KR20130132475A - ｓｉＲＮＡ의 갈락토오스 클러스터-약동학적 조절제 표적 물질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 in vivo 세포로 RNA 간섭 (RNAi) 폴리뉴클레오티드의 표적 전달용 조성물에 관한 것이다. 약동학적 조절제는 표적 리간드 단독에 비해 in vivo 표적을 개선시킨다. 표적 리간드-약동학적 조절제 표적 물질 표적된 RNAi 폴리뉴클레오티드는 in vivo 단독 또는 공-표적 전달 고분자와 함께 투여될 수 있다.

Description

ｓｉＲＮＡ의 갈락토오스 클러스터-약동학적 조절제 표적 물질{Galactose Cluster-pharmacokinetic Modulator Targeting Moiety For siRNA}

본 발명은 ｓｉＲＮＡ의 갈락토오스 클러스터-약동학적 조절제 표적 물질에 관한 것이다.

살아있는 세포로 폴리뉴클레오티드 및 다른 실질적으로 세포막 불투과성 화합물의 전달은 세포의 복잡한 막 시스템에 의해 매우 제한된다. 안티센스, RNAi, 및 유전자 치료에 사용된 약물은 상대적으로 큰 친수성 고분자이고, 종종 높은 음전하이다. 이러한 물리적 특성 모두 세포막 쪽으로 이들의 직접 확산을 엄격하게 제한한다. 이러한 이유로, 폴리뉴클레오티드 전달의 주요 장벽은 세포막을 통해 세포의 세포질 또는 핵으로 폴리뉴클레오티드의 전달이다.

in vivo에서 작은 핵산을 전달하는데 사용되었던 하나의 수단은 작은 표적 분자, 또는 지질 또는 스테롤에 핵산을 결합한 것이었다. 어떤 전달 및 활성은 이러한 컨쥬게이트와 함께 관찰되는 동안, 이러한 방법으로 요구된 핵산 용량은 엄청나게 컸다.

in vitro에서 세포로 폴리뉴클레오티드의 상당히 효율적인 전달을 이루는 많은 형질감염 시약이 개발되었다. 그러나, 이러한 동일한 형질감염 시약을 이용한 폴리뉴클레오티드의 in vivo 전달은 복잡하고, in vivo 독성, 반대 혈청 상호작용, 및 좋지 못한 표적에 의해 비효율적이 된다. in vitro에서 잘 작용한 형질감염 시약, 양이온성 고분자 및 지질은, 일반적으로 큰 양이온성 정전기 입자를 형성하고 세포막을 불안정화시킨다. in vitro 형질감염 시약의 양전하는 전하-전하(정전기) 상호작용을 통해 핵산과의 결합을 용이하게 함으로써 핵산/형질감염 시약 복합체를 형성한다. 또한, 양전하는 세포에 비히클의 비특이적 결합 및 막 융합, 불안정화, 또는 파괴에 유익하다. 막의 불안정화는 실질적으로 세포막을 통해 세포막 불투과성 폴리뉴클레오티드의 전달을 용이하게 한다. 이러한 특성은 in vitro에서 핵산 전달을 용이하게 하는 반면, in vivo에서는 독성 및 비효율적 표적을 야기한다. 양이온성 전하는 혈청 성분과 상호작용을 하고, 폴리뉴클레오티드-형질감염 시약 상호작용의 불안정화, 좋지 못한 생체이용률 및 좋지 못한 표적을 야기한다. 형질감염 시약의 막 활성은, in vitro에서 효율적일 수 있고, 종종 in vivo에서 독성을 일으킨다.

in vivo 전달의 경우, 비히클(핵산 및 관련된 전달제)은 직경 100㎚ 미만, 바람직하게는 50㎚ 미만으로 작아야 한다. 20㎚ 미만 또는 10㎚ 미만의 더 작은 복합체도 여전히 더 유용할 것이다. 100㎚ 보다 더 큰 전달 비히클은 in vivo에서 혈관 세포 이외의 세포에 거의 접근하지 않는다. 정전기적 상호작용에 의해 형성된 복합체는 생리적 식염수 농도 또는 혈청 성분에 노출되었을 때 응집하거나 분해되는 경향이 있다. 또한, in vivo 전달 비히클에 대한 양전하는 반대 혈청 상호작용을 야기하여 좋지 못한 생체이용률을 일으킨다. 흥미롭게도, 높은 음전하도 표적에 필요한 상호작용을 간섭하여, 즉 세포 수용체에 표적 리간드를 결합하여 표적된 in vivo 전달을 억제할 수 있다. 따라서, 중성에 가까운 비히클이 in vivo 분포 및 표적에 바람직하다. 주의 깊은 조절 없이, in vivo 에서 사용될 때 막 파괴 또는 불안정한 활성은 독성이다. 비히클 독성과 핵산 전달 사이의 균형은 in vivo 보다 in vitro 에서 더 쉽게 도달한다.

로제마 등의 미국특허공개 제 20040162260호는 막 활성 폴리아민의 막 파괴 활성을 가역적으로 조절하는 방법을 설명하였다. 막 활성 폴리아민은 세포막의 파괴 방법을 제공하였다. pH-의존적 가역적인 조절은 표적 세포의 엔도좀(endosomes)에 대한 활성을 제한함으로써 독성을 제한하는 방법을 제공하였다. 이의 방법은 폴리아민 위에 있는 아민과 2-프로피오닉-3-메틸말레익 무수물의 변형에 의존하였다.

이 변형은 일차 아민을 카복실기의 쌍 (β 카복실 및 γ 카복실)으로의 전환을 통해 다가양이온(polycation)을 다가음이온(polyanion)으로 전환시켰고, 폴리아민의 막 활성을 가역적으로 억제시켰다. 로제마 등(Bioconjugate Chem. 2003, 14, 51-57)은 β 카복실이 완전 겉보기 음전하를 나타내지 않고 그 자체가 막 활성을 억제하지 않았을 수 있다는 것을 보고하였다. γ 카복실기의 추가는 효과적인 막 활성 억제에 필요하다고 보고되었다. 핵산과 전달 비히클의 공-전달을 가능하게 하기 위해, 핵산을 전달 고분자에 공유결합하였다. 이들은 이들의 생물학적으로 불안정한 컨쥬게이트 전달 시스템을 이용하여 in vitro 세포로 폴리뉴클레오티드의 전달을 나타낼 수 있었다. 그러나, 비히클은 핵산과 높은 음전하 밀도를 갖는 변형된 고분자와 함께 크게 음전하이기 때문에, 이 시스템은 in vivo 전달에 효율적이지 않았다. 음전하는 망상내피계(reticuloendothelial system, RES)에 의해 세포-특이적 표적을 억제하고 비-특이적 흡수를 향상시킬 가능성이 있다.

로제마 등의 미국특허공개 제 20080152661호는 변형된 막 활성 고분자의 높은 음전하 밀도를 제거하여 미국특허공개 제 20040162260호의 방법을 개선하였다. 로제마 등은 2-프로피오닉-3-메틸말레익 무수물의 γ 카복실을 중성 친수성 표적 (갈락토오스) 및 입체적 안정화 (PEG) 기로 치환하여, 효과적인 in vivo 간세포 표적을 포함하는 동안 막 활성의 전체 수 용해도 및 가역적인 억제를 유지할 수 있었다. 종래와 같이, 폴리뉴클레오티드는 형질감염 고분자에 공유결합되었다. 형질감염 고분자에 폴리뉴클레오티드의 공유결합을 유지하여, 형질감염 고분자로부터 폴리뉴클레오티드의 해리를 막음으로써 in vivo 투여 동안 표적 세포로 폴리뉴클레오티드와 형질감염 고분자의 공-전달을 확실하게 한다. 형질감염 고분자가 세포 외부로부터 또는 세포내 이입 구획(endocytic compartment) 내부로부터 세포막을 통해 세포질로 폴리뉴클레오티드의 수송을 제공하기 때문에, 폴리뉴클레오티드와 형질감염 고분자의 공-전달이 필요하였다. 미국특허공개 제 20080152661호는 이러한 새로운 개선된 생리적으로 반응성 폴리컨쥬게이트를 이용하여 in vivo 간세포로 폴리뉴클레오티드, 특히 RNAi 올리고뉴클레오티드의 매우 효율적인 전달을 설명하였다.

그러나, 폴리아민에 핵산의 공유결합은 본질적 한계(inherent limitation)를 가진다. 형질감염 고분자의 변형은, 핵산과 차폐제(masking agent) 모두에 결합하기 위해 전하 상호작용에 의해 복잡화된다. 양전하 고분자에 음전하 핵산의 결합은 응집하는 경향이 있어, 이에 의해 혼합물의 농도를 제한한다. 응집은 과량의 다가양이온 또는 다가음이온의 존재에 의해 극복될 수 있다. 그러나, 이러한 해결은 핵산과 고분자가 제형화될 수 있는 비율로 제한된다. 또한, 변형되지 않은 양이온성 고분자 위에 음전하 핵산의 결합은 복합체의 응축 및 응집을 야기하고 고분자 변형을 억제하였다. 음전하 고분자를 형성하는 고분자의 변형은, 핵산의 결합을 손상시켰다.

로제마 등은 미국특허공개 제 20080152661호 및 미국가출원 제 61/307,490호에 기재된 기술을 더 개선시켰다. 미국가출원 제 61/307,490호에서 로제마 등은 표적 분자를 조심스럽게 선별하고 siRNA 및 전달 고분자에 독립적으로 적당한 표적 분자를 결합시킴으로써, siRNA 및 전달 고분자가 in vivo 세포에 두 가지 요소의 효과적인 표적이 여전히 결합되지 않게 유지할 수 있고 siRNA의 효율적인 기능적 표적 전달을 이룰 수 있다고 설명하였다. 미국특허공개 제 20080152661호 및 미국가출원 제 61/307,490호에 사용된 전달 고분자는 상대적으로 큰 합성 고분자인 폴리(비닐 에테르) 및 폴리(아크릴레이트)이었다. 큰 고분자는 세포-특이적 결합용 표적 리간드 및 증가된 차폐(shielding)용 PEG 둘 다를 변형시킬 수 있다. 큰 고분자는 세포 엔도좀 내에 핵산의 증가된 막 활성 및 개선된 보호를 통해, 효과적인 전달이 필요하였다. 큰 다가양이온은 양쪽 막 및 음이온성 RNAs와 더 강하게 상호작용한다.

우리는 현재 개선된 RNA 간섭 폴리뉴클레오티드 표적 물질을 이용한 개선된 siRNA 전달 시스템을 개발하였다.

발명의 개요

바람직한 실시예에서, 본 발명은 표적 리간드-약동학적 조절제 표적 화합물에 결합된 RNA 간섭 폴리뉴클레오티드(siRNA-컨쥬게이트)를 포함하는 in vivo 표적 세포로 RNA 간섭 폴리뉴클레오티드 전달용 조성물을 특징으로 한다. 표적 리간드-약동학적 조절제 표적 화합물은 표적 리간드 단독에 비해 in vivo 순환 및 표적 특성을 향상시킨다. 예시적인 표적 리간드는 아시알로당단백질 수용체 리간드 및 폴레이트(folate)를 포함한다. 약동학적 조절제는 표적 리간드와 조합될 때 증가된 조직 표적을 제공한다. 그 다음, siRNA는 단독으로 또는 전달 분자와 조합하여 주사될 수 있다.

바람직한 실시예에서, 우리는 16 이상의 탄소 원자를 갖는 소수성 기를 포함하는 약동학적 조절제를 기재한다. 표적 리간드와 조합될 때, 표적 리간드-약동학적 조절제는 siRNA의 개선된 in vivo 전달을 제공한다. 예시적인 적당한 소수성 기는 콜레스테롤, 팔미토일, 헥사데크-8-에노일, 올레일, (9E,12E)-옥타데카-9,12-디에노일, 디옥타노일, 및 C16-C20 아실을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 16 미만의 탄소 원자를 갖는 소수성 기는 폴리뉴클레오티드 표적을 향상시키는데 덜 효과적이다.

폴리뉴클레오티드 표적 물질로서 유용한 약동학적 조절제는 콜레스테롤, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 아릴기, 아르알킬기, 아르알케닐기, 및 아르알키닐기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 각각은 선형, 분기, 또는 고리일 수 있다. 약동학적 조절제는 바람직하게는 탄소 및 수소 원자만 함유하는 탄화수소이다. 그러나, 소수성을 유지하는 치환 또는 헤테로원자, 예를 들어 불소를 허용할 수 있다.

하나의 실시예에서, 본 발명은 아시알로당단백질 수용체 (asialoglycoprotein receptor, ASGPr)-표적된 가역적으로 차폐된 막 활성 폴리아민(전달 고분자) 및 갈락토오스 클러스터-약동학적 조절제 표적 물질에 결합된 RNA 간섭 폴리뉴클레오티드(siRNA-컨쥬게이트)를 포함하는 in vivo 간세포로 RNA 간섭 폴리뉴클레오티드 전달용 조성물을 특징으로 한다. 전달 고분자 및 siRNA-컨쥬게이트는 별도로 합성되었고, 별도의 용기 또는 단일 용기에서 공급될 수 있다. RNA 간섭 폴리뉴클레오티드는 고분자에 결합되지 않는다.

하나의 실시예에서, 막 활성 폴리아민은 아민-함유 모노머, 더 낮은 소수성 모노머, 및 더 높은 소수성 모노머의 랜덤 중합에 의해 형성된 양극성 (amphipathic) 고분자를 포함한다. 아민-함유 모노머는 일차 아민 및 이차 아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 펜던트 아민기를 함유한다. 더 낮은 소수성 모노머는 1-6 탄소 원자를 갖는 펜던트 소수성 기를 함유한다. 더 높은 소수성 모노머는 12-36 또는 그 이상의 탄소 원자를 갖는 펜던트 소수성 기를 함유한다. 아민기 대 소수성 기의 비는 막 파괴 활성, 바람직하게는 소수성 모노머 당 ≥1 아민 모노머를 갖는 수용성 고분자를 형성하기 위해 선택된다. 하나의 실시예에서, 고분자는 60-80% 아민 모노머를 가질 것이다. 소수성 기는 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 아릴기, 아르알킬기, 아르알케닐기, 및 아르알키닐기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 각각은 선형, 분기, 또는 고리, 스테롤, 스테로이드, 및 스테로이드 유도체일 수 있다. 소수성 기는 바람직하게는 탄소 및 수소 원자만 함유하는 탄화수소이다. 그러나, 소수성을 유지하는 치환 또는 헤테로원자, 예를 들어 불소를 포함하는 것이 허용될 수 있다. 특히 적당한 막 활성 폴리아민은 폴리(비닐 에테르) 랜덤 삼중합체(terpolymer) 또는 폴리(아크릴레이트) 랜덤 삼중합체를 포함한다.

바람직한 실시예에서, ASGPr-표적된 가역적으로 차폐된 멜리틴 펩티드는 펩티드 위에 있는 일차 아민을 ASGPr 리간드-함유 차폐제와 반응시켜 가역적으로 변형시킨 멜리틴 펩티드를 포함한다. 만일 변형기의 절단이 아민을 회복시키면, 아민은 가역적으로 변형된다. 멜리틴 펩티드의 가역적인 변형은 멜리틴 펩티드의 막 활성을 가역적으로 억제한다. 바람직하게는, 고분자 아민과 차폐제의 변형 또한 아민의 전하를 중화시킨다. 바람직한 ASGPr 리간드-함유 차폐제는 갈락토사민 또는 이치환된 말레익 무수물 아민-반응성 기를 갖는 갈락토사민 유도체를 포함한다. 무수물과 아민의 반응은 아민을 가역적으로 변형시켜 말레아메이트(maleamate) 또는 말레암산(maleamic acid)을 형성한다. 차폐된 상태에서, 가역적으로 차폐된 멜리틴 펩티드는 막 파괴 활성을 나타내지 않는다. 멜리틴 펩티드 위에 있는 아민의 80% 이상, 또는 90% 이상의 가역적인 변형은 막 활성을 억제하고 세포 표적 기능을 제공하는데, 즉 가역적으로 차폐된 멜리틴 펩티드를 형성하는데 필요하다.

바람직한 실시예에서, 가역적으로 차폐된 막 활성 폴리아민은 고분자 위에 있는 아민을 차폐제와 반응시켜 가역적으로 변형시킨 발명의 막 활성 폴리아민을 포함한다. 만일 변형기의 절단이 아민을 회복시키면, 아민은 가역적으로 변형된다. 막 활성 폴리아민의 가역적인 변형은 막 활성 폴리아민의 막 활성을 가역적으로 억제한다. 바람직하게는, 차폐제 또한 표적 기능 및/또는 혈청 상호작용 회피 기능을 제공한다. 바람직하게는, 고분자 아민과 차폐제의 변형 또한 아민의 전하를 중화시킨다. 바람직한 차폐제는 갈락토사민 또는 갈락토사민 유도체 또는 이치환된 말레익 무수물 아민-반응성 기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 무수물과 아민의 반응은 아민을 가역적으로 변형시켜 말레아메이트 또는 말레암산을 형성한다. 차폐된 상태에서, 가역적으로 차폐된 막 활성 폴리아민은 막 파괴 활성을 나타내지 않는다. 폴리아민 위에 있는 아민의 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 또는 80% 이상과 차폐제의 가역적인 변형은 막 활성을 억제하고 세포 표적 기능을 제공하는데, 즉 가역적으로 차폐된 막 활성 고분자를 형성하는데 필요할 수 있다. 기재된 막 활성 폴리아민의 막 활성 억제 및/또는 in vivo 표적은 고분자 아민의 >50%의 변형을 필요로 한다.

RNAi 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트 및 전달 고분자는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께 포유동물에 투여될 수 있다. 하나의 실시에에서, 전달 고분자 및 RNAi 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트는 포유동물에 투여하기 전에 용액에서 혼합될 수 있다. 다른 실시예에서, 전달 고분자 및 RNAi 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트는 별도의 용액으로 포유동물에 병용투여될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 전달 고분자 및 RNAi 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트는 순차적으로 포유동물에 투여될 수 있다. 순차적 투여의 경우, 전달 고분자는 RNAi 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트의 투여 전에 투여될 수 있다. 대안적으로, 순차적 투여의 경우, RNAi 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트는 전달 고분자의 투여 전에 투여될 수 있다.

발명의 목적, 특징, 및 장점은 수반하는 도면과 함께 받아들여질 때 하기의 상세한 설명으로부터 더 명백해질 것이다.

도 1은 양극성 폴리(비닐 에테르) 랜덤 삼중합체의 중합의 반응식이다.
도 2는 siRNA-콜레스테롤 컨쥬게이트 용량이 유전자 녹다운에 미치는 영향을 설명한 그래프이다.
도 3은 소수물질(hydrophobe) 크기가 간으로 표적하는 siRNA-소수물질 컨쥬게이트에 미치는 영향을 설명한 그래프이다.
도 4는 siRNA-소수물질 컨쥬게이트 용량이 몇몇의 소수성 기의 유전자 녹다운에 미치는 영향을 설명한 그래프이다.
도 5는 전달 고분자 용량이 간으로 siRNA-소수물질 컨쥬게이트 전달에 미치는 영향을 설명한 그래프이다.
도 6은 RNA에 GalNAc 클러스터의 결합을 나타낸 도이다.
도 7은 다양한 약동학적 조절제에 결합된 siRNA의 혈장에서 지속을 설명한 그래프이다.

본 발명은 개선된 RNA 간섭 폴리뉴클레오티드 표적 물질을 기재한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 표적 물질은 약동학적 조절제와 결합된 표적 리간드를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 표적 리간드와 약동학적 조절제는 서로 공유결합된 다음 siRNA에 공유결합된다. 바람직한 실시예에서, siRNA에 결합은 생리적으로 불안정한 공유결합이다.

바람직한 실시예에서, 우리는 소수성 기로 이루어진 약동학적 조절제를 기재한다. 더 상세하게는, 약동학적 조절제는 16 이상의 탄소 원자를 갖는 소수성 기로 이루어진다. 예시적인 적당한 소수성 기는 콜레스테롤, 팔미토일, 헥사데크-8-에노일, 올레일, (9E,12E)-옥타데카-9,12-디에노일, 디옥타노일, 및 C16-C20 아실을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 16 미만의 탄소 원자를 갖는 소수성 기는 폴리뉴클레오티드 표적을 향상시키는데 덜 효과적이다.

폴리뉴클레오티드 표적 물질로서 유용한 약동학적 조절제는 콜레스테롤, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 아릴기, 아르알킬기, 아르알케닐기, 및 아르알키닐기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 각각은 선형, 분기, 또는 고리일 수 있다. 약동학적 조절제는 바람직하게는 탄소 및 수소 원자만 함유하는 탄화수소이다. 그러나, 소수성을 유지하는 치환 또는 헤테로원자, 예를 들어 불소를 허용할 수 있다.

표적 리간드와 약동학적 조절제는 결합하여 지지체 분자를 통해 표적 리간드-약동학적 조절제 표적 물질을 형성한다. 표적 물질 지지체는 약동학적 조절제에 표적 리간드의 결합을 허용하고 RNAi 폴리뉴클레오티드에 결합을 더 허용하는 어느 소분자일 수 있다. 예시적인 지지체는 리신 또는 오르니틴이다. 리신 또는 오르니틴 분자는 표적 리간드와 약동학적 조절제가 결합될 수 있는 2개의 아민기 및 RNAi 폴리뉴클레오티드에 결합될 수 있는 카복실기를 함유한다. 또한, 갈락토오스 클러스터 및 siRNA 폴리뉴클레오티드에 공유결합될 수 있는 약동학적 조절제를 합성하는 것이 가능하다.

본 명세서는 in vivo 포유동물의 표적세포로 RNA 간섭(RNAi) 폴리뉴클레오티드의 개선된 전달 방법을 기재한다. 이전에, 폴리뉴클레오티드의 in vivo 전달은 폴리뉴클레오티드와 전달 비히클의 물리적 결합을 필요로 한다. 폴리뉴클레오티드는 다가양이온/핵산 복합체에서 처럼 전달 비히클과 정전기적으로 결합되고, 리포좀 및 안정한 핵산-지질 입자(stable nucleic acid-lipid particles, SNALPs)에서 처럼 전달 비히클에 의해 캡슐화되거나, 또는 Dynamic PolyConjugates(Rozema et al. 2007)에서 처럼 전달 비히클에 공유결합되었다. 놀랍게도, 우리는 적당한 RNAi 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트 분자 및 적당하게 표적된 전달 고분자를 이용하여, RNAi 폴리뉴클레오티드가 전달 고분자로부터 분리될 수 있고 여전히 폴리뉴클레오티드의 효율적인 간세포 전달을 이룬다는 것을 발견하였다.

