JP2002539846A

JP2002539846A - インターロイキン−５シグナルトランスダクションのアンチセンスモジュレーション

Info

Publication number: JP2002539846A
Application number: JP2000608790A
Authority: JP
Inventors: ディーン，ニコラス・エム; カラス，ジェームズ・ジー; マッケイ，ロバート
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1999-03-26
Filing date: 2000-03-17
Publication date: 2002-11-26
Also published as: US20020128216A1; US20040121376A1; US6136603A; WO2000058512A1; AU3529800A; EP1192271A1

Abstract

(57)【要約】インターロイキン-5シグナルトランスダクションのアンチセンスモジュレーションための組成物および方法を提供する。インターロイキン-5およびインターロイキン-5受容体αをコードする核酸を標的とするアンチセンス化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチド、は好ましい。インターロイキン-5シグナルトランスダクションのモジュレーションおよびインターロイキン-5シグナルトランスダクションに関連する疾患の治療のためにこれらの化合物を使用する方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明はインターロイキン-5（IL-5）シグナル伝達を、IL-5および／あるいは
IL-5受容体α（IL-5Rα）の発現のモジュレーションを通して、モジュレートす
るための組成物および方法を提供する。特に、本発明はIL-5あるいはIL-5Rαを
コードする核酸と特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンス化合物、特にオリ
ゴヌクレオチドに関する。そのようなオリゴヌクレオチドは、IL-5およびIL-5R
αの発現を各々モジュレートすることが示されている。

【０００２】発明の背景サイトカインは比較的低分子量であり、細胞自身あるいは近接する細胞のどち
らかの機能を変える目的で細胞から分泌される薬理学的に活性を有するタンパク
質である。サイトカインは造血の重要な制御物質である。それらは細胞表面上の
特異的な受容体に結合することによりそれらの作用を発揮する。サイトカインの
中には、多くのインターロイキンならびに成長およびコロニー刺激因子がある。
インターロイキン-5（IL-5）は、白血球の１つの型であり骨髄から放出される好
酸球の成長、活性化、成熟、および生存の制御にとって重要なサイトカインであ
る。好酸球は、喘息の場合の肺あるいは好酸球増多筋痛の場合の筋肉など、組織
の長期慢性炎症により特徴付けられる特定の疾患（“好酸球性症候群”）の病原
を意味する。これらに加えて他の好酸球性症候群は、アレルギー性鼻炎およびア
トピー性皮膚炎を含む。好酸球は、悪性腫瘍の細胞性浸潤物の要素としても注目
されている。好酸球は傷あるいは炎症の部位に誘引され、そこでそれらは活性化
の処理を受ける。好酸球は喘息、特に喘息の長期間の反応、およびその他の炎症
性および／あるいはアレルギー性の状態の病原において根本的な役割をしている
ので、IL-5シグナルトランスダクションは臨床的に重要である。

【０００３】ヒトでは、IL-5は好酸球および好塩基球の分化および成熟を特異的に促進する
ことにおいて選択的である。血液および組織の好酸球増多は、アレルギーおよび
喘息における特徴的な異常であり、確信的な証拠によりIL-5はこの選択的好酸球
性炎症を制御する鍵となるサイトカインとしての意味をもつ。従って、IL-5の産
生あるいはエフェクター機能の阻害は、喘息およびその他の好酸球性疾患におい
て好酸球性要素を排除するであろうし、好酸球特異的炎症性媒介物質の放出によ
るさらなる組織の破壊を防ぐであろうし、潜在的には臨床的な利益を提供するで
あろう。実際、モノクローナル抗体を用いてIL-5を中和することで、モルモット
、マウス、およびサルにおいてアレルゲン攻撃により引き起こされる気管支肺胞
の好酸球増多を完全に阻害することができる。ヒトにおける肺の好酸球増多と喘
息の間には相関が存在しており、IL-5を選択的に阻害することで、動物モデルに
おける気道の過剰反応をブロックできることが明らかである。

【０００４】喘息は、一時的な気道障害、気管支の過剰反応の増加、および気道の炎症によ
り特徴付けられる。気道における活性化T細胞および好酸球の数および肺機能の
測定の一つである1秒間での努力呼気肺活量（FEV1）の異常、つまり気管支の反
応性の増加と喘息における臨床的な重症度の間には関連性が示されている。イン
ターロイキン-5（IL-5）mRNAおよびタンパク質レベルの両方が、アトピー性およ
び内因性の喘息患者の両方からの気管支の生検において増加することが記述され
ている。

【０００５】 IL-5は細胞表面のIL-5受容体（IL-5R）を媒介として細胞と相互作用する。IL-
5受容体はα-およびβ-サブユニットのヘテロ二量体である。IL-5受容体α-サブ
ユニットはIL-5Rに特異的であるのに対して、β-サブユニットはIL-3、IL-5、お
よび顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に共通である。
ヒトIL-5受容体（IL-5R）はin vitroで好酸球、好塩基球、およびBリンパ球に発
現するが、B細胞上での役割には疑問が残る。膜固定型の他にも、二つの型の可
溶性ヒトIL-5Rαが産生される。α鎖の膜型のみがβ鎖と複合体を形成し、シグ
ナル伝達に必要とされる。

【０００６】 T細胞由来IL-5と肺の好酸球増多の間の関連は、IL-5受容体αmRNAのレベルの
増加が喘息患者からの気管支の生検にも見出され、好酸球はこの増加したIL-5R
α発現の有力な部位である、という観察によりさらに強められる。さらに、IL-5
受容体の膜結合型を発現する好酸球のサブセットはFEV1と逆比例の相関があり、
一方、受容体の可溶性型を発現するサブセットはFEV1と正比例の相関がある。こ
れらの観察により、IL-5受容体αアイソフォームの発現は臨床的予後の決定にお
いて主要な重要性をもつことが示唆される。受容体の可溶性型は喘息性の患者に
有益な役割を供給しうる。それゆえ、喘息およびその他の好酸球性症候群におい
て好酸球増多を防止する効果的な治療的アプローチは、膜だけでなく可溶性IL-5
受容体の発現を選択的に阻害することが必要であろう、と現在は信じられている
。加えて、アレルゲン誘導好酸球増多、遅い時期の気道反応、および気管支の過
剰反応性のいくつかの動物および肺エクスプラント（explant）モデルがあり、
これらはIL-5および気道の好酸球増多および肺機能の低下の間の関連を集約的に
支持する。

【０００７】 IL-5機能の阻害に対するいくつかのアプローチが試されている。キメラ化、人
体への適応化（humanized）およびその他のインターロイキン-5（IL-5）モノク
ローナル抗体（mAbs）、および医薬組成物および治療的方法は、WO 96/21000に
開示される。IL-5 mRNAを切断するリボザイムはWO 95/23225に開示される。二つ
のホスホロチオエート結合を有する16merホスホジエステルオリゴデオキシヌク
レオチドは、IL-5 mRNAを標的とし、ヒト末梢血単核細胞によるIL-5の分泌を阻
害するために使用された（WeltmanとKarim, Allergy Asthma Proc., 1998, 19,
257-261; Sept.-Oct. 1998）。アデノシン除去（free）アンチセンスオリゴヌク
レオチドを気道上皮に本質的に投与することにより気道の疾患を治療する方法は
、WO 96/40162に開示される。IL-5およびIL-5受容体は開示されるアンチセンス
標的の中にある。

【０００８】従って、特に喘息およびその他の反応性気道疾患の治療および予防において、
IL-5シグナルトランスダクションをモジュレートする組成物および方法の必要性
が長い間所望されている。

【０００９】発明の概要本発明はアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関し、それらはIL-5
あるいはIL-5Rαをコードする核酸を標的とするものであり、これらの遺伝子標
的の発現をモジュレートするものである。本発明のアンチセンス化合物を含む医
薬的およびその他の組成物も提供する。さらに、本発明の一つあるいはそれ以上
のアンチセンス化合物あるいは組成物と細胞あるいは組織を接触させることを含
む、前記の細胞あるいは組織においてIL-5および／あるいはIL-5Rαの発現をモ
ジュレートする方法を提供する。さらに、本発明の一つあるいはそれ以上のアン
チセンス化合物あるいは組成物と細胞あるいは組織を接触させることを含む、前
記の細胞あるいは組織においてIL-5シグナル伝達をモジュレートする方法を提供
する。さらに、本発明の一つあるいはそれ以上のアンチセンス化合物あるいは組
成物の、治療的あるいは予防的に効果的な量を投与することによって、IL-5シグ
ナル伝達あるいはIL-5あるいはIL-5Rαに関連する疾患あるいは状態となってい
る、あるいはなりやすいという疑いのある動物、特にヒトを治療する方法を提供
する。

【００１０】発明の詳細な説明本発明は、IL-5シグナルトランスダクションを、好ましくはIL-5あるいはIL-5
受容体αの発現をモジュレートすることにより、モジュレートできるアンチセン
ス化合物を包含する。これらの化合物は、研究および、予防的なものを含めた治
療的な使用の両方にとって有用である。

【００１１】ヒトIL-5受容体α遺伝子は14のエクソンを含有する。受容体の一つの膜固定型
（membrane-anchored form）および二つの可溶性型が同定されている。ヒトIL-5
受容体αの膜固定型をコードするmRNA転写物は、エクソン1-10および12-14を含
有する。エクソン11は変異スプライシング事象（alternative splicing event）
によりスプライシングされて除去される。主要な可溶性アイソフォーム（可溶性
型1）は、エクソン11中の正常スプライシング事象およびインフレーム（in-fram
e）停止コドンの結果として産生される。他の可溶性型（可溶性型2）はスプライ
シングされないで産生し、それゆえエクソン11内で読むことより生成される（Tu
ypensら Eur. Cytokine Netw., 1992, 3, 451-459）。

【００１２】マウスIL-5受容体αの膜型をコードするmRNAは11のエクソンを含有する。受容
体の経膜的ドメインはエクソン9にコードされる。受容体の可溶性（分泌性）型
をコードするmRNAは、ディファレンシャルなスプライシング事象の結果である。
受容体の可溶性型1をコードするmRNAはエクソン9を欠いており（エクソン8はエ
クソン10にスプライシングされる）、可溶性型2をコードするmRNAはエクソン9お
よび10を欠いている（エクソン8はエクソン11にスプライシングされる）（Imamu
raら、DNA and Cell Biol., 1994, 13, 283-292）。

【００１３】マウスおよびヒトの両方には、IL-5受容体αの可溶性型および膜結合型の両方
が存在する。マウスでは、可溶性型が発現するが、通常実験は外来性組換え可溶
性受容体を加えることで行われる。組換えマウスIL-5受容体αはIL-5を結合し、
IL-5反応性Y16B細胞株の増殖を阻害しない。in vivoでは、組換え可溶性マウスI
L-5受容体αは、抗原-誘導気道好酸球増多を抑制する。ヒトでは、組換えヒト可
溶性IL-5受容体αはヒトIL-5を結合し、in vitroでその生物学的活性を阻害する
、すなわちTF-1の増殖および生存を妨げる。言い換えると、ヒトの系では、可溶
性IL-5受容体αはスポンジ（sponge）として作用して、IL-5サイトカインを結合
してその効果をブロックする。IL-5受容体αの膜結合型のみがIL-5シグナルを変
換（transduce）することができる。可溶性ヒトIL-5受容体αは正常ではヒトの
生物学的液体には検出されない；しかし、可溶性ヒトIL-5受容体αの発現と喘息
性の被験体の肺機能の間には正比例の相関が観察されている。

【００１４】本発明は、IL-5シグナルトランスダクションをモジュレートする際に使用する
ためのオリゴマーアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを用いる。好ま
しい態様において、これはIL-5あるいはIL-5Rαをコードする核酸分子の機能を
モジュレートすることにより、究極的には産生されたIL-5あるいはIL-5Rαの量
をモジュレートすることにより行われる。IL-5あるいはIL-5Rαをコードする一
つあるいはそれ以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物を
提供する。ここで使用される好ましい態様において、“IL-5をコードする核酸”
という用語は、IL-5をコードするDNA、そのDNAから転写される（プレRNAおよびm
RNAを含む）RNA、およびそのRNA由来のcDNAも含む。同様に、“IL-5Rαをコード
する核酸”という用語は、IL-5RαをコードするDNA、そのDNAから転写される（
プレRNAおよびmRNAを含む）RNA、およびそのRNA由来のcDNAも含む。本発明の文
脈において、“核酸標的”という用語は、IL-5あるいはIL-5Rαのどちらかをコ
ードする核酸分子を含み、これらのどちらかに従って、アンチセンス化合物は相
補的である。オリゴマー化合物とその標的核酸との特異的なハイブリダイゼーシ
ョンは、核酸の正常機能を干渉する。標的核酸のこの機能をそれと特異的にハイ
ブリダイズする化合物によりモジュレートすることは、一般に“アンチセンス”
として言及される。干渉されるDNAの機能は複製および転写を含む。干渉されるR
NAの機能は、全ての生命の機能、例えばタンパク質翻訳部位へのRNAの移動、RNA
からのタンパク質の翻訳、一つあるいはそれ以上の種類のmRNAを産するためのRN
Aのスプライシング、およびRNAに関わりあるいはRNAにより容易にされうる触媒
活性などを含む。そのような標的核酸機能の干渉の全体的な効果は、IL-5あるい
はIL-5Rαの発現のモジュレーションにある。本発明の文脈において、“モジュ
レーション”は遺伝子発現の増加（刺激）あるいは減少（阻害）のどちらかを意
味する。本発明の文脈において、阻害は遺伝子発現のモジュレーションの好まし
い形であり、mRNAは好ましい標的である。

【００１５】特異的核酸をアンチセンスの標的とすることは好ましい。本発明の文脈におい
て、特異的な核酸に対してアンチセンス化合物を“標的とする”ことは、複数段
階の過程である。過程は通常、機能がモジュレートされるべき核酸配列の同定か
ら始まる。例えば、これはその発現が特定の障害あるいは疾患状態と関連する細
胞性遺伝子（あるいは遺伝子から転写されたmRNA）、あるいは感染病原体由来の
核酸分子でありうる。本発明において、標的はIL-5あるいはIL-5Rαをコードす
る核酸分子である。標的化の過程は、所望する効果、例えばタンパク質発現の検
出あるいはモジュレーションを得られるように、アンチセンス相互作用が起こる
様にするための本遺伝子内の一つあるいは複数の部位の決定を含む。本発明の文
脈において、好ましい遺伝子内の部位は、遺伝子のオープンリーディングフレー
ム（ORF）の翻訳開始あるいは停止コドンを含む領域である。当該技術分野で知
られるように、翻訳開始コドンは典型的には5'-AUG（転写されたmRNA分子におい
て；対応するDNA分子では5'-ATG）であるため、翻訳開始コドンは“AUGコドン”
、“開始コドン”あるいは“AUG開始コドン”としても言及される。少数の遺伝
子はRNA配列5'-GUG、5'-UUGあるいは5'-CUGをもつ翻訳開始コドンをもち、5'-AU
A、5'-ACGおよび5'-CUGはin vivoで機能することを示している。従って、“翻訳
開始コドン”および“開始コドン”という用語は、各々の例において開始アミノ
酸が典型的に（真核生物では）メチオニンあるいは（原核生物では）ホルミルメ
チオニンであるにも関わらず、多くのコドン配列を含むことができる。真核生物
あるいは原核生物の遺伝子が二つあるいはそれ以上の代替の開始コドンをもち、
そのうちのいずれの一つが特定の細胞型あるいは組織において、あるいは特定の
一連の状態のもとで翻訳開始に優先的に利用しうることも、当該技術分野で知ら
れている。本発明の文脈において、“開始コドン”および“翻訳開始コドン”は
、IL-5あるいはIL-5Rαをコードする遺伝子から転写されたmRNA分子の翻訳を開
始させるためにin vivoで使用される一つあるいは複数のコドンについて言及し
、そのようなコドンの配列には関わらない。

【００１６】遺伝子の翻訳終了コドン（あるいは“停止コドン”）は三つの配列、すなわち
5'-UAA、5'-UAGおよび5'-UGA（対応するDNA配列はそれぞれ5'-TAA、5'-TAGおよ
び5'-TGA）の一つをもちうることも、当該技術分野で知られている。“開始コド
ン領域”および“翻訳開始コドン領域”という用語は、翻訳開始コドンからのど
ちらかの方向（すなわち、5'あるいは3'）において、約25から約50までの隣接す
るヌクレオチドを含むようなmRNAあるいは遺伝子の一部について言及する。同様
に、“停止コドン領域”および“翻訳終了コドン領域”という用語は、翻訳終了
コドンからのどちらかの方向（すなわち、5'あるいは3'）において、約25から約
50までの隣接するヌクレオチドを含むようなmRNAあるいは遺伝子の一部について
言及する。

【００１７】翻訳開始コドンと翻訳終了コドンの間の領域について言及することが当該技術
分野で知られる、オープンリーディングフレーム（ORF）あるいは“コーディン
グ領域”は、効果的に標的とされうる領域でもある。他の標的領域は、翻訳開始
コドンから5'方向におけるmRNAの一部について言及すると当該技術分野で知られ
る5'非翻訳領域（5'UTR）を含み、従って、mRNAの5'キャップ部位と翻訳開始コ
ドンの間のヌクレオチドあるいは遺伝子上で対応するヌクレオチドを含み、そし
て、翻訳終了コドンから3'方向におけるmRNAの一部について言及すると当該技術
分野で知られる3'非翻訳領域（3'UTR）を含み、従って、mRNAの翻訳終了コドン
と3'末端の間のヌクレオチドあるいは遺伝子上で対応するヌクレオチドを含む。
mRNAの5'キャップは、5'-5'三リン酸結合を介してmRNAの最も5'-側の残基に結合
するN7-メチル化グアノシンを含む。mRNAの5'キャップ領域は、5'キャップ構造
そのものならびにキャップに隣接する最初の50ヌクレオチドを含むと考えられて
いる。5'キャップ領域は好ましい標的領域でもありうる。

【００１８】いくつかの真核生物のmRNA転写物は直接翻訳されるが、多くは“イントロン”
として知られる一つあるいはそれ以上の領域を含有し、翻訳前に転写物から除去
される。残存（およびそれ故翻訳される）領域は“エクソン”として知られ、一
緒にプライスされて連続的なmRNA配列を形成する。mRNAスプライス部位、すなわ
ちイントロン-エクソン結合部は好ましい標的領域でもあり、異常型スプライシ
ングが疾患と関係する場合、あるいは特定のmRNAスプライス産物の過剰産生が疾
患と関係する場合において特に利用される。再構成あるいは欠損による異常型の
融合結合も好ましい標的である。イントロンは効果的であり、それ故、例えばDN
AあるいはプレmRNAを標的とするアンチセンス化合物の好ましい標的領域でもあ
りうる、ということも分かっている。

【００１９】ひとたび一つあるいはそれ以上の標的部位が同定されれば、標的と十分に相補
的な、すなわち十分よく十分に特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドが選択され、所望する効果を与える。

