JP2016185968A - ｓｉＲＮＡ用ガラクトースクラスター−薬物動態調節剤標的指向部分 - Google Patents

Abstract

【課題】インビボでのRNA干渉（RNAi）ポリヌクレオチドの細胞への標的指向送達するための組成物及びその投与方法の提供。【解決手段】siRNA等にガラクトースまたはガラクトース誘導体からなる標的指向リガンド-薬物動態調節剤標的指向部分を結合させたポリヌクレオチド誘導体を含む組成物。薬物動態調節剤が、標的指向リガンド単独に比べてインビボでの標的指向を改善する。単独または膜活性ポリアミンなどの標的指向送達ポリマーと一緒に、インビボで投与する方法。【選択図】なし

Description

ポリヌクレオチドおよび他の実質的に細胞膜不透過性化合物の生細胞への送達は、細胞の複雑な膜系によって高度に制限されている。アンチセンス、RNAi、および遺伝子療法において用いられる薬物は比較的大きい親水性ポリマーであり、高度に負に荷電していることが多い。これらの物理的特徴はいずれも、細胞膜を通過してのそれらの直接拡散を厳しく制限する。このため、ポリヌクレオチド送達の主な障壁は、細胞膜を通過しての細胞の細胞質または核へのポリヌクレオチドの送達である。

インビボで小さい核酸を送達するために用いられてきた1つの手段は、核酸を小さい標的指向分子または脂質もしくはステロールのいずれかに結合することであった。これらの結合体でいくらかの送達および活性が観察されたが、これらの方法により必要とされる核酸用量は極端に大きい。

インビトロでポリヌクレオチドの細胞への適度に効率的な送達を達成する多くの形質移入試薬も開発されている。しかし、これらの同じ形質移入試薬を用いてのポリヌクレオチドのインビボ送達は、インビボ毒性、有害な血清相互作用、および不良な標的指向により複雑で無効となっている。インビトロで良好にはたらく形質移入試薬、カチオンポリマーおよび脂質は、典型的には大きいカチオン静電粒子を形成し、細胞膜を不安定化する。インビトロ形質移入試薬の正電荷は電荷-電荷（静電）相互作用を介して核酸との結合を促進し、したがって核酸/形質移入試薬複合体を形成する。正電荷は媒体の細胞への非特異的結合、および膜融合、不安定化、または破壊のためにも有益である。膜の不安定化は実質的に細胞膜不透過性ポリヌクレオチドの細胞膜を通過しての送達を促進する。これらの特性はインビトロでの核酸移動を促進するが、これらはインビボで毒性および無効な標的指向を引き起こす。カチオン電荷は血清成分との相互作用をもたらし、これはポリヌクレオチド-形質移入試薬相互作用の不安定化、不良なバイオアベイラビリティ、および不良な標的指向を引き起こす。インビトロでは有効でありうる、形質移入試薬の膜活性は、インビボでは毒性につながることが多い。

インビボ送達のために、媒体（核酸および関連する送達物質）は小さい、直径100nm未満、好ましくは50nm未満であるべきである。さらにより小さい複合体、20nm未満または10nm未満がより有用であろう。100nmよりも大きい送達媒体はインビボで血管細胞以外の細胞にほとんど接近できない。静電相互作用により形成された複合体は、生理的塩濃度または血清成分に曝露されると凝集または分解する傾向にある。さらに、インビボ送達媒体上のカチオン電荷は有害な血清相互作用と、したがって不良なバイオアベイラビリティにつながる。面白いことに、高い負の電荷も、標的指向に必須の相互作用、すなわち標的指向リガンドの細胞受容体への結合、を妨害することにより、標的インビボ送達を阻害しうる。したがって、インビボでの分布および標的指向のために、中性に近い媒体が望ましい。注意深く調節しなければ、膜破壊または不安定化活性はインビボで用いると毒性である。媒体毒性と核酸送達との釣り合いを取ることは、インビボよりもインビトロでより容易に達成される。

Rozemaらは、米国特許公報第20040162260号（特許文献1）で、膜活性ポリアミンの膜破壊活性を可逆的に調節する手段を示した。膜活性ポリアミンにより細胞膜を破壊する手段が提供された。pH依存性の可逆的調節により、標的細胞のエンドソームに対する活性を制限し、したがって毒性を制限する手段が提供された。彼らの方法は、2-プロピオン酸-3-メチル無水マレイン酸によるポリアミン上のアミンの修飾に頼るものであった。

この修飾は、カルボキシル基の対（βカルボキシルおよびγカルボキシル）への一級アミンの変換を介してポリカチオンをポリアニオンに変換し、ポリアミンの膜活性を可逆的に阻害した。Rozemaら（Bioconjugate Chem. 2003, 14, 51-57）（非特許文献1）は、βカルボキシルは完全な見かけの負電荷を示さず、それ自体では膜活性を阻害することができないと報告した。有効な膜活性阻害のためにはγカルボキシル基の追加が必須であると報告された。核酸と送達媒体の同時送達を可能にするために、核酸が送達ポリマーに共有結合された。彼らはその生物学的に不安定な結合体送達システムを用いて、インビトロでポリヌクレオチドの細胞への送達を示すことができた。しかし、媒体は高度に負に荷電しているため、高い負電荷密度を有する核酸および修飾ポリマーのいずれでも、この系はインビボ送達のために効率的ではなかった。負電荷は細網内皮系（RES）による細胞特異的標的指向を阻害し、非特異的取り込みを増強した可能性がある。

Rozemaらは、米国特許公報第20080152661号（特許文献2）で、修飾膜活性ポリマーの高い負電荷密度を除去することにより、米国特許公報第20040162260号（特許文献1）の方法を改善した。2-プロピオン酸-3-メチル無水マレイン酸のγカルボキシルの代わりに中性親水性標的指向（ガラクトース）および立体安定化（PEG）基を用いることにより、Rozemaらは全般的水溶性および膜活性の可逆的阻害を保持する一方で、有効なインビボ肝実質細胞標的指向を組み込むことができた。前と同様、ポリヌクレオチドが形質移入ポリマーに共有結合された。ポリヌクレオチドの形質移入ポリマーへの共有結合は、ポリヌクレオチドの形質移入ポリマーからの解離を防止することにより、インビボ投与中のポリヌクレオチドと形質移入ポリマーとの標的細胞への同時送達を確実にするために維持された。形質移入ポリマーは細胞外またはエンドサイトーシス区画内のいずれかからの細胞膜を通過してのポリヌクレオチドの細胞質への輸送を提供するため、ポリヌクレオチドと形質移入ポリマーとの同時送達が必要とされる。米国特許公報第20080152661号（特許文献2）は、この新しい改善された生理的反応性ポリ結合体を用いての、インビボでのポリヌクレオチド、具体的にはRNAiオリゴヌクレオチドの肝細胞への非常に効率的な送達を示した。

しかし、核酸のポリアミンへの共有結合は固有の制限を有した。核酸およびマスキング剤の両方を結合するための形質移入ポリマーの修飾は、電荷相互作用によって複雑となった。負に荷電した核酸の正に荷電したポリマーへの結合は凝集を起こしやすく、それにより混合物の濃度が制限される。凝集は過剰のポリカチオンまたはポリアニオンの存在によって克服することができた。しかし、この解決法は核酸とポリマーを製剤しうる比を制限した。同様に、負に荷電した核酸の非修飾カチオンポリマーへの結合は複合体の凝縮および凝集を引き起こし、ポリマー修飾を阻害した。負のポリマーを形成するポリマーの修飾は、核酸の結合を損なった。

Rozemaらは、米国特許仮出願第61/307,490号（特許文献3）において、米国特許出願公開第20080152661号（特許文献2）に記載の技術をさらに改善した。米国特許仮出願第61/307,490号（特許文献3）において、Rozemaらは、標的指向分子を注意深く選択し、適切な標的指向分子をsiRNAおよび送達ポリマーの両方に独立に結合することにより、siRNAおよび送達ポリマーを分離し、なおインビボで両方の要素の細胞への有効な標的指向を保持し、siRNAの効率的な機能的標的指向送達を達成しうることを示した。米国特許出願公開第20080152661号（特許文献2）および米国特許仮出願第61/307,490号（特許文献3）の両方で用いた送達ポリマーは、比較的大きい合成ポリマーのポリ(ビニルエーテル)およびポリ(アクリラート)であった。より大きいポリマーは、細胞特異的結合のための標的指向リガンドおよび遮蔽増大のためのPEGの両方による修飾を可能にした。より大きいポリマーは、おそらくは膜活性の増大および細胞エンドソーム内の核酸の保護改善を通じて、有効な送達のために必要であった。より大きいポリカチオンは膜およびアニオン性RNAの両方とより強く相互作用する。

発明者らは、改善されたRNA干渉ポリヌクレオチド標的指向部分を用いて、改善されたsiRNA送達系を開発した。

米国特許公報第20040162260号 米国特許公報第20080152661号 米国特許仮出願第61/307,490号

Rozemaら（Bioconjugate Chem. 2003, 14, 51-57）

好ましい態様において、本発明は、インビボでRNA干渉ポリヌクレオチドを標的細胞に送達するための組成物であって、標的指向リガンド-薬物動態調節剤標的指向化合物に結合されているRNA干渉ポリヌクレオチド（siRNA結合体）を含む組成物を特徴とする。標的指向リガンド-薬物動態調節剤標的指向化合物は、標的指向リガンド単独に比べて、改善されたインビボ循環および標的指向特性を有する。例示的標的指向リガンドには、アシアロ糖タンパク質受容体リガンドおよび葉酸が含まれる。薬物動態調節剤は、標的指向リガンドと組み合わせた場合、組織標的指向の増大を提供する。次いで、siRNAを単独または送達分子との組み合わせで注入することができる。

好ましい態様において、発明者らは、16個以上の炭素原子を有する疎水性基を含む薬物動態調節剤を記載する。標的指向リガンドと組み合わせた場合、標的指向リガンド-薬物動態調節剤はsiRNAの改善されたインビボ送達を提供する。例示的な適切な疎水性基は、コレステロール、パルミトイル、ヘキサデカ-8-エノイル、オレイル、(9E,12E)-オクタデカ-9,12-ジエノイル、ジオクタノイル、およびC16〜C20アシルを含む群より選択しうる。16個未満の炭素原子を有する疎水性基はポリヌクレオチド標的指向を増強する上で有効性が低い。

ポリヌクレオチド標的指向部分として有用な薬物動態調節剤は、それぞれ直鎖、分枝、または環式でありうる、コレステロール、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基からなる群より選択してもよい。薬物動態調節剤は好ましくは、炭素および水素原子だけを含む炭化水素である。しかし、疎水性を維持する置換またはヘテロ原子、例えばフッ素は許容されうる。

一つの態様において、本発明はインビボでRNA干渉ポリヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物であって、ASGPrを標的とする可逆的にマスクした膜活性ポリアミン（送達ポリマー）およびガラクトースクラスター-薬物動態調節剤標的指向部分に結合されているRNA干渉ポリヌクレオチド（siRNA結合体）を含む組成物を特徴とする。送達ポリマーおよびsiRNA結合体を別々に合成し、別々の容器または1つの容器で供給してもよい。RNA干渉ポリヌクレオチドはポリマーに結合していない。

一つの態様において、膜活性ポリアミンは、アミン含有モノマー、低級疎水性モノマー、および高級疎水性モノマーのランダム重合により生成した両親媒性ポリマーを含む。アミン含有モノマーは、一級アミンおよび二級アミンからなる群より選択されるアミン側基を含む。低級疎水性モノマーは、1〜6個の炭素原子を有する疎水性側基を含む。高級疎水性モノマーは、12〜36個以上の炭素原子を有する疎水性側基を含む。アミン基の疎水性基に対する比は、膜破壊活性を有する水溶性ポリマーを生成するよう選択され、好ましくは疎水性モノマー1つにつき≧1のアミンモノマーである。一つの態様において、ポリマーは60〜80％のアミンモノマーを有することになる。疎水性基はアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基からなる群より選択されてもよく、これらはそれぞれ直鎖、分枝、または環状、ステロイド、およびステロイド誘導体であってもよい。疎水性基は好ましくは炭素および水素原子だけを含む炭化水素である。しかし、疎水性を維持し、例えば、フッ素を含む置換またはヘテロ原子が認められることもある。特に適切な膜活性ポリアミンはポリ(ビニルエーテル)ランダムターポリマーまたはポリ(アクリラート)ランダムターポリマーを含む。

好ましい態様において、ASGPrを標的とする可逆的にマスクしたメリチンペプチドは、ペプチド上の一級アミンとASGPrリガンド含有マスキング剤との反応によって可逆的に修飾したメリチンペプチドを含む。修飾基を切断してアミンが復旧する場合、アミンは可逆的に修飾されている。メリチンペプチドの可逆的修飾は、メリチンペプチドの膜活性を可逆的に阻害する。ポリマーアミンのマスキング剤による修飾は、好ましくはアミンの電荷の中和もする。好ましいASGPrリガンド含有マスキング剤は、二置換無水マレイン酸アミン反応性基を有するガラクトサミンまたはガラクトサミン誘導体を含む。無水物とアミンとの反応は、アミンを可逆的に修飾して、マレアマートまたはマレアミド酸を生成する。マスクした状態で、可逆的にマスクしたメリチンペプチドは膜破壊活性を示さない。膜活性を阻害し、細胞標的指向機能を提供する、すなわち可逆的にマスクしたメリチンペプチドを生成するために、メリチンペプチド上のアミンの80％よりも多く、または90％よりも多くの可逆的修飾が必要とされる。

好ましい態様において、可逆的にマスクした膜活性ポリアミンは、ポリマー上のアミンのマスキング剤との反応により可逆的に修飾した本発明の膜活性ポリアミンを含む。修飾基の切断がアミンを復旧する場合、アミンは可逆的に修飾されている。膜活性ポリアミンの可逆的修飾は、膜活性ポリアミンの膜活性を可逆的に阻害する。好ましくは、マスキング剤は標的指向機能および/または血清相互作用回避機能も提供する。ポリマーアミンのマスキング剤による修飾は、好ましくはアミンの電荷の中和もする。好ましいマスキング剤は二置換無水マレイン酸アミン反応性基を有するガラクトサミンもしくはガラクトサミン誘導体またはポリエチレングリコールを含む。無水物のアミンとの反応は、アミンを可逆的に修飾してマレアマートまたはマレアミド酸を生成する。マスクした状態で、可逆的にマスクした膜活性ポリアミンは膜破壊活性を示さない。膜活性を阻害し、細胞標的指向機能を提供する、すなわち可逆的にマスクした膜活性ポリマーを生成するために、アミン上のアミンの50％よりも多く、55％よりも多く、60％よりも多く、65％よりも多く、70％よりも多く、75％よりも多く、または80％よりも多くのマスキング剤による可逆的修飾が必要とされることもある。記載する膜活性ポリアミンの膜活性阻害および/またはインビボ標的指向は、ポリマーアミンの＞50％の修飾を必要とする。

RNAiポリヌクレオチド結合体および送達ポリマーを薬学的に許容される担体または希釈剤中で哺乳動物に投与することができる。一つの態様において、哺乳動物への投与前に送達ポリマーおよびRNAiポリヌクレオチド結合体を溶液中で混合してもよい。もう一つの態様において、送達ポリマーおよびRNAiポリヌクレオチド結合体を別々の溶液中で哺乳動物に同時投与してもよい。さらにもう一つの態様において、送達ポリマーおよびRNAiポリヌクレオチド結合体を哺乳動物に逐次投与してもよい。逐次投与のために、送達ポリマーをRNAiポリヌクレオチド結合体の投与前に投与してもよい。または、逐次投与のために、RNAiポリヌクレオチド結合体を送達ポリマーの投与前に投与してもよい。

[1] 標的指向リガンド-薬物動態調節剤標的指向部分に共有結合されているRNA干渉ポリヌクレオチドを含む、インビボでオリゴヌクレオチドを細胞に送達するための組成物。
[2] RNA干渉ポリヌクレオチドが、標的指向リガンド-薬物動態調節剤標的指向部分に生理的に不安定な連結を介して共有結合されている、[1]記載の組成物。
[3] 薬物動態調節剤が、16個以上の炭素原子を有する疎水性基からなる、[1]記載の組成物。
[4] 薬物動態調節剤が、16〜20個の炭素原子を有する疎水性基からなる、[3]記載の組成物。
[5] 薬物動態調節剤が、パルミトイル、ヘキサデカ-8-エノイル、オレイル、(9E,12E)-オクタデカ-9,12-ジエノイル、ジオクタノイル、およびC16-C20アシルからなる群より選択される、[3]記載の組成物。
[6] 薬物動態調節剤がコレステロールからなる、[3]記載の組成物。
[7] 標的指向リガンドが細胞受容体リガンドからなる、[1]記載の組成物。
[8] 細胞受容体リガンドがアシアロ糖タンパク質受容体標的指向部分を含む、[7]記載の組成物。
[9] アシアロ糖タンパク質受容体標的指向部分が、ガラクトース、ガラクトサミン、N-ホルミル-ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-プロピオニル-ガラクトサミン、N-n-ブタノイル-ガラクトサミン、およびN-イソ-ブタノイルガラクトサミンからなる群より選択される、[8]記載の組成物。
[10] アシアロ糖タンパク質受容体標的指向部分がガラクトースクラスターを含む、[8]記載の組成物。
[11] ガラクトースクラスターがN-アセチルガラクトサミン三量体からなる、[10]記載の組成物。
[12] 細胞受容体リガンドが葉酸を含む、[7]記載の組成物。
[13] ポリヌクレオチド送達ポリマーをさらに含む、[1]記載の組成物。
[14] ポリヌクレオチド送達ポリマーが、可逆的に修飾された膜活性ポリアミンを含む、[13]記載の組成物。
[15] RNA干渉ポリヌクレオチドが、DNA、RNA、dsRNA、RNA干渉ポリヌクレオチド、siRNA、およびmiRNAからなる群より選択される、[1]記載の組成物。
[16] ASGPr標的指向部分-薬物動態調節剤標的指向部分に共有結合されているポリヌクレオチドを含む、インビボで該ポリヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物。
[17] ASGPr標的指向部分が、ガラクトース、ガラクトサミン、N-ホルミル-ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-プロピオニル-ガラクトサミン、N-n-ブタノイル-ガラクトサミン、N-イソ-ブタノイルガラクトサミン、ガラクトースクラスター、およびN-アセチルガラクトサミン三量体からなる群より選択される、[16]記載の組成物。
[18] 薬物動態調節剤が、16個以上の炭素原子を有する疎水性基、16〜20個の炭素原子を有する疎水性基、パルミトイル、ヘキサデカ-8-エノイル、オレイル、(9E,12E)-オクタデカ-9,12-ジエノイル、ジオクタノイル、およびC16-C20アシル、ならびにコレステロールからなる群より選択される、[16]記載の組成物。
[19] ASGPr標的指向部分-薬物動態調節剤標的指向部分がポリヌクレオチドに生理的に不安定な連結を介して連結されている、[16]記載の組成物。
[20] ASGPr標的指向部分および薬物動態調節剤がポリヌクレオチドに骨格分子を介して連結されている、[16]記載の組成物。
本発明のさらなる目的、特徴、および利点は、添付の図面と一緒に読めば、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。

