JPH10512446A

JPH10512446A - 腫瘍細胞を処置するための組成物および方法

Info

Publication number: JPH10512446A
Application number: JP8521791A
Authority: JP
Inventors: モリソン，リチャード・エス; ツェン，ベン・ワイ; ブラウン，ボブ・ディ
Original assignee: ジンタ・インコーポレイテッド; モリソン，リチャード・エス
Priority date: 1995-01-10
Filing date: 1996-01-11
Publication date: 1998-12-02
Also published as: WO1996021471A1; AU4655296A; US5783683A; CA2209989A1; EP0871494A4; EP0871494A1

Abstract

(57)【要約】アンチセンス分子、その組成物、およびアンチセンスＲＮＡをコードするベクター、ならびに細胞の増加を抑制するためにアンチセンス分子、その組成物およびベクターを使用する方法。このアンチセンス分子はヒトの線維芽細胞増殖因子受容体遺伝子１（ＦＧＦＲ１）に対して実質的に相補的である。

Description

【発明の詳細な説明】腫瘍細胞を処置するための組成物および方法この出願は１９９５年１月１０日に出願された米国特許出願第０８／３７１００１号の一部継続出願であって、その内容を本明細書中に参考として引用する。本発明の背景１．本発明の分野この発明は腫瘍細胞数の増加（ｇｒｏｗｔｈ）を抑制するためのアンチセンス分子に、および腫瘍細胞の増加を抑制するためにこのアンチセンス分子を使用する方法に、関する。殊に、本発明はアンチセンスオリゴヌクレオチドの組成物および神経膠芽細胞腫細胞の増加を抑制する方法に関する。２．関連技術の記載本発明の背景を記載するためおよび実行に関する追加的詳細を提供するために本明細書中に参照した報告その他の資料は参考のために本明細書に引用するものである。便宜のために参考文献を番号によって参照して、後記の引用文献の欄にまとめて記載する。ヒトの初代中枢神経系腫瘍の大多数はグリア細胞由来新生物（グリオーマまたは神経膠芽細胞腫）である。これらの新生物の殆どは脳細胞の星状細胞系列から由来する。たとえば外科手術、放射線療法および化学療法のような類型的癌治療法はヒトの神経膠芽細胞腫に対して無効であるか、または神経膠芽細胞腫細胞に対して特異的ではない。その結果、神経膠芽細胞腫の多重形に罹患している患者の平均生存期間は約１４ケ月である。ヒト神経膠芽細胞腫の大多数（９０％）はたとえば通常に使用されるアルキル化剤のような慣例的化学療法剤に対して抵抗性である。さらにその上、これらの薬剤は癌細胞に特異的ではなく、増殖しつつあるいかなる細胞もその増加が阻害される。その結果、これらの薬剤は多数の副作用を有する。放射線療法にも同じ限界がある。現在ではヒトの神経膠芽細胞腫に対して有効な型の免疫療法または遺伝子治療は存在しない。星状細胞腫瘍の原因はいまだ不明確であるが、正常細胞の癌細胞への形質転換およびその悪性腫瘍への進行は生化学的レベルでは部分的に特性が解明されている。悪性組織の多くが細胞を刺激して分裂増殖させる蛋白質である塩基性線維芽細胞増殖因子（ＢＦＧＦ）を異常に多量に産生することが発見されている（１、２、３）。ＢＦＧＦの効果は線維芽細胞増殖因子受容体蛋白質（ＦＧＦＲ）との特異的結合を経て媒介されるものと信じられている。ＦＧＦＲは膜結合蛋白質である。高親和性ＦＧＦＲ５種をコードする構造的に関連した遺伝子４種が確認されている（４〜９）。ＦＧＦ蛋白質およびその受容体がヒトの神経膠腫細胞内に確認されている（１０）が、しかしながら、神経膠芽細胞腫細胞の増加および正常な組織への侵潤におけるそれらの役割は理解されていない。アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドはオンコジーン機能を排除する可能性のある特異的治療手段の一例である。これら単一鎖合成オリゴヌクレオチドは標的プレｍＲＮＡ（異種核ＲＮＡ−ｈｎＲＮＡ）または標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的なヌクレオシド塩基配列を有し、水素結合塩基対形成によりハイブリッド二本鎖を形成する。たとえばジエステル、ホスホロチオエート、またはホスホロジチオエートのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの形による標的ＲＮＡ二本鎖は二本鎖を形成した領域ではＲＮａｓｅＨによる分解の対象であると報告されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは分解的作用機構により、またはプレｍＲＮＡのプロセッシングまたはｍＲＮＡの翻訳に関わる酵素を立体的に遮断することにより、作用すると考えられている。オリゴマーとＲＮＡのこのハイブリッド形成は発現、すなわち標的ｍＲＮＡコードのその蛋白質への翻訳、を防止または妨害してその蛋白質産物の効果を妨げるかまたはその活性を防止すると考えられる。遺伝子が発現するｍＲＮＡ配列はセンス配列と命名されており、それに相補的な配列はアンチセンス配列と命名されている。１個のｍＲＮＡ分子は多数の蛋白質コピーを与えるので、一定の条件下には酵素の活性部位の阻害よりもｍＲＮＡの分解の方が効果的である。合成オリゴデオキシヌクレオチドがｃ−ｍｙｃ蛋白質の産生を阻害して試験管内でヒト白血球細胞の増加を休止させるとの報告がある（１１）。オリゴデオキシヌクレオチドがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）を含むレトロウイルスの特異的阻害剤であるとの報告もある（１２）。オリゴデオキシヌクレオチドを使用してｂＦＧＦの発現を抑制する試みおよび培養基内で形質転換ヒト星状細胞の増加を阻止する試みが行われた（１３、１４）。これらのオリゴヌクレオチドがその効果を発揮する作用機序は議論のあるところである。従って、ヒトにおける神経膠芽細胞腫多重形腫瘍を治療するかまたは少なくとも生存率および罹患率を改善する手段としてヒトの神経膠芽細胞腫腫瘍に特異的であって、ヒト神経膠芽細胞腫細胞の増加を抑制、阻止、防止または顕著に削減する療法をさらに開発する必要がある。発明の要約本発明は前記諸問題を解決してアンチセンス分子、アンチセンス分子の組成物および本発明の分子および組成物を提供する。これらの本発明の分子およびその組成物をヒトの神経膠芽細胞腫多重形を治療し、または少なくともその存在に関連する生存率および罹患率を改善する手段としてヒトの神経膠芽細胞腫細胞の増加を阻害し、防止し、または顕著に削減するために使用する方法を提供する。本発明は神経膠芽細胞腫細胞をＦＧＦＲ１α−プレｍＲＮＡに実質的に相補的なヌクレオシド配列を有するオリゴマーと接触させると、ＦＧＦＲ１βを含む全ての型のＦＧＦＲ１の出現が減少してその作用が阻害または減弱され、そのため神経膠芽細胞腫細胞の増加が抑制されるとの発見に基づくものである。好適な側面によれば本発明のオリゴマーはヒトのＦＧＦＲ１遺伝子が発現するＲＮＡの配列部分に結合し、殊に好適な側面によれば第一の免疫グロブリン様ドメインをコードするα−エクソンに結合する。ヒトＦＧＦＲ１遺伝子を発現する腫瘍細胞に接触すると本発明のオリゴマーは少なくとも１種のＦＧＦＲ１遺伝子産物の発現または活性を選択的に削減してその腫瘍細胞の増加を抑制する。本発明はさらにこれらのオリゴマーに加えて医薬的に許容される担体の組成物を包含する。本発明の一側面では神経膠腫細胞または神経膠芽細胞腫細胞の増殖を阻止または減少するかまたは細胞死の開始を促進するための組成物を提供する。この組成物はＦＧＦＲ１プレｍＲＮＡに実質的に相補的であってそれに結合するオリゴマーの有効量および医薬的に許容される担体とを含む。このオリゴマーは好ましくは約１０から約３０ヌクレオシド、より好ましくは約１２から約３０ヌクレオシドを有するものであって、約１５から２４ヌクレオシドを含むオリゴマーは特に好適である。好適なオリゴマーにはホスホロスロエートオリゴマーを含む。配列番号１および１５から１９までから選択したヌクレオシド塩基配列を有するオリゴマーは特に好適である。さらに別の側面によれば、本発明はＦＧＦＲ１プレｍＲＮＡに対して、さらに好ましくはＦＧＦＲ１プレｍＲＮＡのαエクソンに対して実質的に相補性であって、それに結合するオリゴマーを提供する。このオリゴマーは好ましくは約１０から約３０ヌクレオシド、さらに好ましくは約１２から約３０ヌクレオシド、を有する。約１５から約２４ヌクレオシドを有するオリゴマーは特に好適である。好適なオリゴマーはホスホロスロエートオリゴマーを包含する。配列番号１および１５から１９までから選択したヌクレオシド配列を有するオリゴマーは特に好適である。別の側面によれば、本発明はその他のＦＧＦＲ蛋白質の活性に実質的に影響することなくＦＧＦＲ１蛋白質の活性を選択的に阻止または防止する化合物の細胞増殖を阻止または減少するかまたは細胞死を増加するために有効な量をこれら細胞またはそれらの環境に接触することを含む神経膠腫細胞または神経膠芽細胞腫細胞の増殖を阻止または減少するかまたは細胞死を促進する方法に関する。ＦＧＦＲ１蛋白質の活性を阻止または防止するとは処理した細胞内にあるＦＧＦＲ１蛋白質のレベルを低下させることを含む。特に好適な側面によれば、これら化合物にはＦＧＦＲ１プレｍＲＮＡに実質的に相補的なオリゴマーを包含する。本発明のその他の特性はヒト腫瘍細胞に遺伝子移入するためのベクターを提供する。本発明のベクターは腫瘍細胞内にあるヒトＦＧＦＲ１遺伝子からの発現を減少し、少なくとも１種のＦＧＦＲ１遺伝子産物の発現を削減することによって腫瘍細胞の増加を抑制する性質を有するアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を包含する。本発明では腫瘍細胞の増加を抑制する方法も提供する。この方法は本発明アンチセンスオリゴマーおよびその組成物をＦＧＦＲ１を発現する腫瘍細胞に導入する段階を包含する。本発明の方法がアンチセンス分子を腫瘍細胞に導入する条件は腫瘍細胞内のＦＧＦＲ１遺伝子の発現を削減し、腫瘍細胞の増加を抑制するために十分なものである。本発明の前記およびその他多数の特性および付随する優越性は添付図面とともに本発明に関する下記の詳細な記載を参照すればよく理解されるはずである。図面の簡単な説明図１は試験管内における神経膠芽細胞腫細胞増加に対するアンチセンスオリゴマーおよび対照オリゴマーの効果を示す。図２はＦＧＦＲ１αアンチセンスオリゴマーおよび逆対照オリゴマーの用量− 反応曲線（細胞数対オリゴマー濃度）を示す。図３は神経膠芽細胞腫細胞の増殖に対してアンチセンスオリゴマーおよび対照オリゴマーを用いる多重処理の効果が表示されている時間的経過を示す。白四角は非処理対照の細胞数／ウェルを示す。黒丸はＦＧＦＲ１ＡＳα（配列番号１）３日処理での細胞数／ウェルである。白丸はＦＧＦＲ１ＡＳα（配列番号１）５日処理での細胞数／ウェルを描く。白三角はＦＧＦＲ１ＡＳｃｏｎｔ（配列番号１０）（逆方向アンチセンスオリゴヌクレオチド）３日処理での細胞数／ウェルを描く。黒三角はＦＧＦＲ１ＡＳｃｏｎｔ（配列番号１０）５日処理での細胞数／ウェルを描く。図４はアンチセンスオリゴマーおよび対照オリゴマー処理神経膠芽細胞腫細胞におけるＦＧＦＲ１発現のＲＴ−ＰＣＲサザンブロット分析である。Ａ図は非処理対照細胞を描く。Ｂ図はＦＧＦＲ１アンチセンスαオリゴマー（配列番号１）処理細胞を描く。Ｃ図はＦＧＦＲ１アンチセンスｃｏｎｔオリゴマー（逆方向）（配列番号１０）処理細胞を描く。図５はＦＧＦＲ２ｍＲＮＡの発現のＲＴ−ＰＣＲサザンブロット分析である。図５はオリゴマーなし、ＦＧＦＲ１ＡＳαオリゴマー［配列番号１］およびＦＧＦＲ２アンチセンスオリゴマー［配列番号１２］で処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞での結果を描く。