【００２０】本発明の文脈において、“ハイブリダイゼーション”は、相補的なヌクレオシ
ド間あるいはヌクレオチドの塩基間での、ワトソン-クリック、フーグステン（H
oogsteen）あるいは逆転フーグステン（reversed Hoogsteen）水素結合でありう
る、水素結合を意味する。例えば、アデニンとチミンは水素結合形成を介して対
になる相補的なヌクレオ塩基である。ここで使用する“相補的”は、二つのヌク
レオチド間の正確な対形成の能力について言及する。例えば、もしオリゴヌクレ
オチドのある部位のヌクレオチドが、DNAあるいはRNAの同部位にあるヌクレオチ
ドと水素結合が可能であると、その時オリゴヌクレオチドおよびDNAあるいはRNA
はその部位で互いに対して相補的であると考えられる。オリゴヌクレオチドおよ
びDNAあるいはRNAは、各々の分子において十分に多くの対応する位置が互いに水
素結合可能であるヌクレオチドで占められている時には、互いに対して相補的で
ある。従って、“特異的にハイブリダイズ可能”および“相補的”は、安定的で
特異的な結合がオリゴヌクレオチドおよびDNAあるいはRNA標的間で起こるような
、十分な程度の相補性あるいは正確な対形成を示すのに使用される用語である。
特異的にハイブリダイズするためには、アンチセンス化合物の配列がその標的の
配列と100％相補的である必要はない、ということは当該技術分野で理解されて
いる。アンチセンス化合物は、標的DNAあるいはRNA分子と化合物の結合が標的DN
AあるいはRNAの正常機能を干渉して有用性を失わせる時に、そして、特異的な結
合が望ましい状況下、すなわちin vivoアッセイあるいは治療的処置、およびin
vitroアッセイの場合における生理学的状況下、アッセイが行われる状況下で、
非標的配列とアンチセンス化合物の非特異的な結合を避けるために十分な程度の
相補性がある時に、特異的なハイブリダイズが可能である。

【００２１】アンチセンス化合物は一般に研究用試薬および診断試薬として使用される。例
えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、強い特異性により遺伝子発現を阻害
でき、しばしば当業者により特定の遺伝子の機能を解明するために使用される。
アンチセンス化合物は、例えば生物学的な経路の様々な構成員の機能の識別をす
るためにも使用される。それゆえ、アンチセンスモジュレーションは研究的使用
のために利用されている。

【００２２】アンチセンスの特異性および感受性は、当該技術者により治療的使用のために
も利用されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物およびヒトにおけ
る疾患状態の治療において治療的部分として使用されている。アンチセンスオリ
ゴヌクレチドは安全かつ効果的にヒトに投与されており、多くの臨床試験が現在
進行中である。このように、オリゴヌクレオチドは、細胞、組織および動物、特
にヒトの治療計画において有用であるように形づくられうる有用な治療的モダリ
ティーでありうる、ということが確立されている。本発明の文脈において、“オ
リゴヌクレオチド”という用語は、リボ核酸（RNA）あるいはデオキシリボ核酸
（DNA）あるいはその模倣物のオリゴマーあるいはポリマーについて言及する。
この用語は、天然に存在するヌクレオ塩基、糖および共有ヌクレオシド間（バッ
クボーン）結合、ならびに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴ
ヌクレオチドを含む。そのような修飾されたあるいは置換されたオリゴヌクレオ
チドは、例えば、細胞性取り込みの亢進、核酸標的との親和性の亢進、およびヌ
クレアーゼ存在下での安定性の向上などの所望される特徴のため、しばしば本来
の形態以上に好ましい。

【００２３】アンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンス化合物の好ましい形態である
一方で、本発明は他のオリゴマーアンチセンス化合物を包含し、以下に記載する
ようなオリゴヌクレオチド模倣物を含むが、これらには限定されない。本発明に
従ったアンチセンス化合物は、好ましくは約8から約30のヌクレオ塩基を含む。
約8から約30のヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが特に好ま
しい。当該技術分野で知られるように、ヌクレオシドは塩基-糖の組み合わせで
ある。ヌクレオシドの塩基部分は通常は複素環式の塩基である。そのような複素
環式の塩基の二つの最も一般的な分類は、プリンとピリミジンである。ヌクレオ
チドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシ
ドである。ペントフラノシル糖を含むこれらのヌクレオシドについて、リン酸基
は糖の2'、3'あるいは5'の水酸基部分のいずれかと結合しうる。オリゴヌクレオ
チドの形成において、リン酸基は隣接するヌクレオシドと互いに共有結合し、直
鎖のポリマー化合物を形成する。この直鎖のポリマー構造の各々の末端は順次さ
らに結合して環状構造を形成することができる。しかし、開環直鎖構造が一般的
に好ましい。オリゴヌクレオチド構造内において、リン酸基はオリゴヌクレオチ
ドのヌクレオシド間バックボーンを形成するとして一般に言及される。RNAおよ
びDNAの通常の結合あるいはバックボーンは、3'から5'のホスホジエステル結合
である。

【００２４】本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の具体的な例は、修飾され
たバックボーンあるいは非天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチ
ドを含む。本明細書において定義されるように、修飾されたバックボーンを有す
るオリゴヌクレオチドは、バックボーン内にリン原子を保持するもの、およびバ
ックボーン内にリン原子を有さないものを含む。本明細書の目的のため、および
当該技術分野において時々言及されるように、ヌクレオシド間のバックボーンに
リン原子を持たない修飾されたオリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドである
と考えられる。

【００２５】好ましい修飾されたオリゴヌクレオチドのバックボーンは、例えば、通常3'-5
'結合を有する、ホスホロチオエート（phosphorothioates）、キラルのホスホロ
チオエート、ホスホロジチオエート（phosphorodithioates）、ホスホトリエス
テル（phosphotriesters）、アミノアルキルホスホトリエステル（aminoalkylph
osphotriesters）、3'-アルキレンホスホネート（alkylene phosphonates）およ
びキラルのホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフ
ィネート（phosphinates）、3'-アミノホスホールアミデート（phosphoramidate
s）およびアミノアルキルホスホールアミデート（aminoalkylphosphoramidates
）を含むホスホールアミデート、チオノホスホールアミデート（thionophosphor
amidates）チオノアルキルホスホネート（thionophosphonates）、チオノアルキ
ルホスホトリエステル（thionoalkylphosphotriesters）およびボラノホスフェ
ート（boranophosphates）、これらの2'-5'結合類似体、およびヌクレオシド単
位の隣接する対合が5'-3'に対して3'-5'に結合するか、または5'-2'に対して2'-
5'を結合する反転した極性を持つもの、を含む。様々な塩、混合塩および遊離酸
の形態も含まれる。

【００２６】上記リン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許は、U.S.: 3,687,808；4
,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,0
19；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,
455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,11
1；5,563,253；5,571,799；5,587,361;および5,625,050、を含み、その各々は本
明細書中に参考文献として援用されるが、これらには限定されない。

【００２７】その中にリン原子を含まない好ましい修飾されたオリゴヌクレオチドのバック
ボーンは、その中に短鎖アルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、
混合へテロ原子およびアルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、あ
るいは一つまたはそれ以上の短鎖ヘテロ原子あるいはヘテロ環状ヌクレオシド間
結合により形成されるバックボーンを持つ。これらは、（一部はヌクレオシドの
糖部分から形成される）モルホリノ結合；シロキサンバックボーン；スルフィド
、スルホキシドおよびスルホンバックボーン；ホルムアセチルおよびチオホルム
アセチルバックボーン；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバッ
クボーン；アルケン含有バックボーン；スルファメートバックボーン；メチレン
イミノおよびメチレンヒドラジノバックボーン；スルホネートおよびスルホンア
ミドバックボーン；アミドバックボーン；および混合したN、O、SおよびCH₂構成
部分を有する他のもの、を持つものを含む。

【００２８】上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許は、U.S.: 5,034,
506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5
,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,3
07；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,
610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437;および5,6
77,439、を含み、その各々は本明細書中に参考文献として援用されるが、これら
には限定されない。

【００２９】他の好ましいヌクレオチド模倣物において、ヌクレオチド単位の糖とヌクレシ
チド間結合の両方、すなわちバックボーンは、新規基に置き換えられる。塩基単
位は、適した核酸標的化合物とハイブリダイゼーションするために維持される。
このような一つのオリゴマー化合物、優れた素晴らしいハイブリダイゼーション
特性を持つことを示しているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（PNA
）として言及される。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖バックボー
ンはアミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボーンに置き換
えられる。ヌクレオ塩基は保持され、バックボーンのアミド部分のアザ窒素原子
に直接あるいは間接的に結合する。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特
許は、U.S.: 5,539,082；5,714,331;および5,719,262を含み、その各々は本明細
書中に参考文献として援用されるが、これらには限定されない。PNA化合物のさ
らなる教示は、Nielsen ら.（Science, 1991, 254, 1497-1500）に見つけられる
。

【００３０】本発明の最も好ましい態様は、ホスホロチオエートバックボーンを持つオリゴ
ヌクレオチド、およびヘテロ原子バックボーンを持つオリゴヌクレオシドであり
、そして特に、上記で参照される米国特許5,489,677の-CH₂-NH-O-CH₂-、-CH₂-N(
CH₃)-O-CH₂-〔メチレン（メチルイミノ）あるいはMMIバックボーンとして知られ
ている〕、-CH₂-O-N(CH₃)-CH₂-、-CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂-および-O-N(CH₃)-CH₂ -CH₂-〔ここで、本来のホスホジエステルバックボーンは -O-P-O-CH₂-として示
される〕、および上記で参照される米国特許 5,602,240のアミドバックボーンで
ある。また、上記で参照される米国特許5,034,506のモルホリノバックボーン構
造を持つオリゴヌクレオチドも好ましい。

【００３１】修飾オリゴヌクレオチドは一つあるいはそれ以上の置換糖部分も含有しうる。
好ましいオリゴヌクレオチドは2'部位に以下のものの一つを含む：OH；F；O-、S
-,あるいはN-アルキル；O-、S-,あるいはN-アルケニル；O-、S- あるいはN-アル
キニル；あるいは O-アルキル-O-アルキル、ここでアルキル、アルケニルおよび
アルキニルは、置換あるいは非置換のC₁からC₁₀アルキル、あるいはC₂からC₁₀ア
ルケニルおよびアルキニルでありうる。O〔(CH₂)_nO〕_mCH₃、O(CH₂)_nOCH₃,、O(CH₂ )_nNH₂、O(CH₂)_nCH₃、O(CH₂)_nONH₂,およびO(CH₂)_nON〔(CH₂)_nCH₃,)〕₂は特に好
ましく、ここでのnおよびmは1から約10までである。他の好ましいオリゴヌクレ
オチドは2'部位に以下のものの一つを含む：C₁からC₁₀の低級アルキル、置換低
級アルキル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリルあるいはO-アラルキル、SH
、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、
ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリ
アルキルアミノ、置換シリル、RNA開裂基、レポーター基、インターカレーター
、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、あるいはオリゴヌクレオチ
ドの薬力学特性を改善する基および同様な特性を持つ置換基。好ましい修飾は、
アルコキシアルコキシ基、2'-メトキシエトキシ（2'-O-CH₂CH₂OCH₃、2'-O-(2-メ
トキシエチル)あるいは2'-MOEとしても知られる) を含む（Martin ら、Helv. Ch
im. Acta, 1995, 78, 486-504）。さらなる好ましい修飾は、2'-ジメチルアミノ
オキシエトキシ、すなわち、2'-DMAOEとしても知られる2'-O(CH₂)₂ON(CH₃)₂基、
および2'-ジメチルアミノエトキシエトキシすなわち、2'-O-CH₂-O-CH₂-N(CH₂)₂
を含む。

【００３２】他の好ましい修飾は、2'-メトキシ（2'-O-CH₃）、2'-アミノプロポキシ（2'-O
CH₂CH₂CH₂NH₂）、および2'-フルオロ（2'-F）を含む。同様な修飾はオリゴヌク
レオチドの他の部位、特に3'末端ヌクレオチド、あるいは2'-5'結合オリゴヌク
レオチドにおける糖の3'部位および5'末端ヌクレオチドの5'部位でもおこなわれ
うる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分
などの糖模倣物も持ちうる。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米
国特許は、U.S.: 4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5
,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,7
22；5,597,909；5,610,300；5,627,053l 5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,
670,633;および5,700,920、を含み、その各々は本明細書中に参考文献として援
用されるが、これらには限定されない。

【００３３】オリゴヌクレオチドはヌクレオ塩基（しばしば当該技術分野において簡単に“
塩基”として言及される）修飾あるいは置換も含みうる。ここで使用されるよう
に、“非修飾の”あるいは“天然の”ヌクレオ塩基は、プリン塩基のアデニン（
A）およびグアニン（G）、およびピリミジン塩基のチミン（T）、シトシン（C）
およびウラシル（U）を含む。修飾ヌクレオ塩基は、5-メチルシトシン（5-me-C
）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデ
ニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデ
ニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、
2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピ
ニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラ
シル（シュードウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、
8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-
ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシ
トシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-ア
ザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンおよび3-デアザグアニン
および3-デアザアデニン、などの他の合成および天然のヌクレオ塩基を含む。さ
らなるヌクレオ塩基は、米国特許No. 3,687,808にて開示されるもの、Kroschwit
z, J.I., The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, ed
. John Wiley & Sons, 1990, pages 858-859にて開示されるもの、Englischら（
Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613）により開示され
るもの、およびSanghvi, Y.S., Crooke, S.T.およびLebleu, B.編、Antisense R
esearch and Applications（CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 289-302）にて
開示されるものを含む。これらのヌクレオ塩基のいくつかは、本発明のオリゴマ
ー化合物の結合親和力を高めるのに特に有用である。これらには、5-置換ピリミ
ジン、6-アザピリミジンおよびN-2、N-6およびO-6置換プリンを含み、2-アミノ
プロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含む。
5-メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を0.6-1.2℃増加することを示し
（Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research a
nd Applications, 1993, CRC Press, Boca Raton, pp. 276-278）、現在では好
ましい塩基置換であり、2'-O-メトキシエチル糖修飾との組合せ時はより一層特
別に好ましい。

【００３４】上記記載の修飾ヌクレオ塩基の特定のものならびに他の修飾ヌクレオ塩基の調
製を教示する代表的な米国特許は、上記記載のU.S. 3,687,808、ならびにU.S.:
4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,
187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5
,594,121；5,596,091；5,614,617；5,681,941;および5,750,692、を含み、その
各々は本明細書中に参考文献として援用されるが、これらには限定されない。

【００３５】本発明のオリゴヌクレオチドのもう一つの修飾は、オリゴヌクレオチドの活性
、細胞性分布あるいは細胞性取り込みを亢進する一つあるいはそれ以上の部分あ
るいは結合部をオリゴヌクレオチドに対して化学的に結合することを含む。その
ような部分は、コレステロール部分（Letsingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 1989, 86, 6553-6556）、コール酸（Manoharanら、Bioorg. Med. Chem. Lett
., 1994, 4, 1053-1059）、チオエステル、例えばヘキシル-S-トリチルチオール
（Manoharanら、Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309；Manoharanら、Bi
oorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770）、チオコレステロール（Oberhau
serら、Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538）、脂肪族鎖、例えばドデカンジ
オールあるいはウンデシル残基（Saison-Behmoarasら、EMBO J., 1991, 10, 111
1-1118；Kabanovら、FEBS Lett., 1990, 259, 327-330；Svinarchukら、Biochim
ie, 1993, 75, 49-54）、リン脂質、例えばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロール
あるいはトリエチルアンモニウム 1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホ
スホネート（Manoharanら、Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654；Sheaら
、Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783）、ポリアミンあるいはポリエチレ
ングリコール鎖（Manoharanら、Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-97
3）、あるいはアダマンタン酢酸（Manoharanら、Tetrahedron Lett., 1995, 36,
3651-3654）、パルミチル部分（Mishraら、Biochim. Biophys. Acta., 1995, 1
264, 229-237）、あるいはオクタデシルアミンあるいはヘキシルアミノ-カルボ
ニル-オキシコレステロール部分（Crookeら、J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937）などの脂質部分を含むが、それらには限定されない。

【００３６】そのようなオリゴヌクレオチド結合物の調製を教示する代表的な米国特許は、
U.S.: 4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；
5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,
802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4
,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,2
63；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,
082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,53
6；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,4
51,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142
；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928および
5,688,941、を含み、その各々は本明細書中に参考文献として援用されるが、こ
れらには限定されない。

【００３７】与えられた化合物の全ての部分にとって一様に修飾することは必ずしも必要で
はなく、実際に前記の修飾の一つ以上は単一の化合物中に、あるいはオリゴヌク
レオチド内の単一のオリゴヌクレオシドにおいてさえ取り込まれうる。本発明は
キメラ化合物であるアンチセンス化合物も含む。本発明の文脈において、“キメ
ラの”アンチセンス化合物あるいは“キメラ”は、二つあるいはそれ以上の化学
的に別個な領域を含有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、特にオリゴヌクレ
オチドであり、それらは各々少なくとも一つのモノマー単位、すなわちオリゴヌ
クレオチド化合物の場合はヌクレオチド、で構成されている。これらのオリゴヌ
クレオチドは典型的に少なくとも一つの領域を含み、ここで標的核酸についてヌ
クレアーゼ分解に対する増加した抵抗性、増加した細胞性取り込み、および／あ
るいは増加した結合親和力をオリゴヌクレオチドに与えるようにオリゴヌクレオ
チドが修飾される。オリゴヌクレオチドの追加的な領域は、RNA:DNAあるいはRNA
:RNAハイブリッドを開裂させうる酵素のための基質として機能しうる。例として
、RNase HはRNA:DNA二本鎖のRNA鎖を開裂させる細胞性エンドヌクレアーゼであ
る。従って、RNase Hの活性化によりRNA標的が開裂し、それにより遺伝子発現の
オリゴヌクレオチド阻害の効率がより大きく亢進する。RNA標的の開裂は日常的
にゲル電気泳動により、もし必要ならば、当該技術分野で知られる関連する核酸
ハイブリダイゼーション技術により検出できる。

【００３８】本発明のキメラアンチセンス化合物は、上記したように、二つあるいはそれ以
上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび
／あるいはヌクレオチド模倣物の合成構造物として形成されうる。そのような化
合物は当該技術分野においてハイブリッドあるいはギャップマーとしても言及さ
れている。そのようなハイブリッド構造物の調製を教示する代表的な米国特許は
、U.S.: 5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711
；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356;および5,700,922
、を含み、その各々は本明細書中に参考文献として援用されるが、これらには限
定されない。

【００３９】本発明に従って使用されるアンチセンス化合物は、固相合成のよく知られる技
術を通して都合良く日常的に作製されうる。そのような合成の装置は、例えば、
アプライドバイオシステムズ（Foster City, CA）を含むいくつかの業者によっ
て販売されている。当該技術分野で知られるそのような合成のいくつかの他の手
段は、追加的にあるいは代替的に使用されうる。ホスホロチオエートおよびアル
キル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製するために、同様な技術を使用す
ることはよく知られている。

【００４０】本発明のアンチセンス化合物はin vitroで合成され、アンチセンス分子のin v
ivoでの合成を指向するために設計される生物学的起源、あるいは遺伝的ベクタ
ー構築物のアンチセンス組成物は含まない。

