JP4652648B2 - キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびその細胞トランスフェクション処方物 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関し、そしてより詳細には、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼに対する、標的ｍＲＮＡの有効かつ持続性のノックアウトにより証明されるような、高い抵抗性、高い配列特異性、およびＲＮＡｓｅ Ｈを活性化する能力、を示すキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。細胞への有効なトランスフェクションを提供する、キャリア分子を有するオリゴヌクレオチドの処方物もまた提供する。
【０００２】
（発明の背景）
標的遺伝子の機能を特異的に阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、選択的抗ウイルス治療、および抗癌治療におけるその見込みから広範囲に及ぶ研究の課題であった。安定性（すなわち、細胞のヌクレアーゼに対する抵抗性）を含む特性の最適な組み合わせ、細胞の取り込み、ＤＮＡ／ＲＮＡの結合親和力および結合特異性、ならびに阻害の効果を有するオリゴヌクレオチド類似体を設計することに、多くの研究が向けられている。ネイティブの核酸のリン酸ジエステル結合は、エンドヌクレアーゼ、そしてエキソヌクレアーゼによって分解されるので、初期の研究の多くは、ヌクレアーゼ耐性アナログの設計することに向けられた。ホスホロチオエートは、一つのそのようなクラスの化合物であり、これはインビボ生体内では比較的安定であり、そしてＲＮＡｓｅ Ｈを活性化する能力を保持する（アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡを不活化する初期の機構）。しかし、ホスホロチオエートの使用は、いくつかの不利益を提供する。この不利益は、他の細胞成分への高レベルな非特異的な結合を含み、しばしば望ましくない副作用、およびＲＮＡに対する結合親和性の低下を引き起こす。
【０００３】
２’−酸素で置換された、オリゴマーのリボヌクレオチドは、高いＲＮＡ結合親和性、および非置換リボヌクレオチドと比較して、内因性のヌクレアーゼに対する低い感受性を示す。２’−Ｏ−メチルが置換されたリボヌクレオチドは、より大きな置換基、（例えばエチル、プロピル、ペンチル、アリル）より高い結合親和性を提供するが、より大きな置換基は、より高いエキソヌクレアーゼ耐性をもたらすと報告されている（例えば、Ｍｏｎｉａら、Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（２４）：１４５３３，１９９６参照）。Ａｒｒｏｗら（米国特許第５，８４９，９０２号）は、「リン酸ジエステル結合を有する２’−Ｏ−メチル塩基は、エキソヌクレアーゼによって分解され、そして、それは、細胞内における使用、またはアンチセンスの治療的適応に適さない」ことが述べられている。ホスホロチオエート結合およびリン酸トリエステル結合は、低下した結合親和性の不利益、より困難な合成（リン酸トリエステル）、そしてまたはより高い毒性（ホスホロチオエート）の不利益を、提供したにもかかわらず、後者の群によって、高い安定性を有するものとして推奨された。
【０００４】
従って、アンチセンス活性、標的結合親和力、生物適合性、および安定性の最適な組み合わせを有するアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物に対する必要性は、まだある。
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、一つの局面では、式５’−Ｗ−Ｘ¹−Ｙ−Ｘ²−Ｚ−３’ （ここでＷは、５’−Ｏ−アルキルチミジンのような５’−Ｏ−アルキルヌクレオチドを表し、Ｘ¹、およびＸ²の各々は、７から１２ブロックのリン酸ジエステル結合した２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチドを表す）を有するキメラのヌクレオチドを含む。Ｙは５から１２ブロックのホスホロチオエート結合したデオキシリボヌクレオチドを表し、そしてＺは、オリゴヌクレオチドの３末端で、ヌクレアーゼ活性をブロックするために効果的なブロッキング基を表す。一つの実施形態において、Ｚは、３−３’を連結したヌクレオチドである。さらなる実施形態では、５’−Ｏ−アルキルヌクレオチド、および／または２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチドのアルキル基は、メチル基である。さらなる実施形態では、基Ｗ、および／またはＺは、Ｘ¹およびＸ²にそれぞれ、リン酸ジエステル結合、リン酸トリエステル、ホスホロチオエート、または、ホスホルアミダイト結合を介して結合する。好ましくは、Ｗは、リン酸ジエステル、またはホスホロチオエート結合を介して結合し、そしてＺは、比較的、ヌクレアーゼ耐性の結合を介して結合する。すなわち、リン酸トリエステル結合、ホスホロチオエート結合もしくは、ホスホルアミダイト結合である。
【０００６】
特定の実施形態では、キメラオリゴヌクレオチドのセグメントＸ¹−Ｙ−Ｘ²は本明細書中で開示される配列番号１〜２４、のいずれかにより示される配列を有する。
【０００７】
別の局面では、本発明は、薬学的に受容可能なビヒクル中に上述されるようなオリゴヌクレオチドを含む、治療的組成物を提供する。好ましい実施形態では、このビヒクルは、脂質カチオン性ペプトイド結合体、または「リピトイド」を含む。脂質カチオン性ペプトイド結合体の一つのクラスは、以下の式の化合物を含む：
Ｌ−リンカー−［Ｎ（ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ₂）ＣＨ₂（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｒ）ＣＨ₂（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｒ）ＣＨ₂（Ｃ＝Ｏ）］₃−ＮＨ₂
