HUT69922A - Oligonucleotide modification of cell adhesion - Google Patents

Oligonucleotide modification of cell adhesion Download PDF

Info

Publication number
HUT69922A
HUT69922A HU9500630A HU9500630A HUT69922A HU T69922 A HUT69922 A HU T69922A HU 9500630 A HU9500630 A HU 9500630A HU 9500630 A HU9500630 A HU 9500630A HU T69922 A HUT69922 A HU T69922A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
oligonucleotide
seq
sequence
icam
cells
Prior art date
Application number
HU9500630A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9500630D0 (en
Inventor
C Frank Bennet
Christopher K Mirabelli
Original Assignee
Isis Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/007,997 external-priority patent/US5591623A/en
Priority claimed from US08/063,167 external-priority patent/US5514788A/en
Application filed by Isis Pharmaceuticals Inc filed Critical Isis Pharmaceuticals Inc
Publication of HU9500630D0 publication Critical patent/HU9500630D0/hu
Publication of HUT69922A publication Critical patent/HUT69922A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70525—ICAM molecules, e.g. CD50, CD54, CD102
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70542—CD106
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/7056—Lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C07K14/70564—Selectins, e.g. CD62
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Emulsifying, Dispersing, Foam-Producing Or Wetting Agents (AREA)

Description

A találmány tárgya készítmények és eljárások olyan betegségek kezeléséhez és diagnózisához, amelyek fogékonyak az intercelluláris adhéziós molekulák szintézisének vagy anyagcseréjének befolyásolásával végzett kezelésre. Olyan oligonukleotidokat írtak le, amelyek sepcifikusan hibridizálhatók az intercelluláris adhéziós molekula-l-et, a vaszkuláris sejtadhéziós molekula-l-et és az endoteliális leukocita adhéziós molekula-l-et kódoló nukleinsavakkal. Az oligonukleotid az említett specifikus hibridizációhoz elégséges mennyiségű és minőségű nukleotid egységet tartalmaz.
A találmány egyéb előnyben részesített megvalósítási módjaiban az oligonukleotidők specifikusan hibridizálhatók transzkripciós kezdőhellyel, transzlációs kezdőhellyel, az
- -transzlálatlan szekvenciákkal, a 3'-transzlálatlan szekvenciákkal és a közbenső szekvenciákkal. Eljárásokat írtak le a sejtadhéziós proteinek (e proteinek valamelyikének megfelelő RNS-sel vagy
DNS-sel specifikus hibridizációra képes oligonukleotiddal végzett) befolyásolása beavatkozásra fogékony valamint a se.j tadhéziós betegségek kezelésére.
útján végrehajtott gyógyászati betegségben szenvedő állatok, molekulák befolyásolására reagáló
81147-7976-GI
HhOQGdO
KÖZZÉTÉTELI
PÉLDÁNY
ΊKépviselő:
* DANUBIA Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.
SEJTADHÉZIÓ MÓDOSÍTÁSA OLIGONUKLEOTIDDAL f
ISIS Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad, CA, Amerikai Egyesült Államok
Feltalálók:
BENNET C. Frank, Carlsbad, CA
MIRABELLI Cristopher K., Dover, MA
Amerikai Egyesült Államok
A bejelentés napja: 1993. 08. 27.
Elsőbbségei: 1992. 09. 02. (07/939 855) 1993. 01. 21. (08/007 997) 1993. 05. 17. (08/063 167)
US
A nemzetközi bejelentés száma: PCT/US93/08101
A nemzetközi közzététel száma: WO94/05333
81147-7976-GI/gcs
A találmány reagensek és modulálására
tárgya diagnosztikai módszerek, gyógykezelések a sejtadhéziós vizsgálati molekulák reagáló betegségekhez. Részletesebben, a találmány tárgya oligonukleotidők, és a fehérvérsejtek más fehérvérsejtekhez és egyéb sejttípusokhoz való tapadását (adhézióját) szabályozó proteinek szintézisében szerepet játszó bizonyos messenger ribonukleinsavak (mRNS) vagy
DNSek közötti interakciók.
A találmány tárgya az intercelluláris adhéziós molekula-l-et (ICAM-1), az endoteliális leukocita adhéziós molekula-l-et (ELAM-1;
szelektin néven
Eis ismert) és a vaszkuláris sejtadhéziós molekula-l-et (VCAM-1) kódoló mRNS-hez történő hibridizációhoz tervezett antiszensz oligonukleotidők. Azt találtuk, hogy ezek az oligonukleotidők az RNS vagy DNS akt ivitásának befolyásolását (modulálását), s ennek megfelelően, specifikus sejtadhéziós molekulák szintézisének és métábólizmusának befolyásolását eredményezik, ami a betegség átmeneti enyhülését és gyógyászati hatásokat eredményez.
A gyulladás a szövetek által sérülés, fertőzés vagy szövetpusztulás hatására kiváltott, lokalizált védekezési reakció, ami a fertőző vagy sérülést okozó anyag (szer) lebontását, és a sérült szövetből történő eltávolítását eredményezi. A tipikus gyulladásos reakció a következők szerint zajlik:
antigén idegenként való felismerése vagy szövetkárosulás felismerése; szolubilis gyulladás mediátorok szintetizálása és felszabadulása; gyulladásos sejtek • · · • · • ·· « • ·
toborzása a fertőzés vagy szövetkárosodás helyére; a bejutott organizmusok vagy a károsodott szövet lebontása és eltávolítása; a bejutott organizmusok eltávolítása vagy a károsodás megszűnésekor a rendszer deaktiválódása. Sok, gyulladással lejátszódó emberi betegség esetében a gyulladásos reakciókat csillapító homeosztázisos mechanizmusok hibásak, ami a normális szövet károsodását vagy lebomlását eredményezi.
A sejt-sejt interakciók az immunreakció aktiválásában valamennyi fent leírt stádiumban szerepet játszanak. Egy normális gyulladásos reakció esetében az egyik legkorábban kimutatható esemény a leukociták érfel endotéliumhoz való tapadása, amit a leukociták érrendszerből a fertőzés vagy sérülés helyére történő vándorlása követ. E leukociták vagy fehérvérsejtek érfal endotéliumhoz való kötődése a sejtek érrendszerből történő kivándorlásának szükségszerű lépése (Harlan, J.M., Blood, 513-525, 1985). A gyulladás helyén megjelenő első gyulladásos sejtek általában a neutrofil leukociták, melyeket a monociták és a limfociták követnek. A sejt-sejt interakciók szintén kritikus fontosságúak mind a B-lifociták, mind a T-limfociták szaporodásában, ami fokozott humorális, illetve celluláris immunreakciókat eredményez.
A fehérvérsejtek érfal endotéliumhoz és más sejttípusokhoz való tapadását specifikus, adhéziós molekulák elnevezésű proteinek interakciója közvetíti, mely proteinek a
fehérvérsejtek és az érfal endotélium plazmamembránján helyezkednek el. Az adhéziós molekulák közötti interakciók hasonlóak a klasszikus receptor-ligandum interakciókhoz, azzal a különbséggel, hogy a ligandum egy sejt felületén rögzült, nem oldékony. A leukocita tapadását illetően genetikai defektussal rendelkező betegek azonosítása lehetővé tette a kutatóknak, hogy azonosítsák a fehérvérsejtek tapadásáért felelős leukocita adhézió defektus (LAD) proteinek családját. A egy ritka autoszomális sajátosság, amelyet a visszatérő bakteriális fertőzések és a csökkent gennyképződés, illetve sebgyógyulás jellemez. A defektusról kimutatták, hogy normálisan a fehérvérsejtek külső sejtmembránján expresszálódó három heterodimer glikoprotein, a Mac-1, LFA-1 és pl50,95 közös B-alegységében fordul elő (Anderson és Springer, Ann. Rév. Med., 3S, 175-194, 1987). A LAD betegségben szenvedő betegek a granulociták, monociták és limfociták tapadás-függő működéseinek széles spektrumában mutatnak defektusokat. Az
LFA-1 három ligandumát azonosították; ezek az intercelluláris adhéziós molekula-1, -2 és -3 (ICAM-1, ICAM2 és ICAM-3). A Mac-1 és a pl50,95 egyaránt köti a C3bi komplement fragmenst, s talán más, azonosítatlan ligandumokat is. A Mac-1 az ICAM-l-et is köti.
A fehérvérsejtek érfal endotéliumhoz való tapadásában és az azt követő, érrendszerből történő kivándorlásában szerepet játszó egyéb adhéziós molekulákat is azonosítottak. Ezek közé tartozik az endoteliális leukocita adhéziós molekula-1 • · · ·
(ELAM-1), a vaszkuláris sejtadhéziós molekula-1 (VCAM-1) és a granulum membrán protein-140 (GMP-140), és megfelelő receptoraik. Ogy tűnik, a fehérvérsejtek érfal endotéHunihoz való kötődését részben (ha nem egészben) az öt sejtadhéziós molekula, az ICAM-1, ICAM-2, ELAM-1, VCAM-1 és GMP-140 közvetíti (Dustin és Springer, J. Cell. Bioi., 107. 321-331, 1987). Az ICAM-1, ELAM-1, VCAM-1 és GMP-140 sejtfelületi expresszióját gyulladásos inger indukálja. Ezzel ellentétben, az ICAM-2 expressziója konstitutívnak tűnik, s nem érzékeny a citokinek indukciójára. A GMP-140-et általában autocoid-ok indukálják, mint a hisztamin, a leukotrién B4, a vérlemezke aktiváló faktor és a trombin. Az endotél sejteken a maximális expresszió a stimulálás után 1/2-1 órával figyelhető meg, s 2-3 óra elteltével alapszintre tér vissza. Az ELAM-1 és VCAM-1 endotél sejteken lejátszódó expresszióját a citokinek indukálják, mint az interleukin-lB és a tumor nekrózis faktor, a gammainterferon azonban nem. Az ELAM-1 endotél sejteken lejátszódó maximális expressziója a stimulálás után 4-6 órával történik, s 16 óra múlva alapszintre tér vissza. Az ELAM-1 expresszió az új mRNS és protein szintézistől függ. A fokozott VCAM-1 expresszió a tumor nekrózis faktorral végzett kezelés után két órával mutatható ki, a stimulálás után 8 órával maximális értéket ér el, s a stimulálás után legalább 48 óráig emelt szinten marad (Rice és Bevilacqua, Science, 246. 1303-1306, 1989). Az endotél sejteken az ICAM-1 expressziót az interleukin-1, tumor nekrózis faktor és gamma-interferon citokinek indukálják. Az ICAM-1 • · · · • · · ·
maximális expressziója az ELAM-l-éhez hasonlóan alakul; a stimulálás után 8-10 órával következik be, s legalább 48 óráig emelt szinten marad.
a GMP-140 és az ELAM-1 elsődleges szerepet játszik a neutrofil leukociták endotél sejtekhez való tapadásában. A VCAM-1 elsősorban a T- és B-limfocitákat köti. A VCAM-1 ráadásul szerepet játszhat a melanoma és más rákos áttétel kialakulásában. Az ICAM-1 a neutrofil leukociták érfal endotéliumhoz való tapadásában, valamint a monociták és limfociták érfal endotéliumhoz, szöveti fibroblasztokhoz és epidermális keratinocitákhoz való tapadásában játszik szerepet. Az ICAM-1 az antigénprezentáló sejt T-sejt általi felismerésében, a célsejtek természetes killer sejtek által történő lízisében, a limfociták aktiválásában és proliferációjában, és a T-sejtek tímuszban lejátszódó érésében is szerepet játszik. Ojabb adatok ráadásul azt bizonyítják, hogy az ICAM-1 a rhinovírus (amely a közönséges meghűlések több, mint 50 %-áért felelős) fő szerotípusának celluláris receptora (Staunton és mtsi, Cell, 849-853, 1989; Greve és mtsi, Cell, üfi, 839-847, 1989).
Az ICAM-1 expressziója számos különböző gyulladásos bőr rendellenességgel kapcsolatos, mint amilyen az allergiás érintkezési bőrgyulladás, a gyógyszeres bőrkiütés, a lichen planus és a pikkelysömör (Ho és mtsi, J. Am. Acad. Dermatol., 22, 64-68, 1990; Griffiths és Nickoloff, Am. J. Pathology, 135. 1045-1053, 1989; Lisby és mtsi, Br. J.
• ···· « · 4 « « ·· •f · · · ··· *···«· « · • · · · ·4 ···*·« ·· » · » «
4 Dermatol., 125, 479-484, 1989; Shiohara és mtsi, Arch.
Dermatol., 125, 1371-1376, 1989). Az ICAM-1 expressziót
ezenfelül kimutatták reumatoid artritis-ben szenvedő betegek izületi hártyájában (synovium) (Halé és mtsi, Arth. Rheum., 32. 22-30, 1989), cukorbetegek hasnyálmirigy B-sejtjeiben (Campbell és mtsi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86. 4282-4286, 1989), Graves-betegségben szenvedő betegek pajzsmirigy tüszősejtjeiben (Weetman és mtsi, J. Endocrinol., 122. 185-191, 1989) illetve idegen vese- és májkilökődéses betegek pajzsmirigy tüszősejtjeiben (Faull és Russ, Transplantation, 48. 226-230, 1989; Adams és mtsi, Láncét, 1122-1125, 1989).
Azt reméljük, hogy inhibitorai olyan képezik, amelyek az ICAM-1, VCAM-1 és új gyulladásgátló számos gyulladásos
ELAM-1 expresszió szerek osztályát betegség vagy gyulladásai járó betegség ellen (mint az asztma, a reumatoid artritis, az idegen szövet kilökődés, a gyulladásos bélbetegség, a különböző bőrgyógyászati esetek és a pikkelysömör) rendelkeznek aktivitással. Ezenfelül, az ICAM-1, VCAM-1 és ELAM-1 inhibitorai szintén hatásosak lehetnek a rhinovírus okozta meghűlések, az AIDS, a Kaposi szarkóma és néhány rák és áttételeik kezelésében is.
Napjainkban nem ismeretesek olyan gyógyszerek, melyek hatásosan gátolnák az ELAM-1, VCAM-1 és ICAM-1 celluláris adhéziós molekulákat. Az ICAM-1 elleni neutralizáló monoklonális antitestek állat modellekben való alkalmazása bizonyítékot szolgáltat arra, hogy az ilyen inhibitorok • · · ♦ • · •·· · · 4 4 • · 4 · 4 ··· ·· · · «· azonosítva jótékony gyógyászati hatásúak lehetnek az asztma (Wegner és mtsi, Science, 247.
456-459,
1990), átültetett idegen vese kilökődések (Cosimi és mtsi,
J. Immunoi., 144.
4604-4612, 1990) és átültetett idegen szív kilökődések
1992) esetében. Az
ICAM-1 molekula szolubilis formájának alkalmazása tenyészetben tartott sejtek rhinovírusos megakadályozásába^ is hatásos volt (Mariin és fertőzésének mtsi, Natúré,
344. 70-72, 1990/.
Az intercelluláris adhéziós molekulákra ható jelenlegi szerek közé szintetikus peptidek, monoklonális antitestek, és az adhéziós molekulák szolubilis formái tartoznak. Napjainkig nem azonosítottak olyan szintetikus peptideket, amelyek gátolják a VCAM-l-gyel vagy az ELAM-l-gyel lejátszódó interakciót. A monoklonális antitestek hatásosak lehetnek az ICAM-1, VCAM-1 és ELAM-1 expresszió okozta akut gyulladásos reakció kezelésében, a krónikus kezelésben azonban a gazdaállat antitesteket fejleszt a monoklonális antitestek ellen, miáltal korlátozza azok hatékonyságát. Ráadásul, a monoklonális antitestek nagy proteinek, ami nehézséget okozhat a gyulladás helyére történő eljuttatásukban. A sejtadhéziós molekulákkal kapcsolatban, azonfelül, hogy előállításuk költséges, és kötési affinitásuk alacsony, sok, a monoklonális antitestekéhez hasonló korlátozó tényező merül fel. Ennek megfelelően, régóta szükség van olyan molekulákra, amelyek hatásosan gátolják az intercelluláris adhéziós molekulákat. Az • · · •· · · · ··· • ··· · · « · • · · · · · *·«·· ·· · · · ·
- 9 antiszensz oligonukleotidokkal kiküszöbölhetők az ICAM-1, VCAM-1 és ELAM-1 hatásainak gátlásához Jelenleg alkalmazott szerek előnytelen tulajdonságai.
A PCT/US90/02357 nemzetközi bejelentési számú szabadalmi leírásban (Hession és mtsi.) endotél adhéziós molekulákat (ELAM-ok), köztük az ELAM-l-et, VCAM-l-et és VCAM-lb-t kódokó DNS szekvenciákat írnak le. E DNS szekvenciák számos alkalmazását is leírják, például (1) ezen molekulákkal reaktív, monoklonális antitest készítmények előállítását, melyek gyógyszerként alkalmazhatók a leukociták endotél sejtekhez való kötődésének gátlásához; (2) a laukociták ELAM ligandumához való kötődéshez ELAM peptidek előállítását, amelyek végső soron az endotél sejteken az ELAM-hoz kötődnek, miáltal gátolják a leukociták endotél sejtekhez történő kötődését; (3) a gyulladás detektálásához ELAM-okhoz kötődő molekulák (pl. anti-ELAM molekulák vagy markerek, mint ligandum vagy fragmense) alkalmazását; (4) ELAM és ELAM ligandum DNS szekvcenciák alkalmazását olyan nukleinsav molekulák előállításához, amelyek a transzláció szintjén beavatkoznak az ELAM vagy ELAM ligandum expressziójába, melynek során a specifikus mRNS transzlációjának gátlásához antiszensz nukleinsavakat és ribozimeket alkalmaznak, oly módon, hogy az mRNS-t az antiszensz nukleinsawal álcázzák vagy ribozimmal hasítják. Leírják, hogy a kódoló régiók képezik a lehetséges célokat (target). A VCAM-l-et illetően az AUG-t tartják a legvalószínűbb célnak; a 17. példában az AUG helyhez hibridizáló 15-mert írnak le részletesen.
• · · · ·· ···· ·*·♦♦· « · • · · · · · ··«··« ·· ·· ·«
- 10 A találmány első tárgya gyógymódok immunológiai betegségek, idegen szövet kilökődések, rákos betegségek és áttételek, gyulladásos bélbetegség, pikkelysömör és más bőrbetegségek, meghűlések és az AIDS kezelésére a gyulladásos sejtadhéziós molekulák szintézisének és expressziójának megzavarása útján.
