JP3471025B2 - Ｂ７タンパク質の発現を調節するためのオリゴヌクレオチド組成物および方法 - Google Patents

Ｂ７タンパク質の発現を調節するためのオリゴヌクレオチド組成物および方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、Ｔ細胞の活性化の調節に応答する疾患状態
の診断薬、研究用試薬及び治療薬に関する。特には、本
発明は、Ｔ細胞の活性化を調節するタンパク質の合成に
関与する特定の伝令リボ核酸（mRNA）又はDNAとのアン
チセンスオリゴヌクレオチドの相互作用に関する。B7タ
ンパク質をコードする核酸にハイブリダイズするように
設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供され
る。これらのオリゴヌクレオチドはRNA又はDNAの活性の
調節、したがってＴ細胞の活性化の調節につながること
が見出されている。対症、治療及び予防効果が生じる。
また、本発明は、B7タンパク質に対するアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを、第２の抗炎症剤、例えば、細胞間
相互作用を媒介するタンパク質、例えば、細胞接着分子
（ICAM）タンパク質に対する第２のアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドとの組み合わせで含む医薬組成物にも関す
る。
発明の背景 炎症は、感染性及び傷害性作用因子の破壊及び損傷組
織の単離を生じる、傷害、感染又は組織破壊に応答して
組織が起こす局在性防御応答である。典型的な炎症応答
は以下のように進行する：外来物としての抗原の認識又
は組織損傷の認識、可溶性媒介物の合成及び放出、感染
又は組織損傷部位への炎症細胞の召集、侵入生物又は損
傷組織の破壊及び除去、並びにひとたび侵入生物又は損
傷が解決された後のこの系の非活性化。炎症性成分によ
る多くのヒトの疾患においては、その炎症性応答を和ら
げる正常なホメオスタシス機構が欠けており、そのため
に正常組織の損傷及び破壊が生じる。
上述の段階の各々で、細胞−細胞相互作用が免疫応答
の活性化に関与する。正常な炎症応答において最も早期
に検出される出来事の１つは、血管内皮への白血球の付
着、次いで脈管構造を出て感染又は傷害部位に向かう白
血球の移動である。一般には、炎症部位に現れる最初の
炎症細胞は好中球であり、単球及びリンパ球がそれに続
く。細胞−細胞相互作用はＢリンパ球（Ｂ細胞）及びＴ
リンパ球（Ｔ細胞）の両者の活性化にも重要であり、こ
れらは、それぞれ、体液性及び細胞性免疫応答を強化す
る。
免疫系の大きな特徴は自己（宿主）と非自己（外来性
侵入物）とを区別するその能力である。免疫系が示すこ
の顕著な特異性は主としてＴ細胞が媒介する。Ｔ細胞は
感染に対する宿主の防御に関与するが、移植された組織
の器官損傷をも媒介し、移植片対宿主症（GVHD）及び幾
つかの自己免疫疾患における細胞の攻撃にも寄与する。
抗原特異的免疫応答を誘発するためには、Ｔ細胞が抗原
提示細胞（APC）によって届けられる信号を受け取らな
ければならない。Ｔ細胞−APC相互作用は３つの段階に
分割することができる：細胞の付着、Ｔ細胞受容体（TC
R）の認識、及び同時刺激。Ｔ細胞の活性化の誘発にはA
PCからの少なくとも２つの別々の信号が必要である。第
１の信号は抗原特異的であり、APCの表面上に発現した
主要組織適合複合体（MHC）タンパク質、又はMHC関連CD
1タンパク質に関連してTCRが抗原と相互作用する場合に
生じる（“分化クラスター”を意味する“CD"は異なる
Ｔ細胞表面分子を示すのに用いられる用語である）。第
２の（同時刺激の）信号は、Ｔ細胞表面抗原CD28と、B7
ファミリーのタンパク質の一員であるAPC上のそのリガ
ンドとの相互作用に関与する。
44キロダルトンのポリペプチドのジスルフィド結合ホ
モダイマーであり、かつ免疫グロブリンスーパーファミ
リーの一員であるCD28は、Ｔ細胞を活性化し、かつサイ
トカインを産生するための、休止Ｔ細胞表面上の主要同
時刺激信号受容体の１つである（Allison,Curr.Opin.Im
munol.,1994,6,414;Linsley及びLedbetter,Annu.Rev.Im
munol.,1993,11,191;Juneら,Immunol.Today,1994,15,32
1）。CD28を介する信号伝達は、TCR信号伝達と共に相乗
的に、インターロイキン−２（IL−２）の産生及び未変
性Ｔ細胞の増殖の両者を増強する作用をする。B7−１
（別名CD80）がCD28について同定された最初のリガンド
であった（Liu及びLinsley,Curr.Opin.Immunol.,1992,
4,265）。B7−１は通常低水準でAPC上に発現するが、サ
イトカインによる活性化又はCD40のような細胞表面分子
のライゲーションの後に上方調節される（Lenschowら,P
roc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1993,90,11054;Nabaviら,Na
ture,1992,360,266）。初期の研究からはB7−１が同時
刺激を媒介するCD28リガンドであることが示唆された
（Reiserら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1992,89,271;W
uら,J.Exp.Med.,1993,178,1789;Harlanら,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.U.S.A.,1994,91,3137）。しかしながら、基礎的
な混合リンパ球反応に対する抗B7−１モノクローナル抗
体（mAb）の効果が最小であり、B7−１欠損マウスが抗
原に対して正常に応答することが続いて立証された（Le
nschowら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1993,90,11054;F
reemanら,Science,1993,262,909）結果、CD28受容体に
対する第２のリガンド、B7−２（別名CD86）が発見され
た。抗B7−1mAbとは対照的に、抗B7−2mAbはＴ細胞増殖
及びサイトカイン産生の強力な阻害因子である（Wuら,
J.Exp.Med.,1993,178,1789;Chenら,J.Immunol.,1994,15
2,2105;Lenschowら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1993,9
0,11054）。B7:CD28信号伝達は他のＴ細胞同時刺激経
路、例えば、CD40:CD40L（CD40リガンド）信号伝達の必
要成分である可能性がある（Yangら,Science,1996,273,
1862）。
CD28に結合することに加えて、B7−１及びB7−２は細
胞溶解性Ｔ−リンパ球関連タンパク質CTLA4に結合す
る。CTLA4は、構造的にCD28に関連するが活性化の後に
だけＴ細胞上に発現するタンパク質である（Linsleyら,
J.Exp.Med.,1991,174,561）。CTLA4の可溶性組換え形態
CTLA4−Igは、CD28又はB7タンパク質に対するモノクロ
ーナル抗体よりも有効なB7:CD28相互作用の阻害因子で
あることが決定されている。CTLA4−Igでのイン・ビボ
処置により、ヒツジ赤血球又は可溶性抗原に対する抗体
の形成の阻害（Linsleyら,Science,1992,257,792）、心
臓同種移植片及び膵島異種移植片の共存の長期化（Lin
ら,J.Exp.Med.,1993,178,1801;Lenschowら,1992,Scienc
e,257,789;Lenschowら,Curr.Opin.Immunol.,1993,5
（５）,747−52）、及びGVHDにおける免疫応答の大幅な
抑制（Hakimら,J.Immun.,1995,155,1760）が生じた。CD
28及びCTLA4は、両者とも共通のB7受容体を介して作用
するにも関わらず、それぞれ反対の同時刺激及び阻害機
能を果たすことが提唱されている（Allisonら,Science,
1995,270,932）。
1994年６月８日（A2）公開の欧州特許出願EP0600591
では、腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、患者由
来の腫瘍細胞をB7−１タンパク質を発現するように生体
外で組換えにより加工した後、それを患者に再導入する
方法が開示されている。その結果、B7形質移入腫瘍細胞
及び非形質移入腫瘍細胞の両者に対して免疫学的応答が
刺激される。
1995年２月２日公開の国際公開WO95/03408では、B7−
２タンパク質を含む、Ｔ細胞の活性化を同時刺激する新
規CTLA4/CD28リガンドをコードする核酸が開示されてい
る。B7−２タンパク質に対する抗体及びB7−２タンパク
質を産生する方法も開示されている。
1995年２月23日公開の国際公開WO95/05464では、CTLA
4、CD28又はCTLA4−Igに結合する、B7−１以外のポリペ
プチドが開示されている。このようなポリペプチドをコ
ードする核酸を入手する方法も開示されている。
1995年３月９日公開の国際公開WO95/06738では、B7−
２（別名B70）タンパク質をコードする核酸が開示され
ている。B7−２タンパク質に対する抗体及びB7−２タン
パク質を産生する方法も開示されている。
1995年３月15日（A1）公開の欧州特許出願EP0643077
では、B7−２（別名B70）タンパク質と特異的に結合す
るモノクローナル抗体が開示されている。B7−２タンパ
ク質と特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する
方法も開示されている。
1995年７月18日発行の米国特許第5,434,131号では、B
7タンパク質のリガンドとしてのCTLA4タンパク質が開示
されている。CTLA4融合タンパク質（例えば、CTLA4−I
g）を産生する方法及びB7タンパク質又はCTLA4タンパク
質に対する抗体を用いて免疫応答を調節する方法も開示
されている。
1995年８月24日公開の国際公開WO95/22619では、B7−
２タンパク質には結合しない、B7−１タンパク質に特異
的な抗体が開示されている。B7−１タンパク質に対する
抗体を用いて免疫応答を調節する方法も開示されてい
る。
1995年12月21日公開の国際公開WO95/34320では、同時
刺激作用因子を阻害する第１作用因子、例えばCTLA4−I
g融合タンパク質、及び細胞接着を阻害する第２作用因
子、例えば抗LFA−１抗体、を用いてＴ細胞応答を阻害
する方法が開示されている。このような方法が、移植組
織又は器官の拒絶を阻止するのに特に有用であることが
示されている。
1995年12月７日公開の国際公開WO95/32734では、B7分
子の上方調節を妨げ、又は抗原提示細胞上でのICAM−３
の発現を減少させるFcγR II架橋因子が開示されてい
る。このようなFcγR II架橋因子は、凝集ヒトIgG分子
又はヒトIgG分子の凝集Fc断片のようなタンパク質を含
む。
1996年４月18日（A2）及び1996年５月17日（A3）公開
の国際公開WO96/11279では、（１）B7−１及びB7−２を
含む１種類以上の免疫刺激作用因子並びに（２）疾患原
因作用因子由来の抗原をコードする遺伝子配列を含む組
換えウイルスが開示されている。このような組換えウイ
ルスを用いて疾患を治療する方法も開示されている。
現在まで、B7−１及びB7−２のようなB7タンパク質の
発現を有効に調節し、かつそれを妨げる治療薬は知られ
ていない。したがって、B7タンパク質のような重要な同
時刺激分子を有効に調節する化合物及び方法に対する、
長期間求められている必要性が存在する。B7タンパク質
の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドが、
様々な炎症もしくは自己免疫疾患、又は炎症性成分を伴
う障害もしくは疾患、例えば、喘息、若年性糖尿病、筋
無力症、グレーブス病、関節リウマチ、同種移植片拒
絶、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、エリテマトー
デス、全身エリテマトーデス、糖尿病、多発性硬化症、
接触性皮膚炎、鼻炎及び様々なアレルギーに対する活性
を有する新規治療クラスの抗炎症剤を提供することが期
待される。加えて、B7タンパク質の発現を調節すること
が可能なオリゴヌクレオチドは、Ｔ細胞の生体外増殖を
操作する新規手段を提供する。
発明の要旨 本発明によると、B7−１又はB7−２をコードする核酸
と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが提
供される。本発明の特定のオリゴヌクレオチドは、B7−
１もしくはB7−２遺伝子から転写されるmRNA又はその選
択されたDNA部分に直接結合し、それにより、それぞ
れ、B7−１もしくはB7−2mRNAから翻訳されるタンパク
質の量又はB7−１もしくはB7−２遺伝子から転写される
mRNAの量を調節するように設計されている。
オリゴヌクレオチドは、同一性及び数の上で、特定の
核酸と特異的にハイブリダイズするのに十分なヌクレオ
チド配列を含むことができる。このようなオリゴヌクレ
オチドは、通常、“アンチセンス”と記載される。アン
チセンスオリゴヌクレオチドは、通常、研究用試薬、診
断補助剤、及び治療薬として用いられる。
それぞれB7−１及びB7−２タンパク質をコードするB7
−１及びB7−２遺伝子がこのアプローチに特に馴染みや
すいことが発見されている。B7の発現とＴ細胞の活性化
及び増殖との関連の結果として、B7−１又はB7−２の発
現の阻害はそれぞれB7−１又はB7−２の合成の阻害につ
ながり、それによりＴ細胞の活性化及び増殖の阻害につ
ながる。加えて、本発明のオリゴヌクレオチドは、B7転
写体の幾つかの代替スプライス済mRNAのうちの１つの発
現を阻害し、その結果として他の代替スプライス済B7mR
NAの発現を増強させるのに用いることができる。このよ
うな調節は、様々な炎症もしくは自己免疫障害もしくは