【００４１】本発明の化合物は、その他の分子、分子構造物あるいは化合物の混合物、例え
ば、取り込み、分散および／あるいは吸収を援助するためのリポソーム、レセプ
ター標的分子、経口用、直腸用、局所用あるいはその他の製剤、と混合され、カ
プセルに包まれ、あるいはそうでなければ結合されうる。そのような取り込み、
分散および／あるいは吸収を援助する製剤の調製を教示する代表的な米国特許は
、U.S.: 5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158
；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,10
8,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016
；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,54
3,152；5,556,948；5,580,575;および5,595,756、を含み、その各々は本明細書
中に参考文献として援用されるが、これらには限定されない。

【００４２】本発明のアンチセンス化合物は、いずれかの医薬的に許容可能な塩類、エステ
ル、あるいはそのエステルの塩類、あるいはヒトを含めた動物に投与する際に、
生物学的に活性な代謝産物あるいはその残余を（直接的あるいは間接的に）提供
することができる他の化合物を含む。それゆえ、例えば、本開示は本発明の化合
物のプロドラッグおよび医薬的に許容可能な塩類、そのようなプロドラッグの医
薬的に許容可能な塩類、およびその他の生物学的等価物に対しても作成される。

【００４３】 “プロドラッグ”という用語は、体内あるいはその細胞内で、内在性酵素ある
いは他の化学物質および／あるいは条件によって活性型（すなわち、薬剤）に変
換される、不活性型で調製される治療的薬剤を示す。特に、本発明のオリゴヌク
レオチドのプロドラッグ版は、WO 93/24510あるいはWO 94/26764において開示さ
れる方法に従って、SATE〔（S-アセチル-2-チオエチル）リン酸〕誘導体として
調製される。

【００４４】 “医薬的に許容可能な塩類”という用語は、本発明の化合物の生理学的および
医薬的に許容可能な塩類：すなわち、親化合物の所望する生物学的活性を保持し
、それに対する所望しない毒物学的な効果を与えない塩類である。

【００４５】医薬的に許容可能な塩基付加塩類は、アルカリおよびアルカリ土類金属あるい
は有機アミンなどの、金属あるいはアミンで形成される。陽イオンとして使用さ
れる金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである
。適したアミンの例は、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン
、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、
N-メチルグルカミン、およびプロカイン（例えば、Bergeら、"Pharmaceutical S
alts," J. of Pharma Sci., 1977, 66, 1-19を参照）。前記酸性化合物の塩基付
加塩類は、十分な量の所望する塩基と遊離酸型を接触させることにより調製され
、従来の様式で塩類を産生する。遊離酸型は、酸と塩類型を接触させ、従来の様
式で遊離酸を分離することにより再生されうる。遊離酸型は、極性溶媒中での安
定性などの特定の物理的特性において、それら各々の塩類型と多少は異なってい
るが、それ以外については、塩類はそれら各々の遊離酸と本発明の目的にとって
等価である。ここで使用されるように、“医薬的な付加塩類”は、本発明の組成
物の成分の一つの酸型の医薬的に許容可能な塩類を含む。これらはアミンの有機
あるいは無機酸性塩類を含む。好ましい付加塩類は、塩酸、酢酸、サリチル酸、
硝酸およびリン酸などの酸性塩類である。その他の適した医薬的に許容可能な塩
類は当業者によく知られており、例えば塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸あるいは
リン酸などの無機酸を有するもの；例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、
コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、
リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸（glucaric acid
）、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸（mandelic acid
）、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、2-フェノキシ安息香酸、2-アセトキシ安
息香酸、エンボル酸（embolic acid）、ニコチン酸あるいはイソニコチン酸など
の有機物カルボン酸、スルホン酸、硫酸あるいはリン酸あるいはN-置換スルファ
ミン酸を有するもの；例えばグルタミン酸あるいはアスパラギン酸など、および
フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスル
ホン酸、エタン-1,2-ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4-メチルベンゼンス
ルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ナフタレン-1,5-ジスルホン酸、2-あるい
は3-ホスホグリセレート、グルコース-6-ホスフェート、（シクラメートの形成
を伴う）N-シクロヘキシルスルファミン酸などの天然のタンパク質合成に関連す
る20のアルファ-アミノ酸などのアミノ酸を有するもの、あるいはアスコルビン
酸などのその他の有機化合物を有するもの、の様々な無機あるいは有機酸の塩基
性塩類を含む。化合物の医薬的に許容可能な塩類はまた、医薬的に許容可能な陽
イオンを用いて調製されうる。適した医薬的に許容可能な陽イオンは当業者によ
く知られており、アルカリ陽イオン、アルカリ土類陽イオン、アンモニウム陽イ
オンおよび第四アンモニウム陽イオンを含む。炭酸塩あるいは炭酸水素塩も可能
である。

【００４６】オリゴヌクレオチドについて、医薬的に許容可能な塩類の好ましい例は、（a
）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミ
ンおよびスペルミジンなどのポリアミンなどの陽イオンで形成される塩類；（b
）例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、その他の無機酸で形成され
る酸付加塩類；（c）例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸
、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タ
ンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン
酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリ
ガラクツロン酸などの有機酸で形成される塩類；（d）塩素、臭素、およびヨウ
素などの元素状態での陰イオンで形成される塩類、を含むが、これらには限定さ
れない。

【００４７】本発明のアンチセンス化合物は、診断、治療、予防のためおよび研究用試薬お
よびキットとして使用できる。治療のために、IL-5シグナル伝達をモジュレート
することで治療できる疾患あるいは障害を持つと疑われる動物、好ましくはヒト
は、本発明に従って一つあるいはそれ以上のアンチセンス化合物を投与すること
で治療される。本発明の化合物は、適した医薬的に許容可能な希釈剤あるいはキ
ャリアに効果的な量のアンチセンス化合物を加えることにより、医薬的な組成物
中で利用することができる。本発明のアンチセンス化合物および方法の使用はま
た、例えば予防的に、例えば炎症あるいは腫瘍形成を阻止するためあるいは遅ら
せるために、有用でありうる。

【００４８】本発明のアンチセンス化合物は、これらの化合物がIL-5あるいはIL-5Rαをコ
ードする核酸とハイブリダイズし、サンドイッチおよびその他のアッセイを本事
実を利用するために容易に組み立てることが可能になるため、研究および診断に
とって有用である。 IL-5あるいはIL-5Rαをコードする核酸と本発明のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、当該技術分野で知られる
手段により検出できる。そのような手段は、オリゴヌクレオチドと酵素の結合、
オリゴヌクレオチドの放射性標識あるいはその他の適する検出手段を含みうる。
試料中のIL-5あるいはIL-5Rαのレベルを検出するためのそのような検出手段を
使用するキットも調製されうる。

【００４９】本発明は、本発明のアンチセンス化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。
本発明の医薬組成物は、局所性あるいは全身性の治療のどちらが望ましいかに依
存し、および治療すべき部位に依存する多くの方法において投与されうる。投与
は、局所的投与（眼を含みおよび膣および直腸運搬を含む粘膜に対して）、例え
ばネブライザーを含む、粉末あるいはエアロゾルの吸入あるいは吹き付けによる
肺への投与；胸腔内、鼻腔内、表皮および経皮、経口あるいは非経口でありうる
。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内あるいは筋肉内注射あるいは注
入；あるいは例えば髄腔内あるいは脳室内などの頭蓋内投与を含む。少なくとも
一つの2'-O-メトキシエチル修飾をもつオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に
有用であると信じられている。

【００５０】局所的な投与のための医薬的な組成物および製剤は、経皮的パッチ、軟膏、ロ
ーション、クリーム、ゲル、点滴、坐剤、スプレー、液体および粉末を含みうる
。従来の医薬的キャリア、水性、粉末あるいは油性基剤、濃縮剤などは必要であ
り、あるいは望ましい場合がある。コートされたコンドーム、グローブおよびそ
の他も有用でありうる。

【００５１】経口投与のための組成物および製剤は、粉末あるいは顆粒、水あるいは非水性
の媒質における懸濁液あるいは溶液、カプセル、サシェあるいは錠剤、を含む。
濃縮剤、着香料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤（dispersing aids）あるいは結
合剤は所望されうる。

【００５２】非経口、鞘内（intrathecal）あるいは脳室内投与のための組成物は、緩衝液
、希釈剤および浸透亢進剤、キャリア化合物およびその他の医薬的に許容可能な
キャリアあるいは補形薬など（これらには限定されない）のその他の適した添加
物も含みうる、滅菌した水性溶液を含みうる。

【００５３】本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬的な組成物および／あるいは製剤は、
オリゴヌクレオチドの食餌性運搬を亢進するための浸透亢進剤を含んでもよい。
浸透亢進剤は五つの広範なカテゴリー、すなわち、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート
剤、界面活性剤および非界面活性剤、の一つに属するように分類されうる（Lee
ら、Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 91-19
2; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990
, 7, 1-33）。これらの広範なカテゴリーの一つあるいはそれ以上から、一つあ
るいはそれ以上の浸透亢進剤が含まれうる。

【００５４】浸透亢進剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体は、例えば、オ
レイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン
酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、リシンリエート
、モノオレイン（別名、1-モノオレオイル-rac-グリセロール）、ジラウリン、
カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル1-モノカプレート、1-ドデシルアザシク
ロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノ-およびジ-グリセ
リド、およびそれらの生理学的に許容可能な塩類（すなわち、オレエート、ラウ
レート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエー
ト、など）を含む（Leeら、Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Sy
stems, 1991, 8:2, 91-192; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Dru
g Carrier Systems, 1990, 7:1, 1-33; El-Haririら、J. Pharm. Pharmacol., 1
992, 44, 651-654）。いくつかの現在の好ましい脂肪酸の例は、カプレートナト
リウムおよびラウレートナトリウムであり、0.5から5％の濃度で単独であるいは
組み合わせて使用される。

【００５５】胆汁の生理学的な役割は、脂質および脂溶性ビタミンの分散と吸収を容易にす
ることを含む（Brunton, Chapter 38 In: Goodman & Gilman's The Pharmacolog
ical Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardmanら、eds., McGraw-Hill, New Y
ork, NY, 1996,pages 934-935）。様々な天然の胆汁酸塩、およびそれらの合成
誘導体は浸透亢進剤として作用する。従って、“胆汁酸塩”という用語は、天然
に生じる胆汁の構成要素のいずれか、ならびにそれらの合成誘導体のいずれかを
含む。現在の好ましい胆汁酸塩は、ケノデオキシコール酸（CDCA）（Sigma Chem
ical Company, St. Louis, MO）であり、一般に0.5から2％の濃度で使用される
。

【００５６】一つあるいはそれ以上の浸透亢進剤を含む複合製剤を使用することができる。
例えば、胆汁酸塩を脂肪酸と共に使用し、複合製剤を作りうる。好ましい組み合
わせは、CDCAをカプレートナトリウムあるいはラウレートナトリウム（一般に0.
5から5％）と組み合わせることを含む。

【００５７】キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA）、クエン酸、サ
リチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、5-メトキシサリチレートおよびホ
モバニレート（homovanilate））、コラーゲンのN-アシル誘導体、ラウレス-9（
laureth-9）およびベータ-ジケトンのN-アミノアシル誘導体（エナミン）を含む
が、これらには限定されない（Leeら、Critical Reviews in Therapeutic Drug
Carrier Systems, 1991, 8:2, 92-192; Muranishi, Critical Reviews in Thera
peutic Drug Carrier Systems, 1990, 7:1, 1-33; Buurら、J. Control Rel., 1
990, 14, 43-51）。キレート剤は、DNase阻害剤としても機能するというさらな
る利点を有する。

【００５８】界面活性剤は、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-9-ラ
ウリルエーテルおよびポリオキシエチレン-20-セチルエーテル（Leeら、Critica
l Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8:2, 92-191）；およ
びFC-43などのパーフルオロケミカルエマルジョン（perfluorochemical emulsio
ns）（Takahashら、J. Pharm. Phamacol., 1988, 40, 252-257）、を含む。

【００５９】非界面活性剤は、例えば、不飽和環状尿素、1-アルキル-および1-アルケニル
アザシクロ-アルカノン誘導体（Leeら、Critical Reviews in Therapeutic Drug
Carrier Systems, 1991, 8:2, 92-191）；およびジクロフェナックナトリウム
（diclofenac sodium）、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステ
ロイド性抗炎症剤（Yamashitaら、J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626）
、を含む。

【００６０】ここで使用されるように、“キャリア化合物”は核酸、あるいはその類似体に
言及し、それは不活性である（すなわち、それ自体が生物学的活性を持っていな
い）が、例えば、生物学的に活性な核酸を分解すること、あるいは循環系からそ
れを除去することを促進することによって、生物学的活性を持つ核酸の生物学的
利用能を減少させるin vivoでの過程により、核酸として認識される。核酸とキ
ャリア化合物を、典型的に過剰量の後者の物質とともに共投与（coadministrati
on）すると、おそらく共通のレセプターに対するキャリア化合物と核酸の間での
競合のため、肝臓、腎臓あるいは他の循環外貯蔵器において回収される核酸の量
の実質的な減少を引き起こすことができる。例えば、肝臓組織における部分的に
ホスホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドの回収は、それがポリイノシン
酸、硫酸デキストラン、ポリシチジル酸あるいは4-アセトアミド-4'-イソチオシ
アノ-スチルベン-2,2'-ジスルホン酸と共投与されるときに減少する（Miyaoら、
Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakuraら、Antisense & Nucl. Aci
d Drug Dev., 1996, 6, 177-183）。

【００６１】キャリア化合物に対して、“医薬的に許容可能なキャリア”（補形薬）は、医
薬的に許容可能な溶剤、懸濁剤、あるいは動物に一つあるいはそれ以上の核酸を
運搬するための他のいずれかの医薬的に不活性なビヒクル、である。医薬的に許
容可能なキャリアは液体あるいは固体であってもよく、核酸と所定の医薬的な組
成物の他の要素を組み合わせるとき、望ましい量、濃度などを供給するために、
考えた計画された投与様式と共に選択される。典型的な医薬的に許容可能なキャ
リアは、結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンあ
るいはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；増量剤（例えば、ラクトー
スおよび他の糖、微結晶性のセルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム
、エチルセルロース、ポリアクリレート、リン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤
（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化シリ
コン、ステアリン酸、金属ステアレート、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエ
チレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；分解剤（例え
ば、デンプン、グリコール酸デンプンナトリウムなど）；あるいは湿潤剤（例え
ば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）、を含むが、それらには限定されない。経口
的に投与された用量剤形のための、持続的放出経口運搬システムおよび／あるい
は腸コーティングは、米国特許No. 4,704,295；4,556,552；4,309,406;および4,
309,404に記載される。

【００６２】本発明の組成物は、医薬組成物において、その技術的に確立した使用レベルで
従来から見いだされる他の補助的要素を追加的に含みうる。従って、例えば、組
成物は、例えば、抗掻痒剤、収斂剤、局所麻酔剤あるいは抗炎症剤などの、追加
的な互換性のある医薬的に活性をもつ物質を含んでもよく、あるいは色素、着香
料、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、濃縮剤および安定剤などの、本発明の組成物の
様々な用量剤形を物理的に製剤化するのに有用な追加的な物質を含有してもよい
。しかし、そのような物質は、追加するとき、本発明の組成物の要素の生物学的
活性を過度に妨害すべきではない。

【００６３】本発明のある態様において、本発明のアンチセンス化合物は従来の抗-喘息薬
物療法と組み合わせて投与されうる。典型的に、二つの型の薬物療法が喘息を調
節する試みに使用される：速く働いて攻撃を止めるかあるいは症状を軽減する急
速-軽減薬物療法（quick-relief medications）（短期作用気管支拡張薬）およ
び症状および攻撃が開始しないようにする長期間予防的薬物療法（特に抗-炎症
剤）。短期作用気管支拡張薬の例は、短期作用β2拮抗剤、例えば、アルブテロ
ール、ビオルテトール、フェノテロール、イソエタリン、メタプロテレノール、
ピルブテロール、サルブタモールおよびテルブタリン；抗コリン作用剤、例えば
イプラトロピウムブロマイドおよびオキシトロピウムブロマイド；短期作用テオ
フィリン、例えば、アミノフィリン；およびエピネフリン／アドレナリン、であ
る。長期作用予防的薬物療法の例は、吸入あるいは経口コルチコステロイド、例
えば、ベクロメタゾン、ブデソニド、フルチカゾン、トリアミシノロン、プレド
ニゾロン、プレドニゾンおよびメチルプレドニゾロン；ナトリウムクロモグリケ
ートあるいはクロモリンナトリウム；ネドクロミル；経口あるいは吸入長期作用
β2拮抗剤、例えばサルメテロール、ホルモテロール、テルブタリン、サルブタ
モール；持続放出テオフィリン、例えば、アミノフィリン、メチルキサンチンお
よびキサンチン；およびケトチフェン、である。本発明のアンチセンス化合物は
、これらのあるいは当該技術分野で知られるいずれかの喘息薬物療法と組み合わ
せてあるいは結合して投与されうる。

【００６４】本発明の化合物は、もう一つのIL-5シグナル伝達トランスダクションの阻害物
質、好ましくはIL-5に関する抗体、と組み合わせても投与されうる。そのような
抗体は当該技術分野で知られている。

【００６５】本発明のアンチセンス化合物が患者に導入される方法に関わらず、コロイド状
の分散システムは運搬ビヒクルとして使用され、in vivoでの化合物の安定性を
亢進し、および／あるいは特定の器官、組織あるいは細胞型を化合物の標的とし
うる。コロイド状の分散システムは、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフ
ェア、ビーズ、および水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソーム
および特徴は付けられていない構造の脂質：オリゴヌクレオチド複合体を含む脂
質ベースシステムを含むが、それらには限定されない。好ましいコロイド状の分
散システムは多数のリポソームである。リポソームは、二重層構造において配置
される脂質で構成される、一つあるいはそれ以上の外層によって囲まれる水性コ
アをもつ顕微鏡的球体である（一般的に、Chonnら、Current Op. Biotech., 199
5, 6, 698-708参照）。

【００６６】本発明のある態様は、リポソームおよび（a）一つあるいはそれ以上のアンチ
センス化合物および（b）非アンチセンス機構により機能する一つあるいはそれ
以上の他の化学療法剤を含むその他の組成物を提供する。そのような化学療法剤
の例は、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン
、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、メルファラン
、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン（CA
）、5-フルオロウラシル（5-FU）、フロキシウリジン（5-FUdR）、メトトレキサ
ート（MTX)、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、テニ
ポシド（teniposide）、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（DES
）、などのアンチセンサー薬剤を含むが、これらには限定されない。一般的に、
The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkowら、eds., 198
7, Rahway, N.J., pp. 1206-1228を参照のこと。抗炎症薬剤は非ステロイド抗炎
症薬剤およびコルチコステロイドを含むが、これらには限定されず、抗ウイルス
薬剤はリビビリン、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルを含むが、
これらには限定されず、本発明の組成物において組み合わせることもありうる。
一般的に、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed., Berkowら
、eds., 1987, Rahway, N.J., pp. 2499-2506および46-49を各々参照のこと。そ
の他の非アンチセンス化学療法剤も本発明の範囲内にある。二つあるいはそれ以
上を組み合わせた化合物は、一緒にあるいは連続して使用されうる。

