CN112424356A - 用于经口递送寡核苷酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了用于经口施用寡核苷酸的方法。本文还提供了用于经口施用靶向微小RNA的修饰寡核苷酸的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年7月20日提交的美国临时申请62/701,317的优先权权益，所述申请出于任何目的以引用方式整体并入本文。
技术领域
本文提供了用于经口施用寡核苷酸的方法。
背景技术
目前，寡核苷酸(包括抗miR寡核苷酸)的优选施用途径是通过皮下注射。由于经口施用可能更方便，因此已经进行了一些经口施用寡核苷酸的研究。例如，相对于皮下注射，经口施用使用渗透增强剂配制的修饰寡核苷酸在健康志愿者中产生9.5％的平均生物利用度(Tillman等人,2008,J.Pharm.Sci.,97(1):225-36)。尽管最初取得积极结果，但经口递送寡核苷酸仍存在挑战，并且通过反义机制起作用的化合物尚未进入治疗疾病的开发阶段。
发明内容
实施方案1.一种抑制靶RNA活性的方法，其包括向受试者施用包含与所述靶RNA互补的修饰寡核苷酸的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述修饰寡核苷酸具有6至25个连接核苷酸的长度，并且其中所述施用是经口施用。
实施方案2.如实施方案1所述的方法，其中所述靶RNA为微小RNA。
实施方案3.如实施方案1所述的方法，其中所述靶RNA为前信使RNA。
实施方案4.如实施方案1所述的方法，其中所述靶RNA为信使RNA。
实施方案5.如实施方案1所述的方法，其中所述靶RNA为长的非编码RNA。
实施方案6.如实施方案1至5中任一项所述的方法，其中所述靶RNA在肾脏中表达，并且所述化合物由所述修饰寡核苷酸组成。
实施方案7.如实施方案1至5中任一项所述的方法，其中所述靶RNA在肝脏中表达，并且所述化合物包含与缀合物部分连接的所述修饰寡核苷酸。
实施方案8.如实施方案1至7中任一项所述的方法，其中所述受试者患有由所述靶RNA介导的疾病。
实施方案9.如实施方案8所述的方法，其中所述化合物的所述经口施用改善所述疾病的一种或多种症状。
实施方案10.一种抑制微小RNA活性的方法，其包括向受试者施用包含与所述微小RNA互补的修饰寡核苷酸的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述修饰寡核苷酸具有6至25个连接核苷酸的长度并且其中所述施用是经口施用。
实施方案11.如实施方案1所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸与所述微小RNA完全互补。
实施方案12.如实施方案1或2所述的方法，其中所述微小RNA在肾脏中表达，并且所述化合物由所述修饰寡核苷酸组成。
实施方案13.如实施方案1至3中任一项所述的方法，其中所述微小RNA在肝脏中表达，并且所述化合物包含与缀合物部分连接的所述修饰寡核苷酸。
实施方案14.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有6至21个连接核苷的长度。
实施方案15.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有6至18个连接核苷的长度。
实施方案16.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有6至15个连接核苷的长度。
实施方案17.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有6至12个连接核苷的长度。
实施方案18.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有8至12个连接核苷的长度。
实施方案19.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有8至13个连接核苷的长度。
实施方案20.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有6个连接核苷的长度。
实施方案21.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有7个连接核苷的长度。
实施方案22.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有8个连接核苷的长度。
实施方案23.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有9个连接核苷的长度。
实施方案24.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有10个连接核苷的长度。
实施方案25.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有11个连接核苷的长度。
实施方案26.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有12个连接核苷的长度。
实施方案27.如实施方案1至13中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有13个连接核苷的长度。
实施方案28.如实施方案1至27中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸包含至少一个具有修饰的糖部分的核苷。
实施方案29.如实施方案28所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸的各核苷包含修饰的糖部分。
实施方案30.如实施方案28或29所述的方法，其中各修饰的糖部分独立地选自2'-O-甲基糖部分、2'-O-甲氧基乙基糖部分、2'-氟糖部分以及双环糖部分。
实施方案31.如实施方案30所述的方法，其中各双环糖部分独立地选自cEt糖部分和LNA糖部分。
实施方案32.如实施方案31所述的方法，其中cEt核苷是S-cEt核苷。
实施方案33.如实施方案1至27中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸包含多个非双环核苷和多个双环核苷。
实施方案34.如实施方案33所述的方法，其中各非双环核苷独立地选自2'-O-甲基核苷、2'-O-甲氧基乙基核苷和2'-氟核苷。
实施方案35.如实施方案34所述的方法，其中各双环核苷选自cEt核苷和LNA核苷。
实施方案36.如实施方案35所述的方法，其中所述cEt核苷是S-cEt核苷。
实施方案37.如实施方案1至36中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键。
实施方案38.如实施方案1至36中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸的各核苷间键为修饰的核苷间键。
实施方案39.如实施方案37或38所述的方法，其中所述修饰的核苷间键为硫代磷酸酯键。
实施方案40.如实施方案7或13所述的方法，其中所述缀合物部分包含胆固醇部分或碳水化合物部分。
实施方案41.如实施方案40所述的方法，其中所述碳水化合物部分选自N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺和N-异丁酰基-半乳糖胺。
实施方案42.如实施方案7或13所述的方法，其中所述化合物具有以下结构：
Ln-接头-X1-Nm-X2-MO；
其中各L独立地为配体，并且n为1至10；各N独立地为修饰或未修饰的核苷，并且m为1至5；X1为磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；X2为磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO为所述修饰寡核苷酸。
实施方案43.如实施方案42所述的方法，其中如果n大于1，则Ln-接头具有以下结构：
其中各L独立地为配体；n为1至10；S为支架；并且Q'和Q”独立地为连接基团。
实施方案44.如实施方案43所述的方法，其中Q'和Q”各自独立地选自肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰氨基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和6-氨基己酸。
实施方案45.如实施方案43或44所述的方法，其中所述支架将2、3、4或5个配体连接至修饰寡核苷酸。
实施方案46.如实施方案43或44所述的方法，其中所述支架将3个配体连接至修饰寡核苷酸。
实施方案47.如实施方案42至46中任一项所述的方法，其包括以下结构：
其中：
B选自-O-、-S-、-N(RN)-、-Z-P(Z')(Z”)O-、-Z-P(Z')(Z”)O-Nm-X1-和-Z-P(Z')(Z”)O-Nm-X2-；
MO为所述修饰寡核苷酸；
RN选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基和苄基；
Z、Z'和Z”各自独立地选自O和S；
各N独立地为修饰或未修饰的核苷；
m为1至5；
X1选自磷酸二酯键和硫代磷酸酯键；
X2为磷酸二酯键；并且
波浪线指示与其余接头和配体的连接。
实施方案48.如实施方案42至47中任一项所述的方法，其中n为1至5、1至4、1至3或1至2。
实施方案49.如实施方案42至48中任一项所述的方法，其中n为3。
实施方案50.如实施方案42至49中任一项所述的方法，其中至少一种配体选自碳水化合物、胆固醇、脂质、磷脂、抗体、脂蛋白、激素、肽、维生素、类固醇和阳离子脂质。
实施方案51.如实施方案42至50中任一项所述的方法，其中至少一种配体选自甘露糖、葡萄糖、半乳糖、核糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖、木糖、D-甘露糖、L-甘露糖、D-半乳糖、L-半乳糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-核糖、L-核糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、L-果糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-木糖、L-木糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃核糖、β-D-呋喃核糖、α-D-吡喃核糖、β-D-吡喃核糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、葡萄糖胺、半乳糖胺、唾液酸和N-乙酰半乳糖胺。
实施方案52.如实施方案42至50中任一项所述的方法，其中至少一种配体选自N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺和N-异丁酰基-半乳糖胺。
实施方案53.如实施方案42至50中任一项所述的方法，其中各配体为N-乙酰半乳糖胺。
实施方案54.如实施方案42至50中任一项所述的方法，其中所述化合物具有以下结构：