A találmány további tárgya antiszensz oligonukleotidok, amelyek képesek az intercelluláris adhéziós proteineket kódoló nukleinsavak működésének gátlására.
A találmány további tárgya az intercelluláris adhézió rendellenességeinek diagnosztikai módszerei.
A telálmány ezen és egyéb tárgyai a találmány leírásából lesznek nyilvánvalóak.
Az ábrák rövid leírása
Az 1. ábrán a humán intercelluláris adhéziós molekula-1 (ICAM-1) mRNS szekvenciája látható.
A 2. ábrán a humán endoteliális leukocita adhéziós molekula-1 (ELAM-1) mRNS szekvenciája látható.
A 3. ábrán a humán vaszkuláris sejtadhéziós molekula-1 (VCAM-1) mRNS szekvenciája látható.
···· • · 44 4 4 · ·· · · · · ·· •44444 4 · • 4 4 4 4 4 «44 t«· 44 44 · ·
- 11 A 4. ábrán grafikusan mutatjuk be az ICAM-1 különböző humán sejtvonalakba tartozó sejtek felületén lejátszódó expressziójának interleukin-l-gyel (IL-1) és tumor nekrózis faktorral (TNF) végzett indukcióját.
Az 5. ábrán grafikusan mutatjuk be a kiválasztott antiszensz oligonukleotidok humán köldökvéna endotél sejteken lejátszódó ICAM-1 expresszióra gyakorolt hatásait.
A 6/A és 6/B ábrán grafikusan mutatjuk be egy antiszensz oligonukleotid tumor nekrózis faktorral és interleukin-l-gyel stimulált humán köldökvéna endotél sejtekben lejátszódó ICAM-1 expresszióra gyakorolt hatásait.
A 7. ábrán grafikusan mutatjuk be az antiszensz oligonukleotidok DMSO-val differenciált HL-60 sejtek kontroll és tumor nekrózis faktorral kezelt humán köldökvéna endotél sejtekhez való ICAM-1 által közvetített tapadására (adhéziójára) gyakorolt hatását.
A 8. ábrán grafikusan mutatjuk be a kiválasztott antiszensz oligonukleotidok A549 humán tüdő ráksejtekben lejátszódó ICAM-1 expresszióra gyakorolt hatásait.
A 9. ábrán grafikusan mutatjuk be a kiválasztott antiszensz oligonukleotidok primer humán keratinocitákban lejátszódó ICAM-1 expresszióra gyakorolt hatásait.
···· ·· ····
«· · ♦ · ♦ ··· · · • · · « ··· ··· ··
- 12 A 10. ábrán grafikusan mutatjuk be az oligonukleotid lánchosszúság, a Tm (disszociációs hőmérséklet) és az ICAM-1 expresszió gátlására gyakorolt hatás közötti összefüggést.
A 11. ábrán grafikusan mutatjuk be a kiválasztott antiszensz oligonükleotidok DMSO-val differenciált HL-60 sejtek * kontroll és tumor nekrózis faktorral kezelt humán köldökvéna endotél sejtekhez való ICAM-1 által közvetített tapadására (adhéziójára) gyakorolt hatását.
A 12. ábrán grafikusan mutatjuk be a kiválasztott antiszensz oligonükleotidok tumor nekrózis faktorral kezelt humán köldökvéna endotél sejteken lejátszódó ELAM-1 expresszióra gyakorolt hatását.
A 13. ábrán az ELAM-1 mRNS vázlatos rajza látható, melyen bemutatjuk az antiszensz oligonükleotidok célhelyeit.
A 14. ábrán a VCAM mRNS vázlatos rajza látható, melyen bemutatjuk az antiszensz oligonükleotidok célhelyeit.
A 15. ábrán grafikonon mutatjuk be az ICAM-1 expresszió C8161 sejtekben ICAM-l-gyel komplementer antiszensz oligonukleotidokkal végzett kezelés után bekövetkező gátlását.
A 16. ábrán oszlopgrafikonon mutatjuk be az ISIS 3082 oligonukleotid dextrán-szulfáttal (DSS) indukált gyulladásos • · · ·· ·· ·«·· · ·· · · · · ·· «····· « · • · · · · · *«··»· ·· · · ·« bélbetegségre gyakorolt hatását.
A találmány tárgya olyan oligonukleotidok, amelyek specifikusan hibridizálódnak az intercelluláris adhéziós molekula-l-et (ICAM-1), a vaszkuláris sejtadhéziós molekula-l-et (VCAM-1) és az endoteliális leukocita adhéziós molekula-l-et (ELAM-1) kódoló nukleinsavakkal. Az oligonukleotidokat közvetelenül az mRNS-hez vagy egy kiválasztott DNS szakaszhoz való kötődéshez tervezzük. A kötődés eredményeként háromszálú struktúra képződik, miáltal befolyásolható a génről másolódó mRNS mennyisége.
Az ilyen kötődésre képes oligonukeotidokat általánosan antiszensz-ként említjük. Az oligonukleotidok képesek gátolni az RNS vagy DNS működését; gátolják proteinné transzlálódásukat, a citoplazmában való áthelyeződésüket vagy bármely más, a tökéletes biológiai működéshez szükséges aktivitásukat. Az RNS vagy DNS működése egészének vagy részének meghibásodása a sejtadhéziós molekulák pontos expresszióját szabályozó genom egy részének elégtelenségét eredményezi, befolyásolva ezáltal a szóban forgó molekulák anyagcseréj ét.
Az antiszensz támadással előnyös specifikus géneket megcélozni.
Felfedeztük, hogy az
ICAM-l-et, VCAM-l-et és
ELAM-l-et kódoló gének ebből a szempontból különösen alkalmasak.
Az
ICAM-1,
VCAM-1 és ELAM-1 expresszió gátlásától azt várjuk, hogy hasznosak a gyulladásos betegségek, kilökődés, gyulladásos • « ♦ · · · • · • * · · • · • · · · · gyulladással járó betegségek, az idegen szövet a pikkelysömör és más bőrbetegségek, a bélbetegség, a rákos betegségek és áttételeik, valamint vírusfertőzések kezelésében.
A találmány további tárgya eljárások a sejttapadás (adhézió) befolyásolására, melynek során az állatot a sejttapadást befolyásolni képes proteint kódoló nukleinsawal hibridizálható oligonukleotiddal hozzuk érintkezésbe. Az ICAM-l-et, VCAM-l-et és ELAM-l-et kódoló RNS-sel vagy DNSsel hibridizálni képes oligonukleotidok az előnyben részesítettek. A diagnosztikai eljárások szintén a találmány részét képezik.
Az antiszensz oligonukleotidok gyógyszerként sok humán betegség kezelésében nagy reményekre jogosítanak. Az oligonukleotidok specifikusan kötődnek akár a pre-mRNS, akár az érett mRNS komplementer szekvenciáihoz (a Watson-Crickféle bázispárosodás szerint), gátolva ezzel a genetikai információ DNS-ről proteinre történő áramlását. Az antiszensz oligonukleotidok azon tulajdonságai, amelyek célszekvenciáikra specifikussá teszik őket, egyúttal kiamagasló sokoldalúságot is biztosítanak. Mivel az antiszensz oligonukleotidok négy monomer egységből álló hosszú láncok, bármely cél RNS szekvenciához könnyen szintetizálhatok. Az utóbbi időben számos tanulmányban leírták az antiszensz oligonukleotidok célproteinek vizsgálatának biokémiai eszközeként való alkalmazhatóságát • · «·· ·
- 15 (Rothenberg és mtsi, J. Natl. Cancer Inst., fii, 1539-1544, 1989; Zon, G., Pharmaceutical Rés, ü, 539-549, 1988). A fokozott sejtek általi felvételt mutató, nukleáz-rezisztens oligonukleotidok szintézisének napjainkban tapasztalható fejlődése folytán lehetőség nyílik arra, hogy az antiszensz oligonukleotidok alkalmazását egy új gyógykezelési formának tekintsük.
Az antiszensz oligonukleotidok ideális megoldást kínálnak a korábbi megközelítésekben felmerülő problémákra. Ezek az oligonukleotidok egy adott izoenzim szelektív gátlására tervezhetők, gátolják az enzim termelődését, s kiküszöbölik a nem specifikus mechanizmusokat, mint amilyen a szabad gyökök eltávolítása és a több receptorhoz való kötődés. A specifikus inhibitorok tervezéséhez nincs szükség az enzimmechanizmusok vagy a receptor-ligandum interakciók teljes megértésére.
neutrofil leukociták gyulladás helyére történő akut baáramlása a
GMP-140,
ELAM-1 és ICAM-1 endotél sejtek felületén lejátszódó fokozott expressziójának köszönhető.
Ogy tűnik, a gyulladásos reakció késői stádiumaiban a limfociták és monociták megjelenését a VCAM-1 és az ICAM-1 közvetíti. Az ELAM-l és a GMP-140 időszakosan expresszálódnak az érfal endotél sejteken, míg a VCAM-1 és
ICAM-1 állandóan.
A humán ICAm-l-et egy 3,3 kb-os mRNS kódolja, ami 55219 • ··· · ♦· ·♦·· « ·«« « · ··· ««<··· r · · • · · · « · ······ ·· «« ··
- 16 molekulatömegű protein szintézisét eredményezi (1.
ICAM-1 az N-kötött glikozilálási helyeken erősen
Az érett proetin látszólagos molekulatömege 90
SDS-poliakril-amid gélelektroforézissel határoztak és mtsi, Cell, £2, 925-933, 1988). Az ICAM-1 szupergén család tagja; az N-terminálison domént tartalmaz, melyeket citoplazmikus dómén követ. Az LFA-1 helye az első immunglobulin-szerű a kötési helyek azonban különállóknak mtsi, Cell, 61. 243-254). Az újabb vizsgálatok azt bizonyítják, hogy az
2-3 nm átmérőjű hajlított pálca
243-254).
illetően) széles körű szövet és a fehérvérsejteken, keratinocitákon és más az érfal endotél asztrocitákon és lipopoliszachariddal és tumor nekrózis faktor, végzett kezeléssel mtsi, J. Neuroimmunoi., citokines kezelést követő nem határozták meg.
megtalálható fibroblasztokon, dalton ábra). Az glikozilált. kD, amit meg (Staunton az immunglobulin öt immunglobulin-szerű transzmembrán dómén és és a rhinovírus kötési doménban található, tűnnek (Staunton és elektron-mikrográfos
ICAM-1 18,7 nm hosszú és (Staunton és mtsi, Cell, fii,
Az ICAM-1 (elhelyezkedését sejt megoszlást mutat; endotél sejteken, hámsejteken. Az ICAM-1 sejteken, fibroblasztokon, több más sejtvonalon cikonekkel (mint az gamma-interferon és szabályozható (ld. pl.: 23, 117-124, 1989). Az fokozott expressziój a keratinocitákon bakteriális interleukin-1, limfotoxin) Frohman és ICAM-1 expressziójának mechanizmusát
Az ELAM-1 115 kD molekulatömegű membrán glikoprotein (2.
··· 4 ·4 4 444 ··· · · ··· • ··♦ · f «4 • « 4 · «· ···««« ·· 4«*·
- 17 ábra), amely a membrán glikoproteinek szelektin családjának tagja (Bevilacqua és mtsi, Science, 2Δ2., 1160-1165, 1989).
Az ELAM-1 N-terminális régiója a lektin-szerú proteinek tagjaival homológ szekvenciákat tartalmaz, melyeket az epidermális növekedési faktorhoz hasonló dómén, és az 1-es és 2-es komplement receptorokban találhatóhoz hasonló hat, 60 aminosavas tandem ismétlődés követ. Ezek a sajátosságok jellemzőek a GMP-140-re és a MEL-14 antigénre (egy limfocita homing antigén) is. Az ELAM-l-et egy 3,9 kb-os mRNS kódolja. Az ELAM-1 mRNS 3' transzlálatlan régiója több ATTTA szekvencia motívumot tartalmaz, melyek a celluláris mRNS (ELAM-1 expresszió átmeneti természetővel összeférő) gyors turnover-éért felelősek.
Az ELAM-1 celluláris megoszlása korlátozott, hiszen csak érfal endotél sejteken azonosították. Az ICAM-l-hez hasonlóan az ELAM-1 is számos citoklnnel indukálható, köztük a tumor nekrózis faktorral, interleukin-l-gyel, limfotoxinnal, valamint bakteriális lipopoliszachariddal. A gamma-interferon az ICAM-l-gyel ellentétben az ELAM-l-et nem indukálja (Bevilacqua és mtsi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84. 9238-9242, 1987; Wellicome és mtsi, J. Immunoi., 144.
2558-2565, 1990). A humán köldökvéna endotél sejtekben az
ELAM-1 mRNS indukciójának és eltűnésének sebessége megelőzi az ELAM-1 sejtfelületi megjelenését és eltűnését. Az ICAM-l-hez hasonlóan, az ELAM-1 indukció molekuláris mechanizmusa sem ismert.
···♦ «9 ···* • « « · ··♦ · * 9 • « · · * · ······ ·« ♦* · ·
- 18 A VCAM-1 110 kD-os membrán glikoprotein, melyet egy 3,2 kb-os mRNS (3. ábra) kódol. Ogy tűnik, a VCAM-l-et egy egy példányú gén kódolja, amely alternatív splicing folyamaton átesve hat vagy hét immunglobulin domént tartalmazó terméket eredményez (Osborn és mtsi, Cell, £3, 1203-1211, 1989. A VCAM-1 receptora feltételezhetően a CD29 (VLA-4), amit a CD29 monoklonális antitestjeinek azon képessége bizonyít, hogy gátolják a Ramos sejtek VCAM-l-hez való tapadását. A VCAM-1 elsődlegesen az érfal endotél sejteken expresszálódik. Az ICAM-l-hez és az ELAM-l-hez hasonlóan, a VCAM-1 érfal endotél sejteken történő expressziója is citokines kezeléssel szabályozható (Rice és Bevilacqua, Science, 246. 1303-1306, 1989; Rice és mtsi, J. Exp. Med., 171. 1369-1374, 1990). Ogy tűnik, a fokozott expresszió az mRNS indukciójának köszönhető.
A gyógykezelést illetően, a feltételezhetően ICAM-1, VCAM-1 és
ELAM-1 expressziójának csökkentésével kezelhető betegségben szenvedő állatot a találmány szerinti oligonukleotidők beadásával kezeljük.
Az oligonukleotidők gyógyszerkészítményként alakíthatók melyek az oligonukleotidőn kívül hordozókat, dúsító szereket, diluenseket, puffereket, tartósítószereket, felületaktív anyagokat, liposzómákat vagy lipid készítményeket és hasonlókat tartalmazhatnak.
gyógyszerkészítmények tartalmazhatnak egy vagy több aktív összetevőt is, mint például antimikrobiális, gyulladáscsökkentő, érzéstelenítő szereket és hasonlókat.
• ···· ν· «··· · ·· · t · « ·* • ··♦ · · « 4 • · · · 9 · ··· ··· ·· «· ··
A gyógyszerkészítmények a kezelendő területtől, illetve attól függően, hogy helyi vagy szervezetre kiterjedő (szisztémás) kezelésre van-e szükség, különböző módokon adhatók be. A beadás történhet topikálisan (helyileg szemen, hüvelyen, végbélen és orron keresztül), orálisan, inhalálással vagy parenterálisan, például intravénás cseppinfúzióval, szubkután, intraperitoneális vagy intramuszkuláris injekcióval.
A helyi alkalmazáshoz való készítmények közé tartoznak a kenőcsök, lemosószerek, krémek, zselék, cseppek, végbélkúpok, spray-k, folyadékok és porok. E készítményekhez hagyományos gyógyszerészeti hordozók, vizes, por vagy olaj alapanyagok, dúsítószerek és hasonlók lehetnek szükségesek vagy kívánatosak. A készítménnyel bevont kondomok vagy kesztyűk szintén hasznosak lehetnek.
A orális beadáshoz való készítmények közé porok és granulátumok, vizes vagy nem vizes.,közegű szuszpenziók vagy oldatok, kapszulák és tabletták tartoznak. E készítményekhez dúsítószerek, ízesítő anyagok, diluensek, emulgeáló és diszpergáló szerek vagy kötőanyagok lehetnek kívánatosak.
A parenterális beadáshoz való készítmények közé steril, vizes oldatok tartoznak, melyek puffereket, liposzómákat, diluenseket és más alkalmas adalékokat is tartalmazhatnak.
Az adagolás a kezelendő betegség súlyosságától és • ···· ···« · ·· · · · 4·· • ··« · ·· ν * · ·· * A ··· ·4« ·· ··«· érzékenységétől függ, de normális esetben napi egy vagy több dózissal néhány hétig, néhány hónapig, illetve a gyógyulásig vagy a kezelést.
betegség csillapításának eléréséig végezzük a
A szakemberek könnyen meghatározhatják az optimális adagogat, az adagolási módszereket és a beadás gyakoriságát.
A találmányban a gyulladásos sejtadhézió befolyásolására képes proteineknek megfelelő RNS és DNS működésének antiszensz gátlásához oligonukleotidokat alkalmazunk. A találmány leírásában az oligonukleotid kifejezés ribonukleinsav vagy dezoxiribonukleinsav oligomerre vagy polimerre vonatkozik. Ez a kifejezés egyaránt magában foglalja a természetesen előforduló bázisokból, cukrokból és cukrok közötti (gerincváz) kötésekből álló oligomereket, valamint a hasonló működésű, természetesen nem előforduló részeket tartalmazó oligomereket. Az ilyen módosított vagy szubsztituált oligonukleotidok gyakran előnyösebbek, mint a természetes formák, például olyan tulajdonságok miatt, mint a fokozott celluláris felvétel és a nukleázok jelenlétében mutatott fokozott stabilitás.
A találmány szerinti előnyben részesített oligonukleotidok specifikus példái foszfor-tioátokat, foszforsavtriésztereket, metil-foszfonátokat, rövidláncú alkil vagy cikloalkil cukrok közötti kötéseket vagy rövidláncú, heteroatomos vagy heterociklusos cukrok közötti kötéseket tartalmazhatnak. A legelőnyösebbek a CH2-NH-O-CH2, • ·»·4 «« ···« ν ·· * · · · ·· • ··· · · · · • V · · » · • ··· ·· «· η·
CH2-N(CH3)-O-CH2, CH2-0-N(CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2 és
0-N(CH3)-CH2-CH2 gerincvázzal rendelkező oligonukleotidők (melyekben a foszforsav-diészter az 0-P-0-CH2). Szintén előnyben részesítettek azok az oligonukleotidok, amelyek morfolin gerincváz szerkezettel rendelkeznek (Summerton,
J.E.
