JP2016185968A - siRNA用ガラクトースクラスター−薬物動態調節剤標的指向部分 - Google Patents
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Abstract
Description
[2] RNA干渉ポリヌクレオチドが、標的指向リガンド-薬物動態調節剤標的指向部分に生理的に不安定な連結を介して共有結合されている、[1]記載の組成物。
[3] 薬物動態調節剤が、16個以上の炭素原子を有する疎水性基からなる、[1]記載の組成物。
[4] 薬物動態調節剤が、16〜20個の炭素原子を有する疎水性基からなる、[3]記載の組成物。
[5] 薬物動態調節剤が、パルミトイル、ヘキサデカ-8-エノイル、オレイル、(9E,12E)-オクタデカ-9,12-ジエノイル、ジオクタノイル、およびC16-C20アシルからなる群より選択される、[3]記載の組成物。
[6] 薬物動態調節剤がコレステロールからなる、[3]記載の組成物。
[7] 標的指向リガンドが細胞受容体リガンドからなる、[1]記載の組成物。
[8] 細胞受容体リガンドがアシアロ糖タンパク質受容体標的指向部分を含む、[7]記載の組成物。
[9] アシアロ糖タンパク質受容体標的指向部分が、ガラクトース、ガラクトサミン、N-ホルミル-ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-プロピオニル-ガラクトサミン、N-n-ブタノイル-ガラクトサミン、およびN-イソ-ブタノイルガラクトサミンからなる群より選択される、[8]記載の組成物。
[10] アシアロ糖タンパク質受容体標的指向部分がガラクトースクラスターを含む、[8]記載の組成物。
[11] ガラクトースクラスターがN-アセチルガラクトサミン三量体からなる、[10]記載の組成物。
[12] 細胞受容体リガンドが葉酸を含む、[7]記載の組成物。
[13] ポリヌクレオチド送達ポリマーをさらに含む、[1]記載の組成物。
[14] ポリヌクレオチド送達ポリマーが、可逆的に修飾された膜活性ポリアミンを含む、[13]記載の組成物。
[15] RNA干渉ポリヌクレオチドが、DNA、RNA、dsRNA、RNA干渉ポリヌクレオチド、siRNA、およびmiRNAからなる群より選択される、[1]記載の組成物。
[16] ASGPr標的指向部分-薬物動態調節剤標的指向部分に共有結合されているポリヌクレオチドを含む、インビボで該ポリヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物。
[17] ASGPr標的指向部分が、ガラクトース、ガラクトサミン、N-ホルミル-ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-プロピオニル-ガラクトサミン、N-n-ブタノイル-ガラクトサミン、N-イソ-ブタノイルガラクトサミン、ガラクトースクラスター、およびN-アセチルガラクトサミン三量体からなる群より選択される、[16]記載の組成物。
[18] 薬物動態調節剤が、16個以上の炭素原子を有する疎水性基、16〜20個の炭素原子を有する疎水性基、パルミトイル、ヘキサデカ-8-エノイル、オレイル、(9E,12E)-オクタデカ-9,12-ジエノイル、ジオクタノイル、およびC16-C20アシル、ならびにコレステロールからなる群より選択される、[16]記載の組成物。
[19] ASGPr標的指向部分-薬物動態調節剤標的指向部分がポリヌクレオチドに生理的に不安定な連結を介して連結されている、[16]記載の組成物。
[20] ASGPr標的指向部分および薬物動態調節剤がポリヌクレオチドに骨格分子を介して連結されている、[16]記載の組成物。
本発明のさらなる目的、特徴、および利点は、添付の図面と一緒に読めば、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
本明細書において記載するのは、改善されたRNA干渉ポリヌクレオチド標的指向部分である。本発明のポリヌクレオチド標的指向部分は、薬物動態調節剤と組み合わせた標的指向リガンドを含む。好ましい態様において、標的指向リガンドおよび薬物動態調節剤を互いに共有結合し、次いでsiRNAに共有結合する。好ましい態様において、siRNAへの連結は生理的に不安定な共有結合による。
(M1-L)x-P-(L-M2)yプラスN-T、
式中、NはRNAiポリヌクレオチドであり、Tは標的指向リガンド-薬物動態調節剤ポリヌクレオチド標的指向部分であり、Pは膜活性ポリアミンであり、かつマスキング剤M1は、マレアマート連結などの生理的に可逆的な連結Lを介してPに共有結合されている、標的指向部分(肝臓への送達のためにアシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有する、ガラクトースまたはガラクトース誘導体など)を含む。Lの切断はポリアミンP上の非修飾アミンを復旧する。マスキング剤M2は任意である。存在する場合、M2は、マレアマート連結などの生理的に可逆的な連結Lを介してPに共有結合されている、親水性立体安定化部分である。xおよびyはそれぞれ整数である。その非修飾状態で、Pは膜活性ポリアミンである。ポリヌクレオチドのインビボ送達に適した膜活性ポリアミンは当技術分野において述べられている。送達ポリマー(M1-L)x-P-(L-M2)yは膜活性ではない。M1および任意にM2の結合によるPアミンの可逆的修飾は、Pの膜活性を可逆的に阻害または不活化し、Pの正味の正電荷を低減する。十分なマスキング剤をPに結合して、ポリマーの膜活性を阻害する。x+yは、任意のマスキング剤非存在下でのP上のアミンの量により判定して、ポリアミンP上のアミンの50%よりも大きい、より好ましくは60%よりも大きい、より好ましくは70%よりも大きい値を有する。Pがメリチンなどの膜活性ペプチドの場合、x+yは、任意のマスキング剤非存在下でのP上のアミンの量により判定して、ポリアミンP上のアミンの80%よりも大きい、より好ましくは90%よりも大きい値を有する。可逆的連結Lの切断後、非修飾アミンが復旧し、それによりPをその非修飾、膜活性状態に戻す。可逆的連結Lの可逆的結合は、切断が所望の組織、臓器、または細胞下部位に存在するものなどの、所望の生理的条件において起こるように選択する。好ましい可逆的連結はpHに不安定な連結である。(M1-L)x-P-(L-M2)y、ASGPrを標的とする可逆的にマスクした膜活性ポリマー(マスクしたポリマー)、およびT-N、ポリヌクレオチド結合体を別々に合成または製造する。TもNもP、L、M1またはM2に直接または間接的に共有結合されていない。ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド結合体のマスクした、またはマスクしていないポリマーとの静電的また疎水性結合は、ポリヌクレオチドのインビボ肝送達に必要とされていない。マスクしたポリマーおよびポリヌクレオチド結合体は同じ容器または別々の容器で供給することができる。これらは投与の前に混合してもよく、同時投与してもよく、または逐次投与してもよい。
本発明のポリマーは両親媒性膜活性ポリアミンである。ポリマーはモノマーと呼ばれるより小さい単位を繰り返し結合することにより構築される分子である。ポリマーは単一のモノマーを用いるホモポリマーでもありえ、またはポリマーは複数の異なるモノマーを用いるコポリマーもしくはヘテロポリマーでもありうる。ポリマーの主鎖は、その結合がポリマー長の伸長のために必要とされる原子からなる。ポリマーの側鎖は、その結合がポリマー長の伸長のために必要とされない原子からなる。
両親媒性(amphipathic)、または両親媒性(amphiphilic)ポリマーは当技術分野において周知で、認められており、親水性(極性、水溶性)および疎水性(非極性、親油性、水不溶性)基または部分の両方を有する。
本明細書において用いられる膜活性ポリマーは、生体膜に対して以下の効果の1つまたは複数を誘導することができる、表面活性、両親媒性ポリマーである:非膜透過性分子が細胞に侵入する、もしくは膜を通過することを可能にする、膜の変化もしくは破壊、膜における孔形成、膜の分裂、または膜の破壊もしくは溶解。本明細書において用いられる膜、または細胞膜は、脂質二重層を含む。膜の変化または破壊は、以下の検定の少なくとも1つにおいてポリマーの活性により機能的に規定することができる:赤血球溶解(溶血)、リポソーム漏出、リポソーム融合、細胞融合、細胞溶解、およびエンドソーム放出。細胞膜の溶解を引き起こしうる膜活性ポリマーは、膜溶解性ポリマーとも呼ぶ。原形質膜よりもエンドソームまたはリソソームの破壊を優先的に引き起こすポリマーはエンドソーム溶解性と考えられる。膜活性ポリマーの細胞膜に対する効果は一時的でありうる。膜活性ポリマーは、膜に対する親和性を有し、二重層構造の変性または変形を引き起こす。膜活性ポリマーは合成または非天然両親媒性ポリマーでありうる。
エンドソーム溶解性ポリマーは、pHの変化に反応して、エンドソームの破壊もしくは溶解を引き起こす、またはポリヌクレオチドもしくはタンパク質などの通常は細胞膜不透過性の化合物の、エンドソームもしくはリソソームなどの細胞内部の膜封入小胞からの放出を提供することができるポリマーである。エンドソーム溶解性ポリマーは、生理的に適切なpH範囲(通常はpH5.5〜8)にわたって、それらの物理化学的性質のシフトを起こす。このシフトは、電荷、疎水性、または親水性におけるシフトの結果としての、ポリマーの溶解性または他の化合物もしくは膜と相互作用する能力における変化でありうる。例示的エンドソーム溶解性ポリマーは、pHに不安定な基または結合を有する。したがって、マスキング剤がpHに不安定な結合を介してポリマーに結合している、可逆的にマスクした膜活性ポリマーは、エンドソーム溶解性ポリマーであると考えることができる。
本発明の送達ポリマーは、可逆的修飾が膜活性を阻害し、ポリアミンを中和して正電荷を低減し、ほぼ中性電荷のポリマーを生成し、細胞型特異的標的指向を提供し、かつポリマーの非特異的相互作用を阻害する、可逆的に修飾した両親媒性膜活性ポリアミンを含む。ポリアミンはポリアミン上のアミンの可逆的修飾を通じて可逆的に修飾する。
