JP2003501059A - Ｂ７タンパク質発現のアンチセンス調節 - Google Patents

Ｂ７タンパク質発現のアンチセンス調節

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ヴィッカーズ，ティモシー・エイ
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Abstract

(57)【要約】 免疫状態およびT細胞の修飾を介して治療に影響を受けやすい障害の診断ｍ予防および治療のための組成物および方法を提供する。好ましい態様に従い、B7タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダイゼーション可能なオリゴヌクレオチドを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関連出願の引照 本発明は、米国特許出願第09／326,186号（1999年6月4日出願）の一部継続出
願であり、これは米国特許出願第08／777,266号（1996年12月31日出願）の一部
継続出願である。
【０００２】 発明の分野 本発明は、T細胞活性化の調節に応答する疾病状態についての診断薬、研究試
薬および療法薬に関する。本発明は特に、アンチセンスオリゴヌクレオチドとT
細胞活性化を調節するタンパク質の合成に関与する特定のメッセンジャーリボ核
酸（mRNA）またはDNAとの相互作用に関する。B7タンパク質をコードする核酸に
ハイブリダイズするように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供す
る。これらのオリゴヌクレオチドは上記のRNAまたはDNAを調節し、したがってT
細胞活性化を調節することが見いだされた。待期的効果、治療効果および予防効
果が得られる。
【０００３】 発明の背景 炎症は傷害、感染または組織破壊に応答して組織が起す局所的な保護反応であ
り、その結果、感染性または傷害性物質が破壊され、傷害組織が隔離される。典
型的な炎症反応は下記のように進行する：外来物質としての抗原の認識または組
織損傷の認識、可溶性炎症仲介物質の合成および放出、感染部位または組織損傷
部位への炎症細胞動員、侵入生物または損傷組織の破壊および排除、ならびに侵
入生物または損傷が消散した後におけるこの系の不活性化。炎症要素による多く
のヒト疾患においては、炎症反応を減衰させる正常なホメオスタシス機序に欠陥
があるため、正常組織が損傷を受け、または破壊される。
【０００４】 前記の各段階で免疫応答の活性化に細胞-細胞相互作用が関与している。正常
な炎症反応において最初に検出できる症状のひとつは、血管内皮への白血球付着
、次いで血管から感染部位または傷害部位への白血球移動である。一般に炎症部
位に最初に現われる炎症細胞は好中球、続いて単球およびリンパ球である。細胞
-細胞相互作用はBリンパ球（B細胞）とTリンパ球（T細胞）両方の活性化にとっ
ても重要であり、これによりそれぞれ体液性および細胞性免疫応答が増強される
。
【０００５】 免疫系の特徴は、自己（宿主）と非自己（外来侵入物体）を識別できる能力で
ある。免疫系が示すこの顕著な特異性は主にT細胞により仲介される。T細胞は感
染に対する宿主の防御に関与するが、移植組織の臓器損傷をも仲介し、移植片対
宿主疾患（GVHD）およびある種の自己免疫疾患における細胞攻撃にも関係する。
抗原特異性免疫応答を誘導するためには、T細胞は抗原提示細胞（APC）が送る信
号を受容しなければならない。T細胞-APC相互作用は3段階に分けることができる
：細胞付着、T細胞受容体（TCR）認識、および副刺激。T細胞活性化の誘導には
、少なくとも2つの別個の信号が必要である。第1信号は抗原特異性であり、APC
表面に発現する主要組織適合性遺伝子複合体（MHC）タンパク質またはMHC関連CD
1タンパク質に関係する抗原とTCRが相互作用したとき発せられる（”cluster of
differentiation”を表す”CD”は、異なるT細胞表面分子を表示するために用
いられる用語である）。第2（副刺激）信号は、T細胞表面抗原CD28とAPC上にあ
るそれのリガンド（B7ファミリータンパク質のメンバー）との相互作用を伴う。
【０００６】 44kdポリペプチドのジスルフィド結合ホモ二量体であって免疫グロブリンスー
パーファミリーのメンバーであるCD28は、休止T細胞の表面にある、T細胞活性化
およびサイトカイン産生のための主な副刺激信号受容体のひとつである（Alliso
n, Curr. Opin. Immunol., 1994, 6, 414; Linsley and Ledbetter, Annu. Rev.
Immunol., 1993, 11, 191; June et al., Immunol. Today, 1994, 15, 321）。
CD28による信号伝達はTCR信号伝達と相乗作用して、インターロイキン-2（IL-2
）産生と天然T細胞増殖の両方を活性化する。B7-1（CD80としても知られている
）は、CD28に対する最初に同定されたリガンドであった(Liu and Linsley, Curr
. Opin. Immunol., 1992, 4, 265)。B7-1は普通はAPC上に低濃度で発現するが、
サイトカインによる活性化またはCD40などの細胞表面分子の連結によりアップレ
ギュレーションされる（Lenschow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 19
93, 90, 11054; Nabavi et al., Nature, 1992, 360, 266）。初期の研究で、B7
-1は副刺激を仲介するCD28リガンドであることが示唆された（Reiser et al., P
roc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992, 89, 271; Wu et al., J. Exp. Med., 19
93, 178, 1789; Harlan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1994, 91, 3
137）。しかしその後、抗B7-1モノクローナル抗体（mAb）が初期の混合リンパ球
反応に及ぼす作用は小さく、B7-1欠損マウスが抗原に対して正常に反応すること
が証明され（Lenschow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993, 90, 11
054; Freeman et al., Science, 1993, 262, 909）、CD28受容体に対する第2リ
ガンドB7-2（CD86としても知られている）が発見された。抗-B7-1 mAbと対照的
に、抗-B7-2 mAbはT細胞増殖およびサイトカイン産生の有効な阻害物質である（
Wu et al., J. Exp. Med., 1993, 178, 1789; Chen et al., J. Immunol., 1994
, 152, 2105; Lenschow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993, 90, 1
1054）。B7：CD28信号伝達は他のT細胞副刺激経路、たとえばCD40：CD40L（CD40
リガンド）信号伝達に必要な成分であると思われる（Yang et al., Science, 19
96, 273, 1862）。
【０００７】 B7-1およびB7-2はCD28を結合するほか、細胞溶解性Tリンパ球関連タンパク質C
TLA4を結合する。CTLA4は、構造的にはCD28に関連するが、活性化後のT細胞にお
いてのみ発現するタンパク質である（Linsley et al., J. Exp. Med., 1991, 17
4, 561）。可溶性組換え形のCTLA4であるCTLA4-Igは、CD28またはB7タンパク質
に対して形成されたモノクローナル抗体より有効なB7：CD28相互作用阻害物質で
あると判定された。CTLA4-Igでin vivo処理すると、ヒツジ赤血球または可溶性
抗原に対する抗体の形成が阻害され（Linsley et al., Science, 1992, 257, 79
2）、同種移植心臓および異種移植ランゲルハンス島の生存が延長され（Lin et
al., J. Exp. Med., 1993, 178, 1801; Lenschow et al., 1992, Science, 257,
789; Lenschow et al., Curr. Opin. Immunol., 1991, 9, 243）、GVHDにおけ
る免疫応答が有意に抑制される（Hakim et al., J. Immun., 1995, 155, 1760）
。CD28およびCTLA4は両方とも共通のB7受容体を介して作用するが、それぞれ反
対の副刺激機能および阻害機能をもつと提唱された（Allison et al., Science,
1995, 270, 932）。抗原提示細胞上のB7-1およびB7-2分子を両方とも結合するC
TLA4-Igは、安定尋常性乾癬患者のT細胞副刺激を遮断し、それを投与した患者の
46％において50％以上の持続的な臨床疾患活性改善をもたらすことが示された。
この結果は用量依存性であった。Abrams et al., J. Clin. Invest., 1999, 9,
1243-1225。
【０００８】 EPA 0 600 591（1994年6月8日公開）（A2）には、患者から得た腫瘍細胞にB7-
1タンパク質を発現するようにex vivoで工学的組換え処理を施し、次いで患者に
再導入することによる、腫瘍細胞増殖抑制方法が開示されている。その結果、B7
-トランスフェクションした腫瘍細胞とトランスフェクションしていない腫瘍細
胞の両方に対する免疫応答が刺激される。
【０００９】 WO 95／03408（1995年2月2日公開）には、T細胞活性化を副刺激する新規なCTL
A4／CD28リガンド（B7-2タンパク質が含まれる）をコードする核酸が開示されて
いる。B7-2タンパク質に対する抗体、およびB7-2タンパク質の製造方法も開示さ
れている。
【００１０】 WO 95／05464（1995年2月23日公開）には、CTLA4、CD28またはCTLA4-Igに結合
する、B7-1以外のポリペプチドが開示されている。そのようなポリペプチドをコ
ードする核酸を得るための方法も開示されている。
【００１１】 WO 95／06738（1995年3月9日公開）には、B7-2（B70としても知られている）
タンパク質をコードする核酸が開示されている。B7-2タンパク質に対する抗体、
およびB7-2タンパク質の製造方法も開示されている。
【００１２】 EPA 0 643 077（1995年3月15日公開）（A1）には、B7-2（B70としても知られ
ている）タンパク質を特異的に結合するモノクローナル抗体が開示されている。
B7-2タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法も開示されて
いる。
【００１３】 USP5,434,131（1995年7月18日発行）には、B7タンパク質に対するリガンドと
してのCTLA4タンパク質が開示されている。CTLA4融合タンパク質（たとえばCTLA
4-Ig）の製造方法、およびB7タンパク質またはCTLA4タンパク質に対する抗体を
用いる免疫応答調節方法も開示されている。
【００１４】 WO 95／22619（1995年8月24日公開）には、B7-2タンパク質には結合しないB7-
1タンパク質特異性抗体が開示されている。B7-1タンパク質に対する抗体を用い
る免疫応答調節方法も開示されている。
【００１５】 WO 95／34320（1995年12月21日公開）には、副刺激物質を阻害する第1薬、た
とえばCTLA4-Ig融合タンパク質、および細胞接着を阻害する第2薬、たとえば抗-
LFA-1抗体を用いて、T細胞応答を阻害する方法が開示されている。そのような方
法は、移植された組織または臓器の拒絶を抑制するために特に有用である。
【００１６】 WO 95／32734（1995年12月7日公開）には、B7分子のアップレギュレーション
を阻止するか、あるいは抗原提示細胞におけるICAM-3発現に損傷を与える、FcYR
II架橋剤が開示されている。そのようなFcYRII架橋剤には、凝集ヒトIgG分子、
またはヒトIgG分子の凝集Fcフラグメントなどのタンパク質が含まれる。
【００１７】 WO 96／11279（1996年4月18日公開（A2）および1996年5月17日公開（A3））に
は、下記のものをコードする遺伝子配列を含む組換えウイルスが開示されている
：（1）B7-1およびB7-2を含めた1以上の免疫刺激物質、ならびに（2）病因物質
に由来する抗原。そのような組換えウイルスを用いる疾病治療方法も開示されて
いる。
【００１８】 現在まで、B7タンパク質、たとえばB7-1およびB7-2の発現を効果的に調節およ
び阻止する既知の療法薬は知られていない。したがって、B7タンパク質などの重
要な副刺激分子を効果的に調節するための化合物および方法が長年求められてい
る。B7タンパク質の発現を調節しうるオリゴヌクレオチドは、多様な炎症性疾患
もしくは自己免疫疾患、または炎症要素を伴う障害もしくは疾患、たとえば喘息
、若年性糖尿病、重症筋無力症、グレーブス病、慢性関節リウマチ、同種移植片
拒絶、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、紅斑性狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、糖
尿病、多発性硬化症、接触性皮膚炎、鼻炎およびアレルギーに対する活性を備え
た新規な療法クラスの抗炎症薬を提供すると予想される。さらに、B7タンパク質
の発現を調節しうるオリゴヌクレオチドは、T細胞のex vivo増殖を操作するため
の新規な手段を提供するであろう。
【００１９】 発明の概要 本発明によれば、B7-1またはB7-2をコードする核酸と特異的にハイブリダイズ
するオリゴヌクレオチドが提供される。本発明の特定のオリゴヌクレオチドは、
B7-1もしくはB7-2遺伝子から転写されたmRNAまたはそれらの遺伝子のDNAの特定
部分に直接結合し、これによりB7-1もしくはB7-2 mRNAから翻訳されるタンパク
質の量またはB7-1もしくはB7-2 遺伝子から転写されるmRNAの量をそれぞれ調節
するように設計される。
【００２０】 オリゴヌクレオチドは、特定の核酸と特異的にハイブリダイズするのに十分な
アイデンティティーおよび数のヌクレオチド配列を含むことができる。そのよう
なオリゴヌクレオチドを一般に”アンチセンス”という。アンチセンスオリゴヌ
クレオチドは、一般に研究用試薬、診断補助薬および療法薬として用いられる。
【００２１】 それぞれB7-1およびB7-2タンパク質をコードするB7-1およびB7-2遺伝子は、本
発明方法に特に有用である。B7発現とT細胞の活性化および増殖との関連の結果
として、B7-1またはB7-2遺伝子の発現阻害によりそれぞれB7-1またはB7-2の合成
が阻害され、これによりT細胞の活性化および増殖が抑制される。さらに、本発
明のオリゴヌクレオチドは、オータナティブスプライシングされた数種類のB7転
写体mRNAのうちの1つの発現を阻害し、その結果、オータナティブスプライシン
グされた他のB7 mRNAの発現を高めるために使用できる。そのような調節は、多
様な炎症性もしくは自己免疫性の障害もしくは疾患、または炎症要素を伴う障害
もしくは疾患、たとえば喘息、若年性糖尿病、重症筋無力症、グレーブス病、慢
性関節リウマチ、同種移植片拒絶、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、紅斑性
狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、糖尿病、多発性硬化症、接触性皮膚炎、鼻炎、各種ア
レルギー、ならびに癌およびそれらの転移の処置のために望ましい。さらにその
ような調節は、そのような疾患または障害を発症しやすい疑いがあるか、あるい
は発症しやすいことが分かっている動物において、そのような疾患または障害の
発症を予防または調節するために望ましい。本発明はまた、B7タンパク質に対す
るアンチセンスオリゴヌクレオチドを、第2の抗炎症薬、たとえば細胞内接着分
子（ICAM）タンパク質など細胞内相互作用を調節するタンパク質に対する第2ア
ンチセンスオリゴヌクレオチドと組み合わせて含む医薬組成物に関する。
【００２２】 本発明は、動物に、B7タンパク質をコードする核酸と特異的にハイブリダイズ
するオリゴヌクレオチドを接触させる方法を提供する。これらの方法は、たとえ
ば種々の細胞機能ならびに生理学的プロセスおよび状態におけるB7タンパク質発
現を検出し、その役割を判定する際の、またその発現に関連する状態を診断する
ための、道具として有用である。そのような方法はB7遺伝子（たとえばB7-1また
はB7-2遺伝子）の発現を検出するのに使用でき、したがって療法および診断のい
ずれにも有用であると考えられる。本発明は、動物にB7遺伝子と特異的にハイブ
リダイズするオリゴヌクレオチドを接触させることを含む、B7タンパク質発現の
調節方法を提供する。これらの方法は、B7発現とT細胞の活性化および増殖の関
連の結果として、療法および診断のいずれにも有用であると考えられる。本発明
は、本発明のオリゴヌクレオチドを用いてB7関連のT細胞活性化を抑制する方法
をも含む。T細胞の異常または過剰な活性化および増殖が起きる状態の処置方法
も提供される。これらの方法は、本発明のオリゴヌクレオチドを使用し、療法用
としても臨床研究用および診断用の道具としても有用であると考えられる。本発
明のオリゴヌクレオチドは、研究の目的にも使用できる。このように、本発明の
オリゴヌクレオチドが示す特異的ハイブリダイゼーションは、アッセイ、精製、
細胞産生物の調製、その他、当業者に自明の方法に使用できる。
【００２３】 本発明方法は、たとえば種々の免疫系機能ならびに生理学的プロセスおよび状
態におけるB7-1またはB7-2遺伝子発現の役割を検出および判定する際の臨床研究
用道具として、またそれらの発現に関連する状態の診断にも有用である。本発明
のオリゴヌクレオチドが示す特異的ハイブリダイゼーションは、アッセイ、精製
、細胞産生物の調製、その他、当業者に自明の方法に使用できる。たとえば、本
発明のオリゴヌクレオチドはB7タンパク質をコードする核酸に特異的にハイブリ
ダイズするので、この事実を利用するサンドイッチアッセイ法その他のアッセイ
法を容易に構築できる。本発明のオリゴヌクレオチドと試料中に存在するB7タン
パク質コード核酸との特異的ハイブリダイゼーションの検出は、ルーティンに実
施できる。そのような検出法には、本発明のオリゴヌクレオチドを酵素結合、放
射性標識または他の適切な任意の検出系により、検出可能に標識することが含ま
れる。本発明を利用して多数のアッセイ法を組み立てることができる。それらの
アッセイ法は、一般に当業者に自明のとおり、組織または細胞の試料に、ハイブ
リダイゼーションしうるように選定した条件下で、検出可能に標識した本発明の
オリゴヌクレオチドを接触させ、そのハイブリダイゼーションを標識の検出によ
り測定することを含む。
【００２４】 発明の詳細な記述 本発明は、B7-1およびB7-2を含めたB7タンパク質をコードするRNAおよびDNAの
機能のアンチセンス阻害に利用するために、オリゴヌクレオチドを使用する。本
発明はまた、そのようなタンパク質をコードするDNAまたはメッセンジャーRNA（
mRNA）に特異的にハイブリダイズし、結果的にそれらの各遺伝子から転写される
タンパク質の量を調節するように設計した、オリゴヌクレオチドを使用する。mR
NAとのそのようなハイブリダイゼーションはmRNAの正常な役割を妨害し、細胞に
おけるmRNAの機能を調節する。妨害されるmRNAの機能には、すべての生命機能、
たとえばタンパク質翻訳部位へのRNAのトランスロケーション、RNAからの実際の
タンパク質翻訳、1以上のmRNA片を生成するRNAスプライシングが含まれ、RNAに
より関連をもつ可能性のある独立した触媒活性ですら含まれるであろう。そのよ
うなmRNA機能妨害の全体的作用はB7タンパク質発現の調節である。本明細書にお
いて”調節”とは、B7タンパク質発現の増加（刺激）または減少（抑制）を意味
する。本発明に関して、抑制は好ましい形の遺伝子発現調節である。
【００２５】 オリゴヌクレオチドは、特定の核酸と特異的にハイブリダイズするのに十分な
アイデンティティーおよび数のヌクレオチド配列を含むことができる。遺伝子の
センス鎖の一部に特異的にハイブリダイズするそのようなオリゴヌクレオチドを
一般に”アンチセンス”という。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般に研
究用試薬、診断補助薬および療法薬として用いられる。遺伝子発現をきわめて特
異的に阻害しうるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、たとえば生物学的経路の
多数のメンバーの機能を識別するために特定の遺伝子の機能を解明するのに当業
者によりしばしば利用される。したがって、この特異的阻害作用は当業者により
研究用として利用されている。
【００２６】 オリゴヌクレオチドの特異性および感受性は、当業者により療法用としても利
用されている。たとえば以下の米国特許は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを
用いる待期的方法、療法その他の方法を示す。USP 5,135,917は、ヒトインター
ロイキン-1受容体発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
USP 5,098,890は、c-myb癌遺伝子に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、
および特定の癌性状態に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド療法に関する。
USP 5,087,617は、癌患者をアンチセンスオリゴヌクレオチドで治療する方法を
提供する。USP 5,166,195は、HIVのオリゴヌクレオチド阻害薬を提供する。USP
5,004,810は、単純ヘルペスウイルスVmw65 mRNAにハイブリダイズして複製を阻
害しうるオリゴマーを提供する。USP 5,194,428は、インフルエンザウイルスに
対する抗ウイルス活性をもつアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。USP
4,806,463は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびそれらをHTLV-IIIの複
製阻害に使用する方法を提供する。USP 5,286,717は、癌遺伝子の一部に対して
相補的な塩基配列をもつオリゴヌクレオチドを提供する。USP 5,276,019およびU
SP 5,264,423は、細胞において外来核酸の複製を阻害するために使用するホスホ
ロチオエートオリゴヌクレオチド類似体に関する。USP 4,689,320は、CMVに対し
て特異的な抗ウイルス薬としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。US
P 5,098,890は、ヒトc-myb遺伝子のmRNA転写体の少なくとも一部に対して相補的
なオリゴヌクレオチドを提供する。USP 5,242,906は、潜在性EBV感染症の治療に
有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００２７】 アンチセンス攻撃には特異的遺伝子をターゲティングすることが好ましい。本
発明に関して関連核酸にオリゴヌクレオチドを”ターゲティング”するのは、多
工程プロセスである。このプロセスは通常は、その機能を調節すべき核酸配列の
同定から始まる。この配列は、たとえば特定の障害もしくは疾患に関連する細胞
遺伝子（またはその遺伝子から転写されたmRNA）、または感染体に由来する外来
核酸であってよい。本発明におけるターゲットは、特定の場合に調節が望まれる
、免疫系の幾つかの障害および疾患（たとえば炎症性および自己免疫性の疾患）
、ならびに表向きは”正常な”免疫反応（たとえば宿主動物の移植組織拒絶）に
関連する細胞遺伝子である。ターゲティングプロセスには、この遺伝子内の領域
（1以上）であって、目的の効果（タンパク質発現の検出または調節）が得られ
るようなオリゴヌクレオチド相互作用が起きる領域の判定も含まれる。ターゲッ
ト領域が同定されると、このターゲットに対して十分に相補的な、すなわち目的
効果を得るのに十分なほど良好に、かつ十分なほど特異的にハイブリダイズする
オリゴヌクレオチドを選択する。
【００２８】 一般に、アンチセンス調節のためにターゲティングしうる遺伝子領域が5つあ
る：5'側非翻訳領域（以下、”5'-UTR”）、翻訳開始コドン領域（以下、”tIR
”）、オープンリーディングフレーム（以下、”ORF”）、翻訳終止コドン領域
（以下、”tTR”）、および3'側非翻訳領域（以下、”3'-UTR”）。当技術分野
で知られているように、これらの領域は典型的なメッセンジャーRNA分子におい
ては下記の順序で配置されている（左から右へ、5'側から3'側へ）：5'-UTR、tI
R、ORF、tTR、3'-UTR。当技術分野で知られているように、ある真核細胞転写体
はそのまま翻訳されるが、多くのORFは”イントロン”として知られている1以上
の配列を含み、これらは翻訳前に転写体から切り取られる；発現した（切り取ら
れなかった）ORF部分は”エキソン”と呼ばれる（Alberts et al., Molecular B
iology of the Cell, 1983, Garland Publishing Inc., New York, pp. 411-415
）。さらに、多くの真核細胞ORFは1000ヌクレオチド以上の長さであるので、ORF
をたとえば5'側ORF領域、中央ORF領域、および3'側ORF領域に小分割するのが好
都合な場合が多い。場合によりORFは、in vivoで何らかの機能的意味をもつとい
う理由でターゲティングしうる部位を1以上含む。後者のタイプの部位の例には
、遺伝子内ステム-ループ構造（たとえばUSP 5,512,438参照）、およびプロセシ
ングされていないmRNA分子においてはイントロン／エキソンスプライス部位が含
まれる。本発明において好ましい遺伝子内部位の1つは、遺伝子のオープンリー
ディングフレーム（ORF）の翻訳開始コドンを含む領域である。当技術分野で知
られているように、翻訳開始コドンは一般に5'-AUG（転写されたmRNA分子におい
て；対応するDNA分子においては5'-ATG）であるので、翻訳開始コドンは”AUGコ
ドン”、”出発コドン”または”AUG出発コドン”とも呼ばれる。少数の遺伝子
はRNA配列5'-GUG、5'-UUGまたは5'-CUGの翻訳開始コドンをもち、5'-AUA、5'-AC
Gまたは5'-CUGはin vivoで機能することが示された。さらに、5'-UUUはin vitro
で翻訳開始コドンとして機能する（Brigstock et al., Growth Factors, 1990,
4, 45; Gelbert et al., Somat. Cell. Mol. Genet., 1990, 16, 173; Gold and
Stormo, in: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and M
olecular Biology, Vol. 2, 1987, Neidhardt et al., eds., American Society
for Microbiology, ワシントン D.C., p. 1303）。したがって、それぞれの場
合の開始アミノ酸は一般にメチオニン（真核細胞の場合）またはホルミルメチオ
ニン（原核細胞の場合）ではあるが、”翻訳開始コドン”および”出発コドン”
という用語は多数のコドン配列を包含することができる。真核細胞および原核細
胞の遺伝子が2以上のオータナティブ出発コドンをもつ場合があり、特定の細胞
タイプまたは組織においては、あるいは特定のセットの条件下では、異なるアミ
ノ末端配列をもつ関連ポリペプチドを生成するためにそのいずれか1つが優先的
に翻訳開始に使用されることも、当技術分野で知られている（Markussen et al.