ここで、脂質基Ｌは、リン脂質基（すなわち、ＲＯＯＣＣＨ₂ＣＨ（ＣＯＯＲ）ＣＨ₂ＯＰ（Ｏ）₂Ｏ−）のような脂肪酸に誘導基であるか、または約８と２４との間の炭素原子の長さの脂質アルキルを有するアルケン鎖、あるいはステロイド誘導基（例えば、コレステロール基）であり、そしてそのリンカーの右の分子の部分はペプトイドセグメントである。ペプトイドセグメントにおいて、Ｒは、アルキル（分枝型、あるいは非分枝型）、アミノアルキル、そしてアラルキルから選択される。本明細書中で用いられる場合、「アラルキル」を、さらにアリール基（一つの例はベンジル基である）によって置換されているアルキル置換基、好ましくは、低級アルキル置換基をいう。「アリール」とは、単環（例えばベンゼン）、または二つの縮合環（例えばナフチル）を有する置換された一価の芳香族のラジカル、または置換されない一価の芳香族のラジカルをいう。この用語は、ヘテロアリル基を含み、これは、１以上の窒素原子、酸素原子、または硫黄原子を環の中に有する芳香環基である（例えばフリル、ピロール、ピリジル、およびインドール）。「置換される」とは、アリール基の１つ以上の環水素が、置換基（好ましくは、ハロゲン化物、低級アルキル基、もしくは低級アルコキシ基、ハロメチル、または、ハロエチルから選択される）によって置換されることを意味する。
【０００８】
特定の実施形態では、Ｒは、イソプロピル、または４−メトキシフェニルである。単一のリピトイドは、異なる基Ｒを含むか、それらは、分子内で、同一であり得る。
【０００９】
リンカーは、直接結合であり得るか、または、実質的に直鎖状の結合基（例えば、任意の有効な長さのオリゴペプチド、またはアルキル鎖）であり得る。このリンカーはまた、１つ以上のヘテロ原子を含んだ結合（これらの結合は、エステル、アミド、カーボネート、カルバメート、ジスルフィド、ペプチド、およびエーテルからなる基から選択され、これらの基は、鎖の末端か、またはアルキル結合の間の介在性のいずれかであり得る）を有するアルキル鎖でもあり得る。選択された実施形態では、リンカーは、２から約３０の長さの原子、または約３から１５の原子の長さである。
【００１０】
別の局面では、本発明は、非験体における標的遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。この方法は、薬学的に受容可能なビヒクル中で、遺伝子由来の選択された標的核酸配列（キメラオリゴヌクレオチドが上記の構造を有する）の全て、または一部に特異的にハイブリダイズするのに有効なキメラオリゴヌクレオチドの量を、非験体に投与する工程を包含する。一つの実施形態では、標的核酸配列は、標的遺伝子由来のｍＲＮＡである。特定の実施形態では、キメラオリゴヌクレオチドのセグメントＸ¹−Ｙ−Ｘ²は、本明細書中で開示された配列番号１〜２４のいずれかによって示される配列を有する。さらなる実施形態では、このビヒクルは、上記のような脂質カチオン性ペプトイド結合物を含む。
【００１１】
本明細書中でで示すように、本発明のキメラオリゴヌクレオチドは、驚くべき高い安定性、ならびに有効かつ持続的な標的ｍＲＮＡのノックアウトを提供した。発明のこれら、および本発明の他の目的ならびに特徴は、本発明の以下の詳細な説明が、添付する図と共に読まれるときに、より完全に明白になる。
【００１２】
（発明の詳細な記述）
（Ａ．キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド）
（Ｉ．構造）
本発明のキメラオリゴヌクレオチドは、以下にで示される一般構造を有する：
５’−Ｗ−Ｘ¹−Ｙ−Ｘ²−Ｚ−３’
この構造において、Ｙによって示される分子の中央部分はＹは、５および１２との間のホスホロチオエート結合したデオキシリボ核酸（ホスホロチオエートＤＮＡ、またはＰＳ ＤＮＡ）のブロックである。一つの実施形態では、ブロックＹは、十分に相補的なＲＮＡ鎖にハイブリダイズする場合にＲＮＡｓｅ Ｈを活性化するのに効果的であり、従って、ＲＮＡの開裂を促進する。ブロックＹは、Ｘ¹、およびＸ²（各々は、７と１２との間のリン酸ジエステル結合２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチドサブユニット（リン酸ジエステル２’−Ｏ−アルキルＲＮＡ、またはＰＯ２’−Ｏ−アルキルＲＮＡ）を有する）で表される、二つの結合ブロックに隣接している。本明細書中で用いられる場合、「アルキル」とは、炭素および水素を含む十分に飽和した非環式の一価ラジカル（これは、分岐鎖であってもよいし、直鎖状であってもよい（アルキル基の例として、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ヘプチル、およびイソプロピル）、のことをいう。「低級アルキル」とは、１から６の炭素原子、好ましくは１から４の炭素原子のアルキルラジカルのことをいう。
【００１３】
２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチドサブユニット のアルキル基は、好ましくは、低級アルキル基である。一つの実施形態では、アルキル基は、メチル基である。このアルキル基は、より長いアルキル基と比較して、一般に優れた結合、および細胞の取り込みを提供する。この結合ブロックは、ＲＮＡｓｅＨの活性化に関与するのに、必ずしも有効ではないが、十分に相補的なＲＮＡ鎖への結合親和性を提供し、そしてホスホロチオエート結合サブユニットと比較すると、低下した細胞毒性を、また提供し得る。
【００１４】
ブロッキング基ＺおよびＷは、それぞれ、３’および５’末端に提供される。一つの実施形態では、基Ｗ、およびＺは、リン酸ジエステル結合によってそれぞれのＸブロックに結合しており；別の実施形態では、それらは、ホスホロチオエート結合を介して付着させる。３’−ブロッキング基Ｚは、好ましくは、３’対３’結合ヌクレオチドであるが、この末端はまた、他の方法によって（例えば比較的ヌクレアーゼ安定性の結合を介したヌクレオチド末端の添付物（例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミダイト、リン酸トリエステル）、またはヌクレオチドでない部分の付加物によって）ブロックされ得る。
