JP2732546B2 - 細胞接着のオリゴヌクレオチド調節 - Google Patents
細胞接着のオリゴヌクレオチド調節Info
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Description
発明の分野 本発明は、細胞接着分子の合成もしくは代謝の調節に
反応する疾患状態のための診断法、研究用試薬、および
治療法に関する。本発明は具体的には、白血球細胞の他
の白血球細胞および他の細胞種への接着を調節する蛋白
質の合成に関与する所定のメッセンジャーリボ核酸（mR
NA）もしくはDNAとのアンチセンスオリゴヌクレオチド
相互作用に関する。細胞間接着分子−１（ICAM−１）、
内皮白血球接着分子−１（Ｅ−セレクチンとしても知ら
れるELAM−１）、および血管細胞接着分子−１（VCAM−
１）をコードするmRNAにハイブリダイズするように設計
されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。
これらのオリゴヌクレオチドはRNAもしくはDNAの活性調
節を誘導し、そしてそのことにより特異的細胞接着分子
の合成および代謝の調節を誘導することが見いだされ
た。 発明の背景 炎症は、損傷、感染、もしくは組織破壊に反応する組
織により誘導される局所的防御反応であり、これにより
感染性もしくは損傷性作用物質の破壊および損傷を受け
た組織の分離がもたらされる。典型的な炎症反応は次に
示すように進行する。外因性物質としての抗原の認識も
しくは組織損傷の認識、可溶性炎症性媒介物質の合成お
よび放出、感染もしくは組織損傷の部位への炎症細胞の
補充、侵略生体物もしくは損傷組織の破壊および除去、
ならびに一度侵略生体物もしくは損傷組織が分解された
直後のその系の非活性化である。炎症性構成成分に係わ
るヒトの疾患の多くのものにおいては炎症反応を弱める
正常なホメオスタシス機構が欠損しており、このことに
より正常組織の損傷および破壊がもたらされる。 細胞−細胞相互作用は、先に記載の各段階における免
疫反応の活性に係わっている。正常な炎症反応における
最も初期の検出可能なできごとの内の一つは血管内皮へ
の白血球の接着であり、この後に、血管系を出て炎症も
しくは損傷部位へと向かう白血球の遊走が続く。これら
の白血球（leukocytes）、すなわち白血球（white bloo
d cells）の血管内皮への接着は、血管系外への遊走に
おける必須段階である。Harlan J.M.、Blood 1985、6
5、513−525。一般的には、炎症部位に出現する最初の
炎症細胞は好中球であり、この後に単球、そして白血球
が続く。細胞−細胞相互作用もＢ−白血球とＴ−白血球
の両方の増殖にとって重要であり、これにより各々体液
性反応および細胞性免疫反応の亢進がもたらされる。 血管内皮および他の細胞種への白血球の接着は、白血
球細胞と血管内の両方の原形質膜上に存在する「接着分
子」と称される特異的蛋白質間の相互作用により媒介さ
れる。接着分子間の相互作用は、リガンドが可溶性であ
る代わりに細胞表面に固定化されていることを除外して
は古典的なレセプター−リガンド相互作用に類似してい
る。白血球接着における遺伝子欠損を有する患者を同定
することにより、研究者は白血球の接着の原因となる一
群の蛋白質を同定することが可能となる。白血球接着欠
損症（LAD）は、再発性細菌感染、および悪性膿形成、
および創傷治癒により特徴付けられる稀な常染色体特性
である。この欠損症は、通常白血球の細胞外膜上に発現
するMac−１、LFA−１、およびp150,95という３つのヘ
テロ二量体糖蛋白質の共通なＢ−サブユニット中に生じ
ることが示されている。AndersonおよびSpringer、Ann.
Rev.Med.1987、38、175−194。LADを患う患者は、顆粒
球、単球、および白血球の広範な接着依存性機能スペク
トラムの欠損を示す。LFA−１については３つのリガン
ドが同定されており、それらは細胞間接着分子１、２、
および３（ICAM−１、ICAM−２、およびICAM−３）であ
る。Mac−１およびp150,95の両方共が補体断片C3bi、お
よび恐らく他の未同定リガンドに結合する。MAC−１も
やはりICAM−１に結合する。 白血球の血管内皮への接着および後続の血管系外への
遊走に関与する他の接着分子が同定されている。これら
には、内皮白血球接着分子−１（ELAM−１）、血管細胞
接着分子−１（VCAM−１）、顆粒膜蛋白質−140（GMP−
140）、およびそれら各々のレセプターがある。血管内
皮への白血球の接着は、部分的にもしくは全て５つの細
胞接着分子、ICAM−１、ICAM−２、ELAM−１、VCAM−
１、およびGMP−140により媒介されているようである。
DustinおよびSpringer、J.Cell Biol.1987、107、321−
331。接着分子ICAM−１、ELAM−１、VCAM−１、およびG
MP−140の細胞表面上での発現は炎症性刺激により誘導
される。それとは対照的に、ICAM−２の発現は構成的で
あり、そしてサイトカインによる誘導に感受性を示さな
いように思われる。一般的にGMP−140はヒスタミン、ロ
イコトリエンB4、血小板活性化因子、およびトロンビン
のようなオータコイドにより誘導される。内皮細胞上で
の最大発現は刺激後30分から１時間目までに観察され、
そして基準線には２−３時間以内に戻る。内皮細胞上で
のELAM−１およびVCAM−１の発現は、インターロイキン
−１βおよび腫瘍壊死因子のようなサイトカインにより
誘導されるが、ガンマー−インターフェロンによっては
誘導されない。内皮細胞表面上でのELAM−１の最大発現
は刺激後４−６時間目に生じ、そして16時間目までには
基準線に戻る。ELAM−１発現は新しいmRNAおよび蛋白質
合成に依存している。VCAM−１発現の増大は腫瘍壊死因
子での処理後２時間目に検出可能となり、刺激後８時間
目で最大値を示し、そして刺激後少なくとも48時間は増
大したままになる。RiceおよびBevilacqua、Science、1
989、246、1303−1306。内皮細胞上でのICAM−１発現
は、サイトカインであるインターロイキン−１、腫瘍壊
死因子、およびガンマー−インターフェロンにより誘導
される。ELAM−１の最大発現に続くICAM−１の最大発現
は、刺激後８−10時間目に生じ、そして少なくとも48時
間は上昇したままになる。 GMP−140およびELAM−１は主に血管内皮細胞への好中
球の接着に関与している。VCAM−１は主にＴおよびＢ白
血球に結合する。その上VCAM−１は黒色腫および恐らく
は他の癌の転移における役割を担っている可能性があ
る。ICAM−１は血管内皮への好中球の接着、ならびに血
管内皮、組織繊維芽細胞、および上皮ケラチノサイトへ
の単球の接着における役割を担っている。ICAM−１もや
はり抗原提示細胞のＴ−細胞認識、ナチュラルキラー細
胞による標的細胞の溶菌、白血球の活性化および増殖、
ならびに胸腺におけるＴ細胞成熟における役割を担って
いる。その上最近のデータにより、ICAM−１は、一般の
風邪の50％を上回る割合を占めるライノウイルスの主要
血清型の細胞成レセプターであることが示されている。
Staunton et al.、Cell 1989、56、849−853;Grave et
al.、Cell 1989、56、839−847。 ICAM−１発現は、アレルギー性接触性皮膚炎、固定薬
疹、偏平苔癬、および乾癬のような種々の炎症性皮膚疾
患に関連している。Ho et al.、J.Am.Acad.Dermatol.19
90、22、64−68;GriffithsおよびNickoloff、Am.J.Path
ology 1989、135、1045−1053;Lisby et al.、Br.J.Der
matol.1989、120、479−484;Shiohara et al.、Arch.De
rmatol.1989、125、1371−1376。その上ICAM−１発現
は、リューマチ性関節炎を患う患者の滑液;Hale et a
l.、Arth.Rheum.1989、32、22−30、糖尿病疾患の脾臓
Ｂ−細胞;Campbell et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.1989、86、4282−4286;グレービス氏疾患（Graves′
disease）を患う患者における胸腺小胞細胞;Weetman et
al.、J.Endocrinol.1989、122、185−191、ならびに腎
臓および同種異系肝臓移植片拒絶;FaullおよびRuss、Ta
nsplantation 1989、48、226−230;Adams et al.、Lanc
et 1989、1122−1125、において検出されている。 ICAM−１、VCAM−１、およびELAM−１発現の阻害剤に
より、喘息、リューマチ性関節炎、同種異系移植片拒
絶、炎症性腸疾患、種々の皮膚科的症状、および乾癬の
ような種々の炎症性疾患もしくは炎症性成分に関する疾
患に対する活性を有する治療用の種類の新規の抗−炎症
剤が提供されることが望まれていた。その上ICAM−１、
VCAM−１、およびELAM−１の阻害剤は、ライノウイルス
感染に起因する風邪、AIDS、カポジ肉腫、ならびにある
種の癌およびそれらの転移にも有効である可能性があ
る。細胞性接着分子であるELAM−１、VCAM−１、および
ICAM−１の発現を効果的に予防する治療剤は、今日まで
には知られていない。動物モデルにおけるICAM−１に対
する中和用モノクローナル抗体の利用により、もし同定
されたとしたらこのような阻害剤は、喘息;Wegner et a
l.、Science 1990、247、456−459、腎臓同種異系移植
片;Cosimi et al.、J.Immunol.1990、144、4604−461
2、および心臓同種異系移植片;Isobe et al.、Science
1992、255、1125−1127についての治療面での利益をも
たらすであろうという証拠が提供されている。ICAM−１
分子の可溶性形態の利用も、培養物中の細胞のライノウ
イルス感染の予防に有効であった。Marlin et al.、Nat
ure 1990、344、70−72。 細胞間接着分子について影響を与える現行の作用物質
には、合成ペプチド、モノクローナル抗体、および接着
分子の可溶化形態がある。VCAM−１もしくはELAM−１と
の相互作用を遮断する合成ペプチドは今日までには同定
されていない。モノクローナル抗体は、ICAM−１、VCAM
−１、およびELAM−１の発現に起因する急性炎症性反応
の治療に有用であることが証明される可能性がある。し
かしながら慢性的治療に関しては、宿主動物はそのモノ
クローナル抗体に対する抗体を生じさせ、それらの抗体
の有用性を制限する。その上モノクローナル抗体は大き
な蛋白質であり、このことが炎症性部位へのアクセスを
困難にしてしまう可能性がある。細胞接着分子の可溶化
形態は、それらの生産費用がかさみ、そして結合親和性
が低いことに加え、モノクローナル抗体のものと同様の
数多くの制限を課せられている。従って、細胞間接着分
子を効果的に阻害する分子が長いこと望まれてきた。ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは、ICAM−１、VCAM−
１、およびELAM−１の効果を遮断するのに用いられる現
行の作用物質の多くの落とし穴を回避する。 米国PCT出願第90/02357号（Hession et al.）は、ELA
M−１、ならびにVCAM−１およびVCAM−1bを初めとする
内皮接着分子（ELAMs）をコードするDNA配列を開示して
いる。これらのDNA配列の数々の利用法が提供され、そ
れには、（１）内皮細胞への白血球結合を阻害する治療
剤として使用することができる。これらの分子に反応性
を示すモノクローナル抗体調製物の製造、（２）白血球
上のELAMリガンドに結合し、次には内皮細胞上のELAMに
結合することができて、内皮細胞への白血球結合を阻害
するELAMペプチドの製造、（３）炎症を検出するため
の、ELAMに係合する分子の利用（抗−ELAM抗体、もしく
はリガンドもしくはその断片のような標識）、（４）ア
ンチセンス核酸でMRNAをマスクするか、あるいはリボザ
イムでそれを開裂するかのいずれかにより特異的MRNAの
翻訳を遮蔽する目的でアンチセンス核酸およびリボザイ
ムを使用する、翻訳レベルでELAMもしくはELAMリガンド
発現に介在する核酸分子を産生するためのELAMおよびEL
AMリガンドDNA配列の利用、がある。コーディング領域
が最適の標的であることが開示されている。VCAM−１に
ついてはAUGが最もそれらしく思われており、そのためA
UG部分にハイブリダイズする15量体が実施例17において
具体的に開示されている。 発明の目的 炎症性細胞接着分子の合成および発現における二次効
果を介する、免疫学的構成成分に関する疾患、同種異系
移植片、癌および転移、炎症性腸疾患、乾癬、および他
の皮膚疾患、風邪、およびAIDSのための治療を提供する
ことは、本発明の主な目的である。 細胞間接着性蛋白質をコードする核酸の機能を阻害す
ることが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供
することは、本発明の別の目的である。 細胞間接着の機能不全の診断のための方法を提供する
ことは、更に別の目的である。 本発明のこれらの目的および他の目的は、本明細書を
精査することにより明らかになるであろう。 図面の簡単な既述 図１は、ヒトの細胞間接着分子−１（ICAM−１）のmR
NA配列である。 図２は、ヒトの内皮白血球接着分子−１（ELAM−１）
のmRNA配列である。 図３は、ヒトの血管細胞接着分子−１（VCAM−１）の
mRNA配列である。 図４は、インターロイキン−１および腫瘍壊死因子に
よる種々のヒト細胞株の細胞表面におけるICAM−１発現
の誘導のグラフ表示である。 図５は、ヒト臍静脈内皮細胞上のICAM−１発現に対す
る選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果の
グラフ表示である。 図6Aおよび6Bは、腫瘍壊死因子およびインターロイキ
ン−１で刺激したヒト臍静脈内皮細胞でのICAM−１の発
現に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果のグ
ラフ表示である。 図７は、DMSOでの分化処理を施したHL−60細胞の、対
照および腫瘍壊死因子処理を施したヒト臍静脈内皮細胞
へのICAM−１介在性接着に対するアンチセンスオリゴヌ
クレオチドの効果のグラフ表示である。 図８は、A549ヒト肺癌細胞でのICAM−１発現に対する
選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果のグ
ラフ表示である。 図９は、ヒトの初代ケラチノサイトでのICAM−１発現
に対する選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの
効果のグラフ表示である。 図10は、オリゴヌクレオチの鎖長、TmおよびICAM−１
発現の阻害に対する効果の間の関係のグラフ表示であ
る。 表11は、DMSOでの分化処理を施したHL−60細胞の、対
照および腫瘍壊死因子処理を施したヒト臍静脈内皮細胞
へのICAM−１介在性接着に対する選択されたアンチセン
スオリゴヌクレオチドの効果のグラフ表示である。 図12は、腫瘍壊死因子での処理を施したヒト臍静脈内
皮細胞でのELAM−１発現に対する選択されたアンチセン
スオリゴヌクレオチドの効果のグラフ表示である。 図13は、ヒトELAM−1 mRNAのグラフ表示であり、アン
チセンスオリゴヌクレオチドの標的部位を示してある。 図14は、ヒトVCAM−1 mRNAのグラフ表示であり、アン
チセンスオリゴヌクレオチドの標的部位を示してある。 図15は、ICAM−１に相補的なアンチセンスオリゴヌク
レオチドでの処理後のC8161ヒト黒色腫細胞におけるICA
M−１発現の阻害を示す線グラフである。 図16は、硫酸デキストラン（DSS）により誘導した炎
症性腸疾患についてのISIS 3082の効果を示す棒グラフ
である。 発明の要約 本発明に従うと、細胞間接着分子−１（ICAM−１）、
血管細胞接着分子−１（VCAM−１）、および内皮白血球
接着分子−１（ELAM−１）をコードする核酸に特異的に
ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが提供される。
このオリゴヌクレオチドは直接mRNAに、あるいは三重鎖
構造を形成する選択されたDNA部分のいずれかに結合
し、このことによりその遺伝子から生ずるmRNAの量を調
節するように設計されている。 前述の関係は、一般的には「アンチセンス」として表
示される。このオリゴヌクレオチドは、RNAもしくはDNA
の機能、つまり蛋白質への翻訳、もしくは細胞質内への
輸送、もしくはその総体的生物学的機能に必要な他のい
ずれかの活性の内のどれかを阻害することが可能であ
る。RNAもしくはDNAがその機能の全てもしくは一部分を
実行できないために、細胞接着分子が正しく発現される
ように調節するゲノムの一部分の欠損がもたらされ、こ
のことにより、該代謝が調節される。 アンチセンスの攻撃については特異的遺伝子を標的と
することが好ましい。ICAM−１、VCAM−１、およびELAM
−１をコードする遺伝子がこの研究法にとって特に有用
であることを、我々は発見した。ICAM−１、VCAM−１、
およびELAM−１発現の阻害は、炎症性疾患、炎症性構成
成分に関する疾患、同種異系移植片拒絶、乾癬、および
多の皮膚疾患、炎症性腸疾患、癌およびその転移、なら
びにウイルス感染の治療に有効であることが期待され
る。 動物を、細胞接着を調節することが可能な蛋白質をコ
ードする核酸とハイブリダイズすることが可能なオリゴ
ヌクレオチドに接触させることを含む、細胞接着の調節
の方法が提供される。ICAM−１、VCAM−１、およびELAM
−１をコードするRNAもしくはDNAとハイブリダイズする
ことが可能なオリゴヌクレオチドが好ましい。診断のた
めの方法も本発明の一部分である。 好ましい態様の詳細な記述 アンチセンスオリゴヌクレオチドには、ヒトについて
の多くの疾患の治療のための治療剤としての偉大な可能
性が存在する。オリゴヌクレオチドは、ワトソン−クリ
ックの塩基対形成により特定されるように、前−mRNAも
しくは成熱したmRNAのいずれかの相補的配列に特異的に
結合してDNAから蛋白質への遺伝情報の流れを阻害す
る。アンチセンスオリゴヌクレオチドの特性はそれら自
体をそれらの標的配列にとって特異的なものにしている
が、そのような特性は、それらを極端に多目的なものに
もしている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは４つの
単量体単位からなる長い鎖であるため、それらをどのよ
うな標的RNA配列についても容易に合成することができ
る。多大な数にのぼる最近の研究により、標的蛋白質を
研究するための生化学的道具としてのアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドの利用性が証明されている。Rothenberg
et al.、J.Natl.Cancer Inst.1989、81、1539−1544;Z
on、G.Pharmaceutical Res.1988、５、539−549。細胞
取り込みの増加を示すヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオ
チドの合成における最近の進歩のため、現在では新規の
形態の治療法としてのアンチセンスオリゴヌクレオチド
の利用を考案することが可能となっている。 アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、従来の技術
の研究法で直面していた問題に対する理想的解決法が与
えられる。所定のイソ酵素を選択的に阻害するようにそ
れらを設計することができ、それらはその酵素の産生を
阻害し、そしてそれらは複数のレセプターを捕捉するも
しくはそれに結合する遊離ラジカルのような非特異的機
構を回避する。酵素機構もしくはレセプター−リガンド
相互作用を完全に理解することは、特異的阻害剤の設計
には必要でない。 標的の記述 好中球の炎症性部位内への急性浸潤は、内皮細胞表面
におけるGMP−140、ELAM−１、およびICAM−１の発現の
増大に起因するものと思われる。炎症反応の後期段階中
の白血球および単球の出現はVCAM−１およびICAM−１に
より媒介されるものと思われる。ELAM−１およびGMP−1
40は血管内皮細胞上で一時的に発現されるのに対し、VC
AM−１およびICAM−１は慢性的に発現される。 ヒトICAM−１は、55,219ダルトンの蛋白質の合成をも
たらす3.3kbのmRNAによりコードされている（図１）。I
CAM−１はＮ−結合型グリコシル化部位を介して、かな
りの量がグリコシル化されている。SDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により決定したところ、成熟蛋白質
は90kDaという見かけ上の分子量を有している。Saunton
et al.、Cell 1988、52、925−933。ICAM−１は、イム
ノグロブリンスーパー遺伝子ファミリーの一員であり、
アミノ末端に５つの免疫グロブリン様ドメインを有し、
その後には貫膜ドメインおよび細胞質ドメインが続く。
LFA−１およびライノウイルスについての一次結合部位
は、最初の免疫グロブリン様ドメイン中に見いだされて
いる。しかしながらこの結合部位は特殊なもののように
思われる。Staunton et al.、Cell 1990、61、243−35
4。電子顕微鏡による最近の研究により、ICAM−１は18.