疾患、又は炎症性成分を伴う障害もしくは疾患、例え
ば、喘息、若年性糖尿病、筋無力症、グレーブス病、関
節リウマチ、同種移植片拒絶、炎症性腸疾患、多発性硬
化症、乾癬、エリテマトーデス、全身エリテマトーデ
ス、糖尿病、多発性硬化症、接触性皮膚炎、鼻炎、様々
なアレルギー、並びに癌及びそれらの転移の治療に望ま
しい。さらに、このような調節は、このような疾患もし
くは障害に罹患しやすいことが疑われ、又は罹患しやす
いことが知られる動物におけるこのような疾患もしくは
障害の発症を予防もしくは調節するのに望ましい。
動物を、B7タンパク質をコードする核酸と特異的にハ
イブリダイズし得るオリゴヌクレオチドと接触させるこ
とを包含する方法がここで提供される。これらの方法
は、例えば、様々な細胞の機能並びに生理学的プロセス
及び状態でのB7タンパク質の発現の検出及びその役割の
決定におけるツールとして、並びにそのような発現に関
連する状態の診断に有用である。このような方法は、B7
遺伝子（すなわち、B7−１又はB7−２）の発現の検出に
用いることができ、したがって、治療及び診断の両者で
有用であるものと信じられる。動物を、B7遺伝子と特異
的にハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチ
ドと接触させることを包含する、B7タンパク質の発現を
調節する方法がここで提供される。これらの方法は、B7
の発現とＴ細胞の活性化及び増殖との関連の結果とし
て、治療及び診断の両者で有用であるものと信じられ
る。また、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを用
いてＴ細胞のB7関連活性化を阻害する方法をも包含す
る。異常な、もしくは過剰なＴ細胞の活性化及び増殖が
生じる状態を治療する方法も提供される。これらの方法
は本発明のオリゴヌクレオチドを用い、治療の上で、並
びに臨床研究及び診断用のツールとして有用であるもの
と信じられる。本発明のオリゴヌクレオチドは研究の目
的で用いることもできる。このように、本発明のオリゴ
ヌクレオチドによって示される特異的ハイブリダイゼー
ションは検定、精製、細胞産生物の調製及び当業者が予
期し得る他の方法論において用いることができる。
ここに開示される方法は、例えば、様々な免疫系の機
能並びに生理学的プロセス及び状態でのB7−１もしくは
B7−２の発現の検出及びそれらの役割の決定における臨
床研究ツールとして、並びにそれらの発現に関連する状
態の診断に有用でもある。本発明のオリゴヌクレオチド
によって示される特異的ハイブリダイゼーションは検
定、精製、細胞産生物の調製及び当業者が予期し得る他
の方法論において用いることができる。例えば、本発明
のオリゴヌクレオチドはB7タンパク質をコードする核酸
に特異的にハイブリダイズするため、サンドイッチ及び
他の検定を構築してこの事実を利用することが容易にで
きる。本発明のオリゴヌクレオチドの、試料中に存在す
るB7タンパク質をコードする核酸との特異的ハイブリダ
イゼーションの検出は定型的に達成することができる。
このような検出には、酵素結合、放射標識又は他の適切
な検出系によって本発明のオリゴヌクレオチドを検出可
能に標識することが含まれる。本発明を用いて多くの検
定を創出することができ、これらの検定は、通常、組織
もしくは細胞試料を検出可能に標識した本発明のオリゴ
ヌクレオチドと、ハイブリダイゼーション及び標識の検
出によるそのようなハイブリダイゼーションの測定が可
能となるように選択された条件下で接触させることを包
含し、このような条件は当業者によって理解されるもの
である。
図面の簡単な説明 図１は、示されたオリゴヌクレオチドの、COS−７細
胞におけるB7−１タンパク質の発現に対する阻害効果を
示す棒グラフである。
図２は、オリゴヌクレオチドの、B7−１の細胞表面発
現に対する阻害効果を示す用量−応答曲線である。実
線、ISIS13812;破線、ISIS13800;点線、ISIS13805。
図３は、示されたオリゴヌクレオチドの、COS−７細
胞におけるB7−２の細胞表面発現に対する阻害効果を示
す棒グラフである。
図４は、ISIS10373（20量体）及びISIS10996（15量
体）を含む示されたオリゴヌクレオチドの、COS−７細
胞におけるB7−２の細胞表面発現に対する阻害効果を示
す棒グラフである。
図５は、オリゴヌクレオチドによるB7−１又はB7−２
タンパク質発現の阻害の特異性を示す棒グラフである。
交差斜線付きの棒、B7−１の水準；縞付きの棒、B7−２
の水準。
図６は、ICAM−１（ISIS2302）又はB7−２（ISIS1037
3）に対するアンチセンス配列を有するオリゴヌクレオ
チドの、ICAM−１及びB7−２タンパク質の細胞表面発現
に対する阻害効果を示す用量−応答曲線である。×を伴
う実線、ISIS10373で処理した細胞上のB7−１タンパク
質の水準；アスタリスクを伴う破線、ISIS10373で処理
した細胞上のICAM−１タンパク質の水準；三角形を伴う
実線、ISIS2302で処理した細胞上のB7−１タンパク質の
水準；方形を伴う実線、ISIS10373で処理した細胞上のI
CAM−１の水準。
図７は、示されたオリゴヌクレオチドの、Ｔ細胞の増
殖に対する効果を示す棒グラフである。
図８は、オリゴヌクレオチドの、COS−７細胞におけ
るネズミB7−２タンパク質の発現に対する阻害効果を示
す用量−応答曲線である。アスタリスクを伴う実線、IS
IS11696;三角形を伴う破線、ISIS11866。
図９は、オリゴヌクレオチドISIS11696及びISIS11866
の、IC−21細胞におけるネズミB7−２タンパク質の細胞
表面発現に対する効果を示す棒グラフである。左（黒）
の棒、オリゴヌクレオチドなし；中央の棒、３μＭの示
されたオリゴヌクレオチド；右の棒、10μＭの示された
オリゴヌクレオチド。
発明の詳細な説明 本発明は、B7−１及びB7−２を含むB7タンパク質をコ
ードするRNA及びDNAの機能のアンチセンス阻害に用いら
れるオリゴヌクレオチドを用いる。また、本発明は、そ
のようなタンパク質をコードするDNA又は伝令RNA（mRN
A）に特異的にハイブリダイズし、最終的にそれらそれ
ぞれの遺伝子から転写されるそのようなタンパク質の量
を調節するように設計されているオリゴヌクレオチドも
用いる。このようなmRNAとのハイブリダイゼーションは
mRNAの正常な役割を妨害し、細胞内でのその機能を調節
する。妨害しようとするmRNAの機能には全ての生命維持
機能、例えば、タンパク質の翻訳部位へのRNAの移行、R
NAからのタンパク質の実際の翻訳、１つ以上のmRNA種を
生じるRNAのスプライシング、及び、おそらくはRNAが携
わり得る独立した酵素活性でさえが含まれる。このよう
なmRNA機能の妨害の全体的な効果はB7タンパク質の発現
の調節であり、ここで、“調節”はB7タンパク質の発現
の増加（刺激）又は減少（阻害）のいずれかを意味す
る。本発明の脈絡においては、阻害が遺伝子発現の調節
の好ましい形態である。
オリゴヌクレオチドは、同一性及び数の上で、特定の
核酸と特異的にハイブリダイズするのに十分なヌクレオ
チド配列を含むことができる。遺伝子のセンス鎖の一部
と特異的にハイブリダイズするこのようなオリゴヌクレ
オチドは、通常、“アンチセンス”と記載される。アン
チセンスオリゴヌクレオチドは、通常、研究用試薬、診
断補助剤、及び治療薬として用いられる。例えば、優れ
た特異性で遺伝子の発現を阻害することができるアンチ
センスオリゴヌクレオチドは、特定の遺伝子の機能を解
明するのに、例えば、生物学的経路の様々な構成要素の
機能を区別するのに、当業者によってしばしば用いられ
る。したがって、この特異的阻害効果は当業者によって
研究用途で利用されている。
オリゴヌクレオチドの特異性及び感受性は当業者によ
り治療用途にも利用されている。例えば、以下の米国特
許にはアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる対症、
治療及び他の方法が示されている。米国特許第5,135,91
7号は、ヒトインターロイキン−１受容体の発現を阻害
するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。米国
特許第5,098,890号はｃ−myb癌遺伝子と相補的なアンチ
センスオリゴヌクレオチド及び特定の癌状態のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチド治療に向けられている。米国特
許第5,087,617号は癌患者をアンチセンスオリゴヌクレ
オチドで治療する方法を提供する。米国特許第5,166,19
5号はHIVのオリゴヌクレオチド阻害剤を提供する。米国
特許第5,004,810号は単純ヘルペスウイルスVmw65mRNAと
ハイブリダイズし、かつ複製を阻害することが可能なオ
リゴマーを提供する。米国特許第5,194,428号はインフ
ルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を有するアン
チセンスオリゴヌクレオチドを提供する。米国特許第4,
806,463号はアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びHTL
V−IIIの複製の阻害にそれらを用いる方法を提供する。
米国特許第5,286,717号は癌遺伝子の一部と相補的な塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する。米国特
許第5,276,019号及び米国特許第5,264,423号は細胞内で
の外来性核酸の複製の防止に用いられるホスホロチオエ
ートオリゴヌクレオチド類似体に向けられている。米国
特許第4,689,320号はCMVに特異的な抗ウイルス剤として
のアンチセンスオリゴヌクレオチドに向けられている。
米国特許第5,098,890号はヒトｃ−myb遺伝子のmRNA転写
体の少なくとも一部と相補的なオリゴヌクレオチドを提
供する。米国特許第5,242,906号は潜伏EBV感染の治療に
おいて有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供す
る。
アンチセンスの攻撃の標的を特定の遺伝子とすること
が好ましい。オリゴヌクレオチドの関連核酸への“ター
ゲッティング”は、本発明の脈絡においては、多段階プ
ロセスである。このプロセスは、通常、その機能を調節
しようとする核酸配列の同定から開始される。これは、
例えば、その発現が特定の障害もしくは疾患状態に関連
する細胞性遺伝子（もしくはその遺伝子から転写された
mRNA）、又は感染性作用因子に由来する外来性核酸であ
り得る。本発明においては、標的は、幾つかの免疫系の
障害及び疾患（例えば、炎症及び自己免疫疾患）に加え
て、表面上は“正常な”免疫反応（例えば、移植組織に
対する宿主動物の拒絶）に関連する細胞性遺伝子であっ
て、それに対する調節が特定の場合に望ましい遺伝子で
ある。また、ターゲッティングプロセスには、所望の効
果、そのタンパク質の発現の検出もしくは調節のいずれ
か、が生じるようにオリゴヌクレオチドを相互作用させ
るための領域（１つもしくは複数）をこの遺伝子内に決
定することが含まれる。ひとたび標的領域が同定された
ら、その標的と十分に相補的であり、すなわち、十分良
好にハイブリダイズし、かつ所望の効果をもたらすのに
十分な特異性を有するオリゴヌクレオチドを選択する。
一般には、アンチセンス調節の標的とすることができ
る５つの領域が存在する:5'非翻訳領域（以下、“5'−U
TR"）、翻訳開始コドン領域（以下、“tIR"）、読取り
枠（以下、“ORF"）、翻訳終止コドン領域（以下、“tT
R"）、及び3'非翻訳領域（以下、“3'−UTR"）。当該技
術分野において公知のように、これらの領域は典型的な
伝令RNA分子において以下の順序で配置されている（左
から右、5'から3'）:5'−UTR、tIR、ORF、tTR、3'−UT
R。当該技術分野において公知のように、幾つかの真核
生物の転写体は直接翻訳されるものの、多くのORFは１
つ以上の“イントロン”として知られる配列を含み、こ
れらは翻訳される前に転写体から切除される;ORFの発現
した（切除されなかった）部分は“エクソン”と呼ばれ
る（Albertsら,Molecular Biology of the Cell,1983,
Garland Publishing Inc.,New York,pp.411−415）。さ
らに、多くの真核生物のORFは長さが1000ヌクレオチド
以上であるため、ORFを、例えば、5'ORF領域、中央ORF
領域、及び3'ORF領域に細分することがしばしば好都合
である。幾つかの場合には、ORFは、イン・ビボでの機
能的重要性のために標的とすることができる１つ以上の
部位を含む。後者の型の部位の例には、遺伝子内ステム
−ループ構造（例えば、米国特許第5,512,438号を参
照）及び、未処理mRNA分子において、イントロン／エク
ソンスプライス部位が含まれる。本発明の脈絡の中で、
好ましい遺伝子内部位の１つは、その遺伝子の読取り枠
（ORF）の翻訳開始コドンを含む領域である。当該技術
分野において公知のように、翻訳開始コドンは典型的に
は5'−AUG（転写されたmRNA分子において；対応するDNA
分子においては5'−ATG）であるため、翻訳開始コドン
は“AUGコドン”、“スタートコドン（start codon）”
又は“AUGスタートコドン”とも呼ばれる。若干の遺伝
子はRNA配列5'−GUG、5'−UUG又は5'−CUGを有する翻訳
開始コドンを含み、5'−AUA、5'−ACG及び5'−CUGがイ
ン・ビボで機能することが示されている。さらに、５−
UUUがイン・ビトロで翻訳開始コドンとして機能する（B
rigstockら,Growth Factors,1990,4,45;Gelbertら,Soma
t.Cell.Mol.Genet.,1990,16,173;Gold及びStormo,in:Es
cherichia coli and Salmonella typhimurium:Cellular
and Molecular Biology,Vol.2,1987,Neidhardtら,ed
s.,American Society for Microbiology,Washington,D.