其中各N独立地为修饰或未修饰的核苷，并且m为1至5；X1和X2各自独立地为磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO为所述修饰寡核苷酸。
实施方案55.如实施方案42至50中任一项所述的方法，其中所述化合物具有以下结构：
其中各N独立地为修饰或未修饰的核苷，并且m为1至5；X1和X2各自独立地为磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO为所述修饰寡核苷酸。
实施方案56.如实施方案54或55所述的方法，其中X1和X2中的至少一个为磷酸二酯键。
实施方案57.如实施方案54或55所述的方法，其中X1和X2中的每一个为磷酸二酯键。
实施方案58.如实施方案42至57中任一项所述的方法，其中m为1。
实施方案59.如实施方案42至57中任一项所述的方法，其中m为2、3、4或5。
实施方案60.如实施方案42至59中任一项所述的方法，其中Nm为N'pN”，其中各N'独立地为未修饰的核苷，并且p为0至4；并且N”为包含未修饰的糖部分的核苷。
实施方案61.如实施方案60所述的方法，其中p为0。
实施方案62.如实施方案60所述的化合物，其中p为1、2、3或4。
实施方案63.如实施方案60至62中任一项所述的方法，其中所述未修饰的糖部分为β-D-核糖或β-D-脱氧核糖。
实施方案64.如实施方案63所述的方法，其中所述β-D-脱氧核糖为β-D-脱氧核糖腺苷。
实施方案65.如实施方案1至64中任一项所述的方法，其中所述化合物以药物组合物的形式存在。
实施方案66.如实施方案65所述的方法，其中所述药物组合物包含药学上可接受的稀释剂。
实施方案67.如实施方案66所述的方法，其中所述药学上可接受的稀释剂为水溶液。
实施方案68.如实施方案67所述的方法，其中所述水溶液为盐水溶液。
实施方案69.如实施方案67或68所述的方法，其中所述水溶液包含碳酸氢钠。
附图说明
图1示出经口(上图)或皮下(下图)施用各种化合物之后的平均ALDOA去抑制。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域技术人员通常所理解相同的含义。除非提供具体定义，否则与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医疗和药物化学结合使用的命名法以及其程序和技术是本领域中公知和常用的那些。如果本文中的术语存在多个定义，则以本部分中的定义为准。可使用化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及治疗受试者的标准技术。某些此类技术和程序可见于例如以下文献中：“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”,Sanghvi和Cook编,American Chemical Society,Washington D.C.,1994；和“Remington'sPharmaceutical Sciences”,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,第18版,1990；并且其出于任何目的据此以引用方式并入。除非另外指出，否则本文的整篇公开内容中提及的所有专利、专利申请、公布的申请和公布、GENBANK序列、网站以及其他公布材料在允许时均以全文引用方式整体并入。在提及URL或其他此类识别符或地址的情况下，应理解，此类识别符可改变并且英特网上的特定信息可改变，但可通过搜索英特网找到等效信息。对其的提及证明此类信息的可用性和公开传播。
在公开并且描述本发明的组合物和方法之前，应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的并且不旨在具有限制性。必须指出，除非上下文另外明确规定，否则如本说明书和随附权利要求中所用的单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括多个指示物。
定义
“受试者”是指被选择用于治疗或疗法的人。
“有需要的受试者”是指被鉴定为需要特定疗法或治疗的受试者。
“怀疑患有……的受试者”是指表现出疾病的一种或多种临床指标的受试者。
“施用”是指向受试者提供药剂或组合物，并且包括但不限于由医学专业人员施用和自施用。
“经口施用”是指通过受试者的口腔来施用。
“肠胃外施用”是指通过注射或输注施用。肠胃外施用包括但不限于皮下施用、静脉内施用和肌肉内施用。
“皮下施用”是指仅在皮肤以下施用。
“静脉内施用”是指施用至静脉内。
“伴随性施用”是指以各药剂的药理作用存在于受试者中的任何方式将两种或更多种药剂共同施用给受试者。伴随性施用不需要两种药剂在单一药物组合物中、以相同剂型或通过相同施用途径施用。两种药剂的作用无需同时存在。所述作用仅需重叠一段时间而无需共同延长。
“持续时间”是指活性或事件持续的时段。在某些实施方案中，治疗的持续时间为施用药剂或药物组合物的剂量的时段。
“疗法”是指疾病治疗方法。在某些实施方案中，疗法包括但不限于化学疗法、放射疗法或施用药剂。
“治疗”是指应用一种或多种用于治愈或改善疾病的特定程序。在某些实施方案中，特定程序是施用一种或多种药剂。
“改善”是指减轻病状或疾病的至少一种指标的严重性。在某些实施方案中，改善包括延迟或减缓病状或疾病的一种或多种指标的进展。指标的严重性可通过本领域技术人员已知的主观或客观量度来确定。
“处于发展……的风险中”是指受试者易于发展病状或疾病的状态。在某些实施方案中，处于发展病状或疾病的风险中的受试者表现出所述病状或疾病的一种或多种症状，但并不表现出足以诊断为患有所述病状或疾病的数目的症状。在某些实施方案中，处于发展病状或疾病的风险中的受试者表现出所述病状或疾病的一种或多种症状，但程度轻于诊断为患有所述病状或疾病所需的程度。
“预防……发作”是指预防处于发展疾病或病状的风险中的受试者发展所述病状或疾病。在某些实施方案中，处于发展疾病或病状的风险中的受试者接受与已患所述疾病或病状的受试者所接受的治疗类似的治疗。
“延迟……发作”是指延迟处于发展疾病或病状的风险中的受试者发展所述病状或疾病。在某些实施方案中，处于发展疾病或病状的风险中的受试者接受与已患所述疾病或病状的受试者所接受的治疗类似的治疗。
“治疗剂”是指用于治愈、改善或预防疾病的药剂。
“剂量”是指单次施用中所提供的药剂的指定量。在某些实施方案中，可以两次或更多次推注(bolus)、片剂或注射施用剂量。例如，在某些实施方案中，在期望皮下施用时，所期望剂量需要不易由单次注射提供的体积。在此类实施方案中，可使用两次或更多次注射来实现期望剂量。在某些实施方案中，可以两次或更多次注射施用剂量以使个体的注射部位反应最小化。在某些实施方案中，剂量以缓慢输注形式施用。
“剂量单位”是指提供药剂时所采用的形式。在某些实施方案中，剂量单位是容纳冻干寡核苷酸的小瓶。在某些实施方案中，剂量单位是容纳重构寡核苷酸的小瓶。
“治疗有效量”是指药剂向动物提供治疗有益效果的量。
“药物组合物”是指包括药剂的适于施用给个体的物质的混合物。例如，药物组合物可包含无菌水溶液。
“药剂”是指在向受试者施用时提供治疗作用的物质。
“活性药物成分”是指药物组合物中提供期望作用的物质。
“药学上可接受的盐”是指本文提供的化合物的生理学上和药学上可接受的盐，即保留化合物的期望生物活性并且在向受试者施用时不具有不期望的毒理学作用的盐。本文提供的化合物的非限制性的示例性药学上可接受的盐包括钠盐和钾盐形式。除非另外特别指示，否则如本文所用的术语“化合物”、“寡核苷酸”和“修饰寡核苷酸”包括其药学上可接受的盐。
“盐水溶液”是指氯化钠在水中的溶液。
“器官功能改善”是指器官功能朝向正常范围的变化。在某些实施方案中，通过测量受试者血液或尿液中存在的分子来评估器官功能。例如，在某些实施方案中，肝功能改善是通过血液肝转氨酶水平降低进行测量的。在某些实施方案中，肾功能改善是通过血液尿素氮降低、蛋白尿降低、白蛋白尿降低等进行测量的。
“可接受的安全性概况”是指临床上可接受的限度内的副作用模式。
“副作用”是指除期望作用以外的归因于治疗的生理反应。在某些实施方案中，副作用包括但不限于注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常和肌肉疾病。此类副作用可直接或间接检测。例如，血清中的转氨酶水平增加可指示肝毒性或肝功能异常。例如，胆红素增加可指示肝毒性或肝功能异常。
“注射部位反应”是指个体注射部位处的皮肤炎症或异常发红。
“受试者顺应性”是指受试者遵守所推荐或规定的疗法。
“顺应”是指受试者遵守所推荐的疗法。
“所推荐的疗法”是指医学专业人员关于治疗、改善、延迟或预防疾病所推荐的治疗。
“寡核苷酸”是指包含多个各自可彼此独立地修饰或未修饰的连接核苷的化合物。
“修饰寡核苷酸”是指相对于天然存在的末端、糖、核碱基和/或核苷间键具有一个或多个修饰的单链寡核苷酸。修饰寡核苷酸可包含未修饰的核苷。
“抗miR”是指具有与微小RNA互补的核碱基序列的修饰寡核苷酸。
“定标(Targeting)”是指设计和选择将与靶核酸杂交的核碱基序列的过程。
“靶向”是指具有将允许与靶核酸杂交的核碱基序列。
“调节”是指扰动功能、量或活性。在某些实施方案中，调节是指功能、量或活性增加。在某些实施方案中，调节是指功能、量或活性降低。
“表达”是指基因所编码的信息借以转化为细胞中存在并且运转的结构的任何功能和步骤。
“核碱基序列”是指寡聚化合物或核酸中连续核碱基的顺序，通常按5'至3'方向列出，而与任何糖、键和/或核碱基修饰无关。
“连续核碱基”是指核酸中彼此紧邻的核碱基。
“核碱基互补性”是指两个核碱基通过氢键合非共价配对的能力。
“互补”是指一个核酸能够与另一核酸或寡核苷酸杂交。在某些实施方案中，互补是指寡核苷酸能够与靶核酸杂交。
“完全互补”是指寡核苷酸的各核碱基均能够与靶核酸中各相应位置处的核碱基配对。在某些实施方案中，寡核苷酸与微小RNA完全互补(也称为100％互补)，即寡核苷酸的各核碱基与微小RNA中相应位置处的核碱基互补。修饰寡核苷酸可与微小RNA完全互补，并且具有许多小于微小RNA长度的连接核苷。例如，其中寡核苷酸的各核碱基与微小RNA中相应位置处的核碱基互补的具有10个连接核苷的寡核苷酸与微小RNA完全互补。
“互补性百分比”是指寡核苷酸中与靶核酸的等长部分互补的核碱基的百分比。互补性百分比通过用寡核苷酸中与靶核酸中相应位置处的核碱基互补的核碱基的数目除以寡核苷酸中核碱基的总数来计算。
“同一性百分比”是指第一核酸中与第二核酸中相应位置处的核碱基相同的核碱基的数目除以第一核酸中核碱基的总数。在某些实施方案中，第一核酸为微小RNA并且第二核酸为微小RNA。在某些实施方案中，第一核酸为寡核苷酸并且第二核酸为寡核苷酸。
“杂交”是指通过核碱基互补性发生的互补核酸的退火。
“错配”是指第一核酸中的核碱基不能与第二核酸中相应位置处的核碱基进行沃森-克里克(Watson-Crick)配对。
“相同(Identical)”在核碱基序列的情况下是指具有相同核碱基序列，而与糖、键和/或核碱基修饰无关并且与所存在的任何嘧啶的甲基状态无关。
“微小RNA”是指长度在18与25个核碱基之间的内源性非编码RNA，其为由酶Dicer裂解微小RNA前体的产物。成熟微小RNA的实例可见于被称为miRBase的微小RNA数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/)。在某些实施方案中，微小RNA缩写为“微小RNA”或“miR”。