és Weller, D.D.,
034 506 számú Amerikai Egyesült
Államok-beli szabadalmi leírás).
Más előnyben részesített megvalósítási módokban, mint például a protein-nukleinsav (PNA) gerincváz esetében, az oligonukleotid foszforsavdiészter gerince poliamid gerinccel helyettesíthető. E molekulákban a bázisok közvetlenül vagy közvetve a poliamid aza nitrogénatomjához kötődnek (P.E. Nielsen, M. Egholm, R.H. Berg, 0. Buchardt, Science, 254. 1497, 1991). Egyéb előnyben részesített oligonukleotidok alkilcsoporttal és halogénatommal szubsztituált cukor gyököket tartalmazhatnak, melyek 2' helyzetben az alábbi szubsztituensek valamelyikét tartalmazhatják: OH; SH; SCH3; F; OCN; 0(CH2)nNH2 vagy 0(CH3)nCH3, melyekben n jelentése 1-től körülbelül 10-ig terjedő egész szám; 1-10 szénatomos alkilcsoport, szubsztituált, kis szénatomszámú alkilcsoport; alkil-aril vagy aril-alkilcsoport; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; 0-, S- vagy
N-alkilcsoport; 0-, S- vagy N-alkenilcsoport; SOCH3; SO2CH3;
0N02; N02; N3; NH2; hetero-cikloalkilcsoport; hetero cikloalkil-arilcsoport; amino-alkil-aminocsoport; polialkil aminocsoport; szubsztituált szililcsoport; RNS hasító csoport; konjugátum; riporter csoport; interkalátor; oligonukleotid farmakokinetikus tulajdonságait javító csoport; oligonukleotid farmakodinamikus tulajdonságait javító csoport; vagy más, hasonló tulajdonságokkal rendelkező szubsztituensek.
Az oligonukleotidok a pentofuranozilcsoport helyett tartalmazhatnak cukrot utánzó csoportokat, mint például ciklobutilcsoportokat.
A találmány szerinti oligonukleotidok előnyösen körülbelül
3-50 nukleotidot (nukleinsav bázis egység) tartalmaznak.
Előnyösebbek a körülbelül 8-25 nukleotidot tartalmazó
oligonukleotidok, s még előnyösebbek a körülbelül 12-22
nukleotidot tartalmazók. A nukleotid (nukleinsav bázis egység) a szomszédos nukleotidhoz foszforsav-diészter vagy más kötéssel megfelelően kötött bázis-cukor egység.
A találmány szerinti oligonukleotidok a jól ismert szilárd fázisú szintézissel könnyen és rutinszerűen állíthatók elő. Ilyen szintézishez való berendezéseket számos forgalmazó árusít, mint pl. az Applied Biosystems. Bármilyen más szintetizálási módszer alkalmazható, az oligonukleotidok adott szintézise azonban a szakember felkészültségétől függ. Egyéb oligonukleotidok, mint a foszfor-tioátok és az alkilezett származékok előállításának hasonló technikái szintén jól ismertek.
A szakemberek meg fogják érteni, hogy a DNS nyitott leolvasási keretei (ORF; open reading frame) — melyekről az RNS transzkripciója történik — által azonosított messenger RNS-ek nemcsak a DNS nyitott leolvasási kereteiből származó információkat foglalják magukban, hanem azokat az asszociált
ribonukleotidokat is, amelyek 5'-transzlálatlan régióként, 3'-transzlálatlan régióként és közbenső szekvenciaként ismertek. Ilyenformán, a találmány értelmében olyan oligonukleotidok alakíthatók ki, amelyek teljesen vagy részben ezeket az asszociált ribonukleotidokat, valamint az információt hordozó ribonukleotidokat célozzák meg. Az előnyben részesített megvalósítási módokban az oligonukleotid specifikusan hibridizálható transzkripciós kezdőhellyel, transzlációs kezdőhellyel, közbenső szekvenciával és a 3'-transzlálatlan régió szekvenciáival.
A találmány szerinti oligonukleotid specifikusan hibridizálható a fehérvérsejtek más fehérvérsejtekhez vagy más sejttípusokhoz való tapadásában szerepet játszó proteint kódoló nukleinsavak részleteihez. Az előnyben részesített megvalósítási módokban az említett protein az intercelluláris adhéziós molekula-1, a vaszkuláris sejtadhéziós molekula-1 és az endoteliális leukocita adhéziós molekula-1. A találmányban a megfelelő szekvenciát vagy annak egy részét tartalmazó oligonukleotidok alkalmazhatók. Az 1. ábrán például a humán intercelluláris adhéziós molekula-1 mRNS szekvenciája látható. A teljes egészében vagy részben alkalmazható, előnyben részesített szekvencia szakaszok az alábbiak:
5'
3' Szekv. száma
TGGGAGCCATAGCGAGGC1.
GAGGAGCTCAGCGTCGACTG2.
GACACTCAATAAATAGCTGGT3.
GAGGCTGAGGTGGGAGGA4.
CGATGGGCAGTGGGAAAG5.
GGGCGCGTGATCCTTATAGC6.
CATAGCGAGGCTGAGGTTGC7.
CGGGGGCTGCTGGGAGCCAT8.
TCAGGGAGGCGTGGCTTGTG13.
CCTGTCCCGGGATAGGTTCA14.
TTGAGAAAGCTTTATTAACT16.
CCCCCACCACTTCCCCTCTC15.
A 2.
ábrán a humán endoteliális leukocita adhéziós molekula-1 mRNS szekvenciája látható.
A teljes egészében vagy részben alkalmazható, előnyben részesített szekvencia szakaszok az alábbiak:
3' Szekv. száma
CAATCATGACTTCAAGAGTTCT
28.
TCACTGCTGCCTCTGTCTCAGG73.
TGATTCTTTTGAACTTAAAAGGA74.
TTAAAGGATGTAAGAAGGCT75.
CATAAGCACATTTATTGTC
76.
TTTTGGGAAGCAGTTGTTCA
77.
AACTGTGAAGCAATCATGACT78.
CCTTGAGTGGTGCATTCAACCT79.
AATGCTTGCTCACACAGGCATT80.
··· · .*
A 3. ábrán a szekvenciája humán vaszkuláris sejtadhéziós molekula-1 mRNS látható. A teljes egészében vagy részben alkalmazható, előnyben részesített szekvencia szakaszok az alábbiak:
Szekv. száma
3'
5'
CCAGGCATTTTAAGTTGCTGT 40.
CCTGAAGCCAGTGAGGCCCG 41.
GATGAGAAAATAGTGGAACCA 42.
CTGAGCAAGATATCTAGAT 43.
CTACACTTTTGATTTCTGT 44.
TTGAACATATCAAGCATTAGCT 45.
TTTACATATGTACAAATTATGT 46.
AATTATCACTTTACTATACAAA 47.
AGGGCTGACCAAGACGGTTGT 48.
Bár a bemutatott szekvenciákat pontosnak tartjuk, találmány helyes szekvenciákra vonatkozik, abban az esetben is, ha leírásukban esetleg hibák találhatók. A t a1álmányban alkalmazható oligonükleotidok ezen szekvenciák valamelyikét vagy részletét tartalmazzák. Ennek megfelelően.
előnyben részesített a fentebb felsorolt oligonükleotidok vagy azon hasonló oligonükleotidok bármelyikének alkalmazása, amelyeket a szakemberek a gyulladásos sej tadhéziós molekulák szintézisének modulálásához előnyben részesített antiszensz célok (target) ismeretében előállíthatnak.
A találmány néhány előnyben részesített megvalósítási módját
- 26 :··· .... ....
......
.. · · ·.
az alábbi, nem korlátozó jellegű példákban írjuk le. A moduláláshoz alkalmas cél mRNS fajták az adhéziós molekula-l-gyel, az endoteliális leukocita adhéziós molekula-l-gyel és a vaszkuláris sejtadhéziós molekula-lgyel állnak kapcsolatban. A szakemberek meg fogják érteni, hogy a találmány nem korlátozódik kizárólag ezekre, hanem általánosan alkalmazható. Az ICAM-1 és/vagy ELAM-1 és/vagy VCAM-1 termelés gátlásától vagy befolyásolásától azt várjuk, hogy betegségek kezelésében jelentős gyógyászati hatásokkal rendelkeznek. A készítmények hatásosságának értékelése érdekében vizsgálatra vagy vizsgálatok sorozatára van szükség.
1. példa
Az ICAM-1, VCAM-1 és ELAM-1 sejtek felületén lejátszódó expressziójának mennyiségi meghatározása ELISA vizsgálatban specifikus monoklonális antitestek alkalmazásával végezhető. A sejteket 96 üregű mikrotiter lemezeken konfluens állapot eléréséig tenyésztjük, majd a sejteket interleukin-l-gyel vagy tumor nekrózis faktorral — az ELAM-1 mennyiségi meghatározásához 4-8 órán át, az ICAM-1 és a VCAM-1 mennyiségi meghatározásához pedig 8-24 órán át — stimuláljuk. A citokinnel végzett megfelelő idejű inkubálás után a sejteket háromszor óvatosan kalciumot vagy magnéziumot tartalmazó, puffereit, izotóniás oldattal, mint például Dulbecco-féle foszfát-pufferelt sóoldattal (D-PBS) mossuk. A sejteket ezután a mikrotiter lemezen D-PBS-ben ··· · • · • · ·· : · ·: • · · ·♦ ·« hígított 1-2 %-os para-formaldehiddel fixáljuk. A sejteket D-PBS-sel ismételten háromszor mossuk. A mikrotiter lemezen a nem specifikus kötési helyeket D-PBS-ben 2 %-os szarvasmarha szérum albuminnal, 37 °C-on egy óráig blokkoljuk. A sejteket a blokkoló oldatban 37 °C-on egy óráig a megfelelő monoklonális antitesttel inkubáljuk, s a kötetlen antitestet a sejtek D-PBS-sel végzett háromszori mosásával eltávolítjuk. A sejtekhez kötődött antitestet blokkoló oldatban 1:1000 hígítású biotinilált kecske antiegér IgG-vel (Bethesda Research Laboratories, Gaithersberg, MD) 37 °C-on egy óráig végzett inkubálással detektáljuk. A sejteket D-PBS-sel háromszor mossuk, majd 37 °C-on 1:1000 hígítású, β-galaktozidázhoz konjugált sztreptavidinnel (Bethesda Research Laboratories) egy óráig inkubáljuk. A sejteket háromszor öt percig D-PBS-sel mossuk. A specifikus monoklonális antitesthez kötődött β-galaktozidáz mennyiségét úgy határozzuk meg, hogy a lemezt 37 °C-on 3,3 mM klórfenol vörös - β-D-galaktopiranozid, 50 mM nátrium-foszfát és 1,5 mM MgC12 (pH - 7,2) oldatában 2-15 percig tartjuk. A termék koncentrációját az abszorbancia 575 nm-nél ELISA mikrotiter lemezdetektorral végzett mérésével határozzuk meg.
Az ICAM-1 több humán sejtvonalban interleukin-13-val vagy alfa tumor nekrózis faktorral végzett stimulálás után megfigyelt indukciójának példáját a 4. ábrán mutatjuk be. A sejteket növekvő koncentrációjú interleukin-l-gyel vagy tumor nekrózis faktorral 15 órán keresztül stimuláltuk, s a fentiek szerint kezeltük. Az ICAM-1 expressziót 1:1000 • « • · · ·
- 28 • · ·· •· •· ♦· • · hígítású 84H10 monoklonális antitesttel (Amac Inc.,
Westbrook, ME) végzett inkubálással határoztuk meg. Az alkalmazott sejtvonalak a humán köldökvéna endotél sejtvonal (HUVEC), az A431 humán epidermális rákos sejtvonal, az SKMEL-2 humán melanoma sejtvonal és az A549 humán tüdőrák sejtvonal voltak. Az ICAM-1 valamennyi sejtvonalon indukálódott, a sejtfelületi expresszió indukálásában azonban a tumor nekrózis faktor hatásosabb volt, mint az interleukin-1 (4. ábra).
Az antiszensz oligonukleotidok ICAM-1, VCAM-1 és ELAM-1 expresszió gátlására végzett vizsgálatát a fentebb leírtak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a citokinekkel végzett indukció előtt a sejteket oligonukleotiddal kezeljük. Az ICAM-1 expresszió antiszensz oligonukleotidős
gátlásának egy példáját az 5. ábrán mutatjuk be. Humán
köldökvéna endotél sejteket (HUVEC) 37 °C-on 4 órán
keresztül, az oligonukleotidok sejtek általi felvételének
fokozásához 8 μΜ N-[1-(2,3-dioleil-oxi)-propil]-N,N,Ntrimetil-ammónum-kloridot (DOTMA) tartalmazó Opti MEM-ben hígított, növekvő koncentrációjú oligonukleotiddal kezeltünk. A tápközeget eltávolítottuk, s a jelzett koncentrációjú oligonukleotidőt tartalmazó endotél tenyészet tápközeggel (EGM-UV; Clonetics, San Diego, CA) helyettesítettük, s az inkubálást további 4 óráig folytattuk. Az interleukin-lG-t 5 egység/ml koncentrációban adtuk a sejtekhez, s azokat 37 °C-on 14 óráig inkubáltuk. A sejtek ICAM-1 expressziójának mennyiségi meghatározását :·'·.··.···: · ··· · . .· ·;
— · *..· ·..· ..
1:1000 hígítású 84H10 monoklonális antitest alkalmazásával a fentebb leírtak szerint végeztük. Az alkalmazott oligonukleotidők az alábbiak voltak:
1. vegyület (ISIS 1558) - az mRNS transzlációs kodon AUG kezdőhelyét fedő, 64-80 helyzetű bázisaival való hibridizációhoz tervezett foszforsav-diészter oligonukleotid, mely az 5'-TGGGAGCCATAGCGAGGC-3' szekvenciával (1. számú szekvencia) rendelkezik.
2. vegyület (ISIS 1570) - az 1. vegyület szekvenciájának megfelelő foszfor-tioát tartalmú oligonukleotid.
3. vegyület - az 1. és 2. vegyülettel komplementer foszfor-tioát oligonukleotid, mely az 5“-GCCTCGCTATGGCTCCCA-
3' szekvenciával
4. vegyület (81. számú szekvencia) rendelkezik.
(ISIS 1572) - az mRNS 3'-transzlálatlan régiójában a
2190-2210 helyzetű bázisokkal való hibridizációhoz tervezett foszfor-tioát tartalmú oligonukleotid, amely az 5'-GACACTCAATAAATAGCTGGT-3 szekvenciával (3.
számú szekvencia rendelkezik.
5. vegyület (ISIS 1821) - a kontrollként alkalmazott humán 5-lipoxigenáz mRNS-hez való hibridizációhoz tervezett foszfor-tioát tartalmú oligonukleotid, amely az
5'-CATGGCGCGGGCCGCGGG-3 szekvenciával (82. számú szekvencia) rendelkezik.
A humán ICAM-1 mRNS transzlációs régiójának AUG kezdőpontját megcélzó foszforsav-diészter oligonukleotid (1. vegyület) nem gátolja az ICAM-1 expresszióját, míg a megfelelő, foszfor-tioát tartalmú oligonukleotid (2. vegyület) 0,1 uM ···
- 30 koncentrációnál 70 %, 1 koncentrációnál pedig 90 % arányban gátolta azt (4. ábra).
A foszfor-tioát oligonukleotid foszforsav-diészterhez képest fokozott hatása valószínűleg nagyobb stabilitásának köszönhető. A 3. vagyület (a 2. vegyület értelmes [szensz] szála) 10 χΜ koncentrációnál mérsékelten gátolta az ICAM-1 expressziót. Ha a 2. vegyületet a sejtekhez való hozzáadás előtt a 3. vegyülethez hibridizáltuk, a 2. vegyület ICAM-1 expresszióra gyakorolt hatásai mérséklődtek, azt sugallva, hogy a 2. vegyület aktivitása az antiszensz oligonukleotid hatásnak volt tulajdonítható, amelyhez az mRNS-hez való hibridizációra van szükség. A 3'-transzlálatlan szekvenciák ellen irányuló antiszensz oligonukleotid (4. vegyület) 1 uM koncenrációnál 62 % arányban gátolta az ICAM-1 expressziót (5. ábra). A humán 5-lipoxigenázt célzó kontroll oligonukleotid (5. vegyület) az ICAM-1 expresssziót 20 %-ban csökkentette. Ezek az adatok azt bizonyítják, hogy az oligonukleotidok képesek az ICAM-1 humán köldökvéna endotélsejteken lejátszódó expressziójának gátlására, s arra engednek következtetni, hogy az ICAM-1 expresszió gátlása az antiszensz aktivitásnak tulajdonítható.
A 2. vegyület (antiszensz oligonukleotid) 1 uM koncentrációnál gátolja az ICAM-1 növekvő koncentrációjú tumor nekrózis faktorral és interleukin-l-gyel stimulált humán köldökvéna endotél sejteken lejátszódó expresszióját (6. ábra). Ezek az adatok azt bizonyítják, hogy a 2.
vegyület hatásai nem specifikusak
sejtek interleukin-l-gyel végzett stimulálására.
Az
ELAM-1 és
VCAM-1 expresszié antiszensz oligonukleotidokkal végzett gátlásának bizonyításához hasonló vizsgálatok alkalmazhatók.
2. példa
Az antiszensz oligonukleotidok ICAM-1, VCAM-1 vagy ELAM-1 expresszióra gyakorolt hatásainak kimutatásához alkalmazható másik celluláris vizsgálat a sejttapadás vizsgálat. A célsejteket soküregű lemezen egy rétegben tenyésztjük, s oligonukleotiddal, majd citokinnel kezeljük. A tapadó sejteket ezután az egyrétegű sejttenyészethez adjuk, 37 °C-on 30-60 percig inkubáljuk, majd a nem tapadó sejtek eltávolítása érdekében mossuk. Az egyrétegű sejttenyészethez tapadt sejtek mennyiségét a tapadó sejtek közvetlen számlálásával, vagy radioaktív 51Cr izotóppal előzetesen megjelölt sejteket alkalmazva az egyrétegű tenyészethez kapcsolódó radioaktivitás mennyiségi meghatározásával határozhatjuk meg (ld. Dústin és Springer, J. Cell. Bioi., 107. 321-331, 1988). A vizsgálat során az antiszensz oligonukleotidokkal az ICAM-l-et, VCAM-l-et vagy ELAM-l-et egyaránt megcélozhatjuk.