, Development, 1995, 121, 3723; Gao et al., Cancer Res., 1995, 55, 743;
McDermott et al., Gene, 1992, 117, 193; Perri et al., J. Biol. Chem., 19
91, 266, 12536; French et al., J. Virol., 1989, 63, 3270; Pushpa-Rekha e
t al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 26993; Monaco et al., J. Biol. Chem.,
1994, 269, 347; DeVirgilio et al., Yeast, 1992, 8, 1043; Kanagasundaram
et al., Biochim. Biophys. Acta, 1992, 1171, 198; Olsen et al., Mol. Endo
crinol., 1991, 5, 1246; Saul et al., Appl. Environ. Microbiol., 1990, 56
, 3117; Yaoita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 7090; Roger
s et al., EMBO J., 1990, 9, 2273）。本発明において”出発コドン”および”
翻訳開始コドン”は、そのようなコドンの配列（1以上）に関係なく、B7タンパ
ク質をコードする遺伝子から転写されたmRNA分子の翻訳を開始するためにin viv
oで使われるコドン（1以上）を表す。遺伝子の翻訳終止コドン（または”停止コ
ドン”）が3つの配列、すなわち5'-UAA、5'-UAGおよび5'-UGA（対応するDNA配列
はそれぞれ5'-TAA、5'-TAGおよび5'-TGA）うちのいずれか1つをもつ場合がある
ことも、当技術分野で知られている。”出発コドン領域”および”翻訳開始領域
”という用語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち5'側または3'側
）へ約25〜約50の連続ヌクレオチドを含むmRNA部分または遺伝子部分を表す。同
様に、”停止コドン領域”および”翻訳終止領域”という用語は、翻訳終止コド
ンからいずれかの方向（すなわち5'側または3'側）へ約25〜約50の連続ヌクレオ
チドを含むmRNA部分または遺伝子部分を表す。
【００２９】 本発明に関して”オリゴヌクレオチド”という用語は、リボ核酸またはデオキ
シリボ核酸のオリゴマーまたはポリマーを表す。この用語には、天然核酸塩基、
糖および共有結合内部糖（covalent intersugar）（主鎖）結合からなるオリゴ
ヌクレオチド、ならびに同様に機能する非天然部分を含むオリゴヌクレオチドが
含まれる。そのような修飾または置換オリゴヌクレオチドは、たとえば細胞取込
みの増大、ターゲットへの結合の増大、およびヌクレアーゼの存在下での安定性
の増大などの望ましい特性のため、天然形より好ましい場合がしばしばある。
【００３０】 本発明において考慮される好ましい修飾オリゴヌクレオチドの具体例には、ホ
スホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホン酸メチル、短鎖アルキル-も
しくはシクロアルキル-内部糖結合、または短鎖異種原子-もしくは複素環式-内
部糖結合を含むものが含まれる。最も好ましいものは、ホスホロチオエートを含
むオリゴヌクレオチド、およびCH2-NH-O-CH2、CH2-N（CH3）-O-CH2［メチレン（
メチルイミノ）またはMMI主鎖として知られている］、CH2-O-N（CH3）-CH2、CH2 -N（CH3）-N（CH3）-CH2およびO-N（CH3）-CH2-CH2主鎖を含むオリゴヌクレオチ
ドであり、天然ホスホジエステル主鎖はO-P-O-CH2で表される。モルホリノ主鎖
構造をもつオリゴヌクレオチドも好ましい（Summerton and Weller、USP 5,034,
506）。さらに好ましいものは、NR-C（*）-CH2-CH2、CH2-NR-C（*）-CH2、CH2-C
H2-NR-C（*）、C（*）-NR-CH2-CH2およびCH2-C（*）-NR-CH2主鎖を含むオリゴヌ
クレうちのいずれか1つのオチドであり、これらにおいて”*”はOまたはSを表す
（アミド主鎖として知られている；DeMesmaeker et al., WO 92／20823、1992年
11月26日公開）。他の好ましい態様、たとえばペプチド核酸（PNA）主鎖におい
ては、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖がポリアミド主鎖で置換され
、核酸塩基はポリアミド主鎖のアザ窒素原子に直接または間接に結合している（
Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497; USP 5,539,082）。他の好ましい
修飾オリゴヌクレオチドは、2'位に下記のいずれかを含む1以上の置換糖部分を
含むことができる：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3OCH3、OCH3O（CH2）nCH3、O（C
H2）nNH2またはO（CH2）nCH3；これらにおいてnは1〜約10である；C1〜C10低級
アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリールもしくはア
ラルキル；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-もしくはN-アルキル；O-、S-もしく
はN-アルケニル；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；ヘテロシクロアルキル
；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置
換シリル；RNA開裂基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチ
ドの薬物動態特性を改良する基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改
良する基、および類似の特性をもつ他の置換基。好ましい修飾には、2'-メトキ
シエトキシ（2'-O-CH2CH2OCH3、2'-O-（2-メトキシエチル）または2'-MOEとして
も知られている）（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504）、
すなわちアルコキシアルコキシ基が含まれる。さらに好ましい修飾には、2'-ジ
メチルアミノオキシエトキシ、すなわちO（CH2）2ON（CH3）2基（2'-DMAOEとし
ても知られている；後記の実施例に記載）、および2'-ジメチルアミノ-エトキシ
エトキシ（当技術分野で2'-O-ジメチル-アミノ-エトキシ-エチルまたは2'-DMAEO
Eとしても知られている）、すなわち2'-O-CH2-O-CH2-N（CH2）2（同様に後記の
実施例に記載）が含まれる（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486
）。他の好ましい修飾には、2'-メトキシ（2'-O-CH3）、2'-プロポキシ（2'-O-C
H2CH2CH3）および2'-フルオロ（2'-F）が含まれる。同様な修飾がオリゴヌクレ
オチドの他の位置、特に3'末端ヌクレオチドにある糖の3'位および5'末端ヌクレ
オチドの5'位においてなされてもよい。オリゴヌクレオチドは糖模倣体、たとえ
ばシクロブチルをペントフラノシル基の代わりに含むこともできる。
【００３１】 本発明のオリゴヌクレオチドは、上記のほかに、または上記の代わりに、核酸
塩基の修飾または置換を含むことができる。本明細書中で用いる”非修飾”また
は”天然”核酸塩基には、アデニン（A）、グアニン（G）、チミン（T）、シト
シン（C）およびウラシル（U）が含まれる。修飾核酸塩基には、天然核酸中に稀
または一時的にしかみられない核酸塩基、たとえばヒポキサンチン、6-メチルア
デニン、5-メチルシトシン、5-ヒドロキシメチルシトシン（HMC）、グリコシルH
MCおよびゲンチオビオシルHMC、ならびに合成核酸塩基、たとえば5-ブロモウラ
シル、5-ヒドロキシメチルウラシル、8-アザグアニン、7-デアザグアニン、N6（
6-アミノヘキシル）アデニンおよび2,6-ジアミノプリンが含まれる（Kornberg,
A., DNA Replication, 1974, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1974, pp.
75-77; Gebeyehu, G., et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 4513）。
【００３２】 本発明のオリゴヌクレオチドについて、上記のほか、または上記の代わりの好
ましい他の修飾は、細胞によるオリゴヌクレオチド取込みを高める1以上の親油
性部分をオリゴヌクレオチドに結合させることを伴う。そのような親油性部分を
、オリゴヌクレオチド上の幾つかの異なる位置でオリゴヌクレオチドに結合させ
ることができる。好ましい位置には、3'末端ヌクレオチドの糖の3'位、5'末端ヌ
クレオチドの糖の5'位、および任意のヌクレオチドの糖の2'位が含まれる。プリ
ン核酸塩基のN6位も、本発明のオリゴヌクレオチドへの親油性部分の結合に利用
できる（Gebeyehu, G., et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 4513）。その
ような親油性部分には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：コレス
テリル部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553
）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053）
、チオエーテル、たとえばヘキシル-S-トリチルチオール（Manoharan et al., A
nn. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem
. Let., 1993, 3, 2765）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Ac
ids Res., 1992, 20, 533）、脂肪族鎖、たとえばドデカンジオールもしくはウ
ンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 111; Kabanov e
t al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 7
5, 49）、リン脂質、たとえばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールもしくは1,2-
ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホン酸トリエチルアンモニウム（Man
oharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Aci
ds Res., 1990, 18, 3777）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Man
oharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969）、またはアダマ
ンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651）、パル
ミトイル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229）、
またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステ
ロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923）。
親油性部分を含むオリゴヌクレオチド、およびそのようなオリゴヌクレオチドを
製造する方法はUSP 5,138,045、5,218,105および5,459,255に開示されており、
それらの内容を本明細書に援用する。
【００３３】 本発明は、キメラオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドをも包含する
。本発明に関して”キメラ”オリゴヌクレオチドまたは”キメラ”は、2以上の
化学的に異なる領域を含み、それぞれが少なくとも1つのヌクレオチドから構成
されるオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは一般に、ヌク
レアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞取込みの増大、および／またはターゲッ
ト核酸に対する結合親和性の増大をオリゴヌクレオチドにもたらすようにオリゴ
ヌクレオチドが修飾された領域を少なくとも1つ含む。オリゴヌクレオチドの追
加領域は、RNA：DNAまたはRNA：RNAハイブリッドを開裂しうる酵素に対する基質
として作用するものであってよい。たとえばRNase Hは、RNA：DNA二重らせんのR
NA鎖を開裂する細胞エンドヌクレアーゼである。したがってRNase Hが活性化さ
れるとRNAターゲットが開裂し、これにより遺伝子発現のアンチセンス抑制効率
が大幅に高まる。RNAターゲットの開裂は、ゲル電気泳動、および必要ならば当
技術分野で既知の関連核酸ハイブリダイゼーションにより、ルーティンに検出で
きる。たとえばそのような”キメラ”は”ギャップマー（gapmer）”であってよ
い：これは、オリゴヌクレオチドの中央部分（”ギャップ（gap）”）がたとえ
ばRNase Hの基質として作用し、5'および3'部分（”ウィング（wing）”）がタ
ーゲットRNA分子に対してより高い親和性をもつように修飾されているがヌクレ
アーゼ活性を支持することはできないオリゴヌクレオチドである（たとえば2'-
フルオロまたは2'-メトキシエトキシ置換されている）。他のキメラには、”ウ
ィングマー（wingmer）”が含まれる：これは、オリゴヌクレオチドの5'部分が
たとえばRNase Hの基質として作用し、これに対し3'部分がターゲットRNA分子に
対してより高い親和性をもつように修飾されているがヌクレアーゼ活性を支持す
ることはできないオリゴヌクレオチドである（たとえば2'-フルオロまたは2'-メ
トキシエトキシ置換されている）か、あるいはその逆のオリゴヌクレオチドであ
る。
【００３４】 本発明によるオリゴヌクレオチドは、好ましくは約8〜約30のヌクレオチドを
含む。そのようなオリゴヌクレオチドは約15〜約25のヌクレオチドを含むことが
好ましい。当技術分野で知られているように、ヌクレオチドは隣接ヌクレオチド
にホスホジエステル、ホスホロチオエートその他の共有結合によって適切に結合
した塩基-糖の組合わせである。
【００３５】 本発明により使用するオリゴヌクレオチドは、周知の固相合成法で簡便かつル
ーティンに製造できる。そのような合成のための装置は、たとえばApplied Bios
ystems（カリフォルニア州フォスターシティー）など数社により販売されている
。そのほか、またはその代わりに、そのような合成のための当技術分野で知られ
ている他の任意の手段を採用できる。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導
体など、他のオリゴヌクレオチドの製造に同様な方法を用いることも知られてい
る。
【００３６】 本発明のオリゴヌクレオチドは、療法用化合物、診断用具、ならびに研究用試
薬およびキットとして使用できる。”療法のための使用”という用語は、本発明
のオリゴヌクレオチドをin vivoまたはex vivoで動物細胞に接触させることによ
る予防処置、待期的処置および治癒処置のための使用を含む。ex vivoで動物細
胞に接触させる場合、療法のための使用には、そのような細胞を本発明の1以上
のオリゴヌクレオチドで処理した後に動物に取り込ませることが含まれる。特定
の用途に拘束されるわけではないが、たとえば本発明のオリゴヌクレオチドによ
るT細胞増殖ex vivo調節は、APCにおけるB7タンパク質の発現を調節することが
望まれる場合に有効な治療様式として利用できる。たとえばB7-1タンパク質の発
現を阻害するオリゴヌクレオチドは、APC表面にあるB7-2タンパク質の利用能を
高め、したがってex vivoでT細胞に対するB7-2の副刺激作用を増強すると予想さ
れる（Levine et al., Science, 1996, 272, 1939）。
【００３７】 療法用としては、B7タンパク質の発現または活性を調節することにより治療ま
たは予防できる疾患または障害をもつ疑いのある動物を、たとえば本発明による
オリゴヌクレオチドの投与により処置する。本発明のオリゴヌクレオチドは、有
効量のオリゴヌクレオチドを医薬的に許容できる適切な希釈剤またはキャリヤー
に添加することにより、医薬組成物として使用できる。ウイルス性、真菌性およ
び代謝性の疾患に関連があるとされる遺伝子の発現を調節しうるアンチセンス、
三重らせんその他のオリゴヌクレオチドが同定された。アンチセンスオリゴヌク
レオチドはヒトに投与して安全であり、幾つかの臨床試験が現在行われている。
したがって、オリゴヌクレオチドは細胞、組織および動物、特にヒトの処置のた
めの処置方式に有用となるように設計できる有用な療法手段となりうることが確
認された。
【００３８】 本発明のオリゴヌクレオチドは、さらに細胞または組織の試料中におけるB7特
異性核酸の存在を検出するために使用できる。たとえば、5'末端をポリヌクレオ
チドキナーゼで32P標識することにより、放射性標識オリゴヌクレオチドを調製
できる（Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press, 1989, Volume 2, pg. 10.59）。次いで、B7メ
ッセージRNA（したがってB7タンパク質）を含む疑いのある細胞または組織の試
料に、放射性標識オリゴヌクレオチドを接触させ、試料を洗浄して、結合してい
ないオリゴヌクレオチドを除去する。試料中に残存する放射能は結合オリゴヌク
レオチドの存在を示し、これはそのオリゴヌクレオチドに対して相補的な核酸の
存在を示し、シンチレーション計数器その他のルーティン手段を用いて定量でき
る。こうして、これらのタンパク質をコードする核酸の発現が検出される。
【００３９】 本発明の放射性標識オリゴヌクレオチドは、組織のオートラジオグラフィーを
行って研究、診断または療法の目的でB7タンパク質の位置、分布および量を判定
するのにも使用できる。そのような試験では、組織切片を放射性標識オリゴヌク
レオチドで処理し、前記に従って洗浄し、次いでルーティンなオートラジオグラ
フィー法により写真乳剤に感光させる。現像すると、乳剤はB7遺伝子を発現して
いる領域に銀粒子の画像を生じる。銀粒子を定量すると、これらのタンパク質を
コードするmRNA分子の発現を検出することができ、これらの領域にオリゴヌクレ
オチドをターゲティングすることができる。
【００４０】 放射性標識の代わりにフルオレセインその他の蛍光タグと結合させた本発明の
オリゴヌクレオチドを用いて、B7核酸の発現を蛍光検出するための同様なアッセ
イ法を開発することができる。そのような結合は、蛍光標識アミダイトまたは制
御ポアガラス（CPG）カラムを用いる固相合成でルーティンに得られる。蛍光標
識アミダイトおよびCPGは、たとえばGlen Research（バージニア州スターリング
）から入手できる。
【００４１】 本発明は、B7タンパク質をコードする核酸をターゲティングするオリゴヌクレ
オチド、およびそのようなタンパク質をコードする核酸をターゲティングするオ
リゴヌクレオチド用いる。B7タンパク質発現の有無を検出するためのキットも作
製できる。そのようなキットは、適切な遺伝子、すなわちB7タンパク質をコード
する遺伝子をターゲティングするオリゴヌクレオチドを含む。適切なキットおよ
びアッセイ方式、たとえば”サンドイッチ”アッセイ法が当技術分野で知られて
おり、本発明のオリゴヌクレオチドに関する使用に容易に適合させることができ
る。本発明のオリゴヌクレオチドとB7タンパク質コード核酸のハイブリダイゼー
ションは、当技術分野で知られている方法で検出できる。そのような方法には、
オリゴヌクレオチドへの酵素の結合、オリゴヌクレオチドの放射性標識、または
他の適切な検出系が含まれる。B7タンパク質発現の有無を検出するためのキット
も作製できる。
【００４２】 本発明に関して”ハイブリダイゼーション”とは水素結合を意味し、これは相
補的ヌクレオチド間のワトソン-クリック、フーグスティーン型または逆フーグ
スティーン型水素結合であってよい。たとえばアデニンとチアミンは相補的ヌク
レオチド核酸塩基であり、水素結合の形成により対合する。本明細書中で用いる
”相補的”とは、2ヌクレオチド間で厳密に対合する能力を表す。たとえば、オ
リゴヌクレオチドの特定位置のヌクレオチドが、あるDNAまたはRNA分子の同一位
置のヌクレオチドと水素結合しうる場合、そのオリゴヌクレオチドとそのDNAま
たはRNAとはその位置において互いに相補的であるとみなされる。各分子におい
て対応する十分な数の位置が互いに水素結合しうるヌクレオチドで占められてい
る場合、そのオリゴヌクレオチドとそのDNAまたはRNAとは互いに相補的である。
したがって”特異的にハイブリダイズしうる”および”相補的”は、オリゴヌク
レオチドとDNAまたはRNAターゲットとの間で安定かつ特異的な結合が起きるのに
十分な程度の相補性または厳密な対合を表すために用いられる用語である。特異
的にハイブリダイズしうるためにオリゴヌクレオチドがそのターゲットDNA配列
に100％相補的である必要はないことは、当技術分野で理解されている。ターゲ
ットDNAまたはRNA分子へのオリゴヌクレオチドの結合がターゲットDNAまたはRNA
の正常な機能を妨害して機能を低下または喪失させ、かつ特異的に結合させたい
条件下で（すなわち、in vivoアッセイまたは療法処置の場合は生理的条件下で
