JP2948541B2

JP2948541B2 - 細胞接着のオリゴヌクレオチド調節

Info

Publication number: JP2948541B2
Application number: JP8302240A
Authority: JP
Inventors: ベネット，シー・フランク; ミラベリ，クリストファー・ケイ
Original assignee: AISHISU PHARM Inc
Current assignee: AISHISU PHARM Inc
Priority date: 1992-09-02
Filing date: 1996-11-13
Publication date: 1999-09-13
Anticipated expiration: 2014-09-13
Also published as: NO950800L; JPH09182594A; IL106857A; EP0662003A1; AU690858B2; IL106857A0; FI950948A0; NO950800D0; NZ256171A; HU9500630D0; FI950948A; WO1994005333A1; JP2732546B2; AU4840193A; AU6449896A; EP0662003B1; KR0178958B1; EP0662003A4; CA2143748A1; NZ299210A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞接着分子の合
成もしくは代謝の調節に反応する疾患状態のための診断
法、研究用試薬、および治療法に関する。本発明は具体
的には、白血球細胞の他の白血球細胞および他の細胞種
への接着を調節する蛋白質の合成に関与する所定のメッ
センジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）もしくはＤＮＡとのア
ンチセンスオリゴヌクレオチド相互作用に関する。細胞
間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、内皮白血球接着分子
−１（Ｅ−セレクチンとしても知られるＥＬＡＭ−
１）、および血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）を
コードするｍＲＮＡにハイブリダイズするように設計さ
れたアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。こ
れらのオリゴヌクレオチドはＲＮＡもしくはＤＮＡの活
性調節を誘導し、そしてそのことにより特異的細胞接着
分子の合成および代謝の調節を誘導することが見いださ
れた。

【０００２】

【従来の技術】炎症は、損傷、感染、もしくは組織破壊
に反応する組織により誘導される局所的防御反応であ
り、これにより感染性もしくは損傷性作用物質の破壊お
よび損傷を受けた組織の分離がもたらされる。典型的な
炎症反応は次に示すように進行する。外因性物質として
の抗原の認識もしくは組織損傷の認識、可溶性炎症性媒
介物質の合成および放出、感染もしくは組織損傷の部位
への炎症細胞の補充、侵略生体物もしくは損傷組織の破
壊および除去、ならびに一度侵略生体物もしくは損傷組
織が分解された直後のその系の非活性化である。炎症性
構成成分に係わるヒトの疾患の多くのものにおいては炎
症反応を弱める正常なホメオスタシス機構が欠損してお
り、このことにより正常組織の損傷および破壊がもたら
される。

【０００３】細胞−細胞相互作用は、先に記載の各段階
における免疫反応の活性に係わっている。正常な炎症反
応における最も初期の検出可能なできごとの内の一つは
血管内皮ヘの白血球の接着であり、この後に、血管系を
出て炎症もしくは損傷部位へと向かう白血球の遊走が続
く。これらの白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）、すなわ
ち白血球（ｗｈｉｔｅｂｌｏｏｄｃｅｌｌｓ）の血
管内皮ヘの接着は、血管系外への遊走における必須段階
である。ＨａｒｌａｎＪ．Ｍ．、Ｂｌｏｏｄ１９８
５、６５、５１３−５２５。一般的には、炎症部位に出
現する最初の炎症細胞は好中球であり、この後に単球、
そして白血球が続く。細胞−細胞相互作用もＢ−白血球
とＴ−白血球の両方の増殖にとって重要であり、これに
より各々体液性反応および細胞性免疫反応の亢進がもた
らされる。

【０００４】血管内皮および他の細胞種への白血球の接
着は、白血球細胞と血管内の両方の原形質膜上に存在す
る「接着分子」と称される特異的蛋白質間の相互作用に
より媒介される。接着分子間の相互作用は、リガンドが
可溶性である代わりに細胞表面に固定化されていること
を除外しては古典的なレセプター−リガンド相互作用に
類似している。白血球接着における遺伝子欠損を有する
患者を同定することにより、研究者は白血球の接着の原
因となる一群の蛋白質を同定することが可能となる。白
血球接着欠損症（ＬＡＤ）は、再発性細菌感染、および
悪性膿形成、および創傷治癒により特徴付けられる稀な
常染色体特性である。この欠損症は、通常白血球の細胞
外膜上に発現するＭａｃ−１、ＬＦＡ−１、およびｐ１
５０，９５という３つのヘテロ二量体糖蛋白質の共通な
Ｂ−サブユニット中に生じることが示されている。Ａｎ
ｄｅｒｓｏｎおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ、Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｍｅｄ．１９８７、３８、１７５−１９４。ＬＡＤ
を患う患者は、顆粒球、単球、および白血球の広範な接
着依存性機能スペクトラムの欠損を示す。ＬＦＡ−１に
ついては３つのリガンドが同定されており、それらは細
胞間接着分子１、２、および３（ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡ
Ｍ−２、およびＩＣＡＭ−３）である。Ｍａｃ−１およ
びｐ１５０，９５の両方共が補体断片Ｃ３ｂｉ、および
恐らく他の未同定リガンドに結合する。ＭＡＣ−１もや
はりＩＣＡＭ−１に結合する。

【０００５】白血球の血管内皮ヘの接着および後続の血
管系外への遊走に関与する他の接着分子が同定されてい
る。これらには、内皮白血球接着分子−１（ＥＬＡＭ−
１）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）、顆粒膜
蛋白質−１４０（ＧＭＰ−１４０）、およびそれら各々
のレセプターがある。血管内皮への白血球の接着は、部
分的にもしくは全て５つの細胞接着分子、ＩＣＡＭ−
１、ＩＣＡＭ−２、ＥＬＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、およ
びＧＭＰ−１４０により媒介されているようである。Ｄ
ｕｓｔｉｎおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ、Ｊ．ＣｅｌｌＢ
ｉｏｌ．１９８７、１０７、３２１−３３１。接着分
子ＩＣＡＭ−１、ＥＬＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、および
ＧＭＰ−１４０の細胞表面上での発現は炎症性刺激によ
り誘導される。それとは対照的に、ＩＣＡＭ−２の発現
は構成的であり、そしてサイトカインによる誘導に感受
性を示さないように思われる。一般的にＧＭＰ−１４０
はヒスタミン、ロイコトリエンＢ₄、血小板活性化因
子、およびトロンビンのようなオータコイドにより誘導
される。内皮細胞上での最大発現は刺激後３０分から１
時間目までに観察され、そして基準線には２−３時間以
内に戻る。内皮細胞上でのＥＬＡＭ−１およびＶＣＡＭ
−１の発現は、インターロイキン−１βおよび腫瘍壊死
因子のようなサイトカインにより誘導されるが、ガンマ
ー−インターフェロンによっては誘導されない。内皮細
胞表面上でのＥＬＡＭ−１の最大発現は刺激後４−６時
間目に生じ、そして１６時間目までには基準線に戻る。
ＥＬＡＭ−１発現は新しいｍＲＮＡおよび蛋白質合成に
依存している。ＶＣＡＭ−１発現の増大は腫瘍壊死因子
での処理後２時間目に検出可能となり、刺激後８時間目
で最大値を示し、そして刺激後少なくとも４８時間は増
大したままになる。ＲｉｃｅおよびＢｅｖｉｌａｃｑｕ
ａ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９、２４６、１３０３−１
３０６。内皮細胞上でのＩＣＡＭ−１発現は、サイトカ
インであるインターロイキン−１、腫瘍壊死因子、およ
びガンマー−インターフェロンにより誘導される。ＥＬ
ＡＭ−１の最大発現に続くＩＣＡＭ−１の最大発現は、
刺激後８−１０時間目に生じ、そして少なくとも４８時
間は上昇したままになる。

【０００６】ＧＭＰ−１４０およびＥＬＡＭ−１は主に
血管内皮細胞への好中球の接着に関与している。ＶＣＡ
Ｍ−１は主にＴおよびＢ白血球に結合する。その上ＶＣ
ＡＭ−１は黒色腫および恐らくは他の癌の転移における
役割を担っている可能性がある。ＩＣＡＭ−１は血管内
皮への好中球の接着、ならびに血管内皮、組織繊維芽細
胞、および上皮ケラチノサイトへの単球の接着における
役割を担っている。ＩＣＡＭ−１もやはり抗原提示細胞
のＴ−細胞認識、ナチュラルキラー細胞による標的細胞
の溶菌、白血球の活性化および増殖、ならびに胸腺にお
けるＴ細胞成熟における役割を担っている。その上最近
のデータにより、ＩＣＡＭ−１は、一般の風邪の５０％
を上回る割合を占めるライノウイルスの主要血清型の細
胞性レセプターであることが示されている。Ｓｔａｕｎ
ｔｏｎｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ１９８９、５６、８４
９−８５３；Ｇｒａｖｅｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ１
９８９、５６、８３９−８４７。

【０００７】ＩＣＡＭ−１発現は、アレルギー性接触性
皮膚炎、固定薬疹、偏平苔癬、および乾癬のような種々
の炎症性皮膚疾患に関連している。Ｈｏｅｔａ
ｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１
９９０、２２、６４−６８；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓおよび
Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ
１９８９、１３５、１０４５−１０５３；Ｌｉｓｂｙ
ｅｔａｌ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９８
９、１２０、４７９−４８４；Ｓｈｉｏｈａｒａｅｔ
ａｌ．、Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９８９、
１２５、１３７１−１３７６。その上ＩＣＡＭ−１発現
は、リューマチ性関節炎を患う患者の滑液；Ｈａｌｅ
ｅｔａｌ．、Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ．１９８９、３
２、２２−３０、糖尿病患者の脾臓Ｂ−細胞；Ｃａｍｐ
ｂｅｌｌｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８９、８６、４２８２
−４２８６；グレービス氏疾患（Ｇｒａｖｅｓ’ ｄｉ
ｓｅａｓｅ）を患う患者における胸腺小胞細胞；Ｗｅｅ
ｔｍａｎｅｔａｌ．、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．
１９８９、１２２、１８５−１９１、ならびに腎臓およ
び同種異系肝臓移植片拒絶；ＦａｕｌｌおよびＲｕｓ
ｓ、Ｔａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ１９８９、４８、
２２６−２３０；Ａｄａｍｓｅｔａｌ．、Ｌａｎｃ
ｅｔ１９８９、１１２２−１１２５、において検出さ
れている。

【０００８】ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、およびＥＬ
ＡＭ−１発現の阻害剤により、喘息、リューマチ性関節
炎、同種異系移植片拒絶、炎症性腸疾患、種々の皮膚科
的症状、および乾癬のような種々の炎症性疾患もしくは
炎症性成分に関する疾患に対する活性を有する治療用の
種類の新規の抗−炎症剤が提供されることが望まれてい
た。その上ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、およびＥＬＡ
Ｍ−１の阻害剤は、ライノウイルス感染に起因する風
邪、ＡＩＤＳ、カポジ肉腫、ならびにある種の癌および
それらの転移にも有効である可能性がある。細胞性接着
分子であるＥＬＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、およびＩＣＡ
Ｍ−１の発現を効果的に予防する治療剤は、今日までに
は知られていない。動物モデルにおけるＩＣＡＭ−１に
対する中和用モノクローナル抗体の利用により、もし同
定されたとしたらこのような阻害剤は、喘息；Ｗｅｇｎ
ｅｒｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９０、２４
７、４５６−４５９、腎臓同種異系移植片；Ｃｏｓｉｍ
ｉｅｔａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０、
１４４、４６０４−４６１２、および心臓同種異系移植
片；Ｉｓｏｂｅｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ１９
９２、２５５、１１２５−１１２７についての治療面で
の利益をもたらすであろうという証拠が提供されてい
る。ＩＣＡＭ−１分子の可溶性形態の利用も、培養物中
の細胞のライノウイルス感染の予防に有効であった。Ｍ
ａｒｌｉｎｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ１９９０、３
４４、７０−７２。

【０００９】細胞間接着分子について影響を与える現行
の作用物質には、合成ペプチド、モノクローナル抗体、
および接着分子の可溶化形態がある。ＶＣＡＭ−１もし
くはＥＬＡＭ−１との相互作用を遮断する合成ペプチド
は今日までには同定されていない。モノクローナル抗体
は、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、およびＥＬＡＭ−１
の発現に起因する急性炎症性反応の治療に有用であるこ
とが証明される可能性がある。しかしながら慢性的治療
に関しては、宿主動物はそのモノクローナル抗体に対す
る抗体を生じさせ、それらの抗体の有用性を制限する。
その上モノクローナル抗体は大きな蛋白質であり、この
ことが炎症性部位ヘのアクセスを困難にしてしまう可能
性がある。細胞接着分子の可溶化形態は、それらの生産
費用がかさみ、そして結合親和性が低いことに加え、モ
ノクローナル抗体のものと同様の数多くの制限を課せら
れている。従って、細胞間接着分子を効果的に阻害する
分子が長いこと望まれてきた。アンチセンスオリゴヌク
レオチドは、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、およびＥＬ
ＡＭ−１の効果を遮断するのに用いられる現行の作用物
質の多くの落とし穴を回避する。

【００１０】米国ＰＣＴ出願第９０／０２３５７号（Ｈ
ｅｓｓｉｏｎｅｔａｌ．）は、ＥＬＡＭ−１、なら
びにＶＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１ｂを初めとする内
皮接着分子（ＥＬＡＭｓ）をコードするＤＮＡ配列を開
示している。これらのＤＮＡ配列の数々の利用法が提供
され、それには、（１）内皮細胞ヘの白血球結合を阻害
する治療剤として使用することができる、これらの分子
に反応性を示すモノクローナル抗体調製物の製造、
（２）白血球上のＥＬＡＭリガンドに結合し、次には内
皮細胞上のＥＬＡＭに結合することができて、内皮細胞
への白血球結合を阻害するＥＬＡＭペプチドの製造、
（３）炎症を検出するための、ＥＬＡＭに結合する分子
の利用（抗−ＥＬＡＭ抗体、もしくはリガンドもしくは
その断片のような標識）、（４）アンチセンス核酸でＭ
ＲＮＡをマスクするか、あるいはリボザイムでそれを開
裂するかのいずれかにより特異的ＭＲＮＡの翻訳を遮蔽
する目的でアンチセンス核酸およびリボザイムを使用す
る、翻訳レベルでＥＬＡＭもしくはＥＬＡＭリガンド発
現に介在する核酸分子を産生するためのＥＬＡＭおよび
ＥＬＡＭリガンドＤＮＡ配列の利用、がある。コーディ
ング領域が最適の標的であることが開示されている。Ｖ
ＣＡＭ−１についてはＡＵＧが最もそれらしく思われて
おり、そのためＡＵＧ部分にハイブリダイズする１５量
体が実施例１７において具体的に開示されている。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】炎症性細胞接着分子の
合成および発現における二次効果を介する、免疫学的構
成成分に関する疾患、同種異系移植片、癌および転移、
炎症性腸疾患、乾癬、および他の皮膚疾患、風邪、およ
びＡＩＤＳのための治療を提供することは、本発明の主
な目的である。

