CN101889086B - Tnf超家族受体的剪接转换寡聚物，以及它们治疗疾病的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及剪接转换寡核苷酸或剪接转换寡聚物(SSOs)。依照本发明的优选的SSOs靶向TNFR1(TNFRSFlA)或TNFR2(TNFRSFlA)前信使RNA的外显子7，典型地会导致产生分别包含部分或全部外显子7缺失的TNFR变体。发现靶向外显子7的SSOs会产生治疗炎性疾病的具有治疗用途的可溶形式的TNFR。SSO的特征在于它们基本上不能或不能补充RNaseH。

Description

TNF超家族受体的剪接转换寡聚物,以及它们治疗疾病的用途
本申请要求在此全文都全部引入作为参考的US 60/862,350，PCT/US2006/043651和US 11/595,485的优先权。
技术领域
本发明涉及体内或体外制备TNFα受体(TNFR)的剪接变体的组合物和方法，以及所得到的TNFR蛋白质变体。利用剪接转换(splice switching)寡核苷酸或剪接转换寡聚物(SSOs)控制前信使RNA分子的剪接和调节蛋白质的表达可以制备这种变体。依照本发明的优选的SSOs靶向TNFR1(TNFRSF1A)或TNFR2(TNFRSF1A)前信使RNA(pre-mRNA)的外显子7或8，典型地会导致产生分别包含部分或全部外显子7或8缺失的TNFR变体。发现靶向外显子7的SSOs会产生治疗炎性疾病的具有治疗用途的可溶形式的TNFR。SSO的特征在于它们基本上不能或不能补充RNaseH。
发明背景
在此引入作为参考的WO2007/05889记载了与前信使RNA剪接、TNF-α在炎症和炎性病症中的作用以及经由TNF1和TNF2介导的TNF-α活性的媒介作用有关的背景技术。
TNF-α是以膜结合的同型三聚体形式存在的炎性细胞因子原，由蛋白酶TNF-α转换酶(TACE)释放到循环中。被引入循环中的TNF-α是损伤和感染引起的炎性反应的介质。炎性疾病，例如类风湿性关节炎、Crohn氏病、溃疡性结肠炎、牛皮癣和牛皮癣关节炎的进展都涉及TNF-α的作用(Palladino，M.A.，et al.，2003，Nat.Rev.Drug Discov.2：736-46)。短时间(acute)接触高水平的TNF-α将导致脓毒症发生，这一现象在重感染期间已经发生；脓毒症的症状包括休克、缺氧、多器官衰竭和死亡。长期(chronic)低剂量的TNF-α可以导致一种特征在于体重减轻、脱水和脂肪减少的与恶性肿瘤有关的疾病--恶病质。
TNF-α的活性主要由两个不同基因TNFR1和TNFR2编码的两个受体介导。TNFR1是分子量为大约55千道尔顿(kDa)的膜结合蛋白，而TNFR2是分子量为75kDa的膜结合蛋白。在金属蛋白酶的作用下，两个受体的可溶性细胞外域在一定程度上可以从细胞膜上脱落下来。此外，TNFR2的前信使RNA进行选择性剪接，可以产生有活性的全长膜结合受体(mTNFR2)或缺乏外显子7和8的包含跨膜区的编码序列的被分泌的假(decoy)受体(sTNFR2)。sTNFR2结合TNF-α，但不引发生理反应，因此会降低TNF-α的活性。虽然还没有鉴定内源性的被分泌的TNFR1剪接变体，但这两个受体相似的基因结构明确表明存在产生这种TNFR1同种型(isotype)的可能性。
TNF超家族成员活性过强所产生的效应，导致控制TNFR受体的可选择性剪接是有用的，这样分泌形式的量就增加了，完整膜形式的量就减少了。本发明提供了实现这一目标的剪接转换寡核苷酸或剪接转换寡聚物(SSOs)。SSOs类似于反义寡核苷酸(ASONs)。然而，与ASON相反，SSOs能与靶RNA杂交，但不会导致靶RNA被RNase H降解。
SSOs已经被用于修饰某些地中海贫血中发现的异常剪接(KoIe的美国专利No.5,976,879；Lacerra，G.，et al.，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.97：9591)。对IL-5受体α-链(IL-5Rα)的研究表明靶向跨膜外显子的SSOs会增加分泌形式的合成，同时会抑制完整膜形式的合成(Bennett的美国专利No.6,210,892；Karras，J.G.，et al.，2000，MoL Pharm，58：380)。WO00/58512也公开了将IL-5R剪接修改为可溶形式的实施例(实施例25和30)。
SSOs已经被用于产生Tone中检测到的主要的CD40剪接变体，Tone中跨膜区上游的外显子6的缺失导致蛋白质的阅读框发生了改变。在SSO产生预期的mRNA剪接变体时，变体mRNA的翻译产品也变得好象不稳定，因为没有检测到分泌的受体(Siwkowski，A.M.，et al.，2004，Nucleic Acids Res.32；2695)。Tone et al.，PNAS，2001，98(4)：1751-1756预计缺乏外显子6的小鼠剪接变体不是稳定的分泌形式的CD40(参见1756页，右栏)。
WO02/088393公开了具有2′MOE翼和脱氧缺口的靶向小鼠TNFR2的gapmer寡核苷酸，这些寡核苷酸被用来补充(recruit)RNAseH以降解TNFR2mRNA(mRNA下调)。本发明的SSO寡核苷酸不是设计用来用来补充RNaseH的，而是用来破坏TNFR前信使RNA的加工的，因此会导致产生稳定分泌形式的结合配体的TNFR剪接变体。
US2005/202531教导了反义寡核苷酸可以用来改变CD40的可选择的剪接模式的内容，但它没有教导或提供任何有关应被SSOs靶向的CD40剪接元件或区域的启示，也没有教导或提供任何有关应该使用哪个序列的启示。
发明概述
本发明使用剪接转换寡核苷酸或剪接转换寡聚物(SSOs)控制来自TNFR超家族受体的可选择性剪接，这样，被分泌的稳定可溶的配体结合形式的数量就增加了，完整膜形式的数量就减少了。
本发明提供了长度在8和16个核苷酸碱基之间的寡聚物，包含由长度在8和16个碱基之间的核苷酸组成的毗连(contiguous)核碱基序列，其中所述的毗连核碱基序列与SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3或SEQ ID NO4中存在的毗连核苷酸的对应区域互补，而且所述的毗连核碱基序列不包含5个或5个以上毗连的DNA(2’-脱氧核糖核苷)单体单位，其包含选自由β-D-氧LNA，硫代-LNA，氨基-LNA和ena-LNA组成的组的至少一个核苷酸类似物。
任选地，在上述实施方案中，毗连核碱基序列包含或由至少一个更进一步另外的(further)核苷酸类似物(X)组成。
在一个实施方案中，更进一步的核苷酸类似物单位独立地选自由2′-OMe-RNA单位，2′-氟-DNA单位，2′-MOE RNA单位和LNA组成的组。
在一个实施方案中，寡聚物或毗连核碱基序列由长度在8和15个碱基之间的核碱基序列组成，例如，由9、10、11、12、13或14个核碱基组成。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列与选自由SEQ ID NO 131-SEQ IDNo 145、SEQ ID NO 147-SEQ ID NO 161和SEQ ID NO 163-177组成的组的核碱基序列或核碱基基序相同，或者存在于其中。
在一个实施方案中，寡聚物选自由SEQ ID NO 245-SEQ ID NO 246、SEQ ID NO 251-263、SEQ ID NO 264-SEQ ID NO 279和SEQ ID NO280-SEQ ID NO 295组成的组。
在一个实施方案中，所述的毗连核碱基序列与选自由SEQ ID NO 130、SEQ ID NO 146和SEQ ID NO 162组成的组的核碱基序列或核碱基基序相同，或者存在于其中。
在一个实施方案中，寡聚物选自由SEQ ID NO 244、SEQ ID NO 264和SEQ ID NO 280组成的组。
本发明涉及剪接转换寡核苷酸或剪接转换寡聚物(SSOs)。依照本发明的优选的SSOs靶向TNFR1(TNFRSF1A)或TNFR2(TNFRSF1A)前信使RNA的外显子7，典型地会导致产生分别包含部分或全部外显子7缺失的TNFR变体。发现靶向外显子7的SSOs会产生治疗炎性疾病的具有治疗用途的可溶形式的TNFR。SSO的特征在于它们基本上不能补充(recruiting)RNaseH。
本发明提供了长度在8和50个核苷酸碱基之间的寡聚物，例如长度在8和16个核苷酸碱基之间的寡聚物，包含(或由其组成)由长度在8和50个碱基之间的核苷酸组成的毗连核碱基序列，其中所述的毗连核碱基序列与SEQID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4中存在的毗连核苷酸的对应区域互补，优选完全互补，而且所述的毗连核碱基序列不包含5个或5个以上毗连的DNA(2’-脱氧核糖核苷)单体单位。
SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4与PCT/US2006/043651中的SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3或SEQID NO 4相同。
SEQ ID NO 247与SEQ ID NO 1反向互补。SEQ ID NO 248与SEQ ID NO2反向互补。SEQ IDNO 249与SEQ ID NO 3反向互补。SEQ ID NO 250与SEQID NO 4反向互补。
因此，本发明优选包含或由与SEQ ID NO 247、SEQ ID NO 248、SEQID NO 249或SEQ ID NO 250的对应区域(即一部分)同源(优选100％同源)的毗连核碱基序列组成的寡聚物。
本发明提供了长度在8和50个核苷酸碱基之间的寡聚物，包含(或由其组成)由长度在8和50个碱基之间的核苷酸组成的毗连核碱基序列，其中所述的毗连核碱基序列存在于SEQ ID NO 247，SEQ ID NO 248，SEQ ID NO 249或SEQ ID NO 250中存在的毗连核苷酸的(对应)区域，而且所述的毗连核碱基序列不包含5个或5个以上毗连的DNA(2’-脱氧核糖核苷)单体单位。
本发明提供了长度在8和50个核苷酸碱基(nucleobase)之间的寡聚物，包含(或由其组成)由长度在8和50个核碱基之间的核苷酸组成的毗连核碱基序列，其中所述的毗连核碱基(nucleobase)序列与SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4中存在的毗连核苷酸的对应区域互补，优选完全互补，当在具有互补mRNA分子的复合物的双链体(duplex)中形成时，其中所述的寡聚物基本上不能或不能补充RNAseH。
本发明提供了长度在8和50个核碱基之间的寡聚物，包含(或由其组成)由长度在8和50个碱基之间的核苷酸组成的毗连核碱基序列，其中所述的毗连核碱基序列存在于SEQ ID NO 247，SEQ ID NO 248，SEQ ID NO 249或SEQ ID NO 250中存在的毗连核苷酸的(对应)区域，其中当在具有互补mRNA分子的复合物的双链体中形成时，所述的寡聚物基本上不能或不能补充RNAseH。
更进一步地，本发明提供了包含本发明的寡聚物和共价附着于所述寡聚物的至少一个非核苷酸部分的偶联物。
更进一步地，本发明提供了包含本发明的寡聚物或偶联物，以及药学上可接受的载体的药物组合物。
更进一步地，本发明提供了改变TNFα受体前信使RNA mRNA剪接的方法，其中前信使RNA mRNA选自表达TNFRSF1A TNFα受体或TNFRSF1BTNFα受体的哺乳动物细胞中的TNFRSF1A或TNFRSF1A，所述方法包括给细胞施用本发明的寡聚物、偶联物或药物组合物。
本发明也涉及了在表达所述TNFα受体的哺乳动物细胞中制备TNFRSF1A TNFα受体或TNFRSF1B TNFα受体的可溶形式的方法，所述方法包括给细胞施用本发明的寡聚物、偶联物或药物组合物。
上述方法可以更进一步地包括纯化TNFRSF1A TNFα受体或TNFRSF1BTNFα受体的可溶形式的步骤。
本发明也提供了在表达所述TNFα受体的哺乳动物细胞中增加TNFRSF1A TNFα受体或TNFRSF1B TNFα受体的可溶形式表达的方法，所述方法包括给细胞施用本发明的寡聚物、偶联物或药物组合物。
上述方法可以在体内或体外实施。
本发明提供了用本发明的寡聚物制备用于治疗炎性疾病或状态(condition)的药物制剂的用途。
本发明提供了用于治疗炎性疾病或状态的偶联物。
本发明提供了治疗或预防炎性疾病或状态的方法，所述方法包括给患有或很可能患有所述炎性疾病的病人施用本发明的药物组合物的步骤。
本发明提供了在外显子7编码的跨膜结合域包含缺失的TNFα受体的分离或纯化的可溶形式，其中所述TNFα受体选自TNFα受体TNFRSF1A或TNFRSF1B。
本发明提供了缺乏外显子7编码的跨膜结合域的TNFα受体的分离或纯化的可溶形式，其中所述TNFα受体选自TNFα受体TNFRSF1A或TNFRSF1B。
本发明更进一步地提供了编码TNFα受体的可溶形式的核酸。
本发明更进一步地提供了包含本发明的核酸的载体，例如表达载体。
本发明更进一步地提供了包含本发明的核酸或载体的宿主细胞。
本发明更进一步地提供了制备可溶形式的TNFα受体的方法，所述方法包括在允许本发明的核酸表达的条件下培养本发明宿主细胞的步骤，以及随后从所述宿主细胞分离所述的可溶形式的TNFα受体的步骤。
本发明更进一步地提供了包含本发明的分离或纯化的可溶形式的TNFα受体或依照本发明的方法制备的TNFα受体，以及药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明更进一步地提供了利用本发明的分离或纯化的可溶形式的TNFα受体或依照本发明的方法制备的TNFα受体制备用于治疗炎性疾病或状态的药物制剂的用途。
本发明更进一步地提供了本发明的分离或纯化的可溶形式的TNFα受体或依照本发明的方法制备的TNFα受体用于治疗炎性疾病或状态的用途。
相关案件PCT/US2006/043651、PCT/US2007/10557、US 11/595,485和US 11/799,117在此都全部引入作为参考。
附图简述
下列附图与PCT/US2007/10557中描述的那些附图相同。图20对本申请来说是新的。
图1概略地描述了人TNFR2的结构。相应的外显子和内含子分别用盒(box)和线代表。信号序列和跨膜区域用阴影表示。形成信号序列和跨膜区边界的残基，以及最后的残基在图下面标出。外显子边界在图上面标出；如果外显子的3’端和下面外显子的5’端具有相同的残基编号，那么剪接接点将位于编码该残基的密码子内。
图2A用图表解释了来自SSO处理的原代(primary)人肝细胞的可溶性TNFR2的数量。所标示的SSO以50nM的浓度被转染到原代人肝细胞中。48小时之后，利用从R&D系统(Minneapolis，MN)获得的
Figure G2007800535955D00061
人sTNFRII ELISA试剂盒(Quantikine(R)Human sTNF RII ELISA kit)，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)分析细胞外培养基中的可溶性TNFR2。误差线表示3个独立实验的标准差。图2B利用人TNFR2特异的引物，通过RT-PCR分析总RNA中的TNFR2的剪接转换。靶向外显子七的SSOs导致从全长TNFR2mRNA(FL)转变成TNFR2Δ7mRNA(Δ7)。SSO 3083是没有TNFR2剪接转换能力的对照SSO。
图3显示了用靶向小鼠TNFR2外显子7的SSO 10-mers处理的L929细胞的剪接产物。用标示的SSO浓度(50或100nM)转染L929细胞，并在24小时后用RT-PCR评估TNFR2的剪接转换。PCR引物用来扩增外显子5到外显子9，这样486bp的条带就可以代表″全长″(FL)TNFR2。408bp的条带代表缺乏外显子7(Δ7)的转录产物。
图4A和4B显示了用靶向小鼠TNFR2外显子7的SSO 10-mers处理的小鼠的剪接产物。先将标示的SSOs再次悬浮在盐水中，然后以25mg/kg/天的剂量通过腹腔(i.p.)注射到小鼠体内，共注射5天。在SSO注射之前，以及最后的SSO注射之后的10天对小鼠进行预放血处理，并处死小鼠。在处死小鼠时，通过RT-PCR分析来自肝脏的总RNA中的TNFR2剪接转换。FL-全长TNFR2；Δ7-TNFR2Δ7(图4A)。利用从R&D系统(Minneapolis，MN)获得的
Figure G2007800535955D00071
小鼠sTNF RII ELISA试剂盒(Quantikine(R)Mouse sTNF RIIELISA kit)，通过ELISA确定在SSO注射之前(前)和之后(后)所获得的血清中的TNFR2Δ7的浓度(图4B)。误差线表示来自相同样品的3个独立读数的标准差。
图5描述了不同长度的SSOs的剪接转换能力。与图2相同，用标示的SSO转染原代人肝细胞并通过RT-PCR(上部网格)和ELISA(下部网格)分析TNFR2的表达。误差线表示来自2个独立实验的标准差。
图6A和6B图解了SSO处理小鼠肝脏中的TNFR2Δ7mRNA的诱导情况。图6A：对来自SSO 3274处理小鼠肝脏的总RNA进行RT-PCR分析，在1.5％的琼脂糖凝胶上使产物显影。外显子6-外显子8接合点的序列显示在图6B中。
图7A和7B图解了SSO处理的原代人肝细胞中的TNFR2Δ7mRNA的诱导情况。图7A：对来自SSO 3379处理细胞的总RNA进行RT-PCR分析，在1.5％的琼脂糖凝胶上使产物显影。外显子6-外显子8接合点的序列显示图7B中。
图8A和8B图解说明了SSO 3378、3379和3384所产生的TNFR2前信使RNA剪接转换的剂量依赖性。用所示的1-150nM的SSO转染原代人肝细胞。48小时后，收获细胞以获取总RNA，并收集细胞外培养基。图8A：利用人TNFR2特异的引物，通过RT-PCR分析总RNA中的TNFR2的剪接转换。对每种SSO，都以剪接转换数量作为SSO浓度的函数进行绘图。图8B：通过ELISA确定细胞外培养基中的可溶性TNFR2的浓度，并将其作为SSO的函数绘图。误差线表示至少2个独立实验的标准差。
图9图解说明了来自L929细胞的分泌的TNFR2剪接变体的检测情况。用标示的SSOs转染细胞。72小时以后，除去细胞外培养基并通过ELISA进行分析。数据表示为pg可溶性TNFR2/mL。
图10显示了腹腔内(i.p.)注射SSO 3274(上部)和3305(底部)的小鼠体内的剪接产物。以25mg/kg/天的剂量腹膜内注射SSO 32744天(4/1和4/10)或10天(10/1)。在最后一次注射后1天(4/1和10/1)或10天(4/10)处死小鼠，并通过RT-PCR分析来自肝脏的总RNA中的TNFR2剪接转换。每天按照标示剂量注射SSO 3305，共注射4天。第二天处死小鼠，并采用与3274处理动物相同的方法分析肝脏。
图11A图解说明了SSO处理10天后的小鼠血清中的可溶性TNFR2的数量。以25mg/kg/天的剂量给小鼠腹膜内注射标示的SSO或生理盐水(每组n＝5)，共10天。在注射开始前4天和最后一次注射后所标示的天数收集血清。在第10天，通过图22描述的ELISA方法分析血清，处死小鼠并按照图30的描述通过RT-PCR分析肝脏的TNFR2的剪接转换(图11B)。
图12A图解了SSO处理27天后的小鼠血清中的可溶性TNFR2的数量。采用图11的描述处理小鼠，除了在最后一次注射后的第27天收集血清样品外。SSOs 3083和3272是没有TNFR2剪接转换能力的对照。在第27天，处死小鼠并按照图11的描述通过RT-PCR分析肝脏的TNFR2的剪接转换(图11B)。
图13A和13B描述了以细胞为基础的测试中，来自SSO处理小鼠的血清的抗TNF-α活性，其中在SSO处理后第5天(图16A)和第27天(图16B)收集血清样品。用0.1ng/mL的TNF-α，或TNF-α]和从标示SSO处理小鼠获取的10％血清处理L929细胞。24小时后测量细胞生存能力，并参照未处理细胞将其标准化。
图14利用图13中描述的细胞存活试验，比较了来自标示SSO寡核苷酸处理小鼠血清的抗TNF-alpha活性与来自
Figure G2007800535955D00081
和的重组的可溶性TNFR2(rsTNFR2)细胞外域的活性。
图15A和15B比较了muTNFR2Δ7蛋白质(图15A)和mRNA(图15B)的稳定性。以25mg/kg/天的剂量，每天给小鼠注射SSO 3272、SSO 3274或SSO 3305(n＝5)。最后一次注射后，在所标示的那天对小鼠进行放血处理，并测量血清的TNFR2浓度。在最后一次注射SSO后所标示的那一天处死小鼠，按照图10的描述对获得的总RNA进行RT-PCR分析。
图16描绘了最后一次注射10天后，分别以蛋白质或mRNA含量的百分比表示的TNFR2Δ7蛋白质(虚线)和mRNA(实线)水平随时间的变化。
图17图解了用TNFR2Δ7哺乳动物表达质粒转染后，HeLa细胞表达的TNFR2Δ7的抗TNF-alpha活性的剂量依赖性。用标示的小鼠或人TNFR2Δ7转染HeLa细胞，48小时后收集细胞外培养基。通过ELISA确定培养基(media)中的TNFR2Δ7的浓度，并制备系列稀释液。通过图14中的L929细胞毒性试验测定这些稀释液的抗TNF-alpha活性。
图18显示了通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离的已表达的小鼠(A)和人(B)TNFR2D7蛋白。用标示的质粒转染Hela细胞。48小时后，收集并浓缩细胞外培养基，并将细胞收集在RIPA溶解缓冲剂中。通过PAGE分离样品中的蛋白质，并利用识别人和小鼠TNFR2D7蛋白质C末端的TNFR2第一抗体(Abcam)进行western印迹。培养基，用标示质粒转染的Hela细胞的细胞外培养基样品；裂解物，用标示质粒转染的Hela细胞的细胞裂解物。CM，来自未转染的Hela细胞的对照培养基；CL，来自未转染的Hela细胞的对照细胞裂解物。+，分子量标记(kDal)。
图19显示了纯化的His标记的人和小鼠TNFR2D7。按照图18制备包含标示的TNFR2D7蛋白质的未浓缩的细胞外培养基。大约32mL培养基被用到1mL HisPur钴离心柱(HisPur cobalt spin column)(Pierce)上，用包含150mM咪唑的1mL缓冲剂洗脱结合的蛋白质。通过PAGE分析每个样品，按照图18进行western印迹分析。1144-4和1319-1道的多条条带表明出现了不同糖基化形式的TNFR2D7。
图20本发明的寡聚物基序与它们的靶序列SEQ ID NO 1(图20A)、SEQID NO 2(图20B)、SEQ ID NO 3(图20C)和SEQ ID NO 4(图20D)的比对。
发明详述
本发明提供了通过控制编码TNF受体(TNFR1和TNFR2)和来自TNFR超家族的其他细胞因子受体的前信使RNA的剪接来控制所述受体表达的组合物和方法。更具体地说，本发明导致分泌形式的表达增加，完整膜形式的表达减少。此外，本发明可用于治疗与细胞因子活性过度相关的疾病。
存在于完整膜形式mRNA中，但从初级转录本(前信使RNA)中被除去以产生分泌形式的mRNA的外显子被称为″跨膜外显子″。本发明涉及与跨膜外显子和/或受体前信使RNA的邻近内含子这两者中的任何一个互补的核酸和核酸类似物。互补性可以以存在于覆盖剪接位点的前信使RNA序列中的序列为基础，包括但不局限于，以覆盖(或跨越span)外显子-内含子接合点的序列为基础，或者单独地以内含子的序列或外显子的序列为基础。
存在本领域技术人员已知的几种可选择的化学过程()。一个重要的特征是能够与靶RNA杂交，不会导致靶被RNase H降解为2’-脱氧寡核苷酸(″反义寡核苷酸″在下文中被称为″ASON″)。为了清楚起见，这种化合物将被称为剪接-转换寡聚物(SSOs)。本领域技术人员能够理解SSO包括，但是不局限于2’O-修饰的寡核苷酸、硫代磷酸核糖核苷、以及肽核酸和缺乏基于呋核亚硝脲(ribofuranosyl)的连接的其他聚合物。
本发明的一个实施方案涉及给病人或活的受试者施用SSOs以治疗炎性疾病或状况的方法。施用的SSOs会改变前信使RNA的剪接，会产生编码TNFR超家族受体的稳定分泌的配体结合形式的剪接变体，因此会降低配体结合受体的活性。在另一个实施方案中，本发明涉及通过给细胞施用SSOs，在细胞中产生TNFR超家族受体的稳定分泌的配体结合形式的方法。
本发明的一个实施方案涉及可以结合TNF的全长或成熟的蛋白质，其由来源于哺乳动物TNFR基因的cDNA编码，在该cDNA中，外显子6的后面直接连接外显子8，因此缺乏外显子7(″TNFR δ7″)。在另一个实施方案中，本发明涉及包含TNFR δ7的药物组合物。在更进一步的实施方案中，本发明涉及通过施用包含TNFR δ7的药物组合物治疗炎性疾病或状况的方法。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码TNFRδ7的核酸。在更进一步的实施方案中，本发明涉及包含编码TNFRδ7的核酸的药物组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含编码TNFRδ7的核酸的表达载体。
在更进一步的实施方案中，本发明涉及通过用包含编码TNFRδ7的核酸的表达载体转化哺乳动物细胞来增加哺乳动物血清中的可溶性TNFR水平的方法。在另一个实施方案中，本发明涉及用包含编码TNFRδ7的核酸的表达载体转化的细胞。
在更进一步的实施方案中，本发明涉及在适合于表达TNFRδ7情况下，通过培养用包含编码TNFR 57的核酸的表达载体转化的细胞来生产TNFRδ7的方法。在另一个实施方案中，本发明涉及通过施用包含编码TNFRδ7的核酸的表达载体来治疗炎性疾病或状况(condition)的方法。
在另一个实施方案中，公开了改变哺乳动物TNFR2前信使RNA剪接的能产生哺乳动物TNFR2蛋白质的剪接转换寡聚物(SSOs)，所述TNFR2蛋白质可以结合TNF，而且其外显子6的后面直接连接外显子8，因此缺乏外显子7(″TNFR2δ7″)。本发明的一个实施方案涉及给病人或活的受试者施用SSOs以治疗炎性疾病或状况的方法。所施用的SSOs能够改变哺乳动物TNFR2前信使RNA的剪接以产生TNFR2δ7。在另一个实施方案中，本发明涉及通过给细胞施用SSOs以在细胞中产生TNFR2δ7的方法。
在此处的附图和下文的说明书中将详细讨论本发明的上述目标及其他方面。
寡聚物
在一个实施方案中，寡聚物由毗连的核酸碱基序列组成。
然而，寡聚物可能包括侧接在毗连的核酸碱基序列的5’或3’端的其他的核酸碱基序列，或者5’和3’端的更远的核酸碱基序列，这一点也是能够想象到的。这些5’和/或3’′侧接′区的合适长度为1、2、3、4、5或6个核酸碱基。在体内使用时，预计位于本发明的寡聚物末端的DNA或RNA核碱基可以被内源性外切核酸酶从寡聚物上切割下来，因此，包含侧接的DNA或RNA单位不影响寡聚物的体内性能。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列3’末端侧接了1、2或3个DNA或RNA单位。在固相合成寡聚物期间经常使用3’DNA单位。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列5’末端侧接了1、2或3个DNA或RNA单位。