전달 펩티드로부터 폴리뉴클레오티드의 분리는 제형, 합성, 및 제조에서 이점을 제공한다.

a) 폴리뉴클레오티드와 고분자는 공유결합 또는 전하-전하 상호작용에 의해 결합된 필요조건을 제거함으로써, 고분자와 폴리뉴클레오티드의 농도 및 이들 사이의 비율은 결합된 복합체의 용해도 또는 복합체의 제조 능력 보다는 성분의 용해도에 의해서만 제한된다. 증가된 용해도는 폴리뉴클레오티드 또는 전달 고분자의 농도를 증가시키고, 이에 따라 용량을 증가시킨다.

b) 폴리뉴클레오티드와 전달 고분자는 투여 전에 언제든지 혼합될 수 있거나, 또는 완전히 개별적으로 투여될 수 있다. 따라서, 분리는 용액 또는 건조로 개별적으로 저장된 성분을 허용한다.

c) 더 크고, 본질적으로 불안정한 비-공유 전달 시스템에 비해 더 작고, 더 안정한 제형이 가능하다.

d) 차폐된 전달 고분자의 제조는 공유결합된 음전하 폴리뉴클레오티드가 없거나 또는 음전하 폴리뉴클레오티드에 공유결합이 필요한 경우 더 용이하다.

e) 제조는 간단하고, 폴리뉴클레오티드와 전달 고분자의 물리적 결합이 없는 더 적은 단계를 필요로 한다.

본 발명은 일반 구조의 컨쥬게이트 전달 시스템을 포함한다:

여기서, N은 RNAi 폴리뉴클레오티드이고, T는 표적 리간드-약동학적 조절제 폴리뉴클레오티드 표적 물질이며, P는 막 활성 폴리아민이고, 차폐제 M ¹ 은 말레아메이트 결합과 같은 생리적으로 가역적인 결합 L을 통해 P에 공유결합된 (간에 전달하기 위해 아시알로당단백질 수용체에 대해 친화도를 갖는 갈락토오스 또는 갈락토오스 유도체와 같은) 표적 물질을 함유한다. L의 절단(cleavage)은 폴리아민 P 위에 있는 변형되지 않은 아민을 회복시킨다. 차폐제 M ² 는 선택적이다. 만일 존재한다면, M ² 는 말레아메이트 결합과 같은 생리적으로 가역적인 결합 L을 통해 P에 공유결합된 친수성 입체적 안정화제이다. x 및 y는 각 정수이다. 이의 변형되지 않은 상태에서, P는 막 활성 폴리아민이다. 폴리뉴클레오티드의 in vivo 전달에 적합한 막 활성 폴리아민은 기술분야에 기재되었다. 전달 고분자 ( M ¹ -L) _x -P-(L- M ² ) _y 는 막 활성이 아니다. M ¹ 및 임의로 M ² 의 결합에 의한 P 아민의 가역적인 변형은 P의 막 활성을 가역적으로 억제하거나 불활성화시키고 P의 순(net) 양전하를 감소시킨다. 충분한 차폐제는 P에 결합되어 고분자의 막 활성을 억제한다. 어떠한 차폐제 없이 P 위에 있는 아민의 양에 의해 결정된 대로, x + y는 폴리아민 P 위에 있는 아민의 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상의 값을 가진다. 만일 P가 멜리틴과 같은 막 활성 펩티드이면, 어떠한 차폐제 없이 P 위에 있는 아민의 양에 의해 결정된 대로, x + y는 폴리아민 P 위에 있는 아민의 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 값을 가진다. 가역적인 결합 L의 절단 동안, 변형되지 않은 아민은 회복되어 이의 변형되지 않은 막 활성 상태로 P를 복귀시킨다. 가역적인 결합 L의 가역적인 결합은, 원하는 조직, 기관, 또는 아세포(sub-cellular) 위치에 존재하는 것처럼, 원하는 생리적 조건에서 절단이 발생하도록 선택된다. 바람직한 가역적인 결합은 pH 불안정한 결합이다. ASGPr-표적된 가역적으로 차폐된 막 활성 고분자(차폐된 고분자)인 ( M ¹ -L) _x -P-(L-M ² ) _y 및 폴리뉴클레오티드-컨쥬게이트인 T-N을 개별적으로 합성하거나 제조한다. T 또는 N도 P, L, M ¹ 또는 M ² 에 직접적으로 또는 간접적으로 공유결합되지 않는다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드-컨쥬게이트와 차폐된 또는 차폐되지 않은 고분자의 정전기적 또는 소수성 결합은 폴리뉴클레오티드의 in vivo 간 전달에 필요하지 않다. 차폐된 고분자와 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트는 동일한 용기 또는 별개의 용기에서 공급될 수 있다. 이들은 투여, 병용투여, 또는 순차적 투여 전에 혼합될 수 있다.

고분자

본 발명의 고분자는 양극성 막 활성 폴리아민이다. 고분자는 모노머로 불리우는 더 작은 단위가 함께 반복적 결합에 의해 조립된 분자이다. 고분자는 단일 모노머가 사용된 동종중합체(homopolymer)일 수 있으며, 또는 2 이상의 다른 모노머가 사용된 공중합체 또는 이종중합체(heteropolymer)일 수 있다. 고분자의 주 사슬 (main chain)은 이의 결합이 고분자 길이의 전파(propagation)에 필요한 원자로 구성된다. 고분자의 곁사슬(side chain)은 이의 결합이 고분자 길이의 전파에 필요하지 않은 원자로 구성된다.

더 상세하게는, 본 발명의 고분자는 양극성 막 활성 랜덤 공중합체이다. 랜덤 공중합체에서 모노머는 정의되지 않거나 또는 주 사슬에 따라 배열되지 않으며, 예를 들어 - A _x - B _y - 또는 - A _x - B _y - C _z - 로 쓴다. 이러한 고분자의 일반적인 조성은 투입 모노머의 비율에 반영한다. 그러나, 하나의 모노머 대 다른 모노머의 정확한 비율은 사슬 사이에서 다를 수 있다. 모노머의 분포 또한 단일 고분자의 길이에 따라 다를 수 있다. 또한, 모노머의 화학적 성질은 랜덤 공중합체로의 이의 결합율 및 고분자 내 이의 분포에 영향을 미칠 수 있다. 랜덤 공중합체에서 모노머의 비율은 모노머의 투입 비율에 의존하는데, 투입 비율은 결합된 모노머의 비율을 정확하게 일치시키지 않을 수 있다.

양극성

양극성(amphipathic), 또는 양친매성(amphiphilic) 고분자는 기술분야에서 잘 알려져 있는 것으로 인식되며, 친수성(극성, 수용성) 및 소수성(비-극성, 지용성, 불수용성) 기 또는 일부를 가진다.

친수성 기는 화학적 부분이 물-선호하는 질적 용어를 가리킨다. 일반적으로, 이러한 화학적 기는 수용성이고, 물과 함께 수소결합 주개(donors) 또는 받개 (acceptors)이다. 친수성 기는 전하(charged) 또는 비전하(uncharged) 일 수 있다. 전하 기는 양전하(음이온성(anionic)) 또는 음전하(양이온성(cationic)) 또는 모두 (쯔비터이온성)일 수 있다. 친수성기의 예는 하기 화학적 부분을 포함한다: 탄수화물, 폴리옥시에틸렌, 특정 펩티드, 올리고뉴클레오티드, 아민, 아미드, 알콕시 아미드, 카복실산, 황, 및 히드록실.

소수성 기는 화학적 부분이 물-피하는 질적 용어를 가리킨다. 일반적으로, 이러한 화학적 기는 수 불용성이고, 수소결합을 형성하지 않는 경향이 있다. 지용성 기는 지방, 오일, 지질, 및 비-극성 용매에 녹고, 수소 결합을 형성하는 능력을 거의 가지고 있지 않다. 둘(2) 이상의 탄소 원자를 함유하는 탄화수소, 특정 치환된 탄화수소, 콜레스테롤, 및 콜레스테롤 유도체는 소수성 기 및 화합물의 예이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 양극성 고분자에 관하여, 일부는 하나의 공유결합이 깨지고 수소로 대체될 때 유도된 분자로서 정의된다. 예를 들어, 부틸아민에서, 탄소와 질소 결합 사이의 파괴, 및 수소로 대체는 암모니아(친수성) 및 부탄(소수성)으로 된다. 만일 1,4-디아미노부탄이 질소-탄소 결합에서 절단되고 수소로 대체되면, 결과로 생긴 분자는 다시 암모니아(2×) 및 부탄이다. 그러나, 소수성 일부의 형성이 2개 결합의 파괴를 필요로 하기 때문에, 1,4-디아미노부탄은 양극성으로 간주되지 않는다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 표면 활성 고분자는 물의 표면 장력 및/또는 다른 상과 함께 계면 장력을 더 낮추고, 따라서, 액체/기체 계면에서 확실하게 흡착된다. 표면 활성의 특성은 일반적으로 물질의 분자가 양극성 또는 양친매성이라는 사실에 기인한다.

막 활성

본 명세서에 사용된 바와 같이, 막 활성 고분자는 생물학적 막에 하나 이상의 하기의 효과를 유발할 수 있는 표면 활성, 양극성 고분자이다: 세포로 들어가거나 또는 막을 통해 막을 투과할 수 없는 분자를 허용하는 막의 변경 또는 파괴, 막의 기공 형성, 막의 분열, 또는 막의 파괴 또는 용해. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 막, 또는 세포막은 지질 이중층을 포함한다. 막의 변경 또는 파괴는 적어도 하나의 하기 분석에서 고분자의 활성에 의해 기능적으로 정의될 수 있다: 적혈구 용해(red blood cell lysis, 용혈(hemolysis)), 리포좀 누출(liposome leakage), 리포좀 융합, 세포융합, 세포 용해, 및 엔도좀 방출. 세포막의 용해를 야기시킬 수 있는 막 활성 고분자 또한 막 용해 고분자(membrane lytic polymers)라고 한다. 형질막(plasma membrane)을 통해 엔도좀 또는 리소좀의 파괴를 우선적으로 일으키는 고분자는 엔도좀 분해용(endosomolytic)으로 간주된다. 막 활성 고분자가 세포막에 미치는 영향은 일시적일 수 있다. 막 활성 고분자는 막에 대해 친화도를 가지고, 이중층 구조의 변성(denaturation) 또는 변형(deformation)을 일으킨다. 막 활성 고분자는 합성 또는 비-천연 양극성 고분자일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 막 활성 고분자는 HIV TAT 단백질로부터 유래된 아르기닌-풍부 펩티드, 안텐나페디아 펩티드(antennapedia peptide), VP22 펩티드, 트랜스포르탄(transportan), 아르기닌-풍부 인공 펩티드, 작은 구아니디늄-풍부 인공 고분자 등과 같은 화합물로 표시되는 세포 투과 펩티드 또는 고분자로 불리우는 고분자의 종류와 다르다. 세포 투과 화합물이 명백히 세포내 이입 (endocytosis)을 필요로 하지 않고 막의 온전함을 방해하지 않으면서, 지질 이중층의 한쪽으로부터 지질 이중층의 다른쪽으로 막을 통해 몇몇 분자를 수송하는 동안, 이들의 메커니즘은 이해되지 않았다.

세포로 폴리뉴클레오티드의 전달은 막의 기공을 형성하고, 또는 엔도좀 또는 리소좀 소포체를 파괴하는 것을 포함하여 형질막 또는 내부 소포체 막 (엔도좀 또는 리소좀과 같은)을 파괴 또는 불안정화하는 막 활성 고분자에 의해 조정되고, 이로써 세포질로 소포체의 내용물의 방출을 허여한다.

엔도좀 분해용( endosomolytic )

엔도좀 분해용 고분자는 pH의 변화에 대한 반응에서 엔도좀의 파괴 또는 용해를 일으킬 수 있거나, 또는 엔도좀 또는 리소좀과 같은 세포 내부 막으로 쌓인 소포체(membrane-enclosed vesicle)로부터 폴리뉴클레오티드 또는 단백질과 같은 일반적으로 세포막 불투과성 화합물의 방출을 제공할 수 있는 고분자이다. 엔도좀 분해용 고분자는 생리적으로 관련된 pH 범위 (보통 pH 5.5-8)에 대해 이들의 물리화학적 특성의 변화를 겪는다. 이러한 변화는 고분자의 용해도 또는 전하, 소수성, 또는 친수성의 변화의 결과로서 다른 화합물 또는 막과 상호작용하는 능력의 변화일 수 있다. 예시적인 엔도좀 분해용 고분자는 pH-불안정한 기 또는 결합을 가진다. 따라서, pH 불안정한 결합을 통해 차폐제가 고분자에 결합되는 가역적으로 차폐된 막 활성 고분자는 엔도좀 분해용 고분자인 것으로 간주될 수 있다.

멜리틴은 봉독에서 자연적으로 발생하는 작은 양극성 막 활성 펩티드이다. 멜리틴은 생물학적 자원으로부터 분리될 수 있거나 또는 합성될 수 있다. 합성 고분자는 "인간에 의해(by man)" 화학적 방법에 의해 제형화되거나 제조되고 자연적으로 발생하는 생물학적 방법에 의해 제조되지 않는다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 멜리틴은 하기 종의 독에서 발견될 수 있는 멜리틴 과의 자연적으로 발생하는 봉독 펩티드를 포함한다: 양봉꿀벌(Apis mellifera), 한국토종꿀벌(Apis cerana), 땅벌송장벌레(Vespula maculifrons), 장수말벌(Vespa magnifica), 등검은말벌(Vespa velutina nigrithorax), 쌍살벌(Polistes sp.) HQL-2001, 인도 최소종 꿀벌(Apis florea), 인도 최대종 꿀벌(Apis dorsata), 재래꿀벌(Apis cerana cerana), 땡비(Polistes hebraeus). 본 명세서에 사용된 바와 같이, 멜리틴은 자연적으로 발생하는 멜리틴 펩티드와 동일한 또는 유사한 아미노산 서열을 갖는 합성 펩티드도 포함한다. 상세하게는, 멜리틴 아미노산 서열은 표 1에 나타낸 것을 포함한다. 합성 멜리틴 펩티드는 자연적으로 발생하는 L 형 아미노산 또는 거울상이성질체(enantiomeric) D 형 아미노산(역(inverso))을 함유할 수 있다. 그러나, 멜리틴 펩티드는 본질적으로 모든 L 형 또는 모든 D 형 아미노산을 함유해야 한다. 또한, 멜리틴 아미노산 서열은 반대((reverse)(retro))일 수 있다. 레트로 멜리틴은 L 형 아미노산 또는 D 형 아미노산 (레트로인버소(retroinverso))을 가질 수 있다. 또한, 2개의 멜리틴 펩티드는 공유결합하여 멜리틴 이량체를 형성한다. 멜리틴은 펩티드의 아미노 말단 또는 카복시 말단 끝에 결합된 기를 변형할 수 있다. 그러나, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 멜리틴은 서로에 또는 다른 고분자 또는 지지체에 공유결합된 2 이상의 멜리틴 펩티드를 함유하는 사슬 또는 고분자를 포함하지 않는다.

소수성 기는 바람직하게는 탄소 및 수소 원자만 함유하는 탄화수소이다. 그러나, 소수성을 유지하는 비-극성 치환 또는 비-극성 헤테로원자, 예를 들어 불소를 포함하는 것이 허용될 수 있다. 용어 소수성 기는 지방족 기, 방향족 기, 아실기, 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 아릴기, 아르알킬기, 아르알케닐기, 및 아르알키닐기를 포함하며, 각각은 선형, 분기, 또는 고리일 수 있다. 또한, 용어 소수성 기는 스테롤, 스테로이드, 콜레스테롤, 및 스테로이드 및 콜레스테롤 유도체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 더 낮은 소수성 모노머 또는 기는 둘(2) 내지 여섯(6) 탄소 원자를 갖는 소수성 기를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 중간 소수성 모노머 또는 기는 일곱(7) 내지 열하나(11) 탄소 원자를 갖는 소수성 기를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 더 높은 소수성 모노머 또는 기는 열둘(12) 내지 삼십육(36) 또는 그 이상의 탄소 원자를 갖는 소수성 기를 포함한다.

아민기 대 소수성 기의 비율은 막 파괴 활성을 갖는 수용성 고분자를 형성하기 위해 선택된다. 본 발명의 바람직한 막 활성 고분자는 ≥1 ㎎/㎖, ≥5 ㎎/㎖, ≥10 ㎎/㎖, ≥15 ㎎/㎖, ≥20 ㎎/㎖, ≥25 ㎎/㎖, 및 ≥30 ㎎/㎖에서 수용성이다. 본 발명의 바람직한 막 활성 고분자는 표면 활성이다. 본 발명의 막 활성 고분자는 약 3 kDa 내지 약 300 kDa의 크기 범위에서 바람직하다. 고분자가 양극성이기 때문에, 이들은 임계 회합 농도 ≤1 ㎎/㎖를 갖는 수용액에서 자가-회합(self-associate)한다.

하나의 실시예에서, 막 활성 폴리아민 삼중합체(terpolymers)의 모노머 결합 비율은 약 4-8 아민 모노머 : 3-5 더 낮은 소수성 모노머 : 1 더 높은 소수성 모노머이다. 다른 실시예에서, 막 활성 폴리아민의 모노머 결합 비율은 약 5.4-7.5 아민 모노머 : 3-3.5 더 낮은 소수성 모노머 : 1 더 높은 소수성 모노머이다. 다른 실시예에서, 막 활성 폴리아민의 모노머 결합 비율은 약 6 아민 모노머 : 약 3 더 낮은 소수성 모노머 : 약 1 더 높은 소수성 모노머이다. 하나의 실시예에서, 소수성 모노머의 소수성 기는 알킬기로 이루어진다.

하나의 실시예에서, 아민/더 낮은 소수성 기 공중합체는 약 4-8 아민 모노머 : 약 3-5 더 낮은 알킬 모노머의 공급 비율에서의 모노머를 이용하여 합성된다. 다른 실시예에서, 아민/더 낮은 소수성 기 공중합체는 약 15 아민 모노머 : 4 더 낮은 소수성 기 모노머의 공급 비율에서의 모노머를 이용하여 합성될 수 있다.

하나의 실시예에서, 아민/더 낮은 소수성 기/더 높은 소수성 기 삼중합체는 약 4-8 아민 모노머 : 약 3-5 더 낮은 알킬 모노머 : 1 더 높은 알킬 모노머의 공급 비율에서의 모노머를 이용하여 합성된다. 다른 실시예에서, 아민/더 낮은 소수성 기/더 높은 소수성 기 삼중합체는 약 15 아민 모노머 : 4 더 낮은 소수성 기 모노머 : 1 더 높은 소수성 기 모노머의 공급 비율에서의 모노머를 이용하여 합성될 수 있다.

하나의 실시예에서, 특히 적당한 막 활성 폴리아민은 아민 함유 모노머, 부틸-함유 모노머 및 더 높은 소수성 기-함유 모노머를 갖는 공중합체를 포함하고, 더 높은 소수성 기는 12-18 탄소 원자를 함유한다. 특히 적당한 막 활성 폴리아민은 폴리(비닐 에테르) 랜덤 삼중합체 또는 폴리(아크릴레이트) 랜덤 삼중합체를 포함한다.

차폐( Masking )

본 발명의 전달 고분자는 가역적으로 변형된 양극성 막 활성 폴리아민을 포함하고, 가역적인 변형은 막 활성을 억제하고, 양전하를 감소하고 중성에 가까운 전하 고분자를 형성하기 위해 폴리아민을 중화하고, 세포-유형(type) 특이적 표적을 제공하고, 고분자의 비-특이적 상호작용을 억제한다. 폴리아민은 폴리아민 위에 있는 아민의 가역적인 변형을 통해 가역적으로 변형된다.

본 발명의 막 활성 폴리아민은 형질막 또는 리소좀/세포내 이입 막 (lysosomal/endocytic membranes)을 파괴할 수 있다. 이 막 활성은 폴리뉴클레오티드의 세포 전달에 대한 본질적인 특징이다. 그러나, 고분자가 in vivo 투여될 때 막 활성은 독성을 일으킨다. 또한, 폴리아민은 in vivo 많은 음이온성 성분과 즉시 반응하여, 원하지 않는 체내 분포(bio-distribution)를 이끈다. 따라서, 폴리아민의 막 활성의 가역적인 차폐는 in vivo 용도에 필수적이다. 이 차폐는 막 활성 폴리아민에 차폐제의 가역적인 결합을 통해 이루어져 가역적으로 차폐된 막 활성 고분자, 즉 전달 고분자를 형성한다. 막 활성의 억제 외에, 차폐제는 비-특이적 상호작용으로부터 고분자를 보호하고, 혈청 상호작용을 감소시키며, 순환시간을 증가시키고, 세포-특이적 상호작용, 즉 표적을 제공한다.

전체적으로, 이들은 고분자의 막 활성을 억제하고, 비-특이적 상호작용으로부터 고분자를 보호하며 (혈청 상호작용 감소, 순환시간 증가), in vivo 간세포 표적을 제공하는 것이 차폐제의 본질적인 특징이다. 막 활성 폴리아민은 변형되지 않은(차폐되지 않은) 상태에서 막 활성적이고, 변형된(차폐된) 상태에서 막 활성적이지 않다(불활성적이다). 차폐제의 충분한 수가 고분자에 결합되어 원하는 수준의 불활성화를 이룬다. 차폐제의 결합에 의한 고분자의 원하는 수준의 변형은 적당한 고분자 활성 어세이를 이용하여 즉시 측정될 수 있다. 예를 들어, 만일 고분자가 정해진 어세이에서 막 활성을 가진다면, 충분한 수준의 차폐제가 고분자에 결합되어 그 어세이에서 원하는 수준의 막 활성의 억제를 이룬다. 어떠한 차폐제 없이 고분자 위에 있는 아민의 양에 의해 결정된 대로, 차폐는 고분자 위에 있는 아민기의 ≥50%, ≥60%, ≥70%, 또는 ≥80%의 변형을 필요로 한다. 또한, 차폐제의 바람직한 특성은 고분자에 이들의 결합이 고분자의 양전하를 감소시킴으로써 더 중성의 전달 고분자를 형성하는 것이다. 차폐된 고분자는 수용성 용해도를 유지하는 것이 바람직하다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 만일 변형된 고분자가 막 활성을 나타내지 않고 in vivo 세포-특이적 (즉, 간세포) 표적을 나타낸다면, 막 활성 폴리아민은 차폐된다. 만일 고분자에 차폐제를 연결하는 결합의 절단이 고분자 위에 있는 아민을 회복시켜 막 활성이 회복되면, 막 활성 폴리아민은 가역적으로 차폐된다.

차폐제가 생리적으로 가역적인 결합을 통해 막 활성 폴리아민에 공유결합되는 것이 다른 본질적인 특징이다. 생리적으로 가역적인 연결 또는 결합을 이용함으로써, 차폐제는 in vivo 고분자로부터 절단될 수 있고, 이로써 고분자를 차폐하지 않고 차폐되지 않은 고분자의 활성을 회복시킬 수 있다. 적당한 가역적인 결합을 선택함으로써, 원하는 세포 유형 또는 세포 위치에 전달 또는 표적된 후 막 활성 고분자의 활성을 회복시키는 컨쥬게이트를 형성하는 것이 가능하다. 결합의 가역성은 막 활성 고분자의 선택적 활성을 제공한다. 가역적인 공유결합은 생리적으로 불안정한 결합, 세포의 생리적으로 불안정한 결합, pH 불안정한 결합, 매우 pH 불안정한 결합, 및 극도로 pH 불안정한 결합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있는 가역적인 또는 불안정한 결합을 함유한다.

본 발명의 바람직한 차폐제는 수용액에서 고분자를 변형시킬 수 있다(고분자와 가역적인 결합을 형성). 바람직한 아민-반응성 기는 이치환된 말레익 무수물을 포함한다. 바람직한 차폐제는 구조로 표시된다:

여기서, R¹은 메틸(-CH₃) 기, 에틸(-CH₂CH₃) 기, 또는 프로필(-CH₂CH₂CH₃) 기와 같은 알킬기이고(치환된 알킬말레익 무수물을 형성), 및 R²는 표적 리간드 또는 입체적 안정화제를 포함한다.