両親媒性ポリ(ビニルエーテル)ランダムターポリマーの重合のための反応スキームである。 遺伝子ノックダウンに対するsiRNA-コレステロール結合体用量の効果を例示するグラフである。 肝臓へのsiRNA-疎水性物質結合体標的指向に対する疎水性物質のサイズの効果を例示するグラフである。 いくつかの疎水性基についての遺伝子ノックダウンに対するsiRNA-疎水性物質結合体用量の効果を例示するグラフである。 肝臓へのsiRNA-疎水性物質結合体送達に対する送達ポリマー用量の効果を例示するグラフである。 GalNAcクラスターのRNAへの連結を示す図である。 様々な薬物動態調節剤に連結したsiRNAの血漿中の残留を示すグラフである。

発明の詳細な説明
本明細書において記載するのは、改善されたRNA干渉ポリヌクレオチド標的指向部分である。本発明のポリヌクレオチド標的指向部分は、薬物動態調節剤と組み合わせた標的指向リガンドを含む。好ましい態様において、標的指向リガンドおよび薬物動態調節剤を互いに共有結合し、次いでsiRNAに共有結合する。好ましい態様において、siRNAへの連結は生理的に不安定な共有結合による。

好ましい態様において、発明者らは、疎水性基からなる薬物動態調節剤を記載する。より具体的には、薬物動態調節剤は16個以上の炭素原子を有する疎水性基からなる。例示的な適切な疎水性基は、コレステロール、パルミトイル、ヘキサデカ-8-エノイル、オレイル、(9E,12E)-オクタデカ-9,12-ジエノイル、ジオクタノイル、およびC16〜C20アシルを含む群より選択してもよい。16個未満の炭素原子を有する疎水性基はポリヌクレオチド標的指向を増強する上で有効性が低い。

ポリヌクレオチド標的指向部分として有用な薬物動態調節剤は、それぞれ直鎖、分枝、または環式でありうる、コレステロール、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基からなる群より選択してもよい。薬物動態調節剤は好ましくは、炭素および水素原子だけを含む炭化水素である。しかし、疎水性を維持する置換またはヘテロ原子、例えばフッ素は許容されうる。

標的指向リガンドおよび薬物動態調節剤を骨格分子を通じて連結し、標的指向リガンド-薬物動態調節剤標的指向部分を生成する。標的指向部分骨格は、標的指向リガンドの薬物動態調節剤への連結を可能にし、さらにRNAiポリヌクレオチドへの結合を可能にする、任意の小分子でありうる。例示的な骨格はリジンまたはオルニチンである。リジンまたはオルニチン分子は、これらを通じて標的指向リガンドと薬物動態調節剤とが結合しうる2つのアミン基およびこれを通じてRNAiポリヌクレオチドへの結合が作成されうるカルボキシル基を含む。例えば、ガラクトースクラスターおよびsiRNAポリヌクレオチドに共有結合しうる薬物動態調節剤を合成することも可能である。

インビボでRNA干渉（RNAi）ポリヌクレオチドを哺乳動物の標的細胞に送達するための改善された方法を本明細書において記載する。従来、ポリヌクレオチドのインビボ送達はポリヌクレオチドの送達媒体との物理的結合を必要とした。ポリヌクレオチドは、ポリカチオン/核酸複合体のように送達媒体と静電的に結合されているか、リポソームおよび安定な核酸-脂質粒子（SNALP）のように送達媒体によって封入されているか、またはDynamic PolyConjugate（Rozema et al. 2007）のように送達媒体に共有結合されているかのいずれかであった。驚くべきことに、発明者らは、適当なRNAiポリヌクレオチド結合体分子および適当な標的指向送達ポリマーを用いることにより、RNAiポリヌクレオチドを送達ポリマーから分離し、なおポリヌクレオチドの効率的な肝実質細胞送達を達成することができることを見いだした。

ポリヌクレオチドの送達ペプチドからの分離は、製剤、合成、および製造における利点を提供する。

a）ポリヌクレオチドとポリマーが、共有結合または電荷-電荷相互作用のいずれかにより結合されているという必要条件を取り除くことにより、ポリマーおよびポリヌクレオチドの濃度およびそれらの間の比は、結合した複合体の溶解性または複合体を製造する能力ではなく、成分の溶解性によってのみ制限される。溶解性の上昇によりポリヌクレオチドまたは送達ポリマー濃度の上昇と、したがって用量の上昇を可能にする。

b）ポリヌクレオチドおよび送達ポリマーを投与の前の任意の時点で混合してもよく、または別々に投与してもよい。したがって、分離により成分を溶液または乾燥状態のいずれかで別々に保存することが可能となる。

c）より大きい、本質的に不安定な非共有結合送達システムに比べて、より小さい、より安定な製剤が可能である。

d）マスクした送達ポリマーの製造は、共有結合した負に荷電したポリヌクレオチド非存在下または負に荷電したポリヌクレオチドを共有結合する必要性なしで、より容易である。

e）製造は、ポリヌクレオチドの送達ポリマーとの物理的結合非存在下で単純化され、より少ない段階を必要とする。

本発明は、下記の一般構造の結合体送達システムを含む：
(M¹-L)_x-P-(L-M²)_yプラスN-T、
式中、NはRNAiポリヌクレオチドであり、Tは標的指向リガンド-薬物動態調節剤ポリヌクレオチド標的指向部分であり、Pは膜活性ポリアミンであり、かつマスキング剤M¹は、マレアマート連結などの生理的に可逆的な連結Lを介してPに共有結合されている、標的指向部分（肝臓への送達のためにアシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有する、ガラクトースまたはガラクトース誘導体など）を含む。Lの切断はポリアミンP上の非修飾アミンを復旧する。マスキング剤M²は任意である。存在する場合、M²は、マレアマート連結などの生理的に可逆的な連結Lを介してPに共有結合されている、親水性立体安定化部分である。xおよびyはそれぞれ整数である。その非修飾状態で、Pは膜活性ポリアミンである。ポリヌクレオチドのインビボ送達に適した膜活性ポリアミンは当技術分野において述べられている。送達ポリマー(M¹-L)_x-P-(L-M²)_yは膜活性ではない。M¹および任意にM²の結合によるPアミンの可逆的修飾は、Pの膜活性を可逆的に阻害または不活化し、Pの正味の正電荷を低減する。十分なマスキング剤をPに結合して、ポリマーの膜活性を阻害する。x＋yは、任意のマスキング剤非存在下でのP上のアミンの量により判定して、ポリアミンP上のアミンの50％よりも大きい、より好ましくは60％よりも大きい、より好ましくは70％よりも大きい値を有する。Pがメリチンなどの膜活性ペプチドの場合、x＋yは、任意のマスキング剤非存在下でのP上のアミンの量により判定して、ポリアミンP上のアミンの80％よりも大きい、より好ましくは90％よりも大きい値を有する。可逆的連結Lの切断後、非修飾アミンが復旧し、それによりPをその非修飾、膜活性状態に戻す。可逆的連結Lの可逆的結合は、切断が所望の組織、臓器、または細胞下部位に存在するものなどの、所望の生理的条件において起こるように選択する。好ましい可逆的連結はpHに不安定な連結である。(M¹-L)_x-P-(L-M²)_y、ASGPrを標的とする可逆的にマスクした膜活性ポリマー（マスクしたポリマー）、およびT-N、ポリヌクレオチド結合体を別々に合成または製造する。TもNもP、L、M¹またはM²に直接または間接的に共有結合されていない。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド結合体のマスクした、またはマスクしていないポリマーとの静電的また疎水性結合は、ポリヌクレオチドのインビボ肝送達に必要とされていない。マスクしたポリマーおよびポリヌクレオチド結合体は同じ容器または別々の容器で供給することができる。これらは投与の前に混合してもよく、同時投与してもよく、または逐次投与してもよい。

ポリマー
本発明のポリマーは両親媒性膜活性ポリアミンである。ポリマーはモノマーと呼ばれるより小さい単位を繰り返し結合することにより構築される分子である。ポリマーは単一のモノマーを用いるホモポリマーでもありえ、またはポリマーは複数の異なるモノマーを用いるコポリマーもしくはヘテロポリマーでもありうる。ポリマーの主鎖は、その結合がポリマー長の伸長のために必要とされる原子からなる。ポリマーの側鎖は、その結合がポリマー長の伸長のために必要とされない原子からなる。

より具体的には、本発明のポリマーは両親媒性膜活性ランダムコポリマーである。ランダムコポリマーのモノマーは規定された、または主鎖に沿った配列を持たず、例えば、-A_x-B_y-または-A_x-B_y-C_z-と書く。そのようなポリマーの一般的組成はインプットモノマーの比を反映する。しかし、1つのモノマーのもう1つのモノマーに対する正確な比は鎖間で異なる。モノマーの分布も1つのポリマーの長さに沿って異なりうる。同様に、モノマーの化学的性質がそのランダムコポリマーへの組み込み率およびそのポリマー内の分布に影響することもある。ランダムポリマーにおけるモノマーの比はモノマーのインプット比に依存するが、インプット比は組み込まれたモノマーの比に正確にマッチしないこともある。

両親媒性
両親媒性（amphipathic）、または両親媒性（amphiphilic）ポリマーは当技術分野において周知で、認められており、親水性（極性、水溶性）および疎水性（非極性、親油性、水不溶性）基または部分の両方を有する。

親水性基は、質的な用語で、化学部分が水を好むことを示す。典型的には、そのような化学基は水溶性であり、水との水素結合供与体または受容体である。親水性基は荷電または非荷電でありうる。荷電基は正に荷電（アニオン）もしくは負に荷電（カチオン）または両方（両性イオン）でありうる。親水性基の例には、以下の化学部分が含まれる：炭化水素、ポリオキシエチレン、特定のペプチド、オリゴヌクレオチド、アミン、アミド、アルコキシアミド、カルボン酸、硫黄、およびヒドロキシル。

疎水性基は、質的な用語で、化学部分が水を避けることを示す。典型的には、そのような化学基は水溶性ではなく、水素結合を形成しない傾向にある。親油性基は脂肪、油、脂質、および非極性溶媒に溶解し、水素結合を形成する能力はほとんど、またはまったくない。複数の炭素原子を含む炭化水素、特定の置換炭化水素、コレステロール、およびコレステロール誘導体は疎水性基および化合物の例である。

両親媒性ポリマーに関して、本明細書において用いられる部分とは、一つの共有結合が切断され、水素で置換されたときに誘導される分子と定義される。例えば、ブチルアミンにおいて、炭素と窒素との間の結合の切断、および水素による置換は、アンモニア（親水性）およびブタン（疎水性）を生じる。1,4-ジアミノブタンが窒素-炭素結合で切断され、水素で置換されると、得られる分子はここでもアンモニア（2×）およびブタンである。しかし、1,4-ジアミノブタンは、疎水性部分の生成が2つの結合の切断を必要とするため、両親媒性とは考えられない。

本明細書において用いられる表面活性ポリマーは、水の表面張力および/または他の相との界面張力を低下させ、したがって、液体/蒸気界面で積極的に吸着される。表面活性の性質は通常は、物質の分子が両親媒性（amphipathic）または両親媒性（amphiphilic）であるという事実による。

膜活性
本明細書において用いられる膜活性ポリマーは、生体膜に対して以下の効果の1つまたは複数を誘導することができる、表面活性、両親媒性ポリマーである：非膜透過性分子が細胞に侵入する、もしくは膜を通過することを可能にする、膜の変化もしくは破壊、膜における孔形成、膜の分裂、または膜の破壊もしくは溶解。本明細書において用いられる膜、または細胞膜は、脂質二重層を含む。膜の変化または破壊は、以下の検定の少なくとも1つにおいてポリマーの活性により機能的に規定することができる：赤血球溶解（溶血）、リポソーム漏出、リポソーム融合、細胞融合、細胞溶解、およびエンドソーム放出。細胞膜の溶解を引き起こしうる膜活性ポリマーは、膜溶解性ポリマーとも呼ぶ。原形質膜よりもエンドソームまたはリソソームの破壊を優先的に引き起こすポリマーはエンドソーム溶解性と考えられる。膜活性ポリマーの細胞膜に対する効果は一時的でありうる。膜活性ポリマーは、膜に対する親和性を有し、二重層構造の変性または変形を引き起こす。膜活性ポリマーは合成または非天然両親媒性ポリマーでありうる。

本明細書において用いられる膜活性ポリマーは、HIV TATタンパク質由来のアルギニンを多く含むペプチド、アンテナペディアペプチド、VP22ペプチド、トランスポータン、アルギニンを多く含む人工ペプチド、小さいグアニジニウムを多く含む人工ポリマーなどの化合物によって表される、細胞透過性ペプチドまたはポリマーと呼ばれるポリマーのクラスとは異なる。細胞透過性化合物は、見かけ上エンドサイトーシスを必要とすることなく、また膜の完全性を妨害することなく、いくつかの分子を、脂質二重層の一方の側から脂質二重層の他の側へと膜を通過して輸送するようであるが、それらのメカニズムは不明である。

ポリヌクレオチドの細胞への送達は、膜に孔を形成する、またはエンドソームもしくはリソソーム小胞を破壊し、それにより小胞の内容物を細胞質中に放出させることを含む、原形質膜または内部の小胞膜（エンドソームまたはリソソームなど）を破壊または不安定化する、膜活性ポリマーによって仲介される。

エンドソーム溶解性
エンドソーム溶解性ポリマーは、pHの変化に反応して、エンドソームの破壊もしくは溶解を引き起こす、またはポリヌクレオチドもしくはタンパク質などの通常は細胞膜不透過性の化合物の、エンドソームもしくはリソソームなどの細胞内部の膜封入小胞からの放出を提供することができるポリマーである。エンドソーム溶解性ポリマーは、生理的に適切なpH範囲（通常はpH5.5〜8）にわたって、それらの物理化学的性質のシフトを起こす。このシフトは、電荷、疎水性、または親水性におけるシフトの結果としての、ポリマーの溶解性または他の化合物もしくは膜と相互作用する能力における変化でありうる。例示的エンドソーム溶解性ポリマーは、pHに不安定な基または結合を有する。したがって、マスキング剤がpHに不安定な結合を介してポリマーに結合している、可逆的にマスクした膜活性ポリマーは、エンドソーム溶解性ポリマーであると考えることができる。

メリチンは、天然のハチ毒中にみられる小さい両親媒性膜活性ペプチドである。メリチンは生体原料から単離することもでき、または合成品であってもよい。合成ポリマーは「人による」化学的プロセスによって調合または製造され、天然の生体プロセスによって生成されるものではない。本明細書において用いられるメリチンは、例えば、以下の種の毒液中で見いだすことができるメリチンファミリーの天然ハチ毒ペプチドを含む：セイヨウミツバチ（Apis mellifera）、トウヨウミツバチ（Apis cerana）、クロスズメバチの一種（Vespula maculifrons）、スズメバチの一種（Vespa magnifica）、スズメバチの一種（Vespa velutina nigrithorax）、アシナガバチの一種（Polistes sp. HQL-2001）、コミツバチ（Apis florae）、オオミツバチ（Apis dorsata）、トウヨウミツバチ（Apis cerana cerana）、アシナガバチ（Polistes hebraeus）。本明細書において用いられるメリチンは、天然メリチンペプチドと同一、または類似のアミノ酸配列を有する合成ペプチドも含む。具体的には、メリチンアミノ酸配列は表1に示すものを含む。合成メリチンペプチドは、天然のL型アミノ酸または鏡像異性のD型アミノ酸（インベルソ（inverso））を含むことができる。しかし、メリチンペプチドは基本的に全L型または全D型アミノ酸のいずれかを含むべきである。メリチンアミノ酸配列は逆にすることもできる（レトロ（retro））。レトロメリチンはL型アミノ酸またはD型アミノ酸（レトロインベルソ）を有しうる。2つのメリチンペプチドを共有結合してメリチン二量体を生成することもできる。メリチンは、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに結合された修飾基を有しうる。しかし、本明細書において用いられるメリチンは、互いに、またはもう一つのポリマーもしくは骨格に共有結合された、3つ以上のメリチンペプチドを含む鎖またはポリマーを含まない。

疎水性基は好ましくは炭素および水素原子だけを含む炭化水素である。しかし、疎水性を維持し、例えば、フッ素を含む非極性置換または非極性ヘテロ原子が認められることもある。この用語は脂肪族基、芳香族基、アシル基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基を含み、これらはそれぞれ直鎖、分枝、または環状であってもよい。疎水性基なる用語は、ステロール、ステロイド、コレステロール、ならびにステロイドおよびコレステロール誘導体も含む。本明細書において用いられる低級疎水性モノマーまたは基は、2から6個の炭素原子を有する疎水性基を含む。本明細書において用いられる中級疎水性モノマーまたは基は、7から11個の炭素原子を有する疎水性基を含む。本明細書において用いられる高級疎水性モノマーまたは基は、12から36個またはそれ以上の炭素原子を有する疎水性基を含む。

アミン基の疎水性基に対する比は、膜破壊活性を有する水溶性ポリマーを生成するように選択する。本発明の好ましい膜活性ポリマーは、≧1mg/ml、≧5mg/ml、≧10mg/ml、≧15mg/ml、≧20mg/ml、≧25mg/ml、および≧30mg/mlで水溶性である。本発明の好ましい膜活性ポリマーは、表面活性である。本発明の膜活性ポリマーは、好ましくは約3kDaから約300kDaのサイズ範囲である。ポリマーは両親媒性であるため、水性溶液中で自己会合し、臨界会合濃度は≦1mg/mlである。

一つの態様において、膜活性ポリアミンターポリマーのモノマー組み込み比は約4〜8アミンモノマー：3〜5低級疎水性モノマー：1高級疎水性モノマーである。もう一つの態様において、膜活性ポリアミンのモノマー組み込み比は約5.4〜7.5アミンモノマー：3〜3.5低級疎水性モノマー：1高級疎水性モノマーである。もう一つの態様において、膜活性ポリアミンのモノマー組み込み比は約6アミンモノマー対約3低級疎水性モノマー対約1高級疎水性モノマーである。一つの態様において、疎水性モノマーの疎水性基はアルキル基からなる。

一つの態様において、アミン/低級疎水性基コポリマーを、約4〜8アミンモノマー：約3〜5低級アルキルモノマーの供給比でモノマーを用いて合成する。もう一つの態様において、アミン/低級疎水性基コポリマーを、約15アミンモノマー：4低級疎水性基モノマーの供給比でモノマーを用いて合成することができる。

一つの態様において、アミン/低級疎水性基/高級疎水性基ターポリマーを、約4〜8アミンモノマー：約3〜5低級アルキルモノマー：1高級アルキルモノマーの供給比でモノマーを用いて合成する。もう一つの態様において、アミン/低級疎水性基/高級疎水性基ターポリマーを、約15アミンモノマー：4低級疎水性基モノマー：1高級疎水性基モノマーの供給比でモノマーを用いて合成することができる。

一つの態様において、特に適切な膜活性ポリアミンは、アミン含有モノマー、ブチル含有モノマーおよび高級疎水性基含有モノマーを有するコポリマーを含み、ここで高級疎水性基は12〜18個の炭素原子を含む。特に適切な膜活性ポリアミンは、ポリ(ビニルエーテル)ランダムターポリマーまたはポリ(アクリラート)ランダムターポリマーを含む。

マスキング
本発明の送達ポリマーは、可逆的修飾が膜活性を阻害し、ポリアミンを中和して正電荷を低減し、ほぼ中性電荷のポリマーを生成し、細胞型特異的標的指向を提供し、かつポリマーの非特異的相互作用を阻害する、可逆的に修飾した両親媒性膜活性ポリアミンを含む。ポリアミンはポリアミン上のアミンの可逆的修飾を通じて可逆的に修飾する。

