JP7012033B2 - インビトロ腎毒性スクリーニングアッセイ - Google Patents
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Description
本発明は、毒性バイオマーカーとしての上皮成長因子受容体(EGFR)のレベルを、場合によっては腎損傷分子-1 (KIM-1)およびアデノシン三リン酸(ATP)のような他のバイオマーカーと組み合わせて測定する細胞ベースのインビトロアッセイを用いて、核酸分子、特にsiRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアプタマーなどの核酸分子のインビボ腎毒性を予測するための方法に関する。本発明はさらに、核酸分子のライブラリー、特にRNAi剤、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアプタマーなどの核酸分子のライブラリーから、インビボ投与のための1種または複数種の核酸分子を、前記方法を用いて選択する方法に関する。
新規かつ最適化された薬物候補を同定する際の問題の一つは、用量制限毒性の事象である。インビボで評価したとき、典型的には、核酸分子化合物の一部は、薬物誘発性腎障害または腎毒性のような、毒性表現型を生じさせることがある。過去数年間に、核酸分子の腎毒性を予測するための数多くのモデルが、様々なバイオマーカーを用いて開発されてきた。
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのような核酸分子のインビボ腎毒性を予測するための細胞ベースのインビトロアッセイにおいて信頼できるバイオマーカーとしてのEGFRを確立する。
本発明は、核酸分子、特にオリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビボ腎毒性を予測することが見出された、インビトロ毒性アッセイを提供する。
a) 適切な細胞培養培地中で上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞を培養する段階;
b) 該細胞培養物に該核酸分子を投与する段階;
c) 該細胞をある期間にわたってインキュベートする段階;および
d) その後、該細胞内のEGFR mRNAレベルを測定する段階
を含み、EGFR mRNAの低下は、腎毒性に関連するかまたは腎毒性に関連すると予測される核酸分子を示す。
a. 核酸分子のライブラリーを得る段階;
b. 該核酸分子のライブラリーの各メンバーを、上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞培養物に投与する段階;
c. 該細胞をある期間にわたってインビトロで培養する段階;
d. 各核酸分子について細胞内EGFR mRNAの量を測定する段階;および
e. 対照サンプルに対してEGFRの減少が80%を上回る1種または複数種の核酸分子を選択する段階
を含む。
[本発明1001]
哺乳動物における核酸分子のインビボ腎毒性を予測するためのインビトロ方法であって、
a. 適切な細胞培養培地中で、上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞を培養する段階;
b. 該細胞培養物に該核酸分子を投与する段階;
c. 該細胞をある期間にわたってインキュベートする段階;および
d. その後、該細胞内のEGFR mRNAレベルを測定する段階
を含み、EGFR mRNAレベルの低下が、腎毒性に関連するかまたは腎毒性に関連すると予測される核酸分子を示す、方法。
[本発明1002]
EGFR mRNAレベルが、ビヒクル対照または非毒性の参照核酸分子で処理した細胞から得られる参照値と比較され、ここで、非毒性の参照核酸分子はインビボで非毒性であると実証されている、本発明1001の方法。
[本発明1003]
非毒性の参照核酸分子が、CGTcagtatgcgAATc (SEQ ID NO: 1)からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物であり、ここで、小文字はDNA単位を表し、太字の大文字はβ-D-オキシ-LNA単位を表し、全てのLNA Cは5'メチルCであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である、本発明1002の方法。
[本発明1004]
ビヒクル対照または非毒性参照の値に対して80%を下回るEGFR mRNAレベルが、その核酸分子の腎毒性の予測となる、本発明1003の方法。
[本発明1005]
EGFR mRNAレベルが、腎毒性の参照核酸分子で処理した細胞から得られる第2の参照値とさらに比較され、ここで、腎毒性の参照核酸分子はインビボで腎毒性を引き起こすことが実証されている、本発明1002~1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
毒性の参照核酸分子が、GCtgtgtgagcttGG (SEQ ID NO: 4)からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物であり、ここで、小文字はDNA単位を表し、太字の大文字はβ-D-オキシ-LNA単位を表し、全てのLNA Cは5'メチルCであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である、本発明1005の方法。
[本発明1007]
段階(d)が細胞外腎損傷分子-1 (KIM-1)タンパク質または細胞内mRNAレベルの測定をさらに含み、ここで、KIM-1レベルの増加は、腎毒性に関連するかまたは腎毒性に関連すると予測される核酸分子を示す、本発明1001~1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
生理食塩水または非毒性参照の値に対して200%を上回るKIM-1タンパク質のレベルが、その核酸分子の腎毒性の予測となる、本発明1007の方法。
[本発明1009]
生理食塩水または非毒性参照の値に対して1000%を上回るKIM-1 mRNAのレベルが、その核酸分子の腎毒性の予測となる、本発明1007の方法。
[本発明1010]
EGFR mRNAレベルが低下しない場合でも、KIM-1の増加が核酸分子の腎毒性の予測となる、本発明1007~1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
段階(a)の培養培地が少なくとも4ng/mlの上皮成長因子(EGF)を含み、段階(d)が細胞内アデノシン三リン酸(ATP)レベルの測定をさらに含み、ここで、細胞内ATPレベルの低下は、腎毒性に関連するかまたは腎毒性に関連すると予測される原薬を示す、本発明1001~1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
生理食塩水または非毒性参照の値に対して80%を下回る細胞内ATPレベルが、前記原薬の腎毒性の予測となる、本発明1011の方法。
[本発明1013]
EGFRを発現する細胞が、上皮細胞、内皮細胞、間葉細胞、および神経外胚葉細胞からなる群より選択される、本発明1001~1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記細胞培養物が、近位尿細管上皮細胞、遠位尿細管上皮細胞、および集合管上皮細胞、特に初代ヒトPTECまたはラットPTEC細胞からなる群より選択される初代腎上皮細胞培養物である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
EGFRを発現する細胞が、ヒトPTEC-TERT-1、ciPTEC、CACO2、HK-2、NKi-2、またはヒトA549細胞株などの不死化細胞株から培養される、本発明1013の方法。
[本発明1016]
前記核酸分子とのインキュベーションの期間が2~6日間、例えば約3日間である、本発明1001~1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記核酸分子が、RNAi剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはアプタマーから選択される、本発明1001~1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記核酸分子が、2'-O-アルキル-RNA、2'-O-メチル-RNA、2'-アルコキシ-RNA、2'-O-メトキシエチル-RNA、2'-アミノ-DNA、2'-フルオロ-DNA、アラビノ核酸(ANA)、2'-フルオロ-ANA、およびLNAヌクレオシドからなる群より独立して選択される1つまたは複数の2'糖修飾ヌクレオシドを含む、本発明1001~1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記核酸分子が少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む、本発明1001~1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記核酸分子が、RNase Hを動員することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、本発明1001~1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