在一个实施方案中，本发明提供了长度在8和50个核碱基之间的寡聚物，包含由长度在8和50个碱基之间的核苷酸组成的毗连核碱基序列，其中所述的毗连核碱基序列与存在于SEQ ID NO 1，SEQ ID NO 2，SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4中的毗连核苷酸的对应区域(即所述的毗连核碱基序列存在于SEQ ID NO 247，SEQ ID NO 248，SEQ ID NO 249或SEQ ID NO 250中的毗连核苷酸区域(′对应′或部分))互补，而且所述的毗连核碱基序列不包含5个或5个以上毗连的DNA(2’-脱氧核糖核苷)单体单位。
在一个实施方案中，当寡聚物在具有互补mRNA分子的复合物的双链体中形成时，所述的寡聚物基本上不能补充RNAseH。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列包含或由核苷酸类似物(X)组成。
在一个实施方案中，核苷酸类似物(X)独立地选自由2’-O-烷基-RNA单位、2′-OMe-RNA单位，2’-氨基-DNA单位、2′-氟-DNA单位，LNA单位、PNA单位、HNA单位、INA单位组成的组。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列包含核苷酸类似物(X)和核苷酸(x)。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列不包含多于7个毗连核苷酸类似物单位(X)的区域，例如不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个的毗连核苷酸类似物单位(X)。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列最靠近5’端(5’most)的核碱基是核苷酸类似物(X)。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列最靠近5’端的核碱基是核苷酸单位(x)，例如DNA(2’--脱氧核糖核苷)单体单位。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列最靠近3’端的核碱基是核苷酸类似物(X)。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列最靠近3’端的核碱基是核苷酸单位(x)，例如DNA(2’--脱氧核糖核苷)单体单位。在一个实施方案中，毗连核碱基序列包含或由核苷酸和核碱基的交替(alternating)序列组成。在一个实施方案中，核苷酸和核碱基的交替序列选自由Xx，xX，Xxx，xXx，xxX，XXx，XxX，xXX，XXXx，XXxX，XxXX，xXXX，xxxX，xxXx，xXxx，Xxxx，XXXXx，XXXxX，XXxXX，XxXXX，xXXXX，xxxxX，xxxXx，xxXxx，xXxxx，Xxxxx组成的组的序列，其中所述的交替序列可任意重复。
在一个实施方案中，在毗连核碱基序列的全长范围内重复的序列，其中可以任意截短5’和或3’端的重复。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸包含所述的至少一个LNA类似物单位和至少一个不同于LNA的更进一步的核苷酸类似物单位。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸由至少一个X1X2X1或X2X1X2序列组成，其中X1是LNA，X2是不同于LNA的核苷酸类似物，例如2’-OMe RNA单位和2’-氟DNA单位。
在一个实施方案中，单链寡核苷酸的核碱基序列由交替的(alternative)X1和X2单位组成。
在一个实施方案中，核苷酸类似物单位，例如X，独立地选自由2’-OMeRNA单位、2’-氟-DNA单位和LNA单位组成的组。
在一个实施方案中，核苷酸类似物单位(X)是LNA单位。
在一个实施方案中，LNA单位选自由氧-LNA、氨基-LNA、硫代-LNA和ena-LNA组成的组。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列不包含毗连的由5个或5个以上独立地选自DNA和LNA单位的毗连核碱基组成的毗连子序列，其中存在于毗连子序列中的LNA呈α-L-构型。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列不包含毗连的由5个或5个以上独立地选自DNA和LNA单位的毗连核碱基组成的毗连子序列，其中存在于毗连子序列中的LNA是α-L-氧-LNA。
在一个实施方案中，所有LNA单位都是β-D构型。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列只由LNA和DNA单位组成。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列只由LNA和DNA单位组成。优选β-D构型的LNA单位，例如β-D-氧或β-D-硫代或β-D-氨基。
在一个实施方案中，LNA选自由β-D-氧-LNA、β-D-硫代-LNA、β-D-氨基-LNA、ena-LNA组成的组，任选地包括由α-L-氧-LNA、α-L-硫代-LNA或α-L-氨基-LNA组成的组。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列在8和16之间，例如长度为9、10、11、12、13、14、15或16个核碱基，或者在10-14、11-14或12-14之间。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列在8和15之间，例如长度为8、9、10、11、12、13、14或15个核碱基。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列包含与存在于SEQ ID NO 1或SEQID NO 3中的对应区域互补的核碱基，即存在于SEQ ID NO 247或SEQ ID NO249中的毗连核苷酸的(对应)区域的核碱基。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列与选自由SEQ ID NO 1的51-164、SEQ ID NO 2的51-79、SEQ ID NO 3的51-127和SEQ ID NO 4的51-85所组成的组中的序列中存在的毗连核苷酸的对应区域互补。在一个实施方案中，毗连核碱基序列与选自由SEQ ID NO 1的1-50、SEQ ID NO 1的165-215、SEQID NO 2的1-50、SEQ ID NO 2的80-130、SEQ ID NO 3的1-50、SEQ ID NO 3的128-178、SEQ ID NO 4的1-50和SEQ ID NO 4的86-136所组成的组中的序列中存在的毗连核苷酸的对应区域互补。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列包含与5’外显子/内含子3’或3’内含子/外显子5’边界互补的核碱基序列。
在一个实施方案中，5’外显子/内含子3’或3’内含子/外显子5’边界选自由SEQ ID NO 1的核碱基50-51、SEQ ID NO 1的164-165、SEQ ID NO 2的50-51、SEQ ID NO 2的79-80、SEQ ID NO 3的51-52、SEQ ID NO 3的129-139、SEQ ID NO 4的50-51、SEQ ID No 4的81-82所组成的组。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列与选自由SEQ ID NO 74到SEQ IDNO105组成的组的序列中存在的核碱基序列相同，或者存在于该序列中。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列与选自由SEQ ID NO 74、SEQ IDNO75、SEQ ID NO 77、SEQ ID NO 78、SEQ ID NO 80、SEQ ID NO 82和SEQ ID NO 84组成的组的核碱基序列相同，或者存在于该序列中。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列与选自由SEQ ID NO 85、SEQ IDNO 86、SEQ ID NO 87、SEQ ID NO 88和SEQ ID NO 89组成的组的核碱基序列相同，或者存在于该序列中。
在一个实施方案中，寡聚物选自由SEQ ID NO 74、SEQ ID NO 75、SEQID NO 77、SEQ ID NO 78、SEQ ID NO 80、SEQ ID NO 82和SEQ ID NO 84组成的组。
在一个实施方案中，寡聚物选自由SEQ ID NO 86、SEQ ID NO 87、SEQID NO 88和SEQ ID NO 89组成的组。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列包含与选自SEQ ID No 3的核苷酸区域47-49、54-56和122-124互补的核碱基序列。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列与选自由SEQ ID NO 130-SEQ IDNo 145、SEQ ID NO 146-SEQ ID NO 161和SEQ ID NO 162-177组成的组的核碱基序列或核碱基基序相同，或者存在于该序列中。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列与选自由SEQ ID NO 131-SEQ IDNo 145、SEQ ID NO 147-SEQ ID NO 161和SEQ ID NO 163-177组成的组的核碱基序列或核碱基基序相同，或者存在于该序列中。
一个实施方案中，寡聚物选自由SEQ ID NO 243、SEQ ID NO 244、SEQID NO 245或SEQ ID NO 246组成的组。
一个实施方案中，寡聚物包含共价附着于所述寡聚物上的至少一个非核苷酸部分。
剪接转换寡聚物(SSOs)：
另一个方面，本发明使用剪接转换寡核苷酸或剪接转换寡聚物(SSOs)控制TNFR2的选择性剪接，以致缺乏外显子7的可溶性配体结合形式的数量增加，完整膜形式的数量减少。本发明的方法和组合物可用于治疗与tnf活性过度相关的疾病。
因此，本发明的一个实施方案涉及给病人施用SSOs以治疗炎性疾病或状况的方法。所施用的SSOs能够改变前信使RNA的剪接以产生缺乏外显子7的哺乳动物TNFR2蛋白质。
在另一个实施方案中，本发明涉及通过给细胞施用SSOs以在细胞中产生缺乏外显子7的哺乳动物TNFR2蛋白质的方法。
SSO的长度(即寡聚物中单体的数目)与反义寡核苷酸(ASON)相似，典型地在大约8-30之间。在优选的实施方案，SSO在大约10-16个核苷酸之间。可以利用SSOs能与RNA杂交，但不会象传统的反义2’-脱氧寡核苷酸那样激活RNAseH引起的RNA破坏的几种化学过程来实施本发明。可以利用2’O修饰的核酸寡聚物，例如2’O被-O-CH3、-O-CH2-CH2-O-CH3、-O-CH2-CH2-CH2-NH2、-O-CH2-CH2-CH2-OH或-F的修饰的核酸寡聚物来替代(replaced with)实施本发明，优选2’O-甲基或2’O-甲氧乙基修饰的核酸寡聚物。核碱基不必连接到糖上；可以使用被称为肽核酸寡聚物或基于吗啉的寡聚物。在Sazani，p.et al.，2001，nucleic acids res.29：3695中发现了对这些不同的化学连接过程的比较。术语剪接转换寡核苷酸预计包括上述形式。本领域技术人员能够理解反义寡核苷酸gapmers和SSOs之间的关系。Gapmers是包含RNAse H活化区域(典型地为2’-脱氧核糖核苷硫代磷酸酯(deoxyribonucleoside))的ASON，其中活化区域与不活化的核酸酶抵抗寡聚物的侧接。通常，在SSO中可以使用适合于gapmerASON中的侧接序列的任何化学过程。
可以通过公知的固相合成技术制备本发明的SSOs。可以另外使用或替换使用其他的任何适合这种合成的工具。已经公知可利用类似的方法制备寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基衍生物。
SSO的碱基可以是传统的胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶或胸腺嘧啶脱氧核苷。或者，可以使用修饰的碱基。特别有价值的是结合亲合力增加的修饰碱基。优选的修饰碱基的非限制性例子有被称为g-clamp或9-(氨基乙氧基)吩恶嗪(phenoxazine)的核苷酸、与鸟嘌呤核苷形成4个氢键的胞嘧啶类似物。(Flanagan，W.M.，et al.，1999，proc.Natl.Acad.Sci.96：3513；Holmes，S.C，2003，Nucleic Acids Res.31：2759)。其他碱基的具体例子包括，但不限于5-甲基胞嘧啶(MeC)、异胞嘧啶、假胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔尿嘧啶(propynyluracil)、5-丙炔(propyny)-6、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、次黄嘌呤核苷、2，6-二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮腺嘌呤(deazaadenine)、7-丙炔(propyne)-7-去氮鸟嘌呤(deazaguanine)和2-氯6-氨基嘌呤。
当在SSO中使用LNA核苷酸时，也存在非LNA核苷酸的情形是优选的。LNA核苷酸在有非常明显的非特异性结合的杂交中具有如此高的亲合力，因此可以降低游离SSO的有效浓度。当使用LNA核苷酸时，也可以用2’-脱氧核苷酸方便地替换(alternate)它们。可以使用可替换的(alternating)核苷酸、可替换的二核苷酸或其混合形式，例如LDLDLD、LDDLDD或LLDLLD。例如，在一个实施方案中，核苷酸包含选自由LDLDDLLDDLDLDLL，LDLDLLLDDLLLDLL，LMLMMLLMMLMLMLL，LMLMLLLMMLLLMLL，LFLFFLLFFLFLFLL，LFLFLLLFFLLLFLL，LDDLDDLDDL，DLDDLDDLDD，DDLDDLDDLD，LMMLMMLMML，MLMMLMMLMM，MMLMMLMMLM，LFFLFFLFFL，FLFFLFFLFF，FFLFFLFFLF，DLDLDLDLDL，LDLDLDLDL，MLMLMLMLML，LMLMLMLML，FLFLFLFLFL，LFLFLFLFL组成的组的核苷酸序列，其中L是LNA单位，D是DNA单位，M是2′Moe，F是2’氟代。
当2′-脱氧核苷酸或2’-脱氧核苷硫代磷酸酯与LNA核苷酸混合时，避免RNAse H活化是非常重要的。预计SSO的LNA核苷酸在大约三分之一和三分之二之间比较合适。当使用增强亲合力的修饰，包括但不局限于LNA或g-clamp核苷酸时，本领域技术人员将会认识到增加这种增强亲合力的修饰的比例是必需的。
可以使用不活化RNAse H的多种可替换的化学过程。例如：适当的SSOs可以是其中至少一个核苷酸间桥接磷酸盐残基是经过修饰的磷酸盐，例如膦酸甲酯、甲基硫代膦酸酯(methyl phosphonothioate)、phosphoromorpholidate、phosphoropiperazidate和氨基磷酸酯(phosphoroamidate)的寡核苷酸。
例如：依照所描述的内容可以每隔(every other)一个地修饰核苷酸间桥接的磷酸盐残基。在另一个非限制性例子中，这种SSO是其中至少一个核苷酸包含2’位置的低级烷基部分(例如，C1-C4，线性的或分支的，饱和或不饱合的烷基，例如甲基、乙基、乙烯基、丙基、1-丙烯基、2-丙烯基和异丙基)的寡核苷酸。例如：依照所描述的内容可以每隔一个地修饰核苷酸(参见参考文献美国专利5,976,879中的第4栏)。在体内使用时，优选硫代磷酸酯连接。
SSO的长度为大约8-30个碱基。本领域熟练技术人员应理解当使用增加亲合力的化学修饰时，SSO可以短些，但仍然保持特异性。本领域熟练技术人员应该能更进一步地理解SSO长度的上限是通过保持特异性识别靶序列，避免二级结构形成SSO的自身杂交，以及获取进入细胞的限制来限定的。这些限制意味着长度增加(超过(above and beyond)依赖于SSO亲合力的一定长度)的SSO经常被发现是特异性较低、没有活性或活性很差的SSO。
本发明的SSOs包括，但不局限于涉及通过化学连接将增强SSO活性、细胞分布或细胞吸收的一个或多个部分或偶联物连接到SSO上的SSO修饰。这种部分包括，但不局限于脂质部分，例如胆固醇部分、胆酸、硫醚，例如己基-硫-三苯甲基硫醇(tritylthiol)、硫胆固醇、脂肪链，例如、十二烷基或十一烷基残基、磷脂，例如、二-十六基-rac-甘油或三乙铵-二-氧-十六烷基-rac-甘油基-3-h-磷酸盐化合物(phosphonate)、多胺或聚乙二醇链、金刚烷乙酸、棕榈基部分、十八胺或己氨-羰基-羟胆固醇部分。
不必均匀地改变给定SSO中的所有位置，实际上可以在单个化合物，乃至SSOs内部的单个核苷中引入一种以上的上述修饰。
SSOs可以与其他分子、分子结构或化合物的混合物混合、包封、偶联在一起，或者与它们有关联，例如，形成有助于吸收、分布和/或吸收的脂质体、受体靶向的分子，口服剂型、直肠给药剂型、局部给药剂型或其他剂型。
本领域熟练技术人员应理解细胞分化包括，但不局限于剪接体的分化。因此，任何特殊SSO的活性取决于将其引入其中的细胞类型。例如，在一种细胞类型中有效的SSOs在另一种细胞类型中可能是无效的。
本发明的方法、寡核苷酸和剂型(formulation)也是有用的调查人或动物基因剪接的体外或体内工具。通过此处描述的步骤或本领域技术人员熟知的所述步骤的修饰可以实施这种方法。
此处公开的SSOs可用于治疗执业医生打算限制tnf作用或tnf活化的信号路径的任何状态。特别是，本发明可用于治疗炎性疾病。在一个实施方案中，所述状态是炎性系统性疾病，例如类风湿性关节炎或牛皮癣关节炎。在一个实施方案中，这种疾病是炎性肝病。炎性肝病的实例包括，但不局限于与甲型、乙型或丙型肝炎病毒有关的肝炎，酒精性肝病和非酒精性脂肪变性。在另一个实施方案中，炎性疾病是皮肤疾病，例如牛皮癣。
补充RNAseH
本发明的寡聚物不介导基于RNAseH的互补单链RNA分子的切割。能有效补充RNAseH的寡核苷酸需要至少5个毗连的DNA核碱基的延伸(stretch)。
EP 1222309提供了确定RNaseH活性的体外方法，该方法可以用来确定补充RNaseH的能力。与互补RNA靶一起提供时，利用EP 1222309的实施例91-95提供的方法进行测定时，如果以pmol/L/min计，化合物具有同等DNA寡核苷酸至少1％，例如至少5％，例如至少10％或小于20％的初始速率，则认为该化合物能够补充RNase H，其中同等DNA寡核苷酸没有2’位点的取代，寡核苷酸中所有核苷酸之间都是磷酸二酯连接基团的。
当与互补RNA靶和RNaseH一起提供时，利用EP 1222309的实施例91-95提供的方法进行测定时，如果以pmol/L/min计，化合物的RNaseH初始速率小于利用同等DNA寡核苷酸确定的初始速率的20％，例如小于10％，例如小于5％或优选小于0.1％(甚至小于0.1％)，则认为该化合物基本上不补充RNase H，其中同等DNA寡核苷酸没有2’位点的取代，寡核苷酸中所有核苷酸之间都是磷酸二酯连接基团的。
核苷酸类似物
当提到只由核苷酸组成的优选的核苷酸序列基序或核苷酸序列时，应该认识到由该序列限定的本发明的寡聚物可以包含替换所述序列中存在的一个或多个核苷酸的对应的核苷酸类似物，例如LNA单位或其他的核苷酸类似物，所述核苷酸类似物提高寡聚物/靶双链体的双链体稳定性/Tm(即增强亲合力的核苷酸类似物)。
此外，核苷酸类似物可以在体内增强寡聚物的稳定性。
在一个实施方案中，核苷酸类似物(X)独立地选自由2’-氧-烷基-RNA单位、2′-OMe-RNA单位、2′-MOE RNA单位、2’-氨基-DNA单位、2′-氟-DNA单位，LNA单位、PNA单位、HNA单位和INA单位组成的组。
在一个实施方案中，毗连核碱基序列不包含2’OMe核糖核苷酸类似物或2’-MOE核糖核苷酸类似物。
在一个实施方案中，核苷酸类似物是2’MOE，即2’氧-2甲氧乙基RNA。因此，在一个实施方案中，此处提到核碱基基序中的X2或M可以是MOE。
在寡聚物中引入增强亲合力的核苷酸类似物，例如LNA或T-取代的糖可以允许降低特异性结合寡聚物的大小，也可以降低非特异性或异常结合发生前，寡聚物大小的上限。
寡聚物的核碱基序列或毗连核碱基序列与TNFR靶序列的对应区域不完全互补也是合适的，在一个实施方案中，当寡聚物包含增强亲合力的核苷酸类似物，这种核苷酸类似物与TNFR靶中的对应核苷酸形成互补体。
因此寡聚物可以包含或由天然核苷酸，优选2’-脱氧核苷酸(在这里通常被称为″DNA″)，但也可能由核糖核苷酸(在这里通常被称为″RNA″)的简单序列组成，或者它可以包含一个或多个核苷酸″类似物″(也可能完全由其组成)。
核苷酸类似物是由糖、和/或碱基和/或磷酸盐部分的修饰所产生的天然DNA或RNA核苷酸的变体。术语″核碱基″包括天然核苷酸(DNA或RNA类型)，以及它们的这种″类似物″。原则上类似物可以只是″沉默的″，或者″等同于″寡核苷酸上下文中的天然核苷酸，即对寡核苷酸抑制β-联蛋白表达的作用方式没有功能性的影响。如果，例如这种″等同″类似物更容易制造或者制造起来更便宜，或者在存储或制造期间更稳定，或者带有标记或标签，那么它们无论如何都是有用的。然而，优选那些对寡聚物抑制表达的作用方式有功能性影响的类似物；例如，通过增加对靶的结合亲合力、增加对胞内核酸酶的抗性和/或增加转运到细胞中的容易性来产生影响的类似物。
这种核苷酸修饰的实例包括改变糖部分以提供2’-取代基或产生增强结合亲合力和可能提供一些增强的核酸酶抗性的桥接(锁定的核酸)结构；将核苷酸间连接由正常的磷酸二酯键变为对核酸酶攻击抗性更强的连接，例如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯(boranophosphate)。
优选的核苷酸类似物是LNA，例如β-D-氧-LNA、α-L-氧-LNA、β-D-氨基-LNA和β-D-硫代-LNA，，β-D-氧-LNA是最优选的。
在一些实施方案中，寡聚物包含3-8个核苷酸类似物，例如6或7个核苷酸类似物。到目前为止，最优选的实施方案中，至少一个所述的核苷酸类似物是锁定的核酸(LNA)；例如，至少3或至少4个，或者至少5个，或者至少6个，或者至少7个或8个核苷酸类似物是LNA。在一些实施方案中，所有的核苷酸类似物都是LNA。
在一些实施方案中，本发明的寡聚物内部存在的核苷酸类似物独立地选自，例如2’-氧-烷基-RNA单位、2’-氨基-DNA单位、2′-氟-DNA单位、LNA单位、阿拉伯糖核酸(ANA)单位、2′-氟-ANA单位、HNA单位、INA(插入核酸)单位和2′-MOE RNA单位。
2’-氧-甲氧乙基-RNA(2’MOE)、2’-氟-DNA单体和LNA是优选的核苷酸类似物，因此本发明的寡核苷酸可以包含独立地选自这三种类似物的核苷酸类似物，或者可以只包含选自这三种中的一种类似物。
依照本发明的寡聚物优选包含至少一个锁定的核酸(LNA)单位，例如1、2、3、4、5、6、7或8个LNA单位，优选4-8个LNA单位，最优选4个、5个或6个LNA单位。寡聚物包含β-D-氧-LNA和一个或多个下列LNA单位：D-β、L-α构型或其组合构型的硫代-LNA、氨基-LNA、氧-LNA、ena-LNA和/或α-LNA是合适的。
在本发明的一个实施方案中，寡聚物可以包含LNA和DNA单位。LNA和DNA单位组合的总数优选为8-24，例如8-15、或10-25，或10-20或12-16。
在本发明的一个实施方案中，寡聚物的核碱基序列，例如毗连核碱基序列由至少一个LNA组成，剩余的核碱基单位是DNA单位。
在依照本发明的寡聚物的一些实施方案，例如包含LNA的反义寡核苷酸中，所有LNA C单位都是5-甲基胞嘧啶。在一些实施方案中，所有核苷酸类似物都是LNA。
在最优选的实施方案中，寡聚物只包含LNA核苷酸类似物和核苷酸(RNA或DNA，最优选DNA核苷酸，具有任意修饰的核碱基间连接，例如硫代磷酸酯)。
在一些实施方案中，所述核苷酸类似物的至少一个是2’-MOE-RNA，例如2、3、4、5、6、7或8个2’-MOE-RNA核碱基单位。
在一些实施方案中，所述核苷酸类似物的至少一个是2’-氟-DNA，例如2、3、4、5、6、7或8个2’氟-DNA核碱基单位。
Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213，以及略图1描述了核苷类似物的具体实例。
Figure G2007800535955D00221
略图1
术语″LNA″指被称为″锁定核酸″的二环核苷酸类似物。它可以指LNA单体，在″LNA寡核苷酸″的上下文中使用时可以指包含一个或多个这种二环核苷酸类似物的寡核苷酸。
特别优选的化学过程由锁定核酸(LNA)提供(Koshkin，A.A.，et al.，1998，Tetrahedron 54：3607；Obika，S.，et al.，1998，Tetrahedron Lett.39：5401)。此处使用的术语″LNA单位″、″LNA单体″、″LNA残基″、″锁定的核酸单位″、″锁定的核酸单体″或″锁定的核酸残基″指二环核苷类似物。WO 99/14226、WO 00/56746、WO 00/56748、WO 01/25248、WO 02/28875、WO 03/006475和WO 03/095467中描述了LNA单位和它们的合成方法。也可以根据化学式来限定LNA单位。因此，此处使用的″LNA单位″具有下文式1所示的化学结构。
式1
Figure G2007800535955D00231
其中
X选自由O、S和NRH组成的组，R是H或C1-C4烷基；
Y是(-CH2)r，r是1-4的整数；
B是如上所述的天然或非天然来源的碱基。
在一个优选的实施方案中，r是1或2，在一个更优选的实施方案中，r是1。
本发明的寡核苷酸化合物中使用的LNA优选具有如下通式的结构
其中X和Y独立地选自群组-O-、-S-、-N(H)-、N(R)-、-CH2-或-CH-(如果是双键的一部分)、-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-N(H)-、-CH2-N(R)-、-CH2-CH2-或-CH2-CH-(如果是双键的一部分)、-CH＝CH-、其中R选自氢和C1-4-烷基；Z和Z*独立地选自核苷酸间连接、末端基团或保护基团；B组成天然或非天然核苷酸碱基部分；在两个方向的任意一个方向可以发现不对称的基团。
本发明使用的寡聚物中的LNA优选包含符合下式中的任何一个的至少一个LNA单位
Figure G2007800535955D00241
其中，Y是-O-、-S-、-N(H)-、N(RH)-；Z和Z*独立地选自核苷酸间连接、末端基团或保护基团；B组成天然或非天然核苷酸碱基部分，RH选自氢和C1-4-烷基。