“微小RNA调控的转录物”是指通过微小RNA调控的转录物。
“种子序列”是指包含成熟微小RNA序列的5'端的核碱基2至7的核碱基序列。
“种子匹配序列”是指与种子序列互补并且长度与种子序列相同的核碱基序列。
“天然存在的核苷间键”是指核苷之间的3’至5’磷酸二酯键。
“天然糖”是指DNA(2'-H)或RNA(2'-OH)中存在的糖。
“核苷间键”是指相邻核苷之间的共价键。
“连接核苷”是指通过共价键连接的核苷。
“核碱基”是指能够与另一核碱基非共价配对的杂环部分。
“核苷”是指连接至糖部分的核碱基。
“核苷酸”是指具有共价连接至核苷的糖部分的磷酸酯基的核苷。
“包含由多个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物”是指包括具有指定数目的连接核苷的修饰寡核苷酸的化合物。因此，所述化合物可包括附加取代基或缀合物。除非另外说明，否则所述化合物不包括除修饰寡核苷酸的那些核苷以外的任何另外的核苷。
“修饰核苷”是指与天然存在的核苷相比具有任何变化的核苷。修饰核苷可具有修饰的糖和未修饰的核碱基。修饰核苷可具有修饰的糖和修饰核碱基。修饰核苷可具有天然糖和修饰核碱基。在某些实施方案中，修饰核苷为双环核苷。在某些实施方案中，修饰核苷为非双环核苷。
“2'-修饰核苷”是指包含在相当于呋喃糖基环的2'位置的位置处具有任何修饰的糖的核苷，所述位置在2-脱氧核糖或核糖中编号。应了解，2'-修饰核苷包括但不限于包含双环糖部分的核苷。
“修饰的核苷间键”是指与天然存在的核苷间键相比存在任何变化。
“硫代磷酸酯核苷间键”是指核苷之间一个非桥接原子为硫原子的键，即OP(O)(S)O-。为避免疑义，硫原子可被质子化或与抗衡离子诸如Na+、K+等缔合。
“磷酸二酯键”是指核苷之间具有-OP(O)2O-结构的键。为避免疑义，一个非桥接氧可被质子化或与抗衡离子诸如Na+、K+等缔合。
“未修饰的核碱基”是指RNA或DNA的天然存在的杂环碱基：嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)(包括5-甲基胞嘧啶)和尿嘧啶(U)。
“5-甲基胞嘧啶”是指包含连接于胞嘧啶环的5位的甲基的胞嘧啶。
“非甲基化胞嘧啶”是指不具有连接于胞嘧啶环的5位的甲基的胞嘧啶。
“修饰核碱基”是指不是未修饰核碱基的任何核碱基。
“糖部分”是指天然存在的呋喃糖基或修饰的糖部分。
“修饰的糖部分”是指取代的糖部分或糖替代物。
“2'-O-甲基糖”或“2'-OMe糖”是指在2'位具有O-甲基修饰的糖。
“2'-O-甲氧基乙基糖”或“2'-MOE糖”是指在2'位具有O-甲氧基乙基修饰的糖。
“2'-O-氟”或“2'-F”是指在2'位具有氟修饰的糖。
“双环糖部分”是指包含4至7元环的修饰的糖部分(包括但不限于呋喃糖基)，其包含连接4至7元环的两个原子的桥以形成第二环，从而产生双环结构。在某些实施方案中，4至7元环为糖环。在某些实施方案中，4至7元环为呋喃糖基。在某些此类实施方案中，桥连接呋喃糖基的2'碳和4'碳。非限制性的示例性双环糖部分包括LNA、ENA、cEt、S-cEt和R-cEt。
“锁核酸(LNA)糖部分”是指在4'与2'呋喃糖环原子之间包含(CH2)-O桥的取代的糖部分。
“ENA糖部分”是指在4'与2'呋喃糖环原子之间包含(CH2)2-O桥的取代的糖部分。
“限制性乙基(cEt)糖部分”是指在4'与2'呋喃糖环原子之间包含CH(CH3)-O桥的取代的糖部分。在某些实施方案中，CH(CH3)-O桥局限于S型取向。在某些实施方案中，CH(CH3)-O桥局限于R型取向。
“S-cEt糖部分”是指在4'与2'呋喃糖环原子之间包含S型限制性CH(CH3)-O桥的取代的糖部分。
“R-cEt糖部分”是指在4'与2'呋喃糖环原子之间包含R型限制性CH(CH3)-O桥的取代的糖部分。
“2'-O-甲基核苷”是指具有2'-O-甲基糖修饰的修饰核苷。
“2'-O-甲氧基乙基核苷”是指具有2'-O-甲氧基乙基糖修饰的修饰核苷。2'-O-甲氧基乙基核苷可包含修饰或未修饰的核碱基。
“2'-氟核苷”是指具有2'-氟糖修饰的修饰核苷。2'-氟核苷可包含修饰或未修饰的核碱基。
“双环核苷”是指具有双环糖部分的修饰核苷。双环核苷可具有修饰或未修饰的核碱基。
“cEt核苷”是指包含cEt糖部分的核苷。cEt核苷可包含修饰或未修饰的核碱基。
“S-cEt核苷”是指包含S-cEt糖部分的核苷。
“R-cEt核苷”是指包含R-cEt糖部分的核苷。
“β-D-脱氧核糖核苷”是指天然存在的DNA核苷。
“β-D-核糖核苷”是指天然存在的RNA核苷。
“LNA核苷”是指包含LNA糖部分的核苷。
“ENA核苷”是指包含ENA糖部分的核苷。
如本文所用的“连接基团”是指通过一个或多个共价键将第一化学实体连接至第二化学实体的原子或原子团。
如本文所用的“接头”是指通过一个或多个共价键将一个或多个配体连接至修饰或未修饰核苷的原子或原子团。修饰或未修饰的核苷可以是如本文所述的修饰寡核苷酸的一部分，或可通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键连接至修饰寡核苷酸。在一些实施方案中，接头将一个或多个配体连接至修饰寡核苷酸的3'端。在一些实施方案中，接头将一个或多个配体连接至修饰寡核苷酸的5'端。在一些实施方案中，接头将一个或多个配体连接至修饰或未修饰的核苷，所述核苷连接至修饰寡核苷酸的3'端。在一些实施方案中，接头将一个或多个配体连接至修饰或未修饰的核苷，所述核苷连接至修饰寡核苷酸的5'端。当接头将一个或多个配体连接至修饰寡核苷酸的3'端或连接至连接到修饰寡核苷酸的3'端的修饰或未修饰的核苷时，在一些实施方案中，接头的连接点可以是修饰或未修饰的糖部分的3'碳。当接头将一个或多个配体连接至修饰寡核苷酸的5'端或连接至连接到修饰寡核苷酸的5'端的修饰或未修饰的核苷时，在一些实施方案中，接头的连接点可以是修饰或未修饰的糖部分的5'碳。
概述
经口施用寡核苷酸具有可能相对于皮下施用而言有利的若干特征，例如，改善的患者顺应性、改善的给药方便性和不存在皮下注射部位反应。
迄今为止，寡核苷酸(包括抗miR化合物)的经口施用尚未得到充分表征。因此，在实验动物模型中评估了修饰寡核苷酸的经口施用。修饰寡核苷酸在核碱基序列、长度、化学修饰模式和是否存在缀合物部分方面不同。出乎意料地，观察到经口施用某些修饰寡核苷酸表现出与皮下施用后观察到的药效学活性相当的药效学活性。此外，观察到稳健的药效学活性，其中与对于皮下施用相同化合物所检测到的量相比，在靶组织中检测到的修饰寡核苷酸的量相对较低。
因此，本文提供了向受试者经口施用包含与靶RNA互补的修饰寡核苷酸的化合物的方法。靶RNA可以是，例如，微小RNA、前信使RNA、信使RNA或长的非编码RNA。
某些方法
本文提供了抑制靶RNA活性的方法，所述方法包括向受试者施用包含与靶RNA互补的修饰寡核苷酸的化合物或其药学上可接受的盐，其中修饰寡核苷酸具有6至25个连接核苷酸的长度，并且其中施用是经口施用。在某些实施方案中，靶RNA为微小RNA。在某些实施方案中，靶RNA为前信使RNA。在某些实施方案中，靶RNA为信使RNA。在某些实施方案中，靶RNA为长的非编码RNA。
在某些实施方案中，靶RNA存在于肾脏中，并且化合物由修饰寡核苷酸组成。在某些实施方案中，靶RNA存在于肝脏中，并且化合物包含与缀合物部分连接的修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，受试者患有由靶RNA介导的疾病。在某些实施方案中，化合物的经口施用改善由靶RNA介导的疾病的一种或多种症状。
本文提供了抑制微小RNA活性的方法，所述方法包括向受试者施用包含与微小RNA互补的修饰寡核苷酸的化合物或其药学上可接受的盐，其中修饰寡核苷酸具有6至25个连接核苷酸的长度，并且其中施用是经口施用。在某些实施方案中，微小RNA存在于肾脏中，并且化合物由修饰寡核苷酸组成。在某些实施方案中，微小RNA存在于肝脏中，并且化合物包含与缀合物部分连接的修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，受试者患有由微小RNA介导的疾病。在某些实施方案中，化合物的经口施用改善由微小RNA介导的疾病的一种或多种症状。
在某些实施方案中，本文提供的方法包括使肝细胞与本文提供的化合物接触。在某些实施方案中，本文提供的方法包括使肾细胞与本文提供的化合物接触。
本文提供了用于经口施用包含与靶RNA互补的修饰寡核苷酸的化合物的方法，所述化合物用于在疗法中使用。
本文提供了用于经口施用包含与微小RNA互补的修饰寡核苷酸的化合物的方法，所述化合物用于在疗法中使用。
某些化合物和组合物
在某些实施方案中，本文提供的方法包括经口施用包含修饰寡核苷酸的化合物。在某些实施方案中，本文提供的方法包括经口施用由修饰寡核苷酸组成的化合物。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有6至25个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有6至21个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有6至18个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有6至15个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有6至12个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有8至10个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有8至12个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有8至13个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有6个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有7个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有8个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有9个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有10个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有11个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有12个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有13个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有14个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有15个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有16个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有17个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有18个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有19个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有20个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有21个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有22个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有23个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有24个连接核苷的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有25个连接核苷的长度。