KR100452105B1 - Ｂ7 단백질의 발현을 조절하는 올리고뉴클레오티드 조성물 및 방법 - Google Patents

Ｂ7 단백질의 발현을 조절하는 올리고뉴클레오티드 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

T세포 활성의 조절을 통해 치료할 수 있는 면역 질환이나 가벼운 병의 진단, 예방 및 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에 의해 B7 단백질을 암호화하는 핵산과 특이적으로 잡종화할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

Description

Ｂ7 단백질의 발현을 조절하는 올리고뉴클레오티드 조성물 및 방법{Oligonucleotide Compositions and Methods for the Modulation of the Expression of B7 Protein}
염증은 손상, 감염 혹은 조직의 파괴에 반응하여 조직에 의해 일어나는 국부적 보호 반응으로, 감염제 혹은 유해제의 파괴 및 손상된 조직의 분리를 초래한다. 전형적인 염증 반응은 다음과 같다: 외부 항원의 인식 혹은 조직 손상의 인식, 수용성 염증 매개체의 합성 및 방출, 감염 혹은 조직이 손상된 부위에 위치한 염증 세포의 증가 및 침입된 기관 혹은 손상된 조직의 파괴 및 제거, 침입 기관 혹은 손상부위가 한번 치유된 시스템의 불활성 등이 있다. 염증 요인을 갖는 인간의 많은 질병에 있어서, 염증 반응을 약화시키는 정상적인 동종요법의 메카니즘은 정상 조직의 손상과 파괴를 유발하는 결함이 있다.
세포간의 상호작용은 상기 각각의 단계에서 면역 반응의 활성을 수반한다. 정상적인 염증 반응에 있어서 일찍이 검증된 사실들 중 하나는 감염 혹은 손상 부위로 혈관구조에서 백혈구가 이동하여, 내피세포층 혈관에 백혈구가 유착하는 것이다. 일반적으로, 염증 부위에 나타나는 첫번째 염증 세포는 단핵세포와 림프구에 의해 중성색소에 물드는 성질을 가지게 된다. 또한 세포간의 상호작용은 각기 증진된 체액성 및 세포성 면역 반응을 초래하는 B-림프구(B세포)와 T-림프구(T세포) 양쪽 모두의 활성에 있어서 중요하다.
이러한 면역 기구의 특징은 자기(숙주)와 비자기(외래 침입자)를 구별하는 능력에 있다. 상기 면역 기구에 의해 나타나는 놀라운 특이성은 T세포에 의해서 주로 매개된다. T세포는 감염에 대한 숙주의 방어에 관여하지만, 이식된 조직의 기관 손상에 관여하고, 그리고 이식-대-숙주 질병(Graft-versus-Host Disease: GVHD)과 여러 가지 자가면역 질병의 세포에 공격을 한다. 항원-특이 면역 반응을유도하기 위하여, T세포는 항원-공여 세포(antigen-presenting cell: APC)에 의해 전달된 신호를 받아야만 한다. T세포와 APC간의 상호작용은 세포 유착, T세포 수용체(TCR) 인식 및 공촉진의 3단계로 나눌 수 있다. T세포 활성의 유도를 위해 최소한 두 개의 별개의 신호가 APC로부터 요구된다. 제1 신호는 항원-특이성이며, TCR이 주요 조직 적합유전자 복합체(MHC) 단백질 혹은 APC의 표면에서 발현되는 MHC-관련 CD1 단백질("분화 덩어리(cluster of differentiation)" 즉, "CD"란 상이한 T세포 표면 분자들을 의미하는 용어이다)이 있는 상태에서 항원과 상호작용을 할 때 제공된다. 제2(공촉진) 신호는 APC의 리간드와 T세포 표면 항원, 즉 B7족 단백질 중 하나인 CD28간의 상호작용을 수반한다.
44 킬로달튼 폴리펩티드의 이황화 결합된 호모다이머(homodimer)와 면역글로블린 과족(superfamily)인, CD28은 T세포 활성과 시토킨 생성을 위해 휴지된 상태의 T세포 표면에 있는 주요 공촉진 신호 수용체들중 하나이다(Allison,Curr. Opin. Immunol., 1994,6, 414; Linsley and Ledbetter,Annu. Rev. Immunol., 1993,11, 191; 및 Juneet al.,Immunol. Today, 1994,15, 321). CD28을 통한 신호의 도입은 인터루킨-2(IL-2)의 생성과 자연적인 T세포의 증식을 둘 다 증대시키기 위하여 TCR 신호 도입으로 상승 작용을 한다. B7-1(또한 CD80으로 알려진)은 CD28에 대해 확인된 최초의 리간드였다(Liu and Linsley,Curr. Opin. Immunol., 1992,4, 265). B7-1은 APCs에서 낮은 수준으로 보통 발현하지만, 시토킨이나 CD40과 같은 세포 표면 분자의 라이게이션(ligation)에 의해 활성이 상승조절된다(Lenschowet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993,90,11054및 Nabaviet al.,Nature, 1992,360, 266). 초기의 연구에서는 B7-1이 공촉진을 매개하는 CD28 리간드라는 설이 제시되었다(Reiseret al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992,89, 271; Wuet al.,J. Exp. Med., 1993,178,1789; 및 Harlanet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1994,91, 3137). 그러나 안티-B7-1 모노클론 항체(mAbs)가 주로 혼합된 림프구 반응물에 최소한의 영향을 끼쳤으며, B7-1이 결여된 쥐는 항원에 정상적으로 반응했다는 것(Lenschowet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993,90, 11054 및 Fremanet al.,Science, 1993,262, 909)을 차후에 증명하여, CD28 수용체인 B7-2(CD86으로 알려진)에 대한 두번째 리간드를 발견하는 결과를 낳았다. 안티-B7-1 mAbs와는 대조적으로, 안티-B7-2 mAbs는 T세포 증식과 시토킨 생성의 효율적인 저해자이다(Wuet al.,J. Exp. Med., 1993,178, 1789; Chenet al.,J. Immunol., 1994,152, 2105; 및 Lenschowet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993,90,11054). B7:CD28 신호표시는 CD40:CD40L(CD40 리간드) 신호표시와 같이, 다른 T세포 공촉진 단계의 필수적인 구성요소가 될 수 있다(Yanget al.,Science, 1996,273, 1862).
CD28, B7-1 및 B7-2의 결합 이외에, 세포성 T-림프구는 단백질 CTLA4와 관련 작용을 한다. CTLA4는 CD28에 구조적으로 관련성이 있는 단백질이지만, 활성 후에는 단지 T세포에서만 발현을 한다(Linsleyet al.,J. Exp. Med., 1991,174, 561). CTLA4의 수용성 재조합 형태인 CTLA4-Ig는 CD28 혹은 B7 단백질을 조종하는 모노클론 항체보다 B7:CD28의 상호작용의 보다 효율적인 저해자임이 판명되었다. CTLA4-Ig의 시험관내(in vitro) 처리는 양의 적혈구나 수용성 항원에 대한 항체형성의 저해(Linsleyet al.,Science, 1992,257, 792), 심장 타가이식 및 췌장 아이릿 제노그래프트(islet xenograft) 생존의 연장(Linet al.,J. Exp. Med., 1993, 178, 1801; Lenschowet al., 1992,Science, 257, 789; 및 Lemschowet al.,Curr. Opin. Immunol., 1993, 5(5), 742-52) 및 GVHD에서의 면역 반응의 심각한 억제(Hakimet al.,J. Immun., 1995,155, 1760)를 초래한다. CD28과 CTLA4는 보통의 B7 수용체를 통해 둘다 활성화 하였지만, 각각의 공촉진 및 저해 기능은 상반되게 나타난다고 제시되었다(Allisonet al.,Science, 1995, 270, 932).
유럽특허출원 제0 600 591호(1994. 8. 8 공개(A2))는 B7-1 단백질을 발현하기 위해 환자로부터 분리한 종양 세포를 생체내에서(ex vivo) 재조합시켜 종양 세포 성장을 저해하는 방법을 개시하고 있다. 결과에 의하면, 면역 반응은 B7-형질감염이 이루어진 종양 세포 및 형질감염이 이루어지지 않은 종양 세포에서 촉진된다.
국제출원공개 제WO 95/03408호(1995. 2. 2 공개)는 B7-2 단백질을 포함하는, T세포 활성을 공촉진하는 신규의 CTLA4/CD28 리간드를 암호화하는 핵산에 대하여 개시하고 있다. 또한 B7-2 단백질에 대한 항체들과 B7-2 단백질의 생산방법에 대해서도 개시하고 있다.
국제출원공개 제WO 95/05464호(1995. 2. 23 공개)는 B7-1과는 다른, CTLA4에 결합을 하는 폴리펩티드, CD28 혹은 CTLA4-Ig에 대해 개시하고 있다. 또한 폴레펩티드와 같은 것을 암호화하는 핵산을 얻을 수 있는 방법도 개시하고 있다.
국제출원공개 제WO 95/06738호(1995. 3. 9 공개)는 B7-2(B70으로 알려진) 단백질을 암호화하는 핵산을 개시하고 있다. 또한 B7-2 단백질에 대한 항체와 B7-2 단백질을 생산하는 방법에 대해 개시하고 있다.
유럽특허출원 제0 643 077호(1995. 3. 15 공개(A1))는 B7-2(B70으로 알려진) 단백질에 특이적으로 결합하는 모노클론 항체를 개시하고 있다. 또한 B7-2 단백질에 특이적으로 결합하는 모노클론 항체를 생산하는 방법도 개시하고 있다.
미국특허 제5,434,131호(1995. 7. 18 등록)는 B7 단백질의 리간드인 CTLA4 단백질에 대해 개시하고 있다. 또한 CTLA4 융합 단백질(예를 들어, CTLA4-Ig)의 생산방법과 B7 단백질 혹은 CTLA4 단백질에 대한 항체들을 이용하는 면역 반응을 조절하는 방법도 개시하고 있다.
국제출원공개 제WO 95/22619호(1995. 8. 24 공개)는 B7-2 단백질과 결합하지 않는 B7-1 단백질에 대한 항체 특이성을 개시하고 있다. 또한 B7-1 단백질에 항체를 이용하여 면역 반응을 조절하는 방법을 개시하고 있다.
국제출원공개 제WO 95/34320호(1995. 12. 21 공개)는 CTLA4-Ig 융합 단백질과 같은 공촉진제를 저해하는 1차 약품 및 안티-LFA-1 항체와 같은 세포성 유착을 저해하는 2차 약품을 이용하여 T세포 반응을 저해하기 위한 방법을 개시하고 있다. 그러한 방법들은 이식된 조직이나 기관의 거부 반응을 억제시키는데 있어서 유용하다.
국제출원공개 제WO 95/32734호(1995. 12. 7 공개)는 B7 분자의 상승조절을 방해하고 APCs에 있는 ICAM-3의 발현에 손상을 주는 FcγRII 다리화제(bridging agent)를 개시하고 있다. 그러한 FcγRII 다리화제는 수집된 사람의 IgG 분자와수집된 상기 사람의 IgG 분자의 Fc 절편과 같은 단백질들을 포함하고 있다.
국제출원공개 제WO 96/11279호(1996. 4. 18 공개(A2), 1996. 5. 17 공개(A3))는 (1) B7-1과 B7-2를 포함하는 하나 이상의 면역촉진제 및 (2) 약품이 생기도록 하는 질병의 항원을 암호화하는 유전자 염기서열로 이루어진 재조합 바이러스를 개시하고 있다. 또한 그러한 재조합 바이러스를 이용하는 질병의 치료방법을 개시하고 있다.
아직까지, B7-1 및 B7-2와 같은 B7 단백질의 발현을 효율적으로 조절하고 방해하는 치료제로 알려진 것은 없다. 그러므로 B7 단백질과 같은 중요한 공촉진 분자를 효율절으로 조절하는 화합물과 방법은 오랜 숙원과제이다. B7 단백질의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드가 여러 종류의 염증성 혹은 자가면역성 질병이나, 염증 요소를 갖고 있는 가벼운 병 혹은 질병(예를 들어 천식, 연소성 당뇨병, 중증근 무력증, 그레이브스 질환, 류마티스성 관절염, 타가이식 거부 반응, 장염, 다발성 경화증, 건선, 홍반성 루프스, 전신성 루프스, 당뇨, 접촉성 피부염, 비염 및 여러 가지 알러지)에 대해 활성을 갖는 신규의 항염증 치료제들을 제공할 것으로 기대된다. 또한, B7 단백질의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드는 생체내에서(ex vivo) T세포의 증식을 시키는 신규의 수단을 제공할 것이다.
본 발명은 T세포 활성의 조절에 반응하는 질병 상태의 진단, 연구시약 및 치료법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 T세포 활성을 조절하는 단백질을 합성하는 특정한 전령 리보핵산(mRNA) 혹은 DNA와 안티센스 올리고뉴클레오티드간의 상호작용에 관한 것이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 B7 단백질을 암호화하는 핵산과 잡종화할 수 있도록 고안되어 제공된다. 상기 올리고뉴클레오티드는 RNA 혹은 DNA의 활성을 조절하여, T세포 활성을 조절하는 것으로 알려져 있다. 그로 인해 완화, 치료 및 예방의 효과를 볼 수 있다. 또한 본 발명은 세포내 상호작용을 매개하는 단백질, 예를 들어 세포내 접착 분자(ICAM) 단백질에 대한 2차 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 2차 항염증제와 함께 B7 단백질에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
제1도는 B7-1 단백질 발현에 있어서 COS-7 세포에 투여된 올리고뉴클레오티드의 저해 효과를 나타낸 것이다.
제2도는 B7-1 단백질의 세포 표면 발현에 있어서 올리고뉴클레오티드의 저해 효과를 나타낸 투약-반응 곡선이다. 직선은 ISIS 13812이고, 긴 점선은 ISIS 13800이며, 그리고 짧은 점선은 ISIS 13805이다.
제3도는 B7-2의 세포 표면 발현에 있어서 COS-7 세포에 투여된 올리고뉴클레오티드의 저해 효과를 나타낸 막대 그래프이다.
제4도는 B7-2의 세포 표면 발현에 있어서 COS-7 세포에 투여된 ISIS 10373(20-mer) 및 ISIS 10996(15-mer)을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 저해 효과를 보여주는 막대 그래프이다.
제5도는 올리고뉴클레오티드에 의한 B7-1 혹은 B7-2 단백질 발현의 저해 특이성을 나타낸 것이다. ▨ 모양으로 빗금친 막대는 B7-1을 나타내며, ▧ 모양으로 빗금친 막대는 B7-2를 나타낸다.
제6도는 ICAM-1(ISIS 2302) 및 B7-2(ISIS 10373) 단백질의 세포 표면 발현에 있어서 ICAM-1 및 B7-2에 대한 안티센스 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 저해 효과를 나타내는 투약-반응 곡선이다. ---○--- = ISIS 10373으로 처리된 세포의 B7-2 단백질; --●-- = ISIS 10373으로 처리된 세포의 ICAM-1 단백질; ---△--- = ISIS 2302로 처리된 세포의 B7-2 단백질; 및 --□-- = ISIS 2302로 처리된 세포의 ICAM-1 단백질.
제7도는 T세포 증식에 있어서 투여된 올리고뉴클레오티드의 효과를 나타낸 막대 그래프이다.
제8도는 설치류의 B7-2 단백질 발현에 있어서 COS-7 세포의 올리고뉴클레오티드의 저해 효과를 나타낸 투약-반응 곡선이다. ---*--- = ISIS 11696 및 --△-- = ISIS 11866.
제9도는 설치류의 IC-21 세포내의 B7-2 단백질의 세포 표면 발현에 있어서 ISIS 11696 및 ISIS 11866 올리고뉴클레오티드의 효과를 나타내는 막대 그래프이다. ▨ 모양의 왼쪽 막대는 올리고뉴클레오티드 없이 처리한 것이며, □ 모양의 가운데 막대는 3μM의 올리고뉴클레오티드를 투여한 것이며, 그리고 ▧ 모양의 오른쪽 막대는 10μM의 올리고뉴클레오티드를 투여한 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 B7-1 및 B7-2를 포함하는 B7 단백질을 암호화하는 RNA와 DNA의 안티센스 저해에 사용되는 올리고뉴클레오티드를 이용한 것이다. 또한 본 발명은 상기 단백질을 암호화하는 DNA와 전령 RNA(mRNA)와 특이적으로 잡종화할 수 있는, 그리고 상기 각각의 유전자로부터 전사된 단백질의 양을 궁극적으로 조절하기 위하여 고안된 올리고뉴클레오티드를 이용한 것이다. 상기 mRNA와의 잡종화는 mRNA의 정상적인 역할을 방해하고 세포내 기능의 조절을 유발한다.
상기와 같이 방해되는 mRNA의 기능은 단백질 해독을 위한 부위에서의 RNA의 전좌; RNA로부터 단백질의 실질적인 해독; 하나 이상의 mRNA 종을 생산하기 위한 RNA의 스플라이싱; 및 가능한 한 RNA에 의해 관여될 수 있는 독립적인 촉매 활성과 같은 모든 중요한 기능들을 포함한다. mRNA의 기능과 함께 전체적인 방해의 효과는 B7 단백질의 발현을 조절하며, 여기에서 "조절"이란 B7 단백질의 발현에 있어서증가(촉진) 및 감소(저해)를 둘 다 의미하는 것이다. 본 발명에 있어서, 저해는 유전자 발현을 조절하는 바람직한 형태이다.
