolje dostupni. Zbog ovoga, FDA-označeni oligonukleotidi imaj značajno poboljšanu biološku delotvornost. Zbog poboljšane biološke delotvornosti koristiće se manje oligonukleotida. Na osnovu toga i na osnovu činjenice, da je FDA-označeni oligonukleotid efikasnije resorbovan -kako po količini, tako i vremenski - u ćeliju, smanjeni su (toksični) štetni efekti.

Neočekivano je otkriveno, da se ove prednosti ne ograničavaju na FDA-označene oligonukleotide, već praktično svaki molekul može delotvorno (efikasno) da bude uveden u ćeliju ili transportovan kroz biološke membrane uz pomoć obeležavanja sa FDA, ili konjuguje ("FDA-konjugat"). Dalje je otkriveno da se ovaj princip ne ograničava na FDA-konjugate, već i na sve konjugate arilestra određene hemijske strukture. Predmetni pronalazak time predstavlja novi princip za transport molekula kroz biološke membrane.

Poznati su bioreverzibilni O-acilaril-konjugati, koji su predlagani kao prolekovi oligonukleotida (lyer et al., Biooragnaic & Med.Chem.Lett.7(1997) 871-876). Ova jedinjenja - u slučaju kada je aril ostatak aromatični 6-člani prsten - su slična po svojoj

hemijskoj strukturi sa konjugatima prema predmetnom pronalasku. Kod bioreverzibilnih O-acilarii-konjugata hidroliza estra stvara, međutim, destabilizaciju veze između aril ostatka i fosfotriestra oligonukleotida, tako da se bioreverzibilni O-acilaril-konjugati cepaju na svoje sastavne delove, tj. u slobodni oligonukleotid i O-acilaril-ostatak. Ovaj koncept prolekova služi za maskiranje negativnog naboja internukleotidnog fosfatnog mosta i time olakšava resoprciju oligonukleotida u ćeliju. Nasuprot konjugatima prema pronalasku, kod ovih prolekova nije utvrđena ubrzanaresoprcija oligonukleotida u ćelije kao ni izmenjena intraćelijska raspodela oligonukleotida. Dalje, nije objavljena resorpcija oligonukleotida u drugim organizmima. Nasuprot tome, kod konjugata prema ovom pronalasku, tokom resorpcije u ćeliju, ostaje sačuvana kovalentna veza između aril ostatka i oligonukleotida očuvanje kovalentne veze između aril ostatka i oligonukleotida se može lako utvrditi fluorescentnom mikroskopijom, ukoliko aromatična jedinica, kao npr. FDA, pokazuje fluoresecnciju samo posle cepanja estra.

Predmet pronalaska je upotreba arile estara formula F1 i F3 do F11, za koji je vezan molekul koji treba transportovati, a odabran je iz grupe koju čine polinukleotid, oligonukleotid i mononukleotid, za transport ovih molekula kroz molekulske membranein vitro.

Predmet pronalaska su i aril estri formula F1 i F3 do F11,

za koji je vezan molekul koji treba transportovati, a odabran je iz grupe koju čine polinukleotid, oligonukleotid i mononukleotid, za dobijanje leka za prevenciju i/ili lečenje bolesti povezanih sa eksprimiranjem ili prekomernim eksprimiranjem određenog gena, i/ili dijagnostikičkog agnesa za dijagozu ili ranu identifikaciju datih bolesti

Kod jednog posebnog oblika izvođenja, molekul koji treba transportovati je oligonukleotid. Oligonukleotid može, npr., da bude u celini formiran od nukleotida adenozinfosfata, gvanozinfosfata, inozinfosfata, citidinfosfata, uridinfosfata i timidinfosfata. U drugim realizacijama pronalaska, oligonuleotid može, po potrebi, da sadrži jednu ili više modifikacija, npr. hemijske modifikacije. Jedan oligonukleotid može imati više identičnih i/ili različitih modifikacija.

Primeri hemijskih modifikacija su poznati prosečnom stručnjaku i opisani, npr., u E.Uhlmann i A. Pevman, Chemical Revievvs 90 (1990) 543 i "Protocols for Oligonukleotids and Analogs" Svnthesis and Properties & Svnthesis and Analvtical Techniques, S. Agravval, Ed., Humana Press, Totowa, USA 1993 i Modern Svnthetic Methods (Ed. Beat Emst i C. Leumann) Verlag Helvetica Chimica Acta, Bazel, str.331-417, su i opisani.

Hemijska modifikacija jednog oligonukleotida može da obuhvata, npr.,

a) potpunu ili delimičnu zamenu fosfodiesterskih mostova, npr. fosforodioat, fosforoditioat, NR1R1 fosforoamidat, boranofosfat, fosfat-(CrC2i)-0-alkilestar, fosfat-[(C6-Ci2)-aril-(C1-C2i)-0-alkilestar, (d-C8)alkilfosfonat i/ili (C6-C12)arilfosfonat-mostova, pri čemu

R<1>i R<1>nezavisno jedan od drugog su vodonik, (CrCi8)-alkil, (C6-C2o)-aril, (C6-C14)-aril-(d-C8)-alkil, poželjno vodonik, (CVOO-alkil i/ili metoksietil, posebno poželjno vodonik, (Ci-C4)-alkil i/ili metoksietil,

ili

R<1>i R<1>zajedno sa atomom azota koji ih nosi, obrazuju 5-6-člani heterociklični prsten, koji dodatno može da sadrži i još jedan heteroatom iz grpe koju čine O, S, N ;

b) potpunom ili delimičnom zamenom 3'- i/ili 5'-fosfodiestarskih mostova , "defosfo" mostovima (opisanim, npr., kod Uhlmann.E. i Peyman,A., u "Methods in Molecular

Biologv", Vol.20, "Protocols for Oligonukleotides and Analogs", S. Agravvai, Ed., HumanaPress, Totowa 1993, lava 16, 355ff), npr., pomoću formacetata, 3 -tioformacetala, metilhidroksilamina, oksima, metilendimetiihidrazo, dimetilsulfona i/ili siiil grupa ;

c) potpunu ili delimičnu zamenu osnovnog lanca šećernog fosfata, na pr., sa "morfolino"-oligomerima (npr. kod E.P.Stirchak et al.,Nucleic Acids Res. 17 (1989) 6129, i

u J. Summerton i D. VVeller, Antisense and Nucleic Acids Dev. 7 (1997) 187-195 opisani) i/ili pomoću poiiamidnih nukleinskih kiselina ("PNAs") ( opisanih npr.,kod P.E. Nielsen et al., Bioconj.Chgem. 5 (1994) 3) i/ili nukleinske kiseline monoestra fosfonske kiseline ("PHONAs") (opisano na pr., kod Pevman et al., Angew.Chem.lnt.Ed., Engl. 35 (1996) 2632-2638).

d) potpunu i/ili delimičnu zamenu (3-D-2' jedinica dezoksiriboze, npr. sa a-D-2'-dezoksiribozom, L-2'-dezoksiribozom, 2'-F-2'-dezoksiribozom, 2'-0-(C1-C6)alkil-ribozom, 2'-0-(C2-C6)alkenil-ribozom, 2'-[0-(C1-C6)alkil-0-(CrC6)alkil-ribozom, 2'-NH2-2'-dezoksiribozom, 3-D-ksilofuranozom, a-arabinofuranozom, 2,4-didezoksi-B-D-eritro-heksopiranozom, konformaciono ograničenim analozima šećera, kao što su LNA( engl. locked nucleic acids);Singh et al., Chem.Commun., 4 (1998) 455 ; Singh et al., Chem.Commun., 12 (1998) 1247) i karbocikli (opisani, npr,, u Froehler, J.Am.Chem.Soc. 114, (1992) 8320) i/ili analozi šećera sa otvorenim lancem (opisani, npr., u Vandendriessche et al., Tetrahedron 49 (1993) 7223) i/ili analozi bicikličnih šećera (opisani, npr., u M.Tarkov et al., Helv.Chim.Acta, 76 (1993) 481) ; e) modifikaciju i/ili potpunu ili delimičnu zamenu prirodnih nukleozid-baza, npr. 5-(hidroksimetil)uracilom, 5-aminouracilom, pseudouracilom, pseudoizocitozinom,

dihidrouracilom, 5-( Ci-C6)-alkil-uracilom, 5-(C2-C6)-alkenil-uracilom, 5-( C2-C6)-alkinil-uracilom, S^CrCeJ-alkil-citozinom, 5-( C2-C6)-alkenil-citozinom, 5-( C2-C6)-alkinil-citozinom, 5-fluoruracilom, 5-fluorcitozinom, 5-hloruracilom, 5-hlorcitozinom, 5-bromuracilom, 5-bromcitocitozinom ili 7-deaza-7-supstituisanim purinima.

