JP2010524476A - Tnfスーパーファミリー受容体についてのスプライススイッチオリゴマーおよび疾患の治療におけるそれらの使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
SSOは、Toneにおいて検出された主要なCD40スプライス変異体を生産するために使用され、前記変異体では、膜貫通領域の上流にあるエキソン6の欠失がタンパク質の読み枠の変化を生じさせた。SSOは予想されたmRNAスプライス変異体を生じさせたが、分泌された受容体が検出できなかったことから、変異体mRNAの翻訳産物は不安定であると思われた(非特許文献5)。非特許文献6には、エキソン6を欠くマウススプライス変異体は安定な分泌形態のCD40ではない可能性が予測されている(1756ページ、右側の欄参照)。
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列は、配列番号131〜配列番号145、配列番号147〜配列番号161、および配列番号163〜配列番号177からなる群より選択される核酸塩基配列若しくは核酸塩基モチーフ配列と同一であるか、または前記核酸塩基配列若しくは前記核酸塩基モチーフ配列内に存在する。
本発明は、スプライススイッチオリゴヌクレオチドまたはスプライススイッチオリゴマー(SSO)に関する。本発明による好ましいSSOは、TNFR1(TNFRSF1A)またはTNFR2(TNFRSF1A)プレmRNAのエキソン7を標的とし、典型的には、それぞれエキソン7の部分的または全体の欠失を含むTNFR変異体の生成をもたらす。エキソン7を標的とするSSOは、炎症性疾患治療において治療上の利益を有する、可溶性形態のTNFRを生じさせることが認められている。SSOは、RNアーゼHを動員できないか、または実質的に動員できないことを特徴とする。
本発明はさらに、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートおよび医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物を提供する。
本発明は、TNFRSF1A TNF−α受容体またはTNFRSF1B TNF−α受容体を発現する哺乳動物細胞において前記TNF−α受容体またはTNFRSF1B TNF−α受容体の可溶性形態の発現を高める方法を提供し、前記方法は、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートまたは医薬組成物を細胞に投与することを含む。
本発明は、炎症性疾患または状態の治療用薬剤を製造するための、本発明によるオリゴマーの使用方法を提供する。
本発明は、炎症性疾患または状態に罹患している患者または罹患している可能性が高い患者に、本発明による医薬組成物を投与する工程を含む、炎症性疾患または状態を治療または予防する方法を提供する。
本発明はさらに、発現ベクターなどの、本発明による核酸を含むベクターを提供する。
本発明はさらに、本発明による核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。
オリゴマー
一つの実施形態では、オリゴマーは連続する核酸塩基配列からなる。
一つの実施形態では、本発明は、8〜50核酸塩基長からなる連続する核酸塩基配列を含み、前記連続する核酸塩基配列が、配列番号1または配列番号2、配列番号3または配列番号4内に存在する連続するヌクレオチドの対応する領域に相補的であり(すなわち前記連続する核酸塩基配列が、配列番号247または配列番号248、配列番号249または配列番号250内に存在する連続するヌクレオチド(に「対応する」またはその一部)の領域に存在し)、前記連続する核酸塩基配列が、5つ以上の連続するDNA(2’−デオキシリボヌクレオシド)モノマー単位を含まない、8〜50核酸塩基長のオリゴマーを提供する。
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列は、ヌクレオチド類似体(X)を含むか、またはヌクレオチド類似体(X)からなる。
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列は、7個以上の連続するヌクレオチド類似体単位(X)の領域を含まず、例えば6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、または2個以下の連続ヌクレオチド類似体単位(X)を含む。
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列の最も5’側の核酸塩基は、DNA(2’−デオキシリボヌクレオシド)モノマー単位などのヌクレオチド単位(x)である。
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列の最も3’側の核酸塩基は、DNA(2’−デオキシリボヌクレオシド)モノマー単位などのヌクレオチド単位(x)である。
一つの実施形態では、ヌクレオチドと核酸塩基の交互配列は、Xx、xX、Xxx、xXx、xxX、XXx、XxX、xXX、XXXx、XXxX、XxXX、xXXX、xxxX、xxXx、xXxx、Xxxx、XXXXx、XXXxX、XXxXX、XxXXX、xXXXX、xxxxX、xxxXx、xxXxx、xXxxx、Xxxxxからなる群より選択される配列であり、前記交互配列は場合により反復される。
一つの実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、前記の少なくとも1つのLNA類似体単位およびLNA以外の少なくとも1つのさらなるヌクレオチド類似体単位を含む。
一つの実施形態では、Xなどのヌクレオチド類似体単位は、2’−OMe−RNA単位、2’−フルオロ−DNA単位、およびLNA単位からなる群より独立して選択される。
一つの実施形態では、LNA単位は、オキシ−LNA、アミノ−LNA、チオ−LNAおよびエナ−LNAからなる群より選択される。
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列はLNAおよびDNA単位のみからなる。β−D−オキシまたはβ−D−チオまたはβ−D−アミノなどの、β−D立体配置のLNA単位が好ましい。
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列は、配列番号1または配列番号3の対応する領域に相補的である、すなわち配列番号247または配列番号249内に存在する連続するヌクレオチドの(対応する)領域に存在する、核酸塩基配列を含む。
一つの実施形態では、5’エキソン/イントロン3’または3’イントロン/エキソン5’境界は、配列番号1の50−51、配列番号1の164−165、配列番号2の50−51、配列番号2の79−80、配列番号3の51−52、配列番号3の129−139、配列番号4の50−51、配列番号4の81−82の核酸塩基からなる群より選択される。
一つの実施形態では、連続する核酸塩基配列は、ヌクレオチド47〜49、54〜56および122〜124から選択される配列番号3の領域に相補的な核酸塩基配列を含む。
一つの実施形態では、オリゴマーは、前記オリゴマーに共有結合した少なくとも1つの非ヌクレオチド部分を含む。
もう一つの態様では、本発明は、エキソン7を欠く可溶性のリガンド結合形態の量が増加し、内在性膜形態の量が減少するように、スプライススイッチオリゴヌクレオチドまたはスプライススイッチオリゴマー(SSO)を用いてTNFR2の選択的スプライシングを制御する。本発明の方法および組成物は、過度のtnf活性に関連する疾患の治療において使用することができる。
SSOの長さ(すなわちオリゴマー内のモノマーの数)は、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASON)と同様であり、典型的には約8〜30ヌクレオチドである。好ましい実施形態では、SSOは約10〜16ヌクレオチドである。本発明は、RNAにハイブリダイズするが、従来のアンチセンス2’−デオキシオリゴヌクレオチドのようにRNアーゼHによるRNAの分解を活性化させない、いくつかの化学的性質のSSOで実施することができる。本発明は、2’O修飾核酸オリゴマー、例えば2’Oが−O−CH3、−O−CH2−CH2−O−CH3、−O−CH2−CH2−CH2−NH2、−O−CH2−CH2−CH2−OHまたは−Fで置換されているものを用いて実施でき、2’O−メチルまたは2’O−メチルオキシエチルが好ましい。核酸塩基は糖に結合している必要はない、すなわちいわゆるペプチド核酸オリゴマーまたはモルホリンベースのオリゴマーが使用できる。これらの種々の連結化学物質の比較は、Sazani,P.ら、2001,Nucleic Acids Res.29:3695に見られる。スプライススイッチオリゴヌクレオチドという用語は、上記形態を包含することが意図されている。当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドギャップマーとSSOの関係を理解する。ギャップマーは、非活性化ヌクレアーゼ抵抗性オリゴマーに隣接するRNアーゼH活性化領域(典型的には2’−デオキシリボヌクレオシドホスホロチオエート)を含むASONである。一般に、ギャップマーASON内のフランキング配列のために適切な任意の化学物質をSSOにおいて使用できる。
SSOは、取込み、分布および/または吸収を助けるために、例えばリポソーム、受容体標的分子、および経口製剤、直腸用製剤、局所製剤またはその他の製剤のような他の分子、分子構造、または化合物の混合物と混合、封入、複合または結合され得る。
本発明によるオリゴマーは、相補的一本鎖RNA分子のRNアーゼHに基づく切断を仲介しない。オリゴヌクレオチドがRNアーゼHの動員において有効であるためには一続きの少なくとも5つの連続するDNA核酸塩基が必要である。
ヌクレオチドのみからなる好ましいヌクレオチド配列モチーフまたはヌクレオチド配列に言及するとき、その配列によって規定される本発明のオリゴマーは、前記配列内に存在するヌクレオチドの1つ以上の代わりに、LNA単位または、オリゴマー/標的二本鎖の二本鎖安定性/Tmを上昇させるヌクレオチド類似体(すなわち親和性増強ヌクレオチド類似体)などの対応するヌクレオチド類似体を含み得る。
一つの実施形態では、ヌクレオチド類似体(X)は、2’−O−アルキル−RNA単位、2’−OMe−RNA単位、2’MOE RNA単位、2’−アミノ−DNA単位、2’−フルオロ−DNA単位、LNA単位、PNA単位、HNA単位、INA単位からなる群より独立して選択される。
一つの実施形態では、ヌクレオチド類似体は、2’MOE、すなわち2’O−2メトキシエチルRNAである。それ故一つの実施形態では、本明細書の核酸塩基モチーフにおいて言及されるX2またはMは、2’−MOEであり得る。