올리고뉴클레오티드는 특정한 핵산과 특이적으로 잡종화하는 것에 영향을 미칠 수 있도록 충분한 동일성 및 수를 갖는 뉴클레오티드 염기서열로 이루어질 수 있다. 유전자의 센스 가닥 부위에 특이적으로 잡종화할 수 있는 상기 올리고뉴클레오티드를 통상 "안티센스"라고 부른다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연구 시약, 진단 보조제 및 치료제로서 일반적으로 사용된다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 절묘한 특이성을 갖는 유전자 발현을 저해할 수 있으며, 당업자에 의해서 특정한 유전자의 기능을 명료하게 밝혀내기 위하여, 즉 예를 들어 생물학적 경로의 여러 요소들의 기능 사이의 구별에 사용된다. 상기 특이적 저해 효과는 당업자들에 의해 연구되고 있다.
또한 올리고뉴클레오티드의 특이성과 민감성도 당업자들에 의해 치료적으로 이용되었다. 예를 들어, 다음의 미국특허는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하는 완화, 치료 및 다른 방법들에 대해 개시하고 있다. 미국특허 제5,135,917호는 사람의 인터루킨-1 수용체 발현을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하고 있다. 미국특허 제5,098,890호는c-myb종양유전자에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 특정한 독성 상태(cancerous conditions)를 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드 치료법을 제시하고 있다. 미국특허 제5,087,617호는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 암환자를 치료하는 방법을 제공하고 있다. 미국특허 제5,166,195호는 HIV의 올리고뉴클레오티드 저해자를 제공하고 있다. 미국특허제5,004,810호는 헤르페스 심플렉스 바이러스 Vmw65 mRNA의 잡종화 및 복제 저해를 가능하게 하는 올리고머를 제공하고 있다. 미국특허 제5,194,428호는 인플루엔자 바이러스에 대하여 항바이러스성 활성을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하고 있다. 미국특허 제4,806,463호는 HTLV-III 복제를 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 그것을 이용하는 방법을 제공하고 있다. 미국특허 제5,286,717호는 종양유전자의 일부분에 상보적 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 제공하고 있다. 미국특허 제5,276,019호 및 미국특허 제5,264,423호는 세포내 외래 핵산의 복제를 막는데 이용되는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 유사체를 제시하고 있다. 미국특허 제4,689,320호는 CMV에 특이적인 항바이러스제로서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제시하고 있다. 미국특허 제5,098,890호는 사람의 c-myb 유전자의 mRNA전사체의 적어도 한 부분에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 제공하고 있다. 미국특허 제5,242,906호는 잠재적 EBV 감염 치료에 유용한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하고 있다.
안티센스 침투를 위하여 표적 특이 유전자가 바람직하다. 관련된 핵산에 올리고뉴클레오티드를 "표적시키는 것(targeting)"은, 본 발명의 문맥상에서, 여러 단계 의 공정이다. 상기 공정은 조절되는 기능의 핵산 염기서열을 동정하는 것으로 시작된다. 예를 들면, 이것은 특정한 가벼운 병 혹은 질병 상태와 관계 있는 발현이 나타나는 세포성 유전자(혹은 유전자로부터 전사된 mRNA) 또는 감염제로부터 오는 외래 핵산일 수 있다. 본 발명에서, 상기 표적은 외면상 "정상" 면역 반응(예를 들어, 숙주 동물이 이식된 조직에 대해 거부 반응을 나타내는 것)과 같이,특정한 경우에 조절이 요구되는 여러 면역 기구의 가벼운 병 혹은 질병(예를 들어, 염증 및 자가면역 질병)과 관련된 세포성 유전자이다. 상기 표적 공정은 단백질 발현의 검출 혹은 조절 중 그 어느 쪽이라도, 바람직한 효과를 이룰 수 있는 올리고뉴클레오티드 상호작용을 위한 상기 유전자내의 영역(혹은 영역들)의 결정을 포함한다. 일단 표적 영역이 동정되면, 올리고뉴클레오티드는 상기 표적에 대하여 충분히 상보성이 있는, 즉 바람직한 효과를 거둘 수 있게 충분하게 잡종화되어 충분한 특이성을 갖는 것으로부터 선택된다.
일반적으로, 유전자의 5개 영역이 안티센스 조절을 위해 표적될 수 있다: 5' 비해독 지역(이하에서는, "5'-UTR"); 해독 개시 코돈 영역(이하에서는, "tIR"); 오픈 리딩 프레임(open reading frame)(이하에서는, "ORF"); 해독 종결 코돈 영역(이하에서는, "tTR"); 및 3' 비해독 영역(이하에서는, "3'-UTR"). 당업계에서 알려진 바와 같이, 이러한 영역들은 다음의 지시(왼쪽에서 오른쪽으로 즉, 5'에서 3'으로)에 따라서 전형적인 전령 RNA 분자로 배열된다: 5'-UTR, tIR, ORF, tTR, 그리고 3'-UTR. 당업계에서 알려진 바와 같이, 여러 진핵생물의 전사체들은 "인트론"으로 알려진, 해독이 이루어지기 전에 전사체로부터 절단된 하나 이상의 염기서열을 포함하고 있는 많은 ORF들을 직접 해독한다; ORF의 발현된(비절단된) 부위들은 "엑손"이라고 부른다(Albertset al.,Molecular Biology of the Cell, 1983, Garland Publishing Inc., New York, pp. 411-415). 더 나아가, 많은 진핵생물의 ORF들은 길이가 1,000 뉴클레오티드를 넘기 때문에, ORF을 5' ORF 영역, 중심 ORF 영역 및 3' ORF 영역으로 종종 편리하게 세분하기도 한다. 여러 경우에, ORF가생체내에서(in vivo) 어떤 중요한 기능을 위해 표적되는 하나 이상의 부위를 포함할 수 있다. 부위들의 뒤쪽 형태의 예는 유전자내 스템-루프(stem-loop) 구조(예를 들어, 미국특허 제5,512,438호에 개시된) 및 공정되지 않은 mRNA 분자내의 인트론/엑손 스플라이스 부위를 포함한다. 본 발명의 문맥상에서, 하나의 바람직한 유전자내 부위는 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 해독 개시 코돈을 에워싸고 있는 영역이다. 당업계에 알려진 바와 같이, 해독 개시 코돈은 전형적으로 5'-AUG(전사된 mRNA 분자내; DNA 분자와 대응하는 5'-ATG)이기 때문에, 해독 개시 코돈은 "AUG 코돈", "개시 코돈" 혹은 "AUG 개시 코돈"이라고 인용된다. 5'-GUG, 5'-UUG 혹은 5'-CUG, 5'-AUA, 5'-ACG 및 5'-CUG의 RNA 염기서열을 포함하는 해독 개시 코돈을 갖고 있는 소수의 유전자들은 생체내의(in vivo) 기능에 작용을 한다. 더 나아가, 5'-UUU는 시험관내에서(in vitro) 해독 개시 코돈으로 작용한다(Brigstocket al.,Growth Factors, 1990, 4, 45; Gelbertet al.,Somat. Cell. Mol.Genet., 1990, 16, 173; Gold and Stormo, in:Escherichia coli and Salmonella typhimurium:Cellular and Molecular Biology, Vol. 2, 1987; 및 Neidhardtet al., eds., American Society for Microbiology, Washington, D.C., p. 1303). 이렇게, 비록 각각의 경우에 개시인자 아미노산이 전형적으로 메티오닌(진핵생물에서) 혹은 포르밀메티오닌(원핵생물에서)이긴 하지만, "해독 개시 코돈" 및 "개시 코돈"은 많은 코돈 염기서열들을 포함할 수 있다. 진핵생물 및 원핵생물의 유전자들은 특정한 세포 형태나 조직에 있어서 혹은 특정한 조건하에서, 해독 개시를 위해 차별적으로 이용될 수 있는 둘 이상의 선택적 개시 코돈을 가질 수 있으며, 이것은 상이한 아미노 종결 염기서열을 갖도록 관련된 폴리펩티드를 산출하기 위한 것으로 당업계에 알려져 있다(Markussenet al.,Development. 1995,121, 3723; Gaoet al.,Cancer Res., 1995, 55, 743; McDermott et al.,Gene, 1992,117, 193; Perriet al.,J. Biol. Chem., 1991,266, 12536; Frenchet al.,J. Virol., 1989,63, 3270; Pushpa-Rekkaet al.,J. Biol. Chem., 1995,270, 26993; Monacoet al.,J. Biol. Chem., 1994,269, 347; DeVirgilioet al., Yeast, 1992,8, 1043; Kanagasundaramet al.,Biochim. Biophys, Acta, 1992,1171, 198; Olsenet al.,Mol. Endobiol., 1991,5, 1246; Saulet al.,Appl. Environ. Microbiol., 1990,56, 3117; Yaoitaet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990,87, 7090; 및 Rogerset al., EMBO J., 1990, 9, 2273). 본 발명의 문맥상에서, "개시 코돈" 및 "해독 개시 코돈"은 생체내에서(in vivo) 시용되는 것으로, 상기 코돈의 염기서열(들)과는 상관없이, B7 단백질을 암호화하는 유전자로부터 전사된 mRNA 분자의 해독을 개시하기 위한 코돈(들)이다. 유전자의 해독 종결 코돈(혹은 "정지 코돈")은 세 개의 염기서열 즉, 5'-UAA, 5'-UAG 및 5'-UGA(각각의 대응되는 DNA 염기서열은 5'-TAA, 5'-TAG 및 5'-TGA이다) 중 하나일 수 있다. "개시 코돈 영역" 및 "해독 개시 영역"은 해독 개시 코돈으로부터 양방향으로(즉, 5' 혹은 3' 쪽으로) 약 25 내지 50개의 뉴클레오티드로 둘러싸여 있는 상기 mRNA 혹은 유전자의 부위이다. 이와 마찬가지로, "정지 코돈 영역" 및 "해독 종결 영역"이란 해독 종결 코돈으로부터 양방향으로(즉, 5' 혹은 3' 쪽으로) 약 25 내지 50개의 뉴클레오티드로 둘러싸여 있는 상기 mRNA 혹은 유전자의 부위를 말한다.
본 발명의 문맥상에서, "올리고뉴클레오티드"란 리보핵산 혹은 데옥시리보핵산의 올리고머 또는 중합체이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 비자연적으로 생성되는 유사한 작용을 하는 부위를 가지는 올리고뉴클레오티드와 마찬가지로, 자연적으로 생성되는 뉴클레오염기(nucleobases), 당 혹은 공유 당간 골격 결합(covalent intersugar backbone linkages)으로 구성된다. 상기 변형된 혹은 치환된 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 증진된 세포 흡착력, 표적과의 결합 향상 및 뉴클레아제 존재하의 안정성 증가와 같은 바람직한 특성으로 인하여, 본래의 형태보다 흔히 더 바람직하다.
본 발명을 위해 계획되어 바람직하게 변경된 복수의 올리고뉴클레오티드의 특정한 샘플들은 포스포로티오에이트, 포스포로트리에스테르, 메틸포스포네이트, 쇼트 체인 알킬 또는 시클로알킬 당간 결합, 혹은 쇼트 체인 헤테로아토믹 또는 헤테로시클릭 당간 결합을 이루는 것들을 포함한다. 가장 바람직한 것들은 포스포로티오에이트를 가지고 있는 올리고뉴클레오티드 및 CH2-NH-O-CH2, CH2-N(CH3)-O-CH2[메틸렌(메틸리미노) 또는 MMI 골격으로 알려진], CH2-O-N(CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2및 O-N(CH3)-CH2-CH2골격을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드이며, 여기에서 상기 포스포디에스테르의 원래 골격은 O-P-CH2이다. 또한 올리고뉴클레오티드는 모폴리노(morpholino) 골격 구조를 가지는 것이 바람직하다(Summerton and Weller, 미국특허 제5,034,506호). 더욱 바람직한 것은 NR-C(*)-CH2-CH2, CH2-NR-C(*)-CH2, CH2-CH2-NR-C(*), C(*)-NR-CH2-CH2및 CH2-C(*)-NR-CH2골격을 가지는 올리고뉴클레오티드이며, 상기 "*"은 산소 혹은 황(아미드 골격으로 알려진; Demesmaekeret al, 제WO 92/20823호, 1922. 11. 26 공개)을 나타낸다. 다른 바람직한 구체예에서, 펩티드 핵산(PNA) 골격과 같은, 상기 올리고뉴클레오티드의 포스포디에스테르 골격은 폴리아미드 골격으로 대체되며, 여기서 뉴클레오염기는 상기 폴리아미드 골격의 아자 질소 원자에 직접 혹은 간접적으로 결합되어 있다(Nielsenet al.Science, 1991,254, 1497; 미국특허 제5,539,082호). 다른 바람직하게 변형된 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에서 다음 중 하나를 포함하는 하나 이상의 치환된 당 성분을 함유할 수 있다: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3OCH3, OCH3O(CH2)nCH3, O(CH2)nNH2혹은 O(CH2)nCH3(상기 n은 1 내지 10의 수임); C1내지 C10의 저급 알킬, 알콕시알콕시, 치환된 저급 알킬, 알카릴 혹은 아랄킬; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S- 혹은 N-알킬; O-, S- 혹은 N-알케닐; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; 헤테로시크로알킬; 헤테로시크로알카릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 치환된 실릴; RNA 절단기; 수용체기; 인터칼레이터; 및 올리고뉴클레오티드의 파마코다이나믹 성질을 향상시키는 기와 다른 유사한 성질을 가지는 치환체이다. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시[2'-O-(2-메톡시에틸)로 알려진 2'-O-CH2CH2OCH3]를 포함한다(Martinet al.,Helv. Chim. Acta, 1995,78, 486). 다른 바람직한 변형은 2'-메톡시(2'-O-CH3), 2'-프록시(2'-OCH2CH2CH3) 및 2'-플루오르(2'-F)를 포함한다. 이와 유사한 변형이 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서 다른 위치에서, 특히 3' 말단 뉴클레오티드의 당 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 이루어질 수도 있다. 또한 올리고뉴클레오티드는 펜토푸라노실기의 시클로부틸과 같은 당 유사체(mimetics)를 가질 수도 있다.
본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드는 추가적으로 혹은 선택적으로 변경 혹은 치환된 뉴클레오염기를 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 것처럼, "변경되지 않은" 혹은 "천연의" 뉴클레오염기는 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 변경된 뉴클레오염기는 합성된 뉴클레오염기, 예를 들어 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌 및 2,6-디아미노퓨린과 마찬가지로 천연의 핵산, 예를 들어 하이포잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸시토신, 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC 및 젠티오바이오실(gentiobiosyl) HMC에 있어서 단지 드물게 혹은 일시적으로 발견되는 뉴클레오염기를 포함한다(Kornberg, A., DNA Replication, 1974, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1974, pp. 75-77 및 Gebeyehu, G.,et al.,Nucleic Acids Res., 1987,15, 4513).
또 다른 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드의 바람직한 추가적인 또는 선택적인 변경은 상기 올리고뉴클레오티드에 상기 올리고뉴클레오티드의 세포 흡착력을 증진시키는 하나 이상의 지용성(lipophilic) 성분을 화학적으로 결합시키는 것을 수반한다. 상기 지용성 성분은 상기 올리고뉴클레오티드에 있어서 여러 개의 상이한 위치에 있는 올리고뉴클레오티드와 결합될 수 있다. 몇몇 바람직한 위치들은 3' 말단 뉴클레오티드의 3' 당 위치, 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 당 위치 및 모든 뉴클레오티드의 2' 당 위치를 포함한다. 또한 푸린 뉴클레오염기의 N6위치는 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 지용성 성분이 결합되도록 이용될 수 있다(Gegeyehu, G.,et al.,Nucleic Acids Res., 1987,15, 4513). 상기 지용성 성분은 콜레스테릴 성분(Letsingeret al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989,86, 6553), 콜린산(Manoharanet al.,Bioorg. Med. Chem. Let., 1994,4, 1053), 헥실-S-트리틸티올과 같은 티오에테르(Manoharanet al.,Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992,660, 306 및 Manoharanet al.,Bioorg. Med. Chem. Let., 1993,3, 2765), 티오콜레스테롤(Oberhauseret al.,Nucl. Acids Res., 1992,20, 533), 도데캔디올 혹은 언데실 잔기와 같은 지방성 사슬(Saison-Behmoaraset al.,EMBO J., 1991,10, 111; Kabanovet al.,FEBS Lett., 1990,259,327; 및 Svinarchuket al.,Biochemie, 1993,75,49), 디-헥사데실-랙-글리세롤 또는 트리에틸암모니움 1,2-디-O-헥사데실-랙-글리세로-3-H-포스포네이트와 같은 포스포리피드(Manoharanet al.,Tetrahedron Lett., 1995,36, 3651 및 Sheaet al.,Nucl. Acids Res., 1990,18, 3777), 폴리아민 혹은 폴리에틸렌 글리콜 사슬(Manoharanet al.,Nucleosides & Nucleotides, 1995,14, 969), 또는 아다맨탄 아세트산(Manoharanet al.,Tetrahedron Lett., 1995,36, 3651), 팔미틸 성분(Mishraet al.,Biochem. Biophys. Acta, 1995,1264, 229) 또는 옥타데실아민 혹은 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 성분(Crookeet al.,J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996,277, 923)에 제한되지 않는다. 지용성 성분을 포함하는 올리고뉴클레오티드와 상기 올리고뉴클레오티드를 제공하는 방법은 여기에서 참고로 언급된, 미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호에 개시되어 있다.