【００１２】細胞間接着性蛋白質をコードする核酸の機
能を阻害することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオ
チドを提供することは、本発明の別の目的である。

【００１３】細胞間接着の機能不全の診断のための方法
を提供することは、更に別の目的である。

【００１４】本発明のこれらの目的および他の目的は、
本明細書を精査することにより明らかになるであろう。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明に従うと、細胞間
接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子−１
（ＶＣＡＭ−１）、および内皮白血球接着分子−１（Ｅ
ＬＡＭ−１）をコードする核酸に特異的にハイブリダイ
ズするオリゴヌクレオチドが提供される。

【００１６】より詳細には、本発明は、内皮白血球接着
分子−１をコードするメッセンジャーＲＮＡのコーディ
ング領域、３’−非翻訳領域、５’−非翻訳領域または
イントロン／エキソン結合部位を標的とする、内皮白血
球接着分子−１の発現を調節しうるアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドであって、配列番号５２、５３、５４、５
５、５６、５７、５８または５９を含むオリゴヌクレオ
チドを提供する。

【００１７】本発明のオリゴヌクレオチドは直接ｍＲＮ
Ａに、あるいは三重鎖構造を形成する選択されたＤＮＡ
部分のいずれかに結合し、このことによりその遺伝子か
ら生ずるｍＲＮＡの量を調節するように設計されてい
る。

【００１８】前述の関係は、一般的には「アンチセン
ス」として表示される。このオリゴヌクレオチドは、Ｒ
ＮＡもしくはＤＮＡの機能、つまり蛋白質への翻訳、も
しくは細胞質内への輸送、もしくはその総体的生物学的
機能に必要な他のいずれかの活性の内のどれかを阻害す
ることが可能である。ＲＮＡもしくはＤＮＡがその機能
の全てもしくは一部分を実行できないために、細胞接着
分子が正しく発現されるように調節するゲノムの一部分
の欠損がもたらされ、このことにより、該代謝が調節さ
れる。

【００１９】アンチセンスの攻撃については特異的遺伝
子を標的とすることが好ましい。ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡ
Ｍ−１、およびＥＬＡＭ−１をコードする遺伝子がこの
研究法にとって特に有用であることを、我々は発見し
た。ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、およびＥＬＡＭ−１
発現の阻害は、炎症性疾患、炎症性構成成分に関する疾
患、同種異系移植片拒絶、乾癬、および他の皮膚疾患、
炎症性腸疾患、癌およびその転移、ならびにウイルス感
染の治療に有効であることが期待される。

【００２０】動物を、細胞接着を調節することが可能な
蛋白質をコードする核酸とハイブリダイズすることが可
能なオリゴヌクレオチドに接触させることを含む、細胞
接着の調節の方法が提供される。ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡ
Ｍ−１、およびＥＬＡＭ−１をコードするＲＮＡもしく
はＤＮＡとハイブリダイズすることが可能なオリゴヌク
レオチドが好ましい。診断のための方法も本発明の一部
分である。

【００２１】

【発明の実施の形態】アンチセンスオリゴヌクレオチド
には、ヒトについての多くの疾患の治療のための治療剤
としての偉大な可能性が存在する。オリゴヌクレオチド
は、ワトソン−クリックの塩基対形成により特定される
ように、前−ｍＲＮＡもしくは成熟したｍＲＮＡのいず
れかの相補的配列に特異的に結合してＤＮＡから蛋白質
への遺伝情報の流れを阻害する。アンチセンスオリゴヌ
クレオチドの特性はそれら自体をそれらの標的配列にと
って特異的なものにしているが、そのような特性は、そ
れらを極端に多目的なものにもしている。アンチセンス
オリゴヌクレオチドは４つの単量体単位からなる長い鎖
であるため、それらをどのような標的ＲＮＡ配列につい
ても容易に合成することができる。多大な数にのぼる最
近の研究により、標的蛋白質を研究するための生化学的
道具としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの利用性
が証明されている。Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇｅｔａ
ｌ．、Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．１９
８９、８１、１５３９−１５４４；Ｚｏｎ、Ｇ．Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓ．１９８８、５、
５３９−５４９。細胞取り込みの増加を示すヌクレアー
ゼ耐性オリゴヌクレオチドの合成における最近の進歩の
ため、現在では新規の形態の治療法としてのアンチセン
スオリゴヌクレオチドの利用を考案することが可能とな
っている。

【００２２】アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、
従来の技術の研究法で直面していた問題に対する理想的
解決法が与えられる。所定のイソ酵素を選択的に阻害す
るようにそれらを設計することができ、それらはその酵
素の産生を阻害し、そしてそれらは複数のレセプターを
捕捉するもしくはそれに結合する遊離ラジカルのような
非特異的機構を回避する。酵素機構もしくはレセプター
−リガンド相互作用を完全に理解することは、特異的阻
害剤の設計には必要でない。

【００２３】標的の記述好中球の炎症性部位内への急性浸潤は、内皮細胞表面に
おけるＧＭＰ−１４０、ＥＬＡＭ−１、およびＩＣＡＭ
−１の発現の増大に起因するものと思われる。炎症反応
の後期段階中の白血球および単球の出現はＶＣＡＭ−１
およびＩＣＡＭ−１により媒介されるものと思われる。
ＥＬＡＭ−１およびＧＭＰ−１４０は血管内皮細胞上で
一時的に発現されるのに対し、ＶＣＡＭ−１およびＩＣ
ＡＭ−１は慢性的に発現される。

【００２４】ヒトＩＣＡＭ−１は、５５，２１９ダルト
ンの蛋白質の合成をもたらす３．３ｋｂのｍＲＮＡによ
りコードされている（図１−４）。ＩＣＡＭ−１はＮ−
結合型グリコシル化部位を介して、かなりの量がグリコ
シル化されている。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により決定したところ、成熟蛋白質は９０ｋＤａ
という見かけ上の分子量を有している。Ｓａｕｎｔｏｎ
ｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ１９８８、５２、９２５−
９３３。ＩＣＡＭ−１は、イムノグロブリンスーパー遺
伝子ファミリーの一員であり、アミノ末端に５つの免疫
グロブリン様ドメインを有し、その後には貫膜ドメイン
および細胞質ドメインが続く。ＬＦＡ−１およびライノ
ウイルスについての一次結合部位は、最初の免疫グロブ
リン様ドメイン中に見いだされている。しかしながらこ
の結合部位は特殊なもののように思われる。Ｓｔａｕｎ
ｔｏｎｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ１９９０、６１、２
４３−３５４。電子顕微鏡による最近の研究により、Ｉ
ＣＡＭ−１は１８．７ｎｍの長さで２−３ｎｍ直径の折
れ曲がった棹のような構造であることが証明されてい
る。Ｓｔａｕｎｔｏｎｅｔａｌ.、Ｃｅｌｌ１９
９０、６１、２４３−２５４。

【００２５】ＩＣＡＭ−１は広範な組織および細胞分布
を示し、そして白血球細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、ケ
ラチノサイト、および他の上皮細胞において見いだすこ
とができる。血管内皮細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイ
ト、神経膠星状細胞、および数種の細胞株については、
ＩＣＡＭ−１の発現を、細菌性リポ多糖、ならびにイン
ターロイキン−１、腫瘍壊死因子、ガンマー−インター
フェロン、およびリンホトキシンのようなサイトカイン
での処理により調節することができる。例えば、Ｆｒｏ
ｈｍａｎｅｔａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１９８９、２３、１１７−１２４、を参照せよ。
サイトカイン処理後のＩＣＡＭ−１の発現増大について
の分子機構はいまだに決定されていない。

【００２６】ＥＬＡＭ−１は、膜糖蛋白質のセレクチン
ファミリーの一員である１１５−ｋＤａの膜糖蛋白質で
ある（図５−９）。Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａｅｔａ
ｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８９、２４３、１１６０−
１１６５。ＥＬＡＭ−１のアミノ末端領域にはレクチン
−様蛋白質の一員と相同性を有する配列が含まれてお
り、その次には表皮成長因子に類似するドメインが続
き、その次には補体レセプター１および２において見い
だされるものに類似する六縦列をなす６０−アミノ酸反
復構造が続く。これらの特色はＧＭＰ−１４０、および
白血球ホーミング抗原（ｈｏｍｉｎｇａｎｔｉｇｅ
ｎ）であるＭＥＬ１４抗原にも共通している。ＥＬＡＭ
−１は３．９−ｋｂのｍＲＮＡによりコードされる。Ｅ
ＬＡＭ−１のｍＲＮＡの３’−非翻訳領域には、細胞性
ｍＲＮＡの迅速な物質交代の原因となる配列モチーフＡ
ＴＴＴＡが幾つか含まれており、このことはＥＬＡＭ−
１発現が一時的であるという特徴に矛盾しない。

【００２７】ＥＬＡＭ−１は、それが血管内皮細胞にお
いてのみ同定されるに過ぎず、限定された細胞分布を示
す。ＩＣＡＭ−１と同様にＥＬＡＭ−１は、腫瘍壊死因
子、インターロイキン−１、およびリンホトキシンを初
めとする数々のサイトカイン、ならびに細菌性リポ多糖
により誘導される。ＩＣＡＭ−１とは対照的に、ＥＬＡ
Ｍ−１はガンマー−インターフェロンによっては誘導さ
れない。Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａｅｔａｌ．、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９８７、
８４、９２３８−９２４２；Ｗｅｌｌｉｃｏｍｅｅｔ
ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０、１４４、２
５５８−２５６５。ヒトの臍静脈内皮細胞内でのＥＬＡ
Ｍ−１ｍＲＮＡの誘導および消失の動態は、その細胞
表面でのＥＬＡＭ−１の出現および消失より先に生じ
る。ＩＣＡＭ−１に関してと同様に、ＥＬＡＭ−１につ
いての分子機構は解明されていない。

【００２８】ＶＣＡＭ−１は３．２−ｋｂのｍＲＮＡに
よりコードされる１１０−ｋＤａの膜糖蛋白質である
（図１０−１３）。ＶＣＡＭ−１は、６つか７つかのい
ずれかの免疫グロブリンドメインを有する産物を産生す
るための二者択一的スプライシングを受けることができ
る単一コピー遺伝子によりコードされるように思われ
る。Ｏｓｂｏｒｎｅｔａｌ．、Ｃｅｌｌ１９８
９、５９、１２０３−１２１１。ＶＣＡＭ−１へのラモ
ス細胞（Ｒａｍｏｓｃｅｌｌｓ）の接着を遮断するＣ
Ｄ２９に対するモノクローナル抗体の能力により示され
るように、ＶＣＡＭ−１についてのレセプターはＣＤ２
９（ＶＬＡ−４）であることが提唱される。ＶＣＡＭ−
１は血管内皮細胞上にまず最初に発現される。ＩＣＡＭ
−１およびＥＬＡＭ−１と同様に、血管内皮上のＶＣＡ
Ｍ−１の発現はサイトカインでの処理により制御され
る。ＲｉｃｅおよびＢｅｖｉｌａｃｑｕａ、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ１９８９、２４６、１３０３−１３０６；Ｒｉｃ
ｅｅｔａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９０、
１７１、１３６９−１３７４。発現増加はｍＲＡＮの誘
導に起因するものと思われる。

【００２９】治療法については、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡ
Ｍ−１、およびＥＬＡＭ−１の発現を低下させることに
より治療することが可能な疾患を有する疑いのある動物
を、本発明に従うオリゴヌクレオチドを投与することに
より治療する。オリゴヌクレオチドは薬剤学的組成物中
に調剤することができ、この薬剤学的組成物はこのオリ
ゴヌクレオチドの他に、担体、増粘剤、賦形剤、緩衝
液、保存料、界面活性剤、リポソーム、もしくは脂質製
剤などを含むことができる。薬剤学的組成物はこのオリ
ゴヌクレオチドの他に、抗生物質、抗−炎症剤、および
麻酔剤などのような一つもしくは複数の活性成分をも含
むことができる。

【００３０】薬剤学的組成物は、局所的もしくは全身的
治療のいずれが所望されるかに依存して、そして治療す
べき領域に依存して数々の方法において投与することが
できる。投与は、局所投与（経眼的、経膣的、経腸的、
鼻腔内的のものを含む）、経口投与、吸入法による投
与、あるいは動脈内点滴、皮下投与、腹膜内投与、もし
くは筋肉内注射を例とする非経口的投与であることがで
きる。

【００３１】局所投与のための製剤は、軟膏剤、乳液
剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、座剤、噴霧剤、液状
薬、および粉末剤を含むことができる。通常の薬剤学的
担体、水、粉末性、もしくは脂質性基剤、ならびに増粘
剤などが必要であるか、あるいは所望されることがあ
る。コーティング済みコンドームもしくは手袋も有用で
あるだろう。

【００３２】経口投与のための組成物には、粉末剤もし
くは顆粒剤、水もしくは非水性培地中の懸濁液もしくは
水溶液、カプセル剤、薬袋、もしくは錠剤を含む。増粘
剤、矯味・矯臭剤、賦形剤、乳化剤、調剤補助物、もし
くは結合剤が所望されることがある。

【００３３】非経口投与のための製剤も、やはり緩衝
液、リポソーム、賦形剤、および他の適切な添加物を含
むことができる滅菌水溶液を含むことができる。

【００３４】投与量は、治療すべき症状の重篤度および
反応性に依存するが、一般的には数日から数カ月間続く
治療過程に関して、あるいは治療の効果が生じるもしく
は疾患状態の軽減が達成されるまでは、一日当たり一回
もしくは複数回の投与であろう。当業者は至適用量、投
与法、および反復率（ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎｒａｔｅ
ｓ）を容易に決定することができる。

【００３５】本発明は、炎症性細胞接着の調節が可能な
蛋白質に対応するＲＮＡおよびＤＮＡの機能のアンチセ
ンス阻害における用途のためにオリゴヌクレオチドを利
用する。本発明の文脈中では、用語「オリゴヌクレオチ
ド」は、オリゴマーもしくはポリマーのリボ核酸もしく
はデオキシリボ核酸を意味する。この用語には、天然に
存在する塩基、糖、および糖間（主鎖）結合からなるオ
リゴマー、ならびに類似する様式で機能する天然非存在
性部分を有するオリゴマーがある。ヌクレアーゼの存在
下における細胞取り込みの亢進および安定性の増大を一
例とするような特性のために、このように修飾されたも
しくは置換されたオリゴヌクレオチドがはしばしば天然
形態のものよりも好ましい。

