JP3121599B2 - ｒａｆ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド調節 - Google Patents

ｒａｆ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド調節

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、異常細胞増殖およ
び腫瘍形成への関与が示唆されてきた天然に存在する細
胞性遺伝子であるｒａｆ遺伝子の発現を調節するための
組成物および方法に関する。本発明はまた、細胞の過増
殖を阻害するための方法にも関している；これらの方法
は診断的にまたは治療的に使用しうる。さらに、本発明
はｒａｆ遺伝子の発現に付随する病状の処置にも関す
る。
【０００２】
【従来の技術】直接的にまたは間接的に細胞の増殖およ
び分化を制御する細胞性遺伝子の変化は、癌の主原因と
考えられている。ｒａｆ遺伝子ファミリーはＡ−、Ｂ−
およびＣ−ｒａｆ（ｒａｆ−１とも呼ばれる）と称され
る三つの高度に保存された遺伝子を含む。ｒａｆ遺伝子
は細胞増殖を制御する信号伝達過程において重要な制御
的役割を果たしていると考えられているプロテインキナ
ーゼをコードしている。すべての肺癌細胞株の６０％は
ｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡおよび蛋白質を通常ではない高レ
ベルで発現していることが報告されているため、ｃ−ｒ
ａｆ蛋白質の発現は異常な細胞増殖に何らかの役割を果
たしていると考えられている。Ｒａｐｐｅｔ ａｌ．，
Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｅ．
Ｐ．Ｒｅｄｄｙ，Ａ．Ｍ Ｓｋａｌｋａ ａｎｄ Ｔ．
Ｃｕｒｒａｎ，ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１
９８８，ｐｐ．２１３−２５３。
【０００３】オリゴヌクレオチドは動物およびヒトの疾
患状態処置において治療用として用いられてきた。例え
ば、この分野の研究者は現在、ウイルス性、真菌性およ
び代謝疾患に示唆される遺伝子の発現を調節しうるアン
チセンス、トリプレックスおよび他のオリゴヌクレオチ
ド組成物を同定している。
【０００４】例えば、１９９２年８月４日に発行された
米国特許第５，１３５，９１７号はヒトインターロイキ
ン−１レセプター発現を阻害するアンチセンスオリゴヌ
クレオチドを提供している。Ｇａｗｉｒｔｚらの名前で
１９９２年３月２４日に発行された米国特許第５，０９
８，８９０号はｃ−ｍｙｂ癌遺伝子と相補的なアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドおよびある種の癌状態のアンチ
センスオリゴヌクレオチド治療に関している。１９９２
年２月１１日に発行された米国特許第５，０８７，６１
７号はアンチセンスオリゴヌクレオチドによる癌患者の
処置法を提供している。１９９２年１１月２４日に発行
された米国特許第５，１６６，１９５号はＨＩＶのオリ
ゴヌクレオチド阻害剤を提供している。１９９１年４月
２日に発行された米国特許第５，００４，８１０号は単
純ヘルペスウイルスＶｍｗ６５ｍＲＮＡにハイブリダイ
ズして複製を阻害しうるオリゴマーを提供している。１
９９３年３月１６日に発行された米国特許第５，１９
４，４２８号はインフルエンザウイルスに対して抗ウイ
ルス活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提
供している。１９８９年２月２１日に発行された米国特
許第４，８０６，４６３号はアンチセンスオリゴヌクレ
オチドおよびＨＴＬＶ−III複製の阻害にそれらを用い
る方法を提供している。１９９４年２月１５日に発行さ
れた米国特許第５，２８６，７１７号（Ｃｏｈｅｎ ｅ
ｔ ａｌ．）は癌遺伝子に相補的な混合結合オリゴヌク
レオチドホスホロチオエートに関している。米国特許第
５，２７６，０１９号および第５，２６４，４２３号
（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．）は細胞における外来性核
酸の複製阻害に使用されるホスホロチオエートオリゴヌ
クレオチド類似体に関している。アンチセンスオリゴヌ
クレオチドは安全にヒトへ投与され、ウイルスおよび細
胞性遺伝子産物の両方を標的とするいくつかのアンチセ
ンスオリゴヌクレオチド薬剤の臨床応用が現在進行中で
ある。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ＩＳＩ
Ｓ２９２２はＡＩＤＳ患者のサイトメガロウイルス網膜
炎に対して有効であることが示されている。ＢｉｏＷｏ
ｒｌｄ Ｔｏｄａｙ、１９９４年４月２９日、ｐ３。従
って、オリゴヌクレオチドは有用な治療手段であり、細
胞および動物（特にヒト）の処置のための処置養生法で
有用であろうことは確立されている。
【０００５】遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオ
チド阻害はｒａｆ遺伝子の役割の理解において有用な道
具であることが証明されている。ヒトｃ−ｒａｆの最初
の６つのコドンに相補的であるアンチセンスオリゴヌク
レオチドを用いて、インターロイキン−２（ＩＬ−２）
に対するＴ細胞のマイトジェン応答にｃ−ｒａｆを必要
とすることが示された。オリゴヌクレオチドで処理した
細胞はほとんど全部のｃ−ｒａｆ蛋白質の消失およびＩ
Ｌ−２に対する増殖応答の実質的な減少を示した。Ｒｉ
ｅｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１９９３，２３，３１４６−３１５０。Ｒａｐｐら
はプロモーターの下流にアンチセンス配向したｒａｆ遺
伝子を含む発現ベクター、および細胞でアンチセンスｒ
ａｆ遺伝子または突然変異したｒａｆ遺伝子を発現させ
ることによるｒａｆ発現阻害の方法を開示している。Ｗ
Ｏ出願９３／０４１７０。マウスｃ−ｒａｆのコドン１
−６に相補的なアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレ
オチドを用いてラット肝癌細胞株Ｈ４IIＥにおけるＤＮ
Ａ合成のインシュリン刺激を回避した。Ｔｏｒｎｋｖｉ
ｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，１９９
４，２６９，１３９１９−１３９２１。ＷＯ出願９３／
０６２４８号は、ｃ−ｒａｆ遺伝子領域を増幅し、およ
び突然変異の証拠についてそれを分析することを特徴と
する、癌を発生する危険性が大きい個体の同定法および
癌にかかった患者の予後および適当な処置を決定するた
めの方法を開示している。
【０００６】Ｄｅｎｎｅｒらはｒａｆ遺伝子にハイブリ
ダイズするアンチセンスポリヌクレオチド、およびそれ
らを使用する方法を開示している。ＷＯ９４／１５６４
５。ヒトおよびラットｒａｆ配列にハイブリダイズする
オリゴヌクレオチドが開示されている。
【０００７】Ｉｎｖｅｒｓｅｎらはｒａｓ−活性化癌細
胞を殺すことができるｒａｆに相補的なヘテロ型アンチ
センスオリゴヌクレオチドおよびｒａｆ−活性化癌細胞
を殺す方法を開示している。多数のオリゴヌクレオチド
配列が開示されているが、そのどれもが実際にはアンチ
センスオリゴヌクレオチド配列ではない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】ｒａｆ遺伝子発現を阻
害するための改良された組成物および方法が長く待ち望
まれている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明はヒトｒａｆをコ
ードしている核酸を標的とし、かつｒａｆ発現を阻害し
うるオリゴヌクレオチドを提供する。本発明はまたヒト
ｒａｆをコードしている核酸を標的とするキメラオリゴ
ヌクレオチドも提供する。本発明のオリゴヌクレオチド
は診断および治療の両方に有用であると考えられ、本発
明の方法において特に有用であると考えられる。
【００１０】本発明はまた、ヒトｒａｆの発現、特にｒ
ａｆの異常発現を阻害する方法を含む。これらの方法
は、ｒａｆ発現および過増殖が連携しているため、治療
および診断の両方に有用であると考えられる。これらの
方法はまた、例えば種々の細胞機能および生理学的過程
および状態におけるｒａｆ発現の役割を検出および決定
するための、およびｒａｆ発現に付随する状態を診断す
るための道具としても有用である。
【００１１】本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチ
ドを用いる細胞の過増殖を阻害する方法も提供する。こ
れらの方法は、例えば、ｒａｆに付随する細胞過増殖の
診断に有用であると考えられる。異常な増殖的状態の処
置法もまた提供される。これらの方法は本発明のオリゴ
ヌクレオチドを使用している。これらの方法は、治療的
におよび臨床的研究および診断の道具としても有用であ
ると考えられる。
【００１２】
【発明の実施の形態】悪性腫瘍は、癌細胞の特性である
増殖制御の消失を引き起こす一連の段階的進行性変化を
経て発育する。即ち、連続的非制御増殖、周りの組織を
侵襲する能力および異なる器官部位へ転移する能力。注
意深く制御されたインビトロでの研究から、正常および
新生物性細胞の増殖を特徴付ける因子を定義する手がか
りが得られ、細胞増殖および分化を制御する特定の蛋白
質の同定が導かれた。ｒａｆ遺伝子はＡ−、Ｂ−および
ｃ−ｒａｆと名付けられた関連する蛋白質をコードして
いる遺伝子ファミリーの一員である。ｒａｆ遺伝子は高
度に保存されたセリン−トレオニンー特異的プロテイン
キナーゼをコードしている。これらの酵素は異なるよう
に発現される；最も十分に特徴付けられているｃ−ｒａ
ｆは試験されたすべての器官およびすべての細胞株で発
現されている。Ａ−およびＢ−ｒａｆは各々尿性器およ
び脳組織で発現されている。ｃ−ｒａｆプロテインキナ
ーゼ活性および細胞内分布はリン酸化を通してマイトジ
ェンにより制御される。上皮増殖因子、酸性線維芽細胞
増殖因子、血小板由来増殖因子、インシュリン、顆粒球
−マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン
−２、インターロイキン−３およびエリトロポイエチン
を含む種々の増殖因子は、ｃ−ｒａｆのリン酸化を誘導
することが示されている。従って、ｃ−ｒａｆは多数の
増殖因子をそれらの正味の効果（細胞増殖）と結合さ
せ、正常細胞信号伝達経路において基本的な役割を果た
していると考えられている。
【００１３】ある種の異常増殖状態はｒａｆ発現に付随
すると考えられており、従ってｒａｆ発現の阻害に応答
すると考えられている。ｒａｆ蛋白質発現の異常な高レ