Hemijska modifikacija jednog oligonikleotida dalje obuhvata vezivanje oligonukleotida za jedan ili više drugih molekula, koji povoljno utiču na posebne osobine oligonukleotida, npr., stabilnost nukleaza, afinitet prema ciljnoj sekvenci i farmakokinetike, npr. vezivanje za i/ili umrežavanje sa ciljnom sekvencom tokom hibridizacije modifikovanog oligonukleotida sa ciljnom sekvencoom. Primeri ovakvih drugih molekula su polilizin, interkalirajući agensi kao što je piren, akridin, fenazin i fenantridin, fluorescirajuća jedinjenja kao što je fluorescin, agensi za umrežavanje( engl. cross- linker)kao psoralen i azidoproflavin, lipofilni molekuli kao što su (C12~C2o)-alkil grupe, poželjno (Ci2-C20)-alkil grupe, lipidi ka jeo 1,2-di-heksadecil-rac-glicerol, steroidi kao što je holesterin ili testosteron, vitamini kao što je vitamin E, poli- ili oligo-etilenglikol, diestri (C12-C18)-alkil-fosfata, poželjno diestri (C14-C18)- fosfata i -0-CH2-CH(OH)-0-( C12-C,8)-alkil grupe, poželjno -0-CH2-CH(OH)-0-( C12-C16)-alkil grupe. Ove dalje grupe mogu da se konjuguju na 5"- i/ili 3'-kraju i/ili unutar sekvence, npr. za nukleobazu. Postupci za proizvodnju ovako modifikovanih oligonukleotida su poznati prosečnom stručnjaku i opisani npr. u Uhlmann.E & Peyman,A., Chem.Rev.90 (1990) 543 i/ili u M.Mahoren: "Antisense Research and Applications", Crooke and Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, 1993, Glava 17, str.303ff. i/ili EP-A 0 552 766.

Kod daljih, specijalnih oblika izvođenja pronalaska oligonukleotid može na 3'- i/ili 5'-kraju da ima 3'-3'- i/ili 5'-5'-inverzije. Ovaj način hemijskih modifikacija poznat je prosečnom stručnjaku i opisan je, na pr., kod M.Koga et al., J.Org.Chem. 56 (1991) 3757.

Kod konjugata, koji se sastoji od jednog ili više oligonukleotida i jednog ili više aril ostataka, poželjno formula F1 i F3 do F11, konjugacija aril ostataka za jedan oligonukleotid može se obavljati, na pr., na 5'-kraju (A), na 3'-kraj (F) heterociklične baze (E i G), na šećeru (C) ili na p internukleozidnom mostu (B) oligonukleotida. Vezivanje se međutim može obavljati i preko nenukleotidnih jedinica, npr. slučaj (D). Ovi primeri dati su na si.3.

Navedene modifikacije mogu se, takođe primeniti i i na relativno dugačke polinukloetide i, po potrebi, na mono- ili dinukleotide, ili . -nukleozide.

Oligonukleotidi su dužine, npr., 8 do 50 nukleotida, poželjno 10-20 nukleotida. Pogodni su, međutim, i duži oligo- iii polinukloetidi, npr. dužine od 50 do 10.000 nukleotida, poželjno 100 do 1000 nukleotida, koji mogu, u datom slučaju, da budu prisutni kao dvolančanin.

Oligonukleotidi mogu imati bilo koju sekvencu. Zavisno od izabranog cilja, tj. ukoliko je cilj nukleinska kiselina, u zavisnosti od njene sekvence, ili ako je cilj protein, u zavisnosti od sekvence nukleinske kiseline, koja kodira ovaj ciljni protein, odabire se ili dozajnira sekvenca oligonukleotida. Ako je, npr. cilj neki virus, npr., CMV, HIV, HSV-1,

HSV-2, grip, VSV, hepatitis B ili virus papiloma, onda oligonukloetid može imati, npr., jednu od sledećih sekvenci:

a) protiv CMV

b) protiv HIV, npr., c) protiv HSV-1, npr.,

Cilj može biti, na pr., neki protein, koji je uključen u stvaranje raka (kancera), ili je

odgovoran za rast raka. Primeri ovakvih ciljeva su :

1) Nuklearni onkoproteini, kao npr., c-myc, N-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun,

PCNA, p120;

2) Citoplazmički onkoproteini vezani za membrane, kao npr., EJ-ras, c-Ha-ras, N-ras, rrg, bcl-2, cdc-2, c-raf-1, c-mos- c-src, c-abl, c-ets ; 3) Celularni receptori, kao npr., EGF-receptor, Her-2, c-erb2-A, VEGF-receptor (KDR-1), retonoidni receptori, regulaciona podjedinica protein-kinaze, c-fms, Tie-2, c-raf-1 kinaza, PKC-alfa, proteinska kinaza A (R1 alfa); 4) Citokini, faktori rasta, ekstracelularni matriksi, kao npr., CSF-1, IL-6, IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, bFGF, VEGF, mieloblastin, fibronektin.

Oligonukleotidi, usmereni protiv takvih ciljeva i mogu, npr., da poseduju sledeće bazne sekvence :

a) protiv c-Ha-ras, npr.

b) bFGF, npr., c) c-myc, npr., d) c-myb, npr., e) ofos, na pr., f) p120, npr., g) EGF-receptor, npr., h) p53 supresor tumora, npr., i)bcl-2 k) VEGF

I) c-raf kinaza

m) PKC-alfa n) proteinska kinaza A

Ako je cilj integrin ili neki receptor adhezije ćelija-ćelija, kao npr., VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM, ili ELAM, tada oligonukleotid može, na pr., da ima jednu od sledećih sekvenci:

a) VLA-4, na pr.,

b) ICAM-1, na pr., c)ELAM-1, na pr., d)integrinalfa(V)

Ako je cilj protein, koji je odgovoran za proliferaciju ili migraciju, ili učestvuje u

tom/tim procesu(ima), kao na pr.,

1) Nukelarni transaktivator-proteini i ciklini, kao npr., c-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, ciklin i cdd-kinaza ; 2) Mitogeni ili faktori rasta, kao npr., PDGF, bFGF, VEGF, EGF, GB-EGF I TGF-b ; 3) Celularni receptori, kao npr., bFGF-receptor, EGF-receptor i PDGF-receptor;

tada oligonukleotid može da poseduje, npr., jednu od sledećih baznih sekvenci :

a) c-myb

b) c-myc c) cdc-2kinaza d) PCNA (nuklearni antigen proliferacionih ćelija pacova)

Ako je cilj, npr., jedan adenozin-A1-receptor, adenozin-A3-receptor, bradikinin-receptor ili IL-13, moguća je, npr., bazna sekvenca :

Dobijeni su sledeći oligonukleotidi (5' -> 3'):

gde<*>označava pozicije, na kojima je fosfodiesterski most zamenjen fosforotioat-internukleozidnim mostom.

Ove sekvence su konvertovane u sledće konjugate (CO odnosno KO):

KO_1: F3-U1-ON1

KO_2: F0-Li1-ON1

KO_3: F3-U1-ON2

KO_4: F0-U1-ON2

KO_5: F3-U1-ON3

KO_6: F9-U1-ON3

KO_7: F2-U-10N3

KO_8: F0-U1-ON3

KO_9: F3-Li1-ON3-Rhodamin

KO_10: F9-Li1-ON3-Rhodamin

KO_11: F6-Li1-ON3-Rhodamin

KO_12: FQ-Li1-ON3-Rhodamin

KO_13: F3-U1-ON4

KO_14: F3-U1-ON5

KO_15: F3-U1-ON6

KO_16: F3-U1-ON7

K0_17: F3-U1-ON8

K0_18: F3-U1-ON9

K0_19; F3-U1-ON10

KO_20: F3-U1-ON11

KO_21: F7-U1-ON3

gde

"F1 do F11" su aril radikali formula F1 do F11 (v.sl.2);

"LiV je 6-aminoheksil fosfat radikal, koji je vezan za 5'-kraj oligonukleotida (npr., na slici u Prilogu 4): "ON1 do ON11" su opisani oligonukleotidi sekvenci SEQ ID NO 1 do SEQ ID NO 11, i "Rhodamin" je Rhodamin obeležen na 3'-kraju olinukleotida, koji se može detektovati pored fluoresceina.