하나의 실시예에서, 표적 리간드는 ASGPr 표적 물질을 포함한다. 다른 실시예에서, 입체적 안정화제는 PEG를 포함한다.

막 활성 폴리아민은 과량의 차폐제의 존재 하에 차폐제에 결합될 수 있다. 과량의 차폐제는 전달 고분자의 투여 전에 결합된 전달 고분자로부터 제거될 수 있다.

입체적 안정화제

본 명세서에 사용된 바와 같이, 입체적 안정화제는 입체적 안정화제를 함유하지 않은 고분자에 비해 결합된 고분자의 분자내 또는 분자간 상호작용을 막거나 억제하는 비-이온성 친수성 고분자(천연, 합성, 또는 비-천연)이다. 입체적 안정화제는 정전기적 상호작용으로 맞물린 것으로부터 결합된 고분자를 방해한다. 정전기적 상호작용은 양전하 및 음전하 사이의 인력(attractive forces)으로 인해 2 이상의 물질의 비-공유 결합이다. 입체적 안정화제는 혈액 성분과의 상호작용을 억제할 수 있고, 따라서 식균작용증가(opsonization), 식세포작용(phagocytosis), 및 세망내피계(reticuloendothelial system)에 의해 흡수할 수 있다. 따라서, 입체적 안정화제는 이들이 결합된 분자의 순환시간을 증가시킬 수 있다. 또한, 입체적 안정화제는 고분자의 응집을 억제할 수 있다. 바람직한 입체적 안정화제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 PEG 유도체이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 바람직한 PEG는 약 1-500 에틸렌 글리콜 모노머, 2-20 에틸렌 글리콜 모노머, 5-15 에틸렌 글리콜 모노머, 또는 약 10 에틸렌 글리콜 모노머를 가질 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 바람직한 PEG는 약 85-20,000 달톤(Da), 약 200-1000 Da, 약 200-750 Da, 또는 약 550 Da의 평균 분자량을 가질 수도 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 입체적 안정화제는 수용액에서 입체적 안정화제를 함유하지 않은 고분자에 비해 결합된 고분자의 분자내 또는 분자간 상호작용을 막거나 또는 억제한다.

리간드

표적 기, 또는 표적 리간드는 표적 세포 또는 조직, 또는 특이적 세포 유형에 고분자 또는 화합물을 표적 또는 전달하기 위해 사용된다. 표적 기는 분자와 표적 세포의 결합을 향상시킨다. 따라서, 표적 기는 이들이 컨쥬게이트의 세포 분포 및 세포 흡수를 개선시키기 위해 결합된 컨쥬게이트의 약동학적 또는 체내 분포 특성을 향상시킬 수 있다. 하나 이상의 표적 기는 직접적으로 또는 스페이서와의 결합을 통해 막 활성 고분자에 결합될 수 있다. 세포 또는 세포 수용체에 리간드와 같은 표적 기의 결합은 세포내 이입을 개시할 수 있다. 표적 기는 일가, 이가, 삼가, 사가일 수 있거나, 또는 그 이상의 원자가를 가질 수 있다. 표적 기는 세포 표면 분자, 세포 수용체 리간드, 및 항체에 친화도를 갖는 화합물, 항체 단편, 및 세포 표면 분자에 친화도를 갖는 항체 모방체를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 표적 기는 세포 수용체 리간드를 포함한다. 다양한 리간드는 세포 및 특이적 세포 수용체에 약물 및 유전자를 표적하기 위해 사용되었다. 세포 수용체 리간드는 탄수화물, 글리칸, 당류 (갈락토오스, 갈락토오스 유도체, 만노오스, 및 만노오스 유도체를 포함하나 이에 한정되지 않는), 비타민, 폴레이트, 비오틴, 압타머, 및 펩티드 (RGD-함유 펩티드, 인슐린, EGF, 및 트랜스페린을 포함하나 이에 한정되지 않는)를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 표적 기의 예는 아시알로당단백질 또는 갈락토오스 잔기를 이용하여 아시알로당단백질 수용체를 표적하는 것을 포함한다. 예를 들어, 간의 간세포는 ASGP 수용체를 함유한다. 따라서, 갈락토오스-함유 표적 기는 간세포를 표적하기 위해 사용될 수 있다. 갈락토오스 함유 표적 기는 갈락토오스, N-아세틸갈락토사민, 올리고당, 및 당류 클러스터 (예를 들어, Tyr-Glu-Glu-(아미노헥실 GalNAc)₃, 리신-계 갈락토오스 클러스터, 및 콜란-계 (cholane-based) 갈락토오스 클러스터)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 더 적당한 컨쥬게이트는 아시알로당단백질-수용체(ASGPr) 위에서 발견된 탄수화물 인지 도메인 (carbohydrate recognition domains, CRD)에 결합할 수 있는 올리고당을 포함할 수 있다. 올리고당을 함유하는 컨쥬게이트 물질 및/또는 탄수화물 복합체의 예는 미국특허번호 제 6,525,031호에 제공된다.

ASGPr 표적 물질

표적 물질 또는 기는 이들이 컨쥬게이트의 세포-특이적 분포 및 세포-특이적 흡수를 개선시키기 위해 결합한 컨쥬게이트의 약동학적 또는 체내 분포 특성을 향상시킨다. 갈락토오스 및 갈락토오스 유도체를 사용하여 간세포의 표면 위에서 발현된 아시알로당단백질 수용체(ASGPr)에 이들의 결합을 통해 in vivo 간세포에 분자를 표적한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, ASGPr 표적 물질은 갈락토오스의 친화도보다 크거나 같은 ASGPr의 친화도를 갖는 갈락토오스 및 갈락토오스 유도체를 포함한다. ASGPr(s)에 갈락토오스 표적 물질의 결합은 간세포에 전달 고분자의 세포-특이적 표적 및 간세포로의 전달 고분자의 세포내 이입을 용이하게 한다.

ASGPr 표적 물질은 락토오스, 갈락토오스 N-아세틸갈락토사민(GalNAc), 갈락토사민, N-포르밀갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-프로피오닐갈락토사민, N-n-부타노일갈락토사민, 및 N-이소부타노일-갈락토사민을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다(Iobst, S.T. and Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271, 6686). ASGPr 표적 물질은 모노머(예를 들어, 하나의 갈락토사민을 갖는) 또는 다량체(예를 들어, 다수의 갈락토사민을 갖는) 일 수 있다.

어떤 실시예에서, 갈락토오스 표적 물질은 하기 구조로 예시된 바와 같이 PEG 링커를 통해 아민-반응성 기에 결합된다:

여기서, n은 1 내지 19의 정수이다.

하나의 실시예에서, 막 활성 폴리아민은 폴리아민 위에 있는 아민의 ≥50%, ≥60%, ≥70%, 또는 ≥80%에 ASGPr 표적 물질 차폐제의 결합에 의해 가역적으로 차폐된다. 다른 실시예에서, 막 활성 폴리아민은 폴리아민 위에 있는 아민의 ≥50%, ≥60%, ≥70%, 또는 ≥80%에 ASGPr 표적 물질 차폐제와 PEG 차폐제의 결합에 의해 로 가역적으로 차폐된다. 다른 실시예에서, ASGPr 표적 물질 차폐제는 PEG 링커를 통해 아민-반응성 기에 결합된 ASGPr 표적 물질을 포함한다. ASGPr 표적 물질 차폐제와 PEG 차폐제를 모두 갖는 막 활성 폴리아민의 경우, PEG 대 ASGPr 표적 물질의 비율이 약 0-4:1, 더욱 바람직하게는 0.5-2:1 이다. 다른 실시예에서는, 약 1.3-2 PEG 차폐제 대 약 1 갈락토오스 유도체 차폐제가 있다.

표면 전하

제타 전위(zeta potential)는 현탁액에서 입자에 의해 나타나고 표면 전하에 밀접하게 관련된 물리적 특성이다. 수용성 매질에서, 시료의 pH는 제타 전위에 영향을 미치는 가장 중요한 인자 중 하나이다. 전하가 염기/산의 수소화/탈수소화를 기반으로 한 경우, 전하는 pH에 의존한다. 따라서, 제타 전위 값은 중요한 용액 조건, 특히 pH를 포함해야 한다. 일반적인 입자의 경우, 제타 전위의 크기는 콜로이드계의 전위 안정성의 조짐을 보인다. 만일 현탁액 내 모든 입자가 큰 음성 또는 양성 제타 전위를 가진다면, 이들은 서로서로 밀어내는 경향이 있을 것이고, 입자의 합칠 가능성은 없을 것이다. 그러나, 입자가 낮은 제타 전위 값을 가진다면, 입자가 합치고 응집되는 것을 막을 힘이 없을 것이다. 일반적인 입자에 대해 안정하고 불안정한 현탁액 사이의 일반적인 경계선은 일반적으로 +30 또는 -30 mV에서 이해된다. +30 mV 이상의 양성 제타 전위 또는 -30 mV 이상의 음성 제타 전위를 갖는 입자는 일반적으로 안정하다고 간주된다. 기재된 발명의 전달 고분자는 생리적 염 및 pH 8에서 +20 mV 내지 -20 mV의 제타 전위를 나타내나, 수용액에서 콜로이드적으로 안정하고 응집되지 않는다.

막 활성 폴리아민의 양전하, 또는 제타 전위는 차폐제로 변형시켜 감소된다. 고분자 전하, 특히 양전하는 혈청 성분 또는 비-표적 세포와 원하지 않는 상호작용을 야기할 수 있다. 또한, 양 표면 전하는 고분자와 음전하 세포막의 상호작용을 향상시킴으로써 막 활성에서 역할을 한다. 따라서, 중성에 가까운 순 전하 또는 제타 전위를 갖는 전달 고분자는 폴리뉴클레오티드의 in vivo 전달을 선호한다. 본 발명의 전달 고분자인 ASGPr 표적 물질 차폐제와 입체적 안정화제 차폐제의 가역적인 결합에 의해 차폐된 막 활성 폴리아민은 중성에 가까운 겉보기 표면 전하를 가지고 혈청 안정적이다. 더 상세하게는, 본 발명의 전달 고분자는 +30 및 -30 mV 사이, +20 및 -20 mV 사이, +10 및 -10 mV 사이, 또는 +5 및 -5 mV 사이에서 pH 8에서 측정된 제타 전위를 가진다. pH 7에서, 컨쥬게이트의 순 전하는 pH 8에서 보다 더 양성일 것으로 예상된다. 순 전하, 또는 표면 전하는 in vivo 적용에 중요한 인자이다.

불안정한 결합( Labile Linkage )

결합 또는 링커는 하나 이상의 공유 결합을 통해 관심있는 하나의 화학적 기 또는 조각(segment)을 관심있는 다른 화학적 기 또는 조각에 결합한 2개의 원자 사이의 연결이다. 예를 들어, 결합은 고분자에 차폐제를 연결할 수 있다. 결합의 형성은 2개의 별도의 분자를 단일 분자로 연결할 수 있거나 또는 동일한 분자에서 2개의 원자를 연결할 수 있다. 결합은 중성 전하일 수 있거나 또는 양전하 또는 음전하를 가질 수 있다. 가역적인 또는 불안정한 결합(linkage)은 가역적인 또는 불안정한 결합(bond)을 함유한다. 결합은 2개의 연결된 원자 사이의 거리를 증가시키는 스페이서를 임의로 포함할 수 있다. 스페이서는 유연성 및/또는 결합 길이를 더 가할 수 있다. 스페이서는 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 아릴기, 아르알킬기, 아르알케닐기, 아르알키닐기를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않으며; 각각은 하나 이상의 헤테로원자, 헤테로고리, 아미노산, 뉴클레오티드, 및 당류(saccharides)를 함유할 수 있다. 스페이서 기는 기술분야에 잘 알려져 있으며, 선행 목록이 발명의 범위를 한정하는 것으로 의미하지 않는다.

가역적인 또는 불안정한 결합은 동일한 분자에서 다른 공유결합을 파괴 또는 절단하지 않을 조건 하에 선택적으로 파괴 또는 절단될 수 있는 수소 원자의 공유결합 외의 공유결합이다. 더 상세하게는, 가역적인 또는 불안정한 결합은 동일한 분자에서 다른 불안정하지 않은 공유결합보다 적당한 조건 하에 덜 안정하고(열역학적으로) 또는 더 빠르게 파괴된(동력학적으로) 공유결합이다. 분자 내 불안정한 결합의 절단은 2개의 분자를 형성할 수 있다. 기술분야에서 숙련된 자의 경우, 결합의 절단 또는 불안정성은 일반적으로 결합 절단의 반감기(t_{1 /2})(절단하는데 결합의 반이 필요한 시간) 면에서 논의된다. 따라서, 가역적인 또는 불안정한 결합은 분자에서 다른 결합 보다 더 빠르게 선택적으로 절단될 수 있는 결합을 포함한다.

적당한 조건은 불안정한 결합의 유형에 의해 결정되고 유기화학에서 잘 알려져 있다. 불안정한 결합은 pH, 산화 또는 환원 조건 또는 물질, 온도, 염 농도, 효소의 존재(뉴클레아제 및 프로테아제를 포함하는 에스터라제와 같은), 또는 가해진 물질의 존재에 민감할 수 있다. 예를 들어, 증가된 또는 감소된 pH는 pH-불안정한 결합에 적당한 조건이다.

불안정한 기가 변형을 수행할 비율은 불안정한 기를 함유하는 분자의 화학적 성분을 변경함으로써 조절될 수 있다. 예를 들어, 불안정한 기 근처의 특정 화학적 부분(예를 들어, 전자 받개 또는 주개)의 추가는 화학적 변형이 일어날 조건 하에 특정 조건(예를 들어, pH)에 영향을 미칠 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 생리적으로 불안정한 결합은 일반적으로 접하는 조건 또는 포유동물 신체 내에서 접하는 조건과 유사한 조건 하에 절단할 수 있는 불안정한 결합이다. 생리적으로 불안정한 결합 기는 이들이 특정 생리적 조건에 존재할 때 화학적 변형(예를 들어, 절단)을 수행하도록 선택된다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 세포의 생리적으로 불안정한 결합은 포유동물 세포내 조건 하에서 절단할 수 있는 불안정한 결합이다. 포유동물 세포내 조건은 포유동물 세포에서 확인된 pH, 온도, 산화 또는 환원 조건 또는 물질, 및 염 농도와 같은 화학적 조건 또는 포유동물 세포에서 접하는 것과 유사한 것을 포함한다. 또한, 포유동물 세포내 조건은 단백질 가수분해 또는 가수분해 효소와 같은 포유동물 세포에 일반적으로 존재하는 효소 활성의 존재를 포함한다. 또한, 세포의 생리적으로 불안정한 결합은 약학적으로 허용가능한 외인성 물질의 투여에 반응하여 절단될 수 있다. 45분 미만의 반감기를 갖는 적당한 조건 하에 절단되는 생리적으로 불안정한 결합은 매우 불안정하다고 생각된다. 15분 미만의 반감기를 갖는 적당한 조건 하에 절단되는 생리적으로 불안정한 결합은 극도로 불안정하다고 생각된다.

화학적 변형(불안정한 결합의 절단)은 약학적으로 허용가능한 물질을 세포에 첨가하여 개시될 수 있거나 또는 불안정한 결합을 함유하는 분자가 적당한 세포내 및/또는 세포외 환경에 도달할 때 자발적으로 발생할 수 있다. 예를 들어, pH 불안정한 결합은 분자가 산성화된 엔도좀으로 들어갈 때 절단될 수 있다. 따라서, pH 불안정한 결합은 엔도좀 절단할 수 있는 결합으로 생각될 수 있다. 효소 절단할 수 있는 결합은 엔도좀 또는 리소좀에서 또는 세포질에서 존재하는 것과 같은 효소에 노출되었을 때 절단될 수 있다. 디설파이드 결합(disulfide bond)은 분자가 세포의 세포질의 더 환원성 환경에 들어갈 때 절단될 수 있다. 따라서, 디설파이드는 세포질 절단할 수 있는 결합으로 생각될 수 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, pH-불안정한 결합은 산성 조건(pH<7) 하에 선택적으로 파괴된 불안정한 결합이다. 또한, 세포 엔도좀 및 리소좀은 7 미만의 pH를 가지기 때문에, 이러한 결합은 엔도좀의 불안정한 결합으로 일컫을 수 있다. 용어 pH-불안정한(pH-labile)은 pH-불안정한, 매우 pH-불안정한, 및 극도로 pH-불안정한 결합을 포함한다.

무수물과 아민의 반응은 아미드와 산을 형성한다. 많은 무수물의 경우, 가역 반응(무수물과 아민의 형성)은 매우 느리고, 활동적으로 좋지 않다. 그러나, 만일 무수물이 고리형 무수물(cyclic anhydride)이면, 아민과 반응하여 아미드 및 산이 동일한 분자 내에 있는 분자인 아미드 산을 생성한다. 동일한 분자 내에 양쪽 반응성 기(아미드 및 카복실산)의 존재는 가역 반응을 촉진시킨다. 특히, 일차 아민과 말레익 무수물 및 말레익 무수물 유도체의 생성물인 말레암산(maleamic acid)은 이의 비고리형 유사체보다 1×10⁹ 내지 1×10¹³ 배 더 빠른 아민과 무수물로 되돌아간다(Kirby 1980).

아민과 무수물의 반응은 아미드와 산을 형성한다.

아민과 고리형 무수물의 반응은 아미드 산을 형성한다.

아민과 무수물을 형성하기 위한 아미드 산의 절단은 pH-의존적이고, 산성 pH에서 크게 촉진된다. 이 pH-의존적 반응성을 이용하여 가역적인 pH-불안정한 결합과 링커를 형성할 수 있다. 시스-아코니트산(cis-aconitic acid)은 이러한 pH-민감성 링커 분자로서 사용되었다. 먼저 γ-카복실레이트가 분자에 결합된다. 두번째 단계에서, α 또는 β 카복실레이트가 두번째 분자에 결합하여 2개의 분자의 pH-민감성 결합을 형성한다. pH 5에서 이 링커의 절단의 반감기는 8 및 24h 사이이다.

시스-아코니트산 무수물 및 말레익 무수물의 구조.

절단이 발생하는 pH는 불안정한 부분에 화학적 성분의 첨가에 의해 조절된다. 말레암산이 아민과 말레익 무수물로의 전환율은 말레익 무수물계의 치환(R2 및 R3)에 강하게 의존한다. R2가 메틸인 경우, 전환율은 R2 및 R3가 수소인 경우보다 50배 더 높다. R2 및 R3 모두에 알킬 치환이 있으면(예를 들어, 2,3-디메틸말레익 무수물), 전환율은 급격하게 증가한다: 비-치환된 말레익 무수물 보다 10,000배 더 빠르다. 아민과 2,3-디메틸말레익 무수물의 변형으로부터 형성된 말레아메이트 (maleamate) 결합은 절단되어 pH 5에서 4 및 10분 사이의 반감기를 갖는 무수물 및 아민으로 회복된다. 만일 R2 및 R3가 수소보다 더 큰 기이면, 아미드-산이 아민과 무수물로의 전환율은 R2 및/또는 R3가 수소인 경우보다 더 빠를 것이라고 예상된다.

매우 pH-불안정한 결합: 매우 pH-불안정한 결합은 pH 5에서 절단에 대해 45분 미만의 반감기를 가진다. 매우 pH-불안정한 결합의 구성은 화학 기술분야에 잘 알려져 있다.

극도로 pH-불안정한 결합: 극도로 pH-불안정한 결합은 pH 5에서 절단에 대해 15분 미만의 반감기를 가진다. 극도로 pH-불안정한 결합의 구성은 화학 기술분야에 잘 알려져 있다.

이치환된(disubstituted) 고리형 무수물은 본 발명의 막 활성 폴리아민에 차폐제의 결합에 특히 유용하다. 이들은 생리적으로 pH-불안정한 결합을 제공하고, 즉시 아민을 변형시키며, 세포의 엔도좀 및 리소좀에서 확인된 감소된 pH에서 절단하여 아민을 회복시킨다. 두번째, 아민과 반응하여 생성되는 α 또는 β 카복실산기는 고분자에 예상되는 음전하의 약 1/20^th만 기여하는 것으로 나타난다 (Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003). 따라서, 폴리아민과 이치환된 말레익 무수물의 변형은 높은 음전하를 갖는 고분자를 생성하기 보다는 다소 폴리아민의 양전하를 효과적으로 중화한다. 중성에 가까운 고분자는 in vivo 전달을 선호한다.

자연적으로 발생하는 고분자는 자연에서 발견될 수 있는 고분자이다. 예는 폴리뉴클레오티드, 단백질, 콜라겐, 및 다당류 (전분, 셀룰로오스, 글리코사미노글리칸, 키틴, 아가, 아가로오스)를 포함한다. 천연 고분자는 생물학적 자원으로부터 분리될 수 있거나 또는 합성될 수 있다. 합성 고분자는 "인간에 의해" 화학적 방법에 의해 제형화되거나 제조되고 자연적으로 발생하는 생물학적 방법에 의해 제조되지 않는다. 비-천연 고분자는 자연적으로 발생하는 (동물 또는 식물) 물질 또는 모노머(아미노산, 뉴클레오티드, 및 당류와 같은)로부터 제조되지 않는 합성 고분자이다. 고분자는 완전히 또는 부분적으로 천연, 합성, 또는 비-천연일 수 있다.

RNAi 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트

우리는 표적 리간드-약동학적 조절제 표적 물질에 RNAi 폴리뉴클레오티드의 결합, 및 상기 기재된 전달 고분자와 RNAi 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트의 병용 투여가 in vivo RNAi 폴리뉴클레오티드의 개선된 전달을 제공한다는 것을 발견하였다. 기능적 전달에 의해, RNAi 폴리뉴클레오티드는 세포로 전달되고, 예상된 생물학적 활성인 유전자 발현의 서열-특이적 억제를 가지는 것을 의미한다. 포유동물의 맥관구조(vasculature)에 투여된 폴리뉴클레오티드를 포함한 많은 분자는 일반적으로 간에 의해 신체로부터 제거된다. 폴리뉴클레오티드가 분해되거나 또는 반대로 신체로부터 제거하기 위해 처리되고, 폴리뉴클레오티드가 유전자 발현의 서열-특이적 억제를 야기하지 않는 간에 의한 폴리뉴클레오티드의 청소(clearance)는 기능적 전달로 생각되지 않는다.

RNAi 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트는 표적 리간드-약동학적 조절제 표적 물질에 RNAi 폴리뉴클레오티드를 공유결합하여 형성된다. 폴리뉴클레오티드는 반응성 기 A를 함유하도록 합성되거나 변형될 수 있다. 또한, 표적 물질은 반응성 기 B를 함유하도록 합성되거나 변형될 수 있다. 반응성 기 A 및 B는 이들이 기술분야에서 알려진 방법을 이용하여 공유결합을 통해 결합될 수 있도록 선택된다.

표적 물질은 RNAi 폴리뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 결합될 수 있다. 비록 센스 가닥이 바람직하지만, siRNA 폴리뉴클레오티드의 경우, 표적 물질은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에 결합될 수 있다. 어떤 실시예에서, siRNA는 일차 아민기와 같은 반응성 기 A를 함유하는 짧은 알킬 사슬을 통해 표적 물질에 결합된다. 그 다음, 반응성 기 A는 표적 물질 위에 있는 카복실기와 같은 반응성 기 B에 결합된다.