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核碱基序列与靶RNA的核碱基序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少95％、至少96％或100％互补。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸与靶RNA至少90％、至少93％、至少94％、至少95％或100％互补。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸与微小RNA的核碱基序列至少90％、至少93％、至少94％、至少95％或100％互补。
在修饰寡核苷酸的各核苷间键(例如，各硫代磷酸酯键和各磷酸二酯键)中，非桥接杂原子(例如，S-或O-)可被质子化或与抗衡离子诸如Na+、K+等缔合。与每个分子所存在的硫代磷酸酯和/或磷酸二酯键相比，化合物的药学上可接受的盐可包含更少的阳离子抗衡离子(诸如Na+、K+等)(即，一些硫代磷酸酯和/或磷酸二酯键被质子化并且一些与抗衡离子缔合)。例如，长度为9个连接核苷酸的修饰寡核苷酸的药学上可接受的盐可包含每个修饰寡核苷酸分子少于8个阳离子抗衡离子(诸如Na+、K+等)。也就是说，在一些实施方案中，药学上可接受的盐平均可包含每个修饰寡核苷酸分子1、2、3、4、5、6或7个阳离子抗衡离子，其余硫代磷酸酯和/或磷酸二酯键是质子化的。
本文提供包含本文提供的化合物和药学上可接受的稀释剂的药物组合物。在某些实施方案中，药学上可接受的稀释剂为水溶液。在某些实施方案中，水溶液为盐水溶液。如本文所用，药学上可接受的稀释剂应理解为无菌稀释剂。
某些修饰
修饰寡核苷酸可包含对核碱基、糖和/或核苷间键的一种或多种修饰。修饰的核碱基、糖和/或核苷间键可因期望特性诸如细胞吸收增强、对其他寡核苷酸或核酸靶标的亲和力增强以及在核酸酶存在下稳定性增加而优先于未修饰形式被选择。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含一个或多个修饰核苷。在某些实施方案中，修饰核苷为稳定化核苷。稳定化核苷的实例为2’-修饰核苷。
在某些实施方案中，修饰核苷包含修饰的糖部分。在某些实施方案中，包含修饰的糖部分的修饰核苷包含未修饰的核碱基。在某些实施方案中，修饰的糖包含修饰核碱基。在某些实施方案中，修饰核苷为2’-修饰核苷。
在某些实施方案中，2'-修饰核苷包含双环糖部分。在某些此类实施方案中，双环糖部分为呈α构型的D型糖。在某些此类实施方案中，双环糖部分为呈β构型的D型糖。在某些此类实施方案中，双环糖部分为呈α构型的L型糖。在某些此类实施方案中，双环糖部分为呈β构型的L型糖。
在某些实施方案中，双环糖部分在2'与4'碳原子之间包含桥基。包含双环糖部分的核苷称为双环核苷或BNA。在某些实施方案中，双环核苷包括但不限于如下文所描绘的(A)α-L-亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')BNA；(B)β-D-亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')BNA；(C)亚乙基氧基(4'-(CH2)2-O-2')BNA；(D)氨基氧基(4'-CH2-O-N(R)-2')BNA；(E)氧基氨基(4'-CH2-N(R)-O-2')BNA；(F)甲基(亚甲基氧基)(4'-CH(CH3)-O-2')BNA(也称为限制性乙基或cEt)；(G)亚甲基-硫代(4'-CH2-S-2')BNA；(H)亚甲基-氨基(4'-CH2-N(R)-2')BNA；(I)甲基碳环(4'-CH2-CH(CH3)-2')BNA；(J)c-MOE(4'-CH2-OMe-2')BNA；以及(K)亚丙基碳环(4'-(CH2)3-2')BNA。
其中Bx为核碱基部分并且R独立地为H、保护基或C1-C12烷基。
在某些实施方案中，2'-修饰核苷包含选自以下的2'-取代基：F、OCF3、O-CH3、OCH2CH2OCH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(CH3)2、-O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2和O-CH2-C(＝O)-N(H)CH3。
在某些实施方案中，2'-修饰核苷包含选自以下的2'-取代基：F、O-CH3和OCH2CH2OCH3。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含一个或多个核苷间修饰。在某些此类实施方案中，修饰寡核苷酸的各核苷间键为修饰的核苷间键。在某些实施方案中，修饰的核苷间键包含磷原子。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷间键。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含一个或多个修饰核碱基。在某些实施方案中，修饰核碱基选自7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。在某些实施方案中，修饰核碱基选自5-取代嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。
某些缀合物结构
在某些实施方案中，本文提供包含修饰寡核苷酸和缀合物部分的化合物，其中缀合物部分改善化合物向靶细胞类型的递送。
缀合化合物可通过结构C描述：
Ln-接头-X1-Nm-X2-MO；
其中各L独立地为配体，并且n为1至10；各N独立地为修饰或未修饰的核苷，并且m为1至5；X1为磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；X2为磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO为修饰寡核苷酸。
例如，抗miR-122化合物RG6650可通过结构C的以下实施方案描述：
其中MO为修饰寡核苷酸并且具有结构USCSACSACSTCSCS(RG4773)，其中之后未接有下标的核苷为β-D-脱氧核糖核苷，之后接有下标“S”的核苷为S-cEt核苷，并且各核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键；其中X1为磷酸二酯键；m为1；N为β-D-脱氧核糖腺苷；X2为磷酸二酯键；并且其中缀合物部分与修饰寡核苷酸的3'端连接。
在某些实施方案中，结构C的一个或多个配体可以是与GalNAc部分一样促进在肝脏中的吸收的配体。此类配体包括胆固醇以及对脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)具有亲和力的其他配体，包括但不限于半乳糖或半乳糖衍生物。在某些实施方案中，对ASGPR具有亲和力的配体为N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺或N-异丁酰基-半乳糖胺。
在某些实施方案中，当n大于1时，接头包含能够将多于一个L与化合物的其余部分(即，与修饰寡核苷酸(MO)、与X1-Nm-X2-MO、与X-Nm-Y-MO等)连接的支架。在一些此类实施方案中，化合物(诸如结构A、B、C或D的化合物)的Ln-接头部分包含结构E：
其中各L独立地为配体；n为1至10；S为支架；并且Q'和Q”独立地为连接基团。
在某些实施方案中，各Q'和Q”独立地选自肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰氨基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和6-氨基己酸。
在某些实施方案中，支架将2、3、4或5个配体连接至修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，支架将3个配体连接至修饰寡核苷酸。
非限制性的示例性结构E为结构E(i)：
其中L1、L2和L3各自独立地为配体；Q'1、Q'2、Q'3和Q”各自独立地为连接基团；并且R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施方案中，Q'1、Q'2、Q'3和Q”各自独立地选自肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰氨基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和6-氨基己酸。在一些实施方案中，R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基和丁基。在一些实施方案中，R1、R2、R3和R4各自选自H和甲基。
另一非限制性的示例性结构E为结构E(ii)：
其中L1、L2和L3各自独立地为配体；Q'1、Q'2、Q'3和Q”各自独立地为连接基团；并且R1选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施方案中，Q'1、Q'2、Q'3和Q”各自独立地选自肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰氨基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和6-氨基己酸。在一些实施方案中，R1选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基和丁基。在一些实施方案中，R1为H或甲基。
另一非限制性的示例性结构E为结构E(iii)：
其中L1、L2和L3各自独立地为配体；Q'1、Q'2、Q'3和Q”各自独立地为连接基团；并且R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施方案中，Q'1、Q'2、Q'3和Q”各自独立地选自肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰氨基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和6-氨基己酸。在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基和丁基。在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5各自选自H和甲基。
