CN113683673B - 一种基于蜂毒肽的脂肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于蜂毒肽的脂肽及其制备方法和应用，属于生物医药领域。该脂肽是在蜂毒肽的N端偶联C10～18的脂肪酸，C端经过酰胺化修饰得到的。实验表明，相较其母体蜂毒肽，本发明的脂肽对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有更好的抑制作用，且具有更低的溶血性。在体外稳定性试验中，脂肽在胃蛋白酶、胰蛋白酶以及血清中表现出更好的稳定性，是极具应用价值的脂肽，可用于制备新型抗细菌感染的药物等，具有十分广阔的应用前景。

Description

一种基于蜂毒肽的脂肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于脂肽制备领域，涉及一种脂肽的制备和应用，具体涉及一种基于蜂毒肽的脂肽及其制备方法和应用。
背景技术
细菌对于传统抗生素的耐药性问题正在严重威胁全球人类的健康。因此，开发出一类新型的、不易产生耐药性的抗菌药物成为抗菌研究中的迫切任务。抗菌肽(AMPs)是一种天然存在的、具有广谱抗菌功能的多肽，由于其异于抗生素的抗菌作用机制，不易产生耐药性的特性被业界广泛关注。
蜂毒肽是抗菌肽的一种，是蜜蜂毒液的主要活性成分，具有很强的抗菌活性。蜂毒肽的一级结构为GIGAVLKVLTYGLPALISWIKRKRQQ-NH，其一级序列决定了蜂毒肽能够形成两亲性的螺旋结构，这种结构是其与膜结合，形成跨膜螺旋的基础。虽然天然来源的蜂毒肽具有很强的抗菌活性，但由于蜂毒肽在体内外不稳定、容易被多种蛋白酶降解而造成在体内半衰期普遍较短等弊端，此外还存在强烈的溶血红细胞的副作用，这些问题严重的阻碍了其临床的广泛应用。因此，对蜂毒肽结构进行改造与修饰，从而研发出具有高抑菌活性、在机体内外稳定存在和低溶血性的蜂毒肽衍生物是目标方向。
因脂肪酸是生物膜磷脂的重要组成部分，具有较高的疏水性。现有技术中将脂肪酸修饰至抗菌肽中形成脂肽，通过对脂肽的活性、稳定性、抑菌性以及溶血性进行实验评价，为蜂毒肽的修饰提供技术启示。以色列的SHAI研究团队(Shai,等)将不同碳原子长度的癸酸(10碳)、月桂酸(12碳)、肉豆蔻酸(14碳)、棕榈酸(16碳)嫁接到一个非活性的阳离子肽上。研究结果发现，嫁接了癸酸和月桂酸的脂肽没有产生溶血性同时激活了多肽的抗细菌和真菌的活性。而肉豆蔻酸(14碳)和棕榈酸(16碳)产生了高的抗真菌和溶血活性，研究结果表明脂肪酸的碳链长度可以影响多肽的抗菌和溶血性活性。兰州大学药学院的倪京满研究团队最新报道了对蜂毒抗菌肽anoplin的脂化修饰研究成果，具体表现为：将C4、C8、C10、C12的脂肪酸链接到anoplin上，通过蛋白酶和血清共孵育的实验发现多肽的稳定性得到了显著的提高；通过抑菌实验研究发现，随着碳链长度的增长，脂肽的抗菌活性得到提升，但同时溶血性也得到了增加。由此现有技术仍然存在如下问题：
1)脂肽对革兰氏阳性菌的抗菌活性优于对革兰氏阴性菌的抗菌活性，不利于临床上广谱抗菌的应用。
2)难以得到兼顾增强抗菌性和降低溶血性活性的脂肽。
发明内容
本发明意在提供一种基于蜂毒肽的脂肽，以克服现有蜂毒肽修饰产物高溶血性的缺点，提供一种具有广谱抗菌活性和低溶血性的脂肽。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种基于蜂毒肽的脂肽，所述脂肽的母体多肽为蜂毒肽，蜂毒肽氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述SEQ ID NO:1序列为GIGAVLKVLTYGLPALISWIKRKRQQ；在蜂毒肽的N端偶联脂肪酸、C端进行酰胺化修饰得到所述脂肽；所述脂肪酸为C10～C18脂肪酸中任意一种。
本方案的原理及优点是：实际应用中，对蜂毒肽的N端和C端进行修饰，可产生以下有益效果：
1、为了与天然蜂毒肽更为接近，蜂毒肽固相合成末端往往需要封闭，即N端脂肪酸耦合和C端酰胺化，这些修饰会减少多肽的总电荷，降低多肽的溶解度，也可以使脂肽模拟蜂毒肽在自然界中α氨基和羧基的原始状态。