式中、R1はメチル(-CH3)基、エチル(-CH2CH3)基、またはプロピル(-CH2CH2CH3)基などのアルキル基であり(置換アルキル無水マレイン酸を形成する)、かつR2は標的指向リガンドまたは立体安定化部分を含む。
本明細書において用いられる立体安定化部分は、立体安定化部分を含まないポリマーに比べて、それが結合しているポリマーの分子内または分子間相互作用を防止または阻害する、非イオン性親水性ポリマー(天然、合成、または非天然のいずれか)である。立体安定化部分は、それが結合しているポリマーが静電相互作用に参加することを妨害する。静電相互作用は、正電荷と負電荷との間の引力による、複数の物質の非共有結合である。立体安定化部分は血液成分との相互作用を阻害し、したがって細網内皮系によるオプソニン作用、食作用、および取り込みを阻害することができる。したがって、立体安定化部分は、それらが結合している分子の循環時間を延長することができる。立体安定化部分はポリマーの凝集も阻害しうる。好ましい立体安定化部分はポリエチレングリコール(PEG)またはPEG誘導体である。本明細書において用いられる好ましいPEGは、約1〜500のエチレングリコールモノマー、2〜20のエチレングリコールモノマー、5〜15のエチレングリコールモノマー、または約10のエチレングリコールモノマーを有しうる。本明細書において用いられる好ましいPEGは、約85〜20,000ダルトン(Da)、約200〜1000Da、約200〜750Da、または約550Daの分子量平均も有しうる。本明細書において用いられる立体安定化部分は水溶液中で、立体安定化部分を含まないポリマーに比べて、それが結合しているポリマーの分子内または分子間相互作用を防止または阻害する。
標的指向基、または標的指向リガンドは、ポリマーまたは化合物を標的細胞もしくは組織、または特定の細胞型に標的指向させる、または送達するために用いる。標的指向基は分子の標的細胞との結合を増強する。したがって、標的指向基はそれらが結合している結合体の薬物動態または生体内分布特性を増強して、結合体の細胞分布および細胞取り込みを改善しうる。1つまたは複数の標的指向基を膜活性ポリマーに、直接またはスペーサーによる連結を介してのいずれかで連結することができる。標的指向リガンドなどの標的指向基の細胞または細胞受容体への結合はエンドサイトーシスを開始しうる。標的指向基は一価、二価、三価、四価でありえ、またはそれ以上の結合価を有しうる。標的指向基は、細胞表面分子に親和性を有する化合物、細胞受容体リガンド、ならびに細胞表面分子に親和性を有する抗体、抗体断片、および抗体様物質を含む群より選択してもよい。好ましい標的指向基は、細胞受容体リガンドを含む。薬物および遺伝子に細胞および特定の細胞受容体を標的とさせるために、様々なリガンドが用いられてきた。細胞受容体リガンドは、炭水化物、グリカン、糖質(ガラクトース、ガラクトース誘導体、マンノース、およびマンノース誘導体を含むが、それらに限定されるわけではない)、ビタミン、葉酸、ビオチン、アプタマー、およびペプチド(RGD含有ペプチド、インスリン、EGF、およびトランスフェリンを含むが、それらに限定されるわけではない)を含む群より選択してもよい。標的指向基の例には、アシアロ糖タンパク質またはガラクトース残基を用いることにより、アシアロ糖タンパク質受容体を標的とするものが含まれる。例えば、肝臓の肝実質細胞はASGP受容体を含む。したがって、肝実質細胞を標的とするためにガラクトース含有標的指向基を用いてもよい。ガラクトース含有標的指向基には、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン、オリゴ糖、および糖類クラスター(Tyr-Glu-Glu-(アミノヘキシルGalNAc)3、リジン系ガラクトースクラスター、およびコラン系ガラクトースクラスターなど)が含まれるが、それらに限定されるわけではない。さらに適切な結合体には、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGP-R)上で見いだされる炭水化物認識ドメイン(CRD)に結合しうるオリゴ糖が含まれうる。オリゴ糖および/または炭水化物複合体を含む結合体部分の例は、米国特許第6,525,031号に提供されている。
標的指向部分または基は、それらが結合している結合体の薬物動態または生体分布特性を増強して、結合体の細胞特異的分布および細胞特異的取り込みを改善する。ガラクトースおよびガラクトース誘導体は、肝実質細胞表面上で発現されるアシアロ糖タンパク質受容体(ASGPr)へのそれらの結合を通じて、インビボで分子を肝実質細胞へと標的指向させるために用いられてきた。本明細書において用いられるASGPr標的指向部分は、ガラクトースおよびガラクトースと等しいか、またはそれよりも大きいASGPrへの親和性を有するガラクトース誘導体を含む。ガラクトース標的指向部分のASGPrへの結合は、送達ポリマーの肝実質細胞への細胞特異的標的指向および送達ポリマーの肝実質細胞へのエンドサイトーシスを促進する。
ゼータ電位は、懸濁液中の粒子が示す物理的性質であり、表面電荷に密接に関連している。水性媒質中で、試料のpHはゼータ電位に影響をおよぼす最も重要な因子の1つである。電荷が塩基/酸のプロトン化/脱プロトン化に基づいている場合、電荷はpHに依存する。したがって、ゼータ電位の値が意味を持つためには、溶液の状態、特にpHを含まなければならない。典型的な粒子について、ゼータ電位の大きさはコロイド系の潜在的安定性の指標となる。懸濁液中のすべての粒子が大きい負または正のゼータ電位を有する場合、これらは互いに反発する傾向があり、粒子が一緒になる傾向はないであろう。しかし、粒子が低いゼータ電位値を有する場合、粒子が一緒になって凝集するのを防ぐ力はないであろう。典型的な粒子の安定懸濁液と不安定懸濁液との間の一般的境界線は、一般には+30または-30mVのいずれかとされる。+30mVよりも正または-30mVよりも負のゼータ電位を有する粒子は通常は安定と考えられる。記載の発明の送達ポリマーは、生理的塩およびpH8で20mVから-20mVのゼータ電位を示すが、水溶液中でコロイドとして安定であり、凝集しない。
連結またはリンカーは、関心対象の1つの化学基または区分を関心対象のもう一つの化学基または区分に、1つまたは複数の共有結合を介して連結する、2つの原子間の接続である。例えば、連結はマスキング剤をポリマーに接続することができる。連結の形成は2つの別々の分子を1つの分子に接続することもあり、または同じ分子内の2つの原子を接続することもある。連結は中性電荷でもよく、または正もしくは負の電荷を有していてもよい。可逆的または不安定な連結は可逆的または不安定な結合を含む。連結は任意に2つのつなぎ合わせた原子間の距離を延ばすスペーサーを含んでいてもよい。スペーサーは連結に柔軟性および/または長さをさらに加えうる。スペーサーには、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、アラルキニル基が含まれるが、それらに限定されるわけではなく;これらはそれぞれ1つまたは複数のヘテロ原子、複素環、アミノ酸、ヌクレオチド、および糖類を含みうる。スペーサー基は当技術分野において周知で、前述のリストは本発明の範囲を制限する意図はない。
発明者らは、RNAiポリヌクレオチドの標的指向リガンド-薬物動態調節剤標的指向部分への結合、およびRNAiポリヌクレオチド結合体の前述の送達ポリマーとの同時投与は、インビボでのRNAiポリヌクレオチドの改善された送達を提供することを見いだした。機能的送達とは、RNAiポリヌクレオチドが細胞に送達され、予期される生物活性である遺伝子発現の配列特異的阻害を有することを意味する。哺乳動物の脈管構造に投与された、ポリヌクレオチドを含む多くの分子は、通常は肝臓によって体から排出される。ポリヌクレオチドが体からの除去のために分解またはそれ以外に処理され、ポリヌクレオチドが遺伝子発現の配列特異的阻害を引き起こさない、肝臓によるポリヌクレオチドのクリアランスは、機能的送達とは考えない。
ポリヌクレオチド、または核酸もしくはポリ核酸なる用語は、少なくとも2つのヌクレオチドを含むポリマーを意味する当技術分野の用語である。ヌクレオチドはポリヌクレオチドポリマーのモノマー単位である。120未満のモノマー単位を有するポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドと呼ぶことが多い。天然核酸はデオキシリボース-またはリボース-リン酸骨格を有する。非天然または合成ポリヌクレオチドは、インビトロまたは無細胞系で重合されるポリヌクレオチドで、天然リボースまたはデオキシリボース-リン酸骨格と同じまたは類似の塩基を含むが、異なる型の骨格を含みうる。ポリヌクレオチドは任意の当技術分野において公知の技術を用いて合成することができる。当技術分野において公知のポリヌクレオチド骨格には、PNA(ペプチド核酸)、ホスホロチオアート、ホスホロジアミダート、モルホリノ、および天然核酸のリン酸骨格の他の変種が含まれる。塩基にはプリンおよびピリミジンが含まれ、これらにはさらに天然化合物アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然類縁体が含まれる。プリンおよびピリミジンの合成誘導体には、アミン、アルコール、チオール、カルボキシラート、およびハロゲン化アルキルなどであるが、それらに限定されるわけではない、ヌクレオチド上に新しい反応性基を配置する修飾が含まれるが、それらに限定されるわけではない。塩基なる用語は、DNAおよびRNAの任意の公知の塩基類縁体を含む。ポリヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、または任意の適切な組み合わせを含んでいてもよい。ポリヌクレオチドはインビトロで重合してもよく、組換えでもよく、キメラ配列、またはこれらの基の誘導体を含む。ポリヌクレオチドは5'末端、3'末端、または5'および3'両末端に末端キャップ部分を含んでいてもよい。キャップ部分は、逆方向デオキシ脱塩基部分、逆方向デオキシチミジン部分、チミジン部分、または3'グリセリル修飾でありうるが、それらに限定されるわけではない。