核酸分子のライブラリーから、哺乳動物へのインビボ投与のための1種または複数種の核酸分子を選択する方法であって、
a. 核酸分子のライブラリーを得る段階;
b. 該核酸分子のライブラリーの各メンバーを、本発明1013~1015のいずれかのように、上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞培養物に投与する段階;
c.本発明1016のように、該細胞をある期間にわたってインビトロで培養する段階;
d. 本発明1001~1012のいずれかのように、各核酸分子について細胞内EGFR mRNAおよび任意で追加のバイオマーカーの量を測定する段階;および
e. 参照値に対するEGFRの減少率が80%を上回る1種または複数種の核酸分子を選択する段階
を含む、方法。
[本発明1022]
毒性参照物質または親核酸分子と比較して、選択された核酸分子の治療指数が低下している、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記核酸分子のライブラリーが、本発明1017~1020のいずれかの核酸分子のライブラリーである、本発明1021または1022の方法。
[本発明1024]
前記核酸分子のライブラリーが親核酸分子の核酸分子変異体(子核酸分子)のライブラリーであり、ここで、親核酸分子は毒性、例えば腎毒性であり、段階(d)は、親核酸分子よりも毒性の低い1種または複数種の核酸分子変異体を同定し、該核酸分子変異体は親核酸分子の核酸塩基配列を保持する、本発明1021~1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
本発明1021~1024のいずれかの方法によって得られた、核酸分子。
[本発明1026]
本発明1025の核酸分子と、薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩および/またはアジュバントとを含有する、薬学的組成物。
[本発明1027]
医薬における使用のための、本発明1025の核酸分子または本発明1026の薬学的組成物。
不死化細胞株
本発明との関係において用語「不死化細胞株」とは、細胞が正常な細胞老化を免れて、細胞の連続的な増殖または分裂を可能にするように改変された、多細胞生物の単一の細胞に由来する細胞の集団として理解されるべきである。不死化細胞は、インビトロで長期間増殖させることができる。不死化のために必要とされる突然変異は、自然発生的に起こってもよいし、例えば、ウイルスベクター、遺伝子の欠失、テロメラーゼなどの遺伝子もしくはタンパク質の誘導、または癌細胞などの不死細胞との融合を用いて、意図的に誘発してもよい。
本発明との関係において用語「初代細胞培養物」とは、動物の特定の組織から分離された細胞の集団として理解されるべきである。初代細胞培養物は、事前の遺伝子操作またはクローン選択なしに培養されるが、それは、例えばFACSまたは選択的増殖条件を用いて、精製することができる。初代細胞培養物は、新鮮であってもよいし、凍結保存された組織から樹立されてもよい。
本発明によれば、標的核酸は、哺乳動物タンパク質をコードする核酸とすることができ、例えば、遺伝子、RNA、mRNA、pre-mRNA、成熟mRNAまたはcDNA配列であり得る。標的核酸はまた、マイクロRNA、長鎖ノンコーディングRNA、核小体低分子RNAまたはトランスファーRNAであってもよい。
本明細書で使用する用語「核酸分子」または「治療用核酸分子」は、共有結合でつながれた2個以上のヌクレオシドを含む分子として当業者には一般的に理解されている。本発明の方法において言及される核酸分子は、一般に、50ヌクレオチド長以下の治療用オリゴヌクレオチドである。核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドであっても、それを含んでもよく、またはRNAi剤、アプタマー、リボザイムなどの別のオリゴマー核酸分子であってもよい。核酸分子は、一般に、固相化学合成とそれに続く精製によって研究室で作られる。核酸分子の配列に言及する場合には、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基(nucleobase)部分もしくはその修飾体の配列または順序に言及する必要がある。本発明の核酸分子は人間が作り出したものであり、化学的に合成されて、典型的には精製または単離される。本発明の核酸分子は、1種または複数種の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含み得る。
本明細書で使用する用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって、標的遺伝子の発現を調節することができる核酸分子として定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般に、DNAまたはDNA様ヌクレオシドの1つまたは複数のストレッチ(stretch)を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってsiRNAではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。
本明細書で使用するとき、本明細書で相互交換可能に使用される用語「RNAi」、「RNAi剤」、「iRNA剤」、「RNA干渉剤」または「siRNA」は、RNAヌクレオシドを含み、かつRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)経路を介してRNA転写物などの標的核酸の標的化された切断を媒介する、オリゴヌクレオチド分子を指す。iRNAは、RNA干渉(RNAi)として知られるプロセスを介してmRNAの配列特異的分解を指令する。iRNAは、細胞、例えば哺乳動物対象者などの対象者内の細胞における標的核酸の発現を調節する、例えば阻害する。
本明細書で使用するアプタマーという用語は、リガンド-タンパク質相互作用またはリガンド-DNAヘリックス相互作用などのリガンド-標的相互作用を介して、標的を調節することができる三次元構造を形成するオリゴヌクレオチドまたはペプチドを指す。オリゴヌクレオチドアプタマーは、DNA、RNAもしくは修飾ヌクレオシドまたはこれらの混合物から形成することができる。アプタマーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはRNAi剤のように標的ハイブリダイゼーションを介してではなく、その三次元構造を介して有効である。
修飾ヌクレオシド間結合は、例えば、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエートおよびボラノホスフェートを含む群から選択され得る。いくつかの実施態様では、修飾ヌクレオシド間結合は、本発明の方法において試験されるオリゴヌクレオチドのRNase H動員と適合するものであり、例えば、ホスホロチオエート、ジホスホロチオエートまたはボラノホスフェートである。
本発明との関係において、用語「立体選択的」とは、オリゴヌクレオチド中に存在する少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合が特定の立体化学、すなわちRpまたはSpのいずれか、を有する核酸分子、例えばアンチセンス、RNIおよびアプタマー分子などのオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施態様では、立体選択的オリゴヌクレオチド中のホスホロチオエートヌクレオシド間結合の全てが立体選択的であり得、すなわち、各ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、RpおよびSpホスホロチオエートヌクレオシド間結合からなる群より独立して選択される。
本明細書で使用する用語「発現の調節」(modulation of expression)は、オリゴヌクレオチドの投与前の核酸標的の量と比較して、核酸標的の量を変化させるオリゴヌクレオチドの能力についての全体的な用語として理解されるべきである。あるいは、発現の調節は、対照実験を参照して判定することができる。対照は、生理食塩水組成物で処置された個体もしくは標的細胞、または非標的化オリゴヌクレオチド(モック)で処置された個体もしくは標的細胞である、ことが一般に理解される。しかし、それはまた、標準治療で処置された個体であってもよい。