Postupak za dobijanje konjugata, koji sadrži molekul za transport i bar jedan aril ostatak, formula F1 i F3 do F11, pri čemu: a) jedobijen jedan molekul za transport, koji sadrži reaktivnu funkcionalnu grupu na položajui, na kojoj aril ostatak treba da bude vezan ; i

b) je dobijen aril ostatak, i

c) molekul za transport reaguje sa aril ostatkom dajući konjugat.

Reaktivna funkcionalna grupa je, poželjno, amino grupa, merkapto grupa,

hloracetil grupa, izocijanat grupa, izotiocijanat grupa, grupa karbonske kiseline, N-hidroksisukcinimid grupa ili karbonil hloridna grupa. Reakcija molekula koji treba

transportovati, sa aril radikalom se odvija na vrednosti pH < 7,5 ; poželjno pri pH < 7,3, posebno poželjno pri pH 7,0 ili nižem, npr. pH < 7, posebno pri pH<<>6,5. Kod ovih reakcija kuplovanja, sve ostale reaktivne grupe moraju da budu zaštićene pre reakcije upotrebom zaštitnih grupa koje su poznate prosečnom stručnjaku.

U jednom posebnom obliku izvođenja postupka, molekul za transport je polinukleotid, oligonukleotid ili mononukleotid.

Postupci za proizvodnju sadrže u prvom koraku dobijanje molekula koje treba transportovati. U tom smislu, pronalazak se odnosi i na postupke za dobijanje (proizvodnju) oligonukleotida. Oligonukleotidi mogu se proizvoditi pomoću poznatih hemijskih postupaka, npr., opisani u Eckstein.F., (1991) "Oiigonucleotides and Analogues. A Practical Approach", IRL Press, Oxford. Oligonukleotidi mogu se dobiti i postupcima, koji po potrebi, sadrže jedan ili više enzimatskih koraka. Dobijanje konjugata oligonukleotida opisano je u principu u literaturi (J.Goodchild, Bioconjugate Chem.1,

(1990) 165 ; S.Beaucage i R.lver, Tetrahedron 49 (1993) 1925 ; S.Agravval Mezhods in Moiecular Biologv Vol.26 "Protocols for oligonucleotide conjugates" (1994) Humana Press).

Međutim, kod sinteze konjugata oligonukleotida prema zahtevu I treba obratiti pažnju na to da se isti mogu razložiti u alkalnim sredinama. Prema tom nije moguće, na primer, sintisati FDA-označene oligonukleotide u sintetizatoru oligonukleotida prema uobičajenim postupcima, pošto bi estarske grupe FDA-grupe hidrolizovaie pri reakciji sa amonijakom , koja su potrebna za otcepljivanje oligonukleotida sa podloge i za cepanje amino zaštitnih grupa sa heterocikličkih baza. Tako, oligonukleotid je prvo dobijen kao prekursor u nezaštićenom obliku i kondenzovan sa grupom izzahteva i (si.5). Prekursor oligonukleotida poseduje jednu reaktivnu funkionalnu grupu ili funkcionalnu grupu koja se može aktivirati, koja se naknadno prema metodama poznatim prosečnom stručnjaku, derivatizuje sa reagensom, koji sadrži grupu prema zahtevu I u skladu sa pronalaskom. Odgovarajuće reaktivne funkionalne grupe ili funkcionalne grupe koje za aktivaciju su, npr., amino-, merkapto-, hlroacetil, izo(tio)cijanat- funkcionalne grupe i funkcionalne grupe karboksilne kiseline. Posebno lako se uvode u oligonukleotide tzv. amino-linkeri uz pomoć komercijalno dostupnih reagensa. Amino-linker oligonukleotidi zatim reaguju, npr., sa reaktivnim reagensima koji sadrže grupu prema zahtevu I. Ovi reaktivni reagensi su, npr., odgovarajući izocijanati. Grupa u zahtevu I je u tom slučaju vezana preko tiourea-funkciionalne grupe (Prilog 4). Ostali reaktivni reagensi su, npr., karbonil hloridi. Blagi reaktivni reagensi su, npr., N-hidroksisukcinimidi odgovarajućih karbonskih kiselina. Reagensi za aktivaciju su, npr., odgoavarajuće karbonske kiseline, koje se mogu kuplovati sa peptidnim reagensimaza kuplovanje, kao što je HBTU, TBTU ili TOTU. U tom slučaju je grupa u zahtevu I vezana preko amidne funkcionalne grupe. U principu, grupe u zahtevu I prema pronalasku mogu se uvesti na bilo koji položaj oligonukleotida. Prednost je data položajima prikazanim na si.3.

Modifikovani oligonukleotidi su sintetisani izgradnjom lanca oligonukleotida prema standardnim postupcima, kao što je sintea čvrstih faza prema postupku sa fosforamiditom, i derivatizacijom 5'-kraja sa komercijalno dostupnim 5'-amino-modifikatorom C6 (npr. Firma Eurogentec, Seraing, Belgija).

5'-amino modifikator C6 (Mmt = 4-monornetoksitritil)

Posle otcepljivanja derivata oligonukleotida od nosača i uklanjanja zaštite svih bazno-labilnih zaštitinih grupa reakcijom sa amonijakom, monometoksitritil grupa jeuklonjena reakcijom sa 80%-nom sirćetnom kiselinom na sobnoj temperaturi (s.t.). Dobija se oligonukleotid, modifikovan sa 5'-arninoheksilfrosfatom. Amino funkcionalna grupa ovog derivata oligonukleotida reaguje zatim sa FDA-izocijanatom u 0.2 M trietilamonijum bikarbonatnom puderu (TBK pufer) pH 7/DMF. Već posle dva do tri sata amino-linker oligonukleotid bio je potpuno konvenrtovan u žeijeni FDA-derivat (slika 4) Reakcije sa fluorescin-izotiocijanatom obično se vrše na pH 8. Međutim, pri ovom pH, hidrolizuje diacetat FDA-grupe.

Moguće je, naravno, upotrebiti i druge amino-linker reagense, kao npr., 5'-amino-modifikator C3, 5'-amino-modifikator C12, 5'-amino-modifikator 5 ili 5'-tioi-modifikator C6 (svi firme Eurogentec).

Primenom čvrstih faza 3'-amino-modifikatora, kao što je, 3'-amino-modifikator C3 CPG (firma Eurogentec) mogu se dobitii derivati oligonukleotida sa jednom 3'-aminoalkil-grupom, koji naknadno reaguje sa FDA-izocijanatom. Dobija se derivat oligonukleotida,

3'-amino-modifikator C3 CPG (Fmoc=fluorfenilmetoksikarbonil)

koji ima na svom 3'-kraju vezanu grupu formule I prema pronalasku.

Radi uvođenja konjugata na heterocikličnoj bazi nukieozida, u sintezi umesto normalne fosforamidit-jedinice, moguće je upotrebiti odgovarajući amino-modifikator C6 dT (firma Eurogentec), koji se dobija od timidina,. Na kraju sinteze oligonukleotida, trifluoracetil zaštitne grupe se uklanjaju dodatkom amonijaka i slobodna amino funkcionalna grupa reaguje u rastvoru sa FDA-izotiocijanatom.

Na sličan način mogu se uvesti grupe kao u zahtevu I na bilo koji položaj u oligonukleotidima. Lako je uočljivo daje moguće čak i višestruko uvođenje identičnih ili različiti grupa.

Poželjno je biološka membrana sastavni deo ćelije, vezikule ili organele. Predmet pronalaska je upotreba aril radikala za transport molekula kroz membranu u ćeliju in vitro, pri čemu aril ostatak, koji je prethodno opisan, za koji je vezan molekul koji treba transportovati, a odabran je iz grupe koju čine polinukleotid, oligonukleotid i mononukleotid, inkubiran sa ćelijom,

gde se konjugat transportuje u ćeliju, i dati aril ostatak se neće otcepiti.

Dalje, predmet pronalaska su je upotreba aril-radikala, koji je prethodno opisan, za koji je vezan molekul koji treba transportovati, a odabran je iz grupe koju čine polinukleotid, oligonukleotid i mononukleotid, je inkubiran sa ćelijo, pri čemu se konjugat transportuje u ćeliju, a dati aril ostatak se neće otcepiti

Ovo se posebno odnosi na postupke, kod kojih je ćelija, eukariotska ili prokariotska, npr. bakterijska ćelija, ćelija kvasca ili ćelija sisara, poželjno humana ćelija. Kod posebnih oblika izvođenja ćelija je patoioški izmenjena, npr. ćelija tumora.

Poboljšana ćelijska resoprcija konjugata primećena je ne samo u ćelijama sisara, već i kod drugih eukarota i čak kod prokariota.

