JPH06209778A - NF−κBアンチセンスポリヌクレオチド - Google Patents
NF−κBアンチセンスポリヌクレオチドInfo
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract
(57)【要約】 (修正有)
【目的】NF−κBをコードする遺伝子にハイブリダイ
ズし得るオリゴマーを提供する。 【構成】NF−κB転写因子をコードする遺伝子の一部
分に実質的に相補的で、該遺伝子の一部分にハイブリダ
イズし、該遺伝子によるNF−κB転写因子の生産を実
質的に阻止するオリゴヌクレオチド、それらの調整法方
法、それらを含む医薬組成物に関するものである。
ズし得るオリゴマーを提供する。 【構成】NF−κB転写因子をコードする遺伝子の一部
分に実質的に相補的で、該遺伝子の一部分にハイブリダ
イズし、該遺伝子によるNF−κB転写因子の生産を実
質的に阻止するオリゴヌクレオチド、それらの調整法方
法、それらを含む医薬組成物に関するものである。
Description
【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、NF−κB転写因子を
コードする遺伝子の一部分に実質的に相補的で、該遺伝
子の一部分にハイブリダイズし、該遺伝子によるNF−
κB転写因子の生産を実質的に阻止するオリゴヌクレオ
チド、それらの調製方法、それらを含む医薬組成物に関
するものである。
コードする遺伝子の一部分に実質的に相補的で、該遺伝
子の一部分にハイブリダイズし、該遺伝子によるNF−
κB転写因子の生産を実質的に阻止するオリゴヌクレオ
チド、それらの調製方法、それらを含む医薬組成物に関
するものである。
【0002】
【従来の技術】遺伝子のセンス鎖またはその遺伝子から
転写されたmRNAに相補的で、それにハイブリダイズ
し得る核酸オリゴマー(オリゴヌクレオチド)がアンチ
センスオリゴマーである。標的遺伝子のセンス鎖あるい
はmRNAをそのアンチセンスオリゴマーにさらすと、
2つの鎖のハイブリダイゼーションが起こり、その結果
として、オリゴマーがハイブリダイズした状態にある限
り、その遺伝子は転写を妨げられ、またmRNAは翻訳
を阻止されるだろう。それ故に、その遺伝子によりコー
ドされるタンパク質(その遺伝子が調節タンパク質をコ
ードする場合は、あるグループのタンパク質類)が生産
されなくなる。アンチセンスオリゴマーはその特性のた
めに多くの用途を有している。例えば、それらは標的核
酸と結合するそれらの能力のために診断薬として有用で
ある。また、タンパク質合成に及ぼすそれらの作用のた
め、アンチセンスオリゴマーは治療上有用である。アン
チセンスオリゴヌクレオチドの概念およびそれらの化学
は Chemical Reviews 90, 544-579 (1990)に要約されて
いる。
転写されたmRNAに相補的で、それにハイブリダイズ
し得る核酸オリゴマー(オリゴヌクレオチド)がアンチ
センスオリゴマーである。標的遺伝子のセンス鎖あるい
はmRNAをそのアンチセンスオリゴマーにさらすと、
2つの鎖のハイブリダイゼーションが起こり、その結果
として、オリゴマーがハイブリダイズした状態にある限
り、その遺伝子は転写を妨げられ、またmRNAは翻訳
を阻止されるだろう。それ故に、その遺伝子によりコー
ドされるタンパク質(その遺伝子が調節タンパク質をコ
ードする場合は、あるグループのタンパク質類)が生産
されなくなる。アンチセンスオリゴマーはその特性のた
めに多くの用途を有している。例えば、それらは標的核
酸と結合するそれらの能力のために診断薬として有用で
ある。また、タンパク質合成に及ぼすそれらの作用のた
め、アンチセンスオリゴマーは治療上有用である。アン
チセンスオリゴヌクレオチドの概念およびそれらの化学
は Chemical Reviews 90, 544-579 (1990)に要約されて
いる。
【0003】NF−κB転写因子複合体は多種多様の細
胞遺伝子およびウイルス遺伝子の誘導に関与する多面的
な活性化因子である(Baeuerle, P.A., and D. Baltimo
re (1989) Genes Dev. 3: 1689-1698; Lenardo, M.J.,
and D. Baltimore (1989) Cell 58: 227-229)。この活
性複合体はp50およびp65と称する2つのサブユニ
ットから構成されている(Baeuerle and Baltimore (前
掲); Ghosh, S. and D. Baltimore (1990) Nature (Lon
don) 344: 678-682 )。
胞遺伝子およびウイルス遺伝子の誘導に関与する多面的
な活性化因子である(Baeuerle, P.A., and D. Baltimo
re (1989) Genes Dev. 3: 1689-1698; Lenardo, M.J.,
and D. Baltimore (1989) Cell 58: 227-229)。この活
性複合体はp50およびp65と称する2つのサブユニ
ットから構成されている(Baeuerle and Baltimore (前
掲); Ghosh, S. and D. Baltimore (1990) Nature (Lon
don) 344: 678-682 )。
【0004】p50(Ghosh, S. et al. (1990) Cell 6
2: 1019-1029 (文献1); Kieran, M. et al. (1990) Ce
ll 62: 1007-1018 (文献2) )およびp65(Nolan,
G.P.et al. (1991) Cell 64: 961-969 (文献3); Rube
n, S. et al. (1991) Science251: 1490-1493(文献4)
)をコードする遺伝子はすでにクローニングされてお
り、両タンパク質のN末端はがん遺伝子relの産物に
対しかなりの相同を示す。上に挙げた文献1−4はこれ
らの文献番号で表1(実施例1)にも引用されている。
2: 1019-1029 (文献1); Kieran, M. et al. (1990) Ce
ll 62: 1007-1018 (文献2) )およびp65(Nolan,
G.P.et al. (1991) Cell 64: 961-969 (文献3); Rube
n, S. et al. (1991) Science251: 1490-1493(文献4)
)をコードする遺伝子はすでにクローニングされてお
り、両タンパク質のN末端はがん遺伝子relの産物に
対しかなりの相同を示す。上に挙げた文献1−4はこれ
らの文献番号で表1(実施例1)にも引用されている。
【0005】ICAM−1(Voraberger, G. et al. (1
991) Immunol. 147: 2777-2786)、ビメンチン(Lilien
baum, A. et al. (1990) J. Virol. 64: 256-263)およ
びELAM−1(Whelan, J. et al. (1991) Nucleic A
cids Res. 19: 2645-2653 )を含めて、多数の細胞接着
分子(cell adhesion molecule:CAM)がそれらの
5’調節領域内にNF−κB結合部位をもっている。N
F−κBは種々の接着分子を調節することにより細胞接
着に関与し、それ故細胞増殖に影響を及ぼしているよう
だ。
991) Immunol. 147: 2777-2786)、ビメンチン(Lilien
baum, A. et al. (1990) J. Virol. 64: 256-263)およ
びELAM−1(Whelan, J. et al. (1991) Nucleic A
cids Res. 19: 2645-2653 )を含めて、多数の細胞接着
分子(cell adhesion molecule:CAM)がそれらの
5’調節領域内にNF−κB結合部位をもっている。N
F−κBは種々の接着分子を調節することにより細胞接
着に関与し、それ故細胞増殖に影響を及ぼしているよう
だ。
【0006】アンチセンス作用の検定として細胞接着を
利用することが可能である。例えば、アンチセンスオリ
ゴによる、推定接着分子および結腸直腸がん(DCC)
では欠失されている腫瘍抑制遺伝子の抑制が、様々な細
胞の剥離を引き起こす(Narayanan, R. et al. (1992)
Oncogene 7: 553-561 )。細胞と細胞との、および細胞
と基層との接着は、特定の細胞外マトリックス(EC
M)タンパク質および隣接細胞のリガンドの方へ細胞を
向けるいくつかの異なるファミリーのレセプターにより
仲介されている(Albelda, S.M. and C.A. Buck (1990)
FASEB J. 4: 2868-2880)。
利用することが可能である。例えば、アンチセンスオリ
ゴによる、推定接着分子および結腸直腸がん(DCC)
では欠失されている腫瘍抑制遺伝子の抑制が、様々な細
胞の剥離を引き起こす(Narayanan, R. et al. (1992)
Oncogene 7: 553-561 )。細胞と細胞との、および細胞
と基層との接着は、特定の細胞外マトリックス(EC
M)タンパク質および隣接細胞のリガンドの方へ細胞を
向けるいくつかの異なるファミリーのレセプターにより
仲介されている(Albelda, S.M. and C.A. Buck (1990)
FASEB J. 4: 2868-2880)。
【0007】これらのレセプターも、細胞の増殖、分
化、接合部の形成、および極性の様々な側面に影響を及
ぼしている(Albelda and Buck 1990,前掲; Hynes, R.
O. (1992) Cell 69: 11-25 )。組織培養の細胞では、
細胞膜接着部(focal contact :細胞がECMと結合す
る特定の細胞膜領域)の形成にヘパリン硫酸のようなプ
ロテオグリカンおよび種々のインテグリン分子が必要で
ある。インテグリンは細胞と基層の、および細胞と細胞
の、両方の接着のレセプターとして機能するヘテロダイ
マー分子である(Albelda and Buck 1990,前掲)。免疫
グロブリン超遺伝子ファミリーの接着分子も細胞間接着
に関与している。これらの分子は胚形成、損傷治癒、炎
症反応、凝固および転移において重要な役割を果たして
いる(Albelda and Buck 1990,前掲; Hynes 1992, 前
掲)。
化、接合部の形成、および極性の様々な側面に影響を及
ぼしている(Albelda and Buck 1990,前掲; Hynes, R.