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞はＦＧＦＲ２を発現する。図６はＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫増加についてＦＧＦＲ２アンチセンス開始オリゴマーの増加を阻止する作用を示す。ＳＹＳＹ細胞はＦＧＦＲ２を発現する。図７はＦＧＦＲ１αアンチセンス［配列番号１］および対照［配列番号１０］処理神経膠芽細胞腫細胞のｂＦＧＦウエスタンブロット分析であって、ｂＦＧＦレベルに関するこれらオリゴマーの効果を示す。図８は試験管内におけるＴ９８ヒト神経膠芽細胞腫細胞の増加に対するＦＧＦＲ１アンチセンスオリゴマーの効果を示す。細胞数は１日目（白柱）および７日目（ハッチ柱）に測定した。ＮＴは非処理対照を示す。図９はＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４のＲＴ−ＰＣＲサザンブロット分析を示し、Ｒ対照オリゴマー（Ｒ１αＲＣ）（配列番号１０）および非処理対照と比較してＦＧＦＲ１αアンチセンス分子（ＲＩＡＳα）（配列番号１）処理後の神経膠芽細胞腫細胞におけるＦＧＦＲ１ｍＲＮＡの選択的還元を示す。ＧＡＰＤＨを一般的対照として使用した。本発明の詳細な記載本発明は神経膠芽細胞腫細胞の増加を阻止するためのアンチセンスオリゴマーおよびそれらの組成物を提供する。本発明はまた本発明のアンチセンスオリゴマーをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。本発明はまたヒトの神経膠芽細胞腫細胞に本発明のアンチセンスオリゴマーを導入する段階を含むヒトにおける神経膠芽細胞腫の増殖を阻止する方法が含まれる。定義本明細書中に使用する用語「アンチセンスオリゴマー」はアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそれらの類似体を意味し、ポリヌクレオチド標的配列または配列部分を標的配列のヌクレオチド塩基との水素結合相互作用によって認識するヌクレオチド塩基配列範囲を有する範囲の化学種を示す。標的配列は単鎖または二重鎖ＲＮＡ、または単鎖または二重鎖ＤＮＡであることもある。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそれらの類似体はＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮＡの類似体でありうるが、通常はアンチセンスオリゴマーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを示す。このようなＲＮＡまたはＤＮＡ類似体はこれに限定するものではないが２’−Ｏ−アルキル糖修飾体、ならびにメチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホルムアセタール、３’−チオホルムアセタール、スルホン、スルファメート、およびニトロキシド骨格修飾体、アミドおよび塩基部分が修飾された類似体を包含する。これに加えてオリゴマーの類似体は糖部分がその他の適当な基で修飾または置換されたポリマーであって、これにはこれに限定するものではないが、モルホリノ類似体およびペプチド核酸（ＰＮＡ）類似体（５１）を含む。このような類似体には前記修飾の種々の組合せを含み、標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ媒介分解、結合親和性、ヌクレアーゼ抵抗性および／または標的特異性を改善する目的のためのリンケージ基および／または糖または塩基の構造修飾を含む。アンチセンス類似体はいずれのオリゴヌクレオチド類似体型のまたは在来のＤＮＡまたはＲＮＡとの混合物でもありうる。同時に、オリゴヌクレオチドおよびその類似体は単独でまたは別のオリゴヌレオチドまたはその類似体１種またはそれ以上との組合せにおいて使用することもある。このオリゴヌクレオチドの長さは約１０から約１００ヌクレオチドであることもある。本発明には１０から３０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドも有用であるが、好適なオリゴヌクレオチドの長さは約１５塩基から約２４塩基までの範囲内にある。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびその類似体はまたオリゴヌクレオチドおよびその類似体の複合体を含む（１６）。これらの複合体はオリゴヌクレオチドの取込、薬動力学およびヌクレアーゼ耐性、またはオリゴヌクレオチドによる標的配列との交差結合または切断を強化する性能を改善する性質を有する。本明細書中に使用する用語「細胞増殖」は細胞分裂を示す。用語「増加（ｇｒｏｗｔｈ）」または「細胞増加」は本明細書では加速された細胞分裂および減速された細胞死、すなわちアポトーシスおよび壊死、の結果としての細胞数の増加（細胞増殖の増加）も包含する。非制御細胞増殖は癌性細胞または異常細胞型のマーカーである。正常な非癌性細胞はその細胞に特有の型に特徴的な頻度で規則的に分裂する。ある細胞が癌性の段階にまで形質転換されると、細胞は非制御的に分裂し、増殖する。増殖または増加の阻止はその細胞の非制御分裂を変調する。本明細書の「アンチセンス療法」は一般的用語であって、試験管内または生体内で特異的に結合するオリゴマーを用いて望ましくないＤＮＡまたはＲＮＡ配列を三重鎖またはアンチセンス手法によって不活化することを含む。ここで使用するＦＧＦＲ１αエクソンは［配列番号１４］に示すＦＧＦＲ１α エクソンの完全なヌクレオチド配列またはＦＧＦＲ１αエクソンの部分配列のいずれかを示す。ＦＧＦＲ１αエクソンを含む部分配列は本明細書ではＦＧＦＲ１ αエクソンの少なくとも一部を示す。ＦＧＦＲ遺伝子の発現本明細書で使用する「ＦＧＦＲ遺伝子の発現」はヒトのＦＧＦＲ遺伝子からのＲＮＡの発現またはヒトのＦＧＦＲ遺伝子からのＦＧＦＲ蛋白質の産生を示す。高親和性ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）をコードする構造的に関連する遺伝子４種が確認されている（４〜８）。高親和性結合部位に加えて、細胞は細胞関連または細胞外ヘパラン硫酸プロテオグリカンのどちらかである（１８、１９）と特性が解析されている低親和性ＦＧＦ結合部位も示す（１７）。低親和性のグリコサミノグリカン部位への結合は高親和性受容体へのＦＧＦ結合に対しまた生物学的活性に対し必須であると思われる（２０、２１）。硫酸ヘパランの生合成が欠失する細胞はｂＦＧＦへの結合または反応をすることができない。しかしながら、遊離ヘパランまたは硫酸ヘパランのいずれかの添加はｂＦＧＦの高親和性結合を再生する（２０）。これらの結果はヘパリン様、低親和性部位がｂＦＧＦ活性の調節およびｂＦＧＦに対する細胞の反応に重要な役割を果たしていることを証明する。ＦＧＦＲ遺伝子の構造ＦＧＦＲ族の構成員に共通の構造的特徴はシグナルペプチド、細胞外ドメインにある２個または３個の免疫グロブリン様ループ、疎水性膜貫通ドメイン、および短いキナーゼ挿入配列で隔てられた高度に保存されたチロジンキナーゼドメインを包含する（２２）。総合するとこの４種のＦＧＦＲ遺伝子がコードする蛋白質は驚異的に類似している。最も近似的な関連のある蛋白質はＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２（アミノ酸同一性７２％）であるが、一方ではＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ４は類似性が最も低い（同一性５５％）。ＦＧＦＲは各々が相異なる数種の型のＦＧＦに結合できる。しかしながら、ＦＧＦ受容体の細胞および組織に特異的な発現および種々のＦＧＦ族構成員の反応性についていくつかの報告がされている（２３、２４、２５）。異なるＦＧＦ族構成員に対してこの選択的反応性を発生する機構の一つはＲＮＡの相異なるスプライシングによってリガンド結合特異性または親和性の変化する単一な遺伝子から数種の受容体アイソフォームが産生されるものであろう。ＦＧＦＲの構造的変種ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３の構造的変種は実際ＲＮＡ転写体の相異なるスプライシングによって発生する（２２）。この過程によって発生する相異なる受容体は様々なリガンド結合特異性および親和性を表す（２２）。ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２の第三免疫グロブリン様ジスルフィドループの後半に含まれる共通構造の変化の一つはこれら受容体のリガンド結合性を劇的に変化させる（２６）。その他のスプライシングによる変種では細胞外領域にＩｇ様ドメインを２個かまたは３個かのどちらかを含むＦＧＦＲを与える（５、２７、２８）。第一および第三Ｉｇ様ドメインの双方を含む相異なるＲＮＡスプライシングは組織の成長および分化の間に起きるＦＧＦ要求性の変化を反映する細胞および組織に特異的なプロセッシングの対象である（５、２４）。ＦＧＦＲは異なる組織型および異なる発育の期間に特異的に発現すると思われる。ＦＧＦＲの分布を検査した研究は原理的にノーザンブロッティング、ＲＮａｓｅ保護検定法、および原位置ハイブリッド形成に依存しており、ｍＲＮＡ転写物の存在を証明している。一般にＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２は広範に分布していると思われるが、一方ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４はいくらか限定された分布パターンを示す。例えば、発育中の胚ＦＧＦＲ１転写体は中枢神経系内および間葉では優越している。ＦＧＦＲ２転写体は中枢神経系および上皮でも観察される（２５）。ＦＧＦＲ３転写体は中枢神経系内および発育している骨の軟骨原基で優越的に発現している。中枢神経系である程度の発現がある他のＦＧＦＲとは対照的に、ＦＧＦＲ４転写体は発育中の内皮、中胚葉節の筋節区画、および筋節由来骨格筋で観察される。異なるＦＧＦＲ族構成員が示す発現の独特な時間的・空間的パターンはそれらが組織の発育、維持および病理学に明確であるが、まだ知られていない役割を演じていることを強く示唆する。ＦＧＦＲの発現および形質転換ある型のヒトの癌では、ＦＧＦＲ族構成員が増幅される（３１）。最近の報告はヒトの正常組織が悪性腫瘍へと進行をする過程の間に見られるＦＧＦＲ発現の変化を証明した（３２、２２）。これらの報告はヒトの神経膠芽細胞腫においてＦＧＦＲの特異的発現および相異なるスプライシングが正常細胞の形質転換においておよび星状細胞腫瘍の悪性腫瘍への進行において役割を果たすことを証明している。正常な星状細胞はＦＧＦＲ２受容体を発現するがＦＧＦＲ１受容体は発現しない。形質転換の最初期段階で星状細胞はＦＧＦＲ１の発現を開始する。また、形質転換の最初期段階で、ＦＧＦＲ１はαおよびβ−アイソフォームの両方で発現されるが、一般にα型が優越している。星状細胞腫瘍がさらに悪性な段階に進行すると最後には神経膠芽細胞腫多型に到って、ＦＧＦＲ１の発現はα型から殆ど排他的にβ型に移行する。ＦＧＦＲ１のβ型への移行に加えて細胞はＦＧＦＲ２の発現を停止する。好適なアンチセンスオリゴマー本発明はＦＧＦＲ１プレｍＲＮＡの少なくとも一部、より好ましくはＦＧＦＲ１プレｍＲＮＡのαエクソン、またはＲＮＡに結合し、実質的に相補的なアンチセンスオリゴマーは全てのＦＧＦＲ１アイソフォームの発現を阻止または減少して神経膠芽細胞腫細胞の増加を抑制したとの発見に基づく。殊に、本発明により本発明のアンチセンスオリゴマーを神経膠芽細胞腫腫瘍細胞に導入すると、腫瘍細胞の増加が抑制されること、およびこれらのアンチセンス分子の適用によってＦＧＦＲ１ｍＲＮＡが選択的に抑制されること、ならびにＦＧＦＲ１α蛋白質の発現を抑制すること、およびさらにＦＧＦＲ１の主たる別種スプライシング型であるＦＧＦＲ１βが抑制されること、が証明された。