薬理学および毒性学において、投与経路は薬物、液体、毒、または他の物質を体に接触させる道である。一般に、哺乳動物を治療するための薬物および核酸の投与法は当技術分野において周知で、本発明の組成物の投与に適用することができる。本発明の化合物は、任意の適切な経路を介して、最も好ましくは非経口により、その経路に適切に合わせて作られた製剤で投与することができる。したがって、本発明の化合物は、注射により、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、または腹腔内投与することができる。したがって、本発明は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物も提供する。
RNAiポリヌクレオチドを研究目的のため、または細胞において治療的である変化を生じるために送達してもよい。RNAiポリヌクレオチドのインビボ送達は、研究試薬のため、ならびに様々な治療、診断、標的確認、ゲノム発見、遺伝子工学、および薬理ゲノミクス適用のために有用である。発明者らは、肝実質細胞における内因性遺伝子発現の阻害をもたらすRNAiポリヌクレオチド送達を開示してきた。ポリヌクレオチドの送達後に測定したレポーター(マーカー)遺伝子発現のレベルは、他のポリヌクレオチド送達後の遺伝子発現が同様のレベルであるとの合理的な予想を示している。当業者により有益と考えられる治療のレベルは疾患ごとに異なる。例えば、血友病AおよびBはそれぞれX連鎖第VIIIおよび第IX凝固因子の欠失によって引き起こされる。これらの臨床経過は第VIIIまたは第IX因子の通常の血清レベルのパーセンテージによって大きく影響される:<2%、重度;2〜5%、中等度;および5〜30%軽度。したがって、重度患者における循環因子の通常レベルの1%から2%への上昇は有益であると考えることができる。6%よりも高いレベルは自然出血を防止するが、手術または傷害に続発するものは防止しない。同様に、遺伝子の阻害は治療的利益を提供するために100%である必要はない。遺伝子療法の当業者であれば、マーカー遺伝子の結果の十分なレベルに基づき、疾患に特異的な遺伝子発現の有益なレベルを合理的に予想するであろう。血友病の例において、マーカー遺伝子が発現されて第VIII因子の通常レベルの2体積%に匹敵するレベルでタンパク質を生じる場合、第VIII因子をコードする遺伝子も同様のレベルで発現されるであろうと合理的に予期することができる。したがって、レポーターまたはマーカー遺伝子は一般に細胞内タンパク質の発現の有用な代表例として役立つ。
A. アミン含有モノマーの組み込みのためのビニルエーテルモノマー
2-ビニルオキシエチルフタルイミドを、2-クロロエチルビニルエーテル(25g、0.24mol;CAS #110-75-8)およびフタルイミドカリウム(25g、0.135mol;CAS #1074-82-4)を100℃のN,N-ジメチルホルムアミド(DMF、75ml)中、相転移触媒として臭化テトラn-ブチルアンモニウム(0.5g;CAS #1643-19-2)を用いて反応させることにより調製した。この溶液を6時間加熱し、次いで水中で粉砕し、ろ過した。次いで、この固体をメタノールから2回再結晶して、白色結晶を得た。
Xmol%アミン保護ビニルエーテル(例えば、2-ビニルオキシエチルフタルイミド)を乾燥器で乾燥した丸底フラスコの窒素雰囲気下、無水ジクロロメタン中に加える。この溶液にYmol%低級疎水性基(例えば、プロピル、ブチル)ビニルエーテルおよび任意にZmol%高級疎水性基(例えば、ドデシル、オクタデシル)ビニルエーテルを加える(図1)。溶液を-50から-78℃の浴に入れ、2-ビニルオキシエチルフタルイミドを沈澱させる。この溶液に10mol%BF3・(OCH2CH3)2を加え、-50から-78℃で2〜3時間反応を進行させる。メタノール中の水酸化アンモニウム溶液を加えて重合を停止する。ポリマーを減圧下で乾燥し、次いで1,4-ジオキサン/メタノール(2/1)に加える。フタルイミドに対し20mol当量のヒドラジンを加えて、アミンから保護基を除去する。溶液を3時間還流し、次いで減圧下で乾燥する。得られた固体を0.5mol/L HClに溶解し、15分間還流してポリマーの塩酸塩を生成し、蒸留水で希釈し、さらに1時間還流する。次いで、溶液をNaOHで中和し、室温(RT)まで冷却し、分子セルロースチューブに移し、蒸留水に対して透析し、凍結乾燥する。ポリマーをサイズ排除または他のクロマトグラフィを用いてさらに精製することもできる。ポリマーの分子量を、分析用サイズ排除クロマトグラフィおよび多角光散乱によるサイズ排除クロマトグラフィ(SEC-MALS)を含む、標準的手順によりカラムを用いて推定する。
アミン/ブチル/オクタデシルポリ(ビニルエーテル)ターポリマーを、2-ビニルオキシエチルフタルイミド(5g、23.02mmol)、ブチルビニルエーテル(0.665g、6.58mmol)、およびオクタデシルビニルエーテル(0.488g、1.64mmol)モノマーから合成した。2-ビニルオキシエチルフタルイミドを、磁気撹拌子を含む乾燥器で乾燥した200mL丸底フラスコのアルゴン雰囲気下、36mLの無水ジクロロメタン中に加えた。この溶液にブチルビニルエーテルおよびn-オクタデシルビニルエーテルを加えた。モノマーを室温(RT)で完全に溶解し、澄明な均質溶液を得た。次いで、澄明溶液を含む反応容器を、ACS等級の変性アルコールおよびエチレングリコールの1:1溶液にドライアイスを加えて作った-50℃の浴に入れ、フタルイミドモノマーの目に見える沈澱を形成させた。約1.5分間冷却した後、BF3・(OCH2CH3)2(0.058g、0.411mmol)を加えて、重合反応を開始した。フタルイミドモノマーは重合開始後に溶解した。-50℃で3時間反応を進行させた。メタノール中1%水酸化アンモニウム5mLを加えて重合を停止した。次いで、溶媒をロータリーエバポレーションで除去した。
ポリ(アクリラート)およびポリ(メチルアクリラート)ヘテロポリマーを一般的なフリーラジカル反応スキームを用いて合成してもよい(本明細書において用いられるポリ(メタクリラート)ポリアミンはポリ(アクリラート)ポリアミン属の亜属である):
式中、Rは独立に水素またはメチル基であり、Xはポリマー中に所望の比で存在する所望のモノマー側基である。
BOC保護アミン含有モノマー(M):
式中、n=1〜4であり、BOC保護基の除去により一級アミンが生じる。
低級疎水性基モノマー(N):
式中、n=1〜5であり、1つまたは複数の炭素は不飽和であってもよい。
高級疎水性基モノマー(O):
式中、n=8〜24であり、1つまたは複数の炭素は不飽和であってもよい。
R、R'、およびR''は独立に水素またはメチルであり
x=2、3、または4であり
y=0、1、2、3、4、または5[メチル(C1)〜ヘキシル(C6)]であり
z=≧8の整数[デシル(C10)またはそれ以上]であり
a、b、およびdはポリマーが所望の比の前述のモノマーを有するように選択した整数である。
2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)(AIBN、ラジカル開始剤)、アセトニトリル、およびジオキサンはSigma Aldrichから購入した。アクリラートおよびメタクリラートモノマーをろ過して阻害剤を除去した。3-(BOC-アミノ)1-プロパノール(TCI)を塩化アクリロイル(CAS 814-68-6)と反応させて、BOC-アミノプロピルアクリラート(BAPA)を生成した。
BAPA(9.739mmol)(A)、メタクリル酸ブチル(3.478mmol)(B)、およびメタクリル酸オクタデシル(0.6957mmol)(D)を、撹拌子を備えた20mL反応チューブに加えた。アセトニトリル(16ml)と、続いてAIBN(0.4174mmol)を加えた。2回の反応を並行して行うために、前述の段階を繰り返した。反応混合物をN2で30分間パージした。次いで、反応チューブに栓をし、油浴に移し、60℃で3時間加熱した。チューブを取り出し、内容物を合わせた。粗製ポリマーを脱イオン水中で沈澱させ、ニートトリフルオロ酢酸(40ml)と1.5時間反応させて、BOC保護基を除去し、一級アミンおよび水溶性膜活性ポリ(アクリラート)ポリアミンを生成した。200mLの脱イオンH2O(dH2O)を反応混合物に加え、溶液を3500MWカットオフセルロースチューブに移し、高塩に対して24時間と、次いでdH2Oに対して18時間透析した。内容物を蒸発乾固し、100mLのdH2Oに溶解し、凍結乾燥した。乾燥したポリマーを50%MeOH/100mMギ酸アンモニウム/0.2%ギ酸溶液に25mg/mlで溶解した。粗製ポリマー溶液(250mg、10ml)の3回の注入分を、S-200セファクリル担体で、XK50/30cmカラムを5.0ml/分の流速で用いて精製した。カラムを充填し、製造者の指示に従って用いた。(GE Healthcare、説明書56-1130-82 Al、52-2086-00 AH)。ポリマー溶出はShimadzu RID-10A屈折率コレクターを用いて検出した。23分から28分までの分画を集め、各注入ごとに合わせた。溶媒を蒸発させ、精製したポリマーを2回凍結乾燥した。
BAEEA(A)(11.13mmol)、メタクリル酸ブチル(B)(2.086mmol)、およびアクリル酸オクタデシル(D)(0.6957mmol)を、撹拌子を備えた20mL反応チューブに加えた。ジオキサン(16ml)と、続いてAIBN(0.4174mmol)を加えた。2回の反応を並行して行うために、前述の段階を繰り返した。反応混合物をN2で30分間パージした。次いで、反応チューブに栓をし、油浴に移し、60℃で3時間加熱した。チューブを取り出し、内容物を合わせた。ジオキサンをロータリーエバポレーションおよび高減圧により蒸発させ、粗製ポリマーを89.8%ジクロロメタン/10%テトラヒドロフラン/0.2%トリエチルアミン溶液に70mg/mlで溶解した。粗製ポリマー溶液(700mg、10ml)の3回の注入分を、Jordi gelジビニルベンゼン104Åカラム(内径:22mm、長さ:500mm)を5.0ml/分の流速で用いて精製した。ポリマー溶出はShimadzu RID-10A屈折率コレクターを用いて検出した。15.07分〜17.13分の分画を集めて合わせた。溶媒をロータリーエバポレーションにより蒸発させた。