另一非限制性的示例性结构E为结构E(iv)：
其中L1和L2各自独立地为配体；Q'1、Q'2和Q”各自独立地为连接基团；并且R1、R2和R3各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施方案中，Q'1、Q'2和Q”各自独立地选自肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰氨基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和6-氨基己酸。在一些实施方案中，R1、R2和R3各自独立地选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基和丁基。在一些实施方案中，R1、R2和R3各自选自H和甲基。
另一非限制性的示例性结构E为结构E(v)：
其中L1和L2各自独立地为配体；Q'1、Q'2和Q”各自独立地为连接基团；并且R1、R2和R3各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施方案中，Q'1、Q'2和Q”各自独立地选自肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰氨基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和6-氨基己酸。在一些实施方案中，R1、R2和R3各自独立地选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基和丁基。在一些实施方案中，R1、R2和R3各自选自H和甲基。
另一非限制性的示例性结构E为结构E(vi)：
其中L1、L2和L3各自独立地为配体；Q'1、Q'2、Q'3和Q”各自独立地为连接基团；并且R1、R2和R3各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施方案中，Q'1、Q'2、Q'3和Q”各自独立地选自肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰氨基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和6-氨基己酸。在一些实施方案中，R1、R2和R3各自独立地选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基和丁基。在一些实施方案中，R1、R2和R3各自选自H和甲基。
另一非限制性的示例性结构E为结构E(vii)：
其中L1、L2和L3各自独立地为配体；Q'1、Q'2、Q'3和Q”各自独立地为连接基团；R1、R2和R3各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基；并且Z和Z'各自独立地选自O和S。
在一些实施方案中，Q'1、Q'2、Q'3和Q”各自独立地选自肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰氨基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和6-氨基己酸。在一些实施方案中，R1、R2和R3各自独立地选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基和丁基。在一些实施方案中，R1、R2和R3各自选自H和甲基。在一些实施方案中，至少一个P原子上的Z或Z'为S，并且另一个Z或Z'为O(即硫代磷酸酯键)。在一些实施方案中，各-OP(Z)(Z')O-为硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，在至少一个P原子上的Z和Z'均为O(即磷酸二酯键)。在一些实施方案中，各-OP(Z)(Z')O-为磷酸二酯键。
另一非限制性的示例性结构E为结构E(viii)：
其中L1、L2和L3各自独立地为配体；Q'1、Q'2、Q'3和Q”各自独立地为连接基团；并且R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施方案中，Q'1、Q'2、Q'3和Q”各自独立地选自肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰氨基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和6-氨基己酸。在一些实施方案中，R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基和丁基。在一些实施方案中，R1、R2、R3和R4各自选自H和甲基。
描述了非限制性的示例性支架和/或包含支架的接头以及其合成，例如PCT公布WO2013/033230、美国专利8,106,022 B2、美国公布2012/0157509 A1；美国专利5,994,517；美国专利7,491,805 B2；美国专利8,313,772 B2；Manoharan，M.，第16章，Antisense DrugTechnology，Crooke，S.T.，Marcel Dekker，Inc.，2001,391-469。
在某些实施方案中，化合物的Ln-接头部分包含结构F：
其中：
B选自-O-、-S-、-N(RN)-、-Z-P(Z')(Z”)O-、-Z-P(Z')(Z”)O-Nm-X-和-Z-P(Z')(Z”)O-Nm-Y-；
MO为修饰寡核苷酸；
RN选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基和苄基；
Z、Z'和Z”各自独立地选自O和S；
各N独立地为修饰或未修饰的核苷；
m为1至5；
X选自磷酸二酯键和硫代磷酸酯键；
Y为磷酸二酯键；并且
波浪线指示与其余接头和配体的连接。
在某些实施方案中，波浪线指示与上述结构E的连接。
在某些实施方案中，n为1至5、1至4、1至3或1至2。在某些实施方案中，n为1。在某些实施方案中，n为2。在某些实施方案中，n为3。在某些实施方案中，n为4。在某些实施方案中，n为5。
在某些实施方案中，化合物的Ln-接头部分包含结构G：
其中：
B选自-O-、-S-、-N(RN)-、-Z-P(Z')(Z”)O-、-Z-P(Z')(Z”)O-Nm-X-和-Z-P(Z')(Z”)O-Nm-Y-；
MO为修饰寡核苷酸；
RN选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基和苄基；
Z、Z'和Z”各自独立地选自O和S；
各N独立地为修饰或未修饰的核苷；
m为1至5；
X选自磷酸二酯键和硫代磷酸酯键；
Y为磷酸二酯键；
各L独立地为配体；n为1至10；S为支架；并且Q'和Q”独立地为连接基团。
在某些实施方案中，各Q'和Q”独立地选自肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰氨基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯和6-氨基己酸。
化合物的非限制性的示例性Ln-接头部分(例如，结构F或G)在以下结构H中示出：
其中波浪线指示与修饰寡核苷酸、与例如结构B中的X1或与例如结构C或D的X或Y的连接。
在某些实施方案中，包含本文所述的缀合的修饰寡核苷酸的化合物具有结构A：
Ln-接头-MO；
其中各L独立地为配体，并且n为1至10；并且MO为修饰寡核苷酸。
在一些实施方案中，化合物具有结构J：
其中各N独立地为修饰或未修饰的核苷，并且m为1至5；X1和X2各自独立地为磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO为修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，X1和X2中的至少一个为磷酸二酯键。在某些实施方案中，X1和X2中的每一个为磷酸二酯键。
在某些实施方案中，m为1。在某些实施方案中，m为2。在某些实施方案中，m为3、4或5。在某些实施方案中，m为2、3、4或5。在某些实施方案中，当m大于1时，Nm的各修饰或未修饰的核苷可通过磷酸二酯核苷间键或硫代磷酸酯核苷间键连接至Nm的相邻的修饰或未修饰的核苷。
在本文所述的任何实施方案中，Nm可为N'pN”，其中各N'独立地为修饰或未修饰的核苷，并且p为0至4；并且N”为包含未修饰的糖部分的核苷。
在某些实施方案中，p为0。在某些实施方案中，p为1、2、3或4。在某些实施方案中，当p为1、2、3或4时，各N'包含未修饰的糖部分。
在某些实施方案中，未修饰的糖部分为β-D-核糖或β-D-脱氧核糖。在某些实施方案中，β-D-脱氧核糖为β-D-脱氧核糖腺苷。
在某些实施方案中，在p为1、2、3或4时，N'包含嘌呤核碱基。在某些实施方案中，N”包含嘌呤核碱基。在某些实施方案中，嘌呤核碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。在某些实施方案中，N'为β-D-脱氧核糖腺苷或β-D-脱氧核糖鸟苷。在某些实施方案中，N”为β-D-脱氧核糖腺苷或β-D-脱氧核糖鸟苷。
在某些实施方案中，p为1，N'和N”各自为β-D-脱氧核糖腺苷，并且N'和N”通过磷酸二酯核苷间键连接。在某些实施方案中，p为1，N'和N”各自为β-D-脱氧核糖腺苷，并且N'和N”通过磷酸二酯核苷间键连接。在某些实施方案中，p为1，N'和N”各自为β-D-脱氧核糖腺苷，并且N'和N”通过硫代磷酸酯核苷间键连接。
在某些实施方案中，当p为1、2、3或4时，N'包含嘧啶核碱基。在某些实施方案中，N”包含嘧啶核碱基。在某些实施方案中，嘧啶核碱基选自胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶和5,6-二氢尿嘧啶。
在某些实施方案中，各N的糖部分独立地选自β-D-核糖、β-D-脱氧核糖、2'-O-甲氧基糖、2'-O-甲基糖、2'-氟糖以及双环糖部分。在某些实施方案中，各双环糖部分独立地选自cEt糖部分、LNA糖部分和ENA糖部分。在某些实施方案中，cEt糖部分为S-cEt糖部分。在某些实施方案中，cEt糖部分为R-cEt糖部分。
在某些实施方案中，化合物包含与修饰寡核苷酸的5'端连接的缀合物部分。在某些实施方案中，化合物包含与修饰寡核苷酸的3'端连接的缀合物部分。在某些实施方案中，化合物包含与修饰寡核苷酸的5'端连接的缀合物部分。在某些实施方案中，化合物包含与修饰寡核苷酸的3'端连接的第一缀合物部分和与修饰寡核苷酸的5'端连接的第二缀合物部分。
某些代谢产物