ベルはまた形質転換および異常な細胞増殖にも関係する
ことが示唆されている。これらの異常な増殖状態はｒａ
ｆ発現の阻害に応答的であると考えられている。異常な
増殖状態の例は、癌、腫瘍、過生、肺線維症、脈管形
成、乾癬、アテローム、および血管形成術後の狭窄また
は再狭窄のような血管内の平滑筋増殖のような過増殖障
害である。ｒａｆがその一部となっている細胞信号伝達
経路もまた、例えば、組織移植片拒否反応、エンドトキ
シンショックおよび糸球体腎炎のようなＴ細胞増殖（Ｔ
細胞活性化および増殖）により特徴付けられる炎症障害
と関係することが示唆されている。
【００１４】ｒａｆ遺伝子発現の除去または減少が異常
な細胞増殖を停止または逆転させることが観察された。
このことはｒａｆ発現のレベルが異常に高くはない場合
においても観察された。ｒａｆ遺伝子の発現を調節しう
る物質の組成物を提供することが非常に待望されてい
る。細胞、組織および動物におけるｒａｆ遺伝子の検出
法を提供することが非常に待望されている。また、異常
なｒａｆ遺伝子発現に付随する異常な増殖状態の診断お
よび治療の方法を提供することも待望されている。さら
に、ｒａｆ遺伝子の検出および研究のためのキットおよ
び試薬も待望されている。ここで”異常な”ｒａｆ遺伝
子発現とは、ｒａｆ蛋白質の発現のレベルが異常に高い
こと、または異常な増殖状況または状態におけるｒａｆ
発現のレベルとして定義される。
【００１５】本発明はｒａｆをコードしている核酸を標
的とするオリゴヌクレオチドを用いる。オリゴヌクレオ
チドおよびそれがハイブリダイズするその相補的核酸標
的間のこの関係は通常”アンチセンス”と称されてい
る。本発明の文脈において、選択された核酸標的へのオ
リゴヌクレオチドの”標的化”は多段階過程である。こ
の過程は通常、その機能が調節されるべき核酸配列を同
定することから始まる。それは例えば、その発現が特定
の疾病状態に付随する細胞性遺伝子（または遺伝子から
作られるｍＲＮＡ）または感染作因からの外来性核酸で
あろう。本発明において、標的はｒａｆをコードしてい
る核酸である；別の表現では、ｒａｆ遺伝子またはｒａ
ｆ遺伝子から発現されるｍＲＮＡである。標的化過程に
はまた、所望の効果（遺伝子発現の調節）が得られるよ
うに、オリゴヌクレオチドとの相互作用を起こす核酸配
列内の一つまたは複数の部位の決定が含まれる。一つま
たは複数の部位が同定されたら、標的に十分相補的な
（即ち、十分な特異性で十分よくハイブリダイズし、所
望の調節が得られる）オリゴヌクレオチドが選択され
る。
【００１６】本発明の文脈において、”調節”とは阻害
または刺激を意味している。ｒａｆ遺伝子発現の阻害は
現在のところ調節の好適な形である。この調節は例え
ば、本出願の実施例に教示されるように、ｍＲＮＡ発現
のノーザンブロットアッセイまたは蛋白質発現のウェス
タンブロットアッセイのような本分野では日常的な方法
により測定しうる。本出願の実施例に教示されるよう
に、細胞増殖または腫瘍細胞増殖に対する効果も測定可
能である。本発明の文脈において、”ハイブリダイゼー
ション”とは、通常相対する核酸鎖または核酸鎖の二つ
の領域の相補的塩基間の水素結合（ワトソンークリック
塩基対形成としても知られている）を意味している。グ
アニンおよびシトシンは相補的塩基の例であり、それら
の間で三つの水素結合が形成されることが知られてい
る。アデニンおよびチミンは相補的塩基の例であり、そ
れらの間で二つの水素結合が形成される。”特異的にハ
イブリダイズ可能”および”相補的”とは、ＤＮＡまた
はＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチドとの間で安定かつ特
異的な結合が起こるように十分な程度の相補性を示すの
に使用される術語である。特異的にハイブリダイズ可能
であるには、オリゴヌクレオチドはその標的核酸配列と
１００％相補的である必要はないことを理解されたい。
標的へのオリゴヌクレオチドの結合が標的分子の正常な
機能を妨害して有用性の消失を起こす場合、および特異
的結合が望まれる条件下、即ち、インビボアッセイまた
は治療的処置の場合には生理的条件下、またはインビト
ロアッセイの場合にはアッセイが実施される条件下で、
非標的配列へのオリゴヌクレオチドの非特異的結合を避
けるために十分な程度の相補性がある場合、オリゴヌク
レオチドは特異的にハイブリダイズ可能である。
【００１７】本発明の好適な実施態様において、ｃ−ｒ
ａｆおよびＡ−ｒａｆをコードしているｍＲＮＡを標的
とするオリゴヌクレオチドが提供される。本発明に従う
と、ｍＲＮＡは三文字遺伝コードを用いて蛋白質をコー
ドするための情報を運ぶコード領域のみを含むだけでな
く、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、５’キャッ
プ領域、イントロン領域およびイントロン／エクソンま
たはスプライス連結リボヌクレオチドとして知られてい
るような領域を形成する付随するリボヌクレオチドを含
むことを当業者は理解するであろう。従って、これらの
付随するリボヌクレオチド並びにコードリボヌクレオチ
ドの全部または一部を標的とするオリゴヌクレオチドを
本発明に従って処方することができる。好適な態様にお
いて、オリゴヌクレオチドはヒトｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡ
の翻訳開始部位（ＡＵＧコドン）または５’−または
３’−非翻訳領域の配列を標的とする。妨害されるべき
メッセンジャーＲＮＡの機能には、蛋白質翻訳の部位へ
のＲＮＡのトランスロケーション、ＲＮＡからの実際の
蛋白質の翻訳、ＲＮＡのスプライシングまたは成熟およ
びおそらくはＲＮＡにより行われているであろう独立し
た酵素活性のような生存のためのすべての機能が含まれ
る。ＲＮＡ機能のそのような妨害の全体的な効果はｒａ
ｆ蛋白質発現の妨害を起こすことである。
【００１８】本発明はｒａｆ遺伝子発現調節のためのオ
リゴヌクレオチドを提供する。そのようなオリゴヌクレ
オチドはｒａｆをコードしている核酸を標的とする。ｃ
−ｒａｆおよびＡ−ｒａｆの調整のためのオリゴヌクレ
オチドおよび方法が現在のところ好適である；しかしな
がら、ｒａｆの他の型の発現を調節するための組成物お
よび方法もまた有用性を有していると考えられ、本発明
に包含されている。前に定義したように、”調節”とは
阻害または刺激を意味している。ｒａｆ遺伝子の阻害は
現在のところ調節の好適な形である。
【００１９】本発明の文脈において、述語”オリゴヌク
レオチド”とは天然に存在する塩基、糖および糖間（主
鎖）結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドモノ
マーのオリゴマーまたはポリマーを意味している。述
語”オリゴヌクレオチド”はまた、同様に機能する天然
に存在しないモノマー、またはそれらの一部からなるオ
リゴマーも含まれる。そのような修飾または置換オリゴ
ヌクレオチドは、例えば、促進された細胞取り込みおよ
びヌクレアーゼ存在下での増加した安定性のため天然型
よりもしばしば好適である。
【００２０】本発明のある種の好適なオリゴヌクレオチ
ドはキメラオリゴヌクレオチドである。本発明の文脈に
おいて”キメラオリゴヌクレオチド”または”キメラ”
とは、各々少なくとも一つのヌクレオチドから作り上げ
られた二つまたはそれ以上の化学的に異なった領域を含
むオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオ
チドは典型的には、一つまたはそれ以上の有利な性質
（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増加、細胞内への取り込
みの増加、ＲＮＡ標的に対する結合親和性の増加）を与
える少なくとも一つの修飾されたヌクレオチド領域およ
びＲＮａｓｅＨ切断のための基質である領域を含む。一
つの好適な態様において、キメラオリゴヌクレオチド
は、標的結合親和性を増加させるために修飾された少な
くとも一つの領域および通常はＲＮａｓｅＨのための基
質として働く領域を含む。その標的（この場合、ｒａｆ
をコードしている核酸）に対するオリゴヌクレオチドの
親和性は、オリゴヌクレオチドと標的が解離する温度で
あるオリゴヌクレオチド／標的対のＴｍを測定すること
によりルーチン的に決定される；解離は分光学的に検出
される。Ｔｍが高いほど標的に対するオリゴヌクレオチ
ドの親和性は強い。より好適な態様では、ｒａｆ ｍＲ
ＮＡ結合親和性を増加させるために修飾されたオリゴヌ
クレオチドの領域は、糖の２’位が修飾された少なくと
も一つのヌクレオチド（最も好適であるのは２’−Ｏ−
アルキルまたは２’−フルオロ修飾ヌクレオチド）を含
む。そのような修飾はオリゴヌクレオチド内へルーチン
的に組み込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは与えら
れた標的に対し、２’−デオキシオリゴヌクレオチドよ
り高いＴｍ（即ちより強い標的結合親和性）を有してい
ることが示された。そのような増加した親和性の効果は
ｒａｆ遺伝子発現のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻
害を非常に増強することである。ＲＮａｓｅＨはＲＮ
Ａ：ＤＮＡデュープレックスのＲＮＡ鎖を切断する細胞
性エンドヌクレアーゼである；従ってこの酵素の活性化
はＲＮＡ標的の切断を生じ、アンチセンス阻害の効率を
非常に促進しうる。ＲＮＡ標的の切断はゲル電気泳動に
よりルーチン的に示すことができる。別の好適な態様に
おいて、ヌクレアーゼ耐性を増強するためにキメラオリ
ゴヌクレオチドも修飾される。細胞は核酸を分解しうる
種々のエキソ−およびエンド−ヌクレアーゼを含む。多
数のヌクレオチドおよびヌクレオシド修飾が、これらを
取り込んだオリゴヌクレオチドを天然のオリゴヌクレオ
チドよりヌクレアーゼ消化に対してより耐性とすること
が示されている。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオ
チドを細胞抽出物または単離ヌクレアーゼ溶液とともに
インキュベートし、通常はゲル電気泳動により、時間に
関して残存する無傷のオリゴヌクレオチドの程度を測定
することによりルーチン的に測定される。ヌクレアーゼ
耐性を増強するように修飾されているオリゴヌクレオチ
ドは非修飾オリゴヌクレオチドより長く無傷のままで残
る。ヌクレアーゼ耐性を増強または与えるための種々の
オリゴヌクレオチド修飾が示されている。現在のとこ
ろ、少なくとも一つのホスホロチオエート修飾を含むオ
リゴヌクレオチドがより好適である。いくつかの場合、
標的結合親和性を増強させるオリゴヌクレオチド修飾は
また、独立してヌクレアーゼ耐性を増強しうる。