O. (1992) Cell 69: 11-25 )。組織培養の細胞では、
細胞膜接着部(focal contact :細胞がECMと結合す
る特定の細胞膜領域)の形成にヘパリン硫酸のようなプ
ロテオグリカンおよび種々のインテグリン分子が必要で
ある。インテグリンは細胞と基層の、および細胞と細胞
の、両方の接着のレセプターとして機能するヘテロダイ
マー分子である(Albelda and Buck 1990,前掲)。免疫
グロブリン超遺伝子ファミリーの接着分子も細胞間接着
に関与している。これらの分子は胚形成、損傷治癒、炎
症反応、凝固および転移において重要な役割を果たして
いる(Albelda and Buck 1990,前掲; Hynes 1992, 前
掲)。
【0008】細胞接着分子が炎症に関与しているという
認識は新しい治療方法をもたらした。特定の細胞接着分
子に対するモノクローナル抗体が、敗血症性ショックお
よび虚血(再灌流障害)において皮膚炎症部への好中球
の漸増を阻止するために使用されている。
認識は新しい治療方法をもたらした。特定の細胞接着分
子に対するモノクローナル抗体が、敗血症性ショックお
よび虚血(再灌流障害)において皮膚炎症部への好中球
の漸増を阻止するために使用されている。
【0009】
【発明が解決しようとする課題】本発明によれば、NF
−κB転写因子をコードする遺伝子の一部分に実質的に
相補的で、該遺伝子の一部分にハイブリダイズし、該遺
伝子によるNF−κB転写因子の生産を実質的に抑制す
るオリゴマーを用いることにより、細胞接着を阻止する
ことが可能である。細胞接着は炎症、損傷治癒、腫瘍の
発生といった状態において重要な要因となっている。こ
れらのオリゴマーはかかる状態を軽減するという治療用
途を有している。
−κB転写因子をコードする遺伝子の一部分に実質的に
相補的で、該遺伝子の一部分にハイブリダイズし、該遺
伝子によるNF−κB転写因子の生産を実質的に抑制す
るオリゴマーを用いることにより、細胞接着を阻止する
ことが可能である。細胞接着は炎症、損傷治癒、腫瘍の
発生といった状態において重要な要因となっている。こ
れらのオリゴマーはかかる状態を軽減するという治療用
途を有している。
【0010】
【課題を解決するための手段】NF−κB遺伝子の一部
分にハイブリダイズして、NF−κB複合体の合成が起
こるのを実質的に妨げるオリゴマーは細胞接着の阻止に
有効である。NF−κB遺伝子のこれらの部分と結合す
るオリゴマーはどれも、記載した通りにNF−κBの生
産を抑制するだろう。かかるオリゴマーにさらされた細
胞においてNF−κBの生産が抑制されると、その細胞
は表面に付着する能力を失う。ハイブリダイゼーション
により阻止されたときNF−κBの合成が起こるのを実
質的に妨げるNF−κB遺伝子の上記部分は、中でも、
次の配列を有するかまたは実質的に次の配列を有するも
のである:GCC ATG GAC GAA CTG TTC CCC 〔配列番号:
1〕および AGA ATG GCA GAA GAT GAT CCA〔配列番号:
2〕。
分にハイブリダイズして、NF−κB複合体の合成が起
こるのを実質的に妨げるオリゴマーは細胞接着の阻止に
有効である。NF−κB遺伝子のこれらの部分と結合す
るオリゴマーはどれも、記載した通りにNF−κBの生
産を抑制するだろう。かかるオリゴマーにさらされた細
胞においてNF−κBの生産が抑制されると、その細胞
は表面に付着する能力を失う。ハイブリダイゼーション
により阻止されたときNF−κBの合成が起こるのを実
質的に妨げるNF−κB遺伝子の上記部分は、中でも、
次の配列を有するかまたは実質的に次の配列を有するも
のである:GCC ATG GAC GAA CTG TTC CCC 〔配列番号:
1〕および AGA ATG GCA GAA GAT GAT CCA〔配列番号:
2〕。
【0011】本発明のオリゴマーはNF−κB転写因子
をコードする遺伝子(またはmRNA)の一部分にハイ
ブリダイズする能力を有する。このようなオリゴマーが
NF−κB遺伝子の一部分にハイブリダイズすると、こ
の遺伝子によるNF−κBの生産が実質的に妨げられる
だろう。「実質的に妨げられる」とは、NF−κBが生
産されないか、あるいは非機能的レベルで生産されるこ
とを意味する。本明細書中で用いる「遺伝子に結合す
る」とは、対応するmRNAに結合することを含めるも
のとする。NF−κBは別々の遺伝子によってコードさ
れるp50およびp65と呼ばれる2つのサブユニット
から成っている。これらの遺伝子のそれぞれがNF−κ
Bをコードする遺伝子であると見なされる。ここに記載
したオリゴマーはp50遺伝子またはp65遺伝子に、
特にヒト遺伝子に結合する能力を有する。p65遺伝子
かp50遺伝子がオリゴマーとのハイブリダイゼーショ
ンによりブロックされると、NF−κB転写因子は生産
されないだろう。オリゴマーはそれらの標的部位と実質
的に相補的である。それらは標的部位の正確な相補配列
を表す必要はないが、標的部位と選択的にハイブリダイ
ズするに足る相補性をもつべきである。
をコードする遺伝子(またはmRNA)の一部分にハイ
ブリダイズする能力を有する。このようなオリゴマーが
NF−κB遺伝子の一部分にハイブリダイズすると、こ
の遺伝子によるNF−κBの生産が実質的に妨げられる
だろう。「実質的に妨げられる」とは、NF−κBが生
産されないか、あるいは非機能的レベルで生産されるこ
とを意味する。本明細書中で用いる「遺伝子に結合す
る」とは、対応するmRNAに結合することを含めるも
のとする。NF−κBは別々の遺伝子によってコードさ
れるp50およびp65と呼ばれる2つのサブユニット
から成っている。これらの遺伝子のそれぞれがNF−κ
Bをコードする遺伝子であると見なされる。ここに記載
したオリゴマーはp50遺伝子またはp65遺伝子に、
特にヒト遺伝子に結合する能力を有する。p65遺伝子
かp50遺伝子がオリゴマーとのハイブリダイゼーショ
ンによりブロックされると、NF−κB転写因子は生産
されないだろう。オリゴマーはそれらの標的部位と実質
的に相補的である。それらは標的部位の正確な相補配列
を表す必要はないが、標的部位と選択的にハイブリダイ
ズするに足る相補性をもつべきである。
【0012】オリゴヌクレオチドのデザインについて
の、特にハイブリダイゼーション条件の特異性に関す
る、一般的な考察事項は、現在の技術水準において、例
えば Sambrook et al.“Molecular Cloning, A Laborat
ory Manual, 特に第11章, 第2 版, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbot, Cold Spring Harbo
rLaboratory Press (1989) ”に見い出すことができ
る。本発明においては、ヌクレオチド配列の特定の長さ
のオリゴヌクレオチドのみを適当であると見なすことが
理解されよう。このような配列の最小の長さは、所定の
標的配列に対する十分な特異性についての一般に知られ
た考察事項に従って、当業者により決定され得る(例え
ば、上記の Sambrook et al.を参照されたい)。また、
かかる配列の最大の長さも、当分野で知られた考察事項
に従って、例えば実験的にチェックできる十分な細胞膜
浸透効率を考慮することによって、当業者により決定さ
れ得る。
の、特にハイブリダイゼーション条件の特異性に関す
る、一般的な考察事項は、現在の技術水準において、例
えば Sambrook et al.“Molecular Cloning, A Laborat
ory Manual, 特に第11章, 第2 版, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbot, Cold Spring Harbo
rLaboratory Press (1989) ”に見い出すことができ
る。本発明においては、ヌクレオチド配列の特定の長さ
のオリゴヌクレオチドのみを適当であると見なすことが
理解されよう。このような配列の最小の長さは、所定の
標的配列に対する十分な特異性についての一般に知られ
た考察事項に従って、当業者により決定され得る(例え
ば、上記の Sambrook et al.を参照されたい)。また、
かかる配列の最大の長さも、当分野で知られた考察事項
に従って、例えば実験的にチェックできる十分な細胞膜
浸透効率を考慮することによって、当業者により決定さ
れ得る。
【0013】詳細には、配列 GGG GAA CAG TTC GTC CAT
GGC〔配列番号:3〕を含むか、この配列をもつオリゴ
マーは、ヒトp65サブユニットをコードする遺伝子の
一部分に結合する。配列 TGG ATC ATC TTC TGC CAT TCT
〔配列番号:4〕を含むか、この配列をもつオリゴマー
は、ヒトp50サブユニットをコードする遺伝子の一部
分に結合する。これらのオリゴマーはそれに相補的な対
応mRNAにもハイブリダイズする能力を有する。
GGC〔配列番号:3〕を含むか、この配列をもつオリゴ
マーは、ヒトp65サブユニットをコードする遺伝子の
一部分に結合する。配列 TGG ATC ATC TTC TGC CAT TCT
〔配列番号:4〕を含むか、この配列をもつオリゴマー
は、ヒトp50サブユニットをコードする遺伝子の一部
分に結合する。これらのオリゴマーはそれに相補的な対
応mRNAにもハイブリダイズする能力を有する。
【0014】好ましいオリゴマーの長さはおよそ21ヌ
クレオチドであるが、5−50ヌクレオチドのオリゴマ
ーの長さを利用することができる。より高い特異性はよ
り長いオリゴマーの特性であるが、この特性は安定性の
要件や細胞膜通過の容易性と調和させる必要があり、そ
のため比較的短いオリゴマーの方が望ましい。〔配列番
号:1〕から〔配列番号:4〕に一致するオリゴヌクレ
オチドの配列を有するオリゴマーが最も好ましい。
クレオチドであるが、5−50ヌクレオチドのオリゴマ
ーの長さを利用することができる。より高い特異性はよ
り長いオリゴマーの特性であるが、この特性は安定性の
要件や細胞膜通過の容易性と調和させる必要があり、そ
のため比較的短いオリゴマーの方が望ましい。〔配列番
号:1〕から〔配列番号:4〕に一致するオリゴヌクレ
オチドの配列を有するオリゴマーが最も好ましい。
【0015】本明細書中で開示したオリゴマーを細胞の
中に導入すると、このオリゴマーはNF−κB遺伝子の
一部分またはNF−κB mRNAに結合することによ
ってNF−κBの合成を実質的に低下させるか、あるい
は阻止する。驚いたことに、細胞は表面に付着する能力
を結果的に失うことになる。従って、これらのオリゴマ
ーはアンチセンスオリゴマーとして有用であり、それら
にさらされた細胞が表面に付着するのを妨げる。NF−
κB合成および細胞接着を阻止しうるオリゴマーは、実
施例に記載した細胞接着検定により選択することができ
る。
中に導入すると、このオリゴマーはNF−κB遺伝子の
一部分またはNF−κB mRNAに結合することによ
ってNF−κBの合成を実質的に低下させるか、あるい
は阻止する。驚いたことに、細胞は表面に付着する能力