在体外或体内暴露于外切核酸酶和/或内切核酸酶时，化合物可在整个化合物的各个位置进行裂解。这一裂解的产物可保留一定程度的亲本化合物活性，并且因此被视为活性代谢物。因此，化合物的代谢产物可用于本文所述的方法中。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸(未缀合或缀合的)在5'端和/或3'端进行裂解，产生相对于亲本修饰寡核苷酸在5'端和/或3'端少1、2或3个核苷酸的代谢产物。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸在5'端进行裂解，释放5'-端核苷酸并且产生相对于亲本修饰寡核苷酸在5'端少1个核苷酸的代谢产物。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸在5'端进行裂解，释放两个5'-端核苷，并且产生相对于亲本修饰寡核苷酸在5'端少两个核苷酸的代谢产物。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸在3'端进行裂解，释放3'-端核苷酸，并且产生相对于亲本修饰寡核苷酸在3'端少一个核苷酸的代谢产物。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸在3'端进行裂解，释放两个3'-端核苷，并且产生相对于亲本修饰寡核苷酸在3'端少两个核苷酸的代谢产物。
包含与缀合物部分连接的修饰寡核苷酸的化合物也可在修饰寡核苷酸与配体之间的接头内的位点处进行裂解。在某些实施方案中，裂解产生包含一部分缀合物部分的亲本修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，裂解产生包含修饰寡核苷酸与配体之间的接头的一个或多个亚基的亲本修饰寡核苷酸。例如，当化合物具有结构Ln-接头-X1-Nm-X2-MO时，在一些实施方案中，裂解产生包含Nm的一个或多个核苷酸的亲本修饰寡核苷酸。在一些实施方案中，缀合的修饰寡核苷酸的裂解产生亲本修饰寡核苷酸。在一些此类实施方案中，例如，当化合物具有结构Ln-接头-X1-Nm-X2-MO时，在一些实施方案中，裂解产生不具有Nm的任何核苷酸的亲本修饰寡核苷酸。
某些核碱基序列
本文所述的任何核碱基序列(包括但不限于实施例和序列表中存在的那些)独立于对核酸所进行的任何修饰。因此，由SEQ ID NO限定的核酸可独立地包含对一个或多个糖部分、一个或多个核苷间键和/或一个或多个核碱基所进行的一个或多个修饰。
虽然随附于此申请的序列表根据需要将各核碱基序列标识为“RNA”或“DNA”，但实际上，那些序列可用化学修饰的任何组合修饰。本领域技术人员将易于了解诸如“RNA”或“DNA”的用以描述修饰寡核苷酸的名称多少有些随意。例如，包含有包含2′-OH糖部分和胸腺嘧啶碱基的核苷的修饰寡核苷酸可被描述为具有修饰糖(针对DNA的天然2′-H的2′-OH)的DNA或被描述为具有修饰碱基(针对RNA的天然尿嘧啶的胸腺嘧啶(甲基化尿嘧啶))的RNA。
因此，本文提供的核酸序列(包括但不限于序列表中的那些)旨在涵盖含有天然或修饰RNA和/或DNA的任何组合的核酸，包括但不限于具有修饰核碱基的此类核酸。进一步举例并且不加限制，具有核碱基序列“ATCGATCG”的修饰寡核苷酸涵盖具有此核碱基序列(无论修饰还是未修饰)的任何寡核苷酸，包括但不限于包含RNA碱基的此类化合物，诸如具有序列“AUCGAUCG”的那些和具有一些DNA碱基和一些RNA碱基的那些(诸如“AUCGATCG”)以及具有其他修饰碱基的寡核苷酸，诸如“ATmeCGAUCG”，其中meC指示5-甲基胞嘧啶。类似地，具有核碱基序列“AUCGAUCG”的修饰寡核苷酸涵盖具有此核碱基序列(无论修饰还是未修饰)的任何寡核苷酸，包括但不限于包含DNA碱基的此类化合物，诸如具有序列“ATCGATCG”的那些和具有一些DNA碱基和一些RNA碱基的那些(诸如“AUCGATCG”)以及具有其他修饰碱基的寡核苷酸，诸如“ATmeCGAUCG”，其中meC指示5-甲基胞嘧啶。
某些合成方法
修饰寡核苷酸可用本领域已知的自动化固相合成方法制备。在固相合成期间，亚磷酰胺单体依次与核苷偶合，所述核苷与固体支持物共价连接。此核苷为修饰寡核苷酸的3'端核苷。通常，偶合循环包括四个步骤：脱三苯甲基化(用酸移除5'-羟基保护基)、偶合(将活化的亚磷酰胺连接至支持物结合的核苷或寡核苷酸)、氧化或硫化(用氧化剂或硫化剂对新形成的亚磷酸三酯进行转化)和封端(未反应的5'-羟基的乙酰化)。在最终偶合循环后，对固体支持物结合的寡核苷酸进行脱三苯甲基化步骤，然后进行裂解和去保护步骤，所述步骤同时从固体支持物中释放寡核苷酸并且从碱基中移除保护基。通过过滤移除固体支持物，将滤液浓缩并且测试所得溶液的同一性和纯度。然后例如使用填充有阴离子交换树脂的柱纯化寡核苷酸。
GalNAc缀合的修饰寡核苷酸可用自动化固相合成制备，类似于产生未缀合寡核苷酸的固相合成。在GalNAc缀合的寡核苷酸的合成过程中，亚磷酰胺单体依次与GalNAc缀合物偶合，所述GalNAc缀合物与固体支持物共价连接。GalNAc缀合物和GalNAc缀合物固体支持物的合成描述于例如美国专利8,106,022和国际申请公布WO 2013/033230中，其中的每一个以引用方式整体并入本文中，以描述含有碳水化合物的缀合物(包括包含一个或多个GalNAc部分的缀合物)的合成以及与固体支持物共价连接的缀合物的合成。
某些药物组合物
本文提供包含本文提供的化合物和药学上可接受的稀释剂的药物组合物。在某些实施方案中，药学上可接受的稀释剂为水溶液。在某些实施方案中，水溶液为盐水溶液。如本文所用，药学上可接受的稀释剂应理解为无菌稀释剂。合适的施用途径包括但不限于经口施用。
在某些实施方案中，本文提供包含本文提供的化合物和碳酸氢钠的药物组合物。
在某些实施方案中，药物组合物为本文提供的化合物，其已经在合适的稀释剂中制备，在制备期间用酸或碱调节至pH 7.0至9.0，并且接着在无菌条件下冻干。冻干的修饰寡核苷酸随后用合适的稀释剂(例如水溶液，诸如水或生理学上相容的缓冲液，诸如盐水溶液、汉克斯溶液(Hanks's solution)或林格氏溶液(Ringer's solution))重构。在某些实施方案中，用碳酸氢钠溶液将药物组合物的pH调节至约9.0。重构产物以皮下注射形式或以静脉内输注形式施用。冻干的药物产品可包装于用溴丁基橡胶盖塞住并且用铝顶封密封的2mL I型透明玻璃小瓶(硫酸铵处理过的)中。
在某些实施方案中，药物组合物以剂量单位的形式(例如片剂、胶囊、推注等)施用。在一些实施方案中，药物组合物包含选自25mg至250mg的范围内的剂量的本文提供的化合物。在某些实施方案中，此类药物组合物包含以选自以下的剂量存在的本文提供的化合物：25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、205mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg或250mg。
药物组合物还可含有合适的稳定剂或增加药剂的溶解度以允许制备高度浓缩溶液的剂。
制备本文提供的药物组合物用于经口施用。在某些此类实施方案中，药物组合物是通过将一种或多种包含修饰寡核苷酸的化合物与一种或多种药学上可接受的载剂组合来配制的。某些此类载剂使得药物组合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣锭、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆剂、混悬剂等，以供受试者经口摄取。
在某些实施方案中，用于经口使用的药物组合物通过将包含修饰寡核苷酸的化合物和一种或多种固体赋形剂混合而获得。合适的赋形剂包括渗透增强剂，诸如脂肪酸、胆汁酸、螯合剂和非螯合的非表面活性剂。在某些实施方案中，脂肪酸选自花生四烯酸、油酸、月桂酸、癸酸、辛酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱和甘油单酯或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，胆汁酸选自胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、葡糖胆酸(glucholic acid)、甘氨胆酸(glycholic acid)、甘氨脱氧胆酸(glycodeoxycholic acid)、牛磺胆酸(taurocholic acid)、牛磺脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、牛磺-24,25-二氢褐霉酸钠、甘氨二氢褐霉酸钠和聚氧乙烯-9-月桂基醚或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，螯合剂选自EDTA、柠檬酸、水杨酸盐、胶原的N-酰基衍生物、月桂醇聚醚-9和β-二酮的N-氨基酰基衍生物或其混合物。在某些实施方案中，渗透增强剂包括癸酸钠(C10)和/或辛酸钠(C12)。
另外的合适赋形剂包括但不限于填充剂，诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，诸如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在某些实施方案中，任选地研磨所述混合物并且任选地添加助剂。在某些实施方案中，使药物组合物成型以获得片剂或糖衣锭核心。在某些实施方案中，添加崩解剂(例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，诸如海藻酸钠)。
在某些实施方案中，糖衣锭核心具有包衣。在某些此类实施方案中，可使用糖浓溶液，其可任选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶(carbopol gel)、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料添加到片剂或糖衣锭包衣中。
在某些实施方案中，用于经口施用的药物组合物是由明胶制成的推入配合型胶囊。某些此类推入配合型胶囊包含一种或多种本发明的药剂与一种或多种填充剂(诸如乳糖)、粘合剂(诸如淀粉)和/或润滑剂(诸如滑石或硬脂酸镁)以及任选地稳定剂的混合物。在某些实施方案中，用于经口施用的药物组合物是由明胶和塑化剂(诸如甘油或山梨糖醇)制成的软密封胶囊。在某些软胶囊中，一种或多种本发明的药剂溶解或悬浮于合适的液体(诸如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇)中。此外，可添加稳定剂。
在某些实施方案中，药物组合物被制备用于经颊施用。某些此类药物组合物是以常规方式配制的片剂或锭剂。在某些实施方案中，本文提供的药物组合物可另外含有本领域已确定的用量的常规存在于药物组合物中的其他辅助组分。因此，例如，组合物可含有另外的相容性药学活性材料，诸如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或消炎剂。
某些试剂盒
本发明还提供试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含一种或多种本文提供的化合物。在一些实施方案中，本文提供的化合物存在于小瓶内。多个小瓶(诸如10个)可存在于例如分配包装中。在一些实施方案中，小瓶被制造以便于注射器出入。试剂盒还可包含用于使用本文提供的化合物的说明书。
在一些实施方案中，试剂盒可用于向受试者施用本文提供的化合物。在此类情况下，除包含至少一种本文提供的化合物以外，试剂盒还可包含以下中的一种或多种：注射器、酒精药签、棉球和/或网垫。在一些实施方案中，与微小RNA互补的化合物可存在于预填充注射器(诸如具有例如具有针套的27号1/2英寸针的单次剂量注射器)而非小瓶中。多个预填充注射器(诸如10个)可存在于例如分配包装中。所述试剂盒还可包含用于施用本文提供的化合物的说明书。