Konjugati prema ovom su pronalasku ispitani mikroskopski za resoprcije u žive ćelije. Prvo su FDA-označeni oligonukleotidi ispitani na sposobnost CO_1 i CO_3 da uđu u ćelije. Odgovarajući fluorescin-obeleženi oligonukletidi CO_2 i CO_4 su upotrebljeni kao jedinjenja koja su poznata iz stanja tehnike. Sve ispitivane vitalne kulture ćelija životinja su resorbobale CO_1 i CO_3 (FDA-konjugate) u toku 5 do 10 minuta, dok nije bilo moguće detektovati CO_2 i CO_4 (fluorescin-konjugati) posle tog vremena u vitalnim ćelijama.

Mada se resoprcija u bakterije i kvasac dešava znatno sporije, nego kod ćelija sisara, neke od ovih ćelija su resorbovale oligonukleotide prema pronalasku posle perioda od dva sata, dok normalni fiuorescinom označeni oligonukleotidi pod tim uslovima nisu bili resorbovani. Iznenađujuće je to što su u principu svi do sada ispitivani organizmi resorbovali oligonukleotide prema pronalasku bolje nego poznate derivate oligonukleotida. Ovi oganizmi, pored ostalih, obuhvataju životinjeske ćelije, bičare, kvasce, gljive i bakterije (Tabela 3).

Dalje se pokazalo, da ćelije raka posebno dobro resorbuju oligonukleotide. Tako, da je upotreba oligonukleotida prema pronalasku posebno pogodna za terapiju (lečenje) tumora. FDA-označeni antisens oligonukleotid CO_1, koje je usmeren na eg5, inhibira proliferaciju ćelija A549 jednostavnim dodavanjem u medijum, dok je odgovarajući nemodifikovani antisens oligonukleotid ON 1 i fiuorescinom označeni oligonukleotid CO_2 inhibirao proliferaciju ćelija raka tek posle formulacije (kombinovanja) sa pospešivačima penetracije, kao CellFectin-om.

Pronalazak se odnosi na upotrebu konjugata, kod kojih je molekul koji treba transportovati, oligonukleotid za hibridizaciju sa jednolačnanim i/ili dvolančanim nukeiinskim kiselinama npr. DNK (npr. geni, cDNK) i/ili RNK (npr. pre-mRNK, mRNK). Ovi konjugati mogu da se vezuju i sekvenca- specifično za intracelularne proteine kao što su enzimi, kao npr., polimeraze ili telomeraze, ili za faktore transkripcije. Dalje se pronalazak odnosi na primenu ovih konjugata za modulaciju, kao i za potpunu ili delimičnu inhibiciju eksprimiranja određenih ciijnih gena, npr. za potpunu ili delimičnu inhibiciju transkripcije i/ili translacije. Pronalazak se odnosi i na primenu ovakvih konjugata kao antisens oligonukleotida, ribozima, sens oligonukleotida, oligonukleotida koji grade trostruki heliks, himerplasta i/ili Decoy-oligonukleotida. Pored toga, ovi konjugati se mogu upotrebiti kao pomoćna sredstva u molekularnoj biologiji.

Dalje se ovaj pronalazak odnosi na upotrebu oligonukleotida kao lekova i/ili sredstava dijagnostikovanje, i na upotrebu oligonukleotida za dobijanje (proizvodnju) lekova i/ili dijagnostičkih sredstava. Posebno se ovi oligonukleotidi mogu upotrebiti u lekovima za prevenciju i/ili lečenje bolestipovezanih sa ekspresijom ili prekomemom ekspresijom određenih gena. Dalje, oligonukleotidi se mogu upotrebiti za dijagnozu odn. rano otkrivanje ovih bolesti. Pošto je sposobnost oligonukleotida prema pronalasku da uđe u ćeliju vrlo dobra, oni se mogu se upotrebiti za dijagnostiju in vivo, npr. za hibridizaciju in situ u celim organima ili intaktnom organizmu.

Pronalazak se odnosi i na primenu oligonukleotida za detekciju, razdvajanje i umnožavanje nukleinskih kiselina i njihovih analogona. Konjugati su vrlo pogodni za detekciju nukleinskih kiselina u ćelijama, posebno u živim ćelijama. Ove ćelije mogu biti ljudskog ili životinjskog porekla. Posebno, ovi konjugati su pogodni i za organizme, navedene u Tabeli 3, naročito za detekciju patogenih organizama. Oligonukleotidi prema pronalasku se mogu upotrebiiti u poznatim tehničkim varijacijama za umnožavanje nukleinskih kiselina, posebno kod LMPCR( engl. ligation- mediated polymerase chain reaction :lančana reakcija polimeraze posredovana ligacijom), u "Invader Assay" (žig, Third Wave technologies, Inc., VVisconsin, SAD), u TaqMan Svstem (žig), i umultipleks genotyping (multipleksnoodređivanje tipa gena). Od prednosti je i upotreba oligonukleotida za umnožavanje nukleinskih kiselina uz pomoćLight- Cycler- a,koji omogućava određivanje umnožavanja u realnom vremenu. Detekcija po principu molekularnih" beacons" - a(zrakova), kod koga fluorescentna boja ne u nevezanom stanju ne fluorescira, pošto je nekom drugom grupom zaklonjen u oligomeru, predstavlja jednu dalju mogućnost upotrebe oligonukleotida u skladu sa pronalaskom. Moguće je, na primer, kombinovati derivat FDA (npr. na 5'-kraju oligonukleotida) sa Dabcvl radikalom (npr. konjugovanog na 3'-kraju), koji prigušuje fuioroscentni signal u nevezanom stanju čaki i posle kovenrzije derivata FDA derivata u derivat fluorescina. Ovi FDA-modifikovani zraci( beacons)bi, tek posle resoprcije u ćeliju i hibridizacije sa ciljnommRNK, emitovali fuorescentni signal.

Pronalazak se odnosi i na upotrebu oligonukleotida ili lekova koji sadrže ove oligonukleotide, za lečenje bolesti, koje su izazvane ili povezane sa ekspresijom ili prekomernom ekpsresijom definisanih gena. Lekovi prema predmetnom pronalasku mogu se, na pr., upotrebiti za lečenje bolesti, izazvanih virusima, na primer CMV, HIV, HSV-1, HSV-2, grip, VSV, hepatitis B ili v papiloma virusom. Lekovi prema predmetnom pronalasku pogodni su, na pr., i za lečnje raka. Lekovi prema ovom pronalasku pogodni su, npr., i za lečenje bolesti, na koje utiču integrini ili receptori adhezije ćeija-ćelija, npr. VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM ili ELAM. Lekovi prema ovom pronalasku su pogodni, npr., i za prevenciju restenoze, za lečenje vitiliga i drugih obolenja ili poremećaja depigmentacije (npr., kože, kose, očiju), npr., albinizma i psorijaze i astme.

Lekovi se odnose, npr., na farmaceutske preparate koji se administriraju a) oralno, npr. u vidu tableta, tableta obloženih šećerom, tvrdih ili mekih želatinskih kapsula, rastvora, emulzija ili suspenzija, b) rektalno, npr. u vidu supozitorija, ili c) parenteralno, npr. u vidu rastvora za injekcije. Za proizvodnju ovih lekova, konjugati se mogu braditi u , na pr., terapeutski inertnim organskim i/ili neorganskim nosačima ; odgovarajući nosači za tablete, tabelete obložene šećerom i tvrde želatinske kapsule su, na primer, laktoza, kukuruzni škrob ili njihovi derivati, talk i stearinska kiselina ili njene soli. Odgovarajući nosači za rastvore su voda, polioli, skroza, invertni šećeri i glukoza, za rastvore za injekcije su voda, alkoholi, polioli, glicerol i biljna ulja, za supozitorije su : biljna i hidrogenzovana ulja, voskovi, masti i polutečni polioli. Dalje, lekovi mogu da sadrže konzervanse, rastvarače, stabilizatore, sredstva za okvašavanje (okvašivače), emulgatore, zaslađivače, boje, aromate, soli za promenu osmotskog pritiska, pufere, sredstva za oblaganje, antioksidante, i po potrebi, druga terapeutski aktivna jedinjenja. Poželjno se ovi lekovi nanose topikalno ili lokalno, kao npr. uz pomoć katetera ili inhalacijom, ili se administriraju injekcijom ili infuzijom. Za injekcije se konjugat formuliše u tečnom rastvoru, poželjno u fiziološki prihvatljivom puferu, kao to je na primer, Hank-ov rastvor ili Ringer-ovom rastvoru. Konjugat može da se formuliše i u čvrstom obliku i pre upotrebe rastvoriti ili suspendovati. Za sistemsku admonistracijupoželjne su dože od 0,01 mg/kg do oko 50 mg/kg telesne težine na dan.