非修飾DNAおよびRNA分子はインビボで急速に分解され、それ自体は治療的にほとんど役に立たない。したがって、典型的には、本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチドは修飾される。1つの広く使用される修飾は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の使用であり、これは核酸分解からオリゴヌクレオチドを安定化するだけでなく、望ましい薬理学的特性を提供することが知られている。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。
いくつかの実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは、1種または複数種の高親和性修飾ヌクレオシドを含む。高親和性修飾ヌクレオシドは、例えば融解温度(Tm)によって測定されるように、オリゴヌクレオチドに組み込まれたとき、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める修飾ヌクレオシドである。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり+0.5~+12℃、より好ましくは+1.5~+10℃、最も好ましくは+3~+8℃の融解温度の上昇をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野で公知であり、例えば、多くの2'置換ヌクレオシドなどの2'糖修飾ヌクレオシド、ならびにロックド核酸(LNA)が含まれる(例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443およびUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213を参照されたい)。
前記オリゴヌクレオチドは、修飾された糖部分、すなわち、天然に存在するDNAおよびRNAヌクレオシドに見出されるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する1種または複数種のヌクレオシドを含むことができる。
2'糖修飾ヌクレオシドは、2'位にHまたは-OH以外の置換基を持つヌクレオシド(2'置換ヌクレオシド)、または2'連結ビラジカルを含むヌクレオシドであり、2'置換ヌクレオシドおよびLNA (2'-4'ビラジカル架橋)ヌクレオシドが含まれる。例えば、2'修飾糖は、結合親和性の増強および/またはヌクレアーゼ耐性の増加をオリゴヌクレオチドに提供することができる。2'置換された修飾ヌクレオシドの例は、2'-O-アルキル-RNA、2'-O-メチル-RNA、2'-アルコキシ-RNA、2'-O-メトキシエチル-RNA(MOE)、2'-アミノ-DNA、2'-フルオロ-RNAおよび2'-F-ANAヌクレオシドである。さらなる例については、例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443およびUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213、ならびにDeleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937を参照されたい。以下は、いくつかの2'置換された修飾ヌクレオシドの例である。
いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドはLNAオリゴヌクレオチドであり、すなわち、それらは少なくとも1つのLNAヌクレオシドを含む。
式中、全てのキラル中心について、不斉基は、R配置またはS配置のいずれかで存在してもよく;
Xは、-O-、-S-、-N(RN*)-、-C(R6R6*)-から選択され、例えば、いくつかの実施態様では、-O-であり;
Bは、水素、置換されていてもよいC1-4-アルコキシ、置換されていてもよいC1-4-アルキル、置換されていてもよいC1-4-アシルオキシ、天然に存在する核酸塩基および核酸塩基アナログを含む核酸塩基、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドから選択され、好ましくは、Bは核酸塩基または核酸塩基アナログであり;
Pは、隣接モノマーへのヌクレオチド間結合、または5'末端基を示し、そのようなヌクレオチド間結合または5'末端基は、任意で、置換基R5または等しく適用可能な置換基R5*を含み;
P*は、隣接モノマーへのヌクレオチド間結合、または3'末端基を示し;
R4*およびR2*は、一緒になって、-C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-および>C=Zから選択される1~4個の基/原子からなる2価リンカー基を表し、ここで、Zは-O-、-S-および-N(Ra)-から選択され、RaおよびRbは、それぞれ独立して、水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、置換されていてもよいC1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、2個のジェミナル(geminal)置換基RaおよびRbは、一緒になって、置換されていてもよいメチレン(=CH2)を表すことができ、全てのキラル中心について、不斉基はR配置またはS配置のいずれかで存在してもよく;かつ
存在する置換基R1*、R2、R3、R5、R5*、R6およびR6*のそれぞれは、独立して、水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、2個のジェミナル置換基は、一緒になって、オキソ、チオキソ、イミノ、または置換されていてもよいメチレンを表すことができ、ここで、RNは、水素およびC1-4-アルキルから選択され、2個の隣接(非ジェミナル)置換基は二重結合を生じる追加の結合を表すことができ、そしてRN*は、存在しかつビラジカルに関与しない場合、水素およびC1-4-アルキルから選択される;ならびにそれらの塩基性塩および酸付加塩。全てのキラル中心について、不斉基はR配置またはS配置のいずれかで存在してもよい。
式中、Yは、-O-、-CH2O-、-S-、-NH-、N(Re)および/または-CH2-からなる群より選択される;ZおよびZ*は、ヌクレオチド間結合、RH、末端基または保護基の中から独立して選択される;Bは、天然または非天然ヌクレオチド塩基部分(核酸塩基)を構成し、RHは水素およびC1-4-アルキルから選択される;Ra、Rb、Rc、RdおよびReは、任意に独立して、水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、レポーター基、およびリガンドからなる群より選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、2個のジェミナル置換基RaおよびRbは、一緒になって、置換されていてもよいメチレン(=CH2)を表すことができる;RHは水素およびC1-4-アルキルから選択される。いくつかの実施態様では、Ra、Rb、Rc、RdおよびReは、任意に独立して、水素、およびメチルなどのC1-6アルキルからなる群より選択される。全てのキラル中心について、不斉基はR配置またはS配置のいずれかで存在することができ、例えば、2つの例示的な立体化学異性体にはβ-Dおよびα-Lアイソフォームが含まれ、これらは次のように例示することができる。
本明細書で使用する用語「ギャップマー」は、親和性を増強する1種または複数種の修飾ヌクレオシドを含む領域(フランクまたはウィング)が5'側および3'側に配置されたRNase H動員オリゴヌクレオチドの領域(ギャップ)を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。様々なギャップマー設計が本明細書に記載される。ヘッドマーおよびテイルマーは、フランク領域の一方が欠けている、すなわちオリゴヌクレオチドの末端の一方のみが親和性を増強する修飾ヌクレオシドを含む、RNase Hを動員できるオリゴヌクレオチドである。ヘッドマーでは、3'フランクが欠けており(すなわち、5'フランクが親和性を増強する修飾ヌクレオシドを含む)、テイルマーでは、5'フランクが欠けている(すなわち、3'フランクが親和性を増強する修飾ヌクレオシドを含む)。
