JPH08500736A - 細胞接着のオリゴヌクレオチド調節 - Google Patents

細胞接着のオリゴヌクレオチド調節

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Abstract

(57)【要約】 細胞間接着分子の合成もしくは代謝の調節を介する治療およびそのような治療を施すことができる疾患の診断のための組成物および方法が提供される。好ましい態様に従うと、細胞間接着分子−1、血管細胞接着分子−1、および内皮白血球接着分子−1をコード化する核酸と特異的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドが提供される。このオリゴヌクレオチドは、該特異的ハイブリッド形成に効果を与えるに十分な同一性および数のヌクレオチドを含む。他の好ましい態様においては、オリゴヌクレオチドは、転写開始部位、翻訳開始部位、5’−非翻訳配列、3’−非翻訳配列、および介在配列と特異的にハイブリッド形成することが可能である。前述の蛋白質の内の一つに対応するRNAもしくはDNAと特異的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドでの細胞接着性蛋白質の調節による治療介入を施すことが可能な疾患を患う動物を治療する方法が開示される。細胞接着性分子の調節に反応性を示す疾患の治療のための方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞接着のオリゴヌクレオチド調節 発明の分野 本発明は、細胞接着分子の合成もしくは代謝の調節に反応する疾患状態のため の診断法、研究用試薬、および治療法に関する。本発明は具体的には、白血球細 胞の他の白血球細胞および他の細胞種への接着を調節する蛋白質の合成に関与す る所定のメッセンジャーリボ核酸(mRNA)もしくはDNAとのアンチセンス オリゴヌクレオチド相互作用に関する。細胞間接着分子−1(ICAM−1)、 内皮白血球接着分子−1(E−セレクチンとしても知られるELAM−1)、お よび血管細胞接着分子−1(VCAM−1)をコードするmRNAにハイブリダ イズするように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。これ らのオリゴヌクレオチドはRNAもしくはDNAの活性調節を誘導し、そしてそ のことにより特異的細胞接着分子の合成および代謝の調節を誘導することが見い だされた。 発明の背景 炎症は、損傷、感染、もしくは組織破壊に反応する組織により誘導される局所 的防御反応であり、これにより感染性もしくは損傷性作用物質の破壊および損傷 を受けた組織の分離がもたらされる。典型的な炎症反応は次に示すように進行す る。外因性物質としての抗原の認識もしくは組織損傷の認識、可溶性炎症性媒介 物質の合成および放出、感染もしくは組織損傷の部位への炎症細胞の補充、侵略 生体物もしくは損傷組織の破壊および除去、ならびに一度侵略生体物もしくは損 傷組織が分解された直後のその系の非活性化である。炎症性構成成分に係わるヒ トの疾患の多くのものにおいては炎症反応を弱める正常なホメオスタシス機構が 欠損しており、このことにより正常組織の損傷および破壊がもたらされる。 細胞−細胞相互作用は、先に記載の各段階における免疫反応の活性に係わって いる。正常な炎症反応における最も初期の検出可能なできごとの内の一つは血管 内皮への白血球の接着であり、この後に、血管系を出て炎症もしくは損傷部位へ と向かう白血球の遊走が続く。これらの白血球(leukocytes)、すな わち白血球(white blood cells)の血管内皮への接着は、血 管系外への遊走における必須段階である。Harlan J.M.、Blood 1985、65、513−525。一般的には、炎症部位に出現する最初の炎 症細胞は好中球であり、この後に単球、そして白血球が続く。細胞−細胞相互作 用もB−白血球とT−白血球の両方の増殖にとって重要であり、これにより各々 体液性反応および細胞性免疫反応の亢進がもたらされる。 血管内皮および他の細胞種への白血球の接着は、白血球細胞と血管内の両方の 原形質膜上に存在する「接着分子」と称される特異的蛋白質間の相互作用により 媒介される。接着分子間の相互作用は、リガンドが可溶性である代わりに細胞表 面に固定化されていることを除外しては古典的なレセプター−リガンド相互作用 に類似している。白血球接着における遺伝子欠損を有する患者を同定することに より、研究者は白血球の接着の原因となる一群の蛋白質を同定することが可能と なる。白血球接着欠損症(LAD)は、再発性細菌感染、および悪性膿形成、お よび創傷治癒により特徴付けられる稀な常染色体特性である。この欠損症は、通 常白血球の細胞外膜上に発現するMac−1、LFA−1、およびp150,9 5という3つのヘテロ二量体糖蛋白質の共通なB−サブユニット中に生じること が示されている。AndersonおよびSpringer、Ann.Rev. Med.1987、38、175−194。LADを患う患者は、顆粒球、単球 、および白血球の広範な接着依存性機能スペクトラムの欠損を示す。LFA−1 については3つのリガンドが同定されており、それらは細胞間接着分子1、2、 および3(ICAM−1、ICAM−2、およびICAM−3)である。Mac −1およびp150,95の両方共が補体断片C3bi、および恐らく他の未同 定リガンドに結合する。MAC−1もやはりICAM−1に結合する。 白血球の血管内皮への接着および後続の血管系外への遊走に関与する他の接着 分子が同定されている。これらには、内皮白血球接着分子−1(ELAM−1) 、血管細胞接着分子−1(VCAM−1)、顆粒膜蛋白質−140(GMP−1 40)、およびそれら各々のレセプターがある。血管内皮への白血球の接着は、 部 分的にもしくは全て5つの細胞接着分子、ICAM−1、ICAM−2、ELA M−1、VCAM−1、およびGMP−140により媒介されているようである 。DustinおよびSpringer、J.Cell Biol. 1987 、107、321−331。接着分子ICAM−1、ELAM−1、VCAM− 1、およびGMP−140の細胞表面上での発現は炎症性刺激により誘導される 。それとは対照的に、ICAM−2の発現は構成的であり、そしてサイトカイン による誘導に感受性を示さないように思われる。一般的にGMP−140はヒス タミン、ロイコトリエンB4、血小板活性化因子、およびトロンビンのようなオ ータコイドにより誘導される。内皮細胞上での最大発現は刺激後30分から1時 間目までに観察され、そして基準線には2−3時間以内に戻る。内皮細胞上での ELAM−1およびVCAM−1の発現は、インターロイキン−1βおよび腫瘍 壊死因子のようなサイトカインにより誘導されるが、ガンマー−インターフェロ ンによっては誘導されない。内皮細胞表面上でのELAM−1の最大発現は剌激 後4−6時間目に生じ、そして16時間目までには基準線に戻る。ELAM−1 発現は新しいmRNAおよび蛋白質合成に依存している。VCAM−1発現の増 大は腫瘍壊死因子での処理後2時間目に検出可能となり、刺激後8時間目で最大 値を示し、そして刺激後少なくとも48時間は増大したままになる。Riceお よびBevilacqua、Science、1989、246、1303−1 306。内皮細胞上でのICAM−1発現は、サイトカインであるインターロイ キン−1、腫瘍壊死因子、およびガンマー−インターフェロンにより誘導される 。ELAM−1の最大発現に続くICAM−1の最大発現は、刺激後8−10時 間目に生じ、そして少なくとも48時間は上昇したままになる。 GMP−140およびELAM−1は主に血管内皮細胞への好中球の接着に関 与している。VCAM−1は主にTおよびB白血球に結合する。その上VCAM −1は黒色腫および恐らくは他の癌の転移における役割を担っている可能性があ る。ICAM−1は血管内皮への好中球の接着、ならびに血管内皮、組織繊維芽 細胞、および上皮ケラチノサイトへの単球の接着における役割を担っている。I CAM−1もやはり抗原提示細胞のT−細胞認識、ナチュラルキラー細胞による 標的細胞の溶菌、白血球の活性化および増殖、ならびに胸腺におけるT細胞成熟 における役割を担っている。その上最近のデータにより、ICAM−1は、一般 の風邪の50%を上回る割合を占めるライノウイルスの主要血清型の細胞性レセ プターであることが示されている。Staunton et al.、Cell 1989、56、849−853;Grave et al.、Cell 1 989、56、839−847。 ICAM−1発現は、アレルギー性接触性皮膚炎、固定薬疹、偏平苔癬、およ び乾癬のような種々の炎症性皮膚疾患に関連している。Ho et al.、J . Am.Acad.Dermatol. 1990、22、64−68;Gr iffithsおよびNickoloff、Am.J.Pathology 1 989、135、1045−1053;Lisby et al.、Br.J. Dermatol.1989、120、479−484;Shiohara e t al.、Arch. Dermatol.1989、125、1371−1 376。の上ICAM−1発現は、リューマチ性関節炎を患う患者の滑液;Ha le et al.、Arth.Rheum. 1989、32、22−30、 糖尿病患者の牌臓B−細胞;Campbell et al.、Proc.Na tl.Acad.Sci.U.S.A. 1989、86、4282−4286 ;グレービス氏疾患(Graves’ disease)を患う患者における胸 腺小胞細胞;Weetman et al.、J.Endocrinol. 1 989、122、185−191、ならびに腎臓および同種異系肝臓移植片拒絶 ;FaullおよびRuss、Tansplantation 1989、48 、226−230;Adams et al.、Lancet 1989、11 22−1125、において検出されている。 ICAM−1、VCAM−1、およびELAM−1発現の阻害剤により、喘息 、リューマチ性関節炎、同種異系移植片拒絶、炎症性腸疾患、種々の皮膚科的症 状、および乾癬のような種々の炎症性疾患もしくは炎症性成分に関する疾患に対 する活性を有する治療用の種類の新規の抗−炎症剤が提供されることが望まれて いた。その上ICAM−1、VCAM−1、およびELAM−1の阻害剤は、ラ イノウイルス感染に起因する風邪、AIDS、カポジ肉腫、ならびにある種の癌 およびそれらの転移にも有効である可能性がある。細胞性接着分子であるELA M−1、 VCAM−1、およびICAM−1の発現を効果的に予防する治療剤は、今日ま でには知られていない。動物モデルにおけるICAM−1に対する中和用モノク ローナル抗体の利用により、もし同定されたとしたらこのような阻害剤は、喘息 ;Wegner et al.、Science 1990、247、456− 459、腎臓同種異系移植片;Cosimi et al.、J.Immuno 1. 1990、144、4604−4612、および心臓同種異系移植片;I sobe et al.、Science 1992、255、1125−11 27についての治療面での利益をもたらすであろうという証拠が提供されている 。ICAM−1分子の可溶性形態の利用も、培養物中の細胞のライノウイルス感 染の予防に有効であった。Marlin et al.、Nature 199 0、344、70−72。 細胞間接着分子について影響を与える現行の作用物質には、合成ペプチド、モ ノクローナル抗体、および接着分子の可溶化形態がある。VCAM−1もしくは ELAM−1との相互作用を遮断する合成ペプチドは今日までには同定されてい ない。モノクローナル抗体は、ICAM−1、VCAM−1、およびELAM− 1の発現に起因する急性炎症性反応の治療に有用であることが証明される可能性 がある。しかしながら慢性的治療に関しては、宿主動物はそのモノクローナル抗 体に対する抗体を生じさせ、それらの抗体の有用性を制限する。その上モノクロ ーナル抗体は大きな蛋白質であり、このことが炎症性部位へのアクセスを困難に してしまう可能性がある。細胞接着分子の可溶化形態は、それらの生産費用がか さみ、そして結合親和性が低いことに加え、モノクローナル抗体のものと同様の 数多くの制限を課せられている。従って、細胞間接着分子を効果的に阻害する分 子が長いこと望まれてきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ICAM−1 、VCAM−1、およびELAM−1の効果を遮断するのに用いられる現行の作 用物質の多くの落とし穴を回避する。 米国PCT出願第90/02357号(Hession et al.)は、 ELAM−1、ならびにVCAM−1およびVCAM−1bを初めとする内皮接 着分子(ELAMs)をコードするDNA配列を開示している。これらのDNA 配列の数々の利用法が提供され、それには、(1)内皮細胞への白血球結合を阻 害する治療剤として使用することができる、これらの分子に反応性を示すモノク ローナル抗体調製物の製造、(2)白血球上のELAMリガンドに結合し、次に は内皮細胞上のELAMに結合することができて、内皮細胞への白血球結合を阻 害するELAMペプチドの製造、(3)炎症を検出するための、ELAMに結合 する分子の利用(抗−ELAM抗体、もしくはリガンドもしくはその断片のよう な標識)、(4)アンチセンス核酸でMRNAをマスクするか、あるいはリボザ イムでそれを開裂するかのいずれかにより特異的MRNAの翻訳を遮蔽する目的 でアンチセンス核酸およびリボザイムを使用する、翻訳レベルでELAMもしく はELAMリガンド発現に介在する核酸分子を産生するためのELAMおよびE LAMリガンドDNA配列の利用、がある。コーディング領域が最適の標的であ ることが開示されている。VCAM−1についてはAUGが最もそれらしく思わ れており、そのためAUG部分にハイブリダイズする15量体が実施例17にお いて具体的に開示されている。 発明の目的 炎症性細胞接着分子の合成および発現における二次効果を介する、免疫学的構 成成分に関する疾患、同種異系移植片、癌および転移、炎症性腸疾患、乾癬、お よび他の皮膚疾患、風邪、およびAIDSのための治療を提供することは、本発 明の主な目的である。 細胞間接着性蛋白質をコードする核酸の機能を阻害することが可能なアンチセ ンスオリゴヌクレオチドを提供することは、本発明の別の目的である。 細胞間接着の機能不全の診断のための方法を提供することは、更に別の目的で ある。 本発明のこれらの目的および他の目的は、本明細書を精査することにより明ら かになるであろう。 図面の簡単な記述 図1は、ヒトの細胞間接着分子−1(ICAM−1)のmRNA配列である。 図2は、ヒトの内皮白血球接着分子−1(ELAM−1)のmRNA配列であ る。 図3は、ヒトの血管細胞接着分子−1(VCAM−1)のmRNA配列である 。 図4は、インターロイキン−1および腫瘍壊死因子による種々のヒト細胞株の 細胞表面におけるICAM−1発現の誘導のグラフ表示である。 図5は、ヒト臍静脈内皮細胞上のICAM−1発現に対する選択されたアンチ センスオリゴヌクレオチドの効果のグラフ表示である。 図6Aおよび6Bは、腫瘍壊死因子およびインターロイキン−1で刺激したヒ ト臍静脈内皮細胞でのICAM−1の発現に対するアンチセンスオリゴヌクレオ チドの効果のグラフ表示である。 図7は、DMSOでの分化処理を施したHL−60細胞の、対照および腫瘍壊 死因子処理を施したヒト臍静脈内皮細胞へのICAM−1介在性接着に対するア ンチセンスオリゴヌクレオチドの効果のグラフ表示である。 図8は、A549ヒト肺癌細胞でのICAM−1発現に対する選択されたアン チセンスオリゴヌクレオチドの効果のグラフ表示である。 図9は、ヒトの初代ケラチノサイトでのICAM−1発現に対する選択された アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果のグラフ表示である。 図10は、オリゴヌクレオチの鎖長、TmおよびICAM−1発現の阻害に対 する効果の間の関係のグラフ表示である。 表11は、DMSOでの分化処理を施したHL−60細胞の、対照および腫瘍 壊死因子処理を施したヒト臍静脈内皮細胞へのICAM−1介在性接着に対する 選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果のグラフ表示である。 図12は、腫瘍壊死因子での処理を施したヒト臍静脈内皮細胞でのELAM− 1発現に対する選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果のグラフ表示 である。 図13は、ヒトELAM−1 mRNAのグラフ表示であり、アンチセンスオ リゴヌクレオチドの標的部位を示してある。 図14は、ヒトVCAM−1 mRNAのグラフ表示であり、アンチセンスオ リゴヌクレオチドの標的部位を示してある。 図15は、ICAM−1に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理 後のC8161ヒト黒色腫細胞におけるICAM−1発現の阻害を示す線グラフ である。 図16は、硫酸デキストラン(DSS)により誘導した炎症性腸疾患について のISIS 3082の効果を示す棒グラフである。 