간에서 표적 간세포의 경우, 바람직한 표적 리간드는 갈락토오스 클러스터이다. 갈락토오스 클러스터는 2 내지 4 말단 갈락토오스 유도체를 갖는 분자를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 갈락토오스 유도체는 갈락토오스의 친화도보다 크거나 같은 아시알로당단백질 수용체에 대해 친화도를 갖는 갈락토오스 및 갈락토오스 유도체를 포함한다. 말단 갈락토오스 유도체는 이의 C-1 탄소를 통해 분자에 결합된다. 아시알로당단백질 수용체(ASGPr)는 간세포에 독특하고 분기 갈락토오스-말단 당단백질을 결합한다. 바람직한 갈락토오스 클러스터는 아시알로당단백질 수용체에 대해 친화도를 갖는 각 3개의 말단 갈락토사민 또는 갈락토사민 유도체를 가진다. 더 바람직한 갈락토오스 클러스터는 3개의 말단 N-아세틸-갈락토사민을 가진다. 기술분야에서 다른 공통적 용어는 3-촉각(tri-antennary) 갈락토오스, 3가(tri-valent) 갈락토오스 및 갈락토오스 삼량체(trimer)를 포함한다. 3-촉각 갈락토오스 유도체 클러스터는 이(bi)-촉각 또는 일(mono)-촉각 갈락토오스 유도체 구조보다 더 큰 친화도를 갖는 ASGPr에 결합된다고 알려져 있다(Baenziger and Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620; Connolly et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945). nM 친화도를 이루기 위해 다가성(multivalency)이 필요하다. 아시알로당단백질 수용체에 대해 친화도를 갖는 단일 갈락토오스 유도체의 결합은 전달 고분자와 함께 병용 투여될 때 in vivo 간세포로 RNAi 폴리뉴클레오티드의 기능적 전달을 가능하지 않게 한다.

갈락토오스 클러스터는 중심 분기점에 결합된 각 3개의 갈락토오스 유도체를 함유한다. 갈락토오스 유도체는 당류의 C-1 탄소를 통해 중심 분기점에 결합된다. 갈락토오스 유도체는 바람직하게는 링커 또는 스페이서를 통해 분기점에 결합된다. 바람직한 스페이서는 유연한 친수성 스페이서이다(미국특허 제 5885968호; Biessen et al. J. Med. Chem. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546). 바람직한 유연한 친수성 스페이서는 PEG 스페이서이다. 바람직한 PEG 스페이서는 PEG₃ 스페이서이다. 분기점은 3개의 갈락토오스 유도체의 결합을 허용하고 RNAi 폴리뉴클레오티드에 분기점의 결합을 더 허용하는 어느 작은 분자일 수 있다. 예시적인 분기점 기는 디-리신(di-lysine)이다. 디-리신 분자는 3개의 갈락토오스 유도체가 결합될 수 있는 것을 통해 3개의 아민기, 및 디-리신이 RNAi 폴리뉴클레오티드에 결합될 수 있는 것을 통해 카복실 반응성 기를 함유한다. RNAi 폴리뉴클레오티드에 분기점의 결합은 링커 또는 스페이서를 통해 발생할 수 있다. 바람직한 스페이서는 유연한 친수성 스페이서이다. 바람직한 유연한 친수성 스페이서는 PEG 스페이서이다. 바람직한 PEG 스페이서는 PEG₃ 스페이서이다(3개의 에틸렌 단위). 갈락토오스 클러스터는 기술분야에서 알려진 방법을 이용하여 RNAi 폴리뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에 결합될 수 있다. siRNA와 같은 2 가닥을 갖는 RNAi 폴리뉴클레오티드의 경우, 갈락토오스 클러스터는 둘 중 하나의 가닥에 결합될 수 있다.

바람직한 갈락토오스 유도체는 N-아세틸-갈락토사민(GalNAc)이다. 아시알로당단백질 수용체에 대해 친화도를 갖는 다른 당류는 갈락토오스, 갈락토사민, N-포르밀갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-프로피오닐-갈락토사민, N-n-부타노일갈락토사민, 및 N-이소-부타노일갈락토사민을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 아시알로당단백질 수용체에 대해 많은 갈락토오스 유도체의 친화도는 연구되었거나 (예를 들어 Iobst, S.T. and Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271, 6686 참조) 또는 기술분야에서 일반적인 방법을 이용하여 쉽게 결정된다.

갈락토오스 클러스터 중 하나의 실시예

분기점과 핵산 사이의 PEG 스페이서를 갖는 갈락토오스 클러스터

폴리뉴클레오티드

용어 폴리뉴클레오티드, 또는 핵산 또는 폴리핵산은 적어도 2개의 뉴클레오티드를 함유하는 고분자를 나타낸 기술분야의 용어이다. 뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 고분자의 모노머 단위이다. 120 모노머 단위 미만의 폴리뉴클레오티드는 종종 올리고뉴클레오티드라 부른다. 천연 핵산은 데옥시리보오스- 또는 리보오스-포스페이트 백본을 가진다. 비-천연 또는 합성 폴리뉴클레오티드는 in vitro 또는 세포 자유 시스템에서 중합되는 폴리뉴클레오티드이고, 동일 또는 유사한 염기를 함유하나 천연 리보오스 또는 데옥시리보오스-포스페이트 백본 이외의 유형의 백본을 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 기술분야에서 어느 알려진 기술을 이용하여 합성될 수 있다. 기술분야에서 알려진 폴리뉴클레오티드 백본은 PNAs(펩티드 핵산), 포스포로티오에이트, 포스포로디아미데이트, 모폴리노 및 천연 핵산의 포스페이트 백본의 다른 이형을 포함한다. 염기는 퓨린 및 피리미딘을 포함하고, 천연 화합물 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 우라실, 이노신, 및 천연 유사체를 더 포함한다. 퓨린 및 피리미딘의 합성 유도체는 아민, 알콜, 티올, 카복실레이트, 및 알킬할라이드와 같으나 이에 한정되지 않는 뉴클레오티드 위에 새로운 반응성 기를 배치한 변형을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 용어 염기는 DNA 및 RNA의 알려진 염기 유사체 중 어느 것을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 합성 뉴클레오티드, 또는 어느 적당한 조합을 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 in vitro에서 중합될 수 있고, 이들은 재조합일 수 있으며, 키메릭 서열, 또는 이들 기의 유도체를 함유한다. 폴리뉴클레오티드는 5'-말단, 3'-말단, 또는 5' 및 3' 말단 모두에서 말단 캡 부분을 포함할 수 있다. 캡 부분은 역 데옥시 염기가 결여된 부분(inverted deoxy abasic moiety), 역 데옥시 티미딘 부분, 티미딘 부분, 또는 3' 글리세릴 변형일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

RNA 간섭(RNAi) 폴리뉴클레오티드는 서열 특이적 방법으로 트랜스유전자 (transgene)의 메신저 RNA(mRNA) 전사의 번역을 분해 또는 억제하기 위해 포유동물 세포의 RNA 간섭 경로 방법과 상호작용을 통해 RNA 간섭을 유도할 수 있는 분자이다. 2개의 일차 RNAi 폴리뉴클레오티드는 작은 (또는 짧은) 간섭 RNAs(siRNAs) 및 microRNAs(miRNAs) 이다. RNAi 폴리뉴클레오티드는 siRNA, microRNA, 이중-가닥 RNA(dsRNA), 짧은 머리핀 RNA(shRNA), 및 RNA 간섭을 유도할 수 있는 RNA를 인코딩하는 발현 카세트를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. siRNA는 일반적으로 15-50 염기쌍, 바람직하게는 21-25 염기쌍을 함유하고 세포 내에서 발현된 표적 유전자 또는 RNA의 서열을 코딩하는데 뉴클레오티드 서열 동일성(완전히 상보성) 또는 거의 동일성(부분적 상보성)을 갖는 이중 가닥 구조를 포함한다. siRNA는 디뉴클레오티드 3' 돌출물(overhangs)을 가질 수 있다. siRNA는 2개의 어닐링된(annealed) 폴리뉴클레오티드 또는 머리핀 구조를 형성하는 단일 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 본 발명의 siRNA 분자는 센스 영역 및 안티센스 영역을 포함한다. 하나의 실시예에서, 컨쥬게이트의 siRNA는 2개의 올리고뉴클레오티드 단편으로부터 조립되며, 하나의 단편은 siRNA 분자의 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 두번째 단편은 siRNA 분자의 센스 영역의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, 센스 가닥은 폴리뉴클레오티드 링커 또는 비-뉴클레오티드 링커와 같은 링커 분자를 통해 안티센스 가닥에 결합된다. microRNAs(miRNAs)는 이의 mRNA 표적의 파괴 또는 번역 억제(translational repression)를 지도하는 약 22 뉴클레오티드 길이의 작은 비코딩(noncoding) RNA 유전자 산물이다. 만일 miRNA와 표적 mRNA 사이의 상보성이 부분적이면, 표적 mRNA의 번역은 억제된다. 만일 상보성이 광범위하면, 표적 mRNA는 절단된다. miRNAs의 경우, 복합체는 일반적으로 miRNA와 부분적 상동성만 공유하는 mRNA의 3' UTR에 통상 위치된 표적 위치에 결합한다. "씨드 영역(seed region)"은 - 이의 표적과 함께 완전한 염기쌍을 형성하는 miRNA의 5' 말단 위의 약 일곱(7) 연속적인 뉴클레오티드의 신장(stretch) - miRNA 특이성에서 중요한 역할을 한다. mRNA에 RISC/miRNA 복합체의 결합은 단백질 번역의 억제 또는 mRNA의 절단 및 분해를 이끌 수 있다. 최근 자료는 만일 씨딩 영역에서 단지 완전한 염기쌍을 보이는 것 대신 miRNA 및 이의 표적의 전체 길이를 따라 완전한 상동성이 있다면 mRNA 절단이 우선적으로 일어난다는 것을 나타낸다 (Pillai et al. 2007).

RNAi 폴리뉴클레오티드 발현 카세트는 세포에서 전사하여 siRNA, 별도의 센스 및 안티-센스 가닥 선형 siRNAs, 또는 miRNA로서 기능할 수 있는 작은 머리핀 RNAs를 생성할 수 있다. RNA 폴리머라제 Ⅲ 전사된 DNAs는 U6 프로모터, H1 프로모터, 및 tRNA 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택된 프로모터를 함유한다. RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터는 U1, U2, U4 및 U5 프로모터, snRNA 프로모터, microRNA 프로모터, 및 mRNA 프로모터를 포함한다.

알려진 miRNA 서열의 목록은 다른 것들 중에서, 특히 Wellcome Trust Sanger Institute, Penn Center for Bioinformatics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 및 European Molecule Biology Laboratory와 같은 연구 기관에 의해 유지되는 데이터베이스에서 발견될 수 있다. 또한, 알려진 효과적인 siRNA 서열 및 동족(cognate) 결합 위치는 관련 문헌에서 잘 나타난다. RNAi 분자는 기술분야에서 알려진 기술에 의해 즉시 디자인되고 생성된다. 또한, 효과적이고 특이적인 서열 모티프를 찾는 기회를 증가시키는 실험 도구(computational tools)가 있다(Pei et al. 2006, Reynolds et al. 2004, Khvorova et al. 2003, Schwarz et al. 2003, Ui-Tei et al. 2004, Heale et al. 2005, Chalk et al. 2004, Amarzguioui et al. 2004).

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 변형될 수 있다. 이러한 화학적 변형의 비-제한적인 예는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드 간 결합 (phosphorothioate internucleotide linkages), 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 리보뉴클레오티드, 2'-데옥시 리보뉴클레오티드, "universal base" 뉴클레오티드, 5-C-메틸 뉴클레오티드, 및 역 데옥시 염기가 결여된 잔기 결합을 포함한다. 이러한 화학적 변형은 다양한 폴리뉴클레오티드 구조체에서 사용될 때, 세포에서 폴리뉴클레오티드 활성을 보존하고 동시에 이러한 화합물의 혈청 안정성을 증가시키는 것으로 나타낸다. 또한, 화학적으로 변형된 siRNA는 인간에서 인터페론 활성을 활성화하는 가능성을 최소화시킬 수 있다.

하나의 실시예에서, 본 발명의 화학적으로-변형된 RNAi 폴리뉴클레오티드는 2개의 가닥을 갖는 듀플렉스(duplex)를 포함하고, 이들 중 하나 또는 모두는 화학적으로-변형되고, 각 가닥은 약 19 내지 약 29 뉴클레오티드이다. 하나의 실시예에서, 본 발명의 RNAi 폴리뉴클레오티드는 세포 또는 재구성된 in vitro 시스템 내부에서 RNAi를 조정하는 능력을 유지하는 동안 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. RNAi 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있고, 화학적 변형은 하나 이상(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상)의 뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 RNAi 폴리뉴클레오티드는 RNAi 폴리뉴클레오티드에 존재하는 뉴클레오티드의 총 수의 퍼센트로서 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 RNAi 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 약 5 내지 약 100%의 뉴클레오티드 위치의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다(예를 들어, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 뉴클레오티드 위치). 정해진 RNAi 폴리뉴클레오티드에 존재하는 변형된 뉴클레오티드의 실제 퍼센트는 RNAi 폴리뉴클레오티드에 존재하는 뉴클레오티드의 총 수에 의존한다. 만일 RNAi 폴리뉴클레오티드가 단일 가닥이면, 퍼센트 변형은 단일 가닥 RNAi 폴리뉴클레오티드에 존재하는 뉴클레오티드의 총 수를 기준으로 할 수 있다. 마찬가지로, 만일 RNAi 폴리뉴클레오티드가 이중 가닥이면, 퍼센트 변형은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 센스 및 안티센스 가닥 모두에 존재하는 뉴클레오티드의 총 수를 기준으로 할 수 있다. 또한, 정해진 RNAi 폴리뉴클레오티드에 존재하는 변형된 뉴클레오티드의 실제 퍼센트도 RNAi 폴리뉴클레오티드에 존재하는 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드의 총 수에 의존할 수 있다. 예를 들어, RNAi 폴리뉴클레오티드에 존재하는 모든 피리미딘 뉴클레오티드 및/또는 모든 퓨린 뉴클레오티드는 변형된다.

RNAi 폴리뉴클레오티드는 유전자에 의해 인코딩된 RNA의 발현을 조절한다. 많은 유전자들은 서로서로 서열 상동성의 어느 정도를 공유할 수 있기 때문에, RNAi 폴리뉴클레오티드는 충분한 서열 상동성을 갖는 유전자의 종류를 표적하도록 디자인될 수 있다. 따라서, RNAi 폴리뉴클레오티드는 다른 유전자 표적 사이에서 공유되거나 또는 특정 유전자 표적에 독특한 서열에 상보성을 갖는 서열을 함유할 수 있다. 따라서, RNAi 폴리뉴클레오티드는 여러 유전자들 사이에서 상동성을 갖는 RNA 서열의 보존된 영역을 표적하도록 디자인될 수 있고, 이로써 유전자 과 (family)(예를 들어, 다른 유전자 아형(isoform), 스플라이스 변이체(splice variants), 돌연변이체 유전자 등)에서 여러 유전자를 표적한다. 다른 실시예에서, RNAi 폴리뉴클레오티드는 단일 유전자의 특이적 RNA 서열에 독특한 서열을 표적하도록 디자인될 수 있다.

용어 상보성(complementarity)은 전통적 Watson-Crick 또는 다른 비-전통적 유형에 의해 다른 폴리뉴클레오티드 서열과 수소결합을 형성하는 폴리뉴클레오티드의 능력을 나타낸다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자에 관하여, 이의 표적(효과기(effector) 결합 위치) 또는 상보적 서열과 함께 폴리뉴클레오티드 분자의 자유 에너지의 결합은 효소적 mRNA 절단 또는 번역 억제를 진행하는 폴리뉴클레오티드의 관련 기능을 허여하기에 충분하다. 핵산 분자의 자유 에너지의 결합의 측정은 기술분야에서 잘 알려져 있다(Frier et al. 1986, Turner et al. 1987). 퍼센트 상보성은 두번째 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 10 중 5, 6, 7, 8, 9, 10은 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 100% 상보적)과 함께 수소결합을 형성할 수 있는 첫번째 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, Watson-Crick 염기쌍)에서, 인접한 가닥에서, 염기의 퍼센트를 나타낸다. 완전하게 상보적은 폴리뉴클레오티드 서열의 인접한 가닥에서 모든 염기가 두번째 폴리뉴클레오티드 서열에서 인접한 염기의 동일한 수와 함께 수소결합일 것이라는 것을 의미한다.

유전자 발현을 억제, 하향-조절(down-regulate), 또는 녹다운시킴으로써, 유전자로부터 전사된 RNA의 수준 또는 폴리뉴클레오티드, 단백질 또는 RNA로부터 번역된 단백질 서브유닛의 수준을 측정한 대로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드-컨쥬게이트를 차단하지 않고 관찰된 유전자의 발현이 아래로 감소된다는 것을 의미한다. 대조 불활성화 핵산, 스크램블된 서열 또는 불활성화 부조화(mismatch)를 갖는 핵산의 존재 하에, 또는 차폐된 고분자에 폴리뉴클레오티드의 결합 없이 관찰된 본 발명의 조성물에 의해 전달된 폴리뉴클레오티드와 함께 유전자 발현의 억제, 하향-조절, 또는 녹다운의 수준은 바람직하게는 아래이다.

In Vivo 투여

약리학 및 독성학에서, 투여 경로는 약물, 체액, 독, 또는 다른 물질이 신체와 접촉하게 되는 경로이다. 일반적으로, 포유동물의 치료를 위한 약물 및 핵산의 투여 방법은 기술분야에서 잘 알려져 있고, 본 발명의 조성물의 투여로 적용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 어느 적당한 경로, 바람직하게는 비경구를 통해 경로에 적당하게 조건에 맞도록 만든 제제로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 정맥내, 근육내, 피내(intracutaneously), 피하(subcutaneously), 또는 복강내 주사로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

비경구 투여 경로는 혈관내(정맥내, 동맥내), 근육내, 뇌실질내 (intraparenchymal), 피부내(intradermal), 피하(subdermal), 피하(subcutaneous), 종양내, 복강내, 척수강내(intrathecal), 경막하(subdural), 경막외(epidural), 및 주사기 및 바늘 또는 카테터를 사용하는 림프관내(intralymphatic) 주사를 포함한다. 본 명세서에서 혈관내는 신체 내 조직 또는 기관에 연결된 도관이라 불리우는 관 구조 내를 의미한다. 관 구조의 공동(cavity) 내에 체액은 신체 일부로 또는 신체 일부로부터 흐른다. 체액의 예는 혈액, 뇌척수액(cerebrospinal fluid, CSF), 림프액, 또는 담즙을 포함한다. 도관의 예는 동맥(arteries), 소동맥(arterioles), 모세관(capillaries), 세정맥(venules), 동양혈관(sinusoids), 정맥(veins), 림프 (lymphatics), 담관(bile ducts), 및 침 또는 다른 외분비샘(exocrine glands)의 관을 포함한다. 혈관내 경로는 동맥 또는 정맥과 같은 혈관을 통한 전달을 포함한다. 혈액 순환계는 의약품의 체계적 확산을 제공한다.

기재된 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 용액에 주입된다. 약학적으로 허용가능한은 약리학적/독성학적 관점으로부터 포유동물에 허용가능한 특성 및/또는 물질을 나타낸다. 문구 약학적으로 허용가능한은 생리적으로 허용할 수 있고 포유동물에 투여될 때 일반적으로 알레르기 또는 다른 바람직하지 않은 또는 독성 반응을 생성하지 않는 분자 실재물, 조성물 및 특성을 나타낸다. 바람직하게는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 약학적으로 허용가능한은 동물, 특히 인간에서 사용을 위해 연방의 규제 기관 또는 주 정부의 승인이나 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정된 약전에 기재된 것을 의미한다.

RNAi 폴리뉴클레오티드-표적 물질 컨쥬게이트는 전달 고분자와 함께 병용 투여될 수 있다. 병용 투여에 의하여, RNAi 폴리뉴클레오티드와 전달 고분자는 두개가 동시에 포유동물에 존재하도록 포유동물에 투여된다는 것을 의미한다. RNAi 폴리뉴클레오티드-표적 물질 컨쥬게이트 및 전달 고분자는 동시에 투여될 수 있거나 또는 순차적으로 전달될 수 있다. 동시 투여의 경우, 이들은 투여 전에 혼합될 수 있다. 순차적 투여의 경우, RNAi 폴리뉴클레오티드-표적 물질 컨쥬게이트 또는 전달 고분자가 먼저 투여될 수 있다.

치료 효과

RNAi 폴리뉴클레오티드는 연구 목적 또는 치료하는 세포의 변화를 생성하기 위해 전달될 수 있다. RNAi 폴리뉴클레오티드의 in vivo 전달은 연구 시약으로 유용하고, 다양한 치료, 진단, 표적 검증, 게놈 발견, 유전공학 및 약물유전체학 (pharmacogenomics) 적용에 유용하다. 우리는 간세포에서 내인성 유전자 발현의 억제를 가져오는 RNAi 폴리뉴클레오티드를 나타내었다. 폴리뉴클레오티드의 전달 후에 측정된 수용체(마커) 유전자 발현의 수준은 다른 폴리뉴클레오티드의 전달 후에 유전자 발현의 유사한 수준의 적당한 기대를 나타낸다. 기술분야에서 숙련된 자에 의해 유익하다고 간주된 치료수준은 질병으로부터 질병까지 다르다. 예를 들어, 혈우병 A 및 B는 각각 X-결합된 응고 인자 Ⅷ 및 Ⅸ의 결핍에 의해 야기된다. 이들의 임상과정은 인자 Ⅷ 또는 Ⅸ의 정상 혈청 수준의 퍼센트에 의해 크게 영향을 받는다: < 2%, 중증(severe); 2-5%, 중간(moderate); 및 5-30% 가벼운(mild). 따라서, 중증 환자의 순환 인자의 정상 수준의 1% 내지 2%의 증가는 유익한 것으로 생각될 수 있다. 6%보다 더 큰 수준은 자발적인 출혈을 막을 수 있으나 수술 또는 부상에 대한 이차 출혈은 막을 수 없다. 유사하게, 유전자의 억제는 치료 혜택을 제공하기 위해 100%일 필요는 없다. 유전자 치료의 기술분야에서 숙련된 자는 마커 유전자 결과의 충분한 수준을 기초로 질병에 대해 특이적인 유전자 발현의 유익한 수준을 적당하게 예상할 것이다. 혈우병 예에서, 만일 마커 유전자가 인자 Ⅷ의 정상 수준의 2%의 부피의 비교 수준에서 단백질을 생성하기 위해 발현되었다면, 인자 Ⅷ의 유전자 코딩 또한 유사한 수준에서 발현될 것이라고 적당하게 예상할 수 있다. 따라서, 수용체 또는 마커 유전자는 일반적으로 세포내 단백질의 발현에 대해 유용한 범례(paradigm) 역할을 한다.