本発明の膜活性ポリアミンは、形質膜またはリソソーム/エンドサイトーシス膜を破壊することが可能である。この膜活性はポリヌクレオチドの細胞送達にとって必須の特徴である。しかし、ポリマーをインビボで投与すると、膜活性は毒性につながる。ポリアミンはインビボで多くのアニオン成分とも容易に相互作用し、望まれない生体破壊につながる。したがって、ポリアミンの膜活性の可逆的マスキングはインビボでの使用のために必須である。このマスキングは、マスキング剤を膜活性ポリアミンに可逆的に結合して、可逆的にマスクした膜活性ポリマー、すなわち送達ポリマーを生成することにより達成される。膜活性の阻害に加えて、マスキング剤はポリマーを非特異的相互作用から遮蔽し、血清相互作用を低減し、循環時間を増大させ、かつ細胞特異的相互作用、すなわち標的指向を提供する。

全般的に、マスキング剤がポリマーの膜活性を阻害し、ポリマーを非特異的相互作用から遮蔽し（血清相互作用を低減し、循環時間を増大させ）、かつインビボでの肝実質細胞標的指向を提供することは、マスキング剤の必須の特徴である。膜活性ポリアミンは非修飾（マスクしていない）状態で膜活性であり、修飾（マスクした）状態で膜活性ではない（不活性化）。所望のレベルの不活化を達成するのに十分な数のマスキング剤をポリマーに連結する。マスキング剤の結合によるポリマーの所望のレベルの修飾は、適当なポリマー活性検定を用いて容易に判定される。例えば、ポリマーが所定の検定において膜活性を有するならば、その検定において膜活性の所望のレベルの阻害を達成するのに十分なレベルのマスキング剤をポリマーに連結する。マスキングは、いかなるマスキング剤も非存在下で、ポリマー上のアミンの定量により判定して、ポリマー上のアミン基の≧50％、≧60％、≧70％、または≧80％の修飾を必要とする。マスキング剤のポリマーへの結合がポリマーの正電荷を低減し、したがってより中性の送達ポリマーを生成することも、マスキング剤の好ましい特徴である。マスクしたポリマーが水溶性を保持していることが望ましい。

本明細書において用いられる膜活性ポリアミンは、修飾ポリマーが膜活性を示さず、インビボで細胞特異的（すなわち、肝実質細胞）標的指向を示す場合、マスクされている。膜活性ポリアミンは、マスキング剤をポリマーに連結している結合の切断がポリマー上のアミンを復旧させ、それにより膜活性を復旧させる場合、可逆的にマスクされている。

マスキング剤が膜活性ポリアミンに生理的に可逆的な結合を通じて共有結合していることも、もう一つの必須の特徴である。生理的に可逆的な連結または結合を用いることにより、マスキング剤をインビボでポリマーから切断し、それによりポリマーのマスクを除去し、マスクしていないポリマーの活性を復旧することができる。適当な可逆的連結を選択することにより、所望の細胞型または細胞部位に送達または標的指向させられた後に膜活性ポリマーの活性を復旧する結合体を生成することが可能である。連結の可逆性は、膜活性ポリマーの選択的活性化を提供する。可逆的共有結合は、生理的に不安定な結合、細胞生理的に不安定な結合、pHに不安定な結合、pHに非常に不安定な結合、およびpHに極度に不安定な結合からなる群より選択されうる、可逆的または不安定な結合を含む。

本発明の好ましいマスキング剤は、水溶液中でポリマーを修飾（ポリマーと可逆的結合を形成）することができる。好ましいアミン反応性基は二置換無水マレイン酸を含む。好ましいマスキング剤は下記の構造で表される：

式中、R¹はメチル（-CH₃）基、エチル（-CH₂CH₃）基、またはプロピル（-CH₂CH₂CH₃）基などのアルキル基であり（置換アルキル無水マレイン酸を形成する）、かつR²は標的指向リガンドまたは立体安定化部分を含む。

一つの態様において、標的指向リガンドはASGPr標的指向部分を含む。別の態様において、立体安定化部分はPEGを含む。

膜活性ポリアミンは、過剰のマスキング剤存在下でマスキング剤に結合することができる。過剰のマスキング剤は送達ポリマーの投与前に結合送達ポリマーから除去してもよい。

立体安定化部分
本明細書において用いられる立体安定化部分は、立体安定化部分を含まないポリマーに比べて、それが結合しているポリマーの分子内または分子間相互作用を防止または阻害する、非イオン性親水性ポリマー（天然、合成、または非天然のいずれか）である。立体安定化部分は、それが結合しているポリマーが静電相互作用に参加することを妨害する。静電相互作用は、正電荷と負電荷との間の引力による、複数の物質の非共有結合である。立体安定化部分は血液成分との相互作用を阻害し、したがって細網内皮系によるオプソニン作用、食作用、および取り込みを阻害することができる。したがって、立体安定化部分は、それらが結合している分子の循環時間を延長することができる。立体安定化部分はポリマーの凝集も阻害しうる。好ましい立体安定化部分はポリエチレングリコール（PEG）またはPEG誘導体である。本明細書において用いられる好ましいPEGは、約1〜500のエチレングリコールモノマー、2〜20のエチレングリコールモノマー、5〜15のエチレングリコールモノマー、または約10のエチレングリコールモノマーを有しうる。本明細書において用いられる好ましいPEGは、約85〜20,000ダルトン（Da）、約200〜1000Da、約200〜750Da、または約550Daの分子量平均も有しうる。本明細書において用いられる立体安定化部分は水溶液中で、立体安定化部分を含まないポリマーに比べて、それが結合しているポリマーの分子内または分子間相互作用を防止または阻害する。

リガンド
標的指向基、または標的指向リガンドは、ポリマーまたは化合物を標的細胞もしくは組織、または特定の細胞型に標的指向させる、または送達するために用いる。標的指向基は分子の標的細胞との結合を増強する。したがって、標的指向基はそれらが結合している結合体の薬物動態または生体内分布特性を増強して、結合体の細胞分布および細胞取り込みを改善しうる。1つまたは複数の標的指向基を膜活性ポリマーに、直接またはスペーサーによる連結を介してのいずれかで連結することができる。標的指向リガンドなどの標的指向基の細胞または細胞受容体への結合はエンドサイトーシスを開始しうる。標的指向基は一価、二価、三価、四価でありえ、またはそれ以上の結合価を有しうる。標的指向基は、細胞表面分子に親和性を有する化合物、細胞受容体リガンド、ならびに細胞表面分子に親和性を有する抗体、抗体断片、および抗体様物質を含む群より選択してもよい。好ましい標的指向基は、細胞受容体リガンドを含む。薬物および遺伝子に細胞および特定の細胞受容体を標的とさせるために、様々なリガンドが用いられてきた。細胞受容体リガンドは、炭水化物、グリカン、糖質（ガラクトース、ガラクトース誘導体、マンノース、およびマンノース誘導体を含むが、それらに限定されるわけではない）、ビタミン、葉酸、ビオチン、アプタマー、およびペプチド（RGD含有ペプチド、インスリン、EGF、およびトランスフェリンを含むが、それらに限定されるわけではない）を含む群より選択してもよい。標的指向基の例には、アシアロ糖タンパク質またはガラクトース残基を用いることにより、アシアロ糖タンパク質受容体を標的とするものが含まれる。例えば、肝臓の肝実質細胞はASGP受容体を含む。したがって、肝実質細胞を標的とするためにガラクトース含有標的指向基を用いてもよい。ガラクトース含有標的指向基には、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン、オリゴ糖、および糖類クラスター（Tyr-Glu-Glu-(アミノヘキシルGalNAc)₃、リジン系ガラクトースクラスター、およびコラン系ガラクトースクラスターなど）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。さらに適切な結合体には、アシアロ糖タンパク質受容体（ASGP-R）上で見いだされる炭水化物認識ドメイン（CRD）に結合しうるオリゴ糖が含まれうる。オリゴ糖および/または炭水化物複合体を含む結合体部分の例は、米国特許第6,525,031号に提供されている。

ASGPr標的指向部分
標的指向部分または基は、それらが結合している結合体の薬物動態または生体分布特性を増強して、結合体の細胞特異的分布および細胞特異的取り込みを改善する。ガラクトースおよびガラクトース誘導体は、肝実質細胞表面上で発現されるアシアロ糖タンパク質受容体（ASGPr）へのそれらの結合を通じて、インビボで分子を肝実質細胞へと標的指向させるために用いられてきた。本明細書において用いられるASGPr標的指向部分は、ガラクトースおよびガラクトースと等しいか、またはそれよりも大きいASGPrへの親和性を有するガラクトース誘導体を含む。ガラクトース標的指向部分のASGPrへの結合は、送達ポリマーの肝実質細胞への細胞特異的標的指向および送達ポリマーの肝実質細胞へのエンドサイトーシスを促進する。

ASGPr標的指向部分は、ラクトース、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン（GalNAc）、ガラクトサミン、N-ホルミルガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-プロピオニルガラクトサミン、N-n-ブタノイルガラクトサミン、およびN-イソブタノイルガラクトサミンからなる群より選択されてもよい（Iobst, S.T. and Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271, 6686）。ASGPr標的指向部分はモノマー（例えば、1つのガラクトサミンを有する）またはマルチマー（例えば、複数のガラクトサミンを有する）の部分でありうる。

いくつかの態様において、ガラクトース標的指向部分を、下記の構造で例示するとおり、PEGリンカーを通じてアミン反応性基に連結する：

式中、nは1から19の間の整数である。

一つの態様において、膜活性ポリアミンを、ASGPr標的指向部分マスキング剤のポリアミン上のアミンの≧50％、≧60％、≧70％、または≧80％への結合により可逆的にマスクする。もう一つの態様において、膜活性ポリアミンを、ASGPr標的指向部分マスキング剤およびPEGマスキング剤のポリアミン上のアミンの≧50％、≧60％、≧70％、または≧80％への結合により可逆的にマスクする。もう一つの態様において、ASGPr標的指向部分マスキング剤は、PEGリンカーを介してアミン反応性基に連結されたASGPr標的指向部分を含む。ASGPr標的指向部分マスキング剤およびPEGマスキング剤の両方による膜活性ポリアミンマスキングのために、PEG対ASGPr標的指向部分の比は約0〜4：1、より好ましくは約0.5〜2：1である。もう一つの態様において、約1のガラクトース誘導体マスキング剤に対して約1.3〜2のPEGマスキング剤がある。

表面電荷
ゼータ電位は、懸濁液中の粒子が示す物理的性質であり、表面電荷に密接に関連している。水性媒質中で、試料のpHはゼータ電位に影響をおよぼす最も重要な因子の1つである。電荷が塩基/酸のプロトン化/脱プロトン化に基づいている場合、電荷はpHに依存する。したがって、ゼータ電位の値が意味を持つためには、溶液の状態、特にpHを含まなければならない。典型的な粒子について、ゼータ電位の大きさはコロイド系の潜在的安定性の指標となる。懸濁液中のすべての粒子が大きい負または正のゼータ電位を有する場合、これらは互いに反発する傾向があり、粒子が一緒になる傾向はないであろう。しかし、粒子が低いゼータ電位値を有する場合、粒子が一緒になって凝集するのを防ぐ力はないであろう。典型的な粒子の安定懸濁液と不安定懸濁液との間の一般的境界線は、一般には+30または-30mVのいずれかとされる。+30mVよりも正または-30mVよりも負のゼータ電位を有する粒子は通常は安定と考えられる。記載の発明の送達ポリマーは、生理的塩およびpH8で20mVから-20mVのゼータ電位を示すが、水溶液中でコロイドとして安定であり、凝集しない。

膜活性ポリアミンの正電荷、またはゼータ電位は、マスキング剤での修飾により低下する。ポリマー電荷、特に正電荷は、血清成分または非標的細胞と望まれない相互作用を引き起こしうる。正の表面電荷は、ポリマーの負に荷電した細胞膜との相互作用を増強することにより、膜活性においても役割を果たす。したがって、インビボでのポリヌクレオチドの送達のために、ほぼ中性の正味の電荷またはゼータ電位を有する送達ポリマーが好ましい。本発明の送達ポリマー、ASGPr標的指向部分マスキング剤および立体安定化部分マスキング剤の可逆的結合によりマスクした膜活性ポリアミンは、ほぼ中性の見かけの表面電荷を有し、血清中で安定である。より具体的には、本発明の送達ポリマーは、pH8で測定して+30から-30mVの間、+20から-20mVの間、+10から-10mVの間、または+5から-5mVの間のゼータ電位を有する。pH7では、結合体の正味の電荷はpH8よりも正であると予想される。正味の電荷、または表面電荷は、インビボ適用のための重要な因子である。

不安定な連結
連結またはリンカーは、関心対象の1つの化学基または区分を関心対象のもう一つの化学基または区分に、1つまたは複数の共有結合を介して連結する、2つの原子間の接続である。例えば、連結はマスキング剤をポリマーに接続することができる。連結の形成は2つの別々の分子を1つの分子に接続することもあり、または同じ分子内の2つの原子を接続することもある。連結は中性電荷でもよく、または正もしくは負の電荷を有していてもよい。可逆的または不安定な連結は可逆的または不安定な結合を含む。連結は任意に2つのつなぎ合わせた原子間の距離を延ばすスペーサーを含んでいてもよい。スペーサーは連結に柔軟性および/または長さをさらに加えうる。スペーサーには、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、アラルキニル基が含まれるが、それらに限定されるわけではなく；これらはそれぞれ1つまたは複数のヘテロ原子、複素環、アミノ酸、ヌクレオチド、および糖類を含みうる。スペーサー基は当技術分野において周知で、前述のリストは本発明の範囲を制限する意図はない。

可逆的または不安定な結合は、同じ分子内の他の共有結合を分解または切断しない条件下で選択的に分解または切断されうる、水素原子への共有結合以外の共有結合である。より具体的には、可逆的または不安定な結合は、適切な条件下で同じ分子内の他の不安定でない共有結合よりも安定性が低い（熱力学的に）、またはより速やかに分解される（動力学的に）共有結合である。分子内の不安定な結合の切断は、2つの分子の生成を引き起こしうる。当業者にとって、結合の切断または不安定性は一般には結合切断の半減期（t_1/2）（結合の半分が切断するのに要する時間）によって議論される。したがって、可逆的または不安定な結合は、分子内の他の結合よりも速やかに選択的に切断されうる結合を含む。

適切な条件は不安定な結合の型によって決まり、有機化学において周知である。不安定な結合はpH、酸化もしくは還元条件もしくは物質、温度、塩濃度、酵素の存在（ヌクレアーゼ、およびプロテアーゼを含むエステラーゼなど）、または添加した物質の存在に対して感受性でありうる。例えば、pH上昇または低下はpHに不安定な結合に対する適切な条件である。

不安定な基が変換を起こす速度は、不安定な基を含む分子の化学成分を変えることによって制御することができる。例えば、不安定な基の近くに特定の化学部分（例えば、電子受容体または供与体）を付加することで、化学変換が起こる特定の条件（例えば、pH）に影響をおよぼしうる。

本明細書において用いられる生理的に不安定な結合は、哺乳動物の体内で通常遭遇する条件、または遭遇するものに類似の条件下で切断可能な不安定な結合である。生理的に不安定な連結基は、特定の生理的条件にある場合に化学変換（例えば、切断）を起こすように選択される。

本明細書において用いられる細胞生理的に不安定な結合は、哺乳動物の細胞内条件下で切断可能な不安定な結合である。哺乳動物の細胞内条件には、哺乳動物の細胞において見られる、または遭遇するものに類似の、pH、温度、酸化または還元条件または物質、および塩濃度などの化学的条件が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解または加水分解酵素などの、哺乳動物の細胞において通常存在する酵素活性の存在も含まれる。細胞生理的に不安定な結合は、薬学的に許容される外因性物質の投与に反応して切断されてもよい。半減期が45分未満で適切な条件下で切断される生理的に不安定な結合は、非常に不安定であると考えられる。半減期が15分未満で適切な条件下で切断される生理的に不安定な結合は、極度に不安定であると考えられる。

化学変換（不安定な結合の切断）は、薬学的に許容される物質の細胞への添加によって開始されてもよく、または不安定な結合を含む分子が適切な細胞内および/または細胞外環境に到達した場合に自然に起こってもよい。例えば、pHに不安定な結合は、分子が酸性化されたエンドソームに入ると切断されうる。したがって、pHに不安定な結合はエンドソームで切断可能な結合であると考えられる。酵素切断可能結合は、エンドソームもしくはリソソームまたは細胞質に存在するものなどの酵素に曝露された場合に切断されうる。ジスルフィド結合は、分子が細胞質のより還元性の環境に入った場合に切断されうる。したがって、ジスルフィドは細胞質で切断可能な結合であると考えられる。

本明細書において用いられるpHに不安定な結合は、酸性条件（pH＜7）下で選択的に分解される不安定な結合である。細胞エンドソームおよびリソソームは7未満のpHを有するため、そのような結合はエンドソームで不安定な結合と呼んでもよい。pHに不安定ななる用語は、pHに不安定、pHに非常に不安定、およびpHに極度に不安定な結合を含む。

無水物のアミンとの反応はアミドおよび酸を生成する。多くの無水物にとって、逆反応（無水物およびアミンの生成）は非常に遅く、エネルギー的に好ましくない。しかし、無水物が環状無水物である場合、アミンとの反応はアミド酸、すなわちアミドおよび酸が同じ分子内にある分子を生じる。同じ分子内に両方の反応性基（アミドおよびカルボン酸）が存在することで、逆反応が加速される。特に、一級アミンの無水マレイン酸および無水マレイン酸誘導体との生成物であるマレアミド酸は、その非環式類縁体よりも1×10⁹から1×10¹³倍速くアミンおよび無水物に逆戻りする（Kirby 1980）。

アミドおよび酸を生成するアミンの無水物との反応

アミド酸を生成するアミンの環状無水物との反応

アミンおよび無水物を生成するアミド酸の切断はpH依存的で、酸性pHで大幅に加速される。このpH依存的反応性を利用して可逆的なpHに不安定な結合およびリンカーを生成することができる。シスアコニット酸はそのようなpH感受性リンカー分子として用いられてきた。γ-カルボキシラートをまず分子にカップリングさせる。第二段階で、αまたはβカルボキシラートのいずれかを第二の分子にカップリングさせて、2つの分子のpH感受性カップリングを生成する。このリンカーのpH5での切断の半減期は8から24時間の間である。

無水シスアコニット酸および無水マレイン酸の構造

切断が起こるpHを、不安定な部分に化学的成分を付加することにより制御する。マレアミド酸のアミンおよび無水マレイン酸への変換の速度は、無水マレイン酸系の置換（R2およびR3）に強く依存する。R2がメチルである場合、変換の速度はR2およびR3が水素である場合よりも50倍速い。R2およびR3の両方にアルキル置換がある場合（例えば、2,3-ジメチル無水マレイン酸）、速度の上昇は劇的であり、非置換無水マレイン酸よりも10,000倍速い。アミンの2,3-ジメチル無水マレイン酸による修飾から生成されたマレアマート結合は、pH5で4から10分の間の半減期で切断されて無水物およびアミンを復旧する。R2およびR3が水素よりも大きい基である場合、アミド酸のアミンおよび無水物への変換は、R2および/またはR3が水素である場合よりも速いと予測される。

pHに非常に不安定な結合：pHに非常に不安定な結合は45分未満のpH5での切断の半減期を有する。pHに非常に不安定な結合の構築は化学の技術分野において周知である。

pHに極度に不安定な結合：pHに極度に不安定な結合は15分未満のpH5での切断の半減期を有する。pHに極度に不安定な結合の構築は化学の技術分野において周知である。