を結果的に失うことになる。従って、これらのオリゴマ
ーはアンチセンスオリゴマーとして有用であり、それら
にさらされた細胞が表面に付着するのを妨げる。NF−
κB合成および細胞接着を阻止しうるオリゴマーは、実
施例に記載した細胞接着検定により選択することができ
る。
【0016】NF−κBが転写因子であり、それ故それ
はすべての細胞にとって基本的な機能であるDNAのm
RNAへの転写を仲介するという理由からすると、この
ことは驚くべきことである。NF−κB合成の阻止は細
胞の代謝を狂わせて、細胞に害を加えたり、それを死滅
させることが予測されよう。意外にも、処置された細胞
は生き残っているが、高度に特異的な機能を行う能力、
つまり表面に付着する能力を失っていることがわかっ
た。付着の欠如は細胞同士の付着や生理学的基質への付
着を妨げる。かくして、オリゴマーにさらされた細胞は
それらの挙動を変えるだろう。NF−κBはあらゆる型
の細胞および組織に存在するタンパク質であるから、開
示されたオリゴマーは表面に付着し得るどんな細胞の付
着をも低下させるか、阻止するように機能するだろう。
はすべての細胞にとって基本的な機能であるDNAのm
RNAへの転写を仲介するという理由からすると、この
ことは驚くべきことである。NF−κB合成の阻止は細
胞の代謝を狂わせて、細胞に害を加えたり、それを死滅
させることが予測されよう。意外にも、処置された細胞
は生き残っているが、高度に特異的な機能を行う能力、
つまり表面に付着する能力を失っていることがわかっ
た。付着の欠如は細胞同士の付着や生理学的基質への付
着を妨げる。かくして、オリゴマーにさらされた細胞は
それらの挙動を変えるだろう。NF−κBはあらゆる型
の細胞および組織に存在するタンパク質であるから、開
示されたオリゴマーは表面に付着し得るどんな細胞の付
着をも低下させるか、阻止するように機能するだろう。
【0017】本発明のオリゴマーは、例えば実施例に記
載するようなクローニングや化学合成といった公知方法
で調製することができる。オリゴマーは標的遺伝子の配
列から、あるいはタンパク質の配列より推定された核酸
配列から誘導し得る。慣用方法により調製されたオリゴ
マーは、NF−κB合成を実質的に妨げる能力を調べる
ためにスクリーニングされる。NF−κBをコードする
遺伝子の一部分にハイブリダイズする能力を有し、かく
して該遺伝子によるNF−κB合成を実質的に阻止でき
るオリゴマーの決定は、ハイブリダイゼーションおよび
細胞接着を検出するための通常の手法を使って行われ
る。このようなスクリーニングのための細胞接着検定は
実施例に記載してある。簡単に述べると、表面に付着し
得るあらゆる型の細胞を、通常の条件下で、例えば培養
皿(または細胞を培養するのに適した容器)中でこの皿
の底に細胞を付着させるのに十分な時間増殖させる。細
胞を加える前に、ゼラチンや他の適当な基質の層により
皿の表面をコーティングしてもよい。その後、培養下の
細胞にオリゴマーを加え、ある時間の経過後に細胞が皿
の表面から離脱するとき、オリゴマーの目的とする効果
が観察される。付着の欠如を観察するのに適したインキ
ュベーション時間は12−24時間である。しかし、数
週間またはそれ以上の長期間を必要とする場合もある。
載するようなクローニングや化学合成といった公知方法
で調製することができる。オリゴマーは標的遺伝子の配
列から、あるいはタンパク質の配列より推定された核酸
配列から誘導し得る。慣用方法により調製されたオリゴ
マーは、NF−κB合成を実質的に妨げる能力を調べる
ためにスクリーニングされる。NF−κBをコードする
遺伝子の一部分にハイブリダイズする能力を有し、かく
して該遺伝子によるNF−κB合成を実質的に阻止でき
るオリゴマーの決定は、ハイブリダイゼーションおよび
細胞接着を検出するための通常の手法を使って行われ
る。このようなスクリーニングのための細胞接着検定は
実施例に記載してある。簡単に述べると、表面に付着し
得るあらゆる型の細胞を、通常の条件下で、例えば培養
皿(または細胞を培養するのに適した容器)中でこの皿
の底に細胞を付着させるのに十分な時間増殖させる。細
胞を加える前に、ゼラチンや他の適当な基質の層により
皿の表面をコーティングしてもよい。その後、培養下の
細胞にオリゴマーを加え、ある時間の経過後に細胞が皿
の表面から離脱するとき、オリゴマーの目的とする効果
が観察される。付着の欠如を観察するのに適したインキ
ュベーション時間は12−24時間である。しかし、数
週間またはそれ以上の長期間を必要とする場合もある。
【0018】細胞接着を阻止するオリゴマーは安定性を
向上させるために修飾することができる。天然核酸ホス
フェートの遊離単結合酸素の位置に、酸素、メチルまた
は硫黄が存在するように、オリゴマーを構成するヌクレ
オチドのホスフェート基を修飾する。この種の修飾オリ
ゴマーは実施例に記載するような慣用の合成法により作
られる。これらの置換のどれも、適当な分子を自動合成
機に加えることにより公知方法で作ることができる。
向上させるために修飾することができる。天然核酸ホス
フェートの遊離単結合酸素の位置に、酸素、メチルまた
は硫黄が存在するように、オリゴマーを構成するヌクレ
オチドのホスフェート基を修飾する。この種の修飾オリ
ゴマーは実施例に記載するような慣用の合成法により作
られる。これらの置換のどれも、適当な分子を自動合成
機に加えることにより公知方法で作ることができる。
【0019】かくして、本発明の更なる目的は、固相合
成で合成され、固体支持体に結合された、対応するヌク
レオチド配列の保護されたオリゴヌクレオチドを脱保護
し、固相から切断し、所望により適宜に修飾することを
特徴とする、本発明のオリゴヌクレオチドの調製および
修飾方法を提供することにある。脱保護および切断方法
は合成オリゴヌクレオチドの型に依存し、例えば用いた
保護基あるいは以下に示すようなリン原子上の置換基Y
に左右される。オリゴヌクレオチド、特にこれに含まれ
る塩基も、合成中に、化学修飾により、または伸長工程
で修飾済みの前駆体(構成単位)を用いることにより、
それらの構造を修飾することができる。これらの手法は
当業者に知られている。
成で合成され、固体支持体に結合された、対応するヌク
レオチド配列の保護されたオリゴヌクレオチドを脱保護
し、固相から切断し、所望により適宜に修飾することを
特徴とする、本発明のオリゴヌクレオチドの調製および
修飾方法を提供することにある。脱保護および切断方法
は合成オリゴヌクレオチドの型に依存し、例えば用いた
保護基あるいは以下に示すようなリン原子上の置換基Y
に左右される。オリゴヌクレオチド、特にこれに含まれ
る塩基も、合成中に、化学修飾により、または伸長工程
で修飾済みの前駆体(構成単位)を用いることにより、
それらの構造を修飾することができる。これらの手法は
当業者に知られている。
【0020】好ましいオリゴマーは以下のような簡略化
された構造を有する:
された構造を有する:
【0021】
【化1】
【0022】塩基はヌクレオチド塩基A、T、C、Gを
表す。YはO−、またはS−、もしくはメチル−から選
ばれる。好ましい修飾オリゴマーは上に記載した通りで
あり、次の塩基配列を有する: GGG GAA CAG TTC GTC CAT GGC 〔配列番号:3〕および TGG ATC ATC TTC TGC CAT TCT 〔配列番号:4〕 従って、本発明のオリゴマーは上記の配列を有するヌク
レオチドから構成され、そしてそのヌクレオチドは式−
O−P(=O)(Y)−O−(ここでYはメチル、酸素
および硫黄より成る群から選ばれる)のホスフェート基
で連結されている。
表す。YはO−、またはS−、もしくはメチル−から選
ばれる。好ましい修飾オリゴマーは上に記載した通りで
あり、次の塩基配列を有する: GGG GAA CAG TTC GTC CAT GGC 〔配列番号:3〕および TGG ATC ATC TTC TGC CAT TCT 〔配列番号:4〕 従って、本発明のオリゴマーは上記の配列を有するヌク
レオチドから構成され、そしてそのヌクレオチドは式−
O−P(=O)(Y)−O−(ここでYはメチル、酸素
および硫黄より成る群から選ばれる)のホスフェート基
で連結されている。
【0023】本発明のオリゴマーは、それらが細胞接着
を妨げるという理由のため有用である。例えば炎症の治
療、損傷治癒の促進、および細胞接着を阻止することに
よる腫瘍の破壊においてオリゴマーを実際に役立たせる
のがこの特性である。さらに、本発明の目的は、少なく
とも1種の本発明のオリゴヌクレオチドまたはその修飾
体と、場合により治療上許容される担体物質を含有する
医薬組成物を提供することにある。
を妨げるという理由のため有用である。例えば炎症の治
療、損傷治癒の促進、および細胞接着を阻止することに
よる腫瘍の破壊においてオリゴマーを実際に役立たせる
のがこの特性である。さらに、本発明の目的は、少なく
とも1種の本発明のオリゴヌクレオチドまたはその修飾
体と、場合により治療上許容される担体物質を含有する
医薬組成物を提供することにある。
【0024】また、このような医薬組成物、すなわち細
胞接着防止用あるいは診断用の医薬組成物を調製するた
めの、本発明のオリゴヌクレオチドおよびそれらの修飾
体の使用も本発明の目的である。細胞接着の防止のため
に、オリゴマーは血流中または標的組織に直接注入さ
れ、これらの入口のどちらかから、オリゴマーはその後
拡散によってあるいはレセプターを通して細胞膜を通過
し、細胞の中に入り、そこでそれらは上記の標的配列と
ハイブリダイズする。オリゴマーは抗体またはレセプタ
ーフラグメントのような標的指向性キャリアと結合させ
ても、細胞への効率的運搬のためにリポソームやミセル
として慣用手段により提供されてもよい。メチルまたは
硫黄で置換されたホスフェート基を有するオリゴマーを
生成する上記修飾は、酵素的分解に対して比較的安定し
ているため治療用として同一配列の非修飾オリゴマーよ
りも好ましいオリゴマーをもたらす。さらに、修飾オリ
ゴマーは非修飾オリゴマーよりも容易に細胞膜を通過す
ることができる。
胞接着防止用あるいは診断用の医薬組成物を調製するた
めの、本発明のオリゴヌクレオチドおよびそれらの修飾
体の使用も本発明の目的である。細胞接着の防止のため
に、オリゴマーは血流中または標的組織に直接注入さ
れ、これらの入口のどちらかから、オリゴマーはその後
拡散によってあるいはレセプターを通して細胞膜を通過
し、細胞の中に入り、そこでそれらは上記の標的配列と
ハイブリダイズする。オリゴマーは抗体またはレセプタ
ーフラグメントのような標的指向性キャリアと結合させ
ても、細胞への効率的運搬のためにリポソームやミセル
として慣用手段により提供されてもよい。メチルまたは
硫黄で置換されたホスフェート基を有するオリゴマーを
生成する上記修飾は、酵素的分解に対して比較的安定し
ているため治療用として同一配列の非修飾オリゴマーよ
りも好ましいオリゴマーをもたらす。さらに、修飾オリ
ゴマーは非修飾オリゴマーよりも容易に細胞膜を通過す
ることができる。
【0025】生物学的に活性な化合物を投与するための
慣用方法はどれも有効量のオリゴマーの投与に利用し得
る。より詳細には、修飾または非修飾オリゴマーは単独