C.,p.1303）。したがって、“翻訳開始コドン”及び
“スタートコドン”という用語は、各々の場合における
開始アミノ酸が典型的にはメチオニン（真核生物におい
て）又はホルミルメチオニン（原核生物）ではあるもの
の、多くのコドン配列を包含し得る。真核生物及び原核
生物の遺伝子が２つ以上の代替スタートコドンを有する
ことがあり、それらのうちのいずれをも特定の細胞型も
しくは組織において、又は特定の一組の条件の下で、異
なるアミノ末端配列を有する関連ポリペプチドを産生す
るために優先的に用いることができることも当該技術分
野において公知である（Markussenら,Development,199
5,121,3723:Gaoら,Cancer Res.,1995,55,743;McDermott
ら,Gene,1992,117,193;Perriら,J.Biol.Chem.,1991,26
6,12536;Frenchら,J.Virol.1989,63,3270;Pushpa−Rekh
aら,J.Biol.Chem.,1995,270,26993;Monacoら,J.Biol.Ch
em.,1994,269,347;DeVirgilioら,Yeast,1992,8,1043;Ka
nagasundaramら,Biochim.Biophys.Acta,1992,1171,198;
Olsenら,Mol.Endocrinol.,1991,5,1246;Saulら,Apple.E
nviron.Microbiol.,1990,56,3117;Yaoitaら,Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,1990,87,7090;Rogersら,EMBO J.,1990,9,
2273）。本発明の脈絡において、“スタートコドン”及
び“翻訳開始コドン”は、B7タンパク質をコードする遺
伝子から転写されるmRNA分子の翻訳の開始にイン・ビボ
で用いられるコドン（１つもしくは複数）を指し、これ
はそのようなコドンの配列（１つもしくは複数）とは無
関係である。遺伝子の翻訳終止コドン（又は“ストップ
コドン（stop codon）”）が３つの配列、すなわち、5'
−UAA、5'−UAG及び5'−UGA（対応するDNA配列は、それ
ぞれ、5'−TAA、5'−TAG及び5'−TGAである）のうちの
１つを有し得ることも当該技術分野においては公知であ
る。“スタートコドン領域”及び“翻訳開始領域”とい
う用語は、翻訳開始コドンから、いずれの方向へであっ
ても（すなわち、5'又は3'）約25〜約50の連続するヌク
レオチドを含むようなmRNA又は遺伝子の部分を指す。同
様に、“ストップコドン領域”及び“翻訳終止領域”と
いう用語は、翻訳終止コドンから、いずれの方向へであ
っても（すなわち、5'又は3'）約25〜約50の連続するヌ
クレオチドを含むようなmRNA又は遺伝子の部分を指す。
本発明の脈絡において、“オリゴヌクレオチド”とい
う用語はリボ核酸又はデオキシリボ核酸のオリゴマー又
はポリマーを指す。この用語には、天然ヌクレオベース
（nucleobase）、糖及び共有結合糖間（主鎖）結合を含
んでなるオリゴヌクレオチドに加えて、同様に機能する
非天然部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。こ
のような修飾もしくは置換オリゴヌクレオチドは、その
望ましい特性、例えば、細胞の取り込みの強化、標的へ
の結合の強化及びヌクレアーゼの存在下における安定性
の増加により、しばしば本来の形態よりも好ましい。
本発明で想定される幾つかの好ましい修飾オリゴヌク
レオチドの具体的な例には、ホスホロチオエート、ホス
ホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルも
しくはシクロアルキル糖間結合又は短鎖ヘテロ原子もし
くは複素環糖間結合を有するものが含まれる。最も好ま
しいものは、ホスホロチオエートを有するオリゴヌクレ
オチド、並びにCH2−NH−Ｏ−CH2、CH2−Ｎ（CH3）−Ｏ
−CH2［メチレン（メチルイミノ）もしくはMMI主鎖とし
て知られる］、CH2−Ｏ−Ｎ（CH3）−CH2、CH2−Ｎ（CH
3）−Ｎ（CH3）−CH2及びＯ−Ｎ（CH3）−CH2−CH2主鎖
を有するものであり、ここで、未変性のホスホジエステ
ル主鎖はＯ−Ｐ−Ｏ−CH2で表される。モルホリノ主鎖
構造を有するオリゴヌクレオチドも好ましい（Summerto
n及びWeller、米国特許第5,034,506号）。NR−Ｃ（＊）
−CH2−CH2、CH2−NR−Ｃ（＊）−CH2、CH2−CH2−NR−
Ｃ（＊）、Ｃ（＊）−NR−CH2−CH2及びCH2−Ｃ（＊）
−NR−CH2主鎖を有するオリゴヌクレオチドがさらに好
ましく、ここで、“＊”はＯ又はＳを表す（アミド主鎖
として知られる;DeMesmaekerら,1992年11月26日公開のW
O92/20823）。他の好ましい態様、例えば、ペプチド核
酸（PNA）主鎖においては、オリゴヌクレオチドのホス
ホジエステル主鎖がポリアミド主鎖で置換されており、
ヌクレオベースはこのポリアミド主鎖のアザ窒素原子に
直接、もしくは間接的に結合する（Nielsenら,Science,
1991,254,1497;米国特許第5,539,082号）。他の好まし
い修飾オリゴヌクレオチドは、以下のもののうちの１つ
を2'位に有する１つ以上の置換糖部分を含み得る:OH、S
H、SCH3、Ｆ、OCN、OCH3OCH3、OCH3O（CH2）nCH3、Ｏ
（CH2）nNH2もしくはＯ（CH2）nCH3（ここで、ｎは１〜
約10である）;C1〜C10低級アルキル、アルコキシアルコ
キシ、置換低級アルキル、アルカリールもしくはアラル
キル;Cl;Br;CN;CF3;OCF3;O−、Ｓ−、もしくはＮ−アル
キル;O−、Ｓ−、Ｎ−アルケニル;SOCH3;SO2CH3;ONO2;N
O2;N3;NH2;ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカ
リール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；
置換シリル;RNA開裂基；リポーター基；介在基（インタ
ーカレーター）；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を
改善するための基；又はオリゴヌクレオチドの薬力学的
特性を改善するための基及び同様の特性を有する他の置
換基。好ましい修飾には2'−メトキシエトキシ［2'−Ｏ
−CH2CH2OCH3、別名2'−Ｏ−（２−メトキシエチル）］
が含まれる（Martinら,Helv.Chim.Acta,1995,78,48
6）。他の好ましい修飾には、2'−メトキシ（2'−Ｏ−C
H3）、2'−プロポキシ（2'−OCH2CH2CH3）及び2'−フル
オロ（2'−Ｆ）が含まれる。同様の置換をオリゴヌクレ
オチド上の他の位置、特には、3'末端ヌクレオチド上の
糖の3'位及び5'末端ヌクレオチド上の5'位で行うことが
できる。また、オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシ
ル基の代わりに糖模倣体、例えば、シクロブチルを有し
ていてもよい。
さらに、又はその代わりに、本発明のオリゴヌクレオ
チドはヌクレオベースの修飾又は置換を含んでいてもよ
い。ここで用いられる場合、“非修飾”又は“天然”ヌ
クレオベースにはアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チ
ミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が含ま
れる。修飾ヌクレオベースには、天然核酸においては希
に、もしくは一時的にのみ見出されるヌクレオベース、
例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−メ
チルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン（HM
C）、グリコシルHMC及びゲンチオビオシルHMC、さらに
合成ヌクレオベース、例えば、５−ブロモウラシル、５
−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−
デアザグアニン、N6（６−アミノヘキシル）アデニン及
び2,6−ジアミノプリンが含まれる（Kornberg,A.,DNA R
eplication,1974,W.H.Freeman ＆ Co.,SanFrancisco,19
74,pp.75−77;Gebeyehu,G.ら,Nucleic Acids Res.,198
7,15,4513）。
本発明のオリゴヌクレオチドの他の好ましい追加の、
もしくは代わりの修飾にはオリゴヌクレオチドへの１つ
以上の親油性部分の化学結合が含まれ、これはそのオリ
ゴヌクレオチドの細胞による取り込みを強化する。この
ような親油性部分は、オリゴヌクレオチドに、そのオリ
ゴヌクレオチド上の幾つかの異なる位置で結合させるこ
とができる。幾つかの好ましい位置には、3'末端ヌクレ
オチドの糖の3'位、5'末端ヌクレオチドの糖の5'位、及
びあらゆるヌクレオチドの糖の2'位が含まれる。プリン
ヌクレオベースのN6位も、本発明のオリゴヌクレオチド
に親油性部分を結合させるのに利用することができる
（Gebeyehu,G.ら,NucleicAcids Res.,1987,4513）。こ
のような親油性部分にはコレステリル部分（Letsinger
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553）、コール酸
（Manoharanら,Bioorg.Med.Chem.Let.,1994,4,1053）、
チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオー
ル（Manoharanら,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,306;Man
oharanら,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3,2765）、チオ
コレステロール（Oberhauserら,Nucl.Acids Res.,1992,
20,533）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしく
はウンデシル残基（Saison−Behmoarasら,EMBO J.,199
1,10,111;Kabanovら,FEBS Lett.,1990,259,327;Svinarc
hukら,Biochimie,1993,75,49）、リン脂質、例えば、ジ
−ヘキサデシル−rac−グリセロールもしくはトリエチ
ルアンモニウム1,2−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−rac−グリ
セロ−３−Ｈ−ホスホネート（Manoharanら,Tetrahedro
n Lett.,1995,36,3651;Sheaら,Nucl.Acids Res.,1990,1
8,3777）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール
鎖（Manoharanら,Nucleosides ＆ Nucleotides,1995,1
4,969）、又はアダマンタン酢酸（Manoharanら,Tetrahe
dron Lett.,1995,36,3651）、パルミチル部分（Mishra
ら,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229）、又はオク
タデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−
オキシコレステロール部分（Crookeら,J.Pharmacol.Ex
p.Ther.,1996,277,923）が含まれるが、これらに限定さ
れるものではない。米国特許第5,138,045号、第5,218,1
05号及び第5,459,255号（これらの内容は参照すること
によりここに組み込まれる）に開示されるもののような
親油性部分を含むオリゴヌクレオチド、及びそのような
オリゴヌクレオチドを調製するための方法。
本発明には、キメラオリゴヌクレオチドであるオリゴ
ヌクレオチドも含まれる。“キメラ”オリゴヌクレオチ
ド又は“キメラ”は、本発明の脈絡においては、各々少
なくとも１つのヌクレオチドで形成される、２つ以上の
化学的に異なる領域を含むオリゴヌクレオチドである。
これらのオリゴヌクレオチドは典型的には少なくとも１
つの領域を含み、ここで、このオリゴヌクレオチドは、
ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞による取り
込みの増加、及び／又は標的核酸に対する結合親和性の
増加がこのオリゴヌクレオチドに付与されるように修飾
されている。このオリゴヌクレオチドの追加領域は、RN
A:DNA又はRNA:RNAハイブリッドを開裂することが可能な
酵素の基質としての役割を果たし得る。例として、RNA
分解酵素ＨがRNA:DNA二重鎖のRNA鎖を開裂する細胞性エ
ンドヌクレアーゼである。したがって、RNA分解酵素Ｈ
の活性化によりRNA標的の開裂が生じ、それにより遺伝
子発現のアンチセンス阻害の効率が大きく高められる。
RNA標的の開裂はゲル電気泳動及び、必要であれば、当
該技術分野において公知の関連核酸ハイブリダイゼーシ
ョン技術により定型的に検出することができる。例とし
て、このような“キメラ”は“ギャップマー（gapme
r）”、すなわち、その中央部分（“ギャップ”）が、
例えばRNA分解酵素Ｈの、基質の役割を果たし、かつ5'
及び3'部分（“両翼”）が標的RNA分子に対するより高
い親和性を有するもののヌクレアーゼ活性を支持するこ
とができないような様式で修飾されている（例えば、2'
−フルオロ又は2'−メトキシエトキシ置換）オリゴヌク
レオチドであり得る。他のキメラには、“ウィングマー
（wingmer）”、すなわち、その5'部分が、例えばRNA分
解酵素Ｈの、基質の役割を果たし、それに対して3'部分
が標的RNA分子に対するより高い親和性を有するものの
ヌクレアーゼ活性を支持することができないような様式
で修飾され（例えば、2'−フルオロ又は2'−メトキシエ
トキシ置換）、又はその逆であるオリゴヌクレオチドが
含まれる。
本発明によるオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約
８〜約30のヌクレオチドを有する。このようなオリゴヌ
クレオチドは約15〜25のヌクレオチドを有することがよ
り好ましい。当該技術分野において公知であるように、
ヌクレオチドは、ホスホジエステル、ホスホロチオエー
ト又は他の共有結合により隣接するヌクレオチドに適切
に結合する塩基−糖の組み合わせである。
本発明に従って用いられるオリゴヌクレオチドは、公
知の固相合成技術により好都合に、かつ定型的に作製す
ることができる。このような合成のための機器は、例え
ば、Applied Biosystems（Foster City、CA）を含む幾
つかの製造元によって販売されている。これに加えて、
又はそれに代えて、当該技術分野において公知の、この
ような合成のための他のあらゆる手段を用いることがで
きる。同様の技術を他のオリゴヌクレオチド、例えば、
ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体の調製に用い
ることも公知である。
本発明のオリゴヌクレオチドは治療用化合物、診断用
ツール並びに研究用試薬及びキットとして用いることが
できる。“治療的使用”という用語は、本発明のオリゴ
ヌクレオチドをイン・ビボ又は生体外のいずれかで動物
細胞と接触させる、予防的、対症的及び治癒的な使用を
含むことが意図されている。生体外で動物細胞と接触さ
せる場合、治療的使用には、１種類以上の本発明のオリ
ゴヌクレオチドで治療した後にそのような細胞を動物に
組み込むことが含まれる。特定の有用性に結び付けるこ
とを意図するものではないが、本発明のオリゴヌクレオ
チドによる、例えばＴ細胞の増殖の、生体外調節は、例
えば、APCにおけるB7タンパク質の発現を調節すること
が望ましい潜在的な治療様式において用いることができ
る。例として、B7−１タンパク質の発現を阻害するオリ
ゴヌクレオチドは、APCの表面上のB7−２の有効性を高
め、したがって、生体外でＴ細胞上のB7−２の同時刺激
効果を高めることが期待される（Levineら,Science,199
6,272,1939）。
治療的に使用するには、B7タンパク質の発現又は活性
を調節することにより治療又は予防することができる疾
患又は障害を有することが疑われる動物を、本発明に従
ってオリゴヌクレオチドを投与することにより治療す
る。本発明のオリゴヌクレオチドは、有効量のオリゴヌ
クレオチドを適切な薬学的に許容し得る希釈剤又は担体
に添加することにより、医薬組成物の形態で用いること
ができる。当該分野における研究者は、ウイルス性、真