LNAを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、本発明によるオリゴマーの一部の実施形態では、すべてのLNA C単位は5’メチル−シトシンである。一部の実施形態では、すべてのヌクレオチド類似体はLNAである。
Xは、O、SおよびNRH[式中、RはHまたはC1−C4−アルキルである]からなる群より選択され、
Yは(−CH2)r[式中、rは1〜4の整数である]であり、かつ、
Bは、上述したような天然または非天然起源の塩基である]
に示される化学構造を有する。
本発明のオリゴヌクレオチド化合物において使用されるLNAは、好ましくは一般式:
ZおよびZ*は、ヌクレオシド間結合、末端基または保護基の中から独立して選択され、
Bは、天然または非天然ヌクレオチド塩基部分を構成し、かつ、
不斉基はいずれかの配向で存在し得る]
の構造を有する。
ZおよびZ*は、ヌクレオシド間結合、末端基または保護基の中から独立して選択され、
Bは、天然または非天然核酸塩基を構成し、かつ、
RHは、水素およびC1−4−アルキルから選択される]
のいずれかに従った少なくとも1つのLNAを含む。
から選択されるヌクレオシド間結合を含む。
アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの本発明のオリゴマーは、2以上のタイプのLNA単位を含み得る。適切には、化合物は、β−D−オキシLNA、および以下のLNA単位:チオ−LNA、アミノ−LNA、オキシ−LNA、エナ−LNAおよび/またはD−βまたはL−αのいずれかの立体配座またはそれらの組合せのα−LNAの1つ以上の両方を含み得る。
LNAおよびDNAが好ましいが、MOE、2’−O−Me、および他の2’−置換類似体およびRNAも使用できる。
一つの実施形態では、本発明のオリゴマーはいかなるRNA単位も含まない。
高親和性ヌクレオチド類似体は、同等のDNAヌクレオチドの結合親和性よりも高い、相補的RNAヌクレオチドとの二本鎖熱安定性を有するオリゴヌクレオチドを生じさせるヌクレオチド類似体である。これは、典型的にはTmを測定することによって決定される。
「オリゴマー」という用語と交換可能に使用される「オリゴヌクレオチド」(または単に「オリゴ」)という用語は、本発明に関連して、2つ以上の核酸塩基の共有結合によって形成される分子を指す。本発明のオリゴヌクレオチド(一本鎖オリゴヌクレオチドとも称される)に関連して使用されるとき、「オリゴヌクレオチド」という用語は、一つの実施形態では、例えば8〜26個の核酸塩基、例えば12〜26個の核酸塩基を有し得る。本明細書において詳述される好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、10〜16核酸塩基または8〜15核酸塩基の長さを有する。
本発明のオリゴヌクレオチドの長さは変化し得る。実際に、10〜17または10〜15核酸塩基などの短いオリゴヌクレオチドを有することは有利であると考えられる。
一つの実施形態では、本発明によるオリゴヌクレオチドは、8〜24ヌクレオチド、例えば10〜24ヌクレオチドの長さ、12〜24ヌクレオチド、例えば8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23または24ヌクレオチド長、好ましくは10〜22、例えば12〜22ヌクレオチド、例えば10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21または22ヌクレオチド長、より好ましくは10〜20、例えば12〜20ヌクレオチド長、例えば10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20ヌクレオチド長、さらに一層好ましくは10〜19、例えば12〜19ヌクレオチド長、例えば10、11、12、13、14、15、16、17、18または19ヌクレオチド長、例えば10〜18、例えば12〜18ヌクレオチド長、例えば10、11、12、13、14、15、16、17または18ヌクレオチド長、より好ましくは10〜17、例えば12〜17ヌクレオチド長、例えば10、11、12、13、14、15、16または17ヌクレオチド長、最も好ましくは10〜16、例えば12〜16ヌクレオチド、例えば10、11、12、13、14、15または16ヌクレオチド長を有する。
「ヌクレオシド間連結基」という用語は、DNA単位間、DNA単位とヌクレオチド類似体の間、2つの非LNA単位の間、非LNA単位とLNA単位の間、および2つのLNA単位の間等のような、2つの核酸塩基を共有結合することができる基を意味するように意図されている。好ましい例は、リン酸、ホスホジエステル基およびホスホロチオエート基を含む。
オリゴヌクレオチド内の典型的なヌクレオシド間連結基はリン酸基であるが、これらは、リン酸とは異なるヌクレオシド間連結基によって置換され得る。本発明のさらなる興味深い実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドはそのヌクレオシド間連結基構造において修飾される、すなわち修飾オリゴヌクレオチドはリン酸とは異なるヌクレオシド間連結基を含む。従って、好ましい実施形態では、本発明によるオリゴヌクレオチドは、リン酸とは異なる少なくとも1つのヌクレオシド間連結基を含む。
一つの実施形態では、オリゴマーは、交互LNAおよびそれに続く2つのDNA単位(Xxx)、xXxまたはxxXのモチーフを含む。
一つの実施形態では、オリゴマーは、少なくとも3つのヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも4つのヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも5個のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも6個のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも7個のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも8個のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも9個のヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも10個、例えば少なくとも11個、例えば少なくとも12個のヌクレオチド類似体単位を含む。
本発明のオリゴマーのさらなる設計
一つの実施形態では、本発明によるオリゴマーの、3’末端から数えて最初の核酸塩基は、LNA単位などのヌクレオチド類似体である。
一つの実施形態では、x’’はDNA単位を表す。
一つの実施形態では、Xなどのヌクレオチド類似体単位は、2’−O−アルキル−RNA単位、2’−OMe−RNA単位、2’−アミノ−DNA単位、2’−フルオロ−DNA単位、2’−MOE−RNA単位、LNA単位、PNA単位、HNA単位、INA単位からなる群より独立して選択される。
一つの実施形態では、オリゴマーは、少なくとも1つのLNA類似体単位およびLNA以外の少なくとも1つのさらなるヌクレオチド類似体を含む。
一つの実施形態では、1または複数の非LNAヌクレオチド類似体単位は、2’−OMe−RNA単位および2’−フルオロ−DNA単位から独立して選択される。
一つの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、5個以上の連続するDNAヌクレオチド単位の領域を含まない。一つの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、6個以上の連続DNAヌクレオチド単位の領域を含まない。一つの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、7個以上の連続DNAヌクレオチド単位の領域を含まない。一つの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、8個以上の連続DNAヌクレオチド単位の領域を含まない。一つの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、3個以上の連続DNAヌクレオチド単位の領域を含まない。一つの実施形態では、本発明によるオリゴマーは、2個以上の連続DNAヌクレオチド単位の領域を含まない。
一つの実施形態では、オリゴマーは、少なくとも3個の連続するLNA単位などの、少なくとも3個の連続するヌクレオチド類似体単位からなる少なくとも1つの領域を含む。
本発明によるオリゴヌクレオチドは、一つの実施形態では、以下のモチーフからなる群より選択される核酸塩基の配列5’−3’を有し得る:
LxLxxLLxxLL
LxLxLLLxxLL
LxxLxxLxxL
xLxxLxxLxx 「2つおき」
xxLxxLxxLx 「2つおき」
xLxLxLxLxL 「1つおき」
LxLxLxLxL 「1つおき」
LdLddLLddLL
LdLdLLLddLLL
LMLMMLLMMLL
LMLMLLLMMLL
LFLFFLLFFLL
LFLFLLLFFLLL
LLLLLL
LLLLLLL
LLLLLLLL
LLLLLLLLL
LLLLLLLLLL
LLLLLLLLLLL
LLLLLLLLLLLL
LMMLMMLMML
MLMMLMMLMM 「2つおき」
MMLMMLMMLM 「2つおき」
LFFLFFLFFL 「2つおき」
FLFFLFFLFF 「2つおき」
FFLFFLFFLF 「2つおき」
dLdLdLdLdL 「1つおき」
LdLdLdLdL 「1つおき」
MLMLMLMLML 「1つおき」
LMLMLMLML 「1つおき」
FLFLFLFLFL 「1つおき」
LFLFLFLFL 「1つおき」
LdLddLLddLdLdLL
LdLdLLLddLLLdLL
LMLMMLLMMLMLMLL
LMLMLLLMMLLLMLL
LFLFFLLFFLFLFLL
LFLFLLLFFLLLFLL
LddLddLddL(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d)
dLddLddLdd(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L)
ddLddLddLd(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d)
LMMLMMLMML(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M)
MLMMLMMLMM(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L)
MMLMMLMMLM(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M)
LFFLFFLFFL(F)(F)(L)(F)(F)(L)(F)
FLFFLFFLFF(L)(F)(F)(L)(F)(F)(L)