発明の要約 本発明に従うと、細胞間接着分子−1(ICAM−1)、血管細胞接着分子− 1(VCAM−1)、および内皮白血球接着分子−1(ELAM−1)をコード する核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが提供される。この オリゴヌクレオチドは直接mRNAに、あるいは三重鎖構造を形成する選択され たDNA部分のいずれかに結合し、このことによりその遺伝子から生ずるmRN Aの量を調節するように設計されている。 前述の関係は、一般的には「アンチセンス」として表示される。このオリゴヌ クレオチドは、RNAもしくはDNAの機能、つまり蛋白質への翻訳、もしくは 細胞質内への輸送、もしくはその総体的生物学的機能に必要な他のいずれかの活 性の内のどれかを阻害することが可能である。RNAもしくはDNAがその機能 の全てもしくは一部分を実行できないために、細胞接着分子が正しく発現される ように調節するゲノムの一部分の欠損がもたらされ、このことにより、該代謝が 調節される。 アンチセンスの攻撃については特異的遺伝子を標的とすることが好ましい。I CAM−1、VCAM−1、およびELAM−1をコードする遺伝子がこの研究 法にとって特に有用であることを、我々は発見した。ICAM−1、VCAM− 1、およびELAM−1発現の阻害は、炎症性疾患、炎症性構成成分に関する疾 患、同種異系移植片拒絶、乾癬、および他の皮膚疾患、炎症性腸疾患、癌および その転移、ならびにウイルス感染の治療に有効であることが期待される。 動物を、細胞接着を調節することが可能な蛋白質をコードする核酸とハイブリ ダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドに接触させることを含む、細胞接着 の調節の方法が提供される。ICAM−1、VCAM−1、およびELAM−1 をコードするRNAもしくはDNAとハイブリダイズすることが可能なオリゴヌ クレオチドが好ましい。診断のための方法も本発明の一部分である。 好ましい態様の詳細な記述 アンチセンスオリゴヌクレオチドには、ヒトについての多くの疾患の治療のた めの治療剤としての偉大な可能性が存在する。オリゴヌクレオチドは、ワトソン −クリックの塩基対形成により特定されるように、前−mRNAもしくは成熟し たmRNAのいずれかの相補的配列に特異的に結合してDNAから蛋白質への遺 伝情報の流れを阻害する。アンチセンスオリゴヌクレオチドの特性はそれら自体 をそれらの標的配列にとって特異的なものにしているが、そのような特性は、そ れらを極端に多目的なものにもしている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは4 つの単量体単位からなる長い鎖であるため、それらをどのような標的RNA配列 についても容易に合成することができる。多大な数にのぼる最近の研究により、 標的蛋白質を研究するための生化学的道具としてのアンチセンスオリゴヌクレオ チドの利用性が証明されている。Rothenberg et al.、J.N atl.Cancer Inst. 1989、81、1539−1544;Z on、 G.Pharmaceutical Res. 1988、5、539 −549。細胞取り込みの増加を示すヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドの合 成における最近の進歩のため、現在では新規の形態の治療法としてのアンチセン スオリゴヌクレオチドの利用を考案することが可能となっている。 アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、従来の技術の研究法で直面していた 問題に対する理想的解決法が与えられる。所定のイソ酵素を選択的に阻害するよ うにそれらを設計することができ、それらはその酵素の産生を阻害し、そしてそ れらは複数のレセプターを捕捉するもしくはそれに結合する遊離ラジカルのよう な非特異的機構を回避する。酵素機構もしくはレセプター−リカント相互作用を 完全に理解することは、特異的阻害剤の設計には必要でない。 標的の記述 好中球の炎症性部位内への急性浸潤は、内皮細胞表面におけるGMP−140 、ELAM−1、およびICAM−1の発現の増大に起因するものと思われる。 炎 症反応の後期段階中の白血球および単球の出現はVCAM−1およびICAM− 1により媒介されるものと思われる。ELAM−1およびGMP−140は血管 内皮細胞上で一時的に発現されるのに対し、VCAM−1およびICAM−1は 慢性的に発現される。 ヒトICAM−1は、55,219ダルトンの蛋白質の合成をもたらす3.3 kbのmRNAによりコードされている(図1)。ICAM−1はN−結合型グ リコシル化部位を介して、かなりの量がグリコシル化されている。SDS−ポリ アクリルアミドゲル電気泳動により決定したところ、成熟蛋白質は90kDaと いう見かけ上の分子量を有している。Saunton et al.、Cell 1988、52、925−933。ICAM−1は、イムノグロブリンスーパ ー遺伝子ファミリーの一員であり、アミノ末端に5つの免疫グロブリン様ドメイ ンを有し、その後には貫膜ドメインおよび細胞質ドメインが続く。LFA−1お よびライノウイルスについての一次結合部位は、最初の免疫グロブリン様ドメイ ン中に見いだされている。しかしながらこの結合部位は特殊なもののように思わ れる。Staunton et al.、Cell 1990、61、243− 354。電子顕微鏡による最近の研究により、ICAM−1は18.7nmの長 さで2−3nm直径の折れ曲がった棹のような構造であることが証明されている 。Staunton et al.、Cell 1990、61、243−25 4。 ICAM−1は広範な組織および細胞分布を示し、そして白血球細胞、内皮細 胞、繊維芽細胞、ケラチノサイト、および他の上皮細胞において見いだすことが できる。血管内皮細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイト、神経膠星状細胞、および 数種の細胞株については、ICAM−1の発現を、細菌性リポ多糖、ならびにイ ンターロイキン−1、腫瘍壊死因子、ガンマー−インターフェロン、およびリン ホトキシンのようなサイトカインでの処理により調節することができる。例えば 、Frohman et al.、J. Neuroimmunol.1989 、23、117−124、を参照せよ。サイトカイン処理後のICAM−1の発 現増大についての分子機構はいまだに決定されていない。 ELAM−1は、膜糖蛋白質のセレクチンファミリーの一員である115−k Daの膜糖蛋白質である(図2)。Bevilacqua et al.、Sc ience 1989、243、1160−1165。ELAM−1のアミノ末 端領域にはレクチン−様蛋白質の一員と相同性を有する配列が含まれており、そ の次には表皮成長因子に類似するドメインが続き、その次には補体レセプター1 および2において見いだされるものに類似する六縦列をなす60−アミノ酸反復 構造が続く。これらの特色はGMP−140、および白血球ホーミング抗原(h oming antigen)であるMEL14抗原にも共通している。ELA M−1は3.9−kbのmRNAによりコードされる。ELAM−1のmRNA の3’−非翻訳領域には、細胞性mRNAの迅速な物質交代の原因となる配列モ チーフATTTAが幾つか含まれており、このことはELAM−1発現が一時的 であるという特徴に矛盾しない。 ELAM−1は、それが血管内皮細胞においてのみ同定されるに過ぎず、限定 された細胞分布を示す。ICAM−1と同様にELAM−1は、腫瘍壊死因子、 インターロイキン−1、およびリンホトキシンを初めとする数々のサイトカイン 、ならびに細菌性リポ多糖により誘導される。ICAM−1とは対照的に、EL AM−1はガンマー−インターフェロンによっては誘導されない。Bevila cqua et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1 987、84、9238−9242;Wellicome et al.、J. Immunol.1990、144、2558−2565。ヒトの臍静脈内皮細 胞内でのELAM−1 mRNAの誘導および消失の動態は、その細胞表面での ELAM−1の出現および消失より先に生じる。ICAM−1に関してと同様に 、ELAM−1についての分子機構は解明されていない。 VCAM−1は3.2−kbのmRNAによりコードされる110−kDaの 膜糖蛋白質である(図3)。VCAM−1は、6つか7つかのいずれかの免疫グ ロブリンドメインを有する産物を産生するための二者択一的スプライシングを受 けることができる単一コピー遺伝子によりコードされるように思われる。Osb orn et al.、Cell 1989、59、1203−1211。VC AM−1へのラモス細胞(Ramos cells)の接着を遮断するCD29 に対するモノクローナル抗体の能力により示されるように、VCAM−1につい てのレセプターはCD29(VLA−4)であることが提唱される。VCAM− 1は血管内皮細胞上にまず最初に発現される。ICAM−1およびELAM−1 と同様に、血管内皮上のVCAM−1の発現はサイトカインでの処理により制御 される。RiceおよびBevilacqua、Science 1989、2 46、1303−1306;Rice et al.、J.Exp.Med.1 990、171、1369−1374。発現増加はmRANの誘導に起因するも のと思われる。 治療法については、ICAM−1、VCAM−1、およびELAM−1の発現 を低下させることにより治療することが可能な疾患を有する疑いのある動物を、 本発明に従うオリゴヌクレオチドを投与することにより治療する。オリゴヌクレ オチドは薬剤学的組成物中に調剤することができ、この薬剤学的組成物はこのオ リゴヌクレオチドの他に、担体、増粘剤、賦形剤、緩衝液、保存料、界面活性剤 、リポソーム、もしくは脂質製剤などを含むことができる。薬剤学的組成物はこ のオリゴヌクレオチドの他に、抗生物質、抗−炎症剤、および麻酔剤などのよう な一つもしくは複数の活性成分をも含むことができる。 薬剤学的組成物は、局所的もしくは全身的治療のいずれが所望されるかに依存 して、そして治療すべき領域に依存して数々の方法において投与することができ る。投与は、局所投与(経眼的、経膣的、経腸的、鼻腔内的のものを含む)、経 口投与、吸入法による投与、あるいは動脈内点滴、皮下投与、腹膜内投与、もし くは筋肉内注射を例とする非経口的投与であることができる。 局所投与のための製剤は、軟膏剤、乳液剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、座剤 、噴霧剤、液状薬、および粉末剤を含むことができる。通常の薬剤学的担体、水 、粉末性、もしくは脂質性基剤、ならびに増粘剤などが必要であるか、あるいは 所望されることがある。コーティング済みコンドームもしくは手袋も有用である だろう。 経口投与のための組成物には、粉末剤もしくは顆粒剤、水もしくは非水性培地 中の懸濁液もしくは水溶液、カプセル剤、薬袋、もしくは錠剤を含む。増粘剤、 矯味・矯臭剤、賦形剤、乳化剤、調剤補助物、もしくは結合剤が所望されること がある。 非経口投与のための製剤も、やはり緩衝液、リポソーム、賦形剤、および他の 適切な添加物を含むことができる滅菌水溶液を含むことができる。 投与量は、治療すべき症状の重篤度および反応性に依存するが、一般的には数 日から数カ月間続く治療過程に関して、あるいは治療の効果が生じるもしくは疾 患状態の軽減が達成されるまでは、一日当たり一回もしくは複数回の投与であろ う。当業者は至適用量、投与法、および反復率(repetition rat es)を容易に決定することができる。 本発明は、炎症性細胞接着の調節が可能な蛋白質に対応するRNAおよびDN Aの機能のアンチセンス阻害における用途のためにオリゴヌクレオチドを利用す る。本発明の文脈中では、用語「オリゴヌクレオチド」は、オリゴマーもしくは ポリマーのリボ核酸もしくはデオキシリボ核酸を意味する。この用語には、天然 に存在する塩基、糖、および糖間(主鎖)結合からなるオリゴマー、ならびに類 似する様式で機能する天然非存在性部分を有するオリゴマーがある。ヌクレアー ゼの存在下における細胞取り込みの亢進および安定性の増大を一例とするような 特性のために、このように修飾されたもしくは置換されたオリゴヌクレオチドが はしばしば天然形態のものよりも好ましい。 本発明について意図される幾つかの好ましいオリゴヌクレオチドの具体例には 、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホン酸メチル、短鎖アルキル 、もしくはシクロアルキル糖間結合、あるいは短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式 糖間結合を含むことができる。最も好ましいものは、CH2−NH−O−CH2、 CH2−N(CH3)−O−CH2、CH2−O−N(CH3)−CH2、CH2−N (CH3)−N(CH3)−CH2およびO−N(CH3)−CH2−CH2の主鎖( 式中、ホスホジエステルはO−P−O−CH2である)を有するものである。や はり好ましいものは、モルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドである。 Summerton、J.E.およびWeller、D.D.、米国特許第5, 034,506号。他の好ましい態様においては、蛋白質−核酸(PNA)主鎖 のような、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖をポリアミド主鎖で置換 することができる(この場合、塩基はポリアミド主鎖のアザ窒素原子に直接もし くは間接的に結合している)。P.E.Nielsen、M.Egholm、R .H.Berf、O.Buchardt、Science 1991、254、 1497。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、2’位において、以下に示す置 換基の内の一つを含むアルキルおよびハロゲン置換された糖部分を含むことがで きる。それらの置換基とは、OH、SH、SCH3、F、OCN、O(CH2n NH2、もしくはO(CH2nCH3[式中、nは1から約10までである]、C1 からC10までの低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリル、もしく はアラルキル、C1、Br、CN、CF3、OCF3、O−、S−、もしくはN− アルキル、O−、S−、もしくはN−アルケニル、SOCH3、SO2CH3、O NO2、NO2、N3、NH2、複素環式アルキル、複素環式アルカリル、アミノア ルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されているシリル、RNA開裂用の基 、コンジュゲート、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの 薬物動態特性を改善するための基、もしくはオリゴヌクレオチドの薬物動態特性 を改善するための基、ならびに類似する特性を有する他の置換基である。オリゴ ヌクレオチドはペントフラノシル基の代わりにシクロブチルのような糖擬態物を も有することができる。 本発明に従うオリゴヌクレオチドは、約3から約50までの核酸塩基単位を含 むことが好ましい。このようなオリゴヌクレオチドが、約8から25までの核酸 塩基単位を含むことがより好ましく、そして約12から22までの核酸塩基単位 を有することがなおより好ましい。理解されるように、核酸塩基単位とは、ホス ホジエステルもしくは他の結合を介して隣接する核酸塩基単位に適切に結合して いる塩基−糖の組み合わせ物である。 本発明に従って用いられるオリゴヌクレオチドは、よく知られる技術である固 相合成を介して都合良くかつ日常的に作成することができる。このような合成の ための装置は、Applied Biosystems社を初めとする数々の販 売元により売られている。このような合成のための他の手段のいずれのものも利 用することができるが、オリゴヌクレオチドの実際の合成は、日常的な作業に従 事するものの手腕の範囲内で十分に行われる。ホスホロチオエートおよびアルキ ル化誘導体のような他のオリゴヌクレオチドを製造するための類似する技術もよ く知られている。 本発明に従うと、当業者には、転写されるDNAの読み取り枠(ORFs)に より同定されるメッセンジャーRNAは、そのDNAのORFsからの情報のみ でなく、5’−非翻訳領域、3’−非翻訳領域および介在配列リボヌクレオチド として当業者に知られる領域を形成する関連的リボヌクレオチドからの情報をも 含むことが理解されるであろう。従って、これらの関連的リボヌクレオチドなら びに情報的リボヌクレオチドの全てもしくはその一部分を標的とするオリゴヌク レオチドは、本発明に従って製剤することができる。好ましい態様においては、 このオリゴヌクレオチドは転写開始部位、翻訳開始部位、介在配列、および3’ −非翻訳領域内の配列と特異的にハイブリダイズすることが可能である。 本発明に従うと、このオリゴヌクレオチドは、白血球細胞の、他の白血球細胞 もしくは他の細胞種への接着に係わる蛋白質をコードする核酸の一部分と特異的 にハイブリダイズすることが可能である。