で、または適当な製剤上の担体と組み合わせて、あるい
は担体と結合させて投与される。担体の例としてはペプ
チド、免疫グロブリンおよびそれらのフラグメント、リ
ポソーム、レセプター分子、リガンド分子、例えばホル
モン、酵素、および薬剤投与用の通常の化合物がある。
慣用方法はどれも有効量のオリゴマーの投与に利用し得
る。より詳細には、修飾または非修飾オリゴマーは単独
で、または適当な製剤上の担体と組み合わせて、あるい
は担体と結合させて投与される。担体の例としてはペプ
チド、免疫グロブリンおよびそれらのフラグメント、リ
ポソーム、レセプター分子、リガンド分子、例えばホル
モン、酵素、および薬剤投与用の通常の化合物がある。
【0026】有効量のオリゴマーは経口的、非経口的、
静脈内または皮膚に、あるいは通常の薬学的経路により
投与され得る。有効量のオリゴマーを含む、このような
投与用の処方物も本発明の一部である。標的組織の細胞
接着を防止するためにオリゴマーを局所的に適用するこ
ともできる。オリゴマーの有効量は実験データに基づい
て当業者が決めることができる。例えば、治療部位での
有効量は個々の細胞に有効量を与える in vitro 実験か
ら決定し得る。治療部位の細胞塊に投与するために、そ
して一部のオリゴマーが治療部位に到達できないことに
よる有効濃度の低下を補償するために、これらの量が推
定される。オリゴマーの濃度はいろいろな既知の要因に
左右されよう。これらの要因にはオリゴマー自体の安定
性、長さ、修飾、担体、投与経路および投与ビヒクル
(経口、非経口、静脈内または皮膚)、そして血液脳関
門のような生理学的バリアーを定める治療部位が含まれ
る。治療しようとする者の健康状態も考慮すべき要因で
ある。
静脈内または皮膚に、あるいは通常の薬学的経路により
投与され得る。有効量のオリゴマーを含む、このような
投与用の処方物も本発明の一部である。標的組織の細胞
接着を防止するためにオリゴマーを局所的に適用するこ
ともできる。オリゴマーの有効量は実験データに基づい
て当業者が決めることができる。例えば、治療部位での
有効量は個々の細胞に有効量を与える in vitro 実験か
ら決定し得る。治療部位の細胞塊に投与するために、そ
して一部のオリゴマーが治療部位に到達できないことに
よる有効濃度の低下を補償するために、これらの量が推
定される。オリゴマーの濃度はいろいろな既知の要因に
左右されよう。これらの要因にはオリゴマー自体の安定
性、長さ、修飾、担体、投与経路および投与ビヒクル
(経口、非経口、静脈内または皮膚)、そして血液脳関
門のような生理学的バリアーを定める治療部位が含まれ
る。治療しようとする者の健康状態も考慮すべき要因で
ある。
【0027】治療部位におけるオリゴマーの好ましい有
効量は約1×10-8Mないし約1×10-5Mである。外
用(局所)組成物の場合は、有効量のオリゴマーが製剤
上許容される担体を含む溶液、乳液、クリームまたは軟
膏中に加えられる。製剤上のビヒクルとしては溶液、軟
膏、錠剤、および所定の投与形態に適した通常のビヒク
ルがある。溶液や軟膏が好ましい。溶液は、オリゴマー
および/またはその塩のほかに、生理食塩水のような緩
衝液、BSAのような安定剤、および他の慣用成分を含
んでいてもよい。軟膏、クリーム、乳液、ローションお
よびシャンプーはすべて局所適用を意図しており、公知
の諸成分を含有する。
効量は約1×10-8Mないし約1×10-5Mである。外
用(局所)組成物の場合は、有効量のオリゴマーが製剤
上許容される担体を含む溶液、乳液、クリームまたは軟
膏中に加えられる。製剤上のビヒクルとしては溶液、軟
膏、錠剤、および所定の投与形態に適した通常のビヒク
ルがある。溶液や軟膏が好ましい。溶液は、オリゴマー
および/またはその塩のほかに、生理食塩水のような緩
衝液、BSAのような安定剤、および他の慣用成分を含
んでいてもよい。軟膏、クリーム、乳液、ローションお
よびシャンプーはすべて局所適用を意図しており、公知
の諸成分を含有する。
【0028】本発明のオリゴマーは細胞接着に関連した
疾病状態を治療するために使用することができる。炎症
は基質や他の細胞への細胞接着により仲介される。従っ
て、細胞接着の防止は局部的炎症を軽減するだろう。か
くして、炎症の治療方法は、患者に炎症を軽減するのに
十分な量の本発明オリゴマーを投与することから成って
いる。オリゴマーの好ましい有効濃度は炎症部位におい
て約1×10-8Mないし約1×10 -5Mである。好まし
い投与形態は局所投与である。損傷治癒もまた細胞接着
によって影響される。かくして、炎症について記載した
方法と全く同じ方法で、損傷治癒のために本発明のオリ
ゴマーを投与することができる。
疾病状態を治療するために使用することができる。炎症
は基質や他の細胞への細胞接着により仲介される。従っ
て、細胞接着の防止は局部的炎症を軽減するだろう。か
くして、炎症の治療方法は、患者に炎症を軽減するのに
十分な量の本発明オリゴマーを投与することから成って
いる。オリゴマーの好ましい有効濃度は炎症部位におい
て約1×10-8Mないし約1×10 -5Mである。好まし
い投与形態は局所投与である。損傷治癒もまた細胞接着
によって影響される。かくして、炎症について記載した
方法と全く同じ方法で、損傷治癒のために本発明のオリ
ゴマーを投与することができる。
【0029】本発明のオリゴマーは固形腫瘍を破壊する
という点でも有用である。細胞の形質転換は多くの場合
インテグリンレパートリーの定性変化と関連している
(Plantefaber, L.C. and R.O. Hynes (1989) Cell 56:
281-290)。腫瘍の浸潤および転移のメカニズムは、細
胞と細胞の、そして細胞と下層の正常な相互作用の複雑
な変化を伴う(Juliano, R. (1987) Biochim. Biophys.
Acta 907: 261-278; Ruoslahti, E. and F.G. Giancot
ti (1989) Cancer Cells 1: 119-126; Albeda and Buc
k, 1990, 前掲; Hynes, R.U. (1992) Cell 69: 11-15,
前掲)。
という点でも有用である。細胞の形質転換は多くの場合
インテグリンレパートリーの定性変化と関連している
(Plantefaber, L.C. and R.O. Hynes (1989) Cell 56:
281-290)。腫瘍の浸潤および転移のメカニズムは、細
胞と細胞の、そして細胞と下層の正常な相互作用の複雑
な変化を伴う(Juliano, R. (1987) Biochim. Biophys.
Acta 907: 261-278; Ruoslahti, E. and F.G. Giancot
ti (1989) Cancer Cells 1: 119-126; Albeda and Buc
k, 1990, 前掲; Hynes, R.U. (1992) Cell 69: 11-15,
前掲)。
【0030】腫瘍の進行過程は複雑で、腫瘍発生のいろ
いろな時期に接着特性の低下および増加の両方を示す悪
性細胞を必要とする(Ruoslahti and Giancotti,前掲;
Edelman, G.M. and K.L. Crossin (1991) Annu. Rev. B
iochem. 60: 155-190; Edelman, G.M. et al. (1987) P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8502-8506 )。腫瘍細
胞が転移するためには、まず第一に、腫瘍細胞が血管の
細胞外マトリックスに定着しなければならない。本発明
のオリゴマーはマトリックスへの細胞の接着を阻止す
る。かくして、オリゴマーによる治療は腫瘍の構成細胞
が互いに接着するのを妨げ、その結果腫瘍を溶解するだ
ろう。非付着腫瘍細胞はその後免疫系によって除かれる
だろう。また、非付着腫瘍細胞は定着できないため転移
を起こすことができず、腫瘍形成能をもたない正常な表
現型に復帰するだろう。従って、本発明のオリゴマー
は、固形腫瘍を溶解するのに十分な量の本発明オリゴマ
ーを投与することから成る固形腫瘍の治療方法において
利用し得る。固形腫瘍は転移性の腫瘍であり得る。
いろな時期に接着特性の低下および増加の両方を示す悪
性細胞を必要とする(Ruoslahti and Giancotti,前掲;
Edelman, G.M. and K.L. Crossin (1991) Annu. Rev. B
iochem. 60: 155-190; Edelman, G.M. et al. (1987) P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8502-8506 )。腫瘍細
胞が転移するためには、まず第一に、腫瘍細胞が血管の
細胞外マトリックスに定着しなければならない。本発明
のオリゴマーはマトリックスへの細胞の接着を阻止す
る。かくして、オリゴマーによる治療は腫瘍の構成細胞
が互いに接着するのを妨げ、その結果腫瘍を溶解するだ
ろう。非付着腫瘍細胞はその後免疫系によって除かれる
だろう。また、非付着腫瘍細胞は定着できないため転移
を起こすことができず、腫瘍形成能をもたない正常な表
現型に復帰するだろう。従って、本発明のオリゴマー
は、固形腫瘍を溶解するのに十分な量の本発明オリゴマ
ーを投与することから成る固形腫瘍の治療方法において
利用し得る。固形腫瘍は転移性の腫瘍であり得る。
【0031】さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、
公知方法に従って固体支持体に固定することによりNF
−κB DNAまたはRNAの単離に使用でき、そして
オリゴヌクレオチド自体をNF−κB DNAまたはR
NAの検出に利用し得る。診断用には、本発明のオリゴ
ヌクレオチドを、公知方法により放射性同位元素、酵素
または蛍光化合物のようなシグナル発生物質を用いて標
識することができる。
公知方法に従って固体支持体に固定することによりNF
−κB DNAまたはRNAの単離に使用でき、そして
オリゴヌクレオチド自体をNF−κB DNAまたはR
NAの検出に利用し得る。診断用には、本発明のオリゴ
ヌクレオチドを、公知方法により放射性同位元素、酵素
または蛍光化合物のようなシグナル発生物質を用いて標
識することができる。
【0032】本発明を以下の実施例により説明するが、
これらは例示するためのものであって、いかなる場合も
本発明を制限するものではない。
これらは例示するためのものであって、いかなる場合も
本発明を制限するものではない。
【0033】
【実施例】方法1:アンチセンスオリゴヌクレオチド オリゴヌクレオチドのチオ類似体は、自動合成機(モデ
ル394,Applied Biosystems, Foster City, CA )を
用いて、発表されたプロトコール(Matsukura,M. et a
l. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7706-771
0)に従って合成した。オリゴマーは Nurayanan et al.