또한 본 발명은 키메릭 올리고뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 문언상에서, "키메릭(chimeric)" 올리고뉴클레오티드 혹은 "키메라(chimera)"란 각각이 적어도 하나의 뉴클레오티드인 둘 이상의 화학적으로 구별된 지역을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 일반적으로 상기 올리고뉴클레오티드는 최소한 하나의 영역을 포함하며, 여기에서 상기 올리고뉴클레오티드는 뉴클라아제 감소로 인하여 증가된 올리고뉴클레오타이드의 내성, 증진된 세포 흡착력 및/혹은 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화도를 위하여 변형된다. 올리고뉴클레오티드의 부가적인 영역은 RNA:DNA 혹은 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소로 치환된다. 예를 들자면, RNase H는 RNA:DNA 이중가닥 중 RNA 가닥을 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제이다. 그러므로, RNase H가 활성되면 RNA 표적이 절단되며, 유전자 발현의 안티센스 저해 효과는 크게 향상된다. 일반적으로 RNA 표적의 절단은 젤 전기영동으로 검출될 수 있고, 필요하다면, 당업계에 알려진 핵산 잡종화 기술도 사용될 수 있을 것이다. 예를 들면, "키메라"는 상기 올리고뉴클레오티드의 중심 부분("갭")이 RNase H와 5' 및 3' 부위("윙")가 뉴클레아제 활성을 지지할 수 없지만 표적 RNA 분자에 대하여 보다 큰 친화력을 가지게 하기 위한 형태로 변형된 기질(예를 들면, 치환된 2'-플루오르- 혹은 2'-메톡시에톡시)을 제공하는 "갭머(gapmer)" 즉, 올리고뉴클레오티드이다. 다른 키메라는 "윙머(wingmer)"를 포함하며, "윙머"는 상기 올리고뉴클레오티드의 5' 부위가, 예를 들면, RNase H를 위한 기질로 제공되는 올리고뉴클레오티드인 반면, 3' 부위는 표적 RNA 분자를 위한 더욱 향상된 친화력을 갖는 형태로 변형되며(예를 들면, 치환된 2'-플루오르- 혹은 2'-메톡시에톡시), 또는 그 역도 가능하다.
본 발명에 부합되는 상기 올리고뉴클레오티드는 약 8 내지 30개의 뉴클레오티드로 구성된다. 더 바람직하게는 상기 올리고뉴클레오티드는 약 15 내지 25개의 뉴클레오티드로 구성된다. 당업계에 알려진 바와 같이, 뉴클레오티드는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 다른 공유 결합으로 인접한 뉴클레오티드에 적절하게 결합되어 있는 염기-당 결합이다.
본 발명에 부합하는 상기 올리고뉴클레오티드는 잘 알려진 고체상 합성 기술을 통해 쉽고 일반적으로 제공될 수 있다. 상기 합성 기구는 Applied Biosystems(Foster City, CA)를 포함한 여러 업체에서 구입할 수 있다. 상기 합성을 위해 당업계에서 잘 알려진 또 다른 수단들을 부가적으로 또는 선택적으로 이용할 수 있다. 또한 포스포로티오에이트 및 알킬레이트 유도체와 같은 다른 올리고뉴클레오티드를 제공하는 유사한 기술들을 이용할 수 있다는 것도 잘 알려져 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 치료 화합물, 진단 기구 및 연구 시약과 키트(kit)로서도 이용될 수 있다. "치료적 이용"이란 예방, 완화 및 치유적 이용을 포함하는 것이며, 여기에서 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드는in vivo또는ex vivo로 동물 세포와 접촉된다.ex vivo로 동물 세포와 접촉시키는 경우, 치료적이용은 본 발명의 하나 이상의 올리고뉴클레오티드로 처리한 상기 세포를 동물에 통합되게 하는 것을 포함한다. 특정한 유용성에 얽매이지 않고, 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드에 의한 T세포 증식은, 예를 들어 APCs의 B7 단백질의 발현을 바람직하게 조절하는 잠재적 치료 형태로 이용될 수 있다. 즉, B7-1 단백질의 발현을 저해하는 올리고뉴클레오티드는 APCs의 표면에 있는 B7-2 단백질의 효용성을 증가시켜, 이로 인해ex vivo에서 T세포에 있는 B7-2 단백질의 공촉진적 효과를 증가시킬 것이다(Levineet al.,Science, 1996,272, 1939).
치료적 이용에 있어서, B7 단백질의 활성의 조절에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 질병 혹은 가벼운 병을 가지고 있다고 의심되는 동물에게 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 처방하여 치료한다. 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직한 약제학적으로 이용가능한 희석제 혹은 담체에 올리고뉴클레오티드의 효과적인 양을 첨가한 약제학적 조성물에 이용될 수 있다. 이 분야의 연구자들은 안티센스, 트리플렉스(triplex) 및 바이러스성, 균류 및 대사적 질병에 연루된 유전자의 발현을 조절하는 능력을 가진 올리고뉴클레오티드 조성물을 동정하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 사람에게 안전하게 처방되었고 여러 번의 임상 시도가 현재 잘 진행되고 있다. 따라서 올리고뉴클레오티드는 세포, 조직 및 동물, 그리고 특히 사람의 치료에 대한 치료법에 있어서 유용한 치료적 수단이 될 수 있다는 것이 확립되었다.
본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드는 세포 혹은 조직 샘플의 B7-특이적 핵산의 존재를 검출하는 데에도 사용될 수 있다. 예를 들어, 방사선 표지된 올리고뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 키나아제의 5' 말단에32P를 표지하여 제공될 수 있다(Sambrooket al.,Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Volume 2, pg. 10.59). 그러한 방사선 표지된 올리고뉴클레오티드는 B7 메세지 RNA(및 B7 단백질)를 포함하는 것으로 여겨지는 세포와 조직 샘플에 접촉하며, 그리고 결합이 풀려진 올리고뉴클레오티드는 제거하여 세척된다. 샘플에 남아있는 방사선성분은 결합된 올리코뉴클레오티드의 존재를 나타내며, 더 나아가 상기 올리고뉴클레오티드에 상보적인 핵산의 존재를 나타내고, 그리고 섬광 계수기나 다른 일반적인 수단을 이용하여 측량될 수 있다. 또한 상기 단백질을 암호화하는 핵산의 발현도 검출된다.
연구, 진단 혹은 치료적 목적을 위하여, 본 발명의 방사선 표지된 올리고뉴클레오티드는 B7 단백질의 위치, 분포 및 양을 측정하기 위해서 조직의 방사선 사진을 찍는데 이용될 수 있다. 상기 연구에 있어서, 조직 절편들은 방사선 표지된 올리고뉴클레오티드로 처리되며, 위에서 언급한 바와 같이 세척되며, 그리고 일상적인 방사선 사진을 찍을 때 사진 감광에 의해 노출된다. 감광이 되면, B7 유전자의 발현 지역에는 은색 결의 형상이 생기게 된다. 상기 은색 결의 측량에 의해 상기 단백질을 암호화하는 mRNA 분자의 발현이 검출되며, 상기 지역의 올리고뉴클레오티드가 표적될 수 있다.
B7 핵산 발현을 형광 검출하는 이와 유사한 검정법은 방사선 표지 대신에 플루어레신(fluorescein) 또는 다른 형광성 태그(tag)와 컨쥬게이트된 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용함으로 향상될 수 있다. 일반적으로 상기 컨쥬게이션은 고체상 합성 동안에 형광-표지된 아미디트(amidite) 및 제어된-포아 글래스(controlled-pore glass; CPG) 칼럼(column)을 이용하여 달성될 수 있다. 형광-표지된 아미디트와 CPG는 예를 들어, Glen Research, Sterling VA에서 구입 가능하다.
본 발명은 B7 단백질을 암호화하는 핵산에 표적된 올리고뉴클레오티드와 그러한 단백질을 암호화하는 핵산에 표적된 올리고뉴클레오티드를 이용한다. 또한 B7 단백질의 발현의 존재 및 결여를 검출하는 키트도 제공될 수 있다. 상기 키트는 바람직한 유전자, 다시 말하면, B7 단백질을 암호화하는 유전자에 표적된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 적절한 키트 및 검정법의 형태, 즉 "샌드위치(sandwich)" 검정법과 같은 것은 당업계에 잘 알려져 있으며 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용하는데 있어서 쉽게 채택될 수 있다. B7 단백질을 암호화하는 핵산과 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 잡종화는 당업계에 알려진 수단으로 검출될 수 있다. 상기 수단들은 올리고뉴클레오티드에 대한 효소의 컨쥬게이션, 올리고뉴클레오티드의 방사선표지 혹은 다른 적절한 검출 시스템을 포함할 수 있다. 또한 B7 단백질의 존재 혹은 결여를 검출하는 키트가 제공될 수 있다.
본 발명의 문맥상에서, "잡종화"란 수소결합을 의미하는데, 이는 상보적 뉴클레오티드간의 Watson-Crick, Hoogsteen 또는 역 Hoogsteen 수소결합일 수 있다. 예를 들어, 아데닌과 티민은 수소결합의 형성을 통해 짝을 이루는 상보적 뉴클레오염기이다. 여기에서 사용되는 "상보적"이란 두 개의 뉴클레오티드 사이에 정확한짝을 이루는 것을 말한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 특정한 위치에 있는 뉴클레오티드가 DNA 혹은 RNA 분자의 동일한 위치에 있는 뉴클레오티드와 수소결합을 이룰 수 있다면, 상기 올리고뉴클레오티드와 상기 DNA 혹은 RNA는 같은 위치에서 상보적인 것으로 간주된다. 상기 올리고뉴클레오티드와 상기 DNA 혹은 RNA는 충분한 수의 위치에서 각각에 대해 수소결합할 수 있는 뉴클레오티드에 대해 서로 상보적이다. 그러므로, "특이적 혼성화" 및 "상보적"이라는 용어는 충분한 정도의 상보성을 나타내는 척도 혹은 올리고뉴클레오티드와 DNA 혹은 RNA 표적 사이에 안정적이며 특이한 결합과 같은 정확한 짝을 이루는 것을 나타내는 데에 사용된다. 올리고뉴클레오티드는 그것의 표적 DNA 염기서열과 특이적으로 잡종화하기 위해서 100% 상보적인 것은 필요로 하지 않는 것으로 당업계에서 알려져 있다. 올리고뉴클레오티드는 상기 올리고뉴클레오티드와 상기 표적 DNA 또는 RNA 분자 사이의 결합이 기능의 감소 혹은 손실을 야기하기 위하여 상기 표적 DNA 혹은 RNA의 정상적인 기능을 방해할 때 특이적으로 잡종화되며, 특이적 결합이 요구되는 조건 즉, 생체내 검정 혹은 치료의 경우 또는 시험관내 검정이 이루어지는 경우 즉, 검정이 수행되는 조건하에서 올리고뉴클레오티드와 비-특이적 결합을 억제할 수 있는 충분한 상보성이 있을 때 특이적으로 잡종화되는 것이다.
치료 조성물의 형식 및 차후의 처방은 당업자에게 잘 알려져 있다. 일반적으로, 치료를 위해서, 그러한 치료요법이 요구되는 환자에게 환자의 연령과 진단되는 가벼운 병 혹은 질병의 심각성에 따라서 체중 1kg 당 0.01μg 내지 100g의 범위에서 통상적으로 약제학적으로 수용가능한 담체인 본 발명에 부합하는 올리고뉴클레오티드를 투약한다. 더욱이, 치료요법은 특정한 질병 혹은 가벼운 병의 성질, 상기 심각성과 환자의 전체적인 상태에 따라 다양해 질 수 있으며, 오랜 기간 동안 지속될 수 있을 것이며, 매일 한번씩에서 20년에 한번씩으로 늘어날 수도 있을 것이다. 치료 후에, 환자 상태의 변화에 대해, 그리고 가벼운 병 혹은 질병의 징후의 완화에 대해 점검한다. 환자가 현재 투약 수준에 대해 심각하게 반응하지 않는 경우 올리고뉴클레오티드의 투약량이 증가될 수도 있으며, 혹은 가벼운 병 또는 질병 상태의 징후가 완화되거나 제거되면 투약량이 감소될 수 있다.
여러 경우에, 치료요법의 효율성을 증가시키기 위하여 다른 치료 형태와 컨쥬게이트된 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 환자를 치료하는 것은 더욱 효과적일 수 있다. 본 발명의 문맥상에서, "치료요법"이란 치료, 완화 및 예방 성분을 포함하는 개념이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드는 세포내 접착 분자(ICAM), 더욱 바람직하게는 ICAM-1에 표적된 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 컨쥬게이트되어 이용된다. 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드와 결합을 하는 데에 이용될 수 있는 또 다른 항-염증성 및/혹은 면역 억제제들은 다음의 것들을 포함하지만, 제한되지는 않는다. 수용성 ICAM 단백질(예를 들어, sICAM-1), 항체-독성 컨쥬게이트, 프레드니손, 메틸프레드니손, 아자티오프린, 시클로포스파미드, 시클로스포린, 인터페론, 심패토미메틱스 및 전형적인 항히스타민제(예를 들어 브로페니라민 말레이트, 클로로페니라민 말레이트, 덱스클로로페니라민 말레이트, 트리폴리딘 HCl, 카르비녹사민 말레이트, 클레마스틴 푸마레이트, 디멘하이드리네이트, 디펜하이드라민 HCl, 디페닐파이랄린 HCl, 독실라민수시네이트, 트리펠렌나민 시트레이트, 트리펠렌나민 HCl, 시클리진 HCl, 하이드록시진 HCl, 메클리진 HCl, 메트딜라진 HCl, 프로메타진 HCl, 트리메프라진 타르트레이트, 아자타딘 말레이트, 사이프로헵타딘 HCl 및 테페나딘 등을 포함하는 히스타민 H1수용체 길항제) 및 히스타민 H2수용체 길항제(예를 들어, 라니티딘)).The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkowet al., eds., 1987, Rahway, N.J., pp. 302∼336 및 2516∼2522에서 일반적으로 찾아볼 수 있다. 본 발명의 상기 혼합물을 사용할 때, 상기 약품들은 개별적으로, 연속적으로 혹은 상기의 하나 이상의 다른 약품들과 조합을 이루어 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서는, 개별적으로 이용된 올리고뉴클레오티드와 함께 달성될 수 있는 것보다 더욱 광범위한 정도로 B7 분자를 공촉진적 효과를 저해시키기 위하여, mRNA 종(예를 들어, B7-1)에 표적된 안티센스 올리고뉴클레오티드가 2차 B7 mRNA 종(예를 들어, B7-2)에 표적된 안티센스 올리고뉴클레오티드와 결합해서 이용된다. 상기 구체예의 관련된 변형예로는, 선택적으로 스플라이싱이 이루어진 B7-1 혹은 B7-2 mRNA에 각각의 표적된, 본 발명의 두 개 이상의 올리고뉴클레오티드는 상기 선택적으로 스플라이싱이 이루어진 mRNAs의 두 형태의 발현을 저해하기 위하여 각기 결합된다. 이용된 조절제의 특이성에 따라서, 한가지 형태의 선택적으로 스플라이싱된 mRNA에 대한 저해는 조작되는 주어진 상태에 대한 발현을 충분하게 감소시키지 않을 수도 있다. 그러므로, 상기의 결합물은, 몇몇 경우에, 본 발명의 방법들 중 한가지만을 실행하기 위해 필수적인 정도로 특정한 B7유전자의 발현을 저해하는 데에 바람직할 수 있다.
치료가 성공적으로 이루어진 후, 질병의 재발을 예방하기 위하여 환자는 지속적인 치료를 받는 것이 바람직하며, 여기에서 상기의 올리고뉴클레오티드는 체중 1kg 당 0.01 μg 내지 100 g 의 범위에서, 하루 한번 이상 내지 20년에 한번 정도로 투약을 지속하는 것이 처방된다. 자가면역 혹은 염증성 상태로 판명되거나 의심되는 각각의 경우에 따라, 예방 효과는 체중 1 kg 당 0.01μg 내지 100 g 의 범위에서, 하루 한번 이상 내지 20년에 한번 정도로 예방적 투약의 처방에 의해 달성될 수 있다. 이와 같이, 개인은 세포, 조직 혹은 기관의 이식의 결과, 이식 대 숙주간 질병(graft versus host disease)과 같은 여러 의학적 치료의 결과가 발생시키는 것으로 예상되는 염증 상태로 감염되는 것을 덜 진행시킬 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료의 필요성 여부 및 치료받을 부위에 따라 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 국소적(안과의, 질의, 직장의, 경비의, 그리고 피부의), 경구적 또는 비경구적으로 이루어질 수 있다. 비경구적 투여는 정맥 점적의, 피하의, 내복막의 혹은 근육내 투여 또는 포막내의 혹은 심실내의 투여를 포함한다.
국소적 투여 형태에는 피부 패치(patch), 연고, 로션, 크림, 젤, 드롭, 좌약, 스프레이, 용액 및 분말이 포함된다. 종래의 약제학적 담체, 수용성의, 분말의 혹은 지성의 베이스(base), 시크너(thickeners) 및 이와 유사한 것 등이 필수적이거나 바람직하다. 코팅된 콘돔, 장갑 및 그와 유사한 것들도 또한 유용하다.
경구 투여용 조성물은 분말 또는 입자, 현탁액 또는 수용성 혹은 비-수용성배양액, 캡슐, 향낭 또는 정제를 포함한다. 시크너, 조미료, 희석제, 유화제, 소산제(dispersing aids) 또는 접합제가 바람직하다.