【００６７】もう一つの関連する態様では、本発明の組成物は、第一の核酸を標的とする一
つあるいはそれ以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第
二の核酸標的を標的とする一つあるいはそれ以上の追加のアンチセンス化合物を
含みうる。二つあるいはそれ以上を組み合わせた化合物は、一緒にあるいは連続
して使用されうる。

【００６８】治療的組成物の製剤化およびそれらに続く投与は、当業者の技術内にあると信
じられている。投薬は、治療するべき疾患状態の深刻さおよび反応性に依存して
おり、数日間から数ヶ月、あるいは治療が効果を示すか、あるいは疾患状態の減
少が達せられるまで続く一連の治療をともなう。最適な投薬スケジュールは、患
者の体内の薬剤の蓄積を測定することから算出できる。当業者は、最適な投与量
、投薬方法および反復頻度を容易に決定できる。最適な投与量は、個々のオリゴ
ヌクレオチドの比効力に依存して変化してもよく、in vitroおよびin vivo動物
モデルにおいて効果的であると判断された EC₅₀を基準にして一般的に評価でき
る。一般的に、投与量は体重1 kgあたり0.01μgから100 gであり、毎日、一週間
、一ヶ月間あるいは一年間に一回あるいはそれ以上、あるいは2年から20年ごと
に一回で与えうる。当業者は、体液あるいは組織内の薬剤の残留時間、および濃
度の測定に基づき、投薬のための反復頻度を容易に見積もることができる。成功
した治療に続いて、患者は維持治療を受けて疾患状態の再発を防ぐことが望まし
く、そこではオリゴヌクレオチドは体重1 kgあたり0.01μgから100 gの範囲で、
毎日一回かあるいはそれ以上から20年ごとに一回の範囲で、維持用量を投与され
る。

【００６９】本発明は、その好ましい態様に従って詳細に記載している一方で、以下の実施
例は本発明を説明するためにのみ提供するが、同じものに限定する意図はない。

【００７０】

【実施例】

実施例１：オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホールアミダイ
トデオキシおよび2'-アルコキシアミダイト 2'-デオキシおよび2'-メトキシβ-シアノエチルジイソプロピルホスホールア
ミダイトは、商業的な供給源（例えば、Chemgenes, Needham, MAあるいはGlen R
esearch, Inc. Sterling, VA）から購入した。その他の2'-O-アルコキシ置換ヌ
クレオシドアミダイトは、米国特許5,506,351に記載されるように調製され、本
明細書中に参考文献として援用される。2'-アルコキシアミダイトを使用して合
成されたオリゴヌクレオチドについては、テトラゾールおよび塩基のパルス運搬
後の待機ステップが360秒に増加することを除いて、非修飾オリゴヌクレオチド
のための標準的なサイクルを利用した。

【００７１】 5-メチル-2'-デオキシシチジン（5-Me-C）ヌクレオチドを含有するオリゴヌク
レオチドは、商業的に入手可能なホスホールアミダイト（Glen Research, Sterl
ing, VA or ChemGenes, Needham, MA）を使用して刊行された方法（Sanghviら,
Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197-3203）に従って合成した。

【００７２】 2'-フルオロアミダイト 2'-フルオロデオキシアデノシンアミダイト 2'-フルオロオリゴヌクレオチドは、本明細書中に参考文献として援用される
、Kawasakiら（J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841）およびU.S. Patent 5,670,
633により以前に記載されたように合成する。簡略すると、保護化されたヌクレ
オシドN6-ベンゾイル-2'-デオキシ-2'-フルオロアデノシンは、開始物質として
商業的に入手可能な9-ベータ-D-アラビノフラノシルアデニンを使用して、文献
の手順を改良して、2'-アルファ-フルオロ原子を2'-ベータ-O-トリチル基のS_N2-
置換によって導入されるようにすることにより合成する。このように、N6-ベン
ゾイル-9-ベータ-D-アラビノフラノシルアデニンは、3',5'-ジテトラヒドロピラ
ニル（THP）中間体として中程度の収量において選択的に保護化された。THPおよ
びN6-ベンゾイル基の脱保護は標準的な方法を使用して達せられ、標準的な方法
を使用して、5'-ジメトキシトリチル-（DMT）および5'-DMT-3'-ホスホラミダイ
ト中間体を得る。

【００７３】 2'-フルオロデオキシグアノシン 2'-デオキシ-2'-フルオログアノシンの合成は、開始物質としてテトライソプ
ロピルジシロキサニル（TPDS）保護化9-ベータ-D-アラビノフラノシルグアニン
、および中間体ジイソブチリル-アラビノフラノシルグアノシンへの転化を使用
して達せられる。TPDS基の脱保護の後、THPによるヒドロキシ基の保護化を行い
、ジイソブチリルジ-THP保護化アラビノフラノシルグアニンを得る。選択的なO-
脱アシル化およびトリフラート化の後に、フッ化物をともなう粗精製物の処理を
行い、そしてTHP基の脱保護を行った。標準的な方法を使用して、5'-DMT-および
5'-DMT-3'-ホスホールアミダイトを得る。

【００７４】 2'-フルオロウリジン 2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンの合成は、2,2'-無水-1-ベータ-D-アラビノ
フラノシルウラシルを70％フッ化水素-ピリジンで処理する文献の手順の改良に
より達せられる。標準的な手順を使用して、5'-DMT-および5'-DMT-3'-ホスホー
ルアミダイトを得た。

【００７５】 2'-フルオロデオキシシチジン 2'-デオキシ-2'-フルオロシチジンは、2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンのア
ミノ化を経て合成され、その後選択的な保護化を行ってN4-ベンゾイル-2'-デオ
キシ-2'-フルオロシチジンを得る。標準的な手順を使用して、5'-DMT-および5'-
DMT-3'-ホスホールアミダイトを得る。

【００７６】 2'-O-(2-メトキシエチル)修飾アミダイト 2'-O-メトキシエチル-置換ヌクレオシドアミダイトは以下のように、あるいは
代替的に、Martin, P., Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504の方法に
より調製した。

【００７７】 2,2'-無水〔1-(ベータ-D-アラビノフラノシル)-5-メチルウリジン〕 5-メチルウリジン（リボシルチミン、Yamasa, Choshi, Japanから商業的に入
手可能）（72.0 g、0.279 M）、ジフェニルカーボネート（90.0 g、0.420 M）お
よび重炭酸ナトリウム（2.0 g、0.024 M）をDMF（300 mL）に加えた。混合液を
撹拌しながら加熱して還流して、放出する二酸化炭素ガスを制御様式で放出させ
た。1時間後、わずかに暗色化した溶液を減圧下で濃縮した。得られたシロップ
を撹拌しながらジエチルエーテル（2.5 L）に注いだ。産生物はガムを形成した
。エーテルをデカントし、残留物を最少量のメタノール（約400 mL）に溶解した
。溶液を新鮮なエーテル（2.5 L）に注ぎ、固いガムを得た。エーテルをデカン
トし、ガムを真空オーブンで乾燥させて（60℃、1 mmHgで24時間）固体を得、そ
れを粉砕して淡い黄褐色の粉末を得た（57 g、85％の粗収量）。NMRスペクトル
は構造物と一致し、そのナトリウム塩としてフェノール（約5％）で汚染されて
いた。その物質はさらなる反応のため現状のままで使用し、あるいはエチル酢酸
中のメタノール濃度勾配（10-25％）を使用したカラムクロマトグラフィーによ
りさらに精製して、白色固体、mp 222-4℃を得た。

【００７８】 2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン 2,2'-無水-5-メチルウリジン（195 g、0.81 M）、トリス(2-メトキシエチル)
ホウ酸塩（231 g、0.98 M）および2-メトキシエタノール（1.2 L）を2 Lステン
レススチール圧力容器に加え、160℃のあらかじめ加熱したオイルバスに置いた
。155-160℃で48時間の加熱後、容器を開け、溶液を蒸発させて乾燥させ、MeOH
（200 mL）を用いて研磨した。残留物を熱アセトン（1 L）に懸濁した。不溶性
の塩を濾過し、アセトン（150 mL）で洗浄し、濾液を蒸発させた。残留物（280
g）をCH₃CN（600 mL）に溶解し、蒸発させた。シリカゲルカラム（3 kg）を0.5
％ Et₃NHを含有するCH₂Cl₂/アセトン/MeOH（20:5:3）中にパックした。残留物を
CH₂Cl₂（250 mL）に溶解し、シリカ（150 g）に吸着させ、その後カラムにロー
ドした。産生物をパッキング溶媒で溶出し、160 g（63％）の産生物を得た。さ
らなる物質は不純画分を再精製することで得た。

【００７９】 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン 2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン（160 g、0.506 M）をピリジン（250
mL）と共蒸発し、乾燥した残留物をピリジン（1.3 L）に溶解した。ジメトキシ
トリチルクロリドの最初のアリコート（94.3 g、0.278 M）を加え、混合液を室
温で1時間撹拌した。ジメトキシトリチルクロリドの二番目のアリコート（94.3
g、0.278 M）を加え、反応液をさらに1時間撹拌した。そしてメタノール（170 m
L）を加え、反応を停止した。HPLCの結果、約70％の産生物が存在することが示
された。溶媒を蒸発させ、CH₃CN（200 mL）を用いて研磨した。残留物をCHCl₃（
1.5 L）に溶解し、2×500 mLの飽和NaHCO₃および2×500 mLの飽和NaClを用いて
抽出した。有機層をNa₂SO₄で乾燥させて濾過し、蒸発させた。275 gの残留物を
得た。残留物を3.5 kgのシリカゲルカラムで精製し、パックして0.5％ Et₃NHを
含有するEtOAc/ヘキサン/アセトン（5:5:1）で溶出した。純粋画分を蒸発させ、
164 gの産生物を得た。さらに約20 gを不純粋画分から得て、183 g（57％）の総
収量を得た。

【００８０】 3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリ
ジン 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン（106 g、0
.167 M）、DMF/ピリジン（562 mLのDMFおよび188 mLのピリジンから調製した750
mLの3:1混合液）および無水酢酸（24.38 mL、0.258 M）を混合して、室温で24
時間撹拌した。MeOHを添加してtlc試料を最初に急冷することにより、tlcにより
反応をモニターした。tlcにより判断して反応の完了の際、MeOH（50 mL）を加え
、混合液を35℃で蒸発させた。残留物をCHCl₃（800 mL）に溶解し、2×200 mLの
飽和重炭酸ナトリウムおよび2×200 mLの飽和NaClを用いて抽出し直した。水層
をふたたび200 mLのCHCl₃で抽出した。混合した有機物を硫酸ナトリウムを用い
て乾燥させて蒸発させ、122 gの残留物を得た（約90％産物）。残留物を3.5 kg
のシリカゲルカラムで精製し、EtOAc/ヘキサン（4:1）を使用して溶出した。純
粋産物画分を蒸発させて96 g（84％）を産生した。後の画分からさらに1.5 gを
回収した。

【００８１】 3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-
トリアゾールウリジン最初の溶液はCH₃CN（700 mL）に3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジ
メトキシトリチル-5-メチルウリジン（96 g、0.144 M）を溶解することにより調
製し、取っておいた。トリエチルアミン（189 mL, 1.44 M）をCH₃CN（1 L）中の
トリアゾール（90 g、1.3 M）溶液に加え、-5℃に冷却してオーバーヘッドスタ
ーラーを使用して0.5時間撹拌した。POCl₃を0-10℃に維持された撹拌溶液に一滴
ずつ30分間にわたり加え、得られた混合物をさらに2時間撹拌した。最初の溶液
を後の溶液に一滴ずつ45分間にわたり加えた。得られた反応混合液をコールドル
ームで一晩保存した。塩を反応混合液から濾過し、溶液を蒸発させた。残留物を
EtOAc（1 L）に溶解し、不溶性の固体を濾過により除去した。濾過物を1×300 m
LのNaHCO₃および2×300 mLの飽和NaClで洗浄し、硫酸ナトリウムを用いて乾燥さ
せて蒸発させた。残留物をEtAOcを用いて研磨し、表題化合物を得た。

【００８２】 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジンジオキサン（500 mL）中の3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメト
キシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン（103 g、0.141 M）とNH₄OH（3
0 mL）の溶液を室温で2時間撹拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残留物をMeO
H（2×200 mL）と共沸した。残留物をMeOH（300 mL）に溶解し、2リットルのス
テンレススチール圧力容器に移した。NH₃ガスで飽和したMeOH（400 mL）を加え
、容器を100℃で2時間加熱した（tlcは完全な転化を示した）。容器内容物を蒸
発させて乾燥させ、残留物をEtOAc（500 mL）に溶解し、飽和NaCl（200 mL）で
一回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を蒸発させて、85 g（
95％）の表題化合物を得た。

【００８３】 N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン（85 g、0.
134 M）をDMF（800 mL）に溶解して、安息香酸無水物（37.2 g、0.165 M）を撹
拌しながら加えた。3時間の撹拌後、tlcは反応が約95％完了したことを示した。
溶媒を蒸発させ、残留物をMeOH（200 mL）と共沸した。残留物をCHCl₃（700 mL
）に溶解し、飽和NaHCO₃（2×300 mL）および飽和NaCl（2×300 mL）を用いて抽
出して、MgSO₄で乾燥させて蒸発させ、残留物（96 g）を得た。残留物を、溶出
溶媒として0.5％ Et₃NHを含有するEtOAc/ヘキサン（1:1）を使用して、1.5 kgの
シリカカラムでクロマトグラフィーをした。純粋産物画分を蒸発させて、90 g（
90％）の表題化合物を得た。

【００８４】 N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン-3'-アミダイト N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン（74 g、0.10 M）をCH₂Cl₂（1 L）に溶解した。テトラゾールジイソプロピ
ルアミン（7.1 g）および2-シアノエトキシテトラ（イソプロピル）亜リン酸塩
（40.5 mL、0.123 M）を、窒素雰囲気中で撹拌しながら加えた。得られた混合液
を、室温で20時間撹拌した（tlcは反応が95％完了したことを示した）。反応混
合液を、飽和NaHCO₃（1×300 mL）および飽和NaCl（3×300 mL）を用いて抽出し
た。水性洗浄液をCH₂Cl₂（300 mL）で再び抽出し、抽出物を混合してMgSO₄で乾
燥させて濃縮した。得られた残留物を、溶出溶媒としてEtOAc/ヘキサン（3:1）
を使用して、1.5 kgのシリカカラムでクロマトグラフィーをした。純粋産物画分
を混合して、90.6 g（87％）の表題化合物を得た。

【００８５】実施例２オリゴヌクレオチド合成非置換および置換ホスホジエステル（P=O）オリゴヌクレオチドは、自動化DNA
シンセサイザー（Applied Biosystems model 380B）において、ヨウ素による酸
化をともなう標準的なホスホールアミダイト化学を使用して合成される。

【００８６】ホスホロチオエート（P=S）は、標準的な酸化ボトルを、亜リン酸結合の段階
的なチア化のためにアセトニトリル中の3H-1,2-ベンゾジチオール-3-オン1,1-二
酸化物の0.2 M溶液に換えることを除いて、ホスホジエステルオリゴヌクレオチ
ドの様に合成される。チア化待機ステップを68秒まで増加して、キャッピングス
テップを続けた。55℃（18時間）における濃縮水酸化アンモニウム中でのCPGカ
ラムからの開裂および脱ブロッキングの後、オリゴヌクレオチドを0.5 M NaCl溶
液から2.5容量のエタノールを用いて二回沈殿して精製した。

【００８７】亜リン酸オリゴヌクレオチドは、米国特許5,508,270に記載されるように調製
され、本明細書中に参考文献として援用される。アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許4,469,863に記載され
るように調製され、本明細書中に参考文献として援用される。

【００８８】 3'-デオキシ-3'-メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許5,610
,289あるいは5,625,050に記載されるように調製され、本明細書中に参考文献と
して援用される。

【００８９】ホスホールアミダイトオリゴヌクレオチドは、米国特許5,256,775あるいは米
国特許5,366,878に記載されるように調製され、本明細書中に参考文献として援
用される。

【００９０】アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、公開されたPCT出願PCT/U
S94/00902 およびPCT/US93/06976（各々WO 94/17093およびWO 94/02499として公
開される）に記載されるように調製され、本明細書中に参考文献として援用され
る。

【００９１】 3'-デオキシ-3'-アミノホスホールアミダイトオリゴヌクレオチドは、米国特
許5,476,925に記載されるように調製され、本明細書中に参考文献として援用さ
れる。

【００９２】ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、米国特許5,023,243に記載される
ように調製され、本明細書中に参考文献として援用される。ボラノホスフェート（borano phosphate）オリゴヌクレオチドは、米国特許 5
,130,302および5,177,198に記載されるように調製され、いずれも本明細書中に
参考文献として援用される。

【００９３】実施例３オリゴヌクレオシド合成 MMI結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンメチルイミノ結合オ
リゴヌクレオシド、MDH結合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンジ
メチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、アミド-3結合オリゴヌクレオシドとし
ても同定されるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド、アミド-4結
合オリゴヌクレオシドとしても同定されるメチレンアミノカルボニル結合オリゴ
ヌクレオシド、ならびに例えば、交互のMMIおよびP=OあるいはP=S結合を有する
混合バックボーン化合物は、米国特許5,378,825；5,386,023；5,489,677；5,602
,240および5,610,289に記載されるように調製され、それらの全ては本明細書中
に参考文献として援用される。

【００９４】ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、米
国特許5,264,562および5,264,564に記載されるように調製され、それらすべては
本明細書中に参考文献として援用される。

【００９５】エチレンオキサイド結合オリゴヌクレオシドは、米国特許5,223,618に記載さ
れるように調製され、本明細書中に参考文献として援用される。実施例４ PNA合成ペプチド核酸（PNA）は、Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Propert
ies and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996,
4, 5-23で言及される様々な手順のいずれかに従って調製される。それらは、米
国特許5,539,082, 5,700,922および5,719,262に従っても調製されることができ
、本明細書中に参考文献として援用される。

【００９６】実施例５キメラオリゴヌクレオチドの合成本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドあるいは混合オリゴ
ヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なる型のものである可能性
がある。これらは、結合オリゴヌクレオシドの“ギャップ”部分が結合ヌクレオ
シドの5'および3'“ウイング”部分の間に位置している最初の型、および“ギャ
ップ”部分がオリゴマー化合物の3'あるいは5'末端のどちらかに配置している２
番目の“開放末端”型、を含む。最初の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分
野において“ギャップマー”あるいはギャップ化オリゴヌクレオチドとしても知
られている。２番目の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において“ヘミ
マー”あるいは“ウイングマー”としても知られている。