【００２１】本発明において意図されるいくつかの好適
なオリゴヌクレオチドの特定の例においては、ホスホロ
チオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネー
ト、短鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間結合または
短鎖ヘテロ芳香環またはヘテロ環式糖間（”主鎖”）結
合が含まれているであろう。最も好適なものはホスホロ
チオエートおよびＣＨ2−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ2、 ＣＨ2−
Ｎ（ＣＨ3）−Ｏ−ＣＨ2（メチレン（メチルイミノ）ま
たはＭＭＩ主鎖として知られている）、ＣＨ2−Ｏ−Ｎ
（ＣＨ3）−ＣＨ2、 ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｎ（Ｃ
Ｈ3）−ＣＨ2およびＯ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2−ＣＨ2主
鎖（ここでホスホジエステルはＯ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ2であ
る）を含むものである。モルホリノ主鎖構造を有するオ
リゴヌクレオチドもまた好適である。Ｓｕｍｍｅｒｔｏ
ｎ，Ｊ．Ｅ．およびＷｅｌｌｅｒ，Ｄ．Ｄ．，米国特許
第５，０３４，５０６号。別の好適な態様においては、
蛋白質−核酸またはペプチド−核酸（ＰＮＡ）主鎖のよ
うにオリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖がポリ
アミド主鎖に置き換えられてもよく、塩基はポリアミド
主鎖のアザ窒素原子に直接または間接的に結合されてい
る。Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｒ．
Ｈ．Ｂｅｒｇ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
１９９１，２５４，１４９７。他の好適なオリゴヌク
レオチドは下記の基の一つを２’位に含むアルキルおよ
びハロゲン−置換糖部分を含んでいてもよい：ＯＨ、Ｓ
Ｈ、ＳＣＨ3、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ3ＯＣＨ3、ＯＣＨ3Ｏ
（ＣＨ2）nＣＨ3、Ｏ（ＣＨ2）nＮＨ2またはＯ（Ｃ
Ｈ2）nＣＨ3（式中ｎは１から約１０である）；Ｃlから
Ｃ10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリールも
しくはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ3；ＯＣ
Ｆ3；Ｏ−，Ｓ−，もしくはＮ−アルキル；Ｏ−，Ｓ
−，もしくはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ3；ＳＯ2Ｃ
Ｈ3；ＯＮＯ2；ＮＯ2；Ｎ3；ＮＨ2；ヘテロシクロアル
キル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミ
ノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；
コレステリル基；コンジュゲート；レポーター基；イン
ターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬動力学的特性
を改良する基；オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改
良する基および同様な特性を有する他の基。オリゴヌク
レオチドはペントフラノシル基の代わりにシクロブチル
のような糖模倣物を有していてもよい。他の好適な態様
では少なくとも一つの修飾塩基型またはイノシンのよう
な”万能塩基”を含んでいるであろう。
【００２２】本発明に従ったオリゴヌクレオチドは好適
には約８から約５０ヌクレオチドの長さである。本発明
の文脈においては８から５０モノマーを有する上記のよ
うな天然に存在しないオリゴマーを含むことを理解され
たい。
【００２３】本発明に従って使用されるオリゴヌクレオ
チドはよく知られた固相合成技術により都合よくルーチ
ン的に作製することができる。そのような合成の装置は
Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含むいくつか
の会社から売り出されている。そのような合成のために
他の手段を用いてもよい；オリゴヌクレオチドの実際の
合成はルーチン的に仕事をする人の手腕の範囲内であ
る。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のよう
な他のオリゴヌクレオチドを製造するために同様の技術
を使用することもよく知られている。また、蛍光標識、
ビオチニル化またはコレステロール修飾オリゴヌクレオ
チドのような他の修飾オリゴヌクレオチドを合成するた
めに、同様の技術およびビオチン、フルオレセイン、ア
クリジンまたはソラーレン修飾アミダイトおよび／また
は制御細孔ガラス（ＣＰＧ）（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡ）のような市販品として
入手可能な修飾アミダイトおよびＣＰＧ産物の使用もよ
く知られている。
【００２４】ｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡの一部を標的とする
ある種のオリゴヌクレオチドがｒａｆ発現の阻害および
細胞過増殖の妨害に特に有用であることが見いだされ
た。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いるｃ−ｒａ
ｆ発現の阻害のための方法も同様に細胞過増殖の妨害に
有用である。本発明の方法においては、組織または細胞
をオリゴヌクレオチドと接触させる。本発明の文脈にお
いて、組織または細胞を一つまたは複数のオリゴヌクレ
オチドと”接触”させるとは、インビトロまたはエクス
ビボで細胞懸濁液または組織試料へオリゴヌクレオチド
を加えるか（通常は液体担体中で）、または動物内の細
胞または組織にオリゴヌクレオチドを投与することを意
味している。
【００２５】治療のため、細胞の過増殖を阻害する方法
および異常な増殖性状態を処置する方法が提供される。
治療組成物の処方および続いての投与は本分野の技術範
囲であると考えられる。一般に、治療のためには、本発
明に従ったオリゴヌクレオチドを、医薬として受容可能
な担体中、特定の疾患の性質、その重態度および患者の
全体の状態に依存して変化するであろう用量および期
間、そのような治療が必要と思われる患者に投与する。
本発明の医薬組成物は、局所または全身処置が望まれる
か、または処置される領域に依存して多くの方法で投与
されるであろう。局所（目、膣、直腸、鼻孔内を含
む）、経口または例えば、静脈内滴注、静脈注射または
皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射による非経口で投与さ
れるであろう。
【００２６】局所投与のための処方には、軟膏、ローシ
ョン、クリーム、ゲル、ドロップ、座剤、スプレー、水
剤および散剤が含まれるであろう。通常の医薬担体、水
性、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要であるかま
たは望ましいであろう。被覆コンドーム、グローブなど
もまた有用である。
【００２７】経口投与のための組成物には散剤または顆
粒剤、懸濁剤または水または非水媒質溶液剤、カプセル
剤、サッシェ剤または錠剤が含まれる。増粘剤、芳香
剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤も望まし
いであろう。
【００２８】非経口投与のための処方には無菌水溶液が
含まれ、それは緩衝剤、希釈剤および他の適当な添加物
を含んでいてもよい。
【００２９】そのような医薬担体に加えて、オリゴヌク
レオチドの取り込みを容易にするためにカチオン性液体
が処方に含まれていてもよい。取り込みを容易にするそ
のような組成物の一つはリポフェクチン（ＢＲＬ，Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ ＭＤ）である。
【００３０】投与用量は処置されるべき状態の重度およ
び応答度に依存し、処置進行は治療が達成されるかまた
は疾患状態の軽減が達成されるまで数日から数カ月続
く。至適投与計画は体内の薬剤蓄積の測定から計算しう
る。当業者は容易に至適投与量、投与法および繰り返し
頻度を決定しうる。至適投与量は個々のオリゴヌクレオ
チドの相対的有効性に依存して変化するであろうが、一
般的にはインビトロおよびインビボの動物実験からのＥ
Ｃ５０に基づいて計算しうる。例えば、化合物の分子量
（オリゴヌクレオチド配列および化学構造から導かれ
る）およびＩＣ５０のような有効量（実験的に求められ
る）が与えられると、ｍｇ／ｋｇでの投与量がルーチン
的に計算される。
【００３１】本発明はまた、癌、乾癬または血管狭窄ま
たはアテロームのような過増殖性疾患を有すると疑われ
る患者からの組織または他の試料の異常増殖状態の診断
にも適している。細胞増殖を阻害する本発明のオリゴヌ
クレオチドの能力は、そのような状態を診断するために
用いられる。多くのアッセイが本発明を用いて計画でき
るが、そのようなアッセイは一般にそのような阻害を検
出および通常は定量化しうるように選択された条件下で
組織試料を本発明のオリゴヌクレオチドと接触させるこ
とを含んでいるであろう。同様に、本発明は有効な処置
計画が設計しうるように、他の病因を有する腫瘍からｒ
ａｆ付随性腫瘍を区別するために使用しうる。
【００３２】本発明のオリゴヌクレオチドはまた研究目
的にも使用されるであろう。従って、オリゴヌクレオチ
ドにより示される特異的ハイブリダイゼーションはアッ
セイ、精製、細胞生成物の調製および当業者により認め
られるであろう他の方法論で使用されるであろう。
【００３３】本発明のオリゴヌクレオチドはまたｒａｆ
発現の検出および診断に有用である。例えば、ポリヌク
レオチドキナーゼによる５’末端の32Ｐ標識により放射
性標識オリゴヌクレオチドを製造しうる。Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９，第２巻，ｐ１０．５９。
次に、放射性標識オリゴヌクレオチドをｒａｆ発現が疑
われる組織または細胞試料と接触させ、試料を洗浄して
非結合オリゴヌクレオチドを除去する。試料に残存して
いる放射活性は結合されたオリゴヌクレオチドを示して
おり（それはｒａｆの存在を示している）、シンチレー
ションカウンターまたは他の通常の手段により定量しう