비경구적, 포막내 혹은 심실내 투여용 조성물은 완충제, 희석제 및 다른 적당한 첨가제를 포함하는 무균의 수용성 용액을 포함할 수 있다.
투여량은 며칠에서부터 몇 달까지, 또는 치료가 효과를 보일 때까지 또는 질환의 증상이 축소될 때까지 치료가 지속되는 동안에 치료 중인 질환 증상의 심각성 및 반응도에 따라 결정된다. 최적의 투여 계획은 환자의 신체 내에서 약이 축적되는 것을 측정하면서 수행될 수 있다. 통상의 지식을 가진 자라면 최적의 투여량, 투여 분류법 및 반복도를 쉽게 결정할 수 있다. 최적 투여량은 각각의 올리고뉴클레오티드의 상대적 효능에 따라 다양하며, 일반적으로 시험관내 및 생체내 동물 모델에서 효과적으로 발견되는 EC50에 근거하여 측정될 수 있다. 일반적으로 투여량은 체중 1kg 당 0.01μg 내지 100g 이며, 하루에, 일주일에, 한 달에 또는 2년에서 20년에 한번씩 또는 그 이상씩 복용될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 서술하는 것이며, 제한하는 것은 아니다. 당업자는 여기에서 기술한 특정한 물질 및 절차에 대한 일상적인 실험 및 많은 균등물들을 알고 있으며, 확보할 수 있다. 상기 균등물은 본 발명의 범주 안에 들어오는 것으로 간주된다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하고자 하는 것이며, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
발명의 요약
본 발명에 따르면, B7-1 혹은 B7-2를 암호화하는 핵산과 특이적으로 잡종화하는 올리고뉴클레오티드가 제공된다. 본 발명의 특정한 올리고뉴클레오티드는 전사된 mRNA 형태 혹은 B7-1이나 B7-2 유전자의 선택된 DNA의 일부분에 직접적으로 결합되어지게 고안되어, B7-1 혹은 B7-2 mRNA로부터 해독된 단백질의 양이나 B7-1 혹은 B7-2 유전자로부터 전사된 mRNA의 양을 조절하게 된다.
올리고뉴클레오티드는 특정한 핵산과 특이적으로 잡종화하는 것에 영향을 미칠 수 있도록 충분한 동일성 및 수를 갖는 뉴클레오티드 염기서열을 포함할 수 있다. 그러한 올리고뉴클레오티드를 통상 "안티센스"라고 부른다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연구 시약, 진단 보조제 및 치료제로서 일반적으로 사용된다.
B7-1 및 B7-2 단백질을 각각 암호화하는 B7-1 및 B7-2 유전자는 이러한 연구에 실마리가 되었다. B7 발현과 T세포 활성 및 증식간의 상호관계의 결과에 의하면, B7-1 혹은 B7-2의 발현 저해는 B7-1 혹은 B7-2의 합성 저해 및 T세포 활성 및 증식 저해를 가져온다. 더욱이, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 B7 전사체의 여러 개의 선택적으로 스플라이싱(splicing)이 된 mRNA 중 하나의 발현을 저해하는 데에 이용될 수도 있으나, 이와는 달리 선택적으로 스플라이싱이 된 B7 mRNA의 발현을 향상시키는 결과도 낳았다. 그러한 조절은 여러 가지 염증성 혹은 자가면역성 가벼운 병이나 질병 혹은 염증 요소를 갖고 있는 가벼운 병이나 질병(예를 들어 천식, 연소성 당뇨병, 중증근 무력증, 그레이브스 질환, 류마티스성 관절염, 타가이식 거부 반응, 장염, 다발성 경화증, 건선, 홍반성 루프스, 전신성 루프스, 당뇨, 접촉성 피부염, 비염 및 여러 가지 알레르기 및 암과 그것의 전이)의 치료에 있어서 바람직하다. 상기 조절은 그러한 질병이나 가벼운 병에 걸리기 쉽다고 의심나는, 혹은 그러한 것으로 알려지는 동물의 상기 질병이나 가벼운 병의 발생을 조절하거나 예방하는데 있어서 바람직하다.
B7 단백질을 암호화하는 핵산과 특이적으로 잡종화할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 동물에 접촉시키는 것을 포함하는 방법이 여기에서 제공된다. 상기 방법은 여러 가지 세포 기능과 생리적 작용 및 상태에 있어서 B7 단백질의 발현 기작을 검출하고 측정하는, 상기 발현과 관련된 상태의 진단에 대한 도구로서 이용된다. 상기 방법은 B7 유전자(예를 들어, B7-1 혹은 B7-2)의 발현을 검출하는데 이용될 수 있으며, 치료용으로 그리고 진단용으로 양쪽 둘 다에 있어서 유용하다. B-7 유전자와 특이적으로 잡종화할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 동물에 접촉시키는 것을 포함하는 B7 단백질의 발현을 조절하는 방법이 여기에서 제공된다. 상기 방법은 B7 발현과 T세포 활성 및 증식간의 상호관계의 결과로서 치료용으로, 그리고 진단용으로 양쪽 둘 다에 있어서 유용하다. 본 발명은 상기 발명의 올리고뉴클레오티드를 이용하는 T세포의 B7에 관련된 활성을 저해하는 방법을 제공한다. 또한 비정상적인 혹은 과도한 T세포 활성 및 증식이 발생하는 곳의 상태를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 이용하여, 치료용으로 그리고 의학적 연구 및 진단 수단으로 양쪽 둘 다에 유용성이 있다. 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드는 연구 목적을 위해 이용될 수도 있다. 그러므로, 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드에 의해 나타나는 특이적 잡종화는 당업자에 의해 예견될 수 있는 검정법(assay), 정제, 세포 생성물의 조제 및 다른 계통적 분류법에 이용될 수 있다.
여기에서 개시된 상기의 방법들은 여러 면역 기구의 기능과 생리 작용 및 상태에 대한 B7-1 혹은 B7-2의 발현 기작에 대한 검출 및 측정을 위한, 그리고 상기 발현과 관련된 상태의 진단을 위한 의학적 연구 수단으로써 이용된다. 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드에 나타나는 특이적 잡종화는 당업자에 의해 예견될 수 있는 검정법(assay), 정제, 세포 생성물의 조제 및 다른 계통적 분류법에 이용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드가 B7 단백질을 암호화하는 핵산과 특이적으로 잡종화하기 때문에, 샌드위치(sandwich) 및 다른 검정법들은 상기 사실을 이용하여 쉽게 고안될 수 있다. 샘플에 나타나는 B7 단백질을 암호화하는 핵산과 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 특이적 잡종화의 검출은 일반적으로 달성될 수 있다. 상기 검출은 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 효소의 컨쥬게이션에 의해 검출 가능한 표지, 방사선표지 혹은 다른 적절한 검출 시스템을 포함할 수 있다. 많은 검정법이 본 발명에 형식적으로 이용될 수 있으며, 상기 검정법은 잡종화할 수 있도록 선택되어진 상태에서 본 발명의 검출 가능한 표지를 갖고 있는 올리고뉴클레오티드를 조직 혹은 세포 샘플에 접촉시켜, 표지를 검출하여 그러한 잡종화를 측정하는 것을 일반적으로 포함할 수 있으며, 당업자에 의해 예견될 수 있다.
실시예 1: 핵산의 합성
올리고뉴클레오티드
올리고뉴클레오티드는 요오드를 이용하여 산화하는 표준 포스포라미디트 케미스트리를 사용하는 DNA 자동합성기로 합성되었다. b-시아노에틸디이소프로필 포스포라미디티는 Applied Biosystems(Foster City, CA)에서 구입할 수 있다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 있어서, 표준 산화 용기는 인산 결합의 단계적 티에이션(thiation)을 위해 아세토니트릴에 0.2M 3H-1,2-벤조디티올-3-원-1,1-디옥사이드 용액으로 채워졌다. 티에이션 순환 정지 단계는 68초까지 증가되었고, 보호단계(capping step)가 뒤따라 이루어졌다.
본 발명의 2'-플루오로 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 5'-디메톡시트리틀-3'-포스포라미디트를 사용하여 합성되었으며, 미국특허출원 제463,358호(1990. 1. 11 출원) 및 미국특허출원 제566,977호(1990. 8. 13 출원)에 개시되어 있는 바와 같이 제공되며 여기에서 참고로 인용되었다. 2'-플루오로 올리고뉴클레오티드는 포스포라미디트 캐미스트리와 표준 DNA 합성 프로토콜의 약간의 변형을 이용하여 제공되었다: 디프로텍션(deprotection)은 상온에서 메타놀릭 암모니아를 사용하여 효과를 나타냈다.
본 발명의 2'-메톡시(2'-O-메틸) 올리고뉴클레오티드는, 테트라졸과 염기의 펄스 운반 후에 정지가 360초까지 증가된다는 것을 제외하고, 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드를 위하여 2'-메톡시 β-시아노에틸디이소프로필-포스포로라미디트 (Chemgenes, Needham MA) 및 표준 순환을 이용하여 합성되었다. 다른 2'-알콕시 올리고뉴클레오티드는 이 방법의 변형에 의해 합성되었으며, Glen Research, Inc., Sterling, VA로부터 입수가능한 바람직한 2'-변형된 아미디트를 이용하였다. 상기 합성의 개시에 사용된 3'-염기는 2'-데옥시리보뉴클레오티드였다. 본 발명의 2'-O-프로필 올리고뉴클레오티드는 상기 절차의 약간의 변형에 의해 제공된다.
본 발명의 2' 메톡시에톡시 (2'-O-CH2CH2OCH3) 올리고뉴클레오티드는 Martin,Helv. Chem. Acta1995,78, 486에 개시된 방법에 따라 합성되었다. 합성을 용이하게 하기 위하여, 마지막 뉴클레오티드를 데옥시뉴클레오티드로 했다. 모든 2'-O-CH2CH2OCH3-시토신은 5-메틸 시토신으로 했고, 하기의 절차에 따라 합성되었다.
5-메틸 시토신 단량체의 합성
2,2'-안하이드로[1-(β-D-아라비노푸라노실)-5-메틸루리딘]
5-메틸루리딘(리보실티민, Yamasa, Choshi, Japan을 통해 상업적으로 입수 가능한)(72.0g, 0.279M), 디페닐카르보네이트(90.0g, 0.420M) 및 소듐 바이카르보네이트(2.0g, 0.024M)이 DMF(300mL)에 첨가되었다. 혼합물은 역류로, 교반작용과 함께 열이 가해졌으며, 제어된 방식으로 이산화탄소 가스 방출을 수반하였다. 1시간 후, 약간 탁한 용액이 감소된 압력하에서 농축되었다. 합성된 당밀은 디에틸에테르(2.5L)에 교반작용과 함께 부었다. 상기 생성물은 고무질의 형태를 이루었다.에테르를 다른 곳에 옮겨 부었고, 그 잔여물을 소량의 메탄올(ca. 400mL)에 용해시켰다. 뻣뻣한 고무질을 생성시키기 위하여 상기 용액을 순수한 에테르(2.5L)에 부었다. 상기 에테르를 다른 곳에 옮겨 부었고, 밝은 황갈색 분말로 분쇄된(57g, 85% 비가공 수율) 고체를 제공하기 위하여 진공 오븐(1mm Hg, 60℃로 24 시간 동안)에서 상기 고무질을 건조시켰다. 상기 물질은 다음의 반응을 위해서 사용되었다.
2'-O-메톡시에틸-5-메틸루리딘
2,2'-안하이드로-5-메틸루리딘(195g, 0.81M), 트리스(2-메톡시에틸)보레이트 (231g, 0.98M) 및 2-메톡시에탄올(1.2L)을 2L 스테인레스 스틸 압력 용기에 붓고, 160℃로 미리 예열된 오일 배스(oil bath)에 넣었다. 155 내지 160℃에서 48시간 동안 열을 가한 후, 상기 용기를 개방하여 상기 용액을 건조하게 증발시켰고 MeOH(200mL)를 넣어 가루로 만들었다. 그것의 잔여물은 강한 아세톤(1L)에서 잠시 부유시켰다. 불용해성 염류는 아세톤(150mL)으로 여과되어 세척되었으며, 여과액은 증발되었다. 그것의 잔여물(280g)은 CH3CN(600mL)에서 용해되어 증발되었다. 실리카 젤 칼럼(column)(3kg)은 0.5% Et3NH를 포함하는 CH2Cl2/아세톤/MeOH(20:5:3)에서 채워졌다. 그것의 잔여물을 CH2Cl2(250mL)에서 용해시켰고 상기 칼럼에 로딩시키기 전에 실리카(150g)에 흡착시켰다. 상기 생성물은 생성물의 160g(63%)를 제공하기 위해서 패킹(packing) 용매로 현탁되었다.
2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메톡시루리딘
2'-O-메톡시에틸-5-메톡시루리딘(160g, 0.506M)을 피리딘(250mL)과 함께 증발시켰고 상기 건조된 잔여물은 피리딘(1.3L)에서 용해시켰다. 디메톡시트리틀 클로라이드(94.3g, 0.278M)가 첫 번째로 분주되어 첨가되었고 상기 혼합물은 한 시간 동안 상온에서 교반되었다. 디메톡시트리틀 클로라이드(94.3g, 0.278M)는 두 번째로 분주되어 첨가되었고 상기 반응물은 추가적으로 한 시간 동안 교반되었다. 다음으로, 메탄올(170mL)이 상기 반응을 정지시키기 위하여 첨가되었다. HPLC는 대략 70% 생성물을 나타냈다. 상기 용매는 증발되었고 CH3CN(200mL)을 넣어 가루로 만들었다. 그것의 잔여물은 CHCl3(1.5L)에서 용해시켰고 포화상태의 NaHCO3(2x500mL) 및 NaCl(2x500mL)을 사용하여 추출되었다. 유기물의 상태는 Na2SO4로 건조되어, 여과되었고, 그리고 증발되었다. 275g의 잔여물이 생겼다. 상기 잔여물은 3.5kg의 실리카 젤 칼럼에서 정제되었으며, 0.5% Et3NH를 함유한 EtOAc/헥산/아세톤(5:5:1)으로 희석되었다. 164g의 생성물을 제공하기 위해 미량의 순수한 것들이 증발되었다. 183g(57%)의 총 수율을 제공하기 위해서 약 20g의 부가적인 양을 불순한 미량의 것들로부터 얻었다.
3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸루리딘
2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸루리딘(106g, 0.167M), DMF/피리딘(562mL의 DMF 와 188mL의 피리딘이 3:1인 750mL의 혼합물) 및 아세틱 안하이드리드(24.38mL, 0.258M)를 결합시켜, 상온에서 24시간 동안 교반시켰다. 상기 반응은 MeOH를 첨가시킨 tlc 샘플을 첫 번째 ??칭(quenching)하여 tlc에 의해 점검되었다. 상기 반응의 완료 후, tlc로 판단할 때, MeOH(50mL)를 첨가하며 상기 혼합물을 35℃에서 증발시켰다. 상기 잔여물은 CHCl3(800mL)에서 용해되었고 포화상태의 소듐 바이카보네이트 2x200mL 및 포화상태의 CHCl32x200mL로 추출되었다. 상기 결합된 유기물은 황화나트륨으로 건조되었고 122g의 잔여물(대략 90% 생성물)이 주어졌다. 상기 잔여물은 3.5kg의 실리카 젤 칼럼에서 정제되었고 EtOAc/헥산(4:1)을 이용하여 희석되었다. 순수한 생성물은 96g(84%)을 산출하도록 증발되었다.
3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸-4-트리아졸우리딘
CH3CN(700mL)에서 3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸루리딘(96g, 0.144M)을 용해시킨 첫 번째 용액을 준비했다. 트리에틸아민(189mL, 1.44M)을 CH3CN(1L)에 트리아졸 용액(90g, 1.3M)에 첨가시키고, -5℃로 냉각시켰으며, 그리고 오버헤드 교반기(overhead stirrer)를 이용하여 30분 동안 교반시켰다. POCl3을 0 내지 10℃를 유지하는 교반 용액에 30분 이상 동안 방울로 떨어뜨리면서 첨가하였으며, 합성된 혼합물은 부가적으로 2시간 동안 교반되었다. 상기 첫 번째용액은 나중 용액에 45분 이상 동안 방울로 떨어뜨려 첨가되었다. 상기 합성된 반응 혼합물은 영하의 온도에서 밤새도록 보관되었다. 염류는 상기 반응 혼합물로부터 여과되었으며 상기 용액은 증발되었다. 그것의 잔여물은 EtOAc(1L)에서 용해되었으며 비용해성 고체는 여과에 의해 제거되었다. 상기 여과액은 1x300mL의 NaHCO3및 2x300mL의 포화상태의 NaCl로 세척되었으며 황화나트륨으로 건조되었고 증발되었다. 그것의 잔여물은 목적 화합물을 제공하기 위해 EtOAc로 가루로 만들어졌다.
2'-O-메톡시에틸-5'-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘
다이옥산(500mL)와 NH4OH(300mL)의 3'-O-아세틸-2'-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸-4-트리아졸우리딘(103g, 0.141M) 용액을 2시간 동안 상온에서 교반시켰다. 상기 다이옥산 용액은 증발되었고 그것의 잔여물은 MeOH(2x200mL)로 공비혼합되었다. 상기 잔여물은 MeOH(300mL)에서 용해되었고 2L 스테인레스 스틸 압력 용기로 옮겨졌다. NH3가스로 충전한 MeOH(400mL)를 첨가하고 상기 용기를 100℃에서 2시간 동안 가열했다(tlc는 완전한 변환을 나타냈다). 상기 용기의 내용물은 건조하게 증발되고, 그것의 잔여물은 EtOAc(500mL)에서 용해되며 포화상태의 NaCl(200mL)로 한번 세정된다. 상기 유기물은 황화나트륨에서 건조되고 상기 용액은 목적 화합물의 85g(95%)를 제공하기 위하여 증발되었다.