好ましい態様においては、該蛋白質は 細胞間接着分子−1、血管細胞接着分子−1、および内皮白血球接着分子−1で ある。それに対応する配列もしくはその一部分を含むオリゴヌクレオチドが本発 明において有用である。一例では、図1は、ヒトの細胞間接着分子−1のmRN A配列である。全体もしくはその一部分が有用である可能性のある好ましい配列 セグメントは、 である。 図2は、ヒトの内皮白血球接着分子−1のmRNA配列である。全体もしくは その一部分が有用である可能性のある好ましい配列セグメントは、 である。 図3は、ヒトの血管細胞接着分子−1のmRNA配列である。全体もしくはそ の一部分が有用である可能性のある好ましい配列セグメントは、 である。図示した配列は正確であると思われるものの、万が一間違いが見つかっ たとしても本発明は正しい配列を指示する。本発明における有用なオリゴヌクレ オチドはこれらの配列の内の一つ、もしくはその一部分を含む。従って、先に示 されるこれらのオリゴヌクレオチドの内のいずれか、あるいは当業者が炎症性細 胞接着分子の合成の調節のための好ましいアンチセンス標的の知識から製造する ことができる類似するオリゴヌクレオチドの内のいずれかを利用することが好ま しい。 本発明の幾つかの好ましい態様は、以下に示す非制限的実施例に従って詳細に 説明される。調節のための標的mRNA種は、細胞間接着分子−1、内皮白血球 接着分子−1、および血管細胞接着分子−1に関連する。当業者は、本発明はそ れらに限定はされず、しかしながら本発明は一般的に適用することができるとい うことを判断するであろう。ICAM−1および/またはELAM−1および/ またはVCAM−1の産生の阻害もしくは調節は、疾患治療における有意な治療 学的利益を有することが予期される。これらの組成物の有用性を評定する目的に おいては、一つもしくは一連のアッセイが必要である。 実施例 実施例1 細胞表面上でのICAM−1、VCAM−1、およびELAM−1の発現は、 ELISAにおいて特異的モノクローナル抗体を使用して定量することができる 。細胞は96ウエルのマイクロタイタープレート内において密集するまで増殖さ せる。これらの細胞をインターロイキン−1もしくは腫瘍壊死因子のいずれかで 、ELAM−1を定量するためには4時間から8時間まで、そしてICAM−1 およびVCAM−1を定量するためには8時間から24時間までの間剌激する。 サイトカインでの適切なインキュベーション時間の後、これらの細胞を、ダルベ ッコー(Dulbecco’s)のリン酸緩衝化食塩水(D−PBS)のような 、カルシウムとマグネシウムとを含む緩衝化等張液で3回緩和に洗浄する。その 後細胞をD−PBS中で希釈した1−2%のパラホルムアルデヒドを用いて、マ イクロタイタープレート上に、25℃で20分間直接固定化させる。これらの細 胞を再びD−PBSで3回洗浄する。マイクロタイタープレート上の非特異的結 合 を、37℃において1時間、D−PBS中の2%ウシ血清アルブミンで遮断する 。細胞を37℃において1時間、遮断用溶液中で希釈した適切なモノクローナル 抗体と共にインキュベートする。未結合抗体は、D−PBSでの3回の洗浄によ り除去する。細胞に結合した抗体は、37℃下、1時間の、遮断用溶液中のビオ チニル化ヤギ抗−マウスIgG(Bethesda Reseach Labo ratories社、Gaithersberg、MD)の1:1000希釈液 とのインキュベーションにより検出する。細胞をD−PBSで3回洗浄し、そし てその後37℃下、1時間、β−ガラクトシダーゼ(Bethesda Rea seach Laboratories社)とコンジュゲートさせたストレプト アビジンの1:1000希釈液とインキュベートする。細胞を各5分ずつD−P BSで3回洗浄する。特異的モノクローナル抗体に結合したβ−ガラクトシダー ゼの量を、3.3mMのクロロフェノールレッド−β−D−ガラクトピラノシド 、50mMのリン酸ナトリウム、1.5mMのMgCl2;pH=7.2の溶液 中で、37℃下、2−15分間、プレートを現像することにより決定する。産物 の濃度はELISA用マイクロタイタープレートリーダー内において575nm の吸光度を測定することにより決定する。 数々のヒト細胞株における、インターロイキン−1βもしくは腫瘍壊死因子α のいずれかでの刺激の後に観察されるICAM−1の誘導の例を図4に示す。細 胞は、15時間、インターロイキン−1もしくは腫瘍壊死因子の増加濃度で刺激 し、そして先に示す処理を施した。ICAM−1発現は、モノクローナル抗体8 4H10(Amac Inc.社、Westbrook、ME)の1:1000 希釈液とのインキュベーションにより決定した。使用した細胞株は、第四継代目 のヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)、ヒト表皮癌細胞株(A431)、ヒト黒 色腫細胞株(SK−MEL−2)、およびヒト肺癌細胞株(A549)であった 。ICAM−1をすべての細胞株上で誘導させたが、細胞表面におけるICAM −1発現の誘導においては、腫瘍壊死因子はインターロイキン−1と比較してよ り効果的であった(図4)。 ICAM−1、VCAM−1、もしくはELAM−1の阻害についてのアンチ センスオリゴヌクレオチドのスクリーニングは、オリゴヌクレオチドでの細胞の 前処理をサイトカインでの刺激の前に行うということ以外は先に記載するように 実施する。ICAM−1発現に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害の一 例を図5に示す。ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)は、37℃下で4時間、8 μMの塩化N−[1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル]−N,N,N− トリメチルアンモニウム(DOTMA)を含むOpti MEM(GIBCO社 、Grand Island、NY)中で希釈した増加濃度のオリゴヌクレオチ ドで処理してオリゴヌクレオチドの取り込みを亢進させた。培地を除去し、そし て更に4時間、増加濃度のオリゴヌクレオチドを含む内皮成長用培地(EGM− UV;Clonetics社、San Diego、CA)と交換した。インタ ーロイキン−1βを5単位/mlの濃度においてその細胞に添加し、そして37 ℃において14時間インキュベートした。これらの細胞を、先に記載するように モノクローナル抗体84H10の1:1000希釈液を使用してICAM−1発 現について定量した。使用したオリゴヌクレオチドは、 化合物1−(ISIS 1558) 配列 を有する翻訳コドンのAUG開始部分を含むmRNAの位置64−80とハイブ リダイズするように設計されたホスホジエステルオリゴヌクレオチド、 化合物2−(ISIS 1570) 化合物1と同一の配列に対応するホスホ ロチオエートを含むオリゴヌクレオチド、 化合物3−配列 を示す、化合物1および化合物2に相補的なホスホロチオエートオリゴヌクレオ チド、 化合物4−(ISIS 1572) 配列 を含む3’−非翻訳領域中のmRNAの位置2190−2210にハイブリダイ ズするように設計された、ホスホロチオエートを含むオリゴヌクレオチド、 化合物5−(ISIS 1821) 配列 を含む、対照として用いられるヒトの5−リポキシゲナーゼmRNAにハイブリ ダイズするように設計された、ホスホロチオエートを含むオリゴヌクレオチドで ある。 ヒトICAM−1 mRNAの翻訳領域のAUG開始部分を標的とするホスホ ジエステルオリゴヌクレオチド(化合物1)はICAM−1の発現は阻害しない が、ホスホロチオエートを含む対応するオリゴヌクレオチド(化合物2)はIC AM−1発現を、0.1μMの濃度において70%、そして1μM濃度において 90%阻害した(図4)。ホスホジエステルに勝るホスホロチオエートオリゴヌ クレオチドの効力増大は、恐らく安定性の増加に起因するものと思われる。化合 物2に対するセンス鎖である化合物3は、10μMにおいて控えめながらもIC AM−1発現を阻害した。細胞に添加する前に化合物2を化合物3に対して予め ハイブリダイズさせた場合には、ICAM−1発現に対する化合物2の効果は弱 まり、このことにより化合物2の活性はmRNAへのハイブリッド形成に必要な アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果に起因することが示唆される。3’−非 翻訳配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド(化合物4)は、1μMの 濃度においてICAM−1発現を62%阻害した(図5)。ヒト5−リポキシゲ ナーゼを標的とする対照オリゴヌクレオチドはICAM−1発現を20%減少さ せた。これらのデータにより、オリゴヌクレオチドはヒト臍静脈内皮細胞上での ICAM−1発現を阻害することが可能であることが示され、そしてICAM− 1発現の阻害はアンチセンス活性に起因することが示唆される。 1μMの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド、化合物2は、増加濃度の腫 瘍壊死因子およびインターロイキン−1で刺激したヒト臍静脈内皮細胞上でのI CAM−1発現を阻害する(図6)。これらのデータにより、化合物2の効果は 細胞のインターロイキン−1刺激に特異的でないことが示される。 類似するアッセイを使用して、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるELA M−1およびVCAM−1発現の阻害を示すこともできる。 実施例2 ICAM−1、VCAM−1、もしくはELAM−1発現に対するアンチセン スオリゴヌクレオチドの効果を示すのに用いることができる第一の細胞性アッセ イは、細胞接着アッセイである。標的細胞をマルチウエルプレート上に単層とし て増殖させ、オリゴヌクレオチドで処理し、そして次にサイトカインで処理する 。その後接着性細胞をその単層細胞に添加し、そして37℃において30−60 分間インキュベートし、そして洗浄して非接着性細胞を除去する。単層に接着し ている細胞は、接着性細胞を直接計数するか、あるいは記載されるように51Cr のような放射性同位元素でその細胞を予め標識し、単層に結合している放射活性 を定量するかのいずれかにより決定することができる。DustinおよびSp ringer、J.Cell Biol.1988、107、321−331。 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのアッセイにおいてはICAM−1、V CAM−1、もしくはELAM−1のいずれかを標的とすることができる。 腫瘍壊死因子で処理したヒト臍静脈内皮細胞に対する、DMSOでの分化処理 を施したHL−60細胞の接着についての、ICAM−1 mRNAを標的とす るアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果の一例を表7に示す。ヒト臍静脈内皮 細胞は、12ウエルプレート内において80%密集するまで増殖させた。これら の細胞を37℃下で4時間、8μMのDOTMAを含むOpti−MEM中で希 釈した2μMのオリゴヌクレオチドで処理した。培地を除去し、そして表示され るオリゴヌクレオチドの2μMを含む新鮮な内皮細胞成長用培地(EGE−UV )と取り替え、そして37℃で4時間インキュベートした。1ng/mlの腫瘍 壊死因子を表示されるように細胞に添加し、そして細胞を更に19時間インキュ ベートした。細胞をEGM−UVで一回洗浄し、そして1.3%のDMSOを添 加して1.6×106のHL−60細胞を4日間分化させた。この細胞を37℃ で1時間接着させ、そして37℃に暖めたダルベッコーのリン酸緩衝化食塩水( D−PBS)で4回緩和に洗浄した。接着細胞を、5mMのEDTAを含む0. 25mlの冷却(4℃)リン酸緩衝化食塩水の添加により単層からはがし、氷上 で5分間インキュベートした。EDTAでの処理により除去された細胞の数を血 球計数器で計数することにより決定した。EDTA処理により単層からはがされ た内皮細胞は、形態学的差異によりHL−60細胞から容易に識別することがで きた。 腫瘍壊死因子の非存在下においては、3%のHL−60細胞が内皮細胞に結合 した。1ng/mlの腫瘍壊死因子での内皮細胞単層の処理により、添加した総 細胞の59%にまで接着細胞の数が上昇した(図7)。アンチセンスオリゴヌク レオチドである化合物2もしくは対照オリゴヌクレオチドである化合物5での処 理は、腫瘍壊死因子処理の非存在下においては、単層に接着する細胞の数を変化 させなかった(図7)。このアンチセンスオリゴヌクレオチド、つまり化合物2 は、添加した総細胞の59%から添加した総細胞の17%にまで接着細胞数を減 少させた。それとは対照的に、対照オリゴヌクレオチドである化合物5は、腫瘍 壊死因子で処理した内皮単層へ接着する細胞の数を有意には減少させず、つまり 対照細胞については59%であるのに対して、化合物5で処理した細胞について は添加した総細胞の53%であった。 これらのデータにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、内皮細胞上での ICAM−1発現を阻害することが可能であり、そしてICAM−1発現の阻害 は、配列特異的様式で内皮単層への好中球−様細胞の接着の減少に相関すること が示される。ELAM−1およびVCAM−1のような他の分子も内皮細胞への 白血球の接着を媒介するため、接着は完全に遮断されることは予期されない。 実施例3 オリゴヌクレオチドの合成および特性決定 未修飾DNAオリゴヌクレオチドは自動DNA合成機(Applied Bi osystems model 380B)上で、ヨウ素による酸化を用いる標 準的なホスホルアミダイト化学を使用して合成した。β−シアノエチルジイソプ ロピル−ホスホルアミダイトは、Applied Biosys tems社( Foster City、CA)から購入した。ホスホルチオエートオリゴヌク レオチドについては、標準的な酸化用瓶を、亜リン酸エステル結合の段階的イオ ウ付加のために、アセトニトリル中の3H−1,2−ベンゾジチオール−3−オ ン1,1−ジオキシドの0.2M溶液に入れ替えた。イオウ付加周期待機段階( wait step)を68秒まで増加し、そしてその後にキャッピング段階が 続く。 2’−O−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは2’−O−メチル β−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイト(Chemgenes社, Needham MA)およびテトラゾール、および塩基のパルス輸送後の待機 段階を360秒まで増加させたことを除いては、未修飾オリゴヌクレオチドにつ いての標準周期を使用して合成した。この合成を出発させるのに用いた3’−塩 基は2’−デオキシリボヌクレオチドであった。 2’−フルオロホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、5’−ジメトキシ トリチル−3’−ホスホルアミダイトを使用して合成し、そして本出願と同じ譲 受人に譲渡されている、1990年1月11日に提出された米国特許出願第46 3,358号、および1990年8月13日に提出された同出願第566,97 7号において開示されるように製造した。2’−フルオロオリゴヌクレオチドは 、ホスホルアミダイト化学および標準的DNA合成研究法の若干の変法(脱保護 化を、室温におけるメタノール性アンモニア(methanolic ammo nia)を使用して行っている)を使用して製造した。 制御式微細孔ガラスカラム(controlled pore glass column)(Applied Biosystems社)からの開裂および 55℃下18時間の濃厚な水酸化アンモニウム中での脱保護化の後、このオリゴ ヌクレオチドを、2.5倍容のエタノールを用いる0.5MのNaClからの2 度の沈殿化により精製した。分析用ゲル電気泳動は、20%アクリルアミド、8 M尿素、45mMトリス−ホウ酸緩衝液、pH7.0中で行った。オリゴデオキ シヌクレオチドおよびホスホルチオエートオリゴヌクレオチドは電気泳動より判 断したところ、全長の80%を有する物質よりも大きいものであった。 RNAオリゴヌクレオチド合成は、ABIモデル380BのDNA合成機上で 実施した。標準的な合成周期を、テトラゾールのパルス輸送後の待機段階を90 0秒までに増加させることにより改変した。塩基はメタノール性アンモニア中で の一晩のインキュベーションにより脱保護化した。塩基の脱保護化の後、このオ リゴヌクレオチドを減圧下において乾燥させた。2’ヒドロキシルを保護するt ーブチルジメチルシリルは、テトラヒドロフラン中の1Mのフッ化テトラブチル アンモニウム中でそのオリゴヌクレオチドを一晩インキュベートすることにより 除去した。このRNAオリゴヌクレオチドは、C18sep−pakカートリッジ (Waters社、Division of Millipore Corp. 、 Milford MA)上で更に精製し、そしてエタノール沈殿を行った。 