7nmの長さで２−3nm直径の折れ曲がった棹のような構造
であることが証明されている。Staunton et al.、Cell
1990、61、243−254。 ICAM−１は広範な組織および細胞分布を示し、そして
白血球細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイト、
および他の上皮細胞において見いだすことができる。血
管内皮細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイト、神経膠星状
細胞、および数種の細胞株については、ICAM−１の発現
を、細菌性リポ多糖、ならびにインターロイキン−１、
腫瘍壊死因子、ガンマー−インターフェロン、およびリ
ンホトキシンのようなサイトカインでの処理により調節
することができる。例えば、Frohman et al.、J.Neuroi
mmunol.1989、23、117−124、を参照せよ。サイトカイ
ン処理後のICAM−１の発現増大についての分子機能はい
まだに決定されていない。 ELAM−１は、膜糖蛋白質のセレクチンファミリーの一
員である115−kDaの膜糖蛋白質である（図２）。Bevila
cqua et al.、Science 1989、243、1160−1165。ELAM−
１のアミノ末端領域にはレクチン−様蛋白質の一員と相
同性を有する配列が含まれており、その次には表皮成長
因子に類似するドメインが続き、その次には補体レセプ
ター１および２において見いだされるものに類似する六
縦列をなす60−アミノ酸反復構造が続く。これらの特色
はGMP−140、および白血球ホーミング抗原（homing ant
igen）であるMEL14抗原にも共通している。ELAM−１は
3.9−kbのmRNAによりコードされる。ELAM−１のmRNAの
３′−非翻訳領域には、細胞性mRNAの迅速な物質交代の
原因となる配列モチーフATTTAが幾つか含まれており、
このことはELAM−１発現が一時的であるという特徴に矛
盾しない。 ELAM−１は、それが血管内皮細胞においてのみ同定さ
れるに過ぎず、限定された細胞分布を示す。ICAM−１と
同様にELAM−１は、腫瘍壊死因子、インターロイキン−
１、およびリンホトキシンを初めとする数々のサイトカ
イン、ならびに細菌性リポ多糖により誘導される。ICAM
−１とは対照的に、ELAM−１はガンマー−インターフェ
ロンによっては誘導されない。Bevilacqua et al.、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 1987、84、9238−9242;Wellicome
et al.、J.Immunol.1990、144、2558−2565。ヒトの臍
静脈内皮細胞内でのELAM−1 mRNAの誘導および消失の動
態は、その細胞表面でのELAM−１の出現および消失より
先に生じる。ICAM−１に関してと同様に、ELAM−１につ
いての分子機構は解明されていない。 VCAM−１は3.2−kbのmRNAによりコードされる110−kD
aの膜糖蛋白質である（図３）。VCAM−１は、６つか７
つかのいずれかの免疫グロブリンドメインを有する産物
を産生するための二者択一的スプライシングを受けるこ
とができる単一コピー遺伝子によりコードされるように
思われる。Osborn et al.、Cell 1989、59、1203−121
1。VCAM−１へのラモス細胞（Ramos cells）の接着を遮
断するCD29に対するモノクローナル抗体の能力により示
されるように、VCAM−１についてのレセプターはCD29
（VLA−４）であることが提唱される。VCAM−１は血管
内皮細胞上にまず最初に発現される。ICAM−１およびEL
AM−１と同様に、血管内皮上のVCAM−１の発現はサイト
カインでの処理により制御される。RiceおよびBevilacq
ua、Science 1989、246、1303−1306;Rice et al.、J.E
xp.Med.1990、171、1369−1374。発現増加はmRNAの誘導
に起因するものと思われる。 治療法については、ICAM−１、VCAM−１、およびELAM
−１の発現を低下させることにより治療することが可能
な疾患を有する疑いのある動物を、本発明に従うオリゴ
ヌクレオチドを投与することにより治療する。オリゴヌ
クレオチドは薬剤学的組成物中に調剤することができ、
この薬剤学的組成物はこのオリゴヌクレオチドの他に、
担体、増粘剤、賦形剤、緩衝液、保存料、界面活性剤、
リポソーム、もしくは脂質製剤などを含むことができ
る。薬剤学的組成物はこのオリゴヌクレオチドの他に、
抗生物質、抗−炎症剤、および麻酔剤などのような一つ
もしくは複数の活性成分をも含むことができる。 薬剤学的組成物は、局所的もしくは全身的治療のいず
れが所望されるかに依存して、そして治療すべき領域に
依存して数々の方法において投与することができる。投
与は、局所投与（経眼的、経膣的、経腸的、鼻腔内的の
ものを含む）、経口投与、吸入法による投与、あるいは
動脈内点滴、皮下投与、腹膜内投与、もしくは筋肉内注
射を例とする非経口的投与であることができる。 局所投与のための製剤は、軟膏剤、乳液剤、クリーム
剤、ゲル剤、滴剤、座剤、噴霧剤、液状薬、および粉末
剤を含むことができる。通常の薬剤学的担体、水、粉末
性、もしくは脂質性基剤、ならびに増粘剤などが必要で
あるか、あるいは所望されることがある。コーティング
済みコンドームもしくは手袋も有用であるだろう。 経口投与のための組成物には、粉末剤もしくは顆粒
剤、水もしくは非水性培地中の懸濁液もしくは水溶液、
カプセル剤、薬袋、もしくは錠剤を含む。増粘剤、矯味
・矯臭剤、賦形剤、乳化剤、調剤補助物、もしくは結合
剤が所望されることがある。 非経口投与のための製剤も、やはり緩衝液、リポソー
ム、賦形剤、および他の適切な添加物を含むことができ
る滅菌水溶液を含むことができる。 投与量は、治療すべき症状の重篤度および反応性に依
存するが、一般滴には数日から数カ月間続く治療過程に
関して、あるいは治療の効果が生じるもしくは疾患状態
の軽減が達成されるまでは、一日当たり一回もしくは複
数回の投与であろう。当業者は至適用量、投与法、およ
び反復率（repetition rates）を容易に決定することが
できる。 本発明は、炎症性細胞接着の調節が可能な蛋白質に対
応するRNAおよびDNAの機能のアンチセンス阻害における
用途のためにオリゴヌクレオチドを利用する。本発明の
文脈中では、用語「オリゴヌクレオチド」は、オリゴマ
ーもしくはポリマーのリボ核酸もしくはデオキシリボ核
酸を意味する。この用語には、天然に存在する塩基、
糖、および糖間（主鎖）結合からなるオリゴマー、なら
びに類似する様式で機能する天然非存在性部分を有する
オリゴマーがある。ヌクレアーゼの存在下における細胞
取り込みの亢進および安定性の増大を一例とするような
特性のために、このように修飾されたもしくは置換され
たオリゴヌクレオチドがはしばしば天然形態のものより
も好ましい。 本発明について意図される幾つかの好ましいオリゴヌ
クレオチドの具体例には、ホスホロチオエート、ホスホ
トリエステル、ホスホン酸メチレ、短鎖アルキル、もし
くはシクロアルキル糖間結合、あるいは短鎖ヘテロ原子
もしくは複素環式糖間結合を含むことができる。最も好
ましいものは、CH2−NH−Ｏ−CH2、CH2−Ｎ（CH3）−Ｏ
−CH2、CH2−Ｏ−Ｎ（CH3）−CH2、CH2−Ｎ（CH3）−Ｎ
（CH3）−CH2およびＯ−Ｎ（CH3）−CH2−CH2の主鎖
（式中、ホスホジエステルはＯ−Ｐ−Ｏ−CH2である）
を有するものである。やはり好ましいものは、モルホリ
ノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドである。Summer
ton、J.E.およびWeller、D.D.、米国特許第5,034,506
号。他の好ましい態様においては、蛋白質−核酸（PN
A）主鎖のような、オリゴヌクレオチドのホスホジエス
テル主鎖をポリアミド主鎖で置換することができる（こ
の場合、塩基はポリアミド主鎖のアザ窒素原子に直接も
しくは間接的に結合している）。P.E.Nielsen、M.Eghol
m、R.H.Berf、O.Buchardt、Science 1991、254、1497。
他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２′位において、
以下に示す置換基の内の一つを含むアルキルおよびハロ
ゲン置換された糖部分を含むことができる。それらの置
換基とは、OH、SH、SCH3、Ｆ、OCN、Ｏ（CH2）nNH2、も
しくはＯ（CH2）nCH3［式中、ｎは１から約10までであ
る］、C1からC10までの低級アルキル、置換された低級
アルキル、アルカリル、もしくはアラルキル、Cl、Br、
CN、CF3、OCF3、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル、
Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル、SOCH3、SO2C
H3、ONO2、NO2、N3、NH2、複素環式アルキル、複素環式
アルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミ
ノ、置換されているシリル、RNA開裂用の基、コンジュ
ゲート、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌ
クレオチドの薬物動態特性を改善するための基、もしく
はオリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための
基、ならびに類似する特性を有する他の置換基である。
オリゴヌクレオチドはペントフラノシル基の代わりにシ
クロブチルのような糖擬態物をも有することができる。 本発明に従うオリゴヌクレオチドは、約３から約50ま
での核酸塩基単位を含むことが好ましい。このようなオ
リゴヌクレオチドが、約８から25までの核酸塩基単位を
含むことがより好ましく、そして約12から22までの核酸
塩基単位を有することがなおより好ましい。理解される
ように、核酸塩基単位としては、ホスホジエステルもし
くは他の結合を介して隣接する核酸塩基単位に適切に結
合している塩基−糖の組み合わせ物である。 本発明に従って用いられるオリゴヌクレオチドは、よ
く知られる技術である固相合成を介して都合良くかつ日
常的に作成することができる。このような合成のための
装置は、Applied Biosystems社を初めとする数々の販売
元により売られている。このような合成のための他の手
段のいずれのものも利用することができるが、オリゴヌ
クレオチドの実際の合成は、日常的な作業に従事するも
のの手腕の範囲内で十分に行われる。ホスホロチオエー
トおよびアルキル化誘導体のような他のオリゴヌクレオ
チドを製造するための類似する技術もよく知られてい
る。 本発明に従うと、当業者には、転写されるDNAの読み
取り枠（ORFs）により同定されるメッセンジャーRNA
は、そのDNAのORFsからの情報のみでなく、５′−非翻
訳領域、３′−非翻訳領域および介在配列リボヌクレオ
チドとして当業者に知られる領域を形成する関連的リボ
ヌクレオチドからの情報をも含むことが理解されるであ
ろう。従って、これらの関連的リボヌクレオチドならび
に情報的リボヌクレオチドの全てもしくはその一部分を
標的とするオリゴヌクレオチドは、本発明に従って製剤
することができる。好ましい態様においては、このオリ
ゴヌクレオチドは転写開始部位、翻訳開始部位、介在配
列、および３′−非翻訳領域内の配列と特異的にハイブ
リダイズすることが可能である。 本発明に従うと、このオリゴヌクレオチドは、白血球
細胞の、他の白血球細胞もしくは他の細胞種への接着に
係わる蛋白質をコードする核酸の一部分と特異的にハイ
ブリダイズすることが可能である。好ましい態様におい
ては、該蛋白質は細胞間接着分子−１、血管細胞接着分
子−１、および内皮白血球接着分子−１である。それに
対応する配列もしくはその一部分を含むオリゴヌクレオ
チドが本発明において有用である。一例では、図１は、
ヒトの細胞間接着分子−１のmRNA配列である。全体もし
くはその一部分が有用である可能性のある好ましい配列
セグメントは、 である。 図２は、ヒトの内皮白血球接着分子−１のmRNA配列で
ある。全体もしくはその一部分が有用である可能性のあ
る好ましい配列セグメントは、 である。 図３は、ヒトの血管細胞接着分子−１のmRNA配列であ
る。全体もしくはその一部分が有用である可能性のある
好ましい配列セグメントは、 である。図示した配列は正確であると思われるものの、
万が一間違いが見つかったとしても本発明は正しい配列
を指示する。本発明における有用なオリゴヌクレオチド
はこれらの配列の内の一つ、もしくはその一部分を含
む。従って、先に示されるこれらのオリゴヌクレオチド
の内のいずれか、あるいは当業者が炎症性細胞接着分子
の合成の調節のための好ましいアンチセンス標的の知識
から製造することができる類似するオリゴヌクレオチド
の内のいずれかを利用することが好ましい。 本発明の幾つかの好ましい態様は、以下に示す非制限
的実施例に従って詳細に説明される。調節のための標的
mRNA種は、細胞間接着分子−１、内皮白血球接着分子−
１、および血管細胞接着分子−１に関連する。当業者
は、本発明はそれらに限定はされず、しかしながら本発
明は一般的に適用することができるということを判断す
るであろう。ICAM−１および／またはELAM−１および／
またはVCAM−１の産生の阻害もしくは調節、疾患治療に
おける有意な治療学的利益を有することが予期される。
これらの組成物の有用性を評定する目的においては、一
つもしくは一連のアッセイが必要である。 実施例 実施例１ 細胞表面上でのICAM−１、VCAM−１、およびELAM−１
の発現は、ELISAにおいて特異的モノクローナル抗体を
使用して定量することができる。細胞は96ウエルのマイ
クロタイタープレート内において密集するまで増殖させ
る。これらの細胞をインターロイキン−１もしくは腫瘍
壊死因子のいずれかで、ELAM−１を定量するためには４
時間から８時間まで、そしてICAM−１およびVCAM−１を
定量するためには８時間から24時間までの間刺激する。
サイトカインでの適切なインキュベーション時間の後、
これらの細胞を、ダルベッコー（Dulbecco's）のリン酸
緩衝化食塩水（Ｄ−PBS）のような、カルシウムとマグ
ネシウムとを含む緩衝化等張液で３回緩和に洗浄する。
その後細胞をＤ−PBS中で希釈した１−２％のパラホル
ムアルデヒドを用いて、マイクロタイタープレート上
に、25℃で20分間直接固定化させる。これらの細胞を再
びＤ−PBSで３回洗浄する。マイクロタイタープレート
上の非特異的結合を、37℃において１時間、Ｄ−PBS中
の２％ウシ血清アルブミンで遮断する。細胞を37℃にお
いて１時間、遮断用溶液中で希釈した適切なモノクロー
ナル抗体と共にインキュベートする。未結合抗体は、Ｄ
−PBSでの３回の洗浄により除去する。細胞に結合した
抗体は、37℃下、１時間の、遮断用溶液中のビオチニル
化ヤギ抗−マウスIgG（Bethesda Reseach Laboratories
社、Gaithersberg、MD）の1:1000希釈液とのインキュベ
ーションにより検出する。細胞をＤ−PBSで３回洗浄
し、そしてその後37℃下、１時間、β−ガラクトシダー
ゼ（Bethesda Reaseach Laboratories社）とコンジュゲ
ートさせたストレプトアビジンの1:1000希釈液とインキ
ュベートする。細胞を各５分ずつＤ−PBSで３回洗浄す
る。特異的モノクローナル抗体に結合したβ−ガラクト
シダーゼの量を、3.3mMのクロロフェノールレッド−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド、50mMのリン酸ナトリウム、
1.5mMのMgCl2;pH＝7.2の溶液中で、37℃下、２−15分
間、プレートを現像することにより決定する。産物の濃
度はELISA用マイクロタイタープレートリーダー内にお
いて575nmの吸光度を測定することにより決定する。 数々のヒト細胞株における、インターロイキン−１β
もしくは腫瘍壊死因子αのいずれかでの刺激の後に観察
されるICAM−１の誘導の例を図４に示す。細胞は、15時
間、インターロイキン−１もしくは腫瘍壊死因子の増加
濃度で刺激し、そして先に示す処理を施した。ICAM−１
発現は、モノクローナル抗体84H10（Amac Inc.社、West
brook、ME）の1:1000希釈液とのインキュベーションに
より決定した。使用した細胞株は、第四継代目のヒト臍
静脈内皮細胞（HUVEC）、ヒト表皮癌細胞株（A431）、
ヒト黒色腫細胞株（SK−MEL−２）、およびヒト肺癌細
胞株（A549）であった。ICAM−１をすべての細胞株上で
誘導させたが、細胞表面におけるICAM−１発現の誘導に
おいては、腫瘍壊死因子はインターロイキン−１と比較
してより効果的であった（図４）。 ICAM−１、VCAM−１、もしくはELAM−１の阻害につい
てのアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング
は、オリゴヌクレオチドでの細胞の前処理をサイトカイ
ンでの刺激の前に行うということ以外は先に記載するよ
うに実施する。ICAM−１発現に対するアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド阻害の一例を図５に示す。ヒト臍静脈内
皮細胞（HUVEC）は、37℃下で４時間、８μＭの塩化Ｎ
−［１−（2,3−ジオレイルオキシ）プロピル］−N,N,N
−トリメチルアンモニウム（DOTMA）を含むOpti MEM（G
IBCO社、Grand Island、NY）中で希釈した増加濃度のオ
リゴヌクレオチドで処理してオリゴヌクレオチドの取り
込みを亢進させた。培地を除去し、そして更に４時間、
増加濃度のオリゴヌクレオチドを含む内皮成長用培地
（EGM−UV;Clonetics社、San Diego、CA）と交換した。
インターロイキン−１βを５単位/mlの濃度においてそ
の細胞に添加し、そして37℃において14時間インキュベ
ートした。これらの細胞を、先に記載するようにモノク
ローナル抗体84H10の1:1000希釈液を使用してICAM−１
発現について定量した。使用したオリゴヌクレオチド
は、 化合物１−（ISIS 1558）配列 を有する翻訳コドンのAUG開始部分を含むmRNAの位置64
−80とハイブリダイズするように設計されたホスホジエ
ステルオリゴヌクレオチド、 化合物２−（ISIS 1570）化合物１と同一の配列に対
応するホスホロチオエートを含むオリゴヌクレオチド、 化合物３−配列 を示す、化合物１および化合物２に相補的なホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチド、 化合物４−（ISIS 1572）配列 を含む３′−非翻訳領域中のmRNAの位置2190−2210にハ
イブリダイズするように設計された、ホスホロチオエー
トを含むオリゴヌクレオチド、 化合物５−（ISIS 1821）配列 を含む、対照として用いられるヒトの５−リポキシゲナ
ーゼmRNAにハイブリダイズするように設計された、ホス
ホロチオエートを含むオリゴヌクレオチドである。 ヒトICAM−1 mRNAの翻訳領域のAUG開始部分を標的と
するホスホジエステルオリゴヌクレオチド（化合物１）
はICAM−１の発現は阻害しないが、ホスホロチオエート
を含む対応するオリゴヌクレオチド（化合物２）はICAM
−１発現を、0.1μＭの濃度において70％、そして１μ
Ｍ濃度において90％阻害した（図４）。ホスホジエステ
ルに勝るホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの効力
増大は、恐らく安定性の増加に起因するものと思われ
る。化合物２に対するセンス鎖である化合物３は、10μ
Ｍにおいて控えめながらもICAM−１発現を阻害した。細
胞に添加する前に化合物２を化合物３に対して予めハイ
ブリダイズさせた場合には、ICAM−１発現に対する化合
物２の効果は弱まり、このことにより化合物２の活性は
mRNAへのハイブリッド形成に必要なアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの効果に起因することが示唆される。３′
−非翻訳配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチ
ド（化合物４）は、１μＭの濃度においてICAM−１発現
を62％阻害した（図５）。ヒト５−リポキシゲナーゼを
標的とする対照オリゴヌクレオチドはICAM−１発現を20
％減少させた。これらのデータにより、オリゴヌクレオ
チドはヒト臍静脈内皮細胞上でのICAM−１発現を阻害す
ることが可能であることが示され、そしてICAM−１発現
の阻害はアンチセンス活性に起因することが示唆され
る。 １μＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド、化
合物２は、増加濃度の腫瘍壊死因子およびインターロイ
キン−１で刺激したヒト臍静脈内皮細胞上でのICAM−１
発現を阻害する（図６）。これらのデータにより、化合
物２の効果は細胞のインターロイキン−刺激に特異的で
ないことが示される。 類似するアッセイを使用して、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドによるELAM−１およびVCAM−１発現の阻害を
示すこともできる。 実施例２ ICAM−１、VCAM−１、もしくはELAM−１発現に対する
アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示すのに用い
ることができる第二の細胞性アッセイは、細胞接着アッ
セイである。標的細胞をマルチウエルプレート上に単層
として増殖させ、オリゴヌクレオチドで処理し、そして
次にサイトカインで処理する。その後接着性細胞をその
単層細胞に添加し、そして37℃において30−60分間イン
キュベートし、そして洗浄して非接着性細胞を除去す
る。単層に接着している細胞は、接着性細胞を直接計数
するか、あるいは記載されるように51Crのような放射性
同位元素でその細胞を予め標識し、単層に結合している
放射活性を定量するかのいずれかにより決定することが
できる。DustinおよびSpringer、J.Cell Biol.1988、10
7、321−331。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、そ
のアッセイにおいてはICAM−１、VCAM−１、もしくはEL
AM−１のいずれかを標的とすることができる。 腫瘍壊死因子で処理したヒト臍静脈内皮細胞に対す
る、DMSOでの分化処理を施したHL−60細胞の接着につい
ての、ICAM−1 mRNAを標的とするアンチセンスオリゴヌ
クレオチドの効果の一例を表７に示す。ヒト臍静脈内皮
細胞は、12ウエルプレート内において80％密集するまで
増殖させた。これらの細胞を37℃下で４時間、８μＭの
DOTMAを含むOpti−MEM中で希釈した２μＭのオリゴヌク
レオチドで処理した。培地を除去し、そして表示される
オリゴヌクレオチドの２μＭを含む新鮮な内皮細胞成長
用培地（EGE−UV）と取り替え、そして37℃で４時間イ
ンキュベートした。1ng/mlの腫瘍壊死因子を表示される
ように細胞に添加し、そして細胞を更に19時間インキュ
ベートした。細胞をEGE−UVで一回洗浄し、そして1.3％
のDMSOを添加して1.6×106のHL−60細胞を４日間分化さ
せた。この細胞を37℃で１時間接着させ、そして37℃に
暖めたダルベッコーのリン酸緩衝化食塩水（Ｄ−PBS）
で４回緩和に洗浄した。接着細胞を、5mMのEDTAを含む
0.25mlの冷却（４℃）リン酸緩衝化食塩水の添加により
単層からはがし、氷上で５分間インキュベートした。ED
TAでの処理により除去された細胞の数を血球計数器で計
数することにより決定した。EDTA処理により単層からは
がされた内皮細胞は、形態学的差異によりHL−60細胞か
ら容易に識別することができた。 腫瘍壊死因子の非存在下においては、３％のHL−60細
胞が内皮細胞に結合した。1ng/mlの腫瘍壊死因子での内
皮細胞単層の処理により、添加した総細胞の59％にまで
