CN114502730A - 经化学修饰的靶向snp的寡核苷酸 - Google Patents

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内尔·阿罗宁
山田研
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Abstract

提供了相对于相应野生型基因的表达增强了对含有单核苷酸多态性(SNP)的基因的表达沉默的新寡核苷酸。提供了使用相对于相应野生型基因的表达增强了对含有SNP的基因的表达沉默的新寡核苷酸的方法。

Description

经化学修饰的靶向SNP的寡核苷酸
相关申请
本申请要求2019年8月9日提交的美国临时专利申请No.62/885,066和2020年2月13日提交的美国临时专利申请No.62/976,168的优先权。这些申请的全部内容通过引用并入本文。
联邦政府资助研究的声明
本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号NS104022和GM108803的政府支持下完成的。政府享有本发明中的某些权利。
背景技术
RNA干扰代表了用于抑制基因功能的简单且有效的工具。RNA沉默剂作为研究工具和治疗剂因其以高的序列特异性程度敲低特定蛋白质的表达的能力而受到了特别的关注。RNA沉默剂的序列特异性对于治疗由在携带特定基因的一个突变体和一个野生型拷贝的杂合子中的显性突变引起的疾病特别有用。然而，仍然需要可优先使突变的、引起疾病的等位基因表达沉默而不(或仅最小地)影响野生型等位基因的表达的RNA沉默剂。
发明内容
本公开内容至少部分基于新寡核苷酸的出人意料的发现，相对于杂合子中相应野生型基因的表达，所述新寡核苷酸增强了对含有单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)(例如杂合SNP)基因的表达的沉默，例如高至100倍以上。在某些方面，提供了优先靶向含有SNP的核酸以进行降解的寡核苷酸(例如，dsRNA)，其中所述寡核苷酸(例如，双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA))不靶向或以较小程度靶向相应野生型(非含有SNP)核酸以进行降解。在某些方面，本公开内容的寡核苷酸(例如，dsRNA)：1)与靶核酸中的SNP位互补；并且2)在靶核酸相对于SNP的特定位置处含有错配。在某些实施方案中，寡核苷酸(例如，dsRNA)相对于相应野生型靶核酸序列含有两个错配：1)在野生型SNP位处；和2)在靶核酸序列相对于野生型SNP位的特定位置处。因此，示例性寡核苷酸(例如，dsRNA)含有相对于含SNP靶标的一个错配和相对于相应野生型序列的两个错配，因此导致相对于相应野生型序列优先切割含SNP靶标。
在一个方面，提供了核酸，其具有5’端、3’端和与基因的包含等位基因多态性的区域互补的种子区域，其中所述核酸包含：在种子区域内的位置处的单核苷酸多态性(SNP)位核苷酸，其中所述SNP位核苷酸(SNP position nucleotide)与等位基因多态性互补；与基因中的核苷酸错配的错配(mismatch，MM)位核苷酸；以及在SNP位核苷酸任一侧的至少一个经修饰核苷酸(X)，其中每个X位于距SNP位核苷酸四个、三个或两个核苷酸内。在一些实施方案中，每个X位于距SNP位核苷酸四个核苷酸内。在一些实施方案中，每个X位于距SNP位核苷酸三个核苷酸内。在一些实施方案中，每个X位于距SNP位核苷酸两个核苷酸内。
在某些示例性实施方案中，每个X独立地包含选自以下的糖修饰：2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-氟(2’-F)、2’-核糖、2’-脱氧核糖、2’-F-4’-硫代阿拉伯糖(2’-F-4’-thioarabino，2’F-ANA)、2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-MOE)、4’-S-RNA、锁核酸(lockednucleic acid，LNA)、4’-S-F-ANA、2’-O-烯丙基、2’-O-乙胺、2’-O-氰基乙基-RNA(CNet-RNA)、三环-DNA、环己烯基核酸(cyclohexenyl nucleic acid，CeNA)、阿拉伯核酸(arabinonucleic acid，ANA)和己糖醇核酸(hexitol nucleic acid，HNA)。
在某些示例性实施方案中，X处于紧邻SNP位核苷酸的5’的位置或紧邻SNP位核苷酸的3’的位置。在某些示例性实施方案中，X处于紧邻SNP位核苷酸的5’的位置和紧邻SNP位核苷酸的3’的位置。
在某些示例性实施方案中，SNP位核苷酸存在于从5’端起的第2位至第6位(例如，在从5’端起的第2位、在从5’端起的第3位、在从5’端起的第4位、在从5’端起的第5位或在从5’端起的第6位)。在某些示例性实施方案中，SNP位核苷酸存在于从5’端起的第3位至第6位(例如，在从5’端起的第3位、在从5’端起的第4位、在从5’端起的第5位或在从5’端起的第6位)。在一些实施方案中，SNP位核苷酸存在于从5’端起的第4位至第6位(例如，在从5’端起的第4位、在从5’端起的第5位或在从5’端起的第6位)。在一些实施方案中，SNP位核苷酸存在于从5’端起的第2位至第5位(例如，在从5’端起的第2位、在从5’端起的第3位、在从5’端起的第4位或在从5’端起的第5位)。在一些实施方案中，SNP位核苷酸存在于从5’端起的第3位至第5位(例如，在从5’端起的第3位、在从5’端起的第4位或在从5’端起的第5位)。在一些实施方案中，SNP位核苷酸存在于从5’端起的第2位至第4位(例如，在从5’端起的第2位、在从5’端起的第3位或在从5’端起的第4位)。
在一些实施方案中，MM位核苷酸位于距SNP位核苷酸2至11个核苷酸处。例如，在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸2个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸3个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸4个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸5个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸6个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸7个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸8个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸9个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸10个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸11个核苷酸处。
在一些实施方案中，MM位核苷酸位于距SNP位核苷酸2至6个核苷酸处。例如，在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸2个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸3个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸4个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸5个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸6个核苷酸处。
在另一个方面，提供了核酸，其具有5’端、3’端和与基因的包含等位基因多态性的区域互补的种子区域，其中所述核酸包含：在种子区域内的位置处的SNP位核苷酸，其中所述SNP位核苷酸与等位基因多态性互补；与基因中的核苷酸错配的MM位；以及在MM位核苷酸任一侧的至少一个经修饰核苷酸(Y)，其中每个Y位于距MM位核苷酸四个、三个或两个核苷酸内。在一些实施方案中，每个Y位于距MM位核苷酸四个核苷酸内。在一些实施方案中，每个Y位于距MM位核苷酸三个核苷酸内。在一些实施方案中，每个Y位于距MM位核苷酸两个核苷酸内。
在一些实施方案中，每个Y独立地包含选自以下的糖修饰：2’-OMe、2’-F、2’-核糖、2’-脱氧核糖、2’-F-ANA、2’-MOE、4’-S-RNA、LNA、4’-S-F-ANA、2’-O-烯丙基、2’-O-乙胺、CNet-RNA、三环-DNA、CeNA、ANA和HNA。
在一些实施方案中，Y处于紧邻MM位核苷酸的5’的位置或紧邻MM位核苷酸的3’的位置。在某些示例性实施方案中，Y处于紧邻MM位核苷酸的5’的位置和紧邻MM位核苷酸的3’的位置。
在某些示例性实施方案中，SNP位核苷酸存在于从5’端起的第2位至第6位(例如，在从5’端起的第2位、在从5’端起的第3位、在从5’端起的第4位、在从5’端起的第5位或在从5’端起的第6位)。在一些实施方案中，SNP位核苷酸存在于从5’端起的第3位至第6位(例如，在从5’端起的第3位、在从5’端起的第4位、在从5’端起的第5位或在从5’端起的第6位)。在一些实施方案中，SNP位核苷酸存在于从5’端起的第4位至第6位(例如，在从5’端起的第4位、在从5’端起的第5位或在从5’端起的第6位)。在一些实施方案中，SNP位核苷酸存在于从5’端起的第2位至第5位(例如，在从5’端起的第2位、在从5’端起的第3位、在从5’端起的第4位或在从5’端起的第5位)。在一些实施方案中，SNP位核苷酸存在于从5’端起的第3位至第5位(例如，在从5’端起的第3位、在从5’端起的第4位或在从5’端起的第5位)。在一些实施方案中，SNP位核苷酸存在于从5’端起的第2位至第4位(例如，在从5’端起的第2位、在从5’端起的第3位或在从5’端起的第4位)。
在一些实施方案中，MM位核苷酸位于距SNP位核苷酸2至11个核苷酸处。例如，在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸2个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸3个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸4个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸5个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸6个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸7个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸8个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸9个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸10个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸11个核苷酸处。
在一些实施方案中，MM位核苷酸位于距SNP位核苷酸2至6个核苷酸处。例如，在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸2个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸3个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸4个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸5个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸6个核苷酸处。
在另一个方面，提供了核酸，其具有5’端、3’端和与基因的包含等位基因多态性的区域互补的种子区域，其中所述核酸包含：在种子区域内的位置处的SNP位核苷酸，其中所述SNP位核苷酸与等位基因多态性互补；与基因中的核苷酸错配的MM位；和在SNP位核苷酸任一侧的至少一个经修饰核苷酸(X)，其中每个X位于距SNP位核苷酸四个、三个或两个核苷酸内；以及在MM位核苷酸任一侧的至少一个经修饰核苷酸(Y)，其中每个Y位于距MM位核苷酸四个、三个或两个核苷酸内。在一些实施方案中，每个X位于距SNP位核苷酸四个核苷酸内。在一些实施方案中，每个X位于距SNP位核苷酸三个核苷酸内。在一些实施方案中，每个X位于距SNP位核苷酸两个核苷酸内。在一些实施方案中，每个Y位于距MM位核苷酸四个核苷酸内。在一些实施方案中，每个Y位于距MM位核苷酸三个核苷酸内。在一些实施方案中，每个Y位于距MM位核苷酸两个核苷酸内。
在一些实施方案中，每个X独立地包含选自以下的糖修饰：2’-OMe、2’-F、2’-核糖、2’-脱氧核糖、2’-F-ANA、2’-MOE、4’-S-RNA、LNA、4’-S-F-ANA、2’-O-烯丙基、2’-O-乙胺、CNet-RNA、三环-DNA、CeNA、ANA和HNA。在一些实施方案中，每个Y独立地包含选自以下的糖修饰：2’-OMe、2’-F、2’-核糖、2’-脱氧核糖、2’-F-ANA、2’-MOE、4’-S-RNA、LNA、4’-S-F-ANA、2’-O-烯丙基、2’-O-乙胺、CNet-RNA、三环-DNA、CeNA、ANA和HNA。
在某些示例性实施方案中，X处于紧邻SNP位核苷酸的5’的位置或紧邻SNP位核苷酸的3’的位置。在某些示例性实施方案中，X处于紧邻SNP位核苷酸的5’的位置和紧邻SNP位核苷酸的3’的位置。
在某些示例性实施方案中，Y处于紧邻MM位核苷酸的5’的位置或紧邻MM位核苷酸的3’的位置。在某些示例性实施方案中，Y处于紧邻MM位核苷酸的5’的位置和紧邻MM位核苷酸的3’的位置。
在某些示例性实施方案中，SNP位核苷酸存在于从5’端起的第2位至第6位(例如，在从5’端起的第2位、在从5’端起的第3位、在从5’端起的第4位、在从5’端起的第5位或在从5’端起的第6位)。在一些实施方案中，SNP位核苷酸存在于从5’端起的第3位至第6位(例如，在从5’端起的第3位、在从5’端起的第4位、在从5’端起的第5位或在从5’端起的第6位)。在一些实施方案中，SNP位核苷酸存在于从5’端起的第4位至第6位(例如，在从5’端起的第4位、在从5’端起的第5位或在从5’端起的第6位)。在一些实施方案中，SNP位核苷酸存在于从5’端起的第2位至第5位(例如，在从5’端起的第2位、在从5’端起的第3位、在从5’端起的第4位或在从5’端起的第5位)。在一些实施方案中，SNP位核苷酸存在于从5’端起的第3位至第5位(例如，在从5’端起的第3位、在从5’端起的第4位或在从5’端起的第5位)。在一些实施方案中，SNP位核苷酸存在于从5’端起的第2位至第4位(例如，在从5’端起的第2位、在从5’端起的第3位或在从5’端起的第4位)。
在一些实施方案中，MM位核苷酸位于距SNP位核苷酸2至11个核苷酸处。例如，在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸2个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸3个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸4个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸5个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸6个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸7个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸8个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸9个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸10个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸11个核苷酸处。
一些实施方案，MM位核苷酸位于距SNP位核苷酸2至6个核苷酸处。例如，在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸2个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸3个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸4个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸5个核苷酸处。在一些实施方案中，MM位位于距SNP位核苷酸6个核苷酸处。
在一些实施例中，X和Y是相同的。
在另一个方面，提供了核酸，其具有与基因的包含等位基因多态性的区域互补的5’端和3’端，其中所述核酸包含：与等位基因多态性互补的SNP位核苷酸；与基因中的核苷酸错配的MM位核苷酸；在SNP位核苷酸任一侧的至少一个2’-氟-核糖核苷酸，其中每个2’-氟-核糖核苷酸位于距SNP位核苷酸四个、三个或两个核苷酸内；以及在MM位核苷酸任一侧的至少一个2’-甲氧基-核糖核苷酸，其中每个2’-甲氧基-核糖核苷酸位于距MM位核苷酸四个、三个或两个核苷酸内。
在某些示例性实施方案中，2’-氟-核糖核苷酸处于紧邻SNP位核苷酸的5’的位置或者2’-氟-核糖核苷酸处于紧邻SNP位核苷酸的3’的位置。
在某些示例性实施方案中，2’-氟-核糖核苷酸处于紧邻SNP位核苷酸的5’的位置并且2’-氟-核糖核苷酸处于紧邻SNP位核苷酸的3’的位置。
在某些示例性实施方案中，2’-甲氧基-核糖核苷酸处于紧邻MM位核苷酸的5’的位置或者2’-甲氧基-核糖核苷酸处于紧邻MM位核苷酸的3’的位置。在某些示例性实施方案中，2’-甲氧基-核糖核苷酸处于紧邻MM位核苷酸的5’的位置并且2’-甲氧基-核糖核苷酸处于紧邻MM位核苷酸的3’的位置。
在某些示例性实施方案中，SNP位核苷酸存在于种子区域中，并且MM位核苷酸位于距SNP位核苷酸2至11个核苷酸处(例如，距SNP位核苷酸2个核苷酸处、距SNP位核苷酸3个核苷酸处、距SNP位核苷酸4个核苷酸处、距SNP位核苷酸5个核苷酸处、距SNP位核苷酸6个核苷酸处、距SNP位核苷酸7个核苷酸处、距SNP位核苷酸8个核苷酸处、距SNP位核苷酸9个核苷酸处、距SNP位核苷酸10个核苷酸处或距SNP位核苷酸11个核苷酸处)。
在某些示例性实施方案中，SNP位核苷酸存在于从5’端起的第2位至第6位，并且MM位核苷酸位于距SNP位核苷酸2至6个核苷酸处。
在某些示例性实施方案中，核酸包含三个、四个、五个或六个2’-氟-核糖核苷酸。在某些示例性实施方案中，核酸包含三个、四个、五个或六个2’-甲氧基-核糖核苷酸。
在另一个方面，提供了核酸，其具有与基因的包含等位基因多态性的区域互补的5’端和3’端，其中所述核酸包含：与等位基因多态性互补的SNP位核苷酸；与基因中的核苷酸错配的MM位核苷酸；位于距SNP位核苷酸四个、三个或两个核苷酸内的至少三个2’-氟-核糖核苷酸；以及位于距MM位核苷酸四个、三个或两个核苷酸内的至少三个2’-甲氧基-核糖核苷酸。
在某些示例性实施方案中，2’-氟-核糖核苷酸处于紧邻SNP位核苷酸的5’的位置或者2’-氟-核糖核苷酸处于紧邻SNP位核苷酸的3’的位置。在某些示例性实施方案中，2’-氟-核糖核苷酸处于紧邻SNP位核苷酸的5’的位置以及2’-氟-核糖核苷酸处于紧邻SNP位核苷酸的3’的位置。
在某些示例性实施方案中，2’-甲氧基-核糖核苷酸处于紧邻MM位核苷酸的5’的位置或者2’-甲氧基-核糖核苷酸处于紧邻MM位核苷酸的3’的位置。
在某些示例性实施方案中，2’-甲氧基-核糖核苷酸处于紧邻MM位核苷酸的5’的位置并且2’-甲氧基-核糖核苷酸处于紧邻MM位核苷酸的3’的位置。
在某些示例性实施方案中，SNP位核苷酸存在于种子区域中，并且MM位核苷酸位于距SNP位核苷酸2至11个核苷酸处。
在某些示例性实施方案中，SNP位核苷酸存在于从5’端起的第2位至第6位，并且其中MM位核苷酸位于距SNP位核苷酸2至6个核苷酸处。
在另一个方面，提供了siRNA分子，其包含与靶基因具有互补性的有义链和与该有义链具有互补性的反义链，其中所述反义链包含前述方面或实施方案中任一个的核酸。
在一些实施方案中，有义链的长度为13个核苷酸或核苷酸类似物至17个核苷酸或核苷酸类似物(例如，长度为13、14、15、16或17个核苷酸或核苷酸类似物)。
在一些实施方案中，反义链的长度为18个核苷酸或核苷酸类似物至22个核苷酸或核苷酸类似物(例如，长度为18、19、20、21或22个核苷酸或核苷酸类似物)。
在一些实施方案中，有义链的长度为15个核苷酸或核苷酸类似物，并且反义链的长度为20个核苷酸或核苷酸类似物。
在一些实施方案中，有义链的长度为16个核苷酸或核苷酸类似物，并且反义链的长度为20个核苷酸或核苷酸类似物。
在另一个方面，提供了分支寡核苷酸，其包含彼此共价结合的两个或更多个siRNA分子，其中每个siRNA分子独立地为前述方面或实施方案中任一个的siRNA分子。
在一些实施方案中，分支寡核苷酸包含彼此共价结合的两个siRNA分子。
在一些实施方案中，siRNA分子经由接头彼此共价结合。
附图说明
通过以下结合附图对举例说明性实施方案的详细描述，将更全面地理解本发明的前述和其他特征和优势。本专利或申请文件包含至少一个彩色绘制的附图。在请求并且支付必要的费用之后，官方将提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
图1描绘了含有htt的野生型区域或具有SNP rs362273的htt的相同区域的psiCHECK报道质粒。
图2描绘了条形图，其示出了在用在不同位置具有SNP核苷酸的hsiRNA转染的HeLa细胞中的psiCHECK报道质粒测定之后的萤光素酶活性。该初步筛选产生了多个有效的经疏水修饰的siRNA(hsiRNA)序列。
图3描绘了剂量响应曲线，其示出了三种示例性hsiRNA对psiCHECK报道质粒的沉默作用。
图4描绘了剂量响应曲线，其示出了两种hsiRNA对沉默htt mRNA的效力。
图5描绘了条形图，其示出了在用在不同位置具有第二错配的hsiRNA转染的HeLa细胞中的psiCHECK报道质粒测定之后的萤光素酶活性。
图6描绘了剂量响应曲线，其比较了具有(mm2-7)或不具有(mm2-0)另外的错配的SNP2 hsiRNA的沉默效果。
图7描绘了剂量响应曲线，其比较了具有或不具有另外的错配的SNP4 hsiRNA的沉默效果。
图8描绘了剂量响应曲线，其比较了具有或不具有另外的错配的SNP6 hsiRNA的沉默效果。
图9描绘了剂量响应曲线，其比较了具有另外的错配的SNP4 hsiRNA或SNP6hsiRNA(分别为SNP4-7和SNP6-11)与不具有另外的错配的相同hsiRNA(SNP4-0和SNP4-11)相比的沉默效果。将用两种报道质粒之一转染的HeLa细胞通过被动摄取用hsiRNA反向转染，并处理72小时。用双萤光素酶测定来测量报道基因表达。
图10描绘了htt mRNA表达的剂量响应曲线，其测量了具有另外的错配的hsiRNA的沉默效力。
图11示意性地描绘了根据一些实施方案的hsiRNA和示例性修饰。
图12A至图12C分别描绘了SNP2、SNP4和SNP6 hsiRNA文库。反义链以5’至3’描绘，其中SNP位点为红色，并且错配为蓝色。
图13描绘了根据某些实施方案的多种hsiRNA构建体的反义和有义链序列和修饰模式。mm4-7和mm6-11表现出优异的SNP辨别，并被选择用于进一步筛选。
图14描绘了设计成di-siRNA的示例性SNP选择性化合物。
图15描绘了根据某些示例性实施方案的骨架键联(linkage)。寡核苷酸骨架可包含磷酸酯、硫代磷酸酯(外消旋混合物或立体特异性)、硫代二磷酸酯(diphosphorothioate)、氨基磷酸酯、肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)、硼酸磷酸酯、2’-5’-磷酸二酯、酰胺、膦酰基乙酸酯、吗啉代等的一种或任意组合。