N 4 -벤조닐-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘
2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틀-5-메틸시티딘(85g, 0.134M)은 DMF (800mL)에서 용해되었으며 벤조익 안하이드리드(37.2g, 0.165M)는 교반작용과 함께 첨가되었다. 3시간 동안의 교반작용 후에, tlc는 거의 95%로 완벽하게 상기 반응을 나타내었다. 상기 용액은 증발되었으며, 그것의 잔여물은 MeOH(200mL)로 공비혼합되었다. 상기 잔여물은 CHCl3(700mL)에서 용해되었으며, 포화상태의 NaHCO3(2x300mL) 및 포화상태의 NaCl(2x300mL)로 추출되었고, MgSO4로 건조되었으며, 그리고 잔여물(96g)이 제공되도록 건조되었다. 상기 잔여물은 희석 용제로 0.5% Et3NH가 함유된 EtOAc/헥산(1:1)을 이용하여 1.5kg 실리카 칼럼에서 크로마로그래피를 했다. 미량의 순수한 생성물은 목적 화합물의 90g(90%)를 제공하기 위해 증발되었다.
N 4 -벤조닐-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘-3'-아미디트
N4-벤조닐-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘(74g, 0.10M)은 CH2Cl2(1L)에서 용해되었다. 테트라졸 디이소프로필라민(7.1g) 및 2-시아노에톡시-테트라-(이소프로필)포스피에이트(40.5mL, 0.123M)는 질소 대기 상태에서 교반작용으로 첨가되었다. 상기 반응 혼합물은 상온에서 20 시간 동안 교반되었다(tlc는 95% 완벽한 반응을 나타냈다). 상기 반응 혼합물은 포화상태의 NaHCO3(1x300mL)및 포화상태의 NaCl(3x300mL)로 추출되었다. 상기 수용성 세척은 CH2Cl2(300mL)로 역-추출되었고, 상기 추출물은 결합되었고, MgSO4에서 건조되었고, 그리고 농축되었다. 상기의 잔여물은 희석 용제로 EtOAc/헥산(3:1)을 이용하여 1.5kg 실리카 칼럼에서 크로마로그래피를 했다. 미량의 순수한 생성물은 목적 화합물의 90.6g(87%)를 제공하기 위하여 결합되었다.
정 제
제어된 포아 글래스 칼럼(Applied Biosystems)으로부터 절단한 후 및 18시간 동안 55℃하에서 농축된 암모니움 하이드록시드에서 deblocking 후, 올리고뉴클레오티드를 2.5 배의 부피의 에탄올을 가지고 0.5M NaCl로 두번 침전하여 정제시켰다. 분석적 젤 전기영동은 20% 아크릴아마이드, 8M 우레아, 45mM 트리스-보레이트 완충액 및 pH7.0에서 이루어졌다. 올리고데옥시뉴클레오티드 및 그것의 포스포로티오에이트 유사체는 전체 길이의 80% 이상이 전기영동으로 판독되었다.
염기서열을 가진 일련의 올리고뉴클레오티드들은 사람의 B7-1(hB7-1) 및 설치류의(mB7-1) mRNA 염기서열(Freemanet al.,J. Immunol., 1989,143, 2714 및 Freemanet al.,J. Exp. Med., 1991,174, 625에서 각각 개시된)을 잡종화할 수 있게 고안되었다. 상기 올리고뉴클레오티드에 대한 염기서열, 그것의 변형 및 hB7-1 mRNA에 있어서 각각의 올리고뉴클레오티드의 표적 부위의 위치는 표1 및 2에서 제공된다. 이와 유사하게, 염기서열이 개시된 사람의 B7-2(hB7-2) 및 설치류의B7-2(mB7-2) mRNA(Azumaet al.,Nature, 1993,366, 76 및 Chenet al.,J. Immunol., 1994,152,4929 에서 각각 개시된)를 잡종화할 수 있게 고안된 염기서열을 가진 일련의 올리고뉴클레오티드가 합성되었다. 상기 올리고뉴클레오티드의 염기서열 및 , 그것의 변형 및 hB7-2 mRNA에 있어서 각각의 올리고뉴클레오티드의 표적 부위의 위치는 표3 및 4에 나타내었다. ISIS 2302(서열 번호: 17)를 포함하는, 티센스 올리고뉴클레오티드는 ICAM-1에 표적된 것으로, 여기에서 참고로 인용된 미국특허 제5,514,788호(1993. 5. 17 출원 및 1996. 5. 7 등록)에 개시되어 있다. ISIS 1082(서열 번호: 102) 및 ISIS 3082(서열 번호: 101)는 이전에 기재하였다(Stepkowskiet al.,J. Immunol., 1994, 153, 5336).
상기의 것들의 초기 클로닝 후에, B7 전사체의 선택적인 스플라이싱이 이루어진다는 것이 알려졌다. 상기 알려진 B7-1에 대한 선택적 스플라이싱은, 원래 알려진 사람 및 설치류의 B7-1 cDNA 염기서열의 5' 말단에서 메시지에 있어서 5'이 신장되는 것에 비하면, 상대적으로 간단하다(Borrielloet al., J. Immunol., 1994,153, 5038 및 Inobeet al.,J. Immunol., 1996,157, 588). B7-1 염기서열을 처음으로 밝힌 참고문헌에서 발견된 B7-1 염기서열의 수를 유지하기 위해, 5' 신장 안의 초기에 알려진 염기서열의 위치를 표1 및 2에서는 음수(-1 위치를 시작으로, 대부분의 5' 신장의 3' 염기)로 제공하였다. 설치류의 B7-2의 전사 과정은 B7-1에 대해 알려진 것 보다 훨씬 복잡하다; 예를 들어, 최소한 다섯 개의 별개의 설치류의 B7-2 mRNAs 및 최소한 별개의 두개의 사람 B7-2 mRNAs는 선택적인 스플라이싱에 의해 생산될 수 있다(Borriello et al.,J. Immunol., 1995,155, 5490;Freemanet al., 제WO 95/03408호(1995. 2. 2 공개); 및 Jelliset al.,Immunogenet., 1995,42, 85). 상기 스플라이싱의 특성은 상이한 5' 엑손이 별개의 B7-2 mRNAs를 생산하는데 사용된다는 것이며, 각기 독특한 5' 염기서열을 가지며, 초기에 알려진 B7-2의 염기서열의 전부 혹은 여러 개를 포함하는 3' 부분의 일정 부분을 가지고 있다는 것이다. 결과적으로 B7-2 메시지의 5' 신장 내의 위치는 초기에 알려진 염기서열 내의 위치에 대해서 특별하게 관련되지 않을 수 있다. 따라서, 초기에 알려진 B7-2 염기서열에 포함되지 않은 표적된 염기서열 자리를 특이화하기 위해, 표3의 상이한 등위 배열(제WO 95/03408호의 서열 번호: 1 에 대응하는) 및 표4의 엑손의 수(Borrielloet al.,J. Immunol., 1995,155, 5490)가 사용된다. 더 나아가, 이러한 5' 신장 메세지는 초기에 개시된 염기서열을 지시하는 것으로부터 포텐셜 인-프레임(in-frame) 개시 코돈 상류를 포함하지만, 간단하기 때문에, 그러한 부가적인 포텐셜 개시 코돈들은 표1 내지 4의 표적 부위에 대한 기재에 나타내지 않았다.
표1 내지 4에서는, 다음의 약어가 사용된다: UTR, 비해독 영역; ORF, 오픈 리딩 프레임; tIR, 해독 개시 영역; tTR, 해독 종결 영역; 및 FITC, 플루어레신 이소티오시아네이트. 화학적 변형은 하기와 같이 나타난다. 각각의 약어가 나타내는 여러 변형의 형태와 함께, 2' 플루오로(2'F), 2'-메톡시(2'MO) 혹은 2'-메톡시에톡시(2'ME)을 함유하는 잔여물의 변형이 대담하게 이루어진다. 달리 지시된 것이 없다면, 잔여물간 결합은 포스포디에스테르 결합이다; 포스포로티오에이트 결합은 수퍼스크립트(superscript) 위치(예를 들어, TsA)에서 "S"가 나타내는 것이다. 표적 위치들은 Freemanet al.,J. Immunol., 1989,143:2714(사람의 B7-1 cDNA 염기서열; 표1), Freemanet al.,J. Exp. Med., 1991,174,625(설치류의 B7-1 cDNA 염기서열; 표2), Azumaet al.,Nature, 1993,366:76(사람의 B7-2 cDNA 염기서열; 표3) 및 Chenet al.,J. Immunol., 1994,152:4929(설치류의 B7-2 cDNA 염기서열; 표4)에 의해서 그 수가 정해진다. 뉴클레오티드 염기 코드들은 37 C.F.R.§1.822(b)(1)에서 제시된 바와 같다.
cDNA 클론
사람의 B7-1에 대한 염기서열을 암호화하는 cDNA는 역전사/중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 이용하여 분리되었다. 다우디(Daudi) 세포의 폴리 A+ RNA(ATCC 수탁 번호 CCL 213)는 표준 상태에서 올리고-dT 프라이머를 사용하여 역전사되었다. 42℃에서 30분간의 반응과 heat inactivation 후에, 상기 반응 혼합물(20μL)을 100μL가 되도록 물로 채웠다. 그리고 나서 상기 RT 반응으로부터 10μL 분주된 것을5' 프라이머 즉,
5'-GAT-CAG-GGT-ACC-CCA-AAG-AAA-AAG-TGA-TTT-GTC-ATT-GC-3'(센스, 서열 번호: 20) 및 3' 프라이머 즉,
5'-GAT-AGC-CTC-GAG-GAT-AAT-GAA-TTG-GCT-GAC-AAG-AC-3'(안티센스, 서열 번호: 21)을 이용하여 50μL에서 PCR 반응으로 증폭시켰다.
PCR 생성물을 pcDNA-3 벡터(Invitrogen, San Diego, CA)내로 서브클로닝하기 위해 상기 프라이머들은 독특한 제한 부위를 포함하고 있었다. 상기 5' 프라이머는 이미 개시된 사람의 B7-1 염기서열의 1 내지 26의 염기들(Freemanet al.,J. Immunol., 1989,143, 2714; 프라이머의 13 내지 38 위치)과 동일성을 가지도록, 그리고 클로닝에 이용되도록 Kpn I 제한 부위(상기 프라이머의 7 내지 12 위치)를 포함하도록 고안되었다. 상기 3' 프라이머는 이미 개시된 B7-1에 대한 염기서열의 1450 내지 1471의 염기들(상기 프라이머의 14 내지 35 위치)과 상보성을 이룰 수 있도록, 그리고 Xho I 제한 부위(상기 프라이머의 7 내지 12 위치)를 포함하도록 고안되었다. PCR 후에, 상기 반응은 페놀로 추출되어, 에탄올을 이용하여 침전되었다. 상기 생성물은 적절한 제한 효소에 의해 분해되었으며, 풀-렝스(full-length) 절편은 아가로스 젤에 의해 정제되었고 같은 효소로 분해되어 제공된 pcDNA-3 벡터(Invitrogen, San Diego, CA)내로 라이게이션되었다. 결과적 구성물인, pcB7-1은 제한효소 지도와 표준 절차를 이용한 DNA 염기서열 분석에 의해 확인되었다. 쥐의 B7-1 클론 즉, pcmB7-1은 설치류의 B-림프구 세포주, 70Z3에서 분리된 RNA의 RT-PCR의 방법과 유사한 방법으로 분리되었다.
사람의 B7-2에 대한 염기서열을 암호화하는 cDNA의 1 내지 1391의 위치는 RT-PCR에 의해 분리되었다. 다우디(Daudi) 세포의 폴리 A+ RNA(ATCC 수탁 번호 CCL 213)는 표준 상태에서 올리고-dT 프라이머를 사용하여 역전사되었다. 42℃에서 30분간의 반응과 heat inactivation 후에, 상기 반응 혼합물(20μL)을 100μL가 되도록 물로 채웠다. 그리고 나서 상기 RT 반응으로부터 10μL 분주된 것을 5' 프라이머 즉,
5'-GAT-CAG-GGT-ACC-AGG-AGC-CTT-AGG-AGG-TAG-GG-3'(센스, 서열 번호: 1) 및 3' 프라이머 즉,
5'-GAT-AGC-CTC-GAG-TTA-TTT-CCA-GGT-CAT-GAG-CCA-3'(안티센스, 서열 번호: 2)을 이용하여 50μL에서 PCR 반응으로 증폭시켰다.
상기 5' 프라이머는 개시된 B7-2 염기서열의 1 내지 20의 염기들(Azumaet al.,Nature, 1993,366,76 및 Genbank Accession No. L25259; 상기 프라이머의 13 내지 32 위치)과 동일성을 가지며 클로닝에 이용되도록 Kpn I 부위(상기 프라이머의 7 내지 12 위치)를 포함하도록 고안되었다. 상기 3' 프라이머는 이미 알려진 B7-2의 염기서열의 1370 내지 1391의 염기들(상기 프라이머의 13 내지 33의 위치)에 대해 상보성을 가지고, Xho I 제한 부위(상기 프라이머의 7 내지 12의 위치)를 포함하도록 고안되었다. PCR이 이루어진 후에, 상기 반응은 페놀로 추출되어 에탄올을 이용하여 침전되었다. 상기 생성물은 Xho I 및 Kpn I으로 분해되었고, 풀-렝스 절편은 아가로스 젤에 의해 정제되었으며 같은 효소로 분해되어 준비된 pcDNA-3 벡터(Invitrogen, San Diego, CA)내로 라이게이션되었다. 결과적 구성물인, pcB7-2는 제한효소 지도와 표준 절차를 이용한 DNA 염기서열 분석에 의해 확인되었다.
쥐의 B7-2 클론 즉, pcmB7-2는 P388D1 세포로부터 분리된 RNA의 RT-PCR의 유사한 방법으로 5' 프라이머 즉,
5'-GAT-CAG-GGT-ACC-AAG-AGT-GGC-TCC-TGT-AGG-CA(센스, 서열 번호: 99) 및 3' 프라이머,
5'-GAT-AGC-CTC-GAG-GTA-GAA-TTC-CAA-TCA-GCT-GA(안티센스, 서열 번호: 100)를 이용하여 분리되었다.
상기 5' 프라이머는 개시된 설치류의 B7-2 염기서열의 1 내지 20의 염기들과 동일성을 갖지만, 반면에 3' 프라이머는 1096 내지 1115의 염기들과 상보적이다(Chenet al.,J. Immun., 1994,152, 4929). 이 두 가지 프라이머 모두는 cDNA 클론을 제공하기 위하여 사용된 또 다른 5' 및 3' 프라이머에서 발견된 각각의 제한 효소 부위와 관련된다. 상기 RT-PCR 생성물은 Xho I 및 Kpn I으로 잘라지고 pcDNA-3(Invitrogen, San Diego, CA)내에서 라이게이션되었다.
선택적 스플라이싱으로 이루어진 mRNA와 대응되는, 다른 cDNA 클론들은 적절한 제한 부위를 포함하는 프라이머를 사용하는 지, 그리고 선택된 B7 mRNA와 (5' 프라이머와의) 동일성 혹은 (3' 프라이머에 대한) 상보성을 갖는 지에 따라서 클로닝된다.
실시예 2: 올리고뉴클레오티드에 의한 hB7-1 발현의 조절
B7-1 발현을 저해하는 올리고뉴클레오티드의 능력은 플로우 시토메트리(flowcytometry)에 의해 형질감염된 COS-7 세포에 있어서 B7-1의 세포 표면 발현을 측정하는 것으로 감정되었다.
방 법
COS-7 세포(ATCC 수탁 번호 CRL 1651)는 T-175 플라스크에서 75%가 채워지도록 배양되었다. 상기 플라스미드 pcB7-1은 표준 칼슘 포스피에이트 형질감염에 의해 세포로 삽입되었다. 4시간의 형질감염 후에, 상기 세포들은 트립신을 처리하여 12-웰 디시(12-well dishes)에서 80%가 채워지도록 배양되었다. 상기 세포들은 1시간동안 플라스틱에 고착되도록 하였으며 포스피에이트-완충된 샐라인(PBS)으로 세척되었다. OptiMEMTM(GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) 배지에 15μg/mL의 LipofectinTM(GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD)과 지시된 농도의 올리고뉴클레오티드를 첨가했다. 그로부터 추가적으로 4시간 후에, 상기 세포들은 포스피에이트-완충된 살린(PBS)으로 세척되어, 같은 농도에서 순수한 올리고뉴클레오티드와 함께 10%의 우 태아 혈청(FCS)을 포함한 DMEM(Dulbeccoet al.,Virol., 1959,8, 396; Smithet al.,Virol., 1960,12, 185)내에서 배양되었다.