(1992) (前掲) に記載されるように精製したが、1つ
の改変を加えた。つまり、オリゴ類を無水エタノールで
洗う前にエーテルで常法により再抽出した(6回)。細
胞をトリプシン処理し、オリゴ類(30μM)と混合
し、そして先に記載したように種々のECM被覆皿に2
4時間ないし2週間プレートした(Ito, E. et al. (19
89) Oncogene 4: 1193-1199 )。一部の実験では、オリ
ゴ類を48時間ごとに加えた。また、一部の実験では、
初めに細胞をプレートして、オリゴ類を加える前に細胞
を定着させた。アンチセンスオリゴ実験は別々に調製し
たオリゴ類を用いて3−4回繰り返した。細胞はさまざ
まな継代数のものを使用した。
ル394,Applied Biosystems, Foster City, CA )を
用いて、発表されたプロトコール(Matsukura,M. et a
l. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7706-771
0)に従って合成した。オリゴマーは Nurayanan et al.
(1992) (前掲) に記載されるように精製したが、1つ
の改変を加えた。つまり、オリゴ類を無水エタノールで
洗う前にエーテルで常法により再抽出した(6回)。細
胞をトリプシン処理し、オリゴ類(30μM)と混合
し、そして先に記載したように種々のECM被覆皿に2
4時間ないし2週間プレートした(Ito, E. et al. (19
89) Oncogene 4: 1193-1199 )。一部の実験では、オリ
ゴ類を48時間ごとに加えた。また、一部の実験では、
初めに細胞をプレートして、オリゴ類を加える前に細胞
を定着させた。アンチセンスオリゴ実験は別々に調製し
たオリゴ類を用いて3−4回繰り返した。細胞はさまざ
まな継代数のものを使用した。
【0034】方法2:細胞培養 ネズミES細胞(CCE−24,L. Robertson, コロン
ビア大学)は、1%ゼラチン被覆皿上で15%熱不活化
ウシ胎児血清(FBS)、10ng/mlのヒト白血病
抑制因子(LIF)(UBI, Lake Placid, NY)および
4.5×10-4Mのモノチオグリセロール(Sigma, St.
Louis, MO)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DM
EM)を用いて常法により増殖させた。LIFの除去に
より分化を開始させ、続いてLIF不含培地で6−8日
間継代培養した。細胞系NIH 3T3、Rat−1、
PC−12(ATCC CRL1721)およびS−1
7は記載(Nurayanan et al. (1992),前掲)の通りに維
持した。一次ヒト血管内皮細胞(HUVEC)と一次ケ
ラチノサイトは Clonetech社(Palo Alto, CA )から入
手した。RHEK−1細胞は記載(Rhim, J.S. et al.
(1986) Science 232:385-388 )の通りに維持した。細
胞外マトリックス(ECM)は、3.5×10 -4M N
H4OHを含む0.5%トリトンX−100を用いて集
密的培養物を室温で5分間溶解し、続いてリン酸緩衝溶
液(PBS)で3回洗うことにより、支持細胞層の繊維
芽細胞から確立させた。
ビア大学)は、1%ゼラチン被覆皿上で15%熱不活化
ウシ胎児血清(FBS)、10ng/mlのヒト白血病
抑制因子(LIF)(UBI, Lake Placid, NY)および
4.5×10-4Mのモノチオグリセロール(Sigma, St.
Louis, MO)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DM
EM)を用いて常法により増殖させた。LIFの除去に
より分化を開始させ、続いてLIF不含培地で6−8日
間継代培養した。細胞系NIH 3T3、Rat−1、
PC−12(ATCC CRL1721)およびS−1
7は記載(Nurayanan et al. (1992),前掲)の通りに維
持した。一次ヒト血管内皮細胞(HUVEC)と一次ケ
ラチノサイトは Clonetech社(Palo Alto, CA )から入
手した。RHEK−1細胞は記載(Rhim, J.S. et al.
(1986) Science 232:385-388 )の通りに維持した。細
胞外マトリックス(ECM)は、3.5×10 -4M N
H4OHを含む0.5%トリトンX−100を用いて集
密的培養物を室温で5分間溶解し、続いてリン酸緩衝溶
液(PBS)で3回洗うことにより、支持細胞層の繊維
芽細胞から確立させた。
【0035】方法3:PCR分析 RT−PCRは以前に記載されたように行った(Nuraya
nan et al. (1992),前掲)。p65プライマー (1) 5'
GCG GCC AAG CTT AAG ATC TGC CGA GTA AAC 3'および
(2) 5' CGC TGC TCT AGA GAA CAC AAT GGC CAC TTG CCG
3'は150bpのアンプリコンを規定する。p50プ
ライマー (1) 5' AAA GGT TAT CGT TCA GTT 3'および
(2) 5' TTG TAG ATA GGC AAG GTC 3'は250bpのア
ンプリコンを規定する。GAPDHプライマーはすでに
記載されている(Nurayanan et al. (1992),前掲)。サ
イトカインレセプターのプライマー配列はすでに記載さ
れている(Schmitt, R.M. et al. (1991) Genes Dev.
5: 728-740 )。
nan et al. (1992),前掲)。p65プライマー (1) 5'
GCG GCC AAG CTT AAG ATC TGC CGA GTA AAC 3'および
(2) 5' CGC TGC TCT AGA GAA CAC AAT GGC CAC TTG CCG
3'は150bpのアンプリコンを規定する。p50プ
ライマー (1) 5' AAA GGT TAT CGT TCA GTT 3'および
(2) 5' TTG TAG ATA GGC AAG GTC 3'は250bpのア
ンプリコンを規定する。GAPDHプライマーはすでに
記載されている(Nurayanan et al. (1992),前掲)。サ
イトカインレセプターのプライマー配列はすでに記載さ
れている(Schmitt, R.M. et al. (1991) Genes Dev.
5: 728-740 )。
【0036】方法4:プラスミドの構築 m−p65cDNAの350bpフラグメントをNIH
3T3細胞のcDNAからRT−PCRによりクロー
ニングし、このフラグメントはATG開始コドンを含ん
でいた。PCRプライマーは (1) 5' ACC GCT CGA GCT
AGC CCG GGA CCC TGA CCA TGG AC 3' および (2) 5' CC
G GAA TTC GCT AGC GCT TCA CAC ACT GGA TCC CCA GG
3' を含み、増幅フラグメントをMAM−Neo−CA
TベクターのNheI部位に挿入した(Nurayanan et a
l. (1992),前掲)。センスおよびアンチセンスクローン
を制限分析により同定し、そして塩基配列決定により確
認した。超コイルプラスミドDNAを記載された通りに
エレクトロポレーションによりPC−12細胞に導入し
た(Reiss et al., Biochem. and Biophysical Res.Com
m. 137, 244 (1986) )。
3T3細胞のcDNAからRT−PCRによりクロー
ニングし、このフラグメントはATG開始コドンを含ん
でいた。PCRプライマーは (1) 5' ACC GCT CGA GCT
AGC CCG GGA CCC TGA CCA TGG AC 3' および (2) 5' CC
G GAA TTC GCT AGC GCT TCA CAC ACT GGA TCC CCA GG
3' を含み、増幅フラグメントをMAM−Neo−CA
TベクターのNheI部位に挿入した(Nurayanan et a
l. (1992),前掲)。センスおよびアンチセンスクローン
を制限分析により同定し、そして塩基配列決定により確
認した。超コイルプラスミドDNAを記載された通りに
エレクトロポレーションによりPC−12細胞に導入し
た(Reiss et al., Biochem. and Biophysical Res.Com
m. 137, 244 (1986) )。
【0037】方法5:RNAの単離 RNAはRNAzol−B(Cinna Biotecx, Friendswo
od, Texas )により単離した。ノザンブロットは以前に
Nurayanan ら(前掲)によって記載された通りに行っ
た。
od, Texas )により単離した。ノザンブロットは以前に
Nurayanan ら(前掲)によって記載された通りに行っ
た。
【0038】実施例1 細胞接着検定は本発明オリゴマーの効果を実証するもの
である。NF−κBのそれぞれのサブユニットに対する
修飾ホスホロ−チオオリゴヌクレオチドを合成した(表
1)。表1
である。NF−κBのそれぞれのサブユニットに対する
修飾ホスホロ−チオオリゴヌクレオチドを合成した(表
1)。表1
【0039】表1.ホスホロ−チオオリゴ類を実施例で
用いた。オリゴヌクレオチド配列はそれぞれのmRNA
の5’末端に対応し、開始コドンの上流に存在する3−
4ヌクレオチドを含む。NF−κBのp50およびp6
5サブユニットの阻止効果を試験するために、ネズミE
S細胞を用いた。ES細胞は白血病抑制因子(LIF)
を存在させて未分化状態に維持した。この培養物からL
IFを取り去ることにより分化を開始させた。分化した
ES細胞と未分化ES細胞の両方をp65アンチセンス
オリゴにさらすと、ゼラチン被覆皿からの細胞の完全離
脱が起こった。対照(センス)p65オリゴはES細胞
の接着に対して何も影響を及ぼさなかった。これらの実
験では、細胞をトリプシン処理し、p65に対するオリ
ゴ(30μM)と混合し、ゼラチン被覆皿にプレート
し、そして効果を見分けるために72時間培養後に写真
を撮った。
用いた。オリゴヌクレオチド配列はそれぞれのmRNA
の5’末端に対応し、開始コドンの上流に存在する3−
4ヌクレオチドを含む。NF−κBのp50およびp6
5サブユニットの阻止効果を試験するために、ネズミE
S細胞を用いた。ES細胞は白血病抑制因子(LIF)
を存在させて未分化状態に維持した。この培養物からL
IFを取り去ることにより分化を開始させた。分化した
ES細胞と未分化ES細胞の両方をp65アンチセンス
オリゴにさらすと、ゼラチン被覆皿からの細胞の完全離
脱が起こった。対照(センス)p65オリゴはES細胞
の接着に対して何も影響を及ぼさなかった。これらの実
験では、細胞をトリプシン処理し、p65に対するオリ