Konjugati i/ili njihove fiziološki podnošljive soli, mogu se adminsitrirati kao lekovi životinjama, poželjno sisarima, a posebno ljudima, sami ili u smeši jednog sa drugim ili u obliku farmaceutskih preparata, koje omogućavaju topikalnu, perkutanu, parenteralnu ili enteralnu upotrebi i koji sadržem kao aktivnu komponentu, delotvornu dozu bar jednog konjugata, pored uobičajenih farmaceutski prihvatljivih nosača i aditiva. Preparati obično sadrže oko 0,1 do 90 tež.% terapeutski aktivnog jedinjenja. Za lečenje bolesti kože, npr,. psorijaze ili vitiliga prednost se daje topikalnoj primeni, npr., u obliku kremova, losiona ili tinktura, emulzija, suspenzija. Lekovi su dobijeni na poznat način, (na pr., Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publ.Co., Easton, PA, USA), pri čemu se koriste farmaceutski inertni neorganski i/ili organski nosači. Za proizvodnju pilula, tableta, dražeja i kapsula od tvrdog želatina, može se koristiti, npr., laktoza, kukuruzni škrob i/ili njihovi derivati, talk, stearinska kiselina i njene soli, itd. Odgovarajući nosači za meke želatinske kapsule i/ili supozitorije su, npr., masti, voskovi, polutvrdi i tečni polioli, prirodna i/ili hidrogenzovana ulja, itd. Pogodni nosači za dobijanje rastvora i/ili sirupa su voda, saharoza, invertni šećer, glukoza, polioli, itd. Pogodni nosači za dobijanje injekcionih rastvora su voda, alkoholi, glicerin, polioli, biljna ulja, itd. Kao nosači za mikrokapsule, implantante i/ili štapiće pogodni su smešei polimeriza glikolne kiseline i mlečne kiseline. Dalje, pogodne su i formulacije sa lipozomima, poznate prosečnom stručnjaku (N.VVeiner, Drug Develop ind Pharm 15(1989) 1523 "Liposome Dermatics", Springer Verlag 1992), na pr., HVJ-lipozomi (Havashi, Gene Therapy, 3 (1996) 878).

Lek, pored aktivnog jedinejnja i nosača može da sadrži i aditive, kao npr., punioce, ekstendere, dezintegrante, vezivna sredstva, sredstva za klizenje, stabilizatore, emulgiratore, konzervanse, zaslađivače, boje, za poboljšanje ukusa i arome, sredstva za zgušnjavanje, razblaživače, puferske supstance, dodatne rastvarače i/ili pomoćne rastvarače i/ili sredstva za postizanje depo efekta u i soli za promenu osmotskog pritiska, sredstva za oblaganje i/ili antioksidante. Takođe mogu da sadže dva ili više različitih oligonukleotida i/ili njihove fiziološki prihvaltjive soli, kao i, pored bar jedan oligonukleotida, jednu ili više drugih terapeutski aktivnih supstanci. Doza se može menjati unutar širokih granica i treba je prilagoditi svakom pojedinačnom slučaju.

Slike

Si. 1 : Slika prikazuje primere aril radikala.

SI.2a i 2b : Prikazuju primere aril radikala.

51.3 : Prikazuje različite primere (A, B, C, D, E, F, G) konjugacije između molekula koji treba da se transportuje, (ovde oligonukleotid) i aril radikala u zahtevu I. "R" je radikal u zahtevu I; "B" označava heterocikličnu bazu.

51.4 : Prikazuje mogućnost za proizvodnju konjugata prema pronalasku (ovde se sastoji od FDA-izocijanata i oligonukleotida).

51.5 : Prikazuje apsropciju konjugata CO_5 u REH-ćelije iz medijuma, tokom vremena, pri čemu je u jednom slučaju primenjen medijum bez seruma ( ♦), a u drugom slučaju medijum sa serumom (■). Apsorpcija u ćelije određena je pomoću FACS-a.

51.6 : Prikazuje određivanje apsropcije C_1 (FDA-konjugat :♦ ) i CO_2 (FITC-oligomer: A) u ćelije pomoću FACS-merenja. Početna koncentracija ekstracelularnog konjugata oligonukleotida iznosila je 1 uM ; O i a su kontrolne vrednosti.

51.7 : Zavisnost dužine transfekcije FDA-konjugovanih poliA-nukleotida u REH-ćelijama. 51.8 : Prikazuje poređenje apsorpcije u ćelije konjugata fluorescin-diacetat- i fluorescin-dipivalat-oligonukleotida

K39 : Karboksifluorescin-diacetat (F3 jednako FDA) iz Primera 15

K41 : Karboksifluorescin-dipivalat (F2) iz Primera 10.

51.9 : Ispitivanje aprosrpcije u ćeliju dvostruko označenog Cy3-oligonukloetid-F3-konjugata [1 uM] tokom inkubacije sa REH ćelijama, fluorscentnom mikroskopijom. Aprospcija posle 4 sata, levo : fluorescentno obeiežavenje ; sredina : bojenje cijaninom ; desno : snimak faznih kontrasta ; gore : oligonukleotid K33 ; dole : oligonukleotid K34.

Primeri

Primer 1 : Sinteza oligonukleotida

Oligonukleotidi se sintetizuju na automatskom DNK sintetizatoru (Applied Biosvstems Model 380B ili 394) uz primenu postupka "Standard Phosphoramidit Chemie" (standardna hernija fosforamidita) i oksidacijom jodom (F.Eckstein, Ed. "Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach", IRL Press, Oxford, 1991). Za uvođenje fosforotioat premošćenja u mešane fosforotioate i fosfodiestre, oligonukleotidi se oksidišu, umesto jodom, sa TETD (tetraetiltiuramdisulfidom) ili reagensom Beaucage-a. Posle otcepljenja čvrstog nosača (CPG ili tentažela) i skidanja zaštitnih grupa koncentrovanom NH3 na 55fC u toku 18 sati, oligonukleotidi se prvo prečišćavaju taloženjem sa butanolom (Savvadogo, Van Dvke, Nucl.Acids,Res.19 (1991) 674). Oligonukleotidi se zatim prečišćavaju preparativnom elektroforezom sa želom ili FPLC. Posle toga se dobija natrijumova so taloženjem iz 0,5M rastvora NaCI sa 2,5 zapreminskih delova etanola. Analiza oligonukleotida vršena je : a) Analitičkom gel-elektroforezom u 20%-nom akrilamidu, 8M urei, 454M Tris-boratnom puferu, pH 7,0 i/ili

b) HPLC-analizom (analizom pomoću tečne hromatografije visiokog pritiska):

VVaters GenPak FAX, gradijent CH3CN (400 ml), H20 (1,6 I) NaH2P04 (3,1 g), NaCI

(11,7 g)pH 6,8 (0.1M u NaCI), posle CH3CN (400 ml), H20(1,6 I), NaH2P04(3,1 g), NaCI (175,3 g) pH 6,8 (1,5M u NaCI) i/ili

c) Kapilarnom gel- elektroforezom Beckmann Kapillare eCAPTM , kolona sa želom U100P dužine 65 cm, 100 mm unut. prečnika, prozor 15 sa jedne strane, pufer 140 mM

Tris, 360 mM borne kiseline, 7M uree, i/ili

d) Elektrosprav - masenom spektroskopijom.

Analiza oligonukleotida je pokazala da se se isti dobija uvek čistoće veće od 90%,

najčešće veće od 95%.

Primer 2 : Uvođenje jednog 5'-amino iinkera u jedan oligonukleotid

Oligonukleotid pripremljen je kao u Primeru 1. Posle sprezanja poslednjeg nukleotida dimetiioksitritil grupa na 5'-kraju je otcepljena. Slobodna hidroksil grupa pretvorena upotrebom komercijalno dobavljivog 5'-amino-modifikatora C6 (Firma Eurogenetic, Seirang, Belgija) uz katalizu tetrazolom, oksidiše se jodnom vodom. Zatim se oligonukleotid otcepi obradom sa konc. amonijakom na 50fC preko noći i sve bazno labilne zaštitne grupe internukleozidnih grupa na amino funkcijama se skidaju. U poslednjem koraku zaštitna monometoksioksitritil-grupa skinuta je 3-satnom obradom sa 80%-nom sirćetnom kiselinom na s.t. Dobijeni oligonukleotid analiziranje kako je opisano u Primeru 1.