2、N端偶联脂肪酸的脂肽具有蜂毒肽的抗菌特性和脂肪酸的疏水特性。N端偶联脂肪酸阻断脂肽蛋白酶易损区与降解酶的接触，减少酶的降解，显著增强蜂毒肽的稳定性，延长其在体内的药物作用时间。
3、N端偶联脂肪酸的碳链长度可以影响多肽的抗菌和溶血活性。发明人实验发现，在氨基酸序列为GIGAVLKVLTYGLPALISWIKRKRQQ的蜂毒肽N端偶联C10～C18的脂肪酸，随着脂肪酸碳链长度的增加，脂肽的抗菌活性得到提升，同时脂肽的溶血性反而得到降低，直至脂肪酸的碳链长度达到16个碳；当脂肪酸碳链长度超过16个碳，形成的脂肽没有表现出持续性活性增强的效果。
优选的，作为一种改进，先使用氨基酸合成蜂毒肽，再在蜂毒肽的N端进行脂肪酸修饰，在蜂毒肽的C端进行酰胺化修饰；切割、纯化后得到前体Cn-蜂毒肽，n＝10～18。采用上述技术方案，选择Fmoc法合成蜂毒肽，其反应条件温和，副反应少，产率高，并且Fmoc基团本身具有特征性紫外吸收，易于监测控制反应的进行。
优选的，作为一种改进，合成蜂毒肽所用氨基酸为L-型氨基酸或D-型氨基酸。L-型氨基酸和D-型氨基酸合成的蜂毒肽具有相同抗菌活性。
优选的，作为一种改进，所述脂肪酸为C16脂肪酸中任意一种。脂肽溶血性和稳定性试验结果表明，当n≥14时，脂肽的稳定性和抗菌性明显提升，而溶血性明显降低；其中n＝16时，脂肽显示最低的溶血性和最高的稳定性及抗菌效果，n﹥16时，形成的脂肽其稳定性和抗菌效果没有持续性的效果增强。
优选的，作为一种改进，基于蜂毒肽的脂肽在制备广谱抗菌药物或者抗菌组合物中的应用。对比蜂毒肽和抗生素，基于蜂毒肽的脂肽对所有实验菌株均表现出更好的抗菌效果，尤其是对甲氧苯青霉素耐受的金黄色葡萄球菌的抗菌效果显著，可以作为一种广谱抗菌药物使用。
优选的，作为一种改进，细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。采用上述技术方案，证明脂肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较好的抗菌效果提升，尤其是C16-蜂毒肽对所有实验菌株具有最小的MIC值1.56～8.33μM，证明N端修饰脂肪酸的脂肽可显著提高其广谱抗菌效果。
优选的，作为一种改进，所述细菌包括埃希氏菌属、葡萄球菌属、克雷伯氏菌属、假单胞菌属和芽孢杆菌属。采用上述技术方案，所选细菌集合覆盖常见危害人类的细菌。
优选的，作为一种改进，基于蜂毒肽的脂肽在制备防腐剂或者防腐组合物中的应用。基于蜂毒肽的脂肽具有广谱抗菌性，适用于制备防腐剂时添加使用。
优选的，作为一种改进，基于蜂毒肽的脂肽在制备表面活性剂或者表面活性组合物中的应用。基于蜂毒肽的脂肽具有氨基酸的亲水性和脂肪酸的疏水性，适用于制备表面活性剂时添加使用。
优选的，作为一种改进，基于蜂毒肽的脂肽在制备抗生物膜的自组装凝胶或者抗生物膜组合物中的应用。基于蜂毒肽的脂肽具有广谱抗菌性，适用于制备抗生物膜的自组装凝胶时添加使用。
附图说明
图1为本发明实施例1C10-蜂毒肽的质谱图。
图2为本发明实施例2C12-蜂毒肽的质谱图。
图3为本发明实施例3C14-蜂毒肽的质谱图。
图4为本发明实施例4C16-蜂毒肽的质谱图。
图5为本发明实施例5C18-蜂毒肽的质谱图。
图6为本发明对比例1蜂毒肽的质谱图。
图7为本发明实验例2中脂肽的溶血性评价结果图。
图8为本发明实验例3中脂肽的胰蛋白酶溶液稳定性评价结果图。
图9为本发明实验例3中脂肽的胰凝乳蛋白酶溶液稳定性评价结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的实验材料：蜂毒肽合成所需氨基酸、胰蛋白、胰凝乳蛋白、Triton X-100酶购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。其他常规试剂采用进口分装或国产分析纯。抗菌实验菌种来源见表1：
表1：菌株及来源：
菌株 来源
E.coli ATCC 25922 购于ATCC
E.coli ML-35ATCC 43837 购于ATCC