接着細胞の数が上昇した（図７）。アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドである化合物２もしくは対照オリゴヌクレ
オチドである化合物５での処理は、腫瘍壊死因子処理の
非存在下においては、単層に接着する細胞の数を変化さ
せなかった（図７）。このアンチセンスオリゴヌクレオ
チド、つまり化合物２は、添加した総細胞の59％から添
加した総細胞の17％にまで接着細胞数を減少させた。そ
れとは対照的に、対照オリゴヌクレオチドである化合物
５は、腫瘍壊死因子で処理した内皮単層へ接着する細胞
の数を有意には減少させず、つまり対照細胞については
59％であるのに対して、化合物５で処理した細胞につい
ては添加した総細胞の53％であった。 これらのデータにより、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、内皮細胞上でのICAM−１発現を阻害することが
可能であり、そしてICAM−１発現の阻害は、配列特異的
様式で内皮単層への好中球−様細胞の接着の減少に相関
することが示される。ELAM−１およびVCAM−１のような
他の分子も内皮細胞への白血球の接着を媒介するため、
接着は完全に遮断されることは予期されない。 実施例３ オリゴヌクレオチドの合成および特性決定 未修飾DNAオリゴヌクレオチドは自動DNA合成機（Appl
ied Biosystems model 380B）上で、ヨウ素による酸化
を用いる標準的なホスホルアミダイト化学を使用して合
成した。β−シアノエチルジイソプロピル−ホスホルア
ミダイトは、Applied Biosystems社（Foster City、C
A）から購入した。ホスホルチオエートオリゴヌクレオ
チドについては、標準的な酸化用瓶を、亜リン酸エステ
ル結合の段階的イオウ付加のために、アセトニトリル中
の3H−1,2−ベンゾジチオール−３−オン1,1−ジオキシ
ドの0.2M溶液に入れ替えた。イオウ付加周期待機段階
（wait step）を68秒まで増加し、そしてその後にキャ
ッピング段階が続く。 ２′−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドは２′−Ｏ−メチルβ−シアノエチルジイソプロピ
ルホスホルアミダイト（Chemgenes社,Needham MA）およ
びテトラゾール、および塩基のパルス輸送後の待機段階
を360秒まで増加させたことを除いては、未修飾オリゴ
ヌクレオチドについての標準周期を使用して合成した。
この合成を出発させるのに用いた３′−塩基は２′−デ
オキシリボヌクレオチドであった。 ２′−フルオロホスホロチオエートオリゴヌクレオチ
ドは、５′−ジメトキシトリチル−３′−ホスホルアミ
ダイトを使用して合成し、そして本出願と同じ譲受人に
譲渡されている、1990年１月11日に提出された米国特許
出願第463,358号、および1990年８月13日に提出された
同出願第566,977号において開示されるように製造し
た。２′−フルオロオリゴヌクレオチドは、ホスホルア
ミダイト化学および標準的DNA合成研究法の若干の変法
（脱保護化を、室温におけるメタノール性アンモニア
（methanolic ammonia）を使用して行っている）を使用
して製造した。 制御式微細孔ガラスカラム（controlled pore glass
column）（Applied Biosystems社）からの開裂および55
℃下18時間の濃厚の水酸化アンモニウム中での脱保護化
の後、このオリゴヌクレオチドを、2.5倍容のエタノー
ルを用いる0.5MのNaClからの２度の沈殿化により精製し
た。分析用ゲル電気泳動は、20％アクリルアミド、8M尿
素、45mMトリス−ホウ酸緩衝液、pH7.0中で行った。オ
リゴデオキシヌクレオチドおよびホスホルチオエートオ
リゴヌクレオチドは電気泳動より判断したところ、全長
の80％を有する物質よりも大きいものであった。 RNAオリゴヌクレオチド合成は、ABIモデル380BのDNA
合成機上で実施した。標準的な合成周期を、テトラゾー
ルのパルス輸送後の待機段階を900秒までに増加させる
ことにより改変した。塩基はメタノール性アンモニア中
での一晩のインキュベーションにより脱保護化した。塩
基の脱保護化の後、このオリゴヌクレオチドを減圧下に
おいて乾燥させた。２′ヒドロキシルを保護するｔ−ブ
チルジメチルシリルは、テトラヒドロフラン中の1Mのフ
ッ化テトラブチルアンモニウム中でそのオリゴヌクレオ
チドを一晩インキュベートすることにより除去した。こ
のRNAオリゴヌクレオチドは、C18Sep−Pakカートリッジ
（Waters社、Division of Millipore Corp.、Milford M
A）上で更に精製し、そしてエタノール沈殿を行った。 この合成法により取得されるホスホルチオエートとホ
スホジエステル結合との相対的な量は、31P NMR分光法
により周期的に検査した。このスペクトルは、溶媒とし
て酸化重水素もしくはジメチルスルホキシド−d6を使用
して室温で取得した。ホスホロチオエート試料は、典型
的には１パーセントを下回るホスホジエステル結合を含
んでいた。 二次評定は、50mMの酢酸トリエチルアンモニウム、pH
7.0、中のアセトニトリルの濃度勾配（30分間で４％か
ら32％まで、流速＝1.5ml/分）を使用するPRP−１カラ
ム（Hamilton Co.社、Reno、Nevada）上でのトリチル−
オン（trityl−on）HPLCにより精製した。適切な分画を
ひとまとめにし、蒸留し、そして室温において15分間５
％酢酸で処理した。この溶液を同容積の酢酸エチルで抽
出し、そして水酸化アンモニウムで中和し、そして凍結
乾燥した。HPLC精製したオリゴヌクレオチドは、ICAM−
１発現についてELISAアッセイにより判定したところ、
沈殿させたオリゴヌクレオチドとは効力における有意な
差異を生じなかった。 実施例４ 細胞培養およびオリゴヌクレオチドでの処理 ヒト肺癌細胞株A549を、American Type Culture Coll
ection（Bethesda MD）から取得した。細胞を、１グラ
ムのグルコース／リットルおよび10％ウシ胎児血清（Ir
vine Scientific社）を含むダルベッコ変法イーグル培
地（Irvine Scientific社、Irvine CA）中で増殖させ
た。ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）（Clonetics社、San
Diego CA）は、EGM−UV培地（Clonetics社）中で培養し
た。HUVECは、第二継代物と第六継代物との間のものを
使用した。ヒト表皮癌A431細胞はAmerican Type Cultur
e Collectionから取得し、そして4.5g/lのグルコースを
含むDMEM中で培養した。ヒトの初代ケラチノサイトはCl
onetics社から取得し、そしてKGM（ケラチノサイト増殖
用培地、Clonetics社）中で増殖させた。 96−ウエルプレート中で増殖させた細胞を、予め37℃
に暖めたOpti−MEM（GIBCO社、Grand.Island、NY）で３
回洗浄した。HUVEC細胞の場合には10μg/mlの塩化Ｎ−
［１−（2,3−ジオレイルオキシ）プロピル］−N,N,N−
トリメチルアンモニウム（DOTMA、Bethesda.Research L
abs社、Bethesda MD）を、あるいはA549細胞の場合には
20μg/mlのDOTMAを含む100μｌのOpti−MEMを、各ウエ
ルに添加した。オリゴヌクレオチドは、0.2μｍのCentr
ex酢酸セルロースフィルター（Schleicher and Schuell
社、Keene、NH）を通す遠心処理により滅菌した。オリ
ゴヌクレオチドを20×の保存溶液として各ウエルに添加
し、そして37℃において４時間インキュベートした。培
地を除去し、そして表示の濃度のオリゴヌクレオチドを
含む150μｌの適切な成長培地に入れ替えた。細胞をさ
らに３−４時間、37℃でインキュベートし、そして表示
したように適切なサイトカインで14−16時間刺激した。
ICAM−１発現は実施例１に記載のように決定した。オリ
ゴヌクレオチドとの最初の４時間のインキュベーション
の間に、DOTMAが存在することにより、オリゴヌクレオ
チドの効力が少なくとも100倍増加した。この効力の上
昇は、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みの上昇に関連
していた。 実施例５ インターロイキン−１β−刺激化細胞におけるICAM−１
遺伝子発現に対する活性についての追加のアンチセンス
オリゴヌクレオチドのELISAスクリーニング アンチセンスオリゴヌクレオチドは最初、ヒトICAM−
1 mRNAにおける５つの標的部位にハイブリダイズするよ
うに設計された。オリゴヌクレオチドは、ホスホジエス
テル（Ｐ＝Ｏ、ISIS 1558、1559、1563、1564、および1
565）、ならびにホスホロチオエート（Ｐ＝S;ISIS 157
0、1571、1572、1573、および1574）の両形態において
合成した。これらのオリゴヌクレオチドを表１に示す。 オリゴヌクレオチドによるインターロイキン−１β−刺
激化細胞表面上のICAM−１発現の阻害は、実施例１に記
載のELISAアッセイにより決定した。オリゴヌクレオチ
ドは２つの異なる細胞株において検査した。ホスホジエ
ステルオリゴヌクレオチドはどれもICAM−１発現を阻害
しなかった。これは恐らく、細胞内におけるホスホジエ
ステルオリゴヌクレオチドの迅速な分解によるものであ
ると思われる。５つのホスホロチオエートオリゴヌクレ
オチドの内でも、最も活性が高かったのはAUG翻訳開始
コドンにハイブリダイズするISIS 1570であった。２′
−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで
あるISIS 2974は、HUVECおよびA549細胞でのICAM−１発
現の阻害においてはISIS 1570と比較すると約３倍低い
有効性を示した。２′−フルオロオリゴヌクレオチドで
あるISIS 2634も有効性が低かった。 ５つの最初の標的を用いて得られた初期データに基づ
き、追加のオリゴヌクレオチドを、ICAM−1 mRNAとハイ
ブリダイズするように設計した。予想される転写開始部
位（５′キャップ部位）にハイブリダイズするアンチセ
ンスオリゴヌクレオチド（ISIS 3067）は、図８におい
て示されるように、IL−１β−刺激化細胞においてはAU
Gコドンにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（ISI
S 1570）とほぼ同程度の活性を示した。ISIS 1931およ
び1932は、AUG翻訳開始コドンの各々５′および３′に
ハイブリダイズする。AUG領域にハイブリダイズする３
つ全てのオリゴヌクレオチドはICAM−１発現を阻害する
が、ISIS 1932はISIS 1570およびISIS 1931と比較する
とやや活性が劣っていた。ICAM−1 mRNAのコーディング
領域にハイブイダイズするオリゴヌクレオチド（ISIS 1
933、1934、1935、1574、および1936）は弱い活性を示
した。翻訳終止コドンにハイブリダイズするオリゴヌク
レオチド（ISIS 1937および1938）は中程度の活性を示
した。 驚くべきことに、最も活性の高いアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドはISIS 1939であり、これはICAM−1 mRNA
の３′−非翻訳領域の配列を標的とするホスホロチオエ
ートオリゴヌクレオチドである（表１を参照せよ）。同
じ配列を有する他のオリゴヌクレオチドである２′−Ｏ
−メチル（ISIS 2973）および２′−フルオロ（ISIS 26
37）をも検査したが、これらはこのレベルの活性は示さ
なかった。他の３′−非翻訳配列を標的とするオリゴヌ
クレオチド（ISIS 1572、1573、および1940）もISIS 19
39程の活性は示さなかった。実際のところ、ポリアデニ
ル化シグナルを標的とするISIS 1940はICAM−１発現を
阻害しなかった。 検査した16の最初のオリゴヌクレオチドの内で、ISIS
1939が予期せず最大のアンチセンス活性を示すことが
判明したため、ICAM−1 mRNAの３′−非翻訳領域におけ
る配列にハイブリダイズするように、他のオリゴヌクレ
オチドを設計した（表１に示されるISIS 2302、2303、2
304、2305、および2307）。ISIS 1939標的のわずか５塩
基分３′側にある配列にハイブリダイズするISIS 2307
は、この一連のもののうちで最も活性が低かった（図
８）。ISIS.1939標的の３′側の143塩基分の位置にある
ICAM−1 mRNAにハイブリダイズするISIS 2302はISIS 19
39に匹敵し得る活性を有しており、この一連のものの内
でも最高の活性を示した。ヒトICAM−1 mRNAの３′−非
翻訳領域の予想されるRNA二次構造の調査により（M.Zuk
er、Science 1989、244、48−52）、ISIS 1939とISIS 2
302との両方は安定なステム−ループ構造をとることが
予期される構造にハイブリダイズすることが示された。
最近の定説により、アンチセンスオリゴヌクレオチドを
設計する際にはRNA二次構造の領域は避けるべきことが
示唆されている。従ってISIS 1939およびISIS 2302は、
ICAM−１発現を阻害することが予期されなかった。 対照オリゴヌクレオチドであるISIS 1821はISIS 1934
のものに匹敵する活性でHUVEC細胞におけるICAM−１発
現を阻害したが、A549細胞においてはISIS 1821はISIS1
934と比較して低い有効性を示した。陰性対照であるISI
S 1821はICAM発現に対しては少量の活性を示すことが見
いだされ、これは恐らくAUG翻訳開始コドンの３′側15
塩基分の位置のICAM−1 mRNAにハイブリダイズする（13
塩基分の12が対合する）能力がその原因の一部をなすた
めであると思われる。 これらの研究により、ICAM−1 mRNAのAUG翻訳開始コ
ドンおよび特異的３′−非翻訳配列が、ICAM−１発現の
アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害に対する最高の感
受性を示したことが示される。 ヒト臍静脈細胞およびヒト肺癌細胞（A549）における
ICAM−１発現を阻害することに加えて、ISIS 1570、ISI
S 1939、およびISIS 2302はヒト表皮癌A431細胞および
ヒトの初代ケラチノサイトにおけるICAM−１発現を阻害
することが示された（図９に示する）。これらのデータ
により、アンチセンスオリゴヌクレオチドは幾つかのヒ
ト細胞株におけるICAM−１発現を阻害することが可能で
あることが示される。その上、これらのオリゴヌクレオ
チドの効力程度の順位は、調査した４つの細胞株におい
ては同一であった。ICAM−１発現はヒトの初代ケラチノ
サイトにおいて阻害可能であるという事実は重要であ
り、それは表皮ケラチノサイトはアンチセンスヌクレオ
チドの対象標的であるという理由による。 実施例６ 他のサイトカインで刺激した細胞でのICAM−１発現のア
ンチセンスオリゴヌクレオチド阻害 ２つのオリゴヌクレオチド、ISIS 1570およびISIS 19
39を、TNF−αおよびIFN−γ−誘導化ICAM−１発現を阻
害する能力について検査した。１μＭのアンチセンスオ
リゴヌクレオチドでのA549細胞の処理により、配列特異
的な様式でIL−１β、TNF−α、およびIFN−γ−誘導化
ICAM−１発現が阻害された。これらのアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドはIL−１βおよびTNF−α−誘導化ICAM
−１発現を同程度阻害したが、IFN−γ−誘導化ICAM−
１発現はアンチセンス阻害に対してより大きな感受性を
示した。対照オリゴヌクレオチドであるISIS 1821は、
以下に示すようにIL−１βもしくはTNF−α−誘導化ICA
M−１発現を有意には阻害せず、そしてIFN−γ−誘導化
ICAM−１発現を若干阻害した。 実施例７ アンチセンス効果はセンス鎖対照により打ち消される オリゴヌクレオチドISIS 1570およびISIS 1939による
ICAM−１発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害
は、それら各々のセンス鎖を有するオリゴヌクレオチド
のハイブリッド形成によりもとに戻すことができた。単
独で適用させた場合には、ISIS 1570についてのホスホ
ロチオエートセンス鎖（ISIS 1575）はわずかながらIL
−１β−誘導化ICAM−１発現を亢進させた。細胞に添加
する前に等モル濃度でISIS 1570とISIS 1575とを混合さ
せた場合には、ISIS 1570の効果は遮断された。ISIS 19
39に対する相補鎖（ISIS 2115）は、細胞に単独で添加
した場合にICAM−１発現を46％亢進させた。ISIS 1939
にISIS 2115を予めハイブリダイズさせると、ISIS 1939
によるICAM−１発現の阻害は完全に遮断された。 実施例８ オリゴヌクレオチドのTm値（標的からのオリゴヌクレオ
チドの解離温度）の測定 アンチセンスオリゴヌクレオチドによるICAM−１発現
の阻害の効果がそれぞれの標的部位に対するそれぞれの
親和性に起因するか否かを決定するために、各オリゴヌ
クレオチドについての熱力学的測定を行った。アンチセ
ンスオリゴヌクレオチド（ホスホロチオエートとして合
成した）をそれぞれの相補的DNA配列（ホスホジエステ
ルとして合成した）にハイブリダイズさせた。温度に対
する吸光度の曲線を、100mMのNa+、10mMのリン酸、0.1m
MのEDTA、pH7.0中の４μＭの各鎖オリゴヌクレオチドで
測定した。Tm値およびデュプレックス形成の自由エネル
ギーを、直線勾配の基準線を有する２状態モデルにデー
タを適合させることから取得した（Petersheim、Ｍおよ
びD.H.Turner、Biochemistry 1983、22、256−263）。
結果は少なくとも３つの実験値の平均値である。 アンチセンスオリゴヌクレオチドをそれぞれの相補的
DNA配列（ホスホジエステルとして合成した）とハイブ
リダイズさせた場合、ISIS 1940を例外とする全てのア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも50℃のTm値
を示した。従って全てのオリゴヌクレオチドは、標的配
列が露出されている場合には、標的であるICAM−1 mRNA
にハイブリダイズすることが可能であるはずである。驚
くべきことに、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効力
は、TmあるいはΔＧ゜37゜のいずれにも直接は相関して
いなかった。最大生物活性を示すオリゴヌクレオチドで
あるISIS 1939は、他のオリゴヌクレオチドの大半のも
のが示すものと比較してより低いTm値を示した。従っ
て、ハイブリッド形成親和性は生物活性を確かめるには
不十分なものである。 実施例９ ICAM−１発現のアンチセンス阻害におけるオリゴヌクレ
オチド長の影響 アンチセンス活性についてのオリゴヌクレオチド長の
影響を、ISIS 1570（ISIS 2165、2173、2149、2163、お
よび2164）、ならびにISIS 1939（ISIS 2540、2544、25
45、2546、2547、および2548）の先端切断変異物を用い
て検査した。アンチセンス活性は概して、オリゴヌクレ
オチド長が減少するに従って減少した。16塩基分の長さ
であるオリゴヌクレオチドは18塩基分のオリゴヌクレオ
チドと比較して若干低い活性を示した。14塩基分の長さ
であるオリゴヌクレオチドは有意に低い活性を示し、そ
して12もしくは10塩基分の長さのオリゴヌクレオチドは
弱い活性を示すに過ぎなかった。オリゴヌクレオチド長
とTm値とアンチセンス活性との関連性の検査により、14
塩基分と16塩基分の長さとの間に激しい変化が生じる一
方で、Tm値は長さと共に直線的に増加することが示され
る（図10）。 実施例10 ICAM−１のアンチセンス阻害の特異性 ICAM−１についてのアンチセンスオリゴヌクレオチド
ISIS 1570およびISIS 1939の特異性を、35S−ラベル蛋
白質の免疫沈降により評価した。A549細胞は25cm2の組
織培養用フラスコ内で密集するまで増殖させ、そして実
施例４に記載のようにアンチセンスオリゴヌクレオチド
で処理した。この細胞を、表示されるように、インター
ロイキン−１βで14時間刺激し、メチオニン非含有DMEM
に10％の透析済みウシ胎児血清を添加したもので洗浄
し、そして10％の透析済みウシ胎児血清、１μＭのオリ
ゴヌクレオチド、および表示されるインターロイキン−
１βを含むメチオニン非含有培地中で１時間インキュベ
ートした。35S−メチオニン／システイン混合物（Tran
35S−ラベル、ICN社、Costa Mesa、CA、から購入）を10
0μCi/mlの活性になるように細胞に添加し、そしてその
細胞を更に２時間インキュベートした。細胞性蛋白質
は、50mMのトリス−HCl pH8.0、150mMのNaCl、1.0％のN
P−40、0.5％のデオキシコール酸塩、および2mMのEDTA
（ウエル当たり0.5ml）を用いて、４℃において30分間
インキュベートした。18,000×ｇにおける20分間の遠心
処理により抽出物の濁りを除いた。この上清を200μｌ
のプロテインＧ−セファロースビーズ（Bethesda Resea
rch Labs社、Bethesda MD）に４℃において２時間予備
吸着させ、等量に分割し、そして５μｇのICAM−１モノ
クローナル抗体（AMAC Inc.社、Westbrook ME、から購
入した）、あるいはHLA−A,B抗体（W6/32、American Ty
pe Culture Collection、Bethesda、MD、から取得した
マウスハイブリドーマ細胞から産生させた）のいずれか
と共に、４℃において15時間インキュベートした。プロ
テインＧ−セファロースの50％懸濁液（v/v）の200μｌ
と共に４℃において２時間インキュベートすることによ
り免疫複合体を捕獲し、溶菌用緩衝液で５回洗浄し、そ
してSDS−ポリアクリルアミドゲル上で分離させた。蛋
白質はオートラジオグラフィーにより検出した。 ５単位/mlのインターロイキン−１βでのA549細胞の
処理により、二重線として移動する95−100kDaの蛋白質
が合成されることが示され、そしてこの蛋白質はICAM−
１に対するモノクローナル抗体により免疫沈降した。二
重線として見かけは、ICAM−１の異なるグリコシル化形
態に起因するものと思われる。１μＭの濃度におけるア
ンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 1570での細胞の予
備処理によりICAM−１合成は約50％減少し、一方、１μ
ＭのISIS 1939によってはICAM−１の合成はほぼ基準線
にまで減少した。ICAM−１のELISAアッセイ（実施例１
および５）においては不活性を示すアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドISIS 1940は、ICAM−１合成を有意に減少
させなかった。ICAM−１標的とハイブリダイズ可能なア
ンチセンスオリゴヌクレオチドの内のいずれのものもHL
A−A,B合成における論証可能な効果を持たず、このこと
によりICAM−１に対するこれらオリゴヌクレオチドの特
異性が示された。その上、ICAM−１抗体およびプロテイ
ンＧ−セファロースと非特異的に沈殿する蛋白質は、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理により有意な影
響を受けなかった。 実施例11 細胞接着アッセイによるICAM−１に対する活性について
の追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニ
ング ヒト臍静脈内皮（HUVEC）細胞を増殖させ、そして実
施例４におけるようにオリゴヌクレオチドで処理した。
細胞を、ISIS 1939、ISIS 1940、もしくは対照オリゴヌ
クレオチドであるISIS 1821のいずれかで４時間処理