【００３６】本発明について意図される幾つかの好まし
いオリゴヌクレオチドの具体例には、ホスホロチオエー
ト、ホスホトリエステル、ホスホン酸メチル、短鎖アル
キル、もしくはシクロアルキル糖間結合、あるいは短鎖
ヘテロ原子もしくは複素環式糖間結合を含むことができ
る。最も好ましいものは、ＣＨ₂−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ₂、Ｃ
Ｈ₂−Ｎ(ＣＨ₃)−Ｏ−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｏ−Ｎ(ＣＨ₃)−
ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｎ(ＣＨ₃)−Ｎ(ＣＨ₃)−ＣＨ₂ および
Ｏ−Ｎ(ＣＨ₃)−ＣＨ₂−ＣＨ₂ の主鎖（式中、ホスホジ
エステルはＯ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ₂である）を有するもので
ある。やはり好ましいものは、モルホリノ主鎖構造を有
するオリゴヌクレオチドである。Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ、
Ｊ．Ｅ．およびＷｅｌｌｅｒ、Ｄ．Ｄ．、米国特許第
５，０３４，５０６号。他の好ましい態様においては、
蛋白質−核酸（ＰＮＡ）主鎖のような、オリゴヌクレオ
チドのホスホジエステル主鎖をポリアミド主鎖で置換す
ることができる（この場合、塩基はポリアミド主鎖のア
ザ窒素原子に直接もしくは間接的に結合している）。
Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ、Ｒ．Ｈ．
Ｂｅｒｆ、Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ１
９９１、２５４、１４９７。他の好ましいオリゴヌクレ
オチドは、２’位において、以下に示す置換基の内の一
つを含むアルキルおよびハロゲン置換された糖部分を含
むことができる。それらの置換基とは、ＯＨ、ＳＨ、Ｓ
ＣＨ₃、Ｆ、ＯＣＮ、Ｏ（ＣＨ₂）_nＮＨ₂、もしくはＯ
（ＣＨ₂）_nＣＨ₃［式中、ｎは１から約１０までであ
る］、Ｃ₁からＣ₁₀までの低級アルキル、置換された低
級アルキル、アルカリル、もしくはアラルキル、Ｃｌ、
Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ₃、ＯＣＦ₃、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ
−アルキル、Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル、Ｓ
ＯＣＨ₃、ＳＯ₂ＣＨ₃、ＯＮＯ₂、ＮＯ₂、Ｎ₃、ＮＨ₂、
複素環式アルキル、複素環式アルカリル、アミノアルキ
ルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されているシリ
ル、ＲＮＡ開裂用の基、コンジュゲート、レポーター
基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動
態特性を改善するための基、もしくはオリゴヌクレオチ
ドの薬物動態特性を改善するための基、ならびに類似す
る特性を有する他の置換基である。オリゴヌクレオチド
はペントフラノシル基の代わりにシクロブチルのような
糖擬態物をも有することができる。

【００３７】本発明に従うオリゴヌクレオチドは、約３
から約５０までの核酸塩基単位を含むことが好ましい。
このようなオリゴヌクレオチドが、約８から２５までの
核酸塩基単位を含むことがより好ましく、そして約１２
から２２までの核酸塩基単位を有することがなおより好
ましい。理解されるように、核酸塩基単位とは、ホスホ
ジエステルもしくは他の結合を介して隣接する核酸塩基
単位に適切に結合している塩基−糖の組み合わせ物であ
る。

【００３８】本発明に従って用いられるオリゴヌクレオ
チドは、よく知られる技術である固相合成を介して都合
良くかつ日常的に作成することができる。このような合
成のための装置は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ社を初めとする数々の販売元により売られている。
このような合成のための他の手段のいずれのものも利用
することができるが、オリゴヌクレオチドの実際の合成
は、日常的な作業に従事するものの手腕の範囲内で十分
に行われる。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導
体のような他のオリゴヌクレオチドを製造するための類
似する技術もよく知られている。

【００３９】本発明に従うと、当業者には、転写される
ＤＮＡの読み取り枠（ＯＲＦｓ）により同定されるメッ
センジャーＲＮＡは、そのＤＮＡのＯＲＦｓからの情報
のみでなく、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域およ
び介在配列リボヌクレオチドとして当業者に知られる領
域を形成する関連的リボヌクレオチドからの情報をも含
むことが理解されるであろう。従って、これらの関連的
リボヌクレオチドならびに情報的リボヌクレオチドの全
てもしくはその一部分を標的とするオリゴヌクレオチド
は、本発明に従って製剤することができる。好ましい態
様においては、このオリゴヌクレオチドは転写開始部
位、翻訳開始部位、介在配列、および３’−非翻訳領域
内の配列と特異的にハイブリダイズすることが可能であ
る。

【００４０】本発明に従うと、このオリゴヌクレオチド
は、白血球細胞の、他の白血球細胞もしくは他の細胞種
への接着に係わる蛋白質をコードする核酸の一部分と特
異的にハイブリダイズすることが可能である。好ましい
態様においては、該蛋白質は細胞間接着分子−１、血管
細胞接着分子−１、および内皮白血球接着分子−１であ
る。それに対応する配列もしくはその一部分を含むオリ
ゴヌクレオチドが本発明において有用である。一例で
は、図１−４は、ヒトの細胞間接着分子−１のｍＲＮＡ
配列である。全体もしくはその一部分が有用である可能
性のある好ましい配列セグメントは、５’ ３’ 配列番号 TGGGAGCCATAGCGAGGC １ GAGGAGCTCAGCGTCGACTG ２ GACACTCAATAAATAGCTGGT ３ GAGGCTGAGGTGGGAGGA ４ CGATGGGCAGTGGGAAAG ５ GGGCGCGTGATCCTTATAGC ６ CATAGCGAGGCTGAGGTTGC ７ CGGGGGCTGCTGGGAGCCAT ８ TCAGGGAGGCGTGGCTTGTG １３ CCTGTCCCGGGATAGGTTCA １４ TTGAGAAAGCTTTATTAACT １６ CCCCCACCACTTCCCCTCTC １５である。

【００４１】図５−９は、ヒトの内皮白血球接着分子−
１のｍＲＮＡ配列である。全体もしくはその一部分が有
用である可能性のある好ましい配列セグメントは、５’ ３’ 配列番号 CAATCATGACTTCAAGAGTTCT ２８ TCACTGCTGCCTCTGTCTCAGG ７３ TGATTCTTTTGAACTTAAAAGGA ７４ TTAAAGGATGTAAGAAGGCT ７５ CATAAGCACATTTATTGTC ７６ TTTTGGGAAGCAGTTGTTCA ７７ AACTGTGAAGCAATCATGACT ７８ CCTTGAGTGGTGCATTCAACCT ７９ AATGCTTGCTCACACAGGCATT ８０である。

【００４２】図１０−１３は、ヒトの血管細胞接着分子
−１のｍＲＮＡ配列である。全体もしくはその一部分が
有用である可能性のある好ましい配列セグメントは、５’ ３’ 配列番号 CCAGGCATTTTAAGTTGCTGT ４０ CCTGAAGCCAGTGAGGCCCG ４１ GATGAGAAAATAGTGGAACCA ４２ CTGAGCAAGATATCTAGAT ４３ CTACACTTTTGATTTCTGT ４４ TTGAACATATCAAGCATTAGCT ４５ TTTACATATGTACAAATTATGT ４６ AATTATCACTTTACTATACAAA ４７ AGGGCTGACCAAGACGGTTGT ４８である。図示した配列は正確であると思われるものの、
万が一間違いが見つかったとしても本発明は正しい配列
を指示する。本発明における有用なオリゴヌクレオチド
はこれらの配列の内の一つ、もしくはその一部分を含
む。従って、先に示されるこれらのオリゴヌクレオチド
の内のいずれか、あるいは当業者が炎症性細胞接着分子
の合成の調節のための好ましいアンチセンス標的の知識
から製造することができる類似するオリゴヌクレオチド
の内のいずれかを利用することが好ましい。

【００４３】本発明の幾つかの好ましい態様は、以下に
示す非制限的実施例に従って詳細に説明される。調節の
ための標的ｍＲＮＡ種は、細胞間接着分子−１、内皮白
血球接着分子−１、および血管細胞接着分子−１に関連
する。当業者は、本発明はそれらに限定はされず、しか
しながら本発明は一般的に適用することができるという
ことを判断するであろう。ＩＣＡＭ−１および／または
ＥＬＡＭ−１および／またはＶＣＡＭ−１の産生の阻害
もしくは調節は、疾患治療における有意な治療学的利益
を有することが予期される。これらの組成物の有用性を
評定する目的においては、一つもしくは一連のアッセイ
が必要である。

【００４４】

【実施例】

実施例１細胞表面上でのＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、およびＥ
ＬＡＭ−１の発現は、ＥＬＩＳＡにおいて特異的モノク
ローナル抗体を使用して定量することができる。細胞は
９６ウエルのマイクロタイタープレート内において密集
するまで増殖させる。これらの細胞をインターロイキン
−１もしくは腫瘍壊死因子のいずれかで、ＥＬＡＭ−１
を定量するためには４時間から８時間まで、そしてＩＣ
ＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１を定量するためには８時間
から２４時間までの間刺激する。サイトカインでの適切
なインキュベーション時間の後、これらの細胞を、ダル
ベッコー（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）のリン酸緩衝化食塩
水（Ｄ−ＰＢＳ）のような、カルシウムとマグネシウム
とを含む緩衝化等張液で３回緩和に洗浄する。その後細
胞をＤ−ＰＢＳ中で希釈した１−２％のパラホルムアル
デヒドを用いて、マイクロタイタープレート上に、２５
℃で２０分間直接固定化させる。これらの細胞を再びＤ
−ＰＢＳで３回洗浄する。マイクロタイタープレート上
の非特異的結合を、３７℃において１時間、Ｄ−ＰＢＳ
中の２％ウシ血清アルブミンで遮断する。細胞を３７℃
において１時間、遮断用溶液中で希釈した適切なモノク
ローナル抗体と共にインキュベートする。未結合抗体
は、Ｄ−ＰＢＳでの３回の洗浄により除去する。細胞に
結合した抗体は、３７℃下、１時間の、遮断用溶液中の
ビオチニル化ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ
ＲｅｓｅａｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ）の１：１０００希釈液と
のインキュベーションにより検出する。細胞をＤ−ＰＢ
Ｓで３回洗浄し、そしてその後３７℃下、１時間、β−
ガラクトシダーゼ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅａｓｅａｃ
ｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）とコンジュゲートさ
せたストレプトアビジンの１：１０００希釈液とインキ
ュベートする。細胞を各５分ずつＤ−ＰＢＳで３回洗浄
する。特異的モノクローナル抗体に結合したβ−ガラク
トシダーゼの量を、３．３ｍＭのクロロフェノールレッ
ド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５０ｍＭのリン酸ナ
トリウム、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂；ｐＨ＝７．２の溶
液中で、３７℃下、２−１５分間、プレートを現像する
ことにより決定する。産物の濃度はＥＬＩＳＡ用マイク
ロタイタープレートリーダー内において５７５ｎｍの吸
光度を測定することにより決定する。

【００４５】数々のヒト細胞株における、インターロイ
キン−１βもしくは腫瘍壊死因子αのいずれかでの刺激
の後に観察されるＩＣＡＭ−１の誘導の例を図１４に示
す。細胞は、１５時間、インターロイキン−１もしくは
腫瘍壊死因子の増加濃度で刺激し、そして先に示す処理
を施した。ＩＣＡＭ−１発現は、モノクローナル抗体８
４Ｈ１０（ＡｍａｃＩｎｃ．社、Ｗｅｓｔｂｒｏｏ
ｋ、ＭＥ）の１：１０００希釈液とのインキュベーショ
ンにより決定した。使用した細胞株は、第四継代目のヒ
ト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト表皮癌細胞株
（Ａ４３１）、ヒト黒色腫細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−
２）、およびヒト肺癌細胞株（Ａ５４９）であった。Ｉ
ＣＡＭ−１をすべての細胞株上で誘導させたが、細胞表
面におけるＩＣＡＭ−１発現の誘導においては、腫瘍壊
死因子はインターロイキン−１と比較してより効果的で
あった（図１４）。

【００４６】ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、もしくはＥ
ＬＡＭ−１の阻害についてのアンチセンスオリゴヌクレ
オチドのスクリーニングは、オリゴヌクレオチドでの細
胞の前処理をサイトカインでの刺激の前に行うというこ
と以外は先に記載するように実施する。ＩＣＡＭ−１発
現に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害の一例
を図１５に示す。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）
は、３７℃下で４時間、８μＭの塩化Ｎ−［１−（２，
３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリ
メチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）を含むＯｐｔｉＭ
ＥＭ（ＧＩＢＣＯ社、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、Ｎ
Ｙ）中で希釈した増加濃度のオリゴヌクレオチドで処理
してオリゴヌクレオチドの取り込みを亢進させた。培地
を除去し、そして更に４時間、増加濃度のオリゴヌクレ
オチドを含む内皮成長用培地（ＥＧＭ−ＵＶ；Ｃｌｏｎ
ｅｔｉｃｓ社、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）と交換し
た。インターロイキン−１βを５単位／ｍｌの濃度にお
いてその細胞に添加し、そして３７℃において１４時間
インキュベートした。これらの細胞を、先に記載するよ
うにモノクローナル抗体８４Ｈ１０の１：１０００希釈
液を使用してＩＣＡＭ−１発現について定量した。使用
したオリゴヌクレオチドは、化合物１−（ＩＳＩＳ１５５８）配列 5'-TGGGAGCCATAGCGAGGC-3' （配列番号１）を有する翻訳コドンのＡＵＧ開始部分を含むｍＲＮＡの
位置６４−８０とハイブリダイズするように設計された
ホスホジエステルオリゴヌクレオチド、化合物２−（ＩＳＩＳ１５７０）化合物１と同一の
配列に対応するホスホロチオエートを含むオリゴヌクレ
オチド、化合物３−配列 5'-GCCTCGCTATGGCTCCCA-3' （配列番号８１）を示す、化合物１および化合物２に相補的なホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチド、化合物４−（ＩＳＩＳ１５７２）配列 5'-GACACTCAATAAATAGCTGGT-3' （配列番号３）を含む３’−非翻訳領域中のｍＲＮＡの位置２１９０−
２２１０にハイブリダイズするように設計された、ホス
ホロチオエートを含むオリゴヌクレオチド、化合物５−（ＩＳＩＳ１８２１）配列 5'-CATGGCGCGGGCCGCGGG-3' （配列番号８２）を含む、対照として用いられるヒトの５−リポキシゲナ
ーゼｍＲＮＡにハイブリダイズするように設計された、
ホスホロチオエートを含むオリゴヌクレオチドである。