ギャップマーオリゴヌクレオチドは、アンチセンス機構を介して、mRNAまたはウイルスRNAなどの細胞内の標的RNAを阻害するために、広く使用されている(それゆえに、アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドとも呼ばれる)。ギャップマー構造では、該オリゴヌクレオチドは、5'→3'方向に、少なくとも3つの異なる構造領域、5'-フランク、ギャップおよび3'-フランク、F-G-F'を含む。G領域またはギャップ領域は、RNase Hを動員することができる少なくとも5個連続したヌクレオチドの領域、例えば、6~14 DNAヌクレオチドなどのDNAヌクレオチドの領域、またはRNase Hを動員することができる他のヌクレオシド、例えば、α-L-オキシ-LNA、2'-フルオロ-ANAおよびUNAを含む。ギャップ領域の5'側および3'側には、2'修飾ヌクレオチドなどの、親和性を増強する1種または複数種の修飾ヌクレオシドを含む領域(FおよびF'、フランキング領域またはウィング領域とも呼ばれる)が配置されている。いくつかの実施態様では、フランキング領域は1~8ヌクレオチドの長さであり得る。
2'1-3-N'1-4-2'1-3
2'1-2-N'1-2-2'1-2-N'1-2-2'1-2
であり、ここで、2'は修飾ヌクレオシドを示し、N'はRNAまたはDNAである。いくつかの実施態様では、交互フランクの全ての修飾ヌクレオシドはLNAであり、N'はDNAである。さらなる実施態様では、領域Fおよび/またはF'中の1種または複数種の2'修飾ヌクレオシドは、独立して、2'-O-アルキル-RNA単位、2'-O-メチル-RNA、2'-アミノ-DNA単位、2'-フルオロ-DNA単位、2'-アルコキシ-RNA、MOE単位、LNA単位、アラビノ核酸(ANA)単位、および2'-フルオロ-ANA単位から選択される。
用語「LNAギャップマー」は、親和性を増強する修飾ヌクレオシドの少なくとも1つがLNAヌクレオシドである、ギャップマーオリゴヌクレオチドを指す。ある実施態様では、ギャップマーオリゴヌクレオチドの両方のフランク領域は、少なくとも1つのLNA単位を含み、ある実施態様では、フランク領域のヌクレオシドの全てがLNAヌクレオシドである。
用語「混合ウィングギャップマー」または「混合フランクギャップマー」は、フランク領域の少なくとも一方が少なくとも1個のLNAヌクレオシドと少なくとも1個の非LNA修飾ヌクレオシドを含む、LNAギャップマーを指す。少なくとも1個の非LNA修飾ヌクレオシドは、例えば、少なくとも1個のDNAヌクレオシドまたは少なくとも1個の2'置換された修飾ヌクレオシド、例えば2'-O-アルキル-RNA、2'-O-メチル-RNA、2'-アルコキシ-RNA、2'-O-メトキシエチル-RNA (MOE)、2'-アミノ-DNA、2'-フルオロ-RNAおよび2'-F-ANAヌクレオシドなどである。いくつかの実施態様では、混合ウィングギャップマーは、一方のフランク(例えば、5'または3')がLNAヌクレオシドのみを含み、他方のフランク(対応して3'または5')が2'置換された修飾ヌクレオシドおよび任意でLNAヌクレオシドを含む。
用語「ギャップブレーカーオリゴヌクレオチド」(gapbreaker oligonucleotide)は、ギャップ領域が5個未満の連続したDNAヌクレオシドを含むように、ギャップ領域が非RNase H動員ヌクレオシド(ギャップブレーカーヌクレオシド、E)によって分断されているにもかかわらず、RNase H動員を維持することができるギャップマーに関して使用される。非RNase H動員ヌクレオシドは、例えば、3'エンド立体構造のヌクレオシド、例えばヌクレオシドのリボース糖環のC2'とC4'の間の架橋がβ立体配置にあるLNA、例えばβ-D-オキシLNAまたはScETヌクレオシドである。RNase Hを動員するギャップブレーカーオリゴヌクレオチドの能力は、典型的には、配列特異的であり、または化合物特異的でさえある - Rukov et al. 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476-8487を参照されたい;これは、標的RNAのより特異的な切断を場合によってはもたらすRNase Hを動員する「ギャップブレーカー」オリゴヌクレオチドを開示している。
F-G-E-G-F'、特にF1-7-G3-4-E1-G3-4-F'1-7
D'-F-G-F'、特にD'1-3-F1-7-G3-4-E1-G3-4-F'1-7
F-G-F'-D''、特にF1-7-G3-4-E1-G3-4-F'1-7-D''1-3
D'-F-G-F'-D''、特にD'1-3-F1-7-G3-4-E1-G3-4-F'1-7-D''1-3
式中、GはDNAヌクレオシドを表し、領域D'およびD''は任意であって、追加の5'および/または3'ヌクレオシド、例えばDNAヌクレオシドであり得る。
いくつかの実施態様では、親ギャップマーオリゴヌクレオチドに由来する子オリゴヌクレオチドは、立体選択的であるギャップ領域のヌクレオシド間結合を少なくとも1つ有し、任意で、ギャップ領域はRpおよびSpヌクレオシド間結合の両方を含む。
アンチセンスオリゴヌクレオチドのRNase H活性は、相補的RNA分子と二重鎖を形成した場合にRNase Hを動員するその能力を指す。WO01/23613は、RNase H活性を測定するためのインビトロ方法を提供しており、この方法を用いて、RNase Hを動員する能力を測定することができる。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸配列を提供された場合に、それが、pmol/l/minで測定される以下の初期速度、すなわち、試験される修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチド中の全モノマー間にホスホロチオエート結合を有するDNAモノマーのみを含むオリゴヌクレオチドを用いて、WO01/23613(参照により本明細書に組み入れられる)の実施例91~95に記載される方法により測定された初期速度の少なくとも5%、例えば少なくとも10%、または20%を超える初期速度を有するならば、RNase Hを動員することができるとみなされる。
本発明の方法によって同定された核酸分子は、それらがなおも有効な核酸分子であることを判定するために、本発明の方法の一環として、さらに毒性を試験することができる。特に、核酸ベースの核酸分子では、毒性が低下する場合、それは、一部には、該核酸分子の有効性の低下によるものであることが観察されている。本発明の一局面において、毒性グレードの低下は、有効性の有意な低下をもたらさない。いくつかの実施態様では、本発明の方法に従って選択された核酸分子の治療指数(therapeutic index:TI)は、毒性参照物質と比較して改善される。本発明において、TIは、対象者の50%に望ましい効力(標的のノックダウンまたは薬理学的効果)をもたらす用量(EC50)で割った、対象者の50%に腎臓の有害作用を引き起こす核酸分子の用量(TD50)を指す。いくつかの実施態様では、毒性の参照核酸分子、例えば、本明細書中の化合物4-1または毒性の親オリゴヌクレオチドまたは毒性の親核酸分子と比較した場合に、TIは少なくとも10%、例えば、少なくとも15、25、50、75、100、150、200、250または300%増加する。実験目的では、標的がマウスに存在すると仮定すると、TD50およびEC50は7日間のマウス研究において決定され得る。例えば核酸分子について、マウスにおけるその配列保存が望ましくない場合、他のモデル種、例えば、ラット、サル、イヌ、ブタまたはサル(例えば、カニクイザル)を使用することができる。いくつかの実施態様では、TIの増加は、TD50の増加およびEC50の減少の低さまたは減少なしに起因する。TIの増加はまた、両方のパラメーターの改善の結果でもある。本発明の方法に関して、TIの増加は、核酸分子の有効性を改善する(すなわち、EC50の減少)だけではもたらされない。
いくつかの実施態様では、コンジュゲート部分は、炭水化物、非ヌクレオシド糖、炭水化物複合体であるか、またはそれを含む。いくつかの実施態様では、炭水化物は、ガラクトース、ラクトース、n-アセチルガラクトサミン、マンノース、およびマンノース-6-リン酸からなる群より選択される。
インビボ毒性の予測
本明細書に記載の方法は、哺乳動物における核酸分子のインビボ毒性を予測するために使用される。どの化合物の毒性も、典型的にはその用量に依存しているため、本発明の方法は、陰性対照、および/もしくは毒性プロファイルが知られている核酸分子と比較して、または核酸分子のライブラリー、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドのライブラリーなどの核酸分子の集団(またはライブラリー)と比較して、化合物の比較毒性プロファイルを評価するために使用することができる。これに関して、インビボ毒性の予測は、核酸分子が哺乳動物にインビボで投与される場合に、腎毒性などの毒性表現型にさらされる比較リスクの評価であり得る。
a) 適切な細胞培養培地中で上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞を培養する段階;