し、その後TNF−αで20時間刺激した。基になるHUVECは
HL−60細胞と最小限の結合を示した一方で、TNF−刺激
化HUVECは添加した総細胞の内の19％に結合した。0.3μ
ＭのISIS 1939でのHUVEC単層の予備処理により、図11に
示されるようにHL−60細胞の接着が基準線にまで減少し
た。対照オリゴヌクレオチドであるISIS 1821およびISI
S 1940は19％から９％へと細胞接着のパーセンテージを
減少させた。これらのデータにより、ICAM−１を標的と
するアンチセンスオリゴヌクレオチドはTNF−α−処理
済みHUVECへの白血球様細胞株（HL−60）の接着を特異
的に減少させることができるということが示される。 実施例12 ELAM−１遺伝子発現に対する活性についてのアンチセン
スオリゴヌクレオチドのELISAスクリーニング ヒトの初代臍静脈内皮（HUVEC）細胞（第二継代から
第五継代までのもの）を96−ウエルプレートにプレート
培養し、そして密集させた。細胞をOpti−MEM（GIBCO
社、Grand Island NY）で３回洗浄した。細胞を、10μg
/mlのDOTMA溶液（Bethesda Research Labs社、Bethesda
MD）を含むOpti−MEM中で希釈した増加濃度のオリゴヌ
クレオチドで、37℃において４時間処理した。培地を除
去し、そしてEGM−UV（Clonetics社、San Diego CA）に
オリゴヌクレオチドを添加したものと交換した。腫瘍壊
死因子αをこの培地に添加し（2.5ng/ml）、そしてこの
細胞を更に４時間、37℃においてインキュベートした。 ELAM−１発現はELISAにより検出した。細胞を、37℃
に予め暖めたダルベッコリン酸緩衝化食塩水（Ｄ−PB
S）で３回洗浄した。細胞を４℃において20分間、95％
エタノールで固定化させ、Ｄ−PBSで３回洗浄し、そし
てＤ−PBS中の２％BSAで遮断した。細胞を、２％BSAを
含むＤ−PBS中で0.5μg/mlに希釈したELAM−１モノクロ
ーナル抗体BBA−１（Ｒ＆D Systems社、Minneapolis M
N）と共にインキュベートした。細胞は、実施例１にお
いて示すように、Ｄ−PBSで３回洗浄し、そして結合し
ているELAM−１抗体をビオチニル化ヤギ抗−マウス二次
抗体を用い、次には、β−ガラクトシダーゼ−コンジュ
ゲートストレプトアビジンを用いて検出した。 ELAM−1 cDNAの11の異なる領域を標的とするアンチセ
ンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ならびに
ICAM−１を標的とする２つのオリゴヌクレオチド（対照
として）の活性を、ELAM−１のELISAを使用して決定し
た。オリゴヌクレオチドおよび標的を表２に示す。 ICAM−１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド
に関して観察されたものと比較すると（実施例５）、EL
AM−１活性の最も有効なオリゴヌクレオチドモジュレー
ター（ISIS 2679）はELAM−１の５′−非翻訳領域内の
特異的配列とハイブリダイズ可能であった。ISIS 2679
標的の３塩基分上流で終了する配列にハイブリダイズし
たオリゴヌクレオチドISIS 2687は、有意な活性を示さ
なかった（図12）。従ってISIS 2679は、アンチセンス
オリゴヌクレオチドでの阻害に特有の感受性を示すELAM
−1 mRNAの独特の部位にハイブリダイズする。アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドでの阻害に対するこの部位の感
受性は、RNA二次構造による予測もしくは文献上の情報
を基にしては予測不可能なものであった。 実施例13 ELAM−１遺伝子発現に対する活性についての追加のアン
チセンスオリゴヌクレオチドのELISAスクリーニング 18のアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドによるELAM−１発現の阻害は、実施例12において記
載されるELISAアッセイを用いて決定した。ELAM−1 mRN
A上のこれらのオリゴヌクレオチドの標的部位を、図13
に示す。ELAM−１に対する各オリゴヌクレオチドの配列
および活性を表３に示す。星印（＊）により示されるオ
リゴヌクレオチドは約50nMもしくはそれを下回るIC50値
を有し、そしてそのようなものであることが好ましい。
IC50値は、ELAM−１発現の50％阻害をもたらすオリゴヌ
クレオチドの用量を示す。 ３−非翻訳領域を標的とする追加のオリゴヌクレオチド
（ISIS 4728）はELAM発現を阻害しなかった。 実施例14 VCAM−１遺伝子発現に対する活性についてのアンチセン
スオリゴヌクレオチドのELISAスクリーニング 15のアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドによるVCAM−１発現の阻害は、細胞をTNF−αで16
時間刺激させ、そしてVCAM−１発現を0.5μg/mlで用い
るVCAM−１特異的モノクローナル抗体（Ｒ＆D Systems
社、Minneapolis、MN）により検出したことを除いて
は、実施例12において記載されるものとほぼ同様のELIS
Aアッセイを使用して決定した。VCAM−1 mRNA上のこれ
らオリゴヌクレオチドの標的部位を図14に示す。VCAM−
１に対する各オリゴヌクレオチドの配列および活性を表
４に示す。星印（＊）により示されるオリゴヌクレオチ
ドは約50nMもしくはそれを下回るIC50値を有し、そして
そのようなものであることが好ましい。IC50値は、VCAM
−１発現の50％阻害をもたらすオリゴヌクレオチドの用
量を示す。 実施例15 C8161ヒト黒色腫細胞におけるICAM−１発現：ヒト黒色
腫細胞株C8161（Dr.Dan Welch、Hershey Medical Cente
r、からの贈与）は、再発性悪性黒色腫を患う患者から
の腹壁転移に由来する。これらの細胞は、無胸腺ヌード
マウス内への皮下、皮内、および静脈内注射後に、肺、
皮下組織、脾臓、肝臓、および局所リンパ節における重
複転移を形成する。細胞は10％のウシ胎児血清を含むDM
A−F12培地中で増殖させ、そして2mMのEDTAを用いて継
代した。 C8161細胞のTNF−αへの露出により、ICAM−１の細胞
表面発現の６倍の増加、およびこれらの細胞におけるIC
AM−1 mRNAレベルの増加がもたらされた。細胞表面にお
けるICAM−１発現はELISAにより測定した。細胞を、37
℃において４時間、15μg/mlのリポフェクチン（Lipofe
ctin）の存在下、増加濃度のアンチセンスオリゴヌクレ
オチドで処理した。ICAM−１発現は、5ng/mlのTNF−α
と16時間インキュベーションすることにより誘導させ
た。細胞をDPBS中で３回洗浄し、そして２％ホルムアル
デヒド中で20分間固定させた。細胞をDPBSで洗浄し、37
℃において１時間２％BSAで遮断し、そしてICAM−１モ
ノクローナル抗体84H10（AMAC、Inc.社、Westbrook、M
E）と共にインキュベートした。結合した抗体濃度の検
出は、ビオチニル化ヤギ抗−マウスIgGとのインキュベ
ーションを行い、そしてその後にβ−ガラクトシダーゼ
−コンジュゲートストレプトアビジンとのインキュベー
ションを行い、そしてクロロフェノールレッド−β−Ｄ
−ガラクトピラノシドでの現象を行い、そしてその後に
575nmでの吸光度による定量化を行うことにより決定し
た。ICAM−1 mRNAレベルは、ノザンブロット分析により
測定した。 実施例16 C8161ヒト黒色腫細胞におけるICAM−１発現のオリゴヌ
クレオチド阻害：図15に示すように、ICAM−１を標的と
するアンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 1570（配列
番号１）、ISIS 1939（配列番号15）、およびISIS 2302
（配列番号22）は、ICAM−１の細胞表面発現を減少させ
た（実施例16におけるようにELISAにより検出）。５−
リポオキシゲナーゼに相補的な陰性対照オリゴヌクレオ
チドISIS 1822は、ICAM−１発現に影響を及ぼさなかっ
た。このデータは、対照の活性に対するパーセンテージ
として示され、以下のように算出した。 （オリゴヌクレオチド処理済みサイトカイン誘導化細胞
についてのICAM−１発現）−（基準的ICAM−１発現）／
（ICAM−１サイトカイン誘導化発現）−（基準的ICAM−
１発現）×100 ISIS 1939（配列番号15）およびISIS 2302（配列番号
22）はICAM−1 mRANレベルを顕著に減少させたが（ノザ
ンブロット分析により検出）、ISIS−1570（配列番号
１）はICAM−1 mRNAレベルをわずかに減少させるのみで
あった。 実施例17 実験的転移アッセイ：転移におけるICAM−１の役割を評
価するために、実験的転移アッセイを、無胸腺ヌードマ
ウスの側方尾静脈内への１×105のC8161細胞の注入によ
り実施した。サイトカインであるTNF−αおよびインタ
ーフェロンγでのC8161細胞の処理によっては、ヌード
マウス内への細胞の注入を行った際に肺転移数の増大が
もたらされることが既に示されている［Miller、D.E.お
よびWelch、D.R.（1990）Proc.Am.Assoc.Cancer Res.1
3:353］。 ４週間後にマウスを屠殺し、器官をブイン（Bouin'
s）の固定液中で固定し、そして肺の転移病変を解剖顕
微鏡を使用して計数した。４週令の雌の無胸腺ヌードマ
ウス（Harlan Sprague Dawaley種）を使用した。動物は
NIHの基準に基づいて維持した。各４−８匹の群を実験
的転移アッセイにおいて検査した。 実施例18 アンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 1570およびISIS
2302は、C8161細胞の転移能を減少させる:ICAM−１に相
補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 1570およ
びISIS 2302でのC8161細胞の処理は、陽イオン性脂質で
あるリポフェクチン（Lipofectin）（Gibco/BRL社、Gai
thersburg、MD）の存在下において実施した。アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは実施例３において記載のよう
に合成した。細胞を106細胞/mlで60mmの組織培養用ディ
ッシュに撒き、そして37℃で３日間インキュベートし、
Opti−MEM（Gibco/BRL社）で３度洗浄し、そして100μ
ｌのOpti−MEM培地を各ウエルに添加した。0.5μＭのオ
リゴヌクレオチドと15μg/mlのリポフェクチンとを室温
において15分間混ぜ合わせた。25μｌのオリゴヌクレオ
チド−リポフェクチン混合物を適切なディッシュに添加
し、そして37℃において４時間インキュベートした。オ
リゴヌクレオチド−リポフェクチン混合物を除去し、そ
して10％のウシ胎児血清を含むDME−F12培地と入れ替え
た。４時間後に500U/mlのTNF−αを適切なウエルに添加
し、そして18時間インキュベートし、この18時間目の時
点で細胞をプレートから除去し、計数を行い、そして無
胸腺ヌードマウスに注入した。 ISIS 1570（配列番号１）もしくはISIS 2302（配列番
号22）でのC8161細胞の処理によってこれらの細胞の転
移能は減少し、そしてTNF−α処理によりもたらされたC
8161の転移能増加はなくなった。データを表５に示す。 実施例19 ICAM−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを検
査するためのマウスモデル：細胞間接着分子により媒介
されるものと思われる多くの症状はヒトにおける研究へ
持ち込むことが不可能である。一例では、同種異系移植
片拒絶はICAM−１の妨害を行うことにより改善されるも
のと思われる症状であるが、これはヒトの移植患者より
もむしろ動物において評価すべきものであることは明ら
かである。他のこのような例は炎症性腸疾患であり、そ
して更に別のものは好中球遊走（遊出）である。しかし
ながらこれらの症状は、本明細書において用いられるマ
ウスモデルのような動物モデルにおいて検査することが
できる。 マウス細胞におけるICAM−１発現の阻害のためのオリ
ゴヌクレオチド配列を同定した。マウスICAM−１は、ヒ
トのICAM−１配列と約50％の相同性を有しており、その
ためヒトのICAM−１を標的としたオリゴヌクレオチドの
評定を行って得られた情報を使用して、マウスのICAM−
1 mRNA配列を標的とする一連のオリゴヌクレオチドを設
計および合成した。免疫沈降アッセイを使用してこれら
のオリゴヌクレオチドについての活性のスクリーニング
を行った。 マウスDCEK−ICAM−１細胞（Dr.Adrienne Brian、Uni
versity of California at San Diego、より贈与され
た）を、37℃において４時間、20μg/mlのDOTMA/DOPE溶
液の存在下において１μＭのオリゴヌクレオチドで処理
した。培地を10％の透析済みウシ胎児血清および１μＭ
のアンチセンスオリゴヌクレオチドを添加したメチオニ
ン非含有培地と入れ替えた。細胞をメチオニン非含有培
地中で１時間インキュベートし、そしてその後100μCi/
mlの35S−ラベルメチオニン／システイン混合物をその
細胞に添加した。細胞を更に２時間インキュベートし、
PBSで４回洗浄し、そして20mMのトリス、pH7.2、20mMの
KCl、5mMのEDTA、１％のTriton X−100、0.1mMのロイペ
プチン、10μg/mlのアプロチニン、および1mMのPMSFを
含む緩衝液で抽出した。ICAM−１は、マウス−特異的IC
AM−１抗体（YN1/1.7.4）と共にインキュベートし、そ
の後にプロテインＧ−セファロースにかけることにより
抽出物から免疫沈降させた。この免疫沈降物をSDS−PAG
Eにより分析し、そしてオートラジオグラフィーにかけ
た。マウスICAM−１のAUGコドンを標的とするホスホロ
チオエートオリゴヌクレオチドISIS 3066および3069
は、ICAM−１合成を各々48％および63％阻害した一方
で、マウスICAM−1 mRNAの３′−未翻訳領域における配
列を標的とするオリゴヌクレオチドISIS 3065およびISI
S 3082はICAM−１合成を各々47％および97％阻害した。
マウスICAM−１に対して最も活性の高いアンチセンスオ
リゴヌクレオチドは３′−未翻訳領域を標的としてい
た。ISIS 3082についてこれらの結果に基づく更に詳細
な評定を行ったところ、この20−量体ホスホロチオエー
トオリゴヌクレオチドは配列（５′から３′へ） TGC ATC CCC CAG GCC ACC AT （配列番号83） を含んでいた。 実施例20 ICAM−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドはマ
ウスモデル系において炎症性腸疾患を軽減する 炎症性腸疾患（IBD）についてのマウスモデルが最近
開発された。Okayasu et al.、（1990）Gastroenterolo
gy 98:694−702。マウスへの硫酸デキストランの投与に
より、全ての詳細においてヒトのIBDに類似する結腸炎
が誘導される。硫酸デキストラン誘導化IBDおよびヒトI
BDについてはその後に、組織学的レベルにおけるより綿
密な比較が行われ、そしてこのマウスモデルは極度に再
現性が良く、そして信頼できるモデルであることが見い
だされた。これを、本明細書中においては、マウスICAM
−１の３′−未翻訳領域に相補的な20−塩基ホスホロチ
オエートアンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 3082の
効果を検査するのに用いる。 体重約25−30グラムである雌のスイスウエブスター種
（Swiss Webster）マウス（８週令）を標準的な条件下
に維持する。マウスは、実験手順の開始前少なくとも５
日間は順化させる。マウスに、飲料水中に含まれる５％
の硫酸デキストランを５日間与える（自由接種可能）。
それに付随して、薬剤学的担体中に含まれるISIS 308
2、担体単独（陰性対照）、もしくはTGF−β（マウスに
おける硫酸デキストラン介在性結腸炎を予防することが
知られている）を投与する。ISIS 3082は５日間毎日の1
mg/kgもしくは10mg/kgの皮下注射として投与した。TGF
−βは、１μg/マウスで結腸内投与した。1mg/kgにおい
ては、このオリゴヌクレオチドは、硫酸デキストラン誘
導性結腸炎の予防においてTGF−βと同様の効果を示し
た。 マウスは６日目に屠殺し、そして結腸を組織学的評定
に供した。屠殺するまでの疾患作用については、体重変
化に関してマウスを観察することおよび結腸炎の兆候に
関して便を観察することによる記録を行った。マウスの
体重は毎日計測した。便は粘稠度の変化について、なら
びに潜在性もしくは総体的出血の存在について毎日観察
した。集計システムを使用して疾患作用係数を開発し、
それにより体重減少、便の粘稠度、および出血の存在を
０から３までのスケールで等級付けを行い（０は正常で
あり、そして３は最も重篤な影響である）、そして係数
を算出した。疾患作用係数における薬物誘導性の変化を
統計的に分析した。疾患作用係数は概してIBDと極端に
良好な状態で相関することが示された。結果を図16に示
す。1mg/kgにおいては、このオリゴヌクレオチドは疾患
係数を40％減少させた。 実施例21 ICAM−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドはマ
ウス異所性心臓移植モデルにおける生存率を増加させる 同種異系移植片拒絶の予防におけるICAM−１アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの治療効果を決定するために、
マウスICAM−１特異的オリゴヌクレオチドISIS 3082
を、マウスの血管化異所性心臓移植モデルにおける作用
について検査した。Balb/cマウスからの心臓を、Isobe
et al.［（1991）Circulation 84:1246−1255］により
主に記載される初代血管化移植片としてC3Hマウスの腹
腔内に移植した。オリゴヌクレオチドを７日用アルツェ
ットポンプ（７−day Alzet pump）を介する継続的静脈
内投与により投与した。未治療マウスについての平均生
存期間は9.2±0.8日（８、９、９、９、10、10日）であ
った。７日間5mg/kgのISIS 3082での治療を行ったマウ
スは、14.3±4.6日（11、12、13、21日）にまで平均生
存期間が伸びた。 実施例22 ICAM−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは白
血球遊走を減少させる 組織および器官の白血球遊出は炎症性過程の主要な側
面であり、そして炎症によりもたらされる組織破壊に寄
与している。白血球遊走におけるISIS 3082の効果を、
カラゲニンに浸したスポンジを皮下移植するマウスモデ
ルを用いて調査した。カラゲニンは白血球遊走および水
腫を刺激誘導する。炎症性滲出液中の白血球遊走につい
てのオリゴヌクレオチドの効果を、移植したスポンジに
遊出する白血球の定量により評定する。４時間の絶食の
後に40匹のマウスを、各５匹のマウスを含む８つの群へ
と無作為抽出により割り振った。各マウスにMetofane
（商標）での麻酔を施し、そして1mlの20mg/mlカラゲニ
ン溶液を染み込ませたポリエステルスポンジを皮下移植
した。群１には、スポンジ移植の前４時間目に10ml/kg
での食塩水を静脈投与し、そしてこれを賦形剤対照とし
て用いた。群２には、3mg/kgで20ml/kgの容積のインド
メタシン（陽性対照）を、手術直後、６−８時間後に再
度、そして移植後21時間目にさらに再び経口投与した。
群３には、ISIS 3082を5mg/kgでスポンジ移植の３時間
前に静脈投与した。群４には、ISIS 3082を5mg/kgでス
ポンジ移植直後に静脈投与した。群５、６、７、および
８にはISIS 3082を5mg/kgでスポンジ移植後各２、４、
８、および18時間目に投与した。移植後24時間目にスポ
ンジを取り出し、EDTAおよび食塩水（5ml）中に浸し、
そして絞って乾かした。スポンジ滲出混合物中の白血球
の総数を決定した。 賦形剤対照群との比較を行うと、3mg/kgのインドメタ
シンの経口投与により平均白血球計測数が79％減少し
た。 スポンジ移植の４時間前に5mg/kgのISIS 3082を投与
した後には、平均白血球計測数の42％の減少が観察され
た（群３）。スポンジ移植直後に5mg/mlのISIS 3082を
投与した後には、平均白血球計測数の47％の減少が観察
された（群４）。全ての動物は研究過程の間中正常であ
るように思われた。
反応する疾患状態のための診断法、研究用試薬、および
治療法に関する。本発明は具体的には、白血球細胞の他
の白血球細胞および他の細胞種への接着を調節する蛋白
質の合成に関与する所定のメッセンジャーリボ核酸（mR
NA）もしくはDNAとのアンチセンスオリゴヌクレオチド
相互作用に関する。細胞間接着分子−１（ICAM−１）、
内皮白血球接着分子−１（Ｅ−セレクチンとしても知ら
れるELAM−１）、および血管細胞接着分子−１（VCAM−
１）をコードするmRNAにハイブリダイズするように設計
されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。
これらのオリゴヌクレオチドはRNAもしくはDNAの活性調
節を誘導し、そしてそのことにより特異的細胞接着分子
の合成および代謝の調節を誘導することが見いだされ
た。 発明の背景 炎症は、損傷、感染、もしくは組織破壊に反応する組
織により誘導される局所的防御反応であり、これにより
感染性もしくは損傷性作用物質の破壊および損傷を受け
た組織の分離がもたらされる。典型的な炎症反応は次に
示すように進行する。外因性物質としての抗原の認識も
しくは組織損傷の認識、可溶性炎症性媒介物質の合成お
よび放出、感染もしくは組織損傷の部位への炎症細胞の
補充、侵略生体物もしくは損傷組織の破壊および除去、
ならびに一度侵略生体物もしくは損傷組織が分解された
直後のその系の非活性化である。炎症性構成成分に係わ
るヒトの疾患の多くのものにおいては炎症反応を弱める
正常なホメオスタシス機構が欠損しており、このことに
より正常組織の損傷および破壊がもたらされる。 細胞−細胞相互作用は、先に記載の各段階における免
疫反応の活性に係わっている。正常な炎症反応における
最も初期の検出可能なできごとの内の一つは血管内皮へ
の白血球の接着であり、この後に、血管系を出て炎症も
しくは損傷部位へと向かう白血球の遊走が続く。これら
の白血球（leukocytes）、すなわち白血球（white bloo
d cells）の血管内皮への接着は、血管系外への遊走に
おける必須段階である。Harlan J.M.、Blood 1985、6
5、513−525。一般的には、炎症部位に出現する最初の
炎症細胞は好中球であり、この後に単球、そして白血球
が続く。細胞−細胞相互作用もＢ−白血球とＴ−白血球
の両方の増殖にとって重要であり、これにより各々体液
性反応および細胞性免疫反応の亢進がもたらされる。 血管内皮および他の細胞種への白血球の接着は、白血
球細胞と血管内の両方の原形質膜上に存在する「接着分
子」と称される特異的蛋白質間の相互作用により媒介さ
れる。接着分子間の相互作用は、リガンドが可溶性であ
る代わりに細胞表面に固定化されていることを除外して
は古典的なレセプター−リガンド相互作用に類似してい
る。白血球接着における遺伝子欠損を有する患者を同定
することにより、研究者は白血球の接着の原因となる一
群の蛋白質を同定することが可能となる。白血球接着欠
損症（LAD）は、再発性細菌感染、および悪性膿形成、
および創傷治癒により特徴付けられる稀な常染色体特性
である。この欠損症は、通常白血球の細胞外膜上に発現
するMac−１、LFA−１、およびp150,95という３つのヘ
テロ二量体糖蛋白質の共通なＢ−サブユニット中に生じ
ることが示されている。AndersonおよびSpringer、Ann.