【００１５】
５’末端は、５’−Ｏ−アルキルヌクレオチドサブユニット（Ｗ）を用いてブロックされる（ここでアルキルは、低級アルキルが好ましい）。一つの実施形態では、Ｗは、５’−Ｏ−メチルチミジンである。このブロッキング基は、細胞培養物、ならびに血清中のキメラオリゴヌクレオチドに安定性を与えることが見出されている。例えば、細胞培養におけるｍＲＮＡノックアウトの持続時間（以下でさらに議論される）は、代表的には、トランスフェクションの後、３−５日に及ぶ。安定性を与えることに加え、このブロッキング基、および３’対３’ヌクレオチドブロッキング基は、オリゴヌクレオチドの取り込みまたは分布を妨害しないことが見出された。
【００１６】
本発明のキメラヌクレオチドは、確立された手順に従って、溶層合成、または好ましくは、固層合成を用いて調製され得る。例示的なキメラオリゴヌクレオチドの合成（例えば、図１）は、実施例１に記載される。
【００１７】
（Ｂ．アンチセンス活性）
上記の式に基づくアンチセンスキメラオリゴヌクレオチド（ＡＫＴ１（配列番号１）、またはＡＫＴ２（配列番号２）に対する配列を有する）は、実施例１に記述されたように調製された。オリゴヌクレオチドはまた、上記の式で表示されるような５’末端の５’−Ｏ−メチルチミジンを含む。これらのオリゴヌクレオチドでは、Ｘ¹およびＸ²は、２’−Ｏ−メチルＰＯ ＲＮＡの７塩基のブロックであり、Ｙは、ＰＳ ＤＮＡであり、Ｚは、３’対３’結合したヌクレオチドであり、そしてＷは、５’−Ｏ−メチルチミジンである。Ｚ、およびＷの両方は、リン酸ジエステル結合を介して、それぞれのＸブロックに結合されていた。実施例２で記載されるように、細胞にトランスフェクトした場合、種々の配列（表１を参照のこと）を有する本発明のキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、内因性のｍＲＮＡの驚くほど有効な分解を示し、それぞれの遺伝子活性の欠失を生じる。図５および図６は、結腸癌細胞およびＨＴ１０８０細胞のそれぞれにおける、内因性のＡＫＴ１ ｍＲＮＡのレベルを示し、抗ＡＫＴ１キメラオリゴヌクレオチド（配列番号１）を用いてトランスフェクトされる。同様に、ｈＣＨＫ１（配列番号３）に対するキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、内因性ｍＲＮＡの分解、ｃｈｋ１キナーゼ活性の欠失、そしてｃｈｋ１機能の欠失（すなわち、Ｇ２細胞周期チェックポイントコントロール）を示した。
【００１８】
表１に示される配列を有する、さらなるキメラヌクレオチドを調製し、実施例２に記載されるように、細胞に投与した（上記のように、各オリゴヌクレオチドは、５’−Ｏ−メチルチミジンを含む。これは、列挙された配列に示されない）。これらのオリゴヌクレオチドにおいて、上記の式を参照して、Ｘ¹およびＸ²は、２’−Ｏ−メチルＰＯ ＲＮＡの７塩基のブロックであり、Ｙは、ＰＳ ＤＮＡの９〜１１基のブロックであり、Ｚは、３’対３’で結合したヌクレオチドである。そしてＷは、５’−Ｏ−メチルチミジンである。ＺおよびＷの両者は、リン酸ジエステル結合を介して結合される。
【００１９】
ｍＴｙｒオリゴ（配列番号１７〜１８）（これはＢ１６メラノーマ細胞にトランスフェクトされる）を除いて、表１に示される全てのオリゴは、トランスフェクションのために、「リピトイド１」（以下を参照のこと）を用い、ＨＴ１０８０細胞にトランスフェクトされ、２４時間培養した。表は、各ケースにおいて観察されたｍＲＭＡのノックアウトのおおよそのレベルを与える。９０％以上のｍＲＮＡレベルの低下が表に示されるように頻繁に観察された。
【００２０】
【表１】
（トランスフェクション薬剤）
核酸組成物を細胞へ送達するための種々のストラテジーが存在する。細菌性のベクターは、比較的効果的な送達を提供するが、いくつかのケースにおいて、被験体において免疫学的な合併症の危険性、または不必要な増殖性の危険の原因となる安全性の問題が提示される。細胞のゲノム中に組み込まない点、および休止細胞中に形質転換され得る点で、アデノウィルスのベクターは、確かな利点を示した。しかしながら、これらベクターのすべては、時間を消費する組換えＤＮＡ技術により調製されなくてはならない。オリゴヌクレオチドはまた、多くの最近の研究の対象である、化学的なトランスフェクション薬剤を介して細胞に送達され得る。これら薬剤は、ポリリシンおよびカチオン性脂質のようなポリカチオンの分子を含む。リポソーム組成物である、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｆｅｌｇｎｅｒら，ＰＮＡＳ ８４：７４１３，１９８７）（カチオン性脂質である、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド）および中性のリン脂質である、ＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）を含む）が広く使われる。これらの方法のいずれか、および他の方法（例えば、リン酸カルシウム塩媒介トランスフェクション）は、報告された手順によって本発明の前記オリゴヌクレオチドを送達するために使用され得る。
【００２１】
送達の一つの方法は、「リピトイド（ｌｉｐｉｔｏｉｄｓ）」および「コレステロイド」 としてとして知られるトランスフェクション薬剤の使用を含む。例えば、前記トランスフェクション薬剤は米国特許出願第６０／０２３，８６７号、同第６０／０５４，７４３号および同第０９／１３２，８０８号に基づく、共に係るＰＣＴ公開、ＷＯ ９８／０６４３７およびＷＯ ９９／０８７１１（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら）に記述される（これらは本明細書中で参考として援用される）。脂質カチオン性ペプトイド結合体は、プラスミドＤＮＡをインビトロで細胞に送達するために有効な試薬であるとこれら参考文献に示される。これらの化合物はオリゴヌクレオチドを種々の初代細胞株および腫瘍細胞株に有効に送達することが本明細書中で示されている。送達の有効性は、さらに以下に記載されるような、ＦＩＴＣ−標識されたオリゴヌクレオチドの蛍光分析、またはキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドのトランスフェクション後のｍＲＮＡレベルをモニターすることによって評価された。