간은 대사작용(예를 들어, 다양한 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemias)의 지질단백질 대사작용)에서 이의 중심 역할이 주어진 유전자 치료 및 순환 단백질(예를 들어, 혈우병의 혈액 응고 인자)의 분비를 위해 가장 중요한 표적 조직 중 하나이다. 또한, 만성 간염 및 간경변과 같은 후천적 장애(acquired disorders)는 일반적이고 또한 폴리뉴클레오티드 기반의 간 치료에 의해 잠재적으로 처리된다. 간을 침범하는 또는 간에 의해 침범된 많은 질환 또는 질병은 간에서 유전자 발현의 녹다운(억제)를 통해 잠재적으로 치료된다. 이러한 간 질환 및 질병은 간암(간세포암, HCC 포함), 바이러스성 감염(간염 포함), 신진 대사 장애(고지혈증 및 당뇨 포함), 섬유증, 및 급성 간 손상을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.

투여된 전달 고분자 및 RNAi-폴리뉴클레오티드-컨쥬게이트의 양(용량)은 실험적으로 결정될 수 있다. 우리는 0.1-10 ㎎/㎏ 동물 무게의 siRNA-컨쥬게이트 및 5-60 ㎎/㎏ 동물 무게의 전달 고분자를 이용하여 유전자 발현의 효과적인 녹다운을 나타내었다. 마우스에서 바람직한 양은 0.25-2.5 ㎎/㎏ siRNA-컨쥬게이트 및 10-40 ㎎/㎏ 전달 고분자이다. 더욱 바람직하게는, 약 12.5-20 ㎎/㎏ 전달 고분자가 투여된다. RNAi-폴리뉴클레오티드-컨쥬게이트의 양은 일반적으로 더 큰 용량에서 독성이 없기 때문에 쉽게 증가된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, in vivo는 유기체(organism) 내부에서 발생하는, 더 상세하게는 포유동물과 같은, 부분적 또는 죽은 것과 반대되는, 전체 살아있는 다세포 유기체(동물)의 살아있는 조직 안 또는 위에서 수행된 과정을 의미한다.

실시예

실시예 1. 폴리 (비닐 에테르) 랜덤 공중합체

A. 아민-함유 모노머의 결합을 위한 비닐 에테르 모노머 .

2-비닐옥시 에틸 프탈이미드는 상전이 촉매로서 테트라 n-부틸 암모늄 브로마이드(0.5 g; CAS #1643-19-2)를 이용하여 100℃ N,N-디메틸포름아미드(DMF, 75 ml)에서 2-클로로에틸 비닐 에테르(25 g, 0.24 mol; CAS #110-75-8)와 포타슘 프탈이미드(25 g, 0.135　mol; CAS #1074-82-4)를 반응시켜 제조되었다. 이 용액을 6h 동안 가열한 다음 물에 넣고 여과하였다. 이 고체를 메탄올로 2번 재결정하여 백색 결정을 얻었다.

B. 수용성, 양극성, 막 활성 폴리 (비닐 에테르) 폴리아민 삼중합체의 합성.

X mol% 아민-보호된 비닐에테르(예를 들어, 2-비닐옥시 에틸 프탈이미드)를 무수 디클로로메탄에 질소로 덮여진 오븐 건조된 둥근 바닥 플라스크에 가하였다. 이 용액에, Y mol% 더 낮은 소수성 기(예를 들어, 프로필, 부틸) 비닐에테르 및 임의로 Z mol% 더 높은 소수성 기(예를 들어, 도데실, 옥타데실) 비닐에테르를 가하였다(도 1). 용액을 -50 내지 -78℃ 욕조에 놓고, 2-비닐옥시 에틸 프탈이미드를 침전시켰다. 이 용액에 10 mol% BF₃·(OCH₂CH₃)₂ 를 가하고, -50 내지 -78℃에서 2-3h 동안 반응을 수행하였다. 메탄올 용액 내 암모늄 히드록사이드를 가하여 중합을 종결시켰다. 고분자를 감압 하에 건조시킨 다음, 1,4-디옥산/메탄올 (2/1)에 넣었다. 프탈이미드 당 20 mol 당량의 히드라진을 가하고 아민으로부터 보호기를 제거하였다. 용액을 3h 동안 환류시킨 다음 감압 하에서 건조시켰다. 결과로 생긴 고체를 0.5 mol/L HCl에 녹이고 15분 동안 환류시켜 고분자의 염산 염을 형성하고, 증류수로 희석하고, 추가 시간 동안 환류시켰다. 용액을 NaOH로 중화시킨 다음, 실온 (RT)으로 냉각시키고, 분자 셀룰로오스 튜브로 옮기고, 증류수로 투석하고 동결건조하였다. 고분자를 크기 배제 또는 다른 크로마토그래피를 이용하여 더 정제할 수 있다. 고분자의 분자량은 분석용 크기-배제 크로마토그래피 및 SEC-MALS(size-exclusion chromatography with multi-angle light scattering)를 포함하는 표준 과정에 따른 컬럼을 이용하여 평가하였다.

C. DW1360 의 합성

아민/부틸/옥타데실 폴리(비닐 에테르) 삼중합체를 2-비닐옥시 에틸 프탈이미드(5 g, 23.02 mmol), 부틸 비닐에테르(0.665　g, 6.58 mmol), 및 옥타데실 비닐에테르(0.488 g, 1.64 mmol) 모노머로부터 합성하였다. 2-비닐옥시 에틸 프탈이미드를 36 mL 무수 디클로로메탄이 있는 아르곤으로 덮여진 마그네틱 바를 함유하는 200 mL 오븐 건조된 둥근 바닥 플라스크에 가하였다. 이 용액에 부틸 비닐 에테르 및 n-옥타데실 비닐 에테르를 가하였다. 실온(RT)에서 모노머를 완전히 녹여 투명하고 균일한 용액을 얻었다. 투명한 용액을 함유한 반응 용기를 ACS 등급 변성된 알콜 및 에틸렌 글리콜의 1:1 용액에 드라이 아이스를 가하여 발생된 -50℃ 욕조에 놓은 다음, 프탈이미드 모노머의 눈에 보이는 침전을 형성하였다. 약 1.5분 동안 냉각시킨 후, BF₃·(OCH₂CH₃)₂ (0.058 g, 0.411 mmol) 를 가하여 중합 반응을 개시하였다. 중합 개시하면서 프탈이미드 모노머를 용해시켰다. 반응을 -50℃에서 3h 동안 수행하였다. 메탄올 내 1% 암모늄 히드록사이드 5 mL를 가하여 중합을 종결하였다. 그 다음 용매를 회전 증발로 제거하였다.

그 다음, 고분자를 30 mL의 1,4-디옥산/메탄올 (2/1)에 용해시켰다. 이 용액에 히드라진(0.147 g, 46 mmol)을 가하고, 혼합물을 가열하여 3h 동안 환류하였다. 그 다음, 용매를 회전 증발로 제거하였고, 결과로 생긴 고체를 20 mL의 0.5 mol/L HCl에 넣은 다음 15분 동안 환류시키고, 20 mL의 증류수로 희석하고, 추가 시간 동안 환류하였다. 이 용액을 NaOH로 중화시킨 다음, RT로 냉각시키고, 3,500 분자량 셀룰로오스 튜브로 옮기고, 증류수로 24h (2×20L) 동안 투석하고, 동결건조하였다.

표시된 비닐 에테르 모노머를 함유한 고분자를 기재하지만, 발명은 이러한 특정 모노머에 한정되지 않는다.

D. 수용성, 양극성, 막 활성 폴리 ( 아크릴레이트 ) 폴리아민 삼중합체의 합성.

폴리(아크릴레이트) 및 폴리(메틸아크릴레이트) 이종중합체는 일반적인 자유 라디칼 반응식을 이용하여 합성될 수 있다(본 명세서에 사용된 바와 같이, 폴리(메타크릴레이트) 폴리아민은 속(genus) 폴리(아크릴레이트) 폴리아민의 아속 (subgenus)임):

여기서, R은 독립적으로 수소 또는 메틸기이고, X는 바람직한 비율로 고분자에 존재하는 바람직한 모노머 펜던트 기를 나타낸다.

고분자 합성의 경우, 적당한 모노머는 BOC-보호된 아민-함유 모노머(M)를 포함하나 이에 한정되지 않는다:

여기서, n = 1-4 이고, BOC 보호기의 제거는 일차 아민을 생성한다.

더 낮은 소수성 기 모노머(N):

여기서, n = 1-5 이고, 하나 이상의 탄소는 불포화일 수 있다.

더 높은 소수성 기 모노머(O):

여기서, n = 8-24 이고, 하나 이상의 탄소는 불포화일 수 있다.

상기 모노머를 이용하여, 막 활성 이종중합체를 하기 조성으로 합성하였다: M은 50-90 mol%일 수 있고; N은 10-50 mol%일 수 있고; O은 0-10 mol%일 수 있다.

E. 수용성, 양극성, 막 활성 폴리 ( 아크릴레이트 ) 폴리아민 삼중합체의 합성.

R, R', 및 R"은 독립적으로 수소 또는 메틸이고,

x = 2, 3, 또는 4

y = 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5 [메틸 (C1) - 헥실 (C6)]

z = 정수 ≥ 8 [데실 (C10) 이상]

a, b, 및 d는 상기 기재된 바와 같이 고분자가 바람직한 비율의 모노머를 갖도록 선택된 정수이다.

X mol% 아민-보호된 아크릴레이트 모노머, Y mol% 더 낮은 소수성 기 아크릴레이트 모노머, 및 임의로 Z mol% 더 높은 소수성 기 아크릴레이트 모노머를 교반 바가 장착된 반응 튜브에 가하였다. 적당한 용매(예를 들어, 아세토니트릴 또는 디옥산)를 가하고, 적당한 촉매(예를 들어, AIBN)를 가하고, 반응 혼합물을 N₂로 정화하였다. 반응 튜브를 뚜껑 씌운 다음, 오일 욕조로 옮기고 충분한 시간 동안(예를 들어, 3h) 가열하여(예를 들어 60℃) 중합하였다. BOC 보호기의 제거 전에 조 고분자를 투석, 컬럼 크로마토그래피 및 침전을 포함하나 이에 한정되지 않는 적당한 방법으로 정제할 수 있다. 빙초산 내 2M HCl로 반응시켜 BOC 보호기를 제거하였다. BOC 보호기의 제거는 고분자 일차 아민과 수용성 막 활성 폴리(아크릴레이트) 폴리아민을 생성한다. 그 다음 고분자를 투석, 컬럼 크로마토그래피, 및 침전을 포함하는 적당한 방법으로 정제할 수 있다.

( Ant 40911-3 23-28, Ant 40911-35-2)의 합성.

2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴) (AIBN, 라디칼 개시제), 아세토니트릴, 및 디옥산을 시그마 알드리치로부터 구입하였다. 아크릴레이트 및 메타크릴레이트 모노머를 여과하여 억제제를 제거하였다. 3-(BOC-아미노) 1-프로판올 (TCI)을 아크릴로일 클로라이드(CAS 814-68-6)와 반응시켜 BOC-아미노 프로필 아크릴레이트 (BAPA)를 생성하였다.

교반 바가 장착된 2L 둥근-바닥 플라스크에서, 2-(2-아미노에톡시) 에탄올 (21.1g, 202.9　mmol)을 350 mL 디클로로메탄에 용해시켰다. 별도의 1L 플라스크에서, BOC 무수물(36.6g, 169.1 mmol)을 660 mL 디클로로메탄에 용해시켰다. 2L 둥근-바닥 플라스크를 추가 깔때기로 맞추고, BOC 무수물 용액을 플라스크에 6h에 걸쳐 가하였다. 반응을 밤새도록 교반하면서 방치하였다. 2L 분별 깔때기에서, 생성물을 각 300 ml의 10% 시트르산, 10% K₂CO₃, 포화 NaHCO₃, 및 포화 NaCl로 세척하였다. 생성물인 BOC 보호된 2-(2-아미노에톡시) 에탄올을 Na₂SO₄로 건조시키고, 중력 여과하고, 회전 증발과 고 진공을 이용하여 DCM을 증발시켰다.

교반 바가 장착되고 아르곤이 분출되는 500 ml 둥근-바닥 플라스크에, BOC 보호된 2-(2-아미노에톡시) 에탄올 (27.836g, 135.8 mmol)을 가한 다음, 240 mL 무수 디클로로메탄을 가하였다. 디이소프로필에틸 아민(35.5 ml, 203.7 mmol)을 가하고, 시스템을 드라이 아이스/아세톤 욕조에 놓았다. 아크릴로일 클로라이드(12.1 ml, 149.4 mmol)를 10 ml의 디클로로메탄을 이용하여 희석시키고, 아르곤이 분출된 시스템에 방울방울 가하였다. 시스템을 아르곤 하에 유지시키고, 실온으로 방치하고 밤새도록 교반하였다. 생성물을 각 100 mL의 dH₂O, 10% 시트르산, 10% K₂CO₃, 포화 NaHCO₃, 및 포화 NaCl로 세척하였다. 생성물인 BOC-아미노 에틸 에톡시 아크릴레이트(BAEEA)를 Na₂SO₄로 건조시키고, 중력 여과하고, 회전 증발을 이용하여 DCM을 증발시켰다. 생성물을 7.5㎝ 직경 컬럼을 이용하여 29㎝ 실리카 위에서 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 사용된 용매계는 헥산 내 30% 에틸 아세테이트이었다. Rf: 0.30. 분획을 모으고, 회전 증발과 고진공을 이용하여 용매를 제거하였다. BAEEA를 74% 수율로 얻었다. BAEEA를 냉장고에 저장하였다.

고분자 40911-3 23-28: 70% BAPA, 25% 부틸 메타크릴레이트(CAS 97-88-1), 5% 옥타데실 메타크릴레이트(CAS 4813-57-4), (3% AIBN 촉매) 몰 공급 비율(mole feed ratio) (0.0139 총 mol).

BAPA (9.739 mmol) (A), 부틸 메타크릴레이트(3.478 mmol) (B), 및 옥타데실 메타크릴레이트(0.6957 mmol) (D)를 교반 바가 장착된 20 mL 반응 튜브에 가하였다. 아세토니트릴(16 ml)을 가한 다음 AIBN (0.4174　mmol)을 가하였다. 두개의 반응을 일렬로 수행하기 위해 상기 단계를 반복하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 N₂로 정화하였다. 반응 튜브를 뚜껑 씌운 다음, 오일 욕조로 옮기고 3h 동안 60℃에서 가열하였다. 튜브를 제거하고, 내용물을 합하였다. 조 고분자를 탈이온수로 침전시키고, 1.5h 동안 깨끗한 트리플루오로아세트산(40 ml)과 반응시켜 BOC 보호기를 제거하고, 일차 아민과 수용성 막 활성 폴리(아크릴레이트) 폴리아민을 생성하였다. 200 mL 탈이온화된 H₂O(dH₂O)를 반응에 가하고, 용액을 3500 MW 분획 셀룰로오스 튜브로 옮기고, 24h 동안 고염에 대해 투석한 다음, 18h 동안 dH₂O에 대하여 투석하였다. 내용물을 증발시켜 건조한 후, 100 mL dH₂O에 용해시키고 동결건조하였다. 건조된 고분자를 25 mg/ml에서 50%　MeOH/100　mM 암모늄 포르메이트/0.2% 포름산 용액에 용해시켰다. 3 주입의 조 고분자 용액(250 mg, 10 ml)을 5.0 ml/min의 유속에서 사용된 XK50/30cm 컬럼을 이용하여 S-200 세파크릴 배지 위에서 정제하였다. 컬럼을 채워넣고, 제조자의 지시에 따라 사용하였다 (GE Healthcare, instructions 56-1130-82 Al, 52-2086-00 AK). 고분자 용출을 Shimadzu RID-10A 굴절률 집진기 (refractive index collector)를 이용하여 탐색하였다. 각 수행 동안 23분에서 28분까지의 분획을 모으고 합하였다. 용매를 증발시키고, 정제된 고분자를 2번 동결건조하였다.

고분자 Ant 40911-35-2: 80% BAEEA, 15% 부틸 메타크릴레이트, 5% 옥타데실 아크릴레이트, (3% AIBN 촉매) 몰 공급 비율 (0.013913 총 mol).

BAEEA (A)(11.13 mmol), 부틸 메타크릴레이트 (B)(2.086 mmol), 및 옥타데실 아크릴레이트 (D)(0.6957 mmol)를 교반 바가 장착된 20 mL 반응 튜브에 가하였다. 디옥산(16 ml)을 가한 다음 AIBN (0.4174　mmol)을 가하였다. 두개의 반응을 일렬로 수행하기 위해 상기 단계를 반복하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 N₂로 정화하였다. 반응 튜브를 뚜껑 씌운 다음, 오일 욕조로 옮기고 3h 동안 60℃에서 가열하였다. 튜브를 제거하고, 내용물을 합하였다. 디옥산을 회전 증발과 고진공을 통해 증발시키고, 조 고분자를 70 mg/ml로 89.8% 디클로로메탄/10% 테트라히드로퓨란/0.2% 트리에틸아민 용액에 용해시켰다. 3 주입의 조 고분자 용액(700 mg, 10 ml)을 5.0 ml/min의 유속에서 사용된 Jordi gel 디비닐 벤젠 10⁴Å 컬럼 (내부 직경: 22 mm, 길이: 500 mm) 위에서 정제하였다. 고분자 용출을 Shimadzu RID-10A 굴절률 집진기를 이용하여 탐색하였다. 15.07분에서 17.13분까지의 분획을 모으고 합하였다. 용매를 회전 증발로 증발시켰다.

대략 10mg의 고분자를 0.5 mL 89.8% 디클로로메탄, 10%　테트라히드로퓨란, 0.2% 트리에틸아민에 용해시켰다. 분자량과 다분산도(polydispersity, PDI)는 Jordi 5μ 7.8×300 Mixed Bed LS DVB column을 이용하여 Shimadzu Prominence HPLC에 부착된 Wyatt Helos II 다각도 광산란 검출기(multiangle light scattering detector)를 이용하여 측정하였다. 172,000의 분자량과 1.26의 PDI를 얻었다.

정제된 BOC-보호된 고분자를 1.5　h 동안 깨끗한 트리플루오로아세트산(7 ml) (또는 0.5 h 동안 빙초산 내 2 M HCl)과 반응시켜 BOC 보호기를 제거하고 아민을 생성하였다. 40 mL dH₂O를 반응에 가하고, 용액을 3500 MW 분획 셀룰로오스 튜브로 옮기고, 24h 동안 고염에 대해 투석한 다음 18h 동안 dH₂O에 대하여 투석하였다. 내용물을 증발시켜 건조한 다음, 20-30 mL dH₂O에 용해시키고 2번 동결건조하였다. 고분자 용액을 2-8℃에서 저장하였다.

고분자의 백본에 아민을 결합하는 탄소 원자의 수 및 링커가 분기인지 아닌지는 아민의 pKa 및 아민 근처의 입체 효과(steric effects)에 영향을 미친다. 예를 들어, 상기 고분자의 경우, 에틸 아민은 약 8.1의 pKa를 가지고, 프로필 아민은 약 9.3의 pKa를 가지고, 펜틸 아민은 약 10.2의 pKa를 가진다. 아민의 pKa 또는 아민 근처의 입체 효과는 아민에 결합된 차폐기의 불안정성(lability)에 영향을 미친다. 아민에 말레익 무수물의 가역적인 결합의 경우, 더 높은 pKa의 아민 결과는 아민으로부터 무수물의 더 낮은 방출 속도이다. 또한, 이소프로필 링커와 같은 아민 근처에서 증가된 입체 방해는 아민의 pKa를 증가시킬 수 있다.

고분자 Lau 41305-38-17-19: 80% BAPA, 20% 에틸 메타크릴레이트(CAS 97-63-2), (3% AIBN 촉매) 몰 공급 비율 (0.0105 총 mol).

BAPA (A)(8.40 mmol) 및 에틸 메타크릴레이트 (B)(2.10 mmol)를 교반 바가 장착된 15 mL 반응 튜브에 가하였다. 아세토니트릴(11.5 ml)을 가한 다음 AIBN (0.315　mmol)을 가하였다. 두개의 반응을 일렬로 수행하기 위해 상기 단계를 반복하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 N₂로 정화하였다. 반응 튜브를 뚜껑 씌운 다음, 오일 욕조로 옮기고 3h 동안 60℃에서 가열하였다. 튜브를 제거하고, 내용물을 모았다. 아세토니트릴을 회전 증발과 고진공을 통해 증발시키고, 조 고분자를 50 mg/ml로 74.8% 디클로로메탄/25% 테트라히드로퓨란/0.2% 트리에틸아민 용액에 용해시켰다. 3 주입의 조 고분자 용액(500 mg, 10 ml)을 5.0 ml/min의 유속에서 사용된 Jordi gel 플루오르화 디비닐 벤젠 10⁴Å 컬럼(내부 직경: 22 mm, 길이: 500 mm) 위에서 정제하였다. 고분자 용출을 Shimadzu RID-10A 굴절률 집전기를 이용하여 탐색하였다. 17.16분에서 19.18분까지의 분획을 모으고 합하였다. 용매를 회전 증발로 증발시켰다. 정제된 BOC-보호된 고분자를 1.5　h 동안 빙초산 내 2 M HCl(7 ml)과 반응시켜 BOC 보호기를 제거하고 아민을 생성하였다. 40 mL dH₂O를 반응에 가하고, 용액을 3500 MW 분획 셀룰로오스 튜브로 옮기고, 24hr 동안 고염에 대해 투석한 다음, 18h 동안 dH₂O에 대하여 투석하였다. 내용물을 증발시키고 건조한 다음, 30 mL dH₂O에 용해시키고 2번 동결건조하였다.

F. (보호된) 아민 모노머, 더 낮은 소수성 기 모노머, 및 더 높은 소수성 기 옥타데실 기로부터 합성된 유사한 고분자는 기재된 발명의 수행에서 효과적일 거라고 예측할 것이다.

고분자 특성

실시예 2. DW1360 의 특성.

A. 양극성 분석.

1,6-디페닐-1,3,5-헥사트리엔 (DPH, Invitrogen) 형광 (λ_ex = 350 nm; λ_em= 452 nm)은 소수성 환경에서 향상된다. 이 형광원(fluorophore)은 DW1360 고분자를 분석하기 위해 사용되었다. 0.5 μM (최종 농도) DPH를 pH 8.0, 0.5 mL 50 mM HEPES 완충액 내 10㎍ DW1360에 가하였다. 그 다음, DPH의 형광을 측정하여 이 용액을 소수성 환경에서 DPH 축적에 대해 시험하였다. 컨쥬게이트 존재 하에 증가된 DPH 형광은 고분자에 의한 소수성 환경의 형성을 나타낸다.

B. 분자량.

고분자 분자량(질량, MW)은 배치 모드(batch mode)에서 optilab rEX와 함께 수행하는 Wyatt Dawn Heleos II 위에서 결정되었다. 고분자는 적당한 용매에서 변화하는 농도에서 자랐고, 각각은 Wyatt 시스템 위로 적재되었다. 그 다음, Astra 소프트웨어는 MW를 계산하는 Zimm 도표에서 사용된 농도의 함수 (dn/dc)로 굴절률의 변화를 계산하였다. 정제된 DW1360의 결정된 평균 분자량은 4000-6000 Da 이었다. 정제된 아크릴레이트 고분자의 평균 분자량은 약 100-120 kDa 이었다.