【００９７】〔2'-O-Me〕--〔2'-デオキシ〕--〔2'-O-Me〕キメラホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチド 2'-O-アルキルホスホロチオエートおよび2'-デオキシホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチド部分を有するキメラオリゴヌクレオチドは、前記のようにアプラ
イドバイオシステムズ自動化DNAシンセサイザーモデル380Bを使用して合成され
る。オリゴヌクレオチドは、自動化シンセサイザーおよびDNA部分には2'-デオキ
シ-5'-ジメトキシトリチル-3'-O-ホスホールアミダイト、および5'および3'ウイ
ングには5'-ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-3'-O-ホスホールアミダイトを使
用して合成される。標準的な合成サイクルは、テトラゾールおよび塩基の運搬後
の待機ステップを600秒に増加し、RNAでは４回および2'-O-メチルでは２回繰り
返すことで修飾される。完全な保護化オリゴヌクレオチドは支持体から開裂し、
リン酸基を3:1アンモニア／エタノール中にて室温で一晩脱保護し、そして凍結
乾燥して乾燥させる。次に、メタノールアンモニア中にて室温で24時間処置を行
い、全ての塩基を脱保護し、試料を再び凍結乾燥して乾燥させる。ペレットをTH
F中の1 M TBAFにて室温で24時間再懸濁して2'位を脱保護する。次に、反応物を1
M TEAAで急冷（quench）して、そして試料をロトバック（rotovac）で1/2容量
まで減少させた後、G25サイズの排除カラム（exclusion column）で脱塩した。
次に、回収したオリゴを、収率について分光測光法的に、および純度をキャピラ
リー電気泳動および質量分析法にて、解析する。

【００９８】〔2'-O-(2-メトキシエチル)〕--〔2'-デオキシ〕--〔2'-O-(2-メトキシエチル
)〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド〔2'-O-(2-メトキシエチル)〕--〔2'-デオキシ〕--〔2'-O-(メトキシエチル)
〕キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルアミダイトの2
'-O-(メトキシエチル)アミダイト置換をともなう、2'-O-メチルキメラオリゴヌ
クレオチドの前記手順の様に調製した。

【００９９】〔2'-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル〕--〔2'-デオキシホスホロチオ
エート〕--〔2'-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル〕キメラオリゴヌクレ
オチド〔2'-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル〕--〔2'-デオキシホスホロチオ
エート〕--〔2'-O-(2-メトキシエチル)ホスホジエステル〕キメラオリゴヌクレ
オチドは、2'-O-メチルアミダイトの2'-O-(メトキシエチル)アミダイト置換、キ
メラ構造物のウイング部分内でホスホジエステルヌクレオチド間結合を産生する
ためのヨウ素を用いた酸化、およびセンターギャップのホスホロチオエートヌク
レオチド間結合を産生するための3,H-1,2ベンゾジチオール-3-オン1,1二酸化物
(Beaucage Reagent) を利用した硫化をともなう、2'-O-メチルキメラオリゴヌク
レオチドについての前記手順により調製される。

【０１００】その他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシドおよび混合キ
メラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、米国特許5,623,065に従って
調製され、本明細書中に参考文献として援用される。

【０１０１】実施例６オリゴヌクレオチドの単離制御孔ガラスカラム（Applied Biosystems）からの開裂、および55℃、18時間
の濃水酸化アンモニウム中での脱ブロッキングの後、オリゴヌクレオチドあるい
はオリゴヌクレオシドを2.5容量のエタノールを用いて0.5 M NaClから2回の沈殿
を行うことにより精製した。合成したオリゴヌクレオチドを変性ゲル上でポリア
クリルアミドゲル電気泳動することにより解析し、少なくとも85％の完全長物質
であると判断した。合成において得られたホスホロチオエートおよびホスホジエ
ステルの相対的な量は、³¹P核磁気共鳴分光器により定期的に確認し、いくつか
の研究のためにオリゴヌクレオチドを、Chiangら（J. Biol. Chem., 1991, 266,
18162-18171）によって記載されるようにHPLCにより精製した。HPLC精製物質で
得られた結果は、非HPLC精製物質で得られたものと同様であった。

【０１０２】実施例７ IL-5あるいはIL-5Rα発現のオリゴヌクレオチド阻害の解析 IL-5あるいはIL-5Rα発現のアンチセンスモジュレーションは、当該技術分野
で知られる様々な方法でアッセイすることができる。例えば、IL-5あるいはIL-5
RαmRNAレベルは、ノーザンブロット解析、RNAse保護化アッセイ（RPA）、競合
的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、あるいはリアル-タイムPCR（RT-PCR）により
定量することができる。RNA解析は、総細胞性RNAあるいはポリ(A)+ mRNAで行う
ことができる。RNA単離の方法は、例えば、Ausubelら（Current Protocols in M
olecular Biology, Volume 1, John Wiley & Sons, Inc., 1993, pp. 4.1.1-4.2
.9および4.5.1-4.5.3）に教示されている。ノーザンブロット解析は、当該技術
分野では日常的であり、例えば、Ausubelら（Current Protocols in Molecular
Biology, Volume 1, John Wiley & Sons, Inc., 1996, pp. 4.2.1-4.2.9.）に教
示されている。リアル-タイム定量的（PCR）は、PE-Applied Biosystems（Foste
r City, CA）から入手可能であり、製造業者の使用説明に従って使用する、商業
的に入手可能なABI PRISM 7700 配列検出システム（ABI PRISM 7700 Sequence D
etection System）を使用して都合良く成し遂げることができる。PCRのその他の
方法も当該技術分野において知られている。

【０１０３】 IL-5あるいはIL-5Rαタンパク質レベルは、免疫沈降法、ウエスタンブロット
解析（イムノブロッティング）、ELISA、フローサイトメトリーあるいは蛍光活
性化細胞ソーティング（fluorescence-activated cell sorting）（FACS）など
の当該技術分野でよく知られる様々な方法で定量することができる。 IL-5ある
いはIL-5Rαに対する抗体は同定することができ、PharMingen Inc.（San Diego
CA）などの様々な供給源から得ることができ、あるいは従来の抗体産生方法によ
り調製することができる。ポリクローナル抗血清を調製するための方法は、例え
ば、Ausubelら（Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, John Wi
ley & Sons, Inc., 1997, pp. 11.12.1-11.12.9）に教示される。モノクローナ
ル抗体の調製は、例えば、Ausubelら（Current Protocols in Molecular Biolog
y, Volume 2, John Wiley & Sons, Inc., 1997, pp. 11.4.1-11.11.5）に教示さ
れる。

【０１０４】免疫沈降法は当該技術分野では標準的であり、例えば、Ausubelら（Current P
rotocols in Molecular Biology, Volume 2, John Wiley & Sons, Inc., 1998,
pp. 10.16.1-10.16.11）に見出すことができる。ウエスタンブロット（イムノブ
ロット）解析は当該技術分野では標準的であり、例えば、Ausubelら（Current P
rotocols in Molecular Biology, Volume 2, John Wiley & Sons, Inc., 1997,
pp. 10.8.1-10.8.21）に見出すことができる。酵素-結合イムノソルベントアッ
セイ（ELISA）は当該技術分野では標準的であり、例えば、Ausubelら（Current
Protocols in Molecular Biology, Volume 2, John Wiley & Sons, Inc., 1991,
pp. 11.2.1-11.2.22）に見出すことができる。

【０１０５】実施例８ Poly(A)+ mRNAの単離 Poly(A)+ mRNAは、Miuraら（Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764）に従って単
離される。Poly(A)+ mRNAの単離のためのその他の方法は、例えばAusubelら（Cu
rrent Protocols in Molecular Biology, Volume 1, John Wiley & Sons, Inc.,
1993, pp. 4.5.1-4.5.3.）に教示される。簡略すると、96ウェルプレート上で
成長する細胞について、成長培地を細胞から除去して各々のウェルを200μLの冷
PBSで洗浄する。60μLの溶解緩衝液（10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 1 mM EDTA, 0.5
M NaCl, 0.5％ NP-40, 20 mM vanadyl-ribonucleoside complex）を各々のウェ
ルに加えて、プレートを静かに動かし、そして室温で五分間インキベートする。
55μLの溶解緩衝液をOligo d(T)コート96ウェルプレート（AGCT Inc., Irvine C
A）に移す。プレートを室温で60分間インキベートし200μLの洗浄緩衝液（10 mM
Tris-HCl pH 7.6, 1 mM EDTA, 0.3 M NaCl）で3回洗浄する。最後の洗浄の後、
プレートをペーパータオル上にプロットして余分な洗浄緩衝液を除き、そして5
分間空気乾燥する。あらかじめ70℃に加温した60μLの溶出緩衝液（5 mM Tris-H
Cl pH 7.6）を各々のウェルに加え、プレートを90℃のホットプレート上で5分間
インキベートして、そして溶出物を新鮮な96ウェルプレートに移す。

【０１０６】 100 mmあるいはその他の標準的なプレート上で成長する細胞は、適当な量の全
ての溶液を使用して、同様に処理されうる。実施例９全RNAの単離全mRNAは、RNEASY 96^TMキットおよびQiagen Inc.（Valencia CA）から購入し
た緩衝液を使用して、製造業者の推奨する手順に従って単離される。キットは、
96ウェルプレートを含む様々なサイズのプレートあるいはボトル上で成長する細
胞を用いて使用できる。簡略すると、96ウェルプレート上で成長する細胞につい
て、成長培地を細胞から除去して各々のウェルを200μLの冷PBSで洗浄する。100
μLの緩衝液RLTを各々のウェルに加えて、プレートを勢いよく20秒間動かす。そ
して、100μLの70％エタノールを各々のウェルに加えて、内容物をピペッティン
グで3回上下して混合する。そして、試料を、廃液集合トレーを装着するQIAVAC^T ^M マニホールドおよび真空源（vacuum source）に取り付けられるRNEASY 96^TMウ
ェルプレートに移す。真空は15秒間アプライする。1 mLの緩衝液RW1をRNEASY 96^TM プレートの各々のウェルに加えて、再び真空を15秒間アプライする。そして、
1 mLの緩衝液RPEをRNEASY 96^TMプレートの各々のウェルに加えて、真空を15秒間
アプライする。そして、緩衝液RPE洗浄を繰り返して、真空をさらに10分間アプ
ライする。そして、プレートをQIAVAC^TMマニホールドから外して、ペーパータオ
ル上でブロットして乾燥させる。そして、プレートを1.2 mLの集合管を含有する
集合管ラックを装着するQIAVAC^TMマニホールドに再び取り付ける。そして、RNA
を各々のウェル中で60μLの水をピペッティングすることで溶出して、1分間イン
キベートして、そして、30秒間真空をアプライする。溶出ステップをさらに60μ
Lの水を用いて繰り返す。

【０１０７】マウスIL-5 実施例１０マウスIL-5発現のアンチセンス阻害本発明に従って、一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、刊行された配列
（ここでSEQ ID NO: 1として援用されるGenbank 寄託番号X06271）を使用して、
マウスIL-5 RNAの別々の領域を標的とするように設計された。オリゴヌクレオチ
ドは表１に示す。標的部位は、オリゴヌクレオチドが結合する配列供給源の参照
（Genbank寄託番号X06271）中に与えられるように、ヌクレオチド番号によって
示す。表１の全ての化合物は、長さ20ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド
（“ギャップマー”）であり、十の2'-デオキシヌクレオチドから成る中央“ギ
ャップ”領域で構成され、この両側（5'および3'方向）に五つのヌクレオチド“
ウイング”が隣接する。ウイング（ボールドで示す）は2'-O-メトキシエチル（2
'-MOE）ヌクレオチドで構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は、
オリゴヌクレオチドにわたりホスホロチオエート（P=S）である。他に表示がな
ければ、2'-MOE領域中のシチジン残基は5-メチルシチジンであるが、2'-デオキ
シ領域中のシチジンは修飾されていない。

【０１０８】表１マウスIL-5アンチセンスオリゴヌクレオチド

【０１０９】

【表１】

【０１１０】¹ 全ての結合はホスホロチオエート結合である。太字で示す残基は2'-メトキシ
エトキシであり、残りの残基は2'-デオキシである。全ての2'-メトキシエトキシ
C残基も5-メチルCである。² オリゴヌクレオチドが標的とするGenbank寄託番号X06271、SEQ ID NO. 1から
のヌクレオチド番号。

【０１１１】オリゴヌクレオチドは、商業的に入手可能なマウスIL-5プローブを使用して、
先の実施例に記載されるようにノーザンブロット解析により、EL-4 T細胞（ATCC
TIB-39, American Type Culture Collection, Manassas VA）中でテストした。
結果は表２に示す。これらの細胞はPHA反応性であり、PMAプラスcAMP増加剤（PM
A plus cAMP elevating agents）は、これらの細胞によりIL-5合成において数百
倍の増加を誘導する。細胞は、刊行された方法に従ってIL-5を発現するために維
持および刺激され、エレクトロポレーションによりオリゴヌクレオチドをトラン
スフェクションされた。

【０１１２】オリゴヌクレオチドは10μMの濃度でテストした。結果を表２に示す： SEQ ID NO 8、9、10、19および26（各々、ISIS 16981、16982、16983、16992お
よび16999）は、本アッセイにおいて少なくとも30％のIL-5発現阻害を示してお
り、従ってこれらは好ましい。

【０１１３】表２マウスIL-5 mRNAレベルに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果

【０１１４】

【表２】

【０１１５】実施例１１マウスIL-5 mRNAレベルの減少についてのISIS 16992および16999の用量反応比
較 ISIS 16992および16999（各々、SEQ ID NO: 19および26）をIL-5 mRNAレベル
を減少させる能力について、EL-4 T細胞中にて濃度5から25μMでスクリーニング
した。オリゴヌクレオチドをエレクトロポレーションにより細胞に導入して、mR
NAレベルをノーザンブロット解析により測定した。

【０１１６】 IC50（対照と比較してmRNAが50％減少するオリゴヌクレオチド濃度）は、ISIS
16992では約15μMで得られ、ISIS 16999では18μMで得られた。 ISIS 16999は、オリゴヌクレオチド処理の後、IL-5 mRNAレベルの用量反応測
定において、1、3、および5-ミスマッチ対照配列（各々、ISIS 17983、17984お
よび17985；SEQ ID: 30、31および32）と比較された。本実験において、ISIS 16
999は約9μMのIC50を有し、ISIS 17983は、1-塩基ミスマッチ対照であり、約13
μMのIC50を有した。IL-5 mRNAベレルが各々8％および17％しか減少しない3-お
よび5-塩基ミスマッチ対照については、IC50は得られなかった。

【０１１７】実施例１２マウスIL-5タンパク質レベルの減少についてのISIS 16992および16999の用量
反応比較 ISIS 16992および16999（各々、SEQ ID NO: 19および26）をIL-5タンパク質レ
ベルを減少させる能力について、EL-4 T細胞中にて濃度5から25μMでスクリーニ
ングした。オリゴヌクレオチドをエレクトロポレーションにより細胞に導入して
、タンパク質レベルをマウスIL-5 ELISAキット（Endogen, Woburn MA）を使用し
てELISAアッセイにより測定した。オリゴヌクレオチドの非存在下における開始
のIL-5濃度は約2300 pg/mlであり、これは25μMのISIS 16992では約200 pg/mlま
で減少し、25μMのISIS 16999では約400 pg/mlまで減少した。 IC50は、ISIS 16
992では約13μMで得られ、ISIS 16999では15μMで得られた。

【０１１８】実施例１３ EL-4細胞によるIL-5分泌に対するISIS 16999の効果 EL-4細胞は、先の実施例に記載したように5から20μMの用量でISIS 16999を用
いて処理した。培地中に分泌されたIL-5は、先の実施例に記載したようにELISA
アッセイにより検出した。

【０１１９】分泌IL-5レベルは、オリゴヌクレオチド濃度がゼロから10μMに増加するに従
い、13.5倍減少した。ISIS 16989は、IL-5 mRNAレベルを減少させず（上記の表
２を参照）、分泌IL-5レベルにおいてかなりのより小さな減少（約2.5倍）が見
られた。IL-5レベルは、ISIS 16999での処理の後、少なくとも72時間低いままで
あった。

【０１２０】実施例１４マウスIL-5発現のアンチセンス阻害の最適化マウスIL-5を標的とするさらなる一連のオリゴヌクレオチドを合成した。オリ
ゴヌクレオチド配列は、以前にテストしたものであるが修飾ギャップ配置（modi
fied gap placement）を有するものであった。配列は表３に示す。本表における
標的部位は、先の表で示される同じ配列の親化合物のISIS番号に再び言及する。

【０１２１】表３マウスIL-5発現のアンチセンスモジュレーションの最適化

【０１２２】

【表３】

【０１２３】

【０１２４】

【０１２５】

【０１２６】

【０１２７】¹ 太字で示す残基、2'-メトキシエトキシ-残基（その他は2'-デオキシ-）。他
に表示がなければ、2'-MOE C残基は5'-メチル-C（5meC）および2'-デオキシC残
基は修飾されていない。² 本表の標的部位は、先の表で示される同じ配列の化合物のISIS番号に再び言
及する。

【０１２８】 ISIS 17868、17869、17860、18242および18243は、全てISIS 16999（SEQ ID N
O: 26）のギャップ変異体であり、EL-4 T細胞中にてIL-5 mRNAレベルを減少させ
る能力についてテストされ、親オリゴヌクレオチドであるISIS 16999と比較され
た。15μMのオリゴヌクレオチド濃度（ISIS 16999のIC50）でのスクリーニング
では、ISIS 18243はISIS 16999と同程度の活性を与えた。ISIS 17870および1824
2はわずかにより小さな活性であり、ISIS 17869はささやかな（modest）活性で
あり、ISIS 17868は実質的には不活性であった。一連の用量反応アッセイにおい
て、ISIS 17870および18243はISIS 16999と同程度かあるいはわずかにより大き
な活性を示した。

【０１２９】 ISIS 17858、17859、17860、18246および18247は、全てISIS 16981（SEQ ID N
O: 8）のギャップ変異体であり、EL-4 T細胞中にてIL-5 mRNAレベルを減少させ
る能力についてテストされ、親オリゴヌクレオチドであるISIS 16981と比較され
た。15μMのオリゴヌクレオチド濃度でのスクリーニングでは、ISIS 17859およ
び18246は、親ヌクレオチドであるISIS 16981と同程度の活性を示し、ISIS 1824
7のみわずかにより小さな活性を示した。ISIS 17858および17860は親化合物より
活性があった。従って、テストした全てのISIS 16981ギャップ変異体は好ましい
。

【０１３０】 ISIS 17863、17864、17865、18244および18245は、全てISIS 16992（SEQ ID N
O: 19）のギャップ変異体であり、テストされ、親オリゴヌクレオチドであるISI
S 16992と比較された。15μMのオリゴヌクレオチド濃度でのスクリーニングでは
、ISIS 18245は親化合物よりほんのわずか（約20％）だけより小さい活性を示し
た。ISIS 17863および18244はささやかな活性であり、ISIS 17864および17865は
ほとんど不活性であった。このように、ISIS 18245も好ましい。