Primer 3 : Konjugacija amino-linkera oligonukleotida FDA-izocijanatom

(ilustratvno dat primer)

10 OD (260) 5'-amino-linkera oligonukleotida iz Primera 2 rastvoreno je u 16 ml 0,2M trietilaminijumbikarbonatnog pufera (TBK) i pretvoreno je sa 125 ml dimetilformamida (DMF). Ovoj smeši dodato je 1,5 mg FDA izocijanata i ostavljeno je na mućkanju 3 sata bez svetla. Rezultat pretvaranja proveren je pomoću HPLC. Zatim je dodato 2 ml koncentrovane sirćetne kiseline i zgusnuto je u vakuumu. Posle toga je proizvod prečišćen taloženjem pomoću butanola. Uz pomoć ESI-masene spektroskopije određena je tačna specifična masa. Probe su stalno vršene pri pH manjim od 7, da ne bi nastupala hidroliza aromatičnog estra.

Primer 4 : Sintezaco 1 (5'-F3-G<*>CGAC<*>GC<>>CAT<*>GAC<*>G<*>G-3' ;F3 = FDA)

Oligonukleotid je pripremljen polazeći od jednog COG-T-nosača koji je držao 1 mmol dezoksigvansoina vezanog za 3-kraj, kako je opisano u Primeru 1. Na pozicijama označenim sa<*>sprovedena je oksidacija reagensom Beaucage, sa ciljem uvođenja premošćenja fosforotioatom. Zatim je spregnut, kako je opisano u Primeru 2, 5-amino-modifikator C6. Posle skidanja zaštite pomoću konc. amonijaka i 80%-ne sirćetne kiseline aobijeno je 96 OD (260) 5'-amino linkera-G<*>CGAC<*>GC<*>CAT<*>GAC<*>G<*>G-3. 10 OD (260) 5'-amino-linkera oligonukleotida je zatim pretvoreno sa FDA-izocijanatom, kako je opisano u Primeru 3. Posle taloženja pomoću butanola dobijeno je 8,4 OD (260) željenog oligonukleotida, označenog za FDA. ESI-MS za di-Na so : 5395,93 (sračunato za di-Na : 5395,09).

Primer 5 : Sinteza C0_13 v '

Oligonukleotid pripremljen je polazeći od jednog CPG-nosača, koji je sadržao 1 mmol timidina vezanog za 3'-kraj, kako je opisano u Primeru 1. Sve oksidacije sprovedene su jodnom vodom. Zatim je spregnut 5'-amino-modifikator C6, kako je opisano u Primeru 2. Posle skidanja zaštite konc. amonijakom i 80%-nom sirćetnom kiselinom dobijeno je 72 OD (260) 5'-amino-linker-a TATTCCGTCAT-3'. Posle prečišćavanja preko preparativnog poliakrilamidnog žela dobijeno je 43 OD (260). 10 OD (260) 5'-amino-linker oligonukleotida pretvoreno je sa FDA-izocijanatom kao u Primeru 3. Posle taloženja butanolom dobijeno je 9,1 OD (260) željenog FDA-označenog oligonukleotida. ESI-MS:3934.1 (sračunata Mol.t. 3933,8).

Primer 6 : SintezaC0_21<<5>'<-F7-A*>T-G A C<*>G G A A'T'T'C)

Ovaj oligonuklkeotid pripremljen je polazeći od jednog CPG-nosača, koji drži 1 mmol N6-benzoilitidina vezanog za 3'-kraj, kako je opisano u Primeru 1. Sve oksidacije sprovedene su jodnom vodom. Zatim je spregnut 5 -amino-modifikator C6, kako je opisano u Primeru 2. Posle skidanja zaštite koncentrovanim amonijakom i 80%-nom sirćetnom kiselinom dobijeno je 145 OD (260) 5'-amino linkera - A<*>T<*>GAC<*>GGAA<*>T<*>T<*>C-3'. 10 OD (260) 5'-amino linker-oligonukleotida rastvoreno je u 16 ml 0,2M TBK-pufera, 86 ml DMF i pretvoreno sa 30 ml prethodno pripremljenog aktivacionog estra p-acetoksi benzoeve kiseline. Proizvodnja aktivacionog estra izvršena je mešanjem 50 ml 0,2M p-acetoksi benzoeve kiseline sa 50 ml 0,3M TBTU, uvek u TBF i jednosatnom reakcijom na s.t. Posle 4 sata reakcije amino-linker oligonukleotida sa aktivacionim estrom dodato je 2 ml polukoncentrovane sirćetne kiseline i zgusnuto je u vakuumu. Višak reagensa uklonjen je taloženjem butanolom. Dobijeno je 10,7 OD (260) željenog konjugata oligonukleotida. ESI-MS : 4109,2 (Sračunata Mol.t. 4108,2).

Primer 7 : Ispitivanje celularnog resoprcije konjugata oligonukleotida

Radi ispitivanja resoprcije u ćelije 1 ml suspenzije ćelija pretvoreno je u jednoj Bachofer-komori u kultivacionoj sredini (ili posle ispiranja u PBS kod sredina sa sopstvenom fluorescencijom) uz mikroskopsku kontrolu i sa 1 ml jednog mmolarnog rastvora konjugata oligonukleotida, pri čemu je mešanje izvršeno pipetom i trešenjem komore. Mikroskopija je vršena pomoću TV uređaja Zeiss Axiovert 135 (100x Pian-Neofluar) u načinu rada kontrasta faza. Kao filteri fluoresecncije služili su filteri 09(450-490/FT 510/LP 520)/HBO 59VV. Kao referenca upotrebljen je rastvor 2,4 mM FDA (Aldrich Chem.Co., FW.416.39) u acetonu/PBS-puferu (1:1000 zapr./zapr.). U slučaju FDA-konjugata može se posle resoprcije sopstvene fluorescencije pratiti nastanak fluorescin-liganda estarskim cepanjem. U slučaju liganda, koji ne fluoresciraju, kao acetoksinaftalin-karbonska kiselina, dodata je oligonukleotidu pogodna labeia fluorescencije (FITC, Rhodamin, cijaninska boja Dy3 ili Dy5). Dvojno označavanje kao kod C09 služilo je da pokaže da FDA nije otcepljen od oligonukleotida. Pojedinačne probe vrednovane su 2 do 120 minuta posle dodavanja konjugata oligonukleotida. Kod REH-ćelija se posle 5 do 10 minuta fluorescencija jasno uočavala, kod K562 i adherentnih ćelija dešavao se određeni porast i posle do 60 minuta po dodavanju. Kod slobodnih i živih protozoa resoprcija je trajalo do 1 sata. Kod kvasca je resoprcija nastupalo tek posle dužeg vremena i nije bilo homogeno u sve ćelije. Spore gljiva preuzimale su konjugate FDA oligonukleotida bolje od ćelija šampinjona. Rezultati su sažeti i Tabelama 1 do 3.

Primer 8 : Ispitivanje antiproliferantnog dejstva konjugata oligonukleotida

REH-ćelije (humana pre-B ćelijska leukemija, DSM ACC 22) ili ćelije tumora A549 kultivisane su na 37fC pod 5%-nim C02 u OptiMEM-u sa 10 % telećeg seruma (FKS ; GIBCO-BRL). Na dan pre početka ispitivanja ćelije su tako pretvarane, daje posle 24 sata mogla da bude postignuta koncentracija ćelija od oko 1 x 106/ml. Oligonukleotidi, odn. njihovi konjugati rastvoreni su u destilovanoj vodi kao osnovni rastvori 1 mM i držani su u haldnjaku na -20°C.

Zasad ćelija : (1 x 106 ćelija/ml u OptiMEM-u sa 10% FKS) izvršen je na ploče sa 24 otvora. Radi ispitivanja, derivati oligonukleotida razređeni su (u OptiMEM-u bez FKS) na 2 mM. U svaki otvor smešano je 100 ml rastvora oligonukleotida i 100 ml suspenzije ćelija (ukupna zapremina 200 ml/otvor; koncentracija oligonukleotida 1 mM. Koncentracija seruma 5% FKS, koncen-tracija ćelija 0,5 x 106 ćelija/ml). Posle 4 sata inkubacije na 37fC 1 pod 5% C02 dodato je u svaki otvor 800 ml OptiMEM-a sa 11 % FKS (koncentracija ćelija je sada 1 x 105 ćečija/ml, koncentracija seruma je sada 10% FKS) i dalje je inkubirano. Posle 96 sati na 37fC i 5% C02 izvršeno je merenje koncentracije ćelija pomoću Casy 1 (firma Schaerfe). U tom cilju su ćelije su u svakom otvoru 10 x isisane i ubacivane pipetom 1000 i time pomešane i odmah razređene 1:100 (pri jačem rastu ćelija 1:200) Casyton-om. Dobijeno je određivanje srednje vrednosti gustine ćelija, svaku put iz po 3 probe jedne za drugom iz jednog probnog kompleta.