FFLFFLFFLF(F)(L)(F)(F)(L)(F)(F)
dLdLdLdLdL(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)
LdLdLdLdL(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)(L)
MLMLMLMLML(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)
LMLMLMLML(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)(L)
FLFLFLFLFL(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)
LFLFLFLFL(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)(L)
式中、L=LNA単位、d=DNA単位、M=2’MOE RNA、F=2’フルオロおよび「x」=本明細書において定義される通り。より長いオリゴマーに関しては上記パターンが反復され得ること、およびより短いオリゴマーに関しては、5’末端からまたは3’末端から始まる、上記モチーフの対応する一部分を使用し得ること、およびカッコ内の残基は選択的であることが認識される。
本発明は、エキソン7によってコードされる膜貫通結合ドメイン内に欠失を含む、単離または精製された可溶性形態のTNF−α受容体を提供し、前記TNF−α受容体は、TNF−α受容体TNFR1A若しくはTNFR1B、またはその変異体、フラグメント若しくはホモログから選択される。
一つの実施形態では、単離または精製された可溶性形態のTNF−α受容体は、ヒトTNFR1 TNF−α受容体(配列番号123の残基1〜455または残基30〜455、またはその変異体、フラグメント若しくはホモログ)であり、前記欠失は、残基209から246の間(または配列番号123の残基209〜246に対応する領域)に存在する。
本発明の一つの実施形態は、哺乳動物TNFR遺伝子に由来するcDNAによってコードされ、cDNA内でエキソン6の後に直接エキソン8が続き、その結果としてエキソン7を欠く、完全長または成熟タンパク質である。さらに前記タンパク質は、TNF、好ましくはTNF−αに結合することができ、TNFアンタゴニストとして、好ましくはTNF−αアンタゴニストとして作用することができる。好ましくは、本発明のTNFRは、可溶性細胞外ドメイン単独よりも大きな度合で、より好ましくはTNFR:Fcと同等かまたはそれより大きな度合で、TNF媒介性細胞傷害を阻害することができる。本開示における哺乳動物TNFRは、ヒト、霊長動物、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマおよびブタTNFRを含むが、これらに限定されない。さらに、本開示における哺乳動物TNFRは、タンパク質が、それが比較される参照配列と同等の生物活性を保持する限り、例えば欧州特許出願第1172444号明細書に開示されるもののような、1つ以上の一塩基多型から生じるタンパク質配列を含むが、これに限定されない。
本発明はさらに、本発明による可溶性形態のTNF−α受容体をコードする核酸を提供する。
本発明はまた、本発明の核酸を含むベクターを提供する。
一つの実施形態では、ベクターは、宿主細胞における前記核酸の発現を駆動することができる発現カセットを含む。
本発明はまた、可溶性形態のTNF−α受容体の作製のための方法を提供し、前記方法は、前記核酸の発現を可能にする条件下で本発明による宿主細胞を培養し、その後前記宿主細胞から前記可溶性形態のTNF−α受容体を単離する工程を含む。
本発明の好ましい態様では、TNFR cDNAを含む組換え発現ベクターは、宿主細胞のDNAに安定に組み込まれる。
哺乳動物または昆虫細胞を使用するとき、適切に発現したTNFRタンパク質は細胞外培地に分泌される。標準的な生化学手法を用いてタンパク質を培地から回収し、濃縮して、精製する。レンチウィルスまたはAAV形質導入、プラスミドトランスフェクションまたは何らかの同様の手順による哺乳動物細胞での発現後、またはバキュロウィルス形質導入後の昆虫細胞における発現後、Amicon(登録商標)ろ過ユニットなどの適切な分子量カットオフ値を有する濃縮フィルタを用いてこれらの細胞の細胞外培地を濃縮する。TNFRタンパク質の損失を回避するため、フィルタは50kDalまたはそれ以下のタンパク質の通過を許容すべきである。
定義
「ヌクレオシド間連結基」という用語は、DNA単位間、DNA単位とヌクレオチド類似体との間、2つの非LNA単位の間、非LNA単位とLNA単位との間、および2つのLNA単位の間等のような、2つの核酸塩基を共有結合することができる基を意味するように意図されている。好ましい例は、リン酸、ホスホジエステル基およびホスホロチオエート基を含む。
本明細書において使用される、「作動可能に連結された」という用語は、遺伝因子が、それらが期待されたように作動することを可能にする関係で並べられることを指す。例えば、プロモーターがコード配列(例えば発現ベクター内の)の転写を開始するのを助ける場合、そのプロモーターはコード領域に作動可能に連結されている。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード領域の間に介在残基が存在してもよい。
タンパク質またはポリペプチド(配列)に関連して本明細書において使用される「変異体」という用語は、前記配列内の1つ以上のアミノ酸、すなわち少なくとも1つのアミノ酸、しかし好ましくは50未満のアミノ酸、例えば40未満、30未満、20未満または10未満のアミノ酸、例えば1アミノ酸、1〜2アミノ酸、1〜3アミノ酸、1〜4アミノ酸、1〜5アミノ酸の挿入、欠失または置換によって、もとの(親)ポリペプチドから作製される、またはポリペプチドからの配列情報を使用して作製されるポリペプチドを指す。
本発明の他の実施形態は、本発明によるオリゴマー、タンパク質および核酸を含有する医薬組成物である。
本発明の方法、核酸、タンパク質および製剤はまた、インビトロまたはインビボツールとしても有用である。
従って本発明の一つの実施形態は、患者にSSOを投与することによって炎症性疾患または状態を治療する方法である。投与されたSSOは、TNFRスーパーファミリーの受容体の安定な、分泌型リガンド結合形態をコードするスプライス変異体を生産するようにプレmRNAのスプライシングを変化させ、それによってその受容体に対するリガンドの活性を低下させる。もう一つの実施形態では、本発明は、SSOを細胞に投与することによってTNFRスーパーファミリーの受容体の安定な、分泌型リガンド結合形態を生産する方法である。
本発明は、哺乳動物においてTNFアンタゴニストのレベルを上昇させる方法を提供する。この方法は、本明細書で述べるようにTNFRの発現を駆動する、本明細書で述べる発現ベクターで哺乳動物の細胞を形質転換する工程を含む。
SSOの長さは、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASON)と同様であり、典型的には約10〜24ヌクレオチドである。本発明は、RNAにハイブリダイズするが、従来のアンチセンス2’−デオキシオリゴヌクレオチドのようにRNアーゼHによるRNAの分解を活性化させない、いくつかの化学的性質のSSOで実施することができる。本発明は、2’O−メチルまたは2’O−メチルオキシエチルホスホロチオエートなどの、2’O修飾核酸オリゴマーを用いて実施できる。核酸塩基は糖に結合している必要はない。いわゆるペプチド核酸オリゴマーまたはモルホリンベースのオリゴマーが使用できる。これらの異なる結合化学の比較は、Sazani,P.ら、2001,Nucleic Acids Res.29:3695に見られる。スプライススイッチオリゴヌクレオチドという用語は、上記形態を包含することが意図されている。当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドギャップマーとSSOの関係を理解するであろう。ギャップマーは、非活性化ヌクレアーゼ抵抗性オリゴマーに隣接するRNアーゼH活性化領域(典型的には2’−デオキシリボヌクレオシドホスホロチオエート)を含むASONである。一般に、ギャップマーASON内のフランキング配列のために適切ないかなる化学物質もSSOにおいて使用できる。
SSOは、取込み、分布および/または吸収を助けるために、例えばリポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所または他の製剤のような、他の分子、分子構造、または化合物の混合物と混合、封入、複合または結合され得る。
本発明は、1つ以上のスプライススイッチオリゴマー(SSO)を、腫瘍壊死因子受容体(TNFR)スーパーファミリーの受容体に対するリガンドの活性を低下させる時間および量で被験者に投与することを含む、炎症性疾患または状態を治療する方法を提供し、前記1つ以上のSSOは、前記受容体をコードするプレmRNAのスプライシングを、安定な、分泌型リガンド結合形態の前記受容体の生産を高めるように変化させることができる。
一つの実施形態では、受容体はヒトTNFRSF1Bである。
一つの実施形態では、疾患または状態は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患(クローン病または潰瘍性大腸炎)、肝炎、敗血症、アルコール性肝疾患および非アルコール性脂肪症からなる群より選択される。
一つの実施形態では、受容体は、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF3、TNFRSF5またはTNFRSF11Aであり、前記プレmRNAのスプライシングの前記変化は、エキソン7、エキソン8またはその両方を前記プレmRNAから切り出すことを含む。
一つの実施形態では、前記受容体はヒトTNFRSF1AまたはヒトTNFRSF1Bであり、および前記SSOは、配列番号1、2、3または4からの連続する配列に相補的である少なくとも10から少なくとも20ヌクレオチドを含む。
一つの実施形態では、前記SSOは、2’−デオキシリボヌクレオチド、2’O−Meリボヌクレオチド、2’O−MOEリボヌクレオチド、ヘキシトール(HNA)ヌクレオチドまたはヌクレオシド、2’O−4’C結合二環式リボフラノシル(LNA)ヌクレオチドまたはヌクレオシド、前記のいずれかのホスホロチオエート類似体、前記のいずれかのペプチド核酸(PNA)類似体、前記のいずれかのメチルホスホネート類似体、前記のいずれかのペプチド核酸類似体、前記のいずれかのN3’→P5’ホスホロアミデート類似体、および前記のいずれかのホスホロジアミデートモルホリノヌクレオチド類似体、およびそれらの組合せからなる群より独立して選択される1つ以上のヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。