、あるいはin vitroアッセイの場合はアッセイを実施する条件下で）非ターゲッ
ト配列に対するオリゴヌクレオチドの非特異的結合を避けるのに十分な程度の相
補性がある場合、そのオリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズすることが
できる。
【００４３】 療法用組成物の調製およびその後のそれらの投与は当業者に自明であると考え
られる。一般に療法用としては、そのような療法を必要とする患者に、本発明に
よるオリゴヌクレオチドを、普通は医薬的に許容できるキャリヤー中において、
患者の年齢および処置される障害または疾病状態の重症度に応じて0.01μg〜100
g／体重kgの用量で投与する。さらに処置方式は、個々の疾病または障害の性質
、その重症度および患者の全体的状態に応じて異なる期間続けられ、1日1回から
20年に1回にまで及ぶ。処置後、状態の変化および障害または疾病状態の症状の
軽減について患者を監視する。患者が現在の用量に有意に反応しない場合はオリ
ゴヌクレオチドの用量を増加し、あるいは障害もしくは疾病状態の症状の軽減が
みられた場合または障害もしくは疾病状態が消散した場合は用量を減らすことが
できる。
【００４４】 場合によっては、処置方式の有効性を高めるために他の療法処置と組み合わせ
て本発明のオリゴヌクレオチドで処置することがより有効であろう。本発明に関
して”処置方式”は、治療処置、待期的処置および予防処置を含めるものとする
。好ましい態様においては、本発明のオリゴヌクレオチドを抗炎症薬および／ま
たは免疫抑制薬、好ましくは細胞間接着分子（ICAM）（好ましくはICAM-1）をタ
ーゲティングする1以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドと併用する。本発明
のオリゴヌクレオチドと併用できる他の抗炎症薬および／または免疫抑制薬には
下記のものが含まれるが、これらに限定されない：可溶性ICAMタンパク質（たと
えばsICAM-1）、抗体-毒素結合体、プレドニソン、メチルプレドニソロン、アザ
チオプリン、シクロホスファミド、サイクロスポリン、インターフェロン類、交
感神経様作用薬、一般的な抗ヒスタミン薬（たとえば下記を含めたヒスタミンH1 受容体アンタゴニスト：マレイン酸ブロムフェニラミン、マレイン酸クロルフェ
ニラミン、マレイン酸ジクロルフェニラミン、塩酸トリポリジン、マレイン酸カ
ルビノキサミン、フマル酸クレマスチン、ジメンヒドリナート、塩酸ジフェンヒ
ドラミン、塩酸ジフェニルピラリン、コハク酸ドキシラミン、クエン酸トリペレ
ナミン、塩酸トリペレナミン、塩酸シクリジン、塩酸ヒドロキシジン、塩酸メク
リジン、塩酸メトジラジン、塩酸プロメタジン、酒石酸トリメプラジン、マレイ
ン酸アザタジン、塩酸シプロヘプタジン、テルフェナジンなど）、ヒスタミンH2 受容体アンタゴニスト（たとえばラニタジン）。一般にThe Merck Manual of Di
agnosis and Therapy, 15th Ed., Berkow et al., eds., 1987, ニュージャージ
ー州ローウェイ, pages 302-336 and 2516-2522参照。本発明化合物と併用する
場合、これらの薬剤を別個に、逐次、またはこれらの薬剤のうちの他の1種類以
上と組み合わせて、使用できる。
【００４５】 本発明の他の好ましい態様においては、一方のオリゴヌクレオチドを別個に用
いて達成できるより著しくB7分子の副刺激作用を阻害するために、第1のB7 mRNA
種（たとえばB7-1）をターゲティングするアンチセンスオリゴヌクレオチドと第
2のB7 mRNA種（たとえばB7-2）をターゲティングするアンチセンスオリゴヌクレ
オチドとを併用する。この態様に関連する方式では、両方の形のオータナティブ
スプライシングされたmRNAの発現を阻害するために、それぞれオータナティブス
プライシングされたB7-1またはB7-2 mRNAをターゲティングする2種類以上の本発
明オリゴヌクレオチドを互いに併用する。用いる調節剤の特異性によってはオー
タナティブスプライシングされたmRNAの一方の形の阻害ではある発症について十
分な発現低下が得られない場合があることは、当技術分野で知られている。した
がって、場合によっては、本発明方法のいずれかを実施するのに必要な程度にそ
のB7遺伝子の発現を阻害するために、そのような併用が望まれるであろう。
【００４６】 処置に成功した後、疾病状態の再発を防ぐために患者に維持療法を施すことが
望ましいであろう。その場合、オリゴヌクレオチドを0.01μg〜100g／体重kgの
維持用量で、1日1回以上ないし20年に1回投与する。自己免疫状態または炎症状
態になりやすいことが分かっているか、またはその疑いのある個体の場合、0.01
μg〜100g／体重kgの予防用量を1日1回以上ないし20年に1回投与することにより
、予防効果を得ることができる。同様に、ある医療処置の結果起きると予想され
る炎症状態、たとえば細胞、組織または臓器を個体に移植することにより生じる
移植片対宿主疾患に対して、個体の感受性を低下させることができる。
【００４７】 本発明の医薬組成物は、局所処置または全身処置のいずれが望ましいかに応じ
て、また処置すべき領域に応じて、多数の方法で投与できる。投与は、局所投与
（眼内投与、ならびに膣および直腸への送達を含めた粘膜投与を含む）、たとえ
ば粉末もしくはエアゾル剤の吸入もしくは吹入れによる肺への投与（ネブライザ
ーによる投与を含む）、気管内、鼻腔内、上皮および経皮、経口または非経口投
与であってよい。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉
内への注射もしくは注入；または頭蓋内、たとえばくも膜下もしくは脳室内投与
が含まれる。少なくとも1つの2'-O-メトキシエチル修飾を含むオリゴヌクレオチ
ドは、経口投与に特に有用であると考えられる。
【００４８】 局所投与用配合物には、経皮パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル
剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤および散剤を含めることができる。医薬用の一般
的なキャリヤー、水性、粉末または油性の基剤、増粘剤などが必要であるか、あ
るいは望ましい。コーティングしたコンドーム、手袋なども有用であろう。
【００４９】 経口投与用組成物には、散剤もしくは顆粒剤、水中もしくは非水性媒質中の懸
濁液剤もしくは液剤、カプセル剤、分包剤または錠剤が含まれる。増粘剤、芳香
剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤も望ましい。
【００５０】 非経口、くも膜下または脳室内投与用組成物には無菌水性液剤を含めることが
でき、これは緩衝剤、希釈剤その他の適切な添加物をも含有することができる。 投与法は処置される疾病状態の重症度および反応性に依存し、処置期間は数日
から数カ月まで、あるいは疾病状態が治癒または減退するまで続く。最適な投与
計画は、患者の体内薬物蓄積量の測定から計算できる。最適投与量、投与方法お
よび反復速度は当業者が容易に決定できる。最適投与量は個々のオリゴヌクレオ
チドの相対力価に応じて異なり、一般にin vitroおよびin vivo動物モデルにお
いて有効と認められたEC50に基づいて推定できる。一般に投与量は0.01μg〜100
g／体重kgであり、1日、週、月もしくは年に1回以上投与するか、または2〜20年
毎に1回投与しさえすればよい場合もある。
【００５１】 以下の実施例は本発明を説明するものであり、限定するためのものではない。
当業者はルーティン実験により、本明細書に記載する具体的な物質および方法に
対する多数の均等物を確認できるであろう。そのような均等物は本発明の範囲に
含まれるものとする。
【００５２】 以下の実施例は説明のために示したものにすぎず、本発明を限定するためのも
のではない。
【００５３】
【実施例】
実施例1：核酸の合成 オリゴヌクレオチド オリゴヌクレオチドを、ヨードを用いる酸化による標準的ホスホールアミダイ
ト化学を使用して、自動化DNA合成機で合成した。β-シアノエチルジイソプロピ
ルホスホールアミダイトは、Applied Biosystems（Foster City, CA）から購入
した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドについては、標準的酸化ボトルを
亜リン酸結合の段階的チア化のため、3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン-1,1-ジ
オキシドの0.2 Mアセトニトリル中溶液により置換した。チア化サイクルの待ち
工程を68秒に増やし、そしてその後キャップ工程を行った。
【００５４】 本発明の2'-フルオロホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、5'-ジメトキ
シトリチル-3'-ホスホールアミダイトを使用して合成し、そしてともに本出願の
譲受人と同一の譲受人に譲渡され、そして本明細書中で参考文献として援用され
る1990年1月11日に出願されたU.S. 特許出願シリアル番号463,358号および1990
年8月13日に出願されたシリアル番号566,977号中に開示されたように調製した。
2'-フルオロオリゴヌクレオチドは、ホスホールアミダイト化学を使用して、標
準的DNA合成プロトコールを若干修飾することにより、調製した：脱保護を、室
温でメタノール性アンモニア（methanolic ammonia）を用いて行った。
【００５５】 本発明の2'-メトキシ（2'-O-メチル）オリゴヌクレオチドを、テトラゾールお
よび塩基のパルス送達の後の待ち工程を360秒に増大させたこと以外は、2'-メト
キシβ-シアノエチルジイソプロピル-ホスホールアミダイト（Chemgenes, Needh
am MA）を使用してそして非修飾オリゴヌクレオチドのための標準的サイクルを
使用して、合成した。その他の2'-アルコキシオリゴヌクレオチドを、この方法
を修飾することにより、適切な2'-修飾アミダイト、たとえばGlen Research, In
c.（Sterling, VA）から入手可能なものなどを使用して、合成する。合成を開始
するために使用される3'-塩基は、2'-デオキシリボヌクレオチドであった。本発
明の2'-O-プロピルオリゴヌクレオチドは、この手法を若干修飾することにより
調製する。
【００５６】 本発明の2'-メトキシエトキシ（2'-O-CH2CH2OCH3）オリゴヌクレオチドは、Ma
rtinの方法（Helv. Chim. Acta 1995, 78, 486）にしたがって合成した。合成を
容易にするため、最後のヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドであった。全て
の2'-O-CH2CH2OCH3-シトシンは、5-メチルシトシンであり、これは、以下の方法
にしたがって合成した。
【００５７】 5-メチルシトシンモノマーの合成： 2,2'-無水［1-（β-D-アラビノフラノシル）-5-メチルウリジン］ 5-メチルウリジン（リボシルチミン、Yamasa, Choshi, Japanから商業的に入
手可能）（72.0 g、0.279 M）、ジフェニルカーボネート（90.0 g、0.420 M）お
よび炭酸水素ナトリウム（2.0 g, 0.024 M）を、DMF（300 mL）に対して添加し
た。混合物を攪拌しながら加熱して環流させ、発生した二酸化炭素ガスが制御的
に放出されるようにした。1時間後、若干暗色化した溶液を減圧下にて濃縮した
。得られたシロップを攪拌しながらジエチルエーテル（2.5 L）中に注いだ。生
成物は、ガム状物を形成した。エーテルをデカントし、そして残留物を最小量の
メタノール（約400 mL）中に溶解した。溶液を新しいエーテル（2.5 L）中に注
ぎ、堅いガム状物を得た。エーテルをデカントし、ガム状物を減圧オーブン中で
乾燥させ（60℃、1 mm Hgにて24時間）、固形物を得て、これを粉砕して薄い黄
褐色の粉末を得た（57 g、85％粗収率）。物質をさらなる反応のために使用した
。
【００５８】 2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン 2,2'-無水-5-メチルウリジン（195 g、0.81 M）、tris（2-メトキシエチル）
ホウ酸塩（231 g、0.98 M）および2-メトキシエタノール（1.2 L）を、2 Lのス
テンレス鋼圧力容器に添加し、そしてあらかじめ加熱した油浴中、160℃に静置
した。155〜160℃にて48時間加熱した後、容器を開け、溶液を蒸発させて乾燥さ
せ、そしてMeOH（200 mL）にて研磨した。残留物を熱アセトン（1 L）中に懸濁
した。不溶塩をろ過し、アセトン（150 mL）にて洗浄し、そしてろ過物を蒸発さ
せた。残留物（280 g）をCH3CN（600 mL）中に溶解し、そして蒸発させた。シリ
カゲルカラム（3 kg）を0.5％Et3NHを含有するCH2Cl2/アセトン/MeOH（20:5:3）
中でパックした。残留物をCH2Cl2（250 mL）中で溶解し、シリカ（150 g）上に
吸着させ、その後カラム上にロードした。生成物をパッキング溶媒により溶出し
、160 g（63％）の生成物を得た。
【００５９】 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン 2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン（160 g、0.506 M）をピリジン（250
mL）とともに共蒸発させ、そして乾燥した残留物をピリジン（1.3 L）中に溶解
した。ジメトキシトリチルクロリドの第一のアリコート（94.3 g、0.278 M）を
添加し、そして混合物を室温で1時間攪拌した。ジメトキシトリチルクロリドの
第二のアリコート（94.3 g、0.278 M）を添加し、反応物をさらに1時間攪拌した
。その後、メタノール（170 mL）を添加し、反応を停止させた。HPLCは、約70％
の生成物の存在を示した。溶媒を蒸発させ、そしてCH3CN（200 mL）により研磨
した。残留物をCHCl3（1.5 L）中に溶解し、そして2×500 mLの飽和NaHCO3およ
び2×500 mLの飽和NaClにより抽出した。有機相をNa2SO4上で乾燥させ、ろ過し
、そして蒸発させた。275 gの残留物を得た。残留物を3.5 kg シリカゲルカラム
上で精製し、パックし、そして0.5％Et3NHを含有するEtOAc/ヘキサン/アセトン
（5:5:1）により溶出した。純粋な画分を蒸発させ、164 gの生成物を得た。約20
gが不純物画分からさらに得られ、併せて183 g（57％）の収量を得た。
【００６０】 3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリ
ジン 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン（106 g、0
.167 M）、DMF/ピリジン（562 mLのDMFと188 mLのピリジンから調製された750 m
Lの3:1混合物）および無水酢酸（24.38 mL、0.258 M）をあわせ、そして室温で2
4時間攪拌した。反応物を、MeOHを添加することにより最初にtlcサンプルを急冷
することにより、tlcによりモニターした。tlcにより判断した場合に反応が終了
した際に、MeOH（50 mL）を添加し、混合物を35℃にて蒸発させた。残留物をCHC
l3（800 mL）中に溶解し、そして2×200 mLの飽和炭酸水素ナトリウムおよび2×
200 mLの飽和NaClにより抽出した。水相を200 mLのCHCl3により抽出し直した。
あわせた有機相を硫酸ナトリウムにより乾燥させ、そして蒸発させて、122 gの
残留物を得た（およそ90％の生成物）。残留物を3.5 kg シリカゲルカラム上で
精製し、そしてEtOAc/ヘキサン（4:1）を使用して溶出した。純粋な生成物画分
を蒸発させて、96 g（84％）を得た。
【００６１】 3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-
トリアゾールウリジン 第一の溶液を、3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチ
ル-5-メチルウリジン（96 g、0.144 M）をCH3CN（700 mL）中に溶解することに
より調製し、そして取り置いた。トリエチルアミン（189 mL、1.44 M）をトリア
ゾール（90 g, 1.3 M）のCH3CN（1 L）中溶液に添加し、-5℃まで冷却し、そし
てオーバーヘッドスターラーを使用して0.5時間攪拌した。POCl3を30分以上の時
間をかけて攪拌した溶液に0〜10℃を保ちつつ滴下し、そして得られた混合物を
さらに2時間攪拌した。第一の溶液を後者の溶液に対して45分間以上の時間をか
けて滴下した。得られた反応混合物をコールドルーム中で一晩保存した。塩を反
応混合物からろ過し、そして溶液を蒸発させた。残留物をEtOAc（1 L）中に溶解
し、そして不溶固形物をろ過により取り出した。ろ過物を1×300 mLのNaHCO3お
よび2×300 mLの飽和NaClにより洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させて蒸発さ
せた。残留物をEtOAcにより研磨して、表題化合物を得た。
【００６２】 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン 3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-
トリアゾールウリジン（103 g, 0.141 M）のジオキサン（500 mL）およびNH4OH
（30 mL）中溶液を、室温で2時間攪拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残留物
をMeOH（2×200 mL）とともに共沸させた。残留物をMeOH（300 mL）中に溶解し
、そして2リッターのステンレス鋼圧力容器に移した。NH3ガスで飽和させたMeOH
（400 mL）を添加し、そして容器を100℃まで2時間加熱した（tlcは転換の完了
を示した）。容器内容物を蒸発させて乾燥させ、そして残留物をEtOAc（500 mL
）中に溶解し、飽和NaCl（200 mL）により1回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウ
ム上で乾燥させ、そして溶媒を蒸発させて85 g（95％）の表題化合物表題化合物
を得た。
【００６３】 N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン（85 g、0.
134 M）をDMF（800 mL）中に溶解し、そして無水安息香酸（37.2 g、0.165 M）
を攪拌しながら添加した。3時間攪拌した後、tlcは反応が約95％完了したことを
示した。溶媒を蒸発させ、そして残留物をMeOH（200 mL）とともに共沸させた。
残留物をCHCl3（700 mL）中に溶解し、そして飽和NaHCO3（2×300 mL）および飽
和NaCl（2×300 mL）により抽出し、MgSO4上で乾燥させ、そして蒸発させて残留
物（96 g）を得た。残留物を0.5％Et3NHを含有するEtOAc/ヘキサン（1:1）を溶
出溶媒として使用して、1.5 kgシリカカラム上でクロマトグラフィーにかけた。
純粋生成物画分を蒸発させ、90 g（90％）の表題化合物を得た。
【００６４】 N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン-3'-アミダイト N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン（74 g、0.10 M）をCH2Cl2（1 L）中に溶解した。テトラゾールジイソプロ
ピルアミン（7.1 g）および2-シアノエトキシ-テトラ（イソプロピル）亜リン酸
（40.5 mL、0.123 M）を、窒素雰囲気下にて攪拌しながら添加した。得られた混
合物を室温で20時間攪拌した（tlcは反応が95％完了したことを示した）。反応
混合物を飽和NaHCO3（1×300 mL）および飽和NaCl（3×300 mL）により抽出した
。水性洗浄液をCH2Cl2（300 mL）により抽出し直し、そして抽出物をあわせ、Mg
SO4上で乾燥させ、濃縮した。得られた残留物を、EtOAc/ヘキサン（3:1）を溶出
溶媒として使用する1.5 kg シリカカラム上でのクロマトグラフィーにかけた。
純粋画分をあわせ、90.6 g（87％）の表題化合物を得た。
【００６５】 2'-O-（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトおよび2'-O-（ジメチル
アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト 2'-（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト 2'-（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト［これはまた
、当該技術分野において2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドア
ミダイトとしても知られる］を、以下の段落に記載するように調製する。アデノ
シン、シチジンおよびグアノシンヌクレオシドアミダイトを、環外アミンをアデ
ノシンおよびシチジンの場合にはベンゾイル部分により、グアノシンの場合には
イソブチリルにより保護化することを除き、チミジン（5-メチルウリジン）と同
様に調製する。
【００６６】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O2-2'-無水-5-メチルウリジン O2-2'-無水-5-メチルウリジン（Pro. Bio. Sint., Varese, Italy, 100.0g、0
.416 mmol）、ジメチルアミノピリジン（0.66 g、0.013 eq、0.0054 mmol）を、
周囲温度にて、アルゴン雰囲気下、そして機械的に攪拌しながら、乾燥ピリジン
（500 ml）中に溶解した。tert-ブチルジフェニルクロロシラン（125.8 g、119.