【００２２】
上記参考出願に記載されるキャリアーのいずれかは、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドのトランスフェクションにおける使用に適している。ステロイドカチオン性ペプトイド結合体に取り込むために有用なステロイドのさらなる開示は、ＰＣＴ公開、ＷＯ ９７／４６２２３（Ｆａｓｂｅｎｄｅｒら）、および対応する米国特許第５，９３５，９３６号に見出される（これらは本明細書中で参考として援用される）。
【００２３】
これらの化合物は、従来の液層合成、または固相合成によって調製され得る。上記で引用されるＺｕｃｋｅｒｍａｎｎらに記載されるような、一つのこのような手順では、レジンに結合したペプトイドのＮ末端は、スペーサー（例えば、Ｆｍｏｃ−アミノヘキサン酸、またはＦｍｏｃ−β−アラニン）を用いてアシル化される。Ｆｍｏｃ基の除去の後、一級アミノ基はコレステロールクロロホルメートと反応させて、カルバメート結合（例えば、図２のコレステロイド２，３および４に示されるように）を生成した。次いで、この生成物は、トリフルオロ酢酸を用いてレジンから切断され、そして逆相ＨＰＬＣによって精製される。リン脂質のような脂肪酸由来の脂質部分は、図２にもまた示されるように、ステロイド部分に代わって使用され得る。
【００２４】
ステロイドまたは他の脂質部分はまた、任意の有効な長さの、当業者に容易に入手可能な他の結合によってペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）部分に結合され得る。リンカーは長さ約３０結合までの鎖であり、そしてより好ましくは、長さ約１５結合までの鎖であるが、任意のこの記載は、代表的には直鎖、または実質的に直鎖であるが、分枝した鎖（オリゴペプチドを含む）および介在性の環状基を含むリンカーが使用され得る。このリンカーは一般的にアルキル（Ｃ−Ｃ）結合、および一つ以上の官能基（例えばエステル結合、アミド結合、カーボネイト結合、カルバメイト結合、ペプチド結合、およびエーテル結合）を含む。このリンカーは、コハク酸エステル、またはポリエーテルなどの複数の官能基、を含み得るか、または、好ましくは２〜１０マーのオリゴペプチド、より好ましくは、２〜５マーのオリゴペプチドであり得る。前記ステロイド部分、または脂質部分、およびペプトイドセグメントはまた、直接結合によって結合され得る。
【００２５】
特定の実施形態では、リンカーは、一つ以上の結合を取り込み、その結合は、インビトロでの以下の適切な条件下での切断に感受性である：例えば、加水分解性のエステル、カーボネイト、カルバメート、またはペプチド結合；ジスルフィド結合は、これは十分な還元環境を有する細胞コンパートメント中で切断される；およびペプチド結合、これは内因性のペプチダーゼによって切断可能である。後者に関しては、１０以下のペプチド結合を有するポリペプチドリンカー、または、さらなる実施形態では、５以下のペプチド結合を有するポリペプチドリンカーが、意図されるが、より長いリンカーもまた用いられ得る。
【００２６】
特定の実施形態では、脂質カチオン性ペプトイド結合体は、以下の式：
Ｌ−（ＣＨ₂）_n−（Ｃ＝Ｏ）−［Ｎ（ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ₂）ＣＨ₂（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｒ）ＣＨ₂（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｒ）ＣＨ₂（Ｃ＝Ｏ）］₃−ＮＨ₂、
を有し、
ここで、Ｌは（ｉ）長さ約８〜２４の間の炭素原子の脂肪族アルキル鎖または、アルケニル鎖を有するホスファチジルエタノールアミノ基（すなわちＲＯＯＣＣＨ₂ＣＨ（ＣＯＯＲ）ＣＨ₂ＯＰ（Ｏ）₂Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ₂−）、および（ｉｉ）エステル結合、アミド結合、またはカルバメート結合によって、隣接する−（ＣＨ₂）_n−セグメントに結合したコレステリル基より選択され；ｎは１〜５であり；そして、Ｒはイソプロピル、および４−メトキシフェニルより選択される、化合物クラスに属する。図２に示される、このクラスの代表的な構造は、本明細書中で以下の命名があたえられる；
リピトイド１、またはＬ１ ＤＭＰＥ（ＮａｅＮｍｐｅＮｍｐｅ）₃
リピトイド２、またはＬ２ ＤＭＰＥ（ＮａｅＮｉａＮｉａ）₃
コレステロイド１、またはＣｈｏｌ１ Ｃｈｏｌ−β−ａｌａ−（ＮａｅＮｍｐｅＮｍｐｅ）₃
コレステロイド２、またはＣｈｏｌ２ Ｃｈｏｌ−Ａｈｘ−（ＮａｅＮｍｐｅＮｍｐｅ）₃
コレステロイド３、またはＣｈｏｌ３ Ｃｈｏｌ−β−ａｌａ−（ＮａｅＮｉａＮｉａ）₃
コレステロイド４、またはＣｈｏｌ４ Ｃｈｏｌ−Ａｈｘ−（ＮａｅＮｉａＮｉａ）₃
本明細書中で使用されるように、用語「リピトイド（ｌｉｐｉｔｏｉｄ）」は、上記Ｌ１またはＬ２のような特定のリピトイドを言及しないかぎり、一般的にリピトイドおよびコレステロイドの両方を含むように使用され得る。
【００２７】
トランスフェクトする組成物を調製するために、ペプトイドの水溶液を調製し、リピトイドまたはコレステロイドは、実施例２Ａに記述されたようなオリゴヌクレオチドを用いて、処方された。組成物は、好ましくは、あらゆるＤＮＡの陰性電荷に対して少なくとも２、そして好ましくは２〜４の陽性のリピトイド電荷が存在するような相対量で使用される。リピトイドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの正確な比は、好ましくは、各々の細胞型に対して経験的に決定されるが、一般的に１．５〜２ｎｍｏｌリピトイド／μｇアンチセンスオリゴヌクレオチドの範囲で決定される。細胞は、上記および例２Ｂに記載されるようにトランスフェクトされ得る。
【００２８】