某些实验模型
在某些实施方案中，本发明提供在实验模型中使用和/或测试本文提供的化合物的方法。本领域技术人员能够选择和修改此类实验模型的方案以评估本文提供的化合物。
施用抗miR化合物后微小RNA的反义抑制作用可通过本领域已知的多种方法评估。在某些实施方案中，这些方法用于在体外或体内定量细胞或组织中的微小RNA水平。在某些实施方案中，微小RNA水平的变化通过微阵列分析来测量。在某些实施方案中，微小RNA水平的变化通过若干可商购获得的PCR测定中的一种来测量，诸如
MicroRNA Assay(Applied Biosystems，Life Technologies品牌)。
可使用荧光素酶细胞培养测定评估抗miR化合物的体外活性。在此测定中，对微小RNA荧光素酶感测器构建体进行工程改造以包含与荧光素酶基因融合的目标微小RNA的一个或多个结合位点。当微小RNA结合其在荧光素酶感测器构建体中的同源位点时，荧光素酶表达受到抑制。当将适当的抗miR引入细胞中时，其结合靶微小RNA并且减轻对荧光素酶表达的抑制。因此，在此测定中，作为目标微小RNA的有效抑制剂的抗miR将使荧光素酶表达增加。
可通过测量微小RNA的靶标的mRNA和/或蛋白质水平来评估抗miR化合物的活性。微小RNA结合一个或多个靶RNA内的互补位点，从而导致靶RNA受到抑制，因此微小RNA的抑制导致微小RNA的靶标的mRNA和/或蛋白质水平的增加(即，去抑制)。可在体内或体外测量一种或多种靶RNA的去抑制。例如，miR-122的靶标为醛缩酶A(ALDOA)。miR-122的抑制导致ALDOA mRNA水平的增加，因此ALDOA mRNA水平可用于评估抗miR-122化合物的抑制活性。
实施例
提供以下实施例以便更充分地说明本发明的一些实施方案。然而，其决不应被解释为限制本发明的宽广范围。本领域技术人员将容易地采用本发明的基本原理来设计各种化合物而不背离本发明的精神。
实施例1：
经口施用寡核苷酸具有相对于皮下施用而言可能有利的若干特征，例如，改善的患者顺应性、改善的给药方便性和不存在皮下注射部位反应。迄今为止，抗miR化合物的经口施用尚未得到充分表征。因此，在实验动物模型中评估抗miR化合物的经口施用。
表1示出与微小RNA互补的未缀合的修饰寡核苷酸的序列和糖部分。RG5116与let-7的核苷酸1-19 100％互补。RG5365与let-7的核苷酸1-9 100％互补。RG7443与miR-122的核苷酸2-10 100％互补。之后接有下标“D”的核苷为β-脱氧核糖核苷酸，之后接有下标“M”的核苷为2'-O-甲基核苷，之后接有下标“E”的核苷为2'-O-甲氧基乙基核苷，之后接有下标“F”的核苷为2'-氟核苷，并且之后接有下标“K”的核苷为S-cEt核苷。除非另有说明，否则所有核苷间键均为硫代磷酸酯键，并且所有胞嘧啶均为非甲基化胞嘧啶。
表1：未缀合的修饰寡核苷酸
表2示出包含修饰寡核苷酸和缀合物部分的化合物的结构。
表2：缀合的修饰寡核苷酸
结构C：
结构J：
抗let-7化合物的药效学活性
使用多基因PD特征(multi-gene PD signature)评估抗let-7化合物的药效学(PD)活性。在用抗miR治疗后，通过RT-PCR测量14至18种经过验证的let-7靶基因的表达变化。对所选let-7靶基因的倍数变化的log2取平均值，并且将所述平均值视为let-7 PD特征评分(let-7 PD sig)，其用作药效学活性的指标。
各自具有5只小鼠的组用抗let-7化合物治疗。剂量和施用途径示于表3中，其中“s.c.”指示皮下施用，并且“p.o.”指示经口施用。以PBS递送抗miR化合物用于皮下施用。以PBS溶液制备经口施用的抗miR化合物，并且添加0.3M碳酸氢钠(BC)至pH为9.5。对于经口给药，动物先禁食12小时。在所有治疗组中，向小鼠施用单次剂量并且在四天后处死。收集肝脏、肾脏和结肠组织用于药效学和药代动力学分析。从各组织中分离RNA，并且确定各组的平均let-7 PD特征评分。
表3：抗miR治疗后的let-7 PD Sig评分
如表3所示，在肾脏中，经口施用的100mg/kg 9聚体的PD活性与皮下施用的30mg/kg 9聚体的PD活性相当。在肝脏中，虽然皮下施用后9聚体的PD活性更高，但当经口施用时，9聚体确实表现出PD作用。值得注意的是，在经口施用后，对于较短的9聚体化合物，而非19聚体或胆固醇缀合的19聚体，观察到稳健的PD作用。
抗let-7化合物的药效学活性-剂量反应
为了进一步评估经口施用的抗miR的PD活性，使用在3至100mg/kg范围内的RG5365剂量进行另外的实验。
如表4所示，各自具有5只小鼠的组用抗let-7化合物治疗，其中“s.c.”指示皮下施用，并且“p.o.”指示经口施用。以PBS递送抗miR化合物用于皮下施用。以PBS溶液制备经口施用的抗miR化合物，并且添加0.3M碳酸氢钠(BC)至pH为9.5。对于经口给药，动物先禁食12小时。对于所有治疗组，向小鼠施用单次剂量并且在四天后处死。收集肝脏、肾脏和结肠组织用于药效学和药代动力学分析。从各组织中分离RNA，并且确定各组的平均let-7PD特征评分。
表4：抗miR治疗后的let-7 PD Sig评分
在此实验中还评估了治疗后肝脏和肾脏中存在的抗miR的量。
通过在裂解缓冲液中使用蛋白质消化来提取化合物，然后将抗miR化合物与和化合物具有序列互补性的荧光探针杂交来测量抗miR化合物的组织浓度。杂交后，使用与荧光偶合的高效液相层析(HPLC-FL)评估化合物的同一性和浓度。
表5：组织中的抗miR浓度
在此实验中，在经口施用后，9聚体在肾脏中表现出统计学上显著的剂量依赖性PD作用。虽然在肝脏中使用最高剂量的9聚体观察到统计学上显著的PD作用，但是在三个最低剂量下未观察到PD作用。与先前实验一样，在经口施用后，使用9聚体，而非19聚体，观察到肝脏和肾脏中的PD作用。有趣的是，虽然经口施用9聚体后在肾脏中检测到的抗miR的量低于皮下施用后检测到的量，但PD作用是显著的。此观察结果表明，在经口施用后，在肾脏暴露于相对少量的抗miR化合物的情况下可以实现稳健的PD作用。
抗miR-122化合物的药效学活性
进行实验以评估靶向另外的微小RNA miR-122的抗miR的PD作用。包括靶向let-7的RG5365以用于与本文所述的其他实验进行比较。
如表6中所示，各自具有5只小鼠的组用抗let-7化合物和抗miR-122化合物治疗，其中“s.c.”指示皮下施用，并且“p.o.”指示经口施用。以PBS递送抗miR化合物用于皮下施用。以PBS溶液制备经口施用的抗miR化合物，并且添加0.3M碳酸氢钠(BC)至pH为9.5。对于经口给药，动物先禁食12小时。对于所有治疗组，向小鼠施用单次剂量并且在四天后处死。收集肝脏和肾脏组织用于药效学和药代动力学分析。从肝脏和肾脏中分离RNA。
对于抗let-7化合物，产生肝脏和肾脏组织的let-7 PD特征评分。对于抗miR-122化合物，通过RT-PCR测量肝脏和肾脏中的ALDOA去抑制。
表6：抗miR治疗后的PD作用
表7：肾脏和肝脏组织中的抗miR量
对于肝脏中的RG6650(*)，除一只动物外，所有动物中的结果均是不可量化的，因此未报告平均ug/g。
在此实验中，经口施用后，靶向let-7的9聚体在肾脏和肝脏中表现出统计学上显著的PD作用。未观察到用抗miR-122化合物治疗后的PD作用，然而，通过miR-122抑制实现的对ALDOA的去抑制可能不是肾脏中PD活性的最佳指标。值得注意的是，虽然经口施用未缀合的抗miR-122化合物RG7443在肝脏中不产生显著PD作用，但经口施用GalNAc缀合化合物RG6650产生与皮下施用后所观察到的相当的PD作用。
抗let-7和抗miR-17化合物的药效学活性
进行实验以评估靶向另外的微小RNA miR-17的抗miR的PD作用。包括靶向let-7的RG5365以用于与本文所述的其他实验进行比较。
如表5中所示，各自具有5只小鼠的组用单次剂量的抗miR化合物治疗。动物在经口施用前禁食12小时。给药后4天处死动物。收集肾脏组织用于药效学和药代动力学分析。
通过使用微小RNA多核糖体移位测定(microRNA polysome shift assay，miPSA)来确定化合物的PD作用，所述测定提供互补抗miR对微小RNA靶标的接合的直接测量(Androsavich等人,Nucleic Acids Research,2015,44:e13)。此测定用于确定抗miR化合物在正常小鼠和PKD小鼠的肾脏中直接接合其微小RNA靶标的程度。miPSA依赖于活性miRNA在转译活性高分子量(HMW)多核糖体中结合其mRNA靶标而受抑制的miRNA驻留于低MW(LMW)多核糖体中的原理。用抗miR治疗导致微小RNA从HMW多核糖体移位到LMW多核糖体，即将微小RNA从HMW多核糖体位移至LMW多核糖体。由miPSA测定，确定位移的量度或PSA评分。
表8中示出肾脏组织中的平均PSA评分和肾脏组织中存在的抗miR的平均量。
表8：抗miR治疗后的PSA评分
如表8所示，如通过PSA位移评分所测量的，各9聚体抗miR在肾脏中表现出显著的PD作用。有趣的是，虽然经口施用各9聚体后在肾脏中检测到的抗miR的量小于皮下施用后检测到的量，但PD作用是显著的。此观察结果表明，与皮下施用后相比，经口施用后，在肾脏暴露于较低量的抗miR的情况下可以实现显著的PD作用。
总之，尽管检测到相对较低的组织水平，但这些实验证明经口施用的缀合和未缀合的短抗miR化合物在靶组织中具有稳健的PD作用(在肝脏中使用缀合的抗miR并且在肾脏中使用未缀合的抗miR)。
实施例2：另外的抗miR-122化合物
为了进一步评估经口和皮下递送的化合物的相对活性，测试了具有不同长度、缀合物部分和核苷间键的另外的抗miR-122化合物。化合物在表9中示出。与GalNAc部分缀合的化合物具有如实施例1中的结构C所示的结构，其中X2为磷酸二酯键，m为1，Nm为β-D-脱氧核苷(dA)，X1为磷酸二酯键，并且MO为修饰寡核苷酸。与胆固醇部分缀合的化合物具有如实施例1中的结构J所示的结构，其中X2为磷酸二酯键，m为1，Nm为β-D-脱氧核苷(dA)，X1为磷酸二酯键，并且MO为修饰寡核苷酸。
在此组化合物中，包含所测试的最长寡核苷酸的化合物为18聚体RG2459，也称为RG-101。产生RG2459的一系列截短，由此产生化合物RG7441、RG3396、RG7442和RG6650，其分别具有15、14、13和9个连接核苷的修饰寡核苷酸。这四种化合物中的每一种包含通过磷酸二酯连接的β-D-脱氧核糖腺苷与修饰寡核苷酸缀合的GalNAc部分。RG6386类似于RG2459，其在修饰寡核苷酸的5'端具有糖修饰的变化。RG8210包含具有与RG6650相同的化学修饰的修饰寡核苷酸，但是替代地通过磷酸二酯连接的β-D-脱氧核糖腺苷与胆固醇部分缀合。RG7443具有与RG6650和RG8120的修饰寡核苷酸相同的化学修饰模式，但是未缀合的。RG2634和RG3059均包含一致地经过cEt修饰的修饰寡核苷酸，其通过磷酸二酯连接的β-D-脱氧核糖腺苷与GalNAc部分缀合。RG2634的修饰寡核苷酸的核苷间键为硫代磷酸酯，而RG3059的核苷间键为磷酸二酯。RG4474的修饰寡核苷酸的核碱基序列包含与miR-122序列的错配，并且用作错配对照化合物。
之后接有下标“D”的核苷指示β-D-脱氧核糖核苷；之后接有下标“E”的核苷指示2’-MOE核苷；之后接有下标“S”的核苷指示S-cEt核苷。磷酸二酯核苷间键通过上标“O”指示；所有其他核苷间键均为硫代磷酸酯。“Me”指示核苷的碱基上的5-甲基。