る。放射性標識オリゴを用いて組織のオートラジオグラ
フィーを実施し、研究、診断または治療の目的でｒａｆ
発現の局在化、分布または量を決定することができる。
そのような研究においては、組織切片を放射性標識オリ
ゴヌクレオチドで処理し、上記のように洗浄し、次にル
ーチンオートラジオグラフィー法に従って写真乳化剤へ
暴露する。現像すると乳化剤はｒａｆを発現している範
囲に銀粒子のイメージを与える。銀粒子の定量によりｒ
ａｆ発現を検出することができる。
【００３４】ｒａｆ発現の蛍光検出のための類似のアッ
セイは、放射性標識の代わりにフルオレセインまたは他
の蛍光性標識とコンジュゲートさせた本発明のオリゴヌ
クレオチドを用いて開発することができる。そのような
コンジュゲートは、蛍光標識アミダイトまたはＣＰＧ
（例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉ
ｎｇ ＶＡから入手可能なフルオレセイン標識アミダイ
トおよびＣＰＧ。Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅ
ｒｌｉｎｇ ＶＡの１９９３年のＤＮＡ研究用製品カタ
ログｐ．２１を参照されたい）を使用した固相合成の間
にルーチン的に製造される。
【００３５】各々のこれらのアッセイの様式は本分野で
は既知である。当業者は本発明の技術に従って容易にこ
れらの既知のアッセイをｒａｆ発現の検出に適用でき、
ｒａｆ発現を検出する新規かつ有用な手段が提供され
る。 ｃ−ｒａｆ発現のオリゴヌクレオチド阻害 表１に示したオリゴヌクレオチドはＧｅｎｂａｎｋ ｃ
−ｒａｆ配列ＨＵＭＲＡＦＲ（Ｇｅｎｂａｎｋリストｘ
０３４８４）を用いて設計し、合成し、ノーザンブロッ
トアッセイを用いてＴ２４膀胱癌細胞でのｃ−ｒａｆ発
現の阻害について試験した。すべてホスホロチオエート
主鎖を有するオリゴデオキシヌクレオチドである。
【００３６】
【表１】
【００３７】１００ｎＭまたは２００ｎＭの濃度でのオ
リゴヌクレオチドの第一回目のスリーニングにおいて、
オリゴヌクレオチド５０７４、５０７５、５１３２、８
０３４、７８２６、７８２７および７８２８はｃ−ｒａ
ｆ ｍＲＮＡの少なくとも５０％の阻害を示し、それ故
これらのオリゴヌクレオチドが好適である。オリゴヌク
レオチド５１３２および７８２６（配列ＩＤ番号：８お
よび配列ＩＤ番号：１７）は約９０％を超える阻害を示
し、より好適である。別のアッセイにおいて、オリゴヌ
クレオチド６７２１，７８４８，７８４７および８０９
４はｃ−ｒａｆレベルを５０％以上減少させた。これら
のオリゴヌクレオチドもまた好適である。これらの内、
７８４７（配列ＩＤ番号：２２）はｃ−ｒａｆ ｍＲＮ
Ａの約９０％を超える阻害を示し、より好適である。 ｒａｆに対するＩＳＩＳ５１３２の特異性 ｒａｆ ｍＲＮＡに対するＩＳＩＳ５１３２の特異性
は、このオリゴヌクレオチドをＴ２４細胞においてＨａ
−ｒａｓならびにｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡを阻害する能力
について試験するノーザンブロットアッセイにより示さ
れた。Ｈａ−ｒａｓは形質転換および腫瘍発生への関与
が示唆されている細胞性癌遺伝子である。ＩＳＩＳ５１
３２はＨａ−ｒａｓ ｍＲＮＡレベルに影響を与えるこ
となくｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡをほとんど完全になくすこ
とが示された。 ２’−修飾オリゴヌクレオチド こららのオリゴヌクレオチドのあるものは、ホスホジエ
ステル（Ｐ＝Ｏ）またはホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）
主鎖で合成され、また一様に２’−Ｏ−メチル、２’−
Ｏ−プロピルまたは２’−フルオロ基で糖の２’位が置
換されていた。オリゴヌクレオチドは表２に示されてい
る。
【００３８】
【表２】
【００３９】一様な２’−Ｏ−メチル修飾およびホスホ
ロチオエート主鎖を有する表２のオリゴヌクレオチド
を、ウェスタンブロットアッセイにより決定されるＴ２
４細胞におけるｃ−ｒａｆ蛋白質発現の阻害能力につい
て試験した。オリゴヌクレオチド８０３３，７８３４お
よび７８３５が最も大きな阻害を示し、好適である。こ
れらの内、８０３３および７８３４がより好適である。 キメラオリゴヌクレオチド 配列ＩＤ番号：８を有するキメラオリゴヌクレオチドを
合成した。こられのオリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メ
チル修飾ヌクレオチドの二つの領域により隣接される
６，８または１０デオキシヌクレオチドの中心”ギャッ
プ”領域を有していた。主鎖は一様にホスホロチオエー
トであった。ノーザンブロット分析において、これらの
オリゴヌクレオチドの三つすべて（ＩＳＩＳ６７２０，
６−デオキシギャップ；ＩＳＩＳ６７１７，８−デオキ
シギャップ；ＩＳＩＳ６７２９，１０−デオキシギャッ
プ）がＴ２４細胞におけるｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡ発現の
７０％を超える阻害を示した。これらのオリゴヌクレオ
チドは好適である。８−デオキシギャップ化合物（６７
１７）は９０％を超える阻害を示し、より好適である。
【００４０】２’−Ｏ−メチル修飾の一つまたはそれ以
上の領域および一様なホスホロチオエート主鎖を有する
追加のキメラオリゴヌクレオチドを合成した。これらは
表３に示されている。すべてホスホロチオエートであ
り；ボールド体領域は２’−Ｏ−メチル修飾領域を示し
ている。
【００４１】
【表３】
【００４２】ノーザンブロット分析によりそれらがｃ−
ｒａｆ ｍＲＮＡを阻害する能力を試験し、ＩＳＩＳ７
８４８、７８４９、７８５１、７８５６、７８５５、７
８５４、７８４７および７８５３が７０％より大きな阻
害を示し、好適である。これらの内、７８５１、７８５
５、７８４７、および７８５３が９０％を超える阻害を
示し、より好適である。
【００４３】種々の２’修飾を有する追加のキメラオリ
ゴヌクレオチドを合成し、試験した。これらは表４に示
されている。すべてホスホロチオエートであり；ボール
ド体領域は２’−修飾領域を示している。
【００４４】
【表４】
【００４５】これらの内、オリゴヌクレオチド６７２
０、６７１７、６７２９、９７２０および９０５８が好
適である。オリゴヌクレオチド６７１７、６７２９、９
７２０および９０５８がより好適である。
【００４６】２’−Ｏ−プロピル糖修飾およびキメラＰ
＝Ｏ／Ｐ＝Ｓ主鎖を有する二つのキメラオリゴヌクレオ
チドも合成した。これらは表５に示されており、そこで
イタリック体領域は２’が修飾されかつホスホジエステ
ル主鎖を有する領域を示している。
【００４７】
【表５】
【００４８】癌細胞増殖の阻害 ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ５１３
２がＴ２４膀胱癌細胞増殖を阻害することが示された。
細胞をリポフェクチン（オリゴヌクレオチド取り込みを
増加させるカチオン性脂質）とともに種々の濃度のオリ
ゴヌクレオチドで処理した。表６に示したように細胞増
殖の用量依存性阻害が示され、ここで”なし”は非処理
対照（オリゴヌクレオチドなし）を示し、”対照”は陰
性対照オリゴヌクレオチドで処理したことを示してい
る。結果は非処理対照と比較したパーセント阻害として
示されている。
【００４９】
【表６】
【００５０】Ｔ２４ヒト膀胱癌腫瘍に対するＩＳＩＳ５
１３２の効果 ヌードマウスにおいて皮下ヒトＴ２４膀胱癌腫移植片を
確立させ、ＩＳＩＳ５１３２および関連しない対照ホス
ホロチオエートオリゴヌクレオチドを２５ｍｇ／ｋｇの
用量で週に３回腹腔内に投与することにより処理した。
この予備的研究において、ＩＳＩＳ５１３２は１１日後
対照と比較して３５％腫瘍増殖を阻害した。オリゴヌク
レオチド処理腫瘍は研究期間を通して対照腫瘍より小さ
かった。 ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌腫瘍に対するＩＳＩＳ５１３２
の効果 ヌードマウスにおいて皮下ヒトＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌
腫移植片を確立させ、ＩＳＩＳ５１３２および関連しな
い対照ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを０．６
ｍｇ／ｋｇまたは６．０ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回静
脈内に投与することにより処理した。ＩＳＩＳ５１３２
は２７日後（研究の終了日）対照と比較して約８０％腫
瘍増殖を阻害した。
【００５１】ＩＳＩＳ５１３２はまた、ヌードマウス中
のＭＤＡ−ＭＢ２３１移植片に対し腹腔内に投与しても
有効であった。オリゴヌクレオチドは１日１回０．６ｍ
ｇ／ｋｇまたは６．０ｍｇ／ｋｇで投与した。２７日後
（研究の終了日）、腫瘍体積は対照と比較して５７％
（０．６ｍｇ／ｋｇ）または６４％（６．０ｍｇ／ｋ
ｇ）阻害された。 ＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍におけるｃ−ｒａｆ ＲＮＡレ
ベルに対するＩＳＩＳ５１３２の効果 ＲＮＡをＭＤＡ−ＭＢ２３１腫瘍移植片から単離し、ノ
ーザンブロットを実施してｒａｆ ＲＮＡレベルに対す
るオリゴヌクレオチドの効果を評価した。ＩＳＩＳ５１
３２は２７日後に、静脈内投与の場合は６７％および腹
腔内投与の場合は３９％、ｒａｆ ＲＮＡレベルを減少
させた（いずれも６ｍｇ／ｋｇ）。 Ｃｏｌｏ２０５ヒト結腸癌腫瘍に対するＩＳＩＳ５１３
２の効果 ヌードマウスにおいて皮下ヒトＣｏｌｏ２０５結腸癌腫
移植片を確立させ、ＩＳＩＳ５１３２および関連しない
対照ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、６．０
ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回静脈内に投与することによ
り処理した。この研究において、ＩＳＩＳ５１３２は２
５日後に対照と比較して４０％以上腫瘍増殖を阻害し
た。 Ａ５４９ヒト肺腺癌腫瘍に対するＩＳＩＳ５１３２の効
果 皮下ヒトＡ５４９肺腺癌異種移植片をオスＢａｌｂ／ｃ
ヌードマウスで確立させ、０．００６から６．０ｍｇ／
ｋｇの範囲の用量での静脈内注射による毎日の投与によ
りＩＳＩＳ５１３２および対照オリゴヌクレオチドで処
理した。図１に示されるように、ＩＳＩＳ５１３２はす
べての用量で用量応答的に腫瘍サイズを減少させた。ス
クランブル化ｒａｆオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１０３