ヒト線維肉腫（ＨＴ１０８０）細胞へのＦＩＴＣ標識されたキメラオリゴヌクレオチドの送達の範囲を、蛍光分析を介して評価した。（後の研究において使用されたすべてのオリゴヌクレオチドは、表１に表された研究のために記載されるようなキメラヌクレオチドであった。）そのオリゴヌクレオチドの配列はＰＤＫ１（配列番号２５、配列番号２３の逆）のリバースコントロールであり、その結果細胞へのオリゴヌクレオチドの影響は、最小である。オリゴヌクレオチドは、（ａ）市販のトランスフェクション薬剤であるＥｆｆｅｃｔｅｎｅ^TM、（ｂ）ペプチトイド（ＮａｅＮｍＰｅＮｍｐｅ）₃（ペプトイド１）、（ｃ）オリゴ対リピトイドの電荷比が１：４のリピトイド１、（ｄ）電荷比が１：３でのリピトイド１との複合体生成を介してトランスフェクトされた。Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ^TMと比較して、リピトイド１は、トランスフェクトされた細胞の蛍光分析から証明されたように有意により高いトランスフェクション効率、およびより高い程度の核の送達を与えた。より高いリピトイド／オリゴ電荷比（１：４３ｃ）はまた、１：３の比よりもより有効なようである。
【００２９】
図３は、キメラアンチヌクレオチドのＡＫＴ１へのトランスフェクションに起因する、上記のように（ＡＫＴ１−ＡＳ）、コントロールオリゴヌクレオチドＡＫＴ１−ＲＣ（ＲＣ＝リバースコントロール；配列番号２６；配列番号１の逆）、ＡＫＴ−２−ＡＳおよびＡＫＴ２−ＲＣ（配列番号２７；配列番号２の逆）と比較して、ＨＴ１０８０細胞における内因性のＡＫＴ１ ｍＲＮＡの減少を示す。同じオリゴはまた、市販の脂質（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ^TM）およびペプトイド（（ＮａｅＮｍｐｅＮｍｐｅ）₃）によって送達された。図３に示した結果は、Ｌ１がトランスフェクトされたＡＫＴ１キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡレベルにおいても最も著しい低下を示す。
【００３０】
コレステロイドによるオリゴヌクレオチドの送達の有効性は、（非ステロイド）リピトイドの有効性と同様、または優位であるとわかった。例えば、図４に示されるように、コレステロイド１による上記のキメラアンチＡＫＴ１オリゴの送達は、結腸癌細胞株（Ｌｏｖｏ）におけるリピトイド１、またはリピトイド２の送達より、よりよいＡＫＴ１ ｍＲＮＡノックアウト達成した。
【００３１】
コレステロイドは、インビトロでの細胞への実質的に減少した毒性のさらなる利点を提供する。図５は、実施例３おいて記載されるように、５０〜３００ｎＭのオリゴヌクレオチドをトランスフェクションの後のＬｏｖｏ結腸癌細胞の４日間の増殖アッセイを示す。（また、非活性であると予想されるリバースコントロールＰＤＫ１キメラオリゴヌクレオチドを使用した。）これらのチャートは、リピトイド１および２（図５Ａ、Ｃ）を用いるトランスフェクションと比較して、コレステロイド２および３（図５Ｂ、Ｄ）を用いるオリゴヌクレオチドトランスフェクションの後のＬｏｖｏ細胞の増殖および生存度の有意な増加を実証する。この効果は、この細胞型において限定されず、そしてまた、Ｋｍ１２Ｌ４結腸癌細胞（図６）、およびＣｏｌｏ３２０ＤＭ結腸癌細胞（図７）の増殖アッセイにおいても観察された。
【００３２】
コレステロイドの減少した毒性についてさらに調査するするために、トランスフェクション（実施例４を参照のこと）に続き、以下の細胞のＦＡＣＳ分析を行い、ネクローシス細胞（ＰＩ＋）、初期のアポトーシス細胞（アネキシン＋）、後期アポトーシス細胞（アネキシン＋／ＰＩ＋）および健康な細胞（アネキシン−／ＰＩ−）の数を決定した。図８の白いカラムは、健康な細胞の数を反映し、一方、バーの色付けされた部分は（明瞭にするため短い線のセグメントによって区別される）死んだ細胞、または瀕死の細胞を表す。Ｋｍ１２Ｌ４（図８Ａ−Ｂ）およびＨＣＴ１１６細胞（図８Ｃ−Ｄ）においてその分析を行った。瀕死の細胞の割合をトランスフェクションの後、４時間（図８Ａ、Ｃ）または２４時間（図８Ｂ、Ｄ）について測定した。異なる細胞型は、異なるトランスフェクションに対する感受性を示したが、コレステロイドを用いてトランスフェクトされた細胞は、一貫して最も健康な細胞を含み、そして細胞死の最も低い程度を示した。このより低い毒性はまた、コレステロイドを市販の脂質である、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）およびＣｙｔｏｆｅｃｔｉｎ^TMと比較した際にも見られた。
【００３３】
（実施例）
以下の実施例は例示するが、いかなる方法においても、本発明の限定を意図しない。
【００３４】
（実施例１．キメラｐｏＲＮＡ−ｐｓＤＮＡ−ｐｏＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成）
キメラオリゴヌクレオチドを確立した製法に従って、固相合成を使用して、調製した。ＰｅｒＳｐｅｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）８９０９ ＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒおよびＡＢＩ ３９４ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡＢＩ／Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を、ＲＮＡの添加およびＤＮＡに連結したホスホロチオエートの添加のために、それぞれ使用した。８のアミダイト試薬瓶を有する唯一の機器を使用して合成を行うことも可能である。別の記載がないかぎり、すべての試薬調製および合成は、製造者の標準プロトコルを使用して行った。
【００３５】
５’−ＣＰＧ担体カラム、５’−Ｏ−メチル−ＲＮＡホスホルアミダイト、５’−Ｏ−メチル−ｄＴ−ＣＥホスホルアミダイト、および硫化試薬、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−ｏｎｅ−２，２−ジオキシドは、すべてＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）より入手した。
【００３６】