【００４７】ヒトＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡの翻訳領域の
ＡＵＧ開始部分を標的とするホスホジエステルオリゴヌ
クレオチド（化合物１）はＩＣＡＭ−１の発現は阻害し
ないが、ホスホロチオエートを含む対応するオリゴヌク
レオチド（化合物２）はＩＣＡＭ−１発現を、０．１μ
Ｍの濃度において７０％、そして１μＭ濃度において９
０％阻害した（図１４）。ホスホジエステルに勝るホス
ホロチオエートオリゴヌクレオチドの効力増大は、恐ら
く安定性の増加に起因するものと思われる。化合物２に
対するセンス鎖である化合物３は、１０μＭにおいて控
えめながらもＩＣＡＭ−１発現を阻害した。細胞に添加
する前に化合物２を化合物３に対して予めハイブリダイ
ズさせた場合には、ＩＣＡＭ−１発現に対する化合物２
の効果は弱まり、このことにより化合物２の活性はｍＲ
ＮＡへのハイブリッド形成に必要なアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの効果に起因することが示唆される。３’
−非翻訳配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチ
ド（化合物４）は、１μＭの濃度においてＩＣＡＭ−１
発現を６２％阻害した（図１５）。ヒト５−リポキシゲ
ナーゼを標的とする対照オリゴヌクレオチドはＩＣＡＭ
−１発現を２０％減少させた。これらのデータにより、
オリゴヌクレオチドはヒト臍静脈内皮細胞上でのＩＣＡ
Ｍ−１発現を阻害することが可能であることが示され、
そしてＩＣＡＭ−１発現の阻害はアンチセンス活性に起
因することが示唆される。

【００４８】１μＭの濃度のアンチセンスオリゴヌクレ
オチド、化合物２は、増加濃度の腫瘍壊死因子およびイ
ンターロイキン−１で刺激したヒト臍静脈内皮細胞上で
のＩＣＡＭ−１発現を阻害する（図１６）。これらのデ
ータにより、化合物２の効果は細胞のインターロイキン
−１刺激に特異的でないことが示される。

【００４９】類似するアッセイを使用して、アンチセン
スオリゴヌクレオチドによるＥＬＡＭ−１およびＶＣＡ
Ｍ−１発現の阻害を示すこともできる。

【００５０】実施例２ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、もしくはＥＬＡＭ−１発
現に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示
すのに用いることができる第二の細胞性アッセイは、細
胞接着アッセイである。標的細胞をマルチウエルプレー
ト上に単層として増殖させ、オリゴヌクレオチドで処理
し、そして次にサイトカインで処理する。その後接着性
細胞をその単層細胞に添加し、そして３７℃において３
０−６０分間インキュベートし、そして洗浄して非接着
性細胞を除去する。単層に接着している細胞は、接着性
細胞を直接計数するか、あるいは記載されるように⁵¹Ｃ
ｒのような放射性同位元素でその細胞を予め標識し、単
層に結合している放射活性を定量するかのいずれかによ
り決定することができる。ＤｕｓｔｉｎおよびＳｐｒｉ
ｎｇｅｒ、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１９８８、１０
７、３２１−３３１。アンチセンスオリゴヌクレオチド
は、そのアッセイにおいてはＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−
１、もしくはＥＬＡＭ−１のいずれかを標的とすること
ができる。

【００５１】腫瘍壊死因子で処理したヒト臍静脈内皮細
胞に対する、ＤＭＳＯでの分化処理を施したＨＬ−６０
細胞の接着についての、ＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡを標的
とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果の一例を
図１７に示す。ヒト臍静脈内皮細胞は、１２ウエルプレ
ート内において８０％密集するまで増殖させた。これら
の細胞を３７℃下で４時間、８μＭのＤＯＴＭＡを含む
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中で希釈した２μＭのオリゴヌクレオ
チドで処理した。培地を除去し、そして表示されるオリ
ゴヌクレオチドの２μＭを含む新鮮な内皮細胞成長用培
地（ＥＧＥ−ＵＶ）と取り替え、そして３７℃で４時間
インキュベートした。１ｎｇ／ｍｌの腫瘍壊死因子を表
示されるように細胞に添加し、そして細胞を更に１９時
間インキュベートした。細胞をＥＧＭ−ＵＶで一回洗浄
し、そして１．３％のＤＭＳＯを添加して１．６×１０
⁶のＨＬ−６０細胞を４日間分化させた。この細胞を３
７℃で１時間接着させ、そして３７℃に暖めたダルベッ
コーのリン酸緩衝化食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）で４回緩和に
洗浄した。接着細胞を、５ｍＭのＥＤＴＡを含む０．２
５ｍｌの冷却（４℃）リン酸緩衝化食塩水の添加により
単層からはがし、氷上で５分間インキュベートした。Ｅ
ＤＴＡでの処理により除去された細胞の数を血球計数器
で計数することにより決定した。ＥＤＴＡ処理により単
層からはがされた内皮細胞は、形態学的差異によりＨＬ
−６０細胞から容易に識別することができた。

【００５２】腫瘍壊死因子の非存在下においては、３％
のＨＬ−６０細胞が内皮細胞に結合した。１ｎｇ／ｍｌ
の腫瘍壊死因子での内皮細胞単層の処理により、添加し
た総細胞の５９％にまで接着細胞の数が上昇した（図１
７）。アンチセンスオリゴヌクレオチドである化合物２
もしくは対照オリゴヌクレオチドである化合物５での処
理は、腫瘍壊死因子処理の非存在下においては、単層に
接着する細胞の数を変化させなかった（図１７）。この
アンチセンスオリゴヌクレオチド、つまり化合物２は、
添加した総細胞の５９％から添加した総細胞の１７％に
まで接着細胞数を減少させた。それとは対照的に、対照
オリゴヌクレオチドである化合物５は、腫瘍壊死因子で
処理した内皮単層へ接着する細胞の数を有意には減少さ
せず、つまり対照細胞については５９％であるのに対し
て、化合物５で処理した細胞については添加した総細胞
の５３％であった。

【００５３】これらのデータにより、アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドは、内皮細胞上でのＩＣＡＭ−１発現を
阻害することが可能であり、そしてＩＣＡＭ−１発現の
阻害は、配列特異的様式で内皮単層への好中球−様細胞
の接着の減少に相関することが示される。ＥＬＡＭ−１
およびＶＣＡＭ−１のような他の分子も内皮細胞への白
血球の接着を媒介するため、接着は完全に遮断されるこ
とは予期されない。

【００５４】実施例３オリゴヌクレオチドの合成および特性決定未修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドは自動ＤＮＡ合成機
（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓｍｏｄｅｌ
３８０Ｂ）上で、ヨウ素による酸化を用いる標準的な
ホスホルアミダイト化学を使用して合成した。β−シア
ノエチルジイソプロピル−ホスホルアミダイトは、Ａｐ
ｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から購入した。ホスホルチオエートオ
リゴヌクレオチドについては、標準的な酸化用瓶を、亜
リン酸エステル結合の段階的イオウ付加のために、アセ
トニトリル中の３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−
オン１，１−ジオキシドの０．２Ｍ溶液に入れ替えた。
イオウ付加周期待機段階（ｗａｉｔｓｔｅｐ）を６８
秒まで増加し、そしてその後にキャッピング段階が続
く。

【００５５】２’−Ｏ−メチルホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルβ−シアノエチルジ
イソプロピルホスホルアミダイト（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ
社，ＮｅｅｄｈａｍＭＡ）およびテトラゾール、およ
び塩基のパルス輸送後の待機段階を３６０秒まで増加さ
せたことを除いては、未修飾オリゴヌクレオチドについ
ての標準周期を使用して合成した。この合成を出発させ
るのに用いた３’−塩基は２’−デオキシリボヌクレオ
チドであった。

【００５６】２’−フルオロホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチドは、５’−ジメトキシトリチル−３’−ホ
スホルアミダイトを使用して合成し、そして本出願と同
じ譲受人に譲渡されている、１９９０年１月１１日に提
出された米国特許出願第４６３，３５８号、および１９
９０年８月１３日に提出された同出願第５６６，９７７
号において開示されるように製造した。２’−フルオロ
オリゴヌクレオチドは、ホスホルアミダイト化学および
標準的ＤＮＡ合成研究法の若干の変法（脱保護化を、室
温におけるメタノール性アンモニア（ｍｅｔｈａｎｏｌ
ｉｃａｍｍｏｎｉａ）を使用して行っている）を使用
して製造した。

【００５７】制御式微細孔ガラスカラム（ｃｏｎｔｒｏ
ｌｌｅｄｐｏｒｅｇｌａｓｓｃｏｌｕｍｎ）（Ａｐ
ｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）からの開裂およ
び５５℃下１８時間の濃厚な水酸化アンモニウム中での
脱保護化の後、このオリゴヌクレオチドを、２．５倍容
のエタノールを用いる０．５ＭのＮａＣｌからの２度の
沈殿化により精製した。分析用ゲル電気泳動は、２０％
アクリルアミド、８Ｍ尿素、４５ｍＭトリス−ホウ酸緩
衝液、ｐＨ７．０中で行った。オリゴデオキシヌクレオ
チドおよびホスホルチオエートオリゴヌクレオチドは電
気泳動より判断したところ、全長の８０％を有する物質
よりも大きいものであった。

【００５８】ＲＮＡオリゴヌクレオチド合成は、ＡＢＩ
モデル３８０ＢのＤＮＡ合成機上で実施した。標準的な
合成周期を、テトラゾールのパルス輸送後の待機段階を
９００秒までに増加させることにより改変した。塩基は
メタノール性アンモニア中での一晩のインキュベーショ
ンにより脱保護化した。塩基の脱保護化の後、このオリ
ゴヌクレオチドを減圧下において乾燥させた。２’ヒド
ロキシルを保護するｔ−ブチルジメチルシリルは、テト
ラヒドロフラン中の１Ｍのフッ化テトラブチルアンモニ
ウム中でそのオリゴヌクレオチドを一晩インキュベート
することにより除去した。このＲＮＡオリゴヌクレオチ
ドは、Ｃ₁₈Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ
社、ＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣ
ｏｒｐ．、ＭｉｌｆｏｒｄＭＡ）上で更に精製し、そ
してエタノール沈殿を行った。

【００５９】この合成法により取得されるホスホルチオ
エートとホスホジエステル結合との相対的な量は、³¹Ｐ
ＮＭＲ分光法により周期的に検査した。このスペクト
ルは、溶媒として酸化重水素もしくはジメチルスルホキ
シド−ｄ₆を使用して室温で取得した。ホスホロチオエ
ート試料は、典型的には１パーセントを下回るホスホジ
エステル結合を含んでいた。

【００６０】二次評定は、５０ｍＭの酢酸トリエチルア
ンモニウム、ｐＨ７．０、中のアセトニトリルの濃度勾
配（３０分間で４％から３２％まで、流速＝１．５ｍｌ
／分）を使用するＰＲＰ−１カラム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ
Ｃｏ．社、Ｒｅｎｏ、Ｎｅｖａｄａ）上でのトリチル
−オン（ｔｒｉｔｙｌ−ｏｎ）ＨＰＬＣにより精製し
た。適切な分画をひとまとめにし、蒸留し、そして室温
において１５分間５％酢酸で処理した。この溶液を同容
積の酢酸エチルで抽出し、そして水酸化アンモニウムで
中和し、そして凍結乾燥した。ＨＰＬＣ精製したオリゴ
ヌクレオチドは、ＩＣＡＭ−１発現についてＥＬＩＳＡ
アッセイにより判定したところ、沈殿させたオリゴヌク
レオチドとは効力における有意な差異を生じなかった。

【００６１】実施例４細胞培養およびオリゴヌクレオチドでの処理ヒト肺癌細胞株Ａ５４９を、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐ
ｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａＭＤ）から取得した。細胞を、１グラムのグル
コース／リットルおよび１０％ウシ胎児血清（Ｉｒｖｉ
ｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を含むダルベッコ変法
イーグル培地（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
社、ＩｒｖｉｎｅＣＡ）中で増殖させた。ヒト臍静脈
内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社、Ｓａ
ｎＤｉｅｇｏＣＡ）は、ＥＧＭ−ＵＶ培地（Ｃｌｏ
ｎｅｔｉｃｓ社）中で培養した。ＨＵＶＥＣは、第二継
代物と第六継代物との間のものを使用した。ヒト表皮癌
Ａ４３１細胞はＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔ
ｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから取得し、そして４．
５ｇ／ｌのグルコースを含むＤＭＥＭ中で培養した。ヒ
トの初代ケラチノサイトはＣｌｏｎｅｔｉｃｓ社から取
得し、そしてＫＧＭ（ケラチノサイト増殖用培地、Ｃｌ
ｏｎｅｔｉｃｓ社）中で増殖させた。

【００６２】９６−ウエルプレート中で増殖させた細胞
を、予め３７℃に暖めたＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ
社、Ｇｒａｎｄ．Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で３回洗浄し
た。ＨＵＶＥＣ細胞の場合には１０μｇ／ｍｌの塩化Ｎ
−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ、Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ．ＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｓ社、Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａＭＤ）を、あるいはＡ５４９細胞の場合
には２０μｇ／ｍｌのＤＯＴＭＡを含む１００μｌのＯ
ｐｔｉ−ＭＥＭを、各ウエルに添加した。オリゴヌクレ
オチドは、０．２μｍのＣｅｎｔｒｅｘ酢酸セルロース
フィルター（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄＳｃｈｕｅ
ｌｌ社、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）を通す遠心処理により滅菌
した。オリゴヌクレオチドを２０×の保存溶液として各
ウエルに添加し、そして３７℃において４時間インキュ
ベートした。培地を除去し、そして表示の濃度のオリゴ
ヌクレオチドを含む１５０μｌの適切な成長培地に入れ
替えた。細胞をさらに３−４時間、３７℃でインキュベ
ートし、そして表示したように適切なサイトカインで１
４−１６時間刺激した。ＩＣＡＭ−１発現は実施例１に
記載のように決定した。オリゴヌクレオチドとの最初の
４時間のインキュベーションの間に、ＤＯＴＭＡが存在
することにより、オリゴヌクレオチドの効力が少なくと
も１００倍増加した。この効力の上昇は、オリゴヌクレ
オチドの細胞取り込みの上昇に関連していた。

【００６３】実施例５インターロイキン−１β−刺激化細胞におけるＩＣＡＭ
−１遺伝子発現に対する活性についての追加のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドのＥＬＩＳＡスクリーニングアンチセンスオリゴヌクレオチドは最初、ヒトＩＣＡＭ
−１ｍＲＮＡにおける５つの標的部位にハイブリダイ
ズするように設計された。オリゴヌクレオチドは、ホス
ホジエステル（Ｐ＝Ｏ、ＩＳＩＳ１５５８、１５５
９、１５６３、１５６４、および１５６５）、ならびに
ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ；ＩＳＩＳ１５７０、１５
７１、１５７２、１５７３、および１５７４）の両形態
において合成した。これらのオリゴヌクレオチドを表I
に示す。