一つの実施形態では、本発明は、細胞においてTNFRスーパーファミリーからの受容体の安定な、分泌型リガンド結合形態の生産を高める方法を提供し、前記方法は、前記細胞に1つ以上のスプライススイッチオリゴマー(SSO)を投与することを含み、前記1つ以上のSSOは、前記受容体の安定な、分泌型リガンド結合形態の生産を高めるように、前記受容体をコードするプレmRNAのスプライシングを変化させることができる。
一つの実施形態では、前記受容体は、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF3、TNFRSF5、TNFRSF8およびTNFRSF1Aからなる群より選択される哺乳動物受容体である。
一つの実施形態では、前記受容体はヒトTNFRSF1Bである。
一つの実施形態では、本発明は、少なくとも10から少なくとも20ヌクレオチドを含むスプライススイッチオリゴマー(SSO)を提供し、前記SSOは、TNFRスーパーファミリーからの受容体をコードするプレmRNAのスプライシングを、前記受容体の安定な、分泌型リガンド結合形態の生産を高めるように変化させることができる。
一つの実施形態では、前記受容体はヒトTNFRSF1Bである。
一つの実施形態では、SSOは、2’−デオキシリボヌクレオチド、2’O−Meリボヌクレオチド、2’O−MOEリボヌクレオチド、ヘキシトール(HNA)ヌクレオチドまたはヌクレオシド、2’O−4’C結合二環式リボフラノシル(LNA)ヌクレオチドまたはヌクレオシド、前記のいずれかのホスホロチオエート類似体、前記のいずれかのペプチド核酸(PNA)類似体、前記のいずれかのメチルホスホネート類似体、前記のいずれかのペプチド核酸類似体、前記のいずれかのN3’→P5’ホスホロアミデート類似体、および前記のいずれかのホスホロジアミデートモルホリノヌクレオチド類似体、およびそれらの組合せからなる群より独立して選択される1つ以上のヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む。
一つの実施形態では、前記SSOは、配列番号1、2、3または4からの連続する配列に相補的である少なくとも10から少なくとも20ヌクレオチドを含む。
一つの実施形態では、前記タンパク質は、少なくとも1つのプロセシング修飾、化学修飾または翻訳後修飾を含み、前記修飾は、アセチル化、アシル化、アミド化、ADPリボシル化、グリコシル化、メチル化、ペグ化、プレニル化、リン酸化、またはコレステロール複合からなる群より選択される。
一つの実施形態では、前記発現ベクターは、プラスミドまたはウィルスである。
一つの実施形態では、細胞はエクスビボで形質転換される。
一つの実施形態では、前記発現ベクターは組織特異的プロモーターを含み、前記組織特異的プロモーターは、例えば肝細胞またはマクロファージに由来し得る。
本発明は、哺乳動物細胞、昆虫細胞または微生物細胞などの、本発明の発現ベクターで形質転換された細胞を提供する。
本発明は、本発明の発現ベクターを、TNF−α活性などのTNF活性を低下させるために十分な時間および量で被験者に投与することを含む、炎症性疾患または状態を治療する方法を提供する。
一つの実施形態では、前記SSOの配列は、配列番号14、30、46、70、71、72および73、並びに少なくとも8ヌクレオチドのそれらのサブ配列からなる群より選択される配列を含む。
本発明は、1つ以上のスプライススイッチオリゴマー(SSO)を細胞に投与することを含む、前記細胞において、腫瘍壊死因子(TNF)を結合することができるタンパク質の生産を高める方法を提供し、前記タンパク質は、哺乳動物腫瘍壊死因子受容体2(TNFR2)(またはTNFR1)遺伝子に由来するcDNAによってコードされるアミノ酸を含む配列を有し、cDNAは、5’から3’方向の連続する順に、前記遺伝子のシグナル配列の切断点の後の第一アミノ酸をコードするコドンから前記遺伝子のエキソン6および前記遺伝子のエキソン8を経て前記遺伝子のエキソン10まで、または前記遺伝子のオープン・リーディング・フレームの第一アミノ酸をコードするコドンから前記遺伝子のエキソン6および前記遺伝子のエキソン8を経て前記遺伝子のエキソン10までを含み、前記1つ以上のSSOは、前記受容体をコードするプレmRNAのスプライシングを、前記タンパク質の生産を高めるように変化させることができる。一つの実施形態では、前記方法はインビボで実施される。
(実施例1)
オリゴヌクレオチド
表6は、交互の2’−デオキシ−および2’O−4’−(メチレン)−二環式リボヌクレオシドホスホロチオエートとの、上述した配列を有するキメラロックト核酸(LNA)SSOを列挙する。これらはSantaris Pharma,Denmarkによって合成された。各々のSSOに関して、5’末端ヌクレオシドは2’O−4’−メチレン−リボヌクレオシドであり、3’末端ヌクレオシドは2’デオキシ−リボヌクレオシドであった。表7は、交互の2’−O−メチル−リボヌクレオシド−ホスホロチオエート(2’−OMe)および2’O−4’−(メチレン)−二環式リボヌクレオシドホスホロチオエートとのキメラLNA SSOの配列を示す。これらはSantaris Pharma,Denmarkによって合成された。LNAを大文字で示し、2’−OMeを小文字で示す。
L929細胞を、10%胎仔ウシ血清および抗生物質を添加した最小必須培地に維持した(37℃、5%CO2)。トランスフェクションのため、L929細胞を105細胞/ウェルで24穴プレートで培養し、24時間後にトランスフェクトした。オリゴヌクレオチドを、指示されている濃度で、製造者の指示に従ってLipofectamine(商標)2000トランスフェクション試薬2μL(Invitrogen)と複合した。ヌクレオチド/脂質複合体を、次に、細胞に適用し、24時間インキュベートした。その後培地を吸引し、細胞をTRI試薬(商標)(MRC,Cincinnati,OH)で採集した。
全RNAをTRI試薬(MRC,Cincinnati,OH)で単離し、TNFR1またはTNFR2 mRNAを、製造者の指示に従ってrTthポリメラーゼ(Applied Biosystems)を使用してGeneAmp(登録商標)RT−PCRによって増幅した。反応当たり約200ngのRNAを使用した。本明細書で述べる実施例において使用したプライマーは表2に含まれる。PCRのサイクルを実施した:95℃、60秒間、56℃、30秒間、72℃、60秒間を合計22〜30サイクル。
製造者の指示に従ってPlatinum(登録商標) Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen)でPCRを実施した。各反応物50μLについて、どちらも約30pmolの正プライマーと逆プライマーを使用した。本明細書で述べる実施例において使用したプライマーは表5に含まれる。熱サイクル反応は、特に明記しない限り、以下のように実施した:94℃、3分間、次に94℃、30秒間、55℃、30秒間および72℃、105秒間を30〜40サイクル、次いで72℃、3分間。PCR産物を1.5%アガロースゲル上で分析し、エチジウムブロマイドで視覚化した。
ヒト肝細胞を、ADMET technologiesからまたはThe UNC Cellular Metabolism and Transport Core at UNC−Chapel Hillから懸濁液中で入手した。細胞を洗浄し、10%FBS、1mg/mLヒトインスリンおよび13nMデキサメタゾンを添加したRPMI 1640に懸濁した。培地3mL中0.5×106細胞/プレートで6穴プレートに肝細胞を塗布した。1〜1時間半後、非接着細胞を除去し、培地を、1mg/mLヒトインスリンおよび13nMデキサメタゾンを添加した、FBSを含まないRPMI 1640と交換した。
細胞培養培地または血清中の可溶性TNFR2のレベルを決定するため、R&D Systems(Minneapolis,MN)からのQuantikine(登録商標)Mouse sTNF RII ELISAキットまたはR&D Systems(Minneapolis,MN)からのQuantikine(登録商標)Human sTNF RII ELISAキットを使用した。検出のために使用した抗体は、プロテアーゼ切断形態の受容体も検出する。ELISAプレートを450nmに設定したマクロプレートリーダを用いて読み取り、波長補正を570nmに設定した。
104細胞/穴で96穴プレートに接種したL929細胞を、合計100mLの完全MEM培地(10%標準FBSを含む)中の指示されたオリゴヌクレオチドで処理したマウスからの10%血清の存在下に、0.1ng/mL TNF−αおよび1mg/mLアクチノマイシンDで処理し、37℃で最大24時間増殖させた。対照レーンは、未処理マウスからの10%血清中で培養した。24時間後にCellTiter 96(登録商標)AQueous One Solution Reagent(Promega)20mLを添加し、マイクロプレートリーダで490nmの吸光度を測定することによって細胞生存能を測定した。細胞生存能を未処理細胞に基準化した。
培地20mLまたは溶解産物20mgを4〜12% NuPAGE(登録商標)ポリアクリルアミドゲル(Invitrogen)の各穴に負荷した。ゲルを200Vで40分間泳動させた。タンパク質を、30Vで1時間、Invitrolon(商標)PVDF膜(Invitrogen)に転写し、次にそれを、StartingBlock(登録商標)ブロッキング緩衝液(Pierce)により、室温で1時間ブロックした。膜を、ヒトおよびマウスTNFR2のC末端を認識するウサギポリクローナル抗体(Abeam)と共に室温で3時間インキュベートした。PBS−T緩衝液(1×PBS、0.1%Tween−20)中で3回洗浄した後、膜を二次ヤギ抗ウサギ抗体(Abeam)と共に室温で1時間インキュベートし、再びPBS−T緩衝液で3回洗浄した。次に、製造者の推奨に従ってECL Plus(商標)(GE Healthcare)でタンパク質を検出し、その後写真撮影した。
TNFR mRNAに関するSSOスプライススイッチ活性
表6は、米国特許出願第11/595,485号に述べられている配列を有し、マウスおよびヒトTNFRを標的とするSSOのスプライススイッチ活性を示す。マウスTNFR2 エキソン7を標的とするSSOのうちで、少なくとも8つは多少のmuTNFR2 Δ7 mRNAを生じた。特に、SSO 3312、3274および3305は、エキソン7の少なくとも50%のスキッピングを誘導した。SSO 3305処理はほぼ完全なスキッピングを生じさせた。一次ヒト肝細胞にトランスフェクトした、ヒトTNFR2 エキソン7を標的とするSSOのうちで、少なくとも7つのSSOは多少のhuTNFR2 Δ7 mRNAを生じた。特に、SSO 3378、3379、3384および3459は、エキソン7の少なくとも75%のスキッピングを誘導し(図2B)、huTNFR2 Δ7の細胞外培地への有意な誘導を生じさせた(図2A)。
SSOが誘導するTNFR2スプライス変異体のスプライスジャンクションの分析