BAPA(A)(8.40mmol)およびメタクリル酸エチル(B)(2.10mmol)を、撹拌子を備えた15mL反応チューブに加えた。アセトニトリル(11.5ml)と、続いてAIBN(0.315mmol)を加えた。2回の反応を並行して行うために、前述の段階を繰り返した。反応混合物をN2で30分間パージした。次いで、反応チューブに栓をし、油浴に移し、60℃で3時間加熱した。チューブを取り出し、内容物を合わせた。アセトニトリルをロータリーエバポレーションおよび高減圧により蒸発させ、粗製ポリマーを74.8%ジクロロメタン/25%テトラヒドロフラン/0.2%トリエチルアミン溶液に50mg/mlで溶解した。粗製ポリマー溶液(500mg、10ml)の3回の注入分を、Jordi gelフッ化ジビニルベンゼン104Åカラム(内径:22mm、長さ:500mm)を5.0ml/分の流速で用いて精製した。ポリマー溶出はShimadzu RID-10A屈折率コレクターを用いて検出した。17.16分〜19.18分の分画を集めて合わせた。溶媒をロータリーエバポレーションにより蒸発させた。精製したBOC保護ポリマーを氷酢酸中2M HCl(7ml)と1.5時間反応させて、BOC保護基を除去し、アミンを生成した。40mLのdH2Oを反応混合物に加え、溶液を3500MWカットオフセルロースチューブに移し、高塩に対して24時間と、次いでdH2Oに対して18時間透析した。内容物を蒸発乾固し、30mLのdH2Oに溶解し、2回凍結乾燥した。
実施例2. DW1360の特徴付け
A. 両親媒性分析
1,6-ジフェニル-1,3,5-ヘキサトリエン(DPH、Invitrogen)蛍光(λex=350nm;λem=452nm)は疎水性環境で増強される。この蛍光を用いてDW1360ポリマーを分析した。0.5μM(最終濃度)DPHを0.5mLの50mM HEPES緩衝液、pH8.0中10μgのDW1360に加えた。次いで、DPHの蛍光を測定することにより、溶液を疎水性環境におけるDPH蓄積について試験した。結合体存在下でのDPH蛍光の増大は、ポリマーによる疎水性環境の形成を示す。
ポリマー分子量(質量)(MW)を、バッチモードでのoptilab rEXと一緒にWyatt Dawn Heleos IIで分析して求めた。ポリマーを様々な濃度で適切な溶媒に加え、それぞれをWyattシステムにロードした。次いで、Astraソフトウェアで濃度の関数としての屈折率の変化を計算し(dn/dc)、これをZimmプロットで用いてMWを計算した。精製したDW1360について求めた平均分子量は4000〜6000Daであった。精製したアクリラートポリマーの平均分子量は約100〜120kDaであった。
ポリマーのゼータ電位をMalvern Zetasizerナノシリーズ(Nano ZS)機器を用いて測定した。CDMマスクポリマーのゼータ電位は0から-30mVの間で変動し、0から-20mVの間がより多かった。ゼータ電位は残留HEPESでpH8に緩衝化した等張グルコース中で測定した。pH7では、結合体はアミンの一部のプロトン化によりいくらかの正電荷を獲得すると予想される。
DW1360ポリマーを前述のとおりに合成し、続いて14重量当量のHEPES塩基および7重量当量のCDM-NAGとCDM-PEGとの重量比2:1の混合物(平均11単位)で処理した。1時間後、無水マレイン酸誘導体処理した結合体のアミン含量を、100mM NaHCO3中のトリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)で処理することにより測定した。マレイン酸修飾していない結合体に対して規準化すると、修飾アミンの量は全体の約75%であると定量された。この修飾の程度は加える無水マレイン酸の量を変えるか、または反応条件を変更することで変動しうる。
10mgの卵ホスファチジルコリンを、100mMカルボキシフルオレセイン(CF)および10mM HEPES、pH7.5を含む緩衝液1mLで水和した。次いで、リポソームを孔径100nmのポリカーボネートフィルター(Nucleopore, Pleasanton, CA)を通して押し出した。捕捉されていないCFを、Sepharose 4B-200を用い、pH8の10mM HEPESおよび0.1mol/L NaClで溶出するサイズ排除クロマトグラフィにより除去した。一定量200μLのCFロードリポソームを等張緩衝液1.8mLに加えた。小胞懸濁液に0.25μgのポリマーを加えた30分後、蛍光(λex=488、λem=540)を測定した。各実験終了時に、1%Triton X-100溶液40μlを加えて小胞を破壊し、最大溶解を判定した。
(表1)メリチンペプチドは高い膜活性を示すことを示した。
n.d.−判定していない。
a−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
b−CDM、CDM-gal、もしくはCDM-PEGまたはその組み合わせによる修飾は膜活性を阻害する。
実施例4. マスキング剤
A. 2-プロピオン酸-3-メチル無水マレイン酸マスキング剤前駆体(カルボキシジメチル無水マレイン酸またはCDM)の合成
無水テトラヒドロフラン50mL中の水素化ナトリウム(0.58g、25mmol)の懸濁液に2-ホスホノプロピオン酸トリエチル(7.1g、30mmol)を加えた。水素ガスの発生停止後、無水テトラヒドロフラン10mL中の2-オキソグルタル酸ジメチル(3.5g、20mmol)を加え、30分間撹拌した。次いで、水10mLを加え、テトラヒドロフランをロータリーエバポレーションにより除去した。得られた固体と水との混合物をエチルエーテル3×50mLで抽出した。エーテル抽出物を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して、淡黄色油状物を得た。油状物をシリカゲルクロマトグラフィで、エーテル:ヘキサン=2:1で溶出して精製し、4g(収率82%)の純粋なトリエステルを得た。次いで、このトリエステルを、水酸化カリウム4.5g(5当量)を含む水およびエタノールの50/50混合物50mLに溶解することにより、2-プロピオン酸-3-メチル無水マレイン酸を生成した。この溶液を1時間加熱還流した。次いで、エタノールをロータリーエバポレーションにより除去し、溶液を塩酸でpH2まで酸性化した。次いで、この水溶液を酢酸エチル200mLで抽出し、分離し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して、白色固体を得た。次いで、この固体をジクロロメタンおよびヘキサンから再結晶して、2g(収率80%)の2-プロピオン酸-3-メチル無水マレイン酸を得た。
最も広く研究された肝実質細胞標的指向リガンドはガラクトースに基づいており、これは肝実質細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体(ASGPr)によって結合される。ガラクトースまたはガラクトース誘導体の結合は、オリゴ糖のキトサン、ポリスチレン誘導体、およびポリアクリルアミドHPMAを含む、少数の水溶性が高く、非荷電のポリマーの肝実質細胞標的指向を促進することが明らかにされている。ASGPr標的指向基は、ラクトース、すなわちガラクトース-グルコース二糖を用い、グルコース残基の修飾を介して、容易に生成される。ラクトビオン酸(LBA、グルコースが酸化されてグルオン酸となっている、ラクトース誘導体)は、標準のアミドカップリング技術を用いて、無水マレイン酸に容易に組み込まれる。
塩化メチレン50mL中のCDM(300mg、0.16mmol)の溶液に塩化オキサリル(2g、10重量当量)およびジメチルホルムアミド(5μl)を加えた。反応を終夜進行させ、その後過剰の塩化オキサリルおよび塩化メチレンをロータリーエバポレーションにより除去して、CDM酸塩化物を得た。酸塩化物を塩化メチレン1mLに溶解した。この溶液に、塩化メチレン10mL中の、CDM-PEGについてはポリエチレングリコールモノメチルエーテル(MW平均550)またはCDM-NAGについては(アミノエトキシ)エトキシ-2-(アセチルアミノ)-2-デオキシ-β-D-ガラクトピラノシド(すなわち、アミノビスエトキシル-エチルNAG)1.1モル当量、およびピリジン(200μl、1.5当量)を加えた。次いで、溶液を1.5時間撹拌した。次いで、溶媒を除去し、得られた固体を水5mLに溶解し、0.1%TFA水/アセトニトリル勾配を用いての逆相HPLCにより精製した。
実施例5. 膜活性ポリアミンの可逆的修飾/マスキング;すなわち、膜活性ポリマーのCDM-NAGまたはCDM-NAGプラスCDM-PEGの混合物による修飾
等張グルコース中の膜活性ポリアミン(例えば、前述のDW1360)xmgの溶液にHEPES遊離塩基14xmgと、続いてCDM-NAG 7xmgまたはCDM-NAG 2.3xmgおよびCDM-PEG 4.6xmgの混合物のいずれか、合計7xの二置換無水マレイン酸マスキング剤を加えた。次いで、動物への投与の前に、溶液を室温で少なくとも30分間インキュベートした。CDM-NAGまたはCDM-PEGのポリアミンとの反応により下記を得た:
式中、Rはポリマーであり、R1はASGPr標的指向部分または立体安定化部分を含む。無水物とポリマーアミンとの間の反応において生じた無水物カルボキシルは、予想された電荷の約1/20を示した(Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003)。したがって、膜活性ポリマーは、高度に負に荷電したポリアニオンに変換されるのではなく、有効に中和される。