Az ICAM-1 mRNS-t megcélzó antiszensz oligonukleotidok
DMSO-val differenciált HL-60 sejtek tumor nekrózis faktorral
- 32 ··· . ♦··* ’·.* •♦· •· <♦·· kezelt humán köldökvéna endotél sejtekhez való tapadására gyakorolt hatásainak példáját a 7. ábrán mutatjuk be. A humán köldökvéna endotél sejteket 80 %-os konfluens állapot eléréséig 12 üregű lemezeken tenyésztettük. A sejteket 37 °C-on 8 /24 DOTMA-t tartalmazó Opti-MEM-ben hígított 2 uM oligonukleotiddal 4 óráig kezeltük. A tápközeget eltávolítottuk, s a jelzett oligonukleotidot 2 lü koncentrációban tartalmazó friss endotél sejt tenyészet tápközeggel (EGM-UV) helyettesítettük, majd az inkubálást 37 °C-on 4 óráig folytattuk. A sejtekhez 1 ng/ml koncentrációban tumor nekrózis faktort adtunk, s további 19 órán át inkubáltuk. A sejteket ezután EGM-UV tápközeggel egyszer mostuk, s 1,6 x 106 HL-60 sejtet 4 napig 1,3 % DMSO hozzáadásával differenciáltunk. A sejteket 37 ’C-on 1 óráig hagytuk összetapadni, s 37 °C-ra melegített Dulbecco-féle foszfát-pufferelt sóoldattal (D-PBS) négyszer óvatosan mostuk. A tapadó (adherens) sejteket 5 mM EDTA-t tartalmazó 0,25 ml hideg (4 ’C) foszfát-pufferelt sóoldat hozzáadásával választottuk le az egyrétegű tenyészetről, s jégen 5 percig inkubáltuk. Az EDTA-val végzett kezeléssel eltávolított sejtek számát hemocitométerrel végzett számlálással határoztuk meg. Az egyrétegű tenyészetről EDTA-val végzett kezeléssel eltávolított endotél sejtek morfológiai különbségek alapján könnyen megkülönböztethetők a HL-60 sej tektől.
Tumor nekrózis faktor hiányában a HL-60 sejtek 3 %-a tapadt az endotél sejtekhez. Az endotél sejtréteg 1 ng/ml tumor nekrózis faktorral végzett kezelése a tapadó sejtek számát az összes hozzáadott sejt 59 %-ára növelte (7. ábra). A 2. (antiszensz oligonukleotid) vegyülettel vagy az 5. (kontroll oligonukleotid) vegyülettel végzett kezelés a tumor nekrózis faktoros kezelés hiányában nem változtatta meg az egyrétegű sejttenyészethez tapadó sejtek számát (7. ábra). A 2. (antiszensz oligonukleotid) vegyület a tapadó sejtek számát az összes hozzáadott sejtek 59 %-áról 17 %-ára csökkentette (7. ábra). Ezzel szemben, az 5. (kontroll oligonukleotid) vegyület nem csökkentette jelentősen a tumor nekrózis faktorral kezelt endotél sejtréteghez tapadó sejtek számát, vagyis a kontroll sejtek esetében az Összes hozzáadott sejtek 59 %-ával szemben az 5. vegyülettel kezelt sejtek esetében az összes hozzáadott sejt 53 %-a volt tapadó.
Ezen adatok azt jelzik, hogy az antiszensz oligonukleotidok az endotél sejteken képesek az ICAM-1 expresszió gáltására, s az ICAM-1 expresszió gátlása szekvencia-specifikus összefüggésben áll a neutrofil-szerú sejtek endotél sejtréteghez való tapadásának csökkenésével. Mivel a fehérvérsejtek endotél sejtekhez való tapadását egyéb molekulák is (mint az ELAM-1 és VCAM-1) közvetítik, nem várható el, hogy a tapadás tökéletesen megszűnjön.
'*·«»
3. példa
Az oligonukleotidők szintézise és karaJcterizálása
A modifikáltlan DNS oligonukleotidokat automata szintetizátoron (Applied Biosystems 380B modell), standard foszfor-amidites eljárás alkalmazásával, jódos oxidációval szintetizáltuk. A ö-ciano-etil-diizopropil-foszforamiditeket az Applied Biosystems-től (Foster City, CA) szereztük be. A foszfor-tioát oligonukleotidok szintéziséhez a standard oxidációs fiolát a foszfit kötések lépésenkénti kénezéséhez 3H-1,2-benzo-ditiol-3-on-l,1-dioxid 0,2 M acetontiriles oldatával helyettesítettük. A kénezéses ciklus várakozási lépésének idejét 68 másodpercre növeltük, amit a cap (sapka)-képző lépés követett.
A 2'-0-metil foszfor-tioát oligonukleotidokat 2'-0-metil-Bciano-etil-diizopropil-foszforamiditek (Chemgenes, Needham MA) és a modifikálatlan oligonukleotidok szintéziséhez való standard ciklus alkalmazásával szintetizáltuk, azzal a különbséggel, hogy a tetrazol és a bázis pulzusszerű adagolása utáni várakozási időt 360 másodpercre növveltük. A szintézis beindításához alkalmazott 3'-bázis 2'-dezoxiribonukleotid volt.
A 2'-fluor foszfor-tioát oligonukleotidokat 5'-dimetoxitritil-3'-foszfor-amiditek (Chemgenes, Needham, MA) alkalmazásával szintetizáltuk, s a 463 358 számú (1990. január 11.) és 566 977 számú Amerikai Egyesült Államok-beli ** 9 : ··· ; : ··· ..·· ·
- 35 szabadalmi bejelentésben (1990. augusztus 13.) (melyek képviselője megegyezik a jelen bejelentés képviselőjével, s melyeket hivatkozásul említünk) leírt módon állítottuk elő.
A 2'-fluor oligonukleotidokat foszfor-amidites eljárással, s a standard DNS szintetizálási eljárás csekély módosításával állítottuk elő (a védőcsoport eltávolítást szobahőmérsékleten metanolos ammónia alkalmazásával végeztük).
A kontrollált pórusú üvegoszlopról (Apllied Biosystems) történő lehasítás és a védőcsoportok koncentrált ammónium-hidroxid oldatban 55 °C-on 18 órán át végzett eltávolítása után az oligonukleotidokat 0,5 M NaCl oldatból 2,5 térfogat etanollal kétszer végzett kicsapással tisztítottuk. Az analitikai gélelektroforézist 20 % akrilamid, 8 mM karbamid és 45 mM Tris-borát puffer (pH 7,0) elegyében végeztük. Az oligodezoxinukleotidokról és a foszfor-tioát oligonukleotidokról elektroforézis alapján megállapítottuk, hogy a 80 %-nál nagyobb mértékben teljes hosszúságúak.
Az RNS oligonukleotidok szintézisét ABI modell 380B DNS szintetizátorral szintetizáltuk. A standard szintetizálási ciklust úgy módosítottuk, hogy a tetrazol pulzusszerű adagolása utáni várakozási lépést 900 másodpercre növeltük. A bázisok védőcsoportját metanolos ammóniában egy éjszakán keresztül végzett inkubálással távolítottuk el. Ezután az oligonukleotidokat in vacuo szárítottuk. A 2'-
• ·
- 36 hidroxilcsoport terc-butil-dimetil-szilil védőcsoportját az
oligonukleotid 1 M tetrahidrofurános tetrabutil-ammónium-
fluorid oldatban egy éjszakán át végzett inkubálásával
távolítottuk el. Az RNS oligonukleotidokat Cia Sep-Pak
tölteten (Waters, Division of Millipore Corp., Milford MA)
tovább tisztítottuk, s etanollal kicsaptuk.
Az e szintézissel kapott foszfor-tioát és foszforsavdiészter kötések relatív mennyiségét szabályos időközönként 31P NMR spektroszkópiával ellenőriztük. A spektrumot környezeti hőmérsékleten, oldószerként deutériumoxid vagy dimetil-szulfoxid-de alkalmazásával kaptuk. A foszfor-tioát minták jellemzően kevesebb, mint 1 % foszforsav-diészter kötést tartalmaztak.
A tritil-on HPLC-vel tisztított oligonukleotidokkal PRP-1 oszlopon (Hamilton
Reno,
Nevada), mM trietil-ammónium-acetát oldatban (pH
7,0)
4-32 % acetonitril gradiens alkalmazásával 30 percig egy második értékelést végeztünk (átfolyási sebesség - 1,5 ml/perc). A megfelelő frakciókat összegyűjtöttük, bepároltuk, és környezeti hőmérsékleten 15 percig 5 %-os ecetsavval kezeltük.
Az oldatot egyenlő térfogatú etil-acetáttal extraháltuk, ammónium-hidroxiddal semlegesítettük, fagyasztottuk és liofilizáltuk. Amint azt az ICAM-1 expresszió ELISA vizsgálatával megállapítottuk, az HPLC-vel tisztított oligonukleotidők hatékonyságukat tekintve nem különböztek jelentősen kicsapott oligonukleotidőktől.
• · · ··* « · ··· »«···· « ·
4. példa
Sejttenyésztés és oligonukleotidőkkal végzett kezelés
Az A549 tüdőrák sejtvonalat az American Type Culture Collection-tól (Bethesda, MD) kaptuk. A sejteket 1 g/1 glükózt és 10 % magzati borjúszérumot (Irvine Scientific) tartalmazó Dulbecco-féle módosított Eagle tápközegben (Irvine Scientific, Irvine CA) tenyésztettük. A humán köldökvéna endotél sejteket (HUVEC) (Clonetics, San Diego, CA) EGM-UV tápközegben (Clonetics) tenyésztettük. A HUVEC sejteket a második és hatodik passzálás között használtuk. A A431 humán epidermális ráksejteket az American Type Culture Collection-tól kaptuk, s 4,5 g/1 glükózt tartalmazó DMEM-ben tenyésztettük. Primer humán keratinocitákat a Clonetics-től kaptunk, s a sejteket keratinocita nevelő tápközegben (KGM; Clonetics) tenyésztettük.
A 96 üregű lemezeken tenyésztett sejteket háromszor 37 °C-ra előmelegített Opti-MEM-mel (GIBCO, Grand Island, NY) mostuk. Valamennyi üreghez 100 ul Opti-MEM-et adtunk, ami a HUVEC sejtek esetében 10 ^g/ml, az A549 sejtek esetében pedig 20 /jg/ml N- [ 1- (2,3-dioleil-oxi) -propil J-N, N, N-t rímet ilammónium-kloridot (DOTMA, Bethesda Research Labs, Bethesda, MD) tartalmazott. Az oligonukleotidokat 0,2 urn-es Centrex cellulóz-acetát filteren (Schleicher és Schuell, Keene, NH) keresztül centrifugálva sterilizáltuk. Az oligonukleotidokat 20-szoros koncentrációjú törzsoldatként adtuk az üregekhez, s a sejteket 37 oC-on 4 óráig inkubáltuk. A tápközeget • ·
eltávolitottuk, s a feltüntetett koncentrációjú oligonukleotidot tartalmazó, megfelelő nevelő tápközeg 150 ul-ével helyettesítettük. A sejteket 37 °C-on további 3-4 óráig inkubáltuk, majd a megfelelő citokinnel 14-16 órán át stimuláltuk. Az ICAM-1 expressziót az 1. példában leírtak szerint határoztuk meg. Az oligonukleotiddal végzett inkubálás első 4 órája alatt a DOTMA jelenléte az oligonukleotid hatását legalább százszorosára növelte. A hatékonyság ilyen mértékű növekedése összhangban áll az oligonukleotid sejtek általi felvételének fokozódásával.
5. példa
További antiszensz oligonükleotidok ICAM-1 génexpresszió elleni aktivitásának ELISA vizsgálata interleukin-10-val stimulált sejtekben
Az antiszensz oligonukleotidokat eredetileg a humán ICAM-1 mRNS öt célhelyével való hibridizációhoz terveztük. Az
oligonukleotidokat foszforsav-diészter (P=0; ISIS 1558,
1559, 1563, 1564 és 1565) és foszfor-tioát alakban (P=S;
ISIS 1570, 1571, 1572, 1573 és 1574) szintetizáltuk. Az
oligonukleotidokat az 1. táblázatban mutatjuk be.
1. TÁBLÁZAT
A humán ICAM-l-et célzó antiszensz oligonukleotidok
ISIS sz. Szekv. sz. Célrégió Modifikálás
1558 1. AUG kodon (64-81) P=0
1559 2. 5 '-transzlálatlan (32-49) P=0
1563 3. 3'-transzlálatlan (2190-3010) P=0
1564 4. 3'-transzlálatlan (2849-2866) P=0
1565 5. Kódoló régió (1378 -1395) P=0
1570 1. AUG kodon (64-81) P=S
1571 2. 5'-transzlálatlan (32-49) P=S
1572 3. 3'-transzlálatlan (2190-3010) P=S
1573 4. 3'-transzlálatlan (2849-2866) P=S
1574 5. Kódoló régió (1378 -1395) P=S
1930 6. 5'-transzlálatlan (1-20) P=S
1931 7. AUG kodon (55-74) P=S
1932 8. AUG kodon (72-91) P=S
1933 9. Kódoló régió (111- 130) P=S
1934 10. Kódoló régió (351- 370) P=S
1935 11. Kódoló régió (889- 908) P=S
1936 12. Kódoló régió (1459 1-1468) P=S
1937 13. Terminációs kodon (1651-1687) P=S
1938 14. Terminációs kodon (1668-1687) P=S
1939 15. 3'-transzlálatlan (1952-1971) P=S
1940 16. 3'-transzlálatlan (2975-2994) P=S
2149 17. AUG kodon (64-77) P=S
2163 18. AUG kodon (64-75) P=S
• · · ·
- 40 1. TÁBLÁZAT (folytatás)
ISIS sz. Szekv. sz. Célrégió Modifikálás
2164 19. AUG kodon (64-73) P=S
2165 20. AUG kodon (66-80) P=S
2173 21. AUG kodon (64-79) P=S
2302 22. 3'-transzlálatlan (2114-2133) P=S
2303 23. 3'-transzlálatlan (2039-2058) P=S
2304 24. 3'-transzlálatlan (1895-1914) P=S
2305 25. 3'-transzlálatlan (1935-1954) P=S
2307 26. 3'-transzlálatlan (1976-1995) P=S
2634 1. AUG kodon (64-81) 2'-fluor-A,
-C és -U; P=S
2637 15. 3 '-transzlálatlan (1952-1971) 2'-fluor-A,
—C és -U;
2691 1. AUG kodon (64-81) P=0, kivéve az
utolsó 3 bázist, P=S
2710 15. 3 '-transzlálatlan (1952-1971) 2'-0-metil;
P=S
2711 1. AUG kodon (64-81) 2'-0-metil; P=S
2973 15. 3 '-transzlálatlan (1952-1971) 2'-0-metil;
P=S
2974 1. AUG kodon (64-81) 2'-0-metil; P=S
3064 27. 5'-CAP (32-51) P=S; a 3' régióhoz
spacer-ként adott G és C
3067 84. 5' -CAP (32-51) P=S
3222 84. 5' -CAP (32-51) 2'-0-metil; P=0
- 41 • · · · · · · ··· · · · · · 99··· · · * • · · · · ·
1. TÁBLÁZAT (folytatás)
ISIS sz. Szekv. sz. Célrégió Modifikálás
3224 84. 5' -CAP (32-51) 2'-0-metil; P=S
3581 85. 3' -transzlálatlan (1959-1978) P=S
Az interleukin-lB-val stimulált sejtek felületén az ICAM-1 expresszió oligonukleotidos gátlását az 1. példában leírtak szerint ELISA vizsgálattal határoztuk meg. Az oligonukleotidokat két különböző sejtvonalban teszteltük. A foszforsav-diészter oligonukleotidok egyike sem gátolta az ICAM-1 expressziót, ami valószínűleg ezen oligonukleotidok sejtben mutatott gyors lebomlásának tudható be. Az öt foszfor-tioát oligonukleotid közül az AUG transzlációs iniciációs kodonhoz hibridizáló ISIS 1570 volt a legaktívabb. Az ISIS 2974 2'-0-metil foszfor-tioát oligonukleotid az ICAM-1 expresszió HUVEC és A549 sejtekben történő gátlásában hozzávetőleg háromszor kisebb aktivitást mutatott, mint az ISIS 1570. Az ISIS 2634 2'-fluor oligonukleotid szintén kevésbé volt hatásos.
Az öt eredeti cél esetében kapott kezdeti adatok alapján az ICAM-1 mRNS-sel hibridizálható további oligonukleotidokat terveztünk. Az előre megjósolt transzkripciós kezdőhelyhez (5' cap hely) hibridizáló antiszensz oligonukleotid (ISIS 3067) az IL-lÖ-val stimulált sejtekben hozzávetőleg • · · · • · · · • · · · · · • · · · · « · • · · · · · *····· · · ··
- 42 ugyanolyan aktív volt, mint az AUG kodonhoz hibridizáló oligonukleotid (ISIS 1570) (ld. 8. ábra). Az ISIS 1931 és 1932 oligonukleotid az AUG transzlációs iniciációs kodon 5', illetve 3' részével hibridizál. Az AUG régióhoz hibridizáló mindhárom oligonukleotid gátolja az ICAM-1 expressziót, bár az ISIS 1932 valamivel kisebb mértékben volt aktív, mint az ISIS 1570 és ISIS 1931 oligonukleotid. Az ICAM-1 mRNS kódoló régiójához hibridizáló oligonukleotidok (ISIS 1933, 1934, 1935, 1574 és 1936) gyenge aktivitást tanúsítottak, míg a transzláció terminációs kodonhoz hibridizálók (ISIS 1937 és 1938) mérsékelt aktivitást mutattak.
A legaktívabb antiszensz oligonukleotid, meglepő módon, az ISIS 1939, az ICAM-1 mRNS 3'-transzlálatlan régiójában lévő szekvenciára célzott foszfor-tioát oligonukleotid volt (ld.