菌性及び代謝性疾患に関与する遺伝子の発現を調節する
ことが可能な、アンチセンス、三重鎖及び他のオリゴヌ
クレオチド組成物を識別している。アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドはヒトに安全に投与されており、幾つかの
臨床試験が現在進行中である。したがって、オリゴヌク
レオチドが、細胞、組織及び動物、特にはヒトを治療す
るための治療措置において有用となるように構成するこ
とができる有用な治療手段であり得ることが確立されて
いる。
さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、細胞もしく
は組織試料中のB7特異的核酸の存在を検出するのに用い
ることができる。例えば、ポリヌクレオチドキナーゼを
用いて5'末端を32P標識することにより放射標識オリゴ
ヌクレオチドを調製することができる（Sambrookら,Mol
ecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spring Har
bor Laboratory Press,1989,Volume 2,pg.10.59）。次
に、放射標識オリゴヌクレオチドをB7伝令RNA（したが
って、B7タンパク質）を含むことが疑われる細胞もしく
は組織試料と接触させ、それらの試料を洗浄して未結合
オリゴヌクレオチドを除去する。試料中に残留する放射
能は結合したオリゴヌクレオチドの存在を示し、それは
そのオリゴヌクレオチドと相補的な核酸の存在を示すも
のであり、これはシンチレーションカウンター又は他の
定型的な手段を用いて定量することができる。このよう
にして、これらのタンパク質をコードする核酸の発現を
検出する。
また、本発明の放射標識オリゴヌクレオチドは、組織
のオートラジオグラフィーを行って、研究、診断又は治
療のためにB7タンパク質の局在化、分布及び定量化を決
定するのにも用いることができる。このような研究にお
いては、組織切片を放射標識オリゴヌクレオチドで処理
して上述のように洗浄した後、定型的なオートラジオグ
ラフィー手順に従って写真用エマルジョンに露出する。
このエマルジョンは、現像すると、B7遺伝子を発現する
領域全体にわたって銀粒子の画像を生じる。これらの銀
粒子を定量化することにより、これらのタンパク質をコ
ードするmRNA分子の発現を検出することができ、これら
の領域に対するオリゴヌクレオチドのターゲッティング
が可能となる。
B7核酸の発現を蛍光検出するための類似の検定を、放
射標識の代わりにフルオレセイン又は他の蛍光タグが結
合した本発明のオリゴヌクレオチドを用いて開発するこ
とができる。このような結合は、固相合成の間に、蛍光
標識アミダイト又は多孔性ガラス（controlled pore gl
ass）（CPG）カラムを用いて定型的に達成される。フル
オレセイン標識アミダイト及びCPGは、例えば、Glen Re
search、Sterling VAから入手可能である。
本発明は、B7タンパク質をコードする核酸を標的とす
るオリゴヌクレオチド及びそのようなタンパク質をコー
ドする核酸を標的とするオリゴヌクレオチドを用いる。
B7タンパク質の発現の有無を検出するためのキットも調
製することができる。このようなキットは適切な遺伝
子、すなわち、B7タンパク質をコードする遺伝子を標的
とするオリゴヌクレオチドを含む。適切なキット及び検
定の形式、例えば“サンドイッチ”検定は、当該技術分
野において公知であり、本発明のオリゴヌクレオチドと
の使用に容易に適合させることができる。本発明のオリ
ゴヌクレオチドとB7タンパク質をコードする核酸とのハ
イブリダイゼーションは当該技術分野において公知の手
段により検出することができる。このような手段には、
オリゴヌクレオチドへの酵素の結合、オリゴヌクレオチ
ドの放射標識又は他のあらゆる適切な検出系が含まれ得
る。B7タンパク質の有無を検出するためのキットも調製
することができる。
本発明の脈絡において、“ハイブリダイゼーション”
は相補的ヌクレオチド間の水素結合を意味し、この水素
結合はWatson−Crick、Hoogsteen又は逆Hoogsteen水素
結合であり得る。例えば、アデニン及びチミンが、その
対が水素結合の形成によるものである相補的ヌクレオベ
ースである。ここで用いられる場合、“相補的”は、２
つのヌクレオチドの間で正確に対を形成する能力を指
す。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置のヌクレ
オチドがDNA又はRNA分子の同じ位置のヌクレオチドと水
素結合することが可能である場合、そのオリゴヌクレオ
チドとそのDNA又はRNAとはその位置で互いに相補的であ
るものと考えられる。そのオリゴヌクレオチドとそのDN
A又はRNAとは、各々の分子において対応する位置のうち
の十分な数が互いに水素結合することができるヌクレオ
チドによって占められる場合、互いに相補的である。し
たがって、“特異的にハイブリダイズ可能”及び“相補
的”は、オリゴヌクレオチドとDNA又はRNA標的との間で
安定かつ特異的な結合が生じるような、十分な程度の相
補性又は正確な対形成を示すのに用いられる用語であ
る。特異的にハイブリダイズ可能であるためにオリゴヌ
クレオチドがその標的DNA配列と100％相補的である必要
がないことは当該技術分野において理解される。標的DN
A又はRNA分子へのオリゴヌクレオチドの結合がその標的
DNA又はRNAの正常な機能を妨害して機能の低減又は喪失
を生じ、かつ特異的結合が望ましい条件下、すなわち、
イン・ビボ検定もしくは治療的処置においては生理学的
条件下、又はイン・ビトロ検定においてはその検定が行
われる条件下において、非標的配列に対するそのオリゴ
ヌクレオチドの非特異的結合を回避するのに十分な程度
の相補性が存在する場合、そのオリゴヌクレオチドは特
異的にハイブリダイズ可能である。
治療用組成物の処方及び引き続くそれらの投与は当業
者の技術の範囲内にあるものと信じられる。一般に、治
療のためには、そのような治療を必要とする患者に、通
常は薬学的に許容し得る担体中の本発明によるオリゴヌ
クレオチドを、患者の年齢及び治療する障害もしくは疾
患状態の重篤性に応じて体重kg当たり0.01μｇ〜100gの
範囲の用量で投与する。さらに、この治療措置は、その
持続期間をその疾患もしくは障害の性質、その重篤性及
び患者の全体的な状態に応じて変化させることができ、
１日に１回から20年ごとに１回まで拡張することができ
る。治療の後、患者を、その患者の状態の変化及び障害
もしくは疾患状態の症状の緩和について監視する。オリ
ゴヌクレオチドの投与量は、患者が現在の投与量水準に
対して顕著な応答を示さない場合には増加させることが
でき、あるいは障害もしくは疾患状態の症状の緩和が観
察される場合、又は障害もしくは疾患状態が取り除かれ
ている場合には用量を減少させることができる。
幾つかの場合には、治療措置の効力を高めるために本
発明のオリゴヌクレオチドを他の治療様式と共に用いて
患者を治療することがより有効であり得る。本発明の脈
絡において、“治療措置”という用語は、治療的、対症
的及び予防的な様式を含むことが意図されている。好ま
しい態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、細
胞接着分子（ICAM）、好ましくはICAM−１を標的とする
１種類以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドと共に用
いられる。本発明のオリゴヌクレオチドと組み合わせて
用いることができる他の抗炎症剤及び／又は免疫抑制剤
には、可溶性ICAMタンパク質（例えば、sICAM−１）、
抗体−毒素結合体、プレドニゾン、メチルプレドニソロ
ン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポ
リン、インターフェロン、交感神経模倣薬、通常の抗ヒ
スタミン剤（ヒスタミンH1受容体アンタゴニスト、例え
ば、マレイン酸ブロムフェニラミン（brompheniramine
maleate）、マレイン酸クロロフェニラミン（chlorphen
iramine maleate）、マレイン酸デキシクロロフェニラ
ミン（dexchlorpheniramine maleate）、トリポリジンH
Cl（tripolidine HCl）、マレイン酸カルビノキサミン
（carbinoxamine maleate）、フマル酸クレマスチン（c
lemastine fumarate）、ジメンヒドリネート（dimenhyd
rinate）、ジフェンヒドラミンHCl（diphenhydramine H
Cl）、ジフェニルピラリンHCl（diphenylpyraline HC
l）、コハク酸ドキシルアミン（doxylamine succinat
e）、クエン酸トリペレンアミン（tripelennamine citr
ate）、トリペレンアミンHCl（tripelennamine HCl）、
シクリジンHCl（cyclizine HCl）、ヒドロキシジンHCl
（hydroxyzine HCl）、メクリジンHCl（meclizine HC
l）、メトジラジンHCl（methdilazine HCl）、プロメタ
ジンHCl（promethazine HCl）、酒石酸トリメプラジン
（trimeprazine tartrate）、マレイン酸アザタジン（a
zatadine maleate）、シプロヘプタジンHCl（cyprohept
adine HCl）、ターフェナジン（terfenadine）等を含
む）、ヒスタミンH2受容体アンタゴニスト（例えば、ラ
ニチジン（ranitidine））が含まれるが、これらに限定
されるものではない。一般には、The Merck Manual of
Diagnosis and Therapy,15th Ed.,Berkowら,eds.,1987,
Rahway,N.J.,302−336頁及び2516−2522頁を参照。本発
明の化合物と共に用いる場合、このような薬剤は個別
に、連続的に、又は１種類以上の他のこのような薬剤と
組み合わせて用いることができる。
本発明の別の好ましい態様においては、あるB7mRNA種
（例えば、B7−１）を標的とするアンチセンスオリゴヌ
クレオチドを第２のB7mRNA種（例えば、B7−２）を標的
とするアンチセンスオリゴヌクレオチドと組み合わせて
用いる。これは、B7分子の同時刺激効果を、いずれかの
オリゴヌクレオチドを個別に用いて達成することができ
るものよりも高い程度まで阻害するためである。この態
様に関連するものにおいては、代わりの様式でスプライ
スされたB7−１もしくはB7−2mRNAを各々標的とする２
種類以上の本発明のオリゴヌクレオチドを、これらの代
わりの様式でスプライスされたmRNAの両形態の発現を阻
害するために互いに組み合わせる。用いられる調節作用
因子の特異性に依存して、代わりの様式でスプライスさ
れたmRNAの一方の形態の阻害が、発症する所定の状態に
つながる発現を十分に減少させる結果とはならないこと
が当該技術分野において公知である。したがって、この
ような組み合わせは、幾つかの場合において、特定のB7
遺伝子の発現を本発明の方法のうちの１つを実施するの
に必要な程度にまで阻害するのに望ましいものであり得
る。
治療に成功した後、その患者に維持療法を施して疾患
状態の再発を予防することが望ましいことがあり、ここ
ではオリゴヌクレオチドを、体重kg当たり0.01μｇ〜10
0gの範囲の維持用量で、１日に１回以上ないし20年毎に
１回投与する。自己免疫もしくは炎症状態の傾向にある
ことが知られ、又はそれが疑われる個人における場合、
体重kg当たり0.01μｇ〜100gの範囲の予防的用量を１日
１回以上ないし20年毎に１回投与することにより、予防
効果を達成することができる。同様にして、個人を、あ
る医療処置の結果として生じることが予想される炎症状
態、例えば、その個人への細胞、組織又は器官の移植か
ら生じる移植片対宿主症に対する感受性を低下させるこ
とができる。
本発明の医薬組成物は、局所的もしくは全身的処置の
いずれが望ましいのか、及び治療しようとする領域に応
じて、幾つかの方法で投与することができる。投与は局
所（眼、膣、直腸、鼻内、経皮を含む）であっても、経
口であっても、又は非経口であってもよい。非経口投与
には静脈内点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射、又
はくも膜下もしくは室内投与が含まれる。
局所投与用の製剤には経皮パッチ、軟膏、ローショ
ン、クリーム、ゲル、ドロップ、座剤、スプレー、液体
及び粉末が含まれる。通常の医薬担体、水性、粉末もし
くは油状基剤、増粘剤等が必要であるか、又は望ましい
ものであり得る。被覆コンドーム、手袋等も有用であり
得る。
経口投与用の組成物には粉末もしくは顆粒、水もしく
は非水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、サシ
ェイ又は錠剤が含まれる。増粘剤、香料、希釈剤、乳化
剤、分散助剤又は結合剤が望ましいものであり得る。
非経口、くも膜下又は室内投与用の組成物には無菌水
溶液が含まれ、これもまた緩衝剤、希釈剤及び他の適切
な添加物を含むことができる。
投薬は治療しようとする疾患状態の重篤性及び応答性
に依存し、その一連の治療は数日〜数ヶ月、又は治癒が
達成され、もしくは疾患状態の低減が達成されるまで続
く。最適投薬スケジュールは、患者体内での薬物の蓄積
の測定から算出することができる。当業者は最適投与
量、投薬方法及び反復率を容易に決定することができ
る。最適投与量は個々のオリゴヌクレオチドの相対効力
に応じて変化する可能性があり、一般には、イン・ビト
ロ及びイン・ビボ動物モデルにおいて有効であることが
見出されたEC50に基づいて見積もることができる。一般
には、投与量は体重kg当たり0.01μｇ〜100gであり、毎
日、毎週、毎月もしくは毎年１回以上投与することがで
き、あるいは２〜20年毎に１回の投与であってもよい。
以下の例は本発明を説明するものであり、それを限定
することを意図するものではない。当業者は、ここに記
載される特定の物質及び手順の多数の等価物を認識し、
又は定型的な実験により確認することができるであろ
う。このような等価物は本発明の範囲内にあるものと考
えられる。
以下の例は説明のためだけに提供されるものであり、
本発明を限定することを意図するものではない。
実施例 実施例1:核酸の合成 オリゴヌクレオチド オリゴヌクレオチドを、自動DNA合成機で、ヨウ素で
の酸化を伴う標準ホスホラミダイト化学を用いて合成し
た。ｂ−シアノエチルジイソプロピルホスホラミダイト
はApplied Biosystems（Foster City、CA）から購入し
た。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドについて
は、亜リン酸結合の段階的チア化（thiation）のため、
標準酸化瓶をアセトニトリル中の3H−1,2−ベンゾジチ
オール−３−オン−1,1−ジオキシドの0.2M溶液で置き
換えた。チア化サイクル待機工程を68秒に増加させ、続
いてキャッピング工程を行った。
本発明の2'−フルオロホスホロチオエートオリゴヌク
レオチドを5'−ジメトキシトリチル−3'−ホスホラミダ
イトを用いて合成し、1990年１月11日出願の米国特許出
願連続番号第463,358号及び1990年８月13日出願の連続
番号第566,997号に開示される通りに調製した。これら
の特許出願は本願と同じ譲受人に譲渡されたものであ
り、参照することによりここに組み込まれる。2'−フル
オロオリゴヌクレオチドはホスホラミダイト化学を用
い、標準的なDNA合成プロトコルに僅かな改変を施して
調製した：脱保護をメタノール性アンモニアを用いて室
温で行った。
本発明の2'−メトキシ（2'−Ｏ−メチル）オリゴヌク
レオチドを、2'−メトキシβ−シアノエチルジイソプロ
ピル−ホスホラミダイト（Chemgenes、NeedhamMA）及
び、テトラゾール及び塩基のパルス搬送後の待機工程を
360秒に増加させたこと以外は非修飾オリゴヌクレオチ
ドの標準的なサイクルを用いて合成した。他の2'−アル
コキシオリゴヌクレオチドは、この方法を改変すること
により、適切な2'−修飾アミダイト、例えば、Glen Res
earch,Inc.、Sterling、VAから入手できるものを用いて
合成した。この合成を開始させるのに用いられる3'塩基
は2'−デオキシリボヌクレオチドであった。本発明の2'
−Ｏ−プロピルオリゴヌクレオチドはこの手順を僅かに
改変することにより調製する。
本発明の2'メトキシエトキシ（2'−Ｏ−CH2CH2OCH3）
オリゴヌクレオチドは、Martin,Helv.Chim.Acta 1995,7
8,486の方法に従って合成した。合成を容易にするた
め、最後のヌクレオチドはデオキシヌクレオチドであっ
た。全ての2'−Ｏ−CH2CH2OCH3−シトシンは５−メチル
シトシンであり、これは以下の手順に従って合成した。