【００６４】

【表１】

【００６５】

【表２】

【００６６】オリゴヌクレオチドによるインターロイキ
ン−１β−刺激化細胞表面上のＩＣＡＭ−１発現の阻害
は、実施例１に記載のＥＬＩＳＡアッセイにより決定し
た。オリゴヌクレオチドは２つの異なる細胞株において
検査した。ホスホジエステルオリゴヌクレオチドはどれ
もＩＣＡＭ−１発現を阻害しなかった。これは恐らく、
細胞内におけるホスホジエステルオリゴヌクレオチドの
迅速な分解によるものであると思われる。５つのホスホ
ロチオエートオリゴヌクレオチドの内でも、最も活性が
高かったのはＡＵＧ翻訳開始コドンにハイブリダイズす
るＩＳＩＳ１５７０であった。２’−Ｏ−メチルホス
ホロチオエートオリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ２
９７４は、ＨＵＶＥＣおよびＡ５４９細胞でのＩＣＡＭ
−１発現の阻害においてはＩＳＩＳ１５７０と比較す
ると約３倍低い有効性を示した。

【００６７】２’−フルオロオリゴヌクレオチドである
ＩＳＩＳ２６３４も有効性が低かった。

【００６８】５つの最初の標的を用いて得られた初期デ
ータに基づき、追加のオリゴヌクレオチドを、ＩＣＡＭ
−１ｍＲＮＡとハイブリダイズするように設計した。
予想される転写開始部位（５’キャップ部位）にハイブ
リダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩ
Ｓ３０６７）は、図１８において示されるように、Ｉ
Ｌ−１β−刺激化細胞においてはＡＵＧコドンにハイブ
リダイズするオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１５７
０）とほぼ同程度の活性を示した。ＩＳＩＳ１９３１
および１９３２は、ＡＵＧ翻訳開始コドンの各々５’お
よび３’にハイブリダイズする。ＡＵＧ領域にハイブリ
ダイズする３つ全てのオリゴヌクレオチドはＩＣＡＭ−
１発現を阻害するが、ＩＳＩＳ１９３２はＩＳＩＳ
１５７０およびＩＳＩＳ１９３１と比較するとやや活
性が劣っていた。ＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡのコーディン
グ領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（ＩＳ
ＩＳ１９３３、１９３４、１９３５、１５７４、および
１９３６）は弱い活性を示した。翻訳終止コドンにハイ
ブリダイズするオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１９３
７および１９３８）は中程度の活性を示した。

【００６９】驚くべきことに、最も活性の高いアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドはＩＳＩＳ１９３９であり、こ
れはＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡの３’−非翻訳領域の配列
を標的とするホスホロチオエートオリゴヌクレオチドで
ある（表Iを参照せよ）。同じ配列を有する他のオリゴ
ヌクレオチドである２’−Ｏ−メチル（ＩＳＩＳ２９７
３）および２’−フルオロ（ＩＳＩＳ２６３７）をも
検査したが、これらはこのレベルの活性は示さなかっ
た。他の３’−非翻訳配列を標的とするオリゴヌクレオ
チド（ＩＳＩＳ１５７２、１５７３、および１９４
０）もＩＳＩＳ１９３９程の活性は示さなかった。実際
のところ、ポリアデニル化シグナルを標的とするＩＳＩ
Ｓ１９４０はＩＣＡＭ−１発現を阻害しなかった。

【００７０】検査した１６の最初のオリゴヌクレオチド
の内で、ＩＳＩＳ１９３９が予期せず最大のアンチセ
ンス活性を示すことが判明したため、ＩＣＡＭ−１ｍ
ＲＮＡの３’−非翻訳領域における配列にハイブリダイ
ズするように、他のオリゴヌクレオチドを設計した（表
Iに示されるＩＳＩＳ２３０２、２３０３、２３０
４、２３０５、および２３０７）。ＩＳＩＳ１９３９
標的のわずか５塩基分３’側にある配列にハイブリダイ
ズするＩＳＩＳ２３０７は、この一連のもののうちで
最も活性が低かった（図１８）。ＩＳＩＳ．１９３９標
的の３’側の１４３塩基分の位置にあるＩＣＡＭ−１
ｍＲＮＡにハイブリダイズするＩＳＩＳ２３０２はＩＳ
ＩＳ１９３９に匹敵し得る活性を有しており、この一
連のものの内でも最高の活性を示した。ヒトＩＣＡＭ−
１ｍＲＮＡの３’−非翻訳領域の予想されるＲＮＡ二
次構造の調査により（Ｍ．Ｚｕｋｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ
１９８９、２４４、４８−５２）、ＩＳＩＳ１９３９
とＩＳＩＳ２３０２との両方は安定なステム−ループ
構造をとることが予期される構造にハイブリダイズする
ことが示された。最近の定説により、アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドを設計する際にはＲＮＡ二次構造の領域
は避けるべきことが示唆されている。従ってＩＳＩＳ
１９３９およびＩＳＩＳ２３０２は、ＩＣＡＭ−１発
現を阻害することが予期されなかった。

【００７１】対照オリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ
１８２１はＩＳＩＳ１９３４のものに匹敵する活性で
ＨＵＶＥＣ細胞におけるＩＣＡＭ−１発現を阻害した
が、Ａ５４９細胞においてはＩＳＩＳ１８２１はＩＳ
ＩＳ１９３４と比較して低い有効性を示した。陰性対照
であるＩＳＩＳ１８２１は、ＩＣＡＭ発現に対しては
少量の活性を示すことが見いだされ、これは恐らくＡＵ
Ｇ翻訳開始コドンの３’側１５塩基分の位置のＩＣＡＭ
−１ｍＲＮＡにハイブリダイズする（１３塩基分の１
２が対合する）能力がその原因の一部をなすためである
と思われる。

【００７２】これらの研究により、ＩＣＡＭ−１ｍＲ
ＮＡのＡＵＧ翻訳開始コドンおよび特異的３’−非翻訳
配列が、ＩＣＡＭ−１発現のアンチセンスオリゴヌクレ
オチド阻害に対する最高の感受性を示したことが示され
る。

【００７３】ヒト臍静脈細胞およびヒト肺癌細胞（Ａ５
４９）におけるＩＣＡＭ−１発現を阻害することに加え
て、ＩＳＩＳ１５７０、ＩＳＩＳ１９３９、および
ＩＳＩＳ２３０２はヒト表皮癌Ａ４３１細胞およびヒ
トの初代ケラチノサイトにおけるＩＣＡＭ−１発現を阻
害することが示された（図１９に示す）。これらのデー
タにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドは幾つかの
ヒト細胞株におけるＩＣＡＭ−１発現を阻害することが
可能であることが示される。その上、これらのオリゴヌ
クレオチドの効力程度の順位は、調査した４つの細胞株
においては同一であった。ＩＣＡＭ−１発現はヒトの初
代ケラチノサイトにおいて阻害可能であるという事実は
重要であり、それは表皮ケラチノサイトはアンチセンス
ヌクレオチドの対象標的であるという理由による。

【００７４】実施例６他のサイトカインで刺激した細胞でのＩＣＡＭ−１発現
のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害２つのオリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ１５７０および
ＩＳＩＳ１９３９を、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ−
誘導化ＩＣＡＭ−１発現を阻害する能力について検査し
た。１μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでのＡ５
４９細胞の処理により、配列特異的な様式で、ＩＬ−１
β、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γ−誘導化ＩＣＡＭ−
１発現が阻害された。これらのアンチセンスオリゴヌク
レオチドはＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α−誘導化ＩＣＡ
Ｍ−１発現を同程度阻害したが、ＩＦＮ−γ−誘導化Ｉ
ＣＡＭ−１発現はアンチセンス阻害に対してより大きな
感受性を示した。対照オリゴヌクレオチドであるＩＳＩ
Ｓ１８２１は、以下に示すようにＩＬ−１βもしくは
ＴＮＦ−α−誘導化ＩＣＡＭ−１発現を有意には阻害せ
ず、そしてＩＦＮ−γ−誘導化ＩＣＡＭ−１発現を若干
阻害した。

【００７５】

【表３】アンチセンスオリゴヌクレオチド（％対照発現）サイトカイン ISIS 1570 ISIS 1939 ISIS 1821 ３ U/ml ＩＬ−１β 56.6 ± 2.9 38.1 ± 3.2 95 ± 6.6 １ ng/ml ＴＮＦ−α 58.1 ± 0.9 37.6 ± 4.1 103.5 ± 8.2 100 U/ml ガンマ-ＩＦＮ 38.9 ± 3.0 18.3 ± 7.0 83.0 ± 3.5

【００７６】実施例７アンチセンス効果はセンス鎖対照により打ち消されるオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１５７０およびＩＳＩＳ
１９３９によるＩＣＡＭ−１発現のアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド阻害は、それら各々のセンス鎖を有する
オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成によりもとに戻
すことができた。単独で適用させた場合には、ＩＳＩＳ
１５７０についてのホスホロチオエートセンス鎖（Ｉ
ＳＩＳ１５７５）はわずかながらＩＬ−１β−誘導化
ＩＣＡＭ−１発現を亢進させた。細胞に添加する前に等
モル濃度でＩＳＩＳ１５７０とＩＳＩＳ１５７５と
を混合させた場合には、ＩＳＩＳ１５７０の効果は遮
断された。ＩＳＩＳ１９３９に対する相補鎖（ＩＳＩ
Ｓ２１１５）は、細胞に単独で添加した場合にＩＣＡ
Ｍ−１発現を４６％亢進させた。ＩＳＩＳ１９３９に
ＩＳＩＳ２１１５を予めハイブリダイズさせると、Ｉ
ＳＩＳ１９３９によるＩＣＡＭ−１発現の阻害は完全
に遮断された。

【００７７】実施例８オリゴヌクレオチドのＴｍ値（標的からのオリゴヌクレ
オチドの解離温度）の測定アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＩＣＡＭ−１発
現の阻害の効果がそれぞれの標的部位に対するそれぞれ
の親和性に起因するか否かを決定するために、各オリゴ
ヌクレオチドについての熱力学的測定を行った。アンチ
センスオリゴヌクレオチド（ホスホロチオエートとして
合成した）をそれぞれの相補的ＤＮＡ配列（ホスホジエ
ステルとして合成した）にハイブリダイズさせた。温度
に対する吸光度の曲線を、１００ｍＭのＮａ⁺、１０ｍ
Ｍのリン酸、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０、中の
４μＭの各鎖オリゴヌクレオチドで測定した。Ｔｍ値お
よびデュプレックス形成の自由エネルギーを、直線勾配
の基準線を有する２状態モデルにデータを適合させるこ
とから取得した（Ｐｅｔｅｒｓｈｅｉｍ、ＭおよびＤ．
Ｈ．Ｔｕｒｎｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９８
３、２２、２５６−２６３）。結果は少なくとも３つの
実験値の平均値である。

【００７８】アンチセンスオリゴヌクレオチをそれぞれ
の相補的ＤＮＡ配列（ホスホジエステルとして合成し
た）とハイブリダイズさせた場合、ＩＳＩＳ１９４０
を例外とする全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドは
少なくとも５０℃のＴｍ値を示した。従って全てのオリ
ゴヌクレオチドは、標的配列が露出されている場合に
は、標的であるＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡにハイブリダイ
ズすることが可能であるはずである。驚くべきことに、
アンチセンスオリゴヌクレオチドの効力は、Ｔｍあるい
はΔＧ゜₃₇゜のいずれにも直接は相関していなかった。
最大生物活性を示すオリゴヌレオチドであるＩＳＩＳ
１９３９は、他のオリゴヌクレオチドの大半のものが示
すものと比較してより低いＴｍ値を示した。従って、ハ
イブリッド形成親和性は生物活性を確かめるには不十分
なものである。

【００７９】実施例９ＩＣＡＭ−１発現のアンチセンス阻害におけるオリゴヌ
クレオチド長の影響アンチセンス活性についてのオリゴヌクレオチド長の影
響を、ＩＳＩＳ１５７０（ＩＳＩＳ２１６５、２１
７３、２１４９、２１６３、および２１６4）、ならび
にＩＳＩＳ１９３９（ＩＳＩＳ２５４０、２５４
４、２５４５、２５４６、２５４７、および２５４８）
の先端切断変異物を用いて検査した。アンチセンス活性
は概して、オリゴヌクレオチド長が減少するに従って減
少した。１６塩基分の長さであるオリゴヌクレオチドは
１８塩基分のオリゴヌクレオチドと比較して若干低い活
性を示した。１４塩基分の長さであるオリゴヌクレオチ
ドは有意に低い活性を示し、そして１２もしくは１０塩
基分の長さのオリゴヌクレオチドは弱い活性を示すに過
ぎなかった。オリゴヌクレオチド長とＴｍ値とアンチセ
ンス活性との関連性の検査により、１４塩基分と１６塩
基分の長さとの間に激しい変化が生じる一方で、Ｔｍ値
は長さと共に直線的に増加することが示される（図２
０）。

【００８０】実施例１０ＩＣＡＭ−１のアンチセンス阻害の特異性ＩＣＡＭ−１についてのアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドＩＳＩＳ１５７０およびＩＳＩＳ１９３９の特異
性を、³⁵Ｓ−ラベル蛋白質の免疫沈降により評価した。
Ａ５４９細胞は２５ｃｍ²の組織培養用フラスコ内で密
集するまで増殖させ、そして実施例４に記載のようにア
ンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。この細胞
を、表示されるように、インターロイキン−１βで１４
時間刺激し、メチオニン非含有ＤＭＥＭに１０％の透析
済みウシ胎児血清を添加したもので洗浄し、そして１０
％の透析済みウシ胎児血清、１μＭのオリゴヌクレオチ
ド、および表示されるインターロイキン−１βを含むメ
チオニン非含有培地中で１時間インキュベートした。³⁵
Ｓ−メチオニン／システイン混合物（Ｔｒａｎ³⁵Ｓ−ラ
ベル、ＩＣＮ社、ＣｏｓｔａＭｅｓａ、ＣＡ、から購
入）を１００μＣｉ／ｍｌの活性になるように細胞に添
加し、そしてその細胞を更に２時間インキュベートし
た。細胞性蛋白質は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ
８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．０％のＮＰ−４
０、０．５％のデオキシコール酸塩、および２ｍＭのＥ
ＤＴＡ（ウエル当たり０．５ｍｌ）を用いて、４℃にお
いて３０分間インキュベートした。１８，０００×ｇに
おける２０分間の遠心処理により抽出物の濁りを除い
た。この上清を２００μｌのプロテインＧ−セファロー
スビーズ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａ
ｂｓ社、ＢｅｔｈｅｓｄａＭＤ）に４℃において２時
間予備吸着させ、等量に分割し、そして５μｇのＩＣＡ
Ｍ−１モノクローナル抗体（ＡＭＡＣＩｎｃ．社、Ｗ
ｅｓｔｂｒｏｏｋＭＥ、から購入した）、あるいはＨ
ＬＡ−Ａ，Ｂ抗体（Ｗ６／３２、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙ
ｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ、ＭＤ、から取得したマウスハイブリドーマ
細胞から産生させた）のいずれかと共に、４℃において
１５時間インキュベートした。プロテインＧ−セファロ
ースの５０％懸濁液（ｖ／ｖ）の２００μｌと共に４℃
において２時間インキュベートすることにより免疫複合
体を捕獲し、溶菌用緩衝液で５回洗浄し、そしてＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル上で分離させた。蛋白質はオ
ートラジオグラフィーにより検出した。