５３はどの用量でも効果はなかった（図２）。 Ａ５４９腫瘍細胞におけるｃ−ｒａｆ ＲＮＡレベルに
対するＩＳＩＳ５１３２の効果 Ａ５４９腫瘍移植片からＲＮＡを単離し、ノーザンブロ
ットを実施してｒａｆＲＮＡレベルに対するオリゴヌク
レオチドの効果を評価した。ＩＳＩＳ５１３２はｒａｆ
ＲＮＡレベルを段々と減少させ、それはオリゴ処理か
ら８時間後に始まった。実験を１３日目で終了させた
時、ＲＮＡレベルはまだ減少しつつあり、対照の約１５
％のレベルに達していた。 Ａ５４９肺移植片腫瘍に対するＩＳＩＳ６７１７、２’
−Ｏ−メチルギャップ形成オリゴヌクレオチドの効果 表４に示したＩＳＩＳ６７１７、２’−Ｏ−メチルギャ
ップ形成オリゴヌクレオチドがＡ５４９腫瘍移植片増殖
を阻害する能力をＩＳＩＳ５１３２と比較した。０．０
０６、０．０６、０．６および６．０ｍｇ／ｋｇの用量
での静脈内投与では、二つのオリゴヌクレオチドの腫瘍
増殖に対する効果は実質的に区別できなかった。従っ
て、ＩＳＩＳ６７１７は本発明の好適な態様である。 Ａ−ｒａｆを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチ
ド Ａ−ｒａｆ ｍＲＮＡの一部を標的とし、Ａ−ｒａｆ発
現を阻害するある種のオリゴヌクレオチドは細胞過増殖
の阻害に有用であると考えられる。そのようなアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドを用いるＡ−ｒａｆ発現阻害の
ための方法も同様に細胞過増殖の阻害に有用であると考
えられる。
【００５２】表７に示したホスホロチオエート デオキ
シオリゴヌクレオチドをＧｅｎｂａｎｋ Ａ−ｒａｆ配
列ＨＵＭＡＲＡＦＩＲ（Ｇｅｎｂａｎｋリストｘ０４７
９０）を利用して設計し合成した。
【００５３】
【表７】
【００５４】オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ９０６１、Ｉ
ＳＩＳ９０６９およびＩＳＩＳ１０２２８を、Ａ５４
９、Ｔ２４およびＮＨＤＦ細胞中のＡ−ｒａｆ ｍＲＮ
Ａレベルに対するそれらの効果についてノーザンブロッ
ト分析により評価した。三つのオリゴヌクレオチドはす
べて三つの細胞型のすべてにおいて用量依存的様式でＡ
−ｒａｆＲＮＡレベルを減少させ、すべての細胞型にお
いて５００ｎＭの用量で５０％を超える阻害を示した。
最大阻害（８８％）はＴ２４細胞においてＩＳＩＳ９０
６１および９０６９で達成された。これら三つのオリゴ
ヌクレオチド（ＩＳＩＳ９０６１、９０６９および１０
２２８）は好適であり、ＩＳＩＳ９０６１および９０６
９がより好適であった。 ラットおよびマウスｃ−ｒａｆを標的とするオリゴヌク
レオチドの同定 ｒａｆキナーゼにより媒介されると考えられている多く
の状態は、ヒトにおける研究を実施することができな
い。例えば、組織移植片拒否反応はｒａｆ発現を妨害す
ることにより改善されるように見える状態である；しか
し、明らかにこのことはヒト移植患者ではなく動物で評
価されねばならない。別のそのような例は再狭窄であ
る。しかしながら、これらの状態はここで使用したラッ
トおよびマウスモデルのような動物モデルでは試験可能
である。
【００５５】ラットおよびマウス細胞でｃ−ｒａｆ発現
を阻害するためのオリゴヌクレオチド配列が同定され
た。ラットおよびマウスｃ−ｒａｆ遺伝子は高度に相同
的な領域を有している；ヒトｃ−ｒａｆを標的とするオ
リゴヌクレオチドの評価から得られた情報を用いてラッ
トおよびマウス両方のｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡ配列を標的
とする一連のオリゴヌクレオチドを設計し、合成した。
これらのオリゴヌクレオチドをノーザンブロット分析を
用いてマウスｂＥＮＤ細胞およびラットＡ−１０細胞で
の活性についてスクリーニングした。オリゴヌクレオチ
ド（すべてホスホロチオエート）は表８に示されてい
る。
【００５６】
【表８】
【００５７】オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１１０６１お
よび１０７０７０は４００ｎＭの用量でマウスｂＥＮＤ
細胞でのｃ−ｒａｆ ＲＮＡレベルを９０％を超えて阻
害することが見いだされた。これら二つのオリゴヌクレ
オチドは２００ｎＭの濃度でラットＡ−１０細胞のｒａ
ｆ ＲＮＡレベルを実質的に完全に阻害した。ＩＳＩＳ
１０７０７のＩＣ５０は、マウスｂＥＮＤ細胞で１７０
ｎＭであり、ラットＡ−１０細胞で８５ｎＭであること
が見いだされた。ＩＳＩＳ１１０６１のＩＣ５０は、マ
ウスｂＥＮＤ細胞で８５ｎＭであり、ラットＡ−１０細
胞で３０ｎＭであると決定された。 マウスにおける内在性ｃ−ｒａｆ ＲＮＡ発現に対する
ＩＳＩＳ１１０６１の効果 マウスに３日間毎日ＩＳＩＳ１１０６１（５０ｍｇ／ｋ
ｇ）または対照オリゴヌクレオチドまたは対照塩溶液を
腹腔内に注射した。動物を殺し、器官をノーザンブロッ
ト分析によりｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡ発現について分析し
た。ＩＳＩＳ１１０６１は肝臓のｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡ
を約７０％減少させることが観察された。対照オリゴヌ
クレオチドはｃ−ｒａｆ発現には何の影響も与えなかっ
た。ＩＳＩＳ１１０６１の効果はｃ−ｒａｆに特異的で
あった；Ａ−ｒａｆおよびＧ３ＰＤＨ ＲＮＡレベルは
オリゴヌクレオチド処理により影響を受けなかった。ｃ
−ｒａｆに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドはマ
ウス心臓同種移植モデルにおいて生存を延長させる同種
移植拒否反応を防止するｃ−ｒａｆアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドＩＳＩＳ１１０６１の治療的効果を決定す
るため、マウス血管新生化異所性心臓移植モデルにおけ
る活性についてこのオリゴヌクレオチドを試験した。本
質的にはＩｓｏｂｅ ｅｔａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉ
ｏｎ １９９１，８４，１２４６−１２５５により記載
されているように、一次血管新生化移植片としてＣ５７
ＢＩ１０マウスからの心臓をＣ３Ｈマウスの腹部腔内へ
移植した。オリゴヌクレオチドを７日間アルゼットポン
プを通して連続的に静脈内投与した。非処理マウスの平
均同種移植片生存時間は７．８３±０．７５日であった
（７、７、８、８、８、９日）。２０ｍｇ／ｋｇまたは
４０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ１１０６１で７日間処理した
マウスの同種移植片はすべて少なくとも１１日生存して
いた（２０ｍｇ／ｋｇでは１１、１１、１２日、および
４０ｍｇ／ｋｇでは＞１１、＞１１、＞１１日）。
【００５８】ラットで行われた試験的研究では、Ｌｅｗ
ｉｓラットからの心臓をＡＣＩラットの腹部腔内へ移植
した。ラットにアルゼットポンプを通して２０ｍｇ／ｋ
ｇのＩＳＩＳ１１０６１を７日間投与した。非処理ラッ
トの平均同種移植片生存時間は８．８６±０．６９日で
あった（８、８、９、９、９、９、１０日）。オリゴヌ
クレオチド処理ラットの平均同種移植片生存時間は１
５．３±１．１５日であった（１４、１６、１６日）。 平滑筋細胞増殖に対するｃ−ｒａｆを標的とするアンチ
センスオリゴヌクレオチドの効果 平滑筋細胞増殖は、例えば血管形成術後のアテロームお
よび再狭窄のような血管狭窄の原因である。Ａ−１０ラ
ット平滑筋細胞の増殖に対するＩＳＩＳ１１０６１の効
果を決定するために実験を行った。培養細胞をＩＳＩＳ
１１０６１（リポフェクチンを加えて）を添加して、ま
たは添加せずに増殖させ、ウシ胎児血清で刺激後２４時
間および４８時間に細胞増殖を測定した。ＩＳＩＳ１１
０６１（５００ｎＭ）は用量応答的に血清刺激細胞増殖
を阻害することが観察され、２４時間および４８時間後
の最大阻害は各々４６％および７５％であった。この化
合物について２００ｎＭのＩＣ５０値が得られた。非相
関対照オリゴヌクレオチドは５００ｎＭの用量まで影響
を与えなかった。 ラットにおける再狭窄に対するｃ−ｒａｆを標的とする
アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果 血管形成術再狭窄のラット頚動脈障害モデルは開発され
ており、ｃ−ｍｙｃ癌遺伝子を標的とするアンチセンス
オリゴヌクレオチドの再狭窄に対する効果を評価するた
めに使用されてきた。Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｃｌｉ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９４，９３，８２０−
８２８。このモデルを用いて再狭窄に対するラットｃ−
ｒａｆを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド
（特にＩＳＩＳ１１０６１）の効果を評価することがで
きる。バルーンカテーテルによる頚動脈損傷に続いて、
オリゴヌクレオチドを静脈内注射、アルゼットポンプを
通した連続的静脈内投与またはＢｅｎｎｅｔｔらにより
記載されているようなプルロニックゲルマトリックスで
の頚動脈への直接投与により投与する。回復後、ラット
を殺し、頚動脈を顕微鏡により試験して、ルミナール断
面積に対する処理の効果を決定する。
【００５９】本発明は以下の実施例によりさらに例示さ
れるが、それらは例示のためだけであり、本発明を特定
の態様に制限することを意図しているものではない。
【００６０】
【実施例】実施例１ オリゴヌクレオチドの合成および
特性付け 非修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドはヨウ素による酸化を
行う標準ホスホロアミダイト化学を用いて自動化ＤＮＡ
合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ モデ
ル３８０Ｂ）で合成した。β−シアノエチルジイソプロ
ピル ホスホロアミダイトはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から購
入した。ホスホロチオエート オリゴヌクレオチドにつ
いては、標準酸化ボトルをホスファイト結合の段階的チ
オ化のために０．２Ｍ Ｈ−１，２−ベンゾジチオール
−３−オン １，１−ジオキシドのアセトニトリル溶液
で置き換えた。チオ化サイクル待ち時間は６８秒に増加
し、続いてキャッピング工程を行った。２’−Ｏ−メチ
ル ホスホロチオエート オリゴヌクレオチドは２’−