マウスおよびヒトの両方の細胞におけるSSOスプライススイッチが、予想されるTNFR2 Δ7 mRNAを導くことを確認するため、SSO誘導のTNFR2 Δ7 mRNAをRT−PCRによって分析し、配列決定した。
マウスにSSO 3274を25mg/kg/日で10日間腹腔内注射した。その後マウスを犠死させ、肝臓からの全RNAを、正プライマーTR045(配列番号228)および逆プライマーTR046(配列番号229)を使用したRT−PCRによって分析した。産物を1.5%アガロースゲル上で分析し(図6A)、TNFR2 Δ7についての産物を標準分子生物学手法を用いて単離した。単離したTNFR2 Δ7産物を、同じプライマーを用いたPCRによって増幅し、その後配列決定した(図6B)。配列データは、配列CTCTCTTCCAATTGAGAAGCCCTCCTGC(配列番号127のヌクレオチド777〜804)を含み、これは、SSO誘導のTNFR2 Δ7 mRNAがエキソン7を欠くことおよびエキソン6がエキソン8に直接連結されていることを確認する。
一次ヒト肝細胞を、実施例1で述べたようにSSO 3379でトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に全RNAを単離した。RNAを、製造者の指示に従ってランダム・ヘキサマ・プライマーを使用してSuperscript(商標)II逆転写酵素(Invitrogen)でcDNAに変換した。正プライマーTR049(配列番号202)および逆プライマーTR050(配列番号203)を使用して、cDNAに関してPCRを実施した。産物を1.5%アガロースゲル上で分析した(図7A)。TNFR2 Δ7に対応するバンドを、標準分子生物学手法を用いて単離し、その後配列決定した(図7B)。配列データは、配列CGCTCTTCCAGTTGAGAAGCCCTTGTGC(配列番号125のヌクレオチド774〜801)を含み、これは、SSO誘導のTNFR2 Δ7 mRNAがエキソン7を欠くことおよびエキソン6がエキソン8に直接連結されていることを確認する。
一次ヒト肝細胞におけるTNFR2 Δ7タンパク質のSSO用量依存的生産
一次ヒト肝細胞におけるSSOのスプライススイッチ活性の用量反応を試験した。ヒト肝細胞をADMET technologiesから懸濁液中で入手した。細胞を3回洗浄し、播種培地(L−グルタミン酸、10%FBS、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび12nMデキサメタゾンを添加したRPMI 1640)に懸濁した。肝細胞を生存能に関して評価し、コラーゲン被覆した24穴プレートに1.0×105細胞/穴で播種した。典型的には、細胞生存率は85〜93%であった。約24時間後、培地を維持培地(FBSを含まない播種培地)と交換した。
マウス細胞からのTNFR2スプライス変異体の分泌
可溶性TNFR2タンパク質の生産および細胞外培地中への分泌を誘導するSSOの能力を試験した。L929細胞を実施例1で述べたようにSSOで処理し、トランスフェクションの最大48時間後に細胞外培地試料を収集した。試料中の可溶性TNFR2の濃度をELISAによって測定した(図9)。RNAスプライシングのシフトを最もよく誘導したSSOは、同時に大部分のタンパク質を細胞外培地に分泌した。特に、SSO 3305、3312および3274は、可溶性TNFR2をバックグラウンドに比べて少なくとも3.5倍に上昇させた。従って、スプライス変異体mRNAの誘導は、可溶性TNFR2の生産および分泌と相関した。
SSOのインビボ注射はマウスにおいてmuTNFR2 Δ7 mRNAを生成した。
食塩水中のSSO 3305を、3mg/kg〜25mg/kgの用量で4日間毎日マウスに腹腔内注射した。5日目にマウスを犠死させ、肝臓からの全RNAをRT−PCRによって分析した。データは、細胞培養において認められたのと同様のスプライススイッチ効果を示す。25mg/kgの最大用量で、SSO 3305処理はΔ7 mRNAへのほとんど完全な変換を誘導した(図10、下のパネル)。
循環TNFR2 Δ7
マウスに、SSO 3274、3305または対照3083を25mg/kg/日で10日間腹腔内注射した。注射前および最後の注射後1、5および10日目にマウスから採血した。血清中の可溶性TNFR2 Δ7の濃度を測定した。SSO処理は、少なくとも10日間、バックグラウンドを上回る可溶性TNFR2 Δ7タンパク質レベルを誘導した(図11)。
マウス血清における抗TNF−α活性
SSO 3274処理マウスからの血清の抗TNF−α活性をL929細胞傷害性アッセイにおいて試験した。このアッセイでは、血清を、実施例1で述べたように培養したL929細胞を固定濃度のTNF−αの細胞傷害作用から保護するその能力に関して評価する。SSO 3274で処理したマウスからの血清は、0.1ng/mL TNF−αに暴露したL929細胞の生存能を高めたが、対照SSO(3083または3272)では生存能の上昇を認めなかった(図13)。それ故、SSO 3274血清は、TNF−αに結合して不活性化し、それによって細胞をTNF−αの細胞傷害作用から保護するのに十分なTNF−αアンタゴニストを含んでいた。この抗TNF−α活性は、SSO 3274の最後の注射後5日目および27日目の動物の血清中に存在した。
SSOが生成するTNFR2 Δ7と他の抗TNF−αアンタゴニストとの比較
L929細胞を上述したように播種した。(i)マウスTNFR2の236アミノ酸残基の細胞外ドメインを有する、Sigma(登録商標)からの組換え可溶性タンパク質(0.01〜3mg/mL)、(ii)SSO 3274またはSSO 3305処理マウスからの血清(1.25〜10%、未処理マウスからの血清中で希釈、TNFR2 Δ7の濃度をELISAによって決定した)、または(iii)最終容量100μl、最終マウス血清濃度10%のEnbrel(登録商標)(0.45〜150pg/ml)のいずれかと共に、無血清MEM 90μL、0.1ng/ml TNF−αおよび1μg/mlアクチノマイシンDを含む試料を調製した。試料を室温で30分間インキュベートした。その後、培養した細胞に試料を適用し、5%CO2加湿雰囲気中37℃で最大24時間インキュベートした。CellTiter 96(登録商標)AQueous One Solution Reagent(Promega)20μLを添加し、マイクロプレートリーダで490nmの吸光度を測定することによって細胞生存能を測定した。細胞生存能を未処理細胞に基準化し、TNFアンタゴニスト濃度の関数として表示した(図14)。
TNFR2 Δ7 mRNAおよびタンパク質の安定性
マウスを、25mg/kg/日の用量を腹腔内注射によって5日間毎日、SSO 3274または3272(対照)(n=5)で処理した。注射前および最後の注射後5、15、22、27および35日目に再びマウスから採血した。血清中の可溶性TNFR2 Δ7の濃度を測定した(図15A)。肝臓中のTNFR2のスプライスシフトも、犠死の時点で肝からの全RNAのRT−PCRによって決定した(図15B)。実施例7からのデータと合わせて、SSO処理後のTNFR2 mRNAレベルの時間経過を構築し、血清中のTNFR2 Δ7タンパク質の時間経過と比較した(図16)。データは、インビボでのTNFR2 Δ7 mRNAが血清中のTNFR2 Δ7タンパク質よりも約4倍速い速度で崩壊することを示す。35日目に、TNFR2 Δ7 mRNAは微量しか検出できなかったが、TNFR2 Δ7タンパク質はそのピーク濃度から20%だけ低下していた。
ヒトTNFR2 Δ7 cDNAの作製
完全長ヒトTNFR2 cDNAを含むプラスミドをOriGene(カタログ番号:TC119459、NM_001066.2)から購入した。逆プライマーTR001(配列番号116)および正プライマーTR002(配列番号117)を用いてプラスミドに関するPCRを実施することによりcDNAを得た。標準分子生物学手法を用いてPCR産物を単離し、精製した。PCR産物は、終結コドンのない1383bpのTNFR2オープン・リーディング・フレームを含む。
ヒトTNFR1 Δ7 cDNAの作製
完全長ヒトTNFR2 cDNAを含むプラスミドをOriGene(カタログ番号:TC127913、NM_001065.2)から購入する。TR006逆プライマー(配列番号204)およびTR007正プライマー(配列番号205)を用いてプラスミドに関するPCRを実施することによりcDNAを得る。標準分子生物学手法を用いて完全長ヒトTNFR1 cDNA PCR産物を単離し、精製する。
マウスTNFR2 Δ7 cDNAの作製
完全長マウスTNFR2 cDNAを作製するため、TR012逆プライマー(配列番号214)およびTR013正プライマー(配列番号215)を使用して、商業的に入手可能なFirstChoice(商標) PCR−Ready Mouse Liver cDNA(Ambion、カタログ番号:AM3300)に関するPCR反応を実施した。完全長マウスTNFR2 cDNA PCR産物を、標準分子生物学手法を用いて単離し、精製する。次にTR014正プライマー(配列番号216)とTR012逆プライマーを用いて生じた産物に関するPCRを実施することにより、適切なコザック配列を導入した。
マウスTNFR1 Δ7 cDNAの作製
完全長マウスTNFR1 cDNAを作製するため、TR020逆プライマー(配列番号230)およびTR021正プライマー(配列番号231)を使用して、商業的に入手可能なFirstChoice(商標) PCR−Ready Mouse Liver cDNA(Ambion、カタログ番号:AM3300)に関するPCR反応を実施する。完全長マウスTNFR1 cDNA PCR産物を、標準分子生物学手法を用いて単離し、精製する。
哺乳動物細胞におけるヒトTNFR2 Δ7の発現のためのベクターの構築
哺乳動物細胞におけるヒトTNFR2 Δ7タンパク質の発現のため、実施例12からのヒトTNFR2 Δ7 cDNA PCR産物を適切な哺乳動物発現ベクターに組み込んだ。終結コドンを伴うものと終結コドンを伴わないものの両方の、実施例12からのTNFR2 Δ7 cDNA PCR産物と、pcDNA(商標)3.1D/V5−His TOPO(登録商標)発現ベクター(Invitrogen)を、製造者の指示に従って平滑末端連結し、単離した。ヒトTNFR2 Δ7をコードするインサートを含むプラスミドを、供給者の指示に従ってOneShot(登録商標) Top10コンピテント細胞(Invitrogen)に形質転換した。形質転換混合物50mLを、100mg/mLアンピシリンを添加したLB培地で培養し、37℃で一晩インキュベートした。単一コロニーを使用して100mg/mLアンピシリンを含むLB培地の培養物5mLを接種し、37℃で一晩インキュベートした。次に培養物を使用して100mg/mLアンピシリンを含むLB培地200mLに接種し、37℃で一晩増殖させた。製造者の指示に従ってGenElute(商標)Plasmid Maxiprepキット(Sigma)を使用してプラスミドを単離した。精製効率は、試料当たり0.5〜1.5mgの範囲であった。