修飾の前に、5×mgのCDM-NAGを氷酢酸の0.1%水溶液から凍結乾燥した。乾燥したNAG誘導体に、0.2×mLの等張グルコースおよび10×mgのHEPES遊離塩基中の×mgのメリチンの溶液を加えた。CDM-NAGが完全に溶解した後、動物への投与前に溶液を室温で少なくとも30分間インキュベートした。CDM-NAGのペプチドとの反応により下記を得た:
式中、Rはメリチンであり、R1はASGPr標的指向部分NAGを含む。無水物とポリマーアミンとの間の反応中に生じた無水物カルボキシルは、予想される電荷の約1/20を示す(Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003)。したがって、膜活性ポリマーは、高度に負に荷電したポリアニオンに変換されるのではなく、有効に中和される。
実施例7. GalNAcクラスターの合成
A. {2-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸ベンジルエステルの合成
2-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-エタノール(62.2g、414mmol)をアルゴン雰囲気下で無水DMF 875mLに溶解し、0℃に冷却した。NaH(12.1g、277mmol、鉱油中55%)を注意深く加え、氷浴を取り除き、撹拌を80℃で1時間続けた。反応混合物を周囲温度まで冷却し、ブロモ酢酸(18.98g、137mmol)をDMF溶液(20mL)として滴加漏斗より加えて処理した。75℃でさらに30分後、ブロモメチル-ベンゼン(23.36g、137mmol)をニートで加え、エステル化を30分間進行させた。冷却し、砕氷上に注意深く加え、酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、すべての溶媒を蒸発させた後、フラッシュクロマトグラフィ(SiO2、酢酸エチル/ヘプタン=8/2)により、6.41gの表題化合物を黄色油状物で得た。MS (ISP): 299.2 [M+H]+。
市販の酢酸(2S,3R,4R,5R,6R)-4,5-ジセトキシ-6-アセトキシメチル-3-アセチルアミノ-テトラヒドロ-ピラン-2-イルエステル(10.0g、26mmol)を無水CH2Cl2 116mLに溶解し、トリメチルシリルトリフラート(14.27g、64mmol)で処理した。反応を45℃で終夜進行させた。0℃まで冷却した後、トリエチルアミン(4.88mL、35mmol)を加え、混合物をCH2Cl2で希釈し、NaHCO3溶液および水で洗浄した。Na2SO4で乾燥し、溶媒を蒸発させて、10.3gの表題化合物を褐色油状物で得、これをそれ以上精製せずに次の段階で用いた。MS (ISP): 330.0 [M+H]+。
上で調製した酢酸(3aR,5R,6R,7R,7aR)-6-アセトキシ-5-アセトキシメチル-2-メチル-5,6,7,7a-テトラヒドロ-3aH-ピラノ[3,2-d]オキサゾル-7-イルエステル(10.3g、26mmol)および{2-[2-(2-ヒドロキシ-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸ベンジルエステル(8.62g、29mmol)を520mLのCH2Cl2中で混合し、4オングストロームモレキュラーシーブス63gで処理した。1時間後、トリメチルシリルトリフラート(6.13g、28mmol)を加えた。反応混合物を周囲温度で週末の間撹拌した。トリエチルアミン(5.21mL、37mmol)を加え、モレキュラーシーブスをろ去し、ろ液をCH2Cl2で希釈し、NaHCO3溶液および水で洗浄した。Na2SO4で乾燥し、溶媒を蒸発させた後、フラッシュクロマトグラフィ(SiO2、酢酸エチル/AcOH/MeOH/水=60/3/3/2)により、15.7gの表題化合物を褐色油状物で得た。MS (ISP): 626.6 [M-H]-。
上で調製した(2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-ジアセトキシ-6-アセトキシメチル-3-アセチルアミノ-テトラヒドロ-ピラン-2-イルオキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-酢酸ベンジルエステル(15.7g、25mmol)を酢酸エチル525mLに溶解し、1.6gのPd/C(10%)で、1atmのH2雰囲気下、周囲温度で3時間水素添加した。セライトを通してろ過し、溶媒を蒸発させた後、フラッシュクロマトグラフィ(SiO2、CH2Cl2/MeOH=80/20)により、6.07gの表題化合物を褐色ゴムで得た。MS (ISP): 536.5 [M-H]-。
上で調製した(2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-ジアセトキシ-6-アセトキシメチル-3-アセチルアミノ-テトラヒドロ-ピラン-2-イルオキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-酢酸(2.820g、5.246mmol)および(S)-6-アミノ-2-((S)-2,6-ジアミノ-ヘキサノイルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル塩酸塩(調製は下記参照、0.829g、1.749mmol)をCH2Cl2 32mLおよびDMF 3.2mLの混合物に溶解し、ヒューニッヒ塩基(2.096mL、12.25mmol)、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(0.714g、5.248mmol)および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩(1.006g、5.248mmol)で逐次処理し、周囲温度で終夜撹拌した。すべての揮発性物質を減圧(i.v.)下で除去し、粗製反応混合物を調製用HPLC(38回、Gemini、5μ、C18)で精製し、凍結乾燥後に1.650gの表題生成物を白色粉末で得た。MS (ISP): 1945.8 [M+Na]+。
(17S,20S)-1-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)-20-(1-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラ-ヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)-11-オキソ-3,6,9-トリオキサ-12-アザヘキサデカン-16-イル)-17-(2-(2-(2-(2-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-アセトアミド-4,5-ジアセトキシ-6-(アセトキシメチル)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イルオキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)-アセトアミド)-11,18-ジオキソ-3,6,9-トリオキサ-12,19-ジアザヘニコサン-21-酸
上で調製したGalNAcクラスターベンジルエステル(0.674g、0.350mmol)をMeOH 50mLに溶解し、0.065gのPd/C(10%)で、1atmのH2雰囲気下、周囲温度で4時間水素添加した。セライトを通してろ過し、溶媒を蒸発させて、0.620gの表題化合物を白色泡状物で得た。MS (ISP): 1917.0 [M+2H]2+。
A. (S)-6-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル
(S)-6-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸(5.00g、10.67mmol)およびフェニル-メタノール(2.305g、21.34mmol)をCH2Cl2 25mLに溶解し、N-ヒドロキシベンゾトリアゾール(1.933g、11.74mmol)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC、2.250g、11.74mmol)、およびエチル-ジイソプロピル-アミン(2.137mL、12.49mmol)で逐次処理した。90分間撹拌した後、揮発性物質を減圧下、周囲温度で除去し、残渣を酢酸エチルに溶解し、水、NH4Cl溶液および食塩水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させた。次いで、粗製混合物をエタノール20mLに溶解し、水10mLを加えて生成物を沈澱させた。ろ過し、乾燥して、5.669gの表題化合物を得、これをエタノール/ヘキサンから再結晶して、4.27gの純粋なベンジルエステルを得た。MS (ISP): 559.2 [M+H]+。
上で調製した(S)-6-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシ-カルボニルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル(4.270g、7.643mmol)をTHF 15mLに溶解し、ジエチルアミン15mLで処理した。周囲温度で4時間後、MSおよびTLCは出発原料がないことを示した。溶媒を蒸発させ、トルエンと共沸乾燥して、4.02gの遊離アミンを得、これを次の段階で直接用いた。
上で調製した(S)-2-((S)-2,6-ビス-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ヘキサノイルアミノ)-6-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ヘキサン酸ベンジルエステル(4.516、6.793mmol)をジオキサン中4mol/L HClに溶解した。数分後、ガスが発生し、沈澱が生じた。周囲温度で3時間後、反応混合物を注意深く蒸発させ、徹底的に乾燥して、3.81gの表題化合物をオフホワイト泡状物で得、これをそれ以上精製せずに上の実施例7. E. GalNAcクラスターベンジルエステルで用いた。MS (ISP): 365.3 [M+H]+。