代表的な合成を行うために、望ましい配列の最後の７塩基を、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡホスホルアミダイトを供給した８９０９ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒに入れた。適切な５’−ＣＰＧカラムを取り付け、そして最終的にＤＭＴをオンにして、１μモルスケールのＲＮＡ合成を行った。
【００３７】
次いで、カラムを８９０９から取り出し、そしてＡＢＩ ３９４に取り付けた。硫化試薬は部分１５に取り付け（酸化剤を置換するために）、そしてオリゴのホスホロチオエートの中間部分のための合成を行った。合成は、最終的にＤＭＴをオンにして１μモル硫化プログラムを使用し行った。
【００３８】
次いで、カラムを取り出し、そして８９０９に交換した。最後の７の２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基を加え、ＤＭＴをオンにして１μモルＲＮＡプログラムを使用した。最終的にチェーンターミネーター、５’−Ｏ−メチル−ｄＴ−ＣＥ（シアノエチル）ホスホルアミダイトを加えた（カップリング時間を３００秒みまで延ばすように修正した１μモルＤＮＡプロトコルを使用した）。オリゴヌクレオチドを担体から切断し、脱保護して、そして標準的な方法を使用してゲル精製した。
【００３９】
（実施例２．標的ＲＮＡのアンチセンスインヒビター）
（Ａ、トランスフェクション混合物の調製）
各トランスフェクション混合物について担体分子（好ましくはリピトイド、またはコレステロイド）を０．５ｍＭ（水溶液）の実質的な濃度に調製し、超音波処理し均一な溶液を得、そして０．４５μｍのＰＶＤＦメンブレンを通じて濾過した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを１００μＭ（滅菌したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水）の実質的な濃度に調製した。
【００４０】
オリゴヌクレオチドをＯｐｔｉＭＥＭ^TM（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中で微小遠心管で、２μＭまで、または約２０μオリゴ／ｍｌＯｐｔｉＭＥＭ^TMまで希釈した。別個の微小遠心管において、リピトイドまたはコレステロイド（代表的な約１．５〜２ｎｍｏｌリピトイド／μｇのアンチセンスヌクレオチドの量で）を、オリゴヌクレオチドを希釈するのに使用したＯｐｔｉＭＥＭ^TMと同じ量に希釈した。希釈したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、すぐに希釈したリピトイドに加え、そして上下にピペッティングにより混合した。
【００４１】
（Ｂ．トランスフェクション）
トランスフェクションの前に、細胞を組織培養皿に１日プレートして、血清を有する増殖培地中で、６０−９０％のトランスフェクション密度を得た。オリゴヌクレオチド／リピトイド混合物を、混合後すぐに、細胞に、１００〜３００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度まで加えた。細胞をトランスフェクション混合物と共に、３７℃、５％ＣＯ₂、で４−２４時間培養した。培養後、トランスフェクション混合物を取り出し、そして血清を有する通常の増殖培地と交換した。
【００４２】
製造者のプロトコルに従って、ＲＮｅａｓｙ^TMｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を使用して、総ＲＮＡを抽出した。
【００４３】
（Ｃ．逆転写）
標的ｍＲＮＡのレベルを、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ^TMリアルタイムのＰＣＲマシンを使用して定量した。標的ｍＲＮＡの値は内部コントロール（例えば、βアクチン）に対して規準化した。
【００４４】
各２０μｌの反応について、抽出したＲＮＡ（一般的に合計０．２〜１μｇ）は滅菌した０．５ｍｌまたは１．５ｍｌの微小遠心分離管に入れ、そして総容量１２．５μｌまで水を加えた。各チューブに７．５μｌの緩衝液／酵素混合物を加えた。その混合物は、２．５μｌのＨ₂Ｏ、２．０μｌの１０Ｘ反応緩衝液、１０μｌのオリゴｄＴ（２０ｐｍｏｌ）、１．０μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ（各１０ｍＭ）、０．５μｌＲＮＡｓｉｎ（登録商標）（２０ｕ）（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）、および０．５μｌのＭＭＬＶ逆転写酵素（５０ｕ）（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，）を（列挙された順に）混合により調製した。内容物を上下にピペッティングすることにより混合し、そして反応混合物を４２℃で１時間培養した。各チューブの内容物は増幅の前に遠心した。
【００４５】
（Ｄ．ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ^TM増幅のＲＴ反応）
増幅混合物を以下の順で混合することにより調製した：１Ｘ ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、３ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１４０μＭの各ｄＮＴＰ、０．１７５ｐｍｏｌの各オリゴ、１：５０，０００に希釈されたＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、０．２５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１ユニットのＴａｑポリメラーゼ、そして２０μｌまでのＨ₂Ｏ。（ＰＣＲ緩衝液ＩＩはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）より１０Ｘ濃度で入手可能である。１Ｘ濃度中に、１０ｍＭＴｒｉｓ ｐＨ８．３および５０ｍＭ ＫＣｌを含む。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）は、二本鎖ＤＮＡに結合した際に、蛍光を発する色素である。二本鎖ＰＣＲ産物が増幅の間に生成する場合、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎに由来する蛍光は増加する。）