C. 입자 크기 및 제타 전위.

고분자의 제타 전위는 Malvern Zetasizer 나노 시리즈 (나노 ZS) 기기를 사용하여 측정되었다. CDM-차폐된 고분자의 제타 전위는 0과 -30 mV 사이, 더 바람직하게는 0과 -20 mV 사이에서 변하였다. 제타 전위는 잔류의 HEPES와 함께 pH 8에서 등장성 글루코오스 완충액에서 측정되었다. pH 7에서, 컨쥬게이트는 몇몇 아민의 수소화로 인해 몇몇 양전하를 얻을 것으로 기대될 것이다.

D. CDM -시약 변형 후 컨쥬게이트에서 아민기의 정량화.

DW1360 고분자를 이전에 기재된 대로 합성하였으며, 이어서 14　wt 당량 HEPES 염기 및 7　wt 당량의 CDM-NAG 및 CDM-PEG (평균 11 단위)의 2:1 wt:wt 혼합물을 처리하였다. 한 시간 후, 말레익 무수물 유도체 처리된 컨쥬게이트의 아민 함량은 100mM NaHCO₃ 내 트리니트로벤젠 설폰산(TNBS)으로 처리하여 측정되었다. 말레아메이트를 변형시키지 않은 컨쥬게이트로 표준화할 때, 변형된 아민의 양은 전체 중 약 75%로 측정되었다. 이 변형 정도는 첨가된 말레익 무수물의 양을 변화시킴으로써 또는 반응 조건을 변경함으로써 변화할 수 있다.

E. 리포좀 용해

10㎎의 난황 포스파티딜콜린을 pH 7.5에서 100mM 카복시플루오레세인(CF) 및 10mM HEPES를 함유하는 1 mL의 완충액으로 수화시켰다. 그 다음, 리포좀은 100-㎚ 공극 폴리카보네이트 여과기(Nucleopore, Pleasanton, CA)를 통해 압출되었다. 덫에 걸리지 않은(unentrapped) CF는 pH 8에서 10 mM HEPES 및 0.1 mol/L NaCl로 용출시키는 Sepharose 4B-200을 이용하여 크기 배제 크로마토그래피로 제거되었다. 200μL 분취량(aliqout)의 CF-적재된 리포좀을 1.8 mL의 등장성 완충액에 가하였다. 형광(λ_ex = 488; λ_em= 540)은 소포 현탁액에 0.25㎍의 고분자를 가한 후 30분에서 측정되었다. 각 실험 말미에, 최대 용해를 결정하기 위해 40㎕의 1% Triton X-100 용액을 가하여 소포체(vesicles)를 파괴하였다.

실시예 3. 멜리틴 양쪽성 고분자 펩티드

[표 1] 높은 막 활성을 나타내기 위해 멜리틴 펩티드를 설명하였다.

n.d. - 측정하지 않음.

a - 디올레올릴 포스파티딜 에탄올아민

b - CDM, CDM-gal, 또는 CDM-PEG 또는 이의 조합으로 변형은 막 활성을 억제함.

차폐제

실시예 4. 차폐제

A. 2- 프로피오닉 -3- 메틸말레익 무수물 차폐제 전구체 ( 카복시디메틸말레익 무수물 또는 CDM )의 합성.

2-프로피오닉-3-메틸말레익 무수물

50 mL 무수 테트라히드로퓨란 내 수소화 나트륨(0.58 g, 25 mmol)의 현탁액에 트리에틸-2-포스포노프로피오네이트(7.1 g, 30 mmol)를 가하였다. 수소 기체의 방출을 중단한 후, 10 mL 무수 테트라히드로퓨란 내 디메틸-2-옥소글루타레이트 (3.5 g, 20 mmol)를 가하고 30분 동안 교반하였다. 10 mL 물을 가한 다음, 테트라히드로퓨란을 회전증발로 제거하였다. 결과로 생긴 고체 및 물 혼합물을 3×50 mL 에틸 에테르로 추출하였다. 에테르 추출액을 합하고, 마그네슘 설페이트로 건조하고, 옅은 노란색 오일로 농축하였다. 오일을 2:1 에테르:헥산으로 용출하여 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 4g(82% 수율)의 순수한 트리에스터를 얻었다. 이 트리에스터를 4.5g(5 당량)의 수산화칼륨을 함유하는 물과 에탄올의 50/50 혼합물의 50 mL에 용해시켜 2-프로피오닉-3-메틸말레익 무수물을 형성하였다. 이 용액을 1h 동안 가열 환류시켰다. 에탄올을 회전 증발로 제거한 다음, 용액을 염산으로 pH 2로 산성화하였다. 이 수용액을 200 mL 에틸 아세테이트로 추출한 다음, 분리하고, 마그네슘 설페이트로 건조하고, 농축하여 백색 고체를 얻었다. 그 다음, 이 고체를 디클로로메탄 및 헥산으로 재결정하여 2g(80% 수율)의 2-프로피오닉-3-메틸말레익 무수물을 얻었다.

티오에스터, 에스터, 및 아미드는 옥살릴 클로라이드로 CDM을 이의 산 클로라이드로 전환시키고 이어서 티올, 에스터, 또는 아민 및 피리딘을 가하여 CDM으로부터 합성될 수 있다. CDM과 이의 유도체는 기술분야에서 표준적인 방법에 의해 표적 리간드, 입체적 안정화제, 전하 기, 및 다른 반응성 기와 함께 즉시 변형된다. 결과로 생긴 분자를 사용하여 아민을 가역적으로 변형할 수 있다.

차폐제를 CDM의 변형을 통해 합성하여 바람직하게는 전하 중성 물질을 합성하였다:

여기서, R1은 ASGPr 표적 리간드 또는 입체적 안정화제(예를 들어, PEG)를 포함한다.

B. ASGPr 표적 기를 함유하는 차폐제 .

가장 널리-연구된 간세포 표적 리간드는 간세포 위에 있는 아시알로당단백질 수용체(ASGPr)에 의해 결합된 갈락토오스를 기준으로 한다. 갈락토오스 또는 갈락토오스 유도체의 결합은 올리고당 키토산, 폴리스티렌 유도체, 및 폴리아크릴아미드 HPMA를 포함하는 매우 적은 수용성, 비전하 고분자의 간세포 표적을 촉진시키는 것으로 나타내었다. ASGPr 표적 기는 글루코오스 잔기의 변형을 통해 갈락토오스-글루코오스 이당류인 락토오스를 이용하여 즉시 생성된다. 락토바이오산 (lactobionic acid)(LBA, 글루코오스를 글루콘산으로 산화시키는 락토오스 유도체)은 표준 아미드 결합 기술을 이용하여 말레익 무수물 유도체로 즉시 통합된다.

C. 입체적 안정화제 CDM - PEG 및 표적 기 CDM - NAG (N-아세틸 갈락토사민 ) 합성

50 mL 메틸렌클로라이드 내 CDM(300 mg, 0.16 mmol)의 용액에 옥살릴 클로라이드(2 g, 10 wt. 당량) 및 디메틸포름아미드(5 ㎕)를 가하였다. 반응을 밤새도록 수행하였고, 과량의 옥살릴 클로라이드 및 메틸렌 클로라이드를 회전 증발로 제거하여 CDM 산 클로라이드를 얻었다. 산 클로라이드를 1 mL의 메틸렌 클로라이드에 용해시켰다. 이 용액에 1.1 몰당량의 CDM-PEG에 대해 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(평균 MW 550) 또는 CDM-NAG에 대해 (아미노에톡시)에톡시-2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노사이드(즉, 아미노 비스에톡실-에틸 NAG), 및 10 mL의 메틸렌 클로라이드 내 피리딘(200㎕, 1.5 eq)을 가하였다. 그 다음, 용액을 1.5 h 교반하였다. 용매를 제거한 다음, 결과로 생긴 고체를 5 mL의 물에 용해시키고 0.1% TFA/물/아세토니트릴 구배를 이용하여 역-상 HPLC를 이용하여 정제하였다.

바람직하게는, 5 내지 20 에틸렌 단위를 함유하는 PEG는 이-치환된 말레익 무수물에 결합된다. 더욱 바람직하게는, 10-14 에틸렌 단위를 함유하는 PEG는 이-치환된 말레익 무수물에 결합된다. PEG는 가변적인 길이일 수 있고, 5-20 또는 10-14 에틸렌 단위의 평균 길이를 가진다. 대안적으로, PEG는 정확하게 11 또는 13 에틸렌 단위를 가지는 단분산, 균일 또는 별개일 수 있다.

상기 나타난 바와 같이, PEG 스페이서는 무수물 기와 ASGPr 표적 기 사이에 있을 수 있다. 바람직한 PEG 스페이서는 1-10 에틸렌 단위를 함유한다.

알킬 스페이서를 갖는 CDM-NAG

가역적인 고분자 변형

실시예 5. 막 활성 폴리아민의 가역적인 변형/차폐; 즉, CDM - NAG 또는 CDM -NAG + CDM - PEG 의 혼합물로 막 활성 고분자의 변형.

등장성 글루코오스 내 ×㎎ 막 활성 폴리아민(예를 들어, 상기 기재된 DW1360)의 용액에, 총 7× 이치환된 말레익 무수물 차폐제에 대해, 14×㎎의 HEPES 유리 염기를 가하고 이어서 7×㎎ CDM-NAG 또는 2.3×㎎ CDM-NAG 및 4.6×㎎ CDM-PEG의 혼합물을 가하였다. 그 다음, 용액을 동물 투여 전에 RT에서 적어도 30분 동안 배양하였다. CDM-NAG 또는 CDM-PEG와 폴리아민을 반응시켜 하기 물질을 수득하였다:

여기서, R은 고분자이고, R1은 ASGPr 표적 물질 또는 입체적 안정화제를 포함한다. 무수물과 고분자 아민 사이의 반응에서 생성된 무수물 카복실은 ~1/20^th의 예상된 전하를 나타낸다(Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003). 따라서, 막 활성 고분자는 크게 음전하 다가음이온으로 전환하기 보다는 효과적으로 중화된다.

실시예 6. 멜리틴과 CDM - NAG 의 가역적인 변형/차폐.

변형 전에, 5×㎎ CDM-NAG를 0.1% 빙초산 수용액으로부터 동결건조시켰다. 건조된 NAG 유도체에 0.2×mL의 등장성 글루코오스 및 10×㎎의 HEPES 유리 염기 내 ×㎎ 멜리틴 용액을 가하였다. CDM-NAG의 완전 용해 후, 용액을 동물 투여 전에 RT에서 적어도 30분 동안 배양하였다. CDM-NAG와 펩티드를 반응시켜 하기 물질을 수득하였다:

여기서, R은 멜리틴이고, R1은 ASGPr 표적 물질 NAG를 포함한다. 무수물과 고분자 아민 사이의 반응에서 생성된 무수물 카복실은 ~1/20^th의 예상된 전하를 나타낸다(Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003). 따라서, 막 활성 고분자는 크게 음전하 다가음이온으로 전환하기 보다는 효과적으로 중화된다.

siRNA - 컨쥬게이트

실시예 7. GalNAc 클러스터의 합성.

A. {2-[2-(2-히드록시-에톡시)-에톡시]-에톡시}-아세트산 벤질 에스터의 합성

2-[2-(2-히드록시-에톡시)-에톡시]-에탄올 (62.2 g, 414 mmol)을 아르곤 하에 875 mL의 abs. DMF에 용해시키고 0℃로 냉각시켰다. NaH (12.1 g, 277 mmol, 미네랄 오일 내 55 %)를 조심스럽게 가하고, 얼음 욕조를 제거하고, 80℃에서 1h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 대기 온도로 냉각시키고, DMF-용액 (20 mL)으로 적하 깔때기(dropping funnel)를 통해 가해진 브로모아세트산(18.98 g, 137 mmol)으로 처리하였다. 75℃에서 추가 30분 후에, 브로모메틸-벤젠 (23.36 g, 137 mmol)을 가하고 30분 동안 에스테르화를 수행하였다. 냉각시키고, 얼음 조각에 조심스럽게 쏟아붓고, 에틸 아세테이트로 추출한 다음, 물로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 모든 용매를 증발시킨 다음, 플래시 컬럼크로마토그래피(SiO₂, 에틸 아세테이트/헵탄 = 8/2)하여 노란색 오일로 6.41 g의 표제 화합물을 수득하였다. MS (ISP): 299.2　[M+H]⁺.

B. 아세트산 (3aR,5R,6R,7R,7aR)-6-아세톡시-5-아세톡시메틸-2-메틸-5,6,7,7a-테트라히드로-3aH-피라노[3,2-d]옥사졸-7-일 에스터.

시판되는 아세트산 (2S,3R,4R,5R,6R)-4,5-디아세톡시-6-아세톡시메틸-3-아세틸아미노-테트라히드로-피란-2-일 에스터 (10.0 g, 26 mmol)를 116 mL의 abs. CH₂Cl₂에 용해시키고 트리메틸실릴 트리플레이트 (14.27 g, 64 mmol)로 처리하였다. 반응을 45℃에서 밤새도록 수행하였다. 0℃로 냉각시킨 후, 트리에틸아민 (4.88 mL, 35 mmol)을 가하고, 혼합물을 CH₂Cl₂로 희석시키고 NaHCO₃-용액 및 물로 세척하였다. Na₂SO₄로 건조시키고 용매를 증발시켜 갈색 오일로 10.3 g의 표제 화합물을 수득하였으며, 다음 단계를 위해 더 이상 정제하지 않고 사용하였다. MS (ISP): 330.0 [M+H]⁺.

C. (2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-디아세톡시-6-아세톡시메틸-3-아세틸아미노-테트라히드로-피란-2-일옥시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-아세트산 벤질 에스터.

상기 제조된 아세트산 (3aR,5R,6R,7R,7aR)-6-아세톡시-5-아세톡시메틸-2-메틸-5,6,7,7a-테트라히드로-3aH-피라노[3,2-d]옥사졸-7-일 에스터 (10.3 g, 26 mmol) 및 {2-[2-(2-히드록시-에톡시)-에톡시]-에톡시}-아세트산 벤질 에스터 (8.62 g, 29 mmol)를 520 mL의 CH₂Cl₂에 혼합시키고 63 g의 분자체 4Å로 처리하였다. 1　h 후, 트리메틸실릴 트리플레이트 (6.13 g, 28 mmol)를 가하였다. 반응 혼합물을 대기 온도에서 주말 동안 교반하였다. 트리에틸아민 (5.21 mL, 37 mmol)을 가하고, 분자체를 여과하여 버리고, 여과액을 CH₂Cl₂로 희석하고 NaHCO₃-용액 및 물로 세척하였다. Na₂SO₄로 건조시키고 용매를 증발시킨 다음 플래시 컬럼크로마토그래피 (SiO₂, 에틸 아세테이트/AcOH/MeOH/물 = 60/3/3/2)하여 갈색 오일로 15.7　g의 표제 화합물을 얻었다. MS (ISP): 626.6 [M-H]^-.

D. (2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-디아세톡시-6-아세톡시메틸-3-아세틸아미노-테트라히드로-피란-2-일옥시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-아세트산

상기 제조된 (2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-디아세톡시-6-아세톡시메틸-3-아세틸아미노-테트라히드로-피란-2-일옥시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-아세트산 벤질 에스터 (15.7 g, 25 mmol)를 525 mL의 에틸 아세테이트에 용해시키고, 대기 온도에서 3시간 동안 1 atm의 H₂ 하에 1.6 g의 Pd/C (10%)로 수소화하였다. 셀라이트로 여과하고 용매를 증발시킨 다음 플래시 컬럼크로마토그래피 (SiO₂, CH₂Cl₂/MeOH = 80/20)하여 갈색 검으로 6.07　g의 표제 화합물을 얻었다. MS (ISP): 536.5 [M-H]^-.

E. 아세테이트 보호된 GalNAc 클러스터 벤질 에스터

상기 제조된 (2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-디아세톡시-6-아세톡시메틸-3-아세틸아미노-테트라히드로-피란-2-일옥시)-에톡시]-에톡시}-에톡시)-아세트산 (2.820 g, 5.246 mmol) 및 (S)-6-아미노-2-((S)-2,6-디아미노-헥사노일아미노)-헥산산 벤질 에스터 염산 (하기 제조 참조, 0.829 g, 1.749 mmol)을 32 mL의 CH₂Cl₂ 및 3.2 mL의 DMF의 혼합물에 용해시키고, Hunig's 염기 (2.096 mL, 12.25 mmol), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (0.714 g, 5.248 mmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 염산 (1.006 g, 5.248 mmol)으로 연속적으로 처리하고, 대기 온도에서 밤새도록 교반하였다. 모든 휘발성 물질을 i.V.로 제거하고, 조 반응 혼합물을 분취용 HPLC (38 runs, Gemini, 5μ, C18)로 정제하고 동결건조하여 백색 분말로 1.650 g의 표제 화합물을 얻었다. MS (ISP): 1945.8 [M+Na]⁺.

F. 아세테이트 보호된 GalNAc 클러스터 유리 산 (당 히드록실 보호된).

(17S,20S)-1-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)-20-(1-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)-11-옥소-3,6,9-트리옥사-12-아자헥사데칸-16-일)-17-(2-(2-(2-(2-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)에톡시)에톡시)에톡시)-아세트아미도)-11,18-디옥소-3,6,9-트리옥사-12,19-디아자헤니코산-21-오익산

상기 제조된 GalNAc 클러스터 벤질 에스터 (0.674 g, 0.350 mmol)를 50 mL의 MeOH에 용해시키고, 대기 온도에서 4h 동안 1 atm의 H₂ 하에 0.065 g의 Pd/C (10%)로 수소화하였다. 셀라이트로 여과하고 용매를 증발시킨 다음 백색 거품으로 0.620　g의 표제 화합물을 얻었다. MS (ISP): 1917.0 [M+2H]²⁺.

실시예 8. 갈락토오스 클러스터 분기점의 합성, (S)-6-아미노-2-((S)-2,6- 디 아미노- 헥사노일아미노 )- 헥산산 벤질 에스터 염산.

A. (S)-6-tert-부톡시카보닐아미노-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-헥산산 벤질 에스터.

(S)-6-tert-부톡시카보닐아미노-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-헥산산(5.00 g, 10.67 mmol) 및 페닐-메탄올(2.305 g, 21.34 mmol)을 25 mL의 CH₂Cl₂에 용해시키고, N-히드록시벤조트리아졸(1.933 g, 11.74　mmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 염산(EDC, 2.250　g, 11.74 mmol), 및 에틸-디이소프로필-아민(2.137 ml, 12.49 mmol)으로 연속적으로 처리하였다. 90분 동안 교반한 후, 휘발성 물질을 대기 온도에서 i.v.로 제거하고, 잔기를 에틸아세테이트에 가하고, 물, NH₄Cl-용액 및 소금물로 세척한 다음, Na₂SO₄로 건조하고, 증발시켰다. 조 혼합물을 20 mL의 에탄올에 용해시킨 다음, 10 mL의 물을 가하여 생성물을 침전시켰다. 여과 및 건조시켜, 5.669 g의 표제 화합물을 수득하였으며, 에탄올/헥산으로 재결정하여 4.27 g의 순수한 벤질 에스터를 얻었다. MS (ISP): 559.2 [M+H]⁺.

B. (S)-2-((S)-2,6-비스-tert-부톡시카보닐아미노-헥사노일아미노)-6-tert-부톡시카보닐아미노-헥산산 벤질 에스터.

상기 제조된 (S)-6-tert-부톡시카보닐아미노-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-헥산산 벤질 에스터(4.270 g, 7.643 mmol)를 15 mL의 THF에 용해시키고, 15 mL의 디에틸아민으로 처리하였다. 대기 온도에서 4h 후, MS 및 TLC는 출발물질이 없음을 나타내었다. 용매를 증발시키고 톨루엔으로 공비 건조(azeotropic drying)시켜 4.02 g의 유리 아민을 얻었으며, 다음 단계에 직접적으로 사용되었다.

시판되는 (S)-2,6-비스-tert-부톡시카보닐아미노-헥산산(3.177g, 9.17　mmol)을 13 mL의 CH₂Cl₂에 용해시키고, 0℃에서 에틸-디이소프로필-아민(4.71 ml, 27.5 mmol), O-(1,2-디히드로-2-옥소-피리딜)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TPTU, 2.725 g, 9.172 mmol)로 처리하였다. 15분 후에 최소 CH₂Cl₂에 용액으로서 상기 제조된 아민과 1.57 mL의 에틸-디이소프로필-아민(1,2 당량)으로 처리하고, 반응을 대기 온도에서 2h 동안 수행하였다. 모든 휘발성 물질을 i.v.로 제거하고, 잔기를 에틸아세테이트에 가하고, NaHCO₃-용액, NH₄Cl-용액 및 물로 세척한 다음, Na₂SO₄로 건조하고, 증발시켰다. 플래시 크로마토그래피 (SiO₂, 헵탄/에틸아세테이트 = 4/6) 하고, 이어서 헵탄/최소량의 에틸아세테이트로 결정화하여 백색 고체로 4.516 g의 표제 화합물을 생성하였다. MS (ISP): 665.4 [M+H]⁺.

C. (S)-6-아미노-2-((S)-2,6-디아미노-헥사노일아미노)-헥산산 벤질 에스터 삼염산

상기 제조된 (S)-2-((S)-2,6-비스-tert-부톡시카보닐아미노-헥사노일아미노)-6-tert-부톡시카보닐아미노-헥산산 벤질 에스터(4.516, 6.793 mmol)를 디옥산 내 4　mol/L HCl에 용해시켰다. 몇분 후, 기체를 발생시키고 침전물이 형성되었다. 대기 온도에서 3h 후, 반응 혼합물을 조심스럽게 증발시키고, 주의깊게 건조하여 황백색 거품(off-white foam)으로 3.81 g의 표제 화합물을 수득하였으며, 상기 실시예 7. E. GalNAc 클러스터 벤질 에스터를 더 이상 정제하지 않고 사용하였다. MS (ISP): 365.3 [M+H]⁺.

실시예 9. 폴리뉴클레오티드 표적 물질

폴리뉴클레오티드 표적 물질은 리신 또는 오르니틴 지지체 분자 위에 있는 아민에 GalNAc 클러스터 및 약동학적 조절제를 결합하여 제조되었다. 지지체 위의 카복실 기는 siRNA와 같은 RNAi 폴리뉴클레오티드에 공유결합을 위해 유용하다.

실시예 10. GalNAc 클러스터- 팔미토일 표적 물질

A. (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-6-헥사데카노일아미노-헥산산 벤질 에스터

시판되는 Fmoc-Lys(팔미토일)-OH (0.899 g, 1.481 mmol)을 15 mL의 CH₂Cl₂에 현탁시키고, 벤질 알콜 (0.320 g, 0.305 mL, 2.96 mmol, 2 당량), 히드록시벤조트리아졸 (HOBT, 0.268 g, 1.63 mmol, 1.1 당량), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드·HCl (EDC, 0.312 g, 1.63 mmol, 1.1 당량), 및 N-에틸-디이소프로필아민 (0.224 g, 0.297 mL, 1.733 mmol, 1.17 당량)으로 연속적으로 처리하였다. 노란색 용액을 2h 동안 교반한 다음, 얼음조각/NH₄Cl 용액에 쏟아붓고, 에틸아세테이트로 추출하고, 물로 세척한 다음, Na₂SO₄로 건조하고, 모든 용매를 증발시킨 다음, 플래시 크로마토그래피 (SiO₂, 에틸아세테이트/헵탄 = 1/1) 하여 황백색 고체로 0.692 g의 표제 화합물을 얻었다. MS (ISP): 697.6 [M+H]⁺.