图16描绘了根据某些示例性实施方案的糖修饰。糖修饰包括2’-O-甲基、2’-氟、2’-核糖、2’-脱氧核糖、2’-F-ANA、MOE、4’-S-RNA、LNA、4’-S-F-ANA、2’-O-烯丙基、2’-O-乙胺、CNet-RNA、三环-DNA、CeNA、ANA、HNA等的一种或任意组合。
图17描绘了根据某些示例性实施方案的核苷酸间键。潜在的核苷酸间键可在可用所描绘的任何部分来稳定的任何给定寡核苷酸链的5’或3’端的前两个核苷酸之间。
图18描绘了根据某些示例性实施方案的5’稳定化修饰。合适的5’稳定化修饰可以是磷酸酯、无磷酸酯、乙烯基膦酸酯、C5-甲基(R或S或外消旋)、乙烯基上的C5-甲基、经还原的乙烯基(例如，三碳烷基)等。
图19描绘了根据某些示例性实施方案的缀合物部分。合适的缀合部分可以是任何长度的烷基链、维生素、配体、肽或生物活性缀合物，例如鞘糖脂、多不饱和脂肪酸、开环甾体(secosteroid)、甾体激素、甾体脂质等。
图20以图形方式描绘了包含在从5’端起的第6位的SNP位核苷酸和位于从5’端起的第11位的错配位核苷酸的SNP辨别支架的活性是序列非依赖性的。
图21示出了本文中所述的经乙烯基膦酸酯(vinyl phosphonate，VP)修饰的亚基间键联的代表性合成。
图22描绘了用于制备具有经VP修饰的亚基间键联的寡核苷酸的方法。
图23是根据某些示例性实施方案的经VP修饰的RNA的图示。
图24示出了根据某些示例性实施方案合成的经VP修饰的寡核苷酸的序列。
图25是siRNA效力的比较研究的总结。
图26是与在SNP位点rs362273周围的HTT序列比对的hsiRNA反义支架的示意图，其中绿色框描绘了SNP位点的位置。
图27A和27B示出了在siRNA序列中添加错配的效果提高了等位基因辨别而不损害对突变等位基因的沉默。
图28A和28B描绘了由合成仪制备的经VP修饰的序列。
图29示出了用于制备本文中提供的经VP修饰的寡核苷酸的另一种方法。
图30示出了经VP修饰的键联对SNP选择性siRNA的靶/非靶辨别的效果。
图31示出了示例性的二分支siRNA化学支架。
图32A是为测量HTT蛋白水平进行的western印迹。图32B示出了相对于黏着斑蛋白归一化的蛋白质水平。
图33描绘了剂量响应曲线，其比较了在SNP位点靶向G而不是A的寡核苷酸的沉默效果。
图34示出了在先前为剂量响应而选择的序列中引入单个错配的示例性序列。
图35示出了许多示例性寡核苷酸骨架修饰。
图36示出了根据某些示例性实施方案的寡核苷酸分支基序。双螺旋表示寡核苷酸。不同接头、间隔区和分支点的组合允许生成广泛多样的分支hsiRNA结构。
图37示出了具有缀合生物活性部分的示例性分支寡核苷酸。
图38示出了示例性的亚酰胺接头、间隔区和分支部分。
图39是与在替代SNP位点rs362273周围的HTT序列比对的hsiRNA反义支架的示意图。
图40描绘了条形图，其示出了在用图39的hsiRNA转染的HeLa细胞中的psiCHECK报道质粒测定之后的萤光素酶活性。“SNP”之后的数字表示SNP在siRNA中的位置。
图41描绘了剂量响应曲线，其比较了在SNP3位点靶向C或T的图39的寡核苷酸的沉默效果。
图42描绘了条形图，其示出了在用经修饰以在不同位置的第二错配为特征的图39的hsiRNA转染的HeLa细胞中的psiCHECK报道质粒测定之后的萤光素酶活性。
图43示出了示例性修饰的亚基间接头。
图44A示出了用于制备用于本文中提供的经修饰的含次膦酸酯寡核苷酸的单体的代表性实例。图44B示出了用于制备用于本文中提供的经修饰的含次膦酸酯寡核苷酸的另一种单体的代表性实例。图44C示出了用于制备本文中提供的经修饰的含次膦酸酯寡核苷酸的代表性实例。
图45示出了HTT基因内的示例性SNP(SEQ ID NO：1至10(从上到下编号))。
图46是流程图，其示出了用于产生和选择SNP辨别性siRNA的方法。
图47示出了表示SNP在siRNA内的位置的命名约定。
图48A至图48D以图形方式描绘了通过改变与siRNA的SNP位核苷酸和MM位核苷酸相邻的2’-氟/2’-甲氧基含量介导的靶和非靶结合和切割的效力和辨别。(A)描绘了关于多种SNP6-11变体的结果。(B)描绘了关于6-11与具有经修饰的ffmff模式(在第6位的SNP附近的四个2’-氟-核糖核苷酸和2’-甲氧基-核糖核苷酸)的6-11的结果。(C)描绘了关于6-11与具有经修饰的mmm11模式(在第11位的MM附近的三个2’-甲氧基-核糖核苷酸)的6-11的结果。(D)描绘了关于6-11与具有经修饰的fff6mmm11模式(在第6位的SNP附近的三个2’-氟-核糖核苷酸和在第11位的MM附近的三个2’-甲氧基-核糖核苷酸)的6-11的结果。HeLa细胞用两种报道质粒之一转染，通过被动摄取用siRNA反向转染，并处理72小时。使用双萤光素酶测定来测量报道基因表达。
具体实施方式
本公开内容涉及可用于使位于编码突变体蛋白的基因内的等位基因多态性沉默的组合物，其包含寡核苷酸例如RNA沉默剂(例如RNA，例如双链RNA(“dsRNA”)、反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide，“ASO”)等。在一个具体方面，寡核苷酸例如RNA沉默剂是本文中提供的dsRNA剂，其破坏具有核苷酸特异性和选择性的相应突变mRNA(例如，含SNP的mRNA)。寡核苷酸例如RNA沉默剂，例如本文中公开的dsRNA剂靶向对应于突变基因的多态性区域的mRNA，导致突变mRNA的切割，并阻止相应突变体蛋白例如功能获得性突变体蛋白例如亨廷顿蛋白(huntingtin protein)的合成。
定义
除非本文中另外限定，否则本文中使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。在任何潜在歧义的情况下，本文中提供的定义优先于任何字典或外在限定。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数形式，并且复数术语应包括单数形式。除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。术语“包括”以及其他形式诸如“包含”和“含有”的使用不是限制性的。
如本文在寡核苷酸序列的背景下使用的，“A”表示包含碱基腺嘌呤的核苷(例如，腺苷或其经化学修饰的衍生物)，“G”表示包含碱基鸟嘌呤的核苷(例如，鸟苷或其经化学修饰的衍生物)，“U”表示包含碱基尿嘧啶的核苷(例如，尿苷或其经化学修饰的衍生物)，并且“C”表示包含碱基腺嘌呤的核苷(例如，胞苷或其经化学修饰的衍生物)。
本文中使用的术语“封端基团”是指替代官能团例如醇(ROH)、羧酸(RCO2H)或胺(RNH2)中氢原子的化学部分。封端基团的非限制性实例包括：烷基(例如甲基、叔丁基)；烯基(例如乙烯基、烯丙基)；羧基(例如乙酰基、苯甲酰基)；氨基甲酰基；磷酸酯；和膦酸酯(例如乙烯基膦酸酯)。其他合适的封端基团是本领域技术人员已知的。
术语“核苷酸类似物”或“改变的核苷酸”或“经修饰核苷酸”是指非标准核苷酸，包括非天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。示例性核苷酸类似物在任何位置处被修饰以改变核苷酸的某些化学特性，但仍保留核苷酸类似物执行其预期功能的能力。可衍生的核苷酸位置的实例包括5位，例如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷、5-丙炔尿苷、5-丙烯基尿苷等；6位，例如6-(2-氨基)丙基尿苷；对于腺苷和/或鸟苷的8-位，例如，8-溴鸟苷、8-氯鸟苷、8-氟鸟苷等。核苷酸类似物还包括脱氮核苷酸，例如，7-脱氮-腺苷；O-和N-修饰的(例如，烷基化的，例如，N6-甲基腺苷，或如本领域另外已知的)核苷酸；以及其他杂环修饰的核苷酸类似物，例如在Herdewijn，Antisense Nucleic Acid Drug DeV.，2000Aug.10(4)：297-310中描述的那些。
术语“寡核苷酸”是指短的核苷酸和/或核苷酸类似物聚合物。术语“RNA类似物”是指与相应的未改变的或未经修饰RNA相比具有至少一个改变的或经修饰核苷酸但保留与相应的未改变的或未经修饰RNA相同或相似的性质或功能的多核苷酸(例如，经化学合成的多核苷酸)。如上所述，寡核苷酸可通过键联连接，与具有磷酸二酯键联的RNA分子相比，这导致较低的RNA类似物水解速率。例如，类似物的核苷酸可包含亚甲基二醇、亚乙基二醇、氧基甲基硫代、氧基乙基硫代、氧基羰基氧基、二氨基磷酸酯、氨基磷酸酯和/或硫代磷酸酯键联。在一些具体实施方案中，RNA类似物包括糖和/或骨架修饰的核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。这样的改变或修饰还可包括添加非核苷酸物质，例如添加至RNA的末端或在内部添加(在RNA的一个或更多个核苷酸处)。RNA类似物只需与天然RNA足够相似，即其具有介导RNA干扰的能力。
本文中使用的示例性寡核苷酸包括但不限于siRNA、miRNA、shRNA、CRISPR指导、DNA寡核苷酸、反义寡核苷酸、AAV寡核苷酸、间隔聚体(gapmer)、混合聚体(mixmer)、miRNA抑制剂、SSO、PMO、PNA等。
本文中使用的术语“RNA干扰”(RNA interference，“RNAi”)是指RNA的选择性胞内降解。RNAi在细胞中天然发生以去除外来RNA(例如病毒RNA)。天然RNAi通过从游离dsRNA上切割下来的片段进行，该片段将降解机制引导至其他类似的RNA序列。或者，RNAi可通过人工引起，例如，以使靶基因的表达沉默。
本文中使用的术语“hsiRNA”是指本文中提供的双链RNA的一个实施方案，其中RNA分子是经完全化学修饰的，包括一种或更多种疏水性修饰，如本文中所述的。
具有“与靶mRNA序列充分互补以指导靶特异性RNA干扰(RNAi)”的链的RNAi剂，例如RNA沉默剂意指该链具有足以触发RNAi机制或过程破坏靶mRNA的序列。
本文中使用的术语“分离的RNA”(例如，“分离的siRNA”或“分离的siRNA前体”)是指当通过重组技术产生时基本上不含其他细胞物质或培养基或者当化学合成时基本不含化学前体或其他化学物质的RNA分子。
本文中使用的术语“RNA沉默”是指由RNA分子介导的一组序列特异性调节机制(例如，RNA干扰(RNAi)、转录基因沉默(transcriptional gene silencing，TGS)、转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)、压制(quelling)、共抑制、翻译抑制等)，其导致对相应蛋白质编码基因表达的抑制或“沉默”。已在许多类型的生物体包括植物、动物和真菌中观察到RNA沉默。
术语“辨别性RNA沉默(discriminatory RNA silencing)”是指RNA分子基本上抑制“第一”或“靶”多核苷酸序列的表达同时基本上不抑制“第二”或“非靶”多核苷酸序列的表达的能力，例如，当两个多核苷酸序列都存在于同一细胞中时。在某些实施方案中，靶多核苷酸序列对应于靶基因，而非靶多核苷酸序列对应于非靶基因。在另一些实施方案中，靶多核苷酸序列对应于靶等位基因，而非靶多核苷酸序列对应于非靶等位基因。在某些实施方案中，靶多核苷酸序列是编码靶基因的调节区(例如，启动子或增强子元件)的DNA序列。在另一些实施方案中，靶多核苷酸序列是由靶基因编码的靶mRNA。
“涉及”疾病或病症的基因包括这样的基因：其正常或异常表达或者功能影响或导致疾病或病症或者所述疾病或病症的至少一种症状。
本文中使用的术语“靶基因”(例如杂合多态性例如杂合SNP的突变等位基因)是其表达将被显著抑制或“沉默”的基因。这种沉默可通过RNA沉默来实现，例如，通过切割靶基因的mRNA或靶基因的翻译抑制。术语“非靶基因”(例如，野生型等位基因)是其表达不被显著沉默的基因。在一个实施方案中，靶基因和非靶基因的多核苷酸序列(例如，由靶基因和非靶基因编码的mRNA)的不同之处可在于一个或更多个核苷酸。在另一个实施方案中，靶基因和非靶基因的不同之处可在于一个或更多个多态性(例如，单核苷酸多态性或SNP)。在另一个实施方案中，靶基因和非靶基因可共有小于100％的序列同一性。在另一个实施方案中，非靶基因可以是靶基因的同源物(例如，直系同源物或旁系同源物)。
“靶等位基因”是其表达将被选择性抑制或“沉默”的等位基因(例如，SNP等位基因)。这种沉默可通过RNA沉默来实现，例如，通过siRNA切割靶基因或靶等位基因的mRNA。术语“非靶等位基因”是其表达不被显著沉默的等位基因(例如，相应的野生型等位基因)。在某些实施方案中，靶和非靶等位基因可对应于相同的靶基因。在另一些实施方案中，靶等位基因对应于靶基因或与靶基因相关，并且非靶等位基因对应于非靶基因或与非靶基因相关。在一个实施方案中，靶和非靶等位基因的多核苷酸序列的不同之处可在于一个或更多个核苷酸。在另一个实施方案中，靶和非靶等位基因的不同之处可在于一个或更多个等位基因多态性(例如，一个或更多个SNP)。在另一个实施方案中，靶和非靶等位基因可共有小于100％的序列同一性。
本文中使用的术语“多态性”是指当比较来自不同来源或对象(但来自相同生物体)的相同基因序列时在基因序列中鉴定或检测到的变异(例如，一个或更多个缺失、插入或替换)。例如，当比较来自不同对象的相同基因序列时，可鉴定出多态性。这样的多态性的鉴定在本领域中是常规的，方法类似于用于检测例如乳腺癌点突变的那些。例如，鉴定可例如通过从对象的淋巴细胞提取的DNA，然后使用针对多态性区域的特异性引物扩增所述多态性区域来进行。或者，当比较同一基因的两个等位基因时，可鉴定出多态性。
在一些具体实施方案中，多态性是单核苷酸多态性(SNP)。生物体内同一基因的两个等位基因之间的序列变异在本文中称为“等位基因多态性”。在某些实施方案中，等位基因多态性对应于SNP等位基因。例如，等位基因多态性可包含SNP的两个等位基因之间的单核苷酸变异，在本文中也称为杂合SNP。多态性可在编码区内的核苷酸处，但由于遗传密码的简并性，编码的氨基酸序列没有变化。或者，多态性序列可在特定位置处编码不同的氨基酸，但氨基酸的变化不影响蛋白质功能。多态性区域也可存在于基因的非编码区域中。在一些具体实施方案中，多态性存在于基因的编码区或基因的非翻译区(例如，5’UTR或3’UTR)中。
本文中使用的术语“等位基因频率”是个体群体中单个基因座处等位基因(例如，SNP等位基因)的相对频率的量度(例如，比例或百分比)。例如，在个体群体在其每个体细胞中携带特定染色体基因座(以及占据该基因座的基因)的n个基因座的情况下，那么等位基因的等位基因频率是该等位基因在群体中占据的基因座的分数或百分比。在一些具体实施方案中，等位基因(例如SNP等位基因)的等位基因频率在样本群体中为至少10％(例如，至少15％、20％、25％、30％、35％、40％或更多)。
本文中使用的术语“功能获得性突变”是指基因中的任何突变，其中由所述基因编码的蛋白质(即，突变体蛋白)获得了通常与该蛋白质(即，野生型蛋白质)不相关的功能，引起或促成疾病或病症。功能获得性突变可以是基因中核苷酸的缺失、添加或替换，这导致编码蛋白质的功能发生变化。在一个实施方案中，功能获得性突变改变突变体蛋白的功能或引起与其他蛋白质的相互作用。在另一个实施方案中，功能获得性突变例如通过改变的突变体蛋白与所述正常野生型蛋白质的相互作用而导致正常野生型蛋白质的降低或去除。
本文中使用的术语“功能获得性病症”是指以功能获得性突变为特征的病症。在一个实施方案中，功能获得性病症是由功能获得性突变引起的神经退行性疾病，例如多聚谷氨酰胺病症和/或三核苷酸重复疾病，例如亨廷顿病(Huntington’s disease)。在另一个实施方案中，功能获得性病症由癌基因中的功能获得引起，突变的基因产物是功能获得性突变体，例如由ret癌基因(例如ret-1)中的突变引起的癌症，例如内分泌肿瘤、甲状腺髓样肿瘤、甲状旁腺激素肿瘤、多发性内分泌肿瘤2型等。另外的示例性功能获得性病症包括但不限于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateralsclerosis，ALS)、人免疫缺陷病症(HIV)和慢通道先天性肌无力综合征(slow channelcongenital myasthenic syndrome，SCCMS)。
本文中使用的术语“三核苷酸重复疾病”是指以位于基因内的扩展的三核苷酸重复区为特征的任何疾病或病症，该扩展的三核苷酸重复区是疾病或病症的起因。三核苷酸重复疾病的实例包括但不限于脊髓小脑共济失调12型、脊髓小脑共济失调8型、脆性X综合征、脆性XE精神发育迟缓、弗里德赖希共济失调(Friedreich’s ataxia)和强直性肌营养不良。用于根据本公开内容进行治疗的示例性三核苷酸重复疾病是以在基因的编码区5’端的扩展的三核苷酸重复区为特征或由其引起的那些，该基因编码突变体蛋白，其引起疾病或病症或者是疾病或病症的起因。某些三核苷酸疾病例如其中突变与编码区不相关的脆性X综合征可能不适合用于根据本公开内容的方法进行治疗，因为没有合适的mRNA被RNAi靶向。相比之下，例如弗里德赖希共济失调的疾病可适合用于根据本公开内容的方法进行治疗，因为尽管致病突变不在编码区内(即，位于内含子内)，但突变可在例如mRNA前体(例如，预剪接的mRNA前体)内。
本文中使用的术语“多聚谷氨酰胺病症”是指特征在于在编码区5’端的(CAG)n重复的扩增(因此在所编码的蛋白质中编码扩增的多聚谷氨酰胺区域)的任何疾病或病症。在一个实施方案中，多聚谷氨酰胺病症以神经细胞的进行性退化为特征。多聚谷氨酰胺病症的实例包括但不限于亨廷顿病、脊髓小脑共济失调1型、脊髓小脑共济失调2型、脊髓小脑共济失调3型(也称为马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease))和脊髓小脑共济失调6型、脊髓小脑共济失调7型、齿状核红核苍白球丘脑下部萎缩(dentatoiubral-pallidoluysian atrophy)等。
术语“单核苷酸多态性病症”或“SNP病症”是指以存在SNP例如杂合SNP为特征的病症。SNP病症包括但不限于苯丙酮尿症、囊性纤维化、镰状细胞性贫血、白化病、亨廷顿病、强直性肌营养不良1型、高胆固醇血症(常染色体显性，B型)、神经纤维瘤病(1型)、多囊肾病(1和2)、血友病A、迪谢内肌营养不良(Duchenne’s muscular dystrophy)、X连锁低磷酸血症佝偻病(X-linked hypophosphatemic rickets)、雷特综合征(Rett’s syndrome)、非梗阻性生精衰竭(non-obstructive spermatogenic failure)等。示例性杂合SNP病症是亨廷顿病。
在某些方面，提供了双链RNA(dsRNA)，其包含与基因的包含等位基因多态性的区域互补的约15至35个核苷酸的第一链和与第一链的至少一部分互补的约15至35个核苷酸的第二链，其中第一链在从5’端起的第2位至第7位处包含与等位基因多态性互补的单核苷酸多态性(SNP)位核苷酸；并且包含与基因中的核苷酸错配的位于距SNP位核苷酸2至11个核苷酸处的错配(MM)位核苷酸。在一些示例性实施方案中，SNP位核苷酸在从5’端起的第2、4或6位，并且错配(MM)位核苷酸位于距SNP位核苷酸2至6个核苷酸处。
本文中使用的“单核苷酸多态性位核苷酸”或“SNP位核苷酸”是指本文中所述的RNA(例如，dsRNA的第一链)的对应于靶核酸序列的多态性位置(即对应于SNP等位基因的突变核苷酸或对应于野生型等位基因的野生型核苷酸)的位置。例如，可将链标记为“SNP2”、“SNP3”或“SNP4”以表示SNP的位置为距链的5’端2、3或4个核苷酸。
在某些示例性实施方案中，SNP位核苷酸在种子区域内。在某些示例性实施方案中，SNP位核苷酸位于从5’端起的第2位至第7位、从5’端起的第2位至第6位或从5’端起的第2位至第5位。在某些示例性实施方案中，SNP位核苷酸位于从本文中所述的RNA(例如，dsRNA的第一链)的5’端起的第2位、5’端起的第3位、5’端起的第4位、5’端起的第5位、5’端起的第6位或5’端起的第7位。在某些示例性实施方案中，SNP位核苷酸位于表5至7中所示的位置。
本文中使用的术语“种子区域”是指对应于从RNA链的5’端起的第2位至第7位的六核苷酸段(stretch)。认为靶mRNA的siRNA识别是由其反义链的种子区域赋予的。
本文中使用的“错配位核苷酸”或“MM位核苷酸”是指本文中所述的RNA(例如，dsRNA的第一链)的位于不对应于SNP位核苷酸的位置。MM位核苷酸可由其从本文中所述的RNA的5’端或3’端(例如，dsRNA的第一链的5’或3’端)起的位置来限定，或者由其相对于本文中所述的RNA(例如，dsRNA的第一链)的SNP位核苷酸的位置来限定。
在某些示例性实施方案中，MM位核苷酸位于距SNP位核苷酸2至11个核苷酸处、2至10个核苷酸处、2至9个核苷酸处、2至8个核苷酸处、2至7个核苷酸处或2至6个核苷酸处。在某些示例性实施方案中，MM位核苷酸位于距SNP位核苷酸11个核苷酸处、10个核苷酸处、9个核苷酸处、8个核苷酸处、7个核苷酸处、6个核苷酸处、5个核苷酸处、4个核苷酸处、3个核苷酸处或2个核苷酸处。在某些示例性实施方案中，MM位核苷酸位于表5至7中所示的位置。
在一个实施方案中，本文中所述的RNA(例如，dsRNA的第一链)与等位基因多态性同源，除了在相对于对应于等位基因多态性的核苷酸的特定位置处的一个错配寡核苷酸。在某些实施方案中，错配在距SNP位核苷酸约6个核苷酸内、在距SNP位核苷酸约5个核苷酸内、在距SNP位核苷酸约4个核苷酸内、在距SNP位核苷酸约3个核苷酸内、在距SNP位核苷酸约2个核苷酸内或在距SNP位核苷酸约1个核苷酸内。在一些具体实施方案中，错配不与SNP位核苷酸相邻。
在另一个实施方案中，SNP位核苷酸在从5’端起的第2、3、4、5或6位。在一个实施方案中，SNP位核苷酸在从5’端起的第2位。在一个实施方案中，在从5’端起的第3位。在一个实施方案中，SNP位核苷酸在从5’端起的第4位。在一个实施方案中，SNP位核苷酸在从5’端起的第5位。在一个实施方案中，SNP位核苷酸在从5’端起的第6位。
在某些示例性实施方案中，本文中所述的RNA(例如，dsRNA的第一链)在从5’端起的第5、7、8、11、14、15或16位处包含MM位核苷酸。在某些示例性实施方案中，本文中所述的RNA(例如，dsRNA的第一链)包含距SNP位核苷酸1、2、3、4、5、8、9、10或11个核苷酸的MM位核苷酸。
在某些示例性实施方案中，本文中所述的RNA(例如，dsRNA的第一链)包含选自以下的SNP位核苷酸(以从5’端起为参考)-MM位核苷酸(以从5’端起为参考)组合：2-7、4-7、4-8、4-15、6-5、6-8、6-11、6-14、6-16、3-5、3-7和3-8。
在一个特别示例性的实施方案中，本文中所述的RNA(例如，dsRNA的第一链)包含在从5’端起的第6位的SNP位核苷酸和在从5’端起的第11位的MM位核苷酸。在另一个特别示例性的实施方案中，本文中所述的RNA(例如，dsRNA的第一链)包含在从5’端起的第4位的SNP位核苷酸和在从5’端起的第7位的错配。
在一个方面，本文中提供的双链RNA选择性地使具有等位基因多态性的突变等位基因沉默。在一个实施方案中，本文中提供的双链RNA使具有等位基因多态性的突变等位基因沉默并且不影响同一基因的野生型等位基因。在另一个实施方案中，本文中提供的双链RNA使具有等位基因多态性的突变等位基因沉默并且对同一基因的野生型等位基因的沉默程度低于突变等位基因。
因此，在一个方面，本公开内容提供了通过以下来对患有以与等位基因多态性相关的突变体蛋白为特征或由其引起的疾病或者处于患有该疾病的风险之中的对象进行治疗的方法：向该对象施用有效量的靶向编码突变体蛋白(例如亨廷顿蛋白)的基因内的等位基因多态性的RNAi剂，使得基因的序列特异性干扰发生，从而导致疾病的有效治疗。
在一个方面，与相应野生型等位基因相比，本文中公开的RNA沉默剂更有效地优先使包含多态性的突变等位基因沉默。在某些示例性实施方案中，本文中公开的dsRNA对包含多态性的等位基因的沉默比相应野生型等位基因多约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。在一个实施方案中，本文中公开的RNA沉默剂对包含多态性的等位基因的沉默比相应野生型等位基因多至少约50％。在某些示例性实施方案中，本文中公开的dsRNA对包含多态性的等位基因的沉默是使相应野生型等位基因沉默的水平的至少约5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍、约50倍、约55倍、约60倍、约65倍、约70倍、约75倍、约80倍、约85倍、约90倍、约95倍、约100倍、约110倍、约120倍、约130倍、约140倍、约150倍、约160倍、约170倍、约180倍、约190倍、约200倍、约250倍、约300倍、约350倍、约400倍、约450倍、或多至约500倍。