K.pneumonia ATCC 700603 购于ATCC
P.aeruginosa FADDI-PA070 购于ATCC
P.aeruginosa ATCC 27853 购于ATCC
S.aureus ATCC 25923 购于ATCC
S.aureus ATCC 43300 购于ATCC
B.subtilis ATCC 23857 购于ATCC
Methicillin-resistant S.aureus 936 购于ATCC
实施例1：
根据蜂毒肽的序列进行蜂毒肽以及基于蜂毒肽的脂肽的人工合成，蜂毒肽(Melittin)序列：GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2。
合成步骤如下：
(一)将碳端第1个氨基酸的羧基固定在2-氯-三苯甲基氯树脂上
称取2.0g 2-氯-三苯甲基氯树脂(取代度0.4mmol·g-1，树脂上有效氯的含量为2.0×0.4＝0.8mmol)，加入到含有N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的反应柱中，搅拌1小时以充分溶胀树脂。抽去DMF，加入溶有Fmoc-Gln-OH(2×0.8mmol)和二异丙基乙胺(DIEA)(4×0.8mmol)的DMF溶液到树脂中，于室温下振荡反应2小时。抽去反应液，用DMF洗涤树脂3次后，加入含有过量甲醇和(4×0.8mmol)DIEA的DMF混合溶液继续搅拌1小时，以封闭树脂中未参与氨基酸连接反应的活性氯基团。用DMF洗涤树脂3次，往树脂中加入15mL20％的哌啶/DMF溶液(V/V)，于室温下振荡反应10分钟，重复2次，以脱去端氨基上的Fmoc保护基团。再用DMF洗涤树脂4次。
(二)按蜂毒肽(Mel)氨基酸序列顺序添加第2～26个氨基酸以及C10脂肪酸
将氨基酸(3×0.8mmol)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)(4×0.8mmol)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)(4×0.8mmol)及DIEA(6×0.8mmol)溶解于DMF溶液，活化羧基后加入到树脂中，于室温下振荡反应1.5小时。反应完后用DMF洗涤树脂3次，用茚三酮的甲醇溶液(10mg·mL-1)验证氨基是否缩合完全。若溶液呈蓝色或发红，表示缩合不完全，需重新添加氨基酸与活化剂重复缩合步骤；若溶液为明亮黄色或未变色，表示此步缩合完全，脱去Fmoc保护基团并按氨基酸序列继续延长肽链，最后将脂肪酸作为一个氨基酸链接到肽链的末端。
(三)切割、纯化产物
待脂肽链合成结束后，分别用DMF、二氯甲烷、甲醇洗涤树脂数次，然后真空干燥过夜。用成分为三氟乙酸(83％)、苯酚(6.3％)、苯甲硫醚(4.3％)、水(4.3％)及1,2-乙二硫醇(2.1％)的切割剂将多肽从树脂上切落，同时侧基的保护基也被切落，切落时间为2小时。收集混合液，旋转蒸发浓缩，加入冰乙醚沉淀出产品，并用乙醚多次洗涤，离心收集沉淀，干燥过夜。然后将产物溶于蒸馏水中，冷冻干燥后保存于-20℃。
实施例2-5、对比例1制备方法基本如实施例1所述，其脂肪酸和产物区别如表2所示。
表2：实施例1-5、对比例1的脂肪酸和产物区别
实施例 脂肪酸 产物
实施例1 C10 Mel-C10
实施例2 C12 Mel-C12
实施例3 C14 Mel-C14
实施例4 C16 Mel-C16
实施例5 C18 Mel-C18
对比例1 — Mel
如图1-6所示，实施例1-5、对比例1所得产物经反相高效液相色谱C18柱测定合成脂肽纯度(>95％)，ESI-MS质谱确认脂肽的分子量。
本发明实施例和对比例均采用L-型氨基酸，替换L-型氨基酸为D-型氨基酸进行脂肽合成，对其产物进行抗菌性、溶血性以及稳定性相关实验，实验结果表明D-型氨基酸合成的脂肽与L-型氨基酸合成的脂肽实验结果差异不大。因此，本发明仅显示使用L-型氨基酸合成脂肽的实验结果。
实验例1：脂肽的抗菌性活性评价