この合成法により取得されるホスホルチオエートとホスホジエステル結合との 相対的な量は、31P NMR分光法により周期的に検査した。このスペクトルは 、溶媒として酸化重水素もしくはジメチルスルホキシド−d6を使用して室温で 取得した。ホスホロチオエート試料は、典型的には1パーセントを下回るホスホ ジエステル結合を含んでいた。 二次評定は、50mMの酢酸トリエチルアンモニウム、pH7.0、中のアセ トニトリルの濃度勾配(30分間で4%から32%まで、流速=1.5ml/分 )を使用するPRP−1カラム(Hamilton Co.社、Reno、Ne vada)上でのトリチル−オン(trityl−on)HPLCにより精製し た。適切な分画をひとまとめにし、蒸留し、そして室温において15分間5%酢 酸で処理した。この溶液を同容積の酢酸エチルで抽出し、そして水酸化アンモニ ウムで中和し、そして凍結乾燥した。HPLC精製したオリゴヌクレオチドは、 ICAM−1発現についてELISAアッセイにより判定したところ、沈殿させ たオリゴヌクレオチドとは効力における有意な差異を生じなかった。 実施例4 細胞培養およびオリゴヌクレオチドでの処理 ヒト肺癌細胞株A549を、American Type CultureC ollection(Bethesda MD)から取得した。細胞を、1グラ ムのグルコース/リットルおよび10%ウシ胎児血清(Irvine Scie ntific社)を含むダルベッコ変法イーグル培地(Irvine Scie ntific社、Irvine CA)中で増殖させた。ヒト臍静脈内皮細胞( HUVEC)(Clonetics社、San Diego CA)は、EGM −UV培地(Clonetics社)中で培養した。HUVECは、第二継代物 と第六継代物との間のものを使用した。ヒト表皮癌A431細胞はAmeric an Type Culture Collectionから取得し、そして4 .5g/lのグルコースを含むDMEM中で培養した。ヒトの初代ケラチノサイ トはClonetics社から取得し、そしてKGM(ケラチノサイト増殖用 培地、Clonetics社)中で増殖させた。 96−ウエルプレート中で増殖させた細胞を、予め37℃に暖めたOpti− MEM(GIBCO社、Grand.Island、NY)で3回洗浄した。H UVEC細胞の場合には10μg/mlの塩化N−[1−(2,3−ジオレイル オキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウム(DOTMA、Be thesda.Research Labs社、Bethesda MD)を、 あるいはA549細胞の場合には20μg/mlのDOTMAを含む100μl のOpti−MEMを、各ウエルに添加した。オリゴヌクレオチドは、0.2μ mのCentrex酢酸セルロースフィルター(Schleicher and Schuell社、Keene、NH)を通す遠心処理により滅菌した。オリ ゴヌクレオチドを20×の保存溶液として各ウエルに添加し、そして37℃にお いて4時間インキュベートした。培地を除去し、そして表示の濃度のオリゴヌク レオチドを含む150μlの適切な成長培地に入れ替えた。細胞をさらに3−4 時間、37℃でインキュベートし、そして表示したように適切なサイトカインで 14−16時間剌激した。ICAM−1発現は実施例1に記載のように決定した 。オリゴヌクレオチドとの最初の4時間のインキュベーションの間に、DOTM Aが存在することにより、オリゴヌクレオチドの効力が少なくとも100倍増加し た。この効力の上昇は、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みの上昇に関連してい た。 実施例5 インターロイキン−1β−刺激化細胞におけるICAM−1遺伝子発現に対する 活性についての追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドのELISAスクリーニ ング アンチセンスオリゴヌクレオチドは最初、ヒトICAM−1 mRNAにおけ る5つの標的部位にハイブリダイズするように設計された。オリゴヌクレオチド は、ホスホジエステル(P=O、ISIS 1558、1559、1563、1 564、および1565)、ならびにホスホロチオエート(P=S;ISIS 1570、1571、1572、1573、および1574)の両形態において 合成した。これらのオリゴヌクレオチドを表1に示す。 オリゴヌクレオチドによるインターロイキン−1β−刺激化細胞表面上のICA M−1発現の阻害は、実施例1に記載のELISAアッセイにより決定した。オ リゴヌクレオチドは2つの異なる細胞株において検査した。ホスホジエステルオ リゴヌクレオチドはどれもICAM−1発現を阻害しなかった。これは恐らく、 細胞内におけるホスホジエステルオリゴヌクレオチドの迅速な分解によるもので あると思われる。5つのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの内でも、最も 活性が高かったのはAUG翻訳開始コドンにハイブリダイズするISIS 15 70であった。2’−O−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである ISIS 2974は、HUVECおよびA549細胞でのICAM−1発現の 阻害においてはISIS 1570と比較すると約3倍低い有効性を示した。2 ’−フルオロオリゴヌクレオチドであるISIS 2634も有効性が低かった 。 5つの最初の標的を用いて得られた初期データに基づき、追加のオリゴヌクレ オチドを、ICAM−1 mRNAとハイブリダイズするように設計した。予想 される転写開始部位(5’キャップ部位)にハイブリダイズするアンチセンスオ リゴヌクレオチド(ISIS 3067)は、図8において示されるように、I L−1β−刺激化細胞においてはAUGコドンにハイブリダイズするオリゴヌク レオチド(ISIS 1570)とほぼ同程度の活性を示した。ISIS 19 31および1932は、AUG翻訳開始コドンの各々5’および3’にハイブリ ダイズする。AUG領域にハイブリダイズする3つ全てのオリゴヌクレオチドは ICAM−1発現を阻害するが、ISIS 1932はISIS 1570およ びISIS 1931と比較するとやや活性が劣っていた。ICAM−1 mR NAのコーディング領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド(ISIS1 933、1934、1935、1574、および1936)は弱い活性を示した 。翻訳終止コドンにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド(ISIS 193 7および1938)は中程度の活性を示した。 驚くべきことに、最も活性の高いアンチセンスオリゴヌクレオチドはISIS 1939であり、これはICAM−1 mRNAの3’−非翻訳領域の配列を標 的とするホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである(表1を参照せよ)。 同じ配列を有する他のオリゴヌクレオチドてある2’−O−メチル(ISIS2 973)および2’−フルオロ(ISIS 2637)をも検査したが、これら はこのレベルの活性は示さなかった。他の3’−非翻訳配列を標的とするオリゴ ヌクレオチド(ISIS 1572、1573、および1940)もISIS1 939程の活性は示さなかった。実際のところ、ポリアデニル化シグナルを標的 とするISIS 1940はICAM−1発現を阻害しなかった。 検査した16の最初のオリゴヌクレオチドの内で、ISIS 1939が予期 せず最大のアンチセンス活性を示すことが判明したため、ICAM−1 mRN Aの3’−非翻訳領域における配列にハイブリダイズするように、他のオリゴヌ クレオチドを設計した(表1に示されるISIS 2302、2303、230 4、2305、および2307)。ISIS 1939標的のわずか5塩基分3 ’側にある配列にハイブリダイズするISIS 2307は、この一連のものの うちで最も活性が低かった(図8)。ISIS.1939標的の3’側の143 塩基分の位置にあるICAM−1 mRNAにハイブリダイズするISIS23 02はISIS 1939に匹敵し得る活性を有しており、この一連のものの内 でも最高の活性を示した。ヒトICAM−1 mRNAの3’−非翻訳領域の予 想されるRNA二次構造の調査により(M.Zuker、Science198 9、244、48−52)、ISIS 1939とISIS 2302との両方 は安定なステム−ループ構造をとることが予期される構造にハイブリダイズする ことが示された。最近の定説により、アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計す る際にはRNA二次構造の領域は避けるべきことが示唆されている。従ってIS IS 1939およびISIS 2302は、ICAM−1発現を阻害すること が予期されなかった。 対照オリゴヌクレオチドであるISIS 1821はISIS 1934のも のに匹敵する活性でHUVEC細胞におけるICAM−1発現を阻害したが、A 549細胞においてはISIS 1821はISIS1934と比較して低い有 効性を示した。陰性対照であるISIS 1821は、ICAM発現に対しては 少量の活性を示すことが見いだされ、これは恐らくAUG翻訳開始コドンの3’ 側15塩基分の位置のICAM−1 mRNAにハイブリダイズする(13塩基 分の12が対合する)能力がその原因の一部をなすためであると思われる。 これらの研究により、ICAM−1 mRNAのAUG翻訳開始コドンおよび 特異的3’−非翻訳配列が、ICAM−1発現のアンチセンスオリゴヌクレオチ ド阻害に対する最高の感受性を示したことが示される。 ヒト請静脈細胞およびヒト肺癌細胞(A549)におけるICAM−1発現を 阻害することに加えて、ISIS 1570、ISIS 1939、およびIS IS 2302はヒト表皮癌A431細胞およびヒトの初代ケラチノサイトにお けるICAM−1発現を阻害することが示された(図9に示する)。これらのデ ータにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドは幾つかのヒト細胞株におけるI CAM−1発現を阻害することが可能であることが示される。その上、これらの オリゴヌクレオチドの効力程度の順位は、調査した4つの細胞株においては同一 であった。ICAM−1発現はヒトの初代ケラチノサイトにおいて阻害可能であ るという事実は重要であり、それは表皮ケラチノサイトはアンチセンスヌクレオ チドの対象標的であるという理由による。 実施例6 他のサイトカインで刺激した細胞でのICAM−1発現のアンチセンスオリゴヌ クレオチド阻害 2つのオリゴヌクレオチド、ISIS 1570およびISIS 1939を 、TNF−αおよびIFN−γ−誘導化ICAM−1発現を阻害する能力につい て検査した。1μMのアンチセンスオリゴヌクレオチドでのA549細胞の処理 により、配列特異的な様式で、IL−1β、TNF−α、およびIFN−γ−誘 導化ICAM−1発現が阻害された。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチド はIL−1βおよびTNF−α−誘導化ICAM−1発現を同程度阻害したが、 IFN−γ−誘導化ICAM−1発現はアンチセンス阻害に対してより大きな感 受性を示した。対照オリゴヌクレオチドであるISIS 1821は、以下に示 すようにIL−1βもしくはTNF−α−誘導化ICAM−1発現を有意には阻 害せず、そしてIFN−γ−誘導化ICAM−1発現を若干阻害した。 実施例7 アンチセンス効果はセンス鎖対照により打ち消される オリゴヌクレオチドISIS 1570およびISIS 1939によるIC AM−1発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害は、それら各々のセンス鎖 を有するオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成によりもとに戻すことができた 。単独で適用させた場合には、ISIS 1570についてのホスホロチオエー トセンス鎖(ISIS 1575)はわずかながらIL−1β−誘導化ICAM −1発現を亢進させた。細胞に添加する前に等モル濃度でISIS 1570と ISIS 1575とを混合させた場合には、ISIS 1570の効果は遮断 された。ISIS 1939に対する相補鎖(ISIS 2115)は、細胞に 単独で添加した場合にICAM−1発現を46%亢進させた。ISIS 193 9にISIS 2115を予めハイブリダイズさせると、ISIS 1939に よるICAM−1発現の阻害は完全に遮断された。 実施例8 オリゴヌクレオチドのTm値(標的からのオリゴヌクレオチドの解離温度)の測 定 アンチセンスオリゴヌクレオチドによるICAM−1発現の阻害の効果がそれ それの標的部位に対するそれぞれの親和性に起因するか否かを決定するために、 各オリゴヌクレオチドについての熱力学的測定を行った。アンチセンスオリゴヌ クレオチド(ホスホロチオエートとして合成した)をそれそれの相補的DNA配 列(ホスホジエステルとして合成した)にハイブリダイズさせた。温度に対する 吸光度の曲線を、100mMのNa+、10mMのリン酸、0.1mMのEDT A、pH7.0、中の4μMの各鎖オリゴヌクレオチドで測定した。Tm値およ びデュプレックス形成の自由エネルギーを、直線勾配の基準線を有する2状態モ デルにデータを適合させることから取得した(Petersheim、Mおよび D.H.Turner、Biochemistry 1983、22、256− 263)。結果は少なくとも3つの実験値の平均値である。 アンチセンスオリゴヌクレオチをそれぞれの相補的DNA配列(ホスホジエス テルとして合成した)とハイブリダイズさせた場合、ISIS 1940を例外 とする全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも50℃のTm値を示 した。従って全てのオリゴヌクレオチドは、標的配列が露出されている場合には 、標的であるICAM−1 mRNAにハイブリダイズすることが可能であるは ずである。驚くべきことに、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効力は、Tmあ るいはΔG゜37゜のいずれにも直接は相関していなかった。最大生物活性を示す オリゴヌレオチドであるISIS 1939は、他のオリゴヌクレオチドの大半 のものが示すものと比較してより低いTm値を示した。従って、ハイブリッド形 成親和性は生物活性を確かめるには不十分なものである。 実施例9 ICAM−1発現のアンチセンス阻害におけるオリゴヌクレオチド長の影響 アンチセンス活性についてのオリゴヌクレオチド長の影響を、ISIS 15 70(ISIS 2165、2173、2149、2163、および2164) 、ならびにISIS 1939(ISIS 2540、2544、2545、2 546、2547、および2548)の先端切断変異物を用いて検査した。アン チセンス活性は概して、オリゴヌクレオチド長が減少するに従って減少した。1 6塩基分の長さであるオリゴヌクレオチドは18塩基分のオリゴヌクレオチドと 比較して若干低い活性を示した。14塩基分の長さであるオリゴヌクレオチドは 有意に低い活性を示し、そして12もしくは10塩基分の長さのオリゴヌクレオ チ ドは弱い活性を示すに過ぎなかった。オリゴヌクレオチド長とTm値とアンチセ ンス活性との関連性の検査により、14塩基分と16塩基分の長さとの間に激し い変化が生じる一方で、Tm値は長さと共に直線的に増加することが示される( 図10)。 実施例10 ICAM−1のアンチセンス阻害の特異性 ICAM−1についてのアンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 1570 およびISIS 1939の特異性を、35S−ラベル蛋白質の免疫沈降により評 価した。A549細胞は25cm2の組織培養用フラスコ内で密集するまで増殖 させ、そして実施例4に記載のようにアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理し た。この細胞を、表示されるように、インターロイキン−1βで14時間刺激し 、メチオニン非含有DMEMに10%の透析済みウシ胎児血清を添加したもので 洗浄し、そして10%の透析済みウシ胎児血清、1μMのオリゴヌクレオチド、 および表示されるインターロイキン−1βを含むメチオニン非含有培地中で1時 間インキュベートした。35S−メチオニン/システイン混合物(Tran35S− ラベル、ICN社、Costa Mesa、CANから購入)を100μCi/ m1の活性になるように細胞に添加し、そしてその細胞を更に2時間インキュベ ートした。細胞性蛋白質は、50mMのトリス−HCI pH8.0、150m MのNaCl、1.0%のNP−40、0.5%のデオキシコール酸塩、および 2mMのEDTA(ウエル当たり0.5ml)を用いて、4℃において30分間 インキュベートした。18,000×gにおける20分間の遠心処理により抽出 物の濁りを除いた。