増幅混合物の各２０μｌのアリコートに、２μｌの鋳型ＲＴを加え、そして標準的なプロトコルに従って増幅を行った。
【００４６】
（実施例３．細胞増殖分析）
細胞を１ウェルあたり５０００細胞の密度の９６ウェルプレートに播種した。４日間の増殖分析について、５つの独立した９６ウェルプレートを各々の日に１つ調製した。一晩のインキュベーションの後、上記の手順を使用して細胞をトランスフェクトした。増殖アッセイにおける各々の日において、１つのプレートからすべての培地を除去し、そして−７０度で凍結した。４日目に、すべてのプレートをＱｕａｔｏｓ^TMアッセイキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて発色した。Ｑｕａｔｏｓ^TMアッセイキットは、ＤＮＡの量を決定し、従って、各ウェル中の細胞の数を決定する。
【００４７】
（実施例４．細胞毒性分析）
細胞を、３５０００細胞／ウェルおよび一晩付着させた３５ｍｍ皿に播種した。次いで、細胞にオリゴヌクレオチド／脂質処方物を用いて５０〜３００ｎＭでトランスフェクトし、そして４時間または２４時間培養した。細胞を１２時間後に収集した（これは、浮遊細胞を含む培地を含む）。次いで、生細胞をネクローシス細胞およびアポトーシス細胞を検出するために、プロピジウムヨウ素（ＰＩ）によって染色し、そしてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔの指示に従ってＦＩＴＣ結合Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ（これは初期のアポトーシス細胞および後期のアポトーシス細胞を検出する）を用いて対比染色した。次いで、細胞をＦＡＣＳ分析によって分析し、相対的なＰＩ＋の数、アネキシンＶ＋の数、ＰＩ＋ アネキシンＶ＋、およびＰＩ−／アネキシンＶ‐細胞の数を測定した。この結果を、パーセントとして表す（図８）。
本発明は、特定の方法および実施形態を参照して記載されたが、本発明から逸脱することなく種々の改変がなされ得ることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明の一つの実施形態に従う、キメラオリゴヌクレオチドの模式図を示す。
【図２】 図２は、本発明の組成物および方法においてオリゴヌクレオチドキャリア−として有用な、リン脂質ペプトイド結合体「リピトイド」、ならびにコレステロールペプトイド結合体（コレステロイド）の選択を示す。
【図３】 図３は、ＨＴ１０８０細胞へＥｆｆｅｃｔｅｎｅ^TM、リピトイド１、ならびにペプトイド１を介して送達される、ＡＫＴ１ならびにＥｆｆｅｃｔｅｎｅ^TMを介して送達されるコントロールオリゴ（ＡＫＴ２−Ａ、ＡＫＴ２−ＲＣ、およびＡＫＴ１−ＲＣ）に対するアンチセンスオリゴのＡＫＴ１ｍＲＮＡレベルに対する効果を示す。
【図４】 図４は、以下と組み合わせて、結腸癌細胞（Ｌｏｖｏ）へ送達されるＡＫＴ１に対するアンチセンスオリゴのＡＫＴ１ ｍＲＮＡレベルに対する効果を示す：リピトイド１、２つの異なる電荷比のリピトイド２（ＤＭＰＥ（ＮａｅＮｉａＮｉａ）₃）、二つの異なる電荷比のコレステロイド１（Ｃｈｏｌ−β−ａｌａ−（ＮａｅＮｍｐｅＮｍｐｅ）₃）、そして市販されているトランスフェクション剤であるＣｙｔｏｆｅｃｔｉｎ^TM。
【図５】 図５は、それぞれ、異なるリピトイドとコレステロイドキャリヤーと組み合わせて、本発明のキメラヌクレオチドを用いる、Ｌｏｖｏ、Ｋｍ１２Ｌ４ならびにＣｏｌｏ３２０ＤＭ結腸癌細胞のトランスフェクションの細胞増殖に対する効果を示す。
【図６】 図６は、それぞれ、異なるリピトイドとコレステロイドキャリヤーと組み合わせて、本発明のキメラヌクレオチドを用いる、Ｌｏｖｏ、Ｋｍ１２Ｌ４ならびにＣｏｌｏ３２０ＤＭ結腸癌細胞のトランスフェクションの細胞増殖に対する効果を示す。
【図７】 図７は、それぞれ、異なるリピトイドとコレステロイドキャリヤーと組み合わせて、本発明のキメラヌクレオチドを用いる、Ｌｏｖｏ、Ｋｍ１２Ｌ４ならびにＣｏｌｏ３２０ＤＭ結腸癌細胞のトランスフェクションの細胞増殖に対する効果を示す。
【図８】 図８は、以下と組み合わせて、Ｋｍ１２Ｌ４、およびにＨＣＴ−１６６細胞に対するオリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクトされたいくつかの細胞の生育能力アッセイの結果を示す：リピトイド１および２、コレステロイド１および３、ならびに、市販されているトランスフェクション試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、およびＣｙｔｏｆｅｃｔｉｎ^TMと共に、トランスフェクション（ここで白い領域は、健常な細胞のレベルを示す）。
【配列表】

Claims (21)

1. ＲＮＡｓｅ Ｈを活性化する能力を有する、式、５’−Ｗ−Ｘ^１−Ｙ−Ｘ^２−Ｚ−３’のキメラオリゴヌクレオチドであって、ここで、Ｗは、５’−Ｏ−アルキルヌクレオチドを表し；各Ｘ^１およびＸ^２は７〜１２のリン酸ジエステル結合した２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチドのブロックを表し；
   Ｙは５〜１２のホスホロチオエート結合したデオキシリボヌクレオチドのブロックを表し；
   およびＺは該オリゴヌクレオチドの３’末端に、ヌクレアーゼ活性をブロックするのに有効な、ブロッキング基を表す、キメラオリゴヌクレオチド。
2. 前記５’−Ｏ−アルキルヌクレオチドおよび２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチドのアルキル基が低級アルキル基である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