抗菌测定采用基于肉汤微稀释的方法，并按照CLSI《抗菌药物敏感性试验指南》进行。E.coli ATCC 25922、E.coli ML-35ATCC 43837、K.pneumonia ATCC 700603、P.aeruginosa FADDI-PA070、P.aeruginosa ATCC 27853、S.aureus ATCC 25923、S.aureusATCC 43300、B.subtilis ATCC 23857、Methicillin-resistant S.aureus 936分别在37℃的LB培养基、NB培养基或MHB培养基中培养过夜复苏。复苏的菌液在新鲜MHB培养基中稀释40倍后在37℃环境中孵育1.5～2小时。用储存液配制脂肽的工作液(采用万古霉素和硫酸粘菌素作为抗生素对照)，浓度梯度设置为2倍，浓度从0.015到64μg/mL，一式两份。将工作液加入到96孔板内，每个梯度设置5个平行。将孵育所得的菌液稀释至最终浓度为1×106CFU/mL，然后，将50μL的稀释菌液加入到孔板内，调整脂肽的浓度范围为0.008～32μg/mL，细菌的密度为5×105CFU/mL。每个处理三个平行样。然后将所有平板覆盖并在37℃下孵育18小时后测试MICs，每个实验组/对照组MICs取平均值，获得MIC值。
结果如表3所示，万古霉素对革兰氏阳性菌有显著的抑菌效果(MIC值为2.3～4.57μM)，对革兰氏阴性菌抑菌效果不明显(MIC值≥49.33μM)；硫酸粘菌素抑菌效果刚好与之相反，对革兰氏阴性菌抑菌效果显著(MIC值为0.24～1.35μM)，两者均不具备广谱抗菌性。
而蜂毒肽耦合脂肪酸形成的脂肽则显示出广谱抗菌活性。如表3所示，脂肽对革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli)，克雷伯氏菌(K.pneumonia)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)抑菌效果(MIC值为1.74～17.45μM)优于母体蜂毒肽(MIC值为15.44～37.16μM)。对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的抑菌效果(MIC值为2.73～36.55μM)明显优于母体蜂毒肽(MIC值为31.56～91.69μM)；脂肪酸耦合蜂毒肽显著提升了蜂毒肽的抑菌效果，且对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有较好的抑菌效果，尤其Mel-C16显示出最好的广谱抗菌活性(MIC值为1.56～8.33μM)，适用于制备新型抗细菌感染的药物，具有十分广阔的应用前景。
表3蜂毒肽和脂肽的MIC值测定
Figure BDA0003256803060000071
实验例2：脂肽的溶血性评价
从兔子血液中分离出兔血红细胞，用磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH 7.4)洗涤，4000rpm离心4～5次。然后，红细胞分散在0.25％(v/v)磷酸盐缓冲溶液中。准备512μM的蜂毒肽及脂肽的储备液。将脂肽储存液用PBS液2倍稀释八个浓度梯度获得工作溶液。随后将等体积的血红细胞悬浮液和不同浓度的脂肽工作液加入到96孔板内，在37℃条件下孵育1小时。96孔板离心后，将离心后的上清液小心转移至新的孔板内，在490nm Triton X-100溶液(1％,v/v20μL)设置为阳性对照代表100％细胞溶血作用，血红细胞的PBS溶液(20μL)被用作阴性对照组。孵育完成后，将96孔板离心沉淀出完整的红细胞，将每孔上清收集于一个新的96板内，在490nm处用测定吸收值。溶血率按下式计算：
Figure BDA0003256803060000081
所有的实验重复三次。
实验结果如图7所示，因蜂毒肽自身具有较高的溶血性，对比例1获得的Mel溶血性范围为13.4～91.3％，不利于蜂毒肽的临床应用。蜂毒肽N端耦合脂肪酸形成脂肽，脂肽与血红细胞的脂膜结合困难，从而降低了蜂毒肽的溶血性；实验结果显示，在浓度为0～256μM范围内，脂肽的溶血性范围为0～51.2％，当脂肽的浓度达256μM时，脂肽Mel-C16的溶血性低至2.8％，该结果揭示基于蜂毒肽的脂肽具有更低的溶血活性，对细胞毒性较小，具有广泛的临床应用前景。