５−メチルシトシンモノマーの合成： 2,2'−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシ
ル）−５−メチルウリジン］ ５−メチルウリジン（リボシルチミン、Yamasa、銚
子、日本から購入可能）（72.0g、0.279M）、炭酸ジフ
ェニル（90.0g、0.420M）及び重炭酸ナトリウム（2.0
g、0.024M）をDMF（300mL）に添加した。この混合物を
攪拌しながら還流温度まで加熱し、発生する二酸化炭素
ガスを制御しながら放出させた。１時間後、この僅かに
黒みがかった溶液を減圧下で濃縮した。生じたシロップ
を、攪拌しながら、ジエチルエーテル（2.5L）に注ぎ入
れた。この生成物はゴム状物質を形成した。エーテルを
デカントし、残滓を最少量のメタノール（約400mL）に
溶解した。この溶液を新鮮なエーテル（2.5L）に注ぎ入
れることで、固いゴム状物質が生じた。エーテルをデカ
ントし、ゴム状物質を真空オーブン内で乾燥（60℃、1m
mHgで24時間）させて固体を得、これを粉砕して明黄褐
色の粉末とした（57g、粗収率85％）。この物質をその
ままさらなる反応に用いた。
2'−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン 2,2'−アンヒドロ−５−メチルウリジン（195g、0.81
M）、ホウ酸トリス（２−メトキシエチル）（231g、0.9
8M）及び２−メトキシエタノール（1.2L）を2Lステンレ
ス鋼圧力に添加し、160℃の予め加熱した油浴に入れ
た。155−160℃で48時間加熱した後、容器を開き、溶液
を蒸発させて乾燥させ、MeOH（200mL）と共に摩砕し
た。その残滓を熱アセトン（1L）に懸濁させた。不溶性
塩を濾過し、アセトン（150mL）で洗浄して濾液を蒸発
させた。その残滓（280g）をCH3CN（600mL）に溶解し、
蒸発させた。シリカゲルカラム（3kg）に、0.5％のEt3N
Hを含むCH2Cl2/アセトン/MeOH（20:5:3）を充填した。
残滓をCH2Cl2（250mL）に溶解し、カラムに添加する前
にシリカ（150g）に吸着させた。生成物を充填溶媒で溶
出し、160g（53％）の生成物を得た。
2'−Ｏ−メトキシエチル−5'−Ｏ−ジメトキシトリチル
−５−メチルウリジン 2'−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（160
g、0.506M）をピリジン（250mL）と共に蒸発させ、乾燥
残滓をピリジン（1.3L）に溶解した。塩化ジメトキシト
リチルの第１分量（94.3g、0.278M）を添加し、その混
合物を室温で１時間攪拌した。塩化ジメトキシトリチル
の第２分量（94.3g、0.278M）を添加し、その反応物を
さらに１時間攪拌した。その後、メタノール（170mL）
を添加して反応を停止させた。HPLCにより、約70％の生
成物の存在が示された。溶媒を蒸発させ、CH3CN（200m
L）と共に摩砕した。その残滓をCHCl3（1.5L）に溶解
し、２×500mLの飽和NaHCO3及び２×500mLの飽和NaClで
抽出した。有機相をNa2SO4で乾燥させ、濾過して蒸発さ
せた。275gの残滓を得た。その残滓を、0.5％のEt3NHを
含むEtOAc/ヘキサン／アセトン（5:5:1）で充填及び溶
出する3.5kgのシリカゲルカラムで精製した。約20gの追
加物を不純物画分から得、総収量が183g（57％）となっ
た。
3'−Ｏ−アセチル−2'−Ｏ−メトキシエチル−5'−Ｏ−
ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン 2'−Ｏ−メトキシエチル−5'−Ｏ−ジメトキシトリチ
ル−５−メチルウリジン（106g、0.167M）、DMF/ピリジ
ン（562mLのDMF及び188mLのピリジンから調製した3:1混
合液750mL）及び無水酢酸（24.38mL、0.258M）を合わ
せ、室温で24時間攪拌した。反応をtlcで、最初にtlc試
料の反応をMeOHを添加して停止させることにより監視し
た。tlcによる判断で反応が完了したら、直ちにMeOH（5
0mL）を添加し、その混合物を35℃で蒸発させた。その
残滓をCHCl3（800mL）に溶解し、２×200mLの飽和重炭
酸ナトリウム及び２×200mLの飽和NaClで抽出した。水
層を再度200mLのCHCl3で抽出した。合わせた有機物を硫
酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させて122gの残滓を得た
（約90％の生成物）。その残滓を3.5kgのシリカゲルカ
ラムで精製し、EtOAc/ヘキサン（4:1）を用いて溶出し
た。純粋生成物画分を蒸発させて96g（84％）を得た。
3'−Ｏ−アセチル−2'−Ｏ−メトキシエチル−5'−Ｏ−
ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウ
リジン 3'−Ｏ−アセチル−2'−Ｏ−メトキシエチル−5'−Ｏ
−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（96g、0.1
44M）をCH3CN（700mL）に溶解することにより第１溶液
を調製し、脇に寄せた。トリエチルアミン（189mL、1.4
4M）をCH3CN（1L）中のトリアゾール（90g、1.3M）の溶
液に添加して−５℃に冷却し、オーバーヘッド攪拌機を
用いて0.5時間攪拌した。POCl3を滴下により30分間にわ
たって、０−10℃に維持したこの攪拌溶液に添加し、得
られた混合物をさらに２時間攪拌した。第１溶液を後者
の溶液に、滴下により45分間にわたって添加した。生じ
た反応混合物を低温室内で一晩保存した。この反応混合
物から塩を濾過し、溶液を蒸発させた。その残滓をEtOA
c（1L）に溶解し、不溶性固体を濾過により除去した。
濾液を１×300mLのNaHCO3及び２×300mLの飽和NaClで洗
浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させて蒸発させた。その残
滓をEtOAcと共に摩砕して表題の化合物を得た。
2'−Ｏ−メトキシエチル−5'−Ｏ−ジメトキシトリチル
−５−メチルシチジン ジオキサン（500mL）及びNH4OH（30mL）中の3'−Ｏ−
アセチル−2'−Ｏ−メトキシエチル−5'−Ｏ−ジメトキ
シトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン
（103g、0.141M）の溶液を室温で２時間攪拌した。この
ジオキサン溶液を蒸発させ、残滓をMeOH（２×200mL）
と共沸させた。その残滓をMeOH（300mL）に溶解し、２
リットルステンレス鋼圧力容器に移した。NH3ガスで飽
和させたMeOH（400mL）を添加し、容器を100℃に２時間
加熱した（tlcにより完全な変換が示された）。容器の
内容物を蒸発させて乾燥させ、その残滓をEtOAc（500m
L）に溶解して飽和NaCl（200mL）で１回洗浄した。有機
物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を蒸発させて表題
の化合物85g（95％）を得た。
N4−ベンゾイル−2'−Ｏ−メトキシエチル−5'−Ｏ−ジ
メトキシトリチル−５−メチルシチジン 2'−Ｏ−メトキシエチル−5'−Ｏ−ジメトキシトリチ
ル−５−メチルシチジン（85g、0.134M）をDMF（800m
L）に溶解し、無水安息香酸（37.2g、0.165M）を攪拌し
ながら添加した。３時間攪拌した後、tlcにより反応が
約95％完了したことが示された。溶媒を蒸発させ、その
残滓をMeOH（200mL）と共沸させた。その残滓をCHCl
3（700mL）に溶解して飽和NaHCO3（２×300mL）及び飽
和NaCl（２×300mL）で抽出し、MgSO4で乾燥させ、蒸発
させて残滓（96g）を得た。その残滓を、1.5kgシリカカ
ラムで、0.5％のEt3NHを含むEtOAc/ヘキサン（1:1）を
溶出溶媒として用いてクロマトグラフ処理した。純粋生
成物画分を蒸発させ、表題の化合物90g（90％）を得
た。
N4−ベンゾイル−2'−Ｏ−メトキシエチル−5'−Ｏ−ジ
メトキシトリチル−５−メチルシチジン−3'−アミダイ
ト N4−ベンゾイル−2'−Ｏ−メトキシエチル−5'−Ｏ−
ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（74g、0.10
M）をCH2Cl2（1L）に溶解した。テトラゾールジイソプ
ロピルアミン（7.1g）及び２−シアノエトキシ−テトラ
（イソプロピル）ホスファイト（40.5mL、0.123M）を、
攪拌しながら、窒素雰囲気下で添加した。得られた混合
物を室温で20時間攪拌した（tlcにより反応が95％完了
したことが示された）。この反応混合物を飽和NaHCO
3（１×300mL）及び飽和NaCl（３×300mL）で抽出し
た。水性洗浄液をCH2Cl2（300mL）で再度抽出し、抽出
物を合わせ、MgSO4で乾燥させて濃縮した。得られた残
滓を、1.5kgシリカカラムで、EtOAc/ヘキサン（3:1）を
溶出溶媒として用いてクロマトグラフ処理した。純粋画
分を合わせて、表題の化合物90.6g（87％）を得た。
精製： 多孔性ガラスカラム（Applied Biosystems）から切り
離し、濃水酸化アンモニウム中55℃で18時間脱ブロック
した後、2.5容積のエタノールを含む0.5N NaClから２
回沈殿させることによりオリゴヌクレオチドを精製し
た。分析ゲル電気泳動を、20％アクリルアミド、8M尿
素、45mMトリス−ホウ酸緩衝液、pH7.0において行っ
た。オリゴヌクレオチド及びそれらのホスホロチオエー
ト類似体が、電気泳動から、80％を上回る完全長物質で
あるものと判定された。
公開されているヒトB7−１（hB7−１）及びネズミ（m
B7−１）mRNA配列（それぞれ、Freemanら,J.Immunol.,1
989,143,2714及びFreemanら,J.Exp.Med.,1991,174,62
5）にハイブリダイズするように設計された配列を有す
る一連のオリゴヌクレオチド。これらのオリゴヌクレオ
チドの配列及びそれらに対する修飾、並びにhB7−1mRNA
上のそれらの標的部位の各々の位置を表１及び２に示
す。同様に、ヒトB7−２（hB7−２）及びネズミB7−２
（mB7−２）mRNAの公開された配列（それぞれ、Azuma
ら,Nature,1993,366,76;Chenら,J.Immunol.,1994,152,4
929）にハイブリダイズするように設計された配列を有
する一連のオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオ
リゴヌクレオチドの配列及びそれらに対する修飾、並び
にhB7−2mRNA上のそれらの標的部位の各々の位置を表３
及び４に記載する。ISIS2302（配列番号17）を含む、IC
AM−１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは
1996年５月７日発行の米国特許第5,514,788号に記載さ
れており、これは参照することによりここに組み込まれ
る。ISIS1082（配列番号102）及びISIS3082（配列番号1
01）は従来記載されている（Stepkowskiら,J.Immunol.,
1994,153,5336）。
それらの初期クローン化に続いて、B7転写体の代替ス
プライシングが報告されている。報告されているB7−１
の代替スプライシングは比較的単純であり、元来報告さ
れているヒト及びネズミB7−1cDNA配列（Borrielloら,
J.Immunol.,1994,153,5038;Inobeら,J.Immunol.,1996,1
57,588）の5'末端に対して5'側に伸びるメッセージが生
じた。B7−１の配列を最初に報告する参考文献中に見出
されるB7−１の配列の番号付けを維持するため、表１及
び２において、これらの最初に報告された配列の5'伸長
内の位置には負の数字が付与されている（−１位、5'伸
長の最も3'側から始まる）。ネズミのB7−２転写体の処
理はB7−１についてこれまで報告されているものよりも
かなり複雑である：例えば、少なくとも５つの別個のネ
ズミB7−2mRNA、及び少なくとも２つの別個のヒトB7−2
mRNAを代替スプライシングにより産生させることができ
る（Borrielloら,J.Immunol.,1995,155,5490;Freeman
ら,WO95/03408,1995年２月２日公開；また、Jellisら,I
mmunogenet.,1995,42,85も参照）。これらのスプライシ
ングの性質は異なる5'エクソンを別個のB7−2mRNAの産
生に用いるようなものであり、その各々は独自の5'配列
を有するものの、最初に報告されたB7−２の配列の幾つ
か、もしくはそれらの全てからなる3'部分を共有する。
結果として、B7−２メッセージの5'伸長内の位置が最初
に報告された配列内の位置に独自に関連することはあり
得ない。したがって、表３においては（WO95/03408の配
列番号１のものに対応する）異なる座標の組が、表４に
おいては（Borrielloら,J.Immunol.,1995,155,5490に示
される）エクソン番号が、最初に報告されたB7−２の配
列に含まれない標的設定された配列の位置を指定するの
に用いられる。さらに、これらの5'伸長メッセージは最
初に公開された配列で示されるものの上流に潜在的なフ
レーム内開始コドンを含むが、簡便にするため、そのよ
うなさらなる潜在的な開始コドンは表１−４における標
的部位の説明には示さない。
表１−４においては、以下の略語を用いる:UTR、非翻
訳領域;ORF、読取り枠;tIR、翻訳開始領域;tTR、翻訳終
止領域;FITC、フルオレセインイソチオシアネート。化
学修飾は以下のように示す。2'フルオロ（2'F）、2'−
メトキシ（2'MO）又は2'−メトキシエトキシ（2'ME）修
飾を有する残基は、修飾の型をそれぞれの略語で示しな
がらボールド体で示す（emboldened）。他に指示されな
い限り、残基間の結合はホスホジエステル結合である；
ホスホロチオエート結合は上付位置に“S"で示す（例え
ば、TSA）。標的の位置は、Freemanら,J.Immunol.,198
9,143:2714（ヒトB7−1cDNA配列；表１）、Freemanら,
J.Exp.Med.,1991,174,625（ネズミB7−1cDNA配列；表
２）、Azumaら,Nature,1993,366:76（ヒトB7−2cDNA配
列；表３）及びChenら,J.Immunol.,1994,152:4929（ネ
ズミB7−2cDNA配列；表４）に従って番号を付けた。ヌ
クレオチド塩基のコードは37C.F.R.§1.822（ｂ）
（１）に示されている。
cDNAクローン： ヒトB7−１の配列をコードするcDNAを逆転写／ポリメ
ラーゼ連鎖反応（RT−PCR）を用いて単離した。Daudi細
胞（ATCC受付番号CCL213）に由来するポリＡ＋RNAを、
オリゴdTプライマーを用いて、標準条件下で逆転写し
た。42℃で30分反応させて熱不活性化した後、反応混合
物（20μＬ）を水で100μＬとした。次に、このRT反応
からの一定分量10μＬを、50μＬのPCR反応において、
5'プライマー、 5'−GAT−CAG−GGT−ACC−CCA−AAG−AAA−AAG−TGA
−TTT−GTC−ATT−GC−3' （センス、配列番号20）、及び3'プライマー、 5'−GAT−AGC−CTC−GAG−GAT−AAT−GAA−TTG−GCT
−GAC−AAG−AC−3' （アンチセンス、配列番号21）を用いて増幅した。
これらのプライマーは、PCR産生物をベクターpcDNA−
３（Invitrogen,San Diego,CA）にサブクローン化する
ための独特の制限部位を含んでいた。5'プライマーは公
開されたヒトB7−１配列の塩基１〜26（Freemanら,J.Im
munol.,1989,143,2714;プライマーの13−38位）との同
一性を有するように設計され、クローン化において用い
るためのKpn I制限部位（プライマーの７−12位）を含
む。3'プライマーは公開されたB7−１の配列の塩基1450
〜1471（プライマーの14−35位）と相補的であるように
設計され、Xho I制限部位（プライマーの７−12位）を
含む。PCRの後、反応物をフェノールで抽出し、エタノ
ールを用いて沈殿させた。その産生物を適切な制限酵素
で消化して完全長断片をアガロースゲルで精製し、同じ
酵素で消化することによって調製したベクターpcDNA−
３（Invitrogen,San Diego,CA）にライゲートした。得
られた構築体pcB7−１を、標準的な手順を用いる制限マ
ッピング及びDNA配列解析により確認した。マウスB7−
１クローン、pcmB7−１を、ネズミのＢリンパ細胞系70Z
3から単離したRNAのRT−PCRにより、同様の方法で単離
した。
また、ヒトB7−２の配列、１〜1391位をコードするcD
NAもRT−PCRにより単離した。Daudi細胞（ATCC受付番号