0 mL、1.1 eq、0.458 mmol）を一度に添加した。反応物を周囲温度にて16時間攪
拌した。TLC（Rf 0.22、酢酸エチル）は、反応が完了したことを示した。溶液を
減圧下にて濃縮し、濃厚な油状物を得た。これをジクロロメタン（1 L）および
飽和炭酸ナトリウム（2×1 L）およびブライン（1 L）の間で分配した。有機相
を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして減圧下で濃縮し、濃厚な油状物を得た。
油状物を酢酸エチルとエチルエーテルの1:1混合物（600mL）中に溶解し、そして
溶液を-10℃まで冷却した。得られた結晶生成物をろ過することにより回収し、
エチルエーテル（3×200 mL）により洗浄し、そして乾燥させ（40℃、1mm Hg、2
4時間）149 g（74.8％）の白色固体を得た。TLCおよびNMRは、純粋な生成物であ
る点で一致した。
【００６７】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-（2-ヒドロキシエチル）-5-メチル
ウリジン 2 Lのステンレス鋼の、攪拌しない圧力反応容器中に、テトラヒドロフラン中
ボラン（1.0 M、2.0 eq、622 mL）を添加した。ドラフトチャンバー中で手動で
攪拌しながら、エチレングリコール（350 mL、過剰量）を、水素ガスの発生が静
まるまで、はじめは注意深く添加した。5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O2-
-2'-無水-5-メチルウリジン（149 g、0.311 mol）および炭酸水素ナトリウム（0
.074 g、0.003 eq）を手動で攪拌しながら添加した。反応容器をシールし、油浴
中で内部の温度が160℃に達するまで加熱し、そしてその後16時間維持した（圧
力< 100 psig）。反応容器を周囲温度まで冷却し、開封した。TLC（所望の生成
物についてのRf 0.67、そして副産物であるara-TについてはRf 0.82、酢酸エチ
ル）は、約70％が生成物に変換したことを示した。さらに副産物が形成されるこ
とを防止するため、反応を停止し、減圧下（10〜1mm Hg）、温水浴（40-100℃）
中、エチレングリコールを除去するために使用されたより厳しい条件を用いて濃
縮した。［あるいは、いったん低沸点の溶媒を飛ばし、残った溶液を酢酸エチル
と水の間で分配することができる。生成物は有機相中にあるだろう。］残留物を
カラムクロマトグラフィーにより精製した（2 kgシリカゲル、1:1〜4:1の酢酸エ
チル-ヘキサン濃度勾配）。適切な画分をあわせ、ストリップ化し、乾燥させて
生成物を白色のパリパリの泡状物（84 g、50％）としたが、開始物質（17.4 g）
および純粋な再使用可能な開始物質20 gが混入していた。あまり純粋でない回収
された開始化合物に基づく収率は、58％であった。TLCおよびNMRは、99％純粋な
生成物である点で一致した。
【００６８】 2'-O-（［2-フタルイミドオキシ）エチル］-5'-t-ブチルジフェニルシリル- 5
-メチルウリジン 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-（2-ヒドロキシエチル）-5-メチル
ウリジン（20 g、36.98 mmol）を、トリフェニルホスフィン（11.63 g、44.36 m
mol）およびN-ヒドロキシフタルイミド（7.24g、44.36 mmol）とともに混合した
。その後それを高度減圧下にて2日間、40℃にてP2O5上で乾燥させた。反応混合
物をアルゴンによりフラッシュし、そして乾燥THF（369.8 mL、Aldrich, 確実に
シールされたボトル）を添加して透明や溶液を得た。ジエチル-アゾジカルボキ
シレート（6.98 mL、44.36 mmol）を反応混合物に対して滴下した。得られた濃
赤色が次の一滴を添加する直前の消失するように、添加速度を維持した。添加が
完了した後、反応物を4時間攪拌した。そのときまでに、TLCは反応が完了したこ
とを示した（酢酸エチル:ヘキサン、60:40）。溶媒を減圧下にて蒸発させた。得
られた残留物をフラッシュカラム上に静置しそして酢酸エチル:ヘキサン（60:40
）により溶出して、2'-O-（［2-フタルイミドオキシ）エチル］-5'-t-ブチルジ
フェニルシリル-5-メチルウリジンを白色泡状物（21.819 g、86％）として得た
。
【００６９】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-［（2-ホルムアドキシイミノオキシ
）エチル］-5-メチルウリジン 2'-O-（［2-フタルイミドオキシ）エチル］-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-
メチルウリジン（3.1 g、4.5 mmol）を乾燥CH2Cl2（4.5 mL）中に溶解し、そし
てメチルヒドラジン（300 mL、4.64 mmol）を-10℃〜0℃にて滴下した。1時間後
に、混合物をろ過し、ろ過物を氷冷CH2Cl2により洗浄し、そしてあわせた有機相
を水、ブラインで洗浄し、そして無水Na2SO4上で乾燥させた。溶液を濃縮して、
2'-O-（アミノオキシエチル）チミジンを得て、これをその後MeOH（67.5 mL）中
に溶解した。これに対して、ホルムアルデヒド（20％水溶液、w/w、1.1 eq.）を
添加して、得られた混合物を1時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去した；残留物
をクロマトグラフィーにかけ、5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-［（2-
ホルムアドキシイミノオキシ）エチル］-5-メチルウリジンを白色泡状物（1.95
g、78％）として得た。
【００７０】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-［N,N-ジメチルアミノオキシエチル
］-5-メチルウリジン 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-［（2-ホルムアドキシイミノオキシ
）エチル］-5-メチルウリジン（1.77 g、3.12 mmol）を、1M ピリジニウムp-ト
ルエンスルホネート（PPTS）の乾燥MeOH（30.6 mL）中溶液中に溶解した。シア
ノ水素化ホウ素ナトリウム（Sodium cyanoborohydride）（0.39 g、6.13 mmol）
をこの溶液に対して10℃、不活性雰囲気下にて添加した。反応混合物を、10℃に
て10分間攪拌した。その後、反応容器を氷浴から取りだし室温で2時間攪拌し、
反応をTLC（CH2Cl2中5％MeOH）によりモニターした。NaHCO3水溶液（5％、10 mL
）を添加し、そして酢酸エチル（2×20mL）により抽出した。酢酸エチル相を無
水Na2SO4上で乾燥させて、蒸発乾固させた。残留物を1 M PPTSのMeOH（30.6 mL
）中溶液中に溶解した。ホルムアルデヒド（20％ w/w、30 mL、3.37 mmol）を添
加し、反応混合物を室温で10分間攪拌した。反応混合物を氷浴中で10分間冷却し
、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（0.39 g、6.13 mmol）を添加し、反応混合物
を10℃にて10分間攪拌した。10分後、反応混合物を氷浴から取りだし、室温で2
時間攪拌した。反応混合物に対して、5％NaHCO3（25 mL）溶液を添加し、そして
酢酸エチル（2×25 mL）により抽出した。酢酸エチル相を無水Na2SO4上で乾燥さ
せ、そして蒸発乾固させた。得られた残留物をフラッシュカラムクロマトグラフ
ィーにより精製し、そしてCH2Cl2中5％MeOH溶液により溶出し、5'-O-tert-ブチ
ルジフェニルシリル-2'-O-［N,N-ジメチルアミノオキシエチル］-5-メチルウリ
ジンを白色泡状物（14.6 g、80％）として得た。
【００７１】 2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン トリエチルアミントリヒドロフルオリド（3.91 mL、24.0 mmol）を乾燥THFお
よびトリエチルアミン（1.67 mL、12 mmol、乾燥、KOH上で保存）中に溶解した
。ついで、このトリエチルアミン-2HFの混合物を5'-O-tert-ブチルジフェニルシ
リル-2'-O-［N,N-ジメチルアミノオキシエチル］-5-メチルウリジン（1.40 g、2
.4 mmol）に対して添加し、そして室温で24時間攪拌した。反応は、TLC（CH2Cl2 中5％MeOH）によりモニターした。溶媒を減圧下で除去し、残留物をフラッシュ
カラム上にのせ、そしてCH2Cl2中10％MeOHにより溶出して、2'-O-（ジメチルア
ミノオキシエチル）-5-メチルウリジン（766 mg、92.5％）を得た。
【００７２】 5'-O-DMT-2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン 2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン（750 mg、2.17 mmo
l）を高度減圧下、40℃にて一晩P2O5上で乾燥させた。ついで、無水ピリジン（2
0mL）ととも共蒸発させた。得られた残留物をアルゴン雰囲気下にてピリジン（1
1mL）中に溶解した。4-ジメチルアミノピリジン（26.5 mg、2.60 mmol）、4,4'-
ジメトキシトリチルクロリド（880 mg、2.60 mmol）を混合物に対して添加し、
そして反応混合物を全ての開始化合物が消失するまで室温で攪拌した。ピリジン
を減圧下にて除去し、そして残留物をクロマトグラフィーにかけ、そしてCH2Cl2 中10％MeOH（数滴のピリジンを含有する）により溶出し、5'-O-DMT-2'-O-（ジメ
チルアミノ-オキシエチル）-5-メチルウリジン（1.13 g、80％）を得た。
【００７３】 5'-O-DMT-2'-O-（2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン-3'
-［（2-シアノエチル）-N,N-ジイソプロピルホスホールアミダイト］ 5'-O-DMT-2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン（1.08 g
、1.67 mmol）をトルエン（20mL）とともに共蒸発させた。残留物に対して、N,N
-ジイソプロピルアミンテトラゾニド（0.29 g、1.67 mmol）を添加し、高度減圧
下、40℃にて一晩P2O5上で乾燥させた。ついで、反応混合物を無水アセトニトリ
ル（8.4 mL）中に溶解し、そして2-シアノエチル-N,N,N1,N1-テトライソプロピ
ルホスホールアミダイト（2.12 mL、6.08 mmol）を添加した。反応混合物を、不
活性雰囲気下、周囲温度にて4時間攪拌した。反応の進行は、TLC（ヘキサン:酢
酸エチル1:1）によりモニターした。溶媒を蒸発させ、残留物を酢酸エチル（70
mL）中に溶解し、そして5％NaHCO3水溶液（40 mL）により洗浄した。酢酸エチル
相を無水Na2SO4上で乾燥させ、そして濃縮した。得られた残留物をクロマトグラ
フィー（溶出液として酢酸エチル）にかけ、5'-O-DMT-2'-O-（2-N,N-ジメチルア
ミノオキシエチル）-5-メチルウリジン-3'-［（2-シアノエチル）-N,N-ジイソプ
ロピルホスホールアミダイト］を泡状物として得た（1.04 g、74.9％）。
【００７４】 2'-（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト 2'-（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト［当該技術分野におい
て2'-O-（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても知られる］を
、以下の段落に記載されるように調製する。アデノシン、シチジンおよびチミジ
ンヌクレオシドアミダイトを同様に調製する。
【００７５】 N2-イソブチリル-6-O-ジフェニルカルバモイル-2'-O-（2-エチルアセチル）-5
'-O-（4,4'-ジメトキシトリチル）グアノシン-3'-［（2-シアノエチル）-N,N-ジ
イソプロピルホスホールアミダイト］ 2'-O-アミノオキシエチルグアノシン類似体を、ジアミノプリンリボシドの選
択的2'-O-アルキル化により得ることができる。複数グラム量のジアミノプリン
リボシドをSchering AG（Berlin）から購入して、少量の3'-O-異性体を含む2'-O
-（2-エチルアセチル）ジアミノプリンリボシド類似体を提供することができる
。2'-O-（2-エチルアセチル）ジアミノプリンリボシドを分離して、アデノシン
デアミナーゼにより処理することにより2'-O-（2-エチルアセチル）グアノシン
に変換することができる（McGee, D. P. C., Cook, P. D., Guinosso, C. J., W
O 94/02501 A1 940203）。標準的保護手順により2'-O-（2-エチルアセチル）-5
'-O-（4,4'-ジメトキシトリチル）グアノシンおよび2-N-イソブチリル-6-O-ジフ
ェニルカルバモイル-2'-O-（2-エチルアセチル）-5'-O-（4,4'-ジメトキシトリ
チル）グアノシンを提供すべきであり、それを還元して2-N-イソブチリル-6-O-
ジフェニルカルバモイル-2'-O-（2-エチルアセチル）-5'-O-（4,4'-ジメトキシ
トリチル）グアノシンを提供することができる。前述の通り、ヒドロキシル基を
Mitsunobu反応を介してN-ヒドロキシフタルイミドにより置き換えることができ
、そして保護化されたヌクレオシドを通常のようにホスフィチル化（phosphityl
ated）して、2-N-イソブチリル-6-O-ジフェニルカルバモイル-2'-O-（2-エチル
アセチル）-5'-O-（4,4'-ジメトキシトリチル）グアノシン-3'-［（2-シアノエ
チル）-N,N-ジイソプロピルホスホールアミダイト］を得ることができる。
【００７６】 2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ（2'-DMAEOE）ヌクレオシドアミダイト 2'-ジメチルアミノエトキシエトキシヌクレオシドアミダイト（当該技術分野
においては、2'-O-ジメチルアミノエトキシエチル、すなわち2'-O-CH2-O-CH2-N
（CH2）2、または2'-DMAEOEヌクレオシドアミダイトとしても知られる）を、以
下のように調製する。その他のヌクレオシドアミダイトを同様に調製する。
【００７７】 2'-O-［2（2-N,N-ジメチルアミノエトキシ）エチル］-5-メチルウリジン 2［2-（ジメチルアミノ）エトキシ］エタノール（Aldrich, 6.66 g、50 mmol
）をテトラヒドロフラン中ボラン溶液（1 M、10 mL、10 mmol）に対して、100 m
Lのボンベ中にて、攪拌しながら、ゆっくりと添加した。固体が溶解するにつれ
て水素ガスが発生する。O2-,2'-無水-5-メチルウリジン（1.2 g、5 mmol）およ
び炭酸水素ナトリウム（2.5 mg）を添加し、ボンベをシールし、油浴中に静置し
て155℃で26時間加熱する。ボンベを室温まで冷却し、そして開封する。粗溶液
を濃縮し、そして残留物を水（200 mL）およびヘキサン（200 mL）の間で分配す
る。過剰のフェノールを、ヘキサン相中に抽出する。水相を酢酸エチル（3×200
mL）により抽出し、そしてあわせた有機相を水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウ
ム上で乾燥させて、濃縮した。残留物を、メタノール/メチレンクロリド1:20（2
％トリエチルアミンを有する）を溶出液として使用して、シリカゲル上にカラム
詰めした。カラム画分が濃縮されるにつれ、無色固体が形成され、それを回収し
て表題化合物を白色固体として得た。
【００７８】 5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-［2（2-N,N-ジメチルアミノエトキシ）エチル
）］-5-メチルウリジン 無水ピリジン（8 mL）、トリエチルアミン（0.36 mL）およびジメトキシトリ
チルクロリド（DMT-Cl、0.87 g、2 eq.）中0.5 g（1.3 mmol）の2'-O-［2（2-N,
N-ジメチルアミノ-エトキシ）エチル）］-5-メチルウリジンを添加し、1時間攪
拌する。反応混合物を水（200 mL）中に注ぎ、そしてCH2Cl2（2×200 mL）によ
り抽出する。あわせたCH2Cl2相を飽和NaHCO3溶液により洗浄し、ついで飽和NaCl
溶液により洗浄し、そして無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を蒸発させ
、その後MeOH:CH2Cl2:Et3N（20:1、v/v、1％トリエチルアミンを含む）を使用し
てシリカゲルクロマトグラフィーを行うことにより表題化合物を得る。
【００７９】 5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-［2（2-N,N-ジメチルアミノエトキシ）エチル
）］-5-メチルウリジン-3'-O-（シアノエチル-N,N-ジイソプロピル）ホスホール
アミダイト ジイソプロピルアミノテトラゾリド（0.6 g）および2-シアノエトキシ-N,N-ジ
イソプロピルホスホールアミダイト（1.1 mL、2 eq.）を、CH2Cl2（20 mL）中に
溶解した5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-［2（2-N,N-ジメチルアミノエトキシ）
エチル）］-5-メチルウリジン（2.17 g、3 mmol）の溶液に対して、アルゴン雰
囲気下にて添加する。反応混合物を一晩攪拌し、そして溶媒を蒸発させる。得ら
れた残留物を酢酸エチルを溶出液として使用するシリカゲルフラッシュカラムク
ロマトグラフィーにより精製し、表題化合物を得る。
【００８０】 精製： 制御孔ガラスカラム（Applied Biosystems）から切断し、濃水酸化アンモニウ
ム中で55℃にて18時間脱ブロック化した後、オリゴヌクレオチドを2.5容量のエ
タノールを使用して0.5 M NaClから2回沈殿させることにより精製した。分析的
ゲル電気泳動を20％アクリルアミド、8 M尿素、45 mM Tris-ホウ酸塩バッファー
、pH 7.0中で行った。オリゴデオキシヌクレオチドおよびそのホスホロチオエー
ト類似体を、電気泳動から80％以上の完全長物質であることを判断した。
【００８１】 B7アンチセンスオリゴヌクレオチド 公開されたヒトB7-1（hB7-1）およびマウス（mB7-1）mRNA配列（それぞれFree
man et al., J. Immunol., 1989, 143, 2714, and Freeman et al., J. Exp. Me
d., 1991, 174, 625）に対してハイブリダイズする配列を有する一連のオリゴヌ
クレオチドを設計した。これらのオリゴヌクレオチドの配列および修飾、hB7-1
mRNA上のその標的部位のそれぞれの位置を、表1および2に示す。同様に、ヒトB7
-2（hB7-2）およびマウスB7-2（mB7-2）mRNAの発行された配列（それぞれ、Azum
a et al., Nature, 1993, 366, 76; Chen et al., J. Immunol., 1994, 152, 49
29）に対してハイブリダイズするように設計した配列を有する一連のオリゴヌク
レオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドの配列および修飾、およびhB
7-2 mRNA上のその標的部位のそれぞれの位置を表3および4に記載する。ISIS 230
2（SEQ ID NO: 17）を含む、ICAM-1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドは、1996年5月7日に付与されたU.S. Patent No. 5,514,788中に記載されてお
り、これを本明細書中に参考文献として援用する。ISIS 1082（SEQ ID NO: 102
）およびISIS 3082（SEQ ID NO: 101）は以前に記載した（Stepkowski et al.,
J. Immunol., 1994, 153, 5336）。
【００８２】 最初のクローニングに引き続き、B7転写物の選択的スプライシング（alternat
ive splicing）現象が報告された。B7-1についての報告された選択的スプライシ
ングは、比較的単純であり、それによりもともと報告されたヒトおよびマウスB7