B. (S)-2-아미노-6-헥사데카노일아미노-헥산산 벤질 에스터.

상기 제조된 (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-6-헥사데카노일아미노-헥산산 벤질 에스터 (0.692 g, 0.993 mmol)를 15 mL의 THF에 용해시키고, 19 mL의 디에틸아민(∼18 당량)으로 처리하였다. 대기 온도에서 3h 후, 모든 휘발성 물질을 i.v.로 제거하고, 조 반응 혼합물을 플래시 크로마토그래피 (SiO₂, CH₂Cl₂/MeOH (10 %))로 정제하여 백색 고체로 0.355 g의 표제 화합물을 수득하였다. MS (ISP): 475.3 [M+H]⁺.

C.

상기 제조된 GalNAc 클러스터 유리 산 (실시예 7F.) (17S,20S)-1-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)-20-(1-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)-테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)-11-옥소-3,6,9-트리옥사-12-아자헥사데칸-16-일)-17-(2-(2-(2-(2-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-아세트아미도-4,5-디아세톡시-6-(아세톡시메틸)테트라히드로-2H-피란-2-일옥시)에톡시)에톡시)에톡시)-아세트아미도)-11,18-디옥소-3,6,9-트리옥사-12,19-디아자헤니코산-21-오익산 (0.185 g, 0.101 mmol)을 2.0 mL의 CH₂Cl₂에 용해시키고, 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAt, 0.014 g, 0.101 mmol, 1　당량), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드·HCl (EDC, 0.019 g, 0.101 mmol, 1 당량), 및 N-에틸-디이소프로필아민 (0.013 g, 0.017 mL, 0.101 mmol, 1 당량)을 연속적으로 처리하였다. 대기 온도에서 15분 동안 교반한 후, 최소 CH₂Cl₂에 용해시킨 (S)-2-아미노-6-헥사데카노일아미노-헥산산 벤질 에스터(0.048 g, 0.101 mmol, 1　당량)를 가하고, 반응을 2h 동안 수행하였다. 용매를 증발시킨 다음, 조 혼합물을 플래시 크로마토그래피 (SiO₂, CH₂Cl₂/MeOH (7 % 내지 >10 %))하여 백색 거품으로 0.133 g의 표제 화합물을 수득하였다. MS (ISP): 1167.1 [M+2Na]²⁺/2.

D.

상기 제조된 벤질 에스터 (0.130 g, 0.057 mmol)를 5 mL의 MeOH에 용해시키고, 대기 온도에서 3h 동안 1 atm의 H₂ 하에 0.024 g의 Pd/C (10%)로 수소화하였다. 셀라이트로 여과하고 용매를 증발시킨 다음 무색 오일로 0.123　g의 표제 화합물을 얻었다. MS (ISP): 2221.0 [M+Na]⁺.

실시예 11. GalNAc 클러스터 팔미토일과 오르니틴 링커의 합성 ( C16 )

Fmoc-Lys(팔미토일)-OH 대신 Fmoc-L-Orn(팔미토일)-OH를 사용하여 실시예 10과 유사한 방법으로 제조하여 백색 거품으로 표제 화합물을 얻었다. MS (ISP): 1093.1 [M+2H]²⁺/2.

실시예 12. GalNAc 클러스터 (E)- 헥사데크 -8- 에노일의 합성 ( C16 )

A. (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-6-((E)-헥사데크-8-에노일아미노)-헥산산 2-트리메틸실라닐-에틸 에스터

Fmoc-Lys((E)-헥사데크-8-에노일)-OH (0.500 g, 0.827 mmol)을 15 mL의 CH₂Cl₂에 현탁시키고, 2-(트리메틸실릴)에탄올 (0.196 g, 0.236 mL, 1.65　mmol, 2 당량), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAt, 0.123 g, 0.909 mmol, 1.1 당량), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드·HCl (EDC, 0.174 g, 0.909 mmol, 1.1　당량), 및 N-에틸-디이소프로필아민 (0.125 g, 0.164 mL, 0.967 mmol, 1.17 eq.)을 연속적으로 처리하였다. 그 다음, 노란색 용액을 주말 내내 교반하였다. 얼음 조각/HCl 용액에 쏟아붓고, 에틸아세테이트로 추출한 다음, 물로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 모든 용매를 증발시킨 후, 플래시 크로마토그래피 (SiO₂, CH₂Cl₂/MeOH = 9/1)하고 AcOEt/헵탄으로 결정화하여 황백색 반-고체로 0.488 g의 표제 화합물을 수득하였다. MS (ISP): 705.6 [M+H]⁺.

B. (S)-2-아미노-6-((E)-헥사데크-8-에노일아미노)-헥산산 2-트리메틸실라닐-에틸 에스터

상기 제조된 (S)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-6-((E)-헥사데크-8-에노일아미노)-헥산산 2-트리메틸실라닐-에틸 에스터 (0.488 g, 0.690 mmol)를 15 mL의 THF에 용해시키고, 1.35 mL의 디에틸아민(∼18 당량)으로 처리하였다. 대기 온도에서 3h 후, 모든 휘발성 물질을 i.v.로 제거하고, 조 반응 혼합물을 플래시 크로마토그래피 (SiO₂, CH₂Cl₂/MeOH (10 %))로 정제하여 노란색 오일로 0.259 g의 표제 화합물을 수득하였다. MS (ISP): 483.6 [M+H]⁺.

C. GalNAc 클러스터 (E)-헥사데크-8-에노일 (C16)

상기 화합물은 (S)-2-아미노-6-((E)-헥사데크-8-에노일아미노)-헥산산 2-트리메틸실라닐-에틸 에스터를 사용하고, 하기와 같이 보호기를 절단하여 상기한 대로 제조하였다: 끝에서 두 번째 단계 후, 결과의 2-트리메틸실라닐-에틸 에스터 (245 mg, 0.107 mmol, 당량: 1.00)를 THF abs. (5 mL)와 혼합하여 무색의 용액을 얻었다. 테트라부틸-암모늄 플루오라이드 삼수화물 (168 mg, 0.533 mmol, 당량: 5.00)을 0℃에서 가하고, 반응을 밤새도록 냉장고에 저장하였다. 얼음 조각에 쏟아붓고, 에틸아세테이트로 추출한 다음, 물로 세척하고 Na₂SO₄로 건조시키고, 모든 용매를 증발시켜 끈저거리는 오일을 수득하였다. 아세토니트릴 및 물에 용해시키고 동결건조하여 백색 고체로 0.120 g의 표제 화합물을 얻었다. MS (ISP): 1121.5 [M+2Na]²⁺/2.

실시예 13. GalNAc 클러스터 올레일의 합성 ( C18 )

(S)-2-아미노-6-((E)-헥사데크-8-에노일아미노)-헥산산 2-트리메틸실라닐-에틸 에스터 대신 (S)-2-(트리메틸실릴)에틸 2-아미노-6-올레아미도헥산오에이트를 사용하여 상기 실시예와 유사한 방법으로 제조하여 황백색 거품으로 표제 화합물을 얻었다. MS (ISP): 1113.6 [M+2H]²⁺/2.

실시예 14. GalNAc 클러스터 (9E,12E)- 옥타데카 -9,12- 디에노일의 합성 ( C18 )

(S)-2-아미노-6-((E)-헥사데크-8-에노일아미노)-헥산산 2-트리메틸실라닐-에틸 에스터 대신 (S)-2-(트리메틸실릴)에틸 2-아미노-6-((9E,12E)-옥타데카-9,12-디엔아미도)헥산오에이트를 사용하여 상기 실시예와 유사한 방법으로 제조하여 노란색의 동결건조된 고체로 표제 화합물을 얻었다. MS (ISP): 1134.55 [M+2Na]²⁺/2.

실시예 15. GalNAc 클러스터- 옥타노일의 합성 ( C8 )

Fmoc-Lys(팔미토일)-OH 대신 Fmoc-Lys(옥타노일)-OH를 사용하여 상기 실시예에 기재된 대로 제조하여 옅은 노란색 거품으로 표제 화합물을 얻었다. MS (ISP): 1044.5 [M+2H]²⁺/2.

실시예 16. GalNAc 클러스터- 도데카노일의 합성 ( C12 )

Fmoc-Lys(팔미토일)-OH 대신 Fmoc-Lys(도데카노일)-OH를 사용하여 상기 실시예에 기재된 대로 제조하여 옅은 노란색 거품으로 표제 화합물을 얻었다. MS (ISP): 2166.04 [M+Na]⁺.

실시예 17. GalNAc 클러스터- C20 - 아실의 합성

Fmoc-Lys(팔미토일)-OH 대신 Fmoc-Lys(이코사노일)-OH를 사용하여 상기 실시예에 기재된 대로 제조하여 옅은 노란색 거품으로 표제 화합물을 얻었다. MS (ISP): 1150.58 [M+2Na]²⁺/2.

실시예 18. GalNAc 클러스터- C24 - 아실의 합성

Fmoc-Lys(팔미토일)-OH 대신 Fmoc-Lys(테트라코사노일)-OH를 사용하여 상기 실시예에 기재된 대로 제조하여 옅은 노란색 거품으로 표제 화합물을 얻었다. MS (ISP): 2312.24 [M+H]⁺.

실시예 19. GalNAc 클러스터- 디옥타노일의 합성 (2 xC8 )

A. (S)-6-((S)-2,6-비스-tert-부톡시카보닐아미노-헥사노일아미노)-2-(9H-플루오렌-9-일-메톡시카보닐아미노)-헥산산

둥근 바닥 플라스크에서, Fmoc-Lys-OH (1.393 g 3.78 mmol, 당량: 1.00)를 CH₂Cl₂ (16 mL)에 용해시키고 옅은 노란색 용액을 얻었다. Huenig's 염기 (1.955 g, 2.57 mL, 15.1　mmol, 당량: 4.00) 및 트리메틸클로로실란 (0.863 g, 1.00 mL, 7.94 mmol, 당량: 2.10)을 가하고, 반응 혼합물을 20분 동안 교반하였다.

두 번째 둥근 바닥 플라스크에서, Boc-Lys(Boc)-OH (1.31 g, 3.78 mmol, 당량: 1.00)를 DMF (16 mL)에 용해시키고 무색의 용액을 얻었다. Huenig's 염기 (0.587 mg, 0.77 mL, 4.54 mmol, 당량: 1.20) 및 TPTU [125700-71-2] (1.123 g, 3.78 mmol, 당량: 1.00)를 가하고, 반응 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 상응하는 실릴 에스터 모노실릴아민을 함유하는 첫 번째 플라스크로부터의 용액을 가한 다음, 반응을 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 얼음 조각/NH₄Cl 위에 쏟아붓고, AcOEt로 2번 추출한 다음, H₂O 및 소금물로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시키고, 증발건조시켰다. 플래시 크로마토그래피 SiO₂ (CH₂Cl₂ 내 8 % MeOH)를 수행하여 황백색 거품으로 2.324 g의 표제 화합물을 얻었다. MS (ISP): 697.5 [M+H]⁺, 719.4 [M+Na] ⁺.

B. (S)-6-((S)-2,6-비스-tert-부톡시카보닐아미노-헥사노일아미노)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-헥산산 벤질 에스터

상기 제조된 (S)-6-((S)-2,6-비스-tert-부톡시카보닐아미노-헥사노일아미노)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-헥산산 (2.32 g, 3.33 mmol, 당량: 1.00) 및 페닐-메탄올 (0.720 g, 6.66 mmol, 당량: 2.00)을 30 mL의 CH₂Cl₂에 용해시키고, 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAt, 0.498 g, 3.66 mmol, 당량: 1.10), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 염산 (EDC, 0.702 g, 3.66　mmol, 당량: 1.10), 및 에틸-디이소프로필-아민 (0.503 g, 0.66 mL, 3.90 mmol, 당량: 1.17)으로 연속적으로 처리하였다. 120분 동안 교반한 후, 휘발성 물질을 i.v.로 제거하고, 이어서 플래시 크로마토그래피 (CH₂Cl₂ 내 8 % MeOH)하여 옅은 노란색 밀랍 고체로 2.573 g의 표제 화합물을 수득하였다. MS (ISP): 787.5 [M+H]⁺.

C. (S)-6-((S)-2,6-디아미노-헥사노일아미노)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-헥산산 벤질 에스터

상기 제조된 (S)-6-((S)-2,6-비스-tert-부톡시카보닐아미노-헥사노일아미노)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-헥산산 벤질 에스터 (염산으로서, 0.613 g, 0.779 mmol, 당량: 1.00)를 디옥산 (4 mL)에 용해시키고, 디옥산 내 4M HCl(당량: 10) 3.89 mL로 처리하였다. 3h 후, MS는 출발물질이 없음을 나타내었다. 모든 휘발성 물질을 i.v.로 제거하여 0.519 g의 염산으로서 표제 화합물을 얻었으며, 다음 단계를 위해 더 이상 정제하지 않고 사용하였다. MS (ISP): 587.3 [M+H]⁺.

D. (S)-6-((S)-2,6-비스-옥타노일아미노-헥사노일아미노)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-헥산산 벤질 에스터

상기 제조된 (S)-6-((S)-2,6-디아미노-헥사노일아미노)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-헥산산 벤질 에스터 (0.519 g, 0.771 mmol, 당량: 1.00) 및 카프릴산 (0.234 g, 1.619 mmol, 당량: 2.10)을 12 mL의 CH₂Cl₂에 용해시키고, 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAt, 0.220 g, 1.619 mmol, 당량: 2.10), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 염산 (EDC, 0.310 g, 1.619　mmol, 당량: 2.10), 및 에틸-디이소프로필-아민 (0.498 g, 0.666 mL, 3.855 mmol, 당량: 5.00)으로 연속적으로 처리하였다. 180분 동안 교반한 후, 혼합물을 얼음 조각 위에 쏟아붓고, AcOEt로 두번 추출하고, 물로 세척하고, MgSO₄로 건조시킨 다음 증발건조시켰다. AcOEt/헥산으로부터 결정화하여 백색 고체로 0.453 g의 표제 화합물을 수득하였다. MS (ISP): 839.8 [M+H]⁺, 861.8 [M+Na]⁺.

E. (S)-2-아미노-6-((S)-2,6-비스-옥타노일아미노-헥사노일아미노)-헥산산 벤질 에스터

상기 제조된 (S)-6-((S)-2,6-비스-옥타노일아미노-헥사노일아미노)-2-(9H-플루오렌-9-일메톡시카보닐아미노)-헥산산 벤질 에스터 (0.450 g, 0.536 mmol)를 2.2 mL의 THF에 현탁시키고, 2.2 mL의 디에틸아민 (~40 당량)으로 처리하였다. 대기 온도에서 24시간 동안 격렬하게 교반한 후, 모든 휘발성 물질을 i.v.로 제거하고, 조 반응 생성물을 EtOEt로 두 번 분쇄하여 백색 고체로 0.258 g의 표제 화합물을 얻었다. MS (ISP): 617.5 [M+H]⁺.

F. GalNAc 클러스터-디옥타노일 (2xC8)

(S)-2-아미노-6-헥사데카노일아미노-헥산산 벤질 에스터 대신 (S)-2-아미노-6-((S)-2,6-비스-옥타노일아미노-헥사노일아미노)-헥산산 벤질 에스터를 사용하여 상기 실시예에 기재된 대로 제조하여 백색 거품으로 표제 화합물을 얻었다. MS (ISP): 2342.19 [M+H]⁺.

실시예 20. 폴리뉴클레오티드 표적 물질- siRNA 합성

A. 물질.

건조 메탄올 (MeOH), 소듐 메틸레이트, 앰버라이트(Amberlite) IR-120, 소듐 설페이트, 건조 N,N-디메틸포름아미드 (DMF), 건조 디클로로메탄 (DCM), N,N'-디시클로헥실카보디이미드 (DCC), N-히드록시석신이미드 (NHS), N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA) 및 소듐 아세테이트 용액 (3 M, pH 5.2)을 Sigma Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany)로부터 구입하였다. 트리에틸암모늄 아세테이트 (TEAA) 완충액 (2.0 M, pH 7.0) 및 RP-HPLC용 아세토니트릴 (ACN) (HPLC quality)은 Biosolve (Valkenswaard, Netherlands)로부터 구입하였다. 에탄올 (EtOH) (p.a.)은 Merck (Darmstadt, Germany)로부터 구입하였다. Optilab HF (Membra Pure, Germany) 시스템으로부터의 정제수를 사용하였다. 자원 RPC 3 mL 컬럼 (10 x 0,64 cm; 15 ㎛ 입자 크기)은 GE Healthcare (Freiburg, Germany)로부터 구입하였다. HPLC 정제는 AKTA Explorer 100 (GE Healthcare)으로부터 구입하였다.

B. GalNAc 클러스터- RNA 컨쥬게이트의 합성 .

화합물 1(150 mg, 0.082 mmol)을 건조 메탄올(5.5 ml)에 용해시키고, 42㎕의 소듐 메틸레이트를 가하였다(MeOH 내 25% 용액). 혼합물을 실온에서 2h 동안 아르곤 대기 하에서 교반하였다. 동량의 메탄올과 양이온성 교환 수지 앰버라이트 (Amberlite) IR-120의 일부를 가하여 pH 약 7.0으로 하였다. 앰버라이트를 여과하여 제거하고, 용액을 Na₂SO₄로 건조시키고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 화합물 2는 백색 거품의 정량적 수율로 얻었다. TLC(SiO₂, DCM/MeOH 5:1 + 0.1% CH₃COOH): R_f 2 = 0.03; MeOH 내 황산 용액(5%)을 검출하기 위해 가열하여 사용하였다. ESI-MS, 직접 주입, 음성 모드(negative mode); [M-H]^-1 _calculated: 1452.7; [M-H]^1- _measured: 1452.5.

화합물 1

화합물 2

화합물 2(20 mg, 0.014 mmol)를 피리딘과 디클로로메탄으로 공-증발시켰다. 잔류물을 건조 DMF(0.9 ml)에 용해시키고, DMF 내 N-히드록시석신이미드의 용액 (1.6 mg, 0.014 mmol)을 아르곤 대기 하에 교반하면서 가하였다. 0℃에서 DMF 내 DCC (3.2 mg, 0.016 mmol)를 천천히 가하였다. 반응을 실온으로 따뜻하게 하고, 밤새도록 교반하였다. 화합물 3을 C-6 아미노 링커인 화합물 4가 갖춰진 RNA에 결합하기 위해 더 이상 정제하지 않고 사용하였다.

화합물 3

화합물 4

C. GalNAc 클러스터- PK - RNA 컨쥬게이트의 합성.

화합물 1로 표시되는 일반 구조의 화합물을 건조 메탄올에 용해시키고, 소듐 메틸레이트(9 당량)를 가하였다(MeOH 내 25% 용액). 혼합물을 실온에서 2h 동안 아르곤 대기 하에서 교반하였다. 반응 혼합물을 메탄올로 희석시키고, 이어서 양이온성 교환 수지 앰버라이트 IR-120의 일부를 가하여 pH 약 7.0으로 하였다. 앰버라이트를 여과하여 제거하고, 용액을 Na₂SO₄로 건조시키고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 화합물 2로 표시되는 일반 구조의 화합물을 백색 거품의 정량적 수율로 얻었다.

화합물 1

화합물 2

다음 단계에서, 화합물 2로 표시되는 일반 구조의 화합물을 NHS 형성에 의해 활성화시켰다. 화합물 2를 피리딘과 디클로로메탄으로 공-증발시켰다. 잔류물을 건조 DMF에 용해시키고, DMF 내 N-히드록시석신이미드 용액 (1.0 당량)을 아르곤 대기 하에 교반하면서 가하였다. 0℃에서 DMF 내 DCC 용액 (1.1 당량)를 천천히 가하였다. 반응을 실온으로 따뜻하게 하고, 밤새도록 교반하였다. 화합물 3으로 표시되는 일반 구조의 결과의 활성화된 화합물을 RNA에 결합하기 위해 더 이상 정제하지 않고 사용하였다. 폴리뉴클레오티드 표적 물질을 (화합물 4로 표시되는) 아미노-링커를 함유하는 6개의 탄소를 통해 RNAs의 5'-말단에 결합하였다.

화합물 3

화합물 4

D. 아미노-변형된 RNA 의 합성.

센스 가닥의 5'-말단에 C-6-아미노링커가 갖춰진 RNA는 AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Freiburg, Germany) 및 고체 지지체(Prime Synthesis, Aston, PA, USA)로서 조절된 공극 유리를 이용하여 1215μmol의 규모로 고체상 위에서 표준 포스포라미디트 화학으로 생성되었다. 2'-O-메틸 뉴클레오티드를 함유하는 RNA는 상응하는 포스포라미디트, 2'-O-메틸 포스포라미디트 및 TFA-헥실아미노링커 아미디트(Sigma-Aldrich, SAFC, Hamburg, Germany)를 사용하여 생성되었다. 절단, 탈보호 및 정제는 기술분야에서 알려진 방법에 의해 이루어졌다(Wincott F., et al, NAR 1995, 23,14, 2677-84). 아미노-변형된 RNA는 음이온 교환 HPLC(순도: 96.1%)로 특징지워졌고, 동일성은 ESI-MS로 확인하였다([M+H]¹⁺ _calculated: 6937.4; [M+H] ¹⁺ _measured: 6939.0). 서열: 5'-(NH₂C₆)GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA-3'; u,c: 상응하는 염기의 2'-O-메틸 뉴클레오티드, s: 포스포로티오에이트.

E. GalNAc 클러스터 RNA 컨쥬게이트의 합성 (화합물 4 ).

5'-말단에 C-6 아미노 링커가 갖춰진 RNA(2.54μmol)를 동결건조시키고, 250㎕ 소듐 보레이트 완충액(0.1 M 소듐 보레이트, pH 8.5, 0.1 M KCl) 및 1.1 mL DMSO에 용해시켰다. RNA 용액에 8㎕의 DIPEA를 가한 후, 계속 교반하면서 DMF 내 화합물 3(이론적으로 0.014 mmol)의 용액을 천천히 가하였다. 반응 혼합물을 35℃에서 밤새도록 교반하였다. 반응을 RP-HPLC (자원 RPC 3 ml, 완충액: A: 물 내 100 mM TEAA, B: 95% ACN 내 100　mM TEAA, 구배: 20 CV 내 5% B 내지 22% B)를 이용하여 관찰하였다. -20℃에서 EtOH 내 소듐 아세테이트(3 M)를 이용하여 RNA를 침전시킨 후, 상기 기재된 조건을 이용하여 RNA 컨쥬게이트를 정제하였다. 순수한 분획을 모으고, 소듐 아세테이트/EtOH를 이용하여 원하는 컨쥬게이트인 화합물 4를 침전시켰다. 화합물 4를 59% 수율(1.50μmol)로 분리하였다. 화합물 4의 순도는 음이온 교환 HPLC(순도: 91.7 %)로 분석하였고, 동일성은 ESI-MS ([M+H]¹⁺ _calculated: 8374.4; [M+H]¹⁺ _measured: 8376.5)로 확인되었다.