本文中使用的术语RNA沉默剂(例如siRNA或RNA沉默剂)的“反义链”是指与靶向用于沉默的基因的mRNA的约10至50个核苷酸，例如约15至30、16至25、18至23或19至22个核苷酸的部分基本上互补的链。反义链或第一链具有与期望靶mRNA序列充分互补以指导靶特异性沉默的序列，例如足以触发通过RNAi机制或过程(RNAi干扰)破坏期望靶mRNA的互补性或足以触发对期望靶mRNA的翻译抑制。
术语RNA沉默剂(例如siRNA或RNA沉默剂)的“有义链”或“第二链”是指与反义链或第一链互补的链。反义和有义链也可称为第一或第二链，第一或第二链与靶序列具有互补性，并且相应的第二或第一链与所述第一或第二链具有互补性。miRNA双链体中间体或siRNA样双链体包含与靶向用于沉默的基因的mRNA的约10至50个核苷酸的部分具有充分互补性的miRNA链和具有充分互补性以与miRNA链形成双链体的miRNA*链。
本文中使用的术语“反义寡核苷酸”或“ASO”是指这样的核酸(例如RNA)：其与靶RNA(例如含SNP的mRNA或含SNP的前mRNA)具有充分序列互补性以便以有效方式(例如，以有效抑制靶mRNA翻译和/或靶前mRNA剪接的方式)阻断靶RNA的区域。具有“与靶RNA充分互补的序列”的反义寡核苷酸意指反义物质具有足以掩蔽蛋白质的结合位点(否则该蛋白质将调节剪接)的序列，和/或反义物质具有足以掩蔽核糖体的结合位点的序列，和/或反义物质具有足以改变靶RNA的三维结构以防止剪接和/或翻译的序列。
本文中使用的“5’端”，如在反义链的5’端中，是指例如在反义链的5’末端的1至约5个核苷酸的5’末端核苷酸。本文中使用的“3’端”，如在有义链的3’端中，是指与互补反义链的5’端的核苷酸互补的区域，例如1至约5个核苷酸的区域。
本文中使用的术语“碱基对”是指寡核苷酸双链体(例如，由RNA沉默剂的链和靶mRNA序列形成的双链体)的相对链上的核苷酸(或核苷酸类似物)对之间的相互作用，主要是由于所述核苷酸(或核苷酸类似物)之间的氢键、范德华相互作用等。本文中使用的术语“键强度”或“碱基对强度”是指碱基对的强度。
本文中使用的术语“错配碱基对”是指由非互补或非Watson-Crick碱基对组成的碱基对，例如非正常互补的G:C、A:T或A:U碱基对。本文中使用的术语“多义碱基对”(也称为非辨别性碱基对)是指由通用核苷酸形成的碱基对。
可用于本公开内容的缀合化合物的接头包括二醇链(例如，聚乙二醇)、烷基链、肽、RNA、DNA及其组合。本文中使用的缩写“TEG”是指三乙二醇。
寡核苷酸的设计
在某些实施方案中，本公开内容的寡核苷酸(例如siRNA)是包含有义链和互补反义链的双链体，该反义链与含有等位基因多态性的靶mRNA具有充分互补性以介导RNAi。在一些示例性实施方案中，siRNA分子的长度为约10至50个或更多个核苷酸，即每条链包含10至50个核苷酸(或核苷酸类似物)。在一些特别示例性的实施方案中，siRNA分子的长度为每条链中约15至35，例如约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34或约35个核苷酸，其中链之一与靶区域充分互补。
在一些示例性实施方案中，将链进行比对以使得在链末端有至少1、2或3个碱基不对齐(即，在相反链中不存在互补碱基)，以使得当链退火时，在双链体的一端或两端存在1、2或3个残基的突出端(overhang)。在一些示例性实施方案中，siRNA分子的长度为约10至50个或更多个核苷酸，即每条链包含10至50个核苷酸(或核苷酸类似物)。在一些特别示例性的实施方案中，siRNA分子的长度为每条链中约15至35，例如约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34或约35个核苷酸，其中链之一与包含等位基因多态性的靶序列基本上互补，并且另一条链与第一链互补或基本上互补。在一个实施方案中，除了一个另外的错配(也称为次要错配)之外，siRNA分子与含有等位基因多态性的靶序列完全互补。
在一些实施方案中，每条链包含10至50个核苷酸或核苷酸类似物(例如，10个核苷酸或核苷酸类似物、11个核苷酸或核苷酸类似物、12个核苷酸或核苷酸类似物、13个核苷酸或核苷酸类似物、14个核苷酸或核苷酸类似物、15个核苷酸或核苷酸类似物、16个核苷酸或核苷酸类似物、17个核苷酸或核苷酸类似物、18个核苷酸或核苷酸类似物、19个核苷酸或核苷酸类似物、20个核苷酸或核苷酸类似物、21个核苷酸或核苷酸类似物、22个核苷酸或核苷酸类似物、23个核苷酸或核苷酸类似物、24个核苷酸或核苷酸类似物、25个核苷酸或核苷酸类似物、26个核苷酸或核苷酸类似物、27个核苷酸或核苷酸类似物、28个核苷酸或核苷酸类似物、29个核苷酸或核苷酸类似物、30个核苷酸或核苷酸类似物、31个核苷酸或核苷酸类似物、32个核苷酸或核苷酸类似物、33个核苷酸或核苷酸类似物、34个核苷酸或核苷酸类似物、35个核苷酸或核苷酸类似物、36个核苷酸或核苷酸类似物、37个核苷酸或核苷酸类似物、38个核苷酸或核苷酸类似物、39个核苷酸或核苷酸类似物、40个核苷酸或核苷酸类似物、41个核苷酸或核苷酸类似物、42个核苷酸或核苷酸类似物、43个核苷酸或核苷酸类似物、44个核苷酸或核苷酸类似物、45个核苷酸或核苷酸类似物、46个核苷酸或核苷酸类似物、47个核苷酸或核苷酸类似物、48个核苷酸或核苷酸类似物、49个核苷酸或核苷酸类似物、或50个核苷酸或核苷酸类似物)。在一些实施方案中，每条链包含10至49个核苷酸或核苷酸类似物(例如，10个核苷酸或核苷酸类似物、11个核苷酸或核苷酸类似物、12个核苷酸或核苷酸类似物、13个核苷酸或核苷酸类似物、14个核苷酸或核苷酸类似物、15个核苷酸或核苷酸类似物、16个核苷酸或核苷酸类似物、17个核苷酸或核苷酸类似物、18个核苷酸或核苷酸类似物、19个核苷酸或核苷酸类似物、20个核苷酸或核苷酸类似物、21个核苷酸或核苷酸类似物、22个核苷酸或核苷酸类似物、23个核苷酸或核苷酸类似物、24个核苷酸或核苷酸类似物、25个核苷酸或核苷酸类似物、26个核苷酸或核苷酸类似物、27个核苷酸或核苷酸类似物、28个核苷酸或核苷酸类似物、29个核苷酸或核苷酸类似物、30个核苷酸或核苷酸类似物、31个核苷酸或核苷酸类似物、32个核苷酸或核苷酸类似物、33个核苷酸或核苷酸类似物、34个核苷酸或核苷酸类似物、35个核苷酸或核苷酸类似物、36个核苷酸或核苷酸类似物、37个核苷酸或核苷酸类似物、38个核苷酸或核苷酸类似物、39个核苷酸或核苷酸类似物、40个核苷酸或核苷酸类似物、41个核苷酸或核苷酸类似物、42个核苷酸或核苷酸类似物、43个核苷酸或核苷酸类似物、44个核苷酸或核苷酸类似物、45个核苷酸或核苷酸类似物、46个核苷酸或核苷酸类似物、47个核苷酸或核苷酸类似物、48个核苷酸或核苷酸类似物、或49个核苷酸或核苷酸类似物)。在一些实施方案中，每条链包含10至48个核苷酸或核苷酸类似物(例如，10个核苷酸或核苷酸类似物、11个核苷酸或核苷酸类似物、12个核苷酸或核苷酸类似物、13个核苷酸或核苷酸类似物、14个核苷酸或核苷酸类似物、15个核苷酸或核苷酸类似物、16个核苷酸或核苷酸类似物、17个核苷酸或核苷酸类似物、18个核苷酸或核苷酸类似物、19个核苷酸或核苷酸类似物、20个核苷酸或核苷酸类似物、21个核苷酸或核苷酸类似物、22个核苷酸或核苷酸类似物、23个核苷酸或核苷酸类似物、24个核苷酸或核苷酸类似物、25个核苷酸或核苷酸类似物、26个核苷酸或核苷酸类似物、27个核苷酸或核苷酸类似物、28个核苷酸或核苷酸类似物、29个核苷酸或核苷酸类似物、30个核苷酸或核苷酸类似物、31个核苷酸或核苷酸类似物、32个核苷酸或核苷酸类似物、33个核苷酸或核苷酸类似物、34个核苷酸或核苷酸类似物、35个核苷酸或核苷酸类似物、36个核苷酸或核苷酸类似物、37个核苷酸或核苷酸类似物、38个核苷酸或核苷酸类似物、39个核苷酸或核苷酸类似物、40个核苷酸或核苷酸类似物、41个核苷酸或核苷酸类似物、42个核苷酸或核苷酸类似物、43个核苷酸或核苷酸类似物、44个核苷酸或核苷酸类似物、45个核苷酸或核苷酸类似物、46个核苷酸或核苷酸类似物、47个核苷酸或核苷酸类似物、或48个核苷酸或核苷酸类似物)。在一些实施方案中，每条链包含10至47个核苷酸或核苷酸类似物(例如，10个核苷酸或核苷酸类似物、11个核苷酸或核苷酸类似物、12个核苷酸或核苷酸类似物、13个核苷酸或核苷酸类似物、14个核苷酸或核苷酸类似物、15个核苷酸或核苷酸类似物、16个核苷酸或核苷酸类似物、17个核苷酸或核苷酸类似物、18个核苷酸或核苷酸类似物、19个核苷酸或核苷酸类似物、20个核苷酸或核苷酸类似物、21个核苷酸或核苷酸类似物、22个核苷酸或核苷酸类似物、23个核苷酸或核苷酸类似物、24个核苷酸或核苷酸类似物、25个核苷酸或核苷酸类似物、26个核苷酸或核苷酸类似物、27个核苷酸或核苷酸类似物、28个核苷酸或核苷酸类似物、29个核苷酸或核苷酸类似物、30个核苷酸或核苷酸类似物、31个核苷酸或核苷酸类似物、32个核苷酸或核苷酸类似物、33个核苷酸或核苷酸类似物、34个核苷酸或核苷酸类似物、35个核苷酸或核苷酸类似物、36个核苷酸或核苷酸类似物、37个核苷酸或核苷酸类似物、38个核苷酸或核苷酸类似物、39个核苷酸或核苷酸类似物、40个核苷酸或核苷酸类似物、41个核苷酸或核苷酸类似物、42个核苷酸或核苷酸类似物、43个核苷酸或核苷酸类似物、44个核苷酸或核苷酸类似物、45个核苷酸或核苷酸类似物、46个核苷酸或核苷酸类似物、或47个核苷酸或核苷酸类似物)。在一些实施方案中，每条链包含10至46个核苷酸或核苷酸类似物(例如，10个核苷酸或核苷酸类似物、11个核苷酸或核苷酸类似物、12个核苷酸或核苷酸类似物、13个核苷酸或核苷酸类似物、14个核苷酸或核苷酸类似物、15个核苷酸或核苷酸类似物、16个核苷酸或核苷酸类似物、17个核苷酸或核苷酸类似物、18个核苷酸或核苷酸类似物、19个核苷酸或核苷酸类似物、20个核苷酸或核苷酸类似物、21个核苷酸或核苷酸类似物、22个核苷酸或核苷酸类似物、23个核苷酸或核苷酸类似物、24个核苷酸或核苷酸类似物、25个核苷酸或核苷酸类似物、26个核苷酸或核苷酸类似物、27个核苷酸或核苷酸类似物、28个核苷酸或核苷酸类似物、29个核苷酸或核苷酸类似物、30个核苷酸或核苷酸类似物、31个核苷酸或核苷酸类似物、32个核苷酸或核苷酸类似物、33个核苷酸或核苷酸类似物、34个核苷酸或核苷酸类似物、35个核苷酸或核苷酸类似物、36个核苷酸或核苷酸类似物、37个核苷酸或核苷酸类似物、38个核苷酸或核苷酸类似物、39个核苷酸或核苷酸类似物、40个核苷酸或核苷酸类似物、41个核苷酸或核苷酸类似物、42个核苷酸或核苷酸类似物、43个核苷酸或核苷酸类似物、44个核苷酸或核苷酸类似物、45个核苷酸或核苷酸类似物、或46个核苷酸或核苷酸类似物)。在一些实施方案中，每条链包含10至45个核苷酸或核苷酸类似物(例如，10个核苷酸或核苷酸类似物、11个核苷酸或核苷酸类似物、12个核苷酸或核苷酸类似物、13个核苷酸或核苷酸类似物、14个核苷酸或核苷酸类似物、15个核苷酸或核苷酸类似物、16个核苷酸或核苷酸类似物、17个核苷酸或核苷酸类似物、18个核苷酸或核苷酸类似物、19个核苷酸或核苷酸类似物、20个核苷酸或核苷酸类似物、21个核苷酸或核苷酸类似物、22个核苷酸或核苷酸类似物、23个核苷酸或核苷酸类似物、24个核苷酸或核苷酸类似物、25个核苷酸或核苷酸类似物、26个核苷酸或核苷酸类似物、27个核苷酸或核苷酸类似物、28个核苷酸或核苷酸类似物、29个核苷酸或核苷酸类似物、30个核苷酸或核苷酸类似物、31个核苷酸或核苷酸类似物、32个核苷酸或核苷酸类似物、33个核苷酸或核苷酸类似物、34个核苷酸或核苷酸类似物、35个核苷酸或核苷酸类似物、36个核苷酸或核苷酸类似物、37个核苷酸或核苷酸类似物、38个核苷酸或核苷酸类似物、39个核苷酸或核苷酸类似物、40个核苷酸或核苷酸类似物、41个核苷酸或核苷酸类似物、42个核苷酸或核苷酸类似物、43个核苷酸或核苷酸类似物、44个核苷酸或核苷酸类似物、或45个核苷酸或核苷酸类似物)。在一些实施方案中，每条链包含10至44个核苷酸或核苷酸类似物(例如，10个核苷酸或核苷酸类似物、11个核苷酸或核苷酸类似物、12个核苷酸或核苷酸类似物、13个核苷酸或核苷酸类似物、14个核苷酸或核苷酸类似物、15个核苷酸或核苷酸类似物、16个核苷酸或核苷酸类似物、17个核苷酸或核苷酸类似物、18个核苷酸或核苷酸类似物、19个核苷酸或核苷酸类似物、20个核苷酸或核苷酸类似物、21个核苷酸或核苷酸类似物、22个核苷酸或核苷酸类似物、23个核苷酸或核苷酸类似物、24个核苷酸或核苷酸类似物、25个核苷酸或核苷酸类似物、26个核苷酸或核苷酸类似物、27个核苷酸或核苷酸类似物、28个核苷酸或核苷酸类似物、29个核苷酸或核苷酸类似物、30个核苷酸或核苷酸类似物、31个核苷酸或核苷酸类似物、32个核苷酸或核苷酸类似物、33个核苷酸或核苷酸类似物、34个核苷酸或核苷酸类似物、35个核苷酸或核苷酸类似物、36个核苷酸或核苷酸类似物、37个核苷酸或核苷酸类似物、38个核苷酸或核苷酸类似物、39个核苷酸或核苷酸类似物、40个核苷酸或核苷酸类似物、41个核苷酸或核苷酸类似物、42个核苷酸或核苷酸类似物、43个核苷酸或核苷酸类似物、或44个核苷酸或核苷酸类似物)。在一些实施方案中，每条链包含10至43个核苷酸或核苷酸类似物(例如，10个核苷酸或核苷酸类似物、11个核苷酸或核苷酸类似物、12个核苷酸或核苷酸类似物、13个核苷酸或核苷酸类似物、14个核苷酸或核苷酸类似物、15个核苷酸或核苷酸类似物、16个核苷酸或核苷酸类似物、17个核苷酸或核苷酸类似物、18个核苷酸或核苷酸类似物、19个核苷酸或核苷酸类似物、20个核苷酸或核苷酸类似物、21个核苷酸或核苷酸类似物、22个核苷酸或核苷酸类似物、23个核苷酸或核苷酸类似物、24个核苷酸或核苷酸类似物、25个核苷酸或核苷酸类似物、26个核苷酸或核苷酸类似物、27个核苷酸或核苷酸类似物、28个核苷酸或核苷酸类似物、29个核苷酸或核苷酸类似物、30个核苷酸或核苷酸类似物、31个核苷酸或核苷酸类似物、32个核苷酸或核苷酸类似物、33个核苷酸或核苷酸类似物、34个核苷酸或核苷酸类似物、35个核苷酸或核苷酸类似物、36个核苷酸或核苷酸类似物、37个核苷酸或核苷酸类似物、38个核苷酸或核苷酸类似物、39个核苷酸或核苷酸类似物、40个核苷酸或核苷酸类似物、41个核苷酸或核苷酸类似物、42个核苷酸或核苷酸类似物、或43个核苷酸或核苷酸类似物)。在一些实施方案中，每条链包含10至42个核苷酸或核苷酸类似物(例如，10个核苷酸或核苷酸类似物、11个核苷酸或核苷酸类似物、12个核苷酸或核苷酸类似物、13个核苷酸或核苷酸类似物、14个核苷酸或核苷酸类似物、15个核苷酸或核苷酸类似物、16个核苷酸或核苷酸类似物、17个核苷酸或核苷酸类似物、18个核苷酸或核苷酸类似物、19个核苷酸或核苷酸类似物、20个核苷酸或核苷酸类似物、21个核苷酸或核苷酸类似物、22个核苷酸或核苷酸类似物、23个核苷酸或核苷酸类似物、24个核苷酸或核苷酸类似物、25个核苷酸或核苷酸类似物、26个核苷酸或核苷酸类似物、27个核苷酸或核苷酸类似物、28个核苷酸或核苷酸类似物、29个核苷酸或核苷酸类似物、30个核苷酸或核苷酸类似物、31个核苷酸或核苷酸类似物、32个核苷酸或核苷酸类似物、33个核苷酸或核苷酸类似物、34个核苷酸或核苷酸类似物、35个核苷酸或核苷酸类似物、36个核苷酸或核苷酸类似物、37个核苷酸或核苷酸类似物、38个核苷酸或核苷酸类似物、39个核苷酸或核苷酸类似物、40个核苷酸或核苷酸类似物、41个核苷酸或核苷酸类似物、或42个核苷酸或核苷酸类似物)。在一些实施方案中，每条链包含10至41个核苷酸或核苷酸类似物(例如，10个核苷酸或核苷酸类似物、11个核苷酸或核苷酸类似物、12个核苷酸或核苷酸类似物、13个核苷酸或核苷酸类似物、14个核苷酸或核苷酸类似物、15个核苷酸或核苷酸类似物、16个核苷酸或核苷酸类似物、17个核苷酸或核苷酸类似物、18个核苷酸或核苷酸类似物、19个核苷酸或核苷酸类似物、20个核苷酸或核苷酸类似物、21个核苷酸或核苷酸类似物、22个核苷酸或核苷酸类似物、23个核苷酸或核苷酸类似物、24个核苷酸或核苷酸类似物、25个核苷酸或核苷酸类似物、26个核苷酸或核苷酸类似物、27个核苷酸或核苷酸类似物、28个核苷酸或核苷酸类似物、29个核苷酸或核苷酸类似物、30个核苷酸或核苷酸类似物、31个核苷酸或核苷酸类似物、32个核苷酸或核苷酸类似物、33个核苷酸或核苷酸类似物、34个核苷酸或核苷酸类似物、35个核苷酸或核苷酸类似物、36个核苷酸或核苷酸类似物、37个核苷酸或核苷酸类似物、38个核苷酸或核苷酸类似物、39个核苷酸或核苷酸类似物、40个核苷酸或核苷酸类似物、或41个核苷酸或核苷酸类似物)。在一些实施方案中，每条链包含10至40个核苷酸或核苷酸类似物(例如，10个核苷酸或核苷酸类似物、11个核苷酸或核苷酸类似物、12个核苷酸或核苷酸类似物、13个核苷酸或核苷酸类似物、14个核苷酸或核苷酸类似物、15个核苷酸或核苷酸类似物、16个核苷酸或核苷酸类似物、17个核苷酸或核苷酸类似物、18个核苷酸或核苷酸类似物、19个核苷酸或核苷酸类似物、20个核苷酸或核苷酸类似物、21个核苷酸或核苷酸类似物、22个核苷酸或核苷酸类似物、23个核苷酸或核苷酸类似物、24个核苷酸或核苷酸类似物、25个核苷酸或核苷酸类似物、26个核苷酸或核苷酸类似物、27个核苷酸或核苷酸类似物、28个核苷酸或核苷酸类似物、29个核苷酸或核苷酸类似物、30个核苷酸或核苷酸类似物、31个核苷酸或核苷酸类似物、32个核苷酸或核苷酸类似物、33个核苷酸或核苷酸类似物、34个核苷酸或核苷酸类似物、35个核苷酸或核苷酸类似物、36个核苷酸或核苷酸类似物、37个核苷酸或核苷酸类似物、38个核苷酸或核苷酸类似物、39个核苷酸或核苷酸类似物、或40个核苷酸或核苷酸类似物)。在一些实施方案中，每条链包含10至39个核苷酸或核苷酸类似物(例如，10个核苷酸或核苷酸类似物、11个核苷酸或核苷酸类似物、12个核苷酸或核苷酸类似物、13个核苷酸或核苷酸类似物、14个核苷酸或核苷酸类似物、15个核苷酸或核苷酸类似物、16个核苷酸或核苷酸类似物、17个核苷酸或核苷酸类似物、18个核苷酸或核苷酸类似物、19个核苷酸或核苷酸类似物、20个核苷酸或核苷酸类似物、21个核苷酸或核苷酸类似物、22个核苷酸或核苷酸类似物、23个核苷酸或核苷酸类似物、24个核苷酸或核苷酸类似物、25个核苷酸或核苷酸类似物、26个核苷酸或核苷酸类似物、27个核苷酸或核苷酸类似物、28个核苷酸或核苷酸类似物、29个核苷酸或核苷酸类似物、30个核苷酸或核苷酸类似物、31个核苷酸或核苷酸类似物、32个核苷酸或核苷酸类似物、33个核苷酸或核苷酸类似物、34个核苷酸或核苷酸类似物、35个核苷酸或核苷酸类似物、36个核苷酸或核苷酸类似物、37个核苷酸或核苷酸类似物、38个核苷酸或核苷酸类似物、或39个核苷酸或核苷酸类似物)。在一些实施方案中，每条链包含10至38个核苷酸或核苷酸类似物(例如，10个核苷酸或核苷酸类似物、11个核苷酸或核苷酸类似物、12个核苷酸或核苷酸类似物、13个核苷酸或核苷酸类似物、14个核苷酸或核苷酸类似物、15个核苷酸或核苷酸类似物、16个核苷酸或核苷酸类似物、17个核苷酸或核苷酸类似物、18个核苷酸或核苷酸类似物、19个核苷酸或核苷酸类似物、20个核苷酸或核苷酸类似物、21个核苷酸或核苷酸类似物、22个核苷酸或核苷酸类似物、23个核苷酸或核苷酸类似物、24个核苷酸或核苷酸类似物、25个核苷酸或核苷酸类似物、26个核苷酸或核苷酸类似物、27个核苷酸或核苷酸类似物、28个核苷酸或核苷酸类似物、29个核苷酸或核苷酸类似物、30个核苷酸或核苷酸类似物、31个核苷酸或核苷酸类似物、32个核苷酸或核苷酸类似物、33个核苷酸或核苷酸类似物、34个核苷酸或核苷酸类似物、35个核苷酸或核苷酸类似物、36个核苷酸或核苷酸类似物、37个核苷酸或核苷酸类似物、或38个核苷酸或核苷酸类似物)。在一些实施方案中，每条链包含10至37个核苷酸或核苷酸类似物(例如，10个核苷酸或核苷酸类似物、11个核苷酸或核苷酸类似物、12个核苷酸或核苷酸类似物、13个核苷酸或核苷酸类似物、14个核苷酸或核苷酸类似物、15个核苷酸或核苷酸类似物、16个核苷酸或核苷酸类似物、17个核苷酸或核苷酸类似物、18个核苷酸或核苷酸类似物、19个核苷酸或核苷酸类似物、20个核苷酸或核苷酸类似物、21个核苷酸或核苷酸类似物、22个核苷酸或核苷酸类似物、23个核苷酸或核苷酸类似物、24个核苷酸或核苷酸类似物、25个核苷酸或核苷酸类似物、26个核苷酸或核苷酸类似物、27个核苷酸或核苷酸类似物、28个核苷酸或核苷酸类似物、29个核苷酸或核苷酸类似物、30个核苷酸或核苷酸类似物、31个核苷酸或核苷酸类似物、32个核苷酸或核苷酸类似物、33个核苷酸或核苷酸类似物、34个核苷酸或核苷酸类似物、35个核苷酸或核苷酸类似物、36个核苷酸或核苷酸类似物、或37个核苷酸或核苷酸类似物)。在一些实施方案中，每条链包含10至36个核苷酸或核苷酸类似物(例如，10个核苷酸或核苷酸类似物、11个核苷酸或核苷酸类似物、12个核苷酸或核苷酸类似物、13个核苷酸或核苷酸类似物、14个核苷酸或核苷酸类似物、15个核苷酸或核苷酸类似物、16个核苷酸或核苷酸类似物、17个核苷酸或核苷酸类似物、18个核苷酸或核苷酸类似物、19个核苷酸或核苷酸类似物、20个核苷酸或核苷酸类似物、21个核苷酸或核苷酸类似物、22个核苷酸或核苷酸类似物、23个核苷酸或核苷酸类似物、24个核苷酸或核苷酸类似物、25个核苷酸或核苷酸类似物、26个核苷酸或核苷酸类似物、27个核苷酸或核苷酸类似物、28个核苷酸或核苷酸类似物、29个核苷酸或核苷酸类似物、30个核苷酸或核苷酸类似物、31个核苷酸或核苷酸类似物、32个核苷酸或核苷酸类似物、33个核苷酸或核苷酸类似物、34个核苷酸或核苷酸类似物、35个核苷酸或核苷酸类似物、或36个核苷酸或核苷酸类似物)。在一些实施方案中，每条链包含10至35个核苷酸或核苷酸类似物(例如，10个核苷酸或核苷酸类似物、11个核苷酸或核苷酸类似物、12个核苷酸或核苷酸类似物、13个核苷酸或核苷酸类似物、14个核苷酸或核苷酸类似物、15个核苷酸或核苷酸类似物、16个核苷酸或核苷酸类似物、17个核苷酸或核苷酸类似物、18个核苷酸或核苷酸类似物、19个核苷酸或核苷酸类似物、20个核苷酸或核苷酸类似物、21个核苷酸或核苷酸类似物、22个核苷酸或核苷酸类似物、23个核苷酸或核苷酸类似物、24个核苷酸或核苷酸类似物、25个核苷酸或核苷酸类似物、26个核苷酸或核苷酸类似物、27个核苷酸或核苷酸类似物、28个核苷酸或核苷酸类似物、29个核苷酸或核苷酸类似物、30个核苷酸或核苷酸类似物、31个核苷酸或核苷酸类似物、32个核苷酸或核苷酸类似物、33个核苷酸或核苷酸类似物、34个核苷酸或核苷酸类似物、或35个核苷酸或核苷酸类似物)。在一些实施方案中，每条链包含11至35个核苷酸或核苷酸类似物(例如，11个核苷酸或核苷酸类似物、12个核苷酸或核苷酸类似物、13个核苷酸或核苷酸类似物、14个核苷酸或核苷酸类似物、15个核苷酸或核苷酸类似物、16个核苷酸或核苷酸类似物、17个核苷酸或核苷酸类似物、18个核苷酸或核苷酸类似物、19个核苷酸或核苷酸类似物、20个核苷酸或核苷酸类似物、21个核苷酸或核苷酸类似物、22个核苷酸或核苷酸类似物、23个核苷酸或核苷酸类似物、24个核苷酸或核苷酸类似物、25个核苷酸或核苷酸类似物、26个核苷酸或核苷酸类似物、27个核苷酸或核苷酸类似物、28个核苷酸或核苷酸类似物、29个核苷酸或核苷酸类似物、30个核苷酸或核苷酸类似物、31个核苷酸或核苷酸类似物、32个核苷酸或核苷酸类似物、33个核苷酸或核苷酸类似物、34个核苷酸或核苷酸类似物、或35个核苷酸或核苷酸类似物)。在一些实施方案中，每条链包含12至35个核苷酸或核苷酸类似物(例如，12个核苷酸或核苷酸类似物、13个核苷酸或核苷酸类似物、14个核苷酸或核苷酸类似物、15个核苷酸或核苷酸类似物、16个核苷酸或核苷酸类似物、17个核苷酸或核苷酸类似物、18个核苷酸或核苷酸类似物、19个核苷酸或核苷酸类似物、20个核苷酸或核苷酸类似物、21个核苷酸或核苷酸类似物、22个核苷酸或核苷酸类似物、23个核苷酸或核苷酸类似物、24个核苷酸或核苷酸类似物、25个核苷酸或核苷酸类似物、26个核苷酸或核苷酸类似物、27个核苷酸或核苷酸类似物、28个核苷酸或核苷酸类似物、29个核苷酸或核苷酸类似物、30个核苷酸或核苷酸类似物、31个核苷酸或核苷酸类似物、32个核苷酸或核苷酸类似物、33个核苷酸或核苷酸类似物、34个核苷酸或核苷酸类似物、或35个核苷酸或核苷酸类似物)。在一些实施方案中，每条链包含13至35个核苷酸或核苷酸类似物(例如，13个核苷酸或核苷酸类似物、14个核苷酸或核苷酸类似物、15个核苷酸或核苷酸类似物、16个核苷酸或核苷酸类似物、17个核苷酸或核苷酸类似物、18个核苷酸或核苷酸类似物、19个核苷酸或核苷酸类似物、20个核苷酸或核苷酸类似物、21个核苷酸或核苷酸类似物、22个核苷酸或核苷酸类似物、23个核苷酸或核苷酸类似物、24个核苷酸或核苷酸类似物、25个核苷酸或核苷酸类似物、26个核苷酸或核苷酸类似物、27个核苷酸或核苷酸类似物、28个核苷酸或核苷酸类似物、29个核苷酸或核苷酸类似物、30个核苷酸或核苷酸类似物、31个核苷酸或核苷酸类似物、32个核苷酸或核苷酸类似物、33个核苷酸或核苷酸类似物、34个核苷酸或核苷酸类似物、或35个核苷酸或核苷酸类似物)。在一些实施方案中，每条链包含14至35个核苷酸或核苷酸类似物(例如，14个核苷酸或核苷酸类似物、15个核苷酸或核苷酸类似物、16个核苷酸或核苷酸类似物、17个核苷酸或核苷酸类似物、18个核苷酸或核苷酸类似物、19个核苷酸或核苷酸类似物、20个核苷酸或核苷酸类似物、21个核苷酸或核苷酸类似物、22个核苷酸或核苷酸类似物、23个核苷酸或核苷酸类似物、24个核苷酸或核苷酸类似物、25个核苷酸或核苷酸类似物、26个核苷酸或核苷酸类似物、27个核苷酸或核苷酸类似物、28个核苷酸或核苷酸类似物、29个核苷酸或核苷酸类似物、30个核苷酸或核苷酸类似物、31个核苷酸或核苷酸类似物、32个核苷酸或核苷酸类似物、33个核苷酸或核苷酸类似物、34个核苷酸或核苷酸类似物、或35个核苷酸或核苷酸类似物)。在一些实施方案中，每条链包含15至35个核苷酸或核苷酸类似物(例如，15个核苷酸或核苷酸类似物、16个核苷酸或核苷酸类似物、17个核苷酸或核苷酸类似物、18个核苷酸或核苷酸类似物、19个核苷酸或核苷酸类似物、20个核苷酸或核苷酸类似物、21个核苷酸或核苷酸类似物、22个核苷酸或核苷酸类似物、23个核苷酸或核苷酸类似物、24个核苷酸或核苷酸类似物、25个核苷酸或核苷酸类似物、26个核苷酸或核苷酸类似物、27个核苷酸或核苷酸类似物、28个核苷酸或核苷酸类似物、29个核苷酸或核苷酸类似物、30个核苷酸或核苷酸类似物、31个核苷酸或核苷酸类似物、32个核苷酸或核苷酸类似物、33个核苷酸或核苷酸类似物、34个核苷酸或核苷酸类似物、或35个核苷酸或核苷酸类似物)。