实验例3：脂肽在酶溶液中的稳定性评价
用细菌生长抑制法测定胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶中肽的稳定性。简而言之，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶在PBS中溶解，最终浓度为0.02～2000μg/mL，稀释10倍。将脂肽溶解于PBS中，最终浓度为1mM，并与不同浓度的胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶按1:4的体积比混合。在37℃环境中孵化6小时，蛋白酶处理过的脂肽溶液被移至60℃环境中加热15分钟加热灭活酶的活性从而停止蛋白酶反应。将溶液用MHB培养基稀释至2×MIC浓度,然后添加到96孔板中和大肠杆菌ATCC 25922(1106CFU/mL)在37℃环境中孵化18小时。生长抑制通过设置吸光度为600nm波长的酶标仪测试，脂肽的稳定性通过细菌的存活率显示，细菌存活率计算公式如下：
Figure BDA0003256803060000082
其中OD600nm(脂肽)的值为多肽和蛋白酶共孵育后的溶液孵育的大肠杆菌吸光度；OD600nm(阴性对照)的值为未添加多肽的溶液孵育的大肠杆菌吸光度。
实验结果如图8、图9所示：图8结果显示，在2000～0.02μg/mL的范围内，脂肽和原始肽在胰蛋白酶溶液中孵育后，测试脂肽的细菌生存率在0～17.9％范围内，相比较蜂毒肽孵育后，细菌的生存率在92.4～96.1％范围内，结果说明蜂毒肽耦合脂肪酸后，脂肽的稳定性显著的升高，具有广泛的临床应用前景。
图9结果显示，在2000～0.02μg/mL的范围内，脂肽和原始肽在胰凝乳蛋白酶溶液中孵育后，测试脂肽的细菌生存率在0～57.9％范围内，相比较蜂毒肽孵育后，细菌的生存率在85.1～95.4％范围内，结果说明蜂毒肽耦合脂肪酸后，脂肽的稳定性显著的升高，具有广泛的临床应用前景。
实验例4：蜂毒肽衍生物在血浆中的稳定性评价
为了评估蜂毒肽衍生物在血浆中的稳定性，将实施例和对比例获得的脂肽与10％的兔血血浆在37℃环境中分别共孵育1h和6h。然后将加入脂肽的血浆溶液加热至60℃，孵育15分钟后测试对大肠杆菌ATCC 25922的MIC值，以获得脂肽在血浆中的稳定性数据。
实验结果如表4所示，蜂毒肽、Mel-C10以及Mel-C12在10％的兔血血浆环境中共孵育6h后将丧失抗菌活，即脂肽稳定性差。但n≥14时，在10％的兔血血浆环境中均未丧失抗菌活性，说明蜂毒肽耦合C14～C18脂肪酸在10％的兔血血浆环境中具有高稳定性，且稳定性明显优于蜂毒肽；因此蜂毒肽N端耦合脂肪酸能明显提高蜂毒肽的稳定性，基于蜂毒肽的脂肽比蜂毒肽在各方面的应用上更占优势。
表4多肽在10％的兔血血浆孵育1h或6h后对大肠杆菌ATCC 25922的抗菌活性
Figure BDA0003256803060000091
a：对照组中MIC的测定为脂肽在PBS液中孵育1h或6h，在3个重复的独立实验中测定。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Figure BDA0003256803060000101
序列表
<110> 重庆市畜牧科学院
<120> 一种基于蜂毒肽的脂肽及其制备方法和应用
<130> 2021.09.10
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Tyr Gly Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln
20 25

Claims (6)