【００８１】５単位／ｍｌのインターロイキン−１βで
のＡ５４９細胞の処理により、二重線として移動する９
５−１００ｋＤａの蛋白質が合成されることが示され、
そしてこの蛋白質はＩＣＡＭ−１に対するモノクローナ
ル抗体により免疫沈降した。二重線としての見かけは、
ＩＣＡＭ−１の異なるグリコシル化形態に起因するもの
と思われる。１μＭの濃度におけるアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドＩＳＩＳ１５７０での細胞の予備処理によ
りＩＣＡＭ−１合成は約５０％減少し、一方、１μＭの
ＩＳＩＳ１９３９によってはＩＣＡＭ−１の合成はほ
ぼ基準線にまで減少した。ＩＣＡＭ−１のＥＬＩＳＡア
ッセイ（実施例１および５）においては不活性を示すア
ンチセンスオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１９４０は、
ＩＣＡＭ−１合成を有意に減少させなかった。ＩＣＡＭ
−１標的とハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴヌ
クレオチドの内のいずれのものもＨＬＡ−Ａ，Ｂ合成に
おける論証可能な効果を持たず、このことによりＩＣＡ
Ｍ−１に対するこれらオリゴヌクレオチドの特異性が示
された。その上、ＩＣＡＭ−１抗体およびプロテインＧ
−セファロースと非特異的に沈殿する蛋白質は、アンチ
センスオリゴヌクレオチドでの処理により有意な影響を
受けなかった。

【００８２】実施例１１細胞接着アッセイによるＩＣＡＭ−１に対する活性につ
いての追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリ
ーニングヒト臍静脈内皮（ＨＵＶＥＣ）細胞を増殖させ、そして
実施例４におけるようにオリゴヌクレオチドで処理し
た。細胞を、ＩＳＩＳ１９３９、ＩＳＩＳ１９４
０、もしくは対照オリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ
１８２１のいずれかで４時間処理し、その後ＴＮＦ−α
で２０時間刺激した。基になるＨＵＶＥＣはＨＬ−６０
細胞と最小限の結合を示した一方で、ＴＮＦ−刺激化Ｈ
ＵＶＥＣは添加した総細胞の内の１９％に結合した。
０．３μＭのＩＳＩＳ１９３９でのＨＵＶＥＣ単層の
予備処理により、図２１に示されるようにＨＬ−６０細
胞の接着が基準線にまで減少した。対照オリゴヌクレオ
チドであるＩＳＩＳ１８２１およびＩＳＩＳ１９４
０は１９％から９％へと細胞接着のパーセンテージを減
少させた。これらのデータにより、ＩＣＡＭ−１を標的
とするアンチセンスオリゴヌクレオチドはＴＮＦ−α−
処理済みＨＵＶＥＣへの白血球様細胞株（ＨＬ−６０）
の接着を特異的に減少させることできるということが示
される。

【００８３】実施例１２ＥＬＡＭ−１遺伝子発現に対する活性についてのアンチ
センスオリゴヌクレオチドのＥＬＩＳＡスクリーニングヒトの初代臍静脈内皮（ＨＵＶＥＣ）細胞（第二継代か
ら第五継代までのもの）を９６−ウエルプレートにプレ
ート培養し、そして密集させた。細胞をＯｐｔｉ−ＭＥ
Ｍ（ＧＩＢＣＯ社、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄＮＹ）
で３回洗浄した。細胞を、１０μｇ／ｍｌのＤＯＴＭＡ
溶液（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｓ
社、ＢｅｔｈｅｓｄａＭＤ）を含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ
中で希釈した増加濃度のオリゴヌクレオチドで、３７℃
において４時間処理した。培地を除去し、そしてＥＧＭ
−ＵＶ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社、ＳａｎＤｉｅｇｏ
ＣＡ）にオリゴヌクレオチドを添加したものと交換し
た。腫瘍壊死因子αをこの培地に添加し（２．５ｎｇ／
ｍｌ）、そしてこの細胞を更に４時間、３７℃において
インキュベートした。

【００８４】ＥＬＡＭ−１発現はＥＬＩＳＡにより検出
した。細胞を、３７℃に予め暖めたダルベッコリン酸緩
衝化食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）で３回洗浄した。細胞を４℃
において２０分間、９５％エタノールで固定化させ、Ｄ
−ＰＢＳで３回洗浄し、そしてＤ−ＰＢＳ中の２％ＢＳ
Ａで遮断した。細胞を、２％ＢＳＡを含むＤ−ＰＢＳ中
で０．５μｇ／ｍｌに希釈したＥＬＡＭ−１モノクロー
ナル抗体ＢＢＡ−１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社、Ｍｉ
ｎｎｅａｐｏｌｉｓＭＮ）と共にインキュベートし
た。細胞は、実施例１において示すように、Ｄ−ＰＢＳ
で３回洗浄し、そして結合しているＥＬＡＭ−１抗体を
ビオチニル化ヤギ抗−マウス二次抗体を用い、次にはβ
−ガラクトシダーゼ−コンジュゲートストレプトアビジ
ンを用いて検出した。

【００８５】ＥＬＡＭ−１ｃＤＮＡの１１の異なる領
域を標的とするアンチセンスホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチド、ならびにＩＣＡＭ−１を標的とする２つ
のオリゴヌクレオチド（対照として）の活性を、ＥＬＡ
Ｍ−１のＥＬＩＳＡを使用して決定した。オリゴヌクレ
オチドおよび標的を表IIに示す。

【００８６】

【表４】表II ヒトＥＬＡＭ−１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ番号配列番号標的領域修飾１９２６２８ＡＵＧコドン(143−164) Ｐ＝Ｓ２６７０２９３′−非翻訳領域（3718−3737）Ｐ＝Ｓ２６７３３０３′−非翻訳領域（2657−2677）Ｐ＝Ｓ２６７４３１３′−非翻訳領域（2617−2637）Ｐ＝Ｓ２６７８３２３′−非翻訳領域（3558−3577）Ｐ＝Ｓ２６７９３３５′−非翻訳領域（41−60）Ｐ＝Ｓ２６８０３４３′−非翻訳領域（3715−3729）Ｐ＝Ｓ２６８３３５ＡＵＧコドン(143−163) Ｐ＝Ｓ２６８６３６ＡＵＧコドン(149−169) Ｐ＝Ｓ２６８７３７５′−非翻訳領域（18−37）Ｐ＝Ｓ２６９３３８３′−非翻訳領域（2760−2788）Ｐ＝Ｓ２６９４３９３′−非翻訳領域（2934−2954）Ｐ＝Ｓ

【００８７】ＩＣＡＭ−１を標的とするアンチセンスオ
リゴヌクレオチドに関して観察されたものと比較すると
（実施例５）、ＥＬＡＭ−１活性の最も有効なオリゴヌ
クレオチドモジュレーター（ＩＳＩＳ２６７９）はＥ
ＬＡＭ−１の５’−非翻訳領域内の特異的配列とハイブ
リダイズ可能であった。ＩＳＩＳ２６７９標的の３塩
基分上流で終了する配列にハイブリダイズしたオリゴヌ
クレオチドＩＳＩＳ２６８７は、有意な活性を示さな
かった（図２２）。従ってＩＳＩＳ２６７９は、アン
チセンスオリゴヌクレオチドでの阻害に特有の感受性を
示すＥＬＡＭ−１ｍＲＮＡの独特の部位にハイブリダイ
ズする。アンチセンスオリゴヌクレオチドでの阻害に対
するこの部位の感受性は、ＲＮＡ二次構造による予測も
しくは文献上の情報を基にしては予測不可能なものであ
った。

【００８８】実施例１３ＥＬＡＭ−１遺伝子発現に対する活性についての追加の
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＥＬＩＳＡスクリー
ニング１８のアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドによるＥＬＡＭ−１発現の阻害は、実施例１２にお
いて記載されるＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定した。
ＥＬＡＭ−１ｍＲＮＡ上のこれらのオリゴヌクレオチ
ドの標的部位を、図２３に示す。ＥＬＡＭ−１に対する
各オリゴヌクレオチドの配列および活性を表IIIに示
す。星印（＊）により示されるオリゴヌクレオチドは約
５０ｎＭもしくはそれを下回るＩＣ５０値を有し、そし
てそのようなものであることが好ましい。ＩＣ５０値
は、ＥＬＡＭ−１発現の５０％阻害をもたらすオリゴヌ
クレオチドの用量を示す。

【００８９】

【表５】

【００９０】３−非翻訳領域を標的とする追加のオリゴ
ヌクレオチド（ＩＳＩＳ４７２８）はＥＬＡＭ発現を
阻害しなかった。

【００９１】実施例１４ＶＣＡＭ−１遺伝子発現に対する活性についてのアンチ
センスオリゴヌクレオチドのＥＬＩＳＡスクリーニング１５のアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドによるＶＣＡＭ−１発現の阻害は、細胞をＴＮＦ−
αで１６時間刺激させ、そしてＶＣＡＭ−１発現を０．
５μｇ／ｍｌで用いるＶＣＡＭ−１特異的モノクローナ
ル抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌ
ｉｓ、ＭＮ）により検出したことを除いては、実施例１
２において記載されるものとほぼ同様のＥＬＩＳＡアッ
セイを使用して決定した。ＶＣＡＭ−１ｍＲＮＡ上の
これらオリゴヌクレオチドの標的部位を図２４に示す。
ＶＣＡＭ−１に対する各オリゴヌクレオチドの配列およ
び活性を表IVに示す。星印（＊）により示されるオリゴ
ヌクレオチドは約５０ｎＭもしくはそれを下回るＩＣ５
０値を有し、そしてそのようなものであることが好まし
い。ＩＣ５０値は、ＶＣＡＭ−１発現の５０％阻害をも
たらすオリゴヌクレオチドの用量を示す。

【００９２】

【表６】

【００９３】実施例１５Ｃ８１６１ヒト黒色腫細胞におけるＩＣＡＭ−１発現：
ヒト黒色腫細胞株Ｃ８１６１（Ｄｒ．ＤａｎＷｅｌｃ
ｈ、ＨｅｒｓｈｅｙＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ、
からの贈与）は、再発性悪性黒色腫を患う患者からの腹
壁転移に由来する。これらの細胞は、無胸腺ヌードマウ
ス内への皮下、皮内、および静脈内注射後に、肺、皮下
組織、脾臓、肝臓、および局所リンパ節における重複転
移を形成する。細胞は１０％のウシ胎児血清を含むＤＭ
Ａ−Ｆ１２培地中で増殖させ、そして２ｍＭのＥＤＴＡ
を用いて継代した。

【００９４】Ｃ８１６１細胞のＴＮＦ−αへの露出によ
り、ＩＣＡＭ−１の細胞表面発現の６倍の増加、および
これらの細胞におけるＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡレベルの
増加がもたらされた。細胞表面におけるＩＣＡＭ−１発
現はＥＬＩＳＡにより測定した。細胞を、３７℃におい
て４時間、１５μｇ／ｍｌのリポフェクチン（Ｌｉｐｏ
ｆｅｃｔｉｎ）の存在下、増加濃度のアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドで処理した。ＩＣＡＭ−１発現は、５ｎ
ｇ／ｍｌのＴＮＦ−αと１６時間インキュベーションす
ることにより誘導させた。細胞をＤＰＢＳ中で３回洗浄
し、そして２％ホルムアルデヒド中で２０分間固定させ
た。細胞をＤＰＢＳで洗浄し、３７℃において１時間２
％ＢＳＡで遮断し、そしてＩＣＡＭ−１モノクローナル
抗体８４Ｈ１０（ＡＭＡＣ、Ｉｎｃ．社、Ｗｅｓｔｂｒ
ｏｏｋｅ、ＭＥ）と共にインキュベートした。結合した
抗体濃度の検出は、ビオチニル化ヤギ抗−マウスＩｇＧ
とのインキュベーションを行い、そしてその後にβ−ガ
ラクトシダーゼ−コンジュゲートストレプトアビジンと
のインキュベーションを行い、そしてクロロフェノール
レッド−β−Ｄ−ガククトピラノシドでの現像を行い、
そしてその後に５７５ｎｍでの吸光度による定量化を行
うことにより決定した。ＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡレベル
は、ノザンブロット分析により測定した。

【００９５】実施例１６Ｃ８１６１ヒト黒色腫細胞におけるＩＣＡＭ−１発現の
オリゴヌクレオチド阻害：図２５に示すように、ＩＣＡ
Ｍ−１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドＩ
ＳＩＳ１５７０（配列番号１）、ＩＳＩＳ１９３９
（配列番号１５）、およびＩＳＩＳ２３０２（配列番
号２２）は、ＩＣＡＭ−１の細胞表面発現を減少させた
（実施例１６におけるようにＥＬＩＳＡにより検出）。
５−リポオキシゲナーゼに相補的な陰性対照オリゴヌク
レオチドＩＳＩＳ１８２２は、ＩＣＡＭ−１発現に影
響を及ぼさなかった。このデータは、対照の活性に対す
るパーセンテージとして示され、以下のように算出し
た。

【００９６】（オリゴヌクレオチド処理済みサイトカイ
ン誘導化細胞についてのＩＣＡＭ−１発現）−（基準的
ＩＣＡＭ−１発現）／（ＩＣＡＭ−１サイトカイン誘導
化発現）−（基準的ＩＣＡＭ−１発現）×１００ＩＳＩＳ１９３９（配列番号１５）およびＩＳＩＳ
２３０２（配列番号２２）はＩＣＡＭ−１ｍＲＡＮレ
ベルを顕著に減少させたが（ノザンブロット分析により
検出）、ＩＳＩＳ−１５７０（配列番号１）はＩＣＡＭ
−１ｍＲＮＡレベルをわずかに減少させるのみであっ
た。