Ｏ−メチル β−シアノエチルジイソプロピル−ホスホ
ロアミダイト（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ，Ｎｅｅｄｈａｍ
ＭＡ）および非修飾オリゴヌクレオチドのための標準サ
イクル（ただし、テトラゾールおよび塩基のパルス運搬
後の待ち時間を３６０秒に延長した）を用いて合成し
た。合成の開始に使用した３’−塩基は２’−デオキシ
リボヌクレオチドであった。２’−Ｏ−プロピルオリゴ
ヌクレオチドはこの工程をわずかに変更して製造した。
【００６１】２’−フルオロ ホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドは５’−ジメトキシトリチル−３’−ホ
スホロアミダイトを用いて合成し、１９９０年１月１１
日に出願された米国特許出願第４６３，３５８号および
１９９０年８月１３日に出願された第５６６，９７７号
（これらは本出願と同一の譲渡人に譲渡されており、こ
こに引例として包含されている）に開示されているよう
に製造した。２’−フルオロ オリゴヌクレオチドはホ
スホロアミダイト化学を用い、および標準ＤＮＡ合成プ
ロトコールをわずかに変更して製造された：脱保護は室
温でメタノール性アンモニアを用いて達成された。
【００６２】制御細孔ガラスカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から切断し、濃水酸化アンモニ
ウム中５５℃で１８時間脱保護した後、オリゴヌクレオ
チドを２．５容量のエタノールで０．５Ｍ ＮａＣｌか
ら二度沈澱させて精製した。分析ゲル電気泳動は２０％
アクリルアミド、８Ｍ尿素、４５ｍＭトリスーホウ酸緩
衝液、ｐＨ７．０で実施した。オリゴデオキシヌクレオ
チドおよびそれらのホスホロチオエート類似体は８０％
を超える完全長物質であることが電気泳動から判断され
た。 実施例２ ｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡ発現阻害のノーザンブ
ロット分析 ヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖ
ｉｌｌｅ ＭＤ）から得た。細胞は１０％熱不活性化ウ
シ胎児血清および各々５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび
ストレプトマイシンを補給したＬ−グルタミンを含むマ
ッコイ５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒ
ｓｂｕｒｇ ＭＤ）で増殖させた。細胞は１００ｍｍプ
レートに播種した。それらが７０％コンフルエントに達
したとき、オリゴヌクレオチドで処理した。プレートを
１０ｍｌの前もって温めたＰＢＳおよび２．５μｌのＤ
ＯＴＭＡを含む５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ還元血清培地
で洗浄した。リポフェクチンを含むオリゴヌクレオチド
を所望の濃度まで添加した。処理して４時間後、培地を
マッコイ培地に置き換えた。オリゴヌクレオチド処理後
２４から７２時間後に細胞を集め、標準ＣｓＣｌ精製法
を用いてＲＮＡを単離した。Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．
Ｅ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓ
ｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，
Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．Ｓ
ｅｉｄｍａｎ ａｎｄ Ｋ．Ｓｔｒａｈｌ，ｅｄｓ），
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄＳｏｎｓ，ＮＹ。全ＲＮ
ＡはＣｓＣｌクッション上での細胞溶解物の遠心分離に
より単離した。ＲＮＡ試料は１．２％アガロースーホル
ムアルデヒド ゲルを通して電気泳動し，１２−１４時
間以上かけてキャピラリー拡散によりハイブリダイゼー
ション膜に移した。ＲＮＡはＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）内
でＵＶ光へ暴露することにより膜と架橋させ、ランダム
ープライム化３２Ｐ−標識ｃ−ｒａｆ ｃＤＮＡプロー
ブ（ＡＴＣＣから得られた）または対照としてＧ３ＰＤ
Ｈプローブとハイブリダイズさせた。ＲＮＡはＰｈｏｓ
ｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａ
ｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて定量し
た。 実施例３ Ｔ２４細胞におけるｃ−ｒａｆキナーゼ蛋白
質の特異的阻害 Ｔ２４細胞をＴ＝０およびＴ＝２４時間目にオリゴヌク
レオチド（２００ｎＭ）およびリポフェクチンで処理し
た。蛋白質抽出物をＴ＝４８時間に調製し、アクリルア
ミドで電気泳動し、ｃ−ｒａｆ（ＵＢＩ，Ｌａｋｅ Ｐ
ｌａｃｉｄ，ＮＹ）またはＡ−ｒａｆ（Ｔｒａｎｓｄｕ
ｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｋｎｏｘｖｉ
ｌｌｅ，ＴＮ）に対するポリクローナル抗体を用いるウ
ェスタンブロットにより分析した。放射性標識第二抗体
を使用し、ｒａｆ蛋白質はＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅ
ｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎ
ｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて定量した。 実施例４ 細胞増殖のアンチセンス阻害 第０日にＴ２４細胞を種々の濃度のオリゴヌクレオチド
およびリポフェクチンで２時間処理した（５０ｎＭオリ
ゴヌクレオチドおよび２μｇ／ｍｌリポフェクチン；１
００ｎＭオリゴヌクレオチドおよび２μｇ／ｍｌリポフ
ェクチン；２５０ｎＭオリゴヌクレオチドおよび６μｇ
／ｍｌリポフェクチンまたは５００ｎＭオリゴヌクレオ
チドおよび１０μｇ／ｍｌリポフェクチン）。第１日に
細胞を所望のオリゴヌクレオチド濃度で２時間、２回目
の処理を行った。第２日に細胞を計数した。 実施例５ ヌードマウスにおけるＴ２４ヒト膀胱癌腫瘍
異種移植片に対するＩＳＩＳ５１３２の効果 ５ｘ１０６のＴ２４細胞をヌードマウスの右内側腿の皮
下に移植した。オリゴヌクレオチド（塩溶液に懸濁した
ＩＳＩＳ５１３２および非相関対照ホスホロチオエート
オリゴヌクレオチド）を腫瘍細胞接種４日後から週に３
回投与した。塩溶液のみの対照もまた実施した。オリゴ
ヌクレオチドは腹腔内注射により与えた。オリゴヌクレ
オチド用量は２５ｍｇ／ｋｇであった。処理から１１、
１５および１８日目に腫瘍サイズを測定し、腫瘍体積を
計算した。 実施例６ ヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒ
ト乳癌腫瘍異種移植片に対するＩＳＩＳ５１３２の効果 ５ｘ１０６のＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞をヌードマウスの
右内側腿の皮下に移植した。オリゴヌクレオチド（塩溶
液に懸濁したＩＳＩＳ５１３２および非相関対照ホスホ
ロチオエートオリゴヌクレオチド）を腫瘍細胞接種１０
日後から毎日１回投与した。塩溶液のみの対照もまた実
施された。オリゴヌクレオチドは０．６ｍｇ／ｋｇまた
は６．０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注射により与えた。
腫瘍細胞接種の１０、１３、１６、２０、２３および２
７日後に腫瘍サイズを測定し、腫瘍体積を計算した。
【００６３】腹腔内オリゴヌクレオチド投与において
は、オリゴヌクレオチドを腫瘍細胞接種１０日後から毎
日１回投与した。塩溶液のみの対照もまた実施された。
オリゴヌクレオチドは０．６ｍｇ／ｋｇまたは６．０ｍ
ｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射により与えた。腫瘍細胞接
種の１０、１３、１６、２０、２３および２７日後に腫
瘍サイズを測定し、腫瘍体積を計算した。 実施例７ ヌードマウスにおけるＣｏｌｏ２０５ヒト結
腸癌腫瘍異種移植片に対するＩＳＩＳ５１３２の効果 ５ｘ１０６のＣｏｌｏ２０５細胞をヌードマウスの右内
側腿の皮下に移植した。オリゴヌクレオチド（塩溶液に
懸濁したＩＳＩＳ５１３２および非相関対照ホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチド）を腫瘍細胞接種５日後か
ら毎日１回投与した。塩溶液のみの対照もまた実施され
た。オリゴヌクレオチドは静脈内注射により与えた。オ
リゴヌクレオチド用量は６ｍｇ／ｋｇであった。腫瘍細
胞接種の５、８、１１、１４、１８、２２および２５日
後に腫瘍サイズを測定し、腫瘍体積を計算した。 実施例８ ヌードマウスにおける異種移植片を用いたｒ
ａｆ付随腫瘍のための診断アッセイ 本アッセイを用いて、ｒａｆ発現により生じる腫瘍を診
断し他の腫瘍と区別する。腫瘍のバイオプシ試料を処理
して（例えば、コラゲナーゼまたはトリプシンまたは他
の常法により）、腫瘍の塊を解離させた。５ｘ１０６の
腫瘍細胞をヌードマウスの右内側腿の皮下に移植した。
塩溶液に懸濁したアンチセンスオリゴヌクレオチド（例
えば、ＩＳＩＳ５１３２）を腫瘍細胞接種４日後から週
に３回一つまたはそれ以上のマウスに投与した。対照マ
ウスには塩溶液のみを投与した。オリゴヌクレオチド用
量は２５ｍｇ／ｋｇであった。処理の１１日後に腫瘍サ
イズを測定し、腫瘍体積を計算した。オリゴヌクレオチ
ド処理マウスの腫瘍体積を対照マウスのものと比較し
た。処理マウスのｒａｆ付随腫瘍の体積は対照マウスよ
り測定可能なほど小さかった。ｒａｆ発現以外の原因で
生じる腫瘍はｒａｆを標的とするオリゴヌクレオチドに
応答しないと予測され、したがってオリゴヌクレオチド
処理および対照マウスの腫瘍容量は等しい。 実施例９ ｒａｆ発現の検出 オリゴヌクレオチドを合成後、ポリヌクレオチドキナー
ゼで５’末端を３２Ｐで放射性標識した。Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９，第２巻，ｐｇ．１１．３
１−１１．３２。放射性標識オリゴヌクレオチドを特異
的ハイブリダイゼーションを起こすことができる条件
下、腫瘍バイオプシ試料または乾癬が疑われる皮膚試料
のようなｒａｆ発現が疑われる組織または細胞試料と接
触させ、試料を洗浄して非結合オリゴヌクレオチドを除