Rev.Med.1987、38、175−194。LADを患う患者は、顆粒
球、単球、および白血球の広範な接着依存性機能スペク
トラムの欠損を示す。LFA−１については３つのリガン
ドが同定されており、それらは細胞間接着分子１、２、
および３（ICAM−１、ICAM−２、およびICAM−３）であ
る。Mac−１およびp150,95の両方共が補体断片C3bi、お
よび恐らく他の未同定リガンドに結合する。MAC−１も
やはりICAM−１に結合する。 白血球の血管内皮への接着および後続の血管系外への
遊走に関与する他の接着分子が同定されている。これら
には、内皮白血球接着分子−１（ELAM−１）、血管細胞
接着分子−１（VCAM−１）、顆粒膜蛋白質−140（GMP−
140）、およびそれら各々のレセプターがある。血管内
皮への白血球の接着は、部分的にもしくは全て５つの細
胞接着分子、ICAM−１、ICAM−２、ELAM−１、VCAM−
１、およびGMP−140により媒介されているようである。
DustinおよびSpringer、J.Cell Biol.1987、107、321−
331。接着分子ICAM−１、ELAM−１、VCAM−１、およびG
MP−140の細胞表面上での発現は炎症性刺激により誘導
される。それとは対照的に、ICAM−２の発現は構成的で
あり、そしてサイトカインによる誘導に感受性を示さな
いように思われる。一般的にGMP−140はヒスタミン、ロ
イコトリエンB4、血小板活性化因子、およびトロンビン
のようなオータコイドにより誘導される。内皮細胞上で
の最大発現は刺激後30分から１時間目までに観察され、
そして基準線には２−３時間以内に戻る。内皮細胞上で
のELAM−１およびVCAM−１の発現は、インターロイキン
−１βおよび腫瘍壊死因子のようなサイトカインにより
誘導されるが、ガンマー−インターフェロンによっては
誘導されない。内皮細胞表面上でのELAM−１の最大発現
は刺激後４−６時間目に生じ、そして16時間目までには
基準線に戻る。ELAM−１発現は新しいmRNAおよび蛋白質
合成に依存している。VCAM−１発現の増大は腫瘍壊死因
子での処理後２時間目に検出可能となり、刺激後８時間
目で最大値を示し、そして刺激後少なくとも48時間は増
大したままになる。RiceおよびBevilacqua、Science、1
989、246、1303−1306。内皮細胞上でのICAM−１発現
は、サイトカインであるインターロイキン−１、腫瘍壊
死因子、およびガンマー−インターフェロンにより誘導
される。ELAM−１の最大発現に続くICAM−１の最大発現
は、刺激後８−10時間目に生じ、そして少なくとも48時
間は上昇したままになる。 GMP−140およびELAM−１は主に血管内皮細胞への好中
球の接着に関与している。VCAM−１は主にＴおよびＢ白
血球に結合する。その上VCAM−１は黒色腫および恐らく
は他の癌の転移における役割を担っている可能性があ
る。ICAM−１は血管内皮への好中球の接着、ならびに血
管内皮、組織繊維芽細胞、および上皮ケラチノサイトへ
の単球の接着における役割を担っている。ICAM−１もや
はり抗原提示細胞のＴ−細胞認識、ナチュラルキラー細
胞による標的細胞の溶菌、白血球の活性化および増殖、
ならびに胸腺におけるＴ細胞成熟における役割を担って
いる。その上最近のデータにより、ICAM−１は、一般の
風邪の50％を上回る割合を占めるライノウイルスの主要
血清型の細胞成レセプターであることが示されている。
Staunton et al.、Cell 1989、56、849−853;Grave et
al.、Cell 1989、56、839−847。 ICAM−１発現は、アレルギー性接触性皮膚炎、固定薬
疹、偏平苔癬、および乾癬のような種々の炎症性皮膚疾
患に関連している。Ho et al.、J.Am.Acad.Dermatol.19
90、22、64−68;GriffithsおよびNickoloff、Am.J.Path
ology 1989、135、1045−1053;Lisby et al.、Br.J.Der
matol.1989、120、479−484;Shiohara et al.、Arch.De
rmatol.1989、125、1371−1376。その上ICAM−１発現
は、リューマチ性関節炎を患う患者の滑液;Hale et a
l.、Arth.Rheum.1989、32、22−30、糖尿病疾患の脾臓
Ｂ−細胞;Campbell et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.1989、86、4282−4286;グレービス氏疾患（Graves′
disease）を患う患者における胸腺小胞細胞;Weetman et
al.、J.Endocrinol.1989、122、185−191、ならびに腎
臓および同種異系肝臓移植片拒絶;FaullおよびRuss、Ta
nsplantation 1989、48、226−230;Adams et al.、Lanc
et 1989、1122−1125、において検出されている。 ICAM−１、VCAM−１、およびELAM−１発現の阻害剤に
より、喘息、リューマチ性関節炎、同種異系移植片拒
絶、炎症性腸疾患、種々の皮膚科的症状、および乾癬の
ような種々の炎症性疾患もしくは炎症性成分に関する疾
患に対する活性を有する治療用の種類の新規の抗−炎症
剤が提供されることが望まれていた。その上ICAM−１、
VCAM−１、およびELAM−１の阻害剤は、ライノウイルス
感染に起因する風邪、AIDS、カポジ肉腫、ならびにある
種の癌およびそれらの転移にも有効である可能性があ
る。細胞性接着分子であるELAM−１、VCAM−１、および
ICAM−１の発現を効果的に予防する治療剤は、今日まで
には知られていない。動物モデルにおけるICAM−１に対
する中和用モノクローナル抗体の利用により、もし同定
されたとしたらこのような阻害剤は、喘息;Wegner et a
l.、Science 1990、247、456−459、腎臓同種異系移植
片;Cosimi et al.、J.Immunol.1990、144、4604−461
2、および心臓同種異系移植片;Isobe et al.、Science
1992、255、1125−1127についての治療面での利益をも
たらすであろうという証拠が提供されている。ICAM−１
分子の可溶性形態の利用も、培養物中の細胞のライノウ
イルス感染の予防に有効であった。Marlin et al.、Nat
ure 1990、344、70−72。 細胞間接着分子について影響を与える現行の作用物質
には、合成ペプチド、モノクローナル抗体、および接着
分子の可溶化形態がある。VCAM−１もしくはELAM−１と
の相互作用を遮断する合成ペプチドは今日までには同定
されていない。モノクローナル抗体は、ICAM−１、VCAM
−１、およびELAM−１の発現に起因する急性炎症性反応
の治療に有用であることが証明される可能性がある。し
かしながら慢性的治療に関しては、宿主動物はそのモノ
クローナル抗体に対する抗体を生じさせ、それらの抗体
の有用性を制限する。その上モノクローナル抗体は大き
な蛋白質であり、このことが炎症性部位へのアクセスを
困難にしてしまう可能性がある。細胞接着分子の可溶化
形態は、それらの生産費用がかさみ、そして結合親和性
が低いことに加え、モノクローナル抗体のものと同様の
数多くの制限を課せられている。従って、細胞間接着分
子を効果的に阻害する分子が長いこと望まれてきた。ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは、ICAM−１、VCAM−
１、およびELAM−１の効果を遮断するのに用いられる現
行の作用物質の多くの落とし穴を回避する。 米国PCT出願第90/02357号（Hession et al.）は、ELA
M−１、ならびにVCAM−１およびVCAM−1bを初めとする
内皮接着分子（ELAMs）をコードするDNA配列を開示して
いる。これらのDNA配列の数々の利用法が提供され、そ
れには、（１）内皮細胞への白血球結合を阻害する治療
剤として使用することができる。これらの分子に反応性
を示すモノクローナル抗体調製物の製造、（２）白血球
上のELAMリガンドに結合し、次には内皮細胞上のELAMに
結合することができて、内皮細胞への白血球結合を阻害
するELAMペプチドの製造、（３）炎症を検出するため
の、ELAMに係合する分子の利用（抗−ELAM抗体、もしく
はリガンドもしくはその断片のような標識）、（４）ア
ンチセンス核酸でMRNAをマスクするか、あるいはリボザ
イムでそれを開裂するかのいずれかにより特異的MRNAの
翻訳を遮蔽する目的でアンチセンス核酸およびリボザイ
ムを使用する、翻訳レベルでELAMもしくはELAMリガンド
発現に介在する核酸分子を産生するためのELAMおよびEL
AMリガンドDNA配列の利用、がある。コーディング領域
が最適の標的であることが開示されている。VCAM−１に
ついてはAUGが最もそれらしく思われており、そのためA
UG部分にハイブリダイズする15量体が実施例17において
具体的に開示されている。 発明の目的 炎症性細胞接着分子の合成および発現における二次効
果を介する、免疫学的構成成分に関する疾患、同種異系
移植片、癌および転移、炎症性腸疾患、乾癬、および他
の皮膚疾患、風邪、およびAIDSのための治療を提供する
ことは、本発明の主な目的である。 細胞間接着性蛋白質をコードする核酸の機能を阻害す
ることが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供
することは、本発明の別の目的である。 細胞間接着の機能不全の診断のための方法を提供する
ことは、更に別の目的である。 本発明のこれらの目的および他の目的は、本明細書を
精査することにより明らかになるであろう。 図面の簡単な既述 図１は、ヒトの細胞間接着分子−１（ICAM−１）のmR
NA配列である。 図２は、ヒトの内皮白血球接着分子−１（ELAM−１）
のmRNA配列である。 図３は、ヒトの血管細胞接着分子−１（VCAM−１）の
mRNA配列である。 図４は、インターロイキン−１および腫瘍壊死因子に
よる種々のヒト細胞株の細胞表面におけるICAM−１発現
の誘導のグラフ表示である。 図５は、ヒト臍静脈内皮細胞上のICAM−１発現に対す
る選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果の
グラフ表示である。 図6Aおよび6Bは、腫瘍壊死因子およびインターロイキ
ン−１で刺激したヒト臍静脈内皮細胞でのICAM−１の発
現に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果のグ
ラフ表示である。 図７は、DMSOでの分化処理を施したHL−60細胞の、対
照および腫瘍壊死因子処理を施したヒト臍静脈内皮細胞
へのICAM−１介在性接着に対するアンチセンスオリゴヌ
クレオチドの効果のグラフ表示である。 図８は、A549ヒト肺癌細胞でのICAM−１発現に対する
選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果のグ
ラフ表示である。 図９は、ヒトの初代ケラチノサイトでのICAM−１発現
に対する選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの
効果のグラフ表示である。 図10は、オリゴヌクレオチの鎖長、TmおよびICAM−１
発現の阻害に対する効果の間の関係のグラフ表示であ
る。 表11は、DMSOでの分化処理を施したHL−60細胞の、対
照および腫瘍壊死因子処理を施したヒト臍静脈内皮細胞
へのICAM−１介在性接着に対する選択されたアンチセン
スオリゴヌクレオチドの効果のグラフ表示である。 図12は、腫瘍壊死因子での処理を施したヒト臍静脈内
皮細胞でのELAM−１発現に対する選択されたアンチセン
スオリゴヌクレオチドの効果のグラフ表示である。 図13は、ヒトELAM−1 mRNAのグラフ表示であり、アン
チセンスオリゴヌクレオチドの標的部位を示してある。 図14は、ヒトVCAM−1 mRNAのグラフ表示であり、アン
チセンスオリゴヌクレオチドの標的部位を示してある。 図15は、ICAM−１に相補的なアンチセンスオリゴヌク
レオチドでの処理後のC8161ヒト黒色腫細胞におけるICA
M−１発現の阻害を示す線グラフである。 図16は、硫酸デキストラン（DSS）により誘導した炎
症性腸疾患についてのISIS 3082の効果を示す棒グラフ
である。 発明の要約 本発明に従うと、細胞間接着分子−１（ICAM−１）、
血管細胞接着分子−１（VCAM−１）、および内皮白血球
接着分子−１（ELAM−１）をコードする核酸に特異的に
ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが提供される。
このオリゴヌクレオチドは直接mRNAに、あるいは三重鎖
構造を形成する選択されたDNA部分のいずれかに結合
し、このことによりその遺伝子から生ずるmRNAの量を調
節するように設計されている。 前述の関係は、一般的には「アンチセンス」として表
示される。このオリゴヌクレオチドは、RNAもしくはDNA
の機能、つまり蛋白質への翻訳、もしくは細胞質内への
輸送、もしくはその総体的生物学的機能に必要な他のい
ずれかの活性の内のどれかを阻害することが可能であ
る。RNAもしくはDNAがその機能の全てもしくは一部分を
実行できないために、細胞接着分子が正しく発現される
ように調節するゲノムの一部分の欠損がもたらされ、こ
のことにより、該代謝が調節される。 アンチセンスの攻撃については特異的遺伝子を標的と
することが好ましい。ICAM−１、VCAM−１、およびELAM
−１をコードする遺伝子がこの研究法にとって特に有用
であることを、我々は発見した。ICAM−１、VCAM−１、
およびELAM−１発現の阻害は、炎症性疾患、炎症性構成
成分に関する疾患、同種異系移植片拒絶、乾癬、および
多の皮膚疾患、炎症性腸疾患、癌およびその転移、なら
びにウイルス感染の治療に有効であることが期待され
る。 動物を、細胞接着を調節することが可能な蛋白質をコ
ードする核酸とハイブリダイズすることが可能なオリゴ
ヌクレオチドに接触させることを含む、細胞接着の調節
の方法が提供される。ICAM−１、VCAM−１、およびELAM
−１をコードするRNAもしくはDNAとハイブリダイズする
ことが可能なオリゴヌクレオチドが好ましい。診断のた
めの方法も本発明の一部分である。 好ましい態様の詳細な記述 アンチセンスオリゴヌクレオチドには、ヒトについて
の多くの疾患の治療のための治療剤としての偉大な可能
性が存在する。オリゴヌクレオチドは、ワトソン−クリ
ックの塩基対形成により特定されるように、前−mRNAも
しくは成熱したmRNAのいずれかの相補的配列に特異的に
結合してDNAから蛋白質への遺伝情報の流れを阻害す
る。アンチセンスオリゴヌクレオチドの特性はそれら自
体をそれらの標的配列にとって特異的なものにしている
が、そのような特性は、それらを極端に多目的なものに
もしている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは４つの
単量体単位からなる長い鎖であるため、それらをどのよ
うな標的RNA配列についても容易に合成することができ
る。多大な数にのぼる最近の研究により、標的蛋白質を
研究するための生化学的道具としてのアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドの利用性が証明されている。Rothenberg
et al.、J.Natl.Cancer Inst.1989、81、1539−1544;Z
on、G.Pharmaceutical Res.1988、５、539−549。細胞
取り込みの増加を示すヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオ
チドの合成における最近の進歩のため、現在では新規の
形態の治療法としてのアンチセンスオリゴヌクレオチド
の利用を考案することが可能となっている。 アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、従来の技術
の研究法で直面していた問題に対する理想的解決法が与
えられる。所定のイソ酵素を選択的に阻害するようにそ
れらを設計することができ、それらはその酵素の産生を
阻害し、そしてそれらは複数のレセプターを捕捉するも
しくはそれに結合する遊離ラジカルのような非特異的機
構を回避する。酵素機構もしくはレセプター−リガンド
相互作用を完全に理解することは、特異的阻害剤の設計
には必要でない。 標的の記述 好中球の炎症性部位内への急性浸潤は、内皮細胞表面
におけるGMP−140、ELAM−１、およびICAM−１の発現の
増大に起因するものと思われる。炎症反応の後期段階中
の白血球および単球の出現はVCAM−１およびICAM−１に
より媒介されるものと思われる。ELAM−１およびGMP−1
40は血管内皮細胞上で一時的に発現されるのに対し、VC
AM−１およびICAM−１は慢性的に発現される。 ヒトICAM−１は、55,219ダルトンの蛋白質の合成をも
たらす3.3kbのmRNAによりコードされている（図１）。I
CAM−１はＮ−結合型グリコシル化部位を介して、かな
りの量がグリコシル化されている。SDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により決定したところ、成熟蛋白質
は90kDaという見かけ上の分子量を有している。Saunton
et al.、Cell 1988、52、925−933。ICAM−１は、イム
ノグロブリンスーパー遺伝子ファミリーの一員であり、
アミノ末端に５つの免疫グロブリン様ドメインを有し、
その後には貫膜ドメインおよび細胞質ドメインが続く。
LFA−１およびライノウイルスについての一次結合部位
は、最初の免疫グロブリン様ドメイン中に見いだされて
いる。しかしながらこの結合部位は特殊なもののように
思われる。Staunton et al.、Cell 1990、61、243−35
4。電子顕微鏡による最近の研究により、ICAM−１は18.