二置換環状無水物は、マスキング剤の本発明の膜活性ポリアミンへの結合のために特に有用である。これらは生理的にpHに不安定な連結を提供し、容易にアミンを修飾し、かつ細胞エンドソームおよびリソソームで見られる低いpHでの切断によってこれらのアミンを復旧する。第二に、アミンとの反応によって作成されるαまたはβカルボン酸基は、ポリマーに対して予想される負電荷の約1/20しか寄与しないようである（Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003）。したがって、ポリアミンの二置換無水マレイン酸による修飾は、高い負電荷を有するポリマーを作成するよりもむしろ、ポリアミンの正電荷を効果的に中和する。インビボ送達のためにはほぼ中性のポリマーが好ましい。

天然ポリマーは天然に見いだしうるポリマーである。例にはポリヌクレオチド、タンパク質、コラーゲン、および多糖（デンプン、セルロース、グリコサミノグリカン、キチン、寒天、アガロース）が含まれる。天然ポリマーは生物原料から単離することもでき、または合成によるものでもよい。合成ポリマーは「人による」化学的プロセスにより調合または製造され、天然の生物学的プロセスによって作成されるのではない。非天然ポリマーは、天然（動物または植物）の材料またはモノマー（アミノ酸、ヌクレオチド、および糖類など）から作成されない合成ポリマーである。ポリマーは完全または部分的に天然、合成、または非天然であってもよい。

RNAiポリヌクレオチド結合体
発明者らは、RNAiポリヌクレオチドの標的指向リガンド-薬物動態調節剤標的指向部分への結合、およびRNAiポリヌクレオチド結合体の前述の送達ポリマーとの同時投与は、インビボでのRNAiポリヌクレオチドの改善された送達を提供することを見いだした。機能的送達とは、RNAiポリヌクレオチドが細胞に送達され、予期される生物活性である遺伝子発現の配列特異的阻害を有することを意味する。哺乳動物の脈管構造に投与された、ポリヌクレオチドを含む多くの分子は、通常は肝臓によって体から排出される。ポリヌクレオチドが体からの除去のために分解またはそれ以外に処理され、ポリヌクレオチドが遺伝子発現の配列特異的阻害を引き起こさない、肝臓によるポリヌクレオチドのクリアランスは、機能的送達とは考えない。

RNAiポリヌクレオチド結合体を、RNAiポリヌクレオチドを標的指向リガンド-薬物動態調節剤標的指向部分に共有結合することにより生成する。ポリヌクレオチドは、それが反応性基Aを含むように合成または修飾してもよい。標的指向部分は、それが反応性基Bを含むように合成または修飾してもよい。反応性基AおよびBは、それらが当技術分野において公知の方法を用いて共有結合を介して連結されうるように選択する。

標的指向部分は、RNAiポリヌクレオチドの3'または5'末端に連結してもよい。siRNAポリヌクレオチドに対し、標的指向部分はセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれに連結してもよいが、センス鎖が好ましい。いくつかの態様において、siRNAを標的指向部分に、一級アミン基などの反応性基Aを含む短いアルキル鎖を介して結合する。次いで、反応性基Aを、標的指向部分上のカルボキシル基などの反応性基Bにカップリングする。

肝臓中の肝実質細胞の標的指向に関して、好ましい標的指向リガンドはガラクトースクラスターである。ガラクトースクラスターは、2から4つの末端ガラクトース誘導体を有する分子を含む。本明細書において用いられるガラクトース誘導体なる用語は、ガラクトースおよびアシアロ糖タンパク質受容体に対してガラクトースと同等またはそれよりも大きい親和性を有するガラクトースの誘導体の両方を含む。末端ガラクトース誘導体を分子に、そのC-1炭素を通じて結合する。アシアロ糖タンパク質受容体（ASGPr）は肝実質細胞に特有で、分枝ガラクトース末端糖タンパク質に結合する。好ましいガラクトースクラスターは、それぞれアシアロ糖タンパク質受容体に親和性を有する3つの末端ガラクトサミンまたはガラクトサミン誘導体を有する。より好ましいガラクトースクラスターは、3つの末端N-アセチルガラクトサミンを有する。当技術分野において一般的な他の用語には、三分岐ガラクトース、三価ガラクトースおよびガラクトーストリマーが含まれる。三分岐ガラクトース誘導体クラスターはASGPrに、二分岐または単鎖ガラクトース誘導体構造よりも大きい親和性で結合する（Baenziger and Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620；Connolly et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945）。nMの親和性を達成するには多価が必要とされる。アシアロ糖タンパク質受容体に親和性を有する1つのガラクトース誘導体の結合は、送達ポリマーと同時投与した場合に、インビボでのRNAiポリヌクレオチドの肝実質細胞への機能的送達を可能にしない。

ガラクトースクラスターはそれぞれ中心の分枝点に連結している3つのガラクトース誘導体を含む。ガラクトース誘導体を中心分枝点に糖のC-1炭素を通じて結合する。ガラクトース誘導体を好ましくは分枝点にリンカーまたはスペーサーを介して連結する。好ましいスペーサーは柔軟な親水性スペーサーである（米国特許第5885968号；Biessen et al. J. Med. Chem. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546）。好ましい柔軟な親水性スペーサーはPEGスペーサーである。好ましいPEGスペーサーはPEG₃スペーサーである。分枝点は、3つのガラクトース誘導体の結合を可能にし、分枝点のRNAiポリヌクレオチドへの結合をさらに可能にする、任意の低分子である。例示的分枝点基はジリシンである。ジリシン分子は、それを通じて3つのガラクトース誘導体が結合する3つのアミン基、およびそれを通じてジリシンがRNAiポリヌクレオチドに結合しうるカルボキシル反応性基を含む。分枝点のRNAiポリヌクレオチドへの結合は、リンカーまたはスペーサーを通じて起こりうる。好ましいスペーサーは柔軟な親水性スペーサーである。好ましい柔軟な親水性スペーサーはPEGスペーサーである。好ましいPEGスペーサーはPEG₃スペーサー（3つのエチレン単位）である。ガラクトースクラスターは当技術分野において公知の方法を用いてRNAiポリヌクレオチドの3'または5'末端に結合してもよい。siRNAなどの2つの鎖を有するRNAiポリヌクレオチドに対し、ガラクトースクラスターはいずれの鎖に結合してもよい。

好ましいガラクトース誘導体はN-アセチルガラクトサミン（GalNAc）である。アシアロ糖タンパク質受容体に親和性を有する他の糖類は、ガラクトース、ガラクトサミン、N-ホルミルガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-プロピオニルガラクトサミン、N-n-ブタノイルガラクトサミン、およびN-イソブタノイルガラクトサミンを含むリストから選択されてもよい。多くのガラクトース誘導体のアシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性は研究されており（例えば、Iobst, S.T. and Drickamer, K. J.B.C. 1996, 271, 6686参照）、または当技術分野において典型的な方法を用いて容易に判定される。

ガラクトースクラスターの一態様

分枝点と核酸との間にPEGスペーサーを有するガラクトースクラスター

ポリヌクレオチド
ポリヌクレオチド、または核酸もしくはポリ核酸なる用語は、少なくとも2つのヌクレオチドを含むポリマーを意味する当技術分野の用語である。ヌクレオチドはポリヌクレオチドポリマーのモノマー単位である。120未満のモノマー単位を有するポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドと呼ぶことが多い。天然核酸はデオキシリボース-またはリボース-リン酸骨格を有する。非天然または合成ポリヌクレオチドは、インビトロまたは無細胞系で重合されるポリヌクレオチドで、天然リボースまたはデオキシリボース-リン酸骨格と同じまたは類似の塩基を含むが、異なる型の骨格を含みうる。ポリヌクレオチドは任意の当技術分野において公知の技術を用いて合成することができる。当技術分野において公知のポリヌクレオチド骨格には、PNA（ペプチド核酸）、ホスホロチオアート、ホスホロジアミダート、モルホリノ、および天然核酸のリン酸骨格の他の変種が含まれる。塩基にはプリンおよびピリミジンが含まれ、これらにはさらに天然化合物アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然類縁体が含まれる。プリンおよびピリミジンの合成誘導体には、アミン、アルコール、チオール、カルボキシラート、およびハロゲン化アルキルなどであるが、それらに限定されるわけではない、ヌクレオチド上に新しい反応性基を配置する修飾が含まれるが、それらに限定されるわけではない。塩基なる用語は、DNAおよびRNAの任意の公知の塩基類縁体を含む。ポリヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、または任意の適切な組み合わせを含んでいてもよい。ポリヌクレオチドはインビトロで重合してもよく、組換えでもよく、キメラ配列、またはこれらの基の誘導体を含む。ポリヌクレオチドは5'末端、3'末端、または5'および3'両末端に末端キャップ部分を含んでいてもよい。キャップ部分は、逆方向デオキシ脱塩基部分、逆方向デオキシチミジン部分、チミジン部分、または3'グリセリル修飾でありうるが、それらに限定されるわけではない。

RNA干渉（RNAi）ポリヌクレオチドは、配列特異的様式で導入遺伝子のメッセンジャーRNA（mRNA）転写物を分解またはその翻訳を阻害するための、哺乳動物細胞のRNA干渉経路機構との相互作用を通じてRNA干渉を誘導することができる分子である。2つの主なRNAiポリヌクレオチドは低分子（または短い）干渉RNA（siRNA）およびマイクロRNA（miRNA）である。RNAiポリヌクレオチドは、siRNA、マイクロRNA、二本鎖RNA（dsRNA）、短鎖ヘアピンRNA（shRNA）、およびRNA干渉を誘導しうるRNAをコードする発現カセットを含む群より選択されうる。siRNAは、典型的には15〜50塩基対、好ましくは21〜25塩基対を含み、細胞内で発現された標的遺伝子またはRNAにおけるコード配列と同じ（完全に相補的）またはほぼ同じ（部分的に相補的）ヌクレオチド配列を有する、二本鎖構造を含む。siRNAはジヌクレオチド3'オーバーハングを有していてもよい。siRNAは2つのアニールしたポリヌクレオチドまたはヘアピン構造を形成する1つのポリヌクレオチドからなっていてもよい。本発明のsiRNA分子はセンス領域およびアンチセンス領域を含む。一つの態様において、結合体のsiRNAは2つのオリゴヌクレオチド断片から構築され、ここで1つの断片はsiRNA分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含み、第二の断片はsiRNA分子のセンス領域のヌクレオチド配列を含む。もう一つの態様において、センス鎖はアンチセンス鎖に、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーなどのリンカー分子を介して接続される。マイクロRNA(miRNA）は、それらのmRNA標的の破壊または翻訳抑制を誘導する、約22ヌクレオチドの長さの小さい非コードRNA遺伝子産物である。miRNAと標的mRNAとの間の相補性が部分的である場合、標的mRNAの翻訳が抑制される。相補性が高度である場合、標的mRNAは切断される。miRNAについて、複合体は、典型的にはmiRNAと部分的相同性しか共有しないmRNAの3'UTRに通常は位置する標的部位に結合する。「シード領域」-その標的と完全な塩基対を形成する、miRNAの5'末端における約7つの連続するヌクレオチドのひと続きの配列-は、miRNA特異性において重要な役割を果たす。RISC/miRNA複合体のmRNAへの結合は、タンパク質翻訳の抑制またはmRNAの切断および分解のいずれかを引き起こしうる。最近のデータは、シード領域でのみ完全な塩基対形成を示す代わりに、miRNAおよびその標的の全長にわたり完全な相同性がある場合に、mRNA切断が優先的に起こることを示している（Pillai et al. 2007）。

RNAiポリヌクレオチド発現カセットは細胞内で転写されて、siRNA、別々のセンスおよびアンチセンス鎖直鎖siRNA、またはmiRNAとして機能しうる小さいヘアピンRNAを産生することができる。RNAポリメラーゼIII転写DNAは、U6プロモーター、H1プロモーター、およびtRNAプロモーターを含むリストから選択されるプロモーターを含む。RNAポリメラーゼIIプロモーターには、U1、U2、U4、およびU5プロモーター、snRNAプロモーター、マイクロRNAプロモーター、ならびにmRNAプロモーターが含まれる。

公知のmiRNA配列のリストは、特にWellcome Trust Sanger Institute、Penn Center for Bioinformatics、Memorial Sloan Kettering Cancer Center、およびEuropean Molecule Biology Laboratoryなどの研究組織によって維持されるデータベース中に見いだすことができる。公知の有効なsiRNA配列および同族の結合部位も関連する文献中に詳細に示されている。RNAi分子は当技術分野において公知の技術によって容易に設計され、産生される。加えて、有効かつ特異的配列モチーフを見いだす機会を高めるコンピューターツールがある（Pei et al. 2006, Reynolds et al. 2004, Khvorova et al. 2003, Schwarz et al. 2003, Ui-Tei et al. 2004, Heale et al. 2005, Chalk et al. 2004, Amarzguioui et al. 2004）。

本発明のポリヌクレオチドは化学的に修飾することができる。そのような化学的修飾の非限定例には、ホスホロチオアートヌクレオチド間連結、2'-O-メチルリボヌクレオチド、2'-デオキシ-2'-フルオロリボヌクレオチド、2'-デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、5-C-メチルヌクレオチド、および逆方向デオキシ脱塩基残基組み込みが含まれる。これらの化学的修飾は、様々なポリヌクレオチド作成物において用いる場合、細胞内でポリヌクレオチド活性を保存するが、同時にこれらの化合物の血清安定性を高めることが示されている。化学的に修飾したsiRNAは、ヒトにおけるインターフェロン活性を活性化する可能性を最小限にすることもできる。

一つの態様において、本発明の化学的に修飾したRNAiポリヌクレオチドは、2つの鎖を有する二重鎖を含み、その一方または両方は化学的に修飾されていてもよく、ここで各鎖は約19から約29ヌクレオチドである。一つの態様において、本発明のRNAiポリヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含むが、細胞または再構成したインビトロ系内部でRNAiを仲介する能力を維持している。RNAiポリヌクレオチドを修飾することができ、ここで化学修飾は1つまたは複数（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上）のヌクレオチドを含む。本発明のRNAiポリヌクレオチドは、RNAiポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの総数のパーセンテージとして修飾ヌクレオチドを含みうる。したがって、本発明のRNAiポリヌクレオチドは一般にはヌクレオチドの位置の約5から約100％（例えば、ヌクレオチドの位置の5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または100％）の修飾ヌクレオチドを含みうる。所与のRNAiポリヌクレオチド中に存在する修飾ヌクレオチドの実際のパーセンテージは、RNAiポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの総数に依存する。RNAiポリヌクレオチドが一本鎖である場合、修飾パーセントは一本鎖RNAiポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチドの総数に基づきうる。同様に、RNAiポリヌクレオチドが二本鎖である場合、修飾パーセントはセンス鎖、アンチセンス鎖、またはセンスおよびアンチセンス両方の鎖中に存在するヌクレオチドの総数に基づきうる。加えて、所与のRNAiポリヌクレオチド中に存在する修飾ヌクレオチドの実際のパーセンテージは、RNAiポリヌクレオチド中に存在するプリンおよびピリミジンヌクレオチドの総数にも依存しうる。例えば、ここでRNAiポリヌクレオチド中に存在するすべてのピリミジンヌクレオチドおよび/またはすべてのプリンヌクレオチドが修飾される。

RNAiポリペプチドは遺伝子によってコードされるRNAの発現を調節する。複数の遺伝子が互いにある程度の配列相同性を共有しうるため、RNAiポリヌクレオチドは十分な配列相同性を有する遺伝子のクラスを標的とするよう設計することができる。したがって、RNAiポリヌクレオチドは、異なる遺伝子標的の間で共有される、または特定の遺伝子標的に特有である、配列に対する相補性を有する配列を含むことができる。したがって、RNAiポリヌクレオチドは、いくつかの遺伝子間の相同性を有するRNA配列の保存領域を標的とし、それにより遺伝子ファミリー内のいくつかの遺伝子（例えば、異なる遺伝子アイソフォーム、スプライスバリアント、突然変異体遺伝子など）を標的とするよう設計することができる。もう一つの態様において、RNAiポリヌクレオチドは、1つの遺伝子の特定のRNA配列に特有な配列を標的とするよう設計することができる。

相補性なる用語は、ポリヌクレオチドが伝統的なワトソン-クリックまたは他の非伝統的な型のいずれかによりもう一つのポリヌクレオチド配列と水素結合を形成する能力を意味する。本発明のポリヌクレオチド分子に関して、ポリヌクレオチド分子のその標的（エフェクター結合部位）または相補的配列との結合自由エネルギーは、ポリヌクレオチドの関連する機能、例えば、酵素的mRNA切断または翻訳阻害を進行させるのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの判定は当技術分野において周知である（Frier et al. 1986, Turner et al. 1987）。相補性パーセントは、第二のポリヌクレオチド配列と水素結合（例えば、ワトソン-クリック塩基対形成）を形成しうる、第一のポリヌクレオチド分子の、近接鎖における塩基のパーセンテージ（例えば、10のうちの5、6、7、8、9、10は50％、60％、70％、80％、90％、および100％の相補性である）を示す。完全に相補性とは、ポリヌクレオチド配列の近接鎖中の塩基すべてが第二のポリヌクレオチド配列における同じ数の近接塩基と水素結合することを意味する。

遺伝子発現を阻害する、ダウンレギュレートする、またはノックダウンするとは、遺伝子から転写されたRNAのレベル、またはRNAから翻訳されたポリペプチド、タンパク質もしくはタンパク質サブユニットのレベルにより評価しての遺伝子の発現が、本発明の阻止ポリヌクレオチド結合体非存在下で観察されるものよりも低減されることを意味する。本発明の組成物により送達されるポリヌクレオチドによる、遺伝子発現の阻害、ダウンレギュレーション、またはノックダウンは、好ましくは対照不活性核酸、混乱した配列もしくは不活化ミスマッチを含む核酸存在下、またはマスクしたポリマーへのポリヌクレオチドの結合非存在下で観察されるレベルよりも低い。

インビボ投与
薬理学および毒性学において、投与経路は薬物、液体、毒、または他の物質を体に接触させる道である。一般に、哺乳動物を治療するための薬物および核酸の投与法は当技術分野において周知で、本発明の組成物の投与に適用することができる。本発明の化合物は、任意の適切な経路を介して、最も好ましくは非経口により、その経路に適切に合わせて作られた製剤で投与することができる。したがって、本発明の化合物は、注射により、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、または腹腔内投与することができる。したがって、本発明は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物も提供する。

投与の非経口経路には、シリンジおよび針またはカテーテルを用いる、血管内（静脈内、動脈内）、筋肉内、実質内、皮内、真皮下、皮下、腫瘍内、腹腔内、クモ膜下、硬膜下、硬膜外、およびリンパ内注射が含まれる。本明細書における血管内とは、体内の組織または臓器に接続される、血管と呼ばれる管状構造内を意味する。管状構造の腔内で、体液は体の部分に流動し、または体の部分から流動する。体液の例には、血液、脳脊髄液（CSF）、リンパ液、または胆汁が含まれる。血管の例には、動脈、細動脈、毛細血管、細静脈、洞様血管、静脈、リンパ管、胆管、および唾液腺または他の外分泌腺の管が含まれる。血管内経路には、動脈または静脈などの血管を通じての送達が含まれる。血液循環系は薬剤の全身拡散を提供する。

記載した組成物を、薬学的に許容される担体溶液中で注射する。薬学的に許容されるとは、薬理学的/毒性学的観点から哺乳動物に対して許容される特性および/または物質を意味する。薬学的に許容されるなる語句は、生理的に耐容でき、典型的には哺乳動物に投与した場合にアレルギー性または他の有害もしくは毒性反応を生じない、分子実体、組成物、および特性を意味する。好ましくは、本明細書において用いられる薬学的に許容されるなる用語は、動物、特にヒトにおいて用いるために、連邦もしくは州政府の規制機関により承認されている、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に収載されていることを意味する。