この上清を200μlのプロテインG−セファロースビーズ (Bethesda Research Labs社、Bethesda MD )に4℃において2時間予備吸着させ、等量に分割し、そして5μgのICAM −1モノクローナル抗体(AMAC Inc.社、Westbrook ME、 から購入した)、あるいはHLA−A,B抗体(W6/32、American Type Culture Collection、Bethesda、MD 、から取得したマウスハイブリドーマ細胞から産生させた)のいずれかと共に、 4 ℃において15時間インキュベートした。プロテインG−セファロースの50% 懸濁液(v/v)の200μlと共に4℃において2時間インキュベートするこ とにより免疫複合体を捕獲し、溶菌用緩衝液で5回洗浄し、そしてSDS−ポリ アクリルアミドゲル上で分離させた。蛋白質はオートラジオグラフィーにより検 出した。 5単位/mlのインターロイキン−1βでのA549細胞の処理により、二重 線として移動する95−100kDaの蛋白質が合成されることが示され、そし てこの蛋白質はICAM−1に対するモノクローナル抗体により免疫沈降した。 二重線としての見かけは、ICAM−1の異なるグリコシル化形態に起因するも のと思われる。1μMの濃度におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 1570での細胞の予備処理によりICAM−1合成は約50%減少し、一方、 1μMのISIS 1939によってはICAM−1の合成はほぼ基準線にまで 減少した。ICAM−1のELISAアッセイ(実施例1および5)においては 不活性を示すアンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 1940は、ICAM −1合成を有意に減少させなかった。ICAM−1標的とハイブリダイズ可能な アンチセンスオリゴヌクレオチドの内のいずれのものもHLA−A,B合成にお ける論証可能な効果を持たず、このことによりICAM−1に対するこれらオリ ゴヌクレオチドの特異性が示された。その上、ICAM−1抗体およびプロテイ ンG−セファロースと非特異的に沈殿する蛋白質は、アンチセンスオリゴヌクレ オチドでの処理により有意な影響を受けなかった。 実施例11 細胞接着アッセイによるICAM−1に対する活性についての追加のアンチセン スオリゴヌクレオチドのスクリーニング ヒト請静脈内皮(HUVEC)細胞を増殖させ、そして実施例4におけるよう にオリゴヌクレオチドで処理した。細胞を、ISIS 1939、ISIS 1 940、もしくは対照オリゴヌクレオチドであるISIS 1821のいずれか で4時間処理し、その後TNF−αで20時間刺激した。基になるHUVECは HL−60細胞と最小限の結合を示した一方で、TNF−刺激化HUVECは添 加した総細胞の内の19%に結合した。0.3μMのISIS 1939でのH UVEC単層の予備処理により、図11に示されるようにHL−60細胞の接着 が基準線にまで減少した。対照オリゴヌクレオチドであるISIS 1821お よびISIS 1940は19%から9%へと細胞接着のパーセンテージを減少 させた。これらのデータにより、ICAM−1を標的とするアンチセンスオリゴ ヌクレオチドはTNF−α−処理済みHUVECへの白血球様細胞株(HL−6 0)の接着を特異的に減少させることできるということが示される。 実施例12 ELAM−1遺伝子発現に対する活性についてのアンチセンスオリゴヌクレオチ ドのELISAスクリーニング ヒトの初代請静脈内皮(HUVEC)細胞(第二継代から第五継代までのもの )を96−ウエルプレートにプレート培養し、そして密集させた。細胞をOpt i−MEM(GIBCO社、Grand Island NY)で3回洗浄した 。細胞を、10μg/mlのDOTMA溶液(Bethesda Resear ch Labs社、Bethesda MD)を含むOpti−MEM中で希釈 した増加濃度のオリゴヌクレオチドで、37℃において4時間処理した。培地を 除去し、そしてEGM−UV(Clonetics社、San Diego C A)にオリゴヌクレオチドを添加したものと交換した。腫瘍壊死因子αをこの培 地に添加し(2.5ng/ml)、そしてこの細胞を更に4時間、37℃におい てインキュベートした。 ELAM−1発現はELISAにより検出した。細胞を、37℃に予め暖めた ダルベッコリン酸緩衝化食塩水(D−PBS)で3回洗浄した。細胞を4℃にお いて20分間、95%エタノールで固定化させ、D−PBSで3回洗浄し、そし てD−PBS中の2%BSAで遮断した。細胞を、2%BSAを含むD−PBS 中で0.5μg/mlに希釈したELAM−1モノクローナル抗体BBA−1( R&D Systems社、Minneapolis MN)と共にインキュベ ートした。細胞は、実施例1において示すように、D−PBSで3回洗浄し、そ して結合しているELAM−1抗体をビオチニル化ヤギ抗−マウス二次抗体を 用い、次にはβ−ガラクトシダーゼ−コンジュゲートストレプトアビジンを用い て検出した。 ELAM−1 cDNAの11の異なる領域を標的とするアンチセンスホスホ ロチオエートオリゴヌクレオチド、ならびにICAM−1を標的とする2つのオ リゴヌクレオチド(対照として)の活性を、ELAM−1のELISAを使用し て決定した。オリゴヌクレオチドおよび標的を表2に示す。 ICAM−1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドに関して観察された ものと比較すると(実施例5)、ELAM−1活性の最も有効なオリゴヌクレオ チドモジュレーター(ISIS 2679)はELAM−1の5’−非翻訳領域 内の特異的配列とハイブリダイズ可能であった。ISIS 2679標的の3塩 基分上流で終了する配列にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドISIS 2 687は、有意な活性を示さなかった(図12)。従ってISIS 2679は 、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの阻害に特有の感受性を示すELAM−1 mRNAの独特の部位にハイブリダイズする。アンチセンスオリゴヌクレオチド での阻害に対するこの部位の感受性は、RNA二次構造による予測もしくは文献 上の情報を基にしては予測不可能なものであった。 実施例13 ELAM−1遺伝子発現に対する活性についての追加のアンチセンスオリゴヌク レオチドのELISAスクリーニング 18のアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるELAM− 1発現の阻害は、実施例12において記載されるELISAアッセイを用いて決 定した。ELAM−1 mRNA上のこれらのオリゴヌクレオチドの標的部位を 、図13に示す。ELAM−1に対する各オリゴヌクレオチドの配列および活性 を表3に示す。星印(*)により示されるオリゴヌクレオチドは約50nMもし くはそれを下回るIC50値を有し、そしてそのようなものであることが好まし い。IC50値は、ELAM−1発現の50%阻害をもたらすオリゴヌクレオチ ドの用量を示す。 3−非翻訳領域を標的とする追加のオリゴヌクレオチド(ISIS 4728) はELAM発現を阻害しなかった。 実施例14 VCAM−1遺伝子発現に対する活性についてのアンチセンスオリゴヌクレオチ ドのELISAスクリーニング 15のアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるVCAM− 1発現の阻害は、細胞をTNF−αで16時間刺激させ、そしてVCAM−1発 現を0.5μg/mlで用いるVCAM−1特異的モノクローナル抗体(R&D Systems社、Minneapolis、MN)により検出したことを除い ては、実施例12において記載されるものとほぼ同様のELISAアッセイを使 用して決定した。VCAM−1 mRNA上のこれらオリゴヌクレオチドの標的 部位を図14に示す。VCAM−1に対する各オリゴヌクレオチドの配列および 活性を表4に示す。星印(*)により示されるオリゴヌクレオチドは約50nM もしくはそれを下回るIC50値を有し、そしてそのようなものであることが好 ましい。IC50値は、VCAM−1発現の50%阻害をもたらすオリゴヌクレ オチドの用量を示す。 実施例15 C8161ヒト黒色腫細胞におけるICAM−1発現:ヒト黒色腫細胞株C81 61(Dr.Dan Welch、Hershey Medical Cent er、からの贈与)は、再発性悪性黒色腫を患う患者からの腹壁転移に由来する 。これらの細胞は、無胸腺ヌードマウス内への皮下、皮内、および静脈内注射後 に、肺、皮下組織、牌臓、肝臓、および局所リンパ節における重複転移を形成す る。細胞は10%のウシ胎児血清を含むDMA−F12培地中で増殖させ、そし て2mMのEDTAを用いて継代した。 C8161細胞のTNF−αへの露出により、ICAM−1の細胞表面発現の 6倍の増加、およびこれらの細胞におけるICAM−1 mRNAレベルの増加 がもたらされた。細胞表面におけるICAM−1発現はELISAにより測定し た。細胞を、37℃において4時間、15μg/mlのリポフェクチン(Lip ofectin)の存在下、増加濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理 した。ICAM−1発現は、5ng/mlのTNF−αと16時間インキュベー ションすることにより誘導させた。細胞をDPBS中で3回洗浄し、そして2% ホルムアルデヒド中で20分間固定させた。細胞をDPBSで洗浄し、37℃に おいて1時間2%BSAで遮断し、そしてICAM−1モノクローナル抗体84 H10(AMAC、Inc.社、Westbrooke、ME)と共にインキュ ベートした。結合した抗体濃度の検出は、ビオチニル化ヤギ抗−マウスIgGと のインキュベーションを行い、そしてその後にβ−ガラクトシダーゼ−コンジュ ゲートストレプトアビジンとのインキュベーションを行い、そしてクロロフェノ ールレッド−β−D−ガククトピラノシドでの現像を行い、そしてその後に57 5nmでの吸光度による定量化を行うことにより決定した。ICAM−1 mR NAレベルは、ノザンブロット分析により測定した。 実施例16 C8161ヒト黒色腫細胞におけるICAM−1発現のオリゴヌクレオチド阻害 :図15に示すように、ICAM−1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオ チトISIS 1570(配列番号1)、ISIS 1939(配列番号15) 、 およびISIS 2302(配列番号22)は、ICAM−1の細胞表面発現を 減少させた(実施例16におけるようにELISAにより検出)。5−リポオキ シゲナーゼに相補的な陰性対照オリゴヌクレオチドISIS 1822は、IC AM−1発現に影響を及ぼさなかった。このデータは、対照の活性に対するパー センテージとして示され、以下のように算出した。 (オリゴヌクレオチド処理済みサイトカイン誘導化細胞についてのICAM−1 発現)−(基準的ICAM−1発現)/(ICAM−1サイトカイン誘導化発現 )−(基準的ICAM−1発現)×100 ISIS 1939(配列番号15)およびISIS 2302(配列番号2 2)はICAM−1 mRANレベルを顕著に減少させたが(ノザンブロット分 析により検出)、ISIS−1570(配列番号1)はICAM−1 mRNA レベルをわずかに減少させるのみであった。 実施例17 実験的転移アッセイ:転移におけるICAM−1の役割を評価するために、実験 的転移アッセイを、無胸腺ヌードマウスの側方尾静脈内への1×105のC81 61細胞の注入により実施した。サイトカインであるTNF−αおよびインター フェロンγでのC8161細胞の処理によっては、ヌードマウス内への細胞の注 入を行った際に肺転移数の増大がもたらされることが既に示されている[Mil ler、D.E.およびWelch、D.R.(1990) Proc.Am. Assoc.Cancer Res. 13:353]。 4週間後にマウスを屠殺し、器官をブイン(Bouin’s)の固定液中で固 定し、そして肺の転移病変を解剖顕微鏡を使用して計数した。4週令の雌の無胸 腺ヌードマウス(Harlan Sprague Dawaley種)を使用し た。動物はNIHの基準に基づいて維持した。各4−8匹の群を実験的転移アッ セイにおいて検査した。 実施例18 アンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 1570およびISIS 2302 は、C8161細胞の転移能を減少させる:ICAM−1に相補的なアンチセン スオリゴヌクレオチドISIS 1570およびISIS 2302てのC81 61細胞の処理は、陽イオン性脂質であるリポフェクチン(Lipofecti n)(Gibco/BRL社、Gaithersburg、MD)の存在下にお いて実施した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは実施例3において記載のよう に合成した。細胞を106細胞/mlで60mmの組織培養用ディッシュに撒き 、そして37℃で3日間インキュベートし、Opti−MEM(Gibco/B RL社)で3度洗浄し、そして100μlのOpti−MEM培地を各ウエルに 添加した。0.5μMのオリゴヌクレオチドと15μg/mlのリポフェクチン とを室温において15分間混ぜ合わせた。25μlのオリゴヌクレオチド−リポ フェクチン混合物を適切なディッシュに添加し、そして37℃において4時間イ ンキュベートした。オリゴヌクレオチド−リポフェクチン混合物を除去し、そし て10%のウシ胎児血清を含むDME−F12培地と入れ替えた。4時間後に5 00U/mlのTNF−αを適切なウエルに添加し、そして18時間インキュベ ートし、この18時間目の時点で細胞をプレートから除去し、計数を行い、そし て無胸腺ヌードマウスに注入した。 ISIS 1570(配列番号1)もしくはISIS 2302(配列番号2 2でのC8161細胞の処理によってこれらの細胞の転移能は減少し、そしてT NF−α処理によりもたらされたC8161の転移能増加はなくなった。データ を表5に示す。 実施例19 ICAM−1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを検査するためのマウス モデル:細胞間接着分子により媒介されるものと思われる多くの症状はヒトにお ける研究へ持ち込むことが不可能である。一例では、同種異系移植片拒絶はIC AM−1の妨害を行うことにより改善されるものと思われる症状であるが、これ はヒトの移植患者よりもむしろ動物において評価すべきものであることは明らか である。他のこのような例は炎症性腸疾患であり、そして更に別のものは好中球 遊走(遊出)である。しかしながらこれらの症状は、本明細書において用いられ るマウスモデルのような動物モデルにおいて検査することができる。 マウス細胞におけるICAM−1発現の阻害のためのオリゴヌクレオチド配列 を同定した。マウスICAM−1は、ヒトのICAM−1配列と約50%の相同 性を有しており、そのためヒトのICAM−1を標的としたオリゴヌクレオチド の評定を行って得られた情報を使用して、マウスのICAM−1 mRNA配列 を標的とする一連のオリゴヌクレオチドを設計および合成した。免疫沈降アッセ イを使用してこれらのオリゴヌクレオチドについての活性のスクリーニングを行 った。 マウスDCEK−ICAM−1細胞(Dr.Adrienne Brian、 University of California at San Dieg o、より贈与された)を、37℃において4時間、20μg/mlのDOTMA /DOPE溶液の存在下において1μMのオリゴヌクレオチドで処理した。培地 を10%の透析済みウシ胎児血清および1μMのアンチセンスオリゴヌクレオチ ドを添加したメチオニン非含有培地と入れ替えた。細胞をメチオニン非含有培地 中で1時間インキュベートし、そしてその後100μCi/mlの35S−ラベル メチオニン/システイン混合物をその細胞に添加した。細胞を更に2時間インキ ュベートし、PBSで4回洗浄し、そして20mMのトリス、pH7.2、20 mMのKCl、5mMのEDTA、1%のTriton X−100、0.1m Mのロイペプチン、10μg/mlのアプロチニン、および1mMのPMSFを 含む緩衝液で抽出した。ICAM−1は、マウス−特異的ICAM−1抗体(Y N1/1.7.4)と共にインキュベートし、その後にプロテインG−セファロ ースにかけることにより抽出物から免疫沈降させた。この免疫沈降物をSDS− PAGEにより分析し、そしてオートラジオグラフィーにかけた。マウスICA M−1のAUGコドンを標的とするホスホロチオエートオリゴヌクレオチドIS IS 3066および3069は、ICAM−1合成を各々48%および63% 阻害した一方で、マウスICAMA−1 mRNAの3’−未翻訳領域における 配列を標的とするオリゴヌクレオチドISIS 3065およびISIS 30 82はICAM−1合成を各々47%および97%阻害した。マウスICAM− 1に対して最も活性の高いアンチセンスオリゴヌクレオチドは3’−未翻訳領域 を標的としていた。