7nmの長さで２−3nm直径の折れ曲がった棹のような構造
であることが証明されている。Staunton et al.、Cell
1990、61、243−254。 ICAM−１は広範な組織および細胞分布を示し、そして
白血球細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイト、
および他の上皮細胞において見いだすことができる。血
管内皮細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイト、神経膠星状
細胞、および数種の細胞株については、ICAM−１の発現
を、細菌性リポ多糖、ならびにインターロイキン−１、
腫瘍壊死因子、ガンマー−インターフェロン、およびリ
ンホトキシンのようなサイトカインでの処理により調節
することができる。例えば、Frohman et al.、J.Neuroi
mmunol.1989、23、117−124、を参照せよ。サイトカイ
ン処理後のICAM−１の発現増大についての分子機能はい
まだに決定されていない。 ELAM−１は、膜糖蛋白質のセレクチンファミリーの一
員である115−kDaの膜糖蛋白質である（図２）。Bevila
cqua et al.、Science 1989、243、1160−1165。ELAM−
１のアミノ末端領域にはレクチン−様蛋白質の一員と相
同性を有する配列が含まれており、その次には表皮成長
因子に類似するドメインが続き、その次には補体レセプ
ター１および２において見いだされるものに類似する六
縦列をなす60−アミノ酸反復構造が続く。これらの特色
はGMP−140、および白血球ホーミング抗原（homing ant
igen）であるMEL14抗原にも共通している。ELAM−１は
3.9−kbのmRNAによりコードされる。ELAM−１のmRNAの
３′−非翻訳領域には、細胞性mRNAの迅速な物質交代の
原因となる配列モチーフATTTAが幾つか含まれており、
このことはELAM−１発現が一時的であるという特徴に矛
盾しない。 ELAM−１は、それが血管内皮細胞においてのみ同定さ
れるに過ぎず、限定された細胞分布を示す。ICAM−１と
同様にELAM−１は、腫瘍壊死因子、インターロイキン−
１、およびリンホトキシンを初めとする数々のサイトカ
イン、ならびに細菌性リポ多糖により誘導される。ICAM
−１とは対照的に、ELAM−１はガンマー−インターフェ
ロンによっては誘導されない。Bevilacqua et al.、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 1987、84、9238−9242;Wellicome
et al.、J.Immunol.1990、144、2558−2565。ヒトの臍
静脈内皮細胞内でのELAM−1 mRNAの誘導および消失の動
態は、その細胞表面でのELAM−１の出現および消失より
先に生じる。ICAM−１に関してと同様に、ELAM−１につ
いての分子機構は解明されていない。 VCAM−１は3.2−kbのmRNAによりコードされる110−kD
aの膜糖蛋白質である（図３）。VCAM−１は、６つか７
つかのいずれかの免疫グロブリンドメインを有する産物
を産生するための二者択一的スプライシングを受けるこ
とができる単一コピー遺伝子によりコードされるように
思われる。Osborn et al.、Cell 1989、59、1203−121
1。VCAM−１へのラモス細胞（Ramos cells）の接着を遮
断するCD29に対するモノクローナル抗体の能力により示
されるように、VCAM−１についてのレセプターはCD29
（VLA−４）であることが提唱される。VCAM−１は血管
内皮細胞上にまず最初に発現される。ICAM−１およびEL
AM−１と同様に、血管内皮上のVCAM−１の発現はサイト
カインでの処理により制御される。RiceおよびBevilacq
ua、Science 1989、246、1303−1306;Rice et al.、J.E
xp.Med.1990、171、1369−1374。発現増加はmRNAの誘導
に起因するものと思われる。 治療法については、ICAM−１、VCAM−１、およびELAM
−１の発現を低下させることにより治療することが可能
な疾患を有する疑いのある動物を、本発明に従うオリゴ
ヌクレオチドを投与することにより治療する。オリゴヌ
クレオチドは薬剤学的組成物中に調剤することができ、
この薬剤学的組成物はこのオリゴヌクレオチドの他に、
担体、増粘剤、賦形剤、緩衝液、保存料、界面活性剤、
リポソーム、もしくは脂質製剤などを含むことができ
る。薬剤学的組成物はこのオリゴヌクレオチドの他に、
抗生物質、抗−炎症剤、および麻酔剤などのような一つ
もしくは複数の活性成分をも含むことができる。 薬剤学的組成物は、局所的もしくは全身的治療のいず
れが所望されるかに依存して、そして治療すべき領域に
依存して数々の方法において投与することができる。投
与は、局所投与（経眼的、経膣的、経腸的、鼻腔内的の
ものを含む）、経口投与、吸入法による投与、あるいは
動脈内点滴、皮下投与、腹膜内投与、もしくは筋肉内注
射を例とする非経口的投与であることができる。 局所投与のための製剤は、軟膏剤、乳液剤、クリーム
剤、ゲル剤、滴剤、座剤、噴霧剤、液状薬、および粉末
剤を含むことができる。通常の薬剤学的担体、水、粉末
性、もしくは脂質性基剤、ならびに増粘剤などが必要で
あるか、あるいは所望されることがある。コーティング
済みコンドームもしくは手袋も有用であるだろう。 経口投与のための組成物には、粉末剤もしくは顆粒
剤、水もしくは非水性培地中の懸濁液もしくは水溶液、
カプセル剤、薬袋、もしくは錠剤を含む。増粘剤、矯味
・矯臭剤、賦形剤、乳化剤、調剤補助物、もしくは結合
剤が所望されることがある。 非経口投与のための製剤も、やはり緩衝液、リポソー
ム、賦形剤、および他の適切な添加物を含むことができ
る滅菌水溶液を含むことができる。 投与量は、治療すべき症状の重篤度および反応性に依
存するが、一般滴には数日から数カ月間続く治療過程に
関して、あるいは治療の効果が生じるもしくは疾患状態
の軽減が達成されるまでは、一日当たり一回もしくは複
数回の投与であろう。当業者は至適用量、投与法、およ
び反復率（repetition rates）を容易に決定することが
できる。 本発明は、炎症性細胞接着の調節が可能な蛋白質に対
応するRNAおよびDNAの機能のアンチセンス阻害における
用途のためにオリゴヌクレオチドを利用する。本発明の
文脈中では、用語「オリゴヌクレオチド」は、オリゴマ
ーもしくはポリマーのリボ核酸もしくはデオキシリボ核
酸を意味する。この用語には、天然に存在する塩基、
糖、および糖間（主鎖）結合からなるオリゴマー、なら
びに類似する様式で機能する天然非存在性部分を有する
オリゴマーがある。ヌクレアーゼの存在下における細胞
取り込みの亢進および安定性の増大を一例とするような
特性のために、このように修飾されたもしくは置換され
たオリゴヌクレオチドがはしばしば天然形態のものより
も好ましい。 本発明について意図される幾つかの好ましいオリゴヌ
クレオチドの具体例には、ホスホロチオエート、ホスホ
トリエステル、ホスホン酸メチレ、短鎖アルキル、もし
くはシクロアルキル糖間結合、あるいは短鎖ヘテロ原子
もしくは複素環式糖間結合を含むことができる。最も好
ましいものは、CH2−NH−Ｏ−CH2、CH2−Ｎ（CH3）−Ｏ
−CH2、CH2−Ｏ−Ｎ（CH3）−CH2、CH2−Ｎ（CH3）−Ｎ
（CH3）−CH2およびＯ−Ｎ（CH3）−CH2−CH2の主鎖
（式中、ホスホジエステルはＯ−Ｐ−Ｏ−CH2である）
を有するものである。やはり好ましいものは、モルホリ
ノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドである。Summer
ton、J.E.およびWeller、D.D.、米国特許第5,034,506
号。他の好ましい態様においては、蛋白質−核酸（PN
A）主鎖のような、オリゴヌクレオチドのホスホジエス
テル主鎖をポリアミド主鎖で置換することができる（こ
の場合、塩基はポリアミド主鎖のアザ窒素原子に直接も
しくは間接的に結合している）。P.E.Nielsen、M.Eghol
m、R.H.Berf、O.Buchardt、Science 1991、254、1497。
他の好ましいオリゴヌクレオチドは、２′位において、
以下に示す置換基の内の一つを含むアルキルおよびハロ
ゲン置換された糖部分を含むことができる。それらの置
換基とは、OH、SH、SCH3、Ｆ、OCN、Ｏ（CH2）nNH2、も
しくはＯ（CH2）nCH3［式中、ｎは１から約10までであ
る］、C1からC10までの低級アルキル、置換された低級
アルキル、アルカリル、もしくはアラルキル、Cl、Br、
CN、CF3、OCF3、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル、
Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル、SOCH3、SO2C
H3、ONO2、NO2、N3、NH2、複素環式アルキル、複素環式
アルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミ
ノ、置換されているシリル、RNA開裂用の基、コンジュ
ゲート、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌ
クレオチドの薬物動態特性を改善するための基、もしく
はオリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための
基、ならびに類似する特性を有する他の置換基である。
オリゴヌクレオチドはペントフラノシル基の代わりにシ
クロブチルのような糖擬態物をも有することができる。 本発明に従うオリゴヌクレオチドは、約３から約50ま
での核酸塩基単位を含むことが好ましい。このようなオ
リゴヌクレオチドが、約８から25までの核酸塩基単位を
含むことがより好ましく、そして約12から22までの核酸
塩基単位を有することがなおより好ましい。理解される
ように、核酸塩基単位としては、ホスホジエステルもし
くは他の結合を介して隣接する核酸塩基単位に適切に結
合している塩基−糖の組み合わせ物である。 本発明に従って用いられるオリゴヌクレオチドは、よ
く知られる技術である固相合成を介して都合良くかつ日
常的に作成することができる。このような合成のための
装置は、Applied Biosystems社を初めとする数々の販売
元により売られている。このような合成のための他の手
段のいずれのものも利用することができるが、オリゴヌ
クレオチドの実際の合成は、日常的な作業に従事するも
のの手腕の範囲内で十分に行われる。ホスホロチオエー
トおよびアルキル化誘導体のような他のオリゴヌクレオ
チドを製造するための類似する技術もよく知られてい
る。 本発明に従うと、当業者には、転写されるDNAの読み
取り枠（ORFs）により同定されるメッセンジャーRNA
は、そのDNAのORFsからの情報のみでなく、５′−非翻
訳領域、３′−非翻訳領域および介在配列リボヌクレオ
チドとして当業者に知られる領域を形成する関連的リボ
ヌクレオチドからの情報をも含むことが理解されるであ
ろう。従って、これらの関連的リボヌクレオチドならび
に情報的リボヌクレオチドの全てもしくはその一部分を
標的とするオリゴヌクレオチドは、本発明に従って製剤
することができる。好ましい態様においては、このオリ
ゴヌクレオチドは転写開始部位、翻訳開始部位、介在配
列、および３′−非翻訳領域内の配列と特異的にハイブ
リダイズすることが可能である。 本発明に従うと、このオリゴヌクレオチドは、白血球
細胞の、他の白血球細胞もしくは他の細胞種への接着に
係わる蛋白質をコードする核酸の一部分と特異的にハイ
ブリダイズすることが可能である。好ましい態様におい
ては、該蛋白質は細胞間接着分子−１、血管細胞接着分
子−１、および内皮白血球接着分子−１である。それに
対応する配列もしくはその一部分を含むオリゴヌクレオ
チドが本発明において有用である。一例では、図１は、
ヒトの細胞間接着分子−１のmRNA配列である。全体もし
くはその一部分が有用である可能性のある好ましい配列
セグメントは、 である。 図２は、ヒトの内皮白血球接着分子−１のmRNA配列で
ある。全体もしくはその一部分が有用である可能性のあ
る好ましい配列セグメントは、 である。 図３は、ヒトの血管細胞接着分子−１のmRNA配列であ
る。全体もしくはその一部分が有用である可能性のある
好ましい配列セグメントは、 である。図示した配列は正確であると思われるものの、
万が一間違いが見つかったとしても本発明は正しい配列
を指示する。本発明における有用なオリゴヌクレオチド
はこれらの配列の内の一つ、もしくはその一部分を含
む。従って、先に示されるこれらのオリゴヌクレオチド
の内のいずれか、あるいは当業者が炎症性細胞接着分子
の合成の調節のための好ましいアンチセンス標的の知識
から製造することができる類似するオリゴヌクレオチド
の内のいずれかを利用することが好ましい。 本発明の幾つかの好ましい態様は、以下に示す非制限
的実施例に従って詳細に説明される。調節のための標的
mRNA種は、細胞間接着分子−１、内皮白血球接着分子−
１、および血管細胞接着分子−１に関連する。当業者
は、本発明はそれらに限定はされず、しかしながら本発
明は一般的に適用することができるということを判断す
るであろう。ICAM−１および／またはELAM−１および／
またはVCAM−１の産生の阻害もしくは調節、疾患治療に
おける有意な治療学的利益を有することが予期される。
これらの組成物の有用性を評定する目的においては、一
つもしくは一連のアッセイが必要である。 実施例 実施例１ 細胞表面上でのICAM−１、VCAM−１、およびELAM−１
の発現は、ELISAにおいて特異的モノクローナル抗体を
使用して定量することができる。細胞は96ウエルのマイ
クロタイタープレート内において密集するまで増殖させ
る。これらの細胞をインターロイキン−１もしくは腫瘍
壊死因子のいずれかで、ELAM−１を定量するためには４
時間から８時間まで、そしてICAM−１およびVCAM−１を
定量するためには８時間から24時間までの間刺激する。
サイトカインでの適切なインキュベーション時間の後、
これらの細胞を、ダルベッコー（Dulbecco's）のリン酸
緩衝化食塩水（Ｄ−PBS）のような、カルシウムとマグ
ネシウムとを含む緩衝化等張液で３回緩和に洗浄する。
その後細胞をＤ−PBS中で希釈した１−２％のパラホル
ムアルデヒドを用いて、マイクロタイタープレート上
に、25℃で20分間直接固定化させる。これらの細胞を再
びＤ−PBSで３回洗浄する。マイクロタイタープレート
上の非特異的結合を、37℃において１時間、Ｄ−PBS中
の２％ウシ血清アルブミンで遮断する。細胞を37℃にお
いて１時間、遮断用溶液中で希釈した適切なモノクロー
ナル抗体と共にインキュベートする。未結合抗体は、Ｄ
−PBSでの３回の洗浄により除去する。細胞に結合した
抗体は、37℃下、１時間の、遮断用溶液中のビオチニル
化ヤギ抗−マウスIgG（Bethesda Reseach Laboratories
社、Gaithersberg、MD）の1:1000希釈液とのインキュベ
ーションにより検出する。細胞をＤ−PBSで３回洗浄
し、そしてその後37℃下、１時間、β−ガラクトシダー
ゼ（Bethesda Reaseach Laboratories社）とコンジュゲ
ートさせたストレプトアビジンの1:1000希釈液とインキ
ュベートする。細胞を各５分ずつＤ−PBSで３回洗浄す
る。特異的モノクローナル抗体に結合したβ−ガラクト
シダーゼの量を、3.3mMのクロロフェノールレッド−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド、50mMのリン酸ナトリウム、
1.5mMのMgCl2;pH＝7.2の溶液中で、37℃下、２−15分
間、プレートを現像することにより決定する。産物の濃
度はELISA用マイクロタイタープレートリーダー内にお
いて575nmの吸光度を測定することにより決定する。 数々のヒト細胞株における、インターロイキン−１β
もしくは腫瘍壊死因子αのいずれかでの刺激の後に観察
されるICAM−１の誘導の例を図４に示す。細胞は、15時
間、インターロイキン−１もしくは腫瘍壊死因子の増加
濃度で刺激し、そして先に示す処理を施した。ICAM−１
発現は、モノクローナル抗体84H10（Amac Inc.社、West
brook、ME）の1:1000希釈液とのインキュベーションに
より決定した。使用した細胞株は、第四継代目のヒト臍
静脈内皮細胞（HUVEC）、ヒト表皮癌細胞株（A431）、
ヒト黒色腫細胞株（SK−MEL−２）、およびヒト肺癌細
胞株（A549）であった。ICAM−１をすべての細胞株上で
誘導させたが、細胞表面におけるICAM−１発現の誘導に
おいては、腫瘍壊死因子はインターロイキン−１と比較
してより効果的であった（図４）。 ICAM−１、VCAM−１、もしくはELAM−１の阻害につい
てのアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング
は、オリゴヌクレオチドでの細胞の前処理をサイトカイ
ンでの刺激の前に行うということ以外は先に記載するよ
うに実施する。ICAM−１発現に対するアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド阻害の一例を図５に示す。ヒト臍静脈内
皮細胞（HUVEC）は、37℃下で４時間、８μＭの塩化Ｎ
−［１−（2,3−ジオレイルオキシ）プロピル］−N,N,N
−トリメチルアンモニウム（DOTMA）を含むOpti MEM（G
IBCO社、Grand Island、NY）中で希釈した増加濃度のオ
リゴヌクレオチドで処理してオリゴヌクレオチドの取り
込みを亢進させた。培地を除去し、そして更に４時間、
増加濃度のオリゴヌクレオチドを含む内皮成長用培地
（EGM−UV;Clonetics社、San Diego、CA）と交換した。
インターロイキン−１βを５単位/mlの濃度においてそ
の細胞に添加し、そして37℃において14時間インキュベ
ートした。これらの細胞を、先に記載するようにモノク
ローナル抗体84H10の1:1000希釈液を使用してICAM−１
発現について定量した。使用したオリゴヌクレオチド
は、 化合物１−（ISIS 1558）配列 を有する翻訳コドンのAUG開始部分を含むmRNAの位置64
−80とハイブリダイズするように設計されたホスホジエ
ステルオリゴヌクレオチド、 化合物２−（ISIS 1570）化合物１と同一の配列に対
応するホスホロチオエートを含むオリゴヌクレオチド、 化合物３−配列 を示す、化合物１および化合物２に相補的なホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチド、 化合物４−（ISIS 1572）配列 を含む３′−非翻訳領域中のmRNAの位置2190−2210にハ
イブリダイズするように設計された、ホスホロチオエー
トを含むオリゴヌクレオチド、 化合物５−（ISIS 1821）配列 を含む、対照として用いられるヒトの５−リポキシゲナ
ーゼmRNAにハイブリダイズするように設計された、ホス
ホロチオエートを含むオリゴヌクレオチドである。 ヒトICAM−1 mRNAの翻訳領域のAUG開始部分を標的と
するホスホジエステルオリゴヌクレオチド（化合物１）
はICAM−１の発現は阻害しないが、ホスホロチオエート
を含む対応するオリゴヌクレオチド（化合物２）はICAM
−１発現を、0.1μＭの濃度において70％、そして１μ
Ｍ濃度において90％阻害した（図４）。ホスホジエステ
ルに勝るホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの効力
増大は、恐らく安定性の増加に起因するものと思われ
る。化合物２に対するセンス鎖である化合物３は、10μ
Ｍにおいて控えめながらもICAM−１発現を阻害した。細
胞に添加する前に化合物２を化合物３に対して予めハイ
ブリダイズさせた場合には、ICAM−１発現に対する化合
物２の効果は弱まり、このことにより化合物２の活性は
mRNAへのハイブリッド形成に必要なアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの効果に起因することが示唆される。３′
−非翻訳配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチ
ド（化合物４）は、１μＭの濃度においてICAM−１発現
を62％阻害した（図５）。ヒト５−リポキシゲナーゼを
標的とする対照オリゴヌクレオチドはICAM−１発現を20
％減少させた。これらのデータにより、オリゴヌクレオ
チドはヒト臍静脈内皮細胞上でのICAM−１発現を阻害す
ることが可能であることが示され、そしてICAM−１発現
の阻害はアンチセンス活性に起因することが示唆され
る。 １μＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチド、化
合物２は、増加濃度の腫瘍壊死因子およびインターロイ
キン−１で刺激したヒト臍静脈内皮細胞上でのICAM−１
発現を阻害する（図６）。これらのデータにより、化合
物２の効果は細胞のインターロイキン−刺激に特異的で
ないことが示される。 類似するアッセイを使用して、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドによるELAM−１およびVCAM−１発現の阻害を
示すこともできる。 実施例２ ICAM−１、VCAM−１、もしくはELAM−１発現に対する
アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示すのに用い
ることができる第二の細胞性アッセイは、細胞接着アッ
セイである。標的細胞をマルチウエルプレート上に単層
として増殖させ、オリゴヌクレオチドで処理し、そして
次にサイトカインで処理する。その後接着性細胞をその
単層細胞に添加し、そして37℃において30−60分間イン
キュベートし、そして洗浄して非接着性細胞を除去す
る。単層に接着している細胞は、接着性細胞を直接計数
するか、あるいは記載されるように51Crのような放射性
同位元素でその細胞を予め標識し、単層に結合している
放射活性を定量するかのいずれかにより決定することが
できる。DustinおよびSpringer、J.Cell Biol.1988、10
7、321−331。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、そ
のアッセイにおいてはICAM−１、VCAM−１、もしくはEL
AM−１のいずれかを標的とすることができる。 腫瘍壊死因子で処理したヒト臍静脈内皮細胞に対す
る、DMSOでの分化処理を施したHL−60細胞の接着につい
ての、ICAM−1 mRNAを標的とするアンチセンスオリゴヌ
クレオチドの効果の一例を表７に示す。ヒト臍静脈内皮
細胞は、12ウエルプレート内において80％密集するまで
増殖させた。これらの細胞を37℃下で４時間、８μＭの
DOTMAを含むOpti−MEM中で希釈した２μＭのオリゴヌク
レオチドで処理した。培地を除去し、そして表示される
オリゴヌクレオチドの２μＭを含む新鮮な内皮細胞成長
用培地（EGE−UV）と取り替え、そして37℃で４時間イ
ンキュベートした。1ng/mlの腫瘍壊死因子を表示される
ように細胞に添加し、そして細胞を更に19時間インキュ
ベートした。細胞をEGE−UVで一回洗浄し、そして1.3％
のDMSOを添加して1.6×106のHL−60細胞を４日間分化さ
せた。この細胞を37℃で１時間接着させ、そして37℃に
暖めたダルベッコーのリン酸緩衝化食塩水（Ｄ−PBS）
で４回緩和に洗浄した。接着細胞を、5mMのEDTAを含む
0.25mlの冷却（４℃）リン酸緩衝化食塩水の添加により
単層からはがし、氷上で５分間インキュベートした。ED
TAでの処理により除去された細胞の数を血球計数器で計
数することにより決定した。EDTA処理により単層からは
がされた内皮細胞は、形態学的差異によりHL−60細胞か
ら容易に識別することができた。 腫瘍壊死因子の非存在下においては、３％のHL−60細
胞が内皮細胞に結合した。1ng/mlの腫瘍壊死因子での内
皮細胞単層の処理により、添加した総細胞の59％にまで
接着細胞の数が上昇した（図７）。アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドである化合物２もしくは対照オリゴヌクレ
オチドである化合物５での処理は、腫瘍壊死因子処理の
非存在下においては、単層に接着する細胞の数を変化さ
せなかった（図７）。このアンチセンスオリゴヌクレオ
チド、つまり化合物２は、添加した総細胞の59％から添
加した総細胞の17％にまで接着細胞数を減少させた。そ
れとは対照的に、対照オリゴヌクレオチドである化合物
５は、腫瘍壊死因子で処理した内皮単層へ接着する細胞
の数を有意には減少させず、つまり対照細胞については