本发明的寡聚物中使用的LNA优选包含选自-O-P(O)2-O-，-O-P(O，S)-O-，-O-P(S)2-O-，-S-P(O)2-O-，-S-P(O，S)-O-，-S-P(S)2-O-，-O-P(O)2-S-，-O-P(O，S)-S-，-S-P(O)2-S-，-O-PO(RH)-O-，O-PO(OCH3)-O-，-O-PO(NRH)-O-，-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-，-O-PO(BH3)-O-，-O-PO(NHRH)-O-，-O-P(O)2-NRH-，-NRH-P(O)2-O-，-NRH-CO-O-，其中RH选自氢和C1-4烷基。
具体优选的LNA单位如略图2所示：
Figure G2007800535955D00242
β-D-氨基酸-LNA
略图(scheme)2
术语″硫代-LNA″包含其中上述通式中的X或Y中的至少一个选自S或-CH2-S-的锁定核苷酸。硫代LNA可以是β-D和α-L构型。
术语″氨基-LNA″包含其中上述通式中的X或Y中的至少一个选自-N(H)-，N(R)-，CH2-N(H)-和-CH2-N(R)-的锁定核苷酸，其中R选自氢和C1-4-烷基。氨基-LNA可以是β-D和α-L构型。
术语″氧-LNA″包含其中上述通式中的X或Y中的至少一个代表-O-或-CH2-O-的锁定核苷酸。氧LNA可以是β-D和α-L构型。
术语″ena-LNA″包含其中上述通式中的Y是-CH2-O-(其中-CH2-O-的氧原子附于与碱基B相对的2’-位置)的锁定核苷酸。
在优选的实施方案中，LNA选自β-D-氧-LNA、α-L-氧-LNA、β-D-氨基-LNA和β-D-硫代、特别是β-D-氧-LNA。
依照本发明的寡聚物优选包含至少一个核苷酸类似物，例如锁定的核酸(LNA)单位，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸类似物，例如锁定的核酸(LNA)单位，优选3-9个核苷酸类似物，例如LNA单位，例如4-8个核苷酸类似物，例如LNA单位，例如6-9个核苷酸类似物，例如LNA单位，优选6、7或8个核苷酸类似物，例如LNA单位。
依照本发明的寡聚物，例如反义寡核苷酸，可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸类似物，例如LNA单位，特别是3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸类似物，例如LNA单位。
优选的LNA单位包含至少一个β-D-氧-LNA单位，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个β-D-氧-LNA单位。
本发明的寡聚物，例如反义寡核苷酸，可以包含一种以上的LNA单位。化合物包含β-D-氧-LNA和一个或多个下列LNA单位：D-β、L-α构型或其组合构型的硫代-LNA、氨基-LNA、氧-LNA、ena-LNA和/或α-LNA是合适的。
优选的寡聚物，例如反义寡核苷酸，可以包含或由核苷酸类似物，例如LNA和DNA单位组成。
优选LNA和DNA，但是也可以使用MOE、2’-O-Me，以及其他2’取代的类似物和RNA。
优选的DNA类似物包括其中2’-H被OH(RNA)以外的基团，例如被-O-CH3，-O-CH2-CH2-O-CH3，-O-CH2-CH2-CH2-NH2，-O-CH2-CH2-CH2-OH或-F替换的DNA类似物。
优选的RNA类似物包括其中2’-OH已经改变，例如被-H(DNA)以外的基团，例如-O-CH3，-O-CH2-CH2-O-CH3，-O-CH2-CH2-CH2-NH2，-O-CH2-CH2-CH2-OH或-F基团取代的RNA类似物。
在一个实施方案中，核苷酸类似物是″ENA″。
在一个实施方案中，本发明的寡聚物不包含任何RNA单位。
与同等的DNA核苷酸的结合亲合力相比，高亲和性核苷酸类似物是产生与互补RNA核苷酸形成具有较高热稳定性的双链体的寡核苷酸的核苷酸类似物。典型地通过测量Tm来确定这一点。
与同等的核苷酸相比，增加寡聚物/靶核酸靶的Tm的核苷酸类似物是优选的(增强亲合力的核苷酸类似物)。寡聚物可以适当地地与靶核酸，例如TNFR mRNA杂交，形成Tm为至少30℃，例如37℃，例如至少40℃，至少50℃，至少55℃或至少60℃的双链体。例如，在一个方案中，Tm在30-80℃之间，例如在40-70℃之间。
在一个实施方案中，本发明寡聚物的核碱基的至少30％，例如至少33％，例如至少40％，例如至少50％，例如至少60％，例如至少66％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％是核苷酸类似物核碱基，例如LNA。在一个实施方案中，本发明的寡聚物的所有核碱基都是核苷酸类似物核碱基，例如LNA。
对于较短的寡核苷酸，可能需要增加(高亲合力)核苷酸类似物，例如LNA的比例，这一点是能够认识到的。
与术语″寡聚物″互换使用的术语″寡核苷酸(或简单地″低聚″oligo)″在本发明上下文中指由两个或多个核碱基的共价键形成的分子。当在本发明的寡核苷酸(也称为单链寡核苷酸)的上下文中使用时，术语″寡核苷酸″在一个实施方案中可能具有，例如8-26个核碱基，例如12-26个核碱基。在此处详述的优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸具有10-16个核碱基或8-15个核碱基的长度。
寡聚物长度的变化
本发明寡核苷酸的长度可以变化。甚至认为较短的寡核苷酸，例如10-17或10-15个碱基的寡核苷酸更有利。
在这样的实施方案中，本发明的寡核苷酸具有10、11、12、13、14、15或16个核碱基的长度。
在一个实施方案中，依照本发明的寡核苷酸的长度为8-24个核碱基，例如10-24个，12-24个核苷酸之间，例如长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸，优选的长度为10-22个，例如12-22个核苷酸之间，例如长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个核苷酸，更优选的长度为10-20个，例如12-20个核苷酸之间，甚至更优选的长度为10-19个，例如12-19个核苷酸之间，例如长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个核苷酸，例如长度为10-18个，例如12-18个核苷酸之间，例如长度为10、11、12、13、14、15、16、17或18个核苷酸，更优选的长度为10-17个，例如12-17个核苷酸之间，例如长度为10、11、12、13、14、15、16或17个核苷酸，最优选的长度为10-16个，例如12-16个核苷酸之间，例如长度为10、11、12、13、14、15或16个核苷酸。
核苷酸间连接基团
术语″核苷酸间连接基团″被用来指能够将两个核碱基共价连接在一起的基团，例如，DNA单位之间、DNA单位和核苷酸类似物之间、两个非LNA单位之间、非LNA单位和LNA单位之间、两个LNA单位之间的基团等等。优选的实例包括磷酸盐、磷酸二酯基团和硫代磷酸酯基团。
核苷酸间连接基团可以选自由如下基团组成的组：-O-P(O)2-O-，-O-P(O，S)-O-，-O-P(S)2-O，-S-P(O)2-O，-S-P(CS)-O-，-S-P(S)2-O，-O-P(O)2-S-，-O-P(CS)-S-，-S-P(O)2-S-，-O-PO(RH)-O-，O-PO(OCH3)-O-，-O-PO(NRH)-O-，-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-，-O-PO(BH3)-O-，-O-PO(NHRH)-O-，-O-P(O)2-NRH-，-NRH-P(O)2-O-，-NRH-CO-O-，-NRH-CO-NRH-，和/或核苷酸间连接基团可以选自由如下基团组成的组：-O-CO-O-，-O-CO-NRH-，-NRH-CO-CH2-，-O-CH2-CO-NRH-，-O-CH2-CH2-NRH-，-CO-NRH-CH2-，-CH2-NRH-CO-，-O-CH2-CH2-S-，-S-CH2-CH2-O-，-S-CH2-CH2-S-，-CH2-SO2-CH2-，-CH2-CO-NRH-，-O-CH2-CH2-NRH-CO-，-CH2-NCH3-O-CH2-，其中RH选自氢和C1-4烷基。合适地，在一些实施方案中，上文提供的包含硫的核苷酸间连接是优选的。
核苷酸间连接的修饰
寡核苷酸中的核苷酸间连接基团是磷酸基，但是可以用不同于磷酸盐的核苷酸间连接基团取代这些磷酸基。在本发明的一个有趣的更进一步地实施方案中，本发明的寡核苷酸的核苷酸间连接基团的结构被改变，即修饰的寡核苷酸包含不同于磷酸盐的核苷酸间连接基团。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸包含至少一个不同于磷酸盐的核苷酸间连接基团。
不同于磷酸盐(-O-P(O)2-O-)的核苷酸间连接基团的具体实例包括-O-P(O，S)-O-，-O-P(S)2-O-，-S-P(O)2-O-，-S-P(O，S)-O-，-S-P(S)2-O-，-O-P(O)2-S-，-O-P(O，S)-S-，-S-P(O)2-S-，-O-PO(RH)-O-，O-PO(OCH3)-O-，-O-PO(NRH)-O-，-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-，-O-PO(BH3)-O-，-O-PO(NHRH)-O-，-O-P(O)2-NRH-，-NRH-P(O)2-O-，-NRH-CO-O-，-NRH-CO-NRH-，-O-CO-O-，-O-CO-NRH-，-NRH-CO-CH2-，-O-CH2-CO-NRH-，-O-CH2-CH2-NRH-，-CO-NRH-CH2-，-CH2-NRH-CO-，-O-CH2-CH2-S-，-S-CH2-CH2-O-，-S-CH2-CH2-S-，-CH2-SO2-CH2-，-CH2-CO-NRH-，-O-CH2-CH2-NRH-CO-，-CH2-NCH3-O-CH2，其中RH是氢或C1-4-烷基。
当修饰核苷酸间连接基团时，优选的核苷酸间连接基团是硫代磷酸酯基团(-O-P(O，S)-O-)。在一个优选的实施方案中，依照本发明的寡核苷酸的所有核苷酸间连接基团都是硫代磷酸酯。
寡核苷酸完全被硫代磷酸酯化在大多数治疗应用中是优选的，但在CNS，例如其中硫代磷酸酯化可能有毒的脑或脊柱(spine)中使用的治疗性寡核苷酸除外，因为缺乏核酸酶，甚至可以在毗连的DNA单位之间使用磷酸二酯键。
在一个实施方案中，寡聚物包含交替的LNA和DNA单位(Xx)或(xX)。
在一个实施方案中，寡聚物包含后面连接有2个DNA单位的交替的LNA基序(Xxx)、xXx或xxX。
在一个实施方案中，至少一个DNA或非LNA核苷酸类似物单位在选自上文所述的任何一个实施方案中被确定为LNA核碱基单位的位置被LNA核碱基取代。
在一个实施方案中，″X″代表LNA单位。
在一个实施方案中，寡聚物包含至少3个核苷酸类似物单位，例如至少4个核苷酸类似物单位，例如至少5个核苷酸类似物单位，例如至少6个核苷酸类似物单位，例如至少7个核苷酸类似物单位，例如至少8个核苷酸类似物单位，例如至少9个核苷酸类似物单位，例如至少10个，例如至少11个，例如至少12个核苷酸类似物单位。
在一个实施方案中，寡聚物包含至少3个LNA单位，例如至少4个LNA单位，例如至少5个LNA单位，例如至少6LNA单位，例如至少7个LNA单位，例如至少8个LNA单位，例如至少9个LNA单位，例如至少10个LNA单位，例如至少11个LNA单位，例如至少12个LNA单位。
在一个实施方案中，至少一个核苷酸类似物，例如LNA单位是胞嘧啶或鸟嘌呤，例如核苷酸类似物，例如LNA单位中的1-10个是胞嘧啶或鸟嘌呤，例如核苷酸类似物，例如LNA单位中的2、3、4、5、6、7、8或9个是胞嘧啶或鸟嘌呤。
在一个实施方案中，至少两个核苷酸类似物，例如LNA单位是胞嘧啶或鸟嘌呤。在一个实施方案中，至少三个核苷酸类似物，例如LNA单位是胞嘧啶或鸟嘌呤。在一个实施方案中，至少四个核苷酸类似物，例如LNA单位是胞嘧啶或鸟嘌呤。在一个实施方案中，至少五个核苷酸类似物，例如LNA单位是胞嘧啶或鸟嘌呤。在一个实施方案中，至少六个核苷酸类似物，例如LNA单位是胞嘧啶或鸟嘌呤。在一个实施方案中，至少七核苷酸类似物，例如LNA单位是胞嘧啶或鸟嘌呤。在一个实施方案中，至少八个核苷酸类似物，例如LNA单位是胞嘧啶或鸟嘌呤。
在一个优选的实施方案中，与同等DNA核苷酸对互补RNA核苷酸的结合亲合力相比，核苷酸类似物与所述互补RNA核苷酸形成具有较高热稳定性的双链体。
在一个实施方案中，核苷酸类似物赋予单链寡核苷酸增强的血清稳定性。
更进一步地设计本发明的寡聚物
在一个实施方案中，从3’末端开始数起的话，依照本发明的寡聚物的第一个核碱基是核苷酸类似物，例如LNA单位。
在一个实施方案中，从3’末端开始数起的话，依照本发明的寡聚物的第二个核碱基是核苷酸类似物，例如LNA单位。
在一个实施方案中，″x″表示DNA单位。
在一个实施方案中，寡聚物在5’末端包含核苷酸类似物单位，例如LNA单位。在一个实施方案中，核苷酸类似物单位，例如X独立地选自由2’-氧-烷基-RNA单位、2′-OMe-RNA单位、2’-氨基-DNA单位、2’-氟-DNA单位，2′-MOE RNA单位、LNA单位、PNA单位、HNA单位和INA单位组成的组。
在一个实施方案中，本发明的寡聚物的所有核碱基都是核苷酸类似物单位。
在一个实施方案中，核苷酸类似物单位，例如X独立地选自由2′-OMe-RNA单位，2′-氟-DNA单位和LNA组成的组。
在一个实施方案中，寡聚物包含所述的至少一个LNA类似物单位和至少一个另外的不同于LNA的核苷酸类似物单位。
在一个实施方案中，非LNA核苷酸类似物单位独立地选自2’-OMe RNA单位和2’-氟-DNA单位。
在一个实施方案中寡聚物由X1X2X1或X2X1X2中的至少一个序列组成，其中X1是LNA，X2是2’-OMe RNA单位或2’-氟-DNA单位。
在一个实施方案中，寡聚物的核碱基序列由交替的X1和X2单位组成。
在一个实施方案中，依照本发明的寡聚物不包含超过5个毗连DNA核苷酸单位的区域。在一个实施方案中，依照本发明的寡聚物不包含超过6个毗连DNA核苷酸单位的区域。在一个实施方案中，依照本发明的寡聚物不包含超过7个毗连DNA核苷酸单位的区域。在一个实施方案中，依照本发明的寡聚物不包含超过8个毗连DNA核苷酸单位的区域。在一个实施方案中，依照本发明的寡聚物不包含超过3个毗连DNA核苷酸单位的区域。在一个实施方案中，依照本发明的寡聚物不包含超过2个毗连DNA核苷酸单位的区域。
在一个实施方案中，寡聚物包含至少一个由至少两个毗连的核苷酸类似物单位，例如至少两个毗连的LNA单位组成的区域。
在一个实施方案中，寡聚物包含至少一个由至少三个毗连的核苷酸类似物单位，例如至少三个毗连的LNA单位组成的区域。
在一个实施方案中，依照本发明的寡聚物不包含超过7个毗连的核苷酸类似物单位，例如LNA单位的区域。在一个实施方案中，依照本发明的寡聚物不包含超过6个毗连的核苷酸类似物单位，例如LNA单位的区域。在一个实施方案中，依照本发明的寡聚物不包含超过5个毗连的核苷酸类似物单位，例如LNA单位的区域。在一个实施方案中，依照本发明的寡聚物不包含超过4个毗连的核苷酸类似物单位，例如LNA单位的区域。在一个实施方案中，依照本发明的寡聚物不包含超过3个毗连的核苷酸类似物单位，例如LNA单位的区域。在一个实施方案中，依照本发明的寡聚物不包含超过2个毗连的核苷酸类似物单位，例如LNA单位的区域。
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸包含的至少50％，例如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或例如100％的寡聚物的核碱基单位(优选具有高亲合力)是核苷酸类似物，例如锁定的核酸(LNA)核碱基单位，
下文的表3和4提供了可以被本发明的寡核苷酸方便靶向的短microRNA序列的非限制性实例。
在一个实施方案中，依照本发明的寡核苷酸具有选自由下列基序组成的组的5’-3’走向的核碱基序列：
LxLxxLLxxLL
LxLxLLLxxLL
LxxLxxLxxL
xLxxLxxLxx’每三个’(third)
xxLxxLxxLx’每三个’
xLxLxLxLxL’每两个’(second)
LXLXLXLXL’每两个’
Ld Ld d LLd d LL
LdLdLLLddLLL
LMLMMLLMMLL
LMLMLLLMMLL
LFLFFLLFFLL
LFLFLLLFFLLL
LLLLLL
LLLLLLL
LLLLLLLL
LLLLLLLLL
LLLLLLLLLL
LLLLLLLLLLL
LLLLLLLLLLLL
LMMLMMLMML
MLMMLMMLMM’每三个’
MMLMMLMMLM’每三个’
LFFLFFLFFL’每三个’
FLFFLFFLFF’每三个’
FFLFFLFFLF’每三个’
dLdLdLdLdL’每两个’
LdLdLdLdL’每两个’
MLMLMLMLML’每两个’
LMLMLMLML’每两个’
FLFLFLFLFL’每两个’
LFLFLFLFL’每两个’
Ld Ld d LLd d Ld Ld LL
LdLdLLLddLLLdLL
LMLMMLLMMLMLMLL
LMLMLLLMMLLLMLL
LFLFFLLFFLFLFLL
LFLFLLLFFLLLFLL
LddLddLddL(d)(d)(L)(d)(d)(L)(d)
dLddLddLdd(L)(d)(d)(L)(d)(d)(L)
ddLddLddLd(d)(L)(d)(d)(L)(d)(d)
LMMLMMLMML(M)(M)(L)(M)(M)(L)(M)
MLMMLMMLMM(L)(M)(M)(L)(M)(M)(L)
MMLMMLMMLM(M)(L)(M)(M)(L)(M)(M)
LFFLFFLFFL(F)(F)(L)(F)(F)(L)(F)
FLFFLFFLFF(L)(F)(F)(L)(F)(F)(L)
FFLFFLFFLF(F)(L)(F)(F)(L)(F)(F)
dLdLdLdLdL(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)
LdLdLdLdL(d)(L)(d)(L)(d)(L)(d)(L)
MLMLMLMLML(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)
LMLMLMLML(M)(L)(M)(L)(M)(L)(M)(L)
FLFLFLFLFL(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)
LFLFLFLFL(F)(L)(F)(L)(F)(L)(F)(L)
其中L＝LNA单位，D＝DNA单位，M＝2′MOE RNA，F＝2’氟代，‘x’为此处所限定的形式。对于较长的寡聚物，可以重复上述模式，对于较短的寡聚物，可以从5’末端或3’末端使用上述基序的对应部分，同时任选括号内的残基，这一点是大家能够认识到的。
在一个实施方案中，本发明更进一步地提供了其中所述寡聚物(或毗连核碱基序列)包含至少一个硫代磷酸酯连接，和/或至少一个3’末端LNA单位，和/或至少一个5’末端LNA单位的寡聚物。
蛋白质
本发明更进一步地提供了在外显子7编码的跨膜结合域包含缺失的分离或纯化的可溶形式的TNFα受体，其中所述TNFα受体选自TNFα受体TNFRSF1A或TNFRSF1B，其变体，片段或同系物。
在一个实施方案中，依照本发明的分离或纯化的可溶形式的TNFα受体缺乏外显子7编码的跨膜结合域。
在一个实施方案中，分离或纯化的可溶形式的TNFα受体是人TNFR1TNFα受体(SEQ ID NO 123的残基1-455，残基30-455，其变体，片段或同系物。)，其中所述缺失在残基209和246之间(或相当于SEQ ID No 123的残基209和246的区域)。
在一个实施方案中，分离或纯化的可溶形式的TNFα具有由SEQ ID NO119的残基1-208，残基30-208，其变体，片段或同系物组成的序列。
在一个实施方案中，分离或纯化的可溶形式的TNFα受体是人TNFR2TNFα受体(SEQ ID NO 127的残基1-435，残基23-435，其变体，片段或同系物，其中所述缺失在残基263和289之间(或相当于SEQ ID No 123的残基209和246的区域)。
在一个实施方案中，分离或纯化的可溶形式的TNFα受体具有由SEQ IDNO 127的残基1-262或23-262组成的序列，或者是其变体，片段或同系物。
在一个优选的实施方案中，可溶形式的TNFα受体是分离纯化的。
本发明的一个实施方案是由来源于哺乳动物TNFR基因的cDNA编码的全长或成熟的蛋白质，其中cDNA的外显子6的后面直接连接外显子8，因此缺乏外显子7。此外，蛋白质可以结合TNF，优选TNF-alpha，可以作为TNF，优选TNF-alpha的拮抗剂。与单独的可溶性细胞外域相比，本发明的TNFR优选能够抑制TNF介导的细胞毒性到更大程度，更优选地到与TNFR：Fc相当或超过它的程度。本发明公开的哺乳动物TNFR包括，但不局限于人、灵长类动物、鼠科动物、犬科动物、猫科动物、牛、羊、马和猪TNFR。此外，本发明公开的哺乳动物TNFR包括，但不局限于由一个或多个单核苷酸多态性，例如EP专利申请1,172,444中公开的那些实例产生的蛋白质序列，只要蛋白质保持与用于进行比较的参考序列可比的生物活性就可以。
在一个实施方案中，哺乳动物TNFR是哺乳动物TNFR1，优选人TNFR1。对于人TNFR1，如SEQ ID NO：122所示的包括信号序列的huTNFR1Δ7和缺乏信号序列的成熟huTNFR1Δ7(SEQ ID NO：122的氨基酸30-417)给出了实施方案中的两个非限制性实例。这些huTNFR1Δ7蛋白质的序列是包含信号序列的野生型人TNFR1(SEQ ID No：118)的氨基酸1-208或缺乏信号序列的成熟huTNFR1Δ7的序列，即野生型人TNFR1的氨基酸30-208，两种情况下上述序列都是直接连接野生型人TNFR1的氨基酸247-455。
在另一个优选的实施方案，哺乳动物TNFR是哺乳动物TNFR2，最优选人TNFR2。对于人TNFR2，如SEQ ID NO：126所示的包括信号序列的huTNFR2Δ7或缺乏信号序列的成熟huTNFR2Δ7(SEQ ID NO：126的氨基酸23-435)给出了实施方案中的两个非限制性实例。这些huTNFR2Δ7蛋白质的序列是包含信号序列的野生型人TNFR2(SEQ ID No：120)的氨基酸1-262或缺乏信号序列的成熟huTNFR2Δ7的的序列，即野生型人TNFR2的氨基酸23-262，两种情况下，上述序列后都因为外显子6-8接合点处独特密码子的形成而直接连接氨基酸谷氨酸，外显子6-8接合点的后面连接有野生型人TNFR2的氨基酸290-461。
本发明的蛋白质也包含被化学修饰的那些蛋白质。蛋白质的化学修饰是指其中至少一个氨基酸残基被自然过程，例如加工或其他的翻译后修饰，或者本领域已知的化学修饰方法改变的蛋白质。这种修饰包含，但不局限于乙酰化、酰化、酰胺化、ADP核糖基化、糖基化、甲基化、聚乙二醇化、异戊烯化、磷酸化或偶联胆固醇。
在一个实施方案中，本发明的蛋白质也可以包括本发明的蛋白质的变体、片段和同系物。然而，这种蛋白质在此处解释的外显子7或外显子8编码的氨基酸序列中包含缺失。
核酸
本发明更进一步地提供了编码本发明的TNFα受体的可溶形式的核酸。
在一个实施方案中，核酸选自由下列核酸组成的组：SEQ ID NO 121的核苷酸1-1251，SEQ ID NO 121的88-1251，SEQ ID NO 125的1-1305和SEQID NO 125的67-1305，或者其变体，同系物或片段，包括由于遗传密码的简并性而与该核酸编码相同的原始氨基酸序列的核酸。
本发明的一个实施方案是编码由来源于哺乳动物TNFR基因的cDNA编码的全长或成熟蛋白质的核酸，其中cDNA的外显子6的后面直接连接外显子8，因此缺乏外显子7。
优选以开放阅读框未被内部的非翻译序列或典型地存在于真核基因中的内含子中断的形式提供这种序列。也可以使用包含相关序列的基因组DNA。在一个实施方案中，核酸是mRNA或cDNA。在另一个实施方案中，它是基因组DNA。
在一个实施方案中，哺乳动物TNFR是哺乳动物TNFR1。适合于该实施方案的哺乳动物TNFR1优选是人TNFR1。对于人TNFR1，如SEQ ID NO：122所示的包含信号序列的编码huTNFR1Δ7和缺乏信号序列的成熟huTNFR1Δ7(SEQ ID NO：122的氨基酸30-417)的核酸给出了实施方案中的两个非限制性实例。这些huTNFR1Δ7核酸的序列优选是包含信号序列的SEQ ID NO：121的核苷酸1-1251和缺乏信号序列的SEQ ID NO：121的核苷酸88-1251。这些huTNFR1Δ7核酸的序列是包含信号序列的野生型人TNFR1(SEQ IDNo：117)的核苷酸1-625或野生型人TNFR1的核苷酸88-625，即缺乏信号序列的成熟huTNFR2Δ7，两种情况下上述序列的后面都直接连接野生型人TNFR1的核苷酸740-1368。
在另一个优选的实施方案，哺乳动物TNFR是哺乳动物TNFR2，最优选人TNFR2。对于人TNFR2，如SEQ ID NO：126所示的包含信号序列的编码huTNFR2Δ7或缺乏信号序列的成熟huTNFR2Δ7(SEQ ID NO：126的氨基酸23-435)的核酸给出了实施方案中的两个非限制性实例。这些huTNFR2Δ7核酸的序列优选是包含信号序列的SEQ ID NO：115的核苷酸1-1305和缺乏信号序列的SEQ ID NO：115的核苷酸67-1305。这些huTNFR2Δ7核酸的序列是包含信号序列的野生型人TNFR2(SEQ ID No：119)的核苷酸1-787或野生型人TNFR2的核苷酸67-787，即缺乏信号序列的成熟huTNFR2Δ7，两种情况下上述序列的后面都直接连接野生型人TNFR2的氨基酸866-1386。
本发明的核酸的碱基可以是传统的胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶或胸腺嘧啶脱氧核苷碱基。或者，可以使用修饰的碱基。其他适当的碱基包括，但不限于5-甲基胞嘧啶(MeC)、异胞嘧啶、假胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔尿嘧啶、5-丙炔-6、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、次黄嘌呤核苷、2，6-二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮腺嘌呤(deazaadenine)、7-丙炔-7-去氮鸟嘌呤(deazaguanine)、2-氯(aminoethoxy)-6-氨基嘌呤和9-(氨乙氧)吩恶嗪。
本发明合适的核酸包括许多的选择性化学变化。例如：本发明适当的核酸包括，但不局限于其中至少一个核苷酸间桥接磷酸盐残基是经过修饰的磷酸盐，例如硫代磷酸酯、膦酸甲酯、甲基硫代膦酸酯、phosphoromorpholidate、phosphoropiperazidate和氨基磷酸酯(phosphoroamidate)的核酸。在另一个非限制性例子中，本发明适当的核酸包括那些其中至少一个核苷酸包含2’位置的低级烷基部分(例如，C1-C4，线性的或分支的，饱和或不饱合的烷基，例如甲基、乙基、乙烯基、丙基、1-丙烯基、2-丙烯基和异丙基)的核酸。
本发明的核酸也包括，但不局限于那些其中至少一个核苷酸是核酸类似物的核酸。这种类似物的实例包括，但不局限于己糖醇(HNA)核苷酸、2’O-4’C-连接的二环的呋核亚硝脲(LNA)核苷酸、肽核酸(PNA)类似物、N3’→P5’的氨基磷酸酯类似物、phosphorodiamidate吗啉代核苷酸类似物和它们的组合。