b) 該細胞培養物に該核酸分子を投与する段階;
c) 該細胞をある期間にわたってインキュベートする段階;および
d) その後、該細胞内のEGFR mRNAレベルを測定する段階
を含み、該細胞内のEGFR mRNAの低下は、腎毒性に関連するかまたは腎毒性に関連すると予測される核酸分子を示す。
実施例に示されるように、本発明者らは、細胞外の腎損傷分子-1 (KIM-1)タンパク質のレベルまたは細胞内KIM-1 mRNAのレベルが、本発明の方法の予測可能性をさらに強化する、EGFRバイオマーカーに対する補足的バイオマーカーとして役立ち得ることを見出した。
a) 適切な細胞培養培地中で上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞を培養する段階;
b) 該細胞培養物に該核酸分子を投与する段階;
c) 該細胞をある期間にわたってインキュベートする段階;および
d) その後、該細胞内のEGFR mRNAレベルおよび上清中のKIM-1タンパク質レベルを測定する段階
を含み、EGFR mRNAレベルの低下または上清中のKIM-1レベルの増加は、腎毒性に関連するかまたは腎毒性に関連すると予測される核酸分子を示す。
a) 少なくとも4ng/mlの上皮成長因子(EGF)を含有する適切な細胞培養培地中で上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞を培養する段階;
b) 該細胞培養物に該核酸分子を投与する段階;
c) 該細胞をある期間にわたってインキュベートする段階;および
d) その後、細胞内EGFR mRNAレベルおよび細胞内ATPレベルを測定する段階
を含み、細胞内EGFR mRNAレベルの低下および細胞内ATPタンパク質レベルの低下は、腎毒性に関連するかまたは腎毒性に関連すると予測される核酸分子を示す。
本発明の実施例では、いくつかの細胞培養物が試験された。初代細胞培養物と不死化細胞培養物は、それらが上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する限り、いずれも本発明の方法において機能するようである。EGFRおよびKIM-1バイオマーカーの場合、EGFR受容体は必ずしも機能的である(すなわち、細胞による培地中のEGFの消費を促進する)必要はない。しかしながら、ATPのようなバイオマーカーを本アッセイで使用する予定であるならば、機能的EGF受容体が必要である。EGFRは内在性であり、このことは、EGFRが細胞によって発現されることを意味する。
本発明の方法で評価される核酸分子は、当技術分野で公知の一般的な方法、例えば、受動拡散、エレクトロポレーション、超音波処理、細胞スクイージング(cell squeezing)、静水圧、ナノ粒子(例:リポソーム)、マグネトフェクション(magnetofection)、細胞透過性ペプチドなどによって細胞培養物に投与することができる。核酸分子は、一般に、トランスフェクションを用いて、またはジムノシス(gymnosis)(裸の送達(naked delivery)としても知られる;Stein et al., NAR 2010 38(1) e3またはSoifer et al., Methods Mol Biol 2012, 815: 333-46参照)として知られる方法を介して投与されるが、他の投与オプションも適用することができる。実施例では、EGFRバイオマーカーを用いたインビトロ腎毒性の予測は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞培養物にトランスフェクションによって、またはジムノシスによって投与されるかに無関係であることが分かる。投与方法は、細胞培養物の特性に適合させる必要がある。いくつかの細胞型は、PTEC型細胞株で実証されるように、オリゴヌクレオチドをジムノシスによって取り込む傾向があり、他の細胞株は、A549細胞株で見られるように、トランスフェクションに適している。したがって、投与方法は、特定の細胞培養物について最良の投与方法を検討するように、最適化を受けることになる。
核酸分子の投与と、関連するバイオマーカーの測定との間の時間は、インキュベーション時間または培養時間である。インビトロ毒性アッセイが可能な限り有効であるためには、読み出し(readout)が再現可能であり、かつ潜在的な毒性問題を有する化合物を一貫して予測する必要がある。別の関連するパラメーターは、アッセイを行うのに要する時間であり、それが迅速に行われるほど、スループットは高くなり得る;このことは、核酸分子の大きなライブラリーをスクリーニングするために本発明の方法を使用する場合に非常に重要である。インキュベーション時間は、細胞培養および投与方法に応じて、最適化を受けることになる。本発明の一実施態様では、核酸分子とのインキュベーション時間は、1~9日、例えば、2~8日、3~7日、または4~6日、特に2~6日または3~6日、例えば2、3、4、5、6、7、8または9日間である。本発明者らは、バイオマーカーEGFRおよびKim-1について、2~6日のインキュベーション時間を用いて十分な再現性を達成することができ、特に、投与後3日目および6日目のバイオマーカー測定が良好な結果を示すことを見出した。本発明の一実施態様では、一本鎖オリゴヌクレオチドを、50~100μMの濃度でジムノシスを用いて細胞培養物に投与し、3~6日間インキュベートして、これらの期間にEGFRおよび/またはKIM-1を測定する。
本発明は、哺乳動物へのインビボ投与に適した1種または複数種の核酸分子を、核酸分子のライブラリーから選択するための方法を提供し、該方法は、
a) 核酸分子のライブラリーを得る段階;
b) 該核酸分子のライブラリーの各メンバーを、例えば「細胞培養物」の項に記載されるような、上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞培養物に投与する段階;
c) 該細胞を、「インキュベーション時間」の項に記載されるような期間にわたってインビトロで培養する段階;
d) 「インビボ毒性の予測」および「補足的バイオマーカー」の項に記載されるような、少なくとも1つの腎毒性バイオマーカーの量を測定する段階;および
e) 参照値に対するEGFRの減少率が、参照値に対して80%以上、例えば、85%以上、90%以上、95%以上、例えば100%またはそれ以上である、1種または複数種の核酸分子を選択する段階
を含む。
a) 親オリゴヌクレオチドのコア核酸塩基配列を保持する、立体選択的オリゴヌクレオチド変異体(子オリゴヌクレオチド)のライブラリーを作製する段階;
b) 上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞培養物において、段階a)で作製されたライブラリーをスクリーニングする段階;および
c) 親オリゴヌクレオチドと比較して、細胞培養物において低減した毒性を有する、該ライブラリー中に存在する1種または複数種の立体選択的変異体を同定する段階
を含む。
上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞培養物であって、任意で該培地が少なくとも4ng/mlの上皮成長因子(EGF)を含有する該培養物に、該オリゴヌクレオチドを投与する段階;
該オリゴヌクレオチドの存在下で該細胞を2~9日間、例えば2~6日間、例えば3日間インキュベートする段階;
その後、例えば、該細胞内のEGFR mRNA、KIM-1 mRNAもしくはATPレベルの量、および/または培地中に放出されたKIM-1の量を測定することによって、本明細書に記載されるような、少なくとも1つの毒性バイオマーカーを測定する段階
を含む。適切には、細胞内EGFR mRNAレベルまたはATPレベルの低下は、腎毒性オリゴヌクレオチドを示しており、また、培地中のKIM-1の上昇は、腎毒性オリゴヌクレオチドを示している。一実施態様では、EGFRバイオマーカーは、任意でKIM-1および/またはATPバイオマーカーの測定と組み合わせて、測定される。
本出願に記載される原薬(drug substance)のインビボ腎毒性を予測する方法に加えて、該方法は、原薬、特に治療用オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドの開発に関連する他の毒性を予測する方法とさらに組み合わせることができる。
a)ヒト血液(身体から分離された血液)に原薬、特にオリゴヌクレオチドを投与する段階
b)該サンプルを30分~8時間インキュベートする段階;
c)その反応を停止させる段階;および
d)次のバイオマーカー:(i)補体バイオマーカーのC3aおよびC5a、ならびに/または(ii)サイトカインバイオマーカーのインターロイキン6 (IL6)、インターロイキン8 (IL8)、腫瘍壊死因子α(TNFα)、および単球走化性タンパク質-1 (MCP1)のうち少なくとも2つ、3つ、4つ、5つまたは全部を測定する段階