去した。試料に残存する放射活性は結合オリゴヌクレオ
チドを示し、シンチレーションカウンターまたは他の通
常手段を用いて定量した。
【００６４】本発明の放射標識オリゴヌクレオチドはま
たオートラジオグラフィーでも使用される。組織切片を
放射性標識オリゴヌクレオチドで処理し、上記のように
洗浄した後、標準オートラジオグラフィー法に従って写
真用感光乳剤を暴露した。乳剤を現像するとｒａｆを発
現している領域の銀粒子のイメージが得られた。ｒａｆ
発現の程度は銀粒子を定量することにより決定された。
【００６５】ｒａｆ発現の蛍光検出のための類似のアッ
セイは、フルオレセインまたは他の蛍光標識で標識され
た本発明のオリゴヌクレオチドを使用した。標識化ＤＮ
Ａオリゴヌクレオチドはヨウ素による酸化を行う標準ホ
スホロアミダイト化学を用いて自動化ＤＮＡ合成機（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ モデル３８０
Ｂ）で合成した。β−シアノエチルジイソプロピル ホ
スホロアミダイトはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から購入した。
フルオレセイン−標識アミダイトはＧｌｅｎ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡ）から購入された。
オリゴヌクレオチドおよび生物試料のインキュベーショ
ンは放射性標識オリゴヌクレオチドで記載したように実
施したが、ｒａｆ発現を示す蛍光を検出するためにはシ
ンチレーションカウンターの代わりに蛍光光度計または
蛍光顕微鏡を使用した。 実施例１０：Ａ５４９異種移植片 ５ｘ１０６のＡ５４９細胞をヌードマウスの右内側腿の
皮下に移植した。塩溶液に懸濁したオリゴヌクレオチド
（ＩＳＩＳ５１３２およびスクランブルｒａｆ対照ホス
ホロチオエートオリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ１０３５
３）を、０．００６から６．０ｍｇ／ｋｇの範囲の容量
で毎日１回静脈内に注射することにより投与した。生じ
た腫瘍は９、１２、１７および２１日後に測定し、腫瘍
容量を計算した。 実施例１１：内因性ｃ−ｒａｆ発現に対するオリゴヌク
レオチドの効果 マウスを第１、２および３日に５０ｍｇ／ｋｇのオリゴ
ヌクレオチド用量で腹腔内注射することにより処理し
た。第４日に動物を殺し、ノーザンブロット分析による
ｃ−ｒａｆ ｍＲＮＡアッセイのために器官を除去し
た。４群の動物を用いた：１）オリゴヌクレオチド処理
なし（塩溶液）；２）陰性対照オリゴヌクレオチドＩＳ
ＩＳ１０８２（単純ヘルペスウイルスを標的とする）；
３）陰性対照オリゴヌクレオチド４１８９（マウス蛋白
質キナーゼＣ−αを標的とする）；４）げっし類ｃ−ｒ
ａｆを標的とするＩＳＩＳ１１０６１。 実施例１２：心臓同種移植片モデル 本質的にＩｓｏｂｅ ｅｔａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉ
ｏｎ １９９１，８４，１２４６−１２５５により記載
されているように、一次血管新生化移植片として心臓を
ラットまたはマウス（ドナーとは異なる種）の腹部腔内
へ移植した。オリゴヌクレオチドは７日間アルゼットポ
ンプを通して連続的に静脈内投与した。心臓同種移植片
の生存は腹部腔の第二の心拍の存在を聞くことによりモ
ニターした。 実施例１３：ラットＡ−１０平滑筋細胞を用いる増殖ア
ッセイ Ａ１０細胞を１０％ウシ胎児血清を加えたダルベッコ改
良イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む９６−ウェルプレー
トに入れ、２４時間放置して付着させた。更に２４時間
０．２％ウシ胎児血清を加えたダルベッコ改良イーグル
培地（ＤＭＥＭ）で細胞を静止させた。静止の最後の４
時間の間に細胞を無血清培地に溶解したＩＳＩＳ１１０
６１＋リポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｂｅｔｈ
ｅｓｄａＭＤ）で処理した。次に、培地を除いて新鮮な
培地に交換し、細胞を１０％ウシ胎児血清で刺激した。
次にプレートをインキュベーター内に置き、血清刺激の
２４および４８時間後にＭＴＳのホルマザンへの変換に
より細胞増殖を評価した（Ｐｒｏｍｅｇａ 細胞増殖キ
ット）。対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１０８２（単
純ヘルペスウイルスを標的とする非相関オリゴヌクレオ
チド）もまた試験した。 実施例１４：ラット頚動脈再狭窄モデル このモデルはＢｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９４，９３，８２０−８２８
により記載されている。ラット頚動脈のバルンカテーテ
ル拡張により動脈内膜過形成を誘導した。ラットを麻酔
し、２０ｍｌの塩溶液で膨張させるバルン塞栓切除術カ
テーテルを通過させることにより総頚動脈損傷を誘導し
た。オリゴヌクレオチドはプルロニックゲル溶液として
動脈壁の外膜表面に適用した。オリゴヌクレオチドは４
℃で０．２５％プルロニックゲル溶液（Ｆ１２７、ＢＡ
ＳＦ Ｃｏｒｐ．）に所望の用量で溶解した。１００μ
ｌのゲル溶液を損傷直後の総頚動脈の末端３分の１に適
用した。対照ラットは対照オリゴヌクレオチドを含むま
たはオリゴヌクレオチドを含まないゲルで同様に処理し
た。首の傷を縫合し、動物を回復させた。１４日後にラ
ットを殺してしゃ血し、そのままパラホルムアルデヒド
およびグルタルアルデヒドで潅流して頚動脈を固定し、
切り出して顕微鏡用に調製した。動脈の断面積を計算し
た。
【００６６】プルロニックゲル投与法と別の方法では、
ラットをオリゴヌクレオチドの静脈注射または連続的静
脈内注入（アルゼットポンプを通して）により処理す
る。
【００６７】
【配列表】
<110> ISIS Pharmaceuticals, Inc <120> Antisense Oligonucleotide Modulation of raf
Gene Expression <130> 000014 <150> JP 8-501257 <151> 1995-5-31 <150> US 08/250856 <151> 1994-5-31 <160> 40 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 1 tgaaggtgag ctggagccat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 2 gctccattga tgcagcttaa 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 3 ccctgtatgt gctccattga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 4 ggtgcaaagt caactagaag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 5 attcttaaac ctgagggagc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 6 gatgcagctt aaacaattct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 7 cagcactgca aatggcttcc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 8 tcccgcctgt gacatgcatt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 9 gccgagtgcc ttgcctggaa 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 10 agagatgcag ctggagccat 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 11 aggtgaaggc ctggagccat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 121 gtctggcgct gcaccactct 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 13 ctgatttcca aaatcccatg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 14 ctgggctgtt tggtgcctta 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 15 tcagggctgg actgcctgct 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 16 ggtgagggag cgggaggcgg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 17 cgctcctcct ccccgcggcg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 18 ttcggcggca gcttctcgcc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 19 gccgccccaa cgtcctgtcg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 20 tcctcctccc cgcggcgggt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 21 ctcgcccgct cctcctcccc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 22 ctggcttctc ctcctcccct 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 23 cgggaggcgg tcacattcgg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 24 tctggcgctg caccactctc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 25 ttctcgcccg ctcctcctcc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 