本発明の一側面によってα−エクソンに相補的なＦＧＦＲ１アンチセンスオリゴマーが細胞増殖の削減およびＦＧＦＲ１ｍＲＮＡ発現の削減に有効であることが証明された。本発明は主たるプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ転写体がＦＧＦＲ１蛋白質のβ−アイソフォームをコードする神経膠芽細胞腫細胞を抑制するためにＦＧＦＲ１プレｍＲＮＡ、より好ましくはα−エクソンのプレｍＲＮＡ、の少なくとも一部に実質的に相補的でそれに結合するアンチセンスオリゴマーを利用する。けれども、翻訳開始部位に指向するアンチセンスオリゴマーは神経膠芽細胞腫細胞の増加を抑制するのに有効であるけれども、ＦＧＦＲ１−α−エクソン特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは神経膠芽細胞腫細胞の増加を抑制するのにＦＧＦＲ１β−エクソンに相補的なオリゴヌクレオチドまたは開始部位に相補的なオリゴヌクレオチドよりも有効であることが判明した。本発明での使用のために適当なアンチセンスオリゴマーには長さが好ましくは約１０から約３０塩基、より好ましくは１２から約３０塩基、最も好ましくは１５から２４塩基であるものを含む。このオリゴヌクレオチドは好ましくはＦＧＦＲ１α−エクソンまたは翻訳開始部位の少なくとも一部に実質的に相補的なオリゴヌクレオチドから選択する。本明細書で用いる「実質的に相補的」とはヒトのＦＧＦＲ１αエクソンのプレｍＲＮＡ配列の少なくとも一部に相補的であって、それに特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドに約８０％相同的なアンチセンスオリゴマーを意味する。作用の機構によって拘束されることを望むのではないが、プレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡをたとえばα−エクソンまたは翻訳開始部位のような部分で分解することは機能的転写体の形成を防止して蛋白質の形成を遮断するものと信じられる。本発明で使用するに適当なアンチセンスオリゴマーにはＦＧＦＲ１ｍＲＮＡに存在する標的配列またはα−エクソン部位または翻訳開始部位に結合する配列部分を指向し、実質的に相補的なオリゴヌクレオチドも包含することがあることを認識すべきである。好ましくは、結合配列部分の長さは約２から約２０塩基である。また、他種遺伝子からのプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡコード鎖に対するアンチセンスオリゴマーの相同性を削減するためにそのアンチセンスオリゴマーが他種の遺伝子にあるプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに共通に存在することのないプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの配列部分に対して実質的に相補的であることは好ましい。本発明の特に好適な側面は下記の配列［配列番号１および１５から１９まで］の一つを含むアンチセンスまたは相補的オリゴマーを含む。５’−ＣＴＧＣＡＣＡＴＣＧＴＣＣＣＧＣＡＧＣＣ−３’［配列番号１］５’−ＧＣＡＣＡＴＣＧＴＣＣＣＧＣＡＧＣＣ−３’［配列番号１５］５’−ＡＣＡＴＣＧＴＣＣＣＧＣＡＧＣＣ−３’［配列番号１６］５’−ＣＧＴＣＣＣＧＣＡＧＣＣ−３’［配列番号１７］５’−ＧＣＡＣＡＴＣＧＴＣＣＣＧＣＡＧＣＣＧＡ−３’［配列番号１８］５’−ＣＴＧＣＡＣＡＴＣＧＴＣＣＣＧＣ−３’［配列番号１９］好適なアンチセンスオリゴマーにはホスホロチオエートオリゴマーを含む。われわれは全てのホスホロチオエートオリゴマー、特に配列番号１および配列番号１５から１９までから選択した配列を有するもの、が特に好適であることを発見した。殊に好適なものは配列番号１および１８のオリゴマーである。われわれは合成ロットの異なるホスホロチオエートオリゴマー全てが腫瘍細胞の増加を削減する活性が異なることを発見した。従って、細胞または腫瘍を処置するための高活性ロットを選択するためにそれらオリゴマーロットを活性について適当なスクリーニング検定法を使用して高い活性を有するロットを選択するためのプレスクリーニングにかけることが望ましい。オリゴマー活性を検索するために適当なスクリーニング検定法は実施例９に記載する。下記の実施例に記載するように、配列番号１のアンチセンスオリゴマーは配列番号１４に示すＦＧＦＲ１遺伝子のヌクレオチド番号２８４から３０３までに対して実質的に相補的である。このＦＧＦＲ１α−エクソンの長さは２６７ヌクレオチドであって配列番号１４のヌクレオチド番号２１０から４６７まで伸びている。これらのアンチセンスオリゴマーはＦＧＦＲ１遺伝子産物（プレｍＲＮＡおよびＦＧＦＲ蛋白質）を発現する腫瘍細胞と接触させると少なくともＦＧＦＲ１遺伝子産物の発現を削減し、これら細胞の増加を阻止する。この発明が属する技術分野の当業者は、多少にかかわらず置換ヌクレオチドを有するアンチセンスオリゴマー、または３’または５’方向に沿ってＦＧＦＲ１プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡが好適な態様よりもさらに伸長するもの、または標的ＦＧＦＲ１α−エクソンの少なくとも一部に実質的に相補的でそれに特異的に結合するが細胞増殖を阻害する配列を含むものもまた本発明の範囲内に包含されることを認識するものである。用語「オリゴマー」または「オリゴヌクレオシド」はヌクレオシド間結合によって結合するヌクレオシドの鎖であって、一般的には長さが約４から約１００ヌクレオシドであるが、その長さは約１００ヌクレオシドよりも大きいこともあるものを示す。それらは通常ヌクレオシドモノマーから合成されるが、酵素的手段によって取得されることもある。そこで、用語「オリゴマー」はヌクレオシドモノマーを結合しているヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオシドの鎖を示し、そこでデオキシ−およびリボ−オリゴヌクレオチド、非イオン性オリゴヌクレオシドアルキル−およびアリールホスホネート類似体、アルキル−およびアリールホスホノチオエート、オリゴヌクレオチドのホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート類似体、オリゴヌクレオチドのホスホルアミデート類似体、たとえばホスホトリエステルおよびその他のオリゴヌクレオシド類似体のような中性ホスフェートエステルオリゴヌクレオシド類似体、および修飾オリゴヌクレオシド、およびヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマーを含む。この用語はまた単量体単位の間に燐基結合の１個またはそれ以上が、たとえばホルムアセタール結合、チオホルムアセタール結合、モルホリノ結合、スルファメート結合、シリル結合、カルバメート結合、アミド結合、グアニジン結合、ニトロキシド結合または置換ヒドラジン結合のような非燐結合によって置換されているヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマーも含む。これらの類似体はＤＮＡおよびＲＮＡ標的との結合親和性を変化させるためにさらに修飾して、２’−Ｏ−アルキル置換を含ませることもある。これには、たとえばモルホリノ塩基類似体またはポリアミド塩基類似体のように糖および燐酸部分の両方が置換または修飾されているヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマーも含む。またこれには塩基、糖、および非ヌクレオシド燐酸骨格が非ヌクレオシド部分によって置換されるか、または非ヌクレオシド部分がヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマーに挿入され、要すればその非ヌクレオシド部分が標的配列との相互作用するか標的細胞への取り込みを変化させるためのその他低分子を結合する役目を担っているヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマーも含む。本発明の実行に当たっては「在来型」または非修飾オリゴデオキシヌクレオチドよりも化学的に修飾した誘導体（すなわち誘導オリゴマー）または化学的に修飾したアンチセンスオリゴマーの類似体を使用することは好ましい。「在来型」オリゴデオキシヌクレオチドはＤＮＡ合成機で標準的ホスホロアミダイト化学を使用して便利に合成できる。適当な誘導体およびその誘導体の製造方法は（１）例えばメチルホスホネート（３５）、アルファデオキシヌクレオチド（３６）、および２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシド（３７）などヌクレアーゼに対するオリゴマーの抵抗性増大、（２）たとえばアクリジン（３８）のような例えば共有結合誘導体などの標的に対するオリゴマーの親和性の増大、および（３）たとえばＦｅエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびその類似体（４３）、５−グリシルアミド−１，１０−ｏ−フェナントロリン（４４）およびジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）誘導体（４５）など切断比率の増大、の変更を含む。その他の誘導体にはこれに限定するものではないが、ホスホロチオエートおよびジチオエート（３４）、アルキル化オリゴマー（たとえばＮ−２−クロロエチルアミンなど）（３９、４０）、フェナジン（４１）、５−メチル−Ｎ⁴，Ｎ⁴−エタノシトジン（４２）および前記修飾および誘導体を含む種々のキメラオリゴヌクレオシドを包含する。前記文献はここに参考のためにその全体を特に引用するものである。本発明の類似体には標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ−介在分解、結合親和性、ヌクレアーゼ抵抗性および／または標的特異性を改善する目的のための結合基および／または糖または塩基の構造的修飾を含む前記修飾体の組合せも含む。そこで、本発明は混合ヌクレオシド間結合、特に単一な非ホスホン酸ヌクレオシド間結合に散在するキラル純なまたは豊富化したホスホネートヌクレオシド間結合を有するセグメント１個またはそれ以上を有する合成オリゴマー、およびそれらの製法を提供することが判明するであろう。そのヌクレオシド間ホスホネート結合には１〜３炭素原子を有する低級アルキルホスホネートヌクレオシド間結合および１〜３炭素原子を有する低級アルキルホスホノチオエート（アルキルチオホスホネート）ヌクレオシド間結合を含む。これら混合オリゴマーセグメントは、好ましくは非ホスホネート結合対ホスホネート結合を１対約１から１対約４の比率で単一の非ホスホネートヌクレオシド間結合の間に散在するホスホネートヌクレオシド間結合を有する。好適な側面によれば、そのようなオリゴマーは非ホスホネートヌクレオシド間結合で交替するキラル純ホスホネートヌクレオシド間結合を有する。特に非ＲＮｓｅＨ活性化領域の１個またはそれ以上にこのようなセグメントを含むオリゴマーは一本鎖ＲＮＡ標的配列の発現または翻訳を防止または阻害するために使用されることがありうる。キメラ体オリゴヌクレオシドはハイブリッドを形成すべきＲＮＡ標的配列に十分に相補的なＲＨａｓｅＨ活性化および非ＲＨａｓｅＨ活性化領域を含む全ヌクレオシド塩基配列を有する。好適なキラル純粋ホスホネート結合にはＲ_p低級アルキルホスホネート結合があり、Ｒ_pメチルホスホネートヌクレオシド間結合はさらに好適である。好適な非ホスホネート結合にはホスホジエステル、ホスホチオエート、およびホスホロジチオエートを包含する。特に好適な側面によれば、この化合物の非ＲＮａｓｅＨ活性化領域におけるホスホジエステル結合で異なるキラル的に純粋なＲ_p−メチルホスホネート結合を有するＲ_p−豊富化オリゴマーが提供される。