ポリヌクレオチド標的指向部分を、GalNAcクラスターおよび薬物動態調節剤のリジンまたはオルニチン骨格分子上のアミンへの結合により作成した。次いで、骨格上のカルボキシル基は、siRNAなどのRNAiポリヌクレオチドへの共有結合のために利用可能であった。
A. (S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-6-ヘキサデカノイルアミノ-ヘキサン酸ベンジルエステル
市販のFmoc-Lys(パルミトイル)-OH(0.899g、1.481mmol)を15mLのCH2C12に懸濁し、ベンジルアルコール(0.320g、0.305mL、2.96mmol、2当量)、ヒドロキシベンゾトリアゾル(HOBT、0.268g、1.63mmol、1.1当量)、l-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド.HCl(EDC、0.312g、1.63mmol、1.1当量)、およびN-エチル-ジイソプロピルアミン(0.224g、0.297mL、1.733mmol、1.17当量)で逐次処理した。次いで、黄色溶液を2時間撹拌した。砕氷/NH4Cl溶液上に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、すべての溶媒を蒸発させた後、フラッシュクロマトグラフィ(SiO2、酢酸エチル/ヘプタン=1/1)により0.692gの表題化合物をオフホワイト固体で得た。MS (ISP): 697.6 [M+H]+。
上で調製した(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-6-ヘキサデカノイル-アミノ-ヘキサン酸ベンジルエステル(0.692g、0.993mmol)を15mLのTHFに溶解し、19mLのジエチルアミン(約18当量)で処理した。周囲温度で3時間後、すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗製反応混合物をフラッシュクロマトグラフィ(SiO2、CH2Cl2/MeOH(10%))で精製して、0.355gの表題化合物を白色固体で得た。MS (ISP): 475.3 [M+H]+。
実施例10と類似であるが、Fmoc-Lys(パルミトイル)-OHの代わりにFmoc-L-Orn(パルミトイル)-OHを用い、白色泡状物として調製。MS (ISP): 1093.1 [M+2H]2+/2。
A. (S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-6-((E)-ヘキサデカ-8-エノイルアミノ)-ヘキサン酸2-トリメチルシラニル-エチルエステル
Fmoc-Lys((E)-ヘキサデカ-8-エノイル)-OH(0.500g、0.827mmol)を15mLのCH2Cl2に懸濁し、2-(トリメチルシリル)エタノール(0.196g、0.236mL、1.65mmol、2当量)、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAt、0.123g、0.909mmol、1.1当量)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド.HCl(EDC、0.174g、0.909mmol、1.1当量)、およびN-エチル-ジイソプロピルアミン(0.125g、0.164mL、0.967mmol、1.17当量)で逐次処理した。次いで、黄色溶液を週末の間撹拌した。砕氷/HCl溶液上に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、すべての溶媒を蒸発させた後、フラッシュクロマトグラフィ(SiO2、CH2Cl2/MeOH=9/1)で精製し、AcOEt/ヘプタンから結晶化して、0.488gの表題化合物をオフホワイト半固体で得た。MS (ISP): 705.6 [M+H]+。
上で調製した(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-6-((E)-ヘキサデカ-8-エノイルアミノ)-ヘキサン酸2-トリメチルシラニル-エチルエステル(0.488g、0.690mmol)を15mLのTHFに溶解し、1.35mLのジエチルアミン(約18当量)で処理した。周囲温度で3時間後、すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗製反応混合物をフラッシュクロマトグラフィ(SiO2、CH2Cl2/MeOH(10%))で精製して、0.259gの表題化合物を黄色油状物で得た。MS (ISP): 483.6 [M+H]+。
上記化合物を、(S)-2-アミノ-6-((E)-ヘキサデカ-8-エノイルアミノ)-ヘキサン酸2-トリメチルシラニル-エチルエステルを用い、保護基を以下のとおりに切断して、前述のとおりに調製した:終わりから2番目の段階の後、得られた2-トリメチルシラニル-エチルエステル(245mg、0.107mmol、1.00当量)を無水THF(5mL)と混合して無色溶液を得た。フッ化テトラブチルアンモニウム三水和物(168mg、0.533mmol、5.00当量)を0℃で加え、反応混合物をフリーザーに終夜保存した。砕氷上に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、すべての溶媒を蒸発させて、粘稠油状物を得た。アセトニトリルおよび水に溶解し、凍結乾燥して、最終的に0.120gの表題化合物を白色固体で得た。MS (ISP): 1121.5 [M+2Na]2+/2。
上記実施例と類似であるが、(S)-2-アミノ-6-((E)-ヘキサデカ-8-エノイルアミノ)-ヘキサン酸2-トリメチルシラニル-エチルエステルの代わりに(S)-2-(トリメチルシリル)エチル2-アミノ-6-オレアミドヘキサノアートを用い、オフホワイト泡状物として調製。MS (ISP): 1113.6 [M+2H]2+/2。
上記実施例と類似であるが、(S)-2-アミノ-6-((E)-ヘキサデカ-8-エノイルアミノ)-ヘキサン酸2-トリメチルシラニル-エチルエステルの代わりに(S)-2-(トリメチルシリル)エチル2-アミノ-6-((9E,12E)-オクタデカ-9,12-ジエンアミド)ヘキサノアートを用い、黄色の凍結乾燥固体として調製。MS (ISP): 1134.55 [M+2Na]2+/2。
前述のとおりであるが、Fmoc-Lys(パルミトイル)-OHの代わりにFmoc-Lys(オクタノイル)-OHを用い、淡黄色泡状物として調製。MS (ISP): 1044.5 [M+2H]2+/2。
前述のとおりであるが、Fmoc-Lys(パルミトイル)-OHの代わりにFmoc-Lys(ドデカノイル)-OHを用い、淡黄色泡状物として調製。MS (ISP): 2166.04 [M+Na]+。
前述のとおりであるが、Fmoc-Lys(パルミトイル)-OHの代わりにFmoc-Lys(イコサノイル)-OHを用い、淡黄色泡状物として調製。MS (ISP): 1150.58 [M+2Na]2+/2。
を、前述のとおりであるが、Fmoc-Lys(パルミトイル)-OHの代わりにFmoc-Lys(テトラコサノイル)-OHを用い、淡黄色泡状物として調製した。MS (ISP): 2312.24 [M+H]+。
A. (S)-6-((S)-2,6-ビス-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ヘキサノイルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イル-メトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸
丸底フラスコ内で、Fmoc-Lys-OH(1.393g 3.78mmol、1.00当量)をCH2Cl2(16mL)に溶解して淡黄色溶液を得た。ヒューニッヒ塩基(1.955g、2.57mL、15.1mmol、4.00当量)およびトリメチルクロロシラン(0.863g、1.00mL、7.94mmol、2.10当量)を加え、反応混合物を20分間撹拌した。
上で調製した(S)-6-((S)-2,6-ビス-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ヘキサノイルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸(2.32g、3.33mmol、1.00当量)およびフェニル-メタノール(0.720g、6.66mmol、2.00当量)を30mLのCH2Cl2に溶解し、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAt、0.498g、3.66mmol、1.10当量)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC、0.702g、3.66mmol、1.10当量)、およびエチル-ジイソプロピル-アミン(0.503g、0.66mL、3.90mmol、1.17当量)で逐次処理した。120分間撹拌した後、揮発性物質を減圧下で除去した。続くフラッシュクロマトグラフィ(CH2Cl2中8%MeOH)により、2.573gの表題化合物を淡黄色ろう状固体で得た。MS (ISP): 787.5 [M+H]+。
上で調製した(S)-6-((S)-2,6-ビス-tert-ブトキシカルボニルアミノ-ヘキサノイルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル(塩酸塩として、0.613g、0.779mmol、1.00当量)をジオキサン(4mL)に溶解し、3.89mLのジオキサン中4M HCl(10当量)で処理した。3時間後、MSは出発原料がないことを示した。すべての揮発性物質を減圧下で除去し、0.519gの表題化合物を塩酸塩で得、これをそれ以上精製せずに次の段階で用いた。MS (ISP): 587.3 [M+H]+。