在一些实施方案中，siRNA包含有义链和反义链(例如，如上所述)，并且反义链的长度为15至25个核苷酸或核苷酸类似物，例如长度为16至24个核苷酸或核苷酸类似物、长度为17至23个核苷酸或核苷酸类似物、长度为18至22个核苷酸或核苷酸类似物、或长度为19至21个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，反义链的长度为15个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，反义链的长度为16个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，反义链的长度为17个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，反义链的长度为18个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，反义链的长度为19个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，反义链的长度为20个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，反义链的长度为21个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，反义链的长度为22个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，反义链的长度为23个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，反义链的长度为24个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，反义链的长度为25个核苷酸或核苷酸类似物。
在一些实施方案中，siRNA包含有义链和反义链(例如，如上所述)，并且有义链的长度为10至20个核苷酸或核苷酸类似物，例如长度为11至19个核苷酸或核苷酸类似物、长度为12至18个核苷酸或核苷酸类似物、长度为13至17个核苷酸或核苷酸类似物、或长度为14至16个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，有义链的长度为10个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，有义链的长度为11个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，有义链的长度为12个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，有义链的长度为13个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，有义链的长度为14个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，有义链的长度为15个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，有义链的长度为16个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，有义链的长度为17个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，有义链的长度为18个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，有义链的长度为19个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，有义链的长度为20个核苷酸或核苷酸类似物。
在一些实施方案中，siRNA包含有义链和反义链(例如，如上所述)，其中反义链的长度为15至25个核苷酸或核苷酸类似物，并且有义链的长度为10至20个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，反义链的长度为16至24个核苷酸或核苷酸类似物，并且有义链的长度为11至19个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，反义链的长度为17至23个核苷酸或核苷酸类似物，并且有义链的长度为12至18个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，反义链的长度为18至22个核苷酸或核苷酸类似物，并且有义链的长度为13至17个核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，反义链的长度为19至21个核苷酸或核苷酸类似物，并且有义链的长度为14至16个核苷酸或核苷酸类似物。
在一些实施方案中，siRNA包含有义链和反义链(例如，如上所述)，其中反义链的长度为20个核苷酸或核苷酸类似物，并且有义链的长度为15个核苷酸或核苷酸类似物。
在一些实施方案中，siRNA包含有义链和反义链(例如，如上所述)，其中反义链的长度为21个核苷酸或核苷酸类似物，并且有义链的长度为15个核苷酸或核苷酸类似物。
在一些实施方案中，siRNA包含有义链和反义链(例如，如上所述)，其中反义链的长度为20个核苷酸或核苷酸类似物，并且有义链的长度为16个核苷酸或核苷酸类似物。
在一些实施方案中，siRNA包含有义链和反义链(例如，如上所述)，其中反义链的长度为21个核苷酸或核苷酸类似物，并且有义链的长度为16个核苷酸或核苷酸类似物。
通常来说，siRNA可通过使用本领域已知的任何方法，例如通过使用以下方案来设计：
1.siRNA可对包含等位基因多态性的靶序列具有特异性。在一些示例性实施方案中，第一链与包含等位基因多态性的靶序列基本上互补，与包含等位基因多态性的靶序列具有一个错配，并且另一链与第一链基本上互补。在一个实施方案中，靶序列在靶基因的编码区之外。示例性靶序列选自靶基因的5’非翻译区(5’-UTR)或内含子区。在这些位点切割mRNA应消除相应突变体蛋白的翻译。来自htt基因其他区域的靶序列也适用于靶向。有义链基于靶序列来设计。此外，具有较低G/C含量(35至55％)的siRNA可比具有高于55％的G/C含量的那些更有活性。因此，在一个实施方案中，本公开内容包含具有35至55％G/C含量的核酸分子。
2.siRNA的有义链基于所选靶位点的序列和等位基因多态性的位置来设计。在一些示例性实施方案中，本公开内容的RNA沉默剂不引发PKR响应(即，具有足够短的长度)。然而，更长的RNA沉默剂可用于例如，不能产生PKR响应的细胞类型，或者PKR响应已被替代方式下调或抑制的情况。
本公开内容的siRNA分子与靶序列具有充分互补性以使得siRNA可介导RNAi。通常来说，使用含有与靶基因的靶序列部分充分相同的核苷酸序列以实现靶基因的RISC介导的切割的siRNA。因此，在一个示例性实施方案中，siRNA的有义链被设计成必须具有与包含等位基因多态性的靶标的一部分充分相同的序列。本公开内容具有能够容许某些序列变异以增强RNAi的效率和特异性的优点。在一个方面，有义链与包含等位基因多态性的靶区域(例如野生型与突变等位基因之间的不同之处在于至少一个碱基对的靶区域，例如包含功能获得性突变的靶区域)具有1个错配的核苷酸，并且另一条链与第一链相同或基本上相同。在一些实施方案中，错配是上游4个核苷酸、对应于等位基因多态性的核苷酸的上游3个核苷酸、对应于等位基因多态性的核苷酸的上游2个核苷酸、上游1个核苷酸、对应于等位基因多态性的核苷酸的下游1个核苷酸、对应于等位基因多态性的核苷酸的下游2个核苷酸、对应于等位基因多态性的核苷酸的下游3个核苷酸、对应于等位基因多态性的核苷酸的下游4个核苷酸、或对应于等位基因多态性的核苷酸的下游5个核苷酸。在一些实施方案中，错配不与对应于等位基因多态性的核苷酸相邻。此外，具有1个或2个核苷酸的小插入或缺失的siRNA序列也可对介导RNAi有效。或者，具有核苷酸类似物替换或插入的siRNA序列对抑制可以是有效的。
序列同一性可通过本领域已知的序列比较和比对算法来确定。为了确定两个核酸序列的(或两个氨基酸序列的)同一性百分比，对序列进行为达到最佳比较目的比对(例如，可在第一序列或第二序列中引入空位以实现最佳比对)。然后比较相应核苷酸(或氨基酸)位置处的核苷酸(或氨基酸残基)。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的残基占据时，则分子在该位置处是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置数的函数(即，同源性百分比(％)＝相同位置数/位置的总数×100)，任选地对引入的空位数和/或引入的空位长度进行罚分。
可使用数学算法完成序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定。在一个实施方案中，在具有充分同一性的序列的某个部分上而不是在具有低同一性程度的部分上产生比对(即，局部比对)。用于序列比较的局部比对算法的一个示例性的非限制性实例是Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68，修订版为Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77的算法。这样的算法被并入Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的BLAST程序(2.0版)中。
在另一个实施方案中，通过引入适当的空位来优化比对，并且在比对序列的长度上确定同一性百分比(即，空位比对)。为了获得空位比对以进行比较，可使用如Altschulet al.，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402所述的Gapped BLAST。在另一个实施方案中，通过引入适当的空位来优化比对，并且在比对序列的整个长度上确定同一性百分比(即，全局比对)。用于序列全局比较的数学算法的一个示例性的非限制性实例是Myersand Miller，CABIOS(1989)的算法。这样的算法被并入ALIGN程序(2.0版)中，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序用于比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分和4的空位罚分。
3.siRNA的反义链或指导链通常与有义链长度相同并且包含互补核苷酸。在一个实施方案中，指导链和有义链是完全互补的，即，当比对或退火时，这些链是平端的。在另一个实施方案中，siRNA的链可以以这样的方式如具有1至4个(例如2个)核苷酸的3’突出端进行配对。突出端可包含对应于靶基因序列(或其互补序列)的核苷酸(或者由对应于靶基因序列(或其互补序列)的核苷酸组成)。或者，突出端可包含脱氧核糖核苷酸例如dT、或核苷酸类似物或其他合适的非核苷酸物质(或由脱氧核糖核苷酸例如dT、或核苷酸类似物或其他合适的非核苷酸物质组成)。因此，在另一个实施方案中，核酸分子可具有2个核苷酸的3’突出端，例如TT。突出的核苷酸可以是RNA或DNA。如上所述，期望选择其中突变体:野生型错配是嘌呤:嘌呤错配的靶区域。
4.使用本领域已知的任何方法，将潜在靶标与适当的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)进行比较，并从考虑中排除与其他编码序列具有显著同源性的任何靶标序列。用于这样的序列同源性检索的一种这样的方法称为BLAST，其可在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)网站获得。
5.选择一个或更多个满足评价标准的序列。
关于siRNA的设计和使用的另外的一般信息可在在The Max-Plank-Institut furBiophysikalishe Chemie网站上可获得的“The siRNA User Guide”中找到。
或者，siRNA可在功能上限定为能够与靶序列杂交的核苷酸序列(或寡核苷酸序列)(例如，400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA、50℃或70℃杂交12至16小时；然后洗涤)。另外的示例性杂交条件包括在70℃下在1×SSC中或在50℃下在1×SSC、50％甲酰胺中杂交，然后在70℃下在0.3×SSC中洗涤；或者在70℃下在4×SSC或在50℃下在4×SSC、50％甲酰胺中杂交，然后在67℃下在1×SSC中洗涤。预计长度小于50个碱基对的杂交体的杂交温度应比杂交体的解链温度(Tm)低5至10℃，其中Tm根据以下等式确定。对于长度小于18个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝2(A+T碱基数)+4(G+C碱基数)。对于长度为18至49个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂交体中的碱基数，并且[Na+]是杂交缓冲液中钠离子的浓度(1×SSC的[Na+]＝0.165M)。多核苷酸杂交的严格条件的另外的实例在Sambrook，J.，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，第9和11章，以及Current Protocols in Molecular Biology，1995，F.M.Ausubel et al.，eds.，John Wiley&Sons，Inc.，第2.10和6.3至6.4节中提供，其出于所有目的通过引用整体并入本文。
阴性对照siRNA应该具有与所选siRNA相同的核苷酸组成，但与适当的基因组没有显著序列互补性。这样的阴性对照可通过随机打乱(scramble)所选siRNA的核苷酸序列来设计。可进行同源性检索以确保阴性对照与适当基因组中的任何其他基因缺乏同源性。另外，可通过将一个或更多个碱基错配引入序列中来设计阴性对照siRNA。
6.为了验证siRNA破坏靶mRNA(例如，野生型或突变亨廷顿mRNA)的有效性，可在基于果蝇(Deosophila)的体外mRNA表达系统中将siRNA与靶cDNA(例如，亨廷顿cDNA)一起孵育。用32P进行放射性标记，在琼脂糖凝胶上对新合成的靶mRNA(例如亨廷顿mRNA)进行放射自显影检测。切割的靶mRNA的存在指示mRNA核酸酶活性。合适的对照包括省略siRNA和使用非靶cDNA。或者，选择具有与所选siRNA相同的核苷酸组成但与适当靶基因没有显著序列互补性的对照siRNA。这样的阴性对照可通过随机打乱所选siRNA的核苷酸序列来设计。可进行同源性检索以确保阴性对照与适当基因组中的任何其他基因缺乏同源性。另外，可通过将一个或更多个碱基错配引入序列中来设计阴性对照siRNA。
siRNAs可设计成靶向上述任何靶序列。所述siRNA包含与靶序列充分互补以介导靶序列沉默的反义链。在某些实施方案中，RNA沉默剂是siRNA。
选择siRNA-mRNA互补位点，其导致最佳的mRNA特异性和最大的mRNA切割。
siRNA样分子
本公开内容的siRNA样分子具有与mRNA(例如htt mRNA)的靶序列“充分互补”以通过RNAi或翻译抑制来指导基因沉默的序列(即，具有含有序列的链)。siRNA样分子以与siRNA分子相同的方式设计，但有义链与靶RNA之间的序列同一性程度近似于在miRNA与其靶标之间所观察到的。通常来说，随着miRNA序列与相应靶基因序列之间序列同一性程度的降低，通过翻译抑制而不是RNAi来介导转录后基因沉默的趋势会提高。因此，在一个替代实施方案中，在期望通过靶基因的翻译抑制来进行转录后基因沉默的情况下，miRNA序列与靶基因序列具有部分互补性。在某些实施方案中，miRNA序列与分散在靶mRNA内(例如，在靶mRNA的3’-UTR内)的一个或更多个短序列(互补位点)具有部分互补性(Hutvagner andZamore，Science，2002；Zeng et al.，Mol.Cell，2002；Zeng et al.，RNA，2003；Doench etal.，Genes&DeV.，2003)。由于翻译抑制的机制是协同的，因此在某些实施方案中可靶向多个互补位点(例如，2、3、4、5或6个)。
siRNA样双链体介导RNAi或翻译抑制的能力可通过靶基因序列与沉默剂的核苷酸序列在互补位点处的非相同核苷酸的分布来预测。在一个实施方案中，在期望通过翻译抑制进行基因沉默的情况下，互补位点的中心部分存在至少一个非相同核苷酸以使得由miRNA指导链与靶mRNA形成的双链体包含中心“凸起(bulge)”(Doench JG et al.，Genes&DeV.，2003)。在另一个实施方案中，引入了2、3、4、5或6个连续或非连续的非相同核苷酸。可选择非相同核苷酸以使得其形成摆动碱基对(例如，G:U)或错配碱基对(G:A、C:A、C:U、G:G、A:A、C:C、U:U)。在一个另外的示例性实施方案中，“凸起”以从miRNA分子的5’端起的第12和13位核苷酸为中心。
经修饰RNA沉默剂
在本公开内容的某些方面，可对如上文所述的本公开内容的RNA沉默剂(或其任何部分)进行修饰以使得药剂的活性得到进一步提高。例如，如上所述的RNA沉默剂可用以下所述的任何修饰来修饰。修饰可部分地用于进一步增强靶标辨别、增强药剂的稳定性(例如防止降解)、促进细胞摄取、增强靶标效率、改善结合(例如与靶标的结合)的效力、改善患者对药剂的耐受性和/或降低毒性。
1)增强靶标辨别的修饰
在某些实施方案中，本公开内容的RNA沉默剂可用去稳定核苷酸(destabilizingnucleotide)替换以增强单核苷酸靶标辨别(参见2007年1月25日提交的美国申请序列号11/698,689和2006年1月25日提交的美国临时申请No.60/762,225，二者均通过引用并入本文)。这样的修饰可足以消除RNA沉默剂对非靶mRNA(例如野生型mRNA)的特异性，而不明显影响RNA沉默剂对靶mRNA(例如功能获得性突变mRNA)的特异性。
在某些示例性实施方案中，本公开内容的RNA沉默剂通过在其反义链中引入至少一种通用核苷酸来修饰。通用核苷酸包含能够与四种常规核苷酸碱基(例如A、G、C、U)中的任一种无区别地进行碱基配对的碱基部分。通常使用通用核苷酸，因为其对RNA双链体或由RNA沉默剂的指导链与靶mRNA形成的双链体的稳定性影响相对较小。示例性通用核苷酸包括具有选自以下的肌苷碱基部分或肌苷类似物碱基部分的那些：脱氧肌苷(例如2’-脱氧肌苷)、7-脱氮杂-2’-脱氧肌苷、2’-氮杂-2’-脱氧肌苷、PNA-肌苷、吗啉代-肌苷、LNA-肌苷、氨基磷酸酯-肌苷、2’-O-甲氧基乙基-肌苷和2’-OMe-肌苷。在一些特别示例性的实施方案中，通用核苷酸是肌苷残基或其天然存在的类似物。
在某些实施方案中，本公开内容的RNA沉默剂通过在距特异性决定核苷酸(specificity-determining nucleotide)11个核苷酸内(例如，在距识别疾病相关多态性的核苷酸(例如SNP位核苷酸)11个核苷酸内)引入至少一个去稳定核苷酸来修饰。例如，可在距特异性决定核苷酸11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸内的位置处引入去稳定核苷酸。在一些示例性实施方案中，在距特异性决定核苷酸3个核苷酸的位置处引入去稳定核苷酸(即，使得在去稳定核苷酸与特异性决定核苷酸之间存在2个稳定核苷酸)。在具有两条链或链部分(例如，siRNA和shRNA)的RNA沉默剂中，可在不包含特异性决定核苷酸的链或链部分中引入去稳定核苷酸。在一些特别示例性的实施方案中，在包含特异性决定核苷酸的相同链或链部分中引入去稳定核苷酸。
在某些实施方案中，本公开内容的RNA沉默剂通过引入式1的经修饰亚基间键联来修饰：
Figure BDA0003584247760000381
其中：
D选自O、OCH2、OCH、CH2和CH；
C选自O-、OH、OR1、NH-、NH2、S-和SH；
A选自O和CH2；
R1是保护基；
Figure BDA0003584247760000391
是任选的双键；并且
亚基间桥接两个任选经修饰核苷。
在一个实施方案中，当C是O-时，A或D不是O。
在一个实施方案中，D是CH2。在另一个实施方案中，式VIII的经修饰亚基间键联是式2的经修饰亚基间键联：
Figure BDA0003584247760000392
在一个实施方案中，D是O。在另一个实施方案中，式VIII的经修饰亚基间键联是式3的经修饰亚基间键联：
Figure BDA0003584247760000393
在一个实施方案中，D是CH。在另一个实施方案中，式VIII的经修饰亚基间键联是式4的经修饰亚基间键联：
Figure BDA0003584247760000394
在另一个实施方案中，经修饰亚基间键联是式5的经修饰亚基间键联：
Figure BDA0003584247760000401
在一个实施方案中，D是OCH2。在另一个实施方案中，经修饰亚基间键联是式6的经修饰亚基间键联：
Figure BDA0003584247760000402
在另一个实施方案中，式VII的经修饰亚基间键联是式7的经修饰亚基间键联：
Figure BDA0003584247760000403
在某些实施方案中，本公开内容的RNA沉默剂通过引入一个或更多个图43的亚基间接头来修饰。在一个示例性实施方案中，图43的亚基间接头在SNP位核苷酸与位于与反义链的SNP位核苷酸直接相邻且在其任一侧上的位置处的核苷酸之间插入。
在某些实施方案中，本公开内容的RNA沉默剂通过在亚基间接头中引入一个或更多个具有下式的乙烯基膦酸酯(VP)基序来修饰：
Figure BDA0003584247760000411
在某些实施方案中，VP基序在寡核苷酸(例如RNA)的任何位置处插入。例如，对于长度为20个核苷酸的寡核苷酸，VP基序可在第1至2、2至3、3至4、4至5、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、13至14、14至15、15至16、16至17、17至18、18至19或19至20位以及这些的任何组合处插入。