1. táblázat). Ugyanezzel a szekvenciával rendelkező egyéb oligonukleotidokat is teszteltünk (2'-0-metil, ISIS 2973; és 2'-fluor, ISIS 2637), de ezek nem mutattak az előzővel megegyező szintű aktivitást. Más 3'-transzlálatlan szekvenciákat célzó oligonukleotidok sem voltak olyan aktívak, mint az ISIS 1939. A poliadenilációs jelre célzott ISIS 1940 oligonukleotid valójában nem gátolta az ICAM-1 expressziót.
Mivel a tesztelt 16 eredeti oligonukleotid közül váratlanul az ISIS 1939 mutatta a legnagyobb antiszensz aktivitást, az ICAM-1 mRNS 3'-transzlálatlan régiójának szekvenciáival való hibridizációhoz további oligonukleotidokat terveztünk (ISIS • ·
- 43 2302, 2303, 2304, 2305 és 2307; ld. 1. táblázat). A sorozatban az ISIS 2307 oligonukleotid, amely az ISIS 1939 céljától 3' irányban csak 5 bázis távolságban lévő helyhez hibridizál, mutatta a legkisebb aktivitást (8. ábra). A sorozat legaktívabb tagja az ISIS 2302 volt, amely az ICAM-1 mRNS-hez az ISIS 1939 célrégiójától 3' irányban 143 bázis távolságban hibridizál. A humán ICAM-1 mRNS 3'-transzlálatlan régiójának előre megjósolt másodlagos RNS szerkezetének vizsgálatával (M. Zucker leírása szerint; Science, 244. 48-52, 1989) kimutattuk, hogy az ISIS 1939 és ISIS 2302 oligonukleotid egyaránt olyan szekvenciához hibridizál, melyekről előzetesen azt jósoltuk, hogy stabil stem-loop (hurok) struktúrában helyezkednek el. A jelenlegi szemlélet azt sugallja, hogy az RNS másodlagos szerkezetének régiói antiszensz oligonukleotidok tervezésénél nem kell számításba venni. Az ISIS 1939 és ISIS 2302 oligonukleotidról így nem jósolhattuk meg, hogy gátolja az ICAM-1 expressziót.
Az ISIS 1821 kontroll oligonukleotid HUVEC sejtekben az ISIS 1934 oligonukleotidéhoz hasonló aktivitással gátolta az ICAM-1 expresszióját; A549 sejtekben az ISIS 1821 azonban kevésbé volt hatásos, mint az ISIS 1934. Az ISIS 1821 negatív kontrollról azt találtuk, hogy az ICÁM expresszió ellen kis aktivitással rendelkezik, valószínűleg részben azon képességének köszönhetően, hogy az AUG transzlációs iniciációs kodontól 3' irányban 15 bázis távolságra hibridizál az ICAM-1 mRNS-sel (13 bázis illeszkedés közül
- 44 • · · ·
12-ben).
Ezek a vizsgálatok azt jelzik, hogy az ICAM-1 antiszensz oligonukleotidos gátlására az ICAM-1 mRNS AUG transzlációs iniciációs kodonja, és a specifikus 3'-transzlálatlan szekvenciák a legérzékenyebbek.
Az ISIS 1570, ISIS 1939 és ISIS 2302 oligonukleotidról kimutattuk, hogy az ICAM-1 expressziót a humán köldökvéna sejteken és A549 humán tüdőrák sejteken kívül az A431 humán epidermális ráksejtekben és humán primer keratinocitákban is gátolják (ld. 9. ábra). Ezek az adatok azt bizonyítják, hogy az antiszensz oligonukleotidok több humán sejtvonalban képesek az ICAM-1 expresszió gátlására. Ezenkívül, az oligonukleotidok hatásosságának sorrendje mind a négy vizsgált sejtvonal esetében azonos volt. Lényeges, hogy az ICAM-1 expresszió gátolható a humán primer keratinocitákban, mivel az epidermális keratinociták az antiszensz oligonukleotidok tervezett céljait képezik.
6. példa
Az ICAM-1 expresszió antiszensz oligonukleotidos gátlása egyéb citokinekkel stimulált sejtekben
Két oligonukleotidot (ISIS 1570 és ISIS 1939) az alfa-TNF-fel és gamma-IFN-nel indukált ICAM-1 expressziót gátló képességére vizsgáltunk. Az A549 sejtek 1 antiszensz oligonukleotiddal végzett kezelése • ♦ · · · ·
- 45 szekvencia-specifikus módon gátolta az IL-lG-val, alfa-TNFfel és gamma-IFN-nel indukált ICAM-1 expressziót. Az antiszensz oligonukleotidok hasonló mértékben gátolták az IL-lG-val és alfa-TNF-fel indukált ICAM-1 expressziót, a gamma-INF-fel indukált expresszió azonban érzékenyebb volt az antiszensz gátlásra. Az ISIS 1821 kontroll oligonukleotid nem gátolta jelentősen az IL-lB-val és alfa-TNF-fel indukált ICAM-1 expressziót, a gamma-INF-fel indukált expressziét pedig csekély mértékben gátolta:
Antiszensz oligonukleotidok (Kontroll expresszió %-a)
Citokin ISIS 1570 ISIS 1939 ISIS 1821
3 E/ml IL-Ιβ 56.6 ± 2,9 38,1 ± 3,2 95 ± 6,6
1 ng/ml alfa-TNF 58,1 ± 0,9 37,6 ± 4,1 103,5 ± 8,2
100 E/ml gamma-IFN 38,9 ± 3,0 18,3 ± 7,0 83,0 + 3,5
7. példa
Az értelmes szálú kontrollok megszüntetik az antiszensz hatásokat
Az ICAM-1 expresszió ISIS 1570 és ISIS 1939 oligonukleotidok általi antiszensz oligonukleotidos gátlása az oligonukleotidok megfelelő értelmes (szensz) szálaikkal történő hibridizálásával visszafordítható. Az ISIS 1570 oligonukleotid foszfor-tioát értelmes szála (ISIS 1575) önmagában alkalmazva mérsékelten fokozta az IL-Ιβ által ···· « · ··««
indukált ICAM-1 expressziót. Ha az ISIS 1575 oligonukleotidőt a sejtekhez való hozzáadás,előtt egyenlő moláris koncentrációban elegyítettük az ISIS 1570 oligonukleotiddal, blokkolta annak hatásait. Az ISIS 1939 komplementer szála (ISIS 2115) a sejtekhez önmagában adva 46 %-kal fokozta az ICAM-1 expressziót. Az ISIS 2115 oligonukleotid ISIS 1939 oligonukleotiddal végzett előzetes hibridizálása tökéletesen blokkolta az ICAM-1 expresszió ISIS 1939 általi gátlását.
8. példa
Az oligonukleotid Tm értékének (az oligonukleotid célrégióról való disszociálódási hőmérséklete) mérése
Annak megállapítása érdekében, hogy az ICAM-1 expresszió antiszensz oligonukleotidős gátlása az oligonukleotidok célhelyeihez való affinitásának köszönhető-e, valamennyi oligonukleotiddal termodinamikai méréseket végeztünk. A foszfor-tioátokként szintetizált antiszensz oligonukleotidokat a foszforsav-diészterekként szintetizált komplementer DNS-szekvenciáikhoz hibridizáltuk. Az abszorbanciát a hőmérséklet függvényében valamennyi egyszálú oligonukleotid esetében 100 mM Na^-oldat, 10 mM foszfátoldat és 0.1 mM EDTA (pH - 7,0) elegyében 4 koncentrációnál mértük. A kettős szál kialakulás Tm és szabadenergia értékeit az adatok két állapotú modellhez (lineáris meredekségei alapvonallal) való illeszkedéséből kaptuk (Petersheim, M. és Turner, D.H., Biochemistry, 22, 256-263, • · · · · « · «·· 4 *··« ····· 4 «4 • «•«•4 ·* 4 4··
- 47 1983).
Ha az antiszensz oligonukleotidok a foszforsav-diészter alakban szintetizált komplementer DNS-szekvenciáikhoz hibridizáltak, az ISIS 1940 kivételével valamennyi antiszensz oligonukleotid Tm értéke legalább 50 °C volt. Ennek megfelelően, amennyiben a célszekvenciák szabadok, valamennyi oligonukleotid képes az ICAM-1 cél mRNS-hez hibridizálni. Az antiszensz oligonukleotidok hatékonysága meglepő módon nem állt egyenes összefüggésben sem a Tm, sem a G°37 értékkel. A legnagyobb biológiai aktivitású oligonukleotid (ISIS 1939) Tm értéke kisebb volt, mint az oligonukleotidok többségéé. Ilyenformán, a hibridizációs affinitás nem elégséges a biológiai aktivitás biztosításához.
9. példa
Az oligonukleotid hosszúságának hatása az ICAM-1 expresszió antiszensz gátlására
Az oligonukleotid hosszúság antiszensz aktivitásra gyakorolt hatását az ISIS 1570 és ISIS 1939 oligonukleotid csonkított változatainak (ISIS 2165, 2173, 2149, 2163 és 2164; illetve ISIS 2540, 2544, 2545, 2546, 2547 és 2548) alkalmazásával teszteltük. Az antiszensz aktivitás az oligonukleotidok hosszúságának csökkenésével általában csökkent. A 16 bázis hosszúságú oligonukleotidok az 18 bázisosoknál kicsit kisebb aktivitást mutattak, a 14 bázisos oligonukleotidok ···« «« *«··
Jelentősen kisebbet, míg a 12 vagy 10 bázis hosszúságúak csak gyenge aktivitást mutattak. Az oligonukleotid hosszúság és a Tm, valamint az antiszensz aktivitás közötti összefüggés vizsgálata azt mutatja, hogy éles átmenet van a 14 és 16 bázis hosszúság között, míg a Tm lineárisan nő a hosszúsággal (10. ábra).
10. példa
Az ICAM-1 antiszensz gátlásának specifitása
Az ISIS
1570 és ISIS 1939 antiszensz oligonukleotid
ICAM-l-re mutatott specifitását 35S-izotóppal
Jelölt proteinek immunprecipitáclójával értékeltük. A549 sejteket cm3-es szövettenyésztő palackokban konfluens állapot eléréséig tenyésztettünk, s a tenyészetet antiszensz oligonukleotidokkal kezeltük (ld. 4. példa). A sejteket 14 órán át interleukin-lG-val stimuláltuk, 10 % dializált magzati borjúszérumot tartalmazó, metionin-mentes DMEM-mel mostuk, s 10 % dializált magzati borjúszérumot, 1 uM oligonukleotidot és jelzett mennyiségű interleukin-lC-t tartalmazó, metionin-mentes DMEM-ben egy óráig inkubáltuk. A 3eS-metionin/cisztein elegyet (Tran35S-label, ICN, Costa
Mesa, CA) 100 jjCi/ml aktivitással adtuk a sejtekhez, és a sejteket további óráig inkubáltuk.
A celluláris proteineket 50 mM
Tris-HCl (pH = 8,0) , 150 mM NaCl oldat,
1,0 % NP-40, 0,5 % dezoxikolát és 2 mM
EDTA elegyével (üregenként 0,5 ml) 4 °C-on 30 percig végzett inkubálással vontuk ki. Az extraktumokat 18000 x g-vel 20 percig végzett centrifugálással tisztítottuk. A felülúszókat 200 pl protein G - Sepharose gyöngyökkel (Bethesda Research Labs, Bethesda, MD) 4 ’C-on 2 óráig preadszorbáltuk, egyenlő részekre osztottuk, s 5 pg ICAM-1 monoklonális antitesttel (AMAC Inc., Westbrook, ME) vagy HLA-A,B antitesttel (W6/32; az American Type Culture Collection-tól [Bethesda, MDJ kapott egér hibridoma sejtekkel állítottuk elő) 4 °C-on 15 órán keresztül inkubáltuk. Az immunkomplexeket 4 °C-on 200 pl 50 V/V %-os protein G-Sepharose szuszpenzióval 2 óráig inkubálva csapdáztuk be, ötször lízis pufferrel mostuk, és SDS-poliakrilamid gélen rezolváltuk. A proteineket autoradiográfiával detektáltuk.
Kimutattuk, hogy az A549 sejtek 5 egység/ml interleukin-löval végzett kezelése párban vándorló, 95-100 kD molekulatömegű protein szintézisét eredményezi, amelyet az ICAM-1 elleni monoklonális antitesttel immunprecipitáltunk. A párként való megjelenésről úgy tartjuk, hogy az ICAM-1 különböző mértékben glikozilált formáinak tudható be. A sejtek 1 koncentrációjú ISIS 1570 antiszensz oligonukleotiddal végzett előkezelése az ICAM-1 szintézisét hozzávetőleg 50 %-kal mérsékelte, míg 1 pM ISIS 1939 az ICAM-1 szintézist majdnem alapszintre csökkentette. Az ISIS 1940 oligonukleotid, amely az ICAM-1 ELISA vizsgálatban inaktív volt (1. és 5. példa), nem csökkentette jelentősen az ICAM-1 szintézist. Az ICAM-1 célokkal (target) hibridizálni képes antiszensz oligonükleotidok egyike sem mutatott kimutatható hatást az HLA-A.B szintézisre, ami az
- 50 oligonukleotidok ICAM-l-re vonatkozó specifitását bizonyítja. Ezenkívül, azok a proteinek, amelyek az ICAM-1 antitesttel és a protein G-Sepharose-zal nem specifikusan precipitálódtak, antiszensz oligonukleotidos kezeléssel nem voltak jelentősen befolyásolhatók.
11. példa
További antiszensz oligonukleotidok vizsgálata ICAM-1 elleni aktivitásra sejtadhéziős vizsgálattal
A humán köldökvéna endotél sejteket (HUVEC) a 4. példában leírtak szerint tenyésztettük és kezeltük az oligonukleotidokkal. A sejteket 4 órán keresztül az ISIS
1939, ISIS 1940 oligonukleotiddal vagy az ISIS 1821 kontroll oligonukleotiddal kezeltük, majd alfa-TNF-fel 20 óráig stimuláltuk. Az alap HUVEC sejtek minimálisan kötődtek a HL-60 sejtekhez, míg a TNF-fel stimulált HUVEC sejtek az összes hozzáadott sejt 19 %-át kötötték. Az HUVEC sejtréteg 0,3 μΜ ISIS 1939 oligonukleotiddal végzett előzetes kezelése a HL-60 sejtek tapadását alapszintre csökkentette (ld. 11.
ábra). Az ISIS 1821 kontroll oligonukleotid és az ISIS 1940 oligonukleotid a tapadó sejtek arányát 19 % - 9 %-ra csökkentette. Ezek az adatok azt mutatják, hogy az ICAM-l-et célzó antiszensz oligonukleotidok specifikusan csökkenthetik a leukocita-szerú sejtvonal (HL-60) alfa-TNF-fel kezelt
HUVEC sejtekhez való tapadását.
• · · ·
12. példa
Az antiszensz oligonukleotidok ELISA vizsgálata ELAM-1 génexpre88zió elleni aktivitásra
2-5. passzálás közötti primer humán köldökvéna endotél sejteket (HUVEC) 96 üregű lemezen szélesztettünk, s a tenyészetet hagytuk konfluens állapotig fejlődni. A sejteket háromszor Opti-MEM-mel (GIBCO, Grand Island, NY) mostuk, majd 37 °C-on 4 órán keresztül 10 pg/ml DOTMA oldatot (Bethesda Research Labs, Bethesda, MD) tartalmazó Opti-MEMben hígított, növekvő koncentrációjú oligonukleotiddal kezeltük. A tápközeget eltávolítottuk, s oligonukleotidot tartalmazó EGM-UV-vel (Clonetics, San Diego, CA) helyettesítettük. A tápközeghez alfa-tumor nekrózis faktort adtunk (2,5 ng/ml), s a sejteket 37 °C-on további 4 óráig inkubáltuk.
Az ELAM-1 expressziót ELISA vizsgálattal határoztuk meg. A sejteket háromszor óvatosan 37 °C-ra felmelegített Dulbecco-féle foszfát-pufferelt sóoldattal (D-PBS) mostuk, 95 %-os etanollal 4 °C-on 20 percig fixáltuk, D-PBS-sel háromszor újra mostuk, s D-PBS-ben 2 % BSA-val blokkoltuk. A sejteket BBA-1 ELAM-1 monoklonális antitesttel (R&D Systems, Minneapolis, MN) inkubáltuk. majd 4 °C-on egy óráig 2 % BSAt tartalmazó D-PBS-ben 0,5 ;;g/ml-re hígítottuk. A sejteket D-PBS-sel háromszor mostuk, s a kötött ELAM-1 antitesteket az 1. példában leírtak szerint biotinilált kecske anti-egér másodlagos antitesttel, majd β-galaktozidázzal konjugált sztreptavidinnel detektáltuk.
Az ELAM-1 cDNS 11 különböző régióját célzó antiszensz foszfor-tioát oligonukleotidok, és az ICAM-l-et célzó két oligonulkeotid (kontroll) aktivitását ELAM-1 ELISA vizsgálat alkalmazásával határoztuk meg. Az oligonukleotidokat és a megcélzott régiókat a 2. táblázatban mutatjuk be.
2. TÁBLÁZAT
Humán ELAM-l-et célzó antiszensz oligonukleotidok
ISIS sz. Szekv. sz. Célrégió Modifikálás
1926 28. AUG kodon (143-164) P=S
2670 29. 3'- transzlálatlan (3718-3737) P=S
2673 30. 3*- transzlálatlan (2657-2677) P=S
2674 31. 3'- transzlálatlan (2617-2637) P=S
2678 32. 3'- transzlálatlan (3558-3577) P=S
2679 33. 5'- transzlálatlan (41-60) P=S
2680 34. 3'- transzlálatlan (3715-3729) P=S
2683 35. AUG ί kodon (143-163) P=S
2686 36. AUG ί kodon (149-169) P=S
2687 37. 5'- transzlálatlan (18-73) P=S
2693 38. 3'- transzlálatlan (2670-2788) P=S
2694 39. 3'- transzlálatlan (2934-2954) P=S
Az ICAM-l-et célzó antiszensz oligonukleotidok esetében tapasztaltakkal (5. példa) ellentétben, az ELAM-1 aktivitás leghatásosabb modulátora (az ISIS 2679 oligonukleotid) az
ELAM-1
5'-transzlálatlan régiójának specifikus szekvenciájával oligonukleotid, irányban három képes hibridizálni. Az ISIS 2687 amely az ISIS 2679 céljától upstream bázis távolságra végződő szekvenciához hibridizál, nem mutatott jelentős aktivitást (12. ábra). Az
ISIS 2679 oligonukleotid ilyenformán az ELAM-1 mRNS egyedüli helyéhez hibridizál, amely egyedülállóan érzékeny az antiszensz oligonukleotidokkal végzett gátlásra. E hely antiszensz oligonukleotidos gátlásra mutatott érzékenysége az RNS másodlagos szerkezetének előzetes jóslásaiból vagy az irodalmi adatokból nem volt megjósolható.