本发明的核酸包括，但不局限于涉及将一个或多个部分或偶联物化学连接到核酸上的核酸修饰。这种部分包括，但不局限于脂质部分，例如胆固醇部分、胆酸、硫醚，例如己基-硫-三苯甲基硫醇(tritylthiol)、硫胆固醇、脂肪链，例如、十二烷基或十一烷基残基、磷脂，例如、二-十六基-rac-甘油或三乙铵、1，2-二-氧-十六烷基-rac-甘油-硫-H-磷酸盐化合物、多胺或聚乙二醇链、金刚烷乙酸、棕榈基部分、十八胺或己氨-羰基-羟胆固醇部分。
表达载体和宿主细胞
本发明也提供了包含本发明的核酸的载体。
在一个实施方案中，载体包含能够驱动所述核酸在宿主细胞中表达的表达盒。
本发明也提供了包含本发明的核酸或载体的宿主细胞。
本发明也提供了制备可溶形式的TNFα受体的方法，所述方法包括在允许所述核酸表达的条件下培养本发明宿主细胞的步骤，以及随后从所述宿主细胞分离所述的可溶形式的TNFα受体的步骤。
本发明提供的表达载体能够扩增或表达编码本发明的哺乳动物TNFR的DNA。本发明也提供了用上述表达载体转化的宿主细胞。表达载体是可复制的DNA构建体，其具有合成的或cDNA衍生的编码哺乳动物TNFR或生物等效类似物的DNA片段，所述DNA片段与来源于哺乳动物、细菌、病毒或昆虫基因的适当的转录或翻译调节元件操作性连接。转录单位通常包含(a)在基因表达中具有调节作用的遗传成分，例如转录启动子或增强子，(b)被转录成mRNA和翻译成蛋白质的结构或编码序列，和(c)适当的转录和翻译起始和终止序列的组合。这种调节元件包括控制转录的操纵序列，编码适当的mRNA核醣体结合部位的序列。可以另外整合通常赋予在宿主细胞中复制能力的复制起点和有助于识别转化体的选择基因。
DNA区域在功能上彼此相关时，可以将它们操作性的连接。例如：如果表达物顺序参与多肽分泌的前体，那么编码信号肽(分泌引导物)的DNA操作性地与编码多肽的DNA连接；如果启动子控制编码序列的转录，那么它就操作性地与编码序列连接；或者如果将核糖体结合部位定位使其允许翻译，那么核糖体结合部位就操作性地与编码序列连接。通常操作性连接意味着邻接，而且对分泌引导物来说，也意味着邻接和位于阅读框内。设计的在酵母表达系统中使用的结构元件优选包括允许宿主细胞将翻译的蛋白质分泌到细胞外的引导序列。换句话说，重组蛋白质的表达没有引导或运输序列，它可以包含N末端甲硫氨酸残基。随后可以任意地从表达的蛋白质上切割该残基以提供终产品。
可以在基本上包含适当宿主微生物，例如细菌，例如大肠杆菌或酵母，例如啤酒酵母的均一的单一培养物的重组表达系统中表达或扩增哺乳动物TNFR DNA，其中所述的重组表达系统已经稳定将重组转录单位整合(通过转化或转染)到染色体DNA上，或者携带有作为固有质粒组分的重组转录单位。此处限定的重组表达系统将组成性地表达或者在与表达的DNA序列或人工基因有联系的调节元件的诱导下表达异种蛋白。
转化的宿主细胞是利用重组DNA技术构建的哺乳动物TNFR载体转化或转染的细胞。转化的宿主细胞通常表达TNFR，但对克隆或扩增TNFR DNA来说，转化的宿主细胞不需要表达TNFR。表达哺乳动物TNFR的适当的宿主细胞包含原核生物、酵母、真菌或高级真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或芽胞杆菌。高级的真核细胞包括，但不局限于已建立的昆虫和哺乳动物细胞系。利用来源于本发明DNA构建体的RNAs，还可以使用没有细胞的翻译系统来生产哺乳动物TNFR。供细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主使用的适当的克隆和表达载体在本领域是公知的。
原核表达宿主可以用来表达不需要广泛蛋白水解作用和二硫化物加工的TNFR。原核表达载体通常包含一个或多个表型的可选择标记物，例如编码赋予抗生素抗性或供给自养需求的蛋白质的基因，以及宿主可以识别的保护在宿主内部扩增的复制起点。转化的适当的原核宿主包括大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌，以及假单胞菌属、链霉菌属和Staphyolococcus属内的不同种细菌，不过也可以使用其他细菌作为选择的宿主。
供细菌使用的有用的表达载体可以包含可选择的标记物和细菌复制起点，其中复制起点来源于包含公知的克隆载体pBR322的遗传成分的可商业获得的质粒(ATCC37017)。这些pBR322″骨架″部分与适当的启动子和要表达的结构序列组合。pBR322包含对氨苄青霉素和四环素具有抗性的基因，因此提供了鉴定转化细胞的简单方式。这种商业载体包括，例如
Figure G2007800535955D00391
ET载体系列(EMD Biosciences，Inc.，Madison，Wis.)。
通常在重组的微生物表达载体中使用的启动子包括乳糖启动子系统、λPL启动子、T7启动子和T7lac启动子。特别有用的细菌表达系统，
Figure G2007800535955D00392
ET系统(EMD Biosciences，Inc.，Madison，Wis.)使用了T7或T7lac启动子和大肠杆菌菌株，例如包含T7RNA聚合酶基因的染色体拷贝的BL21(DE3)。
TNFR蛋白质也可以在酵母和真菌宿主中表达，优选在来自酵母菌种，例如其他属的啤酒酵母中表达，例如也可以使用毕赤氏酵母或克鲁维酵母菌。酵母载体通常包含来自2μ酵母质粒或自主复制序列(ARS)的复制起点、启动子、编码TNFR的DNA、多聚腺苷酸化和终止转录的序列，以及选择基因。酵母载体优选包括允许酵母和大肠杆菌转化的复制起点和可选择的标记物，例如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因、为在色氨酸或尿嘧啶中分别缺乏生长能力的酵母突变株提供可选择标记物的啤酒酵母的TRP1或URA3基因，以及来源于高表达酵母基因的用于诱导下游结构基因转录的启动子。酵母宿主细胞基因组中TRP1或URA3病变的存在为通过分别不存在色氨酸或尿嘧啶时的生长来检测转化提供了有效环境。
酵母载体中适当的启动子序列包括金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶或其他的糖酵解酶，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构化酶、磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶的启动子。在酵母表达中使用的适当载体和启动子在本领域是公知的。
可以使用来自pUC18的用于在大肠杆菌中选择和复制的DNA序列(Ampr基因和复制起点)，以及包含葡萄糖可抑制的ADH2启动子和[α]-因子分泌引导物的酵母DNA序列组装优选的酵母载体。以在启动子和要表达的结构基因之间插入指导异种蛋白质分泌的酵母[α]-因子引导物(leader)。可以修饰引导序列，使其在靠近3’末端的地方包含一个或多个有用的限制性内切酶位点以促进引导序列与外源基因的融合。适当的酵母转化操作方法是本领域熟练技术人员已知的。
用包含ADH2启动子的载体转化的宿主菌株可以生长在由1％酵母抽提物、2％蛋白胨、以及补充有80mg/ml腺嘌呤和80mg/ml尿嘧啶的1％或4％葡萄糖组成的丰富培养基中进行表达。培养基中的葡萄糖一耗尽，ADH2启动子就会发生去阻遏。在更进一步地提纯之前，通过过滤收获粗提的酵母上清液，并保持在4℃。
也可以方便地使用多种哺乳动物或昆虫细胞培养物系统表达TNFR蛋白质。特别优选在哺乳动物细胞中表达重组蛋白质，因为这种蛋白质通常能够正确折叠，适当修饰，并且是完全有功能的。适当的哺乳动物宿主细胞系的实例包括猴肾脏细胞的COS-7系，以及其他能够表达适当载体的细胞系，例如，包括L细胞，例如L929、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可以包含非转录元件，例如复制起点，适当的启动子，例如CMVie启动子、鸡β-肌动蛋白启动子或合成的hEF1-HTLV启动子，与要表达的基因相连的增强子，以及其他5’或3’端侧接的非转录序列，5’或3’端的非翻译序列，例如必需的核糖体结合部位，多腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，以及转录终止序列。在昆虫细胞中生产异种蛋白的杆状病毒系统是本领域技术人员已知的。
可以通过病毒源提供在转化脊椎动物细胞中使用的表达载体的转录和翻译控制序列。例如，通常使用的启动子和增强子来源于多瘤、腺病毒2、猴肾病毒40(SV40)、人巨细胞病毒，例如CMVie启动子、HTLV，例如合成的hEF1-HTLV启动子。来源于SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点，早期和晚期启动子，增强子，剪接和多腺苷酸化位点可以用于提供另一种表达异源DNA序列所需要的遗传成分。
更进一步地，可以使用哺乳动物基因组TNFR启动子，例如控制和/或信号序列，如果这种控制序列与所选择的宿主细胞相容的话。
在本发明的优选方案中，包含TNFR cDNAs的重组表达载体被稳定地整合到宿主细胞的DNA中。
蛋白质表达和纯化：
当使用哺乳动物或昆虫细胞时，适当表达的TNFR蛋白质将被分泌到细胞外培养基中。利用标准的生物化学技术从培养基中回收蛋白质，并进行浓缩和纯化。在哺乳动物细胞中通过慢病毒(lentiviral)转导、AAV转导、质粒转染或任何类似的程序进行表达后，或者在昆虫细胞中通过杆状病毒转导进行表达后，利用具有合适的滤过分子量的浓缩过滤器，例如
Figure G2007800535955D00411
过滤单元浓缩这些细胞的细胞外培养基，为了避免TNFR蛋白质的损失，过滤器应允许等于或低于50kDal的蛋白质流过。
当在细菌培养物中表达TNFR蛋白质时，可以通过标准生物化学技术进行纯化。溶解细菌，除去包含TNFR的细胞提取物中的盐分并使其浓缩。
在两种情况下都优选通过亲和层析法纯化TNFR蛋白质。优选使用具有包含TNF-α的亲合基质的柱层析。换句话说，亲合力纯化标记可以被添加到TNFR蛋白质的N或C末端。例如：聚组氨酸标记(His-标记)可以用于实现这一目的，其中聚组氨酸标记是具有至少六个组氨酸的氨基酸基序(Hengen，P.，1995，Trends Biochem.Sci.20：285-86)。通过框内添加将编码His-标记的核苷酸序列直接添加到表达载体中的TNFR开放阅读框的5’或3’端可以实现His-标记的添加。SEQ ID NO：126中给出了这样一种适合于添加羧基末端His标记的核苷酸序列。当His标记被整合到蛋白质中时，使用镍或钴亲和层析柱来纯化标记的TNFR，然后可以任意地将His标记切割下来。其他适当的亲合纯化标记和具有这种标记的蛋白质的提纯方法是本领域公知的。
或者，可以使用基于非亲合力的纯化方案，包括在基于大小(分子筛色谱)、电荷(阴离子和阳离子交换色谱法)和疏水性(反相色谱法)的一系列柱上分级分离TNFR提取物。高效液相色谱法可用于简化这些步骤。
表达和纯化TNFR蛋白质的其他方法是本领域公知的(参见，例如，Jacobs的美国专利No.5,605,690)。
定义
术语″核苷酸间连接基团″被用来指能够将两个核碱基共价连接在一起的基团，例如，DNA单位之间、DNA单位和核苷酸类似物之间、两个非LNA单位之间、非LNA单位和LNA单位之间、两个LNA单位之间的基团等等。优选的实例包括磷酸盐、磷酸二酯基团和硫代磷酸酯基团。
此处，使用的术语″含氮碱基″(nitrogenous base)包括嘌呤和嘧啶，例如DNA核碱基A、C、T和G，RNA核碱基A、C、U和G，以及非DNA/RNA核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(MeC)、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔尿嘧啶、5-丙炔-6-氟尿嘧啶、5-甲基噻唑尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、次黄嘌呤核苷、2，6-二氨基嘌呤、7-丙炔-7-去氮腺嘌呤(deazaadenine)、7-丙炔-7-去氮鸟嘌呤(deazaguanine)和2-氯6-氨基嘌呤，特别是MeC。应理解非DNA/RNA核碱基的实际选择将取决于寡核苷酸用来靶向的小RNA链中存在的对应(或匹配)核苷酸。例如，如果对应的核苷酸是G，选择能够与G建立氢键的非DNA/RNA核碱基通常是必需的。在这种具体情况下，对应核苷酸是G时，优选的非DNA/RNA核碱基的典型实例为MeC。
这里使用的术语″肿瘤坏死因子受体″、″TNF受体″和″TNFR″指具有天然哺乳动物TNF受体序列的氨基酸序列的蛋白质或基本上与天然哺乳动物TNF受体序列相似的蛋白质，它能够结合TNF分子。在上下文中，这种受体的″天然″受体或基因指天然存在的受体或基因，以及这种受体和基因天然存在的等位基因变化。
与TNFR结合使用的术语″成熟″指以缺乏可能存在于天然基因的全长转录产物中的引导序列或信号序列的形式表达的蛋白质。
这里使用的TNFR蛋白质的命名法遵循蛋白质的命名(例如TNFR2)放在种类命名，例如hu(适合于人)或mu(适合于鼠科动物)之前，后面是Δ(指缺失)和删除的外显子的数目的惯例。例如：huTNFR2Δ7指缺乏外显子7的人TNFR2。缺少任何物种指定时，TNFR从种属上来说是指哺乳动物TNFR。
术语″分泌的″指蛋白质是可溶的，也就是说，它不与细胞膜结合。在上下文中，如果利用本领域技术人员已知的常规试验，在不与膜相关联的组分，例如细胞上清液或血清中可以检测到大部分的某种形式，那么这种形式就是可溶性的。
术语″稳定的″是指利用本领域技术人员已知的常规试验，例如western印迹、ELISA试验在收获的细胞、细胞上清液或血清中可以检测到的分泌形式的TNFR。
这里使用的术语″肿瘤坏死因子″和″TNF″指结合TNF受体的天然发生的蛋白质配体。TNF包括，但不局限于TNF-α和TNF-β。
这里使用的术语″炎性疾病或状态″指至少部分由TNF与其受体结合引起，或者因为这种结合而加重的疾病、紊乱或其他的医学状况。这种疾病或状态包括，但不局限于与升高的TNF水平、升高的TNF受体水平、增强的致敏性或对应信号路径的失调有关的那些疾病。该术语也包括其中已知的TNF拮抗剂已经显示有用的疾病和状态。炎性疾病或状态包括，但不局限于类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、炎性肠病(包括Crohn氏病和溃疡性结肠炎)、肝炎、败血症、酒精性肝病和非酒精性脂肪变性。
这里使用的术语″肝炎″指以至少部分肝脏发炎为特征的胃肠疾病、状态或紊乱。肝炎的实例包括，但不局限于与甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒有关的肝炎，或者与局部缺血/再灌注有关的肝脏炎症。
这里使用的术语″TNF拮抗剂″指利用本领域公知的标准试验测量时，能够可测量性地抑制TNF介导的细胞毒性的蛋白质(例如参见下文实施例中描述的L929细胞毒性试验)。
术语″结合TNF″指通过本领域众所周知的标准结合试验测定时，蛋白质可以结合可检测水平的TNF，优选TNF-α(参见，例如Smith的美国专利No.5,945,397的16-17栏)。在使用标准的结合测试实验时，本发明的每纳摩尔受体优选能够结合大于0.1纳摩尔的TNF-alpha，更优选能结合大于0.5纳摩尔的TNF-α。
这里使用的术语″调节元件″指涉及分子相互作用的有助于核酸功能调节，包括但不限于核酸复制、复制、转录、剪接、翻译或降解调节的核苷酸序列。在自然界中，调节可以是增强或抑制。本领域已知的调节元件包括，例如翻译调节序列，例如启动子和增强子。启动子是在一定条件下，能帮助通常位于启动子下游(3’方向)的编码区域开始转录的DNA区域。表达载体典型地包含与本发明的核酸操作性连接的这种调节元件。
术语″寡聚物″、″剪接转换寡聚物″和″寡核苷酸″在此处可交换使用。
这里使用的术语″操作性连接″指遗传元件的并置，其中元件的关系允许它们以预期方式发生作用。例如，如果启动子帮助编码序列开始转录，那么启动子与编码区域就是操作性连接的(例如在表达载体中)。只要维持了这种功能关系，就可以在启动子和编码区域之间插入残基。
这里使用的术语″转化″或″转染″指将外源核酸插入细胞，不考虑插入所使用的方法，例如脂转染、转导、感染或电穿孔。外源核酸可以保持在非整合载体，例如质粒中，或者可以整合到细胞基因组中。
这里使用的术语″载体″指能运输另一个核酸到已经被连接的分子上的核酸分子。一种载体是″质粒″，指附加的DNA序列可以连接到其中的环状双链DNA环。另一种载体是病毒载体，其中附加的DNA部分可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在将它们引入其中的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)被引入宿主细胞时，会整合到宿主细胞的基因组中，因此能够随宿主基因组一起复制。此外，某些载体、表达载体能够指导与它们操作性连接的基因的表达。通常，在重组DNA技术中使用的表达载体经常是质粒或病毒载体形式(例如，反转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒)。
这里使用的术语″分离的蛋白质″指非天然发生的蛋白质或多肽，或者从与其天然有关的一种或多种组分中分离的蛋白质或多肽。
这里使用的术语″分离的核酸″指非天然发生的核酸，和/或处于分离片段形式或作为较大的构建体的组分的核酸，其中所述的片段或组分来源于至少分离一次的基本上纯的核酸，即没有污染的内源性原料，而且其数量或浓度允许通过标准生物化学方法，例如使用克隆载体的方法鉴别和操作。
这里使用的术语″纯化的蛋白质″指基本上没有其他蛋白质存在的蛋白质。然而，这种纯化的蛋白质可以包含作为稳定剂、载体、赋形剂或共同治疗剂添加的其他蛋白质。这里使用的术语″纯化的″优选指占存在的蛋白质的干重的至少50％，例如至少80％，更优选占存在的蛋白质的重量的95-99％，最优选99.8％，其中存在的蛋白质排除了作为稳定剂、载体、赋形剂或共同治疗剂添加的蛋白质。
这里使用的术语″改变前信使RNA的剪接″指改变细胞前信使RNA靶的剪接，导致剪接产品的比率改变。可以通过本领域技术人员公知的多种技术检测这种剪接改变。例如，总细胞RNA的RT-PCR可用于检测存在和缺少SSO时的剪接产物的比率。
这里使用的术语″互补的″用来指互补性如此充分或配对如此精确以致寡核苷酸和包含靶序列的DNA或RNA之间发生了稳定和特异性的结合。应理解在本领域，寡核苷酸序列不必与靶序列100％互补。例如，对于SSO来说，在允许剪接的情况下，如果存在充分的互补性，就会发生与靶的结合，而且会避免非特异性结合。然而，优选与靶序列(例如这里提到的SEQ ID NO1-4的区域)完全互补(即完全)的寡核苷酸或毗连核碱基序列。
在寡核苷酸的上下文中使用的术语″相当于″和″相当″指本发明的化合物的核碱基和其反向互补序列之间的比较，在一个实施方案中指核碱基序列和同等的(相同的)核碱基序列之间，或者它们的互补序列之间的比较，其中同等的(相同的)核碱基序列可以包含，例如其他的核碱基，但保持相同的碱基序列。核苷酸类似物可以直接地与它们的同等物或对应的自然核苷酸进行比较。与一条序列形成反向互补的序列被称为该序列的互补序列。
当提到这里涉及的核苷酸分子的长度时，长度相当于单体单位，即核碱基的数目，不考虑那些单体单位是核苷酸还是核苷酸类似物。就核碱基而言，术语单体和单位在此处可交换使用。
应理解，当在比值或数值范围的上下文中使用术语″大约″时，读出的公开内容应包括提到的比值或范围。
此处在蛋白质或多肽(序列)的上下文中使用的术语″变体″指通过在原始(亲本)多肽中插入、缺失或替换一个或多个氨基酸，即至少一个氨基酸，但优选少于50个氨基酸，例如少于40，少于30，少于20或少于10个氨基酸，例如1个氨基酸，1-2个氨基酸，1-3个氨基酸，1-4个氨基酸，1-5个氨基酸，从所述多肽制备的多肽，或者利用来自所述多肽的序列信息制备的多肽。
此处在蛋白质或多肽(序列)的上下文中使用的术语″同系物″指与所述多肽序列至少70％同源，例如至少80％同源，例如至少85％同源或至少90％同源，例如至少95％，96％，97％，98％或99％同源的多肽。可以利用Blosum62算法，用ClustalW比对算法确定两个多肽之间的同源性，其中缺口程度(Gap Extent)＝0.5，缺口开放(Gap open)＝10(参见，http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html)。比对在一个实施方案中可以是局部比对(水)，或者在分开的另一个实施方案可以是整体比对(针))。因为此处提到的外显子缺失的TNFR蛋白质的同系物包括各自外显子中的缺失，因此更优选整体比对。
此处在蛋白质或多肽(序列)的上下文中使用的术语″片段″指只由多肽序列的一部分组成的多肽。因此片段可以包含所述多肽序列的至少5％，例如所述多肽序列的至少10％，包括至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％。
上述变体、片段和同系物的定义也适合核酸序列，但同源性算法使用的是DNAfull。显而易见地是，当提到核酸变体、片段或同系物时，术语蛋白质、多肽和氨基酸应相应地替换为核酸、多核苷酸或核碱基/核苷酸。
这里使用的术语″膜结合形式″或″整体膜形式″指具有跨越细胞膜的氨基酸序列的蛋白质，氨基酸序列在膜的两边。
这里使用的术语″稳定分泌的配体结合形式″或有时所称的″稳定可溶的配体结合形式″(此处术语″分泌″和″可溶的″是同义词，而且可以交换使用)指通过被分泌，保持稳定以及仍然能结合对应的配体而与天然膜结合形式的受体相关的蛋白质。应注意这些形式不是由这种分泌形式是否具有生理活性限定的，只要这种剪接变体产物在产生时是被分泌的，稳定的，而且仍能结合配体就可以。
术语″分泌的″指可溶形式，也就是说，它不再与细胞膜结合。在上下文中，如果利用本领域技术人员已知的常规试验发现一种形式是可溶的，那么就可以在不与膜关联的部分，例如细胞上清液或血清中检测到大部分这种形式。
术语″稳定的″指本领域技术人员利用常规试验可检测的分泌形式。例如，蛋白质印迹、ELISA试验可用于检测收获的细胞，细胞上清液或病人血清中的这种形式。
术语″结合配体″指所述形式虽然未必保持了对应整体膜形式的全部特异性配体结合活性，但至少保持了一些显著水平的特异性配体结合活性。
这里使用的术语″降低配体的活性″指导致由配体结合或与受体的相互作用产生的胞内信号传输下降的任何作用。例如，配体与它的受体的可溶形式的结合或者降低有效结合配体的膜形式的受体的数量可以降低活性。
药物组合物和制剂
本发明其他的实施方案涉及包含本发明的寡聚物、蛋白质和核酸的药物组合物。
本发明的寡聚物、核酸和蛋白质可以通过掺合，包封，共轭结合或其他方式联合到其他分子，分子结构或化合物的混合物中，具体实例有有助于摄取，分布和/或吸收的脂质体，受体靶分子，口服剂型，直肠给药剂型，局部给药剂型或其他剂型。
本发明的剂型包含在生理上或药学上可接受的载体，例如水性载体中的本发明的寡聚物、核酸或蛋白质。因此本发明使用的剂型包括，但不局限于那些适合于肠胃外给药的剂型，包括关节内、腹膜内、静脉内、动脉内、皮下，肌肉注射或输注的剂型，以及那些适合于局部给药、眼用、经阴道，口服、经直肠或肺给药的剂型，包括粉末或气雾剂的吸入或吹入，包括通过喷雾器、气管内和鼻内递送的剂型。所述制剂可以方便地以单位制剂形式存在，也可以通过本领域公知的任何方法制备。在任何给定的情况下，最适当的给药途径取决于受试者待治疗的状态的性质和严重程度，以及使用的特殊活性化合物。
本发明的药物组合物包括，但不局限于其生理上和药学上可接受的盐，即保持母体化合物想要的生物活性，此外还不产生不希望有的毒性作用的盐。这种盐的实例有(a)用阳离子，例如钠、钾、铵、镁、钙、多胺，例如精胺和亚精胺等等形成的盐；(b)用无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等等形成的酸加成盐；(c)用有机酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、丁二酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、安息香酸、丹宁酸、棕榈酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、p-甲苯磺酸、萘二磺酸(naphthalene disulfonic acid)、多聚半乳糖醛酸等等形成的盐。
本发明提供了利用上述的寡聚物、蛋白质和核酸制备用于治疗患有下文讨论的涉及TNF活性过强的炎性病症的病人的药物制剂的用途。在制造依照本发明的药物时，本发明的寡聚物、核酸和蛋白质典型地与其它的可接受的载体混合。当然，载体必须是可接受的，也就是与剂型中的任何其他成分相容，而且必须对病人没有害处。载体可以是固体或液体。本发明的寡聚物、核酸和蛋白质被掺入到通过任何基本上由混合组分组成的公知制药技术制备的本发明的制剂中，其中所述制剂任意地包括一种或多种附加的治疗成分。
本发明的制剂包括活性化合物的无菌的水性和非水性注射溶液，这种制剂优选与预期的接受者的血液等渗，而且基本上无热原。这些制剂可以包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂，以及使制剂与预期的接受者的血液等渗的溶质。水性和非水性的无菌的悬浮液可以包括，但不局限于悬浮剂和增稠剂。制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和管形瓶中，而且可以保存在只需要使用之前立即添加无菌液体载体，例如盐水或注射用水的冻干条件下。
在该制剂中，本发明的寡聚物、核酸和蛋白质可以包含在粒子或囊，例如适合于肠胃外给药的脂质体或微晶内。粒子可以是任何适当结构，例如单层或多层的粒子，只要本发明的寡聚物、核酸和蛋白质包含在其中就可以。这种粒子和囊特别优选带正电荷的脂质，例如N-[1-(2，3-dioleoyloxy)丙基]-N，N，N-三甲基-ammoniummethylsulfate或″DOTAP″。这种脂质粒子的制备是公知的(参见参考文献美国专利No.5,976,879的第6栏)。
因此，本发明的一个实施方案涉及通过施用稳定分泌的配体结合形式的TNF受体降低该受体的TNF活性，从而治疗炎性疾病或状态的方法。在另一个实施方案中，本发明涉及通过施用编码稳定分泌的配体结合形式的TNF受体的寡核苷酸降低该受体的TNF活性，从而治疗炎性疾病或状态的方法。在另一个实施方案中，本发明涉及生产稳定分泌的配体结合形式的TNF受体的方法。
下文讨论的本发明的以下方面可应用到上述的实施方案中。
本发明的方法、核酸、蛋白质和剂型也是有用的体外或体内工具。
本发明的实施方案可用于治疗执业医生打算限制TNF作用或TNF活化的信号路径的任何状态。特别是，本发明可用于治疗炎性疾病。在一个实施方案中，所述状态是炎性系统性疾病，例如类风湿性关节炎或牛皮癣关节炎。在另一个实施方案中，所述疾病是炎性肝病。炎性肝病的实例包括，但不局限于与甲型、乙型或丙型肝炎病毒有关的肝炎，酒精性肝病和非酒精性脂肪变性。在另一个实施方案中，炎性疾病是皮肤疾病，例如牛皮癣。
本发明的用途包括，但不局限于治疗已知的TNF拮抗剂已经显示有用的疾病。三个具体的TNF拮抗剂目前已被FDA批准。这些药物是etanercept
Figure G2007800535955D00481