大腸菌におけるヒトTNFR2 Δ7の発現
細菌におけるヒトTNFR2 Δ7タンパク質の発現のため、実施例12からのヒトTNFR2 Δ7 cDNAを、pET Directional TOPO(登録商標)発現ベクター(Invitrogen)などの適切な発現ベクターに組み込む。ベクターの相同な組換え部位に組み込むため、正プライマー(TR002)(配列番号191)および逆プライマー(TR026)(配列番号195)を使用して実施例12からのPCRフラグメントに関するPCRを実施する。生じたPCRフラグメントを、製造者の指示に従ってpET101/D−TOPO(登録商標)ベクター(Invitrogen)と共にインキュベートし、ヒトTNFR2 Δ7細菌発現ベクターを作製する。生じたベクターを大腸菌BL21(DE3)株に形質転換する。ヒトTNFR2 Δ7を、その後、製造者の指示に従って細菌細胞から発現させる。
昆虫細胞におけるヒトTNFR2 Δ7の発現
昆虫細胞におけるヒトTNFR2 Δ7タンパク質の発現のため、実施例12からのヒトTNFR2 Δ7 cDNAをバキュロウィルスベクターに組み込む。正プライマー(TR027)(配列番号196)および逆プライマー(TR028)(配列番号197)を使用して実施例12からのヒトTNFR2 Δ7 cDNAに関するPCRを実施する。生じたPCR産物を制限酵素EcoRIおよびXhoIで消化する。消化したPCR産物を、pENTR(商標)1A、pENTR(商標)2B、pENTR(商標)3C、pENTR(商標)4、またはpENTR(商標)11ベクターのいずれか1つなどの、EcoRIおよびXhoIで消化したpENTR(商標)ベクター(Invitrogen)と連結してエントリベクターを作製する。次に標準分子生物学手法を用いて産物を単離し、増幅して、精製する。
ヒトTNFR2 Δ7の発現のためのアデノ関連ウィルスベクターの作製
ヒトTNFR2 Δ7遺伝子を哺乳動物細胞において発現させるため、ヒトTNFR2 Δ7をインビトロまたはインビボで哺乳動物細胞に送達するために、Grieger,J.ら、2006,Nature Protocols 1:1412に述べられている3プラスミドトランスフェクション系を使用して組換えアデノ関連ウィルス(rAAV)ベクターを作製する。ユニークなフランキングNotI制限部位を導入するため、正プライマー(TR029)(配列番号198)および逆プライマー(TR030)(配列番号199)を使用して実施例12の精製ヒトTNFR2 D7 PCR産物に関するPCRを実施する。得られたPCR産物をNotI制限酵素で消化し、標準分子生物学手法によって単離する。次に、NotI消化したフラグメントをNotI消化したpTR−UF2(University of North Carolina(UNC)Vector Core Facility)に連結して、逆方向末端反復配列に隣接する、CMVieプロモーターに作動可能に連結されたヒトTNFR2 D7オープン・リーディング・フレームを含むプラスミドを作製する。生じたプラスミドを、次に、Grieger,J.らに述べられているように、プラスミドpXX680およびpHelper(UNC Vector Core Facility)でHEK−293細胞にトランスフェクトし、強力な構成的CMVieプロモーターにより発現が駆動される、ヒトTNFR2 Δ7遺伝子を含むrAAV粒子を生産する。Grieger,J.らに述べられているようにウィルス粒子を採取し、精製して、哺乳動物細胞に形質導入するのに適したrAAVストックを提供する。
大腸菌におけるヒトTNFR1 Δ7の発現
細菌におけるヒトTNFR1 Δ7タンパク質の発現のため、cDNAをpET Directional TOPO(登録商標)発現ベクター(Invitrogen)などの適切な発現ベクターに組み込む。ベクターの相同な組換え部位に組み込むため、正プライマー(TR010)(配列番号208)および逆プライマー(TR006)(配列番号204)を使用してcDNAに関するPCRを実施する。得られたPCRフラグメントを、製造者の指示に従ってpET101/D−TOPO(登録商標)ベクター(Invitrogen)と共にインキュベートし、ヒトTNFR1 Δ7細菌発現ベクターを作製する。得られたベクターを大腸菌BL21(DE3)株に形質転換する。ヒトTNFR1 Δ7を、その後、製造者の指示に従って細菌細胞から発現させる。
哺乳動物細胞におけるヒトTNFR1 Δ7の発現
哺乳動物細胞におけるヒトTNFR1 Δ7タンパク質の発現のため、ヒトTNFR1 Δ7 cDNA PCR産物を適切な哺乳動物発現ベクターに組み込む。ヒトTNFR1 Δ7 cDNA PCR産物とpcDNA(商標)3.1D/V5−His TOPO(登録商標)発現ベクター(Invitrogen)を製造者の指示に従って平滑末端連結する。次に、標準分子生物学手法を用いて産物を単離し、増幅して、精製し、哺乳動物発現ベクターを産出する。その後、ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトし、そこで、強力な構成的CMVieプロモーターによりヒトTNFR1 Δ7タンパク質の発現が駆動される。
昆虫細胞におけるヒトTNFR1 Δ7の発現
昆虫細胞におけるヒトTNFR1 Δ7タンパク質の発現のため、実施例12からのcDNAをバキュロウィルスベクターに組み込む。正プライマー(TR031)(配列番号210)および逆プライマー(TR032)(配列番号211)を使用して実施例12からのcDNAに関してPCRを実施する。生じたPCR産物を制限酵素EcoRIおよびXhoIで消化する。消化したPCR産物を、pENTR(商標)1A、pENTR(商標)2B、pENTR(商標)3C、pENTR(商標)4、またはpENTR(商標)11ベクターのいずれか1つなどの、EcoRIおよびXhoIで消化したpENTR(商標)ベクター(Invitrogen)と連結してエントリベクターを産出する。次に標準分子生物学手法を用いて産物を単離し、増幅して、精製する。
ヒトTNFR1 Δ7の発現のためのアデノ関連ウィルスベクターの生成
ヒトTNFR1 Δ7遺伝子を哺乳動物細胞において発現させるため、ヒトTNFR1 Δ7をインビトロまたはインビボで哺乳動物細胞に送達するために、Grieger,J.ら、2006,Nature Protocols 1:1412に述べられている3プラスミドトランスフェクション系を使用して組換えアデノ関連ウィルス(rAAV)ベクターを作製する。ユニークなフランキングNotI制限部位を導入するため、正プライマー(TR033)(配列番号212)および逆プライマー(TR034)(配列番号213)を使用して精製ヒトTNFR1 D7 PCR産物に関するPCRを実施する。生じたPCR産物をNotI制限酵素で消化し、標準分子生物学手法によって単離する。次に、NotI消化したフラグメントをNotI消化したpTR−UF2(University of North Carolina(UNC)Vector Core Facility)に連結して、逆方向末端反復配列に隣接する、CMVieプロモーターに作動可能に連結されたヒトTNFR1 D7オープン・リーディング・フレームを含むプラスミドを作製する。生じたプラスミドを、次に、Grieger,J.らに述べられているように、プラスミドpXX680およびpHelper(UNC Vector Core Facility)でHEK−293細胞にトランスフェクトし、強力な構成的CMVieプロモーターにより発現が駆動される、ヒトTNFR1 Δ7遺伝子を含むrAAV粒子を生成する。Grieger,J.らに述べられているようにウィルス粒子を採取し、精製して、哺乳動物細胞に形質導入するのに適したrAAVストックを提供する。
哺乳動物細胞におけるマウスTNFR2 Δ7の発現のためのベクターの構築
哺乳動物細胞におけるマウスTNFR2 Δ7タンパク質の発現のため、実施例14からのマウスTNFR2 Δ7 cDNA PCR産物を適切な哺乳動物発現ベクターに組み込んだ。終結コドンを伴うものと終結コドンを伴わないものの両方の、実施例14からのTNFR2 Δ7 cDNA PCR産物とpcDNA(商標)3.1D/V5−His TOPO(登録商標)発現ベクター(Invitrogen)を、製造者の指示に従って平滑末端連結し、単離した。マウスTNFR2 Δ7をコードするインサートを含むプラスミドを、供給者の指示に従ってOneShot(登録商標) Top10コンピテント細胞(Invitrogen)に形質転換した。形質転換混合物50mLを、100mg/mLアンピシリンを添加したLB培地で培養し、37℃で一晩インキュベートした。単一コロニーを使用して100mg/mLアンピシリンを含むLB培地の培養物5mLを播種し、37℃で一晩インキュベートした。次に培養物を使用して100mg/mLアンピシリンを含むLB培地200mLに播種し、37℃で一晩増殖させた。製造者の指示に従ってGenElute(商標)Plasmid Maxiprepキット(Sigma)を使用してプラスミドを単離した。精製効率は、試料当たり0.5〜1.5mgの範囲であった。
大腸菌におけるマウスTNFR2 Δ7の発現
細菌におけるマウスTNFR2 Δ7タンパク質の発現のため、実施例14からのマウスTNFR2 Δ7 cDNAを、pET Directional TOPO(登録商標)発現ベクター(Invitrogen)などの適切な発現ベクターに組み込む。ベクターの相同な組換え部位に組み込むため、正プライマー(TR035)(配列番号222)および逆プライマー(TR036)(配列番号223)を使用して実施例14からのPCRフラグメントに関するPCRを実施する。得られたPCRフラグメントを、製造者の指示に従ってpET101/D−TOPO(登録商標)ベクター(Invitrogen)と共にインキュベートし、マウスTNFR2 Δ7細菌発現ベクターを作製する。得られたベクターを大腸菌BL21(DE3)株に形質転換する。マウスTNFR2 Δ7を、その後、製造者の指示に従って細菌細胞から発現させる。
昆虫細胞におけるマウスTNFR2 Δ7の発現
昆虫細胞におけるマウスTNFR2 Δ7タンパク質の発現のため、実施例14からのcDNAをバキュロウィルスベクターに組み込む。正プライマー(TR037)(配列番号224)および逆プライマー(TR038)(配列番号225)を使用して実施例14からのcDNAに関するPCRを実施する。得られたPCR産物を制限酵素EcoRIおよびXhoIで消化する。消化したPCR産物を、pENTR(商標)1A、pENTR(商標)2B、pENTR(商標)3C、pENTR(商標)4またはpENTR(商標)11ベクターのいずれか1つなどの、EcoRIおよびXhoIで消化したpENTR(商標)ベクター(Invitrogen)と連結してエントリベクターを産出する。次に標準分子生物学手法を用いて産物を単離し、増幅して、精製する。