13. példa
További antiszensz oligonukleotidok ELISA vizsgálata ELAM-1 génexpresszió elleni aktivitásra
Tizennyolc antiszensz foszfor-tioát oligonukleotid ELAM-1 expressziót gátló hatását az 12. példában leírt ELISA vizsgálattal határoztuk meg. Ezen oligonukleotidok ELAM-1 mRNS-en lévő célhelyei a 13. ábrán láthatók. Az oligonukleotidok szekvenciáját és ELAM-1 elleni aktivitását a 3. táblázatban mutatjuk be. A csillaggal jelölt oligonukleotidok IC50 értéke hozzávetőleg 50 nM vagy kisebb, s ezek az előnyben részesítettek. Az IC50 érték az ELAM-1 expresszió 50 %-os gátlását eredményező oligonukleotid dózist jelenti.
3. TÁBLÁZAT
A humán ELAM-1 expresszió gáltása antiszensz oligonukleotidokkal (az ELAM-1 expressziót a kontroll százalékaként adjuk meg)
ISIS sz. Szekv. Célrégió ELAM-1 exp.
30 nM se Szekvencia (oligo. 50 nM konc.)
sz. elhelyezkedés
4764* 52. 5'-UTR 1-19 GAAGTCAGCCAAGAACAGCT 70,2 50,2
2687 37. 5'-UTR 17-36 TATAGGAGTTTTGATGTGAA 91,1 73,8
2679* 33. 5--UTR 40-59 CTGCTGCCTCTGTCTCAGGT 6,4 6,0
4759* 53. 5'-UTR 64-83 ACAGGATCTCTCAGGTGGGT 30,0 20,2
2683* 35. AUG 143-163 AATCATGACTTCAAGAGTTCT 47,9 48,5
2686* 36. AUG 148-168 TGAAGCAATCATGACTTCAAG 51,1 46,9
4756* 54. I/E 177-196 CCAAAGTGAGAGCTGAGAGA 53,9 35,7
4732 55. Kódoló 1936-1955 CTGATTCAAGGCTTTGGCAG 68,5 55,3
4730* 56. I/E 3'UTR TTCCCCAGATGCACCTGTTT 14,1 2,3
(2006-2025)
4729* 57. 3'-UTR 2063-2082 GGGCCAGAGACCCGAGGAGA 49,4 46,3
2674* 31. 3'-UTR 2617-2637 CACAATCCTTAAGAACTCTTT 33,5 28,1
2673 30. 3'-UTR 2656-2676 GTATGGAAGATTATAATATAT 58,9 53,8
2694 39. 3'-UTR 2933-2953 GACAATATACAAACCTTCCAT 72,0 64,6
4719* 58. 3'-UTR 2993-3012 ACGTTTGGCCTCATGGAAGT 36,8 34,7
4720 59. 3'-UTR 3093-3112 GGAATGCAAAGCACATCCAT 63,5 70,6
2678* 32. 3'-UTR 3557-3576 ACCTCTGCTGTTCTGATCCT 24,9 15,3
2670 29. 3'-UTR 3717-3736 ACCACACTGGTATTTCACAC 72,2 67,2
I/E: intron/exon kapcsolódás
UTR: transzlálatlan régió (untranslated region)
Egy további, 3'-transzlálatlan régiót célzó oligonukleotid,
az ISIS 4728 nem gátolta az ELAM expressziót.
14. példa
Az antiszensz oligonukleotidok ELISA vizsgálata VCAM-1 génexpresszió elleni aktivitásra
Tizenöt antiszensz foszfor-tioát oligonukleotid VCAM-1 expressziót gátló hatását az 12. példában leírt ELISA vizsgálattal határoztuk meg, azzal a különbséggel, hogy a sejteket az alfa-TNF-fel 16 óráig stimuláltuk, s a VCAM-1 expressziót 0,5 ug/ml koncentrációban alkalmazott VCAM-1 specifikus antitesttel (R & D Systems, Minneapolis, MN)
detektáltuk. Az oligonukleotidok VCAM-1 mRNS-en lévő
célhelyei a 14. ábrán láthatók. Az oligonukleotidok
szekvenc iáj át és VCAM-1 elleni aktivitását a 3. táblázatban
mutatjuk be. A csillaggal jelölt oligonukleotidok IC50
értéke hozzávetőleg 50 nM vagy kisebb, s ezek az előnyben részesítettek. Az ICso érték a VCAM-1 expresszió 50 %-os gátlását eredményező oligonukleotid dózist jelenti.
4. TÁBLÁZAT
A humán VCAM-1 expresszió gáltása antiszensz oligonukleotidokkal (az ELAM-1 expressziót a kontroll százalékaként adjuk meg)
ELAM-1 exp.
ISIS Szekv. Célrégió 30 nM 50 nM sz. sz. elhelyezkedése Szekvencia (oligo. konc.)
5884* 60. 5'-UTR 1-19 CGATGCAGATACCGCGGAGT 79,2 37,2
3791 61. 5'-UTR 38-58 GCCTGGGAGGGTATTCAGCT 92,6 58,0
5862 62. 5'-UTR 48-68 CCTGTGTGTGCCTGGGAGGG 115,0 83,5
3792* 63. AUG 110-129 GGCATTTTAAGTTGCTGTCG 68,7 33,7
5863 64. Kódoló 745-764 CAGCCTGCCTTACTGTGGGC 95,8 66,7
5874* 65. Kódoló 1032-1052 CTTGAACAATTAATTCCACCT 66,5 35,3
5885 66. E/I 1633-1649+1 TTACCATTGACATAAAGTGTT 84,4 52,4
5876* 67. Kódoló 2038-2057 CTGTGTCTCCTGTCTCCGCT 43,5 26,6
5875* 68. Kódoló 2183-2203 GTCTTTGTTGTTTTCTCTTCC 59,2 34,8
3794 69. Term. 2344-2362 TGAACATATCAAGCATTAGC 75,3 52,6
3800* 70. 3'-UTR 2620-2639 GCAATCTTGCTATGGCATAA 64,4 47,7
3805* 71. 3'-UTR 2826-2845 CCCGGCATCTTTACAAAACC 67,7 44,9
3801* 50. 3'-UTR 2872-2892 AACCCAGTGCTCCCTTTGCT 36,5 21,3
5847* 72. 3'-UTR 2957-2976 AACATCTCCGTACCATGCCA 51,8 24,6
3804* 51. 3'-UTR 3005-3024 GGCCACATTGGGAAAGTTGC 55,1 29,3
I/E: intron/exon kapcsolódás
UTR: transzlálatlan régió (untranslated region) • · · · · · • · · ·
15. példa
ICAM-1 expresszió C8161 humán melanoma sejtekben
A C8161 sejtvonal (Dr. Dán Welch [Hershey Medical Center] adománya) kiújuló rosszindulatú melanomában szenvedő beteg hasfali áttételéből származik. Ezek a sejtek pajzsmirigyhiányos, csupasz egereknek szubkután, intradermális és intravénás injekcióval beadva többszörös áttételeket képeznek a tüdőben, irhában, lépben, májban és a nyirokcsomókban. A sejteket 10 % magzati borjúszérumot tartalmazó DMS-F12 tápközegben tenyésztettük, s 2 mM EDTA felhasználásával passzáltuk.
A C8161 sejtek alfa-TNF-fel végzett kezelése az ICAM-1 sejtfelületi expressziójának hatszoros emelkedését, és a sejtekben az ICAM-1 mRNS szintjének fokozódását eredményezte. Az ICAM-1 sejtfelületi expresszióját ELISA vizsgálattal mértük. A sejteket 37 °C-on 15 ug/ml Lipofectin jelenlétében az antiszensz oligonukleotidok növekvő koncentrációjával 4 óráig kezeltük. Az ICAM-1 expressziót 5 ng/ml alfa-TNF-fel 16 óráig végzett inkubálással indukáltuk.
A sejteket háromszor D-PBS-ben mostuk, s 2 %-os formaldehidben 20 percig fixáltuk. A sejteket ezután D-PBSsel mostuk, 37 °C-on egy óráig 2 %-os BSA-val blokkoltuk, s 84H10 ICAM-1 monoklonális antitesttel (AMAC, Inc., Westbrooke, ME) inkubáltuk. A kötött antitest detektálását biotinilált kecske anti-egér IgG-vel, majd β-galaktozidázzal konjugált sztreptavidinnel végzett inkubálással végeztük, s klórfenolvörös-G-D-galaktopiranozid alkalmazásával szín fejlődött ki. A mennyiségi meghatározást 575 nm-nél mért abszorbancia alapján végeztük. Az ICAM-1 mRNS szinteket Northern biot analízissel mértük.
16. példa
Az ICAM-1 expresszié oligonukleotidős gátlása
C8161 humán melanoma sejtekben
Amint a 15. ábrán látható, az ICAM-l-et célzó ISIS 1570 (1. számú szekvencia), ISIS 1939 (15. sz. szekv.) és ISIS 2302 (22. sz. szekv.) antiszensz oligonukleotidok csökkentették az ICAM-1 sejtfelületi expressszióját (amit a 16. példa szerint ELISA vizsgálattal detektáltunk). Az ISIS 1822 negatív kontroll oligonukleotid (amely az 5-lipoxigenázzal komplementer), nem befolyásolta az ICAM-1 expressziót. Az eredményeket a kontroll aktivitás százalékaként fejeztük ki, s az alábbiak szerint számítottuk: (oligonukleotiddal kezelt, citokinnel indukált sejtek ICAM-1 expressziója) (alap ICAM-1 expresszió)/(citokinnel indukált ICAM-1 expresszió) - (alap ICAM-1 expresszió) x 100.
Az ISIS 1939 (15. sz. szekv.) és az ISIS 2302 (22. sz. szekv.) oligonukleotid jelentősen csökkentette az ICAM-1 mRNS szinteket (amit Northern biot analízissel detektáltunk). Az ISIS 1570 (1. sz. szekv.) azonban csak csekély mértékben csökkentette az ICAM-1 mRNS szintet.
• · · ·
17. példa
Kísérletes áttétel (metasztázis) vizsgálat
Az ICAM-1 metasztázisban betöltött szerepének értékeléséhez kísérletes metasztázis vizsgálatokat végeztünk, melynek során tímuszhiányos, csupasz egerek oldalsó farki vénájába 1 x 105 C8161 sejtet injektáltunk. A C8161 sejtek alfa-TNF-fel és gamma-interferonnal végzett kezeléséről korábban kimutatták, hogy a sejteket csupasz egerekbe injektálva fokozott számú tüdő áttételeket (metasztázisokat) okoz (Miller, D.E. és Welch, D.R., Proc. Am. Assoc. Cancer Rés., 13, 353, 1990).
Négy hét elteltével az egereket leöltük, szerveiket Bouin fixáló oldatban fixáltuk, s a tüdőkön az áttételeket boncoló mikroszkóp segítségével vizsgáltuk. A kísérletekhez négyhetes nőstény, tímuszhiányos, csupasz egereket (Harlan Sprague Dawley) használtunk. Az állatokat a NIH előírásai szerint tartottuk. A kísérletes áttétel vizsgálatokban 4-8 egérből álló csoportokat teszteltünk.
18. példa
Az ISIS 1570 és ISIS 2302 antiszensz oligonukleotid csökkenti a C8161 sejtek metasztázisos potenciálját
A C8161 sejtek ICAM-l-gyel komplementer ISIS 1570 és 2302 antiszensz ollgonukleotidokkal végzett kezelését kationos lipid, a lipofektin (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD)
jelenlétében végeztük. Az antiszensz oligonukeotidokat a 3. példában leírtak szerint szintetizáltuk. A sejteket 10® sejt/ml mennyiségben 60 mm-es szővettenyésztő csészékbe helyeztük, 37 °C-on 3 óráig inkubáltuk, majd opti-MEM-mel (Gibco/BRL) háromszor mostuk, s valamennyi üreghez 100 pl Opti-MEM-et adtunk. Szobahőmérsékleten 15 percig 0,5 oligonukleotidot és 15 pg/ml lipofektint elegyítettünk, s az elegy 25 pl-ét a megfelelő csészékhez adtuk, majd 37 ’C-on 4 óráig inkubáltuk. Az oligonukleotid-lipofektin elegyet eltávolitottuk, és 10 %-os magzati borjúszérumot tartalmazó DME-F12 tápközeggel helyettesítettük. 4 óra elteltével a megfelelő üregekhez 500 E/ml alfa-TNF-et adtunk, s 18 órás inkubálás után a sejteket eltávolitottuk a lemezekről, számoltuk, és tímuszhiányos, csupasz egerekbe injektáltuk.
A C8161 sejtek ISIS 5170 (1. sz. szekv.) vagy ISIS 2302 (22. sz. szekv.) oligonukleotiddal végzett kezelése csökkentette metasztázisos potenciáljukat, s megszüntette az alfa-TNF-es kezelés által eredményezett, fokozott metasztázisos képességüket. Az adatokat az 5. táblázatban mutatjuk be.
• * · · · ·
5. TÁBLÁZAT
Az ICAM-l-et célzó antiszensz oligonukleotidok C8161 humán melanoma sejtvonal kísérletes metasztázisára gyakorolt hatása
Kezelés
Tüdő metasztázisok egerenként! száma (átlag ± SEM)
Csak lipofektin 64 + 13
Lipofektin + alfa-TNF 81 + 8
ISIS 1570 + lipofektin 38 + 15
ISIS 2302 + lipofektin 23 + 6
ISIS 1570 + lipofektin + alfa-TNF 49 + 6
ISIS 23-2 + lipofektin + alfa-TNF 31 + 8
19. példa
Egér modellek az antiszensz oligonukleotidok ICAM-1 elleni teszteléséhez
Sok olyan betegség nem vizsgálható emberekben, amelyekről úgy tartják, hogy intercelluláris adhéziós molekulák közvetítik. Például, az átültetett idegen szervek kilökődése olyan betegség, amely valószínűleg javítható az ICAM-1 expresszió befolyásolásával, de ezt inkább állatokon, mint embereken kell értékelni. További ilyen példa a gyulladásos bélbetegség és a neutrofil leukocita migráció (szövetekbe történő beszűrődés). Ezek a betegségek állat modellekben • · · « · « • · ·· • * · · · « • · · · ·# · · · « · «
- 62 tesztelhetek, mint például az általunk használt egér modellel.
Azonosítottuk az egér sejtekben ICAM-1 expresszié gátlásához való oligonukleotid szekvenciákat. Az egér ICAM-1 hozzávetőleg 50 %-os homológiát mutat a humán ICAM-1 szekvenciával. A humán ICAM-l-et célzó oligonukleotidok értékeléséből származó információk alapján az egér ICAM-1 mRNS-t célzó oligonukleotidok sorozatát terveztük és szintetizáltuk. Ezeket az oligonukleotidok aktivitását immunprecipitációs vizsgálattal értékeltük.
Az egér DCEK-ICAM-1 sejteket (Dr. Adrienné Brian [University of California, San Diego] adománya) 20 /jg/ml DOTMA/DOPE jelenlétében 37 °C-on 4 óráig 1 oligonukleotiddal kezeltük. A tápközeget 10 %-os dializált magzati borjúszérumot tartalmazó, metionin-mentes tápközegre cseréltük, a sejteket az új tápközegben egy óráig inkubáltuk, majd 100 //Ci/ml 35S-izotóppal jelölt metionin/cisztein elegyet adtunk hozzájuk. A sejteket további 2 óráig inkubáltuk, PBS-sel négyszer mostuk, s 20 mM Tris-t (pH - 7,2), 20 mM KC1 oldatot, 5 mM EDTA-t, 1 %
Triton Χ-100-at, 0,1 mM leupeptint, 10 z/g/ml aprotinint és 1 mM PMSF-et tartalmazó pufferben extraháltuk. Az extraktumokból az ICAM-l-et egér-specifikus ICAM-1 antitesttel (YN1/1.7.4), majd protein G-Sepharose-zal végzett inkubálással immunprecipitáltuk. Az immunprecipitátumokat SDS-PAGE módszerrel analizáltuk, s ν « t>« * · · ··*» « ·* · <· - · ·· ····« · · · • · · · · · • ·· ··· ·· 4« ·*
- 63 autoradiográfiás vizsgálatot végeztünk. Az egér ICAM-1 AUG kodonját célzó ISIS 3066 és 3069 foszfor-tioát oligonukleotid 48 %, illetve 63 % arányban, míg az egér
ICAM-1 mRNS 3'-transzlálatlan régiójában lévő szekvenciákat célzó ISIS 3065 és ISIS 3082 oligonukleotid 47 %, illetve 97 % arányban gátolta az ICAM-1 szintézist. Az egér ICAM-1 elleni legaktívabb antiszensz oligonukleotid a
3'-transzlálatlan régiót célozta. Az ISIS 3082 oligonukleotidőt ezen eredmény alapján tovább értékeltük; ez a 20-mer foszfor-tioát oligonukleotid az 5'-TGC ATC CCC CAG GCC ACC AT-3' szekvenciából áll (83. számú szekv.).
20. példa
Az ICAM-l-et célzó antiszensz oligonukleotidok egér modell rendszerben enyhítik a gyulladásos bélbetegséget
A gyulladásos bélbetegség (IBD) egér modelljét az utóbbi időben fejlesztették ki (Okayasu és mtsi, Gastroenterology, 98. 694-702, 1990). Egerekben a dextrán-szulfát beadása vastagbélgyulladást (colitis) indukál, amely majdnem minden részletében utánozza a humán IBD-t. A dextrán-szulfáttal indukált IBD-t és a humán IBD-t szövettanilag összehasonlítottuk, s azt találtuk, hogy az egér modell kiválóan reprodukálható és megbízható modell. Ebben a példában ezt a modellt használjuk az egér ICAM-1 3'-transzlálatlan régiójával komplementer, 20 bázisból álló, antiszensz foszfor-tioát oligonukleotid (ISIS 3082) hatásának teszteléséhez.