CCL213）に由来するポリＡ＋RNAを、オリゴdTプライマ
ーを用いて、標準条件下で逆転写した。42℃で30分反応
させて熱不活性化した後、反応混合物（20μＬ）を水で
100μＬとした。次に、このRT反応からの一定分量10μ
Ｌを、50μＬのPCR反応において、5'プライマー、 5'−GAT−CAG−GGT−ACC−AGG−AGC−CTT−AGG−AGG
−TAC−GG−3' （センス、配列番号１）、及び3'プライマー、 5'−GAT−AGC−CTC−GAG−TTA−TTT−CCA−GGT−CAT
−GAG−CCA−3' （アンチセンス、配列番号２）を用いて増幅した。
5'プライマーは公開されたヒトB7−２配列の塩基１−
20（Azumaら,Nature,1993,366,366,76及びGenbank受付
番号L25259;プライマーの13−32位）との同一性を有す
るように設計され、クローン化において用いるためのKp
n I部位（プライマーの７−12位）を含む。3'プライマ
ーは公開されたB7−２の配列の塩基1370−1391（プライ
マーの13−33位）と相補的であるように設計され、Xho
I制限部位（プライマーの７−12位）を含む。PCRの後、
反応物をフェノールで抽出し、エタノールを用いて沈殿
させた。その産生物をXho I及びKpn Iで消化して完全長
断片をアガロースゲルで精製し、同じ酵素で消化するこ
とによって調製したベクターpcDNA−３（Invitrogen,Sa
n Diego,CA）にライゲートした。得られた構築体pcB7−
２を、標準的な手順を用いる制限マッピング及びDNA配
列解析により確認した。
マウスB7−２クローン、pcmB7−２を、同様の方法
で、P388D1細胞から単離したRNAのRT−PCRにより、5'プ
ライマー、 5'−GAT−CAG−GGT−ACC−AAG−AGT−GGC−TCC−TGT
−AGG−CA （センス、配列番号99）、及び3'プライマー、 5'−GAT−AGC−CTC−GAG−GTA−GAA−TTC−CAA−TCA
−GCT−GA （アンチセンス、配列番号100）を用いて単離した。
5'プライマーは公開されたネズミB7−２配列（Chen
ら,J.Immun.,1994,152,4929）の塩基１−20との同一性
を有し、これに対して3'プライマーはその配列の塩基10
96−1115と相補的である。両プライマーは、cDNAクロー
ンの調製に用いられた他の5'及び3'プライマーに見出さ
れるそれぞれの制限酵素部位を含む。RT−PCR産生物をX
ho I及びKpn Iで消化し、pcDNA−３（Invitrogen,San D
iego,CA）にライゲートした。
代替スプライシングから生じるmRNAに対応する他のcD
NAクローンは、同様の方法で、適切な制限部位を含み、
かつ選択されたB7mRNAとの同一性を有し（5'プライマ
ー）又はそれと相補的な（3'プライマー）プライマーを
用いてクローン化する。
実施例2:オリゴヌクレオチドによるhB7−１の発現の調
節 B7−１の発現を阻害するオリゴヌクレオチドの能力
を、形質移入COS−７細胞におけるB7−１の細胞表面発
現をフローサイトメトリーで測定することにより評価し
た。
方法： Ｔ−175フラスコにCOS−７細胞（ATCC受付番号CRL165
1）を75％集密で播種した。プラスミドpcB7−１を、標
準リン酸カルシウム形質移入により、細胞に導入した。
４時間の形質移入の後、これらの細胞をトリプシン処理
し、12ウェル皿に80％集密で播種した。細胞をこのプラ
スチックに１時間付着させた後、リン酸緩衝生理食塩水
（PBS）で洗浄した。OptiMEMTM（GIBCO−BRL、Gaithers
burg、MD）培地を15μg/mLのリポフェクチンTM（Lipofe
ctinTM）（GIBCO−BRL、Gaithersburg、MD）及び示され
た濃度のオリゴヌクレオチドと共に添加した。さらに４
時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄
し、10％ウシ胎児血清（FCS）を含むDMEM（Dulbeccoら,
Virol.,1959,8,396;Smithら,Virol.,1960,12,185）中
で、同じ濃度の新鮮なオリゴヌクレオチドと共にインキ
ュベートした。
B7−１の細胞表面発現に対するオリゴヌクレオチドの
効果を監視するため、オリゴヌクレオチド処理の24−48
時間後に簡単にトリプシン処理することにより処理COS
−７細胞を回収した。これらの細胞をPBSで洗浄した
後、５μＬの結合抗B7−１抗体（すなわち、抗hCD80−F
ITC、Ancell、Bayport、MN;FITC:フルオレセインイソチ
オシアネート）を含む100μＬの染色緩衝液（PBS、0.2
％BSA、0.1％アジド）に再懸濁した。細胞を４℃で30分
間染色してPBSで洗浄し、0.5％パラホルムアルデヒドを
含む300μＬに再懸濁した。細胞を回収し、フルオレセ
インのプロフィールをフローサイトメトリーを用いて決
定した。
結果： 表１に示されるオリゴヌクレオチドを、B7−1cDNAを
一時的に発現するCOS−７細胞において、B7−１の発現
を阻害するそれらの能力について評価した。それらの結
果（図１）から、翻訳開始コドン領域を標的とするISIS
13805及び3'非翻訳領域（UTR）を標的とするISIS13812
が、B7−１の発現を50％を上回って阻害する最も活性な
オリゴヌクレオチドとして同定された。したがって、こ
れらのオリゴヌクレオチドが非常に好ましい。ISIS1379
9（5'非翻訳領域を標的とする）、ISIS13802（5'非翻訳
領域を標的とする）、ISIS13806及び13807（両者ともOR
Fの5'領域を標的とする）、並びにISIS13810（ORFの中
央部分を標的とする）はB7−１の発現の35％〜50％の阻
害を示した。したがって、これらの配列も好ましい。
次に、ISIS13800（これは、フローサイトメトリー検
定においてB7−１の発現の阻害を本質的に示さなかっ
た）並びにISIS13805及び13812を、B7−１の細胞表面発
現を阻害するそれらの能力について、様々なオリゴヌク
レオチド濃度で評価した。これらの検定の結果を図２に
示す。ISIS13812はB7−１の発現の優れた阻害因子であ
り、IC50は約150nMであった。5'UTRを標的とするISIS13
800は本質的に不活性であった。
実施例3:オリゴヌクレオチドによるhB7−２タンパク質
の調節 初期スクリーニングにおいて、B7−２の発現を阻害す
るhB7−２オリゴヌクレオチドの能力を、形質移入COS−
７細胞におけるB7−２の細胞表面発現をフローサイトメ
トリーで測定することにより評価した。用いた方法は、
（１）COS−７細胞をプラスミドpbcB7−２又はBBG−5
8、標準リン酸カルシウム形質移入によって細胞に導入
されたヒトICAM−１（CD54）発現ベクター（Ｒ＆D Syst
ems、Minneapolis、MN）、で形質移入し、（２）用いた
オリゴヌクレオチドは表２に記載されるものであり、か
つ（３）結合抗B7−２抗体（すなわち、抗hCD86−FITC
又は抗CD86−PE、PharMingen、SanDiego、CA;PE:フィコ
エリトリン）をフローサイトメトリーの間用いたことを
除いて実施例２に示されるものと同様であった。
結果： これらの結果を図３に示す。200nMの濃度で、ISIS913
3、ISIS9139及びISIS10373は50％以上の阻害活性を示
し、したがって非常に好ましい。これらのオリゴヌクレ
オチドは3'非翻訳領域（ISIS9133）、翻訳開始コドン領
域（ISIS9139）及び5'非翻訳領域（ISIS10373）を標的
とする。同じ濃度で、ISIS10715、ISIS10716及びISIS10
721（これらは、それぞれ、ISIS9133、ISIS9139及びISI
S10373の無秩序の対照である）は活性を示さなかった。
ISIS10367及びISIS10369での処理では25％を上回る阻害
が生じ、したがって、これらのオリゴヌクレオチドも好
ましい。これらのオリゴヌクレオチドは5'（ISIS1036
7）及び3'（ISIS10369）非翻訳領域を標的とする。
実施例4:オリゴヌクレオチドによるhB7−2mRNAの調節 方法： リボヌクレアーゼ防御検定のため、Totally RNATMキ
ット（Ambion、Austin、TX）を用いるオリゴヌクレオチ
ド処理が完了した18時間後に細胞を回収した。この検定
のためのプローブはプラスミドpcB7−２（Bgl IIで消化
することにより直線化）及びpTR I−ｂ−アクチン（Amb
ion Inc.、Austin、TX）から生成させた。SP6プロモー
ターからの直線化プラスミドのイン・ビトロ転写をα−
32P−UTP（800Ci/ミリモル）の存在下において行い、B7
−２の3'末端（1044−1391位）と相補的なアンチセンス
RNAを得た。プローブをDNA分解酵素Ｉで処理した後にゲ
ル精製し、DNAテンプレートを除去した。リボヌクレア
ーゼ防御検定を、RPA IITMキット（Ambion）を用い、製
造者の指示に従って行った。全RNA（５μｇ）を、42℃
で一晩、105cpmのB7−２プローブ又は対照β−アクチン
プローブとハイブリダイズさせた。次に、このハイブリ
ダイゼーション反応物を、37℃で30分間、0.4単位のRNA
分解酵素Ａ及び２単位のRNA分解酵素T1で処理した。保
護されたRNAを沈殿させて10μＬのゲル添加緩衝液に再
懸濁させ、50％w/vの尿素を含む６％アクリルアミドゲ
ル上、20Wで電気泳動した。その後、このゲルを露出
し、レーンを、PhosphorImager（Molecular Dynamics、
Sunnyvale、CA）を用い、本質的に製造者の指示に従っ
て定量した。
結果： オリゴヌクレオチド媒介hB7−2mRNA調節の程度は、一
般に、hB7−２タンパク質に対してみられる効果に対応
する（表５）。タンパク質発現（フローサイトメトリ
ー）検定と同様に、最も活性のオリゴヌクレオチドはIS
IS9133、ISIS9139及び10373であった。試験したオリゴ
ヌクレオチドで、同じ細胞におけるｂ−アクチンmRNAの
発現に対する阻害効果を有するものはなかった。
実施例5:さらなるhB7−１及びhB7−２オリゴヌクレオチ
ド 初期スクリーニングの間に同定されたオリゴヌクレオ
チドに対して修飾された構造及び／又は配列を有するオ
リゴヌクレオチドを調製した。これらのオリゴヌクレオ
チドを、ヒトB7−２の発現を調節するそれらの能力につ
いて、先の実施例に記載される方法を用いて評価した。
ISIS10996、ISIS10373の20ヌクレオチドの配列から誘
導された15ヌクレオチドの配列を有するオリゴヌクレオ
チド、も調製して評価した。ISIS10996は15ヌクレオチ
ド、5'−GCG−AGC−TCC−CCG−TAC（配列番号90）を有
し、これはISIS10373の配列内に含まれるものである。I
SIS10373及び10996の両者は、Azumaら（Nature,1993,36
6,76）によって提示されたhB7−２の配列の塩基１−67
を含むB7−２メッセージ内に位置する潜在的なステム−
ループ構造が重複する。それらの作用様式（１つもしく
は複数）に関する特定の理論によって結び付けることを
意図するものではないが、ISIS10373及びISIS10996は、
標的RNA内で、二次構造でのループ１疑似一重結び（loo
p1pseudo−half−knots）として結合する潜在能力を有
する。1996年４月30日に発行され、その内容が参照する
ことによりここに組み込まれる米国特許第5,5152,438号
には、疑似一重結びを形成することにより遺伝子の発現
を調節する方法が記載されている。それらの作用様式
（１つもしくは複数）に関わりなく、ISIS10373よりも
長さが短いにも関わらず、15量体ISIS10996は、B7−２
タンパク質発現検定において、それが誘導される20量体
と同程度に（もしくはそれを上回って）活性である（図
4;ISIS10721はISIS10373の無秩序対照である）。関連16
量体、ISIS10889もB7−２タンパク質発現検定において
活性であった。しかしながら、構造的に関連する14量体
（ISIS10995）、13量体（ISIS10994）、12量体（ISIS10
993）、11量体（ISIS10992）及び10量体（ISIS10991）
は、この検定においてほとんど、もしくは全く活性を示
さなかった。ISIS10996を以下の方法でさらに誘導体化
した。
完全に置換した誘導体（ISIS11539）、“ギャップマ
ー”（ISIS11541及び11543）並びに“ウィングマー”
（ISIS11545及び11547）を含む、2'メトキシエトキシ置
換を有するISIS10996誘導体を調製した。実施例５にお
いて説明されるように、2'メトキシエトキシ置換は幾つ
かのヌクレアーゼ（例えば、RNA分解酵素Ｈ）の作用を
妨げるが、その修飾オリゴヌクレオチドの、その標的RN
A分子に対する親和性を高める。これらのオリゴヌクレ
オチドを、hB7−２メッセージを調節するそれらの能力
又は機能について、実施例３、４、７及び８の方法に従
って試験する。
ISIS10996誘導体を、標的RNA分子、例えばhB7−２メ
ッセージ、にRNA分解酵素Ｌを召集するそれらの能力に
ついて評価するために調製した。RNA分解酵素Ｌは（2'
−5'）（Ａ）ｎに結合し、かつそれによって活性化さ
れ、この（2'−5'）（Ａ）ｎはATPから（2'−5'）
（Ａ）ｎ合成酵素により、例えば、インターフェロンに
よる活性化で産生される。RNA分解酵素Ｌは抗ウイルス
機構に関連付けられ、その上細胞の成長の調節にも関連
付けられている（Sawai,Chemica Scripta,1986,21,169;
Charachonら,Biochemistry,1990,29,2550）。（2'−
5'）（Ａ）ｎに結合した抗B7オリゴヌクレオチドの組み
合わせはRNA分解酵素Ｌの活性化、及びそのオリゴヌク
レオチド配列と相補的なB7メッセージへのそのターゲッ
ティングを生じるものと期待される。以下のオリゴヌク
レオチドは、それらの5'末端に、同一の配列（すなわ
ち、ISIS10996のもの）及び同一の（2'−5'）（Ａ）ｎ
“キャップ”を有する:ISIS12492、12495、12496及び13
107。アデノシル残基は3'ヒドロキシル基を有し、ホス
ホロチオエート結合により互いに連結する。このオリゴ
ヌクレオチドの（3'−5'）部分（これは、ヒトB7−2RNA
の一部と相補的な配列を有する）は、（2'−5'）（Ａ）
ｎ“キャップ”に、そのオリゴヌクレオチドの（3'−
5'）部分の5'残基から別のホスホロチオエート結合によ
りその“キャップ”に結合するｎ−アミノヘキシルリン
カーまでのホスホロチオエート結合により結合する。様
々な化学的に多様なこの型のオリゴヌクレオチドを、特
定のメッセージにRNA分解酵素Ｌを召集するそれらの能
力について試験するため、この４種類のオリゴヌクレオ
チドの組に対して以下のように化学修飾を施した。ISIS
12496は、そのオリゴヌクレオチドの（3'−5'）部分が
非修飾であるオリゴヌクレオチドからなる。ISIS13107
においては、天然核酸に見出されるリン酸結合がホスホ
ロチオエート結合で置き換えられている。ホスホロチオ
エート結合はISIS12492及び12495においても用いられて
おり、これらはさらに2'−メトキシエトキシ置換を有す
る。これらのオリゴヌクレオチドを、hB7−２メッセー
ジを調節するそれらの能力及び機能について、実施例
３、４、７及び８の方法に従って試験する。
2'位に修飾を有するISIS10996の誘導体を調製して評
価した。これらの修飾オリゴヌクレオチドには、ISIS11
539（完全に2'−Ｏ−メチル）、ISIS11541（2'−Ｏ−メ
チル“翼”及び中央７塩基“ギャップ”を有する）、IS
IS11543（2'−Ｏ−メチル翼及び９塩基ギャップ）、ISI
S11545（5'2'−Ｏ−メチル翼を有する）及びISIS11547
（3'2'−Ｏ−メチル翼を有する）が含まれていた。2'−
Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドの検定の結果は以下の通
りであった。ISIS10996の完全な2'O−メチル版であるIS
IS11539は、このタンパク質発現検定においては全く活
性ではなかった。ギャップ化及び翼化オリゴヌクレオチ
ド（ISIS11541、11543、11545及び11547）は各々200nM
で幾らかの活性を示した（すなわち、未処理細胞に対し
て60〜70％の発現）が、親化合物ISIS10996によって示
されるもの（すなわち、約50％の発現）よりは少なかっ
た。同様の結果がRNA発現検定において見られた。
5'n−アミノヘキシルリンカーによりコレステロール
が結合しているISIS10373の誘導体であるISIS10782を調
製した。コレステロールのような親油性部分は、ある場
合に細胞によるオリゴヌクレオチドの取り込みを増強す
ることが、取り込みが増強される程度は、それがあった