-1 cDNA配列の5'末端と比較して5'側に伸長されたメッセージを得る（Borriello
et al., J. Immunol., 1994, 153, 5038; Inobe et al., J. Immunol., 1996,
157, 588）。最初にB7-1配列を報告した参考文献中に見られるB7-1配列の番号を
残すために、表1および2においては、最初に報告された配列のこれら5'伸長中の
位置にマイナスの番号をつけた（5'伸長の最も3'側の塩基、位置-1で始まる）。
マウスB7-2転写物のプロセッシングは、これまでB7-1について報告されていたよ
りも、比較的より複雑である；たとえば、少なくとも5種の別個のマウスB7-2 mR
NA、および少なくとも2種の別個のヒトB7-2 mRNAを、選択的スプライシング現象
により生成することができる（Borriello et al., J. Immunol., 1995, 155, 54
90; 1995年2月2日に発行されたFreeman et al., WO 95/03408; Jellis et al.,
Immunogenet., 1995, 42, 85も参照）。これらのスプライシング現象の本質は、
異なる5'エクソンを使用して、別個のB7-2 mRNAを生成することであり、そのそ
れぞれが独自の5'配列を有するが、はじめに報告されたB7-2配列のいくつかまた
は全てからなる3'部分を共有する。結果として、B7-2メッセージの5'伸長中の位
置は、はじめに報告された配列中の位置とは1対1で関連づけることができない。
したがって、表3においては様々なセットの座標（WO 95/03408のSEQ ID NO: 1の
ものに対応）を、そして表4においてはエクソン番号（Borriello et al., J. Im
munol., 1995, 155, 5490中に示されたもの）を使用して、はじめに報告されたB
7-2配列中に含まれない標的配列の位置を特定する。さらに、これらの5'伸長さ
れたメッセージは、はじめに発行された配列中に示された開始コドンの上流に潜
在的な読み枠の開始コドンを含有し、簡単に言えば、そのような追加の潜在的開
始コドンは、表1〜4中の標的部位の記載中には示されていない。
【００８３】 表1〜4において、以下の略語を使用している：UTR、非翻訳領域；ORF、オープ
ンリーディングフレーム；tIR、翻訳開始領域；tTR、翻訳終了領域；FITC、フル
オレセインイソチオシアネート。化学的修飾は、以下の通りである。2'フルオロ
（2'F）、2'-メトキシ（2'MO）または2'-メトキシエトキシ（2'ME）修飾を有す
る残基を太字にし、修飾の型をそれぞれの略語により示す。それ以外であると示
していない場合には、残基間結合は、ホスホジエステル結合である；ホスホロチ
オエート結合は、上付きで“S”により示す（たとえば、TSA）。標的位置は、Fr
eemanら（J. Immunol., 1989, 143:2714（ヒトB7-1 cDNA配列；表1））、Freema
nら（J. Exp. Med., 1991, 174, 625（マウスB7-1 cDNA配列；表2））、Azumaら
（Nature, 1993, 366:76（ヒトB7-2 cDNA配列；表3））およびChenら（J. Immun
ol., 1994, 152:4929（マウスB7-2 cDNA配列；表4））にしたがって番号を付け
る。ヌクレオチド塩基コードは、37 C.F.R. §1.822(b)(1)中に示される。
【００８４】 表1：ヒトB7-1 mRNAを標的とするオリゴヌクレオチドの配列
【００８５】
【表１】
【００８６】
【００８７】 表2：マウスB7-1 mRNAを標的とするオリゴヌクレオチドの配列
【００８８】
【表２】
【００８９】 表3：ヒトB7-2 mRNAを標的とするオリゴヌクレオチドの配列
【００９０】
【表３】
【００９１】
【００９２】
【００９３】 表4：マウスB7-2 mRNAを標的とするオリゴヌクレオチドの配列
【００９４】
【表４】
【００９５】 cDNAクローン： ヒトB7-1についての配列をコードするcDNAを、逆転写/ポリメラーゼ連鎖反応
（RT-PCR)を使用することにより単離した。Daudi細胞（ATCC受託番号No. CCL 21
3)に由来するポリA+ RNAを、オリゴ-dTプライマーを用いて、標準的条件下にて
逆転写した。42℃にて30分間反応を行い、そして加熱不活性化させた後、反応混
合物（20μL)を水により100μLにした。ついで、RT反応物に由来する10μLのア
リコートを、5'プライマー、5'-GAT-CAG-GGT-ACC-CCA-AAG-AAA-AAG-TGA-TTT-GTC
-ATT-GC-3'（センス、SEQ ID NO: 20)および3'プライマー、5'-GAT-AGC-CTC-GAG
-GAT-AAT-GAA-TTG-GCT-GAC-AAG-AC-3'（アンチセンス、SEQ ID NO: 21)を使用し
て、50μLのPCR反応中で増幅した。
【００９６】 プライマーには、PCR産物をベクターpcDNA-3（Invitrogen, San Diego, CA)中
にサブクローニングするための独自の制限部位が含まれる。5'プライマーを、ク
ローニングに使用するために、公開されたヒトB7-1配列の塩基1〜26と同一性を
有し（Freeman et al., J. Immunol., 1989, 143, 2714; プライマーの位置13-3
8)そしてKpn I制限部位（プライマーの位置7〜12）を含むように設計した。3'プ
ライマーは、公開されたB7-1の配列の塩基1450〜1471と相補的であり（プライマ
ーの位置14〜35)そしてXho I制限部位（プライマーの位置7-12)を含むように設
計された。PCRの後、反応物をフェノールで抽出し、そしてエタノールを使用し
て沈殿させた。生成物を適切な制限酵素で消化し、そして完全長断片をアガロー
スゲルにより精製し、そして同一の酵素で消化することにより調製したベクター
pcDNA-3（Invitrogen, San Diego, CA)中にライゲーションした。得られた構築
物pcB7-1は、制限地図を作成し、および標準的手法を使用したDNA配列解析をす
ることにより確認した。マウスB7-1クローン、pcmB7-1は、マウスB-リンパ球細
胞株、70Z3から単離したRNAのRT-PCRにより、同様に単離した。
【００９７】 ヒトB7-2、位置1〜1391の配列をコードするcDNAもまた、RT-PCRにより単離さ
れた。Daudi細胞（ATCC accession No. CCL 213)から得たポリA+ RNAを、オリゴ
-dTプライマーを使用して、標準的条件下で逆転写した。42℃にて30分間反応を
行い、加熱不活性化させた後、反応混合物（20μL)を水により100μLにした。つ
いで、RT反応物に由来する10μLのアリコートを5'プライマー、5'-GAT-CAG-GGT-
ACC-AGG-AGC-CTT-AGG-AGG-TAC-GG-3'（センス、SEQ ID NO: 1)、および3'プライ
マー5'-GAT-AGC-CTC-GAG-TTA-TTT-CCA-GGT-CAT-GAG-CCA-3'（アンチセンス、SEQ ID NO: 2)を使用して、50μL PCR反応中で増幅した。
【００９８】 5'プライマーを、クローニングに使用するため、公開されたB7-2配列の塩基1
〜20と同一性を有し（Azuma et al., Nature, 1993, 366, 76 and Genbank Acce
ssion No. L25259; プライマーの位置13〜32)そしてKpn I部位（プライマーの位
置7〜12)を含むように設計した。3'プライマーを、公開されたB7-2についての配
列の塩基1370〜1391と相補的であり（プライマーの位置13〜33)そしてXho I制限
部位（プライマーの位置7〜12）を含むように設計した。PCRの後、反応物をフェ
ノールで抽出し、そしてエタノールを使用して沈殿させた。生成物を適切な制限
酵素で消化し、そして完全長断片をアガロースゲルにより精製し、そして同一の
酵素で消化することにより調製したベクターpcDNA-3（Invitrogen, San Diego,
CA）中にライゲーションした。得られた構築物pcB7-2は、制限地図を作成し、お
よび標準的手法を使用したDNA配列解析をすることにより確認した。
【００９９】 マウスB7-2クローン、pcmB7-2は、5'プライマー、5'-GAT-CAG-GGT-ACC-AAG-AG
T-GGC-TCC-TGT-AGG-CA（センス、SEQ ID NO: 99）、および3'プライマー5'-GAT-
AGC-CTC-GAG-GTA-GAA-TTC-CAA-TCA-GCT-GA（アンチセンス、SEQ ID NO: 100）を
使用して、P388D1細胞から単離したRNAのRT-PCRにより、同様に単離した。
【０１００】 5'プライマーは、公開されたB7-2配列（Chen et al., J. Immun., 1994, 152,
4929）の塩基1〜20と同一性を有し、一方3'プライマーは塩基1096〜1115と相補
的である。両方のプライマーは、cDNAクローンを調製するために使用される他の
5'プライマーおよび3'プライマー中に見いだされるそれぞれの制限酵素部位を組
み込む。RT-PCR生成物を、Xho IおよびKpn Iにより制限切断し、そしてpcDNA-3
（Invitrogen, San Diego, CA）中にライゲーションした。
【０１０１】 選択的スプライシング現象の結果得られるmRNAに対応するその他のcDNAクロー
ンを、適切な制限酵素部位を含有し、選択したB7 mRNAとの間で同一性（5'プラ
イマー）または相補性（3'プライマー）を有するプライマーを使用して、同様に
クローニングする。
【０１０２】 実施例2：オリゴヌクレオチドによるhB7-1発現のモジュレーション オリゴヌクレオチドがB7-1発現を阻害する能力を、トランスフェクトしたCOS-
7細胞中でのB7-1の細胞表面発現を、フローサイトメトリーにより測定すること
により、評価した。
【０１０３】 方法： T-175フラスコに、COS-7細胞（ATCC accession No. CRL 1651）を75％コンフ
ルエントでまいた。プラスミドpcB7-1を、標準的リン酸カルシウムトランスフェ
クションにより細胞中に導入した。4時間のトランスフェクションの後、細胞を
トリプシン処理し、そして12-ウェルディッシュ中に80％コンフルエントとなる
ようにまいた。細胞を1時間プラスチックに接着させ、ついでリン酸緩衝塩類溶
液（PBS）により洗浄した。OptiMEMTM（GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD）培地を1
5μg/mLのLipofectinTM（GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD）および指定された濃度
のオリゴヌクレオチドとともに添加した。さらに4時間の後、細胞をリン酸緩衝
塩類溶液（PBS）で洗浄し、そして同濃度の新鮮なオリゴヌクレオチドとともに
、10％仔ウシ血清（FCS）を含むDMEM（Dulbecco et al., Virol., 1959, 8, 396
; Smith et al., Virol., 1960, 12, 185）中でインキュベーションした。
【０１０４】 オリゴヌクレオチドのB7-1の細胞表面発現に対する効果をモニターするため、
処理されたCOS-7細胞を簡単なトリプシン処理により、オリゴヌクレオチド処理
の24〜48時間後に回収した。細胞をPBSにより洗浄し、ついで5μLの複合化抗-B7
-1-抗体（すなわち、抗-hCD80-FITC, Ancell, Bayport, MN；FITC：フルオロセ
インイソチオシアネート）を含む100μLの染色バッファー（PBS、0.2％BSA、0.1
％アジド）中に再懸濁した。細胞を4℃にて30分間染色し、PBSで洗浄し、0.5％
パラホルムアルデヒドを含有する300μL中に再懸濁した。細胞を回収し、そして
蛍光プロファイルをフローサイトメーターを使用して、決定した。
【０１０５】 結果： 表1に示されるオリゴヌクレオチドを、B7-1 cDNAを一過性に発現するCOS-7細
胞中にて、そのB7-1発現を阻害する能力について評価した。結果（図1）は、翻
訳開始領域を標的とするISIS 13805、および3'非翻訳領域（UTR）を標的とするI
SIS 13812が、50％以上のB7-1発現の阻害を有する最も活性の高いオリゴヌクレ
オチドであることを同定した。したがって、これらのオリゴヌクレオチドは非常
に好ましい。ISIS 13799（5'非翻訳領域を標的とする）、ISIS 13802（5'非翻訳
領域を標的とする）、ISIS 13806および13807（両方とも、ORFの5'領域を標的と
する）、そしてISIS 13810（ORFの中央部分を標的とする）は、35％〜50％のB7-
1発現の阻害を示した。したがって、これらの配列もまた、好ましい。
【０１０６】 オリゴヌクレオチドISIS 13800（これは、フローサイトメトリーアッセイにお
いてB7-1発現の阻害を本質的になんら示さなかった）、およびISIS 13805および
13812を、オリゴヌクレオチドの様々な濃度で、B7-1の細胞表面発現を阻害する
能力について評価した。これらのアッセイの結果を、図2に示す。ISIS 13812は
、約150 nMのIC50を有する、B7-1発現の優れた阻害剤であった。5' UTRを標的と
するISIS 13800は、本質的に不活性であった。
【０１０７】 実施例3：オリゴヌクレオチドによるhB7-2タンパク質のモジュレーション 最初のスクリーニングにおいて、hB7-2オリゴヌクレオチドがB7-2発現を阻害
する能力を、トランスフェクトしたCOS-7細胞中でのB7-2の細胞表面発現を、フ
ローサイトメトリーにより測定することにより評価した。使用した方法は、（1
）COS-7細胞を、標準的リン酸カルシウムトランスフェクションにより細胞中に
導入した、プラスミドpbcB7-2またはBBG-58、ヒトICAM-1（CD54）発現ベクター
（R&D Systems, Minneapolis, MN）によりトランスフェクトし、（2）使用した
オリゴヌクレオチドが表2に示されたオリゴヌクレオチドであり、そして（3）複
合化抗-B7-2抗体（すなわち、抗-hCD86-FITCまたは抗-CD86-PE, PharMingen, Sa
n Diego, CA; PE：フィコエリトリン）をフローサイトメトリーの間に使用する
こと以外は、実施例2に記載した方法と同様であった。
【０１０８】 結果： 結果を図3に示す。200 nMの濃度では、ISIS 9133、ISIS 9139およびISIS 1037
3は、50％以上の阻害活性を示し、そしてしたがって、非常に好ましい。これら
のオリゴヌクレオチドは、3'非翻訳領域（ISIS 9133）、翻訳開始領域（ISIS 91
39）そして5'非翻訳領域（ISIS 10373）を標的とする。同じ濃度で、それぞれが
ISIS 9133、ISIS 9139およびISIS 10373のスクランブル化対照であるISIS 10715
、ISIS 10716およびISIS 10721は、なんら阻害活性を示さなかった。ISIS 10367
およびISIS 10369により処理したところ、25％以上の阻害が得られ、そしてした
がって、これらのオリゴヌクレオチドもまた好ましい。これらのオリゴヌクレオ
チドは、5'非翻訳領域（ISIS 10367）および3'非翻訳領域（ISIS 10369）を標的
とする。
【０１０９】 実施例4：オリゴヌクレオチドによるhB7-2 mRNAのモジュレーション 方法： リボヌクレアーゼ保護アッセイのために、細胞を、オリゴヌクレオチド処理の
完了の18時間後に、Totally RNATMキット（Ambion, Austin, TX）を使用して、
回収した。アッセイのためのプローブを、プラスミドpcB7-2（linearized by di
gestion with Bgl II）およびpTRI-b-アクチン（Ambion Inc., Austin, TX）か
ら生成した。直線化プラスミドのSP6プロモーターに由来するIn vitro転写を、
α-32P-UTP（800 Ci/mmole）の存在下にて行い、B7-2の3'末端（位置1044〜1391
）に相補的なアンチセンスRNAを得た。プローブをDNase Iで処理した後ゲルで精
製し、DNAテンプレートを除去した。リボヌクレアーゼ保護アッセイを、RPA IIT M キット（Ambion）を使用して、製造者の指示に従って行った。全RNA（5μg）を
、42℃にて一晩、105 cpmのB7-2プローブまたは対照β-アクチンプローブとハイ
ブリダイズさせた。次いで、ハイブリダイゼーション反応物を37℃にて30分間、
0.4単位のRNase Aおよび2単位のRNase T1とともに処理した。保護化されたRNAを
沈殿し、10μLのゲルローディングバッファー中に再懸濁し、そして50％w/vの尿
素を含む6％アクリルアミドゲル上で、20 Wで電気泳動した。次いで、ゲルを露
光し、そしてPhosphorImager（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）を本質的
に製造者の指示に従って使用して、レーンを定量した。
【０１１０】 結果： オリゴヌクレオチド-媒介性hB7-2 mRNAモジュレーションの程度は、一般的にh
B7-2タンパク質について見られた効果と平行した（表5）。タンパク質発現（フ
ローサイトメトリー）アッセイによると、最も活性なオリゴヌクレオチドはISIS
9133、ISIS 9139および10373であった。試験されたオリゴヌクレオチドはいず
れも、いくつかの細胞において、β-アクチンmRNAの発現を阻害する効果を有さ
なかった。
【０１１１】 表5：hB7-2 mRNAを標的とするオリゴヌクレオチドの活性
【０１１２】
【表５】
【０１１３】 実施例5：追加のhB7-1およびhB7-2オリゴヌクレオチド 最初のスクリーニングにおいて同定されたオリゴヌクレオチドに対して修飾さ
れた構造および／または配列を有するオリゴヌクレオチドを調製した。これらの
オリゴヌクレオチドを、前の実施例に記載した方法を使用して、ヒトB7-2発現を
モジュレートする能力について評価した。
【０１１４】 ISIS 10373の20ヌクレオチドの配列に由来する15ヌクレオチドの配列を有する
オリゴヌクレオチドである、ISIS 10996もまた、調製しそして評価した。ISIS 1
0996は、ISIS 10373の配列中に含有される15ヌクレオチド、5'-GCG-AGC-TCC-CCG
-TAC（SEQ ID NO: 90）を含む。ISIS 10373および10996の両方とも、Azumaら（N
ature, 1993, 366, 76）に示されたhB7-2の配列の塩基1〜67を含むB7-2メッセー
ジ中に位置する、可能性のあるステム-ループ構造と重複する。それらの作用の
様式に関する特定の理論のいずれにも束縛されるわけではないが、ISIS 10373お
よびISIS 10996は、標的RNA中の二次構造において、ループ1偽-ハーフ-ノットと
して結合する潜在性を有する。1996年4月30日に付与され、その内容をこの明細
書中で参考文献として援用する、U.S. Patent 5,5152,438は、偽-ハーフ-ノット
の形成により、遺伝子発現をモジュレートするための方法について記載する。そ
れらの作用の様式とは関係なく、ISIS 10373よりも短い長さを有するにもかかわ
らず、15-merのISIS 10996は、B7-2タンパク質発現アッセイにおいて、それが由
来する20-merと同等の（あるいはそれ以上の）活性を有する（図4；ISIS 10721
は、ISIS 10373に対するスクランブル化対照である）。関連する16-merである、
ISIS 10889もまた、B7-2タンパク質発現アッセイにおいて活性である。しかしな
がら、構造的に関連する14-mer（ISIS 10995）、13-mer（ISIS 10994）、12-mer
（ISIS 10993）、11-mer（ISIS 10992）および10-mer（ISIS 10991）は、このア
ッセイにおいて、わずかな活性しか示さないかまたは何も活性を示さなかった。
ISIS 10996はさらに、以下のように誘導化された。
【０１１５】 完全に置換した誘導体（ISIS 11539）、“ギャップマー”（ISIS 11541および
11543）および“ウィングマー”（ISIS 11545および11547）を含む、2'メトキシ
エトキシ置換基を有するISIS 10996誘導体を調製した。実施例5において説明し
たように、2'メトキシエトキシ置換により、いくつかのヌクレアーゼ（たとえば
、RNase H）の活性が阻害されるが、しかし修飾されたオリゴヌクレオチドのそ
の標的RNA分子に対する親和性を亢進する。これらのオリゴヌクレオチドを、hB7