【００９７】実施例１７実験的転移アッセイ：転移におけるＩＣＡＭ−１の役割
を評価するために、実験的転移アッセイを、無胸腺ヌー
ドマウスの側方尾静脈内への１×１０⁵のＣ８１６１細
胞の注入により実施した。サイトカインであるＴＮＦ−
αおよびインターフェロンγでのＣ８１６１細胞の処理
によっては、ヌードマウス内への細胞の注入を行った際
に肺転移数の増大がもたらされることが既に示されてい
る［Ｍｉｌｌｅｒ、Ｄ．Ｅ．およびＷｅｌｃｈ、Ｄ．
Ｒ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａ
ｎｃｅｒＲｅｓ．１３：３５３］。

【００９８】４週間後にマウスを屠殺し、器官をブイン
（Ｂｏｕｉｎ’ｓ）の固定液中で固定し、そして肺の転
移病変を解剖顕微鏡を使用して計数した。４週令の雌の
無胸腺ヌードマウス（ＨａｒｌａｎＳｐｒａｇｕｅ
Ｄａｗａｌｅｙ種）を使用した。動物はＮＩＨの基準に
基づいて維持した。各４−８匹の群を実験的転移アッセ
イにおいて検査した。

【００９９】実施例１８アンチセンスオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１５７０お
よびＩＳＩＳ２３０２は、Ｃ８１６１細胞の転移能を
減少させる：ＩＣＡＭ−１に相補的なアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドＩＳＩＳ１５７０およびＩＳＩＳ２
３０２でのＣ８１６１細胞の処理は、陽イオン性脂質で
あるリポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（Ｇｉｂ
ｃｏ／ＢＲＬ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）の
存在下において実施した。アンチセンスオリゴヌクレオ
チドは実施例３において記載のように合成した。細胞を
１０⁶細胞／ｍｌで６０ｍｍの組織培養用ディッシュに
撒き、そして３７℃で３日間インキュベートし、Ｏｐｔ
ｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社）で３度洗浄し、そ
して１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を各ウエルに添
加した。０．５μＭのオリゴヌクレオチドと１５μｇ／
ｍｌのリポフェクチンとを室温において１５分間混ぜ合
わせた。２５μｌのオリゴヌクレオチド−リポフェクチ
ン混合物を適切なディッシュに添加し、そして３７℃に
おいて４時間インキュベートした。オリゴヌクレオチド
−リポフェクチン混合物を除去し、そして１０％のウシ
胎児血清を含むＤＭＥ−Ｆ１２培地と入れ替えた。４時
間後に５００Ｕ／ｍｌのＴＮＦ−αを適切なウエルに添
加し、そして１８時間インキュベートし、この１８時間
目の時点で細胞をプレートから除去し、計数を行い、そ
して無胸腺ヌードマウスに注入した。

【０１００】ＩＳＩＳ１５７０（配列番号１）もしく
はＩＳＩＳ２３０２（配列番号２２でのＣ８１６１細
胞の処理によってこれらの細胞の転移能は減少し、そし
てＴＮＦ−α処理によりもたらされたＣ８１６１の転移
能増加はなくなった。データを表Vに示す。

【０１０１】

【表７】表V ヒト黒色腫細胞株Ｃ８１６１の実験的転移におけるＩＣＡＭ−１へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果治療マウスあたりの肺転移数（平均 ± Ｓ．Ｅ．Ｍ．）リポフェクチン単独６４ ± １３リポフェクチン + TNF-α ８１ ± ８ ISIS-1570 + リポフェクチン３８ ± １５ ISIS-2302 + リポフェクチン２３ ± ６ ISIS-1570 + リポフェクチン + TNF-α ４９ ± ６ ISIS-2302 + リポフェクチン + TNF-α ３１ ± ８

【０１０２】実施例１９ＩＣＡＭ−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
を検査するためのマウスモデル：細胞間接着分子により
媒介されるものと思われる多くの症状はヒトにおける研
究へ持ち込むことが不可能である。一例では、同種異系
移植片拒絶はＩＣＡＭ−１の妨害を行うことにより改善
されるものと思われる症状であるが、これはヒトの移植
患者よりもむしろ動物において評価すべきものであるこ
とは明らかである。他のこのような例は炎症性腸疾患で
あり、そして更に別のものは好中球遊走（遊出）であ
る。しかしながらこれらの症状は、本明細書において用
いられるマウスモデルのような動物モデルにおいて検査
することができる。

【０１０３】マウス細胞におけるＩＣＡＭ−１発現の阻
害のためのオリゴヌクレオチド配列を同定した。マウス
ＩＣＡＭ−１は、ヒトのＩＣＡＭ−１配列と約５０％の
相同性を有しており、そのためヒトのＩＣＡＭ−１を標
的としたオリゴヌクレオチドの評定を行って得られた情
報を使用して、マウスのＩＣＡＭ−１ｍＲＮＡ配列を
標的とする一連のオリゴヌクレオチドを設計および合成
した。免疫沈降アッセイを使用してこれらのオリゴヌク
レオチドについての活性のスクリーニングを行った。

【０１０４】マウスＤＣＥＫ−ＩＣＡＭ−１細胞（Ｄ
ｒ．ＡｄｒｉｅｎｎｅＢｒｉａｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙｏｆＣａｌｉｆｏｒｎｉａａｔＳａｎＤ
ｉｅｇｏ、より贈与された）を、３７℃において４時
間、２０μｇ／ｍｌのＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ溶液の存在
下において１μＭのオリゴヌクレオチドで処理した。培
地を１０％の透析済みウシ胎児血清および１μＭのアン
チセンスオリゴヌクレオチドを添加したメチオニン非含
有培地と入れ替えた。細胞をメチオニン非含有培地中で
１時間インキュベートし、そしてその後１００μＣｉ／
ｍｌの³⁵Ｓ−ラベルメチオニン／システイン混合物をそ
の細胞に添加した。細胞を更に２時間インキュベート
し、ＰＢＳで４回洗浄し、そして２０ｍＭのトリス、ｐ
Ｈ７．２、２０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％
のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１ｍＭのロイペプチ
ン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、および１ｍＭのＰ
ＭＳＦを含む緩衝液で抽出した。ＩＣＡＭ−１は、マウ
ス−特異的ＩＣＡＭ−１抗体（ＹＮ１／１．７．４）と
共にインキュベートし、その後にプロテインＧ−セファ
ロースにかけることにより抽出物から免疫沈降させた。
この免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、そし
てオートラジオグラフィーにかけた。マウスＩＣＡＭ−
１のＡＵＧコドンを標的とするホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドＩＳＩＳ３０６６および３０６９は、
ＩＣＡＭ−１合成を各々４８％および６３％阻害した一
方で、マウスＩＣＡＭＡ−１ｍＲＮＡの３’−未翻訳
領域における配列を標的とするオリゴヌクレオチドＩＳ
ＩＳ３０６５およびＩＳＩＳ３０８２はＩＣＡＭ−
１合成を各々４７％および９７％阻害した。マウスＩＣ
ＡＭ−１に対して最も活性の高いアンチセンスオリゴヌ
クレオチドは３’−未翻訳領域を標的としていた。ＩＳ
ＩＳ３０８２についてこれらの結果に基づく更に詳細
な評定を行ったところ、この２０−量体ホスホロチオエ
ートオリゴヌクレオチドは配列（５’から３’へ） TGC ATC CCC CAG GCC ACC AT （配列番号８３）を含んでいた。

【０１０５】実施例２０ＩＣＡＭ−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
はマウスモデル系において炎症性腸疾患を軽減する炎症性腸疾患（ＩＢＤ）についてのマウスモデルが最近
開発された。Ｏｋａｙａｓｕｅｔａｌ．、（１９９
０）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ９８：６９
４−７０２。マウスへの硫酸デキストランの投与によ
り、全ての詳細においてヒトのＩＢＤに類似する結腸炎
が誘導される。硫酸デキストラン誘導化ＩＢＤおよびヒ
トＩＢＤについてはその後に、組織学的レベルにおける
より綿密な比較が行われ、そしてこのマウスモデルは極
度に再現性が良く、そして信頼できるモデルであること
が見いだされた。これを、本明細書中においては、マウ
スＩＣＡＭ−１の３’−未翻訳領域に相補的な２０−塩
基ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド
ＩＳＩＳ３０８２の効果を検査するのに用いる。

【０１０６】体重約２５−３０グラムである雌のスイス
ウエブスター種（ＳｗｉｓｓＷｅｂｓｔｅｒ）マウス
（８週令）を標準的な条件下に維持する。マウスは、実
験手順の開始前少なくとも５日間は順化させる。マウス
に、飲料水中に含まれる５％の硫酸デキストランを５日
間与える（自由接種可能）。それに付随して、薬剤学的
担体中に含まれるＩＳＩＳ３０８２、担体単独（陰性
対照）、もしくはＴＧＦ−β（マウスにおける硫酸デキ
ストラン介在性結腸炎を予防することが知られている）
を投与する。ＩＳＩＳ３０８２は５日間毎日の１ｍｇ
／ｋｇもしくは１０ｍｇ／ｋｇの皮下注射として投与し
た。ＴＧＦ−βは、１μｇ／マウスで結腸内投与した。
１ｍｇ／ｋｇにおいては、このオリゴヌクレオチドは、
硫酸デキストラン誘導性結腸炎の予防においてＴＧＦ−
βと同様の効果を示した。

【０１０７】マウスは６日目に屠殺し、そして結腸を組
織学的評定に供した。屠殺するまでの疾患作用について
は、体重変化に関してマウスを観察することおよび結腸
炎の兆候に関して便を観察することによる記録を行っ
た。マウスの体重は毎日計測した。便は粘稠度の変化に
ついて、ならびに潜在性もしくは総体的出血の存在につ
いて毎日観察した。集計システムを使用して疾患作用係
数を開発し、それにより体重減少、便の粘稠度、および
出血の存在を０から３までのスケールで等級付けを行い
（０は正常であり、そして３は最も重篤な影響であ
る）、そして係数を算出した。疾患作用係数における薬
物誘導性の変化を統計的に分析した。疾患作用係数は概
してＩＢＤと極端に良好な状態で相関することが示され
た。結果を図２６に示す。１ｍｇ／ｋｇにおいては、こ
のオリゴヌクレオチドは疾患係数を４０％減少させた。

【０１０８】実施例２１ＩＣＡＭ−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
はマウス異所性心臓移植モデルにおける生存率を増加さ
せる同種異系移植片拒絶の予防におけるＩＣＡＭ−１アンチ
センスオリゴヌクレオチドの治療効果を決定するため
に、マウスＩＣＡＭ−１特異的オリゴヌクレオチドＩＳ
ＩＳ３０８２を、マウスの血管化異所性心臓移植モデ
ルにおける作用について検査した。Ｂａｌｂ／ｃマウス
からの心臓を、Ｉｓｏｂｅｅｔａｌ．［（１９９
１）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ８４：１２４６−１２
５５］により主に記載される初代血管化移植片としてＣ
３Ｈマウスの腹腔内に移植した。オリゴヌクレオチドを
７日用アルツェットポンプ（７−ｄａｙＡｌｚｅｔ
ｐｕｍｐ）を介する継続的静脈内投与により投与した。
未治療マウスについての平均生存期間は９．２±０．８
日（８、９、９、９、１０、１０日）であった。７日間
５ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ３０８２での治療を行ったマ
ウスは、１４．３±４．６日（１１、１２、１３、２１
日）にまで平均生存期間が伸びた。

【０１０９】実施例２２ＩＣＡＭ−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
は白血球遊走を減少させる組織および器官の白血球遊出は炎症性過程の主要な側面
であり、そして炎症によりもたらされる組織破壊に寄与
している。白血球遊走におけるＩＳＩＳ３０８２の効
果を、カラゲニンに浸したスポンジを皮下移植するマウ
スモデルを用いて調査した。カラゲニンは白血球遊走お
よび水腫を刺激誘導する。炎症性滲出液中の白血球遊走
についてのオリゴヌクレオチドの効果を、移植したスポ
ンジに遊出する白血球の定量により評定する。４時間の
絶食の後に４０匹のマウスを、各５匹のマウスを含む８
つの群へと無作為抽出によりに割り振った。各マウスに
Ｍｅｔｏｆａｎｅ（商標）での麻酔を施し、そして１ｍ
ｌの２０ｍｇ／ｍｌカラゲニン溶液を染み込ませたポリ
エステルスポンジを皮下移植した。群１には、スポンジ
移植の前４時間目に１０ｍｌ／ｋｇでの食塩水を静脈投
与し、そしてこれを賦形剤対照として用いた。群２に
は、３ｍｇ／ｋｇで２０ｍｌ／ｋｇの容積のインドメタ
シン（陽性対照）を、手術直後、６−８時間後に再度、
そして移植後２１時間目にさらに再び経口投与した。群
３には、ＩＳＩＳ３０８２を５ｍｇ／ｋｇでスポンジ
移植の３時間前に静脈投与した。群４には、ＩＳＩＳ
３０８２を５ｍｇ／ｋｇでスポンジ移植直後に静脈投与
した。群５、６、７、および８には、ＩＳＩＳ３０８
２を５ｍｇ／ｋｇでスポンジ移植後各２、４、８、およ
び１８時間目に投与した。移植後２４時間目にスポンジ
を取り出し、ＥＤＴＡおよび食塩水（５ｍｌ）中に浸
し、そして絞って乾かした。スポンジ滲出混合物中の白
血球の総数を決定した。

【０１１０】賦形剤対照群との比較を行うと、３ｍｇ／
ｋｇのインドメタシンの経口投与により平均白血球計測
数が７９％減少した。

【０１１１】スポンジ移植の４時間前に５ｍｇ／ｋｇの
ＩＳＩＳ３０８２を投与した後には、平均白血球計測
数の４２％の減少が観察された（群３）。スポンジ移植
直後に５ｍｇ／ｍｌのＩＳＩＳ３０８２を投与した後
には、平均白血球計測数の４７％の減少が観察された
（群４）。全ての動物は研究過程の間中正常であるよう
に思われた。

【０１１２】

【配列表】

【０１１３】配列番号 1: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 18 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 1: TGGGAGCCAT AGCGAGGC 18

【０１１４】配列番号 2: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 2: GAGGAGCTCA GCGTCGACTG 20

【０１１５】配列番号 3: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 21 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 3: GACACTCAAT AAATAGCTGG T 21

【０１１６】配列番号 4: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 18 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 4: GAGGCTGAGG TGGGAGGA 18

【０１１７】配列番号 5: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 18 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 5: CGATGGGCAG TGGGAAAG 18

【０１１８】配列番号 6: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 6: GGGCGCGTGA TCCTTATAGC 20

【０１１９】配列番号 7: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 7: CATAGCGAGG CTGAGGTTGC 20

【０１２０】配列番号 8: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 8: CGGGGGCTGC TGGGAGCCAT 20