ISIS 3082についてこれらの結果に基づく更に詳細 な評定を行ったところ、この20−量体ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド は配列(5’から3’へ) TGC ATC CCC CAG GCC ACC AT (配列番号83) を含んでいた。 実施例20 ICAM−1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドはマウスモデル系におい て炎症性腸疾患を軽減する 炎症性腸疾患(IBD)についてのマウスモデルが最近開発された。Okay asu et al.、(1990) Gastroenterology 9 8:694−702。マウスへの硫酸デキストランの投与により、全ての詳細に おいてヒトのIBDに類似する結腸炎が誘導される。硫酸デキストラン誘導化I BDおよびヒトIBDについてはその後に、組織学的レベルにおけるより綿密な 比較が行われ、そしてこのマウスモデルは極度に再現性が良く、そして信頼でき るモデルであることが見いだされた。これを、本明細書中においては、マウスI CAM−1の3’−未翻訳領域に相補的な20−塩基ホスホロチオエートアンチ センスオリゴヌクレオチドISIS 3082の効果を検査するのに用いる。 体重約25−30グラムである雌のスイスウエブスター種(Swiss We bster)マウス(8週令)を標準的な条件下に維持する。マウスは、実験手 順の開始前少なくとも5日間は順化させる。マウスに、飲料水中に含まれる5% の硫酸デキストランを5日間与える(自由接種可能)。それに付随して、薬剤学 的担体中に含まれるISIS 3082、担体単独(陰性対照)、もしくはTG F−β(マウスにおける硫酸デキストラン介在性結腸炎を予防することが知られ ている)を投与する。ISIS 3082は5日間毎日の1mg/kgもしくは 10mg/kgの皮下注射として投与した。TGF−βは、1μg/マウスで結 腸内投与した。1mg/kgにおいては、このオリゴヌクレオチドは、硫酸デキ ストラン誘導性結腸炎の予防においてTGF−βと同様の効果を示した。 マウスは6日目に屠殺し、そして結腸を組織学的評定に供した。屠殺するまで の疾患作用については、体重変化に関してマウスを観察することおよび結腸炎の 兆候に関して便を観察することによる記録を行った。マウスの体重は毎日計測し た。便は粘稠度の変化について、ならびに潜在性もしくは総体的出血の存在につ いて毎日観察した。集計システムを使用して疾患作用係数を開発し、それにより 体重減少、便の粘稠度、および出血の存在を0から3までのスケールで等級付け を行い(0は正常であり、そして3は最も重篤な影響である)、そして係数を算 出した。疾患作用係数における薬物誘導性の変化を統計的に分析した。疾患作用 係数は概してIBDと極端に良好な状態で相関することが示された。結果を図1 6に示す。1mg/kgにおいては、このオリゴヌクレオチドは疾患係数を40 %減少させた。 実施例21 ICAM−1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドはマウス異所性心臓移植 モデルにおける生存率を増加させる 同種異系移植片拒絶の予防におけるICAM−1アンチセンスオリゴヌクレオ チドの治療効果を決定するために、マウスICAM−1特異的オリゴヌクレオチ ドISIS 3082を、マウスの血管化異所性心臓移植モデルにおける作用に ついて検査した。Balb/cマウスからの心臓を、Isobe et al. [(1991) Circulation 84:1246−1255]により 主に記載される初代血管化移植片としてC3Hマウスの腹腔内に移植した。オリ ゴヌクレオチドを7日用アルツェットポンプ(7−day Alzet pum p)を介する継続的静脈内投与により投与した。未治療マウスについての平均生 存期間は9.2±0.8日(8、9、9、9、10、10日)であった。7日間 5mg/kgのISIS 3082での治療を行ったマウスは、14.3±4. 6日(11、12、13、21日)にまで平均生存期間が伸びた。 実施例22 ICAM−1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは白血球遊走を減少させ る 組織および器官の白血球遊出は炎症性過程の主要な側面であり、そして炎症に よりもたらされる組織破壊に寄与している。白血球遊走におけるISIS 30 82の効果を、カラゲニンに浸したスポンジを皮下移植するマウスモデルを用い て調査した。カラゲニンは白血球遊走および水腫を剌激誘導する。炎症性滲出液 中の白血球遊走についてのオリゴヌクレオチドの効果を、移植したスポンジに遊 出する白血球の定量により評定する。4時間の絶食の後に40匹のマウスを、各 5匹のマウスを含む8つの群へと無作為抽出によりに割り振った。各マウスにM etofane(商標)での麻酔を施し、そして1mlの20mg/mlカラゲ ニン溶液を染み込ませたポリエステルスポンジを皮下移植した。群1には、スポ ンジ移植の前4時間目に10ml/kgでの食塩水を静脈投与し、そしてこれを 賦形剤対照として用いた。群2には、3mg/kgで20ml/kgの容積のイ ンドメタシン(陽性対照)を、手術直後、6−8時間後に再度、そして移植後2 1時間目にさらに再び経口投与した。群3には、ISIS 3082を5mg/ kgでスポンジ移植の3時間前に静脈投与した。群4には、ISIS 3082 を5mg/kgでスポンジ移植直後に静脈投与した。群5、6、7、および8に は、ISIS 3082を5mg/kgでスポンジ移植後各2、4、8、および 18時間目に投与した。移植後24時間目にスポンジを取り出し、EDTAおよ び食塩水(5ml)中に浸し、そして絞って乾かした。スポンジ滲出混合物中の 白血球の総数を決定した。 賦形剤対照群との比較を行うと、3mg/kgのインドメタシンの経口投与に より平均白血球計測数が79%減少した。 スポンジ移植の4時間前に5mg/kgのISIS 3082を投与した後に は、平均白血球計測数の42%の減少が観察された(群3)。スポンジ移植直後 に5mg/mlのISIS 3082を投与した後には、平均白血球計測数の4 7%の減少が観察された(群4)。全ての動物は研究過程の間中正常であるよう に思われた。 【配列表】 配列番号 1: (i)配列の特性: (A)配列の長さ:18 (B)型:Nucleic Acid (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直線状 (iv)アンチセンス:Yes (xi)配列: SEQ ID NO:1: 配列番号 2: (i)配列の特性: (A)配列の長さ:20 (B)型:Nucleic Acid (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直線状 (iv)アンチセンス:Yes (xi)配列: SEQ ID NO:2: 配列番号 3: (i)配列の特性: (A)配列の長さ:21 (B)型:Nucleic Acid (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直線状 (iv)アンチセンス:Yes (xi)配列: SEQID NO:3: 配列番号 4: (i)配列の特性 (A)配列の長さ:18 (B)型:Nucleic Acid (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直線状 (iv)アンチセンス:Yes (xi)配列: SEQID NO:4: 配列番号 5: (i)配列の特性: (A)配列の長さ:18 (B)型:Nucleic Acid (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直線状 (iv)アンチセンス:Yes (xi)配列: SEQ ID NO:5: 配列番号 6: (i)配列の特性: (A)配列の長さ:20 (B)型:Nucleic Acid (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直線状 (iv)アンチセンス:Yes (xi)配列: SEQID NO:6: 配列番号 7: (i)配列の特性: (A)配列の長さ:20 (B)型:Nucleic Acid (C)鎖の数:一本鎖 (D)トポロジー:直線状 (iv)アンチセンス:Yes (xi)配列: SEQ ID NO:7: 配列番号 8: (i)配列の特性: (A)配列の長さ:20 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【手続補正書】特許法第184条の8 【提出日】1994年9月27日 【補正内容】 請求の範囲 1. 細胞間接着分子−1をコードするメッセンジャーRNAの翻訳開始コドン 領域、5’キャップ領域または3’−非翻訳領域を標的とする、細胞間接着分子 −1の発現を調節しうるアンチセンスオリゴヌクレオチド。 2. 約3から約50ヌクレオチドを含む、請求項1記載のアンチセンスオリゴ ヌクレオチド。 3. ヌクレオチドユニット間の連結基の少なくとも1つがイオウ含有種を含む 、請求項1記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 4. ヌクレオチドユニット間の連結基の少なくとも1つがホスホロチオエート 部分を含む、請求項1記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 5. 請求項1記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容しう る担体を含む医薬組成物。 6. 配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 、14、15、22、23、24、25、26、27または84を含むアンチセ ンスオリゴヌクレオチド。 7. 内皮白血球接着分子−1をコードするメッセンジャーRNAの翻訳開始コ ドン領域、3’−非翻訳領域、5’−非翻訳領域またはイントロン/エキソン結 合部位を標的とする、内皮白血球接着分子−1の発現を調節しうるアンチセンス オリゴヌクレオチド。 8. 約3から約50ヌクレオチドを含む、請求項7記載のアンチセンスオリゴ ヌクレオチド。 9. ヌクレオチドユニット間の連結基の少なくとも1つがイオウ含有種を含む 、請求項7記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 10. ヌクレオチドユニット間の連結基の少なくとも1つがホスホロチオエー ト部分を含む、請求項7記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 11. 請求項7記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容し うる担体を含む医薬組成物。 12. 配列番号28、29、30、31、32、33、34、35、36、3 7、38、39、52、53、54、55、56、57、58または59を含む アンチセンスオリゴヌクレオチド。 13. 血管細胞接着分子−1をコードするメッセンジャーRNAの翻訳開始コ ドン領域、翻訳終止コドン領域、コーディング領域、3’−非翻訳領域、5’− 非翻訳領域またはイントロン/エキソン結合部位を標的とする、内皮白血球接着 分子−1の発現を調節しうるアンチセンスオリゴヌクレオチド。 14. 約3から約50ヌクレオチドを含む、請求項13記載のアンチセンスオ リゴヌクレオチド。 15. ヌクレオチドユニット間の連結基の少なくとも1つがイオウ含有種を含 む、請求項13記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 16. ヌクレオチドユニット間の連結基の少なくとも1つがホスホロチオエー ト部分を含む、請求項13記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 17. 請求項13記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容 しうる担体を含む医薬組成物。 18. 配列番号50、51、60、61、62、63、64、65、66、6 7、68、69、70、71または72を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド 。 19. 細胞または組織中の細胞間接着分子−1の合成を調節する方法であって 、細胞または組織を、細胞間接着分子−1をコードするメッセンジャーRNAの 翻訳開始コドン領域、5’キャップ領域または3’−非翻訳領域を標的とするア ンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含む方法。 20. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがイオウ含有種を含む、請求項19記載の方法。 21. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがホスホロチオエート部分を含む、請求項19記載の方法。 22. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号1、2、3、4、5、6 、7、8、9、10、11、12、13、14、15、22、23、24、25 、26、27または84を含む請求項19記載の方法。 23. 細胞または組織中の内皮白血球接着分子−1の合成を調節する方法であ って、細胞または組織を、内皮白血球接着分子−1をコードするメッセンジャー RNAの翻訳開始コドン領域、3’−非翻訳領域、5’−非翻訳領域またはイン トロン/エキソン結合部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触 させることを含む方法。 24. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがイオウ含有種を含む、請求項23記載の方法。 25. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがホスホロチオエート部分を含む、請求項23記載の方法。 26. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号28、29、30、31 、32、33、34、35、36、37、38、39、52、53、54、55 、56、57、58または59を含む、請求項23記載の方法。 27. 細胞または組織中の血管細胞接着分子−1の合成を調節する方法であっ て、細胞または組織を、血管細胞接着分子−1をコードするメッセンジャーRN Aの翻訳開始コドン領域、翻訳終止コドン領域、コーディング領域、3’−非翻 訳領域、5’−非翻訳領域またはイントロン/エキソン結合部位を標的とするア ンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含む方法。 28. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがイオウ含有種を含む、請求項27記載の方法。 29. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがホスホロチオエート部分を含む、請求項27記載の方法。 30. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号50、51、60、61 、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71または72を 含む請求項27記載の方法。 31. 細胞間接着分子−1の変化により調節される疾患を有すると疑われる動 物を治療する方法であって、動物に、治療上有効量の、細胞間接着分子−1をコ ードするメッセンジャーRNAの翻訳開始コドン領域、5’キャップ領域または 3’−非翻訳領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与すること を含む方法。 32. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがイオウ含有種を含む、請求項31記載の方法。 33. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがホスホロチオエート部分を含む、請求項31記載の方法。 34.アンチセンスオリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドお よび薬学的に受容しうる担体を含む医薬組成物中において投与される、請求項3 1記載の方法。 35. アンチセンスオリゴヌクレオチドが局所的に投与される、請求項31記 載の方法。 36. アンチセンスオリゴヌクレオチドが全身的に投与される、請求項31記 載の方法。 37. 前記疾患が同種異系移植片拒絶である、請求項31記載の方法。 38. 前記疾患が乾癬である、請求項31記載の方法。 39. 前記疾患が炎症性疾患である、請求項31記載の方法。 40. 前記炎症性疾患が炎症性腸疾患である、請求項39記載の方法。 