これらの交替するオリゴマーはＲＮＡ標的配列に対する結合親和性の強化が示され、またヌクレアーゼ抵抗性および特異性が増加されることが発見されている。本発明は同様にして好ましくはホスホジエステルであるか、そうでなければホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート結合である非ホスホネート性ヌクルオシド間結合の間に散在するＲ_p配置について強化されたメチルホスホネートヌクレオシド間結合を有するセグメント１個またはそれ以上を含む遺伝子発現へのアンチセンス阻害剤として強化された力価を有するキメラ性アンチセンスオリゴマーも包含する。あらかじめ決定したヌクレオシド単位の塩基配列を有し、ホスホネート結合が単一な非ホスホネート結合の間に散在する非ホスホネート結合と混合してキラル純なホスホネートヌクレオシド間結合を有する本発明のキメラオリゴマーまたはそのセグメントは予め選択したヌクレオシド塩基配列を有し、キラル純のまたはラセミのホスホネートまたはその他のヌクレオシド間結合を有する各ヌクレオシド二量体、三量体または四量体を相互に結合することによって製造してもよい。選択されたキラル性メチルホスホネートおよびその他の一量体、二量体、三量体、その他は非排他的であるが次のヌクレオシド間結合型に到る種々の異なる方法によって互いに結合できる：ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、ホスホロフルオリデート、ボラノホスフェート、ホルムアセタール、およびシリル。有用性および投与誘導オリゴマーは核酸中の標的部位に結合し、次に交差結合（プソラレン）または切断（ＥＤＴＡ）によって不可逆的に修飾するために使用しうる。切断する標的部位の注意深い選択によって、鎖の一つを選択した核酸配列を特異的に切断する分子鋏として使用しうる。本明細書が提供するオリゴマーは核酸セグメントまたはその標的配列と反応させて核酸に不可逆的な修飾、分解、または破壊を起こさせてその機能を不可逆的に阻害できる基と反応するか修飾する核酸に導入することによって誘導体にできる。発現の選択的な不活性化または阻害または変更をさせるため、生きている細胞の中の特定の遺伝子またはその標的配列の発現を不活性化または阻止または変化させるためにこれらのオリゴマーを使用しうる。この標的配列は、たとえばプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡのようなＲＮＡであってもよい。ｍＲＮＡ標的配列には開始コドン領域、コード領域、ポリアデニル化領域、ｍＲＮＡキャップ部位またはスプライス結合部位を包含する。ここに提供するオリゴマーは二本鎖または三重ラセン複合体または核酸の転写領域とのその他の安定な会合の型を形成してもよく、これらの複合体はアンチセンス療法で有用である。多数の疾患その他の病状は望ましくないＤＮＡまたはＲＮＡの存在に帰結されており、これらはある場合には単一鎖であり、他の場合には二重鎖である。これらの疾患および病状は当技術分野で一般的に理解されているようなアンチセンス療法の原理を使用して処置できる。アンチセンス療法には相補性またはその他のいずれかの特異的結合手段により、特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列を標的とすること、すなわち本発明の場合には二本鎖または三本鎖ラセン複合体を形成することを含む。本発明の一側面によれば、これらのアンチセンスオリゴマーは選択した標的遺伝子から転写したＲＮＡの部分に相補的な配列を有する。阻害の精密な分子的機構については最終的な結論は出てはいないが、形成した二本鎖がｍＲＮＡ配列の翻訳、プロセッシングまたは輸送を阻害していることもありうる。本発明の別の側面によれば、選択したＲＮＡ標的配列の発現または翻訳の妨害または防止はＲＮＡ標的配列に相補的なオリゴマーが三重ラセン複合体を形成するように選択した配列を有する三本鎖オリゴマー対として使用する三重ラセン形成によって達成されて標的核酸配列の発現を妨害または防止する。このような三重鎖形成は数種ある方法のどれかで行うことができる。基本的には２種の別々のまたは結合したオリゴマーが単鎖ＲＮＡで三重鎖を形成しうる。従って本発明のアンチセンスオリゴマー（三本鎖オリゴマー対を含む）は標的ＦＧＦＲ１遺伝子のダウンレギュレーションを達成するための三重ラセン複合体の形成によって腫瘍細胞の増加を抑制してヒトＦＧＦＲ１遺伝子と機能的に等価な二重鎖または単鎖核酸の標的配列発現を防止または妨害する点で用途がある。一般的問題として、採用するオリゴマーは標的核酸の配列に相補的である配列を有することになる。しかしながら、絶対的な相補性は必要ではなく、一般には標的核酸と安定な二本鎖（または場合によっては３重ラセン複合体）を形成するために充分な相補性を有するいかなるオリゴマーも適当であると思われる。安定な二本鎖形成はハイブリッド形成オリゴマーの配列と長さおよびアンチセンスオリゴマーと標的配列との間の相補性の程度に依存するので、より長いオリゴマーを使用する時には低い適合度（相補性）に耐えることができる。この点は三本鎖ラセン複合体を形成するオリゴマーについても成立する。しかしながら、長さが約８から約４０ヌクレオシド単位のオリゴマーも二本鎖または三重ラセン構造を形成するに充分な相補性を有し、生理学的条件下に約４０℃より高い融解点を有するものは本発明の方法による使用について特に適当である。本発明で使用するオリゴマーは単独に投与することがあり、また隣接標的または遠距離標的またはアンチセンス機構と前記一般機構との複合効果を目的としてオリゴマーの組合せを投与することがある。治療的投与においては経口投与、局所または局部投与を含む広範な投与形態のためにこのオリゴマーを製剤化できる。その製造段階またはその製剤をある程度酸性にする時に酸性条件と接触することがある投与部位で奏効する条件に少しでも適合させるためにその医薬的製剤に酸抵抗性オリゴマーを含有させることは有益である。技術および製剤は一般的にはレミントンの医薬品科学、Ｍａｃｋ・Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、イーストン、ＰＡの最近版に記載がある。活性成分オリゴマーは一般に投与形態および用量型の性質に依存して、たとえば添加剤または希釈剤のような担体と混合するが、これには用量剤型と投与形態の性質に依存して充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、侵食性ポリマーまたは潤滑剤が含まれる。典型的用量型は錠剤、粉末剤、懸濁剤、乳濁剤および溶液剤を含む液剤、顆粒剤およびカプセル剤を包含する。本発明のある種のオリゴマーには経口投与に殊に適するものもあるが、これではその薬剤が胃内で通常の医薬放出条件では約４時間まで、持続放出剤型の放出条件では約１２時間までの酸性条件に接触する必要がある。ある病状の処置にはこれらオリゴマーを持続放出剤型に製剤化することが有益なことがある。ここに参考のためにその内容を引用するＣｏｌｏｍｂｏへの米国特許第４８３９１７７号およびＣｏｎｔｅへの米国特許第５４２２１２３号はある種の好適な速度制御放出系を記載している。経口投与のためにはこれらオリゴマーは好ましくは２’ −Ｏ−アルキル、中でも２’−Ｏ−メチル、ヌクレオシジル単位を有し、これらのオリゴマーを、たとえばカプセル剤、錠剤および液剤のような通常のならびに遅延放出経口投与型に製剤している。本発明オリゴマーの全身投与は経粘膜または経皮方法によって達成でき、またこれら化合物は経口投与できる。経粘膜または経皮投与のためには浸透すべき障壁に適する浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は当技術分野では一般的に知られており、例えば経粘膜投与に用いる胆汁塩およびフシジン酸誘導体などを含む。これに加えて界面活性剤を浸透を促進するために使用しうる。経粘膜投与は例えば鼻スプレーの使用、ならびに吸入または坐剤による投与に適する製剤によることがある。本発明のアンチセンスオリゴマーは対象に投与するために医薬的に許容される担体と組合せることもできる。適当な医薬的担体の例には、これに限定するものではないがＮ−（１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−ｎ，ｎ，ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）など種々のカチオン性脂質を含む。好適なカチオン性脂質にはここにその開示を参考のために引用する１９９５年６月７日出願の米国特許出願番号０８／４８４７１６号、１９９５年６月７日出願の米国特許出願番号０８／４８３４６５号および１９９５年７月２１日出願の米国特許出願番号０８／５０５８０２号に記載されているものを含む。リポソームも本発明のアンチセンスオリゴマーのために適当な担体である。その他の適当な担体は低速放出ゲルまたはポリマー（９２、９３）であって、これに本発明のアンチセンス分子を含有させる。これらのアンチセンスオリゴマーは静脈内、筋肉内、鼻内、腹腔内、腫瘍内、皮下注射、原位置注射および経口投与を含む、有効ないかなる経路によって投与してもよい。経口投与には本発明のアンチセンス分子およびその類似体を消化管内での分解から守るために腸溶性被覆が必要なこともある。これらアンチセンスオリゴマーを一定量のたとえば食塩水またはその他の適当な液剤のような生理学的に許容される担体または希釈剤と混合する。これらアンチセンスオリゴマーはそれらが標的に達するまでアンチセンス分子を分解から保護するためにおよび／またはアンチセンス分子またはそれらの類似体の組織障壁を経る輸送を促進するためにその他の担体手段と混合することもある。本発明には神経膠芽細胞腫細胞を含む腫瘍細胞の増加を抑制する方法を包含する。この方法はその腫瘍細胞内でのＦＧＦＲ１遺伝子の発現を削減するために充分な条件下にＦＧＦＲ１遺伝子を発現する腫瘍細胞に本発明のアンチセンスオリゴマーを導入する段階を含む。本方法の別の態様にあっては、導入段階は腫瘍の外科的切開、すなわち腫瘍塊の可能な限りの外科的除去の段階を含む脳組織への局所的放出を含む。後続する段階には切開部位に残留する腫瘍塊細胞への本発明のアンチセンス分子の局所的導入を含む。切開部位にある腫瘍細胞への本発明のアンチセンス分子の局所的導入には本発明のアンチセンス分子を含有する低速放出ポリマーの設置を含む。この低速放出ポリマーは腫瘍細胞の増加を阻止するために充分な量のアンチセンス分子を含有する。化合物の脳内での局所的放出方法とその組成物は当技術分野ではよく知られている（４８、４９）。局所的放出のその他の方法には腫瘍内化学療法剤の定位投与を含む（５０、５１）。アンチセンスオリゴマーは癌または新生物細胞の増加、殊に原位置での神経膠芽細胞腫細胞の増加、の阻止に有効な量で投与される。特定のアンチセンスオリゴマーの実際の投与量はたとえば癌の型および段階、アンチセンスオリゴマーの身体内のその他の細胞への毒性、癌細胞による取り込み速度、アンチセンスオリゴマーを投与する個体の体重および年齢のような因子に依存するものである。その患者への有効用量は、たとえばアンチセンスオリゴマーの用量を細胞増殖を阻止するには無効な用量から有効量まで漸次増大するような、通常の方法によって確認できる。濃度が約１０ｎＭから約３０μＭまでの範囲内で癌細胞、殊に神経膠芽細胞腫細胞に与えると細胞増殖を有効に阻止するものと期待される。癌の治療またはその他の処方に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの化学療法的投与における医薬的／薬動力学的パラメータの測定法は当技術分野では知られている（５２）。アンチセンスオリゴマーは少なくとも癌細胞の増殖を阻止するために充分な回数患者に投与される。好ましくはこのアンチセンスオリゴマーは患者に癌細胞内またはその周囲でアンチセンスオリゴマーのレベルを有効濃度に維持するために充分な頻度で投与する。