【０１３１】 ISIS 16999は、同じ配列、バックボーンおよびギャップ配置であるが（デオキ
シギャップおよび2'-メトキシエトキシ領域の両方において）全てのシトシンが5
-メチルシトシンに置き換わっている化合物であるISIS 20391、およびバックボ
ーンが2'-メトキシエトキシ領域においてホスホジエステル（P=O）でありデオキ
シギャップにおいてホスホロチオエート（P=S）である以外はISIS 20391と同じ
であるISIS 20392とも同程度である。オリゴは、EL-4 T細胞中にてIL-5 mRNAレ
ベルを減少させる能力について、5、15、および25μMの用量で比較された。ISIS
20391および20392の両方は、ISIS 16999とほぼ同程度の活性を示し、ISIS 2039
2は親ヌクレオチドよりわずかにより大きな活性を示した。従って、これらの化
合物は好ましい。ISIS 20391および20392の両方の5-塩基ミスマッチは、全ての
濃度で不活性であった。ISIS 20564は、完全なホスホジエステル化合物であり、
別の実験においてこれらの濃度では実質的に不活性であった。

【０１３２】実施例１５ in vivoでのT細胞IL-5 mRNA発現に対するIL-5アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドISIS 20391の効果 IL-5 mRNA発現は、Perkin-Elmer ABI PRISM 7700のTaqManシステムを使用する
リアルタイム定量PCRによりEL-4 T細胞中で測定した。相対的なIL-5レベルはGAP
DHレベルに対して正規化した。プライマーおよびプローブは以下の通りである：
マウスIL-5：プローブ：5'-6-FAM DYE-AG TGT TCT GAC TCT CAG CTG TGT CTG GGC-TAMRA DYE-
3'（SEQ ID NO: 33）センス：5'-TTC AGA GTC ATG AGA AGG ATG CTT-3'（SEQ ID NO:34）アンチセンス：5' ACC ACT GTG CTC ATG GGA ATC T-3'（SEQ ID NO: 35） GAPDH：プローブ：5'-6-FAM DYE-AAG GCC GAG AAT GGG AAG CTT GTC ATC-TAMRA DYE-3'
（SEQ ID NO: 36）センス：5'-GGC AAA TTC AAC GGC ACA GT-3'（SEQ ID NO: 37）アンチセンス：5'-GGG TCT CGC TCC TGG AAG AT-3'（SEQ ID NO: 38）。 ISIS 20391は、卵白アルブミン誘導IL-5レベルと比較して、IL-5 mRNAレベルを7
5％減少させたのに対し、ミスマッチオリゴヌクレオチドISIS 20393はIL-5 mRNA
を40％のみ減少させた。

【０１３３】実施例１６ Balb/cマウスでの卵白アルブミン誘導腹膜炎に対する（マウスIL-5を標的とす
る）ISIS 20391の効果好酸球ペルオキシダーゼ（EPO）比色アッセイを使用して、卵白アルブミン免
疫処置および攻撃後の腹膜洗浄体液中の好酸球増多に対するオリゴヌクレオチド
の効果を測定した。使用した方法は、Strathら（J. Immunol. Meth., 1985, 83,
209-215）を改良したものである。簡略すると、基質溶液は、1 mMの過酸化水素
および0.1％のTriton X-100を含有する0.05 Mトリス緩衝液中の0.05 M o-フェニ
レンジアミンジヒドロクロライド（OPD, Sigma Chem. Co., St. Louis, MO）か
ら成る。反応混合液を細胞に加え、暗所で30分間インキベートして、4 Mの硫酸
の1/4容量を加えることで反応を停止した。EPOは、基質溶液をブランクにして、
492 nmでの吸光度として測定した。本アッセイを使用すると、EPOレベルは存在
する好酸球の数に比例する。マウスに長期にわたりオリゴヌクレオチドを投薬し
た。卵白アルブミン攻撃により、腹膜洗浄体液中のEPOレベルは16倍以上に増加
した。長期にわたり5 mg/kgで投薬したISIS 20391により、卵白アルブミン誘導
後のEPOレベルは47％減少した。ミスマッチ対照によりEPOは約12.6％減少した。

【０１３４】 ISIS 20391によるEPOの用量依存性減少は、10 mg/kgのオリゴヌクレオチド用
量で、ミスマッチ対照による29％の減少と比べて、約75％の減少であった。IL-5
オリゴヌクレオチドは相応して、卵白アルブミン攻撃と比較して腹膜腔内の好酸
球浸潤を86％減少させたが、一方ミスマッチ対照は浸潤を26％のみ減少させた。
長期にわたる皮下投与（移植したミニポンプを使用して15日間にわたり5 mg/kg/
日）を使用すると、卵白アルブミンの肺攻撃モデルにおける好酸球増多に対する
IL-5オリゴヌクレオチドのわずかだが再現性のある阻害効果も得られた。

【０１３５】実施例１７ ISIS 20391による7日の投薬計画の後の腹膜洗浄体液中のIL-5タンパク質の減
少マウスに毎日7日間、5あるいは20 mg/kgでISIS 20391を投薬した。腹膜洗浄の
後、IL-5タンパク質レベルをELISAアッセイを使用して測定した。卵白アルブミ
ン処置マウスのIL-5レベルは約160 pg/mlであった。5および20 mg/kgでのISIS 2
0391を用いた処置により、腹膜体液中のIL-5濃度はそれぞれ110および80 pg/ml
に減少した。5および20 mg/kgでの対照オリゴヌクレオチドにより、IL-5レベル
は160および130 pg/mlに減少した。

【０１３６】実施例１８卵白アルブミン誘導マウス肺喘息モデルに対するIL-5アンチセンスオリゴヌク
レオチドの効果気道炎症はアレルギー性喘息を有する患者で観察される。アレルギー性喘息の
マウスモデルは開発されている（Hesselら J. Immunol. 1998, 160, 2998-3005
）。卵白アルブミンを用いたBALB/cマウスの感作により、血清中の高レベルの卵
白アルブミン特異的IgEが誘導される。感作マウスにおける卵白アルブミンの吸
入により、即時性気管支収縮反応が引き起こされる。感作動物における卵白アル
ブミンの繰り返しの吸入により、in vivoでは非特異的気道過剰反応、および気
道組織では白血球の浸潤が誘導される。

【０１３７】病原体フリーオスBALB/c ByJマウスをJackson Laboratoriesから入手した。活
性感作（active sensitization）は、16日間の毎日のオリゴヌクレオチド処置の
2および9日目に、アルミニウム水酸化物アジュバント中の20μgの卵白アルブミ
ン（Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, grade II）をIP注射することで行った
。これにより、マウス血清中にて80％が卵白アルブミン特異的IgEである高力価
の総IgEが産生された（Hesseら、J. Immunol., 1998, 160, 2998-3005）。処理
の16日目に、マウスを1分間2％の卵白アルブミンエアゾールにも暴露した。エア
ゾールはMedix 8001（Sussex, UK）などの噴霧器で生成された。オリゴヌクレ
オチドは塩水に溶解して、攻撃を通じて抗原感作の2日前から指示された用量で
ボーラス（bolus）注入により尾静脈に毎日静脈注射をした。

【０１３８】気管支肺胞（BAL）を使用して、気道組織の白血球浸潤を測定した。卵白アル
ブミンエアゾールの24時間後に、マウスを安楽死させて、気管カニューレ挿入を
行い塩水洗浄液を回収した。BAL中のパーセント好酸球を決定した。

【０１３９】非感作マウスはBAL液中の好酸球は1.6％であった；卵白アルブミン感作後では
、これは37.6％に増加した。5、10および20 mg/kgのISIS 20391により、BAL中の
好酸球増多は各々11.8％、5.5％および3.8％に減少した。後の二つは統計的に有
意な減少である。10および20 mg/kgでのミスマッチ対照のISIS 20393により、各
々33.6％および28.4％のBAL好酸球数が生じた。陽性対照であるデキサメタゾン
により、好酸球数は5.8％に減少した。

【０１４０】メタコリンに対する気道反応性は、最後のエアゾール暴露後24時間にin vivo
で測定した。噴霧されたメタコリンの用量反応曲線の基線は、全ての動物群につ
いて抗原感作の前0日目に構築した。肺機能はBuxco BioSystem Plethysmograph
（Buxco, Troy NY）を使用してモニターして、測定された気道耐性と相関する亢
進化ポーズ（enhanced pause）（Penh）として表した（Hamelmannら、Am. J.Res
pir. Crit. Care Med., 1997, 156, 766-775）。エアゾール化アルブミンを用い
た攻撃の後、肺機能の記録を30分間行い、早期のアレルギー性反応を調べた。後
期の反応については、卵白アルブミン攻撃後の2時間から9時間にかけて毎時間行
った。気道反応性は、メタコリンに対する気道反応を投薬の各々3分間測定する
ことにより、抗原攻撃後の24時間で測定した。攻撃後の記録は各々の群について
の基線の記録と比較して、Penh刺激インデックスを生成した。陽性対照として、
デキサメタゾンを腹腔内に25 mg/kgで感作前1日、攻撃前2時間、および攻撃後18
時間に投与した。

【０１４１】プレチスモグラフィの結果は、10あるいは20 mg/kgのISIS 20391がメタコリン
誘導アレルギー性気道過剰反応性を阻害し、いくつかの試験においてオリゴヌク
レオチド処理後、約2.0（オリゴなし）から約1.25にピークPenhインデックスを
減少させることを示した。デキサメタゾンは陽性対照であり、Penhを1.0に減少
させた。

【０１４２】一つの実験からのデータは、もう一つの方法、PC100、（誘発性攻撃）、気道
過剰反応性において2倍の増加を与えるのに必要なメタコリンの濃度、に関して
示された。非感作マウスは40.1 mg/kgのメタコリンのPC100を有していた。卵白
アルブミン感作後、そのPC100は9.84であり、非常により低いメタコリンの用量
が気道反応において同じ増加を引き起こしたことを示した。この効果はISIS 203
91により一部可逆的であった。5 mg/kgのISIS 20391ではPC100は10.6であるが、
10および20 mg/kgではPC100は30.7および41.6 mg/kgに増加して、気道過剰反応
性において可逆性を示した。デキサメタゾンは29.8 mg/kgのメタコリンのPC100
を有していた。

【０１４３】実施例１９マウス全体プレチスモグラフィモデルにおける早期および後期アレルギー性気
道反応卵白アルブミン攻撃により、卵白アルブミン攻撃の約2分後と約2時間後に、気
道過剰反応性において別々でかつ顕著なピークを有する二期の（two-phased）反
応が産生される。最初のピークはPenhでは約二倍の増加であり、二番目のピーク
はさらに大きく、Penhで三から四倍の増加である。後期反応は10および20 mg/kg
のISIS 20391により緩和された。特に、後期反応は、（非感作マウスの0.25と比
較して）Penhが卵白アルブミン攻撃後二時間で約0.7に達したとき、10 mg/kgのI
SIS 20391により約0.4のPenhに減少し、これは統計的に有意な減少であった。デ
キサメタゾンによりPenhは約0.3に減少した。10 mg/kgのミスマッチ対照であるI
SIS 20393により、後期Penhは統計的に有意な約0.5に減少を示した。より高用量
の実験では、20 mg/kgのISIS 20391により、卵白アルブミン攻撃の2時間後のPen
hは0.7から0.425に減少し、これは統計的に有意であった。20 mg/kgのミスマッ
チ対照であるISIS 20393により、Penhは有意でない約0.6に減少し、デキサメタ
ゾン（陽性対照）により反応は約0.25に減少した。

【０１４４】ヒトIL-5 実施例２０ヒトIL-5アンチセンスオリゴヌクレオチド一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ヒトIL-5をコードするmRNAを標的
とするように設計した。これらの化合物を表４に示す。

【０１４５】表４ヒトIL-5オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列

【０１４６】

【表４】

【０１４７】

【０１４８】¹ 太字で示す残基、2'-メトキシエトキシ-残基（他は2'-デオキシ-）は“C”残
基、5-メチル-シトシンを含む；全ての結合はホスホロチオエート結合である。
² オリゴヌクレオチドが標的とするGenbank寄託番号X12706、座位名“HSBCDIFF
I”、SEQ ID NO. 78からのヌクレオチド番号。

【０１４９】これらのオリゴヌクレオチドはヒトHSB-2細胞内にエレクロトロポレート去れ
、IL-5 mRNAに対する効果について先の実施例に記載されるようにノーザンブロ
ット解析によりテストされた。HSB-2 T細胞株はAmerican Type Culture Collect
ionから得て、細胞はATCCの推奨に従って培養する。これらはPMA + イオノマイ
シン（ionomycin）を用いた誘導によりIL-5を産生する。オリゴヌクレオチドは
、IL-5 mRNA発現をブロックする能力について10μMの濃度でノーザンブロット解
析によりテストされた。結果は表５に示す。

【０１５０】表５ヒトIL-5を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性

【０１５１】

【表５】

【０１５２】

【０１５３】 ISIS 16084、16085および16094は、IL-5 mRNA発現を少なくとも40％阻害した
。用量反応曲線は、ISIS 16085によるHSB-2細胞におけるヒトIL-5タンパク質発
現の阻害について生成された。オリゴヌクレオチドで処理していない細胞は、約
47 pg/mlのIL-5を発現することが分かった。5、15および25μM用量のISIS 16085
での処理後、IL-5レベルはそれぞれ21、0および0 pg/mlに落ちた。5、15および2
5μM用量の1-ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドでの処理により、IL-5レベルは
それぞれ26、25および20 pg/mlとなった。5、15および25μM用量の3-ミスマッチ
対照オリゴヌクレオチドでの処理により、IL-5レベルはそれぞれ52、48および46
pg/mlとなった。5-ミスマッチオリゴヌクレオチドは、同じ用量による刺激では
、IL-5タンパク質発現を阻害しなかった。

【０１５４】実施例２１ヒトCEM T細胞におけるISIS 16085によるIL-5発現の阻害 RNAse保護アッセイ（Riboquant hCK4, Pharmingen, La Jolla CA）を使用し
て、ISIS 16085が、二番目のT細胞株、約25μMで評価されるIC50を有するCEM（A
merican Type Culture Collectionより入手）においてIL-5発現を阻害すること
を決定した。IL-5発現はこれらの細胞中にて、IL-2、抗CD28架橋抗体、およびジ
ブチリルcAMPの存在下においてPMAプラスイオノマイシンで処理することにより
誘導される。刺激されたCEM細胞におけるISIS 16085対その5-ミスマッチ対照の
用量反応解析により、25μMのオリゴヌクレオチドでIL-5 mRNAに関して、ミスマ
ッチ対照での約22％の減少と比較して、約50％の用量依存性の減少が示された。
本アッセイにて測定されたその他のサイトカイン遺伝子産物では、減少は見られ
なかった。

【０１５５】実施例２２ヒトIL-5を標的とするオリゴヌクレオチドの最適化さらなる2'-メトキシエトキシギャップマーオリゴヌクレオチドを、2'-デオキ
シ領域の配置およびサイズが最適となるように設計した。これらは表６に示す。

【０１５６】表６ヒトIL-5オリゴヌクレオチドのヌクレオチド類似体

【０１５７】

【表６】

【０１５８】¹ 太字で示す残基、2'-メトキシエトキシ-残基（他は2'-デオキシ-）は“C”残
基、5-メチル-シトシンを含む；全ての結合はホスホロチオエート結合である。
² オリゴヌクレオチドが標的とするGenbank寄託番号X12706、座位名“HSBCDIFF
I”、SEQ ID NO. 78からのヌクレオチド番号。

【０１５９】 ISIS 16085およびそのミスマッチ対照の混合バックボーン［ホスホロチオエー
ト（P=S）およびホスホジエステル（P=O）］あるいは全ホスホジエステル（P=O
）バックボーン類似体も設計した。これらは表７に示す。

【０１６０】表７ヒトIL-5オリゴヌクレオチドのヌクレオチド類似体

【０１６１】

【表７】

【０１６２】¹ 太字で示す残基、2'-メトキシエトキシ-残基（他は2'-デオキシ-）；全て“C
”および“C”残基、5-メチル-シトシン；2'-デオキシギャップ中の結合はホス
ホロチオエート結合、2'-デMOE領域中の結合はホスホジエステル結合。

【０１６３】マウスIL-5受容体実施例２３マウスIL-5受容体αオリゴマウスIL-5受容体αの膜型をコードするmRNAは11のエクソンを含有する。受容
体の経膜的ドメインはエクソン9にコードされる。受容体の可溶性（分泌性）型
をコードするmRNAは、ディファレンシャルなスプライシング事象の結果である。
受容体の可溶性型1をコードするmRNAはエクソン9を欠いており（エクソン8はエ
クソン10にスプライシングされる）、可溶性型2をコードするmRNAはエクソン9お
よび10を欠いている（エクソン8はエクソン11にスプライシングされる）（Imamu
raら、DNA and Cell Biol., 1994, 13, 283-292）。

【０１６４】マウスBCL₁細胞は、マウスIL-5受容体αを標的とするアンチセンスオリゴヌク
レオチドをスクリーニングするために選択された。これらは、BALB/c起源の自発
発生腫瘍由来のB細胞白血病細胞であり、マウスあるいはヒトIL-5に対して反応
して増殖する。これは、ヒト慢性リンパ性白血病腫瘍のサブセットに似ているCD
5+株であり、リポ多糖刺激によりIgMを分泌する。細胞は American Type Cultur
e Collection から入手して、10％熱非働化胎児牛血清（Sigma Chemical Co., S
t. Louis, MO）、10 mM Hepes、pH 7.2、50μM 2-ME、2 mM L-グルタミン、100
U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン（Gibco, Grand Island, NY
）を補ったRPMI 1640培地で培養した。

【０１６５】一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、マウスIL-5受容体を標的とするよ
うに設計した。全ては、2'-メトキシエトキシ隣接および中央10塩基デオキシ“
ギャップ”およびホスホロチオエートバックボーンを全体にわたり有するキメラ
化“ギャップマー”である。細胞（PBS中に1×10⁷細胞）は、BTX Electro Cell
Manipulator 600（Genetronics, San Diego CA）を使用して、200V、1000μFの
エレクトロポレーションによりオリゴヌクレオチドをトランスフェクションされ
た。アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は表８に示す。

【０１６６】表８マウスIL-5受容体αオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列

【０１６７】

【表８】

【０１６８】

【０１６９】¹ 太字で示す残基、2'-メトキシエトキシ-残基（他は2'-デオキシ-）は“C”残
基、5-メチル-シトシンを含む；全ての結合はホスホロチオエート結合である。
² オリゴヌクレオチドが標的とするGenbank寄託番号D90205、座位名“MUSIL5R
”、SEQ ID NO. 132からのヌクレオチド番号。³ オリゴヌクレオチドが標的とするGenbank寄託番号S69702、座位名“S69702”
、SEQ ID NO. 133からのヌクレオチド番号。

【０１７０】全細胞RNAを、RNeasyキット（Qiagen, Santa Clara CA）を使用して単離した
。mRNAは、RiboquantキットおよびIL-5受容体αのエクソン9を見渡す（span）特
注されたリボプローブを使用するRNAse保護アッセイ（RPA）により解析した。cD
NAプローブを、エクソン2、8、9あるいは10のエクソン配列に適合するオリゴヌ
クレオチドから生成した。シグナルはMolecular Dynamics PhosphorImagerを使
用して定量した。結果は表９に示す。