として、予測不可能のままではあるが、報告されてい
る。ISIS10782、及び親油性部分を含む他のオリゴヌク
レオチドを、B7−２メッセージを調節するそれらの能力
又は機能について、実施例３、４、７及び８の方法に従
って試験する。
以下のhB7−１オリゴヌクレオチドの一連の2'−メト
キシエトキシ（ここでは“2'ME"）及び2'−フルオライ
ド（ここでは“2'F"）“ギャップマー”誘導体を調製し
た。ISIS12361（それぞれ、ISIS12348及び12473）、ISI
S12362（ISIS12349及び12474）、ISIS12363（ISIS12350
及び12475）、ISIS12364（ISIS12351及び12476）、ISIS
12365（ISIS12352及び12477）、ISIS12366（ISIS12353
及び12478）、ISIS12367（ISIS12354及び12479）、ISIS
12368（ISIS12355及び12480）、ISIS12369（ISIS12356
及び12481）並びにISIS12370（ISIS12357及び12482）。
これらの誘導体の中央非2'−修飾部分（“ギャップ”）
は、そのオリゴヌクレオチドがその標的RNAに結合した
とき、2'−修飾部分がRNA分解酵素Ｌの活性を支持しな
いにも関わらず、それを支持する。しかしながら、これ
らのオリゴヌクレオチドの2'−修飾“翼”は、それらの
標的RNA分子に対するそれらの親和性を高める（Cook,Ch
apter 9 In:Antisense Research and Applications,Cro
okeら,eds.,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.171−17
2）。
他の2'修飾はこの位置でのメトキシ（MO）基の導入で
ある。2'ME−及び2'F−修飾オリゴヌクレオチドと同様
に、この修飾は、そのようなオリゴヌクレオチド及びそ
れらの標的RNAから形成される二重鎖に対するRNA分解酵
素Ｈの作用を妨げるが、その標的RNA分子に対するオリ
ゴヌクレオチドの親和性を高める。ISIS12914及び12915
は代替hB7−1mRNA分子の5'非翻訳領域と相補的な配列を
含み、この代替分子は一次hB7−１転写体の代替スプラ
イシングから生じる。これらのオリゴヌクレオチドは2'
メトキシ修飾を含み、そこから生じる標的親和性の強化
は、幾つかの組織に少量存在し得る代わりの様式でスプ
ライスされたB7−1mRNAに対するより高い活性を許容し
得る（Inobeら,J.Immun.,1996,157,582）。同様に、他
の代替hB7−1mRNAに対するアンチセンス配列を含むISIS
13498及び13499は、それらの標的分子に対するそれらの
活性を高めるために2'メトキシエトキシ修飾を含み、2'
メトキシエトキシ又は2'メトキシ置換がhB7−２オリゴ
ヌクレオチドISIS12912、12913、13496及び13497に組み
込まれている。これらのオリゴヌクレオチドを、hB7−
１を調節するそれらの能力について本質的に実施例２の
方法に従って試験し、又はhB7−２を調節するそれらの
能力について、必要であれば代わりの様式でスプライス
された適切なB7転写体に対応するcDNAクローンを標的細
胞に形質移入することを除いて、実施例３、４、７及び
８の方法に従って試験する。
実施例6:アンチセンス調節の特異性 本発明の幾つかのオリゴヌクレオチドを細胞表面発現
フローサイトメトリー検定において評価し、これらのオ
リゴヌクレオチドのB7−１に対する特異性をB7−２に対
する活性と対照して決定した。この検定において試験し
たオリゴヌクレオチドには、B7−１の発現の阻害因子で
あるISIS13812（図1;実施例２）及びB7−２の発現の阻
害因子であるISIS10373が含まれていた。この検定の結
果を図５に示す。ISIS13812はB7−１の発現を阻害し、B
7−２の発現に対してはほとんど、もしくは全く効果が
ない。同様に図５からわかるように、ISIS10373はB7−
２の発現を阻害し、B7−１の発現に対してはほとんど、
もしくは全く効果がない。ISIS13872（配列番号37、AGT
−CCT−ACT−ACC−AGC−CGC−CT）、ISIS13812の無秩序
対照、及びISIS13809（配列番号51）がこれらの検定に
含まれ、B7−１又はB7−２のいずれに対しても本質的に
活性を示さなかった。
実施例7:抗原提示細胞における、オリゴヌクレオチドに
よるhB7−２の発現の調節 抗原提示細胞（APC）において未変性B7−２遺伝子か
らの発現を阻害するISIS10373の能力を以下のように評
価した。
方法： 単球を以下のように培養してオリゴヌクレオチドで処
理した。樹状細胞については、EDTA処理血液をPolymorp
hprepTM（1.113g/mL;Nycomed、オスロ、ノルウェー）上
に層状に重ね、500×ｇで30分間、20℃で沈降させた。
単核球をその界面から回収した。細胞をPBS、血清非含
有RPM I培地（Mooreら,N.Y.J.Med.,1968,68,2054）、次
いで５％ウシ胎児血清（FBS）を含むRPM Iで洗浄した。
単球を、37℃で１時間のプラスチック細胞培養皿への付
着により選択した。付着させた後、細胞を、リポフェク
チンTM（８μg/mL）を含む血清非含有RPM I中において
オリゴヌクレオチドで処理した。５％FBS及びオリゴヌ
クレオチドを含むRPM Iを、インターロイキン−４（IL
−4;R＆D Systems、Minneapolis、MN）（66ng/mL）及び
顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF;R
＆D Systems、Minneapolis、MN）（66ng/mL）と共に細
胞に添加し、分化を刺激した（Romaniら,J.Exp.Med.,19
94,180,83,1994）。細胞を48時間インキュベートした
後、様々な分子の細胞表面発現をフローサイトメトリー
により測定した。
新鮮な血液から単離した単核球を、細胞による取り込
みを促進するためにカチオン性脂質の存在下において、
オリゴヌクレオチドで処理した。対照オリゴヌクレオチ
ドとして、ISIS2302（ICAM−１の発現の阻害因子；配列
番号17）も細胞に投与した。B7−２タンパク質の発現
を、フローサイトメトリーにより、実施例２の方法に従
って測定した。先の実施例に記載されていないモノクロ
ーナル抗体には抗hCD3（Ancell、Bayport、MN）及び抗H
LA−DR（Becton Dickinson、San Jose、CA）が含まれて
いた。
結果： 図６に示されるように、ISIS10373はB7−２の発現に
対する有意の阻害効果を有し、そのIC50は約250nMであ
る。ISIS10373は、１μＭの用量でさえ、ICAM−１の発
現に対する僅かな効果を有するのみであった。ISIS2302
（配列番号17）、ICAM−１の発現を阻害することが示さ
れている対照オリゴヌクレオチド、はB7−２の発現に対
しては効果がないが、ICAM−１の水準を大きく低下さ
せ、そのIC50は約250nMであった。同様の条件下で、ISI
S10373は、フローサイトメトリーによる測定で、B7−
１、HLA−DR又はCD3の細胞表面発現に影響を及ぼさなか
った。
実施例8:オリゴヌクレオチドによるＴ細胞の増殖の調節 Ｔ細胞の増殖を阻害するISIS2302及びISIS10373の能
力を以下のように評価した。（実施例６と同様に）オリ
ゴヌクレオチド及びサイトカインで処理した単球を抗原
提示細胞としてＴ細胞増殖検定において用いた。分化し
た単球を別々のドナーに由来するCD4＋Ｔ細胞と組み合
わせた。48時間後、［3H］チミジンの取り込みにより増
殖を測定した。
方法： Ｔ細胞増殖検定のため、細胞をEDTA処理全血から、リ
ンパ球を含む高速移動バンドを界面の直下から回収した
ことを除いて上述の通りに単離した。細胞を実施例６に
記載される通りに洗浄した後、NH4Cl溶解により赤血球
を除去した。Ｔ細胞を、Ｔ細胞濃縮カラム（Ｒ＆D Syst
ems、Minneapolis、MN）を用いて、本質的に製造者の指
示に従って精製した。CD4＋Ｔ細胞を全Ｔ細胞集団か
ら、抗CD8結合マグネチックビーズ（AMAC,Inc.、Westbr
ook、ME）を製造者の指示に従って用いてCD8＋細胞を枯
渇させることにより、さらに濃縮した。Ｔ細胞は、Cy−
クロム結合抗CD4mAb（PharMingen、San Diego、CA）を
用いるフローサイトメトリーにより、＞80％CD4＋であ
ることが測定された。
抗原提示細胞（APC）を実施例６に記載される通りに
単離し、マイトマイシンＣ（25μg/mL）で１時間処理し
た後、PBSで３回洗浄した。次に、APC（105細胞）を350
μＬの培養培地中で４×104個のCD4＋Ｔ細胞とあわせ
た。示された場合には、精製CD3mAbも１μg/mLの濃度で
添加した。48時間のインキュベーション期間の最後の６
時間に、ウェル当たりの1.5uCiの［3H］−チミジンの取
り込みを決定することにより増殖を測定した。細胞をフ
ィルター上に回収し、シンチレーション計数により放射
能を測定した。
結果： 図７に示されるように、サイトカインで処理しなかっ
た単核球はＴ細胞の増殖を僅かに誘発したが、これは、
おそらく、細胞上に発現する同時刺激分子の濃度が低い
ことによるものである。しかしながら、細胞をサイトカ
インで処理して樹状様細胞への分化を誘発した場合、IC
AM−１及びB7−２の両者の発現は大きく上方調節され
た。これは強力なＴ細胞増殖応答を生じ、その応答は単
核細胞を誘発する前に抗ICAM−１（ISIS2302）又は抗B7
−２（ISIS10373）オリゴヌクレオチドのいずれかで遮
断することが可能であった。対照オリゴヌクレオチド
（ISIS10721）はＴ細胞の増殖に対してはごく僅かな効
果しか有していなかった。抗ICAM−１（ISIS2302）及び
抗B7−２（ISIS10373）オリゴヌクレオチドの両者を用
いる組み合わせ処理はＴ細胞応答のさらなる低下を生じ
た。
実施例9:オリゴヌクレオチドによるネズミB7遺伝子の調
節 COS−７細胞に一時的に発現するネズミB7−２の発現
を阻害することが可能なオリゴヌクレオチド（表４を参
照）を以下の方法で同定した。ネズミB7−２（mB7−
２）cDNAと相補的な一連のホスホロチオエートオリゴヌ
クレオチドを、mB7−2cDNAクローンを形質移入したCOS
−７細胞において（結合抗mB7−２抗体（すなわち、抗m
CD86−PE、PharMingen、San Diego、CA）以外は実施例
２と同様のサイトメトリーによって測定される）mB7−
２の水準を低下させるそれらの能力についてスクリーニ
ングした。抗mB7−２抗体は、受付番号HB−253でATCCに
寄託されているハイブリドーマからも得ることができ
る。ネズミB7−１の発現を調節することが可能なオリゴ
ヌクレオチド（表２を参照）を、結合抗mB7−１抗体をm
B7−1cDNAクローンで形質移入したCOS−７細胞と共に用
いることを除いて、同様の方法で単離した。
ネズミB7−２に対しては、同定された最も活性のオリ
ゴヌクレオチドはISIS11696（GGA−TTG−CCA−AGC−CCA
−TGG−TG、配列番号18）であり、これはそのcDNAの96
−115位、翻訳開始（AUG）コドンを含む部位、と相補的
である。図８はISIS11696及び無秩序対照ISIS11866（CT
A−AGT−AGT−GCT−AGC−CGG−GA、配列番号19）の用量
−応答曲線を示す。ISIS11696はCOS−７細胞におけるB7
−２の細胞表面発現を阻害し、そのIC50は200−300nMの
範囲にあり、これらに対してISIS11866は試験した最高
濃度（1000nM）で20％未満の阻害を示した。
ネズミB7−２アンチセンスオリゴヌクレオチドをさら
に評価するため、IC−21細胞系を用いた。IC−21単球／
マクロファージ細胞系はB7−１及びネズミB7−２（mB7
−２）の両者を構成的に発現する。これらの細胞をリポ
多糖（LPS;GIBCO−BRL、Gaithersburg、MD）の存在下に
おいてインキュベートすることにより発現の２倍の誘発
を達成することができる（Hathcockら,Science,1993,26
2,905）。
IC−21細胞（ATCC;受付番号TIB186）を、80％集密
で、12ウェルプレートにおいて、10％FCSを含むDMEM培
地に播種した。これらの細胞を、一晩、プレートに付着
させた。翌日、培地を除去して細胞をPBSで洗浄した。
次に、15μg/mLのリポフェクチンTM（GIBCO−BRL、Gait
hersburg、MD）を補足した500μＬのOptiMEMTM（GIBCO
−BRL、Gaithersburg、MD）を各ウェルに添加した。そ
の後、オリゴヌクレオチドを示された濃度で培地に直接
添加した。４時間インキュベートした後、細胞をPBSで
洗浄し、15μg/mLのLPSを補足した培養培地中で一晩イ
ンキュベートした。翌日、掻き取ることで細胞を回収し
た後、フローサイトメトリーにより細胞表面発現につい
て分析した。
ISIS11696及びISIS11866を、リポフェクチンTM（GIBC
O−BRL、Gaithersburg、MD）の存在下において、IC−21
細胞に投与した。結果を図９に示す。10μＭの濃度で、
ISIS11696はmB7−２の発現を完全に阻害し（及びmB7−
２の水準を発現の構成水準未満に低下させ）、これに対
して無秩序対照オリゴヌクレオチドISIS11866は誘発さ
れる発現の水準を40％減少させるだけであった。３μＭ
の濃度で、誘発される発現の水準はISIS11696により大
きく低下し、これに対してISIS11866にはほとんど効果
がなかった。
2'置換（例えば、2'メトキシ、2'メトキシエトキシ）
を含み、ネズミB7−１（ISIS12914、12915、13498、134
99）又はネズミB7−２（ISIS13100、13100及び13102）
の代替転写物を標的とする修飾オリゴヌクレオチドを調
製した。これらのオリゴヌクレオチドを、ネズミB7を調
節するそれらの能力について、本質的に上記方法に従
い、IC−21細胞又は代わりの様式でスプライスされた適
切なB7転写体に対応するcDNAクローンを形質移入したCO
S−７を用いて試験する。
実施例10:オリゴヌクレオチドによる同種移植片拒絶の
調節 化合物を、心臓同種移植片拒絶を阻害するそれらの能
力について評価するためのネズミモデルが従来記載され
ている（Stepkowskiら,J.Immunol.,1994,153,5336）。
このモデルを、B7タンパク質に対するアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド単独の、又は細胞接着分子−１（ICAM−
１）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドとの組み
合わせでの免疫抑制能を評価するのに用いた。
方法： 心臓同種移植片拒絶の研究及びBALB/cマウスのオリゴ
ヌクレオチド処置は本質的に従来記載される通りに行っ
た（Stepkowskiら,J.Immunol.,1994,153,5336）。用い
たアンチセンスオリゴヌクレオチドにはISIS11696、ISI
S3082（ICAM−１を標的とする）及びISIS1082（ヘルペ
スウイルスUL−13遺伝子配列を標的とする対照オリゴヌ
クレオチド）が含まれていた。用いた投与量は（以下に
示されるように）個々のオリゴヌクレオチド１、２、2.
5、５もしくは10mg/kgであった；オリゴヌクレオチドの
組み合わせを投与する場合には、各々のオリゴヌクレオ
チドを１、５もしくは10mg/kgの投与量（それぞれ、
２、10及び20mg/kgの総オリゴヌクレオチド投与量）で
投与した。移植した心臓及びそれらの宿主の生存時間を
監視して記録した。
結果： 未処理マウスの平均生存時間は8.2±0.8日（７、８、
８、８、９、９日）であった。マウスをISIS1082（配列
番号125、非関連対照オリゴヌクレオチド）で７日間処
置することで、平均生存時間が7.1±0.7日（5mg/kg/日;
6、７、７、７、８、８）又は7.0±0.8日（10mg/kg/日;
6、７、７、８）に僅かに減少した。マウスをネズミB7
−２オリゴヌクレオチドISIS11696（配列番号108）で７
日間処置することにより、２種類の用量で、平均生存時
間が9.3日に増加した（2mg/kg/日、9.3±0.6日、９、
９、10;10mg/kg/日、9.3±1.3日、８、９、９、11）。
マウスをICAM−１オリゴヌクレオチドISIS3082で７日間
処置することによってもマウスの平均生存は幾つかの用
量にわたって増加した。具体的には、1mg/kg/日で、平
均生存時間（MSD）は11.0±0.0（11、11、11）であり;
2.5mg/kg/日で、MSDは12.0±2.7（10、12、13、16）で
あり;5mg/kg/日で、MSDは14.1±2.7（10、12、12、13、
16、16、17、17）であり；及び10mg/kg/日で、MSDは15.