3. 前記２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチドのアルキル基がメチル基である、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
4. 前記５’−Ｏ−アルキルヌクレオチドが、５’−Ｏ−アルキルチミジンである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
5. 前記５’−Ｏ−アルキルヌクレオチドが、リン酸ジエステル結合、またはホスホロチオエート結合を介してＸ^１に連結される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
6. 前記基Ｚが、リン酸トリエステル結合、ホスホロチオエート結合、およびホスホルアミダイト結合からなる群から選択される結合を介してＸ^２に連結される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
7. 前記Ｚが、３−３’で連結したヌクレオチドである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
8. 前記セグメントＸ^１−Ｙ−Ｘ^２が、配列番号１〜２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
9. 被験体において標的遺伝子の発現を阻害するために有用な組成物であって、薬学的に受容可能なビヒクル中に請求項１に列挙されるようなキメラオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
10. 請求項９に記載の組成物であって、ここで、前記ビヒクルは以下の式：
    Ｌ−リンカー−［Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）ＣＨ_２（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｒ）ＣＨ_２（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｒ）ＣＨ_２（Ｃ＝Ｏ）］_３−ＮＨ_２
    脂質カチオン性ペプトイド結合体を含み、
    ここで、
    Ｌは約８と２４の間の長さの炭素原子の、少なくとも一つの脂肪族アルキル鎖または脂肪族アルケニル鎖、およびステロイドを含む脂質部分から選択され；基Ｒの各々は、独立して、アルキル、アミノアルキル、およびアラルキルから選択され、そして該リンカーは、直接結合、オリゴペプチド、２〜約３０結合の長さの実質的に直鎖のアルキル鎖、ならびにアルキル結合、およびエステル、アミド、カーボネート、カルバメート、ジスルフィド、ペプチド、およびエーテルからなる群から選択される一つ以上の連結からなる、２〜約３０結合の長さの実質的な直鎖、からなる群から選択される、組成物。
11. 前記リンカーが３〜約１５結合の長さである、請求項１０に記載の組成物。
12. 前記脂肪族アルキル鎖または脂肪族アルケニル鎖が約１４と２４との間の炭素原子の長さである、請求項１０に記載の組成物。
13. 前記Ｌが約８と２４との間の炭素原子の長さの２つの脂肪族アルキル鎖または脂肪族アルケニル鎖を有するリン脂質基である、請求項１０記載の組成物。
14. 前記Ｌがコレステロール基である、請求項１０記載の組成物。
15. 前記Ｒがイソプロピルまたは４−メトキシフェニルである、請求項１０記載の組成物。
16. 請求項１０記載の組成物であって、ここで前記脂質カチオン性ペプトイド結合体は、以下の式：
    Ｌ−（ＣＨ_２）_ｎ−（Ｃ＝Ｏ）−［Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）ＣＨ_２（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｒ）ＣＨ_２（Ｃ＝Ｏ）−Ｎ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｒ）ＣＨ_２（Ｃ＝Ｏ）］_３−ＮＨ_２
    であって、
    ここで、Ｌは、（ｉ）約８と２４との間の炭素原子の長さの脂肪族アルキル鎖、または脂肪族アルケニル鎖を有する、ホスファチジルエタノールアミノ基、および（ｉｉ）エステル結合、アミド結合、またはカルバメート結合によって隣接する−（ＣＨ_２）_ｎ−セグメントに連結されるコレステロール基から選択され；
    ｎは、１〜５であり、
    およびＲは、イソプロピル、そして４−メトキシフェニルから選択される、組成物。
17. 請求項１６記載の組成物であって、ここで、前記脂質カチオン性ペプトイド結合体は、以下：
    （ａ）リピトイド１、またはＤＭＰＥ（ＮａｅＮｍｐｅＮｍｐｅ） _３
    （ｂ）リピトイド２、ＤＭＰＥ（ＮａｅＮｉａＮｉａ） _３
    （ｃ）コレステロイド１、またはＣｈｏｌ−β−ａｌａ−（ＮａｅＮｍｐｅＮｍｐｅ） _３
    （ｄ）コレステロイド２、またはＣｈｏｌ−Ａｈｘ−（ＮａｅＮｍｐｅＮｍｐｅ） _３
    （ｅ）コレステロイド３、またはＣｈｏｌ−β−ａｌａ−（ＮａｅＮｉａＮｉａ） _３
    ；および
    （ｆ）コレステロイド４、またはＣｈｏｌ−Ａｈｘ−（ＮａｅＮｉａＮｉａ）_３
    として表される化合物からなる群から選択される、組成物。
18. 被験体において標的遺伝子の発現を阻害するための組成物であって、該組成物は、該遺伝子由来の選択された標的核酸配列の全てに、または一部に特異的にハイブリダイズするために有効である、請求項１に列挙されるようなキメラオリゴヌクレオチドの量および薬学的に受容可能なビヒクルを含む、組成物。
19. 前記標的核酸配列が、前記標的遺伝子由来のｍＲＮＡである、請求項１８記載の組成物。
20. 前記キメラオリゴヌクレオチドのセグメントＸ^１−Ｙ−Ｘ^２が、配列番号１〜２４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１９記載の組成物。
21. 前記ビヒクルが、請求項１１に列挙されるような脂質カチオン性ペプトイド結合体を含む、請求項１８記載の組成物。