【０１７１】表９マウスIL-5受容体α mRNA発現のアンチセンス阻害

【０１７２】

【表９】

【０１７３】

【０１７４】本アッセイでは、ISIS 16926、16927、16934、16936、16945、16947および169
49は、IL-5Rα mRNA発現の少なくとも約25％の阻害を与え、好ましい。これらの
うち、ISIS 16934、16945および16949は、少なくとも35％の阻害を与え、より好
ましい。

【０１７５】 ISIS 16934、16945および16949は、さらなる研究のために選択された。これら
は、BCL₁細胞におけるマウスIL-5受容体α mRNAの阻害に関して、それぞれ約2.5
μM、1.5μMおよび1μMのIC50を示した。ISIS 16949は、IL-5受容体αタンパク
質発現に対する効果についてテストされ、ほぼ完全な阻害を示した。

【０１７６】実施例２４マウスIL-5受容体αのエクソン9を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチ
ド一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、マウスIL-5受容体α mRNAのコー
ド領域のエクソン9全体を“歩く”ように設計した。オリゴヌクレオチドは、Gen
bank寄託番号D90205として与えられる配列上のヌクレオチド1288から1381までに
広がるエクソン9に沿って、約10ヌクレオ塩基ごとに始まる領域を標的とした。
オリゴヌクレオチドは表１０に示す。

【０１７７】表１０マウスIL-5Rオリゴヌクレオチド- 2' MOEギャップマーのヌクレオチド配列

【０１７８】

【表１０】

【０１７９】¹ 太字で示す残基、2'-メトキシエトキシ-残基（他は2'-デオキシ-）は“C”残
基、5-メチル-シトシンを含む；全ての結合はホスホロチオエート結合である。
² オリゴヌクレオチドが標的とするGenbank寄託番号D90205、座位名“MUSIL5R
”からのヌクレオチド番号。

【０１８０】マウスIL-5受容体αの膜型および可溶性型の両方に対するこれらの化合物の効
果を測定し、表１１に示す。オリゴヌクレオチドはBCL₁細胞にて10μMの用量で
スクリーニングして、IL-5受容体α mRNAはRPAにより測定した。パーセント阻害
は処理していない（オリゴヌクレオチドなし）対照と比較する。

【０１８１】表１１膜型および可溶性IL-5受容体α mRNA発現に対するマウスIL-5受容体α mRNAエ
クソン9を標的とする2'-MOEギャップマーの効果

【０１８２】

【表１１】

【０１８３】¹ 一つの可溶性型のみRPAにより検出可能である；RPAプローブは二つの可溶性
型を識別しない。これらのギャップマーは膜型および可溶性型の両方を減少させ
ることができ、各々のヌクレオチドはほぼ等しく二つの型を減少させた。

【０１８４】実施例２５膜型および可溶性IL-5受容体α mRNA発現に対するマウスIL-5受容体α mRNAエ
クソン9を標的とする完全2'-MOEオリゴヌクレオチドの効果さらなるオリゴヌクレオチドを、エクソン9およびイントロン／エクソン境界
を標的とするように設計した；これらは、全体にわたりホスホロチオエートバッ
クボーンで修飾された均一な（uniformaly）2'-メトキシエトキシであった。こ
れらは以下の表１２に示す。

【０１８５】表１２マウスIL-5Rオリゴヌクレオチド-均一（uniform）2' MOEのヌクレオチド配列

【０１８６】

【表１２】

【０１８７】¹ 太字で示す残基、2'-メトキシエトキシ-残基（他は2'-デオキシ-）は“C”残
基、5-メチル-シトシンを含む；全ての結合はホスホロチオエート結合である。
² Genbank寄託番号D90205、座位名“MUSIL5R”、SEQ ID NO. 132からの共通の
縦座標（co-ordinates）³ ISIS 21761-21764は、Imamura, F.ら（DNA Cell Biol., 1994, 13, 283-292
）の表１において与えられるイントロン-エクソン境界配列にハイブリダイズす
るように設計した。

【０１８８】 BCL1細胞は、10μMの完全2'-メトキシエトキシ、完全ホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチドで24時間処理し、全RNAを抽出してRPAにより解析した。結果は表
１３に示す。

【０１８９】表１３ IL-5 mRNAに対するマウスIL-5受容体α mRNAエクソンを標的とする2' MOE均一
修飾オリゴヌクレオチドの効果

【０１９０】

【表１３】

【０１９１】¹ 太字で示す残基、2'-メトキシエトキシ-残基（他は2'-デオキシ-）は“C”残
基、5-メチル-シトシンを含む；全ての結合はホスホロチオエート結合である。マウスIL-5受容体α mRNAエクソンを標的とする完全修飾2'-メトキシエトキシ
オリゴヌクレオチドの全ては、IL-5受容体αの膜型の発現を減少させ、受容体の
可溶性型の発現を増加させた。これらの同時に起こる効果の潜在力は、アンチセ
ンス標的部位がエクソンの3'末端へ移動するに従い、同じように減少した。IL-5
受容体α転写の全体量は影響を受けない。これは、イントロンの（intronic）3'
スプライス受容部位に対してちょうど遠位のエクソン9を標的とする完全2'-メト
キシエトキシ修飾オリゴヌクレオチドは、スプライス産物中のエクソン9を包含
することをブロックし、（イントロン9中の）その次の下流のスプライス受容部
位に対してスプライシング機構を向け直す（redirect）。特に減少を伴わずあ
るいはさらに特に可溶性型の増加を伴う、IL-5受容体αの膜型の減少は、IL-5シ
グナルトランスダクションに関連する疾患、特に喘息において治療的に有用性が
あると信じられている。これらの結果は、スプライシングはエクソン9を標的と
する均一な2'-メトキシエトキシオリゴヌクレオチドの使用により向け直され、
スプライシングされたmRNA産物からのエクソン9の排除（スキッピング）を引き
起こし、結果として産生される可溶性／膜IL-5受容体の割合が調節されて交替（
controlled alternation）する、ことを示す。

【０１９２】 RNase H-依存性化合物（2' MOEギャップマーISIS 18002）のRNase H-非依存性
化合物（完全2' MOE化合物21752）への転換により、このオリゴヌクレオチド配
列をIL-5受容体αの両方の型の阻害物質から、スプライシングの向け直し（redi
rection）により膜型を選択的に阻害する阻害物質に変えてしまうことも示され
た。

【０１９３】 ISIS 21752はさらなる研究のために選択された。用量反応実験において、約4
μMのIC50がIL-5受容体α mRNAの膜型の阻害に関して得られた。1-塩基ミスマッ
チ（ISIS 23235）は約10.5μMのIC50を与え、3-および5-塩基ミスマッチはいか
なる濃度でもIL-5受容体 mRNAの膜型を阻害しなかった。

【０１９４】実施例２６ IL-5受容体α mRNAの様々な型のエクソン-エクソン境界を標的とするオリゴヌ
クレオチドオリゴヌクレオチドは、2' MOEギャップマーあるいは均一2' MOEのどちらかで
あり、成熟IL-5受容体α mRNAのエクソン-エクソン境界を標的とするように設計
された。マウスIL-5受容体αの膜型をコードするmRNAは11のエクソンを含有する
。受容体の経膜的ドメインはエクソン9にコードされる。受容体の可溶性（分泌
性）型をコードするmRNAは、ディファレンシャルなスプライシング事象の結果で
ある。受容体の可溶性型1をコードするmRNAはエクソン9を欠いており（エクソン
8はエクソン10にスプライシングされる）、可溶性型2をコードするmRNAはエクソ
ン9および10を欠いている（エクソン8はエクソン11にスプライシングされる）。
表１４では、"E7-E8"と表される標的領域は、オリゴヌクレオチドがエクソン7-8
の境界を標的とすることを示す、等々。

【０１９５】表１４マウスIL-5Rオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列

【０１９６】

【表１４】

【０１９７】¹ 太字で示す残基、2'-メトキシエトキシ-残基（他は2'-デオキシ-）、全て“C
”および“C”残基、5-メチル-シトシン；全ての結合はホスホロチオエート結合
である；² Genbank寄託番号D90205、座位名“MUSIL5R”、SEQ ID NO. 132からのヌクレ
オチド番号。

【０１９８】これらの化合物は、RPAにより膜あるいは可溶性IL-5受容体α mRNAを減少させ
る能力について、10μM用量でテストされた。テスとした化合物の結果は表１５
に示す。

【０１９９】表１５可溶性および膜IL-5受容体α mRNAに対するマウスIL-5Rオリゴヌクレオチドの
活性

【０２００】

【表１５】

【０２０１】表１５に示されるように、IL-5受容体αの可溶性型の発現の選択的減少は、エ
クソン8-エクソン10境界、あるいはより少ない範囲ではエクソン8-エクソン11境
界を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて達成され、それらの両
方の結合部位は可溶性受容体 mRNAにのみ見出される。IL-5受容体αの膜型の発
現の選択的減少は、エクソン8-エクソン9境界、あるいはエクソン9-エクソン10
境界を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて達成され、それらの
両方はIL-5受容体αの膜型を標的とするmRNAにのみ存在する。エクソン9のイン
トロン／エクソン境界を横切る（across）完全2' MOEオリゴヌクレオチドの配置
により、エクソン9の内側に位置する完全修飾オリゴヌクレオチドで得られるも
のと同様な効果が生じた。

【０２０２】実施例２７マウスBCL₁細胞におけるIL-5受容体αタンパク質の膜型の発現に対するアンチ
センスオリゴヌクレオチドの効果 BCL₁細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで48時間処理した。使用したオリ
ゴヌクレオチドは、ISIS 16949（IL-5受容体の可溶性および膜型の両方を標的と
する“共通”オリゴヌクレオチド）、膜型のみを標的とするISIS 21752 、IL-5
受容体αの可溶性型のみを標的とするISIS 21853および21855である。オリゴヌ
クレオチドは、先の実施例に記載されるようにエレクトロポレーションにより導
入された。受容体の膜型のレベルに対する効果は、ウエスタンブロット解析によ
り調べられた。膜-濃縮（enriched）画分をTriton X-100不溶性物質として調製
し、8％ゲルを使用してSDS-PAGEにより分離した。マウスIL-5受容体αに対する
抗体はSanta Cruz Biotechnology（Santa Cruz, CA）から購入して、1:1000に希
釈して使用した。

【０２０３】対照（オリゴヌクレオチドなし）と比較すると、ISIS 21752はほぼ完全に膜IL
-5受容体を除去した。ISIS 21853および21855はともに、その効果はほとんどな
いから全くなかった；両方は可溶性受容体アイソフォームを特異的に標的とする
。共通配列オリゴヌクレオチドであるISIS 16949は、可溶性受容体を75％減少さ
せた。

【０２０４】エクソン8、9あるいは10に関して5'イントロンスプライシング部位を標的とす
る完全2'-MOEオリゴヌクレオチドを用いたトランスフェクションにより、その特
定の下流エクソンが特異的に排除されたが、その他の隣接あるいは上流のエクソ
ンは排除されなかった。従って、完全2'-MOEオリゴヌクレオチドなどの高親和性
アンチセンス化合物を用いて'イントロンスプライシング部位を標的とすること
により、mRNA転写物の個々のエクソンの選択的な削除が可能となる。

【０２０５】実施例２８ IL-5受容体αアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したマウスの血液および
腹膜洗浄液中の好酸球の減少マウスに毎日5日間、ISIS 21972あるいはそのミスマッチ対照を用いるあるい
は用いないで組換えマウスIL-5を注射した。血液および腹膜洗浄液中のパーセン
ト好酸球を測定した。対照マウス（オリゴヌクレオチドなし）では、好酸球レベ
ルは腹膜洗浄液中で4％および血液中で2％であった。IL-5処理後、好酸球は洗浄
液中で13.5％および血液中で9.5％に増加した。ミスマッチオリゴヌクレオチド
での処理ではこれに有意な変化はなかった（洗浄液中で13.5％、血液中で10.5％
）が、IL-5受容体αアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理では好酸球レベル
は腹膜洗浄液中で8.5％および血液中で7％に減少した。

【０２０６】ヒトIL-5受容体実施例２９ヒトIL-5受容体αを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドヒトIL-5受容体α遺伝子は14のエクソンを含有する。受容体の一つの膜固定型
および二つの可溶性型が同定されている。膜型はシグナルトランスダクションに
おいて活性化し、可溶性型は拮抗的に作用する。ヒトIL-5受容体αの膜固定型を
コードするmRNA転写物は、エクソン1-10および12-14を含有する。エクソン11は
変異スプライシング事象（alternative splicing event）によりスプライシング
されて除去される。主要な可溶性アイソフォーム（可溶性型1）は、エクソン11
中の正常スプライシング事象およびインフレーム（in-frame）停止コドンの結果
として産生される。他の可溶性型（可溶性型2）はスプライシングされないで産
生し、それゆえエクソン11内で読むことより生成される。

【０２０７】ヒトIL-5受容体αの膜型をコードするmRNA転写物は、エクソン1-10および12-1
4を含有する。エクソン11はスプライシングされて除去される。従って、受容体
の可溶性および膜型の両方に共通であるエクソン1-10中の配列を標的とすること
、および膜型（エクソン12-14）にのみ存在する配列を選択的に標的とすること
は可能である。一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトIL-5受容体α（
IL-5Rα）の膜型に対してのみ特異的にとなるように設計された。これらのオリ
ゴヌクレオチドは、エクソン11の下流の領域（すなわち、エクソン12-14および
介入（interventing）イントロン、停止コドンおよび3'非翻訳領域）を標的とす
る（Tavernier ら、Proc. Natl. Acad. Sci., 1992, 89, 7041-7045）。これら
は表１６に示す。

【０２０８】表１６ヒトIL-5受容体α膜-特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド
配列

【０２０９】

【表１６】

【０２１０】¹ 太字で示す残基、2'-メトキシエトキシ-残基（他は2'-デオキシ-）は“C”残
基、5-メチル-シトシンを含む；全ての結合はホスホロチオエート結合である。
² オリゴヌクレオチドが標的とするGenbank寄託番号 X61176、座位名“HSIL5RG
”、SEQ ID NO. 176からのヌクレオチド番号。

【０２１１】これらの細胞は、TF-1細胞（Dr. Christoph Walker, Novartis Research Cent
re, Horsham, UKの提供）のIL-5受容体発現サブクローンにおいてテストされた
。細胞は、10％熱非働化胎児牛血清（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）、1
0 mM Hepes、pH 7.2、50μM 2-ME、2 mM L-グルタミン、100 U/mlペニシリンお
よび100μg/mlストレプトマイシン（Gibco, Grand Island, NY）を補ったRPMI 1
640培地で培養して、10 ng/mlの組換えヒトIL-5（R & D Systems, Minneapolis,
MN）を48-72時間毎に加えた。TF-1細胞（PBS中に1×10⁷細胞）は、BTX Electro
Cell Manipulator 600（Genetronics, San Diego CA）を使用して、250V、1000
μFのエレクトロポレーションによりオリゴヌクレオチドをトランスフェクショ
ンされた。

【０２１２】全細胞RNAを、RNeasy^TMキット（Qiagen, Santa Clarita CA）を使用して単離
した。ノーザンブロットは、標準的なRT-PCRおよび続くネスティッドプライマー
反応によりHL-60細胞RNAから調製された膜アイソフォーム-特異的エクソン配列
に対応する完全長cDNAプローブあるいはcDNAプローブを使用する標準的な方法を
使用して行った。シグナルはMolecular Dynamics PhosphorImagerを使用して定
量した。結果は表１７に示す。

【０２１３】表１７ IL-5受容体mRNA発現におけるヒトIL-5受容体α膜-特異的アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの活性

【０２１４】

【表１７】

【０２１５】 ISIS 16769、16773、16774、16776、16777、16778および16779は、IL-5受容体
αの膜型を少なくとも40％阻害して、好ましい。これらの中で、ISIS 16769、16
774、16778および16779は、IL-5Rαの可溶性型に対する効果が最小であるために
より好ましい。

【０２１６】 TF-1細胞の表面上のヒトIL-5受容体αの発現に対するISIS 16778の効果は、フ
ローサイトメトリーにより測定された。オリゴヌクレオチドを用いたエレクトロ
ポレーションに続き、TF-1細胞を24時間あるいは指示されたようにインキベート
して、遠沈により回収して冷PBSで洗浄した。細胞は12×75 mmポリスチレンチュ
ーブに移して、4℃でPBS中の2％牛血清アルブミン、0.2％アジ化ナトリウム中で
洗浄した。細胞を200×gで遠沈して、上清を別の容器に移した。特異的抗体を1:
100で、上記緩衝液中の0.1 mL中のヒトIL-5受容体α-フィコエリトリンおよびア
イソタイプ対照抗体に加えた。抗体は、暗所にて4℃で30分間静かに動かしなが
ら細胞と共にインキベートした。そして、細胞を上記のように洗浄して、0.5％
ホルムアルデヒドを用いて0.3 mLのFacsFlow buffer（Becton Dickinson, Frank
lin Lakes, NJ）に再懸濁した。細胞はBecton-Dickinson FACScanで解析した。
結果は、基礎発現を差し引いて、平均蛍光強度に基づく対照発現のパーセンテー
ジとして表した。

【０２１７】 TF-1細胞においてヒトIL-5受容体α細胞表面タンパク質発現に対する、このオ
リゴヌクレオチドの効果を決定するための用量反応実験では、ISIS 16778は約5
μMのIC50を示した。1-ミスマッチ対照は7.5μMのIC50を有し、3-および5-ミス
マッチ対照は、対照の75％以下でIL-5受容体αを阻害しなかった。

【０２１８】さらなる一連のオリゴヌクレオチドを、ヒトIL-5受容体の膜型および可溶性型
の両方を標的とするように設計した。これらのオリゴヌクレオチドは、エクソン
1-10および介入イントロンを標的とし、時々“共通”IL-5受容体オリゴヌクレオ
チドとして言及される。配列は表１８に示す。

【０２１９】表１８ヒトIL-5R“共通”アンチセンスオリゴヌクレオチド

【０２２０】

【表１８】

【０２２１】¹ 太字で示す残基、2'-メトキシエトキシ-残基（他は2'-デオキシ-）は“C”残
基、5-メチル-シトシンを含む；全ての結合はホスホロチオエート結合である。
² オリゴヌクレオチドが標的とするGenbank寄託番号M96652、座位名“HUMIL5RB
”、SEQ ID NO. 195からのヌクレオチド番号。注：これらの配列は、 Genbank寄
託番号M96651および X61176に共通でもある。

【０２２２】表１９ IL-5受容体 mRNA発現におけるヒトIL-5受容体α“共通”アンチセンスオリゴ
ヌクレオチドの活性

【０２２３】

【表１９】

【０２２４】本アッセイでは、ISIS 16781、16782、16783、16785、16786、16787、16788、
16789、16790、16791、16792、16793および16794は、膜および可溶性IL-5受容体
αアイソフォームの両方を50％より多く阻害し、好ましい。これらの中で、ISIS
16786、16788、16789、16790および16793は、両方のアイソフォームを75％より
多く阻害した。