»··♦ · ··*·· ·· · · · · ·· β9·99 · ·* • · 9 9 ·· ♦ ·· 4·· ···♦
- 64 Körülbelül 25-30 g testtömegű, nyolchetes nőstény Swiss Webster egereket standard körülmények között tartottunk. Az egereket a kísérlet előtt legalább 5 napig hagytuk akklimatizálódni. Az egereknek ivóvizükben 5 napon keresztül 5 %-os dextrán-szulfátot (bárhol beszerezhető) adtunk. Ezzel együtt gyógyszerészeti hordozóban ISIS 3082 oligonukleotidot, hordozót önmagában (negatív kontroll), és TGF-6-t (melyről ismert, hogy egerekben védelmet bitosít a dextrán-szulfát által közvetített vastagbélgyulladás ellen) adtunk. Az ISIS 3082 oligonukleotidot öt napon keresztül 1 mg/kg vagy 10 mg/kg dózisú naponkénti szubkután injekcióval adtuk be. A TGF-G-t egerenként 1 ug dózisban vastagbélen keresztül adtuk be. A dextrán-szulfáttal által indukált vastagbélgyulladás elleni védelemben az oligonukleotid 1 mg/kg mennyiségben ugyanolyan hatásos volt, mint a TGF-6.
Az egereket a 6. napon leöltük, és vastagbelüket szövettani vizsgálatnak vetettük alá. A leölés előtt a betegség aktivitását az egerek tömegváltozásainak megfigyelésével, és ürülékükben a vastagbélgyulladás bizonyítékainak vizsgálatával ellenőriztük. Az egerek tömegét naponta mértük. Az egerek ürülékét naponta állagának változásaira és a rejtett vagy szabad szemmel látható vérzések jelenlétére vizsgáltuk. Betegség aktivitási index kialakításához olyan értékelési rendszert alkalmaztunk, mellyel a tömegcsökkenést, ürülék állagot és a vérzések jelenlétét O-tól 3-ig terjedő skálán értékeltük (0 = normális, 3 = súlyos), s az indexet ezek alapján számítottuk ki. A • »··4 • · <··*· * • · * ·· --- ·· « · • · · · · · ··· ··· ·* ·* ··
- 65 betegség aktivitási indexének gyógyszerrel indukált változásait statisztikusan vizsgáltuk. Kimutattuk, hogy a betegség aktivitási index általánosan nagyon Jó összefüggést mutat a gyulladásos bélbetegséggel. Az eredményeket a 16. ábrán mutatjuk be. Az oligonukleotid 1 mg/kg mennyiségben a betegség indexet 40 %-kal csökkentette.
21. példa
Az ICAM-l-et célzó oligonukleotidok a rendellenes elhelyezkedésű (heterotóp) szív transzplantációs egér modellben fokozzáik a túlélést
Az ICAM-1 antiszensz oligonukleotid átültetett idegen szövet kilökődését megakadályozó hatásainak meghatározása érdekében az egér ICAM-1 specifikus oligonukleotidot (ISIS 3082) vérerekkel ellátott heterotop szív transzplantációs egér modellben teszteltük az aktivitásra. Balb/c egerek szívét elsődlegesen vérerekkel ellátott idegen szövetként lényegében Isobe és mtsi (Circulation, 84. 1246-1255, 1991) leírása szerint C3H egerek hasüregébe ültettük át. Az oligonukleotidokat hétnapos Alzet pumpával folyamatos intravénás adagolással adtuk be. A kezeletlen egerek átlagos túlélési ideje 9,2 + 0,8 nap volt (8, 9, 9, 9, 10 és 10 nap). Az egerek hét napig 5 mg/kg ISIS 3082 oligonukleotiddal végzett kezelése az átlagos túlélési időt 14,3 ± 4,6 napra növelte (11, 12, 13, 21 nap).
22. példa
Az ICAM-l-et célzó antiszensz oligonukleotidok csökkentik a leukocita migrációt
A leukociták szövetekbe és szervekbe történő beszűrődése a gyulladásos folyamat fő alkotóeleme, s hozzájárul a gyulladásból eredő károsodáshoz. Az ISIS 3082 oligonukleotid leukocita migrációra gyakorolt hatását olyan egér modell alkalmazásával vizsgáltuk, melyben az egerekbe karragén tengeri moszatban (Chondrus crispus) áztatott szivacsokat ültettünk. A karragén leukocita migrációt és ödémát okoz. Az oligonukleotid leukocita migrációra gyakorolt hatását a gyulladásos váladékban a beültetett szivacsokba beszűrődő leukociták mennyiségének meghatározásával értékeltük. 4 órás koplaltatás után 40 egeret nyolc csoportba (mindegyikben öt egér) osztottunk. Az egereket MetofaneR-nal elaltattuk, s bőrük alá 1 ml 20 mg/ml koncentrációjú karragén oldattal impregnált poliészter szivacsot ültettünk. Az 1. csoportnak a szivacs beültetése előtt négy órával intravénásán 10 ml/kg sóoldatot adtunk, s ez a csoport képezte a vivőanyag
kontrollt. A 2. csoportnak közvetlenül a műtét után, majd
6-8 órával, végül 21 órával később orálisan 3 mg/kg
indometacint adtunk (20 ml/kg térfogatban) (pozitív
kontroll). A 3. csoportnak a szivacs beültetése előtt
intravénásán 5 mg/kg ISIS 3082 oligonukleotidot adtunk. A 4.
csoportnak közvetlenül a szivacs beültetése után, míg az 5..
6., 7. és 8. csoportnak a szivacs beültetése után 2, 4, 8, illetve 18 órával adtuk be intravénásán az 5 mg/kg ISIS 3082 • · ·
- 67 oligonukleotidot. A beültetés után 24 órával a szivacsokat eltávolítottuk, EDTA és sóoldat elegyébe (5 ml) merítettük, majd kipréseltük belőlük a folyadékot. A szivacsból kipréselt váladékban meghatároztuk a leukociták összes számát.
Az indometacin 3 mg/kg mennyiségben orálisan végzett beadása a vivőanyag kontroll csoporttal összehasonlítva az átlagos leukocita szám 79 %-os csökkenését eredményezte.
A 3. csoportban, ahol az ISIS 3082 oligonukleotidot 5 mg/kg mennyiségben a szivacs beültetése előtt adtuk be, az átlagos leukocita szám 42 %-os csökkenését tapasztaltuk. A 4. csoportban, ahol az ISIS 3082 oligonukleotidot 5 mg/kg mennyiségben közvetelnül a szivacs beültetése után adtuk be, az átlagos leukocita szám 47 %-os csökkenését figyeltük meg.
A vizsgálat ideje alatt valamennyi állat normálisnak tűnt.
Szekvenciáiista
Szekvenciák száma: 85
TUDNIVALÓK AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 18 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TGGGAGCCAT AGCGAGGC 18
TUDNIVALÓK A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GAGGAGCTCA GCGTCGACTG 20
TUDNIVALÓK A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GACACTCAAT AAATAGCTGG T 21
TUDNIVALÓK A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 18 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GAGGCTGAGG TGGGAGGA 18
TUDNIVALÓK AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 18 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CGATGGGCAG TGGGAAAG 18
TUDNIVALÓK A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav • · (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 6. SZÁMÚ
GGGCGCGTGA TCCTTATAGC
TUDNIVALÓK A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 7. SZÁMÚ
CATAGCGAGG CTGAGGTTGC
TUDNIVALÓK A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 8. SZÁMÚ
CGGGGGCTGC TGGGAGCCAT
TUDNIVALÓK A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
(A) HOSSZÚSÁG: 20
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
AGAGCCCCGA GCAGGACCAG 20
TUDNIVALÓK A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TGCCCATCAG GGCAGTTTGA 20
TUDNIVALÓK A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 11. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGTCACACTG ACTGAGGCCT 20
TUDNIVALÓK A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CTCGCGGGTG ACCTCCCCTT 20
TUDNIVALÓK A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TCAGGGAGGC GTGGCTTGTG 20
TUDNIVALÓK A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
«··· ·· ····
- 73 CCTGTCCCGG GATAGGTTCA
TUDNIVALÓK A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 15. SZÁMÚ
CCCCCACCAC TTCCCCTCTC
TUDNIVALÓK A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 16. SZÁMÚ
TTGAGAAAGC TTTATTAACT
TUDNIVALÓK A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 14 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris ··« » · ··· ····· · · · • · · · · · *····· ·· ♦ · · ·
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
- 74 (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 17. SZÁMÚ
AGCCATAGCG AGGC
TUDNIVALÓK A 18. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 12 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 18. SZÁMÚ
HCCATAGCGAG GC
TUDNIVALÓK A 19. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 10 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 19. SZÁMÚ
ATAGCGAGGC
TUDNIVALÓK A 20. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 16 (B) TÍPUS: nukleinsav
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
···· · · ···· · • · · · · · • ·· · · * · • » · · · (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 20. SZÁMÚ
TGGGAGCCAT AGCGAG
TUDNIVALÓK A 21. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 16 '(B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 21. SZÁMÚ
GGAGCCATAG CGAGGC
TUDNIVALÓK A 22. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 22. SZÁMÚ
GCCCAAGCTG GCATCCGTCA
TUDNIVALÓK A 23. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
- 76 • · · ·
(A) HOSSZÚSÁG: 20
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 23. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TCTGTAAGTC TGTGGGCCTC 20
TUDNIVALÓK A 24. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 24. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
AGTCTTGCTC CTTCCTCTTG 20 *
TUDNIVALÓK A 25. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 25. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CTCATCAGGC TAGACTTTAA 20 • ···· · · ♦·«· « ·««' ·« ··· ····· * a · • * ♦ · · · «««*·· ·· ·♦ · ·
TUDNIVALÓK A 26. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 26. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TGTCCTCATG GTGGGGCTAT 20
TUDNIVALÓK A 27. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 22 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 27. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TCTGAGTAGC AGAGGAGCTC GA 22
TUDNIVALÓK A 28. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 22
(B) TÍPUS : nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 28. SZÁMÚ
CAATCATGAC TTCAAGAGTT CT
TUDNIVALÓK A 29. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 29. SZÁMÚ
ACCACACTGG TATTTCACAC
TUDNIVALÓK A 30. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 30. SZÁMÚ
GTATGGAAGA TTATAATATA T
TUDNIVALÓK A 31. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú « < · ·· «4 ···· » *· « · « · ·· ······ « · • · · · · · * ·> · ··« ·· ♦· ·*
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
»· « · (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 31. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CACAATCCTT AAGAACTCTT T 21
TUDNIVALÓK A 32. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 32. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
ACCTCTGCTG TTCTGATCCT 20
TUDNIVALÓK A 33. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 33. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CTGCTGCCTC TGTCTCAGGT 20
TUDNIVALÓK A 34. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 15 « ·«*· ·· ···· · ·· 4 * · * ·* «···«· · · • · · * « · • ·· <·< ·« ·· ·* (Β) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 34. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGTATTTGAC ACAGC
TUDNIVALÓK A 35. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 35. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
AATCATGACT TCAAGAGTTC T 21
TUDNIVALÓK A 36. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 36. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TGAAGCAATC ATGACTTCAA G 21 ···«
- 81 TUDNIVALÓK A 37. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 37. SZÁMÚ
TATAGGAGTT TTGATGTGAA
TUDNIVALÓK A 38. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 38. SZÁMÚ
ACAATGAGGG GGTAATCTAC A
TUDNIVALÓK A 39. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 39. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
• »·ΐί 9« ·'·· • · tf » · ·
- 82 GACAATATAC AAACCTTCCA T
TUDNIVALÓK A 40. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 40. SZÁMÚ
CCAGGCATTT TAAGTTGCTG T
TUDNIVALÓK A 41. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 41. SZÁMÚ
CCTGAAGCCA GTGAGGCCCG
TUDNIVALÓK A 42. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
(A) HOSSZÚSÁG: 20
(B) TÍPUS : nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 42. SZÁMÚ
GATGAGAAAA TAGTGGAACCA
TUDNIVALÓK A 43. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 19 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 43. SZÁMÚ
CTGAGCAAGA TATCTAGAT
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
TUDNIVALÓK A 44. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 19 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 44. SZÁMÚ
CTACACTTTT GATTTCTGT
SZEKVENCIA:
TUDNIVALÓK A 45. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 22 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 45. SZÁMÚ
TTGAACATAT CAAGCATTAG CT
TUDNIVALÓK A 46. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 22 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 46. SZÁMÚ
TTTACATATG TACAAATTAT GT
TUDNIVALÓK A 47. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 22 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 47. SZÁMÚ
AATTATCACT TTACTATACA AA
TUDNIVALÓK A 48. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
(A) HOSSZÚSÁG: 21
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 48. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
AGGGCTGACC AAGACGGTTG T 21
TUDNIVALÓK A 49. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 49. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CCATCTTCCC AGGCATTTTA 20
TUDNIVALÓK AZ 50. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 50. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
AACCCAGTGC TCCCTTTGCT
TUDNIVALÓK AZ 51. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 51. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGCCACATTG GGAAAGTTGC 20
TUDNIVALÓK AZ 52. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 52. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GAAGTCAGCC AAGAACAGCT 20
TUDNIVALÓK AZ 53. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 53. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
• ·
ACAGGATCTC TCAGGTGGGT
TUDNIVALÓK AZ 54. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 54. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CCAAAGTGAG AGCTGAGAGA 20
TUDNIVALÓK AZ 55. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 55. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CTGATTCAAG GCTTTGGCAG 20
TUDNIVALÓK AZ 56. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20
(. B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris ··· · · ··· • · · · · · · · • · · · · ·
- 88 (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 56. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TTCCCCAGAT GCACCTGTTT 20
TUDNIVALÓK AZ 57. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 57. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGGCCAGAGA CCCGAGGAGA 20
TUDNIVALÓK AZ 58. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 58. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
ACGTTTGGCC TCATGGAAGT 20
TUDNIVALÓK AZ 59. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 59. SZÁMÚ
GGAATGCAAA GCACATCCAT
TUDNIVALÓK A 60. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 60. SZÁMÚ
CGATGCAGAT ACCGCGGAGT
TUDNIVALÓK A 61. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 61. SZÁMÚ
GCCTGGGAGG GTATTCAGCT
TUDNIVALÓK A 62. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
(A) HOSSZÚSÁG: 20
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 62. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CCTGTGTGTG CCTGGGAGGG 20
TUDNIVALÓK A 63. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 63. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
GGCATTTTAA GTTGCTGTCG 20
TUDNIVALÓK A 64. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 64. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CAGCCTGCCT TACTGTGGGC • · ···« ·· · · · · • · · · • · · · · · ·
- 91 TUDNIVALÓK A 65. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21.
(B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 65. SZÁMÚ
CTTGAACAAT TAATTCCACC T
TUDNIVALÓK A 66. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 66. SZÁMÚ
TTACCATTGA CATAAAGTGT T
TUDNIVALÓK A 67. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 67. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
··♦·
- 92 CTGTGTCTCC TGTCTCCGCT
TUDNIVALÓK A 68. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 68. SZÁMÚ
GTCTTTGTTG TTTTCTCTTCC
TUDNIVALÓK A 69. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 69. SZÁMÚ
TGAACATATC AAGCATTAGC
TUDNIVALÓK A 70. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris • · · · · ··· • ··♦ · · · · • · · · · · ······ ·· ·· ·«
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
• · ···* ·· · · · · • · · · ··· · · · » · · · · (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 70. SZÁMÚ
GCAATCTTGC TATGGCATAA
TUDNIVALÓK A 71. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 71. SZÁMÚ
CCCGGCATCT TTACAAAACC
TUDNIVALÓK A 72. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 72. SZÁMÚ
AACATCTCCG TACCATGCCA
TUDNIVALÓK A 73. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 22 (B) TÍPUS: nukleinsav
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
• ···· ·· ···· * ·«· · · · ·· • ··· · « · · (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 73. SZÁMÚ
TCACTGCTGC CTCTGTCTCA GG
TUDNIVALÓK A 74. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 23 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 74. SZÁMÚ
TGATTCTTTT GAACTTAAAA GGA
TUDNIVALÓK A 75. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 75. SZÁMÚ
TTAAAGGATG TAAGAAGGCT
TUDNIVALÓK A 76. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
(i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK • ·· ♦ 9 9 99 99
(A) HOSSZÚSÁG: 19
(B) TÍPUS : nukleinsav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 76. SZÁMÚ
CATAAGCACA TTTATTGTC 19
TUDNIVALÓK A 77. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 77. SZÁMÚ
TTTTGGGAAG CAGTTGTTCA
TUDNIVALÓK A 78. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 21 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 78. SZÁMÚ
AACTGTGAAG CAATCATGAC T
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
SZEKVENCIA:
TUDNIVALÓK A 79. SZAMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 22 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 79. SZAMÖ SZEKVENCIA:
CCTTGAGTGG TGCATTCAAC CT 22
TUDNIVALÓK A 80. SZAMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 22 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 80. SZAMO SZEKVENCIA:
AATGCTTGCT CACACAGGCA TT 22
TUDNIVALÓK A 81. SZAMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK
(A) HOSSZÚSÁG: 18
(B) TÍPUS: nukle insav
(C) SZÁL: egyszálú
(D) ALAK: lineáris
(iv) ANTI-SZENSZ: igen
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 81. SZÁMO SZEKVENCIA:
GCCTCGCTAT GGCTCCCA 18
TUDNIVALÓK A 82. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 18 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 82. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
CATGGCGCGG GCCGCGGG 18
TUDNIVALÓK A 83. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 83. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TGCATCCCCC AGGCCACCAT 20
TUDNIVALÓK A 84. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú • ·*·« · · * · » · · ··* · · · ·♦ t ··· · · ·· • 4 · · ·· *·· ··fc ·· * *»· (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 84. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TCTGAGTAGC AGAGGAGCTC20
TUDNIVALÓK A 85. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (iv) ANTI-SZENSZ: igen (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 85. SZÁMÚ SZEKVENCIA:
TATGTCTCCC CCACCACTTC ···· · 4 · · 4 ·
4**444 ·· • · 4 4 *4

Claims (3)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Oligonukleotid, amely a sejttapadás befolyásolására képes proteint kódoló nukleinsav legalább egy részével specifikusan hibridizálható.