RNAiポリヌクレオチド-標的指向部分結合体を、送達ポリマーと同時投与することができる。同時投与とは、RNAiポリヌクレオチドおよび送達ポリマーを哺乳動物に、両方が哺乳動物中に同時に存在するように投与することを意味する。RNAiポリヌクレオチド-標的指向部分結合体および送達ポリマーを一斉に投与してもよく、またはこれらを逐次投与してもよい。一斉投与のために、これらを投与前に混合してもよい。逐次投与のために、RNAiポリヌクレオチド-標的指向部分結合体または送達ポリマーのいずれかをまず投与してもよい。

治療効果
RNAiポリヌクレオチドを研究目的のため、または細胞において治療的である変化を生じるために送達してもよい。RNAiポリヌクレオチドのインビボ送達は、研究試薬のため、ならびに様々な治療、診断、標的確認、ゲノム発見、遺伝子工学、および薬理ゲノミクス適用のために有用である。発明者らは、肝実質細胞における内因性遺伝子発現の阻害をもたらすRNAiポリヌクレオチド送達を開示してきた。ポリヌクレオチドの送達後に測定したレポーター（マーカー）遺伝子発現のレベルは、他のポリヌクレオチド送達後の遺伝子発現が同様のレベルであるとの合理的な予想を示している。当業者により有益と考えられる治療のレベルは疾患ごとに異なる。例えば、血友病AおよびBはそれぞれX連鎖第VIIIおよび第IX凝固因子の欠失によって引き起こされる。これらの臨床経過は第VIIIまたは第IX因子の通常の血清レベルのパーセンテージによって大きく影響される：＜2％、重度；2〜5％、中等度；および5〜30％軽度。したがって、重度患者における循環因子の通常レベルの1％から2％への上昇は有益であると考えることができる。6％よりも高いレベルは自然出血を防止するが、手術または傷害に続発するものは防止しない。同様に、遺伝子の阻害は治療的利益を提供するために100％である必要はない。遺伝子療法の当業者であれば、マーカー遺伝子の結果の十分なレベルに基づき、疾患に特異的な遺伝子発現の有益なレベルを合理的に予想するであろう。血友病の例において、マーカー遺伝子が発現されて第VIII因子の通常レベルの2体積％に匹敵するレベルでタンパク質を生じる場合、第VIII因子をコードする遺伝子も同様のレベルで発現されるであろうと合理的に予期することができる。したがって、レポーターまたはマーカー遺伝子は一般に細胞内タンパク質の発現の有用な代表例として役立つ。

肝臓は、その代謝（例えば、様々な高コレステロール血症におけるリポタンパク質代謝）および循環タンパク質の分泌（例えば、血友病における凝固因子）における中心的役割を考慮すると、遺伝子療法の最も重要な標的組織の1つである。加えて、慢性肝炎および肝硬変などの後天的障害は一般的で、ポリヌクレオチドに基づく肝臓療法によって治療できる可能性もある。肝臓に影響をおよぼす、または肝臓によって影響を受けるいくつかの疾患または状態は、肝臓における遺伝子発現のノックダウン（阻害）を通じて治療できる可能性がある。そのような肝疾患および状態は、肝臓癌（肝実質細胞癌、HCCを含む）、ウイルス感染症（肝炎を含む）、代謝障害（高脂血症および糖尿病を含む）、線維症、および急性肝傷害を含むリストから選択されうる。

投与することになる送達ポリマーおよびRNAiポリヌクレオチド結合体の量（用量）は経験的に決定することができる。発明者らは、0.1〜10mg/kg動物体重のsiRNA結合体および5〜60mg/kg動物体重の送達ポリマーを用いて、遺伝子発現の有効なノックダウンを示している。マウスにおける好ましい量は0.25〜2.5mg/kgのsiRNA結合体および10〜40mg/kgの送達ポリマーである。より好ましくは、約12.5〜20mg/kgの送達ポリマーを投与する。RNAiポリヌクレオチド結合体は典型的には大量でも非毒性であるため、その量は容易に増大させる。

本明細書において用いられるインビボとは、生物の内部で起こるもの、より具体的には、部分的または死んだものに対して、哺乳動物などの全体の生きている多細胞生物（動物）の生きている組織内または組織上で行われるプロセスを意味する。

実施例1. ポリ(ビニルエーテル)ランダムコポリマー
A. アミン含有モノマーの組み込みのためのビニルエーテルモノマー
2-ビニルオキシエチルフタルイミドを、2-クロロエチルビニルエーテル（25g、0.24mol；CAS #110-75-8）およびフタルイミドカリウム（25g、0.135mol；CAS #1074-82-4）を100℃のN,N-ジメチルホルムアミド（DMF、75ml）中、相転移触媒として臭化テトラn-ブチルアンモニウム（0.5g；CAS #1643-19-2）を用いて反応させることにより調製した。この溶液を6時間加熱し、次いで水中で粉砕し、ろ過した。次いで、この固体をメタノールから2回再結晶して、白色結晶を得た。

B. 水溶性、両親媒性、膜活性ポリ(ビニルエーテル)ポリアミンターポリマーの合成
Xmol％アミン保護ビニルエーテル（例えば、2-ビニルオキシエチルフタルイミド）を乾燥器で乾燥した丸底フラスコの窒素雰囲気下、無水ジクロロメタン中に加える。この溶液にYmol％低級疎水性基（例えば、プロピル、ブチル）ビニルエーテルおよび任意にZmol％高級疎水性基（例えば、ドデシル、オクタデシル）ビニルエーテルを加える（図1）。溶液を-50から-78℃の浴に入れ、2-ビニルオキシエチルフタルイミドを沈澱させる。この溶液に10mol％BF₃・(OCH₂CH₃)₂を加え、-50から-78℃で2〜3時間反応を進行させる。メタノール中の水酸化アンモニウム溶液を加えて重合を停止する。ポリマーを減圧下で乾燥し、次いで1,4-ジオキサン/メタノール（2/1）に加える。フタルイミドに対し20mol当量のヒドラジンを加えて、アミンから保護基を除去する。溶液を3時間還流し、次いで減圧下で乾燥する。得られた固体を0.5mol/L HClに溶解し、15分間還流してポリマーの塩酸塩を生成し、蒸留水で希釈し、さらに1時間還流する。次いで、溶液をNaOHで中和し、室温（RT）まで冷却し、分子セルロースチューブに移し、蒸留水に対して透析し、凍結乾燥する。ポリマーをサイズ排除または他のクロマトグラフィを用いてさらに精製することもできる。ポリマーの分子量を、分析用サイズ排除クロマトグラフィおよび多角光散乱によるサイズ排除クロマトグラフィ（SEC-MALS）を含む、標準的手順によりカラムを用いて推定する。

C. DW1360の合成
アミン/ブチル/オクタデシルポリ(ビニルエーテル)ターポリマーを、2-ビニルオキシエチルフタルイミド（5g、23.02mmol）、ブチルビニルエーテル（0.665g、6.58mmol）、およびオクタデシルビニルエーテル（0.488g、1.64mmol）モノマーから合成した。2-ビニルオキシエチルフタルイミドを、磁気撹拌子を含む乾燥器で乾燥した200mL丸底フラスコのアルゴン雰囲気下、36mLの無水ジクロロメタン中に加えた。この溶液にブチルビニルエーテルおよびn-オクタデシルビニルエーテルを加えた。モノマーを室温（RT）で完全に溶解し、澄明な均質溶液を得た。次いで、澄明溶液を含む反応容器を、ACS等級の変性アルコールおよびエチレングリコールの1：1溶液にドライアイスを加えて作った-50℃の浴に入れ、フタルイミドモノマーの目に見える沈澱を形成させた。約1.5分間冷却した後、BF₃・(OCH₂CH₃)₂（0.058g、0.411mmol）を加えて、重合反応を開始した。フタルイミドモノマーは重合開始後に溶解した。-50℃で3時間反応を進行させた。メタノール中1％水酸化アンモニウム5mLを加えて重合を停止した。次いで、溶媒をロータリーエバポレーションで除去した。

次いで、ポリマーを30mLの1,4-ジオキサン/メタノール（2/1）に溶解した。この溶液にヒドラジン（0.147g、46mmol）を加え、混合物を3時間加熱還流した。次いで、溶媒をロータリーエバポレーションで除去し、次いで得られた固体を20mLの0.5mol/L HClに加え、15分間還流し、20mLの蒸留水で希釈し、さらに1時間還流した。次いで、この溶液をNaOHで中和し、RTまで冷却し、分子量3,500のセルロースチューブに移し、蒸留水に対して24時間（2×20L）透析し、凍結乾燥した。

示したビニルエーテルモノマーを含むポリマーを記載しているが、本発明はこれらの特定のモノマーに制限されることはない。

D. 水溶性、両親媒性、膜活性ポリ(アクリラート)ポリアミンターポリマーの合成
ポリ(アクリラート)およびポリ(メチルアクリラート)ヘテロポリマーを一般的なフリーラジカル反応スキームを用いて合成してもよい（本明細書において用いられるポリ(メタクリラート)ポリアミンはポリ(アクリラート)ポリアミン属の亜属である）：

式中、Rは独立に水素またはメチル基であり、Xはポリマー中に所望の比で存在する所望のモノマー側基である。

ポリマー合成のために、適切なモノマーには下記が含まれるが、それらに限定されるわけではない：
BOC保護アミン含有モノマー（M）：

式中、n＝1〜4であり、BOC保護基の除去により一級アミンが生じる。
低級疎水性基モノマー（N）：

式中、n＝1〜5であり、1つまたは複数の炭素は不飽和であってもよい。
高級疎水性基モノマー（O）：

式中、n＝8〜24であり、1つまたは複数の炭素は不飽和であってもよい。

前述のモノマーを用いて、以下の組成の膜活性ヘテロポリマーを合成することができる：Mは50〜90mol％でありえ；Nは10〜50mol％でありえ；Oは0〜10mol％でありうる。

E. 水溶性、両親媒性、膜活性ポリ(アクリラート)ポリアミンターポリマーの合成

R、R'、およびR''は独立に水素またはメチルであり
x＝2、3、または4であり
y＝0、1、2、3、4、または5［メチル（C1）〜ヘキシル（C6）］であり
z＝≧8の整数［デシル（C10）またはそれ以上］であり
a、b、およびdはポリマーが所望の比の前述のモノマーを有するように選択した整数である。

Xmol％アミン保護アクリラートモノマー、Ymol％低級疎水性基アクリラートモノマー、および任意にZmol％高級疎水性基アクリラートモノマーを、撹拌子を備えた反応チューブに加える。適切な溶媒（例えば、アセトニトリルまたはジオキサン）と、続いて適切な触媒（例えば、AIBN）を加え、反応混合物をN₂でパージする。次いで、反応チューブに栓をし、油浴に移し、重合させるのに十分な時間（例えば、3時間）加熱する（例えば、60℃）。粗製ポリマーを、BOC保護基の除去の前に、透析、カラムクロマトグラフィ、および沈澱を含むが、それらに限定されるわけではない、適切な手段によって精製してもよい。BOC保護基を、氷酢酸中、2M HClとの反応により除去する。BOC保護基の除去によりポリマー一級アミンおよび水溶性膜活性ポリ(アクリラート)ポリアミンを得る。次いで、ポリマーを、透析、カラムクロマトグラフィ、および沈澱を含むが、それらに限定されるわけではない、適切な手段によって精製してもよい。

（Ant 40911-3 23-28、Ant 40911-35-2）の合成
2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)（AIBN、ラジカル開始剤）、アセトニトリル、およびジオキサンはSigma Aldrichから購入した。アクリラートおよびメタクリラートモノマーをろ過して阻害剤を除去した。3-(BOC-アミノ)1-プロパノール（TCI）を塩化アクリロイル（CAS 814-68-6）と反応させて、BOC-アミノプロピルアクリラート（BAPA）を生成した。

撹拌子を備えた2L丸底フラスコ中、2-(2-アミノエトキシ)エタノール（21.1g、202.9mmol）を350mLのジクロロメタンに溶解した。別の1Lフラスコ中、無水BOC（36.6g、169.1mmol）を660mLのジクロロメタンに溶解した。2L丸底フラスコに滴加漏斗を取り付け、無水BOC溶液をフラスコに6時間かけて加えた。反応混合物を終夜撹拌した。2L分液漏斗中、生成物を各300mlの10％クエン酸、10％K₂CO₃、飽和NaHCO₃、および飽和NaClで洗浄した。生成物であるBOC保護2-(2-アミノエトキシ)エタノールをNa₂SO₄で乾燥し、重力ろ過し、ロータリーエバポレーションおよび高減圧を用いてDCMを蒸発させた。

撹拌子を備え、アルゴンを流した、500ml丸底フラスコ中、BOC保護2-(2-アミノエトキシ)エタノール（27.836g、135.8mmol）と、続いて240mLの無水ジクロロメタンを加えた。ジイソプロピルエチルアミン（35.5ml、203.7mmol）を加え、系をドライアイス/アセトン浴に入れた。塩化アクリロイル（12.1ml、149.4mmol）を10mlのジクロロメタンを用いて希釈し、アルゴンを流した系に滴加した。系をアルゴン雰囲気下に維持し、室温に戻して、終夜撹拌した。生成物を各100mlのdH₂O、10％クエン酸、10％K₂CO₃、飽和NaHCO₃、および飽和NaClで洗浄した。生成物であるBOC-アミノエチルエトキシアクリラート（BAEEA）をNa₂SO₄で乾燥し、重力ろ過し、ロータリーエバポレーションを用いてDCMを蒸発させた。直径7.5cmのカラムを用い、29cmのシリカでのカラムクロマトグラフィにより生成物を精製した。用いた溶媒系はヘキサン中30％酢酸エチルであった。Rf：0.30。分画を集め、溶媒をロータリーエバポレーションおよび高減圧を用いて除去した。BAEEAを収率74％で得た。BAEEAをフリーザーで保存した。

ポリマー40911-3 23-28：70％BAPA、25％メタクリル酸ブチル（CAS 97-88-1）、5％メタクリル酸オクタデシル（CAS 4813-57-4）、（3％AIBN触媒）モル供給比（合計0.0139mol）
BAPA（9.739mmol）（A）、メタクリル酸ブチル（3.478mmol）（B）、およびメタクリル酸オクタデシル（0.6957mmol）（D）を、撹拌子を備えた20mL反応チューブに加えた。アセトニトリル（16ml）と、続いてAIBN（0.4174mmol）を加えた。2回の反応を並行して行うために、前述の段階を繰り返した。反応混合物をN₂で30分間パージした。次いで、反応チューブに栓をし、油浴に移し、60℃で3時間加熱した。チューブを取り出し、内容物を合わせた。粗製ポリマーを脱イオン水中で沈澱させ、ニートトリフルオロ酢酸（40ml）と1.5時間反応させて、BOC保護基を除去し、一級アミンおよび水溶性膜活性ポリ(アクリラート)ポリアミンを生成した。200mLの脱イオンH₂O（dH₂O）を反応混合物に加え、溶液を3500MWカットオフセルロースチューブに移し、高塩に対して24時間と、次いでdH₂Oに対して18時間透析した。内容物を蒸発乾固し、100mLのdH₂Oに溶解し、凍結乾燥した。乾燥したポリマーを50％MeOH/100mMギ酸アンモニウム/0.2％ギ酸溶液に25mg/mlで溶解した。粗製ポリマー溶液（250mg、10ml）の3回の注入分を、S-200セファクリル担体で、XK50/30cmカラムを5.0ml/分の流速で用いて精製した。カラムを充填し、製造者の指示に従って用いた。（GE Healthcare、説明書56-1130-82 Al、52-2086-00 AH）。ポリマー溶出はShimadzu RID-10A屈折率コレクターを用いて検出した。23分から28分までの分画を集め、各注入ごとに合わせた。溶媒を蒸発させ、精製したポリマーを2回凍結乾燥した。

ポリマーAnt 40911-35-2：80％BAEEA、15％メタクリル酸ブチル、5％アクリル酸オクタデシル、（3％AIBN触媒）モル供給比（合計0.013913mol）
BAEEA（A）（11.13mmol）、メタクリル酸ブチル（B）（2.086mmol）、およびアクリル酸オクタデシル（D）（0.6957mmol）を、撹拌子を備えた20mL反応チューブに加えた。ジオキサン（16ml）と、続いてAIBN（0.4174mmol）を加えた。2回の反応を並行して行うために、前述の段階を繰り返した。反応混合物をN₂で30分間パージした。次いで、反応チューブに栓をし、油浴に移し、60℃で3時間加熱した。チューブを取り出し、内容物を合わせた。ジオキサンをロータリーエバポレーションおよび高減圧により蒸発させ、粗製ポリマーを89.8％ジクロロメタン/10％テトラヒドロフラン/0.2％トリエチルアミン溶液に70mg/mlで溶解した。粗製ポリマー溶液（700mg、10ml）の3回の注入分を、Jordi gelジビニルベンゼン10⁴Åカラム（内径：22mm、長さ：500mm）を5.0ml/分の流速で用いて精製した。ポリマー溶出はShimadzu RID-10A屈折率コレクターを用いて検出した。15.07分〜17.13分の分画を集めて合わせた。溶媒をロータリーエバポレーションにより蒸発させた。

約10mgのポリマーを0.5mLの89.8％ジクロロメタン、10％テトラヒドロフラン、0.2％トリエチルアミンに溶解した。分子量および多分散性（PDI）を、Jordi 5μ 7.8×300 Mixed Bed LS DVBカラムを用い、Shimadzu Prominence HPLCに連結したWyatt Helos II多角光散乱検出器を用いて測定した。分子量172,000およびPDI 1.26を得た。

精製したBOC保護ポリマーをニートトリフルオロ酢酸（7ml）と1.5時間（または氷酢酸中2M HClと0.5時間）反応させて、BOC保護基を除去し、アミンを生成した。40mLのdH₂Oを反応混合物に加え、溶液を3500MWカットオフセルロースチューブに移し、高塩に対して24時間と、次いでdH₂Oに対して18時間透析した。内容物を蒸発乾固し、20〜30mLのdH₂Oに溶解し、2回凍結乾燥した。ポリマー溶液を2〜8℃で保存した。

アミンをポリマーの骨格に連結する炭素原子の数およびリンカーが分枝しているかどうかは、アミンのpKaおよびアミン付近の立体効果に影響をおよぼす。例えば、前述のポリマーについて、エチルアミンは約8.1のpKaを有し、プロピルアミンは約9.3のpKaを有し、ペンチルアミンは約10.2のpKaを有する。アミンのpKaまたはアミン付近の立体効果は、アミンに結合しているマスキング基の不安定性に影響をおよぼす。無水マレイン酸のアミンへの可逆的結合について、アミン結果のより高いpKaはアミンからの無水物のより遅い放出速度である。同様に、イソプロピルリンカーによるなどの、アミン付近の立体障害増大は、アミンのpKaを増大させうる。