マウスTNFR2 Δ7の発現のためのアデノ関連ウィルスベクターの作製
マウスTNFR2 Δ7遺伝子を哺乳動物細胞において発現させるため、マウスTNFR2 Δ7をインビトロまたはインビボで哺乳動物細胞に送達するために、Grieger,J.ら、2006,Nature Protocols 1:1412に述べられている3プラスミドトランスフェクション系を使用して組換えアデノ関連ウィルス(rAAV)ベクターを作製する。ユニークなフランキングNotI制限部位を導入するため、正プライマー(TR039)(配列番号226)および逆プライマー(TR040)(配列番号227)を使用して実施例14の精製マウスTNFR2 D7 PCR産物に関するPCRを実施する。得られたPCR産物をNotI制限酵素で消化し、標準分子生物学手法によって単離する。次に、NotI消化したフラグメントをNotI消化したpTR−UF2(University of North Carolina(UNC)Vector Core Facility)に連結して、逆方向末端反復配列に隣接する、CMVieプロモーターに作動可能に連結されたマウスTNFR2 D7オープン・リーディング・フレームを含むプラスミドを作製する。得られたプラスミドを、次に、Grieger,J.らに述べられているように、プラスミドpXX680およびpHelper(UNC Vector Core Facility)でHEK−293細胞にトランスフェクトし、強力な構成的CMVieプロモーターにより発現が駆動される、マウスTNFR2 Δ7遺伝子を含むrAAV粒子を生成する。Grieger,J.らに述べられているようにウィルス粒子を採集し、精製して、哺乳動物細胞に形質導入するのに適したrAAVストックを提供する。
大腸菌におけるマウスTNFR1 Δ7の発現
細菌におけるマウスTNFR1 Δ7タンパク質の発現のため、実施例15からのcDNAをpET Directional TOPO(登録商標)発現ベクター(Invitrogen)などの適切な発現ベクターに組み込む。ベクターの相同な組換え部位に組み込むため、正プライマー(TR024)(配列番号234)および逆プライマー(TR020)(配列番号235)を使用して実施例15からのcDNAに関するPCRを実施する。得られたPCRフラグメントを、製造者の指示に従ってpET101/D−TOPO(登録商標)ベクター(Invitrogen)と共にインキュベートし、マウスTNFR1 Δ7細菌発現ベクターを作製する。生じたベクターを大腸菌BL21(DE3)株に形質転換する。マウスTNFR1 Δ7を、その後、製造者の指示に従って細菌細胞から発現させる。
哺乳動物細胞におけるマウスTNFR1 Δ7の発現
哺乳動物細胞におけるマウスTNFR1 Δ7タンパク質の発現のため、実施例15からのマウスTNFR1 Δ7 cDNA PCR産物を適切な哺乳動物発現ベクターに組み込む。実施例15からのマウスTNFR2 Δ7 cDNA PCR産物とpcDNA(商標)3.1D/V5−His TOPO(登録商標)発現ベクター(Invitrogen)を製造者の指示に従って平滑末端連結する。次に、標準分子生物学手法を用いて産物を単離し、増幅して、精製し、哺乳動物発現ベクターを作製する。その後、ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトし、そこで、強力な構成的CMVieプロモーターによりマウスTNFR1 Δ7タンパク質の発現が駆動される。
昆虫細胞におけるマウスTNFR1 Δ7の発現
昆虫細胞におけるマウスTNFR1 Δ7タンパク質の発現のため、実施例15からのcDNAをバキュロウィルスベクターに組み込む。正プライマー(TR041)(配列番号236)および逆プライマー(TR042)(配列番号237)を使用して実施例15からのcDNAに関してPCRを実施する。生じたPCR産物を制限酵素EcoRIおよびXhoIで消化する。消化したPCR産物を、pENTR(商標)1A、pENTR(商標)2B、pENTR(商標)3C、pENTR(商標)4、またはpENTR(商標)11ベクターのいずれか1つなどの、EcoRIおよびXhoIで消化したpENTR(商標)ベクター(Invitrogen)と連結してエントリベクターを作製する。次に標準分子生物学手法を用いて産物を単離し、増幅して、精製する。
マウスTNFR1 Δ7の発現のためのアデノ関連ウィルスベクターの作製
マウスTNFR1 Δ7遺伝子を哺乳動物細胞において発現させるため、マウスTNFR1 Δ7をインビトロまたはインビボで哺乳動物細胞に送達するために、Grieger,J.ら、2006,Nature Protocols 1:1412に述べられている3プラスミドトランスフェクション系を使用して組換えアデノ関連ウィルス(rAAV)ベクターを作製する。ユニークなフランキングNotI制限部位を導入するため、正プライマー(TR043)(配列番号238)および逆プライマー(TR044)(配列番号239)を使用して実施例14の精製マウスTNFR1 D7 PCR産物に関するPCRを実施する。生じたPCR産物をNotI制限酵素で消化し、標準分子生物学手法によって単離する。次に、NotI消化したフラグメントをNotI消化したpTR−UF2(University of North Carolina(UNC)Vector Core Facility)に連結して、逆方向末端反復配列に隣接する、CMVieプロモーターに作動可能に連結されたマウスTNFR1 D7オープン・リーディング・フレームを含むプラスミドを作製する。得られたプラスミドを、次に、Grieger,J.らに述べられているように、プラスミドpXX680およびpHelper(UNC Vector Core Facility)でHEK−293細胞にトランスフェクトし、強力な構成的CMVieプロモーターにより発現が駆動される、マウスTNFR1 Δ7遺伝子を含むrAAV粒子を生産する。Grieger,J.らに述べられているようにウィルス粒子を採集し、精製して、哺乳動物細胞に形質導入するのに適したrAAVストックを提供する。
TNFR Δ7の発現のためのレンチウィルスベクターの生成
TNFR Δ7遺伝子を哺乳動物細胞において発現させるため、TNFR Δ7をインビトロまたはインビボで哺乳動物細胞に送達するために、複製能を欠くレンチウィルスベクターを作製する。実施例27、30、35および38からのPCR産物とpLenti6/V5−D−TOPO(登録商標)ベクター(Invitrogen)を製造者の指示に従って平滑末端連結する。得られたプラスミドを、標準分子生物学手法を用いて大腸菌に形質転換し、増幅して、精製する。このプラスミドを製造者の指示に従って293FT細胞(Invitrogen)にトランスフェクトし、強力な構成的CMVieプロモーターにより発現が駆動されるTNFR Δ7遺伝子を含むレンチウィルス粒子を生産する。このウィルス粒子を採集し、Tiscornia,G.ら、2006,Nature Protocols 1:241に述べられているように精製して、哺乳動物細胞に形質導入するのに適したレンチウィルスストックを提供する。
哺乳動物細胞におけるTNFR2 Δ7の発現
実施例26および実施例34で作製されたプラスミドを使用して、哺乳動物HeLa細胞において活性タンパク質を発現し、生じたタンパク質を抗TNF−α活性に関して試験した。HeLa細胞を、24穴プレートにおいてL−グルタミン、ゲンタマイシン、カナマイシン、5%FBSおよび5%HSを含むSMEM培地中に1.0×105細胞/穴で播種した。細胞を5%CO2加湿雰囲気中37℃で一晩増殖させた。プラスミドDNA約250ngをOPTI−MEM(商標)50mLに添加し、次にLipofectamine(商標)2000混合物(Lipofectamine(商標)2000対OPTI−MEM(商標)の割合が1:25)50mLを添加して、20分間インキュベートした。その後無血清培地400mLを添加し、24穴プレート中の細胞に適用した。5%CO2加湿雰囲気中37℃で〜48時間のインキュベーション後、培地を収集し、細胞をTRI試薬(商標)800mL中に採取した。全RNAを製造者の指示に従って細胞から単離し、正プライマーTR047(配列番号200)および逆プライマーTR048(配列番号201)を使用したRT−PCRによりヒトTNFR2 Δ7に関して分析するか、または正プライマーTR045(配列番号228)および逆プライマーTR046(配列番号229)を使用したRT−PCRによりマウスTNFR2 Δ7に関して分析した。培地中の可溶性TNFR2の濃度をELISAによって測定した。
哺乳動物細胞におけるTNFR2 Δ7の発現および精製
実施例15および実施例で生成したプラスミドを、哺乳動物HeLa細胞からTNFR2 Δ7を発現させ、精製するために使用した。HeLa細胞を5×105細胞/穴で6穴プレートで培養し、加湿雰囲気中37℃、5%CO2で一晩増殖させた。次に各々のウェルを、1144−4(Hisタグを有するマウスTNFR2 Δ7)、1145−1(マウスTNFR2 Δ7、Hisタグなし)、1230−1(ヒトTNFR2 Δ7、Hisタグなし)または1319−1(Hisタグを有するヒトTNFR2 Δ7)プラスミドのいずれかを使用してプラスミドDNA 1.5mgでトランスフェクトした。トランスフェクションの最大48時間後に培地を収集し、Amicon MWCO 30,000フィルタを用いて約40倍に濃縮した。細胞を、プロテアーゼ阻害剤(Sigma−aldrich)を含むRIPA溶解緩衝液(Invitrogen)120mLに氷上で5分間溶解した。タンパク質濃度をBradfordアッセイによって決定した。タンパク質溶解産物のアリコートおよび細胞外培地からタンパク質を単離し、実施例1で述べたようにウェスタンブロット法によってTNFR2に関して分析した(図18)。
Claims (45)
- 8〜16核酸塩基長からなる連続する核酸塩基配列を含む、8〜16核酸塩基長のオリゴマーであって、前記連続する核酸塩基配列は、配列番号1または配列番号2、配列番号3、配列番号4内に存在する連続するヌクレオチドの対応する領域に相補的であるとともに、前記連続する核酸塩基配列は5つ以上の連続するDNA(2’−デオキシリボヌクレオシド)モノマー単位を含まず、かつ、前記連続する核酸塩基配列は、β−D−オキシLNA、チオ−LNA、アミノ−LNAおよびエナ−LNAからなる群より選択される少なくとも1つのヌクレオチド類似体を含む、オリゴマー。
- 前記オリゴマーは、相補的mRNA分子を有する複合体との二本鎖で形成されたとき、基本的にRNアーゼHを動員することができない請求項1に記載のオリゴマー。
- 前記連続する核酸塩基配列は配列番号1または配列番号3の対応する領域に相補的な核酸塩基配列からなる、請求項1または2に記載のオリゴマー。
- 前記オリゴマーは前記連続する核酸塩基配列からなり、前記連続する核酸塩基配列は8、9、10、11、12、13、14または15核酸塩基長である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のオリゴマー。