-2メッセージをモジュレートする能力あるいは実施例3、4、7および8の方法に従
う機能について、試験する。
【０１１６】 ISIS 10996誘導体を、それらが標的RNA分子、たとえばhB7-2メッセージに対し
てRNase Lを動員する能力について評価するために、調製した。RNase Lは、（2'
-5'）（A）nに結合し、それにより活性化され、続いてたとえばインターフェロ
ンにより活性化される際に（2'-5'）（A）n合成酵素によりATPから生成される。
RNase Lは、抗ウィルスメカニズムにおいて、そして細胞成長の制御においても
関与する（Sawai, Chemica Scripta, 1986, 21, 169; Charachon et al., Bioch
emistry, 1990, 29, 2550）。（2'-5'）（A）nに複合化された抗-B7オリゴヌク
レオチドの組み合わせは、結果としてRNase Lの活性化およびそのオリゴヌクレ
オチド配列に相補的なB7メッセージに対して標的化されることが予想される。以
下のオリゴヌクレオチドは、それらの5'末端の同一の配列（すなわち、ISIS 109
96の配列）および同一の（2'-5'）（A）4“キャップ”を有する：ISIS 12492、1
2495、12496および13107。アデノシル残基は、3'ドロキシル基を有し、そしてホ
スホロチオエート結合により互いに連結している。ヒトB7-2 RNAの部分に対して
配列相補性を有するオリゴヌクレオチドの（3'-5'）部分は、オリゴヌクレオチ
ドの（3'-5'）部分の5'残基から別のホスホロチオエート結合を介して“キャッ
プ”に結合するn-アミノヘキシルリンカーまでのホスホロチオエート結合を介し
て（2'-5'）（A）4“キャップ”と結合する。特定のメッセージに対してRNase L
を動員する能力について、この型の様々な化学的に多様なオリゴヌクレオチドを
試験するために、様々な化学的修飾を、以下に示す4種のオリゴヌクレオチドの
このセットに対して、作製した。ISIS 12496は、オリゴヌクレオチドの（3'-5'
）部分において非修飾オリゴヌクレオチドからなる。ISIS 13107において、ホス
ホロチオエート結合は、天然に存在する核酸中に見出されるリン酸結合を置換す
る。ホスホロチオエート結合はまた、ISIS 12492および12495中にも用いられて
おり、それらはさらに2'-メトキシエトキシ置換基を有する。これらのオリゴヌ
クレオチドを実施例3、4、7および8の方法に従って、hB7-2メッセージまたは機
能をモジュレートする能力について試験した。
【０１１７】 2'位に修飾を有するISIS 10996の誘導体を調製しそして評価した。修飾したオ
リゴヌクレオチドには、ISIS 11539（完全に2'-O-メチル）、ISIS 11541（2'-O-
メチル“ウィング”および中央部7-塩基“ギャップ”を有する）、ISIS 11543（
9-塩基ギャップを有する2'-O-メチルウィングを有する）、ISIS 11545（5' 2'-O
-メチルウィングを有する）およびISIS 11547（3' 2'-O-メチルウィングを有す
る）が含まれる。2'-O-メチルオリゴヌクレオチドのアッセイの結果は、以下の
とおりである。ISIS 10996の完全に2'O-メチル版である、ISIS 11539は、タンパ
ク質発現アッセイにおいて、まったく活性を有さなかった。ギャップ化オリゴヌ
クレオチドおよびウィング化オリゴヌクレオチド（ISIS 11541、11543、11545お
よび11547）は、それぞれ200 nMでいくらかの活性（すなわち、非処理細胞と比
較して60〜70％の発現）を示すが、しかし、親化合物であるISIS 10996により示
される活性（すなわち約50％の発現）より少ない。同様の結果は、RNA発現アッ
セイにおいても見られた。
【０１１８】 5' n-アミノヘキシルリンカーを介してコレステロールを結合したISIS 10373
の誘導体であるISIS 10782を調製した。コレステロールなどの親油性部分は、い
くつかの事例において、オリゴヌクレオチドの細胞による取り込みを亢進するこ
とが報告されているが、ただし取り込みが亢進される程度はあったとしても予想
できないものである。ISIS 10782および親油性部分を含むその他のオリゴヌクレ
オチドを、実施例3、4、7および8の方法に従って、B7-2メッセージまたは機能を
モジュレートする能力について試験した。
【０１１９】 以下のhB7-1オリゴヌクレオチドの一連の2'-メトキシエトキシ（本明細書にお
いては“2'ME”）および2'-フッ化物（本明細書においては“2'F”）“ギャップ
マー”誘導体、ISIS 12361（それぞれISIS 12348および12473）、ISIS 12362（I
SIS 12349および12474）、ISIS 12363（ISIS 12350および12475）、ISIS 12364
（ISIS 12351および12476）、ISIS 12365（ISIS 12352および12477）、ISIS 123
66（ISIS 12353および12478）、ISIS 12367（ISIS 12354および12479）、ISIS 1
2368（ISIS 12355および12480）、ISIS 12369（ISIS 12356および12481）および
ISIS 12370（ISIS 12357および12482）を調製した。2'-修飾部分はそうでないに
もかかわらず、オリゴヌクレオチドがその標的RNAに結合する際に、これらの誘
導体の中央部の非-2'-修飾部分（“ギャップ”）は、RNase H活性をサポートす
る。しかしながら、これらのオリゴヌクレオチドの2'-修飾“ウィング”は、そ
れらの標的RNA分子に対するその親和性を亢進する（Cook, Chapter 9 In: Antis
ense Research and Applications, Crooke et al., eds., CRC Press, Boca Rat
on, 1993, pp. 171-172）。
【０１２０】 別の2'修飾は、この位置にメトキシ（MO）基を導入することである。2'ME-修
飾オリゴヌクレオチドおよび2'F-修飾オリゴヌクレオチドのように、この修飾は
このようなオリゴヌクレオチドそしてその標的RNA分子から形成される二重鎖に
対するRNase Hの作用を阻害し、しかしその標的RNA分子についてのオリゴヌクレ
オチドの親和性を亢進する。ISIS 12914および12915は、最初のhB7-1転写物の選
択的スプライシング現象から生じる、選択的hB7-1 mRNA分子の5'非翻訳領域に相
補的な配列を含む。これらのオリゴヌクレオチドには、2'メトキシ修飾が含まれ
、そしてその結果として得られた亢進された標的親和性により、いくつかの組織
において低い割合で存在する場合がある選択的スプライシングされたB7-1 mRNA
分子に対して、より大きな活性を与える可能性がある（Inobe et al., J. Immun
., 1996, 157, 582）。同様に、その他の選択的hB7-1 mRNAに対するアンチセン
ス配列を含むISIS 13498および13499には、それらの標的分子に対するそれらの
親和性を亢進するために、2'メトキシエトキシ修飾が含まれ、そして2'メトキシ
エトキシあるいは2'メトキシ置換基がhB7-2オリゴヌクレオチドISIS 12912、129
13、13496および13497中に組み込まれている。これらのオリゴヌクレオチドを、
必要な場合には、標的細胞を適切な選択的スプライシングしたB7転写物に対応す
るcDNAクローンでトランスフェクトする以外は、本質的に実施例2の方法に従っ
てhB7-1をモジュレートする能力について試験するか、または実施例3、4、7およ
び8の方法に従ってhB7-2をモジュレートする能力について試験する。
【０１２１】 実施例6：アンチセンスモジュレーションの特異性 本発明のいくつかのオリゴヌクレオチドを、B7-2に対する活性との対比におい
て、B7-1に対するオリゴヌクレオチドの特異性を決定するために、細胞表面発現
を、フローサイトメトリーアッセイにおいて、評価した。このアッセイにおいて
試験されたオリゴヌクレオチドには、B7-1発現の阻害剤であるISIS 13812（図1
；実施例2）およびB7-2発現の阻害剤であるISIS 10373（図3；実施例3）が含ま
れる。このアッセイの結果は、図5に示す。ISIS 13812は、B7-2発現に対してほ
とんどまたはまったく影響を与えることなく、B7-1発現を阻害する。図5におい
てまた見られるように、ISIS 10373は、B7-1発現に対してほとんどまたはまった
く影響を与えることなく、B7-2発現を阻害する。ISIS 13812のスクランブル化対
照であるISIS 13872（SEQ ID NO: 37、AGT-CCT-ACT-ACC-AGC-CGC-CT）およびISI
S 13809（SEQ ID NO: 51）は、これらのアッセイ中に含まれ、そして本質的にB7
-1またはB7-2のいずれに対しても本質的に活性を有さないことが示された。
【０１２２】 実施例7：抗原提示細胞中でのオリゴヌクレオチドによるhB7-2発現のモジュレ
ーション ISIS 10373が抗原提示細胞（APCs）における天然のB7-2遺伝子からの発現を阻
害する能力を、以下のようにして評価した。
【０１２３】 方法： 単球を培養し、そして以下のようにオリゴヌクレオチドで処理した。樹状細胞
については、EDTA-処理した血液をPolymorphprepTM（1.113 g/mL；Nycomed, Osl
o, Norway）上に重層し、そして500×gで20℃にて30分間、沈降させた。単核細
胞をインターフェースから回収した。細胞をPBS、血清不含RPMI培地により洗浄
し（Moore et al., N.Y. J. Med., 1968, 68, 2054）、そしてついで5％ウシ胎
児血清（FBS）を含有するRPMIで洗浄した。単球を、プラスチックの細胞培養デ
ィッシュに37℃にて1時間接着させることにより選別した。接着させた後、細胞
をLipofectinTM（8μg/mL）を含有する血清不含RPMI中にてオリゴヌクレオチド
により処理した。4時間後、細胞を洗浄した。ついで5％FBSおよびオリゴヌクレ
オチドを含有するRPMIを、インターロイキン-4（IL-4；R&D Systems, Minneapol
is, MN）（66 ng/mL）および顆粒球-マクロファージコロニー-刺激因子（GM-CSF
；R&D Systems, Minneapolis, MN）（66 ng/mL）とともに、細胞に添加し、分化
を刺激した（Romani et al., J. Exp. Med., 1994, 180, 83, 1994）。細胞を48
時間インキュベートし、その後様々な分子の細胞表面発現をフローサイトメトリ
ーにより測定した。
【０１２４】 新鮮な血液から単離された単核細胞を、カチオン性脂質の存在下においてオリ
ゴヌクレオチドにより処理し、細胞の取り込みを促進させた。対照オリゴヌクレ
オチドとして、ISIS 2302（ICAM-1発現の阻害剤；SEQ ID NO: 17）もまた、細胞
に投与した。B7-2タンパク質の発現を、実施例2の方法に従って、フローサイト
メトリーにより測定した。前の実施例には記載されていないモノクローナル抗体
には、抗-hCD3（Ancell, Bayport, MN）および抗-HLA-DR（Becton Dickinson, S
an Jose, CA）が含まれる。
【０１２５】 結果： 図6にも示したように、ISIS 10373は、B7-2発現に対して、約250 nMのIC50の
顕著な阻害活性を有する。1μMの用量において、ISIS 10373はICAM-1発現に対し
てわずかな効果しか有さなかった。ICAM-1発現を阻害することが示された対照オ
リゴヌクレオチドであるISIS 2302（SEQ ID NO: 17）は、B7-2発現に対して効果
をなんら有さなかったが、約250 nMのIC50でICAM-1レベルを顕著に減少させた。
同様の条件下において、ISIS 10373は、フローサイトメトリーにより測定した場
合、B7-1、HLA-DRまたはCD3の細胞表面発現に影響しなかった。
【０１２６】 実施例8：オリゴヌクレオチドによるT細胞増殖のモジュレーション ISIS 2302およびISIS 10373がT細胞増殖を阻害する能力を、以下のように評価
した。オリゴヌクレオチドおよびサイトカイン（実施例6に示したもの）により
処理した単球を、T細胞増殖アッセイにおいて抗原提示細胞として使用した。分
化した単球を別のドナー由来のCD4+ T細胞と合わせた。48時間後に、増殖を［3H
］チミジン取り込みにより測定した。
【０１２７】 方法： T細胞増殖アッセイについて、細胞を、リンパ球を含有するより早く移動する
バンドをインターフェースのすぐ下から回収すること以外は、上述したように、
EDTA-処理した全血から単離した。細胞を実施例6に記載したように洗浄し、その
後赤血球をNH4Cl溶解により除去した。T細胞をT細胞濃縮カラム（R&D Systems,
Minneapolis, MN）を本質的に製造者の指示に従って使用して精製した。CD4+ T
細胞をさらに、製造者の指示に従って抗-CD8-結合磁気ビーズ（AMAC, Inc., Wes
tbrook, ME）によりCD8+細胞を枯渇させることにより、全T細胞集団から濃縮し
た。T細胞は、Cy-クローム-結合抗-CD4 mAb（PharMingen, San Diego, CA）を使
用したフローサイトメトリーにより、＞80％CD4+であることが決定された。
【０１２８】 抗原提示細胞（APCs）を実施例6に記載したように単離し、そしてマイトマイ
シンC（25μg/mL）により1時間処理した後、PBSにより3回洗浄した。APCs（105
細胞）をその後、350μLの培養培地中、4×104のCD4+ T細胞と合わせた。示され
た場合には、精製されたCD3 mAbもまた、1μg/mLの濃度で添加した。48時間のイ
ンキュベーション期間の最後の6時間の間、増殖をウェルあたり1.5μCiの［3H］
-チミジンの取り込みを決定することにより測定した。細胞をフィルター上で回
収し、そして放射活性をシンチレーションカウンターを使用して測定した。
【０１２９】 結果： 図7にも示したように、サイトカイン処理していない単核細胞は、わずかにT細
胞増殖を誘導したが、これはおそらく細胞上に発現した共刺激分子のレベルが低
かったからである。しかしながら、細胞をサイトカインで処理し、そして誘導し
て樹状様細胞に分化させると、ICAM-1およびB7-2の両方の発現が強力に亢進調節
された。この結果、単核球の誘導の前に、抗-ICAM-1オリゴヌクレオチド（ISIS
2302）または抗-B7-2オリゴヌクレオチド（ISIS 10373）のいずれかによりブロ
ックされうる、強力なT細胞増殖性応答が引き起こされた。対照オリゴヌクレオ
チド（ISIS 10721）は、T細胞増殖に対して有意な効果を示さなかった。抗-ICAM
-1オリゴヌクレオチド（ISIS 2302）と抗-B7-2オリゴヌクレオチド（ISIS 10373
）の両方による組み合わせ処理の結果、T細胞応答をさらに減少させた。
【０１３０】 実施例9：オリゴヌクレオチドによるマウスB7遺伝子のモジュレーション COS-7細胞中で一過性に発現させたマウスB7-2の発現を阻害することができる
オリゴヌクレオチド（表4を参照）を、以下の方法で同定した。マウスB7-2（mB7
-2）cDNAと相補的な一連のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、そのmB7-
2レベルを減少させる能力についてスクリーニングした（mB7-2 cDNAクローンで
トランスフェクトしたCOS-7細胞中での複合化抗-mB7-2抗体（すなわち、抗-mCD8
6-PE, PharMingen, San Diego, CA）を用いた以外は、実施例2に示すフローサイ
トメトリーにより測定した）。抗-mB7-2抗体は、受託番号No. HB-253でATCCに寄
託されたハイブリドーマから得てもよい。マウスB7-1発現をモジュレートするこ
とができるオリゴヌクレオチド（表2を参照）は、複合化抗-mB7-1抗体をmB7-1 c
DNAクローンによりトランスフェクトしたCOS-7細胞とともに使用すること以外は
、同様にして単離される。
【０１３１】 マウスB7-2については、同定された最も活性なオリゴヌクレオチドは、ISIS 1
1696（GGA-TTG-CCA-AGC-CCA-TGG-TG、SEQ ID NO: 18）であり、これはcDNAの位
置96〜115、すなわち翻訳開始（AUG）コドンを含む部位と相補的である。図8は
、ISIS 11696およびスクランブル化対照であるISIS 11866（CTA-AGT-AGT-GCT-AG
C-CGG-GA、SEQ ID NO: 19）についての用量反応曲線を示す。ISIS 11696は、COS
-7細胞中でのB7-2の細胞表面発現を200〜300 nMの範囲のIC50で阻害し、一方でI
SIS 11866は試験された最高濃度（1000 nM）で20％未満の阻害を示した。
【０１３２】 マウスB7-2アンチセンスオリゴヌクレオチドをさらに評価するため、IC-21細
胞株を使用した。IC-21単球／マクロファージ細胞株は、B7-1およびマウスB7-2
（mB7-2）の両方を、構成的に発現する。発現の2倍の誘導が、細胞をリポ多糖（
LPS；GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD）の存在下でインキュベーションすることに
より達成できる（Hathcock et al., Science, 1993, 262, 905）。
【０１３３】 IC-21細胞（ATCC；受託番号No. TIB 186）を、12-ウェルプレート中、10％FCS
を含むDMEM培地中にて、80％コンフルエントでまいた。細胞を一晩プレートに接
着させた。翌日、培地を取り除き、細胞PBSにより洗浄した。ついで15μg/mLのL
ipofectinTM（GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD）を添加した500μLのOptiMEMTM（G
IBCO-BRL, Gaithersburg, MD）をそれぞれのウェルに添加した。次いで、オリゴ
ヌクレオチドを指示された濃度で培地に対して直接的に添加した。4時間のイン
キュベーションの後、細胞をPBSで洗浄し、そして15μg/mLのLPSを添加した培養
培地中で一晩インキュベーションした。翌日、細胞をかき取って回収し、ついで
細胞表面発現をフローサイトメトリーにより解析した。
【０１３４】 ISIS 11696およびISIS 11866を、LipofectinTM（GIBCO-BRL, Gaithersburg, M
D）の存在下、IC-21細胞に対して投与した。結果を図9に示す。10μMの濃度にお
いて、ISIS 11696はmB7-2の発現を完全に阻害し（そして、mB7-2レベルを発現の
構成レベル以下まで減少させた）、その一方、スクランブル化対照オリゴヌクレ
オチドであるISIS 11866は、誘導された発現のレベルを40％減少させて生成した
。3μMの濃度において、誘導された発現レベルは、ISIS 11696により大幅に減少
したが、一方ISIS 11866はほとんど効果を有さなかった。
【０１３５】 2'置換基（たとえば、2'メトキシ、2'メトキシエトキシ）を含み、そしてマウ
スB7-1の選択的転写物（ISIS 12914、12915、13498、13499またはマウスB7-2選
択的転写物（ISIS 13100、13100および13102）を標的とする、修飾されたオリゴ
ヌクレオチドを調製した。適した選択的スプライシングしたB7転写物に対応する
cDNAクローンによりトランスフェクトしたIC-21細胞またはCOS-7を使用しする上
述した方法に従って、これらのオリゴヌクレオチドを、マウスB7をモジュレート
する能力について試験する。
【０１３６】 実施例10：オリゴヌクレオチドによる同種移植拒絶のモジュレーション 化合物が心臓同種移植片拒絶を阻害する能力を評価するためのマウスモデルが
、以前に記載された（Stepkowski et al., J. Immunol., 1994, 153, 5336）。
このモデルを使用して、B7タンパク質に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
のみの免疫抑制能を、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内接着分子
-1（ICAM-1）に対する免疫抑制能とともに、評価した。
【０１３７】 方法： BALB/cマウスの心臓同種移植片拒絶の研究およびオリゴヌクレオチド処理が、
本質的には以前に記載されたように行われた（Stepkowski et al., J. Immunol.