41. 前記炎症性疾患が白血球侵潤により特徴づけられる、請求項39記載の 方法。 42. 前記疾患が転移により特徴づけられる、請求項31記載の方法。 43. 前記転移が肺に影響を及ぼす、請求項42記載の方法。 44. 前記疾患が悪性黒色腫である、請求項31記載の方法。 45. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号1、2、3、4、5、6 、7、8、9、10、11、12、13、14、15、22、23、24、25 、26、27または84を含む請求項31記載の方法。 46. 内皮白血球接着分子−1の変化により調節される疾患を有すると疑われ る動物を治療する方法であって、動物に、治療上有効量の、内皮白血球接着分子 −1をコードするメッセンジャーRNAの翻訳開始コドン領域、3’−非翻訳領 域、5’−非翻訳領域またはイントロン/エキソン結合部位を標的とするアンチ センスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。 47. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがイオウ含有種を含む、請求項46記載の方法。 48. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがホスホロチオエート部分を含む、請求項46記載の方法。 49. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド および薬学的に受容しうる担体を含む医薬組成物中において投与される、請求項 46記載の方法。 50. アンチセンスオリゴヌクレオチドが局所的に投与される、請求項46記 載の方法。 51. アンチセンスオリゴヌクレオチドが全身的に投与される、請求項46記 載の方法。 52. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号28、29、30、31 、32、33、34、35、36、37、38、39、52、53、54、55 、56、57、58または59を含む、請求項46記載の方法。 53. 血管細胞接着分子−1の変化により調節される疾患を有すると疑われる 動物を治療する方法であって、動物に、治療上有効量の、血管細胞接着分子−1 をコードするメッセンジャーRNAの翻訳開始コドン領域、翻訳終止コドン領域 、コーディング領域、3’−非翻訳領域、5’−非翻訳領域またはイントロン/ エキソン結合部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与すること を含む方法。 54. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがイオウ含有種を含む、請求項53記載の方法。 55. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがホスホロチオエート部分を含む、請求項53記載の方法。 56. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド および薬学的に受容しうる担体を含む医薬組成物中において投与される、請求項 53記載の方法。 57. アンチセンスオリゴヌクレオチドが局所的に投与される、請求項53記 載の方法。 58. アンチセンスオリゴヌクレオチドが全身的に投与される、請求項53記 載の方法。 59. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号50、51、60、61 、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71または72を 含む請求項53記載の方法。 60. 転移性状態を有すると疑われる動物において転移を減少させる方法であ って、動物に、治療上有効量の、細胞間接着分子−1をコードするメッセンジャ ーRNAの翻訳開始コドン領域、5’キャップ領域または3’−非翻訳領域を標 的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。 61. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがイオウ含有種を含む、請求項60記載の方法。 62. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがホスホロチオエート部分を含む、請求項60記載の方法。 63.アンチセンスオリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドお よび薬学的に受容しうる担体を含む医薬組成物中において投与される、請求項6 0記載の方法。 64. 転移が肺に生ずる、請求項60記載の方法。 65. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号1、2、3、4、5、6 、7、8、9、10、11、12、13、14、15、22、23、24、25 、26、27または84を含む請求項60記載の方法。 66. 転移性状態を有すると疑われる動物において転移を減少させる方法であ って、動物に、治療上有効量の、内皮白血球接着分子−1をコードするメッセン ジャーRNAの翻訳開始コドン領域、3’−非翻訳領域、5’−非翻訳領域また はイントロン/エキソン結合部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド を投与することを含む方法。 67. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがイオウ含有種を含む、請求項66記載の方法。 68. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがホスホロチオエート部分を含む、請求項66記載の方法。 69.アンチセンスオリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドお よび薬学的に受容しうる担体を含む医薬組成物中において投与される、請求項6 6記載の方法。 70. 転移が肺に生ずる、請求項66記載の方法。 71. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号28、29、30、31 、32、33、34、35、36、37、38、39、52、53、54、55 、56、57、58または59を含む、請求項66記載の方法。 72. 転移性状態を有すると疑われる動物において転移を減少させる方法であ って、動物に、治療上有効量の、血管細胞接着分子−1をコードするメッセンジ ャーRNAの翻訳開始コドン領域、翻訳終止コドン領域、コーディング領域、3 ’−非翻訳領域、5’−非翻訳領域またはイントロン/エキソン結合部位を標的 とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。 73. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがイオウ含有種を含む、請求項72記載の方法。 74. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがホスホロチオエート部分を含む、請求項72記載の方法。 75.アンチセンスオリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドお よび薬学的に受容しうる担体を含む医薬組成物中において投与される、請求項7 2記載の方法。 76. 転移が肺に生ずる、請求項72記載の方法。 77. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号50、51、60、61 、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71または72を 含む請求項72記載の方法。 78. 乾癬を治療する方法であって、乾癬を有すると疑われる動物に、治療上 有効量の、細胞間接着分子−1をコードするメッセンジャーRNAの翻訳開始コ ドン領域、5’キャップ領域または3’−非翻訳領域を標的とするアンチセンス オリゴヌクレオチドを投与することを含む方法。 79.アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号22を含む、請求項78記載 の方法。 【手続補正書】 【提出日】1995年4月24日 【補正内容】 請求の範囲 1. 細胞間接着分子−1をコードするメッセンジャーRNAの翻訳開始コドン 領域、5’キャップ領域または3’−非翻訳領域を標的とする、細胞間接着分子 −1の発現を調節しうるアンチセンスオリゴヌクレオチド。 2. 約3から約50ヌクレオチドを含む、請求項1記載のアンチセンスオリゴ ヌクレオチド。 3. ヌクレオチドユニット間の連結基の少なくとも1つがイオウ含有種を含む 、請求項1記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 4. ヌクレオチドユニット間の連結基の少なくとも1つがホスホロチオエート 部分を含む、請求項1記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 5. 請求項1記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容しう る担体を含む、細胞間接着分子−1の発現を調節するための医薬組成物。 6. 配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 、14、15、22、23、24、25、26、27または84を含むアンチセ ンスオリゴヌクレオチド。 7. 内皮白血球接着分子−1をコードするメッセンジャーRNAの翻訳開始コ ドン領域、3’−非翻訳領域、5’−非翻訳領域またはイントロン/エキソン結 合部位を標的とする、内皮白血球接着分子−1の発現を調節しうるアンチセンス オリゴヌクレオチド。 8. 約3から約50ヌクレオチドを含む、請求項7記載のアンチセンスオリゴ ヌクレオチド。 9. ヌクレオチドユニット間の連結基の少なくとも1つがイオウ含有種を含む 、請求項7記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 10. ヌクレオチドユニット間の連結基の少なくとも1つがホスホロチオエー ト部分を含む、請求項7記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 11. 請求項7記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容し うる担体を含む、内皮白血球接着分子−1の発現を調節するための医薬組成物。 12. 配列番号28、29、30、31、32、33、34、35、36、3 7、38、39、52、53、54、55、56、57、58または59を含む アンチセンスオリゴヌクレオチド。 13. 血管細胞接着分子−1をコードするメッセンジャーRNAの翻訳開始コ ドン領域、翻訳終止コドン領域、コーディング領域、3’−非翻訳領域、5’− 非翻訳領域またはイントロン/エキソン結合部位を標的とする、血管細胞接着分 子−1の発現を調節しうるアンチセンスオリゴヌクレオチド。 14. 約3から約50ヌクレオチドを含む、請求項13記載のアンチセンスオ リゴヌクレオチド。 15. ヌクレオチドユニット間の連結基の少なくとも1つがイオウ含有種を含 む、請求項13記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 16. ヌクレオチドユニット間の連結基の少なくとも1つがホスホロチオエー ト部分を含む、請求項13記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 17. 請求項13記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容 しうる担体を含む、血管細胞接着分子−1の発現を調節するための医薬組成物。 18. 配列番号50、51、60、61、62、63、64、65、66、6 7、68、69、70、71または72を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド 。 19. 細胞または組織中の細胞間接着分子−1の合成を調節する方法であって 、細胞または組織を、細胞間接着分子−1をコードするメッセンジャーRNAの 翻訳開始コドン領域、5’キャップ領域または3’−非翻訳領域を標的とするア ンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含む方法。 20. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがイオウ含有種を含む、請求項19記載の方法。 21. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがホスホロチオエート部分を含む、請求項19記載の方法。 22. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号1、2、3、4、5、6 、7、8、9、10、11、12、13、14、15、22、23、24、25 、26、27または84を含む請求項19記載の方法。 23. 細胞または組織中の内皮白血球接着分子−1の合成を調節する方法であ って、細胞または組織を、内皮白血球接着分子−1をコードするメッセンジャー RNAの翻訳開始コドン領域、3’−非翻訳領域、5’−非翻訳領域またはイン トロン/エキソン結合部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触 させることを含む方法。 24. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがイオウ含有種を含む、請求項23記載の方法。 25. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがホスホロチオエート部分を含む、請求項23記載の方法。 26. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号28、29、30、31 、32、33、34、35、36、37、38、39、52、53、54、55 、56、57、58または59を含む、請求項23記載の方法。 27. 細胞または組織中の血管細胞接着分子−1の合成を調節する方法であっ て、細胞または組織を、血管細胞接着分子−1をコードするメッセンジャーRN Aの翻訳開始コドン領域、翻訳終止コドン領域、コーディング領域、3’−非翻 訳領域、5’−非翻訳領域またはイントロン/エキソン結合部位を標的とするア ンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含む方法。 28. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがイオウ含有種を含む、請求項27記載の方法。 29. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがホスホロチオエート部分を含む、請求項27記載の方法。 30. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号50、51、60、61 、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71または72を 含む請求項27記載の方法。 31. 細胞間接着分子−1の変化により調節される疾患を有すると疑われる動 物を治療するための医薬組成物であって、治療上有効量の、細胞間接着分子−1 をコードするメッセンジャーRNAの翻訳開始コドン領域、5’キャップ領域ま たは3’−非翻訳領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学 的に受容しうる担体を含む医薬組成物。 32. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがイオウ含有種を含む、請求項31記載の組成物。 33. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがホスホロチオエート部分を含む、請求項31記載の組成物。 34. 前記疾患が同種異系移植片拒絶である、請求項31記載の組成物。 35. 前記疾患が乾癬である、請求項31記載の組成物。 36. 前記疾患が炎症性疾患である、請求項31記載の組成物。 37. 前記炎症性疾患が炎症性腸疾患である、請求項36記載の組成物。 38. 前記炎症性疾患が白血球侵潤により特徴づけられる、請求項36記載の 組成物。 39. 前記疾患が転移により特徴づけられる、請求項31記載の組成物。 40. 前記転移が肺に影響を及ぼす、請求項39記載の組成物。 41. 前記疾患が悪性黒色腫である、請求項31記載の組成物。 42. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号1、2、3、4、5、6 、7、8、9、10、11、12、13、14、15、22、23、24、25 、26、27または84を含む請求項31記載の組成物。 43. 内皮白血球接着分子−1の変化により調節される疾患を有すると疑われ る動物を治療するための医薬組成物であって、治療上有効量の、内皮白血球接着 分子−1をコードするメッセンジャーRNAの翻訳開始コドン領域、3’−非翻 訳領域、5’−非翻訳領域またはイントロン/エキソン結合部位を標的とするア ンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に受容しうる担体を含む医薬組成物 。 44. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがイオウ含有種を含む、請求項43記載の組成物。 45. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがホスホロチオエート部分を含む、請求項43記載の組成物。 46. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号28、29、30、31 、32、33、34、35、36、37、38、39、52、53、54、55 、56、57、58または59を含む、請求項43記載の組成物。 47. 血管細胞接着分子−1の変化により調節される疾患を有すると疑われる 動物を治療するための医薬組成物であって、治療上有効量の、血管細胞接着分子 −1をコードするメッセンジャーRNAの翻訳開始コドン領域、翻訳終止コドン 領域、コーディング領域、3’−非翻訳領域、5’−非翻訳領域またはイントロ ン/エキソン結合部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学 的に受容しうる担体を含む医薬組成物。 48. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがイオウ含有種を含む、請求項47記載の組成物。 49. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがホスホロチオエート部分を含む、請求項47記載の組成物。 50. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号50、51、60、61 、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71または72を 含む請求項47記載の組成物。 51. 転移性状態を有すると疑われる動物において転移を減少させるための医 薬組成物であって、治療上有効量の、細胞間接着分子−1をコードするメッセン ジャーRNAの翻訳開始コドン領域、5’キャップ領域または3’−非翻訳領域 を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に受容しうる担体を 含む医薬組成物。 52. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがイオウ含有種を含む、請求項51記載の組成物。 53. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがホスホロチオエート部分を含む、請求項51記載の組成物。 54. 転移が肺に生ずることを特徴とする、請求項51記載の組成物。 55. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号1、2、3、4、5、6 、7、8、9、10、11、12、13、14、15、22、23、24、25 、26、27または84を含む請求項51記載の組成物。 56. 転移性状態を有すると疑われる動物において転移を減少させるための医 薬組成物であって、治療上有効量の、内皮白血球接着分子−1をコードするメッ センジャーRNAの翻訳開始コドン領域、3’−非翻訳領域、5’−非翻訳領域 またはイントロン/エキソン結合部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオ チドおよび薬学的に受容しうる担体を含む医薬組成物。 57. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがイオウ含有種を含む、請求項56記載の組成物。 58. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがホスホロチオエート部分を含む、請求項56記載の組成物。 59. 転移が肺に生ずることを特徴とする、請求項56記載の組成物。 60. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号28、29、30、31 、32、33、34、35、36、37、38、39、52、53、54、55 、56、57、58または59を含む、請求項56記載の組成物。 61. 転移性状態を有すると疑われる動物において転移を減少させるための医 薬組成物であって、治療上有効量の、血管細胞接着分子−1をコードするメッセ ンジャーRNAの翻訳開始コドン領域、翻訳終止コドン領域、コーディング領域 、3’−非翻訳領域、5’−非翻訳領域またはイントロン/エキソン結合部位を 標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に受容しうる担体を含 む医薬組成物。 62. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがイオウ含有種を含む、請求項61記載の組成物。 63. アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニット間の連結基の 少なくとも1つがホスホロチオエート部分を含む、請求項61記載の組成物。 64. 転移が肺に生ずることを特徴とする、請求項61記載の組成物。 65. アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号50、51、60、61 、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71または72を 含む請求項61記載の組成物。 66. 乾癬を治療するための医薬組成物であって、治療上有効量の、細胞間接 着分子−1をコードするメッセンジャーRNAの翻訳開始コドン領域、5’キャ ップ領域または3’−非翻訳領域を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド および薬学的に受容しうる担体を含む医薬組成物。 67.アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号22を含む、請求項66記載 の組成物。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI C07H 21/04 B 8615−4C (31)優先権主張番号 08/063,167 (32)優先日 1993年5月17日 (33)優先権主張国 米国(US) (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FR,GB,BR,IE,IT,LU,M C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG ,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN, TD,TG),AU,BB,BG,BR,BY,CA, CZ,FI,HU,JP,KP,KR,KZ,LK,M G,MN,MW,NO,NZ,PL,RO,RU,SD ,SK,UA,VN

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1. 細胞接着を調節しうる蛋白質をコードする核酸の少なくとも一部と特異的 にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。 2. mRNAと特異的にハイブリダイズしうる請求項1記載のオリゴヌクレオ チド。 3. 遺伝子と特異的にハイブリダイズして前記遺伝子から生ずるmRNAの量 を調節するための3重鎖構造を形成する、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。 4. 転写開始部位、翻訳開始部位、5’−非翻訳配列、3’−非翻訳配列また はイントロン/エキソン結合部位と特異的にハイブリダイズしうる、請求項2記 載のオリゴヌクレオチド。 5. 5’キャップ部位または介在配列と特異的にハイブリダイズしうる、請求 項4記載のオリゴヌクレオチド。 6. 前記蛋白質が細胞間接着分子−1である、請求項1記載のオリゴヌクレオ チド。 7. 前記蛋白質が内皮白血球接着分子−1である、請求項1記載のオリゴヌク レオチド。 8. 前記蛋白質が血管細胞接着分子−1である、請求項1記載のオリゴヌクレ オチド。 9. 約3から約50ヌクレオチドを含む、請求項1記載のオリゴヌクレオチド 。 10. 約8から約25ヌクレオチドを含む、請求項1記載のオリゴヌクレオチ ド。 11. 約10から約20ヌクレオチドを含む、請求項1記載のオリゴヌクレオ チド。 12. 請求項1記載のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容しうる担体を含 む医薬組成物。 13. ヌクレオチドユニット間の連結基の少なくとも1つがイオウ含有種を含 む、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。 14. ヌクレオチドユニット間の連結基の少なくとも1つがホスホロチオエー ト部分を含む、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。 15. 配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、13、14、15、16、 22、28、40、41、42、43、44、45、46、47、48、73、 74、75、76、77、78、79、80または85を含むオリゴヌクレオチ ド。 16. 請求項15記載のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容しうる担体を 含む医薬組成物。 17. ヌクレオチドユニット間の連結基の少なくとも1つがイオウ含有種を含 む、請求項15記載のオリゴヌクレオチド。 18. ヌクレオチドユニット間の連結基の少なくとも1つがホスホロチオエー ト部分を含む、請求項15記載のオリゴヌクレオチド。 19. 細胞または組織中の細胞間接着分子の合成を調節する方法であって、細 胞または組織を、細胞接着を調節しうる蛋白質をコードする核酸の少なくとも一 部と特異的にハイブリダイズして細胞または組織中の細胞間接着分子の合成を調 節しうるオリゴヌクレオチドと接触させることを含む方法。 20. 前記オリゴヌクレオチドが、転写開始部位、翻訳開始部位、5’−非翻 訳配列、3’−非翻訳配列または介在配列と特異的にハイブリダイズしうる、請 求項19記載の方法。 21. 前記オリゴヌクレオチドが、mRNAの5’キャップ部位またはそれと 隣接する配列と特異的にハイブリダイズしうる、請求項19記載の方法。 22. 前記蛋白質が細胞間接着分子−1である、請求項19記載の方法。 23. 前記蛋白質が内皮白血球接着分子−1である、請求項19記載の方法。 24. 前記蛋白質が血管細胞接着分子−1である、請求項19記載の方法。 25. オリゴヌクレオチドが、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、1 3、14、15、16、22、28、40、41、42、43、44、45、4 6、47、48、73、74、75、76、77、78、79、80または85 を含む、請求項19記載の方法。 26. ヌクレオチドユニット間の連結基の少なくとも1つがイオウ含有種を含 む、請求項19記載の方法。 27. ヌクレオチドユニット間の連結基の少なくとも1つがホスホロチオエー ト部分を含む、請求項19記載の方法。 28. 細胞間接着分子の変化により調節される疾患を有すると疑われる動物を 治療する方法であって、動物を、治療上有効量の、細胞接着分子の合成または代 謝を調節する蛋白質の少なくとも一部をコードする核酸と特異的にハイブリダイ ズしうるオリゴヌクレオチドと接触させることを含む方法。 29. 前記オリゴヌクレオチドが、転写開始部位、翻訳開始部位、5’−非翻 訳配列、3’−非翻訳配列または介在配列と特異的にハイブリダイズしうる、請 求項28記載の方法。 30. 前記オリゴヌクレオチドが、mRNAの5’キャップ部位および隣接す る配列と特異的にハイブリダイズしうる、請求項28記載の方法。 31. 前記蛋白質が細胞間接着分子−1である、請求項28記載の方法。 32. 前記蛋白質が内皮白血球接着分子−1である、請求項28記載の方法。 33. 前記蛋白質が血管細胞接着分子−1である、請求項28記載の方法。 34. 前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容し うる担体を含む医薬組成物として投与される、請求項28記載の方法。 35. オリゴヌクレオチドが局所的に投与される、請求項28記載の方法。 36. オリゴヌクレオチドが全身的に投与される、請求項28記載の方法。 37. オリゴヌクレオチドが、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、1 3、14、15、16、22、28、40、41、42、43、44、45、4 6、47、48、73、74、75、76、77、78、79、80または85 を含む、請求項28記載の方法。 38. ヌクレオチドユニット間の連結基の少なくとも1つがイオウ含有種を含 む、請求項28記載の方法。 39. ヌクレオチドユニット間の連結基の少なくとも1つがホスホロチオエー ト部分を含む、請求項28記載の方法。 40. 表3の配列から選択される、請求項7記載のオリゴヌクレオチド。 41. 配列番号31、32、33、35、36、52、53、54、56、5 7または58を含む、請求項7記載のオリゴヌクレオチド。 42. 表4において同定される配列を含む、請求項8記載のオリゴヌクレオチ ド。 43. 配列番号50、51、60、63、65、67、68、70、71また は72を含む、請求項8記載のオリゴヌクレオチド。 44. 前記疾患が同種異系移植片拒絶である、請求項28記載の方法。 45. 配列番号1を含むオリゴヌクレオチド。 46. 配列番号15を含むオリゴヌクレオチド。 47. 配列番号22を含むオリゴヌクレオチド。 48. 配列番号33または56を含むオリゴヌクレオチド。 49. 配列番号50または67を含むオリゴヌクレオチド。 50. オリゴヌクレオチドが配列番号1、配列番号15、配列番号22または 配列番号84を含む、請求項19記載の方法。 51. オリゴヌクレオチドが配列番号33または56を含む、請求項19記載 の方法。 52. オリゴヌクレオチドが配列番号50または67を含む、請求項19記載 の方法。 53. オリゴヌクレオチドが配列番号1、配列番号15、配列番号22または 配列番号84を含む、請求項28記載の方法。 54. オリゴヌクレオチドが配列番号33または56を含む、請求項28記載 の方法。 55. オリゴヌクレオチドが配列番号50または67を含む、請求項28記載 の方法。 56. 前記疾患が乾癬である、請求項28記載の方法。 57. 前記疾患が炎症性疾患である、請求項28記載の方法。 58. 前記炎症性疾患が炎症性腸疾患である、請求項57記載の方法。 59. 前記炎症性疾患が白血球侵潤により特徴づけられる、請求項57記載の 方法。 60. 前記疾患が転移により特徴づけられる、請求項28記載の方法。 61. 前記転移が肺に影響を及ぼす、請求項60記載の方法。 62. 前記疾患が悪性黒色腫である、請求項28記載の方法。 63. 転移性状態を有すると疑われる動物において転移を減少させる方法であ って、動物を、治療上有効量の、細胞接着分子の合成または代謝を調節する蛋白 質の少なくとも一部をコードする核酸と特異的にハイブリダイズしうるオリゴヌ クレオチドと接触させることを含む方法。 64. 前記オリゴヌクレオチドが、転写開始部位、翻訳開始部位、5’−非翻 訳配列、3’−非翻訳配列または介在配列と特異的にハイブリダイズしうる、請 求項63記載の方法。 65. 前記オリゴヌクレオチドが、mRNAの5’キャップ部位および隣接す る配列と特異的にハイブリダイズしうる、請求項63記載の方法。 66. 前記蛋白質が細胞間接着分子−1である、請求項63記載の方法。 67. 前記蛋白質が内皮白血球接着分子−1である、請求項63記載の方法。 68. 前記蛋白質が血管細胞接着分子−1である、請求項63記載の方法。 69. 前記オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容し うる担体を含む医薬組成物として投与される、請求項63記載の方法。
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