infliximab
Figure G2007800535955D00482
和adalimumab
Figure G2007800535955D00483
这些药物中的一个或多个已被批准用于治疗类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎和炎性肠病(Crohn氏病或溃疡性结肠炎)。
利用蛋白质治疗炎性疾病：
本发明的一个实施方案涉及通过给病人施用SSOs治疗炎性疾病或状态的方法，所施用的SSOs能改变前信使RNA的剪接以产生编码稳定分泌的配体结合形式的TNFR超家族受体的剪接变体，因此能降低该配体对那种受体的活性。在另一个实施方案中，本发明涉及通过给细胞施用SSOs在细胞中生产稳定分泌的配体结合形式的TNFR超家族受体的方法。
在用于治疗用途时，将本发明的纯化的TNFR蛋白质施用给患者，优选施用给人，以治疗依赖TNF的炎性疾病，例如关节炎。在对人进行治疗时，优选使用huTNFRs。可以通过弹丸注射、毗连输注、从植入物持续释放或其他适当的技术施用本发明的TNFR蛋白质。典型地，以包含纯化蛋白质和生理上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物的形式施用TNFR治疗蛋白质。所使用的这种载体的剂量和浓度对接受者无毒性。通常，这种组合物的制备需要将TNFR与缓冲液，抗氧化剂，例如抗坏血酸，多肽，蛋白质，氨基酸，包括葡萄糖，蔗糖或糊精的糖类，如EDTA的螯合剂，谷胱甘肽及其他稳定剂和赋形剂组合。作为示例的适当稀释剂有与同种血清白蛋白混合的中性缓冲盐水或盐水。优选利用适当的赋形剂溶液，例如作为稀释剂的蔗糖将产物配制成冻干剂。也可以添加防腐剂，例如苯甲醇。当然，给药的数量和频率将取决于这种因子的性质，待治疗适应症的严重性，期望的反应，病人的状态等等。
系统施用的本发明的TNFR蛋白质的治疗有效量的优选范围为0.1mg/kg/周到大约100mg/kg/周。在优选的实施方案中，施用的TNFR的量为大约0.5mg/kg/周到大约50mg/kg/周。局部应用时，优选剂量为每次注射大约0.01mg/kg到大约1.0mg/kg。
利用表达载体升高哺乳动物中TNF拮抗剂的水平
本发明提供了升高哺乳动物中TNF拮抗剂水平的方法。该方法包括用此处描述的表达载体转化哺乳动物细胞的步骤，其中表达载体驱动此处描述的TNFR的表达。该方法对大型哺乳动物，例如家庭宠物，用于生产食物的哺乳动物和灵长类动物特别有用。大型哺乳动物的实例有狗，猫、马、奶牛、羊、鹿和猪。灵长类动物的实例有猴、猿和人。
可以在体内或体外转化哺乳动物细胞。当在体内转化时，表达载体被直接施用，例如通过注射施用给哺乳动物。在体内转化细胞的方式在本领域是公知的。当在体外转化时，先从哺乳动物获取细胞，在体外进行转化，然后将转化的细胞再移植到哺乳动物中。
本发明的用途包括，但不局限于治疗已知的TNF拮抗剂已经显示有用的疾病。三个具体的TNF拮抗剂目前已被FDA批准。这些药物是etanercept
Figure G2007800535955D00501
infliximab
Figure G2007800535955D00502
和adalimumab
Figure G2007800535955D00503
这些药物中的一个或多个已被批准用于治疗类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎和炎性肠病(Crohn氏病或溃疡性结肠炎)。
利用开发的适合ASON的步骤可以完成给受试者施用SSO的过程。通过静脉内施用已经成功地将盐水中的ASON以高达6mg/kg的剂量施用给了实验动物和受试验的人，每周施用三次(Yacysyhn，B.R.，et al，2002，Gut 51：30(治疗Crohn氏病的抗ICAM-1ASON)；Stevenson，J.，et al.，1999，J.ClinicalOncology 17：2227(靶向PBMC的抗RAF-1ASON))。已经报告靶向于TNF-α的2’o-MOE硫代磷酸酯ASON的药物动力学(Geary，R.S.，et al.，2003，DrugMetabolism and Disposition 31：1419)。也已经报告了混合的LNA/DNA分子的系统有效性(Fluiter，K.，et al.，2003，Nucleic Acids Res.31：953)。
利用2’O-MOE硫代磷酸酯和PNA化学作用调查了SSO在小鼠模型系统中的全身活性。在除脑、胃和真皮外的所有被研究的组织中观察到了显著活性(Sazani，P.，et al.，2002，Nature Biotechnology 20，1228)。
通常，在传统反义治疗中有用的任何施药方法都可以用来施用本发明的SSO。为了在培养细胞中测试SSO，可以使用已经开发的测试ASON或SSO的任何技术。
本发明的剂型包含在生理上或药学上可接受的载体，例如水性载体中的SSOs。因此本发明使用的剂型包括，但不局限于那些适合于肠胃外给药的剂型，包括腹膜内、关节内、静脉内、动脉内、皮下，肌肉注射或输注的剂型，以及那些适合于局部给药、眼用、经阴道，口服、经直肠或肺(包括粉末或气雾剂的吸入或吹入，包括通过喷雾器、气管内和鼻内递送)施用的剂型。所述制剂可以方便地以单位制剂形式存在，也可以通过本领域公知的任何方法制备。在任何给定的情况下，最适当的给药途径取决于受试者待治疗的状态的性质和严重程度，以及使用的特殊活性化合物。
本发明的药物组合物包括，但不局限于其生理上和药学上可接受的盐，即保持母体化合物想要的生物活性，此外还不产生不希望有的毒性作用的盐。这种盐的实例有(a)用阳离子，例如钠、钾、铵、镁、钙、多胺，例如精胺和亚精胺等等形成的盐；(b)用无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等等形成的酸加成盐(acid addition salts)；(c)用有机酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、丁二酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、安息香酸、丹宁酸、棕榈酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、p-甲苯磺酸、萘二磺酸、多聚半乳糖醛酸等等形成的盐。
本发明提供了利用具有上述特征的SSOs制备用于在受炎性紊乱折磨的病人体内增加缺乏外显子7的哺乳动物TNFR2蛋白质/它对应的膜结合形式的比率的药物的用途，其中炎性紊乱涉及上文讨论的TNF-alpha。在制造依照本发明的药物时，SSOs典型地与可接受的载体混合。当然，载体必须是可接受的，也就是与剂型中的任何其他成分相容，而且必须对病人没有害处。载体可以是固体或液体。SSOs被掺入到通过任何基本上由混合组分组成的公知制药技术制备的本发明的制剂中，其中所述制剂任意地包括一种或多种附加的治疗成分。
本发明的制剂包括活性化合物的无菌的水性和非水性注射溶液，这种制剂优选与预期的接受者的血液等渗，而且基本上无热原。这些制剂可以包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂，以及使制剂与预期的接受者的血液等渗的溶质。水性和非水性的无菌的悬浮液可以包括，但不局限于悬浮剂和增稠剂。制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和管形瓶中，而且可以保存在只需要使用之前立即添加无菌液体载体，例如盐水或注射用水的冻干条件下。
在该制剂中，SSOs可以包含在粒子或囊，例如适合于肠胃外给药的脂质体或微晶内。粒子可以是任何适当结构，例如单层或多层的粒子，只要SSOs包含在其中就可以。这种粒子和囊特别优选带正电荷的脂质，例如N-[1-(2，3-dioleoyloxy)丙基]-N，N，N-三甲基-ammoniummethylsulfate或″DOTAP″。这种脂质粒子的制备是公知的(参见参考文献美国专利No.5,976,879的第6栏)。
SSO可以靶向调节剪接的任何元件或元件组合，包括3’剪接位点，5’剪接位点，分支点，多聚嘧啶区域，外显子剪接增强子，外显子剪接沉默子，内含子剪接增强子，内含子剪接沉默子。
本领域熟练技术人员可以理解，可以利用具有与包含外显子7和它的邻近内含子的TNFR1或TNFR2基因部分的至少8个核苷酸，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，优选10-16个核苷酸互补的序列的SSO实施靶向人TNF TNFR2的本发明。
SEQ ID NO：3包含TNFR2的外显子7的序列和侧接内含子的50个相邻核苷酸。例如，靶向人TNFR2的SSO可以具有选自表4列出的序列的核碱基序列。当使用增强亲合力的修饰，包括但不局限于LNA或g-clamp核苷酸时，本领域技术人员将会认识到SSO的长度可以相应地降低。
本领域熟练技术人员也承认SSO序列的选择必须要考虑避免自身互补的SSO，其中自身互补可能导致部分″发夹″双链结构的形成。另外，应避免高GC含量以将非特异性碱基配对的可能性降到最低程度。此外，也应该避免使用通过BLAST显示的与off-target基因配对的SSOs。
在一些情况下，选择靶向人和至少一个其他物种的SSO序列是优选的。开始在人类中使用之前，可在所述的其他物种中用这些SSOs测试和优化本发明，因此有助于调整报批和药物开发目的。例如，靶向人TNFR2的SEQ IDNos：14，30，46，70和71也与对应的Mullata猕猴序列100％互补。因此，在用于人类以前，可以先在猴子体内用这些序列进行实验治疗。
下文讨论的本发明的以下方面可应用到上述的实施方案中。
SSO的长度与反义寡核苷酸(ASON)相似，典型地在大约10-24个核苷酸之间。可以利用SSOs具有的与RNA杂交，但不象常规的反义2r-脱氧寡核苷酸那样活化RNAse H引起的RNA破坏作用的几种化学性质来实施本发明。可以利用2’O修饰的核酸寡聚物，例如2’氧-甲基或2’氧-甲氧乙基硫代磷酸酯实施本发明。核碱基不必连接到糖上；可以使用被称为肽核酸寡聚物或基于吗啉的寡聚物。在Sazani，p.et al.，2001，nucleic acids res.29：3695中发现了对这些不同的化学连接过程的比较。术语剪接转换寡核苷酸预计包括上述形式。本领域技术人员能够理解反义寡核苷酸gapmers和SSOs之间的关系。Gapmers是包含RNAse H活化区域(典型地为2’-脱氧核糖核苷硫代磷酸酯)的ASON，其中活化区域与不活化的核酸酶抵抗寡聚物侧接。通常，在SSO中可以使用适合于gapmerASON中的侧接序列的任何化学过程。
通过公知的固相合成技术可以制备本发明的SSOs。可以另外使用或替换使用其他的任何适合这种合成的工具。已经公知可利用类似的方法制备寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基衍生物。
锁定的核酸(LNA)提供了特别优选的化学过程(Koshkin，A.A.，et al.，1998，Tetrahedron 54：3607；Obika，S.，et al.，1998，Tetrahedron Lett.39：5401)。LNA是常规的磷酸二酯连接的核糖核苷酸，除了呋核亚硝脲部分是2’O和4’C之间的桥接形成二环外。这种桥接强制呋核亚硝脲环构象变成寡核苷酸与互补RNA杂交时所采用的V-桥(endo)构象。WO03/095467种描述了合成LNA的最新进展。大多数典型的桥是亚甲基或乙烯基。Morita，et al.，2003，Bioorg.and Med.Chem.11：2211中描述了2’O，4’C-乙烯-桥接核酸(ENA)和其他LNA的合成。然而，可以使用可替换的化学过程，用2’N取代2’O。LNA和常规的核苷酸可以混合形成嵌合的SSO。例如，可以使用交替的LNA和2’脱氧核苷酸或交替的LNA和2’O-Me或2’O-MOE形成的嵌合的SSO。这些化学过程的任何替换方式，不仅仅是2’-脱氧核苷酸，都可以是替换磷酸二酯的phosphorothioatediester连接。在体内使用时，优选硫代磷酸酯连接。
当在SSO中使用LNA核苷酸时，也存在非LNA核苷酸的情形是优选的。LNA核苷酸在有非常明显的非特异性结合的杂交中具有如此高的亲合力，以至于可以降低游离SSO的有效浓度。当使用LNA核苷酸时，也可以用2′脱氧核苷酸方便地替换它们。可以使用交替的核苷酸，交替的二核苷酸或混合型，例如LDLDLD或或LDDLDD。当2’-脱氧核苷酸或2’-脱氧核苷硫代磷酸酯与LNA核苷酸混合时，避免RNase H活化很重要。预计SSO的LNA核苷酸在大约三分之一和三分之二之间比较合适。例如，如果SSO是12聚体，那么将存在至少四个LNA核苷酸和四个常规核苷酸。
SSO的碱基可以是传统的胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶或胸腺嘧啶脱氧核苷。或者，也可以使用修饰的碱基。特别有价值的是结合亲合力增加的修饰碱基。优选的修饰碱基的一个非限制性例子是被称为G-clamp或9-(氨基乙氧基)吩恶嗪的核苷酸、与鸟嘌呤核苷形成4个氢键的胞嘧啶类似物(Flanagan，W.M.，et al.，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.96：3513；Holmes，S.C，2003，Nucleic Acids Res.31：2759)。
可以利用不活化RNase H的多种可选择的化学过程。例如：适当的SSOs可能是其中至少一个或全部核苷酸间桥接磷酸盐残基是经过修饰的磷酸盐，例如膦酸甲酯、甲基硫代膦酸酯、phosphoromorpholidates、phosphoropiperazidates和氨基磷酸酯(phosphoroamidates)的寡核苷酸。例如：依照所描述的内容可以每隔一个地修饰核苷酸间桥接的磷酸盐残基。在另一个非限制性例子中，这种SSO是其中至少一个或全部核苷酸包含2’位置的低级烷基部分(例如，C1-C4，线性的或分支的，饱和或不饱合的低级烷基，例如甲基、乙基、乙烯基、丙基、1-丙烯基、2-丙烯基核异丙基)的寡核苷酸。例如，依照所描述的内容可以每隔一个地修饰核苷酸。[参见美国专利5,976,879的第4栏]。
SSO的长度(即寡聚物中单体的数目)为大约10-大约30个碱基。在一个实施方案中，20个碱基的2’O-Me-核糖核苷硫代磷酸酯是有效的。本领域熟练技术人员应理解当使用增加亲合力的化学修饰时，SSO可以短些，但仍然保持特异性。本领域熟练技术人员应该能更进一步地理解SSO长度的上限是通过保持特异性识别靶序列，避免二级结构形成SSO的自身杂交，以及获取进入细胞的限制来限定的。这些限制意味着长度增加(超过依赖于SSO亲合力的一定长度)的SSO经常被发现是特异性较低、没有活性或活性很差的SSO。
本发明的SSOs包括，但不局限于涉及通过化学连接将增强SSO活性、细胞分布或细胞吸收的一个或多个部分或偶联物连接到SSO上的SSO修饰。这种部分包括，但不局限于脂质部分，例如胆固醇部分、胆酸、硫醚，例如己基-硫-三苯甲基硫醇(tritylthiol)、硫胆固醇、脂肪链，例如、十二烷基或十一烷基残基、磷脂，例如、二-十六基-rac-甘油或三乙铵-1，2-二-氧-十六烷基-rac-甘油基-3-氢-磷酸盐化合物、多胺或聚乙二醇链、金刚烷乙酸、棕榈基部分、十八胺或己氨-羰基-羟胆固醇部分。
不必均匀地改变给定SSO中的所有位置，实际上可以在单个化合物，乃至SSOs内部的单个核苷中引入一种以上的上述修饰。SSOs可以与其他分子、分子结构或化合物的混合物混合、包封、偶联在一起，或者与它们有关联，例如，形成有助于吸收、分布和/或吸收的脂质体、受体靶向的分子，口服剂型、直肠给药剂型、局部给药剂型或其他剂型。
本领域熟练技术人员应理解细胞分化包括，但不局限于剪接体的分化。因此，本发明的任何特殊SSO的活性取决于将其引入其中的细胞类型。例如，在一种细胞类型中有效的SSOs在另一种细胞类型中可能是无效的。
本发明的方法、寡核苷酸和剂型也是有用的调查人或动物基因剪接的体外或体内工具。通过此处描述的步骤或本领域技术人员熟知的所述步骤的修饰可以实施这种方法。
本发明可用于治疗执业医生打算限制TNF超家族配体作用或这种配体活化的信号路径的任何状态。特别是，本发明可用于治疗炎性疾病。在一个实施方案中，所述状态是炎性系统性疾病，例如类风湿性关节炎或牛皮癣关节炎。在另一个实施方案中，所述疾病是炎性肝病。炎性肝病的实例包括，但不局限于与甲型、乙型或丙型肝炎病毒有关的肝炎，酒精性肝病和非酒精性脂肪变性。在另一个实施方案中，炎性疾病是皮肤疾病，例如牛皮癣。
本发明的用途包括，但不局限于治疗已知的TNF拮抗剂已经显示有用的疾病。三个具体的TNF拮抗剂目前已被FDA批准。这些药物是etanercept
Figure G2007800535955D00551
infliximab和adalimumab
Figure G2007800535955D00553
这些药物中的一个或多个已被批准用于治疗类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎和炎性肠病(Crohn氏病或溃疡性结肠炎)。
在优选的实施方案中，受体是TNFR1或TNFR2受体。在其他的实施方案中，受体是与TNFR1和TNFR2充分同源的TNFR超家族的成员，例如TNFRSF3、TNFRSF5或TNFRSFI IA，这样与外显子7和8同源的两个外显子中的一个或两个缺失都会产生分泌形式的受体。本领域熟练技术人员应理解，本发明的可操作性不取决于这种分泌形式是否是有生理活性的，只要这种剪接变体的产物是分泌的、稳定的，且能结合配体就可以。
利用开发的适合ASON的步骤可以完成给受试者施用SSO的过程。通过静脉内施用已经成功地将盐水中的ASON以高达6mg/kg的剂量施用给了实验动物和受试验的人，每周施用三次(Yacysyhn，B.R.，et al，2002，Gut 51：30(治疗Crohn氏病的抗ICAM-1ASON)；Stevenson，J.，et al.，1999，J.ClinicalOncology 17：2227(靶向PBMC的抗RAF-1ASON))。已经报告靶向于TNF-α的2’o-MOE硫代磷酸酯ASON的药物动力学(Geary，R.S.，et al.，2003，DrugMetabolism and Disposition 31：1419)。也已经报告了混合的LNA/DNA分子的系统有效性(Fluiter，K.，et al.，2003，Nucleic Acids Res.31：953)。
利用2’O-MOE硫代磷酸酯和PNA化学作用调查了SSO在小鼠模型系统中的全身活性。在除脑、胃和真皮外的所有被研究的组织中观察到了显著活性(Sazani，P.，et al.，2002，Nature Biotechnology 20，1228)。
通常，在传统反义治疗中有用的任何施药方法都可以用来施用本发明的SSO。为了在培养细胞中测试SSO，可以使用已经开发的测试ASON或SSO的任何技术。
本发明的剂型包含在生理上或药学上可接受的载体，例如水性载体中的SSOs。因此本发明使用的剂型包括，但不局限于那些适合肠胃外给药的剂型，包括腹腔内、静脉内、动脉内、皮下，肌肉注射或输注的剂型，以及那些适合局部给药(包括眼用的和用于黏膜的，包括阴道递送)，口服、经直肠或肺(包包括粉末或气雾剂的吸入或吹入，包括通过喷雾器、气管内、鼻内递送)给药的剂型。所述制剂可以方便地以单位制剂形式存在，也可以通过本领域公知的任何方法制备。在任何给定的情况下，最适当的给药途径取决于受试者待治疗的状态的性质和严重程度，以及使用的特殊活性化合物。
本发明的药物组合物包括，但不局限于其生理上和药学上可接受的盐，即保持母体化合物想要的生物活性，此外还不产生不希望有的毒性作用的盐。这种盐的实例有(a)用阳离子，例如钠、钾、铵、镁、钙、多胺，例如精胺和亚精胺等等形成的盐；(b)用无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等等形成的酸加成盐；(c)用有机酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、丁二酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、安息香酸、丹宁酸、棕榈酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、p-甲苯磺酸、萘二磺酸、多聚半乳糖醛酸等等形成的盐；以及(d)由基本阴离子，例如氯、溴和碘形成的盐。
本发明提供了利用具有上述特征的SSOs制备用于在受炎性紊乱折磨的病人体内增加TNFR超家族成员的可溶形式/它对应的膜结合形式的比率的药物的用途，其中炎性紊乱涉及细胞因子，例如，上文讨论的TNF-alpha的活性过强。在制造依照本发明的药物时，SSOs典型地与可接受的载体混合。当然，载体必须是可接受的，也就是与剂型中的任何其他成分相容，而且必须对病人没有害处。载体可以是固体或液体。SSOs被掺入到通过任何基本上由混合组分组成的公知制药技术制备的本发明的制剂中，其中所述制剂任意地包括一种或多种附加的治疗成分。
本发明的制剂包括活性化合物的无菌的水性和非水性注射溶液，这种制剂优选与预期的接受者的血液等渗，而且基本上无热原。这些制剂可以包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂，以及使制剂与预期的接受者的血液等渗的溶质(solutes)。水性和非水性的无菌的悬浮液可以包括，但不局限于悬浮剂和增稠剂。制剂可以存在于单剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿和管形瓶中，可以保存在冻干(冻干)状态，在使用之前，只需要立刻添加无菌液体载体，例如盐水或注射用水就可以。
在该制剂中，SSOs可以包含在脂质粒子或囊，例如适合于肠胃外给药的脂质体或微晶内。粒子可以是任何适当结构，例如单层或多层的粒子，只要SSOs包含在其中就可以。这种粒子和囊特别优选带正电荷的脂质，例如N-[1-(2，3-dioleoyloxi)丙基]-N，N，N-三甲基-ammoniummethylsulfate或″DOTAP″。这种脂质粒子的制备是公知的。[参见参考文献美国专利5,976,879的第6栏]
SSO可以靶向调节剪接的任何元件或元件组合，包括3’剪接位点，5’剪接位点，分支点，多聚嘧啶区域，外显子剪接增强子，外显子剪接沉默子，内含子剪接增强子，内含子剪接沉默子。在显示SSOs活性的下列表格的引导下可以确定SSO的序列，其中SSOs的序列和位置被发现描述在图20中。所属技术领域的技术人员将注意到：1)与外显子互补的SSOs不必与剪接受体位置或剪接供体位置互补，注意表1的SSOs A7-10、B7-7和B7-9；2)与内含子序列互补的SSOs和少至外显子一个核苷酸的SSOs是可操作性的，注意的A8-5和B7-6(表1)；
3)与紧邻外显子的内含子互补的SSOs也是有效的，注意表2的3312；和4)单独的寡核苷酸的效力通常可以预示与其他SSOs组合的SSO的效力。
本领域熟练技术人员可以理解，可以利用具有与包含外显子7或8和它们的邻近内含子的TNFR1或TNFR2基因部分的至少10个核苷酸，优选15-20个核苷酸互补的序列的SSO实施靶向人TNF-α受体的本发明。更优选外显子本身的至少一个核苷酸被包含在互补序列内部。SEQ ID Nos：1-4包含TNFR1(SEQ ID Nos：1和2)和TNFR2(SEQ ID Nos：3和4)的外显子7和8，以及侧接的内含子的50个相邻核苷酸的序列。当使用增强亲合力的修饰，包括，但不限于LNA或G-clamp核苷酸时，熟练技术人员应认识到SSO的长度可以相应地降低。当使用交替的常规核苷酸和LNA核苷酸时，16个核苷酸的长度是有效的。
本领域熟练技术人员也承认SSO序列的选择必须要考虑避免自身互补的SSO，其中自身互补可能导致部分″发夹″双链结构的形成。另外，应避免高GC含量以将非特异性碱基配对的可能性降到最低程度。此外，也应该避免使用通过BLAST显示的与off-target基因配对的SSOs。
在一些情况下，选择靶向人和至少一个其他物种的SSO序列是优选的。使用在人类中开始之前，可在所述的其他物种中用这些SSOs测试和优化本发明，因此有助于调整报批和药物开发目的。例如，靶向人TNFR2的SEQ IDNos：74，75，77，78，80和89也与对应的Macaca Mullata猕猴序列100％互补。因此，在用于人类以前，可以先在猴子体内用这些序列进行实验治疗。
本领域熟练技术人员应理解对如上所述的本发明所进行的多种省略、添加和修饰没有偏离本发明的范围，所有这种修饰和变化都在附加的权利要求书所限定的本发明的范围内。所有引用的参考文献、专利、专利申请或其他文件在此处都合并作为参考。
在下文的序列表中，WO2007/058894中公开了SEQ ID NOs 1-116。SEQIDs NOs 117-242为PCT/US2007/10557中公开的SEQ ID NOs 1-126。SEQ IDsNOs 243-246是本申请中的新序列，而且是本发明的优选寡聚物。
表4：靶向人TNFR2的剪接转换寡聚物：大写字母＝LNA，小写字母＝DNA)-注意SEQ ID No 243靶向小鼠TNFR2。
3378
  SEQID   名称   序列(5′-3′)   描述   核碱基基序
  130   SK100   CcA cAa TcA gTc CtA g   3378全长   CCA CAA TCA GTC CTA G
  131   SK101   A cAa TcA gTc CtA g   -2nt 5′(14mer)   A CAA TCA GTC CTA G
  132   SK102   Aa TcA gTc CtA g   -4nt 5′(12mer)   AA TCA GTC CTA G
  133   SK103   TcA gTc CtA g   -6nt 5′(10mer)   TCA GTC CTA G
  134   SK104   CcA cAa TcA gTc Ct   -2nt 3′(14mer)   CCA CAA TCA GTC CT
  135   SK105   CcA cAa TcA gTc   -4nt 3′(12mer)   CCA CAA TCA GTC
  136   SK106   CcA cAa TcA g   -6nt 3′(10mer)   CCA CAA TCA G
  137   SK107   Ca CaA tCa GtC cTa   -1nt 5′；-1nt 3′(14mer)   CA CAA TCA GTC CTA
  138   SK108   Ca CaA tCa GtC c   -1nt 5′；-3nt 3′(12mer)   CA CAA TCA GTC C
  139   SK109   A cAa TcA gTc Ct   -2nt 5′；-2nt 3′(12mer)   A CAA TCA GTC CT
  140   SK110   CaA tCa GtC cTa   -3nt 5′；-1nt 3′(12mer)   CAA TCA GTC CTA
  141   SK111   Ca CaA tCa Gt   -1nt 5′；-5nt 3′(10mer)   CA CAA TCA GT
  142   SK112   A cAa TcA gTc   -2nt 5′；-4nt 3′(10mer)   A CAA TCA GTC