3±5.8（12、12、13、24）であった。マウスを各々1mg/
kg/日のISIS3082及び11696で７日間処置した場合には幾
らかの相乗作用が見られた;MSDは13.8±1.0（13、13、1
4、15）であった。
実施例11:B7タンパク質をコードする核酸の検出 オリゴヌクレオチドを、合成後に、ポリヌクレオチド
キナーゼを用いる5'末端での32P標識により放射標識す
る。Sambrookら，“Molecular Cloning.A Laboratory M
anual,"Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,Vo
lume 2,pg.11.31。B7タンパク質をコードする核酸にハ
イブリダイズすることが可能な放射標識オリゴヌクレオ
チドを特異的ハイブリダイゼーションが生じ得る条件下
でB7タンパク質の発現が疑われる組織又は細胞と接触さ
せ、その試料を洗浄して未結合オリゴヌクレオチドを除
去する。放射標識オリゴヌクレオチドを特異的ハイブリ
ダイゼーションを可能にする条件下で正常な組織又は細
胞試料と接触させ、その試料を洗浄して未結合オリゴヌ
クレオチドを除去する同様の対照を維持する。試料中に
残存する放射能は結合したオリゴヌクレオチドを示しも
のであり、それをシンチレーションカウンター又は他の
定型的な手段を用いて定量する。試料中に残存する、対
照組織又は細胞と比較してより多量の放射能はB7遺伝子
の発現の増加を示し、それに対して、試料中の、対照よ
りも少量の放射能はB7遺伝子の発現の減少を示す。
また、本発明の放射標識オリゴヌクレオチドはオート
ラジオグラフィーにおいても有用である。B7遺伝子の発
現が疑われる組織の切片を上述の通りに放射標識オリゴ
ヌクレオチドで処理して洗浄し、次に標準的なオートラ
ジオグラフィーの手順に従って写真用エマルジョンに露
光する。正常組織切片の対照も維持する。このエマルジ
ョンは、現像すると、B7遺伝子を発現する領域全体にわ
たって銀粒子の画像を生じ、それを定量化する。対照及
び試験試料で観察される銀粒子を比較することにより、
B7の発現の程度を決定する。
B7遺伝子の発現を蛍光検出するための類似の検定で
は、フルオレセイン又は他の蛍光タグで標識した本発明
のオリゴヌクレオチドが用いられる。標識オリゴヌクレ
オチドは、自動DNA合成機（Applied Biosystems、Foste
r City、CA）で、標準的なホスホラミダイト化学を用い
て合成する。ｂ−シアノエチルジイソプロピルホスホラ
ミダイトはApplied Biosystems（Foster City、CA）か
ら購入する。フルオレセイン標識アミダイトはGlen Res
earch（Sterling、VA）から購入する。オリゴヌクレオ
チド及び生物学的試料のインキュベーションを、シンチ
レーションカウンターの代わりに蛍光顕微鏡を用いて蛍
光を検出することを除いて、放射標識オリゴヌクレオチ
ドについて上述される通りに行う。試料中の、対照組織
又は細胞と比較して多量の蛍光はB7遺伝子の発現の増加
を示し、これに対して、試料中の、対照よりも少量の蛍
光はB7遺伝子の発現の減少を示す。
配列表 （１）GENERAL INFORMATION: （Ｉ）APPLICANTS:Clarence Frank Bennett,Timothy
A.Vickers （ii）TITLE OF INVENTION:Oligonucleotide Composi
tions and Methods for the Modulation of the Expres
sion of B7 Proteins （iii）NUMBER OF SEQUENCES:125 （iv）CORRESPONDENCE ADDRESS: （Ａ）ADDRESSEE:Law Offices of Jane Massey Lic
ata （Ｂ）STREET:66 E.Main Street （Ｃ）CITY:Marlton （Ｄ）STATE:NJ （Ｅ）COUNTRY:USA （Ｆ）ZIP:08053 （ｖ）COMPUTER READABLE FORM: （Ａ）MEDIUM TYPE:DISKETTE,3.5 INCH,1.44 MB ST
ORAGE （Ｂ）COMPUTER:IBM PS/2 （Ｃ）OPERATING SYSTEM:PC−DOS （Ｄ）SOFTWARE:WORDPERFECT 5.1 （vi）CURRENT APPLICATION DATA: （Ａ）APPLICATION NUMBER:n/a （Ｂ）FILING DATE:Herewith （Ｃ）CLASSIFICATION: （vii）PRIOR APPLICATION DATA: （Ａ）APPLICATION NUMBER: （Ｂ）FILING DATE: （viii）ATTORNEY/AGENT INFORMATION: （Ａ）NAME:Jane Massey Licata （Ｂ）REGISTRATION NUMBER:32,257 （Ｃ）REFERENCE/DOCKET NUMBER:ISPH−0244 （ix）TELECOMMUNICATION INFORMATION: （Ａ）TELEPHONE:（609）779−2400 （Ｂ）TELEFAX:（609）810−1454 （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:1: （Ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:32 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:No （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:1: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:2: （Ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:33 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:2: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:3: （Ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:20 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear 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er Immunosuppressive Modalities （Ｃ）JOURNAL:The Journal of Immunology （Ｄ）VOLUME:153 （Ｆ）PAGES:5336−5346 （Ｇ）DATE:01−DEC−1994 （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:101: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:102: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:21 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （iv）ANTI−SENSE:Yes （ｘ） PUBLICATION INFORMATION （Ａ）AUTHORS:Stepkowski,Stanislaw M. Tu,Zizheng Condon,Thomas P. Bennett,C.Frank （Ｂ）TITLE:Blocking of Heart Allograft Reject
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er Immunosuppressive Modalities （Ｃ）JOURNAL:The Journal of Immunology （Ｄ）VOLUME:153 （Ｆ）PAGES:5336−5346 （Ｇ）DATE:01−DEC−1994 （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:102: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:103: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:20 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:103: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:104: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:20 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:104: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:105: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:20 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:105: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:106: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:20 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:106: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:107: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:20 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:107: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:108: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:20 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:108: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:109: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:20 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:109: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:110: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:20 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:110: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:111: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:20 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:111: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:112: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:20 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:112: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:113: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:20 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:113: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:114: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:20 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:114: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:115: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:20 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:115: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:116: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:20 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:116: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:117: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:20 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:117: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:118: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:21 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:118: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:119: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:20 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:119: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:120: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:20 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:120: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:121: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:20 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:121: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:122: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:20 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:122: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:123: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:20 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:123: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:124: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:20 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:124: （２）INFORMATION FOR SEQ ID NO:125: （ｉ）SEQUENCE CHARACTERISTICS: （Ａ）LENGTH:21 （Ｂ）TYPE:Nucleic Acid （Ｃ）STRANDEDNESS:Single （Ｄ）TOPOLOGY:Linear （iv）ANTI−SENSE:Yes （xi）SEQUENCE DESCRIPTION:SEQ ID NO:125:
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ヴィッカーズ，ティモシー・エイ アメリカ合衆国カリフォルニア州92057, オーシャンサイド，ルイゼノ・アベニュ ー 253 (56)参考文献 国際公開95／003408（ＷＯ，Ａ１) 国際公開92／023859（ＷＯ，Ａ１) 国際公開96／015780（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (24)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】共有結合によって連結された20〜30個のヌ
    クレオチドにより形成されたオリゴヌクレオチドであっ
    て、B7−１タンパク質をコードする核酸と特異的にハイ
    ブリダイズし得かつ配列番号30及び36からなる群から選
    択される配列を有するか、又はB7−２タンパク質をコー
    ドする核酸と特異的にハイブリダイズし得かつ配列番号
    ３、９及び16からなる群から選択される配列を有するオ
    リゴヌクレオチドであり、かつ前記B7タンパク質の発現
    を調節するオリゴヌクレオチド。
  2. 【請求項２】共有結合の少なくとも１つが修飾された共
    有結合である、請求項１のオリゴヌクレオチド。
  3. 【請求項３】修飾された共有結合がホスホロチオエート
    結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結
    合、メチレン（メチルイミノ）結合、モルホリノ結合、
    アミド結合、ポリアミド結合、短鎖アルキル糖間結合、
    シクロアルキル糖間結合、短鎖ヘテロ原子糖間結合及び
    複素環糖間結合からなる群より選択される、請求項２の
    オリゴヌクレオチド。
  4. 【請求項４】ヌクレオチドの少なくとも１つが修飾され
    た糖部分を有する、請求項１のオリゴヌクレオチド。
  5. 【請求項５】修飾された糖部分が、ヌクレオチドの2'
    位、3'末端ヌクレオチドの3'位又は5'末端オリゴヌクレ
    オチドの5'位での修飾である、請求項４のオリゴヌクレ
    オチド。
  6. 【請求項６】修飾が、3'ヒドロキシル基のアジド基での
    置換及び3'もしくは5'ヒドロキシル基の水素での置換か
    らなる群より選択される、請求項５のオリゴヌクレオチ
    ド。
  7. 【請求項７】修飾が、2'位での、−OH、−SH、−SCH3、
    −Ｆ、−OCN、−OCH3OCH3、−OCH3O（CH2）nCH3、−Ｏ
    （CH2）nNH2もしくは−Ｏ（CH2）nCH3（ここで、ｎは１
    〜約10である）、C1〜C10低級アルキル基、アルコキシ
    アルコキシ基、置換低級アルキル基、置換アルカリール
    基、置換アラルキル基、−Cl、−Br、−CN、−CF3、−O
    CF3、−Ｏ−アルキル基、−Ｓ−アルキル基、−Ｎ−ア
    ルキル基、Ｏ−アルケニル基、Ｓ−アルケニル基、Ｎ−
    アルケニル基、−SOCH3、−SO2CH3、−ONO2、−NO2、−
    N3、−NH2、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロシクロア
    ルカリール基、アミノアルキルアミノ基、ポリアルキル
    アミノ基、置換シリル基、RNA開裂基、リポーター基、D
    NA介在基、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善す
    るための基、オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善
    するための基、メトキシエトキシ基及びメトキシ基から
    なる群より選択される部分の置換又は付加である、請求
    項５のオリゴヌクレオチド。
  8. 【請求項８】ヌクレオチドの少なくとも１つが修飾され
    たヌクレオベースを有する、請求項１のオリゴヌクレオ
    チド。
  9. 【請求項９】修飾されたヌクレオベースが、ヒポキサン
    チン、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシト
    シン、グリコシル５−ヒドロキシメチルシトシン、ゲン
    チオビオシル５−ヒドロキシメチルシトシン、５−ブロ
    モウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、６−メチ
    ルアデニン、N6−（６−アミノヘキシル）アデニン、８
    −アザグアニン、７−デアザグアニン及び2,6−ジアミ
    ノプリンからなる群より選択される、請求項８のオリゴ
    ヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】請求項１のオリゴヌクレオチド及び薬学
    的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
  11. 【請求項１１】オリゴヌクレオチドが、細胞による前記
    オリゴヌクレオチドの取り込みを強化する少なくとも１
    つの親油性部分を含む、請求項１のオリゴヌクレオチ
    ド。
  12. 【請求項１２】親油性部分が、コレステロール部分、コ
    レステリル部分、コール酸、チオエーテル、チオコレス
    テロール、脂肪族鎖、リン脂質、ポリアミン鎖、ポリエ
    チレングリコール鎖、アダマンタン酢酸鎖、パルミチル
    部分、オクタデシルアミン部分及びヘキシルアミノ−カ
    ルボニル−オキシコレステロール部分からなる群より選
    択される、請求項11のオリゴヌクレオチド。
  13. 【請求項１３】請求項11のオリゴヌクレオチド及び薬学
    的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
  14. 【請求項１４】（ａ）可溶性ICAMタンパク質、抗体−毒
    素結合体、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、アザ
    チオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、イ
    ンターフェロン、交感神経模倣薬、ヒスタミンH1受容体
    アンタゴニスト、及びヒスタミンH2受容体アンタゴニス
    トからなる群より選択される抗炎症剤又は免疫抑制剤； （ｂ）請求項１のオリゴヌクレオチド；及び （ｃ）薬学的に許容し得る担体 を含む医薬組成物。
  15. 【請求項１５】（ａ）共有結合によって連結された20〜
    30個のヌクレオチドにより形成されたオリゴヌクレオチ
    ドであって、前記共有結合の少なくとも１つはホスホジ
    エステル結合以外の結合であり、前記オリゴヌクレオチ
    ドはICAMタンパク質をコードする核酸と特異的にハイブ
    リダイズし得る配列を有し、かつ前記オリゴヌクレオチ
    ドは前記ICAMタンパク質の発現を調節するオリゴヌクレ
    オチド； （ｂ）請求項１のオリゴヌクレオチド；及び （ｃ）薬学的に許容し得る担体 を含む医薬組成物。
  16. 【請求項１６】（ａ）共有結合によって連結された20〜
    30個のヌクレオチドにより形成されたオリゴヌクレオチ
    ドであって、B7−１タンパク質をコードする核酸と特異
    的にハイブリダイズし得かつ配列番号30及び36からなる
    群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドであ
    り、かつ前記B7−１タンパク質の発現を調節するオリゴ
    ヌクレオチド； （ｂ）共有結合によって連結された20〜30個のヌクレオ
    チドにより形成されたオリゴヌクレオチドであって、B7
    −２タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダ
    イズし得かつ配列番号３、９及び16からなる群から選択
    される配列を有するオリゴヌクレオチドであり、かつ前
    記B7−２タンパク質の発現を調節するオリゴヌクレオチ
    ド；及び （ｃ）薬学的に許容し得る担体 を含む医薬組成物。
  17. 【請求項１７】（ａ）可溶性ICAMタンパク質、抗体−毒
    素結合体、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、アザ
    チオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、イ
    ンターフェロン、交感神経模倣薬、ヒスタミンH1受容体
    アンタゴニスト、ヒスタミンH2受容体アンタゴニスト及
    びICAMタンパク質の発現を調節するオリゴヌクレオチド
    からなる群より選択される抗炎症剤又は免疫抑制剤； （ｂ）共有結合によって連結された20〜30個のヌクレオ
    チドにより形成されたオリゴヌクレオチドであって、B7
    −１タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダ
    イズし得かつ配列番号30及び36からなる群から選択され
    る配列を有するオリゴヌクレオチドであり、かつ前記B7
    −１タンパク質の発現を調節するオリゴヌクレオチド； （ｃ）共有結合によって連結された20〜30個のヌクレオ
    チドにより形成されたオリゴヌクレオチドであって、B7
    −２タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダ
    イズし得かつ配列番号３、９及び16からなる群から選択
    される配列を有するオリゴヌクレオチドであり、かつ前
    記B7−２タンパク質の発現を調節するオリゴヌクレオチ
    ド；及び （ｄ）薬学的に許容し得る担体 を含む医薬組成物。
  18. 【請求項１８】細胞又は組織におけるB7タンパク質の発
    現をin vitroで調節する方法であって、前記細胞又は組
    織を請求項１のオリゴヌクレオチドと接触させることを
    含んでなる方法。
  19. 【請求項１９】請求項10の医薬組成物の製造における請
    求項１のオリゴヌクレオチドの使用。
  20. 【請求項２０】請求項13の医薬組成物の製造における請
    求項11のオリゴヌクレオチドの使用。
  21. 【請求項２１】請求項14の医薬組成物の製造における請
    求項１のオリゴヌクレオチドの使用。
  22. 【請求項２２】請求項15の医薬組成物の製造における請
    求項１のオリゴヌクレオチドの使用。
  23. 【請求項２３】請求項16の医薬組成物の製造における請
    求項１のオリゴヌクレオチドの使用。
  24. 【請求項２４】請求項17の医薬組成物の製造における請
    求項１のオリゴヌクレオチドの使用。
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