有効レベルを維持するためにはアンチセンスオリゴマーを毎日数回、毎日またはそれ以下の頻度で投与することが必要でありうる。アンチセンスオリゴマーは癌細胞が検出できなくなるまで、またはそれ以上の処置が有意義な細胞数減少を示せないか、または外科手術またはその他の処置によって管理できる数まで細胞が減少するまで投与される。アンチセンスオリゴマーを投与する時間的長さは、たとえば癌細胞による特定のオリゴマー取り込み速度および細胞がこのオリゴマーに反応するために必要な時間のような因子に依存する。本発明のアンチセンスオリゴマーは患者に２種またはそれ以上の異なるアンチセンスオリゴマー／オリゴデオキシヌクレオチド配列の組合せとしてまたは単一配列型として本発明の方法に従って投与されることもある。従って、本発明のアンチセンスオリゴマー、その組成物および使用方法には各々がＦＧＦＲ１遺伝子産物の少なくとも１種の発現を削減して腫瘍細胞の増加を抑制する本発明の性質を有し、このアンチセンスオリゴマーが相互に混合され、同時に局所放出系に添加される本発明のアンチセンスオリゴマー１種またはそれ以上の組成物を含む。本発明はさらにヒト腫瘍細胞に遺伝子移入するためのベクターを含む。本発明のベクターはヒトＦＧＦＲ１遺伝子からの発現を削減するアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。このベクター放出ヌクレオチド配列から発現されたアンチセンスＲＮＡはＦＧＦＲ１遺伝子から発現されたＲＮＡの発現部分に結合する。このアンチセンスＲＮＡはＦＧＦＲ１遺伝子産物の少なくとも１種の発現を削減して腫瘍細胞の増加を抑制する。このアンチセンスＲＮＡの好適な型はＦＧＦＲ１α−エクソンに実質的に相補的であって特異的に結合するものである。本発明はさらに腫瘍細胞の増加を抑制するためにＦＧＦＲ１遺伝子を発現する腫瘍細胞に本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドをＲＮＡとして導入することによって本発明のベクターを使用する方法を含む。この方法はＦＧＦＲ１遺伝子に実質的に相補性であってそれに結合するアンチセンスＲＮＡをコードする配列を含む本発明のベクターを腫瘍に遺伝子移入する段階を含む。さらに別の段階はこのアンチセンスＲＮＡをコードする配列を発現させて腫瘍細胞内ＦＧＦＲ１発現の低下を起こさせることを含む。哺乳類細胞を遺伝子移入／形質転換するベクターであって、標的遺伝子の発現を阻止するアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むベクターは当技術分野ではよく知られているである（５７）。このベクターを構築する技術およびオンコジーン、プロトオンコジーンおよびその他内因性遺伝子（たとえばＦＧＦＲ１）のダウンレギュレーションによって哺乳類癌細胞の腫瘍原性を抑制するように形質転換するためのそれらベクターの使用方法は広く報告されている（５７）。選択した標的遺伝子から発現されたＲＮＡに特異的でそれに結合するアンチセンスＲＮＡまたは選択した特定の配列部分を含む標的位置から発現されたアンチセンスＲＮＡをコードする配列を含むベクターの腫瘍細胞への遺伝子移入によって腫瘍細胞にアンチセンスＲＮＡを導入するためのプロトコルも知られている（５７）。本発明のＦＧＦＲ１−α−エクソン特異的アンチセンスオリゴマーの細胞増加阻止作用および特異性は下記の実施例に記載する。実施例一般的方法下記の実施例には下記のプロトコルを使用する：Ａ．細胞および細胞培養物この実施例で使用したヒトの細胞は腫瘍生検の小片を培養して得た高悪性度神経膠芽細胞腫から得たＳＮＢ−１９およびＴ９８細胞系列である。細胞系列Ｔ９８はアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託してＡＴＣＣ・ＣＲＬ１６９０と命名されている。ＳＮＢ−１９細胞はＧｒｏｓｓなどが報告している（５３）。これらの腫瘍の由来はＧｒｏｓｓなどが報告した（５３）ようにして組織学的な分析によって確認した。マイコプラズマ不含の神経膠腫細胞系列はＧｒｏｓｓなどが記載したようにして維持した（５３）。細胞系列ＳＨ−ＳＹ５Ｙは神経芽腫の細胞系列であってＧｒａｙなど（５８）、ｐａｔｔｅｒｓｏｎなど（５９）およびｐａｔｔｅｒｓｏｎなど（６０）に記載されている。Ｂ．細胞増加および用量反応関係神経膠腫細胞を１×１０⁵細胞／８．０ｃｍ²組織培養ウェルで血清添加培地（１０％）に塗布した。塗布の１８〜２０時間後に血清添加培地を去り、細胞を燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、血清不含培地（ＳＦＭ）に移した。ＦＧＦＲ１α−アンチセンスオリゴマーを含むアンチセンスオリゴマーまたは適当な対照オリゴヌクレオチドを無菌水に溶解してＳＭＦに変更する時に最終濃度３０μＭの濃度で直接細胞に加えた。これを第１日とした。細胞を３日間連続してアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。時間的経過の研究（第３図、実施例２および３）では細胞の一組を追加的にさらに第７日と第８日にアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは対照オリゴヌクレオチドで処理した。１日から１１日後に細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中でトリプシン処理（０．２５％）して組織培養ウェルから移動した。血球計数器を使用して細胞数を測定した。計数後に、細胞をペレット化してｍＲＮＡの精製およびＰＣＲ分析に使用した。Ｃ．ＲＮＡ−ＰＣＲ分析ＲＮＡ−ＰＣＲ分析によって細胞系列間のＦＧＦＲ１αおよびＦＧＦＲ１β転写物発現の相対的レベルを測定した。製造社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンジェゴ、ＣＡ）の指示書に従ってＭｉｃｒｏＦａｓｔ・Ｔｒａｃｔキットを使用してポリＡ［プラス］ｍＲＮＡを抽出した。腫瘍および隣接脳について、凍結切片（４ミクロン）２０枚からＲＮＡを抽出した。第一の鎖ＤＮＡ合成をｃＤＮＡ・ｃｙｃｌｅキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびランダムプライマーを使用して実行した。ヒトのＦＧＦＲ１の分析には、５’− 末端の−６７ヌクレオチドから−４４ヌクレオチドまでに対応するヌクレオチドプライマーＰ１ａ（配列番号２）およびＦＧＦＲ１に対するｍＲＮＡの３’−末端にあるヌクレオチド１０１４〜１０３５までに相補的なヌクレオチドプライマーＰ１ｂ（配列番号３）を使用した。ヒトのＦＧＦＲ２の分析には５’−末端にあるヌクレオチド１１３〜１３６に対応するヌクレオチドプライマーＰ１ａＲ２（配列番号４）（５’−ＡＡＧＴＧＴＧＣＡＧＡＴＧＧＧＡＴＴＡＡＣＧＴＣ−３’）およびＦＧＦＲ２に対するｍＲＮＡの３’−末端にあるヌクレオチド１１９６〜１２１７までに相補的なヌクレオチドプライマーＰ１ｂＲ２（配列番号５）（５’−ＡＴＴＡＣＣＣＧＣＣＡＡＧＣＡＣＧＴＡＴＡＴ−３’）を使用した。一般にＰＣＲは３０秒間９６℃で３サイクル、１５秒間６４℃、および６０秒間７２℃でＰｅｒｋｉｎ・Ｅｌｍｅｒ・Ｃｅｔｕｓ社のＧｅｎｅ・Ａｍｐ・ＰＣＲシステム９６００を使用して実行した。ｍＲＮＡ負荷の対照としてＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−燐酸脱水素酵素）のｃＤＮＡを５’−末端にあるヌクレオチド２７〜４６に対応するヌクレオチドプライマー（５’−ＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＴＴＧＧＧ−３’）（配列番号６）およびＧＡＰＤＨに対するｍＲＮＡの３’−末端にあるヌクレオチド２３８〜２５７まで（５６）に相捕的なヌクレオチドプライマー（５’−ＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧＣ−３’）（配列番号７）を使用して増幅した。条件はＦＧＦＲ１で使用したものと同一であった。最終２サイクル（全３２サイクル中）の間に³²Ｐ−ｄＣＴＰを使用してＧＡＰＤＨ増幅産物を放射能標識し、６％ポリアクリルアミドゲル上を泳動させ、Ｘ線フィルムに感光させた。反応混合物（２５μＬ）には１０ｍＭ −トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ−ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭ−ＫＣｌ、ゼラチン０．１ｍｇ／ｍＬ、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ・Ｅｌｍｅｒ・Ｃｅｔｕｓ社）０．８単位、０．２ｍＭ−ｄＮＴＰおよび各プライマー０．５ μＭを含有させた。ＦＧＦＲ１αとＦＧＦＲ１βとの相対的転写物水準はＰＣＲサザンブロット分析によって測定した。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル上で分離してナイロン膜フィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に移行させた。これらのフィルターをα−、β−およびγ−アイソフォームに共通な配列（５’−ＡＴＡＡＣＧＧＡＣＣＴＴＧＴＡＧＣＣＴＣＣ−３’）（配列番号８）およびＰＣＲプライマーＰ１ａおよびＰ１ｂ内部から誘導したヌクレオチド６１０〜６３０（５５）に相補的な³²Ｐ−標識ＦＧＦＲ１オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成させた。ＦＧＦＲ２の増幅はヌクレオチド１９２〜２１２に対応するオリゴヌクレオチド（５’−ＧＧＴＣＧＴＴＴＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣ−３’）（配列番号９）（Ｄｉｏｎｎｅなど、１９９０ｂ）を使用して監視した。ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２に特異的なオリゴヌクレオチドのみがその各々の増幅産物とハイブリッドを形成した。シグナル強度はハイブリッドが形成されたナイロン膜から直接ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｄｙｎａｍｉｃｓ社）を使用して測定した。ＰＣＲ増幅は２０から４０サイクルの範囲を通して評価した。ＰＣＲ増幅産物の蓄積は以前に報告した通り（３２）３５サイクルを通じて直線的であった。ＦＧＦＲ１β／ＦＧＦＲ１αの比率は直線的増幅範囲を通じて一定であった。ＰＣＲ−サザンブロットは各試料について全て最低３回実行した。Ｄ．細胞抽出物の調製プロテアーゼ阻害剤リューペプチン１０μｇ／ｍＬ、０．２ｍＭ−ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）、およびペプスタチン、ベスタチンおよびアプロチニン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）１００μｇ／ｍＬ添加１０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、２Ｍ− ＮａＣｌおよび０．１％ＣＨＡＰＳ（３，３−コラミドプロピルジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート）界面活性剤の緩衝液中で培養した細胞をホモジナイズした。ホモジネートを１４０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清液を取り、−８０℃で貯蔵した。