59％であるのに対して、化合物５で処理した細胞につい
ては添加した総細胞の53％であった。 これらのデータにより、アンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、内皮細胞上でのICAM−１発現を阻害することが
可能であり、そしてICAM−１発現の阻害は、配列特異的
様式で内皮単層への好中球−様細胞の接着の減少に相関
することが示される。ELAM−１およびVCAM−１のような
他の分子も内皮細胞への白血球の接着を媒介するため、
接着は完全に遮断されることは予期されない。 実施例３ オリゴヌクレオチドの合成および特性決定 未修飾DNAオリゴヌクレオチドは自動DNA合成機（Appl
ied Biosystems model 380B）上で、ヨウ素による酸化
を用いる標準的なホスホルアミダイト化学を使用して合
成した。β−シアノエチルジイソプロピル−ホスホルア
ミダイトは、Applied Biosystems社（Foster City、C
A）から購入した。ホスホルチオエートオリゴヌクレオ
チドについては、標準的な酸化用瓶を、亜リン酸エステ
ル結合の段階的イオウ付加のために、アセトニトリル中
の3H−1,2−ベンゾジチオール−３−オン1,1−ジオキシ
ドの0.2M溶液に入れ替えた。イオウ付加周期待機段階
（wait step）を68秒まで増加し、そしてその後にキャ
ッピング段階が続く。 ２′−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドは２′−Ｏ−メチルβ−シアノエチルジイソプロピ
ルホスホルアミダイト（Chemgenes社,Needham MA）およ
びテトラゾール、および塩基のパルス輸送後の待機段階
を360秒まで増加させたことを除いては、未修飾オリゴ
ヌクレオチドについての標準周期を使用して合成した。
この合成を出発させるのに用いた３′−塩基は２′−デ
オキシリボヌクレオチドであった。 ２′−フルオロホスホロチオエートオリゴヌクレオチ
ドは、５′−ジメトキシトリチル−３′−ホスホルアミ
ダイトを使用して合成し、そして本出願と同じ譲受人に
譲渡されている、1990年１月11日に提出された米国特許
出願第463,358号、および1990年８月13日に提出された
同出願第566,977号において開示されるように製造し
た。２′−フルオロオリゴヌクレオチドは、ホスホルア
ミダイト化学および標準的DNA合成研究法の若干の変法
（脱保護化を、室温におけるメタノール性アンモニア
（methanolic ammonia）を使用して行っている）を使用
して製造した。 制御式微細孔ガラスカラム（controlled pore glass
column）（Applied Biosystems社）からの開裂および55
℃下18時間の濃厚の水酸化アンモニウム中での脱保護化
の後、このオリゴヌクレオチドを、2.5倍容のエタノー
ルを用いる0.5MのNaClからの２度の沈殿化により精製し
た。分析用ゲル電気泳動は、20％アクリルアミド、8M尿
素、45mMトリス−ホウ酸緩衝液、pH7.0中で行った。オ
リゴデオキシヌクレオチドおよびホスホルチオエートオ
リゴヌクレオチドは電気泳動より判断したところ、全長
の80％を有する物質よりも大きいものであった。 RNAオリゴヌクレオチド合成は、ABIモデル380BのDNA
合成機上で実施した。標準的な合成周期を、テトラゾー
ルのパルス輸送後の待機段階を900秒までに増加させる
ことにより改変した。塩基はメタノール性アンモニア中
での一晩のインキュベーションにより脱保護化した。塩
基の脱保護化の後、このオリゴヌクレオチドを減圧下に
おいて乾燥させた。２′ヒドロキシルを保護するｔ−ブ
チルジメチルシリルは、テトラヒドロフラン中の1Mのフ
ッ化テトラブチルアンモニウム中でそのオリゴヌクレオ
チドを一晩インキュベートすることにより除去した。こ
のRNAオリゴヌクレオチドは、C18Sep−Pakカートリッジ
（Waters社、Division of Millipore Corp.、Milford M
A）上で更に精製し、そしてエタノール沈殿を行った。 この合成法により取得されるホスホルチオエートとホ
スホジエステル結合との相対的な量は、31P NMR分光法
により周期的に検査した。このスペクトルは、溶媒とし
て酸化重水素もしくはジメチルスルホキシド−d6を使用
して室温で取得した。ホスホロチオエート試料は、典型
的には１パーセントを下回るホスホジエステル結合を含
んでいた。 二次評定は、50mMの酢酸トリエチルアンモニウム、pH
7.0、中のアセトニトリルの濃度勾配（30分間で４％か
ら32％まで、流速＝1.5ml/分）を使用するPRP−１カラ
ム（Hamilton Co.社、Reno、Nevada）上でのトリチル−
オン（trityl−on）HPLCにより精製した。適切な分画を
ひとまとめにし、蒸留し、そして室温において15分間５
％酢酸で処理した。この溶液を同容積の酢酸エチルで抽
出し、そして水酸化アンモニウムで中和し、そして凍結
乾燥した。HPLC精製したオリゴヌクレオチドは、ICAM−
１発現についてELISAアッセイにより判定したところ、
沈殿させたオリゴヌクレオチドとは効力における有意な
差異を生じなかった。 実施例４ 細胞培養およびオリゴヌクレオチドでの処理 ヒト肺癌細胞株A549を、American Type Culture Coll
ection（Bethesda MD）から取得した。細胞を、１グラ
ムのグルコース／リットルおよび10％ウシ胎児血清（Ir
vine Scientific社）を含むダルベッコ変法イーグル培
地（Irvine Scientific社、Irvine CA）中で増殖させ
た。ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）（Clonetics社、San
Diego CA）は、EGM−UV培地（Clonetics社）中で培養し
た。HUVECは、第二継代物と第六継代物との間のものを
使用した。ヒト表皮癌A431細胞はAmerican Type Cultur
e Collectionから取得し、そして4.5g/lのグルコースを
含むDMEM中で培養した。ヒトの初代ケラチノサイトはCl
onetics社から取得し、そしてKGM（ケラチノサイト増殖
用培地、Clonetics社）中で増殖させた。 96−ウエルプレート中で増殖させた細胞を、予め37℃
に暖めたOpti−MEM（GIBCO社、Grand.Island、NY）で３
回洗浄した。HUVEC細胞の場合には10μg/mlの塩化Ｎ−
［１−（2,3−ジオレイルオキシ）プロピル］−N,N,N−
トリメチルアンモニウム（DOTMA、Bethesda.Research L
abs社、Bethesda MD）を、あるいはA549細胞の場合には
20μg/mlのDOTMAを含む100μｌのOpti−MEMを、各ウエ
ルに添加した。オリゴヌクレオチドは、0.2μｍのCentr
ex酢酸セルロースフィルター（Schleicher and Schuell
社、Keene、NH）を通す遠心処理により滅菌した。オリ
ゴヌクレオチドを20×の保存溶液として各ウエルに添加
し、そして37℃において４時間インキュベートした。培
地を除去し、そして表示の濃度のオリゴヌクレオチドを
含む150μｌの適切な成長培地に入れ替えた。細胞をさ
らに３−４時間、37℃でインキュベートし、そして表示
したように適切なサイトカインで14−16時間刺激した。
ICAM−１発現は実施例１に記載のように決定した。オリ
ゴヌクレオチドとの最初の４時間のインキュベーション
の間に、DOTMAが存在することにより、オリゴヌクレオ
チドの効力が少なくとも100倍増加した。この効力の上
昇は、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みの上昇に関連
していた。 実施例５ インターロイキン−１β−刺激化細胞におけるICAM−１
遺伝子発現に対する活性についての追加のアンチセンス
オリゴヌクレオチドのELISAスクリーニング アンチセンスオリゴヌクレオチドは最初、ヒトICAM−
1 mRNAにおける５つの標的部位にハイブリダイズするよ
うに設計された。オリゴヌクレオチドは、ホスホジエス
テル（Ｐ＝Ｏ、ISIS 1558、1559、1563、1564、および1
565）、ならびにホスホロチオエート（Ｐ＝S;ISIS 157
0、1571、1572、1573、および1574）の両形態において
合成した。これらのオリゴヌクレオチドを表１に示す。 オリゴヌクレオチドによるインターロイキン−１β−刺
激化細胞表面上のICAM−１発現の阻害は、実施例１に記
載のELISAアッセイにより決定した。オリゴヌクレオチ
ドは２つの異なる細胞株において検査した。ホスホジエ
ステルオリゴヌクレオチドはどれもICAM−１発現を阻害
しなかった。これは恐らく、細胞内におけるホスホジエ
ステルオリゴヌクレオチドの迅速な分解によるものであ
ると思われる。５つのホスホロチオエートオリゴヌクレ
オチドの内でも、最も活性が高かったのはAUG翻訳開始
コドンにハイブリダイズするISIS 1570であった。２′
−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで
あるISIS 2974は、HUVECおよびA549細胞でのICAM−１発
現の阻害においてはISIS 1570と比較すると約３倍低い
有効性を示した。２′−フルオロオリゴヌクレオチドで
あるISIS 2634も有効性が低かった。 ５つの最初の標的を用いて得られた初期データに基づ
き、追加のオリゴヌクレオチドを、ICAM−1 mRNAとハイ
ブリダイズするように設計した。予想される転写開始部
位（５′キャップ部位）にハイブリダイズするアンチセ
ンスオリゴヌクレオチド（ISIS 3067）は、図８におい
て示されるように、IL−１β−刺激化細胞においてはAU
Gコドンにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（ISI
S 1570）とほぼ同程度の活性を示した。ISIS 1931およ
び1932は、AUG翻訳開始コドンの各々５′および３′に
ハイブリダイズする。AUG領域にハイブリダイズする３
つ全てのオリゴヌクレオチドはICAM−１発現を阻害する
が、ISIS 1932はISIS 1570およびISIS 1931と比較する
とやや活性が劣っていた。ICAM−1 mRNAのコーディング
領域にハイブイダイズするオリゴヌクレオチド（ISIS 1
933、1934、1935、1574、および1936）は弱い活性を示
した。翻訳終止コドンにハイブリダイズするオリゴヌク
レオチド（ISIS 1937および1938）は中程度の活性を示
した。 驚くべきことに、最も活性の高いアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドはISIS 1939であり、これはICAM−1 mRNA
の３′−非翻訳領域の配列を標的とするホスホロチオエ
ートオリゴヌクレオチドである（表１を参照せよ）。同
じ配列を有する他のオリゴヌクレオチドである２′−Ｏ
−メチル（ISIS 2973）および２′−フルオロ（ISIS 26
37）をも検査したが、これらはこのレベルの活性は示さ
なかった。他の３′−非翻訳配列を標的とするオリゴヌ
クレオチド（ISIS 1572、1573、および1940）もISIS 19
39程の活性は示さなかった。実際のところ、ポリアデニ
ル化シグナルを標的とするISIS 1940はICAM−１発現を
阻害しなかった。 検査した16の最初のオリゴヌクレオチドの内で、ISIS
1939が予期せず最大のアンチセンス活性を示すことが
判明したため、ICAM−1 mRNAの３′−非翻訳領域におけ
る配列にハイブリダイズするように、他のオリゴヌクレ
オチドを設計した（表１に示されるISIS 2302、2303、2
304、2305、および2307）。ISIS 1939標的のわずか５塩
基分３′側にある配列にハイブリダイズするISIS 2307
は、この一連のもののうちで最も活性が低かった（図
８）。ISIS.1939標的の３′側の143塩基分の位置にある
ICAM−1 mRNAにハイブリダイズするISIS 2302はISIS 19
39に匹敵し得る活性を有しており、この一連のものの内
でも最高の活性を示した。ヒトICAM−1 mRNAの３′−非
翻訳領域の予想されるRNA二次構造の調査により（M.Zuk
er、Science 1989、244、48−52）、ISIS 1939とISIS 2
302との両方は安定なステム−ループ構造をとることが
予期される構造にハイブリダイズすることが示された。
最近の定説により、アンチセンスオリゴヌクレオチドを
設計する際にはRNA二次構造の領域は避けるべきことが
示唆されている。従ってISIS 1939およびISIS 2302は、
ICAM−１発現を阻害することが予期されなかった。 対照オリゴヌクレオチドであるISIS 1821はISIS 1934
のものに匹敵する活性でHUVEC細胞におけるICAM−１発
現を阻害したが、A549細胞においてはISIS 1821はISIS1
934と比較して低い有効性を示した。陰性対照であるISI
S 1821はICAM発現に対しては少量の活性を示すことが見
いだされ、これは恐らくAUG翻訳開始コドンの３′側15
塩基分の位置のICAM−1 mRNAにハイブリダイズする（13
塩基分の12が対合する）能力がその原因の一部をなすた
めであると思われる。 これらの研究により、ICAM−1 mRNAのAUG翻訳開始コ
ドンおよび特異的３′−非翻訳配列が、ICAM−１発現の
アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害に対する最高の感
受性を示したことが示される。 ヒト臍静脈細胞およびヒト肺癌細胞（A549）における
ICAM−１発現を阻害することに加えて、ISIS 1570、ISI
S 1939、およびISIS 2302はヒト表皮癌A431細胞および
ヒトの初代ケラチノサイトにおけるICAM−１発現を阻害
することが示された（図９に示する）。これらのデータ
により、アンチセンスオリゴヌクレオチドは幾つかのヒ
ト細胞株におけるICAM−１発現を阻害することが可能で
あることが示される。その上、これらのオリゴヌクレオ
チドの効力程度の順位は、調査した４つの細胞株におい
ては同一であった。ICAM−１発現はヒトの初代ケラチノ
サイトにおいて阻害可能であるという事実は重要であ
り、それは表皮ケラチノサイトはアンチセンスヌクレオ
チドの対象標的であるという理由による。 実施例６ 他のサイトカインで刺激した細胞でのICAM−１発現のア
ンチセンスオリゴヌクレオチド阻害 ２つのオリゴヌクレオチド、ISIS 1570およびISIS 19
39を、TNF−αおよびIFN−γ−誘導化ICAM−１発現を阻
害する能力について検査した。１μＭのアンチセンスオ
リゴヌクレオチドでのA549細胞の処理により、配列特異
的な様式でIL−１β、TNF−α、およびIFN−γ−誘導化
ICAM−１発現が阻害された。これらのアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドはIL−１βおよびTNF−α−誘導化ICAM
−１発現を同程度阻害したが、IFN−γ−誘導化ICAM−
１発現はアンチセンス阻害に対してより大きな感受性を
示した。対照オリゴヌクレオチドであるISIS 1821は、
以下に示すようにIL−１βもしくはTNF−α−誘導化ICA
M−１発現を有意には阻害せず、そしてIFN−γ−誘導化
ICAM−１発現を若干阻害した。 実施例７ アンチセンス効果はセンス鎖対照により打ち消される オリゴヌクレオチドISIS 1570およびISIS 1939による
ICAM−１発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害
は、それら各々のセンス鎖を有するオリゴヌクレオチド
のハイブリッド形成によりもとに戻すことができた。単
独で適用させた場合には、ISIS 1570についてのホスホ
ロチオエートセンス鎖（ISIS 1575）はわずかながらIL
−１β−誘導化ICAM−１発現を亢進させた。細胞に添加
する前に等モル濃度でISIS 1570とISIS 1575とを混合さ
せた場合には、ISIS 1570の効果は遮断された。ISIS 19
39に対する相補鎖（ISIS 2115）は、細胞に単独で添加
した場合にICAM−１発現を46％亢進させた。ISIS 1939
にISIS 2115を予めハイブリダイズさせると、ISIS 1939
によるICAM−１発現の阻害は完全に遮断された。 実施例８ オリゴヌクレオチドのTm値（標的からのオリゴヌクレオ
チドの解離温度）の測定 アンチセンスオリゴヌクレオチドによるICAM−１発現
の阻害の効果がそれぞれの標的部位に対するそれぞれの
親和性に起因するか否かを決定するために、各オリゴヌ
クレオチドについての熱力学的測定を行った。アンチセ
ンスオリゴヌクレオチド（ホスホロチオエートとして合
成した）をそれぞれの相補的DNA配列（ホスホジエステ
ルとして合成した）にハイブリダイズさせた。温度に対
する吸光度の曲線を、100mMのNa+、10mMのリン酸、0.1m
MのEDTA、pH7.0中の４μＭの各鎖オリゴヌクレオチドで
測定した。Tm値およびデュプレックス形成の自由エネル
ギーを、直線勾配の基準線を有する２状態モデルにデー
タを適合させることから取得した（Petersheim、Ｍおよ
びD.H.Turner、Biochemistry 1983、22、256−263）。
結果は少なくとも３つの実験値の平均値である。 アンチセンスオリゴヌクレオチドをそれぞれの相補的
DNA配列（ホスホジエステルとして合成した）とハイブ
リダイズさせた場合、ISIS 1940を例外とする全てのア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも50℃のTm値
を示した。従って全てのオリゴヌクレオチドは、標的配
列が露出されている場合には、標的であるICAM−1 mRNA
にハイブリダイズすることが可能であるはずである。驚
くべきことに、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効力
は、TmあるいはΔＧ゜37゜のいずれにも直接は相関して
いなかった。最大生物活性を示すオリゴヌクレオチドで
あるISIS 1939は、他のオリゴヌクレオチドの大半のも
のが示すものと比較してより低いTm値を示した。従っ
て、ハイブリッド形成親和性は生物活性を確かめるには
不十分なものである。 実施例９ ICAM−１発現のアンチセンス阻害におけるオリゴヌクレ
オチド長の影響 アンチセンス活性についてのオリゴヌクレオチド長の
影響を、ISIS 1570（ISIS 2165、2173、2149、2163、お
よび2164）、ならびにISIS 1939（ISIS 2540、2544、25
45、2546、2547、および2548）の先端切断変異物を用い
て検査した。アンチセンス活性は概して、オリゴヌクレ
オチド長が減少するに従って減少した。16塩基分の長さ
であるオリゴヌクレオチドは18塩基分のオリゴヌクレオ
チドと比較して若干低い活性を示した。14塩基分の長さ
であるオリゴヌクレオチドは有意に低い活性を示し、そ
して12もしくは10塩基分の長さのオリゴヌクレオチドは
弱い活性を示すに過ぎなかった。オリゴヌクレオチド長
とTm値とアンチセンス活性との関連性の検査により、14
塩基分と16塩基分の長さとの間に激しい変化が生じる一
方で、Tm値は長さと共に直線的に増加することが示され
る（図10）。 実施例10 ICAM−１のアンチセンス阻害の特異性 ICAM−１についてのアンチセンスオリゴヌクレオチド
ISIS 1570およびISIS 1939の特異性を、35S−ラベル蛋
白質の免疫沈降により評価した。A549細胞は25cm2の組
織培養用フラスコ内で密集するまで増殖させ、そして実
施例４に記載のようにアンチセンスオリゴヌクレオチド
で処理した。この細胞を、表示されるように、インター
ロイキン−１βで14時間刺激し、メチオニン非含有DMEM
に10％の透析済みウシ胎児血清を添加したもので洗浄
し、そして10％の透析済みウシ胎児血清、１μＭのオリ
ゴヌクレオチド、および表示されるインターロイキン−
１βを含むメチオニン非含有培地中で１時間インキュベ
ートした。35S−メチオニン／システイン混合物（Tran
35S−ラベル、ICN社、Costa Mesa、CA、から購入）を10
0μCi/mlの活性になるように細胞に添加し、そしてその
細胞を更に２時間インキュベートした。細胞性蛋白質
は、50mMのトリス−HCl pH8.0、150mMのNaCl、1.0％のN
P−40、0.5％のデオキシコール酸塩、および2mMのEDTA
（ウエル当たり0.5ml）を用いて、４℃において30分間
インキュベートした。18,000×ｇにおける20分間の遠心
処理により抽出物の濁りを除いた。この上清を200μｌ
のプロテインＧ−セファロースビーズ（Bethesda Resea
rch Labs社、Bethesda MD）に４℃において２時間予備
吸着させ、等量に分割し、そして５μｇのICAM−１モノ
クローナル抗体（AMAC Inc.社、Westbrook ME、から購
入した）、あるいはHLA−A,B抗体（W6/32、American Ty
pe Culture Collection、Bethesda、MD、から取得した
マウスハイブリドーマ細胞から産生させた）のいずれか
と共に、４℃において15時間インキュベートした。プロ
テインＧ−セファロースの50％懸濁液（v/v）の200μｌ
と共に４℃において２時間インキュベートすることによ
り免疫複合体を捕獲し、溶菌用緩衝液で５回洗浄し、そ
してSDS−ポリアクリルアミドゲル上で分離させた。蛋
白質はオートラジオグラフィーにより検出した。 ５単位/mlのインターロイキン−１βでのA549細胞の
処理により、二重線として移動する95−100kDaの蛋白質
が合成されることが示され、そしてこの蛋白質はICAM−
１に対するモノクローナル抗体により免疫沈降した。二
重線として見かけは、ICAM−１の異なるグリコシル化形
態に起因するものと思われる。１μＭの濃度におけるア
ンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 1570での細胞の予
備処理によりICAM−１合成は約50％減少し、一方、１μ
ＭのISIS 1939によってはICAM−１の合成はほぼ基準線
にまで減少した。ICAM−１のELISAアッセイ（実施例１
および５）においては不活性を示すアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドISIS 1940は、ICAM−１合成を有意に減少
させなかった。ICAM−１標的とハイブリダイズ可能なア
ンチセンスオリゴヌクレオチドの内のいずれのものもHL
A−A,B合成における論証可能な効果を持たず、このこと
によりICAM−１に対するこれらオリゴヌクレオチドの特
異性が示された。その上、ICAM−１抗体およびプロテイ
ンＧ−セファロースと非特異的に沈殿する蛋白質は、ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理により有意な影
響を受けなかった。 実施例11 細胞接着アッセイによるICAM−１に対する活性について
の追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニ
ング ヒト臍静脈内皮（HUVEC）細胞を増殖させ、そして実
施例４におけるようにオリゴヌクレオチドで処理した。
細胞を、ISIS 1939、ISIS 1940、もしくは対照オリゴヌ
クレオチドであるISIS 1821のいずれかで４時間処理
し、その後TNF−αで20時間刺激した。基になるHUVECは
HL−60細胞と最小限の結合を示した一方で、TNF−刺激
化HUVECは添加した総細胞の内の19％に結合した。0.3μ
ＭのISIS 1939でのHUVEC単層の予備処理により、図11に
示されるようにHL−60細胞の接着が基準線にまで減少し
た。対照オリゴヌクレオチドであるISIS 1821およびISI
S 1940は19％から９％へと細胞接着のパーセンテージを
減少させた。これらのデータにより、ICAM−１を標的と
するアンチセンスオリゴヌクレオチドはTNF−α−処理
済みHUVECへの白血球様細胞株（HL−60）の接着を特異
的に減少させることができるということが示される。 実施例12 ELAM−１遺伝子発現に対する活性についてのアンチセン
スオリゴヌクレオチドのELISAスクリーニング ヒトの初代臍静脈内皮（HUVEC）細胞（第二継代から
第五継代までのもの）を96−ウエルプレートにプレート
培養し、そして密集させた。細胞をOpti−MEM（GIBCO
社、Grand Island NY）で３回洗浄した。細胞を、10μg
/mlのDOTMA溶液（Bethesda Research Labs社、Bethesda