ゴ(30μM)と混合し、ゼラチン被覆皿にプレート
し、そして効果を見分けるために72時間培養後に写真
を撮った。
【0040】p50アンチセンスオリゴはES細胞の分
化状態に応じて劇的な効果を示した。未分化ES細胞で
は、p50アンチセンスオリゴの効果がなかった。LI
Fを6日間取り除いてES細胞を分化させた後では、p
50アンチセンスオリゴの添加が細胞の完全離脱を引き
起こし、その効果はp65アンチセンスオリゴの効果と
同等であった。上と同様に、トリプシン処理した(未分
化または分化)細胞をp50に対するオリゴ(30μ
M)と混合し、ゼラチン被覆皿にプレートし、そして写
真を撮った。これらのES細胞の分化状態は、epo−
R、c−kit、G−CSF−RおよびCSF−1Rの
ようなさまざまなサイトカインレセプターの調節アップ
をモニターして確認した。アンチセンスオリゴ離脱細胞
はトリパンブルー排除により生存可能であり、アンチセ
ンスオリゴの存在下で(オリゴは48時間ごとに取り替
えた)2−3週間生育し続けた。ES細胞接着に対する
これらのアンチセンスオリゴの効果は非常に特異的であ
り、非特異的毒性によるものではない。いくつかの無関
係のアンチセンスオリゴはES細胞接着に対しこのよう
な効果を示さなかった。アンチセンスオリゴで処理した
ES細胞は、メチルセルロース培地中でのES細胞の成
長に類似して、懸濁体中で凝集物として成長した(Wile
s, M.V. and G. Keller (1991) Development 111: 259-
267 )。
化状態に応じて劇的な効果を示した。未分化ES細胞で
は、p50アンチセンスオリゴの効果がなかった。LI
Fを6日間取り除いてES細胞を分化させた後では、p
50アンチセンスオリゴの添加が細胞の完全離脱を引き
起こし、その効果はp65アンチセンスオリゴの効果と
同等であった。上と同様に、トリプシン処理した(未分
化または分化)細胞をp50に対するオリゴ(30μ
M)と混合し、ゼラチン被覆皿にプレートし、そして写
真を撮った。これらのES細胞の分化状態は、epo−
R、c−kit、G−CSF−RおよびCSF−1Rの
ようなさまざまなサイトカインレセプターの調節アップ
をモニターして確認した。アンチセンスオリゴ離脱細胞
はトリパンブルー排除により生存可能であり、アンチセ
ンスオリゴの存在下で(オリゴは48時間ごとに取り替
えた)2−3週間生育し続けた。ES細胞接着に対する
これらのアンチセンスオリゴの効果は非常に特異的であ
り、非特異的毒性によるものではない。いくつかの無関
係のアンチセンスオリゴはES細胞接着に対しこのよう
な効果を示さなかった。アンチセンスオリゴで処理した
ES細胞は、メチルセルロース培地中でのES細胞の成
長に類似して、懸濁体中で凝集物として成長した(Wile
s, M.V. and G. Keller (1991) Development 111: 259-
267 )。
【0041】さらに、アンチセンスp50およびp65
の効果は一時的なものであった。新たなオリゴの非存在
下で再プレートしたとき、アンチセンスオリゴ処理ES
細胞はそれらの分化形態または未分化形態を保持してい
た。これらの結果は、NF−κBが細胞と基層の接着に
おいて重要な役割を担っており、NF−κBが機能する
のを妨げると細胞接着が失われることを示している。
の効果は一時的なものであった。新たなオリゴの非存在
下で再プレートしたとき、アンチセンスオリゴ処理ES
細胞はそれらの分化形態または未分化形態を保持してい
た。これらの結果は、NF−κBが細胞と基層の接着に
おいて重要な役割を担っており、NF−κBが機能する
のを妨げると細胞接着が失われることを示している。
【0042】実施例2 未分化ES細胞をp65オリゴ(30μM)の存在下で
培養した。細胞をトリプシン処理し、フィブロネクチン
−(10μg/ml)またはラミニン−(10μg/m
l)被覆皿にプレートし、そして対照として72時間後
に写真を撮った。フィブロネクチン、ラミニンまたはコ
ラーゲン上にプレートした細胞は、p65アンチセンス
オリゴにさらしたとき、完全に離脱した。ところが、支
持細胞層の溶解細胞により生成されたECM上にES細
胞をプレートしたときには、p65アンチセンスオリゴ
の離脱効果が完全に消失した。いくつかの他の接着分子
が支持細胞由来の全ECMにより供給され、これらはN
F−κB機能とは無関係である。未分化ES細胞をp6
5オリゴ(30μM)の存在下で培養した。細胞をトリ
プシン処理し、コラーゲンIV型(5μg/ml)または
3T3支持細胞の溶解により生成されたECM上に再プ
レートし、分析のため72時間後に写真を撮った。
培養した。細胞をトリプシン処理し、フィブロネクチン
−(10μg/ml)またはラミニン−(10μg/m
l)被覆皿にプレートし、そして対照として72時間後
に写真を撮った。フィブロネクチン、ラミニンまたはコ
ラーゲン上にプレートした細胞は、p65アンチセンス
オリゴにさらしたとき、完全に離脱した。ところが、支
持細胞層の溶解細胞により生成されたECM上にES細
胞をプレートしたときには、p65アンチセンスオリゴ
の離脱効果が完全に消失した。いくつかの他の接着分子
が支持細胞由来の全ECMにより供給され、これらはN
F−κB機能とは無関係である。未分化ES細胞をp6
5オリゴ(30μM)の存在下で培養した。細胞をトリ
プシン処理し、コラーゲンIV型(5μg/ml)または
3T3支持細胞の溶解により生成されたECM上に再プ
レートし、分析のため72時間後に写真を撮った。
【0043】ES細胞接着に対するp65アンチセンス
オリゴの効果は非常に速かった。つまり、5時間以内
に、p65アンチセンス処理細胞はそれらの接着特性の
劇的な変化を示した。未分化ES細胞をゼラチン被覆皿
上でオリゴの非存在下に72時間培養した。培地を除
き、定着した細胞に30μMのアンチセンスまたはセン
スp65を含む新しい培地を加えた。1つの区域に印を
つけて、光学分析のため直ちに(0時)および5時間後
に写真を撮った。最終的に、これらの細胞は12−14
時間以内に完全に離脱したが、p65センスもp50ア
ンチセンスオリゴも未分化ES細胞の接着に対し2週間
までの間何の影響も及ぼさなかった。
オリゴの効果は非常に速かった。つまり、5時間以内
に、p65アンチセンス処理細胞はそれらの接着特性の
劇的な変化を示した。未分化ES細胞をゼラチン被覆皿
上でオリゴの非存在下に72時間培養した。培地を除
き、定着した細胞に30μMのアンチセンスまたはセン
スp65を含む新しい培地を加えた。1つの区域に印を
つけて、光学分析のため直ちに(0時)および5時間後
に写真を撮った。最終的に、これらの細胞は12−14
時間以内に完全に離脱したが、p65センスもp50ア
ンチセンスオリゴも未分化ES細胞の接着に対し2週間
までの間何の影響も及ぼさなかった。
【0044】別の実験では、全RNAを単離し、p6
5、p50およびGAPDH発現についてRT−PCR
で分析した。RT−PCRによれば、未分化ES細胞と
分化ES細胞の両方において、p65アンチセンスの存
在下で72時間培養すると、p65アンチセンスオリゴ
はp65 mRNAの発現を阻止したが、p50の発現
とハウスキーピング酵素GAPDHの発現はこれらの細
胞において変わらなかった。同様に、p50アンチセン
スオリゴは、ES細胞の分化状態にかかわりなく、p5
0 mRNAの発現を阻止し、一方p65またはGAP
DH mRNAの発現はこれらの細胞において影響を受
けなかった。このような結果は、ES細胞接着に対する
p65およびp50アンチセンスオリゴの異なる効果が
それぞれのmRNA発現の選択的阻止によるものである
ことを示している。
5、p50およびGAPDH発現についてRT−PCR
で分析した。RT−PCRによれば、未分化ES細胞と
分化ES細胞の両方において、p65アンチセンスの存
在下で72時間培養すると、p65アンチセンスオリゴ
はp65 mRNAの発現を阻止したが、p50の発現
とハウスキーピング酵素GAPDHの発現はこれらの細
胞において変わらなかった。同様に、p50アンチセン
スオリゴは、ES細胞の分化状態にかかわりなく、p5
0 mRNAの発現を阻止し、一方p65またはGAP
DH mRNAの発現はこれらの細胞において影響を受
けなかった。このような結果は、ES細胞接着に対する
p65およびp50アンチセンスオリゴの異なる効果が
それぞれのmRNA発現の選択的阻止によるものである
ことを示している。
【0045】p65アンチセンスオリゴは種々の細胞系
および一次細胞の完全離脱を引き起こし、この効果は配
列および種に特異的であった。p50アンチセンスはこ
れらの細胞に何の影響も与えなかった(表2)。これら
の結果はNF−κBの多面的効果およびNF−κBのp
65サブユニットの細胞接着におけるより一層特異的な
役割を強く裏付けるものである。 表2 細胞系 細胞型 アンチセンスオリゴ 1,2,3 ネズミ 3T3 支持細胞(一次) 繊維芽細胞 m p65 RAT−1 繊維芽細胞 m p65 NIH 3T3 繊維芽細胞 m p65 S−17 骨髄間質細胞 m p65 PC−12 褐色細胞腫 m p65ヒト 一次HUVEC 内皮細胞 h p65 RHEK−1 上皮細胞 h p65 一次ケラチノサイト 上皮細胞 h p65 1)細胞接着に対するアンチセンスオリゴの阻止効果は種
特異的であった。2)対応するセンスオリゴヌクレオチド
は効果がなかった。3)p50センスまたはアンチセンス
オリゴはこれらの細胞の接着を阻止しなかった。表2.
p65に対するアンチセンスオリゴはさまざまな細胞系
の接着を阻止する。繊維芽細胞、間質細胞、ニューロン
細胞、内皮細胞および上皮細胞を含むネズミおよびヒト
起源の種々の細胞系を30μMのp65オリゴ(ネズミ
またはヒト)にさらし、48−72時間後に写真を撮っ
た。表示した細胞系のそれぞれの場合に、細胞接着に対
する著しい効果が観察された。
および一次細胞の完全離脱を引き起こし、この効果は配
列および種に特異的であった。p50アンチセンスはこ
れらの細胞に何の影響も与えなかった(表2)。これら
の結果はNF−κBの多面的効果およびNF−κBのp
65サブユニットの細胞接着におけるより一層特異的な
役割を強く裏付けるものである。 表2 細胞系 細胞型 アンチセンスオリゴ 1,2,3 ネズミ 3T3 支持細胞(一次) 繊維芽細胞 m p65 RAT−1 繊維芽細胞 m p65 NIH 3T3 繊維芽細胞 m p65 S−17 骨髄間質細胞 m p65 PC−12 褐色細胞腫 m p65ヒト 一次HUVEC 内皮細胞 h p65 RHEK−1 上皮細胞 h p65 一次ケラチノサイト 上皮細胞 h p65 1)細胞接着に対するアンチセンスオリゴの阻止効果は種
特異的であった。2)対応するセンスオリゴヌクレオチド
は効果がなかった。3)p50センスまたはアンチセンス
オリゴはこれらの細胞の接着を阻止しなかった。表2.