ポリマーLau 41305-38-17-19：80％BAPA、20％メタクリル酸エチル（CAS 97-63-2）、(3％AIBN触媒）モル供給比（合計0.0105mol）
BAPA（A）（8.40mmol）およびメタクリル酸エチル（B）（2.10mmol）を、撹拌子を備えた15mL反応チューブに加えた。アセトニトリル（11.5ml）と、続いてAIBN（0.315mmol）を加えた。2回の反応を並行して行うために、前述の段階を繰り返した。反応混合物をN₂で30分間パージした。次いで、反応チューブに栓をし、油浴に移し、60℃で3時間加熱した。チューブを取り出し、内容物を合わせた。アセトニトリルをロータリーエバポレーションおよび高減圧により蒸発させ、粗製ポリマーを74.8％ジクロロメタン/25％テトラヒドロフラン/0.2％トリエチルアミン溶液に50mg/mlで溶解した。粗製ポリマー溶液（500mg、10ml）の3回の注入分を、Jordi gelフッ化ジビニルベンゼン10⁴Åカラム（内径：22mm、長さ：500mm）を5.0ml/分の流速で用いて精製した。ポリマー溶出はShimadzu RID-10A屈折率コレクターを用いて検出した。17.16分〜19.18分の分画を集めて合わせた。溶媒をロータリーエバポレーションにより蒸発させた。精製したBOC保護ポリマーを氷酢酸中2M HCl（7ml）と1.5時間反応させて、BOC保護基を除去し、アミンを生成した。40mLのdH₂Oを反応混合物に加え、溶液を3500MWカットオフセルロースチューブに移し、高塩に対して24時間と、次いでdH₂Oに対して18時間透析した。内容物を蒸発乾固し、30mLのdH₂Oに溶解し、2回凍結乾燥した。

F. (保護)アミンモノマー、低級疎水性基モノマー、および高級疎水性基オクタデシル基から合成した同様のポリマーも、記載する発明の実施において有効であると予想される。

ポリマー特徴付け
実施例2. DW1360の特徴付け
A. 両親媒性分析
1,6-ジフェニル-1,3,5-ヘキサトリエン（DPH、Invitrogen）蛍光（λ_ex＝350nm；λ_em＝452nm）は疎水性環境で増強される。この蛍光を用いてDW1360ポリマーを分析した。0.5μM（最終濃度）DPHを0.5mLの50mM HEPES緩衝液、pH8.0中10μgのDW1360に加えた。次いで、DPHの蛍光を測定することにより、溶液を疎水性環境におけるDPH蓄積について試験した。結合体存在下でのDPH蛍光の増大は、ポリマーによる疎水性環境の形成を示す。

B. 分子量
ポリマー分子量（質量）（MW）を、バッチモードでのoptilab rEXと一緒にWyatt Dawn Heleos IIで分析して求めた。ポリマーを様々な濃度で適切な溶媒に加え、それぞれをWyattシステムにロードした。次いで、Astraソフトウェアで濃度の関数としての屈折率の変化を計算し（dn/dc）、これをZimmプロットで用いてMWを計算した。精製したDW1360について求めた平均分子量は4000〜6000Daであった。精製したアクリラートポリマーの平均分子量は約100〜120kDaであった。

C. 分粒およびゼータ電位
ポリマーのゼータ電位をMalvern Zetasizerナノシリーズ（Nano ZS）機器を用いて測定した。CDMマスクポリマーのゼータ電位は0から-30mVの間で変動し、0から-20mVの間がより多かった。ゼータ電位は残留HEPESでpH8に緩衝化した等張グルコース中で測定した。pH7では、結合体はアミンの一部のプロトン化によりいくらかの正電荷を獲得すると予想される。

D. CDM試薬修飾後の結合体中のアミン基の定量
DW1360ポリマーを前述のとおりに合成し、続いて14重量当量のHEPES塩基および7重量当量のCDM-NAGとCDM-PEGとの重量比2：1の混合物（平均11単位）で処理した。1時間後、無水マレイン酸誘導体処理した結合体のアミン含量を、100mM NaHCO₃中のトリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）で処理することにより測定した。マレイン酸修飾していない結合体に対して規準化すると、修飾アミンの量は全体の約75％であると定量された。この修飾の程度は加える無水マレイン酸の量を変えるか、または反応条件を変更することで変動しうる。

E. リポソーム溶解
10mgの卵ホスファチジルコリンを、100mMカルボキシフルオレセイン（CF）および10mM HEPES、pH7.5を含む緩衝液1mLで水和した。次いで、リポソームを孔径100nmのポリカーボネートフィルター（Nucleopore, Pleasanton, CA）を通して押し出した。捕捉されていないCFを、Sepharose 4B-200を用い、pH8の10mM HEPESおよび0.1mol/L NaClで溶出するサイズ排除クロマトグラフィにより除去した。一定量200μLのCFロードリポソームを等張緩衝液1.8mLに加えた。小胞懸濁液に0.25μgのポリマーを加えた30分後、蛍光（λ_ex＝488、λ_em＝540）を測定した。各実験終了時に、1％Triton X-100溶液40μlを加えて小胞を破壊し、最大溶解を判定した。

実施例3. メリチン両親媒性ポリマーペプチド
（表１）メリチンペプチドは高い膜活性を示すことを示した。

n.d.−判定していない。
^a−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
^b−CDM、CDM-gal、もしくはCDM-PEGまたはその組み合わせによる修飾は膜活性を阻害する。

マスキング剤
実施例4. マスキング剤
A. 2-プロピオン酸-3-メチル無水マレイン酸マスキング剤前駆体（カルボキシジメチル無水マレイン酸またはCDM）の合成

無水テトラヒドロフラン50mL中の水素化ナトリウム（0.58g、25mmol）の懸濁液に2-ホスホノプロピオン酸トリエチル（7.1g、30mmol）を加えた。水素ガスの発生停止後、無水テトラヒドロフラン10mL中の2-オキソグルタル酸ジメチル（3.5g、20mmol）を加え、30分間撹拌した。次いで、水10mLを加え、テトラヒドロフランをロータリーエバポレーションにより除去した。得られた固体と水との混合物をエチルエーテル3×50mLで抽出した。エーテル抽出物を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して、淡黄色油状物を得た。油状物をシリカゲルクロマトグラフィで、エーテル：ヘキサン＝2：1で溶出して精製し、4g（収率82％）の純粋なトリエステルを得た。次いで、このトリエステルを、水酸化カリウム4.5g（5当量）を含む水およびエタノールの50/50混合物50mLに溶解することにより、2-プロピオン酸-3-メチル無水マレイン酸を生成した。この溶液を1時間加熱還流した。次いで、エタノールをロータリーエバポレーションにより除去し、溶液を塩酸でpH2まで酸性化した。次いで、この水溶液を酢酸エチル200mLで抽出し、分離し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して、白色固体を得た。次いで、この固体をジクロロメタンおよびヘキサンから再結晶して、2g（収率80％）の2-プロピオン酸-3-メチル無水マレイン酸を得た。

CDMを塩化オキサリルによりその酸塩化物に変換し、続いてチオール、エステル、またはアミンおよびピリジンを加えることにより、CDMからチオエステル、エステル、およびアミドを合成してもよい。CDMおよびその誘導体は、標的指向リガンド、立体安定化部分、荷電基、および他の反応性基で、当技術分野において標準の方法により、容易に修飾される。得られた分子を用いて、アミンを可逆的に修飾することができる。

マスキング剤をCDMの修飾により合成して、好ましくは電荷中性物質を生成する：

式中、R1はASGPr標的指向リガンドまたは立体安定化部分（例えば、PEG）である。

B. ASGPr標的指向基を含むマスキング剤
最も広く研究された肝実質細胞標的指向リガンドはガラクトースに基づいており、これは肝実質細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体（ASGPr）によって結合される。ガラクトースまたはガラクトース誘導体の結合は、オリゴ糖のキトサン、ポリスチレン誘導体、およびポリアクリルアミドHPMAを含む、少数の水溶性が高く、非荷電のポリマーの肝実質細胞標的指向を促進することが明らかにされている。ASGPr標的指向基は、ラクトース、すなわちガラクトース-グルコース二糖を用い、グルコース残基の修飾を介して、容易に生成される。ラクトビオン酸（LBA、グルコースが酸化されてグルオン酸となっている、ラクトース誘導体）は、標準のアミドカップリング技術を用いて、無水マレイン酸に容易に組み込まれる。

C. 立体安定化部分CDM-PEGおよび標的指向基CDM-NAG（N-アセチルガラクトサミン）合成
塩化メチレン50mL中のCDM（300mg、0.16mmol）の溶液に塩化オキサリル（2g、10重量当量）およびジメチルホルムアミド（5μl）を加えた。反応を終夜進行させ、その後過剰の塩化オキサリルおよび塩化メチレンをロータリーエバポレーションにより除去して、CDM酸塩化物を得た。酸塩化物を塩化メチレン1mLに溶解した。この溶液に、塩化メチレン10mL中の、CDM-PEGについてはポリエチレングリコールモノメチルエーテル（MW平均550）またはCDM-NAGについては(アミノエトキシ)エトキシ-2-(アセチルアミノ)-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド（すなわち、アミノビスエトキシル-エチルNAG）1.1モル当量、およびピリジン（200μl、1.5当量）を加えた。次いで、溶液を1.5時間撹拌した。次いで、溶媒を除去し、得られた固体を水5mLに溶解し、0.1％TFA水/アセトニトリル勾配を用いての逆相HPLCにより精製した。

好ましくは、5から20のエチレン単位を含むPEGを二置換無水マレイン酸に結合する。より好ましくは、10〜14のエチレン単位を含むPEGを二置換無水マレイン酸に結合する。PEGは様々な長さのものであってもよく、5〜20または10〜14エチレン単位の平均長を有する。または、PEGは、例えば、ちょうど11または13のエチレン単位を有する、単分散、均一または離散型であってもよい。

上に示すとおり、PEGスペーサーは無水物基とASGPr標的指向基との間に位置してもよい。好ましいPEGスペーサーは1〜10のエチレン単位を含む。

可逆的ポリマー修飾
実施例5. 膜活性ポリアミンの可逆的修飾/マスキング；すなわち、膜活性ポリマーのCDM-NAGまたはCDM-NAGプラスCDM-PEGの混合物による修飾
等張グルコース中の膜活性ポリアミン（例えば、前述のDW1360）xmgの溶液にHEPES遊離塩基14xmgと、続いてCDM-NAG 7xmgまたはCDM-NAG 2.3xmgおよびCDM-PEG 4.6xmgの混合物のいずれか、合計7xの二置換無水マレイン酸マスキング剤を加えた。次いで、動物への投与の前に、溶液を室温で少なくとも30分間インキュベートした。CDM-NAGまたはCDM-PEGのポリアミンとの反応により下記を得た：

式中、Rはポリマーであり、R1はASGPr標的指向部分または立体安定化部分を含む。無水物とポリマーアミンとの間の反応において生じた無水物カルボキシルは、予想された電荷の約1/20を示した（Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003）。したがって、膜活性ポリマーは、高度に負に荷電したポリアニオンに変換されるのではなく、有効に中和される。

実施例6. CDM-NAGによるメリチンの可逆的修飾/マスキング
修飾の前に、5×mgのCDM-NAGを氷酢酸の0.1％水溶液から凍結乾燥した。乾燥したNAG誘導体に、0.2×mLの等張グルコースおよび10×mgのHEPES遊離塩基中の×mgのメリチンの溶液を加えた。CDM-NAGが完全に溶解した後、動物への投与前に溶液を室温で少なくとも30分間インキュベートした。CDM-NAGのペプチドとの反応により下記を得た：

式中、Rはメリチンであり、R1はASGPr標的指向部分NAGを含む。無水物とポリマーアミンとの間の反応中に生じた無水物カルボキシルは、予想される電荷の約1/20を示す（Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003）。したがって、膜活性ポリマーは、高度に負に荷電したポリアニオンに変換されるのではなく、有効に中和される。

siRNA-結合体
実施例7. GalNAcクラスターの合成
A. {2-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸ベンジルエステルの合成

2-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-エタノール（62.2g、414mmol）をアルゴン雰囲気下で無水DMF 875mLに溶解し、0℃に冷却した。NaH（12.1g、277mmol、鉱油中55％）を注意深く加え、氷浴を取り除き、撹拌を80℃で1時間続けた。反応混合物を周囲温度まで冷却し、ブロモ酢酸（18.98g、137mmol）をDMF溶液（20mL）として滴加漏斗より加えて処理した。75℃でさらに30分後、ブロモメチル-ベンゼン（23.36g、137mmol）をニートで加え、エステル化を30分間進行させた。冷却し、砕氷上に注意深く加え、酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、すべての溶媒を蒸発させた後、フラッシュクロマトグラフィ（SiO₂、酢酸エチル/ヘプタン＝8/2）により、6.41gの表題化合物を黄色油状物で得た。MS (ISP): 299.2 [M+H]⁺。

B. 酢酸(3aR,5R,6R,7R,7aR)-6-アセトキシ-5-アセトキシメチル-2-メチル-5,6,7,7a-テトラヒドロ-3aH-ピラノ[3,2-d]オキサゾル-7-イルエステル

市販の酢酸(2S,3R,4R,5R,6R)-4,5-ジセトキシ-6-アセトキシメチル-3-アセチルアミノ-テトラヒドロ-ピラン-2-イルエステル（10.0g、26mmol）を無水CH₂Cl₂ 116mLに溶解し、トリメチルシリルトリフラート（14.27g、64mmol）で処理した。反応を45℃で終夜進行させた。0℃まで冷却した後、トリエチルアミン（4.88mL、35mmol）を加え、混合物をCH₂Cl₂で希釈し、NaHCO₃溶液および水で洗浄した。Na₂SO₄で乾燥し、溶媒を蒸発させて、10.3gの表題化合物を褐色油状物で得、これをそれ以上精製せずに次の段階で用いた。MS (ISP): 330.0 [M+H]⁺。

C. (2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-ジアセトキシ-6-アセトキシメチル-3-アセチルアミノ-テトラヒドロ-ピラン-2-イルオキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-酢酸ベンジルエステル

上で調製した酢酸(3aR,5R,6R,7R,7aR)-6-アセトキシ-5-アセトキシメチル-2-メチル-5,6,7,7a-テトラヒドロ-3aH-ピラノ[3,2-d]オキサゾル-7-イルエステル（10.3g、26mmol）および{2-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸ベンジルエステル（8.62g、29mmol）を520mLのCH₂Cl₂中で混合し、4オングストロームモレキュラーシーブス63gで処理した。1時間後、トリメチルシリルトリフラート（6.13g、28mmol）を加えた。反応混合物を周囲温度で週末の間撹拌した。トリエチルアミン（5.21mL、37mmol）を加え、モレキュラーシーブスをろ去し、ろ液をCH₂Cl₂で希釈し、NaHCO₃溶液および水で洗浄した。Na₂SO₄で乾燥し、溶媒を蒸発させた後、フラッシュクロマトグラフィ（SiO₂、酢酸エチル/AcOH/MeOH/水＝60/3/3/2）により、15.7gの表題化合物を褐色油状物で得た。MS (ISP): 626.6 [M-H]^-。

D. (2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-ジアセトキシ-6-アセトキシメチル-3-アセチルアミノ-テトラヒドロ-ピラン-2-イルオキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-酢酸

上で調製した(2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-ジアセトキシ-6-アセトキシメチル-3-アセチルアミノ-テトラヒドロ-ピラン-2-イルオキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-酢酸ベンジルエステル（15.7g、25mmol）を酢酸エチル525mLに溶解し、1.6gのPd/C（10％）で、1atmのH₂雰囲気下、周囲温度で3時間水素添加した。セライトを通してろ過し、溶媒を蒸発させた後、フラッシュクロマトグラフィ（SiO₂、CH₂Cl₂/MeOH＝80/20）により、6.07gの表題化合物を褐色ゴムで得た。MS (ISP): 536.5 [M-H]^-。

E. 酢酸エステル保護したGalNAcクラスターベンジルエステル

上で調製した(2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-ジアセトキシ-6-アセトキシメチル-3-アセチルアミノ-テトラヒドロ-ピラン-2-イルオキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-酢酸（2.820g、5.246mmol）および(S)-6-アミノ-2-((S)-2,6-ジアミノ-ヘキサノイルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル塩酸塩（調製は下記参照、0.829g、1.749mmol）をCH₂Cl₂ 32mLおよびDMF 3.2mLの混合物に溶解し、ヒューニッヒ塩基（2.096mL、12.25mmol）、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール（0.714g、5.248mmol）および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（1.006g、5.248mmol）で逐次処理し、周囲温度で終夜撹拌した。すべての揮発性物質を減圧（i.v.）下で除去し、粗製反応混合物を調製用HPLC（38回、Gemini、5μ、C18）で精製し、凍結乾燥後に1.650gの表題生成物を白色粉末で得た。MS (ISP): 1945.8 [M+Na]⁺。

F. 酢酸エステル保護したGalNAcクラスター遊離酸（糖ヒドロキシル保護）
(17S,20S)-1-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)-20-(1-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラ-ヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)-11-オキソ-3,6,9-トリオキサ-12-アザヘキサデカン-16-イル)-17-(2-(2-(2-(2-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)-アセトアミド)-11,18-ジオキソ-3,6,9-トリオキサ-12,19-ジアザヘニコサン-21-酸

上で調製したGalNAcクラスターベンジルエステル（0.674g、0.350mmol）をMeOH 50mLに溶解し、0.065gのPd/C（10％）で、1atmのH₂雰囲気下、周囲温度で4時間水素添加した。セライトを通してろ過し、溶媒を蒸発させて、0.620gの表題化合物を白色泡状物で得た。MS (ISP): 1917.0 [M+2H]²⁺。

実施例8. ガラクトースクラスター分枝点、(S)-6-アミノ-2-((S)-2,6-ジアミノ-ヘキサノイルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル塩酸塩の合成
A. (S)-6-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル

(S)-6-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸（5.00g、10.67mmol）およびフェニル-メタノール（2.305g、21.34mmol）をCH₂Cl₂ 25mLに溶解し、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール（1.933g、11.74mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDC、2.250g、11.74mmol）、およびエチル-ジイソプロピル-アミン（2.137mL、12.49mmol）で逐次処理した。90分間撹拌した後、揮発性物質を減圧下、周囲温度で除去し、残渣を酢酸エチルに溶解し、水、NH₄Cl溶液および食塩水で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、蒸発させた。次いで、粗製混合物をエタノール20mLに溶解し、水10mLを加えて生成物を沈澱させた。ろ過し、乾燥して、5.669gの表題化合物を得、これをエタノール/ヘキサンから再結晶して、4.27gの純粋なベンジルエステルを得た。MS (ISP): 559.2 [M+H]⁺。

B. (S)-2-((S)-2,6-ビス-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ヘキサノイルアミノ)-6-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ヘキサン酸ベンジルエステル

上で調製した(S)-6-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシ-カルボニルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル（4.270g、7.643mmol）をTHF 15mLに溶解し、ジエチルアミン15mLで処理した。周囲温度で4時間後、MSおよびTLCは出発原料がないことを示した。溶媒を蒸発させ、トルエンと共沸乾燥して、4.02gの遊離アミンを得、これを次の段階で直接用いた。

市販の(S)-2,6-ビス-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ヘキサン酸（3.177g、9.17mmol）をCH₂Cl₂ 13mLに溶解し、0℃でエチル-ジイソプロピル-アミン（4.71mL、27.5mmol）、O-(1,2-ジドロ-2-オキソ-ピリジル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（TPTU、2.725g、9.172mmol）で処理した。15分後、上で調製したアミンの最小限のCH₂Cl₂溶液およびエチル-ジイソプロピル-アミン1.57mL（1,2当量）で、反応を周囲温度で2時間進行させた。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチルに溶解し、NaHCO₃溶液、NH₄Cl溶液および水で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィ（SiO₂、ヘプタン/酢酸エチル＝4/6）と、続いてヘプタン/最少量の酢酸エチルからの結晶化により、4.516gの表題化合物を白色固体で得た。MS (ISP): 665.4 [M+H]⁺。