上で調製した(S)-6-((S)-2,6-ジアミノ-ヘキサノイルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシ-カルボニルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル(0.519g、0.771mmol、1.00当量)およびカプリル酸(0.234g、1.619mmol、2.10当量)を12mLのCH2Cl2に溶解し、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール(HOAt、0.220g、1.619mmol、2.10当量)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC、0.310g、1.619mmol、2.10当量)、およびエチル-ジイソプロピル-アミン(0.498g、0.666mL、3.855mmol、5.00当量)で逐次処理した。180分間撹拌した後、混合物を砕氷上に注ぎ、AcOEtで2回抽出し、水で洗浄し、MgSO4で乾燥し、蒸発乾固させた。AcOEt/ヘキサンから結晶化して、0.453gの表題化合物を白色固体で得た。MS (ISP): 839.8 [M+H]+、861.8 [M+Na]+。
上で調製した(S)-6-((S)-2,6-ビス-オクタノイルアミノ-ヘキサノイルアミノ)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル(0.450g、0.536mmol)を2.2mLのTHFに懸濁し、2.2mLのジエチルアミン(約40当量)で処理した。周囲温度で24時間激しく撹拌した後、すべての揮発性物質を減圧下で除去し、粗製反応生成物をEtOEtで2回粉砕して、0.258gの表題化合物を白色固体で得た。MS (ISP): 617.5 [M+H]+。
前述のとおりであるが、(S)-2-アミノ-6-ヘキサデカノイルアミノ-ヘキサン酸ベンジルエステルの代わりに(S)-2-アミノ-6-((S)-2,6-ビス-オクタノイルアミノ-ヘキサノイルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステルを用い、白色泡状物として調製。MS (ISP): 2342.19 [M+H]+。
A. 材料
無水メタノール(MeOH)、ナトリウムメチラート、Amberlite IR-120、硫酸ナトリウム、無水N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、無水ジクロロメタン(DCM)、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)および酢酸ナトリウム溶液(3M、pH5.2)はSigma Aldrich Chemie GmbH(Taufkirchen、ドイツ)から購入した。RP-HPLC用の酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)緩衝液(2.0M、pH7.0)およびアセトニトリル(ACN)(HPLC品質)はBiosolve(Valkenswaard、オランダ)から購入した。エタノール(EtOH)(p.a.)はMerck(Darmstadt、ドイツ)から購入した。Optilab HF(Membra Pure、ドイツ)システムから精製した水を用いた。Resource RPC 3mLカラム(10×0,64cm;粒径15μm)はGE Healthcare(Freiburg、ドイツ)から購入した。HPLC精製はAKTA Explorer 100(GE Healthcare)を用いて実施した。
化合物1(150mg;0.082mmol)を無水MeOH(5.5ml)に溶解し、ナトリウムメチラート42μLを加えた(MeOH中25%溶液)。混合物をアルゴン雰囲気下、室温で2時間撹拌した。同量のメタノールと、カチオン交換樹脂のAmberlite IR-120を分割して加え、pH約7.0とした。Amberliteをろ過により除去し、溶液をNa2SO4で乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。化合物2を白色泡状物として定量的収率で得た。TLC(SiO2、DCM/MeOH 5:1+0.1%CH3COOH):Rf2=0.03;検出のために、MeOH中の硫酸の溶液(5%)を用い、続いて加熱した。ESI-MS、直接注入、負モード;[M-H]-1 計算値:1452.7;[M-H]1- 測定値:1452.5。
化合物1で表される一般構造の化合物を無水MeOHに溶解し、ナトリウムメチラート(9当量)を加えた(MeOH中25%溶液)。混合物をアルゴン雰囲気下、室温で2時間撹拌した。反応混合物をメタノールで希釈し、続いてカチオン交換樹脂Amberlite IR-120を分割して加え、pH約7.0とした。Amberliteをろ過により除去し、溶液をNa2SO4で乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。化合物2で表される一般構造の化合物を白色泡状物として定量的収率で得た。
センス鎖の5'末端にC-6-アミノリンカーを有するRNAを、AKTA Oligopilot 100(GE Healthcare、Freiburg、ドイツ)および固体支持体として細孔制御ガラス(controlled pore glass)(Prime Synthesis, Aston, PA, USA)を用い、1215μmolの規模で、固相上、標準のホスホラミダイト化学により産生した。2'-O-メチルヌクレオチドを含むRNAを、対応するホスホラミダイト、2'-O-メチルホスホラミダイトおよびTFA-ヘキシルアミノリンカーアミダイト(Sigma-Aldrich、SAFC、Hamburg、ドイツ)を用いて生成した。切断および脱保護ならびに精製を、当技術分野において公知の方法により達成した(Wincott F., et al, NAR 1995, 23,14, 2677-84)。アミノ修飾RNAをアニオン交換HPLCにより特徴付け(純度:96.1%)、同一性をESI-MSにより確認した([M+H]1+ 計算値:6937.4;[M+H]1+ 測定値:6939.0。配列:
;u、c:対応する塩基の2'-O-メチルヌクレオチド、s:ホスホロチオアート。
5'末端にC-6アミノリンカーを有するRNA(2.54μmol)を凍結乾燥し、250μLのホウ酸ナトリウム緩衝液(0.1Mホウ酸ナトリウム、pH8.5、0.1M KCl)および1.1mL DMSOに溶解した。8μLのDIPEAを加えた後、RNA溶液を持続的に撹拌しながら、これにDMF中の化合物3の溶液(理論的には0.014mmol)をゆっくり加えた。反応混合物を35℃で終夜撹拌した。反応をRP-HPLC(Resource RPC 3mL、緩衝液:A:水中100mM TEAA、B:95%ACN中100mM TEAA、勾配:20CVで5%Bから22%B)を用いてモニターした。-20℃でEtOH中の酢酸ナトリウム(3M)を用いてRNAを沈澱させた後、RNA結合体を前述の条件を用いて精製した。純粋な分画を集め、所望の結合体、化合物4を酢酸ナトリウム/EtOHを用いて沈澱させた。化合物4を収率59%で単離した(1.50μmol)。化合物4の純度をアニオン交換HPLCで分析し(純度:91.7%)、同一性をESI-MSにより確認した([M+H]1+ 計算値:8374.4;[M+H]1+ 測定値:8376.5。
5'末端にC-6アミノリンカーを有するRNAを凍結乾燥し、ホウ酸ナトリウム緩衝液(0.1Mホウ酸ナトリウム、pH8.5、0.1M KCl)およびDMSOの比率1:4の混合物に溶解した。DIPEAを加えた後、RNA溶液を持続的に撹拌しながら、これにDMF中の化合物3の溶液(6当量)をゆっくり加えた。反応混合物を35℃で終夜撹拌した。反応をRP-HPLC(Resource RPC 3mL、緩衝液:A:水中100mM TEAA、B:95%ACN中100mM TEAA、勾配:20CVで5%Bから70%B)を用いてモニターした。-20℃でEtOH中の酢酸ナトリウム(3M、pH5.2)を用いてRNAを沈澱させた後、RNA結合体を前述の条件を用いて精製した。純粋な分画を集め、一般構造4の所望の結合体を酢酸ナトリウム/EtOHを用いて沈澱させて、純粋なRNA結合体を得た。
RNAセンス鎖を有する化合物4を2'-O-メチル-修飾アンチセンスRNA鎖とアニールさせた:アンチセンス配列:
。アポリポタンパク質B mRNAに向けたsiRNA結合体を、アニーリング緩衝液(20mMリン酸ナトリウム、pH6.8;100mM塩化ナトリウム)中の相補鎖の等モル溶液を混合し、85〜90℃の水浴中で3分間加熱し、3〜4時間の間に室温まで冷却することにより生成した。二重鎖形成を、未変性ゲル電気泳動により確認した。
実施例21. インビボでのRNAiポリヌクレオチドの投与、および肝実質細胞への送達
RNAiポリヌクレオチド結合体およびマスクしたポリマーを前述のとおりに合成した。6から8週齢のマウス(C57BL/6またはICR系統、それぞれ約18〜20g)をHarlan Sprague Dawley(Indianapolis IN)から入手した。マウスを注入前に少なくとも2日間収容した。給餌はHarlan Teklad Rodent Diet(Harlan, Madison WI)で適宜行った。RNAiポリヌクレオチド結合体およびマスクしたポリマーを前述のとおりに合成した。マウスに送達ポリマーの溶液0.2mLおよびsiRNA結合体0.2mLを尾静脈に注入した。ポリマーおよびsiRNAの同時注入のために、注入前にsiRNA結合体を修飾ポリマーに加え、全量0.4mlを注入した。組成物は生理的条件において可溶性かつ非凝集性であった。ポリマーおよびsiRNAを別々に注入するために、ポリマーを製剤溶液0.2mL中で注入し、siRNAを等張グルコース0.2mL中で注入した。溶液を尾静脈内への点滴により注入した。他の血管への注入、例えば、眼窩後注入も等しく有効であった。