【０１２１】配列番号 9: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 9: AGAGCCCCGA GCAGGACCAG 20

【０１２２】配列番号 10: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 10: TGCCCATCAG GGCAGTTTGA 20

【０１２３】配列番号 11: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 11: GGTCACACTG ACTGAGGCCT 20

【０１２４】配列番号 12: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 12: CTCGCGGGTG ACCTCCCCTT 20

【０１２５】配列番号 13: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 13: TCAGGGAGGC GTGGCTTGTG 20

【０１２６】配列番号 14: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 14: CCTGTCCCGG GATAGGTTC A 20

【０１２７】配列番号 15: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 15: CCCCCACCAC TTCCCCTCTC 20

【０１２８】配列番号 16: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 16: TTGAGAAAGC TTTATTAACT 20

【０１２９】配列番号 17: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 14 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 17: AGCCATAGCG AGGC 14

【０１３０】配列番号 18: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 12 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 18: CCATAGCGAG GC 12

【０１３１】配列番号 19: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 10 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 19: ATAGCGAGGC 10

【０１３２】配列番号 20: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 16 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 20: TGGGAGCCAT AGCGAG 16

【０１３３】配列番号 21: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 16 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 21: GGAGCCATAG CGAGGC 16

【０１３４】配列番号 22: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 22: GCCCAAGCTG GCATCCGTCA 20

【０１３５】配列番号 23: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 23: TCTGTAAGTC TGTGGGCCTC 20

【０１３６】配列番号 24: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 24: AGTCTTGCTC CTTCCTCTTG 20

【０１３７】配列番号 25: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 25: CTCATCAGGC TAGACTTTAA 20

【０１３８】配列番号 26: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 26: TGTCCTCATG GTGGGGCTAT 20

【０１３９】配列番号 27: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 22 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 27: TCTGAGTAGC AGAGGAGCTC GA 22

【０１４０】配列番号 28: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 22 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 28: CAATCATGAC TTCAAGAGTT CT 22

【０１４１】配列番号 29: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 29: ACCACACTGG TATTTCACAC 20

【０１４２】配列番号 30: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 21 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 30: GTATGGAAGA TTATAATATA T 21

【０１４３】配列番号 31: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 21 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 31: CACAATCCTT AAGAACTCTT T 21

【０１４４】配列番号 32: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 32: ACCTCTGCTG TTCTGATCCT 20

【０１４５】配列番号 33: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 33: CTGCTGCCTC TGTCTCAGGT 20

【０１４６】配列番号 34: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 15 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 34: GGTATTTGAC ACAGC 15

【０１４７】配列番号 35: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 21 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 35: AATCATGACT TCAAGAGTTC T 21

【０１４８】配列番号 36: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 21 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 36: TGAAGCAATC ATGACTTCAA G 21

【０１４９】配列番号 37: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 21 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 37: TATAGGAGTT TTGATGTGAA 21

【０１５０】配列番号 38: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 21 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 38: ACAATGAGGG GGTAATCTAC A 21

【０１５１】配列番号 39: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 21 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 39: GACAATATAC AAACCTTCCA T 21

【０１５２】配列番号 40: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 21 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 40: CCAGGCATTT TAAGTTGCTG T 21

【０１５３】配列番号 41: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 41: CCTGAAGCCA GTGAGGCCCG 20

【０１５４】配列番号 42: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 21 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 42: GATGAGAAAA TAGTGGAACC A 21

【０１５５】配列番号 43: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 19 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 43: CTGAGCAAGA TATCTAGAT 19

【０１５６】配列番号 44: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 19 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 44: CTACACTTTT GATTTCTGT 19

【０１５７】配列番号 45: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 22 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 45: TTGAACATAT CAAGCATTAG CT 22

【０１５８】配列番号 46: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 22 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 46: TTTACATATG TACAAATTAT GT 22

【０１５９】配列番号 47: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 22 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 47: AATTATCACT TTACTATACA AA 22

【０１６０】配列番号 48: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 21 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 48: AGGGCTGACC AAGACGGTTG T 21

【０１６１】配列番号 49: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 49: CCATCTTCCC AGGCATTTTA 20

【０１６２】配列番号 50: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 50: AACCCAGTGC TCCCTTTGCT 20

【０１６３】配列番号 51: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 51: GGCCACATTG GGAAAGTTGC 20

【０１６４】配列番号 52: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 52: GAAGTCAGCC AAGAACAGCT 20

【０１６５】配列番号 53: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 53: ACAGGATCTC TCAGGTGGGT 20

【０１６６】配列番号 54: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 54: CCAAAGTGAG AGCTGAGAGA 20

【０１６７】配列番号 55: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 55: CTGATTCAAG GCTTTGGCAG 20

【０１６８】配列番号 56: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 56: TTCCCCAGAT GCACCTGTTT 20

【０１６９】配列番号 57: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 57: GGGCCAGAGA CCCGAGGAGA 20

【０１７０】配列番号 58: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 58: ACGTTTGGCC TCATGGAAGT 20

【０１７１】配列番号 59: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 59: GGAATGCAAA GCACATCCAT 20

【０１７２】配列番号 60: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 60: CGATGCAGAT ACCGCGGAGT 20

【０１７３】配列番号 61: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 61: GCCTGGGAGG GTATTCAGCT 20

【０１７４】配列番号 62: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 62: CCTGTGTGTG CCTGGGAGGG 20

【０１７５】配列番号 63: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 63: GGCATTTTAA GTTGCTGTCG 20

【０１７６】配列番号 64: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 64: CAGCCTGCCT TACTGTGGGC 20

【０１７７】配列番号 65: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 21 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 65: CTTGAACAAT TAATTCCACC T 21

【０１７８】配列番号 66: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 21 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 66: TTACCATTGA CATAAAGTGT T 21

【０１７９】配列番号 67: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 67: CTGTGTCTCC TGTCTCCGCT 20

【０１８０】配列番号 68: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 68: GTCTTTGTTG TTTTCTCTTCC 20

【０１８１】配列番号 69: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 69: TGAACATATC AAGCATTAGC 20

【０１８２】配列番号 70: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 70: GCAATCTTGC TATGGCATAA 20

【０１８３】配列番号 71: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 71: CCCGGCATCT TTACAAAACC 20

【０１８４】配列番号 72: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 72: AACATCTCCG TACCATGCCA 20

【０１８５】配列番号 73: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 22 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 73: TCACTGCTGC CTCTGTCTCA GG 22

【０１８６】配列番号 74: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 23 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 74: TGATTCTTTT GAACTTAAAA GGA 23

【０１８７】配列番号 75: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 75: TTAAAGGATG TAAGAAGGCT 20

【０１８８】配列番号 76: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 19 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 76: CATAAGCACA TTTATTGTC 19

【０１８９】配列番号 77: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 77: TTTTGGGAAG CAGTTGTTCA 20

【０１９０】配列番号 78: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 21 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 78: AACTGTGAAG CAATCATGAC T 21

【０１９１】配列番号 79: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 22 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 79: CCTTGAGTGG TGCATTCAAC CT 22

【０１９２】配列番号 80: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 22 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 80: AATGCTTGCT CACACAGGCA TT 22

【０１９３】配列番号 81: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 18 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 81: GCCTCGCTAT GGCTCCCA 18

【０１９４】配列番号 82: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 18 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 82: CATGGCGCGG GCCGCGGG 18

【０１９５】配列番号 83: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 83: TGCATCCCCC AGGCCACCAT 20

【０１９６】配列番号 84: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 84: TCTGAGTAGC AGAGGAGCTC 20

【０１９７】配列番号 85: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: Nucleic Acid (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: Yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 85: TATGTCTCCC CCACCACTTC 20

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ヒトの細胞間接着分子−１（ＩＣＡ
Ｍ−１）のｍＲＮＡ配列である。

【図２】図２は、ヒトの細胞間接着分子−１（ＩＣＡ
Ｍ−１）のｍＲＮＡ配列である。

【図３】図３は、ヒトの細胞間接着分子−１（ＩＣＡ
Ｍ−１）のｍＲＮＡ配列である。

【図４】図４は、ヒトの細胞間接着分子−１（ＩＣＡ
Ｍ−１）のｍＲＮＡ配列である。

【図５】図５は、ヒトの内皮白血球接着分子−１（Ｅ
ＬＡＭ−１）のｍＲＮＡ配列である。

【図６】図６は、ヒトの内皮白血球接着分子−１（Ｅ
ＬＡＭ−１）のｍＲＮＡ配列である。

【図７】図７は、ヒトの内皮白血球接着分子−１（Ｅ
ＬＡＭ−１）のｍＲＮＡ配列である。

【図８】図８は、ヒトの内皮白血球接着分子−１（Ｅ
ＬＡＭ−１）のｍＲＮＡ配列である。

【図９】図９は、ヒトの内皮白血球接着分子−１（Ｅ
ＬＡＭ−１）のｍＲＮＡ配列である。

【図１０】図１０は、ヒトの血管細胞接着分子−１
（ＶＣＡＭ−１）のｍＲＮＡ配列である。

【図１１】図１１は、ヒトの血管細胞接着分子−１
（ＶＣＡＭ−１）のｍＲＮＡ配列である。

【図１２】図１２は、ヒトの血管細胞接着分子−１
（ＶＣＡＭ−１）のｍＲＮＡ配列である。

【図１３】図１３は、ヒトの血管細胞接着分子−１
（ＶＣＡＭ−１）のｍＲＮＡ配列である。

【図１４】図１４は、インターロイキン−１および腫
瘍壊死因子による種々のヒト細胞株の細胞表面における
ＩＣＡＭ−１発現の誘導のグラフ表示である。

【図１５】図１５は、ヒト臍静脈内皮細胞上のＩＣＡ
Ｍ−１発現に対する選択されたアンチセンスオリゴヌク
レオチドの効果のグラフ表示である。

【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、腫瘍壊死因子お
よびインターロイキン−１で刺激したヒト臍静脈内皮細
胞でのＩＣＡＭ−１の発現に対するアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの効果のグラフ表示である。

【図１７】図１７は、ＤＭＳＯでの分化処理を施した
ＨＬ−６０細胞の、対照および腫瘍壊死因子処理を施し
たヒト臍静脈内皮細胞へのＩＣＡＭ−１介在性接着に対
するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果のグラフ表
示である。

【図１８】図１８は、Ａ５４９ヒト肺癌細胞でのＩＣ
ＡＭ−１発現に対する選択されたアンチセンスオリゴヌ
クレオチドの効果のグラフ表示である。

【図１９】図１９は、ヒトの初代ケラチノサイトでの
ＩＣＡＭ−１発現に対する選択されたアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドの効果のグラフ表示である。

【図２０】図２０は、オリゴヌクレオチの鎖長、Ｔｍ
およびＩＣＡＭ−１発現の阻害に対する効果の間の関係
のグラフ表示である。

【図２１】図２１は、ＤＭＳＯでの分化処理を施した
ＨＬ−６０細胞の、対照および腫瘍壊死因子処理を施し
たヒト臍静脈内皮細胞へのＩＣＡＭ−１介在性接着に対
する選択されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果
のグラフ表示である。

【図２２】図２２は、腫瘍壊死因子での処理を施した
ヒト臍静脈内皮細胞でのＥＬＡＭ−１発現に対する選択
されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果のグラフ
表示である。

【図２３】図２３は、ヒトＥＬＡＭ−１ｍＲＮＡの
グラフ表示であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドの
標的部位を示してある。

【図２４】図２４は、ヒトＶＣＡＭ−１ｍＲＮＡの
グラフ表示であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドの
標的部位を示してある。

【図２５】図２５は、ＩＣＡＭ−１に相補的なアンチ
センスオリゴヌクレオチドでの処理後のＣ８１６１ヒト
黒色腫細胞におけるＩＣＡＭ−１発現の阻害を示す線グ
ラフである。

【図２６】図２６は、硫酸デキストラン（ＤＳＳ）に
より誘導した炎症性腸疾患についてのＩＳＩＳ３０８
２の効果を示す棒グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｈ 21/04 Ｃ０７Ｈ 21/04 ＢＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ (72)発明者ミラベリ，クリストファー・ケイアメリカ合衆国マサチューセッツ州 02030，ドーヴァー，パイン・ストリート６ (56)参考文献特表平４−502859（ＪＰ，Ａ) 国際公開92／3139（ＷＯ，Ａ１) Ｓｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．243（1989) ｐ．1160−1164 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】内皮白血球接着分子−１をコードするメ
ッセンジャーＲＮＡのコーディング領域、３’−非翻訳
領域、５’−非翻訳領域またはイントロン／エキソン結
合部位を標的とする、内皮白血球接着分子−１の発現を
調節しうるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
配列番号５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８ま
たは５９を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項２】２０から５０ヌクレオチド単位を有す
る、請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】ヌクレオチドユニット間の連結基の少な
くとも１つがイオウ含有種を含む、請求項１記載のアン
チセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】ヌクレオチドユニット間の連結基の少な
くとも１つがホスホロチオエート部分を含む、請求項１
記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】請求項１記載のアンチセンスオリゴヌク
レオチドおよび薬学的に許容しうる担体を含む、内皮白
血球接着分子−１の発現を調節するための医薬組成物。
【請求項６】インビトロもしくはヒトを除く動物にお
いて、細胞または組織中の内皮白血球接着分子−１の合
成を調節する方法であって、細胞または組織を、請求項
１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させる
ことを含む方法。
【請求項７】アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌク
レオチドユニット間の連結基の少なくとも１つがイオウ
含有種を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌク
レオチドユニット間の連結基の少なくとも１つがホスホ
ロチオエート部分を含む、請求項６記載の方法。
【請求項９】内皮白血球接着分子−１の変化により調
節される疾患を有すると疑われる動物を治療するための
医薬組成物であって、治療上有効量の、請求項１記載の
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に受容し
うる担体を含む医薬組成物。
【請求項１０】アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌ
クレオチドユニット間の連結基の少なくとも１つがイオ
ウ含有種を含む、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌ
クレオチドユニット間の連結基の少なくとも１つがホス
ホロチオエート部分を含む、請求項９記載の組成物。
【請求項１２】転移性状態を有すると疑われる動物に
おいて転移を減少させるための医薬組成物であって、治
療上有効量の、請求項１記載のアンチセンスオリゴヌク
レオチドおよび薬学的に受容しうる担体を含む医薬組成
物。
【請求項１３】アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌ
クレオチドユニット間の連結基の少なくとも１つがイオ
ウ含有種を含む、請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌ
クレオチドユニット間の連結基の少なくとも１つがホス
ホロチオエート部分を含む、請求項１２記載の組成物。
【請求項１５】転移が肺に生ずることを特徴とする、
請求項１２記載の組成物。