B7-1의 세포 표면 발현에 대한 올리고뉴클레오티드의 효과를 점검하기 위하여, 처리된 COS-7 세포들을 올리고뉴클레오티드 투여 후에 24 내지 48 시간동안 짧게 트립신처리를 하여 긁어모았다. 상기 세포들을 PBS로 세척한 후에 컨쥬게이트된 안티-B7-1-항체(예를 들어, 안티-hCD80-FITC, Ancell, Bayport, MN; FITC: 플루어레신 이소티오시아네이트) 5μL와 함께 100μL의 염색 완충액(PBS, 0.2% BSA,0.1% 아지드)에 부유시켰다. 상기 세포들은 4℃에서 30분 동안 염색되었고, PBS로 세척하여, 0.5%의 파라포름알데히드를 함유하는 300μL에 부유시켰다. 세포들을 모았고, 플루어레신의 자취는 플로우 시토메트리를 이용하여 측정되었다.
결 과
표1에서 나타나는 상기 올리고뉴클레오티드들은 B7-1 cDNA를 일시적으로 발현하는 COS-7 세포에 있어서, B7-1 발현을 저해하는 능력이 측정되었다. 결과(도1)를 보면 B7-1 발현이 50% 이상이 저해된 가장 활성화된 올리고뉴클레오티드로서, 해독 개시 코돈 영역에 표적된 ISIS 13805가 동정되었고, 3' 비해독 영역(UTR)에 표적된 ISIS 13812가 동정되었다. 이와 같은 상기 올리고뉴클레오티드들이 가장 바람직하다. ISIS 13799(5' 비해독 영역에 표적된), ISIS 13802(5' 비해독 영역에 표적된), ISIS 13806과 ISIS 13807(ORF의 5' 영역에 둘 다 표적된) 및 ISIS 13810(ORF의 중심 부분에 표적된)은 B7-1 발현의 35 내지 50% 저해를 나타냈다. 그러므로 상기 염기서열들도 역시 바람직하다.
올리고뉴클레오티드 ISIS 13800은 플로우 시토메트리 검정법에 의해 B7-1 발현에 본질적인 저해를 보이지 않는 것으로 나타났으며 ISIS 13805 및 13812는 올리고뉴클레오티드의 여러 농도에서 B7-1의 세포 표면 발현을 저해하는 능력을 가진 것으로 측정되었다. 도2는 상기 검정법의 결과들을 나타낸 것이다. ISIS 13812는 대략 150mM의 IC50과 함께 B7-1 발현의 강력한 저해자였다. 5' UTR에 표적되는 ISIS 13800은 본질적으로 불활성하였다.
실시예 3: 올리고뉴클레오티드에 의한 hB7-2 단백질의 조절
초기 스크린에서, B7-2 발현을 저해하는 hB-2 올리고뉴클레오티드의 능력은 형질감염된 COS-7 세포들의 B7-2의 세포 표면 발현을 플로우 시토메트리로 측정하여 감정되었다. 상기 방법들은 (1) COS-7 세포들을 표준 칼슘 포스피에이트 형질감염에 의해 세포안으로 삽입된 플라스미드 pbcB7-2 또는 BBG-58, 사람의 ICAM-1(CD54) 발현 벡터(R&D Systems, Minneapolis, MN)로 형질감염시켰던 것, (2) 표2에서 나타낸 상기 올리고뉴클레오티드 및 (3) 컨쥬게이트된 안티-B7-2 항체(예를 들어, 안티-hCD86-FITC 혹은 안티-CD86-PE, PharMingen, San Diego, CA; PE: 조홍소)가 플로우 시메트리를 이용하는 동안 사용되었던 것을 제외하고는, 실시예 2에서 제공하는 것들과 유사하다.
결 과
도3은 결과들을 나타낸 것이다. 200nM의 농도에서, ISIS 9133, ISIS 9139 및 ISIS 10373은 50% 이상의 저해 활성을 나타냈으므로 가장 바람직하다. 상기 올리고뉴클레오티드들은 3' 비해독 영역(ISIS 9133), 해독 개시 코돈 영역(ISIS 9139) 및 5' 비해독 영역(ISIS 10373)에 표적된다. 같은 농도에서, 상기 ISIS 9133, ISIS 9139 및 ISIS 10373과 대조되는, 각각의 ISIS 10715, ISIS 10716 및 ISIS 10721은 저해 활성을 보이지 않는 것으로 나타났다. ISIS 10367 및 ISIS 10369로 처리한 것은 25% 이상의 저해를 나타냈으므로 상기 올리고뉴클레오티드들 또한 바람직하다. 상기 올리고뉴클레오티드들은 5'(ISIS 10367) 및 3'(ISIS10369) 비해독 영역에 표적된다.
실시예 4: 올리고뉴클레오티드에 의한 hB7-2 mRNA의 조절
방 법
리보뉴클레아제 보호 검정법을 위하여, 세포들은 올리고뉴클레오티드의 처리가 완료된 다음, 18시간이 지난 후에 긁어모아 전체 RNATM키트(Ambion, Austin, TX)를 이용하였다. 상기 검정법의 프로브는 플라스미드 pcB7-2(Bgl II로 절개된 선형의) 및 pTRI-b-actin(Ambion Inc., Austin, TX)로부터 얻어졌다. 시험관내에서, SP6 프로모터로부터 선형의 플라스미드 전사는 α-32P-UTP(800 Ci/mmole)의 존재 하에서 B7-1의 3' 말단(1044 내지 1391 위치)에 상보적인 안티센스 RNA를 생성하도록 하였다. 상기 프로브는 DNA 주형을 제거하기 위하여 DNase I으로 처리를 한 후에 젤-정제되었다. 제조업자의 지침에 따라서 RPA IITMkit(Ambion)을 이용하여 리보뉴클레아제 보호 검정법을 실시하였다. 전체 RNA(5μg)는 밤새, 42℃에서 B7-2 프로브 혹은 대조 베타-엑틴 프로브의 105cpm으로 잡종화되었다. 상기 잡종화 반응은 30분간 37℃에서 RNase A 0.4 unit와 RNase T1 2 unit로 더 처리되었다. 보호된 RNA는 침전되었고, 10μL의 젤 로딩 완충액에 재부유시켰으며, 그리고 20W에서 50% w/v 우레아를 함유한 6% 아크릴아마이드에서 전기영동하였다. 필수적으로 제조업자의 지침에 따라서 PhosphorImager(Molecular Dynamices, Sunnyvale,CA)를 이용하여 상기 젤이 노출되었고 줄(lane)들도 측량되었다.
결 과
올리고뉴클레오티드-매개된 hB7-2 mRNA 조절 범위는 hB7-2 단백질에 대해 나타나는 효과들과 일반적으로 비슷하다(표5). 단백질 발현 검정법(플로우 시토메트리)에 의해, 가장 활성이 있는 올리고뉴클레오티드들은 ISIS 9133, ISIS 9139 및 10373이었다. 시험된 올리고뉴클레오티드들은 그 어떤 것도 같은 세포들에서 b-엑틴 mRNA 발현에 저해 효과를 나타내지 않았다.
hB7-2 mRNA에 표적된 올리고뉴클레오티드의 활성
ISIS # 서열 번호 % Control Protein % Control RNA Expression
9133 3 70.2 46.0
9134 4 88.8 94.5
9135 5 98.2 83.4
9136 6 97.1 103.1
9137 7 80.5 78.1
9138 8 86.4 65.9
9139 9 47.9 32.6
10367 10 71.3 52.5
10368 11 81.0 84.5
10369 12 71.3 81.5
10370 13 84.3 83.2
10371 14 97.3 92.9
10372 15 101.7 82.5
10373 16 43.5 32.7
실시예 5: 첨가된 hB7-1 및 hB7-2 올리고뉴클레오티드
초기 스크리닝 동안에 동정된 상기 올리고뉴클레오티드와 관련성 있게 변형된 구조 및/혹은 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들을 준비했다. 이러한 올리고뉴클레오티드들은 앞의 실시예에서 제공한 방법을 이용하여 사람의 B7-2 발현을 조절하는 능력에 대해 측정되었다.
ISIS 10996 즉, ISIS 10373의 20개의 뉴클레오티드 염기서열에서 얻어낸 15 개의 뉴클레오티드 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 준비하였고 측정했다. ISIS 10996은 15개의 뉴클레오티드, 즉 ISIS 10373의 염기서열에 포함된 5'-GCG-AGC-TCC-CCG-TAC(서열 번호: 90)를 이루고 있다. ISIS 10373 및 10996은 Azumaet al.(Nature, 1993,366, 76)에서 개시된 hB7-2의 염기서열의 1 내지 67의 염기를 포함하는 B7-2 메세지에 위치한 포텐셜 스템-루프 구조와 중복된다. 상기의 작용 모드(들)에 관한 어떤 특정한 이론에 얽매이지 않더라도, ISIS 10373 및 10996은 루프 1 pseudo-half-knots로서 표적 RNA 내의 2차 구조에 결합될 수 있는 가능성을 가지고 있다. 1996. 4. 30 등록된 미국특허 제5,152,438호는 여기에서 참고로 기재된 바 있으며, pseudo-half-knots의 형성에 의해 유전자 발현을 조절하는 방법을 개시하였다. 상기의 작용 모드(들)에 상관 없이, 15-mer ISIS 10996은 ISIS 10373 보다 더 짧은 길이를 가지고 있음에도 불구하고, B7-2 단백질 발현 검정법에서 20-mer 보다 더욱 활성을 나타냈다(도4; ISIS 10721은 ISIS 10373과 대조적이다). 관련된 16-mer인 ISIS 10889는 B7-2 단백질 발현 검정법에서 활성을 나타냈다. 그러나, 구조적으로 관련된 14-mer(ISIS 10995), 13-mer(ISIS 10994), 12-mer(ISIS 10993), 11-mer(ISIS 10992) 및 10-mer(ISIS 10991)는 이 검정법에서 활성을 거의 나타내지 않거나 아예 활성이 나타나지 않았다. ISIS 10996은 하기의 방법으로 유도되었다.
2' 메톡시에톡시 치환체를 갖는 ISIS 10996은 완벽하게 치환된 유도체(ISIS 11539), "갭머"(ISIS 11541 및 11543) 및 "윙머"(ISIS 11545 및 11547)를 포함하도록 제공되었다. 실시예 5에서 기재된 바와 같이, 2' 메톡시에톡시 치환체는 여러 뉴클레아제(예를 들어, RNase H)의 기작을 방해하지만 표적 RNA 분자에 대해 변형된 올리고뉴클레오티드의 친화력을 향상시킨다. 실시예 3, 4, 7 및 8의 방법에 따라 상기 올리고뉴클레오티드들의 hB7-2 메세지 혹은 기작을 조절하는 능력이 분석되었다.
ISIS 10996 유도체들은 표적 RNA 분자, 예를 들어, hB7-2 메세지에 RNase L을 보충할 수 있는 능력을 분석하기 위해 제공되었다. RNase L 는 (2'-5')(A)n에 의해 활성되며,활성 위에서 (2'-5')(A)n합성효소에 의해 ATP로부터 차례로 생성되는 것, 예를 들어, 인터페론과 같은 것에 결합한다.
RNase L은 항바이러스성 기작 및 세포 성장의 조절에 관련해 왔다(Sawai,Chemica Scripta, 1986,21,169; Charachonet al.,Biochemistry, 1990,29, 2550). (2'-5')(A)n에 컨쥬게이트된 안티-B7 올리고뉴클레오티드의 결합은 RNase L의 활성 및 상기 올리고뉴클레오티드 염기서열과 상보적인 B7 메세지를 표적하는 것이 예상된다. 다음 올리고뉴클레오티드들은 동일한 염기서열(즉, ISIS 10996의 염기 서열) 및 그것들의 5' 말단의 동일한 (2'-5')(A)4"캡"을 가진다: ISIS 12492, 12495, 12496 및 13107. 아데노실 잔기는 3' 하이드록실기를 가지며 포스포로티오에이트 결합에 의해 서로 결합한다. 상기 올리고뉴클레오티드의 (3'-5') 부위는사람의 B7-2 RNA의 부위에 상보적인 염기서열을 가지며, 상기 올리고뉴클레오티드의 (3'-5') 부위의 5' 잔기에서 또 다른 포스포로티오에이트 결합을 거쳐서 상기 "캡"에 결합된 n-아미노헥실 링커까지 포스포로티오에이트 결합을 통해 (2'-5')(A)4"캡"에 컨쥬게이트된다. RNase L을 특이한 메세지에 보충시키는 능력에 대해 이 형태의 화학적으로 다양한 올리고뉴클레오티드의 다양성을 분석하기 위하여, 다양한 상이한 화학적 변형이 하기와 같이 4개의 올리고뉴클레오티드를 이렇게 배치시켰다. ISIS 12496은 상기 올리고뉴클레오티드의 (3'-5') 부위에서 변형이 되지 않은 올리고뉴클레오티드로 구성되었다. ISIS 13107에 있어서, 포스포로티오에이트 결합은 자연적으로 핵산을 생성시키는 것에서 발견되는 포스피에이트 결합과 대치된다. 포스포로티오에이트 결합들은 ISIS 12492 및 12495에서도 사용되며, 부가적으로 2'-메톡시에톡시 치환체를 가지고 있다. 상기 올리고뉴클레오티드들은 실시예 3, 4, 7 및 8의 방법에 따라 hB7-2 메세지 및 기능을 조절하는 능력이 분석된다.
2' 위치에서 변형을 하는 ISIS 10996 유도체들을 준비하여 분석하였다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드들은 ISIS 11539(완전한 2'-O-메틸), ISIS 11541(2'-O-메틸 "윙" 및 중심 7-염기 "갭"을 포함하는), ISIS 11543(9-염기 갭을 가지고 있는 2'-O-메틸 윙), ISIS 11545(5' 2'-O-메틸 윙을 포함하는) 및 ISIS 11547(3' 2'-O-메틸 윙을 포함하는)을 포함했다. 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드의 검정 결과는 다음과 같다. ISIS 11539 즉, ISIS 10996의 완전한 메틸 변형(version)은 단백질발현 검정법에서 결국 활성을 나타내지 못했다. 갭된, 그리고 윙된(winged) 올리고뉴클레오티드들(ISIS 11541, 11543, 11545 및 11547)은 200nM에서 여러 활성을 나타냈지만(즉, 처리되지 않은 세포에 대해 60% 내지 70%의 발현), 원래의 화합물 즉, ISIS 10996에서 나타난 것(즉, 약 50% 발현)보다는 적게 나타났다. RNA 발현 검정에서도 유사한 결과들이 나타났다.
ISIS 10782 즉, 5' n-아미노헥실 링커을 거쳐 컨쥬게이트된 콜레스테롤에 대한 ISIS 10373의 유도체가 준비되었다. 콜레스테롤과 같은 지용성 성분들은 여러 경우에서 올리고뉴클레오티드의 세포에 대한 흡착력을 증진시키는 것으로 알려져 왔으나, 흡착력이 증진된 범위가 어떤지는 예측할 수는 없다. ISIS 10782 및 지용성 성분을 포함하는 다른 올리고뉴클레오티드들은 실시예 3, 4, 7 및 8에 의한 방법으로 B7-2 메세지 혹은 기능을 조절하는 능력이 측정된다.
hB7-1 올리고뉴클레오티드의 2'-메톡시에톡시("2'ME") 및 2'-플루오라이드("2'F") "갭머" 유도체 ISIS 12361(ISIS 번호 12348 및 12473, 각각), ISIS 12362(ISIS 번호 12349 및 12474), ISIS 12363(ISIS 번호 12350 및 12475), ISIS 12364(ISIS 번호 12351 및 12476), ISIS 12365(ISIS 번호 12352 및 12477), ISIS 12366(ISIS 번호 12353 및 12478), ISIS 12367(ISIS 번호 12354 및 12479), ISIS 12368(ISIS 번호 12355 및 12480), ISIS 12369(ISIS 번호 12356 및 12481) 및 ISIS 12370(ISIS 번호 12357 및 12482)가 준비되었다. 상기 유도체들의 중심에 있는, 비-2'-변형 ("갭")부분은 상기 올리고뉴클레오티드가 표적 RNA에 결합될 때, RNase H 활성을 지지하지만, 2'-변형된 부분은 그렇지 않다. 그러나, 상기 올리고뉴클레오티드들의 2'-변형된 "윙"들은 그것들의 표적 RNA 분자들에 대한 친화력을 증진시킨다(Cook, Chapter 9In: Antisense Research and Applications, Crooke et al., eds., CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 171-172).
또 다른 2' 변형은 메톡시(MO)기가 바로 이 위치에서 삽입되는 것이다. 2'ME- 및 2'F-변형된 올리고뉴클레오티드와 같이, 이렇게 변형된 것은 상기 올리고뉴클레오티드와 그것들의 표적 RNA 분자로부터 형성된 듀플렉스 위의 RNase H 활성을 저해하지만, 표적 RNA 분자에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화력을 증진시킨다. ISIS 12914 및 12915는 본래의 hB7-1 전사체의 선택적 스플라이싱으로부터 생긴, 선택적인 hB7-1 mRNA 분자의 5' 비해독 영역에 대해 상보적인 염기서열을 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오티드들은 2'-메톡시 변형을 포함하며, 그러한 증진된 표적 친화력은 여러 조직들에서 적은 양으로 나타날 수 있는 선택적 스플라이싱이 이루어진 B7-1 mRNA 분자들에 대해 더욱 활성을 띠게 할 수 있다(Inobeet al.,J. Immun., 1996,157, 582). 이와 유사하게, ISIS 13498 및 13499는 다른 선택적 hB7-1 mRNAs에 대한 안티센스 염기서열을 이루고 있으며, 그것들의 표적 분자에 대한 친화력을 증진시키기 위하여 2' 메톡시에톡시 변형을 포함하고, 2'메톡시에톡시 및 2'메톡시 치환체들은 hB7-2 올리고뉴클레오티드 ISIS 12912, 12913, 13496 및 13497내로 결합된다. 이러한 올리고뉴클레오티드들은, 실시예 2의 방법에 따라서 hB7-1을 조절하는 능력이 측정되거나, 필요한 경우 표적 세포들이 적절하게 선택적으로 스플라이싱된 B7 전사체에 대응하는 cDNA 클론과 함께 형질감염되는 것만 제외하고는, 실시예 3, 4, 7 및 8의 방법에 따라서 hB7-2를 조절하는 능력이 측정된다.