マウスを4時間(ラットの場合は16時間)絶食させた後、顎下出血により血清を採取した。血清ApoBタンパク質レベルを標準のサンドイッチELISA法により求めた。簡単に言うと、ポリクローナルヤギ抗マウスApoB抗体およびウサギ抗マウスApoB抗体(Biodesign International)を、それぞれ捕捉および検出抗体として用いた。HRP結合ヤギ抗ウサギIgG抗体(Sigma)を後で適用し、ApoB/抗体複合体を結合した。次いで、テトラメチル-ベンジジン(TMB、Sigma)発色の吸光度をTecan Safire2(オーストリア、欧州)マイクロプレート読み取り器により450nmで測定した。
マウスからの血漿試料を、標準の手順に従い、0.109mol/Lクエン酸ナトリウム抗凝固剤(1体積)を含むマイクロ遠沈管中に顎下出血により血液(9体積)を採取して調製した。血漿中のF7活性を、BIOPHEN VIIキット(Hyphen BioMed/Aniara, Mason, OH)を製造者の推奨に従って用いる発色法により測定する。発色の吸光度をTecan Safire2マイクロプレート読み取り器を用いて405nmで測定した。
apoB siRNA:
第VII因子siRNA
小文字=2'-O-CH3置換
s=ホスホロチオアート連結
ヌクレオチドの後のf=2'-F置換
ヌクレオチドの前のd=2'-デオキシ
実施例23. siRNA-ガラクトースクラスター-薬物動態調節剤結合体をマスクしたDW1360送達ポリマーと同時投与して用いる、インビボでのsiRNAの肝実質細胞への送達
siRNAおよび送達ポリマーを、示した用量のsiRNAおよびポリマーを用い、前述のとおりに調製し、投与した。
Lau 41305-38-17-19を7重量当量のCDM-PEG:CDM-NAG 2:1で修飾した。完全2'F/MeO安定化第VII因子siRNAをGalNAc3-パルミトイル標的指向部分または他の示した標的指向部分に結合した。siRNA-結合体およびLau 41305-38-17-19送達ポリマーの、20gのICRマウス(n=3)への同時投与は、血清第VII因子タンパク質レベルの低下を引き起こし、siRNAの肝実質細胞への送達および第VII因子遺伝子発現の阻害を示していた。効率的な送達は、送達ポリマーおよびRNAiポリヌクレオチドへの標的指向部分結合の両方を必要とした(表2)。非結合siRNAでは有意なノックダウンは観察されなかった。同時投与した送達ポリマー非存在下では標的遺伝子ノックダウンは観察されなかった。GalNAc3-パルミトイル標的指向リガンドは、GalNAc3標的指向部分またはコレステロールポリヌクレオチド標的指向部分に比べて、siRNAの肝細胞への送達改善を提供した。
a動物体重1キログラムあたりのsiRNAまたはポリマーmg
bタンパク質相対%
Tyr-メリチンを5重量当量のCDM-NAGで修飾した。完全2'F/MeO安定化第VII因子siRNAをGalNAc3-パルミトイル標的指向部分または他の示した標的指向部分に結合した。siRNA-結合体およびTyr-メリチン送達ペプチドの、20gのICRマウス(n=3)への同時投与は、血清第VII因子タンパク質レベルの低下を引き起こし、siRNAの肝実質細胞への送達および第VII因子遺伝子発現の阻害を示していた。効率的な送達は、送達ペプチドおよびRNAiポリヌクレオチドへの標的指向部分結合の両方を必要とした(表3)。非結合siRNAでは有意なノックダウンは観察されなかった。同時投与した送達ポリマー非存在下では標的遺伝子ノックダウンは観察されなかった。GalNAc3-パルミトイル標的指向リガンドは、コレステロールポリヌクレオチド標的指向部分に比べて、siRNAの肝細胞への送達改善を提供した。
a動物体重1キログラムあたりのsiRNAまたはペプチドmg
bタンパク質相対%
DW1360を7重量当量のCDM-PEG:CDM-NAG 2:1で修飾した。完全2'F/MeO安定化apoB siRNAを示した疎水性PK基を有するGalNAc3-PK標的指向部分に結合した。siRNA-結合体およびDW1360送達ペプチドの、20gのICRマウス(n=3)への同時投与は、血清ApoBタンパク質レベルの低下を引き起こし、siRNAの肝実質細胞への送達およびApoB遺伝子発現の阻害を示していた。効率的な送達は、送達ペプチドおよびRNAiポリヌクレオチドへの標的指向部分結合の両方を必要とした(表4)。炭素原子16〜20個のPK基(15〜19個の炭素原子疎水性基)を有するポリヌクレオチド標的指向リガンドで、最適な送達が観察された。
a動物体重1キログラムあたりのsiRNAまたはポリマーmg
bタンパク質相対%
様々な疎水性側鎖を含む6つの異なるGalNAcクラスター-PK標的指向部分を、ApoBに向けたsiRNAに共有結合した。これらの結合体を雄Wistarラットに2.5mg/kgの用量で静脈内(静脈内ボーラス)投与した(表5)。血液試料を異なる動物から投与後5、15、30、60、90、120、240および360分の時点で採取した(各時点でn=2)。採血直後にEDTA血漿を生成し、これを続いてプロテイナーゼK(Epicentre Biotechnologies、米国)で処理した。肝臓および脾臓組織試料(500mg)を、屠殺した動物(n=2)から投与後1.5および6時間の時点で回収した。凍結組織片を粉砕して微粉を得た。各組織の一定量を秤量し、Lysis Mixture(Panomics、米国)、プロテイナーゼK(Epicentre Biotechnologies、米国)およびSONOPULS HD 2070(Bandelin、ドイツ)超音波ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。得られた最終組織溶解物は約50mg/mLの濃度を有していた。
siRNAを葉酸もしくはコレステロールのいずれか単独または葉酸-コレステロール薬物動態調節剤に結合した。5mgのsiRNAをKB異種移植マウスに注入した。次いで、腫瘍を分離し、siRNAの存在について検定した。注入の2時間後、葉酸-コレステロール薬物動態調節剤に結合したsiRNA(>500ng/g)では、葉酸またはコレステロールのいずれか単独に結合したsiRNA(100ng/g未満)に比べて、腫瘍中に有意に多くのsiRNAが認められた。注入の6時間後、差はさらに顕著で、約500ng/gと<50ng/gであった。
Claims (15)
- 骨格分子を介して薬物動態調節剤と共有結合しているアシアロ糖タンパク質受容体リガンドを含む、インビボでRNA干渉ポリヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物であって、ここで、
該アシアロ糖タンパク質受容体は、ポリエチレングリコールスペーサーを介して中心の分枝点にそれぞれ連結している2から4つのガラクトース誘導体を有するガラクトースクラスターを含み、
該薬物動態調節剤は、16個以上の炭素原子を有する疎水性基を含み、かつ、
該骨格分子は、さらに該RNA干渉ポリヌクレオチドと共有結合している、組成物。 - RNA干渉ポリヌクレオチドが、骨格分子に生理的に不安定な連結を介して共有結合されている、請求項1記載の組成物。
- 薬物動態調節剤が、16〜20個の炭素原子を有する疎水性基を含む、請求項1記載の組成物。
- 薬物動態調節剤が、パルミトイル、ヘキサデカ-8-エノイル、オレイル、(9E,12E)-オクタデカ-9,12-ジエノイル、ジオクタノイル、およびC16-C20アシルからなる群より選択される、請求項1記載の組成物。
- 薬物動態調節剤がコレステロールを含む、請求項1記載の組成物。
- ガラクトース誘導体が、ガラクトース、ガラクトサミン、N-ホルミル-ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-プロピオニル-ガラクトサミン、N-n-ブタノイル-ガラクトサミン、およびN-イソ-ブタノイルガラクトサミンからなる群より選択される、請求項1記載の組成物。
- ガラクトースクラスターがN-アセチルガラクトサミン三量体を含む、請求項6記載の組成物。
- ポリヌクレオチド送達ポリマーをさらに含む、請求項1記載の組成物。
- ポリヌクレオチド送達ポリマーが、可逆的に修飾された膜活性ポリアミンを含む、請求項8記載の組成物。
- RNA干渉ポリヌクレオチドが、DNA、RNA、dsRNA、RNA干渉ポリヌクレオチド、siRNA、およびmiRNAからなる群より選択される、請求項1記載の組成物。
- ASGPr標的指向部分-薬物動態調節剤標的指向部分に共有結合されているポリヌクレオチドを含む、インビボで該ポリヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物。
- ASGPr標的指向部分が、ガラクトース、ガラクトサミン、N-ホルミル-ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、N-プロピオニル-ガラクトサミン、N-n-ブタノイル-ガラクトサミン、N-イソ-ブタノイルガラクトサミン、ガラクトースクラスター、およびN-アセチルガラクトサミン三量体からなる群より選択される、請求項11記載の組成物。
- 薬物動態調節剤が、16個以上の炭素原子を有する疎水性基、16〜20個の炭素原子を有する疎水性基、パルミトイル、ヘキサデカ-8-エノイル、オレイル、(9E,12E)-オクタデカ-9,12-ジエノイル、ジオクタノイル、およびC16-C20アシル、ならびにコレステロールからなる群より選択される、請求項11記載の組成物。
- ASGPr標的指向部分-薬物動態調節剤標的指向部分がポリヌクレオチドに生理的に不安定な連結を介して連結されている、請求項11記載の組成物。
- ASGPr標的指向部分および薬物動態調節剤がポリヌクレオチドに骨格分子を介して連結されている、請求項11記載の組成物。
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