在某些示例性实施方案中，VP基序在反义链的第1至2、5至6、6至7、10至11、18至19和/或19至20位中的一个或更多个位置处插入。
在另一些示例性实施方案中，VP基序在反义链的第1至2、6至7、10至11和/或19至20位中的一个或更多个位置处插入。
在一个示例性实施方案中，VP基序在反义链的SNP位核苷酸旁边(即，在SNP位核苷酸与位于与反义链的SNP位核苷酸直接相邻且在其任一侧上的位置处的核苷酸之间)插入。在另一个示例性实施方案中，VP基序在反义链的MM位核苷酸旁边(即，在MM位核苷酸与位于与反义链的MM位核苷酸直接相邻且在其任一侧上的位置处的核苷酸之间)插入。
2)增强效力和特异性的修饰
在某些实施方案中，本公开内容的RNA沉默剂可根据不对称设计规则进行改变以促进在介导RNAi方面的增强效力和特异性(参见美国专利No.8,309,704、7,750,144、8,304,530、8,329,892和8,309,705)。这样的改变促进了siRNA(例如，使用本公开内容的方法设计的siRNA或从shRNA产生的siRNA)的反义链进入到有利于有义链的RISC以使得反义链优先指导靶mRNA的切割或翻译抑制，并因此提高或改善靶标切割和沉默的效率。在一些示例性实施方案中，通过相对于RNA沉默剂的反义链3’端(AS 3’)与有义链5’端(S 5’)之间的键强度或碱基对强度而降低所述RNA沉默剂的反义链5’端(AS 5’)与有义链3’端(S’3)之间的碱基对强度来增强RNA沉默剂的不对称性。
在一个实施方案中，可增强本公开内容的RNA沉默剂的不对称性以使得在第一或反义链的5’端与有义链部分的3’端之间存在比在第一或反义链的3’端与有义链部分的5’端之间更少的G：C碱基对。在另一个实施方案中，可增强本公开内容的RNA沉默剂的不对称性以使得在第一或反义链的5’端与有义链部分的3’端之间存在至少一个错配碱基对。在一个示例性实施方案中，错配碱基对选自G:A、C:A、C:U、G:G、A:A、C:C和U：U。在另一个实施方案中，可增强本公开内容的RNA沉默剂的不对称性以使得在第一或反义链的5’端与有义链部分的3’端之间存在至少一个摆动碱基对，例如G:U。在另一个实施方案中，可增强本公开内容的RNA沉默剂的不对称性以使得有至少一个碱基对包含稀有核苷酸，例如肌苷(I)。在一些示例性实施方案中，碱基对选自I:A、I:U和I:C。在又一个实施方案中，可增强本公开内容的RNA沉默剂的不对称性以使得有至少一个碱基对包含经修饰核苷酸。在一些具体实施方案中，经修饰核苷酸选自2-氨基-G、2-氨基-A、2，6-二氨基-G和2，6-二氨基-A。
在某些实施方案中，在寡核苷酸中的一个或更多个亚基间键联处通过引入具有下式的乙烯基膦酸酯(VP)基序来对本公开内容的RNA沉默剂进行改变：
Figure BDA0003584247760000421
3)具有增强的稳定性的RNA沉默剂
本公开内容的RNA沉默剂可被修饰以提高在血清中或在用于细胞培养的生长培养基中的稳定性。为了增强稳定性，可使3’-残基稳定以防止降解，例如，可选择3’-残基以使其由嘌呤核苷酸，特别是腺苷或鸟苷核苷酸组成。或者，用经修饰类似物替换嘧啶核苷酸，例如用2’-脱氧胸苷替换尿苷是容许的，并且不影响RNA干扰的效率。
在一个具体方面，本公开内容的特征在于包含第一和第二链的RNA沉默剂，其中第二链和/或第一链通过用经修饰核苷酸替换内部核苷酸来修饰以使得与相应未经修饰RNA沉默剂相比体内稳定性得到增强。如本文中所定义的，“内部”核苷酸是存在于除核酸分子、多核苷酸或寡核苷酸的5’端或3’端之外的任何位置的核苷酸。内部核苷酸可在单链分子内或者在双链体或双链分子的链内。在一个实施方案中，通过替换至少一个内部核苷酸来修饰有义链和/或反义链。在另一个实施方案中，通过替换至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个内部核苷酸来修饰有义链和/或反义链。在另一个实施方案中，通过替换至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的内部核苷酸来修饰有义链和/或反义链。在又一个实施方案中，通过替换所有内部核苷酸来修饰有义链和/或反义链。
在本公开内容的一个具体实施方案中，RNA沉默剂可包含至少一种经修饰核苷酸类似物。核苷酸类似物可位于靶特异性沉默活性(例如，RNAi介导活性或翻译抑制活性)基本上不受影响的位置处，例如在siRNA分子的5’端和/或3’端的区域中。特别地，末端可通过并入经修饰核苷酸类似物来稳定。
在某些实施方案中，在寡核苷酸中的一个或更多个亚基间键联处通过引入具有下式的乙烯基膦酸酯(VP)基序来对本公开内容的RNA沉默剂进行改变：
Figure BDA0003584247760000431
多种寡核苷酸类型(例如，间隔聚体(gapmer)、混合聚体(mixmer)、miRNA抑制剂、剪接转换寡核苷酸(splice-switching oligonucleotide，“SSO”)、磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸(phosphorodiamidate morpholino oligonucleotide，“PMO”)、肽核酸(“PNA”)等)可用于本文中所述的寡核苷酸中，任选地使用本文中和例如以下中所述的修饰(例如化学修饰)和/或缀合的多种组合：美国序列号15/089,423；美国序列号15/236,051；美国序列号15/419,593；美国序列号15/697,120和美国专利No.9,809,817；和美国序列号15/814,350和美国专利No.9,862,350，其各自出于所有目的通过引用整体并入本文。
示例性核苷酸类似物包括糖和/或骨架修饰的核糖核苷酸(即，包含对磷酸-糖骨架的修饰)。例如，可修饰天然RNA的磷酸二酯键联以包含氮或硫杂原子中的至少一种。在一些示例性骨架修饰的核糖核苷酸中，与相邻核糖核苷酸连接的磷酸酯基团被经修饰基团(例如硫代磷酸酯基团)替代。在一些示例性糖修饰的核糖核苷酸中，2’OH-基团被选自H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或ON的基团替代，其中R是C1至C6烷基、烯基或炔基并且卤素是F、Cl、Br或I。
在一些具体实施方案中，修饰是2’-氟、2’-氨基和/或2’-硫修饰。一些特别示例性的修饰包括2’-氟-胞苷、2’-氟-尿苷、2’-氟-腺苷、2’-氟-鸟苷、2’-氨基-胞苷、2’-氨基-尿苷、2’-氨基-腺苷、2’-氨基-鸟苷、2，6-二氨基嘌呤、4-硫代-尿苷和/或5-氨基-烯丙基-尿苷。在一个具体实施方案中，2’-氟核糖核苷酸是每个尿苷和胞苷。另外的示例性修饰包括5-溴-尿苷、5-碘-尿苷、5-甲基-胞苷、核糖-胸苷、2-氨基嘌呤、2’-氨基-丁酰基-芘-尿苷、5-氟-胞苷和5-氟-尿苷。2’-脱氧-核苷酸和2’-Ome核苷酸也可用于本公开内容的经修饰RNA沉默剂部分。另外的经修饰残基包括脱氧无碱基(deoxy-abasic)、肌苷、N3-甲基-尿苷、N6，N6-二甲基-腺苷、假尿苷、嘌呤核糖核苷和三唑核苷(ribavirin)。在一个特别示例性的实施方案中，2’部分是甲基，使得连接部分是2’-O-甲基寡核苷酸。
在一个示例性实施方案中，本公开内容的RNA沉默剂包含锁核酸(LNA)。LNA包含抵抗核酸酶活性(高度稳定)并具有对mRNA的单核苷酸辨别的糖修饰核苷酸(Elmen et al.，Nucleic Acids Res.，(2005)，33(1)：439-447；Braasch et al.(2003)Biochemistry 42：7967-7975，Petersen et al.(2003)Trends Biotechnol.21：74-81)。这些分子具有2’-O，4’-C-乙烯桥接的核酸，并具有可能的修饰，例如2’-脱氧-2”-氟尿苷。此外，LNA通过将糖部分限制在3’-内构象中来提高寡核苷酸的特异性，从而预组织核苷酸以进行碱基配对，并将寡核苷酸的解链温度提高多至10℃/碱基。
在另一个示例性实施方案中，本公开内容的RNA沉默剂包含肽核酸(PNA)。PNA包含经修饰核苷酸，其中核苷酸的糖-磷酸部分被中性2-氨基乙基甘氨酸部分替代，该部分能够形成对核酸酶消化具有高度抗性并赋予分子提高的结合特异性的聚酰胺骨架(Nielsen，etal.，Science，(2001)，254：1497-1500)。
在某些示例性实施方案中，使用核碱基修饰的核糖核苷酸，即包含至少一种非天然存在的核碱基而不是天然存在的核碱基的核糖核苷酸。可修饰碱基以阻断腺苷脱氨酶的活性。示例性经修饰核碱基包括但不限于在5-位修饰的尿苷和/或胞苷，例如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；8位修饰的腺苷和/或鸟苷，例如8-溴鸟苷；脱氮核苷酸，例如7-脱氮-腺苷；O-和N-烷基化核苷酸，例如N6-甲基腺苷是合适的。应注意，上述修饰可进行组合。
在另一些实施方案中，可使用交联来改变RNA沉默剂的药代动力学，例如，以提高在体内的半衰期。因此，本公开内容包括具有两条互补核酸链的RNA沉默剂，其中两条链是交联的。本公开内容还包括与另一部分(例如非核酸部分，例如肽)、有机化合物(例如染料)等缀合或未缀合(例如，在其3’末端)的RNA沉默剂。与相应的siRNA相比，以该方式修饰siRNA衍生物可改善所得siRNA衍生物的细胞摄取或增强所得siRNA衍生物的细胞靶向活性，可用于在细胞中追踪siRNA衍生物，或与相应的siRNA相比提高siRNA衍生物的稳定性。
另一些示例性修饰包括：(a)2’修饰，例如在有义链或反义链，但尤其是在有义链中的U上提供2’-OMe部分，或者在3’突出端(例如在3’末端(3’末端意指在分子的3’原子或在最3’的部分，例如，最3’P或2’位置，如上下文所示))中提供2’-OMe部分；(b)骨架的修饰，例如用S替代磷酸骨架中的0，例如在特别是在反义链上的U或A或二者上提供硫代磷酸酯修饰；例如，用S替代P；(c)用C5氨基接头替代U；(d)用G替代A(在大多数情况下，序列变化位于有义链上而不是反义链上)；以及(d)在2’、6’、7’或8’位的修饰。一些示例性实施方案是其中这些修饰中的一种或更多种存在于有义链但不存在于反义链上的那些，或其中反义链具有较少这样的修饰的实施方案。另一些示例性修饰包括在3’突出端(例如在3’末端)使用甲基化P；2’修饰(例如提供2’-OMe部分)与对骨架的修饰(例如用S替代P，例如提供硫代磷酸酯修饰)或者在3’突出端(例如在3’末端)使用甲基化P的组合；用3’烷基修饰；在3’突出端(例如在3’末端)用无碱基吡咯烷酮的修饰；用萘普生、布洛芬或其他抑制3’末端降解的部分的修饰。
4)增强细胞摄取的修饰
在另一些实施方案中，RNA沉默剂可用化学部分进行修饰，例如以增强靶细胞(例如，神经元细胞)的细胞摄取。因此，本公开内容包括与另一部分(例如非核酸部分，例如肽)、有机化合物(例如染料)等缀合或未缀合(例如，在其3’末端)的RNA沉默剂。缀合可通过本领域已知的方法来完成，例如使用以下的方法：Lambert et al.，Drug Deliv.Rev.：47(1)，99-112(2001)(描述了加载到聚氰基丙烯酸烷基酯(polyalkylcyanoacrylate，PACA)纳米粒上的核酸)；Fattal et al.，J.Control Release53(1-3)：137-43(1998)(描述了与纳米粒结合的核酸)；Schwab et al.，Ann.Oncol.5 Suppl.4：55-8(1994)(描述了与嵌入剂、疏水基团、聚阳离子或PACA纳米粒连接的核酸)；和Godard et al.，Eur.J.Biochem.232(2)：404-10(1995)(描述了与纳米粒连接的核酸)。
在一个具体实施方案中，对本公开内容的RNA沉默剂的修饰包含在寡核苷酸的一个或更多个亚基间接头中的乙烯基膦酸酯(VP)基序，其中VP基序具有下式：
Figure BDA0003584247760000461
在一个具体实施方案中，本公开内容的RNA沉默剂与亲脂性部分缀合。在一个实施方案中，亲脂性部分是包含阳离子基团的配体。在另一个实施方案中，亲脂性部分与siRNA的一条或两条链连接。在一个示例性实施方案中，亲脂性部分与siRNA有义链的一端连接。在另一个示例性实施方案中，亲脂性部分与有义链的3’端连接。在某些实施方案中，亲脂性部分选自胆固醇、维生素E、维生素K、维生素A、叶酸或阳离子染料(例如Cy3)。在一个示例性实施方案中，亲脂性部分是胆固醇。另一些亲脂性部分包括胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1，3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基(geranyloxyhexyl group)、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩
Figure BDA0003584247760000462
嗪。
5)束缚配体(Tethered Ligand)
另一些实体可束缚至本公开内容的RNA沉默剂。例如，配体束缚至RNA沉默剂以提高稳定性、与靶核酸的杂交热力学、对特定组织或细胞类型的靶向、或细胞渗透性，例如通过胞吞依赖或非胞吞依赖的机制。配体和相关修饰还可提高序列特异性，并因此降低位点外(off-site)靶向。束缚配体可包括可作为嵌入剂发挥功能的一种或更多种经修饰碱基或糖。在某些示例性实施方案中，这些位于内部区域中，例如在RNA沉默剂/靶双链体的凸起中。嵌入剂可以是芳族化合物，例如多环芳族或杂环芳族化合物。多环嵌入剂可具有堆叠能力，并且可包括具有2、3或4个稠环的体系。本文中所述的通用碱基可包含在配体上。在一个实施方案中，配体可包含切割基团，其通过切割靶核酸而有助于靶基因抑制。切割基团可以是例如博来霉素(例如博来霉素-A5、博来霉素-A2或博来霉素-B2)、芘、菲咯啉(例如O-菲咯啉)、多胺、三肽(例如lys-tyr-lys三肽)或金属离子螯合基团。金属离子螯合基团可包括例如Lu(III)或EU(III)大环络合物、Zn(II)2，9-二甲基菲咯啉衍生物、Cu(II)三联吡啶或吖啶，其可促进游离金属离子(例如Lu(III))在凸起位点选择性切割靶RNA。在一些实施方案中，肽配体可束缚至RNA沉默剂以促进靶RNA的切割，例如，在凸起区域。例如，1，8-二甲基-1，3，6，8，10，13-六氮杂环十四烷(环拉胺(cyclam))可与肽缀合(例如，通过氨基酸衍生物)以促进靶RNA切割。束缚配体可以是氨基糖苷配体，其可使RNA沉默剂具有改善的杂交特性或改善的序列特异性。示例性氨基糖苷类包括糖基化聚赖氨酸、半乳糖基化聚赖氨酸、新霉素B、妥布霉素、卡那霉素A和氨基糖苷类的吖啶缀合物，例如Neo-N-吖啶、Neo-S-吖啶、Neo-C-吖啶、Tobra-N-吖啶和KanaA-N-吖啶。使用吖啶类似物可提高序列特异性。例如，与DNA相比，新霉素B对RNA的亲和力高，但序列特异性低。吖啶类似物neo-5-吖啶对HIV Rev响应元件(Rev-response element，RRE)具有提高的亲和力。在一些实施方案中，氨基糖苷配体的胍类似物(胍糖苷)束缚至RNA沉默剂。在胍基糖苷中，氨基酸上的胺基交换为胍基。胍类似物的连接可增强RNA沉默剂的细胞渗透性。束缚配体可以是聚精氨酸肽、类肽或肽模拟物，其可增强寡核苷酸试剂的细胞摄取。
示例性配体通常以共价方式直接或通过间插系链(intervening tether)间接地与配体缀合的载体偶联。在一些示例性实施方案中，配体通过间插系链与载体连接。在一些示例性实施方案中，配体改变其所并入的RNA沉默剂的分布、靶向或寿命。在一些示例性实施方案中，配体提供对选定靶标(例如分子、细胞或细胞类型、区室(例如细胞或器官区室)、组织、器官或身体区域)的增强的亲和力，例如与不存在这样的配体的种类相比。
示例性配体可改善转运、杂交和特异性性质，并且还可改善所得天然的或经修饰RNA沉默剂或者包含本文中所述的单体和/或天然的或经修饰核糖核苷酸的任何组合的聚合物分子的核酸酶抗性。配体通常可包括治疗性修饰剂，例如用于增强摄取；诊断性化合物或报道基团，例如用于监测分布；交联剂；核酸酶抗性赋予部分；和天然或不寻常的核碱基。一般性实例包括亲脂物(1ipophile)、脂质、甾体(例如，乌发醇(uvaol)、龙舌蓝皂苷配基(hecigenin)、薯蓣皂苷配基)、萜(例如，三萜，例如菝葜皂苷元(sarsasapogenin)、软木三萜酮(Friedelin)、表木栓醇(epifriedelanol)衍生的石胆酸)、维生素(例如，叶酸、维生素A、生物素、吡哆醛)、碳水化合物、蛋白质、蛋白质结合剂、整合素靶向分子、聚阳离子、肽、多胺和肽模拟物。配体可包括天然存在的物质(例如，人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如，右旋糖酐、短梗霉聚糖、壳多糖、壳聚糖、菊糖、环糊精或透明质酸)；氨基酸或脂质。配体也可以是重组或合成分子，例如合成聚合物，例如合成聚氨基酸。聚氨基酸的一些实例包括聚氨基酸是聚赖氨酸(polylysine，PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。多胺的一些实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、多胺、假肽-多胺、肽模拟物多胺、树状聚合物多胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、多胺的季盐或α螺旋肽。
配体还可包括靶向基团，例如细胞或组织靶向剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如抗体，其与特定细胞类型(例如肾细胞)结合。靶向基团可以是促甲状腺素、促黑激素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、黏蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺、多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、运铁蛋白、双膦酸酯、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、甾体、胆汁酸、叶酸、维生素B12、生物素或者RGD肽或RGD肽模拟物。配体的另一些实例包括染料、嵌入剂(例如吖啶和经取代的吖啶)、交联剂(例如补骨脂素(psoralene)、丝裂霉素C)、卟啉类(TPPC4、德克萨卟啉(texaphyrin)、噻呋啉(Sapphyrin))、多环芳烃类(例如吩嗪、二氢吩嗪、菲咯啉、芘)、lys-tyr-lys三肽、氨基糖苷类、胍氨基糖苷类、人工内切核酸酶(例如EDTA)、亲脂性分子例如胆固醇(及其硫代类似物)、胆酸、胆烷酸、石胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、甘油(例如酯(例如单、双或三脂肪酸酯，例如C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20脂肪酸)及其醚，例如C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20烷基；例如1，3-双-O(十六烷基)甘油、1，3-双-O(十八烷基)甘油)、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、硬脂酸(例如，甘油二硬脂酸酯)、油酸、豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩
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嗪)和肽缀合物(例如，触角足肽(antennapedia peptide)、Tat肽)、烷化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、经取代的烷基、经放射性标记的标志物、酶、半抗原(例如生物素)、转运/吸收促进剂(例如，阿司匹林、萘普生、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+络合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可以是蛋白质(例如糖蛋白)、或肽(例如对共配体具有特异性亲和力的分子)、或抗体(例如与特定细胞类型(例如癌细胞、内皮细胞，或骨细胞)结合的抗体)。配体还可包括激素和激素受体。其还可包括非肽类物质，例如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、或多价岩藻糖。配体可以是例如脂多糖、p38MAP激酶的激活剂或NF-KB的激活剂。
配体可以是物质，例如药物，其可提高RNA沉默剂向细胞中的摄取，例如通过破坏细胞的细胞骨架，例如通过破坏细胞的微管、微丝和/或中间丝。所述药物可以是例如taxon、长春新碱、长春碱、细胞松弛素、诺考达唑、japlakinolide、拉春库林A(latrunculinA)、鬼笔环肽、swinholide A、印丹诺辛(indanocine)或myoservin。例如，配体可通过激活炎症应答来提高RNA沉默剂在细胞中的摄取。具有这样的作用的示例性配体包括肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNFα)、白介素-1β或γ干扰素。
在一个方面，配体是脂质或基于脂质的分子。这样的脂质或基于脂质的分子通常结合血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。HSA结合配体允许将缀合物分配至靶组织例如身体的非肾靶组织。例如，靶组织可以是肝，包括肝的实质细胞。其他可结合HSA的分子也可用作配体。例如，可使用萘普生或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可(a)提高对缀合物降解的抗性，(b)提高对靶细胞或细胞膜的靶向或者向靶细胞或细胞膜中的转运，和/或(c)可用于调节与血清蛋白(例如HSA)的结合。基于脂质的配体可用于调节，例如控制缀合物与靶组织的结合。在一个具体实施方案中，基于脂质的配体结合HSA。然而，期望亲和力不要太强以至于不能逆转HSA-配体结合。在另一个示例性实施方案中，基于脂质的配体与HSA弱结合或根本不结合。
在另一个方面，配体是被靶细胞(例如增殖细胞)摄取的部分，例如维生素。这些特别地可用于治疗以不希望的(例如恶性或非恶性类型的)细胞增殖(例如癌细胞)为特征的病症。示例性维生素包括维生素A、E和K。其他示例性维生素包括B族维生素，例如叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或者被癌细胞吸收的其他维生素或营养素。还包括HSA和低密度脂蛋白(LDL)。
在另一个方面，配体是细胞渗透剂，通常是螺旋细胞渗透剂。在某些示例性实施方案中，试剂是两亲性的。示例性试剂是肽，例如tat或触角足肽。如果试剂是肽，其可被修饰，包括肽模拟物、转化体(invertomer)、非肽或假肽键联，以及使用D-氨基酸。螺旋剂通常是α-螺旋剂，其通常具有亲脂面和疏脂(lipophobic)面。
配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(本文中也称为寡肽模拟物)是能够折叠成类似于天然肽的确定的三维结构的分子。肽和肽模拟物与寡核苷酸剂的连接可影响RNA沉默剂的药代动力学分布，例如通过增强细胞识别和吸收。肽或肽模拟部分可以是约5至50个氨基酸长，例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。肽或肽模拟物可以是例如细胞渗透肽、阳离子肽、两亲肽或疏水肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树状聚合物肽、限制肽或交联肽。肽部分可以是L-肽或D-肽。在另一个替代方案中，肽部分可包括疏水膜易位序列(membrane translocation sequence，MTS)。肽或肽模拟物可由DNA的随机序列编码，例如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(one-bead-one-compound，OBOC)组合文库中鉴定的肽(Lam et al.，Nature 354：82-84，1991)。在一些示例性实施方案中，通过并入的单体单元束缚至RNA沉默剂的肽或肽模拟物是细胞靶向肽，例如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽或RGD模拟物。肽部分的长度可为约5个氨基酸至约40个氨基酸。肽部分可具有结构修饰，例如以提高稳定性或直接构象特性。可使用以下所述的任何结构修饰。