p65に対するアンチセンスオリゴはさまざまな細胞系
の接着を阻止する。繊維芽細胞、間質細胞、ニューロン
細胞、内皮細胞および上皮細胞を含むネズミおよびヒト
起源の種々の細胞系を30μMのp65オリゴ(ネズミ
またはヒト)にさらし、48−72時間後に写真を撮っ
た。表示した細胞系のそれぞれの場合に、細胞接着に対
する著しい効果が観察された。
【0046】実施例3 細胞接着に対するp65アンチセンスオリゴの効果を裏
付けるために、MAM−Neo−CATベクター(Nara
yanan et al. (1992)(前掲) )を利用して、PC−12
細胞の対照(センス)とアンチセンスの両方のトランス
フェクタントを確立し、デキサメタゾン誘導可能なp6
5アンチセンスRNAを発現する安定したPC−12細
胞系を使用した。いくつかの独立クローンにおいてデキ
サメタゾン誘導可能なp65アンチセンスRNAが高レ
ベルで検出された。対照のセンスクローンは、デキサメ
タゾン(1×10-6M)で72時間処理し、プレート
し、24時間後に写真を撮ったとき、細胞接着性に何の
変化も示さなかった。アンチセンスp65クローンはデ
キサメタゾンの非存在下では正常な形態を示した。しか
し、p65アンチセンスRNAのデキサメタゾン誘導に
より、これらの細胞におけるp65アンチセンスオリゴ
の効果と類似した、基層への細胞の接着に対する劇的な
効果が現れた。このようなアンチセンスクローンからデ
キサメタゾンを除去した後では、細胞は正常な形態に戻
った。
付けるために、MAM−Neo−CATベクター(Nara
yanan et al. (1992)(前掲) )を利用して、PC−12
細胞の対照(センス)とアンチセンスの両方のトランス
フェクタントを確立し、デキサメタゾン誘導可能なp6
5アンチセンスRNAを発現する安定したPC−12細
胞系を使用した。いくつかの独立クローンにおいてデキ
サメタゾン誘導可能なp65アンチセンスRNAが高レ
ベルで検出された。対照のセンスクローンは、デキサメ
タゾン(1×10-6M)で72時間処理し、プレート
し、24時間後に写真を撮ったとき、細胞接着性に何の
変化も示さなかった。アンチセンスp65クローンはデ
キサメタゾンの非存在下では正常な形態を示した。しか
し、p65アンチセンスRNAのデキサメタゾン誘導に
より、これらの細胞におけるp65アンチセンスオリゴ
の効果と類似した、基層への細胞の接着に対する劇的な
効果が現れた。このようなアンチセンスクローンからデ
キサメタゾンを除去した後では、細胞は正常な形態に戻
った。
【0047】p65アンチセンスオリゴによる細胞接着
の阻止は試験したさまざまな細胞型に適用でき、これは
細胞接着におけるNF−κB複合体の多面的な要求を裏
付けるものである。フィブロネクチン、ラミニンまたは
コラーゲンのようなECMは、NF−κB機能により調
節されるCAMの要求を満たすことができなかった。し
かし、支持細胞層の細胞溶解物により生成されたECM
は、細胞接着におけるNF−κB機能の要求を補う能力
をもっていた。このことは、NF−κB非依存性CAM
が細胞接着に関与している可能性を提起させるものであ
る。
の阻止は試験したさまざまな細胞型に適用でき、これは
細胞接着におけるNF−κB複合体の多面的な要求を裏
付けるものである。フィブロネクチン、ラミニンまたは
コラーゲンのようなECMは、NF−κB機能により調
節されるCAMの要求を満たすことができなかった。し
かし、支持細胞層の細胞溶解物により生成されたECM
は、細胞接着におけるNF−κB機能の要求を補う能力
をもっていた。このことは、NF−κB非依存性CAM
が細胞接着に関与している可能性を提起させるものであ
る。
【0048】デキサメタゾン依存性の基層への細胞接着
阻止は、誘導可能なp65アンチセンスRNAを高レベ
ルで発現する、安定したPC−12アンチセンストラン
スフェクタントにおいて観察された。p65に対するア
ンチセンスオリゴおよびアンチセンスRNAは、PC−
12細胞を基層から離脱した状態の凝集物として成長さ
せた。p65発現の抑制はこれらの細胞における細胞と
細胞の接着よりもむしろ細胞と基層の接着を妨害するよ
うだ。
阻止は、誘導可能なp65アンチセンスRNAを高レベ
ルで発現する、安定したPC−12アンチセンストラン
スフェクタントにおいて観察された。p65に対するア
ンチセンスオリゴおよびアンチセンスRNAは、PC−
12細胞を基層から離脱した状態の凝集物として成長さ
せた。p65発現の抑制はこれらの細胞における細胞と
細胞の接着よりもむしろ細胞と基層の接着を妨害するよ
うだ。
【0049】p50アンチセンスオリゴによるp50
mRNAの抑制は、劇的な効果が見られたES細胞系を
除いて、種々の細胞型に何の影響も与えなかった。未分
化ES細胞の接着はp50発現の抑制によって影響され
なかったが、分化したES細胞では、p50 mRNA
の抑制がp65アンチセンスの効果に匹敵する顕著な接
着阻止をもたらした。これらの結果は、分化したES細
胞では、NF−κBのp65サブユニットがp50以外
の他のサブユニットと複合体を形成しているか、あるい
はホモダイマーとして機能していることを示している。
これはさらに、さまざまな細胞型においてp65発現単
独の抑制が細胞接着に対し劇的な効果を誘起し得るとい
う本発明者らの観察により支持される。これらの条件の
もとではp50の発現は影響されなかった。かくして、
普通の細胞において、p65は細胞接着に関与する種々
の遺伝子の調節に極めて重要な機能を果たすことがで
き、そして単独では細胞質ゾル抑制タンパク質IκBと
複合体を形成した状態で存在できない(Baeuerle, P.A.
and D. Baltimore (1988) Science 242: 540-546 )。
mRNAの抑制は、劇的な効果が見られたES細胞系を
除いて、種々の細胞型に何の影響も与えなかった。未分
化ES細胞の接着はp50発現の抑制によって影響され
なかったが、分化したES細胞では、p50 mRNA
の抑制がp65アンチセンスの効果に匹敵する顕著な接
着阻止をもたらした。これらの結果は、分化したES細
胞では、NF−κBのp65サブユニットがp50以外
の他のサブユニットと複合体を形成しているか、あるい
はホモダイマーとして機能していることを示している。
これはさらに、さまざまな細胞型においてp65発現単
独の抑制が細胞接着に対し劇的な効果を誘起し得るとい
う本発明者らの観察により支持される。これらの条件の
もとではp50の発現は影響されなかった。かくして、
普通の細胞において、p65は細胞接着に関与する種々
の遺伝子の調節に極めて重要な機能を果たすことがで
き、そして単独では細胞質ゾル抑制タンパク質IκBと
複合体を形成した状態で存在できない(Baeuerle, P.A.
and D. Baltimore (1988) Science 242: 540-546 )。
【0050】実施例4 悪性細胞は腫瘍の進行中には低減した接着を示す(Ruos
lathi and Giancotti(前掲) ;Edelman et al. (1987 a
nd 1991), 前掲)。アンチセンスp65によるNF−κ
Bの抑制は腫瘍細胞の成長を阻止する。in vitro実験か
ら、ras形質転換細胞では、形質転換された表現型が
p65アンチセンスオリゴの使用により抑制されること
がわかった。この実験では、K−ras形質転換BAL
B/C3T3細胞(ATCC CCL 163.3)を
p65に対するセンスまたはアンチセンスオリゴで処理
し、そして軟質寒天でのそれらの成長を10日目に測定
した。次に、実施例3に記載した通りに作製した、デキ
サメタゾン誘導可能なベクターを利用するK−ras形
質転換BALB/C 3T3細胞の in vivo安定したセ
ンスおよびアンチセンスRNA発現細胞系を、腫瘍抑制
の証明のために用いた。対照のセンスクローンではな
く、アンチセンスクローンがp65 mRNA発現のデ
キサメタゾン依存性抑制を示し、寒天上にコロニーを形
成しなかった。K−ras mRNA発現はこれらのア
ンチセンスクローンにおいて阻害されなかった。
lathi and Giancotti(前掲) ;Edelman et al. (1987 a
nd 1991), 前掲)。アンチセンスp65によるNF−κ
Bの抑制は腫瘍細胞の成長を阻止する。in vitro実験か
ら、ras形質転換細胞では、形質転換された表現型が
p65アンチセンスオリゴの使用により抑制されること
がわかった。この実験では、K−ras形質転換BAL
B/C3T3細胞(ATCC CCL 163.3)を
p65に対するセンスまたはアンチセンスオリゴで処理
し、そして軟質寒天でのそれらの成長を10日目に測定
した。次に、実施例3に記載した通りに作製した、デキ
サメタゾン誘導可能なベクターを利用するK−ras形
質転換BALB/C 3T3細胞の in vivo安定したセ
ンスおよびアンチセンスRNA発現細胞系を、腫瘍抑制
の証明のために用いた。対照のセンスクローンではな
く、アンチセンスクローンがp65 mRNA発現のデ
キサメタゾン依存性抑制を示し、寒天上にコロニーを形
成しなかった。K−ras mRNA発現はこれらのア
ンチセンスクローンにおいて阻害されなかった。
【0051】最終的には、これらのアンチセンスRNA
発現クローンをヌードマウスに注入し、そのマウスをデ
キサメタゾンの存在下または非存在下で処理した。アン
チセンスクローンは、デキサメタゾンで処理したとき、
腫瘍形成の完全な欠如を示した。さらに、デキサメタゾ
ンの非存在下で維持したアンチセンスクローンからの腫
瘍保持マウスは、デキサメタゾン処理後に腫瘍の完全な
退行を示した。
発現クローンをヌードマウスに注入し、そのマウスをデ
キサメタゾンの存在下または非存在下で処理した。アン
チセンスクローンは、デキサメタゾンで処理したとき、
腫瘍形成の完全な欠如を示した。さらに、デキサメタゾ
ンの非存在下で維持したアンチセンスクローンからの腫
瘍保持マウスは、デキサメタゾン処理後に腫瘍の完全な
退行を示した。
【0052】より詳細には、対照のセンスクローンは、
デキサメタゾンの有無にかかわりなく、ヌードマウスの
注射部位に急速に増殖する腫瘍を7−10日以内に形成
し、そして2−4週間以内に大きな腫瘍を発生させた。
デキサメタゾンの存在下では、p65アンチセンス誘導
腫瘍はセンス誘導腫瘍よりもかなり遅く(4−6倍)増
殖した。さらに、デキサメタゾンの非存在下で2週間以
内にアンチセンスクローンから発生した腫瘍は、マウス
にデキサメタゾンを含む水を1−2週間投与したとき完
全に退行し、最高2か月間腫瘍のない状態を維持した。
これに対して、対照センスクローンから発生した腫瘍は
増殖し続け、4−6週間以内に宿主を死亡させた。
デキサメタゾンの有無にかかわりなく、ヌードマウスの
注射部位に急速に増殖する腫瘍を7−10日以内に形成
し、そして2−4週間以内に大きな腫瘍を発生させた。
デキサメタゾンの存在下では、p65アンチセンス誘導
腫瘍はセンス誘導腫瘍よりもかなり遅く(4−6倍)増
殖した。さらに、デキサメタゾンの非存在下で2週間以
内にアンチセンスクローンから発生した腫瘍は、マウス
にデキサメタゾンを含む水を1−2週間投与したとき完
全に退行し、最高2か月間腫瘍のない状態を維持した。
これに対して、対照センスクローンから発生した腫瘍は
増殖し続け、4−6週間以内に宿主を死亡させた。
【0053】p65アンチセンスRNAについての腫瘍
形成結果に基づいて、ネズミアンチセンスp65オリゴ
がヌードマウスの腫瘍治療に用いられた。2通りのオリ
ゴヌクレオチド投与方法を採用した:皮下、1回の注射
につき1.4mgのオリゴヌクレオチドの2回の週療
法、および2.8mgのオリゴヌクレオチドを含む時間
放出(14日)Alzaポンプ(Alza Corporation, Pa
lo Alto, Calif. )。2種類のネズミ腫瘍細胞系:K−
BALB(線維肉腫)およびB−16(メラノーマ)細
胞(ATCC CRL 6322)を選択し、この両方
とも注射部位に浸潤性の腫瘍を形成する。これらの腫瘍
はどちらの投与方法でもセンスオリゴ処理マウスにおい
て急速に増殖した。これに対して、アンチセンスp65
処理マウスの70%以上は腫瘍の大きさが明らかに縮小
した(3−5倍)。B−16メラノーマを有する非免疫