  143   SK113   CaA tCa GtC c   -3nt 5′；-3nt 3′(10mer)   CAA TCA GTC C
  144   SK114   Aa TcA gTc Ct   -4nt 5′；-2nt 3′(10mer)   AA TCA GTC CT
  145   SK115   AtCa GtC cTa   -5nt 5′；-1nt 3′(10mer)   A TCA GTC CTA
3379
  SEQID   名称   序列(5′-3′)   描述   核碱基基序
146   SK116   CaG tCc TaG aAa GaA a   3379全长   CCA CAA TCA GTC CTA G
147   SK117   G tCc TaG aAa GaA a   -2nt 5′(14mer)   G TCC TAG AAA GAA A
148   SK118   Cc TaG aAa GaA a   -4nt 5′(12mer)   CC TAG AAA GAA A
149   SK119   TaG aAa GaA a   -6nt 5′(10mer)   TAG AAA GAA A
150   SK120   CaG tCc TaG aAa Ga   -2nt 3′(14mer)   CAG TCC TAG AAA GA
151   SK121   CaG tCc TaG aAa   -4nt 3′(12mer)   CAG TCC TAG AAA
152   SK122   CaG tCc TaG a   -6nt 3′(10mer)   CAG TCC TAG A
153   SK123   Ag TcC tAg AaA gAa   -1nt 5′；-1nt3′(14mer)   AG TCC TAG AAA GAA
154   SK124   Ag TcC tAg AaA g   -1nt 5′；-3nt 3′(12mer)   AG TCC TAG AAA G
155   SK125   G tCc TaG aAa Ga   -2nt 5′；-2nt 3′(12mer)   G TCC TAG AAA GA
156   SK126   TcC tAg AaA gAa   -3nt 5′；-1nt 3′(12mer)   TCC TAG AAA GAA
157   SK127   Ag TcC tAg Aa   -1nt5′；-5nt 3′(10mer)   AG TCC TAG AA
158   SK128   G tCc TaG aAa   -2nt 5′；-4nt 3′(10mer)   G TCC TAG AAA
159   SK129   TcC tAg AaA g   -3nt 5′；-3nt3′(10mer)   TCC TAG AAA G
160   SK130   Cc TaG aAa Ga   -4nt 5′；-2nt 3′(10mer)   CC TAG AAA GA
161   SK131   C tAg AaA gAa   -5nt 5′；-1nt 3′(10mer)   C TAG AAA GAA
3384
  SEQID   名称   序列(5′-3′)   描述   核碱基基序
162   SK132   AcT tTt CaC cTg GgT c   3384全长   CCA CAA TCA GTC CTA G
163   SK133   T tTt CaC cTg GgT c   -2nt 5′(14mer)   T TTT CAC CTG GGT C
164   SK134   Tt CaC cTg GgT c   -4nt 5′(12mer)   TT CAC CTG GGT C
  165   SK135   CaC cTg GgT c   -6nt 5′(10mer)   CAC CTG GGT C
166   SK136   AcT tTt CaC cTg Gg   -2nt  3′(14mer)   ACT TTT CAC CTG GG
167   SK137   AcT tTt CaC cTg   -4nt 3′(12mer)   ACT TTT CAC CTG
168   SK138   AcT tTt CaC c   -6nt 3′(10mer)   ACT TTT CAC C
169   SK139   Ct TtT cAc CtG gGt   1nt5′；-1nt 3′(14mer)   CT TTT CAC CTG GGT
170   SK140   Ct TtT cAc CtGg   -1nt 5′；3nt 3′(12mer)   CT TTT CAC CTG G
171   SK141   T tTt CaC cTg Gg   -2nt 5′；-2nt 3′(12mer)   T TTT CAC CTG GG
172   SK142   TtT cAc CtG gGt   -3nt 5′；-1nt 3′(12mer)   TTT CAC CTG GGT
173   SK143   Ct TtT cAc Ct   -1nt 5′；-5nt 3′(10mer)   CT TTT CAC CT
174   SK144   T tTt CaC cTg   -2nt 5′；-4nt 3′(10mer)   T TTT CAC CTG
175   SK145   TtT cAc CtGg   -3nt 5′；-3nt 3′(10mer)   TTT CAC CTG G
176   SK146   Tt CaC cTgGg   -4nt5′；-2nt 3′(10mer)   TT CAC CTG GG
177   SK147   T cAc CtG gGt   -5nt 5′；-1nt 3′(10mer)   T CAC CTG GGT
Figure G2007800535955D00611
Figure G2007800535955D00631
大写字母＝LNA，优选氧LNA(上标o)，优选硫代磷酸酯连接＝下标s，小写字母＝DNA)。mC＝优选的5-甲基胞嘧啶。
表1-3是依照在此处明确引入的WO 2007/058894的表1-3的。
本发明更进一步的实施方案：
本发明提供了治疗炎性疾病或状态的方法，包括给受试者施用一段时间的一种或多种剪接转换寡聚物(SSOs)，其用量为降低肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的配体活性的量，其中所述的一种或多种SSOs能够改变编码所述受体的前信使RNA的剪接，因此能增加稳定分泌的配体结合形式的所述受体的生产。
在一个实施方案中，哺乳动物受体选自由TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF3、TNFRSF5、TNFRSF8和TNFRSFI1A组成的组。
在一个实施方案中，受体是人TNFRSF1A或人TNFRSF1B。在一个实施方案中，受体是人TNFRSF1B。
在一个实施方案中，配体是TNF-α.、RANKL、CD40L LT-α.或LT-β。
在一个实施方案中，疾病或状态选自由类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、炎性肠病(包括Crohn氏病和溃疡性结肠炎)、肝炎、败血症、酒精性肝病和非酒精性脂肪变性组成的组。
在治疗炎性疾病或状态的一个具体实施方法中，施用了两种或多种SSOs。
在一个实施方案中受体是TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF3、TNFRSF5或TNFRSFI1A，所述的改变所述前信使RNA的剪接包括切除来自所述前信使RNA的外显子7或外显子8，或者两者都切除。
在一个实施方案中，所述的改变所述前信使RNA的剪接包括切除外显子7。
在一个实施方案中，所述受体是人TNFRSF1A或人TNFRSF1B，所述的SSO包括与来自SEQ ID Nos：1，2，3或4的毗连序列互补的至少10到至少20个核苷酸。
在一个实施方案中，所述SSO序列包括选自由SEQ ID Nos：74，75，77，78，80，82，84和86-89组成的组的序列。
在一个实施方案中，所述SSOs包含独立地选自由如下选择组成的组的一个或多个核苷酸或核苷：2’-脱氧核糖核苷酸，2’O-Me核糖核苷酸，2’O-MOE核糖核苷酸，己糖醇(HNA)核苷酸或核苷，2’O-4’C-连接的二环呋核亚硝脲(LNA)核苷酸或核苷，上述的任何硫代磷酸酯类似物，上述的任何肽核酸(PNA)类似物；上述的任何methylphosponate类似物，上述的任何肽核酸类似物；上述的任何N3’→P5’(N3’fwdarw P5’)氨基磷酸酯类似物，上述的任何phosphorodiamidate吗啉代核苷酸类似物，以及它们的组合。
在一个实施方案中，所述SSOs包含独立地选自由2’O-Me核糖核苷酸和2’O-4’C-连接的二环呋核亚硝脲(LNA)核苷酸或核苷组成的组的一个或多个核苷酸或核苷。在一个实施方案中，所述给药是肠胃外、局部、口服、经直肠或肺给药。
在一个实施方案中，本发明提供了增加细胞中来自TNFR超家族的稳定分泌的配体结合形式的受体生产的方法，包括给所述细胞施用一种或多种剪接转换寡聚物(SSOs)，其中所述的一种或多种SSOs能够改变编码所述受体的前信使RNA的剪接，因此能够增加稳定分泌的配体结合形式的所述受体的生产。
在一个实施方案中，该方法是在体内实施的。
在一个实施方案中，所述受体是选自由TNFRSF1A，TNFRSF1B，TNFRSF3，TNFRSF5，TNFRSF8和TNFRSF1A组成的组的哺乳动物受体。
在一个实施方案中，所述受体是人TNFRSF1A或人TNFRSF1B。
在一个实施方案中，所述受体是人TNFRSF1B。
在一个实施方案中，所述的SSO包含与来自SEQ ID Nos：1，2，3或4的毗连序列互补的至少10到至少20个核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供了至少10到至少20个核苷酸的SSO，所述SSOs能够改变编码来自TNFR超家族的受体的前信使RNA的剪接，因此能够增加稳定分泌的配体结合形式的所述受体的生产。
在一个实施方案中，所述受体是选自由TNFRSF1A，TNFRSF1B，TNFRSF3，TNFRSF5，TNFRSF8和TNFRSFI1A组成的组的哺乳动物受体。
在一个实施方案中，所述受体是人TNFSF1A或人TNFRSF1B。在一个实施方案中，所述受体是人TNFRSF1B。
在一个实施方案中，SSO包含与来自SEQ ID Nos：1，2，3或4的毗连序列互补的至少10到至少20个核苷酸。
在一个实施方案中，SSOs包含独立地选自由如下选择组成的组的在一个或多个核苷酸或核苷：2’-脱氧核糖核苷酸，2’O-Me核糖核苷酸，2’O-MOE核糖核苷酸，己糖醇(HNA)核苷酸或核苷，2’O-4’C-连接的二环呋核亚硝脲(LNA)核苷酸或核苷，上述的任何硫代磷酸酯类似物，上述的任何肽核酸(PNA)类似物；上述的任何methylphosponate类似物，上述的任何肽核酸类似物；上述的任何N3’→P5’氨基磷酸酯类似物，上述的任何phosphorodiamidate吗啉代核苷酸类似物，以及它们的组合。
在一个实施方案中，所述2’O-4’C-连接的二环呋核亚硝脲(LNA)核苷酸或核苷分别是2’O-4’C-(亚甲基)-呋核亚硝脲核苷酸或核苷，或者是2’O-4’C-(乙烯)呋核亚硝脲核苷酸或核苷。在一个实施方案中，所述SSOs包含独立地选自由2’O-Me核糖核苷酸和2’O-4’C-连接的二环呋核亚硝脲(LNA)核苷酸或核苷组成的组的一个或多个核苷酸或核苷。
在一个实施方案中，所述SSO序列包括选自由SEQ ID Nos：8，9，14，17-21，24-29，32，33，38-42，44-46，50-52，55-57，60，68-71，74，75，77，78，80，82，84和86-89组成的组的序列。
在一个实施方案中，本发明提供了包含SSO和药学上可接受的载体的药物组合物。
在一个实施方案中，所述的SSO包含与来自SEQ ID Nos：1，2，3或4的毗连序列互补的至少10到至少20个核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供了能够结合肿瘤坏死因子(TNF)的分离蛋白质，所述蛋白质具有包含来源于哺乳动物肿瘤坏死因子受体(TNFR)基因的cDNA编码的氨基酸的序列，其中cDNA包含从5’到3’的毗连排列的在所述基因的信号序列的切割位点后的编码第一个氨基酸的密码子，其穿过(through)所述基因的外显子6，所述基因的外显子8和所述基因的外显子10；或者包含编码所述基因的开放阅读框的第一个氨基酸的密码子，其穿过所述基因的外显子6，所述基因的外显子8和所述基因的外显子10。
在一个实施方案中，所述TNF是TNF-alpha。
在一个实施方案中，所述蛋白质包含至少至少一种化学加工或翻译后修饰，其中所述修饰选自由乙酰化、酰化、酰胺化，ADP-核糖基化、糖基化、甲基化、聚乙二醇化、异戊烯化、磷酸化或胆固醇结合组成的组。
在一个实施方案中，所述受体是TNFR1，例如人TNFR1，在一个实施方案中，所述受体是TNFR2，例如人TNFR2。在一个实施方案中，所述蛋白质包含选自由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：6的氨基酸30-417、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：8的氨基酸30-416、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：10的氨基酸23-435、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：12的氨基酸23-448所组成的组的序列。
在一个实施方案中，本发明提供了包含与药学上可接受的载体混合的本发明的蛋白质的药物组合物。在一个实施方案中，本发明提供了包含本发明的纯化蛋白质的组合物。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗炎性疾病或状态的方法，包括给受试者施用本发明的药物组合物一段时间，其用量能有效降低TNF的活性。
在一个实施方案中，所述疾病或状态选自由类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、炎性肠病(包括Crohn氏病和溃疡性结肠炎)、与甲型肝炎病毒有关的肝炎、与乙型肝炎病毒有关的肝炎、与丙型肝炎病毒有关的肝炎、与缺血/再灌注有关的肝炎、败血症、酒精性肝病和非酒精性脂肪变性组成的组。在一个实施方案中，本发明提供了来源于哺乳动物肿瘤坏死因子受体(TNFR)基因并编码能够结合肿瘤坏死因子(TNF)的蛋白质的分离核酸，其中所述蛋白质的cDNA包含从5’到3’的毗连排列的在所述基因的信号序列的切割位点后的编码第一个氨基酸的密码子，其穿过所述基因的外显子6，所述基因的外显子8和所述基因的外显子10；或者包含编码所述基因的开放阅读框的第一个氨基酸的密码子，其穿过所述基因的外显子6，所述基因的外显子8和所述基因的外显子10。在该实施方案中，所述蛋白质的序列包含选自由SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：6的氨基酸30-417、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：8的氨基酸30-416、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：10的氨基酸23-435、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：12的氨基酸23-448所组成的组的序列。在一个实施方案中，所述核酸序列包含选自由SEQ ID NO：5的核苷酸1-1251，SEQ ID NO：5的核苷酸88-1251，SEQ ID NO：7的核苷酸1-1248，SEQ ID NO：7的核苷酸88-1248，SEQ ID NO：9的核苷酸1-1305，SEQ ID NO：9的核苷酸67-1305，SEQ ID NO：11的核苷酸1-1344，SEQ ID NO：11的核苷酸67-1344组成的组的序列。在一个实施方案中，本发明提供了包含与调节序列操作性地连接的本发明的核酸的表达载体。
在一个实施方案中，本发明提供了增强哺乳动物体内TNF拮抗剂水平的方法，包括用本发明的表达载体转化所述哺乳动物的细胞使其表达所述TNF拮抗剂，其中所述载体驱动所述TNFR表达。在一个实施方案中，哺乳动物是人，例如所述人是患有炎性疾病或状态的个体。
在一个实施方案中，所述表达载体是质粒或病毒。
在一个实施方案中，细胞在体内被转化。在一个实施方案中，细胞在体外被转化。
在一个实施方案中，所述表达载体包含组织特异性启动子，所述组织特异性启动子例如，可以源自肝细胞或巨噬细胞。
在一个实施方案中，细胞选自由肝细胞、造血细胞、脾细胞和肌细胞组成的组。
本发明提供了用本发明的表达载体转化的细胞，例如哺乳动物细胞、昆虫细胞或微生物细胞。
本发明提供了产生能结合肿瘤坏死因子(TNF)的蛋白质的方法，包括在适合于表达所述蛋白质的情况下培养本发明的细胞，并收获所述蛋白质。
本发明提供了包含与药学上可接受的载体混合的本发明的核酸或载体的药物组合物。本发明提供了治疗炎性疾病或状态的方法，包括给受试者施用本发明的表达载体一段时间，其用量足以降低TNF的活性，例如TNF-alpha的活性。
在一个实施方案中，疾病或状态选自由类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、炎性肠病(包括Crohn氏病和溃疡性结肠炎)、与甲型肝炎病毒有关的肝炎、与乙型肝炎病毒有关的肝炎、与丙型肝炎病毒有关的肝炎、与缺血/再灌注有关的肝炎、败血症、酒精性肝病和非酒精性脂肪变性组成的组。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗炎性疾病或状态的方法，包括给受试者施用本发明的一种或多种剪接转换寡聚物(SSOs)一段时间，其用量能有效降低TNF的活性，其中，所述的一种或多种SSOs能够改变编码哺乳动物肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)(或TNFR1)的前信使RNA的剪接，因此能够增加能结合肿瘤坏死因子(TNF)的蛋白质的生产，所述蛋白质具有包含来源于所述受体基因的cDNA编码的氨基酸的序列，其中cDNA包含从5’到3’的毗连排列的在所述基因的信号序列的切割位点后的编码第一个氨基酸的密码子，其穿过所述基因的外显子6，所述基因的外显子8和所述基因的外显子10；或者包含编码所述基因的开放阅读框的第一个氨基酸的密码子，其穿过所述基因的外显子6，所述基因的外显子8和所述基因的外显子10。
在一个实施方案中，所述疾病或状态选自由类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、炎性肠病(包括Crohn氏病和溃疡性结肠炎)、与甲型肝炎病毒有关的肝炎、与乙型肝炎病毒有关的肝炎、与丙型肝炎病毒有关的肝炎、与缺血/再灌注有关的肝炎、败血症、酒精性肝病和非酒精性脂肪变性组成的组。在一个实施方案中，所述给药是肠胃外、局部、口服、经直肠或肺给药。
在一个实施方案中，本发明提供了包含至少8个核苷酸的剪接转换寡聚物(SSO)，其中，所述SSOs能够改变编码哺乳动物肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)(或TNFR1)的前信使RNA的剪接，以增加能结合肿瘤坏死因子(TNF)的蛋白质的产生，所述蛋白质具有包含来源于所述受体基因的cDNA编码的氨基酸的序列，其中cDNA包含从5’到3’的毗连排列的在所述基因的信号序列的切割位点后的编码第一个氨基酸的密码子，其穿过所述基因的外显子6，所述基因的外显子8和所述基因的外显子10；或者包含编码所述基因的开放阅读框的第一个氨基酸的密码子，其穿过所述基因的外显子6，所述基因的外显子8和所述基因的外显子10。
在一个实施方案中，本发明提供了包含与来自SEQ ID NO：13的毗连序列互补的至少8个核苷酸的SSO。
在一个实施方案中，所述SSO序列包括选自由SEQ ID Nos：14，30，46，70，71，72和73，以及它们的至少8个核苷酸的子序列组成的组的序列。
在一个实施方案中，所述SSO序列包含选自由SEQ ID Nos：14-61组成的组的序列。
本发明提供了增加细胞中能结合肿瘤坏死因子(TNF)的蛋白质生产的方法，包括给所述细胞施用一种或多种剪接转换寡聚物(SSOs)，其中，所述蛋白质具有包含来源于哺乳动物肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)(或TNFR1)基因的cDNA编码的氨基酸的序列，其中cDNA包含从5’到3’的毗连排列的在所述基因的信号序列的切割位点后的编码第一个氨基酸的密码子，其穿过所述基因的外显子6，所述基因的外显子8和所述基因的外显子10；或者包含编码所述基因的开放阅读框的第一个氨基酸的密码子，其穿过所述基因的外显子6，所述基因的外显子8和所述基因的外显子10，其中，所述一种或多种SSOs能够改变编码所述受体的前信使RNA的剪接，使所述蛋白质的生产增加。在一个实施方案中，该方法是在体内实施的。
本发明提供了包含本发明的SSO和药学上可接受的载体的药物组合物。
实施例
下列实施例与PCT/US2007/10557中描述的那些实施例等同。
实施例1
寡核苷酸。表6列出了具有交替的2’脱氧-和2’O-4’-(亚甲基)-二环-核糖核苷硫代磷酸酯和具有如上所述的序列的嵌合的锁定核酸(LNA)SSOs。这些序列是由丹麦的Santaris Pharma合成的。对于每个SSO，5’-末端的核苷是2’氧-4’-亚甲基-核糖核苷，3’-末端核苷是2’脱氧核糖核苷。表7显示了具有交替的2’-氧-甲基-核糖核苷-硫代磷酸酯(2’-OMe)和2’O-4’-(亚甲基)-二环-核糖核苷硫代磷酸酯的嵌合的LNA SSOs的序列。这些序列是由丹麦的Santaris Pharma合成的。LNA用大写字母显示，2’-OME用小写字母显示。
细胞培养和转染。L929细胞维持在补充有10％胎牛血清和抗生素的最低必需培养基中(37℃，5％CO2)。为了转染，将L929细胞接种到24孔板中，每孔105个细胞，24小时以后进行转染。按照厂家说明，让所标示浓度的寡核苷酸与2μl的LipofectamineTM 2000转染试剂(Invitrogen)形成复合物。然后将核苷酸/脂质复合物施加给细胞并温育24小时。吸出培养基，并用TRI-试剂TM(MRC，Cincinnati，OH)收获细胞。
RT-PCR。用TRI试剂(MRC，Cincinnati，OH)分离总RNA，并按照供应商的说明，利用rTth聚合酶(Applied Biosystems)通过
Figure G2007800535955D00701
RT-PCR扩增TNFR1或TNFR2的mRNA。每个反应使用大约200ng RNA。此处描述的实施例中使用的引物包括在表2中。进行PCR循环：95℃，60秒；56℃，30秒；72℃，60秒，总共进行22-30个循环。
在有些情况下，Cy5标记的dCTP(GE Healthcare)被包含在PCR步骤中用于显象(每50μl PCR反应0.1μl)。在10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离PCR产物，用TyphoonTM 9400扫描器(GE Healthcare)显现Cy5标记的条带。用ImageQuantTM(GE Healthcare)软件对扫描进行量化。或者，不包含Cy5标记的dCTP时，在包含用于显象的痕量溴化乙锭的1.5％的琼脂糖凝胶上分离PCR产物。
PCR
依照厂家的说明用
Figure G2007800535955D00702
Taq DNA聚合酶(Invitrogen)实施PCR。50μl反应，使用大约30pmol的正反向引物。被用于此处描述的实施例中的引物包括在表5中。除非另作说明，否则按照如下条件进行热循环反应：94℃，3分钟；然后94℃，30秒，55℃，30秒，以及72℃，105秒，共30-40个循环；接下来72℃，3分钟。在1.5％的琼脂糖凝胶上分析产物，用溴化乙锭显象。
表5：RT-PCR和PCR引物
  SEQID.   名称   序列5′to 3′
  人TNFR2
  190   TR001   ACT GGG CTT CAT CCC AGC ATC
  191   TR002   CAC CAT GGC GCC CGT CGC CGT CTG G
  192   TR003 CGA CTT CGC TCT TCC AGT TGA GAA GCC CTT GTG CCT GCA G
  193   TR004   TTA ACT GGG CTT CAT CCC AGC ATC
  194   TR005 CTG CAG GCA CAA GGG CTT CTC AAC TGG AAG AGC GAA GTC G
  195   TR026   TTA ACT GGG CTT CAT CCC AGC
  196   TR027 CGA TAG AAT TCA TGG CGC CCG TCG CCG TCT GG
  197   TR028 CCT AAC TCG AGT TAA CTG GGC TTC ATC CCA GC
  198   TR029 GAC TGA GCG GCC GCC ACC ATG GCG CCC GTC GCC GTC TGG
  199   TR030 CTA AGC GCG GCC GCT TAA CTG GGC TTC ATC CCA GCA TC
  200   TR047   CGT TCT CCA ACA CGA CTT CA
  201   TR048   CTT ATC GGC AGG CAA GTG AGG
  202   TR049   ACT GAA ACA TCA GAC GTG GTG TGC
  203   TR050   CCT TAT CGG CAG GCA AGT GAG
  人TNFR1
  204   TR006   CCT CAT CTG AGA AGA CTG GGC G
  205   TR007   GCC ACC ATG GGC CTC TCC ACC GTG C
  206   TR008 GGG CAC TGA GGA CTC AGT TTG TGG GAA ATC GAC ACC TG
  207   TR009 CAG GTG TCG ATT TCC CAC AAA CTG AGT CCT CAG TGC CC
  208   TR010   CAC CAT GGG CCT CTC CAC CGT GC
  209   TR011   TCT GAG AAG ACT GGG CG
  210   TR031 CGA TAG GAT CCA TGG GCC TCT CCA CCG TGC
  211   TR032 CCT AAC TCG AGT CAT CTG AGA AGA CTG GGC G
  212   TR033 GAC TGA GCG GCC GCC ACC ATG GGC CTC TCC ACC GTG C
  213   TR034 CTA AGC GCG GCC GCT CAT CTG AGA AGA CTG GGC G
  小鼠TNFR2