MD）を含むOpti−MEM中で希釈した増加濃度のオリゴヌ
クレオチドで、37℃において４時間処理した。培地を除
去し、そしてEGM−UV（Clonetics社、San Diego CA）に
オリゴヌクレオチドを添加したものと交換した。腫瘍壊
死因子αをこの培地に添加し（2.5ng/ml）、そしてこの
細胞を更に４時間、37℃においてインキュベートした。 ELAM−１発現はELISAにより検出した。細胞を、37℃
に予め暖めたダルベッコリン酸緩衝化食塩水（Ｄ−PB
S）で３回洗浄した。細胞を４℃において20分間、95％
エタノールで固定化させ、Ｄ−PBSで３回洗浄し、そし
てＤ−PBS中の２％BSAで遮断した。細胞を、２％BSAを
含むＤ−PBS中で0.5μg/mlに希釈したELAM−１モノクロ
ーナル抗体BBA−１（Ｒ＆D Systems社、Minneapolis M
N）と共にインキュベートした。細胞は、実施例１にお
いて示すように、Ｄ−PBSで３回洗浄し、そして結合し
ているELAM−１抗体をビオチニル化ヤギ抗−マウス二次
抗体を用い、次には、β−ガラクトシダーゼ−コンジュ
ゲートストレプトアビジンを用いて検出した。 ELAM−1 cDNAの11の異なる領域を標的とするアンチセ
ンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ならびに
ICAM−１を標的とする２つのオリゴヌクレオチド（対照
として）の活性を、ELAM−１のELISAを使用して決定し
た。オリゴヌクレオチドおよび標的を表２に示す。 ICAM−１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド
に関して観察されたものと比較すると（実施例５）、EL
AM−１活性の最も有効なオリゴヌクレオチドモジュレー
ター（ISIS 2679）はELAM−１の５′−非翻訳領域内の
特異的配列とハイブリダイズ可能であった。ISIS 2679
標的の３塩基分上流で終了する配列にハイブリダイズし
たオリゴヌクレオチドISIS 2687は、有意な活性を示さ
なかった（図12）。従ってISIS 2679は、アンチセンス
オリゴヌクレオチドでの阻害に特有の感受性を示すELAM
−1 mRNAの独特の部位にハイブリダイズする。アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドでの阻害に対するこの部位の感
受性は、RNA二次構造による予測もしくは文献上の情報
を基にしては予測不可能なものであった。 実施例13 ELAM−１遺伝子発現に対する活性についての追加のアン
チセンスオリゴヌクレオチドのELISAスクリーニング 18のアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドによるELAM−１発現の阻害は、実施例12において記
載されるELISAアッセイを用いて決定した。ELAM−1 mRN
A上のこれらのオリゴヌクレオチドの標的部位を、図13
に示す。ELAM−１に対する各オリゴヌクレオチドの配列
および活性を表３に示す。星印（＊）により示されるオ
リゴヌクレオチドは約50nMもしくはそれを下回るIC50値
を有し、そしてそのようなものであることが好ましい。
IC50値は、ELAM−１発現の50％阻害をもたらすオリゴヌ
クレオチドの用量を示す。 ３−非翻訳領域を標的とする追加のオリゴヌクレオチド
（ISIS 4728）はELAM発現を阻害しなかった。 実施例14 VCAM−１遺伝子発現に対する活性についてのアンチセン
スオリゴヌクレオチドのELISAスクリーニング 15のアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドによるVCAM−１発現の阻害は、細胞をTNF−αで16
時間刺激させ、そしてVCAM−１発現を0.5μg/mlで用い
るVCAM−１特異的モノクローナル抗体（Ｒ＆D Systems
社、Minneapolis、MN）により検出したことを除いて
は、実施例12において記載されるものとほぼ同様のELIS
Aアッセイを使用して決定した。VCAM−1 mRNA上のこれ
らオリゴヌクレオチドの標的部位を図14に示す。VCAM−
１に対する各オリゴヌクレオチドの配列および活性を表
４に示す。星印（＊）により示されるオリゴヌクレオチ
ドは約50nMもしくはそれを下回るIC50値を有し、そして
そのようなものであることが好ましい。IC50値は、VCAM
−１発現の50％阻害をもたらすオリゴヌクレオチドの用
量を示す。 実施例15 C8161ヒト黒色腫細胞におけるICAM−１発現：ヒト黒色
腫細胞株C8161（Dr.Dan Welch、Hershey Medical Cente
r、からの贈与）は、再発性悪性黒色腫を患う患者から
の腹壁転移に由来する。これらの細胞は、無胸腺ヌード
マウス内への皮下、皮内、および静脈内注射後に、肺、
皮下組織、脾臓、肝臓、および局所リンパ節における重
複転移を形成する。細胞は10％のウシ胎児血清を含むDM
A−F12培地中で増殖させ、そして2mMのEDTAを用いて継
代した。 C8161細胞のTNF−αへの露出により、ICAM−１の細胞
表面発現の６倍の増加、およびこれらの細胞におけるIC
AM−1 mRNAレベルの増加がもたらされた。細胞表面にお
けるICAM−１発現はELISAにより測定した。細胞を、37
℃において４時間、15μg/mlのリポフェクチン（Lipofe
ctin）の存在下、増加濃度のアンチセンスオリゴヌクレ
オチドで処理した。ICAM−１発現は、5ng/mlのTNF−α
と16時間インキュベーションすることにより誘導させ
た。細胞をDPBS中で３回洗浄し、そして２％ホルムアル
デヒド中で20分間固定させた。細胞をDPBSで洗浄し、37
℃において１時間２％BSAで遮断し、そしてICAM−１モ
ノクローナル抗体84H10（AMAC、Inc.社、Westbrook、M
E）と共にインキュベートした。結合した抗体濃度の検
出は、ビオチニル化ヤギ抗−マウスIgGとのインキュベ
ーションを行い、そしてその後にβ−ガラクトシダーゼ
−コンジュゲートストレプトアビジンとのインキュベー
ションを行い、そしてクロロフェノールレッド−β−Ｄ
−ガラクトピラノシドでの現象を行い、そしてその後に
575nmでの吸光度による定量化を行うことにより決定し
た。ICAM−1 mRNAレベルは、ノザンブロット分析により
測定した。 実施例16 C8161ヒト黒色腫細胞におけるICAM−１発現のオリゴヌ
クレオチド阻害：図15に示すように、ICAM−１を標的と
するアンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 1570（配列
番号１）、ISIS 1939（配列番号15）、およびISIS 2302
（配列番号22）は、ICAM−１の細胞表面発現を減少させ
た（実施例16におけるようにELISAにより検出）。５−
リポオキシゲナーゼに相補的な陰性対照オリゴヌクレオ
チドISIS 1822は、ICAM−１発現に影響を及ぼさなかっ
た。このデータは、対照の活性に対するパーセンテージ
として示され、以下のように算出した。 （オリゴヌクレオチド処理済みサイトカイン誘導化細胞
についてのICAM−１発現）−（基準的ICAM−１発現）／
（ICAM−１サイトカイン誘導化発現）−（基準的ICAM−
１発現）×100 ISIS 1939（配列番号15）およびISIS 2302（配列番号
22）はICAM−1 mRANレベルを顕著に減少させたが（ノザ
ンブロット分析により検出）、ISIS−1570（配列番号
１）はICAM−1 mRNAレベルをわずかに減少させるのみで
あった。 実施例17 実験的転移アッセイ：転移におけるICAM−１の役割を評
価するために、実験的転移アッセイを、無胸腺ヌードマ
ウスの側方尾静脈内への１×105のC8161細胞の注入によ
り実施した。サイトカインであるTNF−αおよびインタ
ーフェロンγでのC8161細胞の処理によっては、ヌード
マウス内への細胞の注入を行った際に肺転移数の増大が
もたらされることが既に示されている［Miller、D.E.お
よびWelch、D.R.（1990）Proc.Am.Assoc.Cancer Res.1
3:353］。 ４週間後にマウスを屠殺し、器官をブイン（Bouin'
s）の固定液中で固定し、そして肺の転移病変を解剖顕
微鏡を使用して計数した。４週令の雌の無胸腺ヌードマ
ウス（Harlan Sprague Dawaley種）を使用した。動物は
NIHの基準に基づいて維持した。各４−８匹の群を実験
的転移アッセイにおいて検査した。 実施例18 アンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 1570およびISIS
2302は、C8161細胞の転移能を減少させる:ICAM−１に相
補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 1570およ
びISIS 2302でのC8161細胞の処理は、陽イオン性脂質で
あるリポフェクチン（Lipofectin）（Gibco/BRL社、Gai
thersburg、MD）の存在下において実施した。アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは実施例３において記載のよう
に合成した。細胞を106細胞/mlで60mmの組織培養用ディ
ッシュに撒き、そして37℃で３日間インキュベートし、
Opti−MEM（Gibco/BRL社）で３度洗浄し、そして100μ
ｌのOpti−MEM培地を各ウエルに添加した。0.5μＭのオ
リゴヌクレオチドと15μg/mlのリポフェクチンとを室温
において15分間混ぜ合わせた。25μｌのオリゴヌクレオ
チド−リポフェクチン混合物を適切なディッシュに添加
し、そして37℃において４時間インキュベートした。オ
リゴヌクレオチド−リポフェクチン混合物を除去し、そ
して10％のウシ胎児血清を含むDME−F12培地と入れ替え
た。４時間後に500U/mlのTNF−αを適切なウエルに添加
し、そして18時間インキュベートし、この18時間目の時
点で細胞をプレートから除去し、計数を行い、そして無
胸腺ヌードマウスに注入した。 ISIS 1570（配列番号１）もしくはISIS 2302（配列番
号22）でのC8161細胞の処理によってこれらの細胞の転
移能は減少し、そしてTNF−α処理によりもたらされたC
8161の転移能増加はなくなった。データを表５に示す。 実施例19 ICAM−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを検
査するためのマウスモデル：細胞間接着分子により媒介
されるものと思われる多くの症状はヒトにおける研究へ
持ち込むことが不可能である。一例では、同種異系移植
片拒絶はICAM−１の妨害を行うことにより改善されるも
のと思われる症状であるが、これはヒトの移植患者より
もむしろ動物において評価すべきものであることは明ら
かである。他のこのような例は炎症性腸疾患であり、そ
して更に別のものは好中球遊走（遊出）である。しかし
ながらこれらの症状は、本明細書において用いられるマ
ウスモデルのような動物モデルにおいて検査することが
できる。 マウス細胞におけるICAM−１発現の阻害のためのオリ
ゴヌクレオチド配列を同定した。マウスICAM−１は、ヒ
トのICAM−１配列と約50％の相同性を有しており、その
ためヒトのICAM−１を標的としたオリゴヌクレオチドの
評定を行って得られた情報を使用して、マウスのICAM−
1 mRNA配列を標的とする一連のオリゴヌクレオチドを設
計および合成した。免疫沈降アッセイを使用してこれら
のオリゴヌクレオチドについての活性のスクリーニング
を行った。 マウスDCEK−ICAM−１細胞（Dr.Adrienne Brian、Uni
versity of California at San Diego、より贈与され
た）を、37℃において４時間、20μg/mlのDOTMA/DOPE溶
液の存在下において１μＭのオリゴヌクレオチドで処理
した。培地を10％の透析済みウシ胎児血清および１μＭ
のアンチセンスオリゴヌクレオチドを添加したメチオニ
ン非含有培地と入れ替えた。細胞をメチオニン非含有培
地中で１時間インキュベートし、そしてその後100μCi/
mlの35S−ラベルメチオニン／システイン混合物をその
細胞に添加した。細胞を更に２時間インキュベートし、
PBSで４回洗浄し、そして20mMのトリス、pH7.2、20mMの
KCl、5mMのEDTA、１％のTriton X−100、0.1mMのロイペ
プチン、10μg/mlのアプロチニン、および1mMのPMSFを
含む緩衝液で抽出した。ICAM−１は、マウス−特異的IC
AM−１抗体（YN1/1.7.4）と共にインキュベートし、そ
の後にプロテインＧ−セファロースにかけることにより
抽出物から免疫沈降させた。この免疫沈降物をSDS−PAG
Eにより分析し、そしてオートラジオグラフィーにかけ
た。マウスICAM−１のAUGコドンを標的とするホスホロ
チオエートオリゴヌクレオチドISIS 3066および3069
は、ICAM−１合成を各々48％および63％阻害した一方
で、マウスICAM−1 mRNAの３′−未翻訳領域における配
列を標的とするオリゴヌクレオチドISIS 3065およびISI
S 3082はICAM−１合成を各々47％および97％阻害した。
マウスICAM−１に対して最も活性の高いアンチセンスオ
リゴヌクレオチドは３′−未翻訳領域を標的としてい
た。ISIS 3082についてこれらの結果に基づく更に詳細
な評定を行ったところ、この20−量体ホスホロチオエー
トオリゴヌクレオチドは配列（５′から３′へ） TGC ATC CCC CAG GCC ACC AT （配列番号83） を含んでいた。 実施例20 ICAM−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドはマ
ウスモデル系において炎症性腸疾患を軽減する 炎症性腸疾患（IBD）についてのマウスモデルが最近
開発された。Okayasu et al.、（1990）Gastroenterolo
gy 98:694−702。マウスへの硫酸デキストランの投与に
より、全ての詳細においてヒトのIBDに類似する結腸炎
が誘導される。硫酸デキストラン誘導化IBDおよびヒトI
BDについてはその後に、組織学的レベルにおけるより綿
密な比較が行われ、そしてこのマウスモデルは極度に再
現性が良く、そして信頼できるモデルであることが見い
だされた。これを、本明細書中においては、マウスICAM
−１の３′−未翻訳領域に相補的な20−塩基ホスホロチ
オエートアンチセンスオリゴヌクレオチドISIS 3082の
効果を検査するのに用いる。 体重約25−30グラムである雌のスイスウエブスター種
（Swiss Webster）マウス（８週令）を標準的な条件下
に維持する。マウスは、実験手順の開始前少なくとも５
日間は順化させる。マウスに、飲料水中に含まれる５％
の硫酸デキストランを５日間与える（自由接種可能）。
それに付随して、薬剤学的担体中に含まれるISIS 308
2、担体単独（陰性対照）、もしくはTGF−β（マウスに
おける硫酸デキストラン介在性結腸炎を予防することが
知られている）を投与する。ISIS 3082は５日間毎日の1
mg/kgもしくは10mg/kgの皮下注射として投与した。TGF
−βは、１μg/マウスで結腸内投与した。1mg/kgにおい
ては、このオリゴヌクレオチドは、硫酸デキストラン誘
導性結腸炎の予防においてTGF−βと同様の効果を示し
た。 マウスは６日目に屠殺し、そして結腸を組織学的評定
に供した。屠殺するまでの疾患作用については、体重変
化に関してマウスを観察することおよび結腸炎の兆候に
関して便を観察することによる記録を行った。マウスの
体重は毎日計測した。便は粘稠度の変化について、なら
びに潜在性もしくは総体的出血の存在について毎日観察
した。集計システムを使用して疾患作用係数を開発し、
それにより体重減少、便の粘稠度、および出血の存在を
０から３までのスケールで等級付けを行い（０は正常で
あり、そして３は最も重篤な影響である）、そして係数
を算出した。疾患作用係数における薬物誘導性の変化を
統計的に分析した。疾患作用係数は概してIBDと極端に
良好な状態で相関することが示された。結果を図16に示
す。1mg/kgにおいては、このオリゴヌクレオチドは疾患
係数を40％減少させた。 実施例21 ICAM−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドはマ
ウス異所性心臓移植モデルにおける生存率を増加させる 同種異系移植片拒絶の予防におけるICAM−１アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの治療効果を決定するために、
マウスICAM−１特異的オリゴヌクレオチドISIS 3082
を、マウスの血管化異所性心臓移植モデルにおける作用
について検査した。Balb/cマウスからの心臓を、Isobe
et al.［（1991）Circulation 84:1246−1255］により
主に記載される初代血管化移植片としてC3Hマウスの腹
腔内に移植した。オリゴヌクレオチドを７日用アルツェ
ットポンプ（７−day Alzet pump）を介する継続的静脈
内投与により投与した。未治療マウスについての平均生
存期間は9.2±0.8日（８、９、９、９、10、10日）であ
った。７日間5mg/kgのISIS 3082での治療を行ったマウ
スは、14.3±4.6日（11、12、13、21日）にまで平均生
存期間が伸びた。 実施例22 ICAM−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは白
血球遊走を減少させる 組織および器官の白血球遊出は炎症性過程の主要な側
面であり、そして炎症によりもたらされる組織破壊に寄
与している。白血球遊走におけるISIS 3082の効果を、
カラゲニンに浸したスポンジを皮下移植するマウスモデ
ルを用いて調査した。カラゲニンは白血球遊走および水
腫を刺激誘導する。炎症性滲出液中の白血球遊走につい
てのオリゴヌクレオチドの効果を、移植したスポンジに
遊出する白血球の定量により評定する。４時間の絶食の
後に40匹のマウスを、各５匹のマウスを含む８つの群へ
と無作為抽出により割り振った。各マウスにMetofane
（商標）での麻酔を施し、そして1mlの20mg/mlカラゲニ
ン溶液を染み込ませたポリエステルスポンジを皮下移植
した。群１には、スポンジ移植の前４時間目に10ml/kg
での食塩水を静脈投与し、そしてこれを賦形剤対照とし
て用いた。群２には、3mg/kgで20ml/kgの容積のインド
メタシン（陽性対照）を、手術直後、６−８時間後に再
度、そして移植後21時間目にさらに再び経口投与した。
群３には、ISIS 3082を5mg/kgでスポンジ移植の３時間
前に静脈投与した。群４には、ISIS 3082を5mg/kgでス
ポンジ移植直後に静脈投与した。群５、６、７、および
８にはISIS 3082を5mg/kgでスポンジ移植後各２、４、
８、および18時間目に投与した。移植後24時間目にスポ
ンジを取り出し、EDTAおよび食塩水（5ml）中に浸し、
そして絞って乾かした。スポンジ滲出混合物中の白血球
の総数を決定した。 賦形剤対照群との比較を行うと、3mg/kgのインドメタ
シンの経口投与により平均白血球計測数が79％減少し
た。 スポンジ移植の４時間前に5mg/kgのISIS 3082を投与
した後には、平均白血球計測数の42％の減少が観察され
た（群３）。スポンジ移植直後に5mg/mlのISIS 3082を
投与した後には、平均白血球計測数の47％の減少が観察
された（群４）。全ての動物は研究過程の間中正常であ
るように思われた。
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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 前置審査 (56)参考文献 特表 平４−502859（ＪＰ，Ａ) 国際公開92／3139（ＷＯ，Ａ１) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 266，Ｎｏ．27（1991）ｐ．18162− 18171 Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．243（1989) ｐ．1160−1164 Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．59（1989）ｐ. 1203−1211
Claims (23)
- 【請求項１】細胞間接着分子−１をコードするメッセン
ジャーRNAの５′キャップ領域を標的とする、細胞間接
着分子−１の発現を調節しうるアンチセンスオリゴヌク
レオチドであって、配列番号84を有するオリゴヌクレオ
チド。 - 【請求項２】ヌクレオチドユニット間の連結基の少なく
とも１つがイオウ含有種を含む、請求項１記載のアンチ
センスオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】ヌクレオチドユニット間の連結基の少なく
とも１つがホスホロチオエート部分を含む、請求項１記
載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレ
オチドおよび薬学的に許容しうる担体を含む、細胞間接
着分子−１の発現に関連する疾患を治療するための医薬
組成物。 - 【請求項５】インビトロにおいて、細胞または組織中の
細胞間接着分子−１の合成を調節する方法であって、細
胞または組織を、請求項１記載のアンチセンスオリゴヌ
クレオチドと接触させることを含む方法。 - 【請求項６】アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレ
オチドユニット間の連結基の少なくとも１つがイオウ含
有種を含む、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレ
オチドユニット間の連結基の少なくとも１つがホスホロ
チオエート部分を含む、請求項５記載の方法。 - 【請求項８】細胞間接着分子−１の変化により調節され
る疾患を有すると疑われるヒトを治療するための医薬組
成物であって、治療上有効量の、請求項１記載のアンチ
センスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に受容しうる担
体を含む医薬組成物。 - 【請求項９】アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレ
オチドユニット間の連結基の少なくとも１つがイオウ含
有種を含む、請求項８記載の組成物。 - 【請求項１０】アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌク
レオチドユニット間の連結基の少なくとも１つがホスホ
ロチオエート部分を含む、請求項８記載の組成物。 - 【請求項１１】前記疾患が同種異系移植片拒絶である、
請求項８記載の組成物。 - 【請求項１２】前記疾患が乾癬である、請求項８記載の
組成物。 - 【請求項１３】前記疾患が炎症性疾患である、請求項８
記載の組成物。 - 【請求項１４】前記炎症性疾患が炎症性腸疾患である、
請求項13記載の組成物。 - 【請求項１５】前記炎症性疾患が白血球侵潤により特徴
づけられる、請求項13記載の組成物。 - 【請求項１６】前記疾患が転移により特徴づけられる、
請求項８記載の組成物。 - 【請求項１７】前記転移が肺に影響を及ぼす、請求項16
記載の組成物。 - 【請求項１８】前記疾患が悪性黒色腫である、請求項８
記載の組成物。 - 【請求項１９】転移性状態を有すると疑われるヒトにお
いて転移を減少させるための医薬組成物であって、治療
上有効量の、請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレ
オチドおよび薬学的に受容しうる担体を含む医薬組成
物。 - 【請求項２０】アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌク
レオチドユニット間の連結基の少なくとも１つがイオウ
含有種を含む、請求項19記載の組成物。 - 【請求項２１】アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌク
レオチドユニット間の連結基の少なくとも１つがホスホ
ロチオエート部分を含む、請求項19記載の組成物。 - 【請求項２２】転移が肺に生ずることを特徴とする、請
求項19記載の組成物。 - 【請求項２３】乾癬を治療するための医薬組成物であっ
て、治療上有効量の、請求項１記載のアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドおよび薬学的に受容しうる担体を含む医
薬組成物。
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