- 前記連続する核酸塩基配列の核酸塩基間の連結基は、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびボラノホスフェートからなる群より選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載のオリゴマー。
- 前記連続する核酸塩基配列は、少なくとも1つのさらなるヌクレオチド類似体(X)を含むか、または少なくとも1つのさらなるヌクレオチド類似体(X)からなる、請求項1〜5のいずれか一項に記載のオリゴマー。
- 前記ヌクレオチド類似体(X)は、2’−O−アルキル−RNA単位、2’−OMe−RNA単位、2’MOE RNA単位、2’−アミノ−DNA単位、2’−フルオロ−DNA単位、LNA単位、PNA単位、HNA単位、INA単位からなる群より独立して選択される、請求項6に記載のオリゴマー。
- 前記連続する核酸塩基配列は、2’OMeリボヌクレオチド類似体または2’−MOEリボヌクレオチド類似体を含まない請求項1〜7のいずれか一項に記載のオリゴマー。
- 前記連続する核酸塩基配列は、ヌクレオチド類似体(X)およびヌクレオチド(x)の両方を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のオリゴマー。
- 前記連続する核酸塩基配列は、少なくとも1つのヌクレオチドと少なくとも1つのヌクレオチド類似体とを含むサブ配列を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載のオリゴマー。
- 前記サブ配列は、Xx、xX、Xxx、xXx、xxX、XXx、XxX、xXX、XXXx、XXxX、XxXX、xXXX、xxxX、xxXx、xXxx、Xxxx、XXXXx、XXXxX、XXxXX、XxXXX、xXXXX、xxxxX、xxxXx、xxXxx、xXxxx、Xxxxxからなる群より選択され、前記交互配列が場合により反復される、請求項10に記載のオリゴマー。
- 反復される配列は、前記連続する核酸塩基配列の長さ全体にわたって反復され、場合により5’および/または3’反復配列が切断される、請求項11に記載のオリゴマー。
- 前記連続する核酸塩基配列は、前記少なくとも1つのLNA類似体単位およびLNA以外の少なくとも1つのさらなるヌクレオチド類似体単位を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載のオリゴマー。
- 前記連続する核酸塩基配列は、少なくとも1つの配列X1X2X1またはX2X1X2[式中、X1はLNAであり、X2はLNA以外のヌクレオチド類似体である]からなる、請求項13に記載のオリゴマー。
- 前記連続する核酸塩基配列は、選択的X1およびX2単位からなる、請求項14に記載のオリゴマー。
- 前記さらなるヌクレオチド類似体単位は、2’−OMe−RNA単位、2’−フルオロ−DNA単位、2’−MOE RNA単位、およびLNA単位からなる群より独立して選択される、請求項7〜15のいずれか一項に記載のオリゴマー。
- 前記ヌクレオチド類似体単位(X)はLNA単位である、請求項7〜16のいずれか一項に記載のオリゴマー。
- 前記LNA単位は、α−L−オキシLNA、β−D−オキシLNA、アミノ−LNA、チオ−LNAおよびエナ−LNAからなる群より選択される、請求項7〜17のいずれか一項に記載のオリゴマー。
- 前記連続する核酸塩基配列は、DNAおよびα−L LNA単位から独立して選択される5つ以上の連続する核酸塩基からなる連続するサブ配列を含まない、請求項7〜18のいずれか一項に記載のオリゴマー。
- 前記連続する核酸塩基配列は、DNAおよびα−L−オキシLNA単位から独立して選択される5つ以上の連続する核酸塩基からなる連続するサブ配列を含まない、請求項7〜18のいずれか一項に記載のオリゴマー。
- すべてのLNA単位はβ−D立体配置である、請求項7〜20のいずれか一項に記載のオリゴマー。
- 前記連続する核酸塩基配列は、配列番号1の51〜164、配列番号2の51〜79、配列番号3の51〜127、および配列番号4の51〜85からなる群より選択される配列内に存在する連続するヌクレオチド、または配列番号247〜配列番号250内の同等の位置に存在する連続するヌクレオチドの対応する領域に相補的である、請求項1〜21のいずれか一項に記載のオリゴマー。
- 前記連続する核酸塩基配列は、配列番号1の1〜50、配列番号1の165〜215、配列番号2の1〜50、配列番号2の80〜130、配列番号3の1〜50、配列番号3の128〜178、配列番号4の1〜50、および配列番号4の86〜136からなる群より選択される配列内に存在する連続するヌクレオチド、または配列番号247〜配列番号250内の同等の位置に存在する連続するヌクレオチドの対応する領域に相補的である、請求項1〜21のいずれか一項に記載のオリゴマー。
- 前記連続する核酸塩基配列は、5’エキソン/イントロン3’または3’イントロン/エキソン5’境界、または配列番号247〜配列番号250内の同等の位置に相補的である核酸塩基配列を含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載のオリゴマー。
- 前記5’エキソン/イントロン3’または3’イントロン/エキソン5’境界は、配列番号1の50〜51、配列番号1の164〜165、配列番号2の50〜51、配列番号2の79〜80、配列番号3の51〜52、配列番号3の129〜139、配列番号4の50〜51、配列番号4の81〜82からなる群より選択される核酸塩基、または配列番号247〜配列番号250内の同等の位置の核酸塩基である、請求項24に記載のオリゴマー。
- 前記連続する核酸塩基配列は、配列番号74〜配列番号105からなる群より選択される配列内に存在する核酸塩基配列と同一であるか、または前記核酸塩基配列内に存在する、請求項1〜25のいずれか一項に記載のオリゴマー。
- 前記連続する核酸塩基配列は、配列番号74、配列番号75、配列番号77、配列番号78、配列番号80、配列番号82および配列番号84からなる群より選択される核酸塩基配列と同一であるか、または前記核酸塩基配列内に存在する、請求項26に記載のオリゴマー。
- 前記連続する核酸塩基配列は、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88および配列番号89からなる群より選択される核酸塩基配列と同一であるかまたは前記核酸塩基配列内に存在する、請求項26に記載のオリゴマー。
- 前記連続する核酸塩基配列は、ヌクレオチド47〜49、54〜56および122〜124から選択される配列番号3の領域に相補的な核酸塩基配列を含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載のオリゴマー。
- 前記連続する核酸塩基配列は、配列番号131〜配列番号145、配列番号147〜配列番号161、および配列番号163〜配列番号177からなる群より選択される核酸塩基配列若しくは核酸塩基モチーフ配列と同一であるか、または前記核酸塩基配列若しくは前記核酸塩基モチーフ配列内に存在する、請求項1〜29のいずれか一項に記載のオリゴマー。
- 配列番号245〜配列番号246、配列番号251〜配列番号263、配列番号264〜配列番号279、および配列番号280〜配列番号295からなる群より選択される、請求項32に記載のオリゴマー。
- 前記連続する核酸塩基配列は、配列番号130、配列番号146および配列番号162からなる群より選択される核酸塩基配列若しくは核酸塩基モチーフ配列と同一であるか、または前記核酸塩基配列若しくは前記核酸塩基モチーフ配列内に存在する、請求項1〜29のいずれか一項に記載のオリゴマー。
- 前記オリゴマーは、配列番号244、配列番号264および配列番号280からなる群より選択される、請求項1に記載のオリゴマー。
- 請求項1〜33のいずれか一項に記載のオリゴマーおよび前記オリゴマーに共有結合した少なくとも1つの非ヌクレオチド部分を含むコンジュゲート。
- 請求項1〜33のいずれか一項に記載のオリゴマーまたは請求項34に記載のコンジュゲート、および医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物。
- TNFRSF1A TNF−α受容体またはTNFRSF1B TNF−α受容体を発現する哺乳動物細胞において、TNFRSF1AまたはTNFRSF1Aから選択されるTNF−α受容体プレmRNA mRNAのスプライシングを変化させる方法であって、請求項1〜33のいずれか一項に記載のオリゴマーまたは請求項34に記載のコンジュゲートまたは請求項35に記載の医薬組成物を細胞に投与する工程を含む方法。
- 前記TNF−α受容体を発現する哺乳動物細胞においてTNFRSF1A TNF−α受容体またはTNFRSF1B TNF−α受容体の可溶性形態を作製する方法であって、請求項1〜33のいずれか一項に記載のオリゴマーまたは請求項34に記載のコンジュゲートまたは請求項35に記載の医薬組成物を細胞に投与する工程を含む方法。
- 前記哺乳動物細胞から可溶性形態のTNF−α受容体TNFRSF1AまたはTNFRSF1Bを単離または精製する工程をさらに含む、請求項37に記載の方法。
- 前記TNF−α受容体を発現する哺乳動物細胞においてTNFRSF1A TNF−α受容体またはTNFRSF1B TNF−α受容体の可溶性形態の発現を高める方法であって、請求項1〜33のいずれか一項に記載のオリゴマーまたは請求項34に記載のコンジュゲートまたは請求項35に記載の医薬組成物を細胞に投与する工程を含む、前記方法。
- インビトロまたはインビボで実施される、請求項36〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 炎症性疾患または状態の治療用薬剤を製造するための、請求項1〜33のいずれか一項に記載のオリゴマーまたは請求項34に記載のコンジュゲートの使用方法。
- 炎症性疾患または状態の治療用の、請求項1〜33のいずれか一項に記載のオリゴマーまたは請求項34に記載のコンジュゲート。
- 炎症性疾患または状態に罹患している患者または罹患している可能性が高い患者に対し、請求項35に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、炎症性疾患または状態を治療または予防する方法。
- 炎症性疾患または状態の治療のための、請求項44〜49のいずれか一項に記載の、または請求項57に従って製造された、単離または精製された可溶性形態のTNF−α受容体。
- 炎症性疾患または状態に罹患しているまたは罹患している可能性が高い患者に、請求項56に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、炎症性疾患または状態の治療または予防の方法。
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