  214   TR012   GGT CAG GCC ACT TTG ACT GC
  215   TR013   CAC CGC TGC CCC TAT GGC G
  216   TR014   CAC CGC TGC CAC TAT GGC G
  217   TR015   GGT CAG GCC ACT TTG ACT GCA ATC
  218   TR016   GCC ACC ATG GCG CCC GCC GCC CTC TGG
  219   TR017 GGC ATC TCT CTT CCA ATT GAG AAG CCC TCC TGC CTA CAA AG
  220   TR018 CTT TGT AGG CAG GAG GGC TTC TCA ATT GGA AGA GAG ATG CC
  221   TR019   GGC CAC TTT GAC TGC AAT CTG
  222   TR035   CAC CAT GGC GCC CGC CGC CCT CTG G
  223   TR036   TCA GGC CAC TTT GAC TGC AAT C
  224   TR037 CGA TAG AAT TCA TGG CGC CCG CCG CCC TCT GG
  225   TR038 CCT AAC TCG AGT CAG GCC ACT TTG ACT GCA ATC
  226   TR039 GAC TGA GCG GCC GCC ACC ATG GCG CCC GCC GCC CTC TGG
  227   TR040 CTA AGC GCG GCC GCT CAG GCC ACT TTG ACT GCA ATC
  228   TR045   GAG CCC CAA ATG GAA ATG TGC
  229   TR046   GCT CAA GGC CTA CTG CAT CC
  小鼠TNFR1
  230   TR020   GGT TAT CGC GGG AGG CGG GTC G
  231   TR021   GCC ACC ATG GGT CTC CCC ACC GTG CC
  232   TR022 CAC AAA CCC CCA GGA CTC AGT TTG TAG GGA TCC CGT GCC T
  233   TR023 AGG CAC GGG ATC CCT ACA AAC TGA GTC CTG GGG GTT TGT G
  234   TR024   CAC CAT GGG TCT CCC CAC CGT GCC
  235   TR025   TCG CGG GAG GCG GGT CGT GG
  236   TR041 CGA TAG TCG ACA TGG GTC TCC CCA CCG TGC C
  237   TR042 CCT AAG AAT TCT TAT CGC GGG AGG CGG GTC G
  238   TR043 GAC TGA GCG GCC GCC ACC ATG GGT CTC CCC ACC GTG CC
  239   TR044 CTA AGC GCG GCC GCT TAT CGC GGG AGG CGG GTC G
人肝细胞的培养。从ADMET技术或者UNC-Chapel Hill的UNC细胞代谢和运输中心(UNC Cellular Metabolism and Transport Core)获取悬浮液中的人肝细胞。在补充有10％FBS，1mg/mL人胰岛素和13nM DexamethASONe的RPMI 1640中洗涤并悬浮细胞。肝细胞平铺在6孔板中，每板3ml培养基，105个细胞。1-1.5小时后，去除非粘附细胞，将培养基替换为没有FBS的补充有1mg/mL人胰岛素和130nM DexamethASONe的RPMI 1640。
为了将SSOs递送到6孔板的肝细胞中，10ml的5mM的SSO原液被稀释成100ml OPTI-MEMTM，4ml LipofectamineTM 2000被稀释成100mlOPTI-MEMTM。然后将200ml复合物溶液施加给包含2800ml培养基的6孔板中的细胞，液体总共为3000ml。最后的SSO浓度是17nM。24小时后，在TRI-ReagentTM中收获细胞。按照厂家的说明分离总RNA。大约200ng的总RNA进行反转录-PCR(RT-PCR)。
ELISA。为了确定细胞培养基或血清中的可溶性TNFR2的水平，利用从R&D系统(Minneapolis，MN)获得的
Figure G2007800535955D00731
小鼠sTNF RII ELISA试剂盒或从R&D系统(Minneapolis，MN)获得的
Figure G2007800535955D00732
人sTNF RIIELISA试剂盒。检测使用的抗体也可以检测蛋白酶切割形式的受体。利用设定在450nm的全自动定量绘图酶标仪对ELISA孔板进行读数，波长校正设定在570nm。
为了进行小鼠体内试验，将来自动物的血在37℃下凝结1小时，并在4℃以14,000rpm的转数(Jouan BRA4i离心机)离心10分钟。收集血清，依照厂家的说明，利用1∶10稀释的50ml小鼠血清进行测试。
L929细胞毒性试验。在存在10％来自小鼠血清的情况下，用0.1ng/mLTNF-α和1mg/mL放线菌素D处理平铺在96孔板上，每孔104个细胞的L929细胞，让细胞在37℃生长～24小时，其中所述小鼠用总数为100mL的完全MEM培养基(包含10％合格的FBS)中的标示寡核苷酸处理过。对照组平铺在来自未处理小鼠的10％的血清中。24小时后，通过添加20mL CellTiter
Figure G2007800535955D00733
AQueousOne Solution Reagent(Promega)和用全自动定量绘图酶标仪测量490nm的吸光度来测量细胞的生存能力。参照未处理细胞，将细胞生存能力标准化。
蛋白质斑迹法(Western blots)。将二十毫升培养基或20mg裂解物上样到4-12％的
Figure G2007800535955D00734
聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)的每个孔中。在200V的条件下运行凝胶40分钟。30V转移1小时，将蛋白质转移到InvitrolonTM PVDF膜(Invitrogen)上，然后用
Figure G2007800535955D00735
封闭缓冲液(Blocking Buffer)(Pierce)封闭膜1小时。室温下，用识别人和小鼠TNFR2的C-末端的兔多克隆抗体(Abeam)温育膜3小时，在用PBS-T缓冲液(1xPBS，0.1％Tween-20)冲洗三次后，用二抗羊抗兔抗体(Abeam)在室温下温育膜1小时，然后又用PBS-T缓冲液冲洗三次。最后依照厂家的介绍用ECL PlusTM(GEHealthcare)检测蛋白质并对蛋白质进行拍照。
实施例2-SSO对TNFR mRNA的剪接转换活性
表6显示了具有如美国申请No.11/595,485中描述的序列且靶向小鼠和人TNFRs的SSOs的剪接转换活性。靶向小鼠TNFR2外显子7的SSOs中，至少有8个产生了一些muTNFR2Δ7mRNA。特别是，SSO 3312和3305诱导了至少50％的外显子7缺失；SSO 3305处理导致几乎完全的缺失。转染到原代人肝细胞中，而且靶向人TNFR2外显子7的SSOs中的至少7个SSOs产生了一些huTNFR2Δ7mRNA。特别是，SSOs 3378、3379、3384和3459诱导了至少75％的外显子7缺失(图2B)，huTNFR2Δ7被显著诱导到了细胞外培养基中(图2A)。
表6：SSO的剪接转换活性
Figure G2007800535955D00741
表7包含具有交替的2’-氧-甲基-核糖核苷-硫代磷酸酯(2’-OMe)和2’氧-4’-(亚甲基)-二环-核糖核苷硫代磷酸酯的10个核苷酸嵌合的SSOs的序列。这些SSOs靶向小鼠TNFR2的外显子7。
表7：LNA/2’-OMe-核糖核苷-硫代磷酸酯嵌合的靶向小鼠的SSO
  SEQ ID.   名称   序列5′to 3′*
  178   3274   AgAgCaGaAcCtTaCt
  179   3837   gAaCcTuAcT
  180   3838   aGaGcAgAaC
  181   3839   gAgCaGaAcC
  182   3840   aGcAgAaCcT
  183   3841   gCaGaAcCuT
  184   3842   cAgAaCcTuA
  185   3843   aGaAcCuTaC
*大写字母是2’O-4’-(亚甲基)-二环-核糖核苷；小写字母是2’-OMe
为了分析表7中列出的SSOs的体外剪接转换活性，可以按照实施例1的描述培养并接种L929细胞。为了将表7中的每一个SSOs递送给L929细胞，将SSOs稀释到50ml OPTI-MEMTM中，然后添加50ml LipofectamineTM2000混合物(1份LipofectamineTM2000与25份OPTI-MEMTM)并温育20分钟。接下来，将400ml无血清培养基添加到SSOs中，并将其施用给24孔板中的细胞。SSO的终浓度是50或100nM。24小时后，将细胞收获到800ml TRI-ReagentTM中。依照厂家的说明分离总RNA，并利用正向引物TR045(SEQ ID NO：228)和反向引物TR046(SEQ ID NO：229)通过RT-PCR进行分析(图3)。
为了分析表7中列出的SSOs在体内的剪接转换活性，以25mg/kg/天的剂量给小鼠腹腔内注射表4中列出的SSOs，共注射5天。在注射之前对小鼠进行放血处理，在最后一次注射后的1、5、10天又再次放血。通过ELISA测量第一次注射前和最后一次注射后10天的血清中的可溶性TNFR2Δ7的浓度(图4B)。在第10天处死小鼠，利用正向引物TR045(SEQ ID NO：228)和反向引物TR046(SEQ ID NO：229)通过RT-PCR分析从5-10mg肝脏中获取的总RNA。
所有体外测试的SSO 3274的10核苷酸的SSOs子序列都产生了至少一些muTNFR2Δ7mRNA(图3)。特别是，SSO 3839、3840和3841显示出比衍生它们的更长的16核苷酸的SSO 3274更大的剪接转换活性。体外显示出最大活性的三个10核苷酸SSOs 3839、3840、3841也能在小鼠体内产生大量的muTNFR2Δ7mRNA(图4A)和可溶性muTNFR2Δ7蛋白质(图4B)。
为了评价SSO长度对人TNFR2的剪接转换活性的影响，用不同长度的SSOs处理细胞。用选自表4的标示的SSOs转染原发的人肝细胞。通过丹麦的Santaris Pharma，用交替的2’脱氧和2’O-4’-(亚甲基)-二环-核糖核苷硫代磷酸酯合成这些SSOs。每一个SSO的5’-末端核苷是2’O-4’-亚甲基-核糖核苷，3’-末端核苷是2’脱氧核糖核苷。这些SSOs长度为10-、12-、14-或16-个核苷酸。通过ELISA测定可溶性TNFR2Δ7的浓度(图5，上部的网格)。通过RT-PCR分析总RNA的剪接转换活性(图5，底部的网格)。
实施例3-分析SSO诱导的TNFR2剪接变体的剪接接合
为了在小鼠和人细胞中证实SSO的剪接转换产生了预期的TNFR2Δ7mRNA，通过RT-PCR分析SSO诱导的TNFR2Δ7mRNA并进行测序。
小鼠。以25mg/kg/天的剂量给小鼠腹腔内注射SSO 3274，共注射10天。然后处死小鼠，并利用正向引物TR045(SEQ ID NO：228)和反向引物TR046(SEQ ID NO：229)通过RT-PCR分析来自肝脏的总RNA。在1.5％琼脂糖凝胶上分析产物，并利用标准分子生物学技术分离编码TNFR2Δ7的产物。利用相同的引物通过PCR扩增分离的TNFR2Δ7产物并进行测序(图6B)。序列资料包含序列CTCTCTTCCAATTGAGAAGCCCTCCTGC(SEQ ID NO：127的核苷酸777-804)，这也证实SSO诱导的TNFR2Δ7mRNA缺乏外显子7，外显子6直接连接到外显子8上。
人肝细胞。按照实施例1的描述用SSO 3379转染原代人肝细胞。转染后48小时分离总RNA。依照厂家的说明，利用随机的六聚体引物，用SuperscriptTMII逆转录酶(Invitrogen)将RNA转变为cDNA。利用正向引物TR049(SEQ ID NO：202)和反向引物TR050(SEQ ID NO：203)对cDNA进行PCR。在1.5％的琼脂糖凝胶上分析产物(图7A)。利用标准分子生物学技术分离相当于TNFR2Δ7的条带并进行测序(图7B)。序列资料包含序列CGCTCTTCCAGTTGAGAAGCCCTTGTGC(SEQ ID NO：125的核苷酸774-801)，这也证实SSO诱导的TNFR2Δ7mRNA缺乏外显子7，外显子6直接连接到外显子8上。
实施例4-SSO诱导在原代人肝细胞中生产TNFR2Δ7蛋白质的剂量依赖性
在原代人肝细胞中测试了SSOs的剪接转换活性的剂量反应。获取来自ADMET技术的处于悬浮液中的人肝细胞。将细胞洗涤三次并悬浮在接种培养基中(补充有L-谷氨酸，10％FBS，青霉素，链霉素和12nMDexamethASONe)。评估肝细胞的生存能力，并将肝细胞平铺在涂有胶原的24孔板上，每孔1.0x105个细胞。典型的细胞生存能力是85-93％。大约24小时后，将培养基替换为维持培养基(没有FBS的接种培养基)。
为了将每一个SSOs递送给肝细胞，将SSOs稀释到50ml OPTI-MEMTM中，然后添加50ml LipofectamineTM 2000混合物(1份LipofectamineTM2000与25份OPTI-MEMTM)并温育20分钟。然后将SSOs施用给24孔板中的细胞。最后的SSO浓度是1-150nM。48小时后，将细胞收获到800ml TRI-ReagentTM中。
利用正向引物TR047(SEQ ID NO：200)和反向引物TR048(SEQ ID NO：201)通过RT-PCR分析来自细胞的总RNA(图8A)。通过ELISA测定血清中可溶性TNFR2Δ7的浓度(图8B)。huTNFR2Δ7mRNA(图8A)和分泌的huTNFR2Δ7蛋白质(图8B)都显示出剂量依赖性的升高。
实施例5-来自鼠科动物细胞的TNFR2剪接变体的分泌
测试SSOs诱导可溶性TNFR2蛋白质生产并分泌到细胞外培养基的能力。按照实施例1的描述用SSOs处理L929细胞，转染后48小时收集细胞外培养基样品。通过ELISA测量样品中可溶性TNFR2的浓度(图9)。诱导RNA剪接转移最好的SSOs也能将最多的蛋白质分泌到细胞外培养基中。特别是，SSOs 3305，3312和3274可以相对于背景增加可溶性TNFR2至少3.5倍。因此，剪接变体mRNA的诱导与可溶性TNFR2的生产和分泌有相互关系。
实施例6-体内注射SSOs在小鼠体内产生muTNFR2Δ7mRNA
将盐水中的SSO 3305通过腹膜内注射(i.p.)到小鼠体内，注射剂量为3mg/kg-25mg/kg，每天注射，持续4天。在第5天处死小鼠，通过RT-PCR分析来自肝脏的总RNA。数据显示与细胞培养物中发现的剪接转换效力相似的剪接转换效力。剂量为25mg/kg的最大剂量时，SSO 3305处理几乎诱导完全转变成Δ7mRNA(图10，底部网格)。
对SSO 3274进行的类似实验诱导大约20％转换成Δ7mRNA。为了优化SSO 3274诱导Δ7mRNA的过程，改变了给药方法和从最后一次注射到处死动物的时间。每天将SSO 3274注射(i.p)到小鼠体内，持续4天。SSO处理在第15天分析的小鼠体内诱导大约30％转换成Δ7mRNA，而在第5天分析的小鼠体内观察到20％的转变(图10，上部网格)。此外，注射Δ710天，在第11天处死的小鼠显示出诱导50％的mRNA(图10，上部)。这些体内数据表明TNFR2SSOs可以在给药后至少10天产生muTNFR2Δ7mRNA。
实施例7-循环的TNFR2Δ7
以25mg/kg/天的剂量给小鼠腹腔内注射(i.p)SSO 3274，3305或对照3083，共注射10天。在注射之前对小鼠进行放血处理，在最后一次注射后的1、5、10天又再次放血。测定血清中可溶性TNFR2Δ7的浓度。SSO处理可以诱导可溶性TNFR2Δ7蛋白水平超过背景至少10天(图11)。
为了测试更长时间点的效果，可以重复实验，除了直到最后一次注射后的第27天收集血清样品外。结果显示可溶性TNFR2Δ7的水平在最后一次注射后的第27天只有轻微下降(图12)。
实施例8-小鼠血清中的抗TNF-alpha活性
在L929细胞毒性试验中测试来自SSO 3274处理小鼠的血清的抗TNF-α活性。在该试验中，按照实施例1的描述测定血清保护培养的L929细胞不受固定浓度的TNF-α的细胞毒性影响的能力。来自SSO 3274，而不是对照SSOs(3083或3272)处理小鼠的血清增强了暴露于0.1ng/mL TNF-α的L929细胞的生存能力。因此，SSO 3274血清包含足以结合并活化TNF-α的TNF-α拮抗剂，因此可以保护细胞不受TNF-α的细胞毒性影响。这种抗TNF-α活性存在于最后一次注射SSO 3274后5天和27天的动物血清中。
实施例9-SSO产生的TNFR2Δ7与其他抗TNF-α拮抗剂的比较
依照如上所述的方法接种L929细胞。制备包含90μl无血清的MEM，0.1ng/ml TNF-α和1ug/ml的放线菌素D，以及(i)来自的具有小鼠TNFR2的236个氨基酸残基的细胞外域的重组的可溶性蛋白质(0.01-3mg/mL)，(ii)来自SSO 3274或SSO 3305处理小鼠的血清(1.25-10％，稀释在未处理小鼠的血清中；通过ELISA确定TNFR2Δ7的浓度)或者(iii)
Figure G2007800535955D00792
(0.45-150pg/ml)，至最终体积为100μl，最终小鼠血清浓度为10％。在室温下温育样品30分钟。随后，将样品施用给平铺的细胞，37℃，在包含5％CO2的湿润空气中温育24小时。通过添加20μl CellTiter
Figure G2007800535955D00793
AQueous One Solution Reagent(Promega)并用全自动定量绘图酶标仪测量490nm的吸收度来测量细胞生存能力。参照未处理细胞将细胞生存能力标准化，并以TNF拮抗剂浓度为函数绘图(图14)。
实施例10-TNFR2Δ7mRNA和蛋白质的稳定性
以25mg/kg/天的剂量，每天给小鼠腹腔注射SSO 3274或3272(对照)(n＝5)，共注射5天。在注射开始前和最后一次注射后5、15、22、27和35天对小鼠进行放血处理。测量血清中可溶性TNFR2Δ7的浓度(图15A)。在处死小鼠时，也通过对来自肝脏的总RNA进行RT-PCR确定了肝脏中TNFR2的剪接转换。结合实施例7的数据就会发现，SSO处理后TNFR2mRNA水平的时程与血清中TNFR2Δ7蛋白质的时程一起被构建，而且两者是被比较(图16)。数据显示体内TNFR2Δ7mRNA衰退的速率比血清中TNFR2Δ7蛋白质大约快4倍。在第35天，只能检测到痕量TNFR2Δ7mRNA，但TNFR2Δ7蛋白质却只从最高浓度下降了20％。
实施例11-产生人TNFR2Δ7
通过购买从OriGene(产品目录No：TC119459，NM_001066.2)获取包含全长人TNFR2cDNA的cDNA质粒。通过利用反向引物TR001(SEQ ID NO：116)和正向引物TR002(SEQ ID NO：117)在质粒上实施PCR来获取cDNA。利用标准分子生物学技术分离和纯化PCR产物，所述PCR产物包含没有终止密码子的1383bp的TNFR2开放阅读框。或者，通过利用TR001反向引物和TR002正向引物对来自人单核细胞的总RNA实施RT-PCR，来获取全长人TNFR2cDNA。利用标准分子生物学技术分离和纯化PCR产物。
为了产生人TNFR2Δ7cDNA，在全长人TNFR2cDNA上进行两个分离的PCR反应，以产生TNFR2Δ7cDNA的重叠片段。在一个反应中，利用正向引物TR003(SEQ ID NO：190)和反向引物TR004(SEQ ID NO：191)对全长TNFR2cDNA进行PCR。在一个反应中，利用反向引物TR005(SEQ IDNO：192)和正向引物TR002对全长TNFR2cDNA进行PCR。最后，合并2个重叠片段，并利用正向引物TR002和反向引物TR004进行PCR。利用标准分子生物学技术分离和纯化PCR产物，所述PCR产物预计包含具有终止密码子的1308bp的TNFR2Δ7开放阅读框(SEQ ID NO：125)。
类似地，在这些PCR反应中，利用反向引物TR001代替反向引物TR004产生具有终止密码子的1305bp的人TNFR2Δ7的开放阅读框。当最终的PCR产物被插入适当的载体中时，这也允许添加框内的C末端亲合力纯化标记，例如His标记。
实施例12-产生人TNFR1Δ7
通过购买从OriGene(产品目录No：TC127913，NM_001065.2)获取包含全长人TNFR2cDNA的cDNA质粒。通过利用反向引物TR006(SEQ IDNO：204)和正向引物TR007(SEQ ID NO：205)在质粒上实施PCR来获取cDNA。利用标准分子生物学技术分离和纯化全长人TNFR1cDNA的PCR产物。
或者，通过利用反向引物TR006和正向引物TR007对来自人单核细胞的总RNA实施RT-PCR，来获取全长人TNFR1cDNA。利用标准分子生物学技术分离和纯化全长人TNFR1cDNA的PCR产物。
为了产生人TNFR1Δ7cDNA，在全长人TNFR1cDNA上进行两个分离的PCR反应，以产生TNFR1Δ7cDNA的重叠片段。在一个反应中，利用正向引物TR008(SEQ ID NO：206)和反向引物TR006对全长TNFR1cDNA进行PCR。在一个反应中，利用反向引物TR009(SEQ ID NO：207)和正向引物TRO1O(SEQ ID NO：208)对全长TNFR1cDNA进行PCR。最后，合并2个重叠片段，并利用正向引物TRO1O和反向引物TR006进行PCR。利用标准分子生物学技术分离和纯化PCR产物，所述PCR产物包含具有终止密码子的1254bp的人TNFR1Δ7开放阅读框(SEQ ID NO：121)。
或者，在这些PCR反应中，可以利用反向引物TR011代替反向引物TR006产生没有终止密码子的1251bp的人TNFR1Δ7的开放阅读框。当最终的PCR产物被插入适当的载体中时，这也允许添加框内的C末端亲合力纯化标记，例如His标记。
实施例13-产生鼠科动物TNFR2Δ7cDNA
为了产生全长鼠科动物TNFR2cDNA，利用反向引物TR012(SEQ IDNO：214)和正向引物TR013(SEQ ID NO：215)对商业上获得的FirstChoiceTM的为PCR准备的小鼠肝cDNA(PCR-Ready Mouse Liver cDNA)(Ambion，产品目录No：AM3300)进行PCR。利用标准分子生物学技术分离和纯化全长鼠科动物TNFR2cDNA的PCR产物。然后，通过利用TR014正向引物(SEQ IDNO：216)和反向引物TR012对所产生的产物进行PCR，将合适的Kozak序列引入其中。
或者，通过利用反向引物TR015(SEQ ID NO：217)和正向引物TR016(SEQ ID NO：218)对来自人单核细胞或小鼠肝细胞的总RNA实施RT-PCR，来获取全长的鼠TNFR2cDNA。利用标准分子生物学技术分离和纯化全长鼠科动物TNFR2cDNA的PCR产物。
为了产生鼠的TNFR2Δ7cDNA，在全长鼠的TNFR2cDNA上进行两个分离的PCR反应，以产生TNFR2Δ7cDNA的重叠片段。在一个反应中，利用正向引物TR017(SEQ ID NO：219)和反向引物TR015对全长TNFR2cDNA进行PCR。在一个反应中，利用反向引物TR018(SEQ ID NO：220)和正向引物TR016对全长TNFR2cDNA进行PCR。最后，合并2个重叠片段，并利用正向引物TR016和反向引物TR015进行PCR。利用标准分子生物学技术分离和纯化PCR产物，所述PCR产物预计包含具有终止密码子的1348bp的鼠TNFR2Δ7开放阅读框(SEQ ID NO：127)。
或者，在这些PCR反应中，可以利用反向引物TR019(SEQ ID NO：221)代替反向引物TR015产生没有终止密码子的1345bp的鼠TNFR2Δ7的开放阅读框。当最终的PCR产物被插入适当的载体中时，这也允许添加框内的C末端亲合力纯化标记，例如His标记。
实施例14-产生鼠科动物TNFR1Δ7cDNA
为了产生全长鼠科动物TNFR1cDNA，利用反向引物TR020(SEQ IDNO：230)和正向引物TR021(SEQ ID NO：231)对商业上获得的FirstChoiceTM的为PCR准备的小鼠肝cDNA(PCR-Ready Mouse Liver cDNA)(Ambion，产品目录No：AM3300)进行PCR。利用标准分子生物学技术分离和纯化全长鼠科动物TNFR1cDNA的PCR产物。
或者，通过利用反向引物TR020和正向引物TR021对来自小鼠单核细胞的总RNA实施RT-PCR，来获取全长鼠TNFR1cDNA。利用标准分子生物学技术分离和纯化全长鼠科动物TNFR1cDNA的PCR产物。为了产生鼠的TNFR1Δ7cDNA，在全长人TNFR1cDNA上进行两个分离的PCR反应，以产生TNFR1Δ7cDNA的重叠片段。在一个反应中，利用正向引物TR022(SEQID NO：232)和反向引物TR020对全长TNFR1cDNA进行PCR。在另一个反应中，利用反向引物TR023(SEQ ID NO：233)和正向引物TR024(SEQ IDNO：234)对全长TNFR1cDNA进行PCR。最后，合并2个重叠片段，并利用正向引物TR024和反向引物TR020进行PCR。利用标准分子生物学技术分离和纯化1259bp的PCR产物，所述PCR产物包含具有终止密码子的1251bp的鼠TNFR1Δ7开放阅读框(SEQ ID NO：123)。
或者，在这些PCR反应中，可以利用反向引物TR025(SEQ ID NO：235)代替反向引物TR020产生没有终止密码子的1248bp的鼠TNFR1Δ7的开放阅读框。当最终的PCR产物被插入适当的载体中时，这也允许添加框内的C未端亲合力纯化标记，例如His标记。
实施例15-构建在哺乳动物细胞中表达人TNFR2Δ7的载体
为了在哺乳动物细胞中表达人TNFR2Δ7蛋白质，将来自实施例12的人TNFR2Δ7cDNA PCR产物整合到适当的哺乳动物表达载体中。依照厂家的说明，将来自实施例12的具有和不具有终止密码子的TNFR2Δ7cDNA PCR产物与pcDNATM3.1D V5-His
Figure G2007800535955D00821
表达载体(Invitrogen)进行平末端连接和分离。依照供应商的说明，用包含编码人TNFR2Δ7的插入物的质粒转化
Figure G2007800535955D00822
Top10感受态细胞(Invitrogen)。将五十毫升转化混合物平铺在具有100mg/mL氨苄青霉素的LB培养基上，37℃温育过夜。将单个集落接种到具有100mg/mL氨苄青霉素的LB培养基上，37℃温育过夜。然后将培养物接种到具有100mg/mL氨苄青霉素的200mL LB培养基上，37℃生长过夜。依照厂家的说明，利用GenEluteTM质粒Maxiprep试剂盒(Plasmid Maxiprep kit)(Sigma)分离质粒。纯化效率为每次制备0.5-1.5mg质粒。