弱体化同系マウスでは、アンチセンスp65オリゴヌク
レオチド治療に応答して、腫瘍サイズの同様の縮小が見
られた。センスオリゴで処理したヌードマウスから切除
されたB−16メラノーマにはp65 mRNAの発現
が見られたが、アンチセンスオリゴで処理したマウスか
らのメラノーマには見られなかった。NF−κB様の結
合活性が対照のp65センスオリゴヌクレオチドで処理
したK−BALB細胞とB−16細胞の両方の核抽出物
中に検出され、この活性は30倍過剰モルの非標識オリ
ゴヌクレオチドにより競合された。対照的に、この活性
はp65アンチセンスオリゴ処理細胞では有意に抑制さ
れた。放射性標識したp65センスおよびp65アンチ
センスオリゴを用いた実験では、注射の72時間後に腫
瘍中に2−4%の放射能が検出された。アンチセンスp
65オリゴ処理マウスにおいて、血液学、血清化学また
は骨髄の有意な変化が2週間の処理期間にわたって観察
されることはなかった。
形成結果に基づいて、ネズミアンチセンスp65オリゴ
がヌードマウスの腫瘍治療に用いられた。2通りのオリ
ゴヌクレオチド投与方法を採用した:皮下、1回の注射
につき1.4mgのオリゴヌクレオチドの2回の週療
法、および2.8mgのオリゴヌクレオチドを含む時間
放出(14日)Alzaポンプ(Alza Corporation, Pa
lo Alto, Calif. )。2種類のネズミ腫瘍細胞系:K−
BALB(線維肉腫)およびB−16(メラノーマ)細
胞(ATCC CRL 6322)を選択し、この両方
とも注射部位に浸潤性の腫瘍を形成する。これらの腫瘍
はどちらの投与方法でもセンスオリゴ処理マウスにおい
て急速に増殖した。これに対して、アンチセンスp65
処理マウスの70%以上は腫瘍の大きさが明らかに縮小
した(3−5倍)。B−16メラノーマを有する非免疫
弱体化同系マウスでは、アンチセンスp65オリゴヌク
レオチド治療に応答して、腫瘍サイズの同様の縮小が見
られた。センスオリゴで処理したヌードマウスから切除
されたB−16メラノーマにはp65 mRNAの発現
が見られたが、アンチセンスオリゴで処理したマウスか
らのメラノーマには見られなかった。NF−κB様の結
合活性が対照のp65センスオリゴヌクレオチドで処理
したK−BALB細胞とB−16細胞の両方の核抽出物
中に検出され、この活性は30倍過剰モルの非標識オリ
ゴヌクレオチドにより競合された。対照的に、この活性
はp65アンチセンスオリゴ処理細胞では有意に抑制さ
れた。放射性標識したp65センスおよびp65アンチ
センスオリゴを用いた実験では、注射の72時間後に腫
瘍中に2−4%の放射能が検出された。アンチセンスp
65オリゴ処理マウスにおいて、血液学、血清化学また
は骨髄の有意な変化が2週間の処理期間にわたって観察
されることはなかった。
【0054】
(1)一般情報 (i)出願人: (A)名称:エフ・ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (B)通り:グレンツァーヘルストラッセ (C)都市:バーゼル (D)州:BS (E)国:スイス国 (F)郵便番号 (ZIP):CH-4002 (G)電話:061-688 25 11 (H)テレファックス:061-688 13 95 (I)テレックス:962292/965542 hlr c (ii)発明の名称:NF−κBアンチセンスポリヌクレ
オチド (iii)配列の数:4 (iv)コンピュータ読取り可能形態: (A)媒体型:フロッピーディスク (B)コンピュータ:IBM PC互換機 (C)操作システム:PC−DOS/MS−DOS (D)ソフトウェア:パテントイン リリーズ#1.
0,バージョン#1.25(EPO) (vi)先行出願データ: (A)出願番号:US07/950531 (B)出願日:23−SEP−1992 (2)配列番号:1の情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:21塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:cDNA (iii)ハイポセティカル:NO (iv)アンチセンス:NO (xi)配列の記載:配列番号:1:
オチド (iii)配列の数:4 (iv)コンピュータ読取り可能形態: (A)媒体型:フロッピーディスク (B)コンピュータ:IBM PC互換機 (C)操作システム:PC−DOS/MS−DOS (D)ソフトウェア:パテントイン リリーズ#1.
0,バージョン#1.25(EPO) (vi)先行出願データ: (A)出願番号:US07/950531 (B)出願日:23−SEP−1992 (2)配列番号:1の情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:21塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:cDNA (iii)ハイポセティカル:NO (iv)アンチセンス:NO (xi)配列の記載:配列番号:1:
【0055】
【化2】
【0056】(2)配列番号:2の情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:21塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:cDNA (iii)ハイポセティカル:NO (iv)アンチセンス:NO (xi)配列の記載:配列番号:2:
【0057】
【化3】
【0058】(2)配列番号:3の情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:21塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:DNA (iii)ハイポセティカル:NO (iv)アンチセンス:YES (xi)配列の記載:配列番号:3:
【0059】
【化4】
【0060】(2)配列番号:4の情報 (i)配列の特徴: (A)配列の長さ:21塩基対 (B)配列の型:核酸 (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:DNA (iii)ハイポセティカル:NO (iv)アンチセンス:YES (xi)配列の記載:配列番号:4:
【0061】
【化5】
フロントページの続き (72)発明者 クレイグ アラン ローゼン アメリカ合衆国 07028 ニュージャージ ー州 グレン リッジ,ウィンザー プレ イス 78
Claims (13)
- 【請求項1】 ヒトNF−κB転写因子をコードする遺
伝子の一部分にハイブリダイズし得る能力により特徴づ
けられるヌクレオチド配列から成るか、または該ヌクレ
オチド配列を含むオリゴヌクレオチドであって、該遺伝
子の一部分にハイブリダイズしたとき、NF−κB転写
因子の合成を妨げる上記オリゴヌクレオチド。 - 【請求項2】 NF−κB転写因子をコードする遺伝子
がmRNAである、請求項1記載のオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項3】 長さが5−50ヌクレオチドである、請
求項1または2記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項4】 NF−κB転写因子サブユニットp65
の遺伝子の一部分が配列番号:1に示された配列または
その相補配列を有する、請求項1−3のいずれか1つに
記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項5】 オリゴヌクレオチドが配列番号:3に示
された配列または配列番号:1の配列を有するその相補
配列を含む、請求項1−4のいずれか1つに記載のオリ
ゴヌクレオチド。 - 【請求項6】 NF−κB転写因子サブユニットp50
の遺伝子の一部分が配列番号:2に示された配列または
その相補配列を有する、請求項1−3のいずれか1つに
記載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項7】 オリゴヌクレオチドが配列番号:4に示
された配列または配列番号:2の配列を有するその相補
配列を含む、請求項1、2、3または6記載のオリゴヌ
クレオチド。 - 【請求項8】 ヌクレオチドが式−O−P(=O)
(Y)−O−のホスフェート基(ここでYはメチル、酸
素および硫黄より成る群から選ばれる)により連結され
る、請求項1−7のいずれか1つに記載のオリゴヌクレ
オチド。 - 【請求項9】 疾病の治療において治療上有効な化合物
として使用するための請求項1−8のいずれか1つに記
載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項10】 固相合成により合成され、固体支持体に
結合された対応するヌクレオチド配列の保護されたオリ
ゴヌクレオチドを脱保護し、固体支持体から切り離し、
所望により修飾することを特徴とする、請求項1−8の
いずれか1つに記載のオリゴヌクレオチドの調製方法。 - 【請求項11】 請求項1−8のいずれか1つに記載のオ
リゴヌクレオチド少なくとも1種および場合により治療
上許容される担体物質を含む医薬組成物。 - 【請求項12】 医薬組成物を調製するための請求項1−
8のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチドの使用。 - 【請求項13】 疾病の治療に用いる医薬を製造するため
の請求項1−8のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオ
チドの使用。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US95053192A | 1992-09-23 | 1992-09-23 | |
US950531 | 1992-09-23 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH06209778A true JPH06209778A (ja) | 1994-08-02 |
Family
ID=25490552
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5236828A Pending JPH06209778A (ja) | 1992-09-23 | 1993-09-22 | NF−κBアンチセンスポリヌクレオチド |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5591840A (ja) |
EP (1) | EP0589330A3 (ja) |
JP (1) | JPH06209778A (ja) |
CN (1) | CN1084564A (ja) |
AU (1) | AU673537B2 (ja) |
CA (1) | CA2105595A1 (ja) |
NZ (1) | NZ248691A (ja) |
ZA (1) | ZA936838B (ja) |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JPH0959151A (ja) * | 1995-08-24 | 1997-03-04 | Kao Corp | NF−κB活性化抑制剤 |
JP2003518507A (ja) * | 1999-12-24 | 2003-06-10 | シノヴィス・リミテッド | 免疫系の活性化および阻害 |
US7585848B2 (en) | 2005-01-11 | 2009-09-08 | Rush University Medical Center | Methods and compositions for treating, inhibiting and reversing disorders of the intervertebral disc |
US7871983B2 (en) | 1995-05-12 | 2011-01-18 | Anges Mg Inc. | Remedy and preventive for diseases caused by NF-κB |
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