26 ttctcctcct cccctggcag 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 27 cctgctggct tctcctcctc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 28 gtcaagatgg gctgaggtgg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 29 ccatcccgga cagtcaccac 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 30 atgagctcct cgccatccag 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 31 aatgctggtg gaacttgtag 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 32 ccggtacccc aggttcttca 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 33 ctgggcagtc tgccgggcca 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 34 cacctcagct gccatccaca 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 35 gagattttgc tgaggtccgg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 36 gcactccgct caatcttggg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 37 ctaaggcaca aggcgggctg 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 38 acgaacattg attggctggt 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 39 gtatccccaa agccaagagg <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> human <400> 40 catcagggca gagacgaaca
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ヌードマウスにおけるＡ５４９肺腫
瘍異種移植片の増殖に対するＩＳＩＳ５１３２の効果を
示している折れ線グラフである。ＩＳＩＳ５１３２はす
べての用量で（０．００６ｍｇ／ｋｇ；０．０６ｍｇ／
ｋｇ；０．６ｍｇ／ｋｇ；および６．０ｍｇ／ｋｇ）用
量応答的に腫瘍サイズを減少させた。
【図２】 図２は、ヌードマウスにおけるＡ５４９肺腫
瘍異種移植片の増殖に対するスクランブル化対照オリゴ
ヌクレオチドＩＳＩＳ１０３５３の効果を示している折
れ線グラフである。スクランブル化ｒａｆオリゴヌクレ
オチド、ＩＳＩＳ１０３５３はどの用量でも効果を示さ
なかった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ (72)発明者 ボッグズ，ラッセル・ティー アメリカ合衆国カリフォルニア州92007, カーディフ−バイ−ザ−シー，オックス フォード・アベニュー 2317 (56)参考文献 米国特許4740463（ＵＳ，Ａ) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，23, 3146−3150（1993) Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，15 （２），595−609（1987) Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，14 （２），1009−1015（1986) Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，90（４），548 −550，558，571−573（1990) Ｓｔａｎｌｅｙ Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，”Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉ ｃａｔｉｏｎｓ”，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ 1993 ｂｙ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ, ｐ．13−16 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (24)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒトＡ−ｒａｆをコードするｍＲＮＡを
    標的とし、かつｒａｆ発現を阻害しうる、配列番号２
    ９、３７または４０を有する、２０から５０ヌクレオチ
    ド長さのオリゴヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 少なくとも１つのホスホロチオエート結
    合を有する、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 オリゴヌクレオチドのヌクレオチドユニ
    ットの少なくとも１つが糖部分の２’位で修飾されてい
    る、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 前記糖部分の２’位における修飾が２’
    −Ｏ−アルキルまたは２’−フルオロ修飾である、請求
    項３記載のオリゴヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 ヒトＡ−ｒａｆをコードするｍＲＮＡを
    標的とし、標的親和性を増強するように修飾されている
    少なくとも１つのヌクレオチドを有する第１の領域およ
    びＲＮＡｓｅＨの基質である第２の領域を含む、配列番
    号２９、３７または４０を有する、２０から５０ヌクレ
    オチド長さのキメラオリゴヌクレオチドであって、ｒａ
    ｆの発現を阻害しうることを特徴とするキメラオリゴヌ
    クレオチド。
  6. 【請求項６】 標的親和性を増強するように修飾されて
    いるヌクレオチドが糖部分の２’位で修飾されている、
    請求項５記載のオリゴヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 糖部分の２’位における修飾が２’−Ｏ
    −アルキルまたは２’−フルオロ修飾である、請求項６
    記載のオリゴヌクレオチド。
  8. 【請求項８】 ＲＮＡｓｅＨの基質である領域が少なく
    とも１つの２’−デオキシヌクレオチドを含む、請求項
    ５記載のオリゴヌクレオチド。
  9. 【請求項９】 少なくとも１つのホスホロチオエート結
    合を有する、請求項５記載のオリゴヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】 インビトロまたはヒトを除く動物にお
    いてヒトｒａｆの発現を阻害する方法であって、ヒトｒ
    ａｆを発現する組織または細胞を、請求項１−９のいず
    れかに記載のオリゴヌクレオチドと接触させることを含
    む方法。
  11. 【請求項１１】 前記ヒトｒａｆの発現が異常な発現で
    ある、請求項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記オリゴヌクレオチドがキメラオリ
    ゴヌクレオチドである、請求項１０記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも
    １つのホスホロチオエート結合を有する請求項１０記載
    の方法。
  14. 【請求項１４】 インビトロまたはヒトを除く動物にお
    いて細胞の過増殖を阻害する方法であって、過増殖細胞
    を請求項１−９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド
    と接触させることを含む方法。
  15. 【請求項１５】 前記オリゴヌクレオチドがキメラオリ
    ゴヌクレオチドである、請求項１４記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも
    １つのホスホロチオエート結合を有する請求項１４記載
    の方法。
  17. 【請求項１７】 ヒトを除く動物において異常な増殖性
    状態を処置する方法であって、異常な増殖性状態を有す
    ると疑われる患者または前記患者の細胞、組織もしくは
    体液を、請求項１−９のいずれかに記載のオリゴヌクレ
    オチドと接触させることを含む方法。。
  18. 【請求項１８】 状態が過増殖性疾患である、請求項１
    ７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 過増殖性疾患が癌、再狭窄、乾癬また
    はＴ−細胞の活性化および成長により特徴づけられる疾
    患である、請求項１８記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記オリゴヌクレオチドがキメラオリ
    ゴヌクレオチドである、請求項１７記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記オリゴヌクレオチドが少なくとも
    １つのホスホロチオエート結合を有する請求項１７記載
    の方法。
  22. 【請求項２２】 ヒトｒａｆの発現を阻害するための医
    薬組成物であって、請求項１−９のいずれかに記載のオ
    リゴヌクレオチドを含む組成物。
  23. 【請求項２３】 細胞の過増殖を阻害するための医薬組
    成物であって、請求項１−９のいずれかに記載のオリゴ
    ヌクレオチドを含む組成物。
  24. 【請求項２４】 異常な増殖性状態を処置するための医
    薬組成物であって、請求項１−９のいずれかに記載のオ
    リゴヌクレオチドを含む組成物。
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