1. 一种基于蜂毒肽的脂肽在制备广谱抗菌药物或者组合物中的应用，其特征在于：所述脂肽的母体多肽为蜂毒肽，蜂毒肽氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述SEQ ID NO:1序列为GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ；选择Fmoc法合成蜂毒肽，在蜂毒肽的N端偶联脂肪酸、C端进行酰胺化修饰得到所述脂肽；所述脂肪酸为C10～C18脂肪酸中任意一种。
2.根据权利要求1所述的一种基于蜂毒肽的脂肽在制备广谱抗菌药物或者组合物中的应用，其特征在于：先使用氨基酸合成蜂毒肽，再在蜂毒肽的N端进行脂肪酸修饰，在蜂毒肽的C端进行酰胺化修饰；切割、纯化后得到前体Cn-蜂毒肽，n=10～18。
3.根据权利要求2所述的一种基于蜂毒肽的脂肽在制备广谱抗菌药物或者组合物中的应用，其特征在于：合成蜂毒肽所用氨基酸为L-型氨基酸或D-型氨基酸。
4.根据权利要求2所述的一种基于蜂毒肽的脂肽在制备广谱抗菌药物或者组合物中的应用，其特征在于：所述脂肪酸为C16脂肪酸中任意一种。
5.根据权利要求4所述的基于蜂毒肽的脂肽在制备广谱抗菌药物或者抗菌组合物中的应用，其特征在于：细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
6.根据权利要求5所述的基于蜂毒肽的脂肽在制备广谱抗菌药物或者抗菌组合物中的应用，其特征在于：所述细菌包括埃希氏菌属、葡萄球菌属、克雷伯氏菌属、假单胞菌属和芽孢杆菌属。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103492568A (zh) * 2010-12-17 2014-01-01 箭头研究公司 用于siRNA的半乳糖簇-药代动力学调节剂靶向部分
CN105463002A (zh) * 2014-08-08 2016-04-06 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 多肽类核酸载体、其制备方法及用途
CN111855883A (zh) * 2020-09-24 2020-10-30 中国农业科学院蜜蜂研究所 一种液相色谱串联质谱定量检测蜂毒肽的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103492568A (zh) * 2010-12-17 2014-01-01 箭头研究公司 用于siRNA的半乳糖簇-药代动力学调节剂靶向部分
CN105463002A (zh) * 2014-08-08 2016-04-06 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 多肽类核酸载体、其制备方法及用途
CN111855883A (zh) * 2020-09-24 2020-10-30 中国农业科学院蜜蜂研究所 一种液相色谱串联质谱定量检测蜂毒肽的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Britt Mary Hannah.Reactivity at the membrane interface.《Durham theses, Durham University》.2018,4.2.3 Antimicrobial Properties of Acylated Melittin，摘要第2段. *
Pridmore等.Acyl transfer from phosphocholine lipids to melittin.《CHEMICAL COMMUNICATIONS- ROYAL SOCIETY OF CHEMISTRY》.2011,第47卷(第5期),第1422页左栏倒数第1段，第1423页右栏倒数第2段，第1424页左栏倒数第1段. *
赵亚华 ; 白堡屹 ; 刘蔼珊 ; 高向阳 ; 林健荣 ; .蜂毒肽类似物的基因表达与构效关系.华南理工大学学报(自然科学版).2008,(第12期),全文. *

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