, 1994, 153, 5336）。使用されたアンチセンスオリゴヌクレオチドには、ISIS
11696、ISIS 3082（ICAM-1を標的とする）およびISIS 1082（ヘルペスウィルスU
L-13遺伝子配列を標的とする対照オリゴヌクレオチド）が含まれる。使用された
用量は、個々のオリゴヌクレオチドにつき（以下に示したように）1、2、2.5、5
または10 mg/kgである；オリゴヌクレオチドの組み合わせを投与した場合には、
それぞれのオリゴヌクレオチドを1、5または10 mg/kg（それぞれ2、10および20
mg/kgの全オリゴヌクレオチド用量）で与えられた。移植心臓の生存時間および
それらのホストの生存時間をモニターし記録した。
【０１３８】 結果： 非処理マウスの平均の生存時間は、8.2±0.8日（7、8、8、8、9、9日）であっ
た。マウスを7日間ISIS 1082（SEQ ID NO: 125、無関係の対照オリゴヌクレオチ
ド）で処理した場合、平均生存時間は若干減少し7.1±0.7日（5 mg/kg/日；6、7
、7、7、8、8）あるいは7.0±0.8日（10 mg/kg/日；6、7、7、8）となった。マ
ウスを7日間マウスB7-2オリゴヌクレオチドISIS 11696（SEQ ID NO: 108）で処
理した場合、平均生存時間が増加し、2種類の用量で9.3日（2 mg/kg/日、9.3±0
.6日、9、9、10；10 mg/kg/日、9.3±1.3日、8、9、9、11）となった。マウスを
7日間ICAM-1 オリゴヌクレオチド、ISIS 3082で処理した場合にも、いくつかの
用量でマウスの平均生存時間が増加した。具体的には、1 mg/kg/日の場合、平均
生存時間（MSD）は11.0±0.0（11、11、11）；2.5 mg/kg/日の場合、MSDは12.0
±2.7（10、12、13、16）；5 mg/kg/日の場合、MSDは14.1±2.7（10、12、12、1
3、16、16、17、17）；および10 mg/kg/日の場合、MSDは15.3±5.8（12、12、13
、24）であった。マウスを7日間それぞれ1 mg/kg/日のISIS 3082および11696で
処理した場合には、いくつかの相乗効果が見られた：MSDは13.8±1.0（13、13、
14、15）であった。
【０１３９】 実施例11：B7タンパク質をコードする核酸の検出 オリゴヌクレオチドを、合成後にポリヌクレオチドキナーゼにより5'末端を32 P-標識することにより、放射標識した（Sambrook et al., “Molecular Cloning
. A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Volu
me 2, pg. 11.31）。B7タンパク質をコードする核酸に対してハイブリダイズす
ることができる放射標識したオリゴヌクレオチドを、特異的なハイブリダイゼー
ションが生じうる条件下でB7タンパク質発現が疑われる組織または細胞サンプル
と接触させ、そしてサンプルを洗浄して非結合オリゴヌクレオチドを取り除く。
同様の対照を維持し、ここでは放射標識オリゴヌクレオチドを特異的ハイブリダ
イゼーションを可能にする条件下で正常組織または細胞と接触させ、そしてサン
プルを洗浄して非結合オリゴヌクレオチドを取り除く。サンプル中に放射活性が
残存することにより、結合オリゴヌクレオチドが示され、そしてそれをシンチレ
ーションカウンターまたは他の定法を使用して定量する。対照組織または細胞と
比較してサンプル中に大量の放射活性が残存することにより、B7遺伝子の発現の
増大を示し、一方で対照に対してサンプル中の放射活性が低量である場合には、
B7遺伝子の発現が低下したことが示される。
【０１４０】 放射標識した本発明のオリゴヌクレオチドもまた、オートらジオグラフィーに
て有用である。B7遺伝子の発現が疑われる組織切片を、放射標識したオリゴヌク
レオチドにより処理し、そして上述したように洗浄し、ついで標準的なオートラ
ジオグラフィー手法に従って写真用エマルジョンに曝露した。正常組織切片の対
照も維持する。発色させる場合、エマルジョンにより定量されるB7遺伝子を発現
する領域にわたって、銀粒子の画像を得る。B7発現の程度を、対照および試験サ
ンプルで観察された銀粒子を対比することにより決定する。
【０１４１】 B7遺伝子の発現の蛍光検出のための類似のアッセイにおいて、フルオレセイン
で標識するか、または他の蛍光タグで標識する本発明のオリゴヌクレオチドを使
用する。標識したオリゴヌクレオチドを、自動化DNA合成機（Applied Biosystem
s, Foster City, CA）で、標準的ホスホールアミダイト化学を使用して合成する
。b-シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイトは、Applied Biosystems
（Foster City, CA）から購入する。フルオレセイン-標識したアミダイトは、Gl
en Research（Sterling, VA）から購入する。オリゴヌクレオチドと生物学的サ
ンプルとのインキュベーションは、シンチレーションカウンターの代わりに、蛍
光顕微鏡を使用して蛍光を検出すること以外は、放射標識したオリゴヌクレオチ
ドについて上述したように行う。対照組織または細胞と比較してサンプル中の蛍
光がより多量の場合には、B7遺伝子の発現が増加したことを示し、一方対照と比
較してサンプル中の蛍光がより少ない量の場合には、B7遺伝子の発現が減少した
ことを示している。
【０１４２】 実施例12：キメラ（デオキシギャップ化）ヒトB7-1アンチセンスオリゴヌクレ
オチド ヒトB7-1を標的とする追加のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオ
チドは、ウィングおよび10デオキシヌクレオチドの中央領域で、5つの2'-O-メト
キシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドの領域を有する一様なホスホロチオエートキ
メラオリゴヌクレオチドとして合成した。オリゴヌクレオチド配列は、表6に示
す。
【０１４３】 オリゴヌクレオチドは、実施例4に記載するようにスクリーニングした。結果
を、表7に示す。 オリゴヌクレオチド22315（SEQ ID NO: 128）、22316（SEQ ID NO: 26）、223
17（SEQ ID NO: 129）、22320（SEQ ID NO: 132）、22324（SEQ ID NO: 135）、
22325（SEQ ID NO: 136）、22334（SEQ ID NO: 145）、22335（SEQ ID NO: 146
）、22337（SEQ ID NO: 148）、および22338（SEQ ID NO: 36）は、このアッセ
イにおいて、結果として50％またはそれ以上の阻害を引き起こした。
【０１４４】 表6：ヒトB7-1キメラ（デオキシギャップ化）オリゴデオキシヌクレオチドの
ヌクレオチド配列
【０１４５】
【表６】
【０１４６】 1 太字にした残基は、2'-メトキシエトキシ残基である（他のものは2'-デオキシ
-である）。すべての2'-メトキシエチルシトシンおよび2'-デオキシシトシン残
基は、5-メチル-シトシンである；すべての結合は、ホスホロチオエート結合で
ある。 2 Genbank受託番号No. M27533からの座標、座位名“HUMIGB7”。
【０１４７】 表7：キメラ（デオキシギャップ化）ホスホロチオエートオリゴデオキシヌク
レオチドによるヒトB7-1 mRNA発現の阻害
【０１４８】
【表７】
【０１４９】 より活性なオリゴヌクレオチドのいくつかについて、用量反応実験を行った。
オリゴヌクレオチドの濃度を表8に示す様に変化させた以外は、オリゴヌクレオ
チドを実施例4に記載したようにスクリーニングした。ミスマッチ対照オリゴヌ
クレオチドが含まれる。結果を、表8に示す。
【０１５０】 試験されたすべてのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、およそ60％またはそ
れ以上のmRNAの阻害を伴う用量反応性効果を示す。 表8：COS-7細胞のB7-1キメラ（デオキシギャップ化）アンチセンスオリゴヌク
レオチドに対する用量反応
【０１５１】
【表８】
【０１５２】 実施例13：キメラ（デオキシギャップ化）マウスB7-1アンチセンスオリゴヌク
レオチド マウスB7-1を標的とする追加のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレ
オチドを、ウィングおよび10デオキシヌクレオチドの中央領域において、5つの2
'-O-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドを有する一様なホスホロチオエート
キメラオリゴヌクレオチドとして合成した。オリゴヌクレオチド配列は、表9に
示す。
【０１５３】 オリゴヌクレオチドを、実施例4に記載するようにスクリーニングした。結果
を、表10に示す。 オリゴヌクレオチド18105（SEQ ID NO: 156）、18106（SEQ ID NO: 157）、18
109（SEQ ID NO: 160）、18110（SEQ ID NO: 161）、18111（SEQ ID NO: 162）
、18112（SEQ ID NO: 163）、18113（SEQ ID NO: 164）、18114（SEQ ID NO: 16
5）、18115（SEQ ID NO: 166）、18117（SEQ ID NO: 168）、18118（SEQ ID NO:
169）、18119（SEQ ID NO: 170）、18120（SEQ ID NO: 171）、18122（SEQ ID
NO: 173）、および18123（SEQ ID NO: 174）は、結果としてこのアッセイにおい
て、B7-1 mRNAのおよそ50％以上の阻害を引き起こした。
【０１５４】 表9：マウスB7-1キメラ（デオキシギャップ化）オリゴデオキシヌクレオチド
のヌクレオチド配列
【０１５５】
【表９】
【０１５６】 1 太字にした残基は2'-メトキシエトキシ残基である（その他は2'-デオキシ-で
ある）。すべての2'-メトキシエチルシトシンおよび2'-デオキシシトシン残基は
5-メチル-シトシンである；すべての結合はホスホロチオエート結合である。 2 Genbank受託番号No. X60958からの座標、座位名“MMB7BLAA”。
【０１５７】 表10：キメラ（デオキシギャップ化）ホスホロチオエートオリゴデオキシヌク
レオチドによるマウスB7-1 mRNA発現の阻害
【０１５８】
【表１０】
【０１５９】 実施例14：キメラ（デオキシギャップ化）ヒトB7-2アンチセンスオリゴヌクレ
オチド ヒトB7-2を標的とする追加のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオ
チドを、ウィングおよび10デオキシヌクレオチドの中央領域に5つの2'-O-メトキ
シエチル（2'-MOE）ヌクレオチドの領域を有する一様なホスホロチオエートキメ
ラオリゴヌクレオチドとして合成した。オリゴヌクレオチド配列を表11に示す。
【０１６０】 オリゴヌクレオチドを、実施例4に記載するようにスクリーニングした。結果
を表12に示す。 オリゴヌクレオチド22284（SEQ ID NO: 16）、22286（SEQ ID NO: 176）、222
87（SEQ ID NO: 177）、22288（SEQ ID NO: 178）、22289（SEQ ID NO: 179）、
22290（SEQ ID NO: 180）、22291（SEQ ID NO: 181）、22292（SEQ ID NO: 182
）、22293（SEQ ID NO: 183）、22294（SEQ ID NO: 184）、22296（SEQ ID NO:
186）、22299（SEQ ID NO: 189）、22300（SEQ ID NO: 190）、22301（SEQ ID N
O: 191）、22302（SEQ ID NO: 192）、22303（SEQ ID NO: 193）、22304（SEQ I
D NO: 194）、22306（SEQ ID NO: 196）、22307（SEQ ID NO: 197）、22308（SE
Q ID NO: 198）、22309（SEQ ID NO: 199）、22310（SEQ ID NO: 200）、および
22311（SEQ ID NO: 201）は、結果として、このアッセイにおいてB7-2 mRNAの50
％以上の阻害を引き起こした。
【０１６１】 表11：ヒトB7-2キメラ（デオキシギャップ化）オリゴデオキシヌクレオチドの
ヌクレオチド配列
【０１６２】
【表１１】
【０１６３】 1 太字にした残基は2'-メトキシエトキシ残基である（その他は2'-デオキシ-で
ある）。すべての2'-メトキシエチルシトシンおよび2'-デオキシシトシン残基は
5-メチル-シトシンである；すべての結合はホスホロチオエート結合である。 2 Genbank受託番号No. U04343からの座標、座位名“HSU04343”。
【０１６４】 表12：キメラ（デオキシギャップ化）ホスホロチオエートオリゴデオキシヌク
レオチドによるヒトB7-2 mRNA発現の阻害
【０１６５】
【表１２】
【０１６６】 用量反応実験を、いくつかのより活性なオリゴヌクレオチドで行った。オリゴ
ヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドの濃度を表13に示した様に変化させた以外
は、実施例4に記載したようにスクリーニングした。ミスマッチ対照オリゴヌク
レオチドが含まれた。結果を表13に示す。
【０１６７】 試験されたすべてのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、およそ50％またはそ
れ以上のmRNAの最大阻害を有する、用量反応性効果を示した。 表13：COS-7細胞のB7-2キメラ（デオキシギャップ化）アンチセンスオリゴヌク
レオチドに対する用量反応
【０１６８】
【表１３】
【０１６９】 実施例15：キメラ（デオキシギャップ化）マウスB7-2アンチセンスオリゴヌク
レオチド マウスB7-2を標的とする追加のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレ
オチドは、ウィングおよび10デオキシヌクレオチドの中央領域において5つの2'-
O-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチド領域を有する、一様なホスホロチオエ
ートキメラオリゴヌクレオチドとして合成した。オリゴヌクレオチド配列を表14
に示す。
【０１７０】 オリゴヌクレオチドを、実施例4に記載したようにスクリーニングした。結果
を表15に示す。 オリゴヌクレオチド18084（SEQ ID NO: 206）、18085（SEQ ID NO: 207）、18
086（SEQ ID NO: 208）、18087（SEQ ID NO: 209）、18089（SEQ ID NO: 211）
、18090（SEQ ID NO: 212）、18091（SEQ ID NO: 213）、18093（SEQ ID NO: 21
5）、18095（SEQ ID NO: 217）、18096（SEQ ID NO: 218）、18097（SEQ ID NO: 219）、18098（SEQ ID NO: 108）、18102（SEQ ID NO: 223）、および18103（S
EQ ID NO: 224）は、このアッセイにおいて、結果としてB7-2 mRNA発現の50％ま
たはそれ以上の阻害を引き起こした。
【０１７１】 表14：マウスB7-2キメラ（デオキシギャップ化）オリゴデオキシヌクレオチド
のヌクレオチド配列
【０１７２】
【表１４】
【０１７３】 1 太字にした残基は2'-メトキシエトキシ残基である（その他は2'-デオキシ-で
ある）。すべての2'-メトキシエチルシトシンおよび2'-デオキシシトシン残基は
5-メチル-シトシンである；すべての結合はホスホロチオエート結合である。 2 Genbank受託番号No. S70108からの座標、座位名“S70108”。
【０１７４】 表15：キメラ（デオキシギャップ化）ホスホロチオエートオリゴデオキシヌク
レオチドによるマウスB7-2 mRNA発現の阻害
【０１７５】
【表１５】
【０１７６】 実施例16：B7アンチセンスオリゴヌクレオチドの、細胞表面発現に対する効果 B7アンチセンスオリゴヌクレオチドを、B7-1およびB7-2の両方の細胞表面発現
に対するその効果について試験した。細胞表面発現を、実施例2に記載したよう
に測定した。実験を、ヒトB7およびマウスB7の両方について行った。ヒトB7につ
いての結果を、表16に示す。マウスB7についての結果を表17について示す。
【０１７７】 両方の種において、B7-1アンチセンスオリゴヌクレオチドは、B7-1の細胞表面
発現を特異的に減少させることができた。B7-2アンチセンスオリゴヌクレオチド
は、B7-2ファミリーのメンバーに対して特異的であった。これらのオリゴヌクレ
オチドはまた、B7-1およびB7-2 mRNAレベルに対するそれらの効果についても特
異的であった。
【０１７８】 表16：キメラ（デオキシギャップ化）ホスホロチオエートオリゴデオキシヌク
レオチドによるヒトB7細胞表面発現の阻害
【０１７９】
【表１６】
【０１８０】 表17：キメラ（デオキシギャップ化）ホスホロチオエートオリゴデオキシヌク
レオチドによるマウスB7細胞表面発現の阻害
【０１８１】
【表１７】
【０１８２】 用量反応実験を、いくつかのより活性なヒトB7-1アンチセンスオリゴヌクレオ
チドについて行った。オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドの濃度を表18
中に示すように変化させたこと以外は、実施例2に記載されたようにスクリーニ
ングした。結果を表18に示す。
【０１８３】 試験したすべてのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、およそ60％またはそれ
以上の細胞表面発現の阻害を有する、用量反応性効果を示した。 表18：COS-7細胞のB7-1キメラ（デオキシギャップ化）アンチセンスオリゴヌ
クレオチドに対する用量反応
【０１８４】
【表１８】
【０１８５】 用量反応実験を、いくつかのより活性なヒトB7-2アンチセンスオリゴヌクレオ
チドで行った。オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドの濃度を表19に示す
ように変化させた以外は、実施例2に記載するようにスクリーニングした。結果
を表19に示す。
【０１８６】 試験したすべてのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、85％またはそれ以上の
最大細胞表面発現の阻害を有する、用量反応性効果を示した。 表19：COS-7細胞のB7-2キメラ（デオキシギャップ化）アンチセンスオリゴヌ
クレオチドに対する用量反応
【０１８７】
【表１９】
【０１８８】 実施例17：リウマチ様関節炎についてのマウスモデルにおける、B7-アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの効果 コラーゲン誘導関節炎（CIA）を関節炎のマウスモデルとして使用した（Musse
ner,A., et al., Clin. Exp. Immunol., 1997, 107, 485-493）。6〜8週齢のメ
スDBA/1LacJマウス（Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME）を使用して、B7-
1アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性を評価した。
【０１８９】 0日において、マウスを尾の基部にて、完全Freundのアジュバント（CFA）中で
乳化する、100μgのウシII型コラーゲンを免疫化した。7日において、2回目の追
加投与量のコラーゲンを、同一経路から投与した。14日において、マウスに、10
0μgのLPSを皮下的に投与した。オリゴヌクレオチドを、-3日（0日の3日前）に
開始して研究期間のあいだ継続的に、腹腔内に毎日投与した（10 mg/kgボーラス
）。オリゴヌクレオチド17456（SEQ ID NO. 173）は、18122の完全なホスホロチ
オエート化類似体である。
【０１９０】 重量を毎週記録した。CIAの発症についてマウスを毎日観察した。影響を受け
た関節および影響を受けていない関節の足（paw）の幅および後肢の足関節（ank
le）の幅を、等張キャリパーを用いて1週間に3回測定した。四肢を臨床的に評価
し、そして0〜4のスケール（4が最高）で階級付けした。
【０１９１】 結果を表20に示す。B7-1およびB7-2アンチセンスオリゴヌクレオチドにより処
理することにより、疾患の発生を減少させることができたが、しかし重症度に対
しては適度の効果を有した。17456（SEQ ID NO. 173）および11696（SEQ ID NO.