を含み、その場合に、対照と比較して、少なくとも2つのバイオマーカーの約2倍を超える平均増加は、オリゴヌクレオチドなどの原薬のインビボ免疫毒性を示している。段階a)の血液サンプルは、典型的には、少なくとも1人の健康なヒト対象者、例えば、少なくとも2人または少なくとも3人の健康なヒト対象者から得られる。一般的に、血液サンプルは混合されない。いくつかの実施態様では、補体バイオマーカーC3aおよびC5aの少なくとも1つは、インターロイキン6 (IL6)、インターロイキン8 (IL8)、腫瘍壊死因子α(TNFα)、および単球走化性タンパク質-1 (MCP1)からなる群より選択される少なくとも2つのサイトカインバイオマーカーと組み合わせて測定される。いくつかの実施態様では、少なくともサイトカインバイオマーカーのインターロイキン8 (IL8)および単球走化性タンパク質-1 (MCP1)が測定される。
a)細胞培養培地中のインビトロでの初代哺乳動物肝細胞の集団(またはiPS細胞に由来する肝細胞の集団)に該オリゴヌクレオチドを投与する段階;
b)細胞培養培地中のインビトロでの該細胞を、ある期間にわたり、例えば1~14日間、特に2~7日間培養する段階;および
c)その後、培地に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)のレベルを測定し、かつ/または細胞ATPのレベルを測定する段階
を含み、その場合に、細胞培養培地中の乳酸デヒドロゲナーゼの増加、例えば対照と比較して20%の増加、または細胞ATPレベルの低下、例えば対照と比較して20%の低下は、哺乳動物においてインビボで肝毒性であるかまたは肝毒性であると予測されるオリゴヌクレオチドを示すものである。肝毒性の予測を補足することができるさらなるバイオマーカーは、培養培地中に放出されるマイクロRNA-122(この場合には、細胞培養培地中のマイクロRNA-122の増加が肝毒性を予測する)、および細胞内グルタチオン(GSH)レベル(この場合には、GHSレベルの低下が肝毒性を予測する)である。
さらなる局面において、本発明は、本発明の方法によって得られた核酸分子またはその塩を提供する。さらなる局面では、本発明の方法によって得られた核酸分子またはその塩は、上記のいずれかの核酸分子ならびに薬学的に許容される希釈剤、担体、塩および/またはアジュバントを含有する薬学的組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)が含まれ、薬学的に許容される塩には、ナトリウム塩およびカリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、薬学的に許容される希釈剤は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、薬学的に許容される希釈剤中50~300μMの濃度で使用される。
本発明の以下の実施態様は、本明細書に記載の他の実施態様と組み合わせて使用することができる。
a. 適切な細胞培養培地中で、上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞を培養する段階;
b. 該細胞培養物に該核酸分子を投与する段階;
c. 該細胞をある期間にわたってインキュベートする段階;および
d. その後、該細胞内のEGFR mRNAレベルを測定する段階;
を含み、EGFR mRNAレベルの低下は、腎毒性に関連するかまたは腎毒性に関連すると予測される核酸分子を示す、方法。
a. 核酸分子のライブラリーを得る段階;
b. 該核酸分子のライブラリーの各メンバーを、請求項13~22のいずれか1つに記載のように、上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞培養物に投与する段階;
c. 該細胞を、実施態様に記載のように、ある期間にわたってインビトロで培養する段階;
d. 請求項1~12のいずれか1つに記載のように、各核酸分子について細胞内EGFR mRNAの量を測定する段階;および
e. 参照値に対するEGFRの減少率が80%を上回る1種または複数種の核酸分子を選択する段階
を含む方法。
i. 1つまたは複数の立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の存在;
ii. ギャップサイズの変化;
iii. ギャップブレーカーの導入;
iv. ウィングサイズの変化;
v. ウィング内の2'糖修飾ヌクレオシドの変化;および
vi. ウィング内に少なくとも2つの異なる2'修飾ヌクレオシド、例えばLNAヌクレオシドと2'置換ヌクレオシド、特にMOEを有する、混合ウィングギャップマー
からなる群より選択される1つまたは複数の設計パラメーターにおいて異なる、実施態様37~42に記載の方法。
研究目的のために繁殖させたWistar Han Crl:WI(Han)雄ラットを7~8週齢でCharles River Laboratoriesから入手し、体重に基づいて4グループ(表1、実験A)または8グループ(表1、実験B)に分けて、投薬前に少なくとも5日間順応させた。動物を標準的な環境条件(22±2℃、相対湿度50±20%、明/暗サイクル12h/12h、固形飼料と水を自由に与えた)下で飼育し、AAALAC公認施設で豊かな環境を提供して、定期的にかつ注意深く監視した。全ての手順は、それぞれの現地の規制に従って、また、動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)により与えられた動物許可に従って行った。試験化合物を等張性滅菌生理食塩水中に調製し、滅菌濾過(0.22μm)して、1日目および8日目に40mg/kg (2.5mL/kg)で肩甲間部に投与した。対照群の動物にはビヒクル対照として生理食塩水を与えた。15日目に動物に水道水(10mL/kg)を経口投与し、代謝ケージにおいて尿を氷上に6時間集めた。尿タンパク質レベル(オーションマックス(Aution Max) AX-4280)および尿中腎損傷バイオマーカーを測定した(マルチプレックスMAPラット腎毒性磁気ビーズパネル2)。15日目に、ラットをペントバルビタールの腹腔内注射により犠牲にして、放血させた。腎皮質サンプルを採取し、10%中性緩衝化ホルマリンに浸漬して固定化し、パラフィンに包埋し、5μmの切片にして、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色した。次いで、H&E切片を、Aperio ScanScope AT (Leica Biosystems社)スキャナーを用いて20倍の倍率でスキャンし、その後、スキャンした画像からImageScopeソフトウェアで画像を取り込んだ。次のパラメーターの1つまたは複数を評価した:腎臓の重量、血清クレアチニン、尿タンパク質、尿中のKIM-1タンパク質、KIM-1 mRNA、腎臓の変性/再生、および相対的な尿細管毒性(tubulotoxicity)グレード。
ヒト初代近位尿細管上皮細胞(PTEC)の細胞培養物
初代PTEC (Science Cell Research Labotoriesカタログ番号4100)を製造元の指示に従ってPTEC培地[1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(ThermoFisher Scientific 15140122)、10mM HEPES (ThermoFisher Scientific 15630056)、5μg/mlインスリンおよび5μg/mlトランスフェリンおよび8.65ng/ml亜セレン酸ナトリウム(全て100×濃縮原液から,ThermoFisher Scientific 41400045)、100nMヒドロコルチゾン(Sigma H6909)、3.5μg/mlアスコルビン酸(Sigma A4403)、25ng/mlプロスタグランジンE1 (Sigma P5516)、3.25pg/mlトリヨード-L-チロニン(Sigma T6397)、10ng/mlヒト組換え上皮成長因子(EGF, R&D Systems 236-EG-200)、および100μg/mlジェネティシン(G418硫酸塩, ThermoFisher Scientific 10131027)を含有する、フェノールレッド不含のDMEM/F12 (ThermoFisher Scientific 11039021)]で培養した。