실시예 6: 안티센스 조절의 특이성
본 발명의 여러 올리고뉴클레오티드들은 세포 표면 발현 플로우 시토메트리 검정법을 이용하여 B7-2에 대한 작용과 대비되는 B7-1을 위한 올리고뉴클레오티드의 특이성이 분석되었다. 이러한 올리고뉴클레오티드들은 B7-1 발현의 억제자인 ISIS 13812(도1; 실시예 2) 및 B7-2 발현의 억제자인 ISIS 10373(도3; 실시예 3)을 포함한 상기 검정법에 의해 분석되었다. 도5는 상기 검정법의 결과를 나타낸다. ISIS 13812는 B7-2 발현에서는 효과가 거의 없거나 아예 없었으며 B7-1 발현을 저해하였다. 또한 도5에서는, ISIS 10373은 B7-1 발현에서는 효과가 거의 없거나 아예 없었으며 B7-2 발현을 저해하였다. ISIS 13812와 대조적인 ISIS 13872(서열 번호: 37, AGT-CCT-ACT-ACC-AGC-CGC-CT) 및 ISIS 13809(서열 번호: 51)는 상기 검정법으로 분석된 결과, B7-1 또는 B7-2 중 하나에 대한 활성이 본질적으로 나타나지 않았다.
실시예 7: 항원 공여 세포(APC)에서의 올리고뉴클레오티드에 의한 hB7-2 발현의 조절
APC에 있어서 본래의 B7-2 유전자로부터 발현을 저해하는 ISIS 10373은 하기와 같이 측정되었다.
방 법
단핵세포들은 하기와 같이 올리고뉴클레오티드와 함께 배양되었고 처리되었다. 수상돌기 세포들(dendritic cells)을 위해서, EDTA-처리된 블러드(blood)를 PolymorphprepTM(1.113g/mL; Noycomed, Oslo, Norway)위에 깔고, 20℃에서 30분간 500x g으로 침전시켰다. 세포들을 PBS로 세척하였고 무혈청 RPMI로 세척한 후(Moore et al.,N.Y. J. Med., 1968,68, 2054), 5% 우 태아 혈청(FBS)이 함유된 RPMI에서 배양하였다. 단핵세포들은 1시간 동안 37℃에서 플라스틱 세포 배양 접시에 붙어서 선별되었다. 부착된 후, 세포들은 LipofectinTM(8μg/mL)를 함유하는 무혈청 RPMI에서 올리고뉴클레오티드와 함께 처리되었다. 4시간이 지난 후에, 세포들은 세척되었다. 그런 후에 5% FBS를 함유하는 RPMI 및 올리고뉴클레오티드들은 인터루킨-4(IL-4; R&D System, Minneapolis, MN)(66ng/mL) 및 그래뉼로사이트-대식세포 콜로니-스티뮬레이팅 인자(GM-CSF; R&D System, Minneapolis, MN)(66ng/mL)와 함께 분화를 촉진하기 위해 세포들에 첨가되었다(Romaniet al.,J. Exp. Med., 1994,180, 83, 1994). 세포들은 48시간 동안 배양되었고, 그런 후에 플로우 시토메트리에 의해 다양한 분자들의 세포 표면 발현이 측정되었다.
신선한 블러드로부터 분리된 단핵세포들은 양이온성 지질이 존재하는 상태에서 세포 흡착력을 증진시키기 위하여 올리고뉴클레오티드와 함께 처리되었다. 대조 올리고뉴클레오티드로서, ISIS 2302(ICAM-1 발현의 저해자; 서열 번호: 17)는 상기 세포들에게 투여되었다. B7-2 단백질의 발현은 실시예 2의 방법에 의해 플로우 시토메트리에 의해 측정되었다. 모노클론 항체들은 안티-hCD3(Ancell, Bayport, MN) 및 안티-HLA-DR(Becton Dickinson, San Jose, CA)이 포함된 상기의 실시예에서는 보여지지 않았다.
결 과
도6에서 나타난 바와 같이, ISIS 10373은 대략 250nM의 IC50과 함께 B7-2 발현에 있어서 막대한 저해 효과를 나타낸다. ISIS 10373이 1μM 투여되었을 때에는 ICAM-1 발현에 있어서 약간 효과를 보았다. ISIS 2303(서열 번호: 17) 즉, ICAM-1 발현이 저해되는 것으로 보여지는 대조 올리고뉴클레오티드는 B7-2 발현에 있어서는 효과가 없었으나, IC50을 약 250nM을 가한 후에는 ICAM-1은 급격히 감소되었다. 비슷한 상태 하에서, 플로우 시토메트리에 의해 측정된 것에 의하면, ISIS 10373은 B7-1, HLA-DR 혹은 CD3의 세포 표면 발현에 영향을 주지 못했다.
실시예 8: 올리고뉴클레오티드에 의한 T세포 증식의 조절
T세포 증식을 저해하는 ISIS 2302 및 10373의 능력은 하기와 같이 측정되었다. 올리고뉴클레오티드 및 시토키닌이 처리된 단핵세포(실시예 6과 같이)는 T세포 증식 검정법에서 APC로 이용되었다. 상기 분화된 단핵세포들은 분리된 공여체로부터 CD4+ T세포와 결합되었다. 48시간 후에, 증식은 [3H] 티미딘을 결합시켜 측정되었다.
방 법
T세포 증식 검정법에 있어서, 세포들은, 빠르게 이동하는 림프구를 포함하는 밴드(band)가 접촉면 아래로 모아진 것을 제외하고, 위에서 기재한 바와 같이, EDTA-처리된 전체 블러드로부터 분리되었다. 세포들은 NH4Cl 용해에 의해 적혈구가 제거된 후에, 실시예 6에서 기재된 바와 같이 세척되었다. T세포들은 T세포가 가득차 있는 칼럼(R&D System, Minneapolis, MN)으로 제조업자의 지침에 따라 정제되었다. 또한 제조업자의 지침에 따라 안티-CD8-컨쥬게이티드 마그네틱 비드(AMAC, Inc., Westbrook, ME)로 CD8+ 세포들을 감소시켜 CD4+ T세포들이 전체 T세포의 수로부터 상대적으로 많아졌다. T세포들은 Cy-chrome-컨쥬게이트된 안티-CD4 mAb(PharMingen, San Diego, CA)를 이용하여 플로우 시토메트리로 >80% CD4+가 되도록 측정되었다.
APC는 실시예 6에서 기재된 바와 같이 분리되었고 미토마이신 C(25μg/mL)를 1시간 동안 처리하였고, 그 후에 PBS로 3번 세척하였다. 그리고 나서 APC(105의 세포들)는 350μL의 배양 배지 내에서 4x104CD4+ T세포들과 함께 결합되었다. 지시된 바와 같이, 정제된 CD3 mAb는 1μg/mL의 농도에서 또 첨가되었다. 48시간의 배양 기간의 마지막 6시간 동안, 증식은 [3H]-티미딘의 1.5uCi의 흡착력을 결정함으로써 측정되었다. 상기 세포들을 필터 위로 모았고 방사선이 섬광 계수기에 의해 측정되었다.
결 과
도7에서 나타난 바와 같이, 시토킨-처리가 되지 않은 단핵세포들은 아마도 세포들 위에 공촉진 분자들 낮게 발현하기 때문에, T세포 증식이 미약하게 유도되었다. 그러나, 세포들을 시토킨으로 처리하여 수상돌기와 같은 세포(dendritic-like cells)로 분화되는 것을 유도하였을 때, ICAM-1 및 B7-2 둘 모두의 발현이 크게 향상되었다. 이것은 단핵세포의 유도가 이루어지기 전에 안티-ICAM-1(ISIS 2302) 또는 안티-B7-2(ISIS 10373) 올리고뉴클레오티드로 방해될 수 있는 강한 T세포 증식 반응의 결과를 나타냈다. 대조 올리고뉴클레오티드(ISIS 10721)은 T세포 증식에 미미한 효과를 나타냈다. 상기 안티-ICAM-1(ISIS 2302)과 안티-B7-2(ISIS 10373) 올리고뉴클레오티드로 이 둘을 결합시켜 처리한 것은 T세포 반응이 더욱 감소되었다.
실시예 9: 올리고뉴클레오티드에 의한 설치류의 B7 유전자의 조절
COS-7 세포에서 일시적으로 발현하는 설치류의 B7-2의 발현을 억제하는 능력을 갖는 올리고뉴클레오티드(표4)는 하기와 같은 방법으로 동정되었다. 설치류의 B7-2(mB7-2) cDNA에 상보적인 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 일련의 것들은 mB7-2 cDNA 클론과 함께 형질감염된 COS-7 세포에서 컨쥬게이트된 anti-mB7-2 항체(즉, 안티-mCD86-PE, PharMigen, San Diego, CA)를 제외하고는 실시예 2와 같이 플로우 시토메트리로 측정되어진 mB7-2의 수준을 감소시키는 능력에 대하여 스크리닝되었다. 안티-mB7-2 항체는 ATCC에 기탁되어 있는 수탁 번호 HB-253인 잡종세포에서 얻어질 수 있다. 설치류의 B7-1 발현을 조절하는 능력을 가진 올리고뉴클레오티드들(표2)은 컨쥬게이트된 안티-mB7-1 항체가 mB7-1 cDNA 클론으로 형질감염된 COS-7 세포와 함께 컨쥬게이트되는데 사용되는 것을 제외하고는 일상적으로 분리된다.
설치류의 B7-2에 있어서, 가장 활성을 띠는 동정된 올리고뉴클레오티드는 해독 개시 코돈(AUG)를 포함하는 부위인 cDNA의 96 내지 115 위치에 대하여 상보성이 있는, ISIS 11696(GGA-TTG-CCA-AGC-CCA-TGG-TG, 서열 번호: 18)였다. 도8은 ISIS 11696 및 대조적인 ISIS 11866(CTA-AGT-AGT-GCT-AGC-CGG-GA, 서열 번호: 19)에 대한 투여-반응 곡선이다. ISIS 11696은 200 내지 300nM의 범위의 IC50로 COS-7 세포에서 B7-2의 세포 표면 발현을 저해한 반면, ISIS 11866은 고농도(1000nM)에서도 20% 이하의 저해를 나타냈다.
설치류의 B7-2 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대하여 더 측정해 보기 위하여, IC-21 세포주가 사용되었다. IC-21 단핵세포/대식세포 세포주는 B7-1 및 설치류의 B7-2(mB7-2) 둘 모두를 구조적으로 발현한다. 리포폴리사카라이드(LPS; GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD)가 있는 상태에서 세포들을 배양하여 발현의 2-폴드(2-fold) 유도가 이루어질 수 있다(Hathcocket al.,Science, 1993,262, 905).
IC-21 세포들(ATCC; 수탁 번호 TIB 186)은 10% FCS를 함유한 DMEM 배지가 들어있는 12-웰 플레이트에서 80%가 채워지도록 배양되었다. 상기 세포들은 밤새 플레이트에 고착되게 놔두었다. 다음 날, 상기 배지를 제거하여 세포들을 PBS로 세척하였다. LipofectinTM(GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) 15 μg/mL를 보충한 OptiMEMTM(GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) 500μL는 각각에 첨가되었다. 올리고뉴클레오티드들은 상기 지시된 농도에서 배지로 직접 첨가되었다. 4시간의 배양 후에, 상기 세포들을 PBS로 세척하였고, LPS 15μg/mL를 보충한 배양 배지에서 밤새 배양시켰다. 다음 날, 세포들을 모은 후, 플로우 시토메트리를 이용해서 세포 표면 발현에 대한 분석을 실시하였다.
ISIS 11696 및 11866은 LipofectinTM((GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD)의 존재 하에 IC-21 세포들에게 투여되었다. 도9는 그 결과를 나타낸다. 10uM의 농도에서는, ISIS 11696은 완전하게 mB7-2 발현을 저해하지만(발현의 구성 수준 이하로mB7-2 수준이 감소되었으며), 반면에 대조 올리고뉴클레오티드인 ISIS 11866은 유도된 발현 수준에 있어서 단지 40%의 감소만을 나타냈다. 3uM의 농도에서는, 유도된 발현 수준이 ISIS 11696에 의해 크게 감소하였으나, 반면에 ISIS 11866은 적은 효과만을 나타냈다.
2' 치환체(예를 들어, 2' 메톡시 혹은 2' 메톡시에톡시)를 구성하는 변형된 올리고뉴클레오티드 및 설치류의 B7-1의 선택적인 전사체에 표적되는 것(ISIS 12914, 12915, 13498 및 13499) 혹은 설치류의 B7-2의 전사체에 표적되는 것(ISIS 13100, 13101 및 13102)을 준비했다. 상기 올리고뉴클레오티드들은 바람직하게 선택적으로 스플라이스된 B7 전사체에 대응되는 cDNA 클론으로 형질감염된 IC-21 세포 혹은 COS-7을 이용하여 상기의 방법을 철저하게 따라서 설치류의 B7을 조절하는 능력이 측정되었다.
실시예 10: 올리고뉴클레오티드에 의한 타가이식 거부 반응의 조절
심장 타가이식 거부 반응을 억제하는 능력을 가진 화합물을 측정하는 설치류의 모델은 이미 알려져 있다(Stepkowskiet al.,J. Immunol., 1994,153, 5336). 상기 모델은 B7 단백질에 단 하나에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 혹은 안티센스 올리고뉴클레오티드와 세포내 접착 분자-1(ICAM-1)가 결합했을 때 면역억제 능력을 측정하기 위하여 사용되었다.
방 법
심장 타가이식 거부 반응에 대한 연구 및 BALB/c 쥐(mice)의 올리고 뉴클레오티드 처리는 이전에 개시된 바와 같이 수행되었다(Stepkowskiet al.,J. Immunol., 1994,153, 5336). 안티센스 올리고뉴클레오티드들에는 ISIS 11696, ISIS 3082(ICAM-1에 표적된) 및 ISIS 1082(헤르페스 바이러스 UL-13 유전자 염기서열에 표적된 대조 올리고뉴클레오티드)가 포함되어 이용되었다. 투여된 양은 각각의 올리고뉴클레오티드의 1, 2, 2.5, 5 혹은 10mg/kg이다(하기에 지시된 바와 같이); 올리고뉴클레오티드들 간의 조합을 지시한 경우에는, 각 올리고뉴클레오티드는 1, 5, 혹은 10mg/kg의 투여량이 지시된다(각기, 전체 올리고뉴클레오티드 투여량의 2, 10 및 20mg/kg). 이식된 심장의 생존 기간 및 그것의 숙주는 체크되었고 기록되었다.
결 과
비처리된 쥐에 대한 평균 생존 기간은 8.2±0.8일(7, 8, 8, 8, 9, 9 일)이었다. ISIS 1082(서열 번호: 125, 대조 올리고뉴클레오티드와 관련이 없는)를 7일 동안 쥐에 처리한 결과 평균 생존 기간은 7.1±0.7일(5mg/kg/day; 6, 7, 7, 7, 8, 8) 혹은 7.0±0.8일(10mg/kg/day; 6, 7, 7, 8)로 약간 감소하였다. 설치류의 B7-2 올리고뉴클레오티드 ISIS 11696(서열 번호: 108)을 2번 투여하여 7일 동안 처리한 쥐는 평균 생존 기간이 9.3일(2mg/kg/day, 9.3±0.6일, 9, 9, 10; 10mg/kg/day, 9.3±1.3일, 8, 9, 9, 11)로 증가하였다. ICAM-1 올리고뉴클레오티드 즉, ISIS 3082를 가지고 여러 번 투여하여 7일 동안 처리한 쥐의 생존 기간은 증가되었다. 특히, 1mg/kg/day인 경우, 평균 생존 기간(MSD)이 11.0±0.0 (11, 11, 11)이었고; 2.5mg/kg/day인 경우에는 MSD가 12.0±2.7 (10, 12, 13, 16)이었으며, 5mg/kg/day인 경우, MSD가 14.1±2.7 (10, 12, 12, 13, 16, 16, 17, 17)이었으며; 그리고 10mg/kg/day인 경우, MSD가 15.3±5.8 (12, 12, 13, 24)이었다. 쥐에 7일 동안 ISIS 3082 및 11696을 각각 1mg/kg/day로 처리하였을 때 여러 가지 상승 효과를 볼 수 있었다: 이 경우 MSD는 13.8±1.0 (13, 13, 14, 15)을 나타내었다.