C. (S)-6-アミノ-2-((S)-2,6-ジアミノ-ヘキサノイルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル3塩酸塩

上で調製した(S)-2-((S)-2,6-ビス-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ヘキサノイルアミノ)-6-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ヘキサン酸ベンジルエステル（4.516、6.793mmol）をジオキサン中4mol/L HClに溶解した。数分後、ガスが発生し、沈澱が生じた。周囲温度で3時間後、反応混合物を注意深く蒸発させ、徹底的に乾燥して、3.81gの表題化合物をオフホワイト泡状物で得、これをそれ以上精製せずに上の実施例7. E. GalNAcクラスターベンジルエステルで用いた。MS (ISP): 365.3 [M+H]⁺。

実施例9. ポリヌクレオチド標的指向部分
ポリヌクレオチド標的指向部分を、GalNAcクラスターおよび薬物動態調節剤のリジンまたはオルニチン骨格分子上のアミンへの結合により作成した。次いで、骨格上のカルボキシル基は、siRNAなどのRNAiポリヌクレオチドへの共有結合のために利用可能であった。

実施例10. GalNAcクラスター-パルミトイル標的指向部分
A. (S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-6-ヘキサデカノイルアミノ-ヘキサン酸ベンジルエステル

市販のFmoc-Lys(パルミトイル)-OH（0.899g、1.481mmol）を15mLのCH₂C1₂に懸濁し、ベンジルアルコール（0.320g、0.305mL、2.96mmol、2当量）、ヒドロキシベンゾトリアゾル（HOBT、0.268g、1.63mmol、1.1当量）、l-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド.HCl（EDC、0.312g、1.63mmol、1.1当量）、およびN-エチル-ジイソプロピルアミン（0.224g、0.297mL、1.733mmol、1.17当量）で逐次処理した。次いで、黄色溶液を2時間撹拌した。砕氷/NH₄Cl溶液上に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、すべての溶媒を蒸発させた後、フラッシュクロマトグラフィ（SiO₂、酢酸エチル/ヘプタン＝1/1）により0.692gの表題化合物をオフホワイト固体で得た。MS (ISP): 697.6 [M+H]⁺。

B. (S)-2-アミノ-6-ヘキサデカノイルアミノ-ヘキサン酸ベンジルエステル

上で調製した(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-6-ヘキサデカノイル-アミノ-ヘキサン酸ベンジルエステル（0.692g、0.993mmol）を15mLのTHFに溶解し、19mLのジエチルアミン（約18当量）で処理した。周囲温度で3時間後、すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗製反応混合物をフラッシュクロマトグラフィ（SiO₂、CH₂Cl₂/MeOH（10％））で精製して、0.355gの表題化合物を白色固体で得た。MS (ISP): 475.3 [M+H]⁺。

上で調製したGalNAcクラスター遊離酸（実施例7F）(17S,20S)-1-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)-20-(1-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラ-ヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)-11-オキソ-3,6,9-トリオキサ-12-アザヘキサデカン-16-イル)-17-(2-(2-(2-(2-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)エトキシ)エトキシ)-エトキシ)アセトアミド)-11,18-ジオキソ-3,6,9-トリオキサ-12,19-ジアザヘニコサン-21-酸（0.185g、0.101mmol）を2.0mLのCH₂Cl₂に溶解し、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール（HOAt、0.014g、0.101mmol、1当量）、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド・HCl（EDC、0.019g、0.101mmol、1当量）、およびN-エチル-ジイソプロピルアミン（0.013g、0.017mL、0.101mmol、1当量）で逐次処理した。周囲温度で15分間撹拌した後、最少量のCH₂Cl₂に溶解した(S)-2-アミノ-6-ヘキサデカノイルアミノ-ヘキサン酸ベンジルエステル（0.048g、0.101mmol、1当量）を加え、反応を2時間進行させた。次いで、溶媒を蒸発させ、粗製混合物をフラッシュクロマトグラフィ（SiO₂、CH₂Cl₂/MeOH（7％〜＞10％））で精製して、0.133gの表題化合物を白色泡状物で得た。MS (ISP): 1167.1 [M+2Na]²⁺/2。

上で調製したベンジルエステル（0.130g、0.057mmol））を5mLのMeOHに溶解し、0.024gのPd/C（10％）で、1atmのH₂雰囲気下、周囲温度で3時間水素添加した。セライトを通してろ過し、溶媒を蒸発させて、0.123gの表題化合物を無色油状物で得た。MS (ISP): 2221.0 [M+Na]⁺。

実施例11. オルニチンリンカーを有するGalNAcクラスターパルミトイル（C16）の合成

実施例10と類似であるが、Fmoc-Lys(パルミトイル)-OHの代わりにFmoc-L-Orn(パルミトイル)-OHを用い、白色泡状物として調製。MS (ISP): 1093.1 [M+2H]²⁺/2。

実施例12. GalNAcクラスター(E)-ヘキサデカ-8-エノイル（C16）の合成
A. (S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-6-((E)-ヘキサデカ-8-エノイルアミノ)-ヘキサン酸2-トリメチルシラニル-エチルエステル

Fmoc-Lys((E)-ヘキサデカ-8-エノイル)-OH（0.500g、0.827mmol）を15mLのCH₂Cl₂に懸濁し、2-(トリメチルシリル)エタノール（0.196g、0.236mL、1.65mmol、2当量）、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール（HOAt、0.123g、0.909mmol、1.1当量）、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド.HCl（EDC、0.174g、0.909mmol、1.1当量）、およびN-エチル-ジイソプロピルアミン（0.125g、0.164mL、0.967mmol、1.17当量）で逐次処理した。次いで、黄色溶液を週末の間撹拌した。砕氷/HCl溶液上に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、すべての溶媒を蒸発させた後、フラッシュクロマトグラフィ（SiO₂、CH₂Cl₂/MeOH＝9/1）で精製し、AcOEt/ヘプタンから結晶化して、0.488gの表題化合物をオフホワイト半固体で得た。MS (ISP): 705.6 [M+H]⁺。

B. (S)-2-アミノ-6-((E)-ヘキサデカ-8-エノイルアミノ)-ヘキサン酸2-トリメチルシラニル-エチルエステル

上で調製した(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-6-((E)-ヘキサデカ-8-エノイルアミノ)-ヘキサン酸2-トリメチルシラニル-エチルエステル（0.488g、0.690mmol）を15mLのTHFに溶解し、1.35mLのジエチルアミン（約18当量）で処理した。周囲温度で3時間後、すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗製反応混合物をフラッシュクロマトグラフィ（SiO₂、CH₂Cl₂/MeOH（10％））で精製して、0.259gの表題化合物を黄色油状物で得た。MS (ISP): 483.6 [M+H]⁺。

C. GalNacクラスター(E)-ヘキサデカ-8-エノイル（C16）

上記化合物を、(S)-2-アミノ-6-((E)-ヘキサデカ-8-エノイルアミノ)-ヘキサン酸2-トリメチルシラニル-エチルエステルを用い、保護基を以下のとおりに切断して、前述のとおりに調製した：終わりから2番目の段階の後、得られた2-トリメチルシラニル-エチルエステル（245mg、0.107mmol、1.00当量）を無水THF（5mL）と混合して無色溶液を得た。フッ化テトラブチルアンモニウム三水和物（168mg、0.533mmol、5.00当量）を0℃で加え、反応混合物をフリーザーに終夜保存した。砕氷上に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、すべての溶媒を蒸発させて、粘稠油状物を得た。アセトニトリルおよび水に溶解し、凍結乾燥して、最終的に0.120gの表題化合物を白色固体で得た。MS (ISP): 1121.5 [M+2Na]²⁺/2。

実施例13. GalNAcクラスターオレイル（C18）の合成

上記実施例と類似であるが、(S)-2-アミノ-6-((E)-ヘキサデカ-8-エノイルアミノ)-ヘキサン酸2-トリメチルシラニル-エチルエステルの代わりに(S)-2-(トリメチルシリル)エチル2-アミノ-6-オレアミドヘキサノアートを用い、オフホワイト泡状物として調製。MS (ISP): 1113.6 [M+2H]²⁺/2。

実施例14. GalNAcクラスター(9E,12E)-オクタデカ-9,12-ジエノイル（C18）の合成

上記実施例と類似であるが、(S)-2-アミノ-6-((E)-ヘキサデカ-8-エノイルアミノ)-ヘキサン酸2-トリメチルシラニル-エチルエステルの代わりに(S)-2-(トリメチルシリル)エチル2-アミノ-6-((9E,12E)-オクタデカ-9,12-ジエンアミド)ヘキサノアートを用い、黄色の凍結乾燥固体として調製。MS (ISP): 1134.55 [M+2Na]²⁺/2。

実施例15. GalNAcクラスター-オクタノイル（C8）の合成。

前述のとおりであるが、Fmoc-Lys(パルミトイル)-OHの代わりにFmoc-Lys(オクタノイル)-OHを用い、淡黄色泡状物として調製。MS (ISP): 1044.5 [M+2H]²⁺/2。

実施例16. GalNAcクラスター-ドデカノイル（C12）の合成

前述のとおりであるが、Fmoc-Lys(パルミトイル)-OHの代わりにFmoc-Lys(ドデカノイル)-OHを用い、淡黄色泡状物として調製。MS (ISP): 2166.04 [M+Na]⁺。

実施例17. GalNAcクラスター-C20-アシルの合成

前述のとおりであるが、Fmoc-Lys(パルミトイル)-OHの代わりにFmoc-Lys(イコサノイル)-OHを用い、淡黄色泡状物として調製。MS (ISP): 1150.58 [M+2Na]²⁺/2。

実施例18. GalNAcクラスター-C24-アシルの合成

を、前述のとおりであるが、Fmoc-Lys(パルミトイル)-OHの代わりにFmoc-Lys(テトラコサノイル)-OHを用い、淡黄色泡状物として調製した。MS (ISP): 2312.24 [M+H]⁺。

実施例19. GalNAcクラスター-ジオクタノイル（2×C8）の合成
A. (S)-6-((S)-2,6-ビス-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ヘキサノイルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イル-メトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸

丸底フラスコ内で、Fmoc-Lys-OH（1.393g 3.78mmol、1.00当量）をCH₂Cl₂（16mL）に溶解して淡黄色溶液を得た。ヒューニッヒ塩基（1.955g、2.57mL、15.1mmol、4.00当量）およびトリメチルクロロシラン（0.863g、1.00mL、7.94mmol、2.10当量）を加え、反応混合物を20分間撹拌した。

第二の丸底フラスコ内で、Boc-Lys(Boc)-OH（1.31g、3.78mmol、1.00当量）をDMF（16mL）に溶解して無色溶液を得た。ヒューニッヒ塩基（0.587mg、0.77mL、4.54mmol、1.20当量）およびTPTU［125700-71-2］（1.123g、3.78mmol、1.00当量）を加え、反応混合物を15分間撹拌した。次いで、対応するシリルエステルモノシリルアミンを含む第一のフラスコからの溶液を加え、反応混合物をさらに2時間撹拌した。混合物を砕氷/NH₄Cl上に注ぎ、AcOEtで2回抽出し、H₂Oおよび食塩水で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、蒸発乾固させた。フラッシュクロマトグラフィSiO₂（CH₂Cl₂中8％MeOH）により、2.324gの表題化合物をオフホワイト泡状物で得た。MS (ISP): 697.5 [M+H]⁺、719.4 [M+Na]⁺。

B. (S)-6-((S)-2,6-ビス-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ヘキサノイルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシ-カルボニルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル

上で調製した(S)-6-((S)-2,6-ビス-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ヘキサノイルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸（2.32g、3.33mmol、1.00当量）およびフェニル-メタノール（0.720g、6.66mmol、2.00当量）を30mLのCH₂Cl₂に溶解し、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール（HOAt、0.498g、3.66mmol、1.10当量）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDC、0.702g、3.66mmol、1.10当量）、およびエチル-ジイソプロピル-アミン（0.503g、0.66mL、3.90mmol、1.17当量）で逐次処理した。120分間撹拌した後、揮発性物質を減圧下で除去した。続くフラッシュクロマトグラフィ（CH₂Cl₂中8％MeOH）により、2.573gの表題化合物を淡黄色ろう状固体で得た。MS (ISP): 787.5 [M+H]⁺。

C. (S)-6-((S)-2,6-ジアミノ-ヘキサノイルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル

上で調製した(S)-6-((S)-2,6-ビス-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ヘキサノイルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル（塩酸塩として、0.613g、0.779mmol、1.00当量）をジオキサン（4mL）に溶解し、3.89mLのジオキサン中4M HCl（10当量）で処理した。3時間後、MSは出発原料がないことを示した。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、0.519gの表題化合物を塩酸塩で得、これをそれ以上精製せずに次の段階で用いた。MS (ISP): 587.3 [M+H]⁺。

D. (S)-6-((S)-2,6-ビス-オクタノイルアミノ-ヘキサノイルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシ-カルボニルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル

上で調製した(S)-6-((S)-2,6-ジアミノ-ヘキサノイルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシ-カルボニルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル（0.519g、0.771mmol、1.00当量）およびカプリル酸（0.234g、1.619mmol、2.10当量）を12mLのCH₂Cl₂に溶解し、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール（HOAt、0.220g、1.619mmol、2.10当量）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDC、0.310g、1.619mmol、2.10当量）、およびエチル-ジイソプロピル-アミン（0.498g、0.666mL、3.855mmol、5.00当量）で逐次処理した。180分間撹拌した後、混合物を砕氷上に注ぎ、AcOEtで2回抽出し、水で洗浄し、MgSO₄で乾燥し、蒸発乾固させた。AcOEt/ヘキサンから結晶化して、0.453gの表題化合物を白色固体で得た。MS (ISP): 839.8 [M+H]⁺、861.8 [M+Na]⁺。

E. (S)-2-アミノ-6-((S)-2,6-ビス-オクタノイルアミノ-ヘキサノイルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル

上で調製した(S)-6-((S)-2,6-ビス-オクタノイルアミノ-ヘキサノイルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル（0.450g、0.536mmol）を2.2mLのTHFに懸濁し、2.2mLのジエチルアミン（約40当量）で処理した。周囲温度で24時間激しく撹拌した後、すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗製反応生成物をEtOEtで2回粉砕して、0.258gの表題化合物を白色固体で得た。MS (ISP): 617.5 [M+H]⁺。

F. GalNAcクラスター-ジオクタノイル（2×C8）

前述のとおりであるが、(S)-2-アミノ-6-ヘキサデカノイルアミノ-ヘキサン酸ベンジルエステルの代わりに(S)-2-アミノ-6-((S)-2,6-ビス-オクタノイルアミノ-ヘキサノイルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステルを用い、白色泡状物として調製。MS (ISP): 2342.19 [M+H]⁺。

実施例20. ポリヌクレオチド標的指向部分-siRNA合成
A. 材料
無水メタノール（MeOH）、ナトリウムメチラート、Amberlite IR-120、硫酸ナトリウム、無水N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）、無水ジクロロメタン（DCM）、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）および酢酸ナトリウム溶液（3M、pH5.2）はSigma Aldrich Chemie GmbH（Taufkirchen、ドイツ）から購入した。RP-HPLC用の酢酸トリエチルアンモニウム（TEAA）緩衝液（2.0M、pH7.0）およびアセトニトリル（ACN）（HPLC品質）はBiosolve（Valkenswaard、オランダ）から購入した。エタノール（EtOH）（p.a.）はMerck（Darmstadt、ドイツ）から購入した。Optilab HF（Membra Pure、ドイツ）システムから精製した水を用いた。Resource RPC 3mLカラム（10×0,64cm；粒径15μm）はGE Healthcare（Freiburg、ドイツ）から購入した。HPLC精製はAKTA Explorer 100（GE Healthcare）を用いて実施した。

B. GalNAcクラスター-siRNA結合体の合成
化合物1（150mg；0.082mmol）を無水MeOH（5.5ml）に溶解し、ナトリウムメチラート42μLを加えた（MeOH中25％溶液）。混合物をアルゴン雰囲気下、室温で2時間撹拌した。同量のメタノールと、カチオン交換樹脂のAmberlite IR-120を分割して加え、pH約7.0とした。Amberliteをろ過により除去し、溶液をNa₂SO₄で乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。化合物2を白色泡状物として定量的収率で得た。TLC（SiO₂、DCM/MeOH 5：1＋0.1％CH₃COOH）：R_f2＝0.03；検出のために、MeOH中の硫酸の溶液（5％）を用い、続いて加熱した。ESI-MS、直接注入、負モード；[M-H]^-1 _計算値：1452.7；[M-H]^1- _測定値：1452.5。

化合物2（20mg；0.014mmol）をピリジンおよびジクロロメタンと同時蒸発させた。残渣を無水DMF（0.9ml）に溶解し、アルゴン雰囲気下で撹拌しながらDMF中のN-ヒドロキシスクシンイミドの溶液（1.6mg；0.014mmol）を加えた。0℃でDMF中のDCCの溶液（3.2mg；0.016mmol）をゆっくり加えた。反応混合物を室温まで加温し、終夜撹拌した。化合物3をそれ以上精製せずにC-6アミノリンカーを有するRNAへの結合に用いた、化合物4。

B. GalNAcクラスター-PK-RNA結合体の合成
化合物1で表される一般構造の化合物を無水MeOHに溶解し、ナトリウムメチラート（9当量）を加えた（MeOH中25％溶液）。混合物をアルゴン雰囲気下、室温で2時間撹拌した。反応混合物をメタノールで希釈し、続いてカチオン交換樹脂Amberlite IR-120を分割して加え、pH約7.0とした。Amberliteをろ過により除去し、溶液をNa₂SO₄で乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。化合物2で表される一般構造の化合物を白色泡状物として定量的収率で得た。

次の段階で、化合物2で表される一般構造の化合物をNHS生成により活性化した。化合物2をピリジンおよびジクロロメタンと同時蒸発させた。残渣を無水DMFに溶解し、アルゴン雰囲気下で撹拌しながらDMF中のN-ヒドロキシスクシンイミドの溶液（1.0当量）を加えた。0℃でDMF中のDCCの溶液（1.1当量）をゆっくり加えた。反応混合物を室温まで加温し、終夜撹拌し続けた。得られた化合物3で表される一般構造の活性化化合物をそれ以上精製せずにRNAへの結合に用いた。ポリヌクレオチド標的指向部分をRNAの5'末端に炭素6個を含むアミノリンカーを介して結合した（化合物4で表される）。

C. アミノ修飾RNAの合成
センス鎖の5'末端にC-6-アミノリンカーを有するRNAを、AKTA Oligopilot 100（GE Healthcare、Freiburg、ドイツ）および固体支持体として細孔制御ガラス（controlled pore glass）（Prime Synthesis, Aston, PA, USA）を用い、1215μmolの規模で、固相上、標準のホスホラミダイト化学により産生した。2'-O-メチルヌクレオチドを含むRNAを、対応するホスホラミダイト、2'-O-メチルホスホラミダイトおよびTFA-ヘキシルアミノリンカーアミダイト（Sigma-Aldrich、SAFC、Hamburg、ドイツ）を用いて生成した。切断および脱保護ならびに精製を、当技術分野において公知の方法により達成した（Wincott F., et al, NAR 1995, 23,14, 2677-84）。アミノ修飾RNAをアニオン交換HPLCにより特徴付け（純度：96.1％）、同一性をESI-MSにより確認した（[M+H]¹⁺ _計算値：6937.4；[M+H]¹⁺ _測定値：6939.0。配列：