PTEC-TERT1 (Evercyte GmbH, オーストリア)を製造元の指示に従ってPTEC培地[1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(ThermoFisher Scientific 15140122)、10mM HEPES (ThermoFisher Scientific 15630056)、5μg/mlインスリンおよび5μg/mlトランスフェリンおよび8.65ng/ml亜セレン酸ナトリウム(全て100x濃縮原液から,ThermoFisher Scientific 41400045)、100nMヒドロコルチゾン(Sigma H6909)、3.5μg/mlアスコルビン酸(Sigma A4403)、25ng/mlプロスタグランジンE1 (Sigma P5516)、3.25pg/mlトリヨード-L-チロニン(Sigma T6397)、10ng/mlヒト組換え上皮成長因子(EGF, R&D Systems 236-EG-200)、および100μg/mlジェネティシン(G418硫酸塩, ThermoFisher Scientific 10131027)を含有する、フェノールレッド不含のDMEM/F12 (ThermoFisher Scientific 11039021)]で培養した。
近位尿細管上皮細胞を、Bruce et al, Methods Mol Biol 1001, 53-64 (2013)に記載される手法を簡便にした手法で調製した。1匹の麻酔した雄Wistarラット(10~18週齢)から腎臓を摘出し、冷1×濃縮ハンクス平衡塩溶液(HBSS, ThermoFisher Scientific 14065049)で洗浄した。この臓器の被膜を剥離し、髄質を含まない腎皮質の外側ストリップを1~2mm3片に切断した。組織片を、2mg/mlコラゲナーゼA (Roche 10103586001)および10μg/ml DNAse I (Roche 10104159001)を含有するHBSS 25ml中で連続的に穏やかに振とうしながら37℃で60分間消化した。2%ウシ血清アルブミン(BSA, フラクションV, Roche 10735086001)を含有する氷冷HBSS 25mlの添加により反応を停止させた。解離した組織を最初に200μmセルストレーナー(pluriSelect 43-50200)に通して、続いて100μmセルストレーナー(pluriSelect 43-50100)に通して連続的に濾過した;単細胞および尿細管断片を含むろ液を、MgCl2およびCaCl2を含まないHBSS溶液(HBSS-/-, ThermoFisher Scientific 14175053)中で3回洗浄して遠心分離(100g)した。沈降物を25mlのHBSS-/-中に再懸濁し、25mlの30%OptiPrep溶液[5倍容量の60%OptiPrep密度勾配媒体(Sigma D1556)と、4倍容量のH2O滅菌液と、1倍容量のMgCl2およびCaCl2を含まない10×濃縮リン酸緩衝生理食塩水(PBS-/- ThermoFisher Scientific 14200-067)との混合物]と混合して、15%OptiPrep中の細胞と尿細管断片の懸濁液を得る。その懸濁液を遠心分離した(800g、室温で20分間)。チューブの上部3分の1の細胞バンドを回収した;チューブの底にある沈降物中の細胞を捨てた。回収した細胞を、ラットPTEC培地[1倍容量のDMEM (ThermoFisher Scientific 11966025)、1倍容量のハムF-12栄養混合物(ThermoFisher Scientific 21765029)、2%ウシ胎仔血清(FBS, ThermoFisher Scientific 16000044)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(ThermoFisher Scientific 15140122)、10mM HEPES (ThermoFisher Scientific 15630056)、5μg/mlインスリンおよび5μg/mlトランスフェリンおよび8.65ng/ml亜セレン酸ナトリウム(全て100x濃縮原液から,ThermoFisher Scientific 41400045)、100nMヒドロコルチゾン(Sigma H6909)、3.5μg/mlアスコルビン酸(Sigma A4403)、25ng/mlプロスタグランジンE1 (Sigma P5516)、3.25pg/mlトリヨード-L-チロニン(Sigma T6397)、および10ng/mlラット組換え上皮成長因子(EGF, R&D Systems 3214-EG-100/CF)]中で3回洗浄して遠心分離した(400g、室温で5分間)。最終的な遠心分離工程の後、細胞調製物を50mlのラットPTEC培地中に再懸濁し、3本のコラーゲンI被覆150cm2細胞培養フラスコ(Corning 354486)に分配し、最初の2日間の後に培地を交換して4日間インキュベートした。
CACO2 (ATCC, HTB-37)を、製造元の指示に従って、CACO2培地[DMEM/F12-Glutamax、非必須アミノ酸(1%)、ペニシリン/ストレプトマイシン(1%)(Gibco, 31331-028)(Gibco, 11140-035)(Gibco: 15140-122)、20%FBS (Gibco, 16000-044)]で2回継代して培養し、その後10%FBSを含有するCACO2培地に切り替えた。
A549細胞(ATCC CCL-185)を、製造元の指示に従って、A549培地[F-12K Nut Mix (Gibco, 21127-022)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco: 15140-122)、10%FBS (Gibco 16000-044)]で培養した。
オリゴヌクレオチドをPBSに溶解し、所定の濃度、例えば10、30または100μMで細胞培養物に添加した。各ウェルの全容量は100μlであった。PBSをビヒクル対照として用いた。
細胞内ATPレベルの測定のために、CellTiter-Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay (G7571, Promega Corporation, Madison WI, 米国)を製造元の指示に従って使用した。各サンプルを3つ組で試験した。他の指示がない限り、細胞内ATPレベルは、オリゴヌクレオチド処理後9日目に測定した。ビヒクルに対して80%を下回るATPレベルの低下は、腎毒性を予測するものとみなされた。
培養培地を100μl/ウェルの1×RNA溶解混合物(QuantiGene(登録商標)サンプルプロセッシングキット, QS0101)で置き換えることによって、細胞を回収した。RNA溶解混合物を分析まで-80℃に保った。20μlの溶解物をmRNA捕捉磁気ビーズセット(ヒト細胞ではPanomics QuantiGene(登録商標)Plex Set#12871、ラット細胞ではPanomics QuantiGene(登録商標)Plex Set#31357)と混合し、一晩インキュベートし、分岐DNA増幅について処理し、製造元の指示(Panomics QuantiGene(登録商標)Plexアッセイキット, QP1015)に従って分析した。PPIBプローブを正規化のためのハウスキーピング遺伝子として使用した。3つの生物学的レプリケートの平均蛍光強度(FI)と標準偏差を計算し、ビヒクル対照に対して正規化した。ビヒクルに対して80%を下回る、好ましくは75%を下回るEGFR mRNAレベルの低下は、腎毒性を予測するものとみなされた。
ヒトおよびラットKIM-1の分析のために、細胞上清を氷上で解凍し、サンプル希釈緩衝液(BioRadカタログ番号M60-009RDPD)で1:2および1:10に希釈し、ヒトKIM-1ビーズ(Human Kidney Injury panel 4, Millipore HKI4MAG-99K-KIM1)またはラットKim-1ビーズ(Milliplex Rat Kidney toxicity RKTX1MAG-37K-Kim1)を用いたLuminexベースのELISAにより分析し、その後Bio-Plex(登録商標)200 Systems (BioRad社)を用いて製造元の指示に従って分析した。3つ組のウェルの平均濃度および標準偏差としてデータを記録する。ビヒクルに対して200%を上回るKIM-1タンパク質レベルの増加は、腎毒性を予測するものとみなされた。
本実施例は、オリゴヌクレオチド処理後の細胞培養物の形態への影響を評価する。
本実施例は、8時間から6日間までの時間経過でオリゴヌクレオチドに曝露した細胞におけるバイオマーカーEGFRへの影響を評価する。該化合物の有効性を示すために、標的核酸PCSK9への影響も分析した。
本実施例では、他の標的に対するオリゴヌクレオチドのより大きなセットについて、実施例2における知見が再現可能であるかどうかを評価する。同じ研究において、バイオマーカーKIM-1、EGFおよびATPも同様に測定した。
本実施例では、実施例2および3の知見が、異なる種由来の細胞株において再現可能であるかどうかを評価する。
以下の実施例では、活発なEGF消費を有しないがEGFRを発現する、腎臓由来ではない細胞株が、オリゴヌクレオチドの腎毒性を予測するために使用できるかどうかを調べた。
この実施例では、活発なEGF消費を有しかつEGFRを発現する、腎臓由来ではない別の細胞株が、オリゴヌクレオチドの腎毒性を予測するために使用できるかどうかを試験した。