【０２２５】 ISIS 16793をさらなる研究のために選択した。それは、ヒトIL-5受容体α mRN
Aの可溶性型および膜型の両方の発現を全体的に阻害した。この化合物は、TF-1
細胞においてIL-5受容体α細胞表面タンパク質の減少に関して約2μMのIC50を有
することが分かった。1-ミスマッチ対照は約3μMのIC50を有し、3-および5-ミス
マッチ対照は、対照の75％以下でIL-5受容体αを阻害しなかった。

【０２２６】実施例３０ヒトIL-5受容体α mRNA中のスプライシング部位を標的とするアンチセンスオ
リゴヌクレオチドヒトIL-5受容体α遺伝子は14のエクソンを含有する。受容体の一つの膜固定型
および二つの可溶性型が同定されている。マウス受容体を用いたとき、膜型はシ
グナルトランスダクションにおいて活性化し、可溶性型は活性化せず、拮抗的に
活性化することができる。ヒトIL-5受容体αの膜固定型をコードするmRNA転写物
は、エクソン1-10および12-14を含有する。エクソン11は変異スプライシング事
象（alternative splicing event）によりスプライシングされて除去される。主
要な可溶性アイソフォーム（可溶性型1）は、エクソン11中の正常スプライシン
グ事象およびインフレーム（in-frame）停止コドンの結果として産生される。他
の可溶性型（可溶性型2）はスプライシングされないで産生し、それゆえエクソ
ン11内で読むことより生成それゆえエクソン11内で読むことよりそれゆえエクソ
ン11内で読むことよりされる。

【０２２７】ヒトIL-5受容体αの可溶性型をコードする転写物は、エクソン12、13あるいは
14を含有しない。従って、受容体の可溶性および膜型の両方に共通であるエクソ
ン1-10中の配列を標的とすること、および膜型（エクソン12-14）にのみ存在す
る配列を選択的に標的とすることは可能である。オリゴヌクレオチドは、エクソ
ン11の下流をうまくスプライシングすることを防ぐこと、および従って膜型を離
したスプライシング産物の向け直しをすること、およびIL-5受容体αの可溶性型
が好ましいということの意図を持って、エクソン11の下流の様々なイントロン／
エクソン境界を標的とするようにも設計された。一連のオリゴヌクレオチドは、
IL-5受容体 mRNA中の様々なスプライシング部位あるいは（イントロン-エクソン
境界）を標的とするように設計された。これらは表２０に示し、IL-5受容体 mRN
Aおよび細胞表面タンパク質レベルに対するそれらの効果は表２１および２２に
示す。

【０２２８】表２０ヒトIL-5Rオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列

【０２２９】

【表２０】

【０２３０】¹ 太字で示す残基、2'-メトキシエトキシ-残基（他は2'-デオキシ-）は“C”残
基、5-メチル-シトシンを含む；全ての結合はホスホロチオエート結合である。
² 標的領域は、オリゴヌクレオチドが標的とするイントロン／エクソン結合部
（スプライシング部位）に言及する。I13/E14は、イントロン13の3'末端とエク
ソン14の5'末端の間の結合部を示す。E13/I13は、エクソン13の3'末端とイント
ロン13の5'末端の間の結合部を示す。I12/E13は、イントロン12の3'末端とエク
ソン13の5'末端の間の結合部を示す。E12/I12は、エクソン12の3'末端とイント
ロン12の5'末端の間の結合部を示す。

【０２３１】 I11/E12は、イントロン11の3'末端とエクソン12の5'末端の間の結合部を示す
。標的配列は、Tuypens, T.ら（Eur. Cytokine Netw., 1992, 3, 451-459）の図
2由来である。

【０２３２】表２１スプライシング部位オリゴヌクレオチド（18 mer）によるヒトIL-5受容体α膜
型mRNA発現のモジュレーション

【０２３３】

【表２１】

【０２３４】¹ 太字で示す残基、2'-メトキシエトキシ-残基（他は2'-デオキシ-）は“C”残
基、5-メチル-シトシンを含む；全ての結合はホスホロチオエート結合である。 ISIS 16746、16748および16755は、IL-5膜受容体m RNAの発現を50％以上阻害
して、それゆえこのアッセイにおいて好ましい。ノーザンブロット解析により、
ISIS 16755は可溶性型を有意に阻害することなしに膜受容体転写物を阻害するこ
とが示された。従って、ISIS 16755は他の非-RNAse Hで得られたデータ（例えば
、スプライシング部位を標的とする均一2'-メトキシエトキシオリゴヌクレオチ
ド）と一致するように、膜型を指向してスプライシングを向け直すと信じられて
いる。

【０２３５】表２２スプライシング部位オリゴヌクレオチドによる細胞表面におけるヒトIL-5受容
体αタンパク質発現のモジュレーション（36時間）

【０２３６】

【表２２】

【０２３７】¹ 太字で示す残基、2'-メトキシエトキシ-残基（他は2'-デオキシ-）は“C”残
基、5-メチル-シトシンを含む；全ての結合はホスホロチオエート結合である。
² 標的領域は、オリゴヌクレオチドが標的とするイントロン／エクソン結合部
（スプライシング部位）に言及する。I13/E14は、イントロン13の3'末端とエク
ソン14の5'末端の間の結合部を示す。E13/I13は、エクソン13の3'末端とイント
ロン13の5'末端の間の結合部を示す。I12/E13は、イントロン12の3'末端とエク
ソン13の5'末端の間の結合部を示す。E12/I12は、エクソン12の3'末端とイント
ロン12の5'末端の間の結合部を示す。I11/E12は、イントロン11の3'末端とエク
ソン12の5'末端の間の結合部を示す。

【０２３８】 ISIS 16746、16748、16755および16758は、このアッセイにおいてヒトIL-5膜
受容体αタンパク質を50％以上阻害して、それゆえ好ましい。ISIS 16758および
16755はさらなる研究のために選択された。ISIS 16758は、TL-1細胞におけるIL-
5受容体α細胞表面タンパク質の減少に関して、約5μMのIC50を有することが分
かった。1-ミスマッチ対照は10μMのIC50を有し、3-および5-ミスマッチ対照はI
L-5受容体α発現を阻害しなかった。ISIS 16758は、mRNAレベルを減少させずにI
L-5受容体αタンパク質発現を阻害して、均一2'-メトキシエトキシ修飾オリゴヌ
クレオチドについて予測したように、RNAse H-非依存性機構と一致した。

【０２３９】実施例３１ IL-5受容体αオリゴヌクレオチドで処理したTF-1細胞におけるアポトーシスの
誘導 IL-5（0.5 ng/ml）中で培養した1×10⁶のTF-1細胞を、オリゴヌクレオチド処
理（トランスフェクションは先の実施例に記載されるようにエレクトロポレーシ
ョンにより行った）の48時間後に回収して、ホスファチジルセリン発現を製造業
者の説明に従ってAnnexin-Vフローサイトメトリーキット（Clontech, Palo Alto
, CA）を使用してアポト−シスの測定として検出した。簡略すると、細胞を0.2
mlの染色緩衝液（10mM Hepes, pH 7.4, 140 mM NaCl, 5 mM CaCl₂）に再懸濁し
て、10μlのヨウ化プロピジウムおよび5μlのAnnexin V剤を10分間4℃で加えた
。試料をFacsFlow（Becton Dickinson, Franklin Lakes NJ）緩衝液で希釈して
、Becton Dickinson FACScanで解析した。結果は表２３に示す。

【０２４０】表２３ヒトIL-5受容体αのアンチセンスにより媒介されるアポトーシス誘導

【０２４１】

【表２３】

【０２４２】アポトーシスは、IL-5受容体αのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害により
、IL-5の存在下で培養されたTF-1細胞において誘導されることが示された。実施例３２細胞増殖に対するIL-5受容体オリゴヌクレオチドの効果 2.5×10⁴のTF-1細胞を、エレクトロポレーションの後16時間、IL-5の非存在下
で200μlの完全RPMI中にて96ウェルプレートでインキベートした。IL-5（0.5 ng
/ml）を加えて、培養物を48時間の培養期間の最後の8時間1μCiの〔³H〕-チミジ
ンでパルスした。細胞をガラスファイバーフィルター上に回収して、液体シンチ
レーションカウンティングによりチミジン結合（細胞増殖に対する割合）につい
て解析した。結果は表２４に示す。結果を非処理の対照におけるチミジン結合と
比較する。

【０２４３】表２４ヒトIL-5受容体αアンチセンスオリゴヌクレオチドによるIL-5誘導TF-1細胞増
殖の阻害

【０２４４】

【表２４】

【０２４５】これらのデータは、IL-5受容体αのアンチセンス阻害がIL-5に対する細胞反応
、すなわちIL-5に反応する細胞増殖、を大いに減少させることを示す。対照オリ
ゴヌクレオチドは効果的でなかった。

【０２４６】実施例３３ヒトIL-5受容体αを標的とするオリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチドを、IL-5受容体αの5'非翻訳領域を標的とするように設計
した。これらは表２５に示す。2'-メトキシエトキシギャップマーおよび2'-メト
キシエトキシ化合物の両方を設計した。

【０２４７】表２５ヒトIL-5Rオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列

【０２４８】

【表２５】

【０２４９】¹ 太字で示す残基、2'-メトキシエトキシ-残基（他は2'-デオキシ-）は“C”残
基、5-メチル-シトシンを含む；全ての結合はホスホロチオエート結合である。
² オリゴヌクレオチドが標的とするGenbank寄託番号U18373、座位名“HSU18373
”、SEQ ID NO. 208からのヌクレオチド番号。

【０２５０】実施例３４混合バックボーンオリゴヌクレオチドは、ヒトIL-5受容体αを標的とするよう
に設計された。これらは表２６に示す。

【０２５１】表２６ヒトIL-5Rオリゴヌクレオチドの混合バックボーンヌクレオチド類似体

【０２５２】

【表２６】

【０２５３】¹ 太字で示す残基、2'-メトキシエトキシ-残基（他は2'-デオキシ-）は“C”残
基、5-メチル-シトシンを含む；P=O/P=Sは、2'-MOEにおけるホスホジエステル結
合および2'-デオキシギャップにおけるホスホロチオエート結合を示す。

【０２５４】実施例３５ヒトIL-5受容体αオリゴヌクレオチドの最適化一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、2'メトキシエトキシ領域の様々な
配置を有するように、活性配列に基づいて設計した。これらは表２７に示す。

【０２５５】表２７ヒトIL-5Rオリゴヌクレオチドのヌクレオチド類似体

【０２５６】

【表２７】

【０２５７】

【０２５８】¹ 太字で示す残基、2'-メトキシエトキシ-残基（他は2'-デオキシ-）は“C”残
基、5-メチル-シトシンを含む；全ての結合はホスホロチオエート結合である。

【配列表】

【手続補正書】

【提出日】平成１３年１１月２７日（２００１．１１．２７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ 43/00 １０５１１１１１１Ｃ１２Ｎ 5/02 Ｃ１２Ｎ 5/02 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者カラス，ジェームズ・ジーアメリカ合衆国カリフォルニア州92069，サン・マルコス，モンチュラ・ロード 1159 (72)発明者マッケイ，ロバートアメリカ合衆国カリフォルニア州92116，サンディエゴ，ウィルソン・アベニュー・ナンバー１ 4780 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 DA03 GA11 HA17 4B065 AA93Y AB01 AC20 BA02 BB14 CA24 CA44 4C084 AA13 NA14 ZA592 ZB112 ZB212 ZB262 ZC022 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA59 ZB11 ZB21 ZB26 ZC02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】インターロイキン-5シグナルトランスダクションをモジュレー
トする、長さ8から30のヌクレオ塩基であるアンチセンス化合物。
【請求項２】アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１のアンチセ
ンス化合物。
【請求項３】ヒトインターロイキン-5をコードする核酸分子を標的とし、ヒ
トインターロイキン-5の発現をモジュレートする、請求項１のアンチセンス化合
物。
【請求項４】ヒトインターロイキン-5の発現を阻害するSEQ ID NO: 52、53
あるいは62の少なくとも8-ヌクレオ塩基部分を含む、長さ30までのヌクレオ塩基
であるアンチセンス化合物。
【請求項５】ヒトインターロイキン-5受容体αをコードする核酸分子を標的
とし、ヒトインターロイキン-5受容体αの発現をモジュレートする、請求項１の
アンチセンス化合物。
【請求項６】ヒトインターロイキン-5の発現を阻害するSEQ ID NO: 162、16
6、167、169、170、171あるいは172の少なくとも8-ヌクレオ塩基部分を含む、長
さ30までのヌクレオ塩基であるアンチセンス化合物。
【請求項７】アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾ヌク
レオシド間結合を含む、請求項２のアンチセンス化合物。
【請求項８】アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオシド間結合が
ホスホロチオエート結合である、請求項７のアンチセンス化合物。
【請求項９】アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾糖部
分を含む、請求項２のアンチセンス化合物。
【請求項１０】アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾糖部分が2'-O-メト
キシエトキシ糖部分である、請求項９のアンチセンス化合物。
【請求項１１】実質的にアンチセンスオリゴヌクレオチドの全ての糖部分が
2'-O-メトキシエトキシ糖部分である、請求項１０のアンチセンス化合物。
【請求項１２】アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの修飾ヌ
クレオ塩基を含む、請求項２のアンチセンス化合物。
【請求項１３】アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオ塩基が5-メ
チルシトシンである、請求項１２のアンチセンス化合物。
【請求項１４】アンチセンスオリゴヌクレオチドの各々の2'-O-メトキシエ
トキシ修飾シトシンヌクレオ塩基が5-メチルシトシンである、請求項１０のアン
チセンス化合物。
【請求項１５】キメラオリゴヌクレオチドである請求項１のアンチセンス化
合物。
【請求項１６】請求項１のアンチセンス化合物および医薬的に許容可能なキ
ャリアあるいは希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項１７】コロイド状分散系（colloidal dispersion system）をさら
に含む、請求項１６の医薬組成物。
【請求項１８】アンチセンス化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドであ
る、請求項１６の医薬組成物。
【請求項１９】可溶性インターロイキン-5受容体αを標的とし、可溶性イン
ターロイキン-5受容体αの発現を選択的に阻害する、請求項５のアンチセンス化
合物。
【請求項２０】膜インターロイキン-5受容体αをコードする核酸分子中に見
出せない可溶性インターロイキン-5受容体αをコードする核酸分子の領域を標的
とする、請求項１９のアンチセンス化合物。
【請求項２１】膜インターロイキン-5受容体αを標的とし、膜インターロイ
キン-5受容体αの発現を選択的に阻害する、請求項５のアンチセンス化合物。
【請求項２２】可溶性インターロイキン-5受容体αをコードする核酸分子中
に見出せない膜インターロイキン-5受容体αをコードする核酸分子の領域を標的
とする、請求項２１のアンチセンス化合物。
【請求項２３】インターロイキン-5受容体αの可溶性型および膜型の両方の
発現を阻害する、請求項５のアンチセンス化合物。
【請求項２４】細胞あるいは組織により発現するインターロイキン-5受容体
αアイソフォームの割合を変化させる、請求項５のアンチセンス化合物。
【請求項２５】発現するインターロイキン-5受容体αの膜型に対するインタ
ーロイキン-5受容体αの可溶性型の割合を増加させる、請求項２４のアンチセン
ス化合物。
【請求項２６】アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、実質的にアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの全ての糖部分が2'-O-メトキシエトキシ糖部分である
、請求項２５のアンチセンス化合物。
【請求項２７】アポトーシスを促進する請求項５のアンチセンス化合物。
【請求項２８】インターロイキン-5受容体αをコードするRNAのスプライシ
ングを変えることで、インターロイキン-5受容体αアイソフォームの割合が変わ
る、アンチセンス化合物。
【請求項２９】細胞あるいは組織において、インターロイキン-5シグナルト
ランスダクションをモジュレートするために請求項１のアンチセンス化合物と前
記の細胞あるいは組織を接触させることを含む、インターロイキン-5シグナルト
ランスダクションをモジュレートする方法。
【請求項３０】ヒト細胞あるいは組織において、ヒトインターロイキン-5の
発現を阻害するために請求項３のアンチセンス化合物と前記の細胞あるいは組織
を接触させることを含む、ヒトインターロイキン-5の発現をモジュレートする方
法。
【請求項３１】ヒト細胞あるいは組織において、ヒトインターロイキン-5受
容体αの発現を阻害するために請求項５のアンチセンス化合物と前記の細胞ある
いは組織を接触させることを含む、ヒトインターロイキン-5受容体αの発現をモ
ジュレートする方法。
【請求項３２】ヒト細胞あるいは組織において、ヒトインターロイキン-5受
容体αアイソフォームの割合を変えるために請求項２６のアンチセンス化合物と
前記の細胞あるいは組織を接触させることを含む、ヒトインターロイキン-5受容
体αのアイソフォームの割合を変える方法。
【請求項３３】インターロイキン-5シグナルトランスダクションと関連する
疾患あるいは状態を有するヒトに、インターロイキン-5シグナルトランスダクシ
ョンをモジュレートするために治療的あるいは予防的に効果的な量の請求項１の
アンチセンス化合物を投与することを含む、前記の動物を治療する方法。
【請求項３４】インターロイキン-5発現と関連する疾患あるいは状態を有す
るヒトに、インターロイキン-5発現をモジュレートするために治療的あるいは予
防的に効果的な量の請求項３のアンチセンス化合物を投与することを含む、前記
の動物を治療する方法。
【請求項３５】インターロイキン-5受容体α発現と関連する疾患あるいは状
態を有するヒトに、インターロイキン-5受容体α発現をモジュレートするために
治療的あるいは予防的に効果的な量の請求項５のアンチセンス化合物を投与する
ことを含む、前記のヒトを治療する方法。
【請求項３６】疾患あるいは状態が好酸球性症候群あるいは喘息である、請
求項３５の方法。
【請求項３７】投与の経路が肺投与である、請求項３５の方法。
【請求項３８】インターロイキン-5受容体α発現と関連する疾患あるいは状
態を有するヒトに、インターロイキン-5受容体αアイソフォームの割合を変化さ
せるために治療的あるいは予防的に効果的な量の請求項２８のアンチセンス化合
物を投与することを含む、前記のヒトを治療する方法。
【請求項３９】疾患あるいは状態が好酸球性症候群あるいは喘息である、請
求項３８の方法。
【請求項４０】投与の経路が肺投与である、請求項３８の方法。
【請求項４１】アポトーシスにおける減少により特徴付けられる疾患あるい
は状態を有するヒトに、治療的あるいは予防的に効果的な量の請求項２７のアン
チセンス化合物を投与することを含む、前記のヒトを治療する方法。
【請求項４２】インターロイキン-5受容体α発現と関連する疾患あるいは状
態を有するヒトに、膜インターロイキン-5受容体αの発現をモジュレートするた
めに治療的あるいは予防的に効果的な量の請求項２１のアンチセンス化合物を投
与することを含む、前記の動物を治療する方法。
【請求項４３】疾患あるいは状態が喘息あるいは好酸球性症候群である、請
求項４２の方法。
【請求項４４】投与の経路が肺投与である、請求項４２の方法。
【請求項４５】喘息の治療のための化学療法剤をさらに含む、請求項１６の
医薬組成物。
【請求項４６】請求項２４のアンチセンス化合物および医薬的に許容可能な
キャリアあるいは希釈剤を含む医薬組成物。