产生三个人TNFR2Δ7克隆(1319-1，1138-5与1230-1)，并对它们进行测序。克隆1319-1包含后面直接连接有来自质粒的框内His标记的没有终止密码子的人TNFR2Δ7开放阅读框；而克隆1138-5和1230-1包含后面立刻连接有终止密码子的TNFR2Δ7开放阅读框。SEQ ID NO：242中给出了来自质粒的His标记的序列。克隆1230-1和1319-1的TNFR2Δ7开放阅读框的序列分别与具有和没有终止密码子的SEQ ID NO：125相同。然而，相对于SEQ IDNO：125，克隆1138-5的TNFR2Δ7开放阅读框的序列(SEQ ID NO：231)在外显子10的位置1055处有一个核苷酸不同，前者是A，而后者是G。该单核苷酸变化导致氨基酸352由谷氨酰胺变成精氨酸。
实施例16-在大肠杆菌中表达人TNFR2Δ7
为了在细菌中表达人TNFR2Δ7蛋白质，将来自实施例12的人TNFR2Δ7cDNA整合到适当的表达载体，例如pETDirectional
Figure G2007800535955D00831
表达载体(Invitrogen)中。利用正向引物(TR002)(SEQ ID NO：191)和反向引物(TR026)SEQ ID NO：195对来自实施例12的PCR片段进行PCR，以引入适合载体的同源重组位点。依照厂家的说明，用pET101/D-载体(Invitrogen)温育产生的PCR片段以产生人TNFR2Δ7细菌表达载体。产生的载体被转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中。然后依照厂家的说明从细菌细胞表达人TNFR2Δ7。
实施例17-在昆虫细胞中表达人TNFR2Δ7
为了在昆虫细胞中表达人TNFR2Δ7蛋白质，将来自实施例12的人TNFR2Δ7cDNA整合到杆状病毒载体中。利用正向引物(TR027)(SEQ IDNO：196和反向引物(TR028)(SEQ ID NO：197)对来自实施例12的人TNFR2Δ7cDNA进行PCR。用限制性内切酶EcoRI和Xhol消化产生的PCR产物。将消化的PCR产物与EcoRI和Xhol消化的pENTRTM载体(Invitrogen)，例如pENTR(TM)1A，pENTR(TM)2B，pENTR(TM)3C，pENTR(TM)4或pENTR(TM)11载体中的任何一个连接以产生输入载体。然后，利用标准分子生物学技术分离，扩增和纯化产物。
依照厂家的说明，利用LRClonaseTM(Invitrogen)，通过输入载体与BaculoDirectTM线性DNA(Invitrogen)的同源重组产生包含人TNFR2Δ7cDNA的杆状病毒载体。然后用反应混合物感染Sf9细胞以产生重组的杆状病毒。收获重组杆状病毒以后，证实人TNFR2Δ7被表达。重组杆状病毒的扩增产生了高滴度的病毒库存。用高滴度的病毒库存感染Sf9细胞，从而表达人TNFR2Δ7蛋白质。
实施例18-表达人TNFR2Δ7的腺相关病毒载体的产生
为了在体外或体内将人TNFR2Δ7基因递送给哺乳动物细胞以在所述哺乳动物细胞中进行表达，按照Grieger，J.，et al.，2006，Nature Protocols 1：1412的描述利用三质粒转染系统产生重组的腺病毒相关病毒(rAAV)载体。利用正向引物(TR029)(SEQ ID NO：198)和反向引物(TR030)(SEQ IDNO：199)对实施例12的纯化的人TNFR2D7PCR产物进行PCR，以引入侧接的唯一的NotI限制性位点。用Notl限制性内切酶消化产生的PCR产物，并通过标准分子生物学技术进行分离。然后，将Notl消化的片段连接到Notl消化的pTR-UF2(美国北卡罗来纳州大学(UNC)的载体中心实验室)上，以产生包含人TNFR2D7开放阅读框的质粒，所述开放阅读框与CMVie启动子操作性连接，还侧接了末端反向重复。然后，按照Grieger，J.等的描述，用质粒pXX680和pHelper(UNC载体中心试验室)将产生的质粒转染到HEK-293细胞中，以产生包含人TNFR2Δ7基因的rAAV粒子，其中人TNFR2Δ7基因的表达由较强的组成型CMVie启动子驱动。按照Grieger，J.等的描述收获并纯化病毒粒子以提供适合转导哺乳动物细胞的rAAV原料。
实施例19-在大肠杆菌中表达人TNFR1Δ7
为了在细菌中表达人TNFR1Δ7蛋白质，将cDNA整合到适当的表达载体，例如pETDirectional
Figure G2007800535955D00841
表达载体(Invitrogen)中。利用正向引物(TR010)(SEQ ID NO：208和反向引物(TR006)(SEQ ID NO：204)对cDNA进行PCR，以引入适合载体的同源重组位点。依照厂家的说明，用pET101/D-
Figure G2007800535955D00842
载体(Invitrogen)温育产生的PCR片段以产生人TNFR1Δ7细菌表达载体。产生的载体被转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中。然后依照厂家的说明从细菌细胞表达人TNFR1Δ7。
实施例20-在哺乳动物细胞中表达人TNFR1Δ7
为了在哺乳动物细胞中表达人TNFR1Δ7蛋白质，将人TNFR1Δ7cDNAPCR产物整合到适当的哺乳动物表达载体中，依照厂家的说明，将人TNFR1Δ7cDNA PCR产物与pcDNATM3.1D V5-His
Figure G2007800535955D00851
表达载体(Invitrogen)进行平末端连接。然后，利用标准分子生物学技术分离，扩增和纯化产物以产生哺乳动物表达载体。然后，载体被转染到哺乳动物细胞中，其中人TNFR1Δ7蛋白质的表达由较强的组成型CMVie启动子驱动。
实施例21-在昆虫细胞中表达人TNFR1Δ7
为了在昆虫细胞中表达人TNFR1Δ7蛋白质，将来自实施例12的cDNA整合到杆状病毒载体中。利用正向引物(TR031)(SEQ ID NO：210)和反向引物(TR032)(SEQ ID NO：211)对来自实施例12的cDNA进行PCR。用限制性内切酶EcoRI和Xhol消化产生的PCR产物。将消化的PCR产物与EcoRI和Xhol消化的pENTRTM载体(Invitrogen)，例如pENTRTM1A，pENTRTM2B，pENTRTM3C，pENTRTM4或pENTRTM11载体中的任何一个的连接以产生输入载体。然后，利用标准分子生物学技术分离，扩增和纯化产物。
依照厂家的说明，利用LR ClonaseTM(Invitrogen)，通过输入载体与BaculoDirectTM线性DNA(Invitrogen)的同源重组产生包含人TNFR1Δ7cDNA的杆状病毒载体。然后用反应混合物感染Sf9细胞以产生重组的杆状病毒。收获重组杆状病毒以后，证实人TNFR1Δ7被表达。重组杆状病毒的扩增产生了高滴度的病毒库存。用高滴度的病毒库存感染Sf9细胞，从而表达人TNFR1Δ7蛋白质。
实施例22-表达人TNFR1Δ7的腺相关病毒载体的产生
为了在体外或体内将人TNFR1Δ7基因递送给哺乳动物细胞以在所述哺乳动物细胞中进行表达，按照Grieger，J.，et al.，2006，Nature Protocols 1：1412的描述利用三质粒转染系统产生重组的腺病毒相关病毒(rAAV)载体。利用正向引物(TR033)(SEQ ID NO：212)和反向引物(TR034)(SEQ ID NO：213)对纯化的人TNFR1D7PCR产物进行PCR，以引入侧接的Notl限制性位点。用Notl限制性内切酶消化产生的PCR产物，并通过标准分子生物学技术进行分离。然后，将Notl消化的片段连接到Notl消化的pTR-UF2(美国北卡罗来纳州大学(UNC)的载体中心实验室)上，以产生包含人TNFR1D7开放阅读框的质粒，所述开放阅读框与CMVie启动子操作性连接，还侧接了末端反向重复。然后，按照Grieger，J.等的描述，用质粒pXX680和pHelper(UNC载体中心试验室)将产生的质粒转染到HEK-293细胞中，以产生包含人TNFR1Δ7基因的rAAV粒子，其中人TNFR1Δ7基因的表达由较强的组成型CMVie启动子驱动。按照Grieger，J.等的描述收获并纯化病毒粒子以提供适合转导哺乳动物细胞的rAAV原料。
实施例23-构建在哺乳动物细胞中表达小鼠TNFR2Δ7的载体
为了在哺乳动物细胞中表达鼠的TNFR2Δ7蛋白质，将来自实施例14的鼠的TNFR2Δ7cDNA PCR产物整合到适当的哺乳动物表达载体中。依照厂家的说明，将来自实施例14的具有和不具有终止密码子的TNFR2Δ7cDNAPCR产物与pcDNATM3.1D V5-His
Figure G2007800535955D00861
表达载体(Invitrogen)进行平末端连接和分离。依照供应商的说明，用包含编码鼠的Δ7TNFR2的插入物的质粒转化
Figure G2007800535955D00862
Top10感受态细胞(Invitrogen)。将五十毫升转化混合物平铺在具有100mg/mL氨苄青霉素的LB培养基上，37℃温育过夜。将单个集落接种到具有100mg/mL氨苄青霉素的LB培养基上，37℃温育过夜。然后将培养物接种到具有100mg/mL氨苄青霉素的200mL LB培养基上，37℃生长过夜。依照厂家的说明，利用GenEluteTM质粒Maxiprep试剂盒(Plasmid Maxiprepkit)(Sigma)分离质粒。纯化效率为每次制备0.5-1.5mg质粒。
产生两个鼠TNFR2Δ7克隆(1144-4和1145-3)，并对它们进行测序。克隆1144-4包含后面直接连接有来自质粒的框内His标记的没有终止密码子的鼠的TNFR2Δ7开放阅读框；而克隆1145-3包含后面立刻连接有终止密码子的TNFR2Δ7开放阅读框。SEQ ID NO：242中给出了来自质粒的His标记的序列。相对于SEQ ID NO：127，两个克隆1144-4和1145-3的TNFR2Δ7开放阅读框的序列在位置11处有一个核苷酸不同。这些单个核苷酸的变化导致相对于SEQ ID NO：128出现了四个氨基酸不同。
实施例24-在大肠杆菌中表达鼠TNFR2Δ7
为了在细菌中表达小鼠TNFR2Δ7蛋白质，将来自实施例14的小鼠TNFR2Δ7cDNA整合到适当的表达载体，例如pET Directional
Figure G2007800535955D00871
表达载体(Invitrogen)中。利用正向引物(TR035)(SEQ ID NO：222)和反向引物(TR036)(SEQ ID NO：223)对来自实施例14的PCR片段进行PCR，以引入适合载体的同源重组位点。依照厂家的说明，用pET101/D-载体(Invitrogen)温育产生的PCR片段以产生鼠的TNFR2Δ7细菌表达载体。产生的载体被转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中。然后依照厂家的说明从细菌细胞表达鼠的TNFR2Δ7。
实施例25-在昆虫细胞中表达小鼠TNFR2Δ7
为了在昆虫细胞中表达鼠的TNFR2Δ7蛋白质，将来自实施例14的cDNA整合到杆状病毒载体中。利用正向引物(TR037)(SEQ ID NO：224)和反向引物(TR038)(SEQ ID NO：225)对来自实施例14的cDNA进行PCR。用限制性内切酶EcoRI和Xhol消化产生的PCR产物。将消化的PCR产物与EcoRI和Xhol消化的pENTRTM载体(Invitrogen)，例如pENTRTM1A，pENTRTM2B，pENTRTM3C，pENTRTM4或pENTRTM11载体中的任何一个的连接以产生输入载体。然后，利用标准分子生物学技术分离，扩增和纯化产物。依照厂家的说明，利用LR ClonaseTM(Invitrogen)，通过输入载体与BaculoDirectTM线性DNA(Invitrogen)的同源重组产生包含鼠的TNFR2Δ7cDNA的杆状病毒载体。然后用反应混合物感染Sf9细胞以产生重组的杆状病毒。收获重组杆状病毒以后，证实鼠的TNFR2Δ7被表达。重组杆状病毒的扩增产生了高滴度的病毒库存。用高滴度的病毒库存感染Sf9细胞，从而表达鼠的TNFR2Δ7蛋白质。
实施例26-表达鼠的TNFR2Δ7的腺相关病毒载体的产生
为了在体外或体内将鼠的TNFR2Δ7基因递送给哺乳动物细胞以在所述哺乳动物细胞中进行表达，按照Grieger，J.，et al.，2006，Nature Protocols 1：1412的描述利用三质粒转染系统产生重组的腺病毒相关病毒(rAAV)载体。利用正向引物(TR039)(SEQ ID NO：226)和反向引物(TR040)(SEQ IDNO：227)对实施例14的纯化的鼠TNFR2D7PCR产物进行PCR，以引入侧接的唯一的Notl限制性位点。用Notl限制性内切酶消化产生的PCR产物，并通过标准分子生物学技术进行分离。然后，将Notl消化的片段连接到Notl消化的pTR-UF2(美国北卡罗来纳州大学(UNC)的载体中心实验室)上，以产生包含鼠的TNFR2D7开放阅读框的质粒，所述开放阅读框与CMVie启动子操作性连接，还侧接了末端反向重复。然后，按照Grieger，J.等的描述，用质粒pXX680和pHelper(UNC载体中心试验室)将产生的质粒转染到HEK-293细胞中，以产生包含鼠的TNFR2Δ7基因的rAAV粒子，其中鼠的TNFR2Δ7基因的表达由较强的组成型CMVie启动子驱动。按照Grieger，J.等的描述收获并纯化病毒粒子以提供适合转导哺乳动物细胞的rAAV原料。
实施例27-在大肠杆菌中表达鼠的TNFR1Δ7
为了在细菌中表达小鼠TNFR1Δ7蛋白质，将来自实施例15的cDNA整合到适当的表达载体，例如pET Directional
Figure G2007800535955D00881
表达载体(Invitrogen)中。利用正向引物(TR024)(SEQ ID NO：234)和反向引物(TR020)(SEQ IDNO：235)对来自实施例15的互补DNA进行PCR，以引入适合载体的同源重组位点。依照厂家的说明，用pET101/D-
Figure G2007800535955D00882
载体(Invitrogen)温育产生的PCR片段以产生鼠的TNFR1Δ7细菌表达载体。产生的载体被转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中。然后依照厂家的说明从细菌细胞表达鼠的TNFR1Δ7。
实施例28-在哺乳动物细胞中表达小鼠TNFR1Δ7
为了在哺乳动物细胞中表达鼠的TNFR1Δ7蛋白质，将来自实施例15的鼠的TNFR1Δ7cDNA PCR产物整合到适当的哺乳动物表达载体中。依照厂家的说明，将来自实施例15的鼠的TNFR1Δ7cDNA PCR产物与pcDNATM3.1DV5-His
Figure G2007800535955D00883
表达载体(Invitrogen)进行平末端连接。然后，利用标准分子生物学技术分离，扩增和纯化产物以产生哺乳动物表达载体。然后，载体被转染到哺乳动物细胞中，其中鼠的TNFR1Δ7蛋白质的表达由较强的组成型CMVie启动子驱动。
实施例29-在昆虫细胞中表达小鼠TNFR1Δ7
为了在昆虫细胞中表达鼠的TNFR1Δ7蛋白质，将来自实施例15的cDNA整合到杆状病毒载体中。利用正向引物(TR041)(SEQ ID NO：236)和反向引物(TR042)(SEQ ID NO：237)对来自实施例15的cDNA进行PCR。用限制性内切酶EcoRI和Xhol消化产生的PCR产物。将消化的PCR产物与EcoRI和Xhol消化的pENTRTM载体(Invitrogen)，例如pENTRTM1A，pENTRTM2B，pENTRTM3C，pENTRTM4或pENTRTM11载体中的任何一个的连接以产生输入载体。然后，利用标准分子生物学技术分离，扩增和纯化产物。依照厂家的说明，利用LRClonaseTM(Invitrogen)，通过输入载体与BaculoDirectTM线性DNA(Invitrogen)的同源重组产生包含鼠的TNFR1Δ7cDNA的杆状病毒载体。然后用反应混合物感染Sf9细胞以产生重组的杆状病毒。收获重组杆状病毒以后，证实鼠的TNFR1Δ7被表达。重组杆状病毒的扩增产生了高滴度的病毒库存。用高滴度的病毒库存感染Sf9细胞，从而表达鼠的TNFR1Δ7蛋白质。
实施例30-表达鼠的TNFR1Δ7的腺相关病毒载体的产生
为了在体外或体内将鼠的TNFR1Δ7基因递送给哺乳动物细胞以在所述哺乳动物细胞中进行表达，按照Grieger，J.，et al.，2006，Nature Protocols1：1412的描述利用三质粒转染系统产生重组的腺病毒相关病毒(rAAV)载体。利用正向引物(TR043)(SEQ ID NO：238)和反向引物(TR044)(SEQIDNO：239)对实施例14的纯化的鼠TNFR1D7PCR产物进行PCR，以引入侧接的唯一的Notl限制性位点。用Notl限制性内切酶消化产生的PCR产物，并通过标准分子生物学技术进行分离。然后，将Notl消化的片段连接到Notl消化的pTR-UF2(美国北卡罗来纳州大学(UNC)的载体中心实验室)上，以产生包含鼠的TNFR1D7开放阅读框的质粒，所述开放阅读框与CMVie启动子操作性连接，还侧接了末端反向重复。然后，按照Grieger，J.等的描述，用质粒pXX680和pHelper(UNC载体中心试验室)将产生的质粒转染到HEK-293细胞中，以产生包含鼠的TNFR2Δ7基因的rAAV粒子，其中鼠的TNFR1Δ7基因的表达由较强的组成型CMVie启动子驱动。按照Grieger，J.等的描述收获并纯化病毒粒子以提供适合转导哺乳动物细胞的rAAV原料。
实施例31-表达TNFR Δ7的慢病毒载体的产生
为了在体外或体内将TNFR Δ7基因递送给哺乳动物细胞以在所述哺乳动物细胞中进行表达，要产生不能复制的慢病毒载体。依照厂家的说明，将来自实施例27、30、35和38的PCR产物与pLenti6/V5-D-载体(Invitrogen)进行平末端连接。利用标准分子生物学技术将所产生的质粒转化到大肠杆菌中，并对其进行扩增和纯化。依照厂家的说明将该质粒转染到293FT细胞(Invitrogen)中以产生包含TNFRΔ7基因的慢病毒粒子，其中TNFRΔ7基因的表达由较强的组成型CMVie启动子驱动。按照Tiscornia，G.，et al.，2006，Nature Protocols 1：241的描述收获并纯化病毒粒子以提供适合转导哺乳动物细胞的慢病毒原料。
实施例32-在哺乳动物细胞中表达TNFR2Δ7
用实施例26和34产生的质粒在哺乳动物HeLa细胞中表达活性蛋白质，并测试所产生的蛋白质的抗TNF-alpha活性。HeLa细胞接种在装有包含L-谷氨酰胺、庆大霉素、卡那霉素、5％FBS和5％HS的SMEM培养基的24孔板中，每孔1.0x105个细胞。37℃在包含5％CO2的湿润空气中让细胞生长过夜。将大约250ng质粒DNA添加到50ml OPTI-MEMTM中，然后添加50mlLipofectamineTM 2000混合物(1份LipofectamineTM2000与25份OPTI-MEMTM)并温育20分钟。接下来，添加400ml无血清培养基，并将其施用给24孔板中的细胞。37℃在包含5％CO2的湿润空气中温育48小时后，收集培养基并将细胞收获在800mL TRI-ReagentTM中。依照厂家的说明从细胞分离总RNA，并利用适合于人TNFR2Δ7的正向引物TR047(SEQ ID NO：200)和反向引物TR048(SEQ ID NO：201)或适合于小鼠TNFR2Δ7的正向引物TR045(SEQ ID NO：228)和反向引物TR046(SEQ ID NO：229)进行RT-PCR分析。通过ELISA测定培养基中可溶性TNFR2的浓度。
在L929细胞毒性试验中测试上述培养基的抗TNF-alpha活性。L929细胞接种在装有包含10％常规FBS、青霉素和链霉素的MEM培养基的96孔板中，每孔2x104个细胞，37℃在包含5％CO2的湿润空气中让细胞生长过夜。用来自未转染Hela细胞的培养基将培养基样品稀释1、2、4、8和16倍。将这些样品中的每种样品取90μl添加到10μl的包含1.0ng/ml TNF-alpha和1ug/ml的放线菌素D的无血清培养基中。去除细胞的培养基并用所述的100μl的样品替换培养基。然后，37℃在包含5％CO2的湿润空气中让细胞生长过夜。然后将20mLCellTiter
Figure G2007800535955D00901
AQueousOne Solution Reagent(Promega)添加到每个孔中。4小时以后，通过用全自动定量绘图酶标仪测量490nm的吸光度来测量细胞的生存能力。参照未处理细胞，将细胞生存能力标准化，并以TNF拮抗剂的浓度为函数绘图(图17)。
利用GraphPad软件分析来自该实施例和实施例9的数据以确定3拮抗剂的EC50值。对
Figure G2007800535955D00912
于这些实施例的每一种拮抗剂，通过用分别被固定在100％和0％的最大和最小反应进行非线性回归拟合S形剂量反应曲线。表8显示的EC50值相当于95％的置信水平，每个曲线具有从0.7到0.9的r2值。
表8：TNF-alpha拮抗剂的活性
TNF-α拮抗剂   EC50(ng/mL)
  依那西普   1.1±0.5
  重组可溶性TNFR2(rsTNFR2)   698±180
  SSO 3305处理的鼠血清(小鼠TNFR2Δ7)   0.6±0.2
  SSO 3274处理的鼠血清(小鼠TNFR2Δ7)   0.8±0.3
  来自于1144-4转染Hela细胞的胞外介质(小鼠TNFR2Δ7)   2.4±1.4
  来自于1145-3转染Hela细胞的胞外介质(小鼠TNFR2Δ7)   2.4±0.8
  来自于1230-1转染Hela细胞的胞外介质(人TNFR2Δ7)   1.4±1.1
  来自于1319-1转染Hela细胞的胞外介质(人TNFR2Δ7)   1.7±1.0
  来自于1138-5转染Hela细胞的胞外介质(人TNFR2Δ7)   1.8±1.1
实施例33-哺乳动物细胞中TNFR2Δ7的表达和纯化
实施例15和实施例中产生的质粒用来从哺乳动物HeLa细胞中表达和纯化TNFR2Δ7。HeLa细胞接种在6孔板中，每孔5x105个细胞，37℃在包含5％CO2的湿润空气中让细胞生长过夜。然后，利用1144-4(具有His标记的小鼠TNFR2Δ7)，1145-1(没有His标记的小鼠TNFR2Δ7)，1230-1(没有His标记的人TNFR2Δ7)或1319-1(具有His标记的人TNFR2Δ7)质粒，用1.5mg质粒DNA转染每个孔。转染后～48小时收集培养基并利用Amicon MWCO 30,000过滤器浓缩大约40倍。让细胞溶解在具有蛋白酶抑制剂(Sigma-aldrich)的120mL RIPA溶解缓冲液(Invitrogen)，在冰上保持5分钟。通过Bradford试验确定蛋白质浓度。从部分细胞裂解物分离蛋白质，并通过实施例1描述的适合于TNFR2的蛋白质印迹分析细胞外培养基(图18)。
通过亲和层析法从上述培养基纯化具有His标记的人和小鼠TNFR2D7(分别为克隆1319-1和1144-4)。HisPurTM钴离心柱(Pierce)被用来从上述培养基中纯化包含His标记的小鼠和人TNFR2Δ7。厂家推荐用50mM磷酸钠、300mM氯化钠、10mM咪唑缓冲液(pH 7.4)平衡的1ml HisPurTM柱可以纯化大约32ml培养基。然后，用两倍柱体积的相同缓冲液冲洗柱子，用1ml 50mM的磷酸钠、300mM氯化钠、150mM咪唑缓冲液(pH 7.4)洗脱蛋白质。通过如上所述的蛋白质印迹分析每种洗脱液5ml。TNFR2Δ7出现在洗脱液中，多个条带代表TNFR2D7可变的糖基化形式。经过上述纯化步骤的由不包含His标记的质粒1230-1或1145-1表达的TNFR2D7蛋白质作为阴性对照。这些蛋白质不结合亲和层析柱且不出现在洗脱液中(图19)。
Figure IYZ000007012129600021
Figure IYZ000007012129600031
Figure IYZ000007012129600051
Figure IYZ000007012129600071
Figure IYZ000007012129600081
Figure IYZ000007012129600101
Figure IYZ000007012129600111
Figure IYZ000007012129600131
Figure IYZ000007012129600141
Figure IYZ000007012129600151
Figure IYZ000007012129600171
Figure IYZ000007012129600181
Figure IYZ000007012129600191
Figure IYZ000007012129600201
Figure IYZ000007012129600211
Figure IYZ000007012129600221
Figure IYZ000007012129600231
Figure IYZ000007012129600241
Figure IYZ000007012129600261
Figure IYZ000007012129600271
Figure IYZ000007012129600281
Figure IYZ000007012129600291
Figure IYZ000007012129600301
Figure IYZ000007012129600311
Figure IYZ000007012129600321
Figure IYZ000007012129600331
Figure IYZ000007012129600341
Figure IYZ000007012129600351
Figure IYZ000007012129600361
Figure IYZ000007012129600371
Figure IYZ000007012129600381
Figure IYZ000007012129600391
Figure IYZ000007012129600401
Figure IYZ000007012129600411
Figure IYZ000007012129600421
Figure IYZ000007012129600431
Figure IYZ000007012129600451
Figure IYZ000007012129600461
Figure IYZ000007012129600471
Figure IYZ000007012129600481
Figure IYZ000007012129600501
Figure IYZ000007012129600511
Figure IYZ000007012129600521
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Figure IYZ000007012129600571
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Figure IYZ000007012129600611
Figure IYZ000007012129600621
Figure IYZ000007012129600641

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1.如SEQ ID NO：245所示的寡聚物。
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