適量を取り、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社の蛋白質検出システム（ハーキュリース、ＣＡ）を使用して蛋白質を測定した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって上清液を直接分析するか、または最初にヘパリン−Ａｆｆｉｇｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）とインキュベーションしてヘパリン結合蛋白質を濃縮した。ヘパリン結合蛋白質で濃縮した抽出物をＰＢＳで１：５に希釈し、５０μＬのヘパリン−Ａｆｆｉｇｅｌと４℃で一夜インキュベーションした。この容積のヘパリン−Ａｆｆｉｇｅｌは少なくとも１μｇの精製ヒト組換えｂＦＧＦ（ｈｒ− ｂＦＧＦ、Ｓｙｎｅｒｇｅｎ社、ブールダー、ＣＯ）を結合する。ヘパリン−Ａｆｆｉｇｅｌを次に１４０００×ｇで１０分間遠心分離して上清液を除いた。ヘパリン−Ａｆｆｉｇｅｌを３回ＰＢＳで洗浄し、５％２−メルカプトエタノールおよび２．５％ＳＤＳを含有する試料緩衝液中で５分間煮沸して蛋白質を溶離した。Ｅ．ゲル電気泳動およびウエスタンブロット分析１５％ゲルを使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥでヘパリン結合蛋白質を分割し、ニトロセルロースに移した。非特異的部位はニトロセルロースを５％粉末ミルク添加ＴＢＳＴ（１０ｍＭ−トリス −ＨＣｌｐＨ８．０、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、０．０５％トゥイーン２０）中でインキュベーションして遮断し、ポンカウレッドで染色するか、あるいは抗ｂＦＧＦモノクローナル抗体、ＤＥ６と１：１０００希釈で一夜インキュベーションした。対照実験ではブロットをＴＢＳＴと初代抗体不在下または蛋白質Ａ精製マウスＩｇＧとともにインキュベーションした。ブロットを各１０分間ＴＢＳＴ中で洗浄し、続いてビオチン結合ヒツジ抗マウス２代抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）（１：５００）と室温で４５分間インキュベーションした。ブロットをＴＢＳＴで１０分間づつ３回洗浄し、続いてＴＢＳＴ中でストレプトアビジン（１：１０００）−ビオチン化セイヨウワサビペルオキシダーゼ（１：２５００）複合体と室温で４５分間インキュベーションした。ブロットを次にＴＢＳＴ中で各１０分間づつ４回洗浄した。ブロットをＡｍｅｒｓｈａｍ社のＥＣＬ試薬で製造社の指示書に従って呈色させて免疫反応性バンドを可視化した。ＥＣＬ試薬に１分間接触し、ブロットをサランラップで被覆し、１０分〜１２分間Ｘ線フィルムに感光させた。ｂＦＧＦ蛋白質の分子量はビオチン化マーカー（ＢｉｏＲａｄ社）およびヒト組換えｂＦＧＦ標準（Ｓｙｎｅｒｇｅｎ社、ブールダー、ＣＣ）との比較によって測定した。実施例１アンチセンスオリゴマーの調製３’から５’方向のホスホロチオエートオリギヌクレオチドの合成を固相支持体上で行った。制御孔ガラスのような固体支持体に結合したジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護出発ヌクレオシド（３００μモル）を反応容器に入れた。ＤＭＴ保護基をデブロック剤（ジクロロメタン中２．５％ｖ／ｖジクロロ酢酸、３０当量）で反復処理（塩基によって４〜７回）してこの保護基の完全な除去を確実にした。支持体をアセトニトリルで洗浄して過剰の酸を支持体から除去した。所期のβ−シアノエチルホスホロアミダイトヌクレオシド（支持体上の出発ヌクレオシドに関して２当量）をエチルチオテトラゾール（６当量）と混合し、アルゴン下に５分間撹拌した。過剰のモノマーおよび活性化剤をアセトニトリルで支持体から洗浄除去した。ホスファイト中間体を３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３ −オン−１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬、５当量）で１０分間硫黄化した。ＣａｐＡ（ＴＨＦ中４０％無水酢酸）およびＣａｐＢ（ピリジン中０．６２５％ＤＡＭＰ）を混合してアミダイトモノマーに結合しなかった過剰のアルコールを除去した。全サイクルを反復して所期の長さのオリゴマーを合成した。前記のようにして最終的なＤＭＴをデブロックで除去した。続いて支持体を圧力容器に入れ、オリゴマーを支持体から外し、ヘテロ環アミン上の反応性の塩基保護基を濃水酸化アンモニウムで除去した。水酸化アンモニウム溶液から固体の支持体を濾去し、減圧下にアンモニアを除去した。残渣を移動相に取り、オリゴヌクレオチドをイオン交換クロマトグラフィーで精製して純度＞９７％の物質を得た。通常の収率は出発物質に対して約１．５ｍｇ／μモルであった。実施例２神経膠芽細胞腫細胞の増加に対する本発明アンチセンスオリゴマーの効果前記一般法を使用してＦＧＦＲ１α−エクソン特異的アンチセンスオリゴマーのヒト神経膠芽細胞腫細胞の増加に対する効果を研究した。次のホスホロチオエートオリゴマーを実施例１に記載したようにして合成し、３０μＭ−濃度で神経膠芽細胞腫細胞に与えた： ○ Ｒ２ＡＳ_ini［配列番号１２］はＦＧＦＲ２開始部位エクソン特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドである。 ○ Ｒ１ＡＳ_β［配列番号１１］はＦＧＦＲ１βエクソン特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドである。 ○ Ｒ１ＡＳ_α［配列番号１］はＦＧＦＲ１αエクソン特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドである。 ○ Ｒ１ＡＳ_ini［配列番号１３］はＦＧＦＲ１開始部位エクソン特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドである。 ○ Ｒ１ＡＳ_cont［配列番号１０］は逆方向のＦＧＦＲ１αエクソン特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドである。図１、図２および図３に示すように、ヒトの神経膠芽細胞腫細胞に３０μＭの濃度でＦＧＦＲ１αエクソン特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｒ１ＡＳ α）を導入すると確実かつ高度に再現的な細胞密度の７０〜８０％低下を起こした。この効果は飽和されることでき、用量依存的であった。この観察はヒトＦＧＦＲ１遺伝子から発現されるプレｍＲＮＡまたはＲＮＡの少なくとも一部に特異的に結合するか、またはそのプレｍＲＮＡまたはＲＮＡのα−エクソンの少なくとも一部に結合して腫瘍細胞、殊に神経膠芽細胞腫細胞、の増加を抑制するアンチセンスオリゴマーの効果を示す。図１で「Ｃｏｎｔ」で示した柱グラフはオリゴマーで処置しなかった対照細胞を示す。実施例３対照オリゴマーの神経膠芽細胞腫細胞の増加に対する効果前記一般法を使用して対照ホスホロチオエートアンチセンスオリゴマーのヒト神経膠芽細胞腫細胞の増加に対する効果を研究した。対照として使用した次のホスホロチオエートオリゴマーの添加は本発明の有効なアンチセンスオリゴマーと同等またはさらに高濃度で使用した時に培養基中の神経膠芽細胞腫細胞密度に明確な効果を示さなかった：（ａ）逆方向のＦＧＦＲ１α−エクソン特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｒ１ＡＳ_cont）［配列番号１０］、（ｂ）ＦＧＦＲ２−開始部位エクソン特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｒ２ＡＳ_ini）［配列番号１２］。神経膠芽細胞腫細胞密度に対するＦＧＦＲ１β特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｒ１ＡＳβ）［配列番号１１］の効果も研究した。有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドと同一な塩基構成を保持しているので逆方向のＦＧＦＲα−エクソン特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｒ１ＡＳ_cont）［配列番号１０］は重要な対照である。細胞増加抑制効果の欠失はその標的メッセージとのハイブリッド形成能がない結果であるものと信じられる。図１は神経膠芽細胞腫細胞増加に対するＦＧＦＲ２開始部位エクソン特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｒ２ＡＳ_ini）［配列番号１２］の添加は何の効果も示さないが、培養基中のヒト神経芽細胞腫細胞系列ＳＨ−ＳＹ５Ｙの細胞密度は明らかに削減する（図６）ことを示す。さらに、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞系列はＦＧＦＲ２ｍＲＮＡを発現することおよびＦＧＦＲ２開始部位エクソン特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドによってこのｍＲＮＡは選択的に削減されることが証明された（図５）。図６はＦＧＦＲ２アンチセンスオリゴヌクレオチドはＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞系列の細胞増加を有効に阻止するが、しかしＦＧＦＲ２ｍＲＮＡを欠失するヒトの神経膠芽細胞腫細胞系列増加の阻止には無効である（図１）ことを証明する。これらの結果はＦＧＦＲ２開始部位アンチセンスオリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ２を発現する細胞の細胞増加を有効に阻止することを証明する。そこで、培養基内でＲ２ＡＳ_iniオリゴマーによる神経膠芽細胞腫細胞への効果の不在は細胞増加の阻止はアンチセンスオリゴマーの非特異的効果に起因するのでなく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの添加は、関連ＦＧＦＲ族構成員に相補的なものであっても、細胞増加を抑制するためには十分ではないことを示唆する。神経膠芽細胞腫細胞へのＦＧＦＲ１βアンチセンスオリゴヌクレオチドの添加は細胞密度には無効であった（図１）。この観察は星状細胞が正常細胞から形質転換して悪性神経膠芽細胞腫細胞に進行し、その細胞がＦＧＦＲ１の発現をα優勢アイソフォーム（免疫グロブリンドメイン３個）型からβ優勢アイソフォーム（免疫グロブリンドメイン２個）型までシフトするとの観察とは符合してない。このβ型は７０％から９０％におよぶＦＧＦＲ１メッセージを表わす（３２、３３）。ＦＧＦＲ１βアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する細胞増加効果の不在はＦＧＦＲ１αアンチセンスオリゴヌクレオチドでの効果の観察と同様に符合しない観察である。というのはこのαアイソフォームはヒトの神経膠芽細胞腫にある全メッセージプールの僅かな部分に過ぎないからである。実施例４ＦＧＦＲ１ｍＲＮＡ合成に対する本発明オリゴマーの効果この実施例の目的は神経膠芽細胞腫細胞にＦＧＦＲ１αアンチセンスオリゴマーを与えることが示すＦＧＦＲ１ｍＲＮＡ合成に対する効果の測定である。前記一般法を使用してＦＧＦＲ１αエクソン特異的アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド［配列番号１］を添加してＦＧＦＲ１ｍＲＮＡの発現が選択的に削減されることを証明した（図４）。これとは対照的に逆方向ＦＧＦＲ１α エクソン特異的アンチセンスホスホロチエートオリゴヌクレオチド［配列番号１０］はＦＧＦＲ１ｍＲＮＡレベルには効果を示さず、細胞増加抑制の不能性と符合した（図４）。