この実施例では、トランスフェクションに適した細胞株が腎毒性を予測する方法に適用できるかどうかを試験した。
この実施例では、トランスフェクションに適した細胞株が腎毒性を予測する方法に適用できるかどうかを試験した。
実施例7では、CACO2細胞において、ATPはバイオマーカーとして予測可能でなかったことが示された。CACO2細胞の増殖および生存は、本明細書に記載されるような培養条件においてはEGFに依存しない。本実施例は、本発明の腎毒性アッセイに使用される細胞株上のEGFRのブロッキングがATPバイオマーカーに影響を及ぼすかどうかを確認するために設定された。
実施例9に示されるように、ATPをバイオマーカーとして使用する場合には、機能的EGF受容体が細胞上に必要とされる可能性が高い。本実施例では、細胞内ATPレベルならびにオリゴヌクレオチドによる標的ノックダウンへの培地中のEGF濃度の影響を評価する。
化合物20-1は、ISIS, 388626としても知られており、ナトリウム-グルコース共輸送体2 (SGLT2)を標的とする、2'-O-メトキシエチル-RNA(MOE)修飾を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。この化合物は、13週間の試験で50mg、100mgまたは200mgを週1回投与した場合、ヒトにおいて可逆的なインビボ腎毒性を引き起こすことが示されている(Meer et al 2016 J Pharmacol Exp Ther Vol 359 pp 280-289)。
Claims (25)
- 哺乳動物における核酸分子のインビボ腎毒性を予測するためのインビトロ方法であって、
a. 適切な細胞培養培地中で、上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞を培養する段階;
b. 該細胞培養物に該核酸分子を投与する段階;
c. 該細胞をある期間にわたってインキュベートする段階;および
d. その後、該細胞内のEGFR mRNAレベルを測定する段階
を含み、EGFR mRNAレベルの低下が、腎毒性に関連するかまたは腎毒性に関連すると予測される核酸分子を示す、方法。 - EGFR mRNAレベルが、ビヒクル対照または非毒性の参照核酸分子で処理した細胞から得られる参照値と比較され、ここで、非毒性の参照核酸分子はインビボで非毒性であると実証されている、請求項1に記載の方法。
- 非毒性の参照核酸分子が、CGTcagtatgcgAATc (SEQ ID NO: 1)からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物であり、ここで、小文字はDNA単位を表し、太字の大文字はβ-D-オキシ-LNA単位を表し、全てのLNA Cは5'メチルCであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である、請求項2に記載の方法。
- ビヒクル対照または非毒性参照の値に対して80%を下回るEGFR mRNAレベルが、その核酸分子の腎毒性の予測となる、請求項3に記載の方法。
- EGFR mRNAレベルが、腎毒性の参照核酸分子で処理した細胞から得られる第2の参照値とさらに比較され、ここで、腎毒性の参照核酸分子はインビボで腎毒性を引き起こすことが実証されている、請求項2~4のいずれか一項に記載の方法。
- 毒性の参照核酸分子が、GCtgtgtgagcttGG (SEQ ID NO: 4)からなるアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物であり、ここで、小文字はDNA単位を表し、太字の大文字はβ-D-オキシ-LNA単位を表し、全てのLNA Cは5'メチルCであり、全てのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である、請求項5に記載の方法。
- 段階(d)が細胞外腎損傷分子-1 (KIM-1)タンパク質または細胞内mRNAレベルの測定をさらに含み、ここで、KIM-1レベルの増加は、腎毒性に関連するかまたは腎毒性に関連すると予測される核酸分子を示す、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 生理食塩水または非毒性参照の値に対して200%を上回るKIM-1タンパク質のレベルが、その核酸分子の腎毒性の予測となる、請求項7に記載の方法。
- 生理食塩水または非毒性参照の値に対して1000%を上回るKIM-1 mRNAのレベルが、その核酸分子の腎毒性の予測となる、請求項7に記載の方法。
- EGFR mRNAレベルが低下しない場合でも、KIM-1の増加が核酸分子の腎毒性の予測となる、請求項7~9のいずれか一項に記載の方法。
- 段階(a)の培養培地が少なくとも4ng/mlの上皮成長因子(EGF)を含み、段階(d)が細胞内アデノシン三リン酸(ATP)レベルの測定をさらに含み、ここで、細胞内ATPレベルの低下は、腎毒性に関連するかまたは腎毒性に関連すると予測される原薬を示す、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 生理食塩水または非毒性参照の値に対して80%を下回る細胞内ATPレベルが、前記原薬の腎毒性の予測となる、請求項11に記載の方法。
- EGFRを発現する細胞が、上皮細胞、内皮細胞、間葉細胞、および神経外胚葉細胞からなる群より選択される、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞培養物が、近位尿細管上皮細胞、遠位尿細管上皮細胞、および集合管上皮細胞、特に初代ヒトPTECまたはラットPTEC細胞からなる群より選択される初代腎上皮細胞培養物である、請求項13に記載の方法。
- EGFRを発現する細胞が、ヒトPTEC-TERT-1、ciPTEC、CACO2、HK-2、NKi-2、またはヒトA549細胞株などの不死化細胞株から培養される、請求項13に記載の方法。
- 前記核酸分子とのインキュベーションの期間が2~6日間である、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸分子とのインキュベーションの期間が約3日間である、請求項16に記載の方法。
- 前記核酸分子が、RNAi剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはアプタマーから選択される、請求項1~17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸分子が、2'-O-アルキル-RNA、2'-O-メチル-RNA、2'-アルコキシ-RNA、2'-O-メトキシエチル-RNA、2'-アミノ-DNA、2'-フルオロ-DNA、アラビノ核酸(ANA)、2'-フルオロ-ANA、およびLNAヌクレオシドからなる群より独立して選択される1つまたは複数の2'糖修飾ヌクレオシドを含む、請求項1~18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸分子が少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸分子が、RNase Hを動員することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項1~20のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸分子のライブラリーから、哺乳動物へのインビボ投与のための1種または複数種の腎毒性の減少した核酸分子を選択する方法であって、
a. 核酸分子のライブラリーを得る段階;
b. 該核酸分子のライブラリーの各メンバーを、上皮成長因子受容体(EGFR)を発現する細胞培養物に投与する段階;
c.該細胞をある期間にわたってインビトロで培養する段階;
d.各核酸分子について細胞内EGFR mRNAおよび任意で追加のバイオマーカーの量を測定する段階;および
e. 参照値に対する段階(d)で測定されたEGFR mRNAのレベルが80%を上回る1種または複数種の核酸分子を選択する段階
を含む、方法。 - 毒性参照物質または親核酸分子と比較して、選択された核酸分子の治療指数が低下している、請求項22に記載の方法。
- 前記核酸分子のライブラリーが、請求項18~21のいずれか一項に記載の核酸分子のライブラリーである、請求項22または23に記載の方法。
- 前記核酸分子のライブラリーが親核酸分子の核酸分子変異体(子核酸分子)のライブラリーであり、ここで、親核酸分子は腎毒性であり、段階(d)は、親核酸分子よりも毒性の低い1種または複数種の核酸分子変異体を同定し、該核酸分子変異体は親核酸分子の核酸塩基配列を保持する、請求項22~24のいずれか一項に記載の方法。
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