6)疏水部分
在本文中提供的双链RNA的某些实施方案中，RNA分子与一个或更多个疏水部分缀合(参见PCT公开No.WO 2018/031933，其通过引用并入本文)。在一个实施方案中，疏水部分对低密度脂蛋白和/或中密度脂蛋白具有亲和力。在一个相关实施方案中，疏水部分是具有少于三个双键的饱和或不饱和部分。
在另一个实施方案中，疏水部分对高密度脂蛋白具有亲和力。在一个相关实施方案中，疏水部分是具有三个或更多个双键(例如，具有三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个双键)的多不饱和部分。在一个具体实施方案中，疏水部分是具有三个双键的多不饱和部分。在一个具体实施方案中，疏水部分是具有四个双键的多不饱和部分。在一个具体实施方案中，疏水部分是具有五个双键的多不饱和部分。在一个具体实施方案中，疏水部分是具有六个双键的多不饱和部分。
在另一个实施方案中，疏水部分选自脂肪酸、甾体、开环甾体、脂质、神经节苷脂和核苷类似物以及内源性大麻素。
在另一个实施方案中，疏水部分是神经调节脂质，例如内源性大麻素。内源性大麻素的非限制性实例包括：大麻素(anandamide)、花生四烯酰乙醇胺、2-花生四烯酸甘油醚(2-Arachidonyl glyceryl ether)(诺拉丁醚(noladin ether))、2-花生四烯酸甘油醚(诺拉丁醚)、2-花生四烯酰甘油(2-Arachidonoylglycerol)和N-花生四烯酰多巴胺(N-Arachidonoyl dopamine)。
在另一个实施方案中，疏水部分是ω-3脂肪酸。ω-3脂肪酸的非限制性实例包括但不限于：十六碳三烯酸(hexadecatrienoic acid，HTA)、α-亚麻酸(alpha-linolenicacid，ALA)、十八碳四烯酸(stearidonic acid，SDA)、二十碳三烯酸(eicosatrienoicacid，ETE)、二十碳四烯酸(eicosatetraenoic acid，ETA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA，二十碳五烯酸(Timnodonic acid))、二十一碳五烯酸(heneicosapentaenoic acid，HPA)、二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid，DPA，鰶鱼酸(clupanodonic acid))、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA，二十二碳六烯酸(cervonic acid))、二十四碳五烯酸和二十四碳六烯酸(尼生酸(nisinic acid))。
在另一个实施方案中，疏水部分是ω-6脂肪酸。ω-6脂肪酸的非限制性实例包括但不限于：亚油酸、γ-亚麻酸(gamma-linolenic acid，GLA)、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸(dihomo-gamma-linolenic acid，DGLA)、花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、二十二碳二烯酸、肾上腺酸、二十二碳五烯酸(奥斯本酸(osbond acid))、二十四碳四烯酸和二十四碳五烯酸。
在另一个实施方案中，疏水部分是ω-9脂肪酸。ω-9脂肪酸的非限制性实例包括但不限于：油酸、二十碳烯酸、米德酸(Mead acid)、芥酸和神经酸。
在另一个实施方案中，疏水部分是共轭亚麻酸。共轭亚麻酸的非限制性实例包括但不限于：α-十八碳三烯酸、β-十八碳三烯酸、蓝花楹酸(jacaric acid)、α-桐酸、β-桐酸、梓树酸(catalpic acid)和石榴酸(punicic acid)。
在另一个实施方案中，疏水部分是饱和脂肪酸。饱和脂肪酸的非限制性实例包括但不限于：辛酸、癸酸、二十二烷酸、月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、二十四烷酸和蜡酸。
在另一个实施方案中，疏水部分是选自以下的酸：茹米烯酸(rumelenic acid)、α-十八碳四烯酸、β-十八碳四烯酸、十八碳五烯酸(bosseopentaenoic acid)、松油酸(pinolenic acid)和罗汉松酸(podocarpic acid)。
在另一个实施方案中，疏水部分选自：二十二烷酸(docosanoic acid，DCA)、二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)。在一个具体实施方案中，疏水部分是二十二烷酸(DCA)。在另一个具体实施方案中，疏水部分是DHA。在另一个具体实施方案中，疏水部分是EPA。
在另一个实施方案中，疏水部分是开环甾体。在一个具体实施方案中，疏水部分是钙化醇。在另一个实施方案中，疏水部分是除胆固醇之外的甾体。
在一个具体实施方案中，疏水部分不是胆固醇。
在另一个实施方案中，疏水部分是烷基链、维生素、肽或生物活性缀合物，包括但不限于：鞘糖脂、多不饱和脂肪酸、开环甾体、甾体激素或甾醇脂质。
在一个实施方案中，本文中提供的双链RNA包含一个或更多个经化学修饰核苷酸。在一个具体实施方案中，双链RNA包含交替的2’-甲氧基-核苷酸和2’-氟-核苷酸。在另一个具体实施方案中，双链RNA的一个或更多个核苷酸通过硫代磷酸酯键联与相邻核苷酸连接。在本文中公开的dsRNA的某些实施方案中，错配核苷酸和与错配核苷酸相邻的核苷酸是2’-甲氧基-核糖核苷酸。
在另一个具体实施方案中，在从本文中提供的双链RNA的3’端起的第1位和第2位的核苷酸通过硫代磷酸酯键联与相邻核苷酸连接。在又一个具体实施方案中，在从双链RNA的3’端起的第1位和第2位的核苷酸和在从双链RNA的5’端起的第1位和第2位的核苷酸通过硫代磷酸酯键联与相邻核苷酸连接。
在双链RNA的一个实施方案中，第一寡核苷酸包含至少16个连续核苷酸、5’端、3’端，并且与靶具有互补性，其中：
(1)第一寡核苷酸包含交替的2’-甲氧基-核苷酸和2’-氟-核苷酸；
(2)在从5’端起的第2位和第14位的核苷酸不是2’-甲氧基-核苷酸；
(3)核苷酸通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键联连接；并且
(4)在从3’端起的第1至6位或从3’端起的第1至7位的核苷酸通过硫代磷酸酯键联与相邻核苷酸连接。
7)高级稳定模式
在本文中提供的双链RNA的一个实施方案中：
(1)第一寡核苷酸包含交替的2’-甲氧基-核糖核苷酸和2’-氟-核糖核苷酸，其中每个核苷酸为2’-甲氧基-核糖核苷酸或2’-氟-核糖核苷酸；并且在从第一寡核苷酸的5’端起的第2位和第14位的核苷酸不是2’-甲氧基-核糖核苷酸；
(2)第二寡核苷酸包含交替的2’-甲氧基-核糖核苷酸和2’-氟-核糖核苷酸，其中每个核苷酸为2’-甲氧基-核糖核苷酸或2’-氟-核糖核苷酸；并且在从第二寡核苷酸的5’端起的第2位和第14位的核苷酸是2’-甲氧基-核糖核苷酸；
(3)第一寡核苷酸的核苷酸通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键联与相邻核苷酸连接，其中在从3’端起的第1至6位或从3’端起的第1至7位的核苷酸通过硫代磷酸酯键联与相邻核苷酸连接；并且
(4)第二寡核苷酸的核苷酸通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键联与相邻核苷酸连接，其中在从3’端起的第1位和第2位的核苷酸通过硫代磷酸酯键联与相邻核苷酸连接。
在双链RNA的一个实施方案中，第一寡核苷酸比第二寡核苷酸多3至7个核糖核苷酸。
在一个实施方案中，双链RNA包含11至16个碱基对双链体，其中每个碱基对双链体的核苷酸具有不同的化学修饰(例如，一个核苷酸具有2’-氟修饰并且另一个核苷酸具有2’-甲氧基)。
在双链RNA的一个实施方案中，第一寡核苷酸比第二寡核苷酸多3至7个核糖核苷酸。在另一个实施方案中。
在一个实施方案中，第一寡核苷酸是反义链并且第二寡核苷酸是有义链。参见PCT公开No.WO 2016/161388，其通过引用并入本文。
在一个实施方案中，第一或第二寡核苷酸包含一个或更多个具有下式的VP亚基间修饰：
Figure BDA0003584247760000541
8)分支寡核苷酸
如上公开的两种或更多种RNA沉默剂，例如寡核苷酸构建体，例如siRNA，可通过一个或更多个独立地选自接头、间隔区和分支点的部分相互连接，形成包含两种或更多种RNA沉默剂的分支寡核苷酸。图31示出了用于递送两个siRNA的示例性di-siRNA双分支支架。在一些代表性实施方案中，分支寡核苷酸的核酸各自包含反义链(或其部分)，其中反义链与杂合单核苷酸多态性具有充分互补性以介导RNA介导的沉默机制(例如RNAi)。在另一些实施方案中，提供了第二种类型的分支寡核苷酸，其以包含用于沉默反义转录物的有义链(或其部分)的核酸为特征，其中有义链与反义转录物具有充分互补性以介导RNA介导的沉默机制。在另一些实施方案中，提供了第三种类型的分支寡核苷酸，其包括两种类型的核酸，即包含反义链(或其部分)的核酸和包含有义链(或其部分)的寡核苷酸。
在一些示例性实施方案中，分支寡核苷酸可具有通过接头连接的二至八种RNA沉默剂。接头可以是疏水的。在一个具体实施方案中，本申请的分支寡核苷酸具有二至三个寡核苷酸。在一个实施方案中，寡核苷酸独立地具有显著的化学稳定性(例如，至少40％的组成碱基是经化学修饰的)。在一个具体实施方案中，寡核苷酸具有完全的化学稳定性(即，所有的组成碱基都是经化学修饰的)。在一些实施方案中，分支寡核苷酸包含一个或更多个单链硫代磷酸酯化尾，其各自独立地具有二至二十个核苷酸。在一个具体实施方案中，每个单链尾具有八至十个核苷酸。
在某些实施方案中，分支寡核苷酸的特征在于三个特性：(1)分支结构，(2)完全代谢稳定性，和(3)包含硫代磷酸酯接头的单链尾的存在。在一个具体实施方案中，分支寡核苷酸具有2或3个分支。认为分支结构总体尺寸的提高促进摄取的提高。此外，不受特定活性理论的束缚，认为多个相邻分支(例如，2个或3个)允许每个分支协同作用，并因此显著提高内化、转运和释放的速率。
在多种结构不同的实施方案中提供了分支寡核苷酸。例如，如图36所示，在一些实施方案中，分支点处连接的核酸是单链的并且由miRNA抑制剂、间隔聚体、混合聚体、SSO、PMO或PNA组成。这些单链可连接在其3’或5’端。siRNA与单链寡核苷酸的组合也可用于双重功能。在另一个实施方案中，与间隔聚体、混合聚体、miRNA抑制剂、SSO、PMO和PNA互补的短核酸用于携带这些活性单链核酸并增强分布和细胞内化。短的双链体区域具有低的解链温度(Tm约37℃)，以在分支结构内化到细胞中时迅速解离。
如图37所示，Di-siRNA分支寡核苷酸可包含化学上不同的缀合物。缀合的生物活性配体可用于增强细胞特异性并促进膜缔合、内化和血清蛋白结合。用于缀合的生物活性部分的实例包括DHAg2、DHA、GalNAc和胆固醇。这些部分可通过连接接头或间隔区与Di-siRNA连接，或通过与另一个游离siRNA端连接的另外的接头或间隔区添加。
与具有相同化学组成的非分支化合物相比，分支结构的存在将脑中的组织滞留水平提高了超过100倍，这表明了新的细胞滞留和分布机制。分支寡核苷酸出乎意料地在整个脊髓和脑中均匀分布。此外，分支寡核苷酸表现出出乎意料地高效的全身递送至多种组织，以及非常高水平的组织积聚。
分支寡核苷酸包含多种治疗性核酸，包括ASO、miRNA、miRNA抑制剂、剪接转换、PMO、PNA。在一些实施方案中，分支寡核苷酸还包含缀合的疏水部分并且在体外和体内表现出前所未有的沉默和效力。
接头
在分支寡核苷酸的一个实施方案中，每个接头独立地选自乙二醇链、烷基链、肽、RNA、DNA、磷酸酯、膦酸酯、氨基磷酸酯、酯、酰胺、三唑，及其组合；其中接头的任何碳或氧原子任选地被氮原子替代、带有羟基取代基、或带有氧代取代基。在一个实施方案中，每个接头是乙二醇链。在另一个实施方案中，每个接头是烷基链。在另一个实施方案中，每个接头是肽。在另一个实施方案中，每个接头是RNA。在另一个实施方案中，每个接头是DNA。在另一个实施方案中，每个接头是磷酸酯。在另一个实施方案中，每个接头是膦酸酯。在另一个实施方案中，每个接头是氨基磷酸酯。在另一个实施方案中，每个接头是酯。在另一个实施方案中，每个接头是酰胺。在另一个实施方案中，每个接头是三唑。在另一个实施方案中，每个接头是选自图37的式的结构。
9)式(I)化合物
在另一个方面，本文中提供了式(I)的分支寡核苷酸化合物：
L-(N)n
(I)
其中L选自乙二醇链、烷基链、肽、RNA、DNA、磷酸酯、膦酸酯、氨基磷酸酯、酯、酰胺、三唑，及其组合，其中式(I)任选地还包含一个或更多个分支点B，以及一个或更多个间隔区S；其中B对于每次出现独立地为多价有机物质或其衍生物；S对于每次出现独立地选自乙二醇链、烷基链、肽、RNA、DNA、磷酸酯、膦酸酯、氨基磷酸酯、酯、酰胺、三唑，及其组合；N是包含有义链和反义链的RNA双链体，其中反义链包含与基因的包含等位基因多态性的区域基本上互补的互补性区域，其中反义链包含：与等位基因多态性互补的在从5’端起的第2至7位的单核苷酸多态性(SNP)位核苷酸；和与基因中的核苷酸错配的位于距SNP位核苷酸2至11个核苷酸处的错配(MM)位核苷酸。在一些示例性实施方案中，SNP位核苷酸位于从5’端起的第2、4或6位，并且错配(MM)位核苷酸位于距SNP位核苷酸2至6个核苷酸处。
有义链和反义链各自独立地包含一种或更多种化学修饰；并且n为2、3、4、5、6、7或8。
在一个实施方案中，式(I)化合物具有选自表1的式(I-1)至(I-9)的结构。
表1
Figure BDA0003584247760000571
在一个实施方案中，式(I)化合物是式(I-1)。在另一个实施方案中，式(I)化合物是式(I-2)。在另一个实施方案中，式(I)化合物是式(I-3)。在另一个实施方案中，式(I)化合物是式(I-4)。在另一个实施方案中，式(I)化合物是式(I-5)。在另一个实施方案中，式(I)化合物是式(I-6)。在另一个实施方案中，式(I)化合物是式(I-7)。在另一个实施方案中，式(I)化合物是式(I-8)。在另一个实施方案中，式(I)化合物是式(I-9)。
在式(I)化合物的一个实施方案中，每个接头独立地选自乙二醇链、烷基链、肽、RNA、DNA、磷酸酯、膦酸酯、氨基磷酸酯、酯、酰胺、三唑，及其组合；其中接头的任何碳或氧原子任选地被氮原子替代、带有羟基取代基、或带有氧代取代基。在式(I)化合物的一个实施方案中，每个接头是乙二醇链。在另一个实施方案中，每个接头是烷基链。在式(I)化合物的另一个实施方案中，每个接头是肽。在式(I)化合物的另一个实施方案中，每个接头是RNA。在式(I)化合物的另一个实施方案中，每个接头是DNA。在式(I)化合物的另一个实施方案中，每个接头是磷酸酯。在另一个实施方案中，每个接头是膦酸酯。在式(I)化合物的另一个实施方案中，每个接头是氨基磷酸酯。在式(I)化合物的另一个实施方案中，每个接头是酯。在式(I)化合物的另一个实施方案中，每个接头是酰胺。在式(I)化合物的另一个实施方案中，每个接头是三唑。在式(I)化合物的另一个实施方案中，每个接头是选自图36和图38的式的结构。
在式(I)化合物的一个实施方案中，B是多价有机物质。在式(I)化合物的另一个实施方案中，B是多价有机物质的衍生物。在式(I)化合物的一个实施方案中，B是三醇或四醇衍生物。在另一个实施方案中，B是三羧酸或四羧酸衍生物。在另一个实施方案中，B是胺衍生物。在另一个实施方案中，B是三胺或四胺衍生物。在另一个实施方案中，B是氨基酸衍生物。在式(I)化合物的另一个实施方案中，B选自图38的式。
多价有机物质是包含碳和三价或更高价(即，三个或更多个与如上限定的部分例如S、L或N的连接点)的部分。多价有机物质的非限制性实例包括三醇(例如甘油、间苯三酚等)、四醇(例如核糖、季戊四醇、1，2，3，5-四羟基苯等)、三羧酸(例如柠檬酸、1，3，5-环己烷三羧酸、苯均三酸等)、四羧酸(例如乙二胺四乙酸、苯均四酸等)、叔胺(例如三炔丙基胺、三乙醇胺等)、三胺(例如二亚乙基三胺等)、四胺以及包含羟基、硫醇、氨基和/或羧基部分的组合的物质(例如，氨基酸，例如赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸等)。
在式(I)化合物的一个实施方案中，每个核酸包含一个或更多个经化学修饰核苷酸。在式(I)化合物的一个实施方案中，每个核酸由经化学修饰核苷酸组成。在式(I)化合物的某些实施方案中，＞95％、＞90％、＞85％、＞80％、＞75％、＞70％、＞65％、＞60％、＞55％或＞50％的每个核酸包含经化学修饰核苷酸。
在一个实施方案中，每条反义链独立地包含选自表2的基团的5’末端基团R：
表2
Figure BDA0003584247760000591
在一个实施方案中，R是R1。在另一个实施方案中，R是R2。在另一个实施方案中，R是R3。在另一个实施方案中，R是R4。在另一个实施方案中，R是R5。在另一个实施方案中，R是R6。在另一个实施方案中，R是R7。在另一个实施方案中，R是R8。
式(II)结构
在一个实施方案中，式(I)化合物具有式(II)的结构：
Figure BDA0003584247760000601
其中X，对于每次出现，独立地选自腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷及其经化学修饰的衍生物；Y，对于每次出现，独立地选自腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷及其经化学修饰的衍生物；-表示磷酸二酯核苷间键联；＝表示硫代磷酸酯核苷间键联；并且---对于每次出现单独表示碱基配对相互作用或错配。
在某些实施方案中，式(II)的结构不包含错配。在一个实施方案中，式(II)的结构包含1个错配。在另一个实施方案中，式(II)化合物包含2个错配。在另一个实施方案中，式(II)化合物包含3个错配。在另一个实施方案中，式(II)化合物包含4个错配。在一个实施方案中，每个核酸由经化学修饰核苷酸组成。
在某些实施方案中，式(II)结构的＞95％、＞90％、＞85％、＞80％、＞75％、＞70％、＞65％、＞60％、＞55％或＞50％的X是经化学修饰核苷酸。在另一些实施方案中，式(II)结构的＞95％、＞90％、＞85％、＞80％、＞75％、＞70％、＞65％、＞60％、＞55％或＞50％的X是经化学修饰核苷酸。
式(III)的结构
在一个实施方案中，式(I)化合物具有式(III)的结构：
Figure BDA0003584247760000611
其中X，对于每次出现，独立地为包含2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸；X，对于每次出现，独立地为包含2’-O-甲基修饰的核苷酸；Y，对于每次出现，独立地为包含2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸；并且Y，对于每次出现，独立地为包含2’-O-甲基修饰的核苷酸。
在一个实施方案中，X选自2’-脱氧-2’-氟修饰的腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷。在一个实施方案中，X选自2’-O-甲基修饰的腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷。在一个实施方案中，Y选自2’-脱氧-2’-氟修饰的腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷。在一个实施方案中，Y选自2’-O-甲基修饰的腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷。
在某些实施方案中，式(III)的结构不包含错配。在一个实施方案中，式(III)的结构包含1个错配。在另一个实施方案中，式(III)化合物包含2个错配。在另一个实施方案中，式(III)化合物包含3个错配。在另一个实施方案中，式(III)化合物包含4个错配。
式(IV)的结构
在一个实施方案中，式(I)化合物具有式(IV)的结构：
Figure BDA0003584247760000612
其中X，对于每次出现，独立地选自腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷及其经化学修饰的衍生物；Y，对于每次出现，独立地选自腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷及其经化学修饰的衍生物；-表示磷酸二酯核苷间键联；＝表示硫代磷酸酯核苷间键联；并且---对于每次出现单独表示碱基配对相互作用或错配。
在某些实施方案中，式(IV)的结构不包含错配。在一个实施方案中，式(IV)的结构包含1个错配。在另一个实施方案中，式(IV)化合物包含2个错配。在另一个实施方案中，式(IV)化合物包含3个错配。在另一个实施方案中，式(IV)化合物包含4个错配。在一个实施方案中，每个核酸由经化学修饰核苷酸组成。
在某些实施方案中，式(II)结构的＞95％、＞90％、＞85％、＞80％、＞75％、＞70％、＞65％、＞60％、＞55％或＞50％的X是经化学修饰核苷酸。在另一些实施方案中，式(II)结构的＞95％、＞90％、＞85％、＞80％、＞75％、＞70％、＞65％、＞60％、＞55％或＞50％的X是经化学修饰核苷酸。
式(V)的结构
在一个实施方案中，式(I)化合物具有式(V)的结构：
Figure BDA0003584247760000621
其中X，对于每次出现，独立地为包含2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸；X，对于每次出现，独立地为包含2’-O-甲基修饰的核苷酸；Y，对于每次出现，独立地为包含2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸；并且Y，对于每次出现，独立地为包含2’-O-甲基修饰的核苷酸。
在某些实施方案中，X选自2’-脱氧-2’-氟修饰的腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷。在一个实施方案中，X选自2’-O-甲基修饰的腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷。在一个实施方案中，Y选自2’-脱氧-2’-氟修饰的腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷。在一个实施方案中，Y选自2’-O-甲基修饰的腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷。
在某些实施方案中，式(V)的结构不包含错配。在一个实施方案中，式(V)的结构包含1个错配。在另一个实施方案中，式(V)化合物包含2个错配。在另一个实施方案中，式(V)化合物包含3个错配。在另一个实施方案中，式(V)化合物包含4个错配。
可变接头
在式(I)化合物的一个实施方案中，L具有L1的结构：
Figure BDA0003584247760000631
在L1的一个实施方案中，R是R3并且n是2。
在式(II)的结构的一个实施方案中，L具有L1的结构。在式(III)的结构的一个实施方案中，L具有L1的结构。在式(IV)的结构的一个实施方案中，L具有L1的结构。在式(V)的结构的一个实施方案中，L具有L1的结构。在式(VI)的结构的一个实施方案中，L具有L1的结构。在式(VI)的结构的一个实施方案中，L具有L1的结构。
在式(I)化合物的一个实施方案中，L具有L2的结构：
Figure BDA0003584247760000632
在L2的一个实施方案中，R是R3并且n是2。在式(II)的结构的一个实施方案中，L具有L2的结构。在式(III)的结构的一个实施方案中，L具有L2的结构。在式(IV)的结构的一个实施方案中，L具有L2的结构。在式(V)的结构的一个实施方案中，L具有L2的结构。在式(VI)的结构的一个实施方案中，L具有L2的结构。在式(VI)的结构的一个实施方案中，L具有L2的结构。
10)递送系统
在另一个方面，本文中提供了用于具有式(VI)的结构的治疗性核酸的递送系统：
L-(cNA)n