；u、c：対応する塩基の2'-O-メチルヌクレオチド、s：ホスホロチオアート。

D. GalNAcクラスターRNA結合体（化合物4）の合成
5'末端にC-6アミノリンカーを有するRNA（2.54μmol）を凍結乾燥し、250μLのホウ酸ナトリウム緩衝液（0.1Mホウ酸ナトリウム、pH8.5、0.1M KCl）および1.1mL DMSOに溶解した。8μLのDIPEAを加えた後、RNA溶液を持続的に撹拌しながら、これにDMF中の化合物3の溶液（理論的には0.014mmol）をゆっくり加えた。反応混合物を35℃で終夜撹拌した。反応をRP-HPLC（Resource RPC 3mL、緩衝液：A：水中100mM TEAA、B：95％ACN中100mM TEAA、勾配：20CVで5％Bから22％B）を用いてモニターした。-20℃でEtOH中の酢酸ナトリウム（3M）を用いてRNAを沈澱させた後、RNA結合体を前述の条件を用いて精製した。純粋な分画を集め、所望の結合体、化合物4を酢酸ナトリウム/EtOHを用いて沈澱させた。化合物4を収率59％で単離した（1.50μmol）。化合物4の純度をアニオン交換HPLCで分析し（純度：91.7％）、同一性をESI-MSにより確認した（[M+H]¹⁺ _計算値：8374.4；[M+H]¹⁺ _測定値：8376.5。

E. GalNAcクラスター-PK-RNA結合体（化合物4）の一般合成
5'末端にC-6アミノリンカーを有するRNAを凍結乾燥し、ホウ酸ナトリウム緩衝液（0.1Mホウ酸ナトリウム、pH8.5、0.1M KCl）およびDMSOの比率1：4の混合物に溶解した。DIPEAを加えた後、RNA溶液を持続的に撹拌しながら、これにDMF中の化合物3の溶液（6当量）をゆっくり加えた。反応混合物を35℃で終夜撹拌した。反応をRP-HPLC（Resource RPC 3mL、緩衝液：A：水中100mM TEAA、B：95％ACN中100mM TEAA、勾配：20CVで5％Bから70％B）を用いてモニターした。-20℃でEtOH中の酢酸ナトリウム（3M、pH5.2）を用いてRNAを沈澱させた後、RNA結合体を前述の条件を用いて精製した。純粋な分画を集め、一般構造4の所望の結合体を酢酸ナトリウム/EtOHを用いて沈澱させて、純粋なRNA結合体を得た。

F. siRNAのアニーリング
RNAセンス鎖を有する化合物4を2'-O-メチル-修飾アンチセンスRNA鎖とアニールさせた：アンチセンス配列：

。アポリポタンパク質B mRNAに向けたsiRNA結合体を、アニーリング緩衝液（20mMリン酸ナトリウム、pH6.8；100mM塩化ナトリウム）中の相補鎖の等モル溶液を混合し、85〜90℃の水浴中で3分間加熱し、3〜4時間の間に室温まで冷却することにより生成した。二重鎖形成を、未変性ゲル電気泳動により確認した。

インビボsiRNA送達
実施例21. インビボでのRNAiポリヌクレオチドの投与、および肝実質細胞への送達
RNAiポリヌクレオチド結合体およびマスクしたポリマーを前述のとおりに合成した。6から8週齢のマウス（C57BL/6またはICR系統、それぞれ約18〜20g）をHarlan Sprague Dawley（Indianapolis IN）から入手した。マウスを注入前に少なくとも2日間収容した。給餌はHarlan Teklad Rodent Diet（Harlan, Madison WI）で適宜行った。RNAiポリヌクレオチド結合体およびマスクしたポリマーを前述のとおりに合成した。マウスに送達ポリマーの溶液0.2mLおよびsiRNA結合体0.2mLを尾静脈に注入した。ポリマーおよびsiRNAの同時注入のために、注入前にsiRNA結合体を修飾ポリマーに加え、全量0.4mlを注入した。組成物は生理的条件において可溶性かつ非凝集性であった。ポリマーおよびsiRNAを別々に注入するために、ポリマーを製剤溶液0.2mL中で注入し、siRNAを等張グルコース0.2mL中で注入した。溶液を尾静脈内への点滴により注入した。他の血管への注入、例えば、眼窩後注入も等しく有効であった。

血清ApoBレベル判定
マウスを4時間（ラットの場合は16時間）絶食させた後、顎下出血により血清を採取した。血清ApoBタンパク質レベルを標準のサンドイッチELISA法により求めた。簡単に言うと、ポリクローナルヤギ抗マウスApoB抗体およびウサギ抗マウスApoB抗体（Biodesign International）を、それぞれ捕捉および検出抗体として用いた。HRP結合ヤギ抗ウサギIgG抗体（Sigma）を後で適用し、ApoB/抗体複合体を結合した。次いで、テトラメチル-ベンジジン（TMB、Sigma）発色の吸光度をTecan Safire2（オーストリア、欧州）マイクロプレート読み取り器により450nmで測定した。

血漿第VII因子（F7）活性測定
マウスからの血漿試料を、標準の手順に従い、0.109mol/Lクエン酸ナトリウム抗凝固剤（1体積）を含むマイクロ遠沈管中に顎下出血により血液（9体積）を採取して調製した。血漿中のF7活性を、BIOPHEN VIIキット（Hyphen BioMed/Aniara, Mason, OH）を製造者の推奨に従って用いる発色法により測定する。発色の吸光度をTecan Safire2マイクロプレート読み取り器を用いて405nmで測定した。

実施例22. siRNAは以下の配列を有していた：
apoB siRNA：

第VII因子siRNA

小文字＝2'-O-CH₃置換
s＝ホスホロチオアート連結
ヌクレオチドの後のf＝2'-F置換
ヌクレオチドの前のd＝2'-デオキシ

ガラクトースクラスター-PK標的指向siRNA
実施例23. siRNA-ガラクトースクラスター-薬物動態調節剤結合体をマスクしたDW1360送達ポリマーと同時投与して用いる、インビボでのsiRNAの肝実質細胞への送達
siRNAおよび送達ポリマーを、示した用量のsiRNAおよびポリマーを用い、前述のとおりに調製し、投与した。

A. siRNA-結合体およびマスクしたLau 41305-38-17-19送達ポリマーの同時投与
Lau 41305-38-17-19を7重量当量のCDM-PEG：CDM-NAG 2：1で修飾した。完全2'F/MeO安定化第VII因子siRNAをGalNAc₃-パルミトイル標的指向部分または他の示した標的指向部分に結合した。siRNA-結合体およびLau 41305-38-17-19送達ポリマーの、20gのICRマウス（n＝3）への同時投与は、血清第VII因子タンパク質レベルの低下を引き起こし、siRNAの肝実質細胞への送達および第VII因子遺伝子発現の阻害を示していた。効率的な送達は、送達ポリマーおよびRNAiポリヌクレオチドへの標的指向部分結合の両方を必要とした（表2）。非結合siRNAでは有意なノックダウンは観察されなかった。同時投与した送達ポリマー非存在下では標的遺伝子ノックダウンは観察されなかった。GalNAc₃-パルミトイル標的指向リガンドは、GalNAc₃標的指向部分またはコレステロールポリヌクレオチド標的指向部分に比べて、siRNAの肝細胞への送達改善を提供した。

（表２）siRNA-GalNAcクラスター結合体プラス送達ポリマー注入後のインビボでの標的遺伝子のノックダウン、ポリマー用量の効果

^a動物体重1キログラムあたりのsiRNAまたはポリマーmg
^bタンパク質相対％

B. siRNA-結合体およびマスクしたメリチン送達ペプチドの同時投与
Tyr-メリチンを5重量当量のCDM-NAGで修飾した。完全2'F/MeO安定化第VII因子siRNAをGalNAc₃-パルミトイル標的指向部分または他の示した標的指向部分に結合した。siRNA-結合体およびTyr-メリチン送達ペプチドの、20gのICRマウス（n＝3）への同時投与は、血清第VII因子タンパク質レベルの低下を引き起こし、siRNAの肝実質細胞への送達および第VII因子遺伝子発現の阻害を示していた。効率的な送達は、送達ペプチドおよびRNAiポリヌクレオチドへの標的指向部分結合の両方を必要とした（表3）。非結合siRNAでは有意なノックダウンは観察されなかった。同時投与した送達ポリマー非存在下では標的遺伝子ノックダウンは観察されなかった。GalNAc₃-パルミトイル標的指向リガンドは、コレステロールポリヌクレオチド標的指向部分に比べて、siRNAの肝細胞への送達改善を提供した。

（表３）siRNA-GalNAcクラスター結合体プラス送達ポリマー注入後のインビボでの標的遺伝子のノックダウン、ポリマー用量の効果

^a動物体重1キログラムあたりのsiRNAまたはペプチドmg
^bタンパク質相対％

C. マスクしたDW1360送達ポリマーと同時送達した場合のsiRNA-ガラクトースクラスター-薬物動態調節剤結合体の送達に対する疎水性基サイズの効果
DW1360を7重量当量のCDM-PEG：CDM-NAG 2：1で修飾した。完全2'F/MeO安定化apoB siRNAを示した疎水性PK基を有するGalNAc₃-PK標的指向部分に結合した。siRNA-結合体およびDW1360送達ペプチドの、20gのICRマウス（n＝3）への同時投与は、血清ApoBタンパク質レベルの低下を引き起こし、siRNAの肝実質細胞への送達およびApoB遺伝子発現の阻害を示していた。効率的な送達は、送達ペプチドおよびRNAiポリヌクレオチドへの標的指向部分結合の両方を必要とした（表4）。炭素原子16〜20個のPK基（15〜19個の炭素原子疎水性基）を有するポリヌクレオチド標的指向リガンドで、最適な送達が観察された。

（表４）siRNA-GalNAcクラスター結合体プラス送達ポリマー注入後のインビボでの標的遺伝子のノックダウン、ポリマー用量の効果

^a動物体重1キログラムあたりのsiRNAまたはポリマーmg
^bタンパク質相対％

実施例24. インビボで投与したsiRNA-GalNAcクラスター-PKの生体内分布
様々な疎水性側鎖を含む6つの異なるGalNAcクラスター-PK標的指向部分を、ApoBに向けたsiRNAに共有結合した。これらの結合体を雄Wistarラットに2.5mg/kgの用量で静脈内（静脈内ボーラス）投与した（表5）。血液試料を異なる動物から投与後5、15、30、60、90、120、240および360分の時点で採取した（各時点でn＝2）。採血直後にEDTA血漿を生成し、これを続いてプロテイナーゼK（Epicentre Biotechnologies、米国）で処理した。肝臓および脾臓組織試料（500mg）を、屠殺した動物（n＝2）から投与後1.5および6時間の時点で回収した。凍結組織片を粉砕して微粉を得た。各組織の一定量を秤量し、Lysis Mixture（Panomics、米国）、プロテイナーゼK（Epicentre Biotechnologies、米国）およびSONOPULS HD 2070（Bandelin、ドイツ）超音波ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。得られた最終組織溶解物は約50mg/mLの濃度を有していた。

血漿および組織試料中のsiRNA濃度を、独占権下にあるオリゴヌクレオチド検出法を用いて判定した。簡単に言うと、siRNA定量は、相補的な蛍光（Atto-425）標識PNAプローブとsiRNA二重鎖のアンチセンス鎖とのハイブリダイゼーションおよびAEX-HPLC分離に基づいていた。定量は、対応する非結合ApoB二重鎖の一連の希釈液から生成した外部較正曲線に対する蛍光検出によって行った。この二重鎖は、PK実験で試験したすべての結合体に共通の同一のアンチセンス鎖で構成されていた。血漿試料（0.2〜2μL）および組織試料（約1mg）をHPLC装置に注入した。

肝臓について組織の結果を表5に示す。肝臓において、PK調節剤を欠く（さらなる疎水性鎖なし）標的指向部分を有するsiRNAで最低濃度が見られた。標的指向部分上に疎水性側鎖PK調節剤を有するすべての結合体で、肝臓におけるsiRNA濃度はより高かった。1.5時間後の最高濃度は、GalNAcクラスターに加えて2つのオクタノイル側鎖を有する標的指向部分で見られた。投与の6時間後、GalNAcクラスターに加えてC₂₀-アシル側鎖を有する標的指向部分は最も高い肝臓濃度を示した。したがって、疎水性側鎖が標的指向部分に組み込まれている場合、GalNAc-結合siRNAの肝臓取り込みは、PK特性を調節することによって高めることができる。

具体的なメカニズムは不明であるが、PK調節剤が血漿タンパク質結合の増大と、したがって循環時間の延長を引き起こすことが可能である。次いで、循環時間の延長は組織標的指向の増大をもたらした。反対に、PK調節剤非存在下では、siRNAは腎ろ過によって循環からより速やかに排出された。

分布特性は部分的には側鎖の疎水性と相関しうる。PK調節剤なし、およびC8 PK調節剤は、循環からより速やかに排出され、最も低い肝臓を標的とする分布を有し、最小の標的遺伝子ノックダウンを示した。これに対し、16〜20個の炭素原子を有するPK調節剤の存在は、循環からの排出がより遅く、より高い肝臓を標的とする分布を有し、標的遺伝子ノックダウンの増大を示した（図7）。

（表５）投与1.5時間後の肝臓中のsiRNA

^a注入の1.5時間後

実施例25. 薬物動態調節剤の使用による腫瘍標的指向の増大
siRNAを葉酸もしくはコレステロールのいずれか単独または葉酸-コレステロール薬物動態調節剤に結合した。5mgのsiRNAをKB異種移植マウスに注入した。次いで、腫瘍を分離し、siRNAの存在について検定した。注入の2時間後、葉酸-コレステロール薬物動態調節剤に結合したsiRNA（＞500ng/g）では、葉酸またはコレステロールのいずれか単独に結合したsiRNA（100ng/g未満）に比べて、腫瘍中に有意に多くのsiRNAが認められた。注入の6時間後、差はさらに顕著で、約500ng/gと＜50ng/gであった。

KB異種移植モデル：KB細胞はATCCから入手し、10％FBSを補足したGIBCO/Invitrogenからの葉酸を含まないRPMI 1640培地（# 27016）中で成長させた。KB細胞は、宿主マウスへの注入前に葉酸を含まない培地中で2週間培養すべきである。Athymic Nude-Foxnl^nu（Fox Chase Nude）はHarlan laboratoryから入手した。マウスに葉酸を含まない飼料（DYET# 17772、Dyets Inc.、Bethlehem、PA 18017から）を腫瘍接種の2〜3週間前からと、接種後与えた。コンフルエント以下のKB細胞をトリプシン処理し、PBSで洗浄し、PBS中に100万/100μlで懸濁した。100〜200万個の細胞を左側腹下に皮下注入し、腫瘍成長を1週間に2回デジタルキャリパーでモニターした。腫瘍が5〜8mmの間のサイズになり、したがって十分に血管新生化していると予測されれば（典型的には7〜10日）、マウスにsiRNAを注入した。

siRNA定量：組織試料を凍結状態で微粉砕し、15〜25mgの凍結粉末をヌクレアーゼを含まない水中で1：3希釈したLysis Solution（Panomics/Affymetrix）1mLに懸濁した。試料を超音波スティックで超音波処理し、続いてプロテイナーゼK（Panomics/Affymetrix）により65℃で30分間処理した。プロテイナーゼK処理後、20μLの3M KClを200μLの組織超音波処理物に加えてSDSを沈澱させた。試料を氷上に10分間置き、続いて4℃、4000rcfで15分間遠心分離した。siRNA定量のために上清を回収した。上清100μLをアンチセンス鎖を標的とする10μM Atto610-PNA-プローブ溶液5μLと混合した。ハイブリダイゼーション緩衝液（50mMトリス-Cl、pH8.0）を加えて最終量200μLとした。試料をサーマルサイクラー中95℃で15分間インキュベートし、次いで温度を50℃まで下げ、さらに15分間インキュベートすることによりハイブリダイズさせた。較正曲線を同じ条件下で一連のsiRNA希釈液から生成し、次いですべての試料をHPLCオートサンプラーに入れた。試料を100μLの量で50℃に加熱したDionex DNAPac PA-100 4×250mmカラムに注入した。試料を二成分勾配を用い、1mL/分の流速で溶離した。緩衝液A：lOmMトリス、30％ACN、lOOmM NaCl、pH7。緩衝液B：lOmMトリス、30％ACN、900mM NaCl、pH7。試料を島津RF-lOAxl蛍光検出器（励起：436nm、発光：484nm）を用いて分析した。

Claims (15)

1. 骨格分子を介して薬物動態調節剤と共有結合しているアシアロ糖タンパク質受容体リガンドを含む、インビボでRNA干渉ポリヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物であって、ここで、
   該アシアロ糖タンパク質受容体は、ポリエチレングリコールスペーサーを介して中心の分枝点にそれぞれ連結している2から4つのガラクトース誘導体を有するガラクトースクラスターを含み、
   該薬物動態調節剤は、16個以上の炭素原子を有する疎水性基を含み、かつ、
   該骨格分子は、さらに該RNA干渉ポリヌクレオチドと共有結合している、組成物。
2. RNA干渉ポリヌクレオチドが、骨格分子に生理的に不安定な連結を介して共有結合されている、請求項1記載の組成物。
3. 薬物動態調節剤が、16〜20個の炭素原子を有する疎水性基を含む、請求項1記載の組成物。
4. 薬物動態調節剤が、パルミトイル、ヘキサデカ-8-エノイル、オレイル、(9E,12E)-オクタデカ-9,12-ジエノイル、ジオクタノイル、およびC16-C20アシルからなる群より選択される、請求項1記載の組成物。
5. 薬物動態調節剤がコレステロールを含む、請求項1記載の組成物。
6. ガラクトース誘導体が、ガラクトース、ガラクトサミン、N-ホルミル-ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-プロピオニル-ガラクトサミン、N-n-ブタノイル-ガラクトサミン、およびN-イソ-ブタノイルガラクトサミンからなる群より選択される、請求項1記載の組成物。
7. ガラクトースクラスターがN-アセチルガラクトサミン三量体を含む、請求項6記載の組成物。
8. ポリヌクレオチド送達ポリマーをさらに含む、請求項1記載の組成物。
9. ポリヌクレオチド送達ポリマーが、可逆的に修飾された膜活性ポリアミンを含む、請求項8記載の組成物。
10. RNA干渉ポリヌクレオチドが、DNA、RNA、dsRNA、RNA干渉ポリヌクレオチド、siRNA、およびmiRNAからなる群より選択される、請求項1記載の組成物。
11. ASGPr標的指向部分-薬物動態調節剤標的指向部分に共有結合されているポリヌクレオチドを含む、インビボで該ポリヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物。
12. ASGPr標的指向部分が、ガラクトース、ガラクトサミン、N-ホルミル-ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-プロピオニル-ガラクトサミン、N-n-ブタノイル-ガラクトサミン、N-イソ-ブタノイルガラクトサミン、ガラクトースクラスター、およびN-アセチルガラクトサミン三量体からなる群より選択される、請求項11記載の組成物。
13. 薬物動態調節剤が、16個以上の炭素原子を有する疎水性基、16〜20個の炭素原子を有する疎水性基、パルミトイル、ヘキサデカ-8-エノイル、オレイル、(9E,12E)-オクタデカ-9,12-ジエノイル、ジオクタノイル、およびC16-C20アシル、ならびにコレステロールからなる群より選択される、請求項11記載の組成物。
14. ASGPr標的指向部分-薬物動態調節剤標的指向部分がポリヌクレオチドに生理的に不安定な連結を介して連結されている、請求項11記載の組成物。
15. ASGPr標的指向部分および薬物動態調節剤がポリヌクレオチドに骨格分子を介して連結されている、請求項11記載の組成物。

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