在第一个实验中测试化合物RG2459、RG6650、RG6386、RG7441、RG2634和RG7442。在第二个实验中测试化合物RG7443、RG6650、RG4474、RG3059、RG3396和RG8120。向各自具有三只小鼠的组经口(p.o.)施用100mg/kg剂量或皮下(s.c.)施用10mg/kg剂量。以PBS递送抗miR化合物用于皮下施用。以PBS溶液制备经口施用的抗miR化合物，并且添加0.3M碳酸氢钠(BC)至pH为9.5。对于经口给药，动物先禁食12小时。对于所有治疗组，向小鼠施用单次剂量并且在两天、四天或七天后处死。收集肝脏组织用于药效学和药代动力学分析。从肝脏中分离RNA，并且通过RT-PCR测量肝脏中的ALDOA去抑制，并且将其相对于管家基因RplpO归一化，所述管家基因RplpO也通过RT-PCR测量。
由于在研究结束第2天、第4天和第7天ALDOA的去抑制大致相似，因此计算了在第2天、第4天和第7天内各次治疗的平均ALDOA去抑制，并且在图1中示出。
当皮下施用时，化合物表现出相似的活性。然而，经口施用后，化合物活性的差异是显而易见的。值得注意的是，在经口施用后，具有较短抗miR长度的化合物表现出更大活性的趋势。例如，相对于PBS治疗，包含18、16和14个连接核苷的抗miR的RG2459、RG6386和RG7441不产生ALDOA的显著去抑制。此外，未缀合的9聚体RG7443和具有磷酸二酯连接的8聚体的缀合化合物RG3059基本上不使ALDOA去抑制。阴性对照RG4474不使ALDOA去抑制。包含12聚体抗miR的RG7442和包含13聚体抗miR的RG3396具有更大活性。分别包含9聚体和8聚体抗miR的GalNAc缀合的化合物RG6650和RG2634表现出ALDOA的去抑制。类似地，包含9聚体抗miR的胆固醇缀合的RG8120表现出ALDOA的去抑制。因此，随着抗miR的长度减少，缀合化合物的活性增加，证明较短长度的缀合化合物在经口施用后具有更大活性。
除本文所述的那些之外，本发明的各种修改也将是本领域技术人员根据以上描述显而易知的。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。本申请中引用的各参考文献(包括但不限于期刊文章、美国和非美国专利、专利申请公布、国际专利申请公布、
登录号等)明确地以引用方式整体并入本文。
序列表
<110> 莱古路斯治疗法股份有限公司(Regulus Therapeutics Inc.)
<120> 用于经口递送寡核苷酸的方法
<130> 01138-0039-00PCT
<150> US 62/701,317
<151> 2018-07-20
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工序列(Artificial sequence)
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cattgucaca ctcc 14
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<223> 合成寡核苷酸
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ttgucacact cc 12
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aacaccttgu cacactcc 18
Claims (45)
1.一种抑制微小RNA的活性的方法，其包括向受试者施用包含与所述微小RNA互补的修饰寡核苷酸的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述修饰寡核苷酸具有6至25个连接核苷酸的长度并且其中所述施用是经口施用。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸与所述微小RNA完全互补。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述微小RNA在肾脏中表达，并且所述化合物由所述修饰寡核苷酸组成。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述微小RNA在肝脏中表达，并且所述化合物包含与缀合物部分连接的所述修饰寡核苷酸。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有8至13个连接核苷的长度，或8至12个连接核苷酸的长度。
6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有8个连接核苷的长度。
7.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有9个连接核苷的长度。
8.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有10个连接核苷的长度。
9.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有11个连接核苷的长度。
10.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有12个连接核苷的长度。
11.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸具有13个连接核苷的长度。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸包含至少一个具有修饰的糖部分的核苷。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸的各核苷包含修饰的糖部分。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中各修饰的糖部分独立地选自2'-O-甲基糖部分、2'-O-甲氧基乙基糖部分、2'-氟糖部分以及双环糖部分。
15.如权利要求14所述的方法，其中各双环糖部分独立地选自cEt糖部分和LNA糖部分。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述cEt核苷是S-cEt核苷。
17.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸包含多个非双环核苷和多个双环核苷。
18.如权利要求17所述的方法，其中各非双环核苷独立地选自2'-O-甲基核苷、2'-O-甲氧基乙基核苷和2'-氟核苷。
19.如权利要求18所述的方法，其中各双环核苷选自cEt核苷和LNA核苷。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述cEt核苷是S-cEt核苷。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键。
22.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述修饰寡核苷酸的各核苷间键是修饰的核苷间键。
23.如权利要求21或22所述的方法，其中所述修饰的核苷间键是硫代磷酸酯键。
24.如权利要求4所述的方法，其中所述缀合物部分包含胆固醇部分或碳水化合物部分。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述碳水化合物部分选自N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺和N-异丁酰基-半乳糖胺。
26.如权利要求4所述的方法，其中所述化合物具有以下结构：
Ln-接头-X1-Nm-X2-MO；
其中各L独立地为配体，并且n为1至10；各N独立地为修饰或未修饰的核苷，并且m为1至5；X1为磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；X2为磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO为所述修饰寡核苷酸。
27.如权利要求26所述的方法，其包括以下结构：
其中：
B选自-O-、-S-、-N(RN)-、-Z-P(Z')(Z”)O-、-Z-P(Z')(Z”)O-Nm-X1-和-Z-P(Z')(Z”)O-Nm-X2-；
MO为所述修饰寡核苷酸；
RN选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基和苄基；
Z、Z'和Z”各自独立地选自O和S；
各N独立地为修饰或未修饰的核苷；
m为1至5；
X1选自磷酸二酯键和硫代磷酸酯键；
X2为磷酸二酯键；并且
波浪线指示与其余接头和配体的连接。
28.如权利要求26或27所述的方法，其中n为1至5、1至4、1至3或1至2。
29.如权利要求26或27所述的方法，其中n为3，并且各配体为N-乙酰半乳糖胺。
30.如权利要求26或27所述的方法，其中n为1并且所述配体为胆固醇。
31.如权利要求26或27所述的方法，其中所述化合物具有以下结构：
其中各N独立地为修饰或未修饰的核苷，并且m为1至5；X1和X2各自独立地为磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO为所述修饰寡核苷酸。
32.如权利要求26或27所述的方法，其中所述化合物具有以下结构：
其中各N独立地为修饰或未修饰的核苷，并且m为1至5；X1和X2各自独立地为磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO为所述修饰寡核苷酸。
33.如权利要求31或32所述的方法，其中X1和X2中的至少一个为磷酸二酯键。
34.如权利要求31或32所述的方法，其中X1和X2中的每一个为磷酸二酯键。
35.如权利要求26至34中任一项所述的方法，其中m为1。
36.如权利要求26至34中任一项所述的方法，其中m为2、3、4或5。
37.如权利要求26至36中任一项所述的方法，其中Nm为N'pN”，其中各N'独立地为未修饰的核苷并且p为0至4；并且N”为包含未修饰的糖部分的核苷。
38.如权利要求37所述的方法，其中p为0。
39.如权利要求37或38所述的方法，其中所述未修饰的糖部分为β-D-核糖或β-D-脱氧核糖。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述β-D-脱氧核糖为β-D-脱氧核糖腺苷。
41.如权利要求1至40中任一项所述的方法，其中所述化合物以药物组合物的形式存在。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述药物组合物包含药学上可接受的稀释剂。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述药学上可接受的稀释剂是水溶液。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述水溶液为盐水溶液。
45.如权利要求43或44所述的方法，其中所述水溶液包含碳酸氢钠。
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