(VI)
其中L选自乙二醇链、烷基链、肽、RNA、DNA、磷酸酯、膦酸酯、氨基磷酸酯、酯、酰胺、三唑，及其组合，其中式(VI)任选地还包含一个或更多个分支点B以及一个或更多个间隔区S；其中B对于每次出现独立地为多价有机物质或其衍生物；S对于每次出现独立地选自乙二醇链、烷基链、肽、RNA、DNA、磷酸酯、膦酸酯、氨基磷酸酯、酯、酰胺、三唑，及其组合；每个cNA独立地为包含一个或更多个化学修饰的载体核酸；并且n为2、3、4、5、6、7或8。
在递送系统的一个实施方案中，L是乙二醇链。在递送系统的另一个实施方案中，L是烷基链。在递送系统的另一个实施方案中，L是肽。在递送系统的另一个实施方案中，L是RNA。在递送系统的另一个实施方案中，L是DNA。在递送系统的另一个实施方案中，L是磷酸酯。在递送系统的另一个实施方案中，L是膦酸酯。在递送系统的另一个实施方案中，L是氨基磷酸酯。在递送系统的另一个实施方案中，L是酯。在递送系统的另一个实施方案中，L是酰胺。在递送系统的另一个实施方案中，L是三唑。
在递送系统的一个实施方案中，S是乙二醇链。在另一个实施方案中，S是烷基链。在递送系统的另一个实施方案中，S是肽。在另一个实施方案中，S是RNA。在递送系统的另一个实施方案中，S是DNA。在递送系统的另一个实施方案中，S是磷酸酯。在递送系统的另一个实施方案中，S是膦酸酯。在递送系统的另一个实施方案中，S是氨基磷酸酯。在递送系统的另一个实施方案中，S是酯。在另一个实施方案中，S是酰胺。在另一个实施方案中，S是三唑。
在递送系统的一个实施方案中，n是2。在递送系统的另一个实施方案中，n是3。在递送系统的另一个实施方案中，n是4。在递送系统的另一个实施方案中，n是5。在递送系统的另一个实施方案中，n是6。在递送系统的另一个实施方案中，n是7。在递送系统的另一个实施方案中，n是8。
在某些实施方案中，每个cNA包含＞95％、＞90％、＞85％、＞80％、＞75％、＞70％、>65％、＞60％、＞55％或＞50％的经化学修饰核苷酸。
在一个实施方案中，式(VI)化合物具有选自表3的式(VI-1)至(VI-9)的结构：
表3
Figure BDA0003584247760000651
在一个实施方案中，式(VI)化合物是式(VI-1)的结构。在一个实施方案中，式(VI)化合物是式(VI-2)的结构。在一个实施方案中，式(VI)化合物是式(VI-3)的结构。在一个实施方案中，式(VI)化合物是式(VI-4)的结构。在一个实施方案中，式(VI)化合物是式(VI-5)的结构。在一个实施方案中，式(VI)化合物是式(VI-6)的结构。在一个实施方案中，式(VI)化合物是式(VI-7)的结构。在一个实施方案中，式(VI)化合物是式(VI-8)的结构。在一个实施方案中，式(VI)化合物是式(VI-9)的结构。
在一个实施方案中，式(VI)化合物(包括，例如，式(VI-1)至(VI-9)，每个cNA独立地包含至少15个连续核苷酸。在一个实施方案中，每个cNA独立地由经化学修饰核苷酸组成。
在一个实施方案中，递送系统还包含n个治疗性核酸(nucleic acid，NA)，其中每个NA包含与基因的包含等位基因多态性的区域基本上互补的互补性区域，其中反义链包含：与等位基因多态性互补的在从5’端起的第2至7位的单核苷酸多态性(SNP)位核苷酸；和与基因中的核苷酸错配的位于距SNP位核苷酸2至11个核苷酸处的错配(MM)位核苷酸。在一些示例性实施方案中，SNP位核苷酸位于从5’端起的第2、4或6位，并且错配(MM)位核苷酸位于距SNP位核苷酸2至6个核苷酸处。此外，每个NA都与至少一个cNA杂交。在一个实施方案中，递送系统由2个NA构成。在另一个实施方案中，递送系统由3个NA构成。在另一个实施方案中，递送系统由4个NA构成。在另一个实施方案中，递送系统由5个NA构成。在另一个实施方案中，递送系统由6个NA构成。在另一个实施方案中，递送系统由7个NA构成。在另一个实施方案中，递送系统由8个NA构成。
在一个实施方案中，每个NA独立地包含至少16个连续核苷酸。在一个实施方案中，每个NA独立地包含16至20个连续核苷酸。在一个实施方案中，每个NA独立地包含16个连续核苷酸。在另一个实施方案中，每个NA独立地包含17个连续核苷酸。在另一个实施方案中，每个NA独立地包含18个连续核苷酸。在另一个实施方案中，每个NA独立地包含19个连续核苷酸。在另一个实施方案中，每个NA独立地包含20个连续核苷酸。
在一个实施方案中，每个NA包含至少2个核苷酸的未配对突出端。在另一个实施方案中，每个NA包含至少3个核苷酸的未配对突出端。在另一个实施方案中，每个NA包含至少4个核苷酸的未配对突出端。在另一个实施方案中，每个NA包含至少5个核苷酸的未配对突出端。在另一个实施方案中，每个NA包含至少6个核苷酸的未配对突出端。在一个实施方案中，突出端的核苷酸通过硫代磷酸酯键联连接。
在一个实施方案中，每个NA独立地选自：DNA、siRNA、antagomiR、miRNA、间隔聚体、混合聚体或指导RNA。在一个实施方案中，每个NA独立地为DNA。在另一个实施方案中，每个NA独立地为siRNA。在另一个实施方案中，每个NA独立地为antagomiR。在另一个实施方案中，每个NA独立地为miRNA。在另一个实施方案中，每个NA独立地为间隔聚体。在另一个实施方案中，每个NA独立地为混合聚体。在另一个实施方案中，每个NA独立地为指导RNA。在一个实施方案中，每个NA是相同的。在一个实施方案中，每个NA是不相同的。
在一个实施方案中，还包含n个治疗性核酸(NA)的递送系统具有选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)及其在本文中所述实施方案的结构。在一个实施方案中，递送系统具有选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)及其在本文中所述实施方案的结构，其还包含2个治疗性核酸(NA)。在另一个实施方案中，递送系统具有选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)及其在本文中所述实施方案的结构，其还包含3个治疗性核酸(NA)。在一个实施方案中，递送系统具有选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)及其在本文中所述实施方案的结构，其还包含4个治疗性核酸(NA)。在一个实施方案中，递送系统具有选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)及其在本文中所述实施方案的结构，其还包含5个治疗性核酸(NA)。在一个实施方案中，递送系统具有选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)及其在本文中所述实施方案的结构，其还包含6个治疗性核酸(NA)。在一个实施方案中，递送系统具有选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)及其在本文中所述实施方案的结构，其还包含7个治疗性核酸(NA)。在一个实施方案中，递送系统具有选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)及其在本文中所述实施方案的结构，其还包含8个治疗性核酸(NA)。
在一个实施方案中，递送系统具有选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)的结构，其还包含其中R是R3并且n是2的结构L1或L2的接头。在另一个实施方案中，递送系统具有选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)的结构，其还包含其中R是R3并且n是2的结构L1的接头。在另一个实施方案中，递送系统具有选自式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)的结构，其还包含其中R是R3并且n是2的结构L2的接头。
药物组合物和施用方法
在一个方面，本文中提供了药物组合物，其包含治疗有效量的一种或更多种如本文中所述的化合物、寡核苷酸或核酸以及可药用载体。在一个实施方案中，药物组合物包含一种或更多种如本文中所述的双链的经化学修饰核酸以及可药用载体。在一个具体实施方案中，药物组合物包含一种如本文中所述的双链的经化学修饰核酸以及可药用载体。在另一个具体实施方案中，药物组合物包含两种如本文中所述的双链的经化学修饰核酸以及可药用载体。
在一个具体实施方案中，药物组合物包含双链RNA分子，其包含与基因的编码杂合SNP突变体蛋白的区域互补的约15至35个核苷酸和包含与第一链互补的约15至35个核苷酸的第二链，所述区域包含等位基因多态性，其中dsRNA分子包含不在等位基因多态性位置的错配；并且错配和对应于多态性的核苷酸不在dsRNA分子的中心。
在一个实施方案中，错配是上游4个核苷酸、对应于等位基因多态性的核苷酸的上游3个核苷酸、对应于等位基因多态性的核苷酸的上游2个核苷酸、上游1个核苷酸、对应于等位基因多态性的核苷酸的下游1个核苷酸、对应于等位基因多态性的核苷酸的下游2个核苷酸、对应于等位基因多态性的核苷酸的下游3个核苷酸、对应于等位基因多态性的核苷酸的下游4个核苷酸、或对应于等位基因多态性的核苷酸的下游5个核苷酸。在某些实施方案中，错配不与对应于等位基因多态性的核苷酸相邻。
在药物组合物的另一个实施方案中，双链RNA包含在从5’端起的第2、3、4、5或6位的对应于等位基因多态性的核苷酸。在一个实施方案中，对应于等位基因多态性的核苷酸在从5’端起的第2位。在一个实施方案中，对应于等位基因多态性的核苷酸在从5’端起的第3位。在一个实施方案中，对应于等位基因多态性的核苷酸在从5’端起的第4位。在一个实施方案中，对应于等位基因多态性的核苷酸在从5’端起的第5位。在一个实施方案中，对应于等位基因多态性的核苷酸在从5’端起的第6位。
在药物组合物的一个实施方案中，双链RNA选择性地使具有等位基因多态性例如杂合SNP的突变等位基因沉默。在药物组合物的一个实施方案中，双链RNA使具有等位基因多态性的突变等位基因沉默并且不影响同一基因的野生型等位基因。在药物组合物的另一个实施方案中，本文中提供的双链RNA使具有等位基因多态性的突变等位基因沉默并且对同一基因的野生型等位基因的沉默程度低于突变等位基因。
本公开内容的药物组合物配制成与其预期施用途径相容。施用途径的一些实例包括：肠胃外例如静脉内(IV)、皮内、皮下(SC或SQ)、腹膜内、肌内、经口(例如吸入)、经皮(表面)和经黏膜施用。用于肠胃外、皮内或皮下施加的溶液剂或混悬剂可包含以下组分：无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调节张度(tonicity)的试剂例如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱(例如盐酸或氢氧化钠)调节pH。肠胃外制剂可封装在安瓿、一次性注射器或者由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
适于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在可溶于水的情况下)或分散体，以及用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应是存在易注射性程度的流体。其在制备和储存条件下必须是稳定的，并且必须抵御微生物(例如细菌和真菌)的污染作用而保存。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，及其合适混合物。恰当的流动性可以(例如)通过使用包衣(如卵磷脂)来维持，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小来维持，以及通过使用表面活性剂来维持。通过多种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等)可实现防止微生物的作用。在许多情况下，将期望在组合物中包含等张剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物与上面列举的成分之一或组合(根据需要)一起并入合适的溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常来说，分散体通过将活性化合物并入到无菌载剂中来制备，所述无菌载剂包含基础分散介质和来自上面列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，典型的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加上来自其先前经无菌过滤溶液的任何另外的期望成分的粉末。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人的一系列剂量。这样的化合物的剂量通常应在包括ED50的一系列循环浓度内，具有很小的毒性或没有毒性。根据所采用的剂型和所使用的施用途径，剂量可在此范围内变化。对于本公开内容的方法中使用的任何化合物，可从细胞培养测定初步估计治疗有效剂量。可在动物模型中配制剂量以实现包含如在细胞培养中确定的EC50(即，实现半数最大响应的受试化合物浓度)的循环血浆浓度范围。这样的信息可用于更准确地确定在人中的可用剂量。例如，可通过高效液相色谱法测量血浆中的水平。
治疗方法
本公开内容提供了治疗处于全部或部分由等位基因多态性(例如杂合SNP)引起的疾病或病症的风险之中(或易患所述疾病或病症)的对象的预防和治疗方法二者。在一个实施方案中，疾病或病症是三核苷酸重复疾病或病症。在另一个实施方案中，疾病或病症是多聚谷氨酰胺病症。在一个实施方案中，所述方法包括施用治疗有效量的本文中提供的双链RNA分子。在一个实施方案中，疾病或病症是与亨廷顿蛋白表达相关的病症，并且其中亨廷顿蛋白的改变(尤其是CAG重复拷贝数的扩增)导致亨廷顿蛋白基因(结构或功能)或亨廷顿蛋白(结构或功能或表达)的缺陷，使得临床表现包括在亨廷顿病患者中所见的那些。
在该方法的一些实施方案中，本文中公开的双链RNA与等位基因多态性同源，不同之处在于在相对于对应于等位基因多态性的核苷酸的特定位置处的一个错配寡核苷酸。在某些实施方案中，错配在对应于等位基因多态性的核苷酸的约6个核苷酸内、在对应于等位基因多态性的核苷酸的约5个核苷酸内、在对应于等位基因多态性的核苷酸的约4个核苷酸内、在对应于等位基因多态性的核苷酸的约3个核苷酸内、在对应于等位基因多态性的核苷酸的约2个核苷酸内、或在对应于等位基因多态性的核苷酸的约1个核苷酸内。在一些特别示例性的实施方案中，错配不与对应于等位基因多态性的核苷酸相邻。
在该方法的另一个实施方案中，双链RNA包含在从5’端起的第2、3、4、5或6位的对应于等位基因多态性的核苷酸。在一个实施方案中，对应于等位基因多态性的核苷酸在从5’端起的第2位。在一个实施方案中，对应于等位基因多态性的核苷酸在从5’端起的第3位。在一个实施方案中，对应于等位基因多态性的核苷酸在从5’端起的第4位。在一个实施方案中，对应于等位基因多态性的核苷酸在从5’端起的第5位。在一个实施方案中，对应于等位基因多态性的核苷酸在从5’端起的第6位
在该方法的一个实施方案中，dsRNA包含在从5’端起的第6位的对应于多态性的核苷酸和在从5’端起的第11位的错配。在该方法的一个实施方案中，dsRNA包含在从5’端起的第4位的对应于多态性的核苷酸和在从5’端起的第7位的错配。
在该方法的另一个实施方案中，双链RNA选择性地使具有等位基因多态性的突变等位基因沉默。在一个实施方案中，双链RNA使具有等位基因多态性的突变等位基因沉默并且不影响同一基因的野生型等位基因。在另一个实施方案中，双链RNA使具有等位基因多态性的突变等位基因沉默并且对同一基因的野生型等位基因的沉默程度低于突变等位基因。
在该方法的一个实施方案中，dsRNA包含一个或更多个VP亚基间键联修饰，其中亚基间键联具有下式：
Figure BDA0003584247760000711
在另外的一些实施方案中，dsRNA包含图43所示的亚基间键联修饰中的一种或更多种。
本文中使用的“治疗”定义为向患者施加或施用治疗剂(例如，RNA剂或载体或编码其的转基因)，或者向来自患者的分离的组织或细胞系施加或施用治疗剂，所述患者患有疾病或病症、具有疾病或病症的症状或者对疾病或病症具有倾向，目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改良、改善或影响疾病或病症、疾病或病症的症状或者对疾病的倾向。
在一个方面，本公开内容提供了用于通过向对象施用治疗剂(例如，RNAi剂或载体或编码其的转基因)在对象中预防如上所述的疾病或病症的方法。处于疾病风险中的对象可通过例如本文中所述的诊断或预后测定中的任一种或组合来鉴定。预防剂的施用可在疾病或病症的特征性症状表现之前发生以使得预防疾病或病症或者替代地延迟其进展。
本公开内容的另一个方面涉及治疗性地治疗对象，即改变疾病或病症的症状的发作的方法。在一个示例性实施方案中，本公开内容的调节方法涉及使表达功能获得性突变体的细胞与对基因内的一个或更多个靶序列具有特异性的治疗剂(例如，RNAi剂或载体或编码其的转基因)接触以使得实现对基因的序列特异性干扰。这些方法可在体外(例如，通过用药剂培养细胞)，或者作为替代地在体内(例如，通过向对象施用药剂)进行。
经修饰以增强在神经细胞中的摄取的RNA沉默剂可以以以下单位剂量施用：小于约1.4mg/kg体重，或者小于10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005或0.00001mg/kg体重，以及小于200纳摩尔的RNA剂(例如，约4.4×1016个拷贝)/kg体重，或者小于1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075或0.00015纳摩尔的RNA沉默剂/kg体重。例如，单位剂量可通过注射(例如，静脉内或肌内、鞘内或直接注射到脑中)、吸入给药或表面施加来施用。在一些示例性实施方案中，剂量小于2、1或0.1mg/kg体重。
将RNA沉默剂直接递送至器官(例如，直接递送至脑)的剂量可以是大约约0.00001mg至约3mg/器官、或约0.0001至0.001mg/器官、约0.03至3.0mg/器官、约0.1至3.0mg/器官或者约0.3至3.0mg/器官。剂量可以是有效治疗或预防神经疾病或病症(例如，亨廷顿病)的量。在一个实施方案中，单位剂量的施用频率低于每天一次，例如低于每2、4、8或30天一次。在另一个实施方案中，单位剂量不以频率施用(例如，不是常规频率)。例如，单位剂量可单次施用。在一个实施方案中，有效剂量与其他传统治疗方式一起施用。
在一个实施方案中，向对象施用初始剂量和一个或更多个维持剂量的RNA沉默剂。维持剂量通常低于初始剂量，例如初始剂量的一半少。维持方案可包括用每天0.01μg至1.4mg/kg体重，例如每天10、1、0.1、0.01、0.001或0.00001mg/kg体重的剂量治疗对象。维持剂量通常不超过每5、10或30天施用一次。此外，治疗方案可持续一段时间，该时间段将根据特定疾病的性质、其严重程度和患者的总体状况而变化。在一些具体实施方案中，剂量可不超过每天递送一次，例如不超过每24、36、48小时或更多小时递送一次，例如不超过每5或8天递送一次。治疗之后，可监测患者病症的变化和疾病状态症状的缓解。在患者对当前剂量水平没有显著响应的情况下，可提高化合物的剂量，或者如果观察到疾病状态的症状得到缓解、如果疾病状态已经消除、或如果观察到不期望的副作用，则可降低剂量。
亨廷顿病
在本公开内容的某些方面，RNA沉默剂被设计成靶向在突变体人亨廷顿蛋白(htt)中的多态性(例如，杂合单核苷酸多态性)以治疗亨廷顿病。因此，在另一个方面，本文中提供了治疗或管理亨廷顿病的方法，其包括向需要这样的治疗或管理的患者施用治疗有效量的本文中所述的化合物、寡核苷酸或核酸，或者包含所述化合物、寡核苷酸或核酸的药物组合物。
作为常染色体显性疾病遗传的亨廷顿病导致认知受损和运动疾病。在因饥饿或感染而过早死亡之前，患者可在严重衰弱的情况下生活超过十年。大多数病例在40岁或50岁开始发病，但一部分患者在青少年时期出现疾病。亨廷顿病的基因突变是亨廷顿蛋白基因中加长的CAG重复。在正常个体中，CAG重复的数目从8至35个拷贝不等(Kremer et al.，1994)。基因突变(例如，CAG重复的长度从正常亨廷顿蛋白基因中的少于36个提高到疾病中的超过36个)与具有超过36个连续多聚谷氨酰胺残基的突变体亨廷顿蛋白的合成有关(Aronin et al.，1995)。通常来说，具有36个或更多个CAG重复的个体会患上亨廷顿病。作为以CAG加长为潜在突变的多至20种其他疾病的原型，亨廷顿病仍然没有有效的治疗。多种干预——例如中断凋亡途径、添加试剂以提高线粒体效率和阻断NMDA受体——已在亨廷顿病的细胞培养和小鼠模型中显示出前景。然而，这些方法最多只显示出细胞或动物存活的短暂延长。
与亨廷顿病相关的疾病基因被称为亨廷顿蛋白或(htt)。亨廷顿蛋白基因座很大，跨越180kb，并且由67个外显子组成。亨廷顿蛋白基因广泛表达并且是正常发育所必需的。其以在多种胎儿和成人组织中显示出不同的相对丰度的2种替代的多腺苷酸化形式表达。较大的转录本为约13.7kb，并且主要在成人和胎儿脑中表达，而约10.3kb的较小的转录本表达更广泛。两种转录本就其3’非翻译区而言是不同的(Lin et al.，1993)。预计这两种信息都将编码含有3144个氨基酸的348千道尔顿蛋白质。认为导致亨廷顿病的遗传缺陷赋予mRNA新的特性或改变蛋白质的功能。
亨廷顿病符合遗传学的中心法则：突变基因用作产生突变mRNA的模板；然后突变mRNA指导突变体蛋白的合成(Aronin et al.，1995；DiFiglia et al.，1997)。突变体亨廷顿蛋白(蛋白质)可在纹状体和皮质的选择性神经元中积聚，破坏尚未确定的细胞活动，并导致神经元功能障碍和死亡(Aronin et al.，1999；Laforet et al.，2001)。因为突变基因的单个拷贝就足以引起亨廷顿病，最节俭(parsimonious)的治疗就会使突变基因失效。理论方法可包括停止突变体亨廷顿蛋白的基因转录、破坏突变mRNA和阻断翻译。每个都具有相同的结果——突变体亨廷顿蛋白的丧失。
亨廷顿SNP
根据某些示例性实施方案的适用于靶向的亨廷顿蛋白基因序列中的示例性SNP在下表4中公开。可在例如NCBI维护的公众可获取的“SNP Entrez”数据库中找到每个SNP位点的基因组序列。HD患者和对照DNA的每个SNP位点的杂合频率在表4进一步示出。靶向频繁杂合SNP的组合允许使用相对较少数目的等位基因特异性RNA沉默剂来治疗HD群体中大百分比的个体。
表4.Htt SNP。
Figure BDA0003584247760000741
在一个实施方案中，本公开内容的RNA沉默剂能够靶向表4中列出的一个或更多个SNP位点。在一个实施方案中，本公开内容的RNA沉默剂能够靶向亨廷顿蛋白mRNA的rs363125 SNP位点。在另一个实施方案中，本公开内容的RNA沉默剂能够靶向亨廷顿蛋白mRNA的rs362273 SNP位点。在另一个实施方案中，本公开内容的RNA沉默剂能够靶向亨廷顿蛋白mRNA的rs362307 SNP位点。在另一个实施方案中，本公开内容的RNA沉默剂能够靶向亨廷顿蛋白mRNA的rs362336 SNP位点。在另一个实施方案中，本公开内容的RNA沉默剂能够靶向亨廷顿蛋白mRNA的rs362331 SNP位点。在另一个实施方案中，本公开内容的RNA沉默剂能够靶向亨廷顿蛋白mRNA的rs362272 SNP位点。在另一个实施方案中，本公开内容的RNA沉默剂能够靶向亨廷顿蛋白mRNA的rs362306 SNP位点。在另一个实施方案中，本公开内容的RNA沉默剂能够靶向亨廷顿蛋白mRNA的rs362268 SNP位点。在另一个实施方案中，本公开内容的RNA沉默剂能够靶向亨廷顿蛋白mRNA的rs362267 SNP位点。在另一个实施方案中，本公开内容的RNA沉默剂能够靶向亨廷顿蛋白mRNA的rs363099 SNP位点。在一些实施方案中，RNA沉默剂所靶向的SNP位点与亨廷顿病相关。在一些特别示例性的实施方案中，RNA沉默剂所靶向的SNP位点与亨廷顿病显著相关。
在另外的一些示例性实施方案中，RNA沉默剂包含表5至7的序列中的一种或更多种：
表5
Figure BDA0003584247760000751
表6
Figure BDA0003584247760000761
表7
Figure BDA0003584247760000762
在表5至7的某些实施方案中，U核苷酸可用T核苷酸替代。