실시예 11: B7 단백질을 암호화하는 핵산의 검출
올리고뉴클레오티드들은 합성 후에 폴리뉴클레오티드 키나아제로 5' 말단에32P로 방사선 표지가 된다. Sambrooket al., "Molecular Cloning. A LaboratoryManual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Volume 2, pg. 11.31. B7 단백질을 암호화하는 핵산과 잡종화할 수 있는 방사선 표지된 올리고뉴클레오티드는 특이적 잡종화가 이루어질 수 있는 상태에서 B7 단백질 발현이 가능한 조직 혹은 세포 샘플에 접촉시키며, 상기 샘플은 결합이 이루어지지 않은 올리고뉴클레오티드가 제거되도록 세척된다. 방사선 표지된 올리고뉴클레오티드가 특이적 잡종화가 될 수 있는 상태의 정상적인 조직 혹은 세포 샘플로 접촉되는 것에 있어서도, 비슷한 조치가 계속 취해지며, 상기 샘플은 결합이 이루어지지 않은 올리고뉴클레오티드가 제거되도록 세척된다. 상기 샘플들에서 방사선 활성이 나타나게 되면 올리고뉴클레오티드와 결합을 했다는 것을 나타내는 것이며 섬광 계수기 혹은 다른 일상적인 수단으로 측정한다. 상기 샘플에서 많은 양이 방사선 활성을 보이게 되면 대조 조직 혹은 세포들과 비교하여 B7 유전자의 발현이 증가된 것을 나타내지만, 반면에 상기 샘플들에서 보다 적은 양의 방사선 활성이 나타나게 되면 B7 유전자의 발현이 감소되었다는 것을 나타내는 것이다.
본 발명의 방사선 표지된 올리고뉴클레오티드들은 방사선사진에서도 이용된다. B7 유전자를 발현하는 것으로 보이는 조직의 부분에 방사선 표지된 올리고뉴클레오티드를 처리하여, 상기에 기재된 바와 같이 세척하고 나서, 표준 방사선사진 절차에 따라 사진의 감광제에 노출시킨다. 정상 조직 부분에도 위와 같은 방법을 행한다. 감광이 되었을 때, B7 유전자를 발현하는 지역 위로는 은색 결의 형상이 나타나며 측정된다. B7 발현의 범위는 대조군 및 시험군에서 관찰된 은색 결을 비교하여 측정된다.
B7 유전자의 발현의 형광 검출을 위한 유사한 검정법은 플루어레신 또는 다른 형광 태그로 표지된 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 표지된 올리고뉴클레오티드는 표준 포스포아미디트 캐미스트리를 이용하여 자동 DNA 합성기(Applied Biosystems, Foster City, CA)로 합성된다. b-시아노에틸디이소프로필 포스포아미디트는 Applied Biosystems(Foster City, CA)에서 구입한다. 플루어레신-표지된 아미디트는 Glen Research(Sterling, VA)에서 구입한다. 올리고뉴클레오티드 및 생물학적 샘플들의 배양은, 섬광 계수기 대신에 형광 현미경이 형광물질을 검출하는데 이용되는 것을 제외하고는, 방사선 표지된 올리고뉴클레오티드에 대하여 위에서 설명한 것과 같이 수행된다. 대조 조직 혹은 세포와 비교하여 상기 샘플에서 많은 양의 형광물질이 발견되면 B7 단백질의 발현이 증가되었다는 것을 나타내는 것이며, 반면에 상기 샘플에서 대조군에 비해 적은 양의 형광물질이 발견되면 B7 단백질의 발현이 감소되었다는 것을 나타낸다.
<110> ISIS PHARMACEUTICALS, INC. <120> Oligonucleotide Compositions and Methods for the Modulation of the Expression of B7 Proteins <150> US 08/777,266 <151> 1996-12-31 <160> 125 <170> KOPATIN 1.0 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: No <400> 1 gatcagggta ccaggagcct taggaggtac gg 32 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 2 gatagcctcg agttatttcc aggtcatgag cca 33 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 3 ttccaggtca tgagccatta 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 4 cataaggtgt gctctgaagt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 5 ttactcatgg taatgtcttt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 6 attaaaaaca tgtatcactt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 7 ggaacacaga agcaaggtgg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 8 ccgtacctcc taaggctcct 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 9 cccatagtgc 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Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 14 gggagtcctg gagccccctt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 15 ccattaagct gggcttggcc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 16 tgcgagctcc ccgtacctcc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 17 gcccaagctg gcatccgtca 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 18 ggattgccaa gcccatggtg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 19 ctaagtagtg ctagccggga 20 <210> 20 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: No <400> 20 gatcagggta ccccaaagaa aaagtgattt gtcattgc 38 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 21 gatagcctcg aggataatga attggctgac aagac 35 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 22 gggtaagact ccacttctga 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 23 gggtctccaa aggttgtgga 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 24 gttcctgggt ctccaaaggt 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA 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Yes <400> 29 agaccagggc acttcccagg 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 30 cctgcctccg tgtgtggccc 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 31 gaccagccag caccaagagc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 32 ccacaggaca gcgttgccac 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 33 ccggttcttg tactcgggcc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 34 ccaaccagga gaggtgaggc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 35 ggcaaagcag taggtcaggc 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 36 gcctcatgat ccccacgatc 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 37 agtcctacta ccagccgcct 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 38 tcagggtaag actccacttc 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 39 agggtgttcc tgggtctcca 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 40 ctccgtgtgt ggcccatggc 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 41 ggatggtgat gttccctgcc 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 42 tgagaaagac cagccagcac 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 43 gggcgcagag ccaggatcac 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 44 ggcccaggat gggagcaggt 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 45 agggcgtaca ctttcccttc 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 46 cagccccttg cttctgcgga 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 47 aaggagaggg atgccagcca 20 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 48 ctgttacttt acagagggtt tg 22 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 49 cttctgttac tttacagagg gtttg 25 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 50 ctgttacttt acagagggtt t 21 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 51 gccctcgtca gatgggcgca 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 52 agtcctacta ccagccgcct 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 53 agtaagagtc tattgaggta 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 54 ggttgagttt cacaacctga 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 55 gtccacagaa tggaacagag 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 56 ggcatccacc cggcagatgc 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 57 tggatggcat ccacccggca 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 58 aggcacctcc taggctcaca 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 59 gccaatggag cttaggcacc 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 60 catgatgggg aaagccagga 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 61 aattgcaagc catagcttca 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 62 cggcaaggca gcaatacctt 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 63 cccagcaatg acagacagca 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 64 ggtctgaaag gaccaggccc 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 65 tgggaaaccc ccggaagcaa 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 66 ggctttggga aacccccgga 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 67 tcagattcag gatcctggga 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 68 cccaggtgaa gtcctctgac 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 69 ctgcgccgaa tcctgcccca 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 70 caggcccgaa ggtaaggctg 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 71 tcagctagca cggtgctgaa 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 72 ggcccagcaa acttgcccgt 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 73 ccaccacagt gggctcagcc 20 <210> 74 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 74 ggccatgagg gcaatctaa 19 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-1 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 75 gtggccatga gggcaatcta a 21 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 76 gatttaacat ttggcgccca 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 77 aaagttacaa cattatatct 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 78 agtgcgattc tcaaacctac 20 <210> 79 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 79 tatttgcgag ctcccc 16 <210> 80 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 80 tatttgcgag ctccc 15 <210> 81 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 81 tatttgcgag ctcc 14 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 82 cgacagctcc tgcgctcctc 20 <210> 83 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 83 agctccccgt acctcc 16 <210> 84 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 84 tgcgagctcc ccgtac 16 <210> 85 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 85 ctccccgtac 10 <210> 86 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 86 gctccccgta c 11 <210> 87 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 87 agctccccgt ac 12 <210> 88 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 88 gagctccccg tac 13 <210> 89 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 89 cgagctcccc gtac 14 <210> 90 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 90 gcgagctccc cgtac 15 <210> 91 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 91 gcgagctccc cgt 13 <210> 92 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 92 gccgccgcca agtct 15 <210> 93 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 93 gagaagcaaa gctttcaccc tgtg 24 <210> 94 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 94 gaagcaaagc tttcaccctg tg 22 <210> 95 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 95 gcaaagcttt caccctgtg 19 <210> 96 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 96 ctccccgtac ctcctaaggc tcct 24 <210> 97 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 97 ccccgtacct cctaaggctc ct 22 <210> 98 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Human B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 98 cgtacctcct aaggctcct 19 <210> 99 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: No <400> 99 gatcagggta ccaagagtgg ctcctgtagg ca 32 <210> 100 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: No <400> 100 gatagcctcg aggtagaatt ccaatcagct ga 32 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <300> <301> STEPKOWSKI, Stanislaw M. TU, Zizheng CONDON, Thomas P. BENNETT, C. Frank <302> Blocking of Heart Allograft Rejection by Intercellular Adhesion Molecule-1 Antisense Oligonucleotide Alone or in Combination with Other Immunosuppressive Modalities <303> The Journal of Immunology <304> 153 <306> 5336-5346 <307> 1994-12-01 <400> 101 tgcatccccc aggccaccat 20 <210> 102 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <300> <301> STEPKOWSKI, Stanislaw M. TU, Zizheng CONDON, Thomas P. BENNETT, C. Frank <302> Blocking of Heart Allograft Rejection by Intercellular Adhesion Molecule-1 Antisense Oligonucleotide Alone or in Combination with Other Immunosuppressive Modalities <303> The Journal of Immunology <304> 153 <306> 5336-5346 <307> 1994-12-01 <400> 102 gccgaggtcc atgtcgtacg c 21 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 103 acacgtctac aggagtctgg 20 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 104 caagcccatg gtgcatctgg 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 105 ctggggtcca tcgtgggtgc 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 106 ccgtgctgcc tacaggagcc 20 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 107 ggtgcttccg taagttctgg 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 108 ggattgccaa gcccatggtg 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 109 ctaagtagtg ctagccggga 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 110 tgcgtctcca cggaaacagc 20 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 111 gtgcggccca ggtacttggc 20 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 112 acaaggagga gggccacagt 20 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 113 tgagaggttt ggaggaaatc 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 114 gatagtctct ctgtcagcgt 20 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 115 gttgctgggc ctgctaggct 20 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 116 ctaggtctcg tcgtcggtgg 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 117 tctcactgcc ttcactctgc 20 <210> 118 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 118 gtaccagatg aaggttatca a 21 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 119 ctttggagat tattcgagtt 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 120 gcaagtgtaa agccctgagt 20 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 121 agaattccaa tcagctgaga 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 122 tctgagaaac tctgcacttc 20 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 123 tcctcaggct ctcactgcct 20 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of Oligonucleotide Targeted to Murine B7-2 mRNA, Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 124 ggttgttcaa gtccgtgctg 20 <210> 125 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Strandedness: Single, Topology: Linear, Anti-sense: Yes <400> 125 gccgaggtcc atgtcgtagc c 21

Claims (24)

  1. B7 단백질을 암호화하는 핵산과 특이적으로 잡종화할 수 있는 염기서열을 가지며, 상기 B7 단백질의 발현을 조절하는 것을 특징으로 하는 8 내지 30개의 뉴클레오티드가 공유 결합으로 연결된 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 상기 공유 결합이 변형된 공유 결합인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 변형된 공유 결합은 포스포로티오에이트 결합, 포스포트리에스테르 결합, 메틸 포스포네이트 결합, 메틸렌(메틸이미노) 결합, 모폴리노 결합, 아미드 결합, 폴리아미드 결합, 쇼트 체인 알킬 당간 결합, 시클로알킬 당간 결합, 쇼트 체인 헤테로아토믹 당간 결합 및 헤테로시클릭 당간 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  4. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 상기 뉴클레오티드가 변형된 당 성분을 갖는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 변형된 당 성분은 모든 뉴클레오티드의 2' 위치, 3' 말단 뉴클레오티드의 3' 위치, 혹은 5' 말단 올리고뉴클레오티드의 5' 위치에서 변형되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 변형이 아지도기의 3' 하이드록실기로의 치환 및 수소 원자의 3' 혹은 5' 하이드록실기로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  7. 제5항에 있어서, 상기 변형은 2' 위치에 -OH, -SH, -SCH3, -F, -OCN, -OCH3OCH3, -OCH3O(CH2)nCH3, -O(CH2)nNH2혹은 -O(CH2)nCH3(상기 n은 1 내지 10의 수임), C1내지 C10의 저급 알킬기, 알콕시알콕시기, 치환된 저급 알킬기, 치환된 알카릴기, 치환된 아랄킬기, -Cl, -Br, -CN, -CF3, -OCF3, -O-알킬기, -S-알킬기, -N-알킬기, O-알케닐기, S-알케닐기, N-알케닐기, -SOCH3, -SO2CH3, -ONO2, -NO2, -N3, -NH2, 헤테로시클로알킬기, 헤테로시클로알카릴기, 아미노알킬아미노기, 폴리알킬아미노기, 치환된 실릴기, RNA 절단기, 수용체기, DNA 인터칼레이트기, 올리고뉴클레오티드의 파마코키네틱(pharmacokinetic) 특성을 증가시키는 기, 올리고뉴클레오티드의 파마코다이나믹(pharmacodynamic) 특성을 증가시키는 기, 메톡시에톡시기 및 메톡시기로 이루어진 군으로부터 선택된 성분이 치환 혹은 첨가되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  8. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 상기 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오염기를 갖는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오염기는 하이포잔틴, 5-메틸시토신, 5-하이드록시메틸시토신, 클리코실 5-하이드록시메틸시토신, 젠티오비오실 5-하이드록시메틸시토신, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 6-메틸아데닌, N6-(6-아미노헥실)아데닌, 8-아자구아닌, 7-디아자구아닌 및 2,6-디아미노푸린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  10. 제1항에 있어서, 상기 B7 단백질이 사람의 B7-1인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 염기서열이 서열 번호: 36을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  12. 제1항에 있어서, 상기 B7 단백질이 사람의 B7-2인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 염기서열이 서열 번호: 3, 서열 번호: 9 또는 서열 번호: 16을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  14. 제1항의 상기 올리고뉴클레오티드 및 약제학적으로 수용가능한 담체로 이루어진 항-염증 치료제
  15. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 올리고뉴클레오티드의 세포 친화력을 증진시키는 적어도 하나의 지용성 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  16. 제15항에 있어서, 상기 지용성 성분은 콜레스테롤 성분, 콜레스테릴 성분, 콜린산, 티오에테르, 테오콜레스테롤, 지방성 사슬, 포스포리피드, 폴리아민 사슬, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 성분, 옥타데실아민 성분 및 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 성분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  17. 제15항의 올리고뉴클레오티드 및 약제학적으로 수용가능한 담체로 이루어진 항-염증 치료제.
  18. (a) 수용성 ICAM 단백질, 항체-톡신 컨주게이트, 프레드니손, 메틸프레드니솔론, 아자티오프린, 시클로포스파미드, 시클로스포린, 인터페론, 심패토미메틱, 히스타민 H1수용체 길항제 및 히스타민 H2수용체 길항제로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-염증제 혹은 면역억제제;
    (b) 제1항의 올리고뉴클레오티드; 및
    (c) 약제학적으로 수용가능한 담체;
    로 이루어진 항-염증 치료제.
  19. (a) 공유 결합으로 연결된 8 내지 30개의 뉴클레오티드로 이루어지며, 적어도 하나의 상기 공유 결합은 포스포디에스테르 결합과는 다른 결합이며, ICAM 단백질을 암호화하는 핵산과 특이적으로 잡종화할 수 있는 염기서열을 갖고, 그리고 상기 ICAM 단백질의 발현을 조절하는 올리고뉴클레오티드;
    (b) 제1항의 올리고뉴클레오티드; 및
    (c) 약제학적으로 수용가능한 담체;
    로 이루어진 항-염증 치료제.
  20. (a) 제10항의 올리고뉴클레오티드;
    (b) 공유 결합으로 연결된 8 내지 30개의 뉴클레오티드로 이루어지며, B7-2 단백질을 암호화하는 핵산과 특이적으로 잡종화할 수 있는 염기서열을 갖고, 그리고 상기 B7-2 단백질의 발현을 조절하는 올리고뉴클레오티드; 및
    (c) 약제학적으로 수용가능한 담체;
    로 이루어진 항-염증 치료제.
  21. (a) 수용성 ICAM 단백질, 항체-톡신 컨주게이트, 프레드니손, 메틸프레드니솔론, 아자티오프린, 시클로포스파미드, 시클로스포린, 인터페론, 심패토미메틱, 히스타민 H1수용체 길항제, 히스타민 H2수용체 길항제 및 ICAM 단백질의 발현을 조절하는 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-염증제 혹은 면역억제제;
    (b) 제10항의 올리고뉴클레오티드;
    (c) 공유 결합으로 연결된 8 내지 30개의 뉴클레오티드로 이루어지며, B7-2 단백질을 암호화하는 핵산과 특이적으로 잡종화할 수 있는 염기서열을 갖고, 그리고 상기 B7-2 단백질의 발현을 조절하는 올리고뉴클레오티드; 및
    (d) 약제학적으로 수용가능한 담체;
    로 이루어진 항-염증 치료제.
  22. 제1항의 올리고뉴클레오티드를 생체외(ex vivo) 또는 시험관내(in vitro)에서 세포 또는 조직에 접촉하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직에 있어서의 B7 단백질의 발현을 조절하는 방법.
  23. 치료적으로 효과적인 양의 제1항의 올리고뉴클레오티드를 동물에게 투여하는 것을 특징으로 하는 동물에 있어서의 염증 치료 방법.
  24. 치료적으로 효과적인 양의 제1항의 올리고뉴클레오티드를 동물에게 투여하는 것 특징으로 하는 동물에 있어서의 자가면역 질병의 치료 방법.
KR10-1999-7005654A 1996-12-31 1997-12-16 Ｂ7 단백질의 발현을 조절하는 올리고뉴클레오티드 조성물 및 방법 KR100452105B1 (ko)

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