アンチセンスオリゴヌクレオチドを３日間連続して添加して細胞密度を以後２週間監視した実験では、ＦＧＦＲ１αエクソン特異的アンチセンスホスホロチエートオリゴヌクレオチド［配列番号１］を補充しない時は神経膠芽細胞腫細胞の増加が再開され（図３）、これがＦＧＦＲ１ｍＲＮＡの再発現（図４、１０日および１４日）に関連することが明らかとなった。それ故、神経膠芽細胞腫細胞の増加とそれらのＦＧＦＲ１ｍＲＮＡの発現との間には明瞭な相関関係がある。実施例５ＦＧＦＲ２ｍＲＮＡ合成に対する本発明オリゴマーの効果この実施例の目的は神経芽細胞腫細胞へのＦＧＦＲ１αアンチセンスオリゴマーの導入が示すＦＧＦＲ２合成に対する効果の研究である。前記方法を使用して本発明のＦＧＦＲ１αエクソン特異的アンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド［配列番号１］を添加してもヒト神経芽細胞腫細胞系列ＳＨ−ＳＹ５ＹのＦＧＦＲ２ｍＲＮＡの発現には効果がない（図５）ことを証明した。ＦＧＦＲ２の遺伝子配列および蛋白質機能はＦＧＦＲ１のものと密接に関連しているので、これはＦＧＦＲ１αオリゴマーが配列に基づきこれら２種のｍＲＮＡを識別できることを証明する。使用した細胞系列ＳＨ−ＳＹ５ＹはＦＧＦＲ２を発現するがＦＧＦＲ１を発現しない。これはさらに本発明のＦＧＦＲ１αエクソン特異的オリゴヌクレオチドの配列依存的な作用を証明する。神経膠芽細胞腫細胞系列ＳＮＢ−１９を使用してＦＧＦＲ１αエクソン特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド［配列番号１］の添加はＳＮＢ−１９細胞の塩基性線維芽細胞増殖因子蛋白質レベルには効果がない（図７）ことを証明した。これはＦＧＦＲ１αオリゴマー［配列番号１］がＳＮＢ−１９に存在するＦＧＦＲ１／ｂＦＧＦのオートサインループの非特異的崩壊をしないことを示す。ＦＧＦＲ１αオリゴマー処理した細胞はＦＧＦＲ１産生を阻止したが、なお産生していたリガンドｂＦＧＦの産生は阻止しなかった（図７に示すように）。ＦＧＦＲ１遺伝子とｂＦＧＦ遺伝子とは関連はないと信じられているので、これは化学的特異性がアンチセンス（配列）特異性よりも大きいことを示す。塩基性線維芽細胞増殖因子はヒトの神経膠芽細胞腫細胞の増加を促進することが以前に証明されている有糸分裂促進剤である。前記の結果は本発明の方法を用いてＦＧＦＲ１αアンチセンスオリゴマー［配列番号１］をヒトＦＧＦＲ１遺伝子を発現する腫瘍細胞と接触した時にＦＧＦＲ１ｍＲＮＡの減少を経る特異的作用、すなわちＦＧＦＲ１αアンチセンスオリゴヌクレオチド［配列番号１］による神経膠芽細胞腫細胞増加の抑制を証明する。実施例６Ｔ９８ヒト神経膠芽細胞腫細胞の増加に対する本発明のアンチセンスオリゴマーの効果この実施例の目的はＦＧＦＲ１αアンチセンスホスホロチオエートオリゴマー［配列番号１］のヒト神経膠芽細胞腫細胞の別細胞系列、即ちＴ９８細胞、の増加に対する効果を決定することにある。Ｔ９８細胞を培養して細胞数を前記のように測定した。このＴ９８細胞に３０μＭ−ＦＧＦＲ１αエクソンアンチセンスオリゴヌクレオチドを添加した。１日と７日に細胞密度を測定した。図８に示すようにＦＧＦＲ１αアンチセンスオリゴマー（Ａ５α）［配列番号１］の添加は細胞数の３４％低下を起こした。対照アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ_cont）［配列番号１０］では効果が見られなかった。実施例７ＦＧＦＲ遺伝子の発現に対するＦＧＦＲ１αエクソンアンチセンスオリゴマーの特異性この研究の目的はＦＧＦＲ１αエクソンアンチセンスホスホロチオエートオリゴマー［配列番号１］の神経膠芽細胞腫細胞内にある他種ＦＧＦＲ遺伝子の発現に対する選択性を決定することである。これは細胞増加抑制を起こすことになるＦＧＦＲ１αエクソンアンチセンスオリゴマーとその他のＦＧＦＲ族構成員のｍＲＮＡとの間の推測的な交差ハイブリッド形成を排除するために行った。細胞は前記のように処理した。ｍＲＮＡは殊にこの実験の方法で研究したＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４のｍＲＮＡを除いて前記のように分析した。ＳＮＢ−１９神経膠芽細胞腫細胞は１００ｍｍ皿当り１×１０⁵細胞の割合で血清添加培地に塗布した。１８時間後、細胞をＦＧＦＲ１αアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｒ１ＡＳα、３０μｍ）［配列番号１］またはＦＧＦＲ１αアンチセンス逆方向対照オリゴヌクレオチド（Ｒ１αＲＣ、３０μｍ）［配列番号１０］を添加した血清不含培地に移した。無処理細胞（ＮＴ）を対照として処理した。細胞を連続３日間オリゴヌクレオチドで処理した。７日目に細胞を剥がしてｍＲＮＡおよびｃＤＮＡを各々精製して合成した。３種の処置の各々からのｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行って、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４受容体のｃＤＮＡを増幅した。ＳＮＢ −１９細胞はＦＧＦＲ２は産生しない。図９に示すように、ＦＧＦＲ１ｍＲＮＡは抑制されたが、一方ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４遺伝子の発現には効果がなかった。すなわちＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４のｍＲＮＡは減少しなかった。図９はさらに非特異的対照として使用したＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−燐酸脱水素酵素）の局所的発現も減少しないことを示した。この観察は所期のＦＧＦＲ族の一員、すなわちＦＧＦＲ１ｍＲＮＡのみに対するＦＧＦＲ１αエクソンアンチセンスオリゴマーの特異性を示す。殊にＦＧＦＲ１αアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理はＦＧＦＲ１の発現を抑制するが、逆方向対照オリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ１の発現には効果がなかったことを示す。これに加えて、ＦＧＦＲ１αアンチセンスオリゴヌクレオチドはＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ４の発現を抑制せず、本発明の分子のＦＧＦＲ１に対する作用の選択性を証明した。この説明に限定するものではないが、この観察の意義は細胞増加の阻止がＦＧＦＲ１の抑制のみに起因するものと思われることにある。これはこの発明に期待される標的である。実施例８前記一般法を使用して、数の多少にかかわらず置換ヌクレオチドを有するアンチセンスオリゴマーまたはＦＧＦＲ１プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに沿ってオリゴマー［配列番号１および１５〜１９］よりも３’または５’方向にさらに伸長するもの、または標的ＦＧＦＲ１αエクソンの少なくとも一部に実質的に相補的でそれに特異的に結合するものをＦＧＦＲ１遺伝子を発現する腫瘍細胞に導入する。本明細書に記載する適当な製剤中の本発明のアンチセンスオリゴマーを腫瘍細胞に本明細書に記載する治療的応用を用いて導入することが各種神経膠芽細胞腫における腫瘍細胞の増加を抑制することが判明した。実施例９ＦＧＦＲ１および細胞増加に対するオリゴマー活性の検定ＦＧＦＲ１および細胞増加に対するオリゴヌクレオチド活性の測定操作は次の通りである：ＳＮＢ−１９細胞をポリスチレン９６穴組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社カタログ番号２５８６０）に出発密度ウェル当り約１０００細胞で塗布した。一夜正常増殖培地中で細胞を再生させてガラスに付着させた。正常増殖培地は無菌濾過した１０％ウシ胎児血清（Ｇｅｍｉｎｉ・Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社カタログ番号１００−１０７）および１０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１０Ｉ．Ｕ．／ｍＬのペニシリン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社カタログ番号３０００１ −ＬＩ）を添加したｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）Ｉ（Ｇｉｂｃｏ・ＢＲＬ社カタログ番号３１９８５−０１３）からなる。翌朝に２回２００μＬのＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社カタログ番号２１−０３１−ＬＭ）または血清不含培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）Ｉマイナス血清および抗生物質）で細胞を洗浄することで未製剤化、溶解自由なオリゴヌクレオチド処理を開始した。血清不含培地中の３０μＭ−全ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（２００μＬ）を各ウェルに添加した。各ウェル中のオリゴヌクレオチド含有血清不含培地２００μＬを２４時間おきに３日間別の血清不含培地中の３０ｍＭ−オリゴヌクレオチド２００μＬに交換した。４日目に（全部で９６時間オリゴヌクレオチドに接触）に培地を細胞から去り、さらに２日間（４８時間）放置した。アンチセンス対照オリゴヌクレオチドへの接触６日後に細胞を標準的白色光で観測したが、活性アンチセンスオリゴヌクレオチドは容易に確認できた。アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性ロットでは培地は極く僅かの細胞を有したが、ウェル中の細胞は集合してガラス基質には殆ど付着しなかった。典型的な数では細胞の増加阻止率は６０％から９０％であった。対照オリゴヌクレオチドはどれも細胞の増殖を有意には阻止しないかまたは細胞の会合を起こさなかった。細胞数の定量のために製造社の指示書に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６検定法（Ｐｒｏｍｅｇａ社カタログＧ５４２１）を使用した。全ての場合に目視による細胞増殖減少の印象が商業的な細胞滴定検定法によって確認された。実施例１０オリゴマー取込みの測定未製剤化ＦＩＴＣ−オリゴヌクレオチド取込みを評価する方法は次の通り：ＳＮＢ−１９細胞をウェル当り約１０００細胞の出発密度で１６穴／ガラス底スライド（Ｎｕｎｃ社カタログ１７８５９９）に塗布した。細胞を一夜正常培地中で再生させ、ガラスに付着させた。正常な増殖培地は無菌濾過した１０％ウシ胎児血清（Ｇｅｍｉｎｉ・Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社カタログ番号１００−１０７）および１０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１０Ｉ．Ｕ．／ｍＬのペニシリン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社カタログ番号３０００１−ＬＩ）を添加したｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）Ｉ（Ｇｉｂｃｏ・ＢＲＬ、カタログ番号３１９８５− ０１３）からなる。翌朝に２回２００μＬのＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ社カタログ番号２１−０３１−ＬＭ）または血清不含培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）Ｉマイナス血清および抗生物質）で細胞を洗浄することで未製剤化、溶解自由なＦＩＴＣ−オリゴヌクレオチド（ＦＩＴＣ−ｏｌｉｇｏ）処理を開始した。