5'-F4'(CO-NH)-A<*>T<*>G AC'GGAA<*>T<*>T<*>C

Primer 9 : Sinteza

(ilustratvno dat primer)

Oligonukleotid je pripremljen polazeći od jednog CPG-nosača, koji na svom 3'-kraju držao vezan 1 mmol N4-benzocitidina, kako je opisano u Primeru 1. Oksidacije su vršene jodnom vodom odn. reagensom Beaucage radi uvođenja jednog fosforotioat-ostatka (kada je<*>u sekvenci). Zatim je spregnut i 5-amino-modifikator C6, kako je opisano u Primeru 2. Posle skidanja zaštite konc. amonijakom i 80%-nom sirćetnom kiselinom dobijeno je 145 OD (260) 5'-aminolinker-A<*>T<*>GAC<*>GGAA<*>T<*>T<*>C-3'. 10 OD (260) 5;-aminolinker-oligonukleotida rastvoreno je u 0,2M TBK pufera, 96 ml DMF i pretvoreno pomoću 12,5 ml diacetata dihlorofluorescin-hidrosukcinimida (Mol.t.: 626,36). Posle 3 sata reakcije aminolinker-oligonukleotida sa hidrosukcinimidom dodato je 2 ml polukoncentrovane sirćetne kiseline i zgusnuto je u vakuumu. Posle odsoljavanja kroz jednu NAP-kolonuTM (Pharmacia) sprovedeno je taloženje butanolom. Dobijeno je 2,8 OD (260) željenog konjugata diacetata dihloroflueorescein oligonukleotida. ESI-MS : 4403,3 (sračunato Mol.t. 4403,2).

5'-F2'-(CO-NH)-A<*>~PG A C<*>G G A A<*>T<*>T<*>C

Primer 10: Sinteza

(ilustratvno dat primer)

5'-aminolinker-A<*>T<*>G A C<*>G G A A<*>T TC-3' oligomer proizveden je kako je opisano u Primeru 9. 10 OD (260) 5'-aminolinker-oligonukleotida rastvoreno je u 16 ml o,2M TBK-pufera, 95 ml DMF i sa 12,5 ml karboksifluore-secindipivalat-hidroksisukcinimida (Mol.t. 641,64) pretvoreno. Posle 2 sata reakcije amino-linker oligonukleotida sa hidroksisukcinimidom dodato je još jednom 12,5 ml hidroksisukcinimida i ostavi se da reaguje još 2 sata. Posle toga se dodaju 2 ml polukoncentrovane sirćetne kiseline i zgusne se u vakuumu. Posle odsoljavanja kroz jednu NAP-kolonuTM (Pharmacia) sprovedeno je taloženje butanolom. Dobijeno je 8,1 OD (260) željenog konjugata fluoresceindipilivat-oligonukoetida. ESI-MS : 4472 (sračunata Mol.t. 4471,6).

Primer 11:Sinteza5'-F9-A<*>T<*>G A C<*>G G A A<*>T<*>T<*>C

Oligomer 5'-aminolinker-A<*>T<*>G A C<*>G G A A<*>T<*>T<*>C-3' proizveden je kako je opisano u Primeru 9.. 10 OD (260) 5'-amino-linker-olinukleotida rastvoreno je u 16 ml 0,2M TBK pufera, 95 ml DMF i pretvoreno je sa 25 ml aktivnog estra preparativnog žela poiliakrilamida i dobijeno je 2,95 OD (260) 5'-aminolinkera-(dA)17dA<*>dA<*>dA, 4,9 OD (260) 5'-aminolinkera-(dA)47dA<*->dA<*>dA i 5 OD (260) 5'-aminolinkera-(dA)77dA<*>dA<*>dA. 5'-aminoiinker-oligonukleotidi su, svaki od njih, rastvoreni u 8 ml 0,2M TBK-pufera, 62 ml DMF i sa 1,6 mmol FDA-izocijanata pretvoreno. Posle 3 sata reakcije dodato je još FDA-izocijanata i ostavljeno je da reaguje još 2 sata. Tada je dodato 2 ml polukoncentrovane sirćetne kiseline i zgusnuto je u vakuumu. Posle odsoljavanja kroz jednu NAP-kolonuTM (Pharmacia) sprovedeno je taloženje butanolom. Dobijeno je 1,5 OD (260) 5'-F3-(dA)17dA<*>dA<*>dA, 2,2 OD (260) 5'-F3-(dA)47dA<*>dA<*>dA i 0,9 OD (260) 5'-F3-(dA)77dA<*>dA<*>dA.

,nt5'-F8-A*T*G A C*G G A A*T*T*C

Primer 12 : Sinteza

5'-aminolinker-oligomer-A<*>T<*>G A C<*>G G A A<*>T<*>T<*>C-3' proizveden je kako je opisano u Primeru 9. 10 OD (260) 5'-amino-linker-oligonukleotida rastvoreno je u 16 ml 0,2M TBK-pufera, 96 ml DMF i pretvoreno pomoću 25 ml aktivnog estra acetoksikumarinske karbonske kiseline. Pripremanje aktivnog estra obavljeno je mešanjem 12,5 ml 0,2M acetoksikumarinske karbonske kiseline (2,7 mg u 50 ml DMF) sa 12,5 ml TBTU (4 mg u 50 ml DMF) i 1-nosatnom reakcijom na s.t. Posle 17 sati reakcije aminolinker-oligonukleotida sa aktivnim estrom dodato je 2 ml polukoncentrovane sirćetne kiseline i zgusnuto u vakuumu. Posle odsoljavanja kroz jednu NAP-kolonuTM (Pharmacia)

sprovedeno je taloženje butanolom. Dobijeno je 8,0 OD (260) željenog konjugata acetoksikumarin-oligonukleotida. ESI-MS : 4178,5 (sračunata mol.t. 4175,2).

D. „0 0.. 5'-F3-(dA)n dA*dA*dA ( n= 17, 47 und 77; F3 = FDA)

Primer 13 : Sinteza v /n

Oligonukleotidi su pripremljeni polazeći od jednog CPG-nosača, koji je bio derivatizovan sa 3'-kraja pomoću N6-benzoil-2ž-dezoksiadenozinom, kako je opisano u Primeru 1. Oksidacije posle prva dva sprezanja sprovedene su pomoću reagensa Beaucage radi uvođenja fosforotio ostataka (u sekvencama označenih sa<*>), a sve ostale oksidacije sprovedene su jodnom vodom. Posle je spregnut 5'-mino-modifikator C6, kako je opisano u Primeru 2. Posle skidanja zaštita konc. amonijakom i sa 80%-nom sirćetnom kiselinom i prečišćavanja preko preparativnog žela poliakrilamida, dobijeno je 2,96 OD (260) 5 - aminolinkera-(dA)17dA<*>dA<*>dA, 4,9 OD 5'-minolinkera-(dA)47-dA<*>dA<*>dA i 5 OD (260) 5'-aminolinkera-(dA)77dA<*>dA<*>dA. 5'-aminoiinker-oligonukleotidi rastvarani su, svaki, u po 8 ml 0,2M TBK-pufera, 62 ml DMF i pretvarani sa 1,6 mmol FDA-izocijanata. Posle 3 sata reakcije dodato je još FDA-izocijanata i ostavljeno je da reaguje još 2 sata. Tada je dodato 2 ml polukoncentrovane sirćetne kiseline i zgusnuto je u vakuumu. Posle odsoljavanja kroz jednu NAP-kolonuTM (Pharmacia) sprovedeno je taloženje butanolom. Dobijeno je 1,5 OD (260) 5'-F3-(dA)17dA<*>dA<*>dA, 2,2 OD (260) 5'-F3-(dA)47dA<*>dA<*>dA i 0,9 OD (260) 5'-F3-(dA)77-dA<*>dA<*>dA.