108）の組み合わせは、疾患の発生およびその重症度を有意に減少させることが
できた。
【０１９２】 表20：B7アンチセンスオリゴヌクレオチドのCIAに対する効果
【０１９３】
【表２０】
【０１９４】 1 ピーク日は、それぞれの関節の測定について最大の腫脹の開始からの日数であ
る。 2 重症度は、全臨床スコアをグループ内のマウスの全数により割ったものである
。
【０１９５】 実施例18：多発性硬化症についてのマウスモデルにおけるB7-1アンチセンスオ
リゴヌクレオチドの効果 実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、一般に多発性硬化症についてのマウス
モデルとして受け入れられている（Myers,K.J., et al., J. Neuroimmunol., 19
92, 41, 1-8）。6〜12週齢のSJL/H、PL/J、（SJL×PL/J）F1、（SJL×Balb/c）F
1およびBalb/cのメスマウスを使用して、B7-1アンチセンスオリゴヌクレオチド
の活性を試験した。
【０１９６】 マウスを2本の後肢のパッドおよび尾の基部に、加熱死菌Mycobacterium tuber
culosisを添加した完全Freundのアジュバント中の、脳炎誘発性のタンパク質ま
たはペプチド（Myers,K.J., et al., J. of Immunol., 1993, 151, 2252-2260に
従う）からなるエマルジョンにより免疫化する。2日後、マウスに500 ngのBorda
tella pertussis毒素および追加のアジュバントを静脈内投与する。
【０１９７】 あるいは、疾患は、T細胞の養子移植により誘導することもできる。T細胞は、
CFA中の脳炎誘発性のタンパク質またはペプチドにより免疫化したマウスのリン
パ節の排出物から得られる。T細胞は、組織培養中で数日間培養され、そしてそ
の後ナイーブな同系レシピエント中に静脈内注入される。
【０１９８】 マウスをモニターし、そして毎日、尾の筋肉緊張の喪失、よろめく歩行、そし
て様々な程度の麻痺を含む、疾患のシグナルについて0〜5のスケールでスコア付
けする。
【０１９９】 完全にホスホロチオエート化された18122の類似体であるオリゴヌクレオチド1
7456（SEQ ID NO. 173）を、塩類溶液対照および完全にホスホロチオエート化さ
れたランダム配列のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド17460）と対比し
た。この実験の結果を、図11に示す。
【０２００】 図11に示すように、試験されたオリゴヌクレオチド17456のすべての用量につ
いて、防御的効果が存在する、すなわち、疾患重症度の減少が見られる。0.2 mg
/kgにおいて、この防御的効果は20日後に大きく減少し、しかし試験されたより
高用量では防御的効果は実験の経過（40日）を通じてそのままである。対照オリ
ゴヌクレオチドは、塩類対照により得られた結果と同様の結果をもたらした。
【０２０１】 実施例19：ヒトB7-1を標的とする追加のアンチセンスオリゴヌクレオチド ヒトB7-1を標的とする追加のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオ
チドは、ウィングおよび10デオキシヌクレオチドの中央領域において、5つの2'-
O-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドの領域を有する一様なホスホロチオエ
ートキメラオリゴヌクレオチドとして合成された。オリゴヌクレオチド配列は、
表21に示す。
【０２０２】 ヒト前単核球白血病細胞株、THP-1（American Type Culture Collection, Man
assas, VA）を、10％仔ウシ血清（FCS; Life Technologies, Rockville, MD）を
添加したRPMI 1640成長培地中で維持した。全量で1×107細胞を2 mmキュベット
中、10マイクロモルのオリゴヌクレオチド濃度で、Electrocell Manipulator 60
0装置（Biotechnologies and Experimental Research, Inc.）を用いて、200 V
、1000μFでエレクトロポレーションした。ついで、エレクトロポレーションし
た細胞をペトリ皿に移し、16時間回復させた。次いで、細胞を最終濃度1μg/ml
で16時間、LPSで誘導した。以前の実施例に記載したように、RNAを単離しそして
処理した。結果を表22に示す。
【０２０３】 オリゴヌクレオチド113492、113495、113498、113499、113501、113502、1135
04、113505、113507、113510、113511、113513および113514（SEQ ID NO: 228、
231、234、235、237、238、240、241、243、247、248、250および251）は、この
アッセイにおいて50％またはそれ以上の阻害を結果として引き起こした。
【０２０４】 表21：ヒトB7-1キメラ（デオキシギャップ化）オリゴデオキシヌクレオチドの
ヌクレオチド配列
【０２０５】
【表２１】
【０２０６】 1 太字にした残基は2'-メトキシエトキシ残基である（その他は2'-デオキシ-で
ある）。すべての2'-メトキシエチルシトシンおよび2'-デオキシシトシン残基は
5-メチル-シトシンである；すべての結合はホスホロチオエート結合である。 2 オリゴヌクレオチドの標的とされるGenbank受託番号No. M27533からの座標。
【０２０７】 表22：キメラ（デオキシギャップ化）ホスホロチオエートオリゴデオキシヌク
レオチドによるヒトB7-1 mRNA発現の阻害
【０２０８】
【表２２】
【０２０９】 実施例20：ヒトB7-2を標的とする追加のアンチセンスオリゴヌクレオチド ヒトB7-2を標的とする追加のオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオ
チドは、ウィングおよび10デオキシヌクレオチドの中央領域において、5つの2'-
O-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチドの領域を有する一様なホスホロチオエ
ートキメラオリゴヌクレオチドとして合成した。オリゴヌクレオチド配列は、表
23に示す。
【０２１０】 ヒト前単核球白血病細胞株、THP-1（American Type Culture Collection, Man
assas, VA）を、10％仔ウシ血清（FCS; Life Technologies, Rockville, MD）を
添加したRPMI 1640成長培地中で維持した。全量で1×107の細胞を2 mmキュベッ
ト中、10マイクロモルのオリゴヌクレオチド濃度で、Electrocell Manipulator
600装置（Biotechnologies and Experimental Research, Inc.）を用いて、200
V、1000μFでエレクトロポレーションした。ついで、エレクトロポレーションし
た細胞をペトリ皿に移し、16時間回復させた。次いで、細胞を、LPSおよびジブ
チリルcAMP（500μM）で16時間誘導した。以前の実施例に記載したように、RNA
を単離し、そして処理した。結果は表24に示す。
【０２１１】 オリゴヌクレオチドISIS 113131、113132、113134、113138、113142、113144
、113145、113146、113147、113148、113149、113150、113153、113155、113157
、113158、113159および113160（SEQ ID NO: 256、257、259、263、267、269、2
70、271、272、273、274、275、278、280、282、283、284および285）は、結果
としてこのアッセイにおいて、50％またはそれ以上のB7-2 mRNAの阻害を引き起
こした。
【０２１２】 表23：ヒトB7-2キメラ（デオキシギャップ化）オリゴデオキシヌクレオチドの
ヌクレオチド配列
【０２１３】
【表２３】
【０２１４】 1 太字にした残基は2'-メトキシエトキシ残基である（その他は2'-デオキシ-で
ある）。すべての2'-メトキシエチルシトシンおよび2'-デオキシシトシン残基は
5-メチル-シトシンである；すべての結合はホスホロチオエート結合である。 2 ISIS# 113131および113132については、Genbank受託番号No. L25259からの座
標、座位名“HUMB72A”。残りのオリゴヌクレオチドについては、Genbank受託番
号No.U04343からの座標、座位名“HSU04343”。
【０２１５】 表24：キメラ（デオキシギャップ化）ホスホロチオエートオリゴデオキシヌク
レオチドによるヒトB7-2 mRNA発現の阻害
【０２１６】
【表２４】
【０２１７】 実施例21：ヒト皮膚乾癬モデル 罹患したヒト組織の直接的な研究を行うことができるという理由で、乾癬患者
由来のヒト皮膚の異種移植に基づく乾癬の動物モデルが有利である。乾癬は、単
なる皮膚の疾患であり、そして結果としてヒト乾癬の皮膚をSCIDマウスへの移植
させることにより、マウスにおいて乾癬を高い信頼度で作製することができる。
このようなモデルの一つは、Damら（J. Invest. Dermatol., 1999, 113, 1082-1
089）のモデルである。簡単にいえば、真皮および表皮の両方を含有するケラト
ーマ（keratome）の生検を、乾癬の患者の臨床的な兆候を示していない皮膚また
は乾癬のプラークのいずれかから得る。ケラトーマを、400 Uのペニシリン/ml、
400μgのストレプトマイシン/mlおよび4 mgのゲンタマイシン/mlを添加したEarl
eのバランス化塩類溶液（GIBCO, Grand Island, NY）に移し、そして4℃で保存
する。6〜8週齢の麻酔されたC.B-17 SCIDマウス（Taconic Farms, Germantown,
NY）の側腹部に正所性（orthotopic）の移植をする直前に、ヒト皮膚異種移植片
（1.7×2.2×0.05 cm）をケラトーマから切り出し、そして移植片を吸収性の縫
合糸でそれぞれのSCIDマウスに固定し、そして包帯で1週間覆った。動物を処理
群にランダム化し、そして試験化合物（この場合には、ヒトB7-1オリゴヌクレオ
チドISIS 113492またはヒトB7-2オリゴヌクレオチドISIS 113131、または両方の
オリゴヌクレオチドの組み合わせ）を、30Gの針を使用して、異種移植片中に皮
内注入する。3〜4週間以内に、動物を犠死させ、そして4 mm穿孔の生検をそれぞ
れの異種移植片から取り出す。生検をパラフィン包埋用にホルマリン中で固定し
、および／またはクリオチューブに移しそして液体窒素中で急速冷凍し、そして
-80℃で保存する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 指示したオリゴヌクレオチドがCOS-7細胞におけるB7-1タンパク質発現に及ぼ
す阻害作用を示す棒グラフである。
【図２】 指示したオリゴヌクレオチドがB7-1タンパク質の細胞表面発現に及ぼす阻害作
用を示す用量応答曲線である。実線、ISIS 13812；破線、ISIS 13800；点線、IS
IS 13805。
【図３】 指示したオリゴヌクレオチドがCOS-7細胞におけるB7-2の細胞表面発現に及ぼ
す阻害作用を示す棒グラフである。
【図４】 指示したオリゴヌクレオチド［ISIS 10373（20-mer）およびISIS 10996（15-m
er）を含む］がCOS-7細胞におけるB7-2の細胞表面発現に及ぼす阻害作用を示す
棒グラフである。
【図５】 オリゴヌクレオチドによるB7-1またはB7-2タンパク質発現阻害の特異性を示す
棒グラフである。網目棒、B7-1濃度；斜線棒、B7-2濃度。
【図６】 ICAM-1に対する（ISIS 2302）またはB7-2に対する（ISIS 10373）アンチセン
ス配列をもつオリゴヌクレオチドがICAM-1およびB7-2タンパク質の細胞表面発現
に及ぼす阻害作用を示す用量応答曲線である。X付き実線、ISIS 10373で処理し
た細胞におけるB7-1タンパク質濃度；星印付き破線、ISIS 10373で処理した細胞
におけるICAM-1タンパク質濃度；三角形付き実線、ISIS 2302で処理した細胞に
おけるB7-1タンパク質濃度；四角付き破線、ISIS 10373で処理した細胞における
ICAM-1タンパク質濃度。
【図７】 指示したオリゴヌクレオチドがT細胞増殖に及ぼす作用を示す棒グラフである
。
【図８】 オリゴヌクレオチドがCOS-7細胞におけるネズミB7-2タンパク質発現に及ぼす
阻害作用を示す用量応答曲線である。星印付き実線、ISIS 11696；三角形付き破
線、ISIS 11866。
【図９】 オリゴヌクレオチドISIS 11696およびISIS 11866がIC-21細胞におけるネズミB
7-2タンパク質の細胞表面発現に及ぼす作用を示す棒グラフである。左（黒）の
棒、オリゴヌクレオチドなし；中央の棒、指示したオリゴヌクレオチド3μM；右
の棒、指示したオリゴヌクレオチド10μM。
【図１０】 種々の濃度のISIS 17456がEAEの重症度に及ぼす作用を示すグラフである。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１２月２１日（２００１．１２．２１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 17/06 Ａ６１Ｐ 17/06 19/02 19/02 29/00 29/00 １０１ １０１ 37/00 37/00 37/06 37/06 Ｃ０７Ｈ 21/00 Ｃ０７Ｈ 21/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヴィッカーズ，ティモシー・エイ アメリカ合衆国カリフォルニア州92057， オーシャンサイド，ルイセノ・アベニュー 253 (72)発明者 カラス，ジェームズ・ジー アメリカ合衆国カリフォルニア州92069， サン・マルコス，モンチュラ・ロード 1159 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 HA17 4B063 QA05 QQ03 QQ08 QQ41 QQ67 QR48 QS11 QS12 QS24 QS36 QX07 4C057 MM01 MM02 MM04 MM09 4C084 AA13 AA20 AA27 MA02 NA14 ZA891 ZA961 ZB011 ZB012 ZB021 ZB081 ZB082 ZB111 ZB112 ZB151 ZC611 ZC612 4C086 AA02 AA03 EA16 MA02 MA05 NA14 ZA89 ZA96 ZB01 ZB08 ZB11 ZB15

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 共有結合により結合したヌクレオチド8〜30個を含む化合物で
    あって、そのオリゴヌクレオチドがB7タンパク質をコードする核酸と特異的にハ
    イブリダイズしうる配列を有し、B7タンパク質の発現を調節するものである化合
    物。
  2. 【請求項２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の化
    合物。
  3. 【請求項３】 少なくとも1つの共有結合が修飾共有結合である、請求項1に記
    載の化合物。
  4. 【請求項４】 少なくとも1つのヌクレオチドが糖部分の修飾を有する、請求
    項1に記載の化合物。
  5. 【請求項５】 糖部分の修飾が、任意のヌクレオチドの2'位、3'末端ヌクレオ
    チドの3'位、または5'末端オリゴヌクレオチドの5'位における修飾である、請求
    項4に記載の化合物。
  6. 【請求項６】 少なくとも1つのヌクレオチドが核酸塩基の修飾を有する、請
    求項1に記載の化合物。
  7. 【請求項７】 オリゴヌクレオチドが、細胞による該オリゴヌクレオチドの取
    込みを促進する少なくとも1つの親油性部分を有する、請求項1に記載の化合物。
  8. 【請求項８】 B7タンパク質がヒトB7-1である、請求項1に記載の化合物。
  9. 【請求項９】 配列がSEQ ID NO:：228、231、234、235、237、238、240、241
    、243、247、248、250または251を含む、請求項8に記載の化合物。
  10. 【請求項１０】 B7タンパク質がヒトB7-2である、請求項1に記載の化合物。
  11. 【請求項１１】 配列がSEQ ID NO:：256、257、259、263、267、269、270、2
    71、272、273、274、275、278、280、283、284または285を含む、請求項10に記
    載の化合物。
  12. 【請求項１２】 請求項1に記載の化合物および医薬的に許容できるキャリヤ
    ーを含む組成物。
  13. 【請求項１３】 さらに抗炎症薬または免疫抑制薬を含む、請求項12に記載の
    組成物。
  14. 【請求項１４】 下記を含む組成物： （a）請求項8に記載の化合物； （b）請求項10に記載の化合物および （c）医薬的に許容できるキャリヤー。
  15. 【請求項１５】 さらに抗炎症薬または免疫抑制薬を含む、請求項14に記載の
    組成物。
  16. 【請求項１６】 細胞または組織におけるB7タンパク質の発現を調節する方法
    であって、細胞または組織に請求項1に記載の化合物を接触させることを含む方
    法。
  17. 【請求項１７】 細胞または組織が抗原提示細胞である、請求項16に記載の方
    法。
  18. 【請求項１８】 動物における炎症性または自己免疫性の疾患または状態を処
    置する方法であって、動物に療法有効量の請求項1に記載の化合物を投与するこ
    とを含む方法。
  19. 【請求項１９】 炎症性または自己免疫性の疾患または状態が乾癬、慢性関節
    リウマチまたは多発性硬化症である、請求項18に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 動物における炎症性または自己免疫性の疾患または状態を処
    置する方法であって、動物に療法有効量の請求項12に記載の化合物を投与するこ
    とを含む方法。
  21. 【請求項２１】 炎症性または自己免疫性の疾患または状態が乾癬、慢性関節
    リウマチまたは多発性硬化症である、請求項20に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 動物における炎症性または自己免疫性の疾患または状態を処
    置する方法であって、動物に療法有効量の請求項14に記載の組成物を投与するこ
    とを含む方法。
  23. 【請求項２３】 炎症性または自己免疫性の疾患または状態が乾癬、慢性関節
    リウマチまたは多発性硬化症である、請求項22に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 抗原提示細胞におけるT細胞応答を抑制する方法であって、
    抗原提示細胞に請求項1に記載の化合物を接触させることを含む方法。
  25. 【請求項２５】 動物における同種移植片拒絶を抑制する方法であって、動物
    に請求項1に記載の化合物を投与することを含む方法。
  26. 【請求項２６】 動物において同種移植片拒絶を抑制する方法であって、動物
    に抗炎症薬または免疫抑制薬および請求項1に記載の化合物を投与することを含
    む方法。
  27. 【請求項２７】 動物における同種移植片拒絶を抑制する方法であって、動物
    に請求項12に記載の組成物を投与することを含む方法。
  28. 【請求項２８】 動物にさらに抗炎症薬または免疫抑制薬を投与することを含
    む、請求項27に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 動物における同種移植片拒絶を抑制する方法であって、動物
    に請求項14に記載の組成物を投与することを含む方法。
  30. 【請求項３０】 動物にさらに抗炎症薬または免疫抑制薬を投与することを含
    む、請求項29に記載の方法。
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Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7115580B1 (en) * 1996-12-31 2006-10-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of B7 protein expression
US7235653B2 (en) * 1996-12-31 2007-06-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US20040115638A1 (en) * 2002-12-11 2004-06-17 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of tumor susceptibility gene 101 expression
ATE414539T1 (de) 2002-05-21 2008-12-15 Mayo Foundation Verfahren und materialien zur behandlung und diagnose von mit kallikrein-6 zusammenhängenden entzündlichen zuständen
AU2004231122B2 (en) 2003-04-15 2010-04-08 Xenon Pharmaceuticals Inc. Juvenile hemochromatosis gene (HFE2A), expression products and uses thereof
US7960355B2 (en) * 2003-05-23 2011-06-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
WO2005000202A2 (en) * 2003-05-23 2005-01-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the modulation of the expression of b7 protein
US7897582B2 (en) * 2003-05-23 2011-03-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
EP1713332A4 (en) * 2004-01-23 2010-08-18 Avi Biopharma Inc ANTISENSE OLIGOMERS AND METHOD FOR INDUCTION OF IMMUNOTHERAPY AND IMMUNOSUPPRESSION
AU2005244851B2 (en) 2004-05-12 2010-08-26 Baxter Healthcare S.A. Oligonucleotide-containing microspheres, their use for the manufacture of a medicament for treating diabetes type 1
JP2007537284A (ja) * 2004-05-12 2007-12-20 バクスター インターナショナル インコーポレイテッド 核酸マイクロスフェア、その生成および送達
EP2056883B1 (en) 2006-08-04 2021-09-22 Baxter International Inc. Microsphere-based composition for preventing and/or reversing new-onset autoimmune diabetes
AU2008242842B2 (en) 2007-04-17 2014-06-05 Baxter Healthcare Sa Nucleic acid microparticles for pulmonary delivery
ES2554168T3 (es) * 2008-04-18 2015-12-16 Baxter International Inc. Composición basada en microesferas para prevenir y/o revertir la diabetes autoinmune de nueva aparición
HUE055817T2 (hu) 2009-07-08 2021-12-28 Kymab Ltd Állatmodellek és terápiás molekulák
US20120204278A1 (en) 2009-07-08 2012-08-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
DK2757875T3 (en) 2011-09-19 2018-01-08 Kymab Ltd MANIPULATION OF IMMUNOGLOBULIN GENE DIVERSITY AND MULTI-ANTIBODY THERAPEUTICS
EP2761008A1 (en) 2011-09-26 2014-08-06 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
GB2496375A (en) * 2011-10-28 2013-05-15 Kymab Ltd A non-human assay vertebrate comprising human antibody loci and human epitope knock-in, and uses thereof
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
DE112014004537T5 (de) 2013-10-01 2016-07-21 Kymab Limited Tiermodelle und therapeutische Moleküle

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ209840A (en) 1983-10-17 1988-11-29 Kaji Akira A method of inhibiting viral propagation by hybridising dna with the viral rna thus blocking its action
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5194428A (en) 1986-05-23 1993-03-16 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of influenza virus replication by oligonucleotide phosphorothioates
US4806463A (en) 1986-05-23 1989-02-21 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of HTLV-III by exogenous oligonucleotides
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5004810A (en) 1988-09-30 1991-04-02 Schering Corporation Antiviral oligomers
US5098890A (en) 1988-11-07 1992-03-24 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Antisence oligonucleotides to c-myb proto-oncogene and uses thereof
US5087617A (en) 1989-02-15 1992-02-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for treatment of cancer using oligonucleotides
US5514788A (en) 1993-05-17 1996-05-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of cell adhesion
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5883082A (en) * 1990-08-14 1999-03-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for preventing and treating allograft rejection
US5166195A (en) 1990-05-11 1992-11-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibitors of the human immunodeficiency virus phosphorothioate oligonucleotides
US5135917A (en) 1990-07-12 1992-08-04 Nova Pharmaceutical Corporation Interleukin receptor expression inhibiting antisense oligonucleotides
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5242906A (en) 1991-04-22 1993-09-07 University Of North Carolina At Chapel Hill Antisense oligonucleotides against Epstein-Barr virus
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
AU661854B2 (en) 1991-06-27 1995-08-10 Bristol-Myers Squibb Company CTL4A receptor, fusion proteins containing it and uses thereof
US5747034A (en) 1992-07-09 1998-05-05 Chiron Corporation Methods and materials for the induction of T cell anergy
DE69333698T2 (de) 1992-07-20 2005-12-01 Isis Pharmaceutical, Inc., Carlsbad Pseudo-halbknoten ausbildende rna durch hybridisierung von antisenseoligonnukleotiden an gezielte rna sekundärstrukturen
DK0600591T3 (da) 1992-10-02 2003-08-25 Bristol Myers Squibb Co Inhibering af tumorcellevækst via indgivelse af B7-transfektede celler
WO1995003408A1 (en) 1993-07-26 1995-02-02 Dana-Farber Cancer Institute B7-2: ctl a4/cd 28 counter receptor
US5942607A (en) * 1993-07-26 1999-08-24 Dana-Farber Cancer Institute B7-2: a CTLA4/CD28 ligand
CA2168202A1 (en) * 1993-07-30 1995-03-16 Joseph Dougherty Efficient gene transfer into primary lymphocytes
AU7526894A (en) 1993-08-16 1995-03-14 Arch Development Corporation B7-2: ctla4/cd28 counter receptor
AU7638894A (en) 1993-09-03 1995-03-22 Miyuki Azuma B70(b7-2):ctla-4 bonding protein
JPH0779793A (ja) 1993-09-14 1995-03-28 Sumitomo Electric Ind Ltd Ｂ７０分子に対するモノクローナル抗体
AU2670995A (en) 1994-05-26 1995-12-21 Innogenetics N.V. New methods and compounds for the selective modulation of antigen-specific t-cell responsiveness
JPH10501815A (ja) 1994-06-07 1998-02-17 リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミネソタ 抗原特異的ｔ細胞応答の阻害方法
CA2201592A1 (en) 1994-10-03 1996-04-18 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secre Tary, Department Of Health And Human Services Enhanced immune response by introduction of cytokine gene and/or costimulatory molecule b7 gene in a recombinant virus expressing system
CA2207593A1 (en) * 1994-12-13 1996-06-20 John Gustofson Method and reagent for treatment of arthritic conditions, induction of graft tolerance and reversal of immune responses
US5877021A (en) * 1995-07-07 1999-03-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. B7-1 targeted ribozymes
JPH09291100A (ja) * 1996-04-24 1997-11-11 Sumitomo Electric Ind Ltd ラットｃｄ８６、その遺伝子及びその抗体
US6077833A (en) * 1996-12-31 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein

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WO2000074687A9 (en) 2002-07-04
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