２００μＬの血清不含培地中の３０μＭ−ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドを各ウェルに添加した。これとは別の良く作動する血清不含培地はＲＰＭＩ培地１６４０（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社カタログ番号１１８３５−０２）である。各ウェル中のＦＩＴＣ−オリゴヌクレオチド含有血清不含培地２００μＬを２４時間おきに３日間追加的な２００μＬの血清不含培地中の３０ｍＭ−ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドに交換した。４日目に（全部で９６時間ＦＩＴＣ−オリゴヌクレオチドに接触）に培地を細胞から去り、さらに２日間（４８時間）放置した。ＦＩＴＣ−オリゴヌクレオチドとの接触開始６日後にヒト神経膠芽細胞腫細胞ＳＮＢ−１９内における螢光標識したオリゴヌクレオチドの位置をＥｐｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ・ＥＦ−Ｄ・Ｍｅｒｃｕｒｙ（Ｎｉｋｏｎ社）アタッチメントを装着したＮｉｋｏｎ・Ｌａｂｏｐｈｏｔ型顕微鏡で鏡検した。大多数の細胞核内での螢光オリゴヌクレオチドの明瞭な検出は生物学的活性量のオリゴヌクレオチドが送達された証拠である。鏡検用細胞の調製法は次の通り：振盪してウェルを空にし、細胞を３．７％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ・Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）で固定し、ＰＢＳで洗浄し、次にプラスチック室を動かしガラスからゴムのガスケットを取り去る。Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ・ｍｏｕｎｔｉｎｇ培地（Ｆｉｓｈｅｒ社カタログＯＢ１０００、光漂白阻害剤含有）を装着培地として使用した。拡大率２００倍で容易に核、エンドソームおよびリソソームが見えた。取込み成功は殆ど全部の細胞の核内にある鮮やかな螢光が証明した。取込み失敗は細胞全体のエンドソームおよびリソソーム、特に末端リソソームの細胞周縁クレシェントにある斑点状螢光が証明した。この場合は核の螢光は見られない。本発明の例示的態様を説明して当技術分野の熟練者はこの開示が例示のみであって、種々の別種、適応、および修飾が本発明の範囲内でもなしうることに気付くはずである。従って本発明は本明細書中に例示する特定態様に限定されるものではなく、請求項によってのみ限定されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ツェン，ベン・ワイアメリカ合衆国92130カリフォルニア州サンディエゴ、キャップストーン・ドライブ 13255番 (72)発明者ブラウン，ボブ・ディアメリカ合衆国92024カリフォルニア州エンシニタス、ノース・ウィロー・スプリング・ドライブ 445番

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトＦＧＦＲ１遺伝子から発現したＲＮＡの配列部分に特異的に結合する、腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有用なオリゴマーであって、ヒトＦＧＦＲ１遺伝子を発現する腫瘍細胞に接触させると、少なくとも１つのＦＧＦＲ１遺伝子産物の発現を減少させ、それによって該細胞の増殖を抑制するという特性を有するオリゴマー。２．ＦＧＦＲ１プレｍＲＮＡに実質的に相補的であり、かつこれに結合する、請求項１に記載のオリゴマー。３．ＦＧＦＲ１ α−エクソンプレｍＲＮＡに実質的に相補的であり、かつこれに結合する、請求項１に記載のオリゴマー。４．該ＲＮＡの配列部分がＦＧＦＲ１ α−エクソンを含むものであり、配列番号１及び１５〜１９から選択される配列を有する、請求項３に記載のオリゴマー。５．オリゴヌクレオチド又はその類似体である、請求項１に記載のオリゴマー。６．オリゴヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドからなる群から選択されるものである、請求項５に記載のオリゴマー。７．該類似体が、２'−Ｏ−アルキル糖修飾体、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホルムアセタール、３'−チオホルムアセタール、スルホン、スルファメート、ニトロオキシド骨格修飾体、アミド、塩基部分の修飾体、モルホリノ、ペプチド、核酸、及びそれらのキメラ又はコンジュゲートからなる修飾体の群から選択される少なくとも１つの修飾体を含んでなる、請求項５に記載のオリゴマー。８．腫瘍細胞の増殖を阻害するのに有用な組成物であって、ヒトＦＧＦＲ１遺伝子から発現したＲＮＡの配列部分に特異的に結合するオリゴマーであって、ヒトＦＧＦＲ１遺伝子を発現する腫瘍細胞と接触させると、少なくとも１つのＦＧＦＲ１遺伝子産物の発現を減少させ、それによって該細胞の増殖を抑制するという特性を有するオリゴマーを、薬学上許容し得る担体と共に含有する組成物。９．オリゴマーがＦＧＦＲ１プレｍＲＮＡに実質的に相捕的であり、かつこれに結合するものである、請求項８に記載の組成物。１０．オリゴマーがＦＧＦＲ１ α−エクソンプレｍＲＮＡに実質的に相補的であり、かつこれに結合するものである、請求項８に記載の組成物。１１．該ＲＮＡの配列部分がＦＧＦＲ１ α−エクソンを含み、該オリゴマーが配列番号１及び１５〜１９から選択される配列を有するものである、請求項１０に記載の組成物。１２．該オリゴマーがオリゴヌクレオチドか又はその類似体である、請求項８に記載の組成物。１３．該オリゴヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドからなる群から選択されるものである、請求項１２に記載の組成物。１４．該類似体が、２'−Ｏアルキル糖修飾体、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホルムアセタール、３'−チオホルムアセタール、スルホン、スルファメート、ニトロオキシド骨格修飾体、アミド、塩基部分の修飾体、モルホリノ、ペプチド、核酸、及びそれらのキメラ又はコンジュゲートからなる修飾体の群から選択される少なくとも１つの修飾体を含んでなるものである、請求項１２に記載の組成物。１５．腫瘍細胞中でのヒトＦＧＦＲ１遺伝子からの発現を減少させるアンチセンスＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、ヒト腫瘍細胞をトランスフェクトするためのベクター。１６．該アンチセンスＲＮＡがヒトＦＧＦＲ１遺伝子から発現したＲＮＡの配列部分と結合するものであり、ヒトＦＧＦＲ１遺伝子を発現する腫瘍細胞に接触したときに少なくとも１つのＦＧＦＲ１遺伝子産物の発現を減少させ、これによって該細胞の増殖を抑制するという特性を有するものである、請求項１５に記載のベクター。１７．該配列部分がＦＧＦＲ１ α−エクソンを含むものである、請求項１５に記載のベクター。１８．該アンチセンスＲＮＡがＦＧＦＲ１ＲＮＡに実質的に相補的であり、かつこれに結合するものである、請求項１６に記載のベクター。１９．腫瘍細胞の増殖を抑制するための方法であって、該腫瘍細胞中でのＦＧＦＲ１遺伝子発現を減少させるに十分な条件下でＦＧＦＲ１遺伝子を発現する腫瘍細胞にオリゴマーを導入する工程を含んでなり、該アンチセンスオリゴマーが腫瘍細胞の増殖の阻害に有用なものであり、ヒトＦＧＦＲ１遺伝子から発現したＲＮＡの配列部分と特異的に結合するものであり、ヒトＦＧＦＲ１遺伝子を発現する腫瘍細胞と接触させたときに少なくとも１つのＦＧＦＲ１遺伝子産物の発現を減少させ、これによって該細胞の増殖を抑制するという特性を有するものである方法。２０．該オリゴマーがＦＧＦＲ１プレｍＲＮＡに実質的に相補的であり、かつこれに結合するものである、請求項１９に記載の方法。２１．該オリゴマーがＦＧＦＲ１ α−エクソンプレｍＲＮＡに実質的に相補的であり、かつこれに結合するものである、請求項１９に記載のオリゴマー。２２．該ＲＮＡの配列部分がＦＧＦＲ１ α−エクソンを含み、該オリゴマーが配列番号１及び１５〜１９から選択される配列を有するものである、請求項２１に記載の方法。２３．該アンチセンスオリゴマーがオリゴヌクレオチドか又はその類似体である、請求項１９に記載の方法。２４．オリゴヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドからなる群から選択されるものである、請求項２３に記載の方法。２５．該類似体が、２'−Ｏ−アルキル糖修飾体、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホルムアセタール、３'−チオホルムアセタール、スルホン、スルファメート、ニトロオキシド骨格修飾体、アミド、塩基部分の修飾体、モルホリノ、ペプチド、核酸、及びそれらのキメラ又はコンジュゲートからなる修飾体の群から選択される少なくとも１つの修飾体を含んでなるものである、請求項２３に記載の方法。２６．該オリゴマーを、該オリゴマーの濃度が約０．０１μＭ〜約５０μＭである条件下で該細胞と接触させる、請求項１９に記載の方法。２７．該導入の工程が、以下の工程（ａ）腫瘍から該腫瘍細胞の第１部分をかなり大きく除き、それによって腫瘍細胞の第２部分が除去部位に残るような工程；及び（ｂ）該腫瘍細胞の第２部分を、該腫瘍細胞の第２部分の増殖を抑制するに十分な量の該オリゴマーと接触させる工程を含むものである方法。２８．腫瘍細胞中でのＦＧＦＲ１遺伝子発現を減少させるに十分な条件下でＦＧＦＲ１遺伝子を発現している腫瘍細胞に、アンチセンスＲＮＡを導入する工程を含んでなる、腫瘍細胞の増殖を抑制するための方法であって、導入の工程が（ａ）該腫瘍細胞を、該アンチセンスＲＮＡをコードする配列を含んでなるベクターでトランスフェクトする工程（ｂ）該アンチセンスＲＮＡを発現させる工程を含むものである方法。２９．該アンチセンスＲＮＡが、ヒトＦＧＦＲ１遺伝子から発現したＲＮＡの配列部分と結合する配列を有するものである、請求項２８に記載の方法。３０．該ＲＮＡの配列部分がＦＧＦＲ１ α−エクソンを含むものである、請求項２９に記載の方法。３１．神経膠腫細胞又は神経膠芽細胞腫細胞の、増殖の阻害若しくは減少又は細胞死の開始の誘発のための組成物であって、ＦＧＦＲ１プレｍＲＮＡに実質的に相補的であり、かつこれに結合する約１０〜３０ヌクレオシドのオリゴマーの有効量と、薬学的に許容し得る担体とを含有する組成物。３２．該オリゴマーがホスホロチオエートオリゴマーである、請求項３１に記載の組成物。３３．該オリゴマーが配列番号１及び１５〜１９から選択されるものである、請求項３１に記載の組成物。３４．該オリゴマーがホスホロチオエートオリゴマーである、請求項３３に記載の組成物。３５．ＦＧＦＲ１プレｍＲＮＡに実質的に相補的であり、かつこれに結合する、１０〜３０ヌクレオシドのオリゴマー。３６．ＦＧＦＲ１ α−エクソンプレｍＲＮＡに実質的に相補的であり、かつこれに結合する、請求項３５に記載のオリゴマー。３７．配列番号１及び１５〜１７から選択される配列を有する、請求項３５に記載のオリゴマー。３８．ホスホロチオエートオリゴマーである、請求項３７に記載のオリゴマー。３９．神経膠腫細胞又は腫瘍膠芽細胞腫細胞の、増殖の阻害若しくは減少又は細胞死の誘発のための方法であって、該細胞又はその周辺を、細胞増殖を阻害し若しくは減少させ又は細胞死を増加させるに効果的な量の、ＦＧＦＲ１タンパク質の活性を他のＦＧＦＲ１タンパク質の活性を実質的に損なうことなく選択的に阻害又は抑制するような化合物と、接触させることを含んでなる方法。４０．該化合物がＦＧＦＲ１プレｍＲＮＡに実質的に相補的であり、かつこれに結合するオリゴマーである、請求項３９に記載の方法。