Primer 14 : Sinteza dvojno označenog oligonukleotida

Oligonukleotid je proizveden polazeći od jednog CPG-nosača, koji je omogućavao uvođenje jednog C6-aminolinkera na 3'-kraju (Petrie et al., (1992) Bioconjugate Chem. 3, 85-87), kako je opisano u Primeru 1. Oksidacija le vršena jodnom vodom odn. reagensom Beaucage radi uvođenja jednog ostatka fosforotioata (kada je<*>u sekvenci). Posle otcepljenja poslednje dimetoksitritil zaštitne grupe, 5'-kraj oligonukleotida pretvoren je Cy3-CE fosforamiditom (firma Glen Research, Sterlin, VA, USA; kat.br. 10-5913-xx) i oksidiran je jodnom vodom. Posle skidanja zaštitnih grupa konc. amonijakom (2 sata na 70fC) dobijeno je 64 OD (260) sirovog proizvoda. Posle prečišćavanja preko preparativnog žela poiliakrilamida dobijeno je 3,8 OD 5'-A<*>T<*>G A C<*>G G A<*>T<*>T<*>C-C6-aminolink-3'. Od toga je 3,5 OD (260) rastvoreno u 8 ml TBK-pufera, 62 ml DMF i sa 1,6 mmol FDA-izocijanata pretvoreno. Posle 3,5 sata reakcije aminolinker-oligonukleotida sa hidroksisukcinimidom dodato je 1 ml polukoncentrovane sirćetne kiseline i zgusnuto je u vakuumu. Dobijeno je 3,5 OD (260) željenog dvojno označenog oligonukleotida 5'-Cy3-A<*>T<*>G A C*G G A A*T*T*C-C6-F3.

ESI-MS : 4926,2 (sračunata mol.t. 4927,1).

_, 5'-F3-A*T*G AC'GGA A'T'T'C; F3*FDA

Primer 15 : Sinteza

5'-aminolinker-A<*>T<*>G A C<*>G G A A<*>T<*>T<*>C-3' oligomer porizveden je kako je opisano u Primeru 9. 10 OD (260) 5;-aminolinker-oligonukleotida rastvoreno je u 16 ml 0,2M TBK pufera, 95 ml DMF i pretvoreno pomoću 25 ml FDA-izocijanata (5 mg u 100 ml DMF). Posle 3 sata reakcije aminolinker-oligonukleotida sa izotiocijanatom dodato je još 5 ml izotiocijanata i ostavljeno da reaguje još 2 sata. Dodato je zatim 2 ml polukoncentrovane sirćetne kiseline i zgusnuto je u vakuumu.

Posle odsoljavanja kroz jednu NAP-kolonuTM (Pharmacia) sprovedeno je taloženje butanolom. Dobijeno je 8,5 OD (260) željenog konjugata diacetata fluorescein oligonukleotida. ESI-MS : 4418,4 (sračunato Mol.t. 4418,5).

Primer 16 : Upoređenje celularnog resoprcije oiigonukleotid-konjugata različite dužine 5'-F3-(dA)n dA<*>dA<*>dA ( n= 17, 47 und 77; F3 = FDA)

Određivanje celularnog resoprcije konjugata različite dužine i molekularne težine iz Primera 12 izvršeno je u principu kao u Primeru 7 pomoću REH-ćelija. Kvantifikacija je uzvršena pomoću protočnog citometra. Posle 60 minuta, relativni fluorescentni signali za 5'-F3-(dA)17dA<*>dA<*>dA ("A20") su 49, za 5'-F3-(dA)47dA<*>dA<*>dA ("A50") su 34 a za 5-F3-(dA)77dA*dA*dA ("A80") su 91. FDA-konjugat sa najvećim udelom oligo-nukleotida, koji se sastojao od 80 nukleotida, bio je, na iznenađenje, najefikasnije preuziman u REH-ćelije.

Primer 17 : Upoređenje celularnog resoprcije konjugata oligonukleotida različite derivatizacije

Jedno jedinjenje srodno diacetatu fluoresceina (FDA) je dipivalat fluo-resceina, koje se odlikuje povišenom stabilnošću estarskih grupa. Odgovarajući konjugati oligonukleotida mereni su na protočnom citometru u pogledu njhovog resoprcije. Povećana stabilnost pivalata u odnosu na alkalije i esteraze dovelo je do manjeg resoprcije odgovarajućih konjugata oligonukleotida. Tako je izmerena relativna fluorescencija za konjugat diacetata fluorescina posle 60 minuta iznosila 195, dok je za odgovarajući konjugat dipivalata fluorescina iznosila samo 55.

Primer 18 : Ispitivanje celulalrnog resoprcije dvojno označenog konjugata oligonukleotida 5'-Cy3-A<*>T<*>G A C<*>G G A A*T*T*C-C6-FDA iz Primera 13.

Na FACScan-u F3-konjugat Cy3-oligonukleotida pokazao je brzo upijanje od strane REH-ćelija. Obrada ćelija jednim kompleksom konjugata oligonukleotida/Cellfectin pokazuje slično, ali jasno neravnomernije pre-uzimanje (upijanje). Pritom efekat FDA-konjugata jasno prednjači ispred onog komplkeksa Cellfectin-oligonukleotida.

Dalje je trebalo istražiti i kolokalizaciju obe različite grupe po označavanju oligonukleotida pri inkubaciji ćelijama, da bi se isključilo da se izmerena fluorescencija zasniva samo na otcepljenom FDA odn. fluoreceinu. F3-konjugat Cy3-oligonukleotida sadržavao je kovalentno vezanu cijaninsku boju na 5'-kraju a FDA na 3'-kraju. SI. 9 prikazuje zelenu i crvenu fluorescenciju posle 4-satne inkubacije REH-ćelija F3-konjugatom Cy3-oligonukleotida. Pošto se mogla primetiti kolokalizacija oba markera (označavača) na ćelijama, mora se poći od toga da se oligonukleotid preuzima u nedirnutom obliku. Samo se acetil grupe FDA-dela hidrolizuju, verovatno esterazama, pošto se nefluorescentni FDA-ostatak očigledno prevodi u fluorescentni ostatak fluoresceina. Resoprcija konjugata Cy3/FDA teče vrlo brzo, pošto se prisustvo oba markera već posle 7 minuta po dodavanju moglo potvrditi.

FDA-konjugat CO_1 iz Primera 4 ispitivan je pri 4 koncetracija u pogledu antiproliferanrnog dejstva na A549 tumorske ćelije. Isti je sprečavao proliferaciju i bez dodatka pojačavača penetracije. Odgovarajući oligonukleotid bez konjugata F3 (ON 1) sprečava proliferaciju tek posle stvaranja kompleksa sa nekim pojačavačem penetracije (Cellfectin, firma Gibco, BRL). Rezultati su dati u Tabeli 4.

A : Inkubacija sa FDA-označenim oligonukleotidima CO_1 i CO_3

B : Inkubacija fluoresceinom označenim oligonikleotidima CO_2 i CO_4 (+) slaba resoprocija ;

+ umerena resoprcija;

++ veoma jaka resoprcija ;

nema resoprcije ;

<*>resoprcija samo u oštećenim ćelijama

Claims (9)

1. Upotreba aril radikala formula Ft i F3 do F11, za koji je vezan molekul koji treba transportovati, a odabran je iz grupe koju čine polinukleotid, oligonukleotid i mononukieotida, za transport molekula kroz biološke membranein vitro.

2.Upotreba aril radikala formula F1 i F3 do F11, za koji je vezan molekul koji treba transportovati, a odabran je iz grupe koju čine polinukleotid, oligonukleotid i mononukleotid, za dobijanje ieka za prevenciju i/ili lečenje bolesti povezanih sa eksprimiranjem ili prekomernim eksprimiranjem određenih gena, i/ili dijagnostikičkog agnesa za dijagozu ili ranu identifikaciju datih bolesti.

3. Upotreba prema zahtevu 1 ili 2, naznačena time, što aril radikal(i) je (su) vezani za 5'-kraj, 3'-kraj, heterocikličnu bazu, šećer internukleozidnog mosta, i takođe može da bude vezan preko gradivnih blokova bez nukleotida.

4. Postupak za transport molekula kroz membranein vitro,naznačena time, što aril radikal kao što je opisano u jednom od zahteva 1-3 za koji je vezan molekul, koji se transportuje, odabran iz grupe koju čine polinukleotid, oligonukleotid ili mononukleotid, se inkubira sa membranom.

5. Postupak za transport molekula u ćelijuin vitro,naznačen time, što aril radikal kao što je opisan u jednom od zahteva 1-3 za koji je vezan molekul koji treba transportovati, a odabran je iz grupe koju čine polinukleotid, oligonukleotid ili mononukleotid, s inkubira sa ćelijom, nakon čega se konjugat transportuje u ćeliju, bez otcepljenja aril radikala.

6. Postupak prema zahtevu 5, naznačen time, što je ćelija, eukariotska ili prokariotska ćelija.

7. Postupak prema zahtevu 5 ili 6, naznačen time, što je ćelija, bakterijska ćelija, ćelija kvasca ili ćelija sisara.

8. Postupak prema jedom ili više zahteva 5 do 7, naznačen time, što je ćelija, humana ćelija.

9. Postupak prema jednom ili više zahteva 5 do 8, naznačen time,što je ćelija, ćelija tumora.