F. GalNAc 클러스터 PK - RNA 컨쥬게이트의 일반적 합성 (화합물 4 ).

5'-말단에 C-6 아미노 링커가 갖춰진 RNA를 물로부터 동결건조시키고, 소듐 보레이트 완충액(0.1 M 소듐 보레이트, pH 8.5, 0.1 M KCl) 및 DMSO의 1:4 비율의 혼합물에 용해시켰다. RNA 용액에 DIPEA를 가한 후, 계속 교반하면서 DMF 내 화합물 3(6 당량)의 용액을 천천히 가하였다. 반응 혼합물을 35℃에서 밤새도록 교반하였다. 반응을 RP-HPLC (자원 RPC 3 ml, 완충액: A: 물 내 100 mM TEAA, B: 95% ACN 내 100　mM TEAA, 구배: 20 CV 내 5% B 내지 22% B)를 이용하여 관찰하였다. -20℃에서 EtOH 내 소듐 아세테이트(3 M, pH 5.2)를 이용하여 RNA를 침전시킨 후, 상기 기재된 조건을 이용하여 RNA 컨쥬게이트를 정제하였다. 순수한 분획을 모으고, 소듐 아세테이트/EtOH를 이용하여 원하는 컨쥬게이트인 화합물 4를 침전시켰다.

G. siRNA 의 어닐링

RNA 센스 가닥을 갖는 화합물 4를 2'-O-메틸-변형된 안티센스 RNA 가닥으로 어닐링하였다: 안티센스 서열: 5'-uuGGAUcAAAu-AuAAG-A-uUCcscsU-3'. 아포지질단백질(apolipoprotein) B mRNA에 대해 유도된 siRNA 컨쥬게이트는 어닐링 완충액(20 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8; 100 mM 소듐 클로라이드)에서 상보 가닥의 동몰 (equimolar) 용액을 혼합하여 생성하였고, 85-90℃의 수욕조에서 3분 동안 가열하고, 3-4h 동안 실온으로 냉각시켰다. 듀플렉스(Duplex) 형성을 본래의 겔 전기영동으로 확인하였다.

In Vivo siRNA 전달

실시예 21. in vivo RNAi 폴리뉴클레오티드의 투여, 및 간세포로 전달.

RNAi 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트 및 차폐된 고분자를 상기 기재된 대로 합성하였다. 6 내지 8주령 마우스(종 C57BL/6 또는 ICR, 각 ~18-20g)는 Harlan Sprague Dawley(Indianapolis IN)로부터 얻었다. 마우스는 주입 전 적어도 2일 수용하였다. Harlan Teklad Rodent Diet (Harlan, Madison WI)를 무제한 급여하였다. RNAi 폴리뉴클레오티드 컨쥬게이트와 차폐된 고분자를 상기 기재된 대로 합성하였다. 0.2 mL의 전달 고분자 용액 및 0.2 mL의 siRNA 컨쥬게이트를 마우스의 꼬리 정맥으로 주사하였다. 고분자와 siRNA의 동시 주사의 경우, 주사 전에 siRNA-컨쥬게이트를 변형된 고분자에 가하였고, 전체 양, 0.4 ml를 주사하였다. 조성물은 생리적 조건에서 가용성 및 비응집(nonaggregating)이었다. 고분자와 siRNA를 개별적으로 주사하는 경우, 고분자는 0.2 mL의 제형 용액에 주입되었고, siRNA는 0.2 mL의 등장성 글루코오스에 주입되었다. 용액을 꼬리 정맥으로 주입하여 주사하였다. 다른 용기로 주입, 예를 들어, 우측 후안와(retro-orbital) 주입은 동일하게 효과적이었다.

혈청 ApoB 수준 측정.

마우스를 악하 출혈(submandibular bleeding)로 혈청을 모으기 전에 4h(랫트에 대해서는 16h) 동안 금식시켰다. 혈청 ApoB 단백질 수준을 표준 샌드위치 ELISA 방법으로 측정하였다. 간단하게, 다클론 염소 항-마우스 ApoB 항체 및 토끼 항-마우스 ApoB 항체(Biodesign International)를 각각 포획물 및 검출 항체로 사용하였다. HRP-결합된 염소 항-토끼 IgG 항체(Sigma)는 ApoB/항체 복합체를 결합하기 위해 나중에 적용되었다. 그 다음, 테트라메틸-벤지딘(TMB, Sigma) 비색 개발의 흡광도를 450 nm에서 Tecan Safire2 (Austria, Europe) 마이크로플레이트 리더로 측정하였다.

혈장 인자 Ⅶ(F7) 활성 측정.

마우스로부터 혈장 시료는 0.109 mol/L 소듐 시트레이트 항응고제(1 부피)를 함유하는 미세원심분리 튜브로 악하 출혈에 의해 혈액(9 부피)을 모으고 하기 표준 과정으로 제조하였다. 혈장에서 F7 활성은 제조자의 추천에 따라 BIOPHEN VII kit (Hyphen BioMed/Aniara, Mason, OH)를 이용하여 발색분석(chromogenic method)으로 측정하였다. 비색 개발의 흡광도는 450 nm에서 Tecan Safire2 (Austria, Europe) 마이크로플레이트 리더를 이용하여 측정되었다.

실시예 22. siRNA 는 하기 서열을 가졌다:

apoB siRNA:

센스 5' GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA 3' (서열번호 1)

안티센스 5' uuGGAUcAAAuAuAAGAuUCcscsU 3' (서열번호 2)

인자 Ⅶ siRNA

센스 5' GGAUfCfAUfCfUfCfAAGUfCfUfUfACfdTdT 3' (서열번호 3)

안티센스 5' GUfAAGACfUfUfGAGAUfGAUfCfCfdTsdT 3' (서열번호 4)

소문자(small letter) = 2'-O-CH₃ 치환

s = 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioate linkage)

뉴클레오티드 뒤의 f = 2'-F 치환

뉴클레오티드 앞의 d = 2'-데옥시

갈락토오스 클러스터- PK 표적 siRNA

실시예 23. 차폐된 DW1360 전달 고분자와 함께 병용-투여된 siRNA -갈락토오스 클러스터-약동학적 조절제 컨쥬게이트를 이용하여 in vivo 간세포로 siRNA 의 전달

siRNA 및 전달 고분자를 상기 기재된 대로 제조하였고, 표시된 용량의 siRNA와 고분자를 이용하여 투여하였다.

A. siRNA - 컨쥬게이트 및 차폐된 Lau 41305-38-17-19 전달 고분자의 병용-투여.

Lau 41305-38-17-19는 7 등가 무게의 2:1 CDM-PEG:CDM-NAG로 변형시켰다. 완전히 2'F/MeO 안정화된 인자 VII siRNA를 GalNAc₃-팔미토일 표적 물질 또는 기타 표시된 표적 물질에 결합시켰다. 20 gm ICR 마우스 (n=3)에 siRNA-컨쥬게이트 및 Lau 41305-38-17-19 전달 고분자의 병용-투여는 혈청 인자 VII 단백질 수준을 감소시켜, 간세포로 siRNA의 전달 및 인자 VII 유전자 발현의 억제를 나타낸다. 효율적인 전달은 RNAi 폴리뉴클레오티드에 전달 고분자 및 표적 물질의 결합을 필요로 한다(표 2). 비결합된 siRNA까지 유의한 녹다운이 관찰되지 않았다. 병용-투여된 전달 고분자의 부재는 표적 녹다운이 관찰되지 않았다. GalNAc₃-팔미토일 표적 리간드는 GalNAc₃ 표적 물질 또는 콜레스테롤 폴리뉴클레오티드 표적 물질에 비해 간세포에 siRNA의 개선된 전달을 제공하였다.

siRNA-GalNAc 클러스터 컨쥬게이트 + 전달 고분자의 주입 후에 in vivo 표적 유전자의 녹다운, 고분자 용량의 효과

표적물질	siRNA 용량a (mg/kg)	고분자 용량a (mg/kg)	상대 % 인자 VIIb
n/a	0	0	100±4
n/a	0	3	100
GalNAc3-팔미토일	2	0	100
GalNAc	2	3	100
GalNAc3	2	3	42±5
콜레스테롤	2	3	68±17
GalNAc3-팔미토일	2	3	21±2

a: 킬로그램 동물 무게 당 mg siRNA 또는 고분자

b: 상대 % 단백질

B. siRNA - 컨쥬게이트 및 차폐된 멜리틴 전달 펩티드의 병용-투여.

Tyr-멜리틴은 5 등가 무게의 CDM-NAG로 변형시켰다. 완전히 2'F/MeO 안정화된 인자 VII siRNA를 GalNAc₃-팔미토일 표적 물질 또는 기타 표시된 표적 물질에 결합시켰다. 20 gm ICR 마우스 (n=3)에 siRNA-컨쥬게이트 및 Tyr-멜리틴 전달 펩티드의 병용-투여는 혈청 인자 VII 단백질 수준을 감소시켜, 간세포로 siRNA의 전달 및 인자 VII 유전자 발현의 억제를 나타낸다. 효율적인 전달은 RNAi 폴리뉴클레오티드에 전달 고분자 및 표적 물질의 결합을 필요로 한다(표 3). 비결합된 siRNA까지 유의한 녹다운이 관찰되지 않았다. 병용-투여된 전달 고분자의 부재는 표적 녹다운이 관찰되지 않았다. GalNAc₃-팔미토일 표적 리간드는 콜레스테롤 폴리뉴클레오티드 표적 물질에 비해 간세포에 siRNA의 개선된 전달을 제공하였다.

siRNA-GalNAc 클러스터 컨쥬게이트 + 전달 고분자의 주입 후에 in vivo 표적 유전자의 녹다운, 고분자 용량의 효과

표적물질	siRNA 용량a (mg/kg)	멜리틴 용량a (mg/kg)	상대 % 인자 VIIb
n/a	0	0	100
n/a	0	5	100
GalNAc3-팔미토일	5	0	100
콜레스테롤	5	5	73±14
GalNAc3-팔미토일	5	5	34±11

a: 킬로그램 동물 무게 당 mg siRNA 또는 고분자

b: 상대 % 단백질

C. 차폐된 DW1360 전달 고분자와 함께 공-전달되는 경우 소수성 기 크기가siRNA-갈락토오스 클러스터-약동학적 조절제 컨쥬게이트의 전달에 미치는 영향.

DW-1360은 7 등가 무게의 2:1 CDM-PEG:CDM-NAG로 변형시켰다. 완전히 2'F/MeO 안정화된 apoB siRNA를 표시된 소수성 PK 기를 갖는 GalNAc₃-PK 표적 물질에 결합시켰다. 20 gm ICR 마우스 (n=3)에 siRNA-컨쥬게이트 및 DW-1360 전달 고분자의 병용-투여는 혈청 apoB 단백질 수준을 감소시켜, 간세포로 siRNA의 전달 및 apoB 유전자 발현의 억제를 나타낸다. 효율적인 전달은 RNAi 폴리뉴클레오티드에 전달 펩티드 및 표적 물질의 결합을 필요로 한다(표 4). 최적의 전달은 16-20 탄소 원자를 갖는 PK 기(15-19 탄소 원자를 갖는 소수성 기)를 갖는 폴리뉴클레오티드 표적 리간드와 함께 관찰되었다.

siRNA-GalNAc 클러스터 컨쥬게이트 + 전달 고분자의 주입 후에 in vivo 표적 유전자의 녹다운, 고분자 용량의 효과

PK 조절제	PK 탄소수	siRNA 용량a (mg/kg)	멜리틴 용량a (mg/kg)	상대 % ApoBb
n/a		0	0	100
none	-	0.25	12.5	47±17
옥타노일	8	0.25	12.5	52±3
도데카노일	12	0.25	12.5	41±8
(E)-헥사데크-8-에노일	16	0.25	12.5	27±12
디옥타노일	16	0.25	12.5	25±6
팔미토일	16	0.25	12.5	21±7
올레일	18	0.25	12.5	21±2
(9E,12E)-옥타데카-9,12-디에노일	18	0.25	12.5	21±9
C20-아실	20	0.25	12.5	19±8
C24-아실	24	0.25	12.5	44±5

a: 킬로그램 동물 무게 당 mg siRNA 또는 고분자

b: 상대 % 단백질

실시예 24. in vivo 에 투여된 siRNA - GalNAc 클러스터- PK 의 체내 분포

다양한 소수성 측쇄를 포함하는 6개의 다른 GalNAc 클러스터-PK 표적 물질을 ApoB에 대해 유도된 siRNA에 공유결합하였다. 이들 컨쥬게이트를 2.5 mg/kg 용량으로 수컷 Wistar 랫트에 정맥(i.v. bolus) 투여하였다 (표 5). 혈액 시료를 복용 5, 15, 30, 60, 90, 120, 240 및 360분 후에 다른 동물로부터 모았다 (각 시점에 대해 n=2). 즉시 혈액을 뽑은 후, EDTA 혈장을 생성하고 이어서 프로테이나제 K (Epicentre Biotechnologies, USA)로 처리하였다. 복용 1,5 및 6h 후에 희생된 동물(n=2)로부터 간과 비장 조직 시료 (500 mg)를 얻었다. 얼려진 조직 조각을 갈아서 미세 분말을 얻었다. 각 조직의 분취량의 무게를 재고, Lysis Mixture (Panomics, USA), 프로테이나제 K (Epicentre Biotechnologies, USA) 및 SONOPULS HD 2070 (Bandelin, Germany) 초음파 균질기를 이용하여 균질화시켰다. 결과의 최종 조직 용해물은 ~50 mg/mL의 농도를 가졌다.

혈장 및 조직 시료 내의 siRNA 농도는 특허 올리고뉴클레오티드 검출 방법을 이용하여 측정하였다. 간단하게, siRNA 정량화는 형광적으로 상보적(Atto-425) 표지된 PNA-프로브와 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥의 혼성화를 기초로 하고, 분리는 AEX-HPLC을 기반으로 한다. 정량화는 외부 눈금 곡선에 대해 형광 검출에 의해 수행되었고, 상응하는 비-결합된 ApoB 듀플렉스의 희석 시리즈로부터 생성되었다. 이 듀플렉스는 PK 실험에서 시험된 모든 컨쥬게이트의 공통적인 동일한 안티센스 가닥으로 구성되었다. 혈장 시료 (0.2-2 μL) 및 조직 시료 (~1 mg)를 HPLC 시스템 위에 주입하였다.

간에 대한 조직 결과는 표 5에 나타내었다. 간에서, 가장 낮은 농도가 PK 조절제가 결여된(추가 소수성 사슬 없음) 표적 물질을 갖는 siRNA임을 확인하였다. siRNA 농도는 표적 물질 위에 소수성 측쇄 PK 조절제를 지루하게 하는 모든 컨쥬게이트에 대해 간에서 더 높았다. 1.5 시간 후 가장 높은 농도는 GalNAc 클러스터 이외에 2개의 옥타노일 측쇄를 갖는 표적 물질에 대해 측정하였다. 복용 6 h 후, GalNAc 클러스터 이외에 C₂₀-아실 측쇄를 갖는 표적 물질은 가장 높은 간 농도를 나타내었다. 따라서, GalNAc-결합된 siRNAs의 간 흡수는 소수성 측쇄가 표적 물질로 설계되는 경우 PK 특성을 조절하여 증가될 수 있다.

비록 특정 메커니즘이 알려져 있지 않을지라도, PK 조절제는 혈장 단백질 결합을 증가시키고, 이로써 순환 시간이 증가될 수 있다. 그 다음, 증가된 순환 시간은 증가된 조직 표적을 이끈다. 반대로, PK 조절제가 없는, siRNA는 신장 여과 (renal filtration)에 의한 순환으로부터 더 빨리 분명해졌다.

분포 특성은 측쇄의 소수성과 부분적으로 상호관련 있을 수 있다. PK 조절제 및 C8 PK 조절제는 순환으로부터 더 빨리 분명해졌고, 가장 낮은 간 표적 분포를 가졌고, 최소의 표적 유전자 녹다운을 나타내었다. 반대로, 16-20 탄소 원자를 갖는 PK 조절제의 존재는 순환으로부터 덜 빨리 분명해졌고, 더 높은 간 표적 분포를 가졌고, 증가된 표적 유전자 녹다운을 나타내었다 (도 7).

투여 후 1.5 시간, 간에서 siRNA

폴리뉴클레오티드 표적 물질	간에서 siRNA (ng/g)a
GalNAc 클러스터 (C8)	396±204
GalNAc 클러스터 (2xC-8)	2463±1014
GalNAc 클러스터 (C20)	1725±1753
GalNAc 클러스터 (C24)	767±25
GalNAc 클러스터 (C-16)	990±326
GalNAc 클러스터	189±22

a: 주사 후 1.5h

실시예 25. 약동학적 조절제의 사용을 통한 표적 종양의 증가

폴레이트 또는 콜레스테롤 단독 또는 폴레이트-콜레스테롤 약동학적 조절제에 siRNA를 결합하였다. 5 mg siRNAs를 KB 이종이식 마우스에 주사하였다. 그 다음, siRNA 존재한 종양을 분리하고 어세이하였다. 주사 후 두(2) 시간에, 폴레이트 또는 콜레스테롤 단독 (100 ng/g 미만)에 결합된 siRNA에 비해 폴레이트-콜레스테롤 약동학적 조절제 (>500 ng/g)에 결합된 siRNA에 대해 종양에서 더 유의하게 siRNA를 확인하였다. 주사 후 여섯(6) 시간에는, 그 차이가 훨씬 더 명백하였다, ~500 ng/g 대 <50 ng/g.

KB 이종이식 모델:

KB 세포는 ATCC로부터 얻었으며, 10% FBS로 보충된 GIBCO/Invitrogen의 폴레이트 없는 RPMI 1640 배지 (# 27016)에서 성장시켰다. KB 세포는 숙주 마우스에 주사하기 전에 2주 동안 폴레이트 없는 배지에서 배양하여야 한다. Athymic Nude -Foxn1 ^nu (Fox Chase Nude)는 Harlan laboratory로부터 얻었다. 마우스는 종양 접종 전 2-3주 동안 폴레이트 없는 음식물 (DYET# 17772, from Dyets Inc., Bethlehem, PA 18017)을 급여하였다. 그 후, 서브컨플루언스(Subconfluence) KB 세포를 트립신화하고, PBS로 헹군 다음, PBS에서 1 million/100 ㎕로 현탁하였다. 1-2 백만 세포를 왼쪽 옆구리 아래에 피하주사하고, 종양 성장을 디지탈 캘리퍼로 일주일에 두 번씩 관찰하였다. 종양이 5-8 mm의 크기일 때, 마우스를 siRNA로 주사하였고, 따라서 혈관이 잘 분포됨을 예측하였다 (일반적으로 7-10 일).

siRNA 정량화:

조직 시료는 동결된 상태로 분쇄하였고, 15-25 mg의 동결 분말은 뉴클레아제-없는 물에 희석시킨 1 mL의 1:3 용해 용액(Panomics/Affymetrix)에 현탁시켰다. 시료를 초음파 막대로 초음파 처리하고, 이어서 65℃에서 30분 동안 프로테이나제 K (Panomics/Affymetrix)로 처리하였다. 프로테이나제 K 처리 후, 20 ㎕의 3M KCl을 200 ㎕의 조직에 가하고 초음파 처리하여 SDS를 침전시켰다. 시료를 10분 동안 얼음 위에 놓고, 이어서 4℃에서 4000 rcf에서 15분 동안 원심분리하였다. siRNA 정량화를 위해 상층액을 모았다. 100 ㎕의 상층액을 안티센스 가닥을 표적하는 10 μM Atto610-PNA-프로브 용액 중 5 μL와 혼합하였다. 혼성화 완충액 (50mM TRIS-Cl, pH 8.0)을 200 ㎕의 최종 부피에 가하였다. 시료를 15분 동안 95℃에서 열순환기에서 배양한 다음, 50℃로 온도를 감소시키고 15분 더 배양하여 혼성화하였다. 눈금 곡선은 동일한 조건 하에 siRNA 희석 시리즈로부터 생성되었으며, 모든 시료는 HPLC 자동샘플러에 놓았다. 시료를 50℃에서 가열된 Dionex DNAPac PA-100 4×50 mm 컬럼 위에 100㎕의 부피로 주입하였다. 시료를 1 mL/min 유속으로 구배용매조성(binary gradient)을 이용하여 용출하였다.　완충액 A: 10mM Tris, 30% ACN, 100mM NaCl, pH 7.　완충액 B: 10mM Tris, 30% ACN, 900mM NaCl, pH 7.　시료는 Shimadzu RF-10Axl 형광 검출기 (ex:436nm, em:484nm)를 이용하여 분석하였다.

Claims (20)

1. 표적 리간드-약동학적 조절제 표적 물질에 공유결합된 RNA 간섭 폴리뉴클레오티드를 포함하는 in vivo 세포로 올리고뉴클레오티드 전달용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, RNA 간섭 폴리뉴클레오티드는 생리적으로 불안정한 결합을 통해 표적 리간드-약동학적 조절제 표적 물질에 공유결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 약동학적 조절제는 16 이상의 탄소 원자를 갖는 소수성 기로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 약동학적 조절제는 16-20의 탄소 원자를 갖는 소수성 기로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 3항에 있어서, 약동학적 조절제는 팔미토일, 헥사데크-8-에노일, 올레일, (9E,12E)-옥타데카-9,12-디에노일, 디옥타노일, 및 C16-C20 아실로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 3항에 있어서, 약동학적 조절제는 콜레스테롤로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제 1항에 있어서, 표적 리간드는 세포 수용체 리간드로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 세포 수용체 리간드는 아시알로당단백질 수용체 표적 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 제 8항에 있어서, 아시알로당단백질 수용체 표적 물질은 갈락토오스, 갈락토사민, N-포르밀-갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-프로피오닐-갈락토사민, N-n-부타노일갈락토사민, 및 N-이소부타노일-갈락토사민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 제 8항에 있어서, 아시알로당단백질 수용체 표적 물질은 갈락토오스 클러스터를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
11. 제 10항에 있어서, 갈락토오스 클러스터는 N-아세틸갈락토사민 삼량체로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
12. 제 7항에 있어서, 세포 수용체 리간드는 폴레이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
13. 제 1항에 있어서, 조성물은 폴리뉴클레오티드 전달 고분자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
14. 제 13항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 전달 고분자는 가역적으로 변형된 막 활성 폴리아민을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
15. 제 1항에 있어서, RNA 간섭 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, dsRNA, RNA 간섭 폴리뉴클레오티드, siRNA, 및 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
16. ASGPr 표적 물질-약동학적 조절제 표적 물질에 공유결합된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 in vivo 간세포로 폴리뉴클레오티드 전달용 조성물.
17. 제 16항에 있어서, ASGPr 표적 물질은 갈락토오스, 갈락토사민, N-포르밀-갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, N-프로피오닐-갈락토사민, N-n-부타노일-갈락토사민, N-이소부타노일-갈락토사민, 갈락토오스 클러스터, 및 N-아세틸갈락토사민 삼량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
18. 제 16항에 있어서, 약동학적 조절제는 16 이상의 탄소 원자를 갖는 소수성 기, 16-20의 탄소 원자를 갖는 소수성 기, 팔미토일, 헥사데크-8-에노일, 올레일, (9E,12E)-옥타데카-9,12-디에노일, 디옥타노일, C16-C20 아실, 및 콜레스테롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
19. 제 16항에 있어서, ASGPr 표적 물질-약동학적 조절제 표적 물질은 생리적으로 불안정한 결합을 통해 폴리뉴클레오티드에 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
20. 제 16항에 있어서, ASGPr 표적 물질 및 약동학적 조절제 표적 물질은 지지체 분자를 통해 폴리뉴클레오티드에 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.

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