    2. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amely mRNS-sel specifikusan hibridizálható. 3. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amely
    háromszálú struktúrát képezve specifikusan hibridizálható egy génnel, befolyásolva ezáltal az említett génről átíródó mRNS mennyiségét.
    4. A
  2. 2. igénypont szerinti oligonukleotid, amely transzkripciós kezdőhellyel, transzlációs kezdőhellyel, 5'-transzlálatlan szekvenciákkal, 3'-transzlálatlan szekvenciákkal vagy intron/exon érintkezési hellyel specifikusan hibridizálható.
    5. A 4. igénypont szerinti oligonukleotid, amely 5' cap hellyel vagy közbenső szekvenciával specifikusan hibridizálható.
    6. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amely az intercelluláris adhéziós molekula-1 expresszióját befolyásolj a.
    *··· «· *··»
    - 100
    7. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amely az endoteliális leukocita adhéziós molekula-1 expresszióját befolyásolja.
    8. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, amely a vaszkuláris endotél adhéziós molekula-1 expresszióját befolyásolja.
    igénypont szerinti oligonukleotid, amely körülbelül 3-50 nukleotidot tartalmaz.
    10. Az 1.
    igénypont szerinti oligonukleotid, amely körülbelül 8-25 nukleotidot tartalmaz.
    11. Az 1.
    igénypont szerinti oligonukleotid, amely körülbelül 10-20 nukleotidot tartalmaz.
    12. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti oligonukleotidot és gyógyszerészetileg megfelelő hordozót tartalmaz.
    13. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, melyben a nukleotidok közötti kapcsoló csoportok legalább egyike
    kéntartalmú.
    14. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, melyben a nukleotidok közötti kapcsoló csoportok legalább egyike
    foszfor-tioát gyököt tartalmaz.
    • •«4 ·· ····
    - 101
    15. Oligonukleotid, amely az 1., 2., 3., 4., 5., 6., 7.,
    8., 13., 14., 15., 16., 22., 28., 40., 41., 42., 43., 44.,
    45., 46., 47., 48., 73., 74., 75., 76., 77., 78., 79., 80. vagy 85. számú szekvenciát tartalmazza.
    16. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a 15. igénypont szerinti oligonukleotidot és gyógyszerészetileg megfelelő hordozót tartalmaz.
    17. A 15. igénypont szerinti oligonukleotid, melyben a nukleotidok között kapcsoló csoportok legalább egyike kéntartalmú változatot tartalmaz.
    18. A 15. igénypont szerinti oligonukleotid, melyben a nukleotidok közötti kapcsoló csoportok legalább egyike foszfor-tioát gyököt tartalmaz.
    19. Eljárás intercelluláris adhéziós molekulák szintézisének sejtben vagy szövetben történő befolyásolására, azzal jellemezve, hogy a sejtet vagy szövetet a sej tben vagy szövetben a sejttapadás befolyásolására képes protein legalább egy részét kódoló
    nukleinsavval specifikusan hibridizálható oligonukleotiddal hozzuk érintkezésbe, és a sejtben vagy szövetben módosítjuk a sejtadhéziós molekulák szintézisét.
    20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amely
    - 102 - • *· ···· · V» « · · · ·· • ··· · · * · • · · · Λ · ··· ··· ·· ·· ·· transzkripciós kezdőhellyel, transzlációs kezdőhellyel, 5'-transzlálatlan szekvenciával, 3'-transzlálatlan szekvenciákkal vagy közbenső szekvenciával specifikusan hibridizálható.
    21. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amely specifikusan hibridizálható az mRNS 5' cap (sapka) helyével vagy egy szomszédos szekvenciával.
    22. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett proteinként az intercelluláris adhéziós molekula-1 szintézisét befolyásoljuk.
    23. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett proteinként az endoteliális leukocita adhéziós molekula-1 szintézisét befolyásoljuk.
    24. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett proteinként a vaszkuláris sejtadhéziós molekula-1 szintézisét befolyásoljuk.
    25. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,
    77., 78., 79., 80. vagy 85. számú szekvenciát tartalmazza.
    • · ·
    - 103 -
    26. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amelyben a nukleotidok közötti kapcsoló csoportok legalább egyike kéntartalmú.
    27. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amelyben a nukleotidok közötti kapcsoló csoportok legalább egyike foszfor-tioát gyököt tartalmaz.
    28. Eljárás feltételezhetően intercelluláris adhéziós molekulák módosításával befolyásolható betegségben szenvedő állat kezelésére, azzal jellemezve, hogy az állatot egy protein legalább egy részét kódoló nukleinsavval specifikusan hibridizálható oligonukleotid hatásos mennyiségével hozzuk érintkezésbe, amely intercelluláris adhéziós molekulák szintézisét vagy anyagcseréjét befolyásolja.
    29. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett oligonukleotidként transzkripciós kezdőhellyel, transzlációs kezdőhellyel, 5'-transzlálatlan szekvenciákkal, 3'-transzlálatlan szekvenciákkal vagy közbenső szekvenciával specifikusan hibridizálható oligonukleotidot alkalmazunk.
    30. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett oligonukleotidként az mRNS 5' cap (sapka)
    104 helyével és szomszédos szekvenciákkal specifikusan hibridizálható oligonukleotidot alkalmazunk.
    31. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett proteinként az intercelluláris adhéziós molekula-1 szintézisét befolyásoljuk.
    32. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett proteinként az endoteliális leukocita adhéziós molekula-1 szintézisét befolyásoljuk.
    33. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett proteinként a vaszkuláris sejtadhéziós molekula-1 szintézisét befolyásoljuk.
    34. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett oligonukleotidot az oligonukleotidot gyógyszerészetileg megfelelő hordozóval együtt tartalmazó gyógyszerkészítményben adjuk be.
    35. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett oligonukleotidot helyileg adjuk be.
    36. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett oligonukleotidot az egész szervezetre kiterjedően adjuk be.
    37. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve', • · · ·
    - 105 - hogy olyan oligonukleotidőt alkalmazunk, amely az 1., 2.,
  3. 3., 4., 5., 6., 7., 8., 13., 14., 15.. 16., 22., 28., 40.,
    41., 42., 43., 44., 45., 46., 47., 48., 73., 74., 75., 76.,
    77., 78., 79., 80. vagy 85. számú szekvenciát tartalmazza.
    38. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amelyben a nukleotidok közötti kapcsoló csoportok legalább egyike kéntartalmú.
    39. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan oligonukleotidot alkalmazunk, amelyben a nukleotidok közötti kapcsoló csoportok legalább egyike foszfor-tioát gyököt tartalmaz.
    40. A 7. igénypont szerinti oligonukleotid, amely a 3. táblázatban felsorolt szekvenciák valamelyikét tartalmazza.
    41. A 7. igénypont szerinti oligonukleotid. amely a 31..
    32., 33., 35., 36., 52., 53., 54., 56., 57. vagy 58. számú szekvenciát tartalmazza.
    42. A 8. igénypont szerinti oligonukleotid, amely a 4. táblázatban megadott szekvenciák valamelyikét tartalmazza.
    43. A 8. igénypont szerinti oligonukleotid. amely az
    50., 51., 60., 63., 65., 67., 68., 70., 71. vagy 72. számú szekvenciát tartalmazza.
    • ·
    - 106 ···
    44. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett betegségként átültetett idegen szövet kilökődés kezelését végezzük.
    számú
    48. A 33. oligonukleotid. vagy 56. számú szekvencát tartalmazó 49. az 50. vagy 67. számú szekvencát tartalmazó oligonukleotid.
    50. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1., 15., 22. vagy 84. számú szekvenciát tartalmazó oligonukleotidőt alkalmazunk.
    51. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 33. vagy 56. számú szekvenciát tartalmazó oligonukleotidőt alkalmazunk.
    52. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 50. vagy 67. számú szekvenciát tartalmazó oligonukleotidőt alkalmazunk.
    • · · « ····
    - 107
    53. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal Jellemezve, hogy az 1., 15., 22. vagy 84. számú szekvenciát tartalmazó oligonukleotidot alkalmazunk.
    54. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal Jellemezve, hogy a 33. vagy 56. számú szekvenciát tartalmazó oligonukleotidot alkalmazunk.
    55. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal Jellemezve, hogy az 50. vagy 67. számú szekvenciát tartalmazó oligonukleotidot alkalmazunk.
    56. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal Jellemezve, hogy az említett betegségként pikkelysömör kezelését végezzük.
    57. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal Jellemezve, hogy az említett betegségként gyulladásos betegség kezelését végezzük.
    58. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal Jellemezve, hogy az említett gyulladásos betegségként gyulladásos bélbetegség kezelését végezzük.
    59. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal Jellemezve, hogy az említett gyulladásos betegségként leukocita beszűrődés (infiltráció) kezelését végezzük.
    - 108
    3 60. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,
    -> hogy az említett betegségként áttételekkel jellemezhető betegség kezelését végezzük.
    61. A 60. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett áttételes betegségként a tüdő áttételes betegségeit kezeljük.
    62. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett betegségként rosszindulatú melanoma kezelését végezzük.
    63. Eljárás áttétel kezelésére feltételezhetően áttételes betegségben szenvedő állatban, azzal jellemezve, hogy az állatot egy protein legalább egy részét kódoló nukleinsavval specifikusan hibridizálható oligonukleotid hatásos mennyiségével hozzuk érintkezésbe, amely intercelluláris adhéziós molekulák szintézisét vagy anyagcseréjét befolyásolja.
    64. A 63. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett oligonukleotidként transzkripciós kezdőhellyel, transzlációs kezdőhellyel, 5'-transzlálatlan szekvenciákkal, 3'-transzlálatlan szekvenciákkal vagy közbenső szekvenciával specifikusan hibridizálható oligonukleotidot alkalmazunk.
    65. A 63. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, ···#
    109 hogy az említett oligonukleotiáként az mRNS 5' cap (sapka) -* helyével és szomszédos szekvenciákkal specifikusan hibridizálható oligonukleotidot alkalmazunk.
    66. A 63. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett proteinként az intercelluláris adhéziós molekula-1 szintézisét befolyásoljuk.
    67. A 63. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett proteinként az endoteliális leukocita adhéziós molekula-1 szintézisét befolyásoljuk.
    68. A 63. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett proteinként a vaszkuláris sejtadhéziós molekula-1 szintézisét befolyásoljuk.
    69. A 63. igénypont szerinti eljárás, azzal Jellemezve, hogy az említett oligonukleotidot az oligonukleotidot gyógyszerészetileg megfelelő hordozóval együtt tartalmazó gyógyszerkészítményben adjuk be.
HU9500630A 1992-09-02 1993-08-27 Oligonucleotide modification of cell adhesion HUT69922A (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US93985592A 1992-09-02 1992-09-02
US08/007,997 US5591623A (en) 1990-08-14 1993-01-21 Oligonucleotide modulation of cell adhesion
US08/063,167 US5514788A (en) 1993-05-17 1993-05-17 Oligonucleotide modulation of cell adhesion

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9500630D0 HU9500630D0 (en) 1995-04-28
HUT69922A true HUT69922A (en) 1995-09-28

Family

ID=27358491

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9500630A HUT69922A (en) 1992-09-02 1993-08-27 Oligonucleotide modification of cell adhesion

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP0662003B1 (hu)
JP (3) JP2732546B2 (hu)
KR (1) KR0178958B1 (hu)
AT (1) ATE231915T1 (hu)
AU (2) AU673193B2 (hu)
CA (1) CA2143748A1 (hu)
DE (1) DE69332668T2 (hu)
FI (1) FI950948A (hu)
HU (1) HUT69922A (hu)
IL (1) IL106857A (hu)
NO (1) NO950800L (hu)
NZ (2) NZ299210A (hu)
WO (1) WO1994005333A1 (hu)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6111094A (en) * 1990-08-14 2000-08-29 Isis Pharmaceuticals Inc. Enhanced antisense modulation of ICAM-1
EP0626852A4 (en) * 1992-01-31 1996-03-20 Univ California Method for making universal donor cells.
US5792751A (en) * 1992-04-13 1998-08-11 Baylor College Of Medicine Tranformation of cells associated with fluid spaces
US5677291A (en) * 1993-12-10 1997-10-14 Hoechst Marion Roussel, Inc. Method of lowering serum cholesterol levels with 2,6-di-alkyl-4-silyl-phenols
WO1996015780A1 (en) * 1994-11-23 1996-05-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for preventing and treating allograft rejection
AUPN283195A0 (en) * 1995-05-05 1995-06-01 Australian Water Technologies Pty Ltd Method for the detection of viable cryptosporidium parvum cells
US5795876A (en) * 1996-04-30 1998-08-18 Hoechst Marion Rousssel, Inc. Method of inhibiting vascular cell adhesion molecule-1 and treating chronic inflammatory diseases with 2, 6-di-alkyl-4-silyl-phenols
US5608095A (en) * 1996-04-30 1997-03-04 Hoechst Marion Roussel, Inc. Alkyl-4-silyl-phenols and esters thereof as antiatherosclerotic agents
WO1997046671A1 (en) * 1996-05-30 1997-12-11 University Of British Columbia Enhanced efficacy of liposomal antisense delivery
US6114572A (en) * 1996-11-20 2000-09-05 Hoechst Marion Roussel, Inc. Substituted phenols and thiophenols useful as antioxidant agents
US6121463A (en) * 1997-06-24 2000-09-19 Hoechst Marion Roussel, Inc. Alkyl-4-silylheterocyclic phenols and thiophenols useful as antioxidant agents
US6133467A (en) * 1997-06-25 2000-10-17 Hoechst Marion Roussel, Inc. 2,6-di-t-butyl-4-[(dimethyl-4-methoxyphenylsilyl)-methyl-oxy]phenol and 2,6-di-t-butyl-4-[(dimethyl-2-methoxy-phenylsilyl)methyloxy]phenol
US6887906B1 (en) 1997-07-01 2005-05-03 Isispharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the delivery of oligonucleotides via the alimentary canal
AU1207999A (en) * 1997-10-30 1999-05-24 Brigham And Women's Hospital Control of lymphocyte localization by leep-cam activity
US6197584B1 (en) * 1998-05-01 2001-03-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of CD40 expression
EP1080103A4 (en) * 1998-05-21 2003-07-02 Isis Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR NON-PARENTERAL ADMINISTRATION OF OLIGONUCLEOTIDES
DE59904870D1 (de) * 1998-09-25 2003-05-08 Deutsches Krebsforsch Antisense-sequenzen für die hemmung der expression des adhäsionsmoleküls icam-1
DE19844111A1 (de) * 1998-09-25 2000-04-20 Deutsches Krebsforsch Antisense-Sequenzen für die Hemmung der Expression des Adhäsionsmoleküls ICAM-1
GB9825555D0 (en) * 1998-11-20 1999-01-13 Imp College Innovations Ltd Suppression of xenotransplant rejection
IL131047A0 (en) * 1999-07-22 2001-01-28 Yeda Res & Dev Use of il-18 inhibitors
DE10019252A1 (de) * 2000-04-18 2001-10-31 Klaus Karl Degitz Polydesoxyribonukleotide zur Hemmung der ICAM-1-Genexpression
WO2005082340A2 (en) * 2004-02-20 2005-09-09 Chiron Corporation Modulation of inflammatory and metastatic processes
ES2440799T3 (es) 2005-05-13 2014-01-30 Novartis Ag Métodos para tratar cáncer resistente a los fármacos
USRE47320E1 (en) 2007-11-20 2019-03-26 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of CD40 expression

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5272263A (en) * 1989-04-28 1993-12-21 Biogen, Inc. DNA sequences encoding vascular cell adhesion molecules (VCAMS)
AU641539B2 (en) * 1990-08-14 1993-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of cell adhesion
EP0691853B1 (en) * 1993-04-01 2002-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. ANTISENSE OLIGOS WHICH INTERFERE WITH mRNA CAP ACTIVITY AND INHIBIT TRANSLATION

Also Published As

Publication number Publication date
AU673193B2 (en) 1996-10-31
JPH09182594A (ja) 1997-07-15
NZ299210A (en) 2000-08-25
AU690858B2 (en) 1998-04-30
AU4840193A (en) 1994-03-29
NO950800L (no) 1995-04-24
EP0662003A4 (en) 1997-08-20
JP2937903B2 (ja) 1999-08-23
ATE231915T1 (de) 2003-02-15
JP2732546B2 (ja) 1998-03-30
KR0178958B1 (ko) 1999-03-20
EP0662003A1 (en) 1995-07-12
JP2948541B2 (ja) 1999-09-13
CA2143748A1 (en) 1994-03-17
FI950948A0 (fi) 1995-03-01
JPH08500736A (ja) 1996-01-30
JPH09182595A (ja) 1997-07-15
HU9500630D0 (en) 1995-04-28
WO1994005333A1 (en) 1994-03-17
IL106857A0 (en) 1993-12-08
FI950948A (fi) 1995-04-18
DE69332668D1 (de) 2003-03-06
IL106857A (en) 2005-07-25
NZ256171A (en) 1996-12-20
AU6449896A (en) 1996-12-05
EP0662003B1 (en) 2003-01-29
DE69332668T2 (de) 2003-12-18
NO950800D0 (no) 1995-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5514788A (en) Oligonucleotide modulation of cell adhesion
HUT69922A (en) Oligonucleotide modification of cell adhesion
US6015894A (en) Oligonucleotide modulation of cell adhesion
US5591623A (en) Oligonucleotide modulation of cell adhesion
JP3121599B2 (ja) ｒａｆ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド調節
CA2174315C (en) Oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5883082A (en) Compositions and methods for preventing and treating allograft rejection
EP0544716B1 (en) Oligonucleotide modulation of cell adhesion
US5856099A (en) Antisense compositions and methods for modulating type I interleukin-1 receptor expression
WO1996015780A1 (en) Compositions and methods for preventing and treating allograft rejection
EP0732941A1 (en) Modulation of vascular cell adhesion molecule expression through novel oligonucleotide interactions
US6849612B2 (en) Oligonucleotide modulation of cell adhesion
EP0580795A1 (en) Antisense oligonucleotides to c-kit proto-oncogene and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
DFC4 Cancellation of temporary protection due to refusal