递送核酸的方法
本公开内容的RNA沉默剂可直接引入细胞(例如，神经细胞)中(即，胞内)；或胞外地引入腔、间质空间、生物体的循环中，经口引入，或可通过将细胞或生物体浸入含有核酸的溶液中而引入。血管或血管外循环、血液或淋巴系统以及脑脊液是可引入核酸的部位。
本公开内容的RNA沉默剂可使用本领域已知的核酸递送方法引入，包括注射含有核酸的溶液、用被核酸覆盖的粒子轰击、将细胞或生物体浸泡在核酸的溶液中、或在核酸存在下对细胞膜进行电穿孔。可使用本领域已知的用于将核酸引入细胞的另一些方法，例如脂质介导的载体转运、化学介导的转运和阳离子脂质体转染，例如磷酸钙等。可将核酸与表现出一种或更多种以下活性的其他组分一起引入：增强细胞对核酸的摄取或以其他方式提高对靶基因的抑制。
引入核酸的物理方法包括注射含有RNA的溶液、用被RNA覆盖的粒子轰击、将细胞或生物体浸泡在RNA的溶液中、或在RNA存在下对细胞膜进行电穿孔。包装到病毒颗粒中的病毒构建体将实现表达构建体向细胞中的有效引入以及由表达构建体编码的RNA的转录二者。可使用本领域已知的用于将核酸引入细胞的另一些方法，例如脂质介导的载体转运、化学-IS介导的转运，例如磷酸钙等。因此，可将RNA与表现出一种或更多种以下活性的组分一起引入：增强细胞对RNA的摄取、抑制单链退火、稳定单链或以其他方式提高对靶基因的抑制。
RNA可直接引入细胞中(即，胞内)；或胞外地引入腔、间质空间、生物体的循环中，经口引入，或可通过将细胞或生物体浸入含有RNA的溶液中而引入。血管或血管外循环、血液或淋巴系统以及脑脊液是可引入RNA的部位。
具有靶基因的细胞可来自种系或体细胞、全能或多能、分裂或非分裂、实质或上皮、永生化或经转化的等。细胞可以是干细胞或分化细胞。分化的细胞类型包括脂肪细胞、成纤维细胞、肌细胞、心肌细胞、内皮细胞、神经元、胶质、血细胞、巨核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、白细胞、粒细胞、角质形成细胞、软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、肝细胞以及内分泌或外分泌腺细胞。
取决于特定的靶基因和所递送的双链RNA物质的剂量，该过程可提供对靶基因功能的部分或完全丧失。至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更多的靶细胞中基因表达的降低或丧失是示例性的。基因表达的抑制是指来自靶基因的蛋白质和/或mRNA产物的水平不存在(或可观察到的降低)。特异性是指抑制靶基因而不对细胞的其他基因产生明显影响的能力。可通过对细胞或生物体的外在特性的检查(如下面的实施例中所示)或者通过生物化学技术(例如RNA溶液杂交、核酸酶保护、Northern杂交、逆转录、使用微阵列的基因表达监测、抗体结合、酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、Western印迹、放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)、其他免疫测定、荧光激活细胞分析(fluorescence activated cell analysis，FACS)等)来确认抑制的结果。
对于在细胞系或整个生物体中的RNA介导的抑制，可通过使用易于测定蛋白质产物的报道基因或耐药性基因来方便地测定基因表达。这样的报道基因包括乙酰羟基酸合酶(acetohydroxyacid synthase，AHAS)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β葡萄糖醛酸苷酶(GUS)、氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicolacetyltransferase，CAT)、绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)、萤光素酶(Luc)、胭脂碱合酶(nopaline synthase，NOS)、章鱼碱合酶(octopine synthase，OCS)、及其衍生物。可获得多种选择标志物，其赋予了对氨苄西林、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、膦丝菌素、嘌呤霉素和四环素的抗性。取决于测定，基因表达量的定量允许确定抑制程度，其与未根据本公开内容进行处理的细胞相比大于10％、33％、50％、90％、95％或99％。较低剂量的注射材料和施用RNAi剂之后的较长时间可导致对较小部分细胞(例如，至少10％、20％、50％、75％、90％或95％的靶细胞)的抑制。细胞中基因表达的定量可在靶mRNA的积聚或靶蛋白的翻译的水平上显示出相似的抑制量。例如，抑制效率可通过评估细胞中基因产物的量来确定。可用具有用于抑制性双链RNA的区域之外的核苷酸序列的杂交探针来检测mRNA，或者可用针对该区域的多肽序列产生的抗体来检测翻译的多肽。
RNA可以以允许递送至少一个拷贝/细胞的量引入。更高剂量(例如，至少5、10、100、500或1000个拷贝/细胞)的物质可产生更有效的抑制；更低剂量也可对特定应用有用。
在一个具体方面，测试本公开内容的RNAi剂(例如，靶向突变基因中的多态性的siRNA)关于其特异性降解细胞中，特别是神经元(例如纹状体或皮质神经元克隆系和/或原代神经元)中突变mRNA的能力的效力。其他可容易转染的细胞(例如HeLa细胞或COS细胞)也适用于基于细胞的验证测定。用人野生型或突变cDNA(例如人野生型或突变体亨廷顿蛋白cDNA)转染细胞。共转染标准siRNA、经修饰siRNA或能够从U环mRNA产生siRNA的载体。测量到突变mRNA(例如，突变体亨廷顿蛋白mRNA)和/或突变体蛋白(例如，突变体亨廷顿蛋白)的选择性降低。突变mRNA或蛋白质的降低可与正常mRNA或蛋白质的水平进行比较。出于比较目的，可测定外源引入的正常mRNA或蛋白质(或内源性正常mRNA或蛋白质)。当使用已知对标准转染技术有一定抗性的神经元细胞时，可期望通过被动摄取引入RNAi剂(例如siRNA)。
在某些示例性实施方案中，包含本公开内容的RNA剂(例如dsRNA剂)的组合物可通过多种途径递送至对象的神经系统。示例性途径包括鞘内、实质(例如，在脑中)、经鼻和经眼递送。组合物还可全身递送，例如通过静脉内、皮下或肌内注射，这对于将RNA剂(例如dsRNA剂)递送至外周神经元特别有用。示例性的递送途径是直接递送至脑，例如，递送至脑的脑室或下丘脑中，或递送至脑的外侧或背侧区域中。用于神经细胞递送的RNA剂(例如dsRNA剂)可掺入适用于施用的药物组合物中。
例如，组合物可包含一种或更多种RNA剂(例如dsRNA剂)和可药用载体。本公开内容的药物组合物可以以许多方式施用，这取决于期望局部治疗还是全身治疗以及取决于待治疗的区域。施用可以是局部的(包括眼用的、鼻内的、经皮的)、经口的或肠胃外的。肠胃外施用包括静脉内滴注、皮下、腹膜内或肌内注射、鞘内或室内(intraventricular)(例如，脑室内)施用。在某些示例性实施方案中，使用本文中所述的多种合适的组合物和方法将本公开内容的RNA沉默剂递送穿过血脑屏障(Blood-Brain-Barrier，BBB)。
递送途径可取决于患者的病症。例如，可将本公开内容的抗htt RNA剂(例如dsRNA剂)直接施用到诊断出患有亨廷顿病的对象的脑中(例如，施用到基底神经节的苍白球或纹状体中以及靠近纹状体的中型多棘神经元)。除本公开内容的RNA沉默剂之外，可向患者施用第二治疗，例如姑息性治疗和/或疾病特异性治疗。第二治疗可以是例如对症的(symptomatic)(例如，用于缓解症状)、神经保护性的(例如，用于减缓或停止疾病进展)或恢复性的(例如，用于逆转疾病过程)。对于亨廷顿病的治疗，例如，对症治疗可包括药物氟哌啶醇、卡马西平或丙戊酸盐。另一些治疗可包括心理治疗、物理治疗、言语治疗、交流和记忆辅助、社会支持服务和饮食建议。
RNA剂(例如dsRNA剂)可被递送至脑的神经细胞。可使用不需要组合物穿过血脑屏障的递送方法。例如，可通过直接注射到含有受疾病影响的细胞的区域中来将含有RNA剂(例如dsRNA剂)的药物组合物递送至患者。例如，药物组合物可通过直接注射到脑中来递送。可通过立体定向注射到脑的特定区域(例如，黑质、皮质、海马、纹状体或苍白球)进行注射。RNA剂(例如dsRNA剂)可被递送到中枢神经系统的多个区域中(例如，递送到脑的多个区域中和/或脊髓中)。RNA剂(例如dsRNA剂)可被递送到脑的扩散区域中(例如，扩散递送至脑的皮质)。
在一个实施方案中，RNA剂(例如dsRNA剂)可通过一端被植入到组织(例如脑，例如脑的黑质、皮质、海马、纹状体或苍白球)中的套管或其他递送装置递送。套管可连接到RNA剂(例如dsRNA剂)的储器。流动或递送可由泵，例如渗透泵或微泵，例如Alzet泵(Durect，Cupertino，CA)介导。在一个实施方案中，将泵和储器植入远离组织的区域，例如在腹部，并且递送受到从泵或储器通向释放部位的导管的影响。用于递送至脑的装置例如在美国专利No.6,093,180和5,814,014中进行了描述。
可进一步修饰本公开内容的RNA剂(例如dsRNA剂)以使得其能够穿过血脑屏障。例如，RNA剂(例如dsRNA剂)可与使该剂能够穿过屏障的分子缀合。例如，这样的经修饰的RNA剂(例如dsRNA剂)可通过任何期望的方法(例如通过室内或肌内注射，或通过肺部递送)来施用。
在某些实施方案中，使用外排体来递送本公开内容的RNA剂(例如dsRNA剂)。在全身注射之后，外排体可穿过BBB并将siRNA、反义寡核苷酸、化学治疗剂和蛋白质特异性地递送至神经元(参见Alvarez-Erviti L，Seow Y，Yin H，Betts C，Lakhal S，Wood MJ.(2011).Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targetedexosomes.Nat Biotechnol.2011 Apr；29(4)：341-5.doi：10.1038/nbt.1807；El-Andaloussi S，Lee Y，Lakhal-Littleton S，Li J，SeoW Y，Gardiner C，Alvarez-ErvitiL，Sargent IL，Wood MJ.(2011).Exosome-mediated delivery of siRNA in Vitro andin Vivo.Nat Protoc.2012 Dec；7(12)：2112-26.doi：10.1038/nprot.2012.131；ELAndaloussi S，
Figure BDA0003584247760000801
I，Breakefield XO，Wood MJ.(2013).Extracellular vesicles：biology and emerging therapeutic opportunities.Nat Rev Drug Discov.2013 May；12(5)：347-57.doi：10.1038/nrd3978；El Andaloussi S，Lakhal S，
Figure BDA0003584247760000811
I，Wood MJ.(2013).Exosomes for targeted siRNA delivery across biologicalbarriers.AdV.Drug DeliV Rev.2013 Mar；65(3)：391-7.doi：10.1016/j.addr.2012.08.008)。
在某些实施方案中，使用一种或更多种亲脂性分子以允许将本公开内容的RNA剂(例如dsRNA剂)递送通过BBB(Alvarez-Ervit(2011))。然后RNA沉默剂将被激活，例如，通过酶降解亲脂性伪装物将药物释放为其活性形式而被激活。
在某些实施方案中，可使用一种或更多种受体介导的透化化合物来提高BBB的透过性以允许递送本公开内容的RNA沉默剂。这些药物通过提高血液中的渗透压(其使内皮细胞之间的紧密连接放松)来暂时提高BBB的透过性(El-Andaloussi(2012))。通过使紧密连接放松，可进行正常的RNA沉默剂静脉内注射。
在某些实施方案中，使用基于纳米粒的递送系统将本公开内容的RNA剂(例如dsRNA剂)递送穿过BBB。本文中使用的“纳米粒”是指通常为固体、可生物降解的胶体系统的聚合物纳米粒，其已作为药物或基因载体被广泛研究(S.P.Egusquiaguirre，M.Igartua，R.M.Hernandez，and J.L.Pedraz，“Nanoparticle delivery systems for cancertherapy：adVances in clinical and preclinical research，”Clinical andTranslational Oncology，vol.14，no.2，pp.83-93，2012)。聚合物纳米粒分为两大类，天然聚合物和合成聚合物。用于siRNA递送的天然聚合物包括但不限于环糊精、壳聚糖和去端胶原蛋白(atelocollagen)(Y.Wang，Z.Li，Y.Han，L.H.Liang，and A.Ji，“Nanoparticle-based deliVery system for application of siRNA in vivo，”Current DrugMetabolism，vol.11，no.2，pp.182-196，2010)。合成聚合物包括但不限于聚乙烯亚胺(PEI)、聚(dl-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和树状聚合物，其已被深入研究(X.Yuan，S.Naguib，and Z.Wu，“Recent advances Of siRNA delivery by nanoparticles，”ExpertOpinion on Drug Delivery，v0l.8，no.4，pp.521-536，2011)。有关纳米粒和其他合适递送系统的综述，请参见Jong-Min Lee，Tae-Jong Yoon，and Young-Seok Cho，“RecentDevelopments in Nanoparticle-Based siRNA Delivery for Cancer Therapy，”BioMedResearch International，vol.2013，Article ID782041，10pages，2013.doi：10.1155/2013/782041(通过引用整体并入。)
本公开内容的RNA剂(例如dsRNA剂)可经眼施用，例如以治疗视网膜病症，例如视网膜病变。例如，可将药物组合物施加于眼或附近组织的表面，例如眼睑的内部。其可表面施加，例如通过喷雾、以滴剂形式、作为洗眼剂或软膏剂。可通过本领域已知的眼部递送系统(例如涂药器(applicator)或滴眼器(eye dropper))来递送软膏剂或可滴液体剂。这样的组合物可包括黏液模拟物(mucomimetic)，例如透明质酸、硫酸软骨素、羟丙基甲基纤维素或聚(乙烯醇)；防腐剂，例如山梨酸、EDTA或苄基氯化铬(benzylchronium chloride)，以及通常量的稀释剂和/或载体。药物组合物也可施用于眼的内部，并且可通过针或其他可将其引入选定区域或结构的递送装置来引入。包含RNA沉默剂的组合物也可通过眼贴剂(ocular patch)来施加。
通常来说，本公开内容的RNA剂(例如dsRNA剂)可通过任何合适的方法来施用。本文中使用的表面递送可指将RNA剂(例如dsRNA剂)直接施加到身体的任何表面，包括眼、黏膜、体腔表面或任何内表面。用于表面施用的制剂可包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、喷剂和液体剂。常规的药物载体，水性、粉末或油性基质，增稠剂等可以是必要的或期望的。表面施用也可用作选择性地将RNA剂(例如dsRNA剂)递送至对象的表皮或真皮、或递送至其特定层、或递送至下层组织的手段。
用于鞘内或室内(例如，脑室内)施用的组合物可包括无菌水溶液，其也可包含缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂。用于鞘内或室内施用的组合物通常不包含转染试剂或者除了例如与RNA剂(例如dsRNA剂)连接的亲脂性部分之外的另外的亲脂性部分。
用于肠胃外施用的制剂可包括无菌水溶液，其还可包含缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂。室内注射可通过例如附接至储器的室内导管来促进。对于静脉内使用，应控制溶质的总浓度以使制剂等张。
本公开内容的RNA剂(例如dsRNA剂)可通过肺部递送施用于对象。肺部递送组合物可通过吸入分散体来递送以使得分散体中的组合物可到达肺，在那里其可容易地通过肺泡区域直接吸收到血液循环中。肺部递送对于全身递送和局部递送二者都可有效地治疗肺部疾病。在一个实施方案中，通过肺部递送施用的RNA剂(例如dsRNA剂)已被修饰成使得其能够穿过血脑屏障。
肺部递送可通过不同的方法实现，包括使用基于雾化、气雾化、胶束(micellular)和基于干粉的制剂。可使用液体雾化器、基于气雾剂的吸入器和干粉分散装置来实现递送。计量剂量装置是示例性的。使用雾化器或吸入器的益处之一是污染的可能性最小化，因为装置是独立的(self-contained)。例如，干粉分散装置递送可容易地配制成干粉的药物。RNA沉默剂组合物可单独或与合适的粉末载体组合作为冻干或喷雾干燥粉末来稳定储存。用于吸入的组合物的递送可由给药定时元件介导，该给药定时元件可包括计时器、剂量计数器、时间测量装置或时间指示器，当并入到装置中时能够实现在气雾剂药物施用期间对患者进行剂量追踪、依从性监测和/或给药触发。
可用作载体的药用赋形剂的类型包括：稳定剂例如人血清白蛋白(human serumalbumin，HSA)、填充剂例如碳水化合物、氨基酸和多肽；pH调节剂或缓冲剂；盐例如氯化钠；等。这些载体可以是结晶或非晶形式，或者可以是二者的混合物。
特别有价值的填充剂包括相容性碳水化合物、多肽、氨基酸或其组合。合适的碳水化合物包括：单糖，例如半乳糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、海藻糖等；环糊精，例如2-羟基丙基-β-环糊精；以及多糖，例如棉子糖、麦芽糖糊精、葡聚糖等；糖醇，例如甘露醇、木糖醇等。碳水化合物的示例组包括乳糖、海藻糖、棉子糖、麦芽糖糊精和甘露醇。合适的多肽包括阿司帕坦。氨基酸包括丙氨酸和甘氨酸，其中甘氨酸是示例性的。
合适的pH调节剂或缓冲剂包括由有机酸和碱制备的有机盐，例如柠檬酸钠、抗坏血酸钠等；柠檬酸钠是示例性的。
本公开内容的RNA剂(例如dsRNA剂)可通过经口和经鼻递送来施用。例如，通过这些膜施用的药物起效迅速、提供治疗性血浆水平、避免肝代谢的首过效应、并避免药物暴露于不利的胃肠道(GI)环境。另外的优点包括容易接近膜位点，从而可容易地施加、定位和去除药物。在一个实施方案中，通过经口或经鼻递送施用的RNA沉默剂已被修饰成能够穿过血脑屏障。
在一个实施方案中，包含RNA剂(例如dsRNA剂)的组合物的单位剂量或测量剂量通过植入装置来分配。装置可包含监测对象内参数的传感器。例如，装置可包含泵(例如渗透泵)以及任选的相关电子器件。
对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本文公开的实施例的范围的情况下，可以使用适当的等同方案对本文中所述的方法进行其他适当的修改和改编。现在已经详细描述了某些实施方案，通过参考以下实例将更清楚地理解它们，这些实例仅出于举例说明的目的而被包括，并且不旨在具有限制性。
实施例
实施例1：SNP辨别力因错配的位置而异
图46是流程图，其示出了用于产生和选择SNP辨别性siRNA的方法，该方法在在HTT的实例中实施但也适用于其他基因中的SNP。进行初步筛选以确定SNP放置在哪个位置会导致最大的辨别力。然后，选择产生最佳结果的错配位置，并且在二次筛选中进一步降低对非靶等位基因的亲和力，其中选择具有提高的选择性和/或效力的siRNA分子的化学和结构优化。
HTT基因内有数个在HD患者中具有高杂合率的SNP(图45)。为了优化SNP特异性RNAi介导的对亨廷顿蛋白的沉默，使用HTT mRNA的外显子57中的SNP rs362273作为优化SNP选择性沉默的模型靶标。这种SNP杂合发生在35％的HD患者群体中。
本文中所述的psiCHECK报道质粒包含SNP rs362273和来自htt的外显子57的部分侧翼区域，其在Rluc 3’UTR内。野生型psiCHECK报道质粒包含相同的htt区域但没有SNP(图1)。
用psiCheck报道质粒系统筛选设计成与含有突变SNP(2273-1(A))的亨廷顿(htt)mRNA互补的疏水修饰RNA(hsiRNA)的效力。SNP之后的数字表示SNP在siRNA中的位置(图47)。图2示出了将SNP放置在第2、4或6位提供了最大的SNP辨别力，而不会失去针对突变等位基因的效力。将用两种报道质粒之一转染的HeLa细胞通过被动摄取用1.5μM hsiRNA反向转染，并处理72小时。在转染之后72小时测量萤光素酶活性(图2)。
在HeLa细胞中的剂量响应双萤光素酶测定中进一步测试hsiRNA的等位基因辨别力(图3)。与野生型报道质粒相比，多个hsiRNA优先使含有突变SNP的报道质粒沉默。将用两种报道质粒之一转染的HeLa细胞通过被动摄取用1.5μM hsiRNA反向转染，并处理72小时。在转染之后72小时测量报道质粒表达(图3)。
实施例2：内源性Htt mRNA中的SNP辨别力
测试hsiRNA针对含有纯合rs362273 SNP的内源性亨廷顿蛋白mRNA的效力。由于HeLa细胞在rs362273处是纯合的，每个等位基因上都有A，因此未用该测定评估等位基因辨别力。相反，图4显示出两种hsiRNA，SNP4-0和SNP6-0，在使含有正确SNP的htt mRNA沉默方面高度有效。在用hsiRNA通过被动摄取处理HeLa细胞72小时之后，使用Quantigene 2.0bDNA测定来测量mRNA水平。将人htt mRNA水平相对于人HPRT进行归一化。
实施例3：设计具有更大等位基因辨别力的第二错配的hsiRNA
对于先前选择用于剂量响应的三个hsiRNA(SNP2-0、SNP4-0和SNP6-0，也分别称为mm2、mm4和mm6)中的每一个，设计和合成了具有轻微序列修饰的16个新的hsiRNA(图34)。这些序列在沿原始序列的每个可能位置引入单个错配，以测试第二错配是否比之前更显著地损害对脱靶SNP的沉默，而对靶SNP的沉默的影响很小。反义链序列以5’至3’示出，其中SNP位点为红色，并且新的错配为蓝色(图12)。
图12中hsiRNA的效力的初步筛选表明，相对于对应于SNP的核苷酸位置的第二错配的位置导致HeLa细胞中SNP辨别力的水平不同。将用两种psiCHECK报道质粒之一转染的HeLa细胞通过被动摄取用1.5μM hsiRNA反向转染，并处理72小时。在转染之后72小时测量萤光素酶活性。图5示出了与野生型报道质粒相比，多个hsiRNA辨别性地沉默了包含SNP突变的报道质粒。
在剂量响应曲线中进一步测试包含第二错配的最有效的hsiRNA以验证提高的SNP辨别力。将用两种报道质粒之一转染的HeLa细胞通过被动摄取用hsiRNA反向转染，并处理72小时。用双萤光素酶测定来测量报道基因表达。图6至8示出了具有两个错配的hsiRNA对沉默含有SNP突变的报道质粒相对于野生型报道质粒的IC50值。SNP6-11 hsiRNA(具有在从5’端起的第6位的对应于多态性的核苷酸和在从5’端起的第11位的错配的hsiRNA分子)和SNP4-7 hsiRNA(具有在从5’端起的第4位的对应于多态性的核苷酸和在从5’端起的第7位的错配的hsiRNA分子)被证明是最有效的(参见图7至9)。出乎意料的是，改变SNP周围的修饰模式挽救了因引入第二错配而丧失的效力而不损害辨别力。改变SNP6-11 hsiRNA以使得其在错配核苷酸的侧翼具有2’O-甲基修饰(以及错配核苷酸本身具有2’O-甲基修饰)(参见图10)。
实施例4：另外的修饰
多种寡核苷酸类型(例如，间隔聚体、混合聚体、miRNA抑制剂、剪接转换寡核苷酸(“SSO”)、磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸(“PMO”)、肽核酸(“PNA”)等)可用于本文中所述的寡核苷酸中，任选地使用本文中和例如以下中所述的修饰(例如化学修饰)和/或缀合的多种组合：美国序列号15/089,423；美国序列号15/236,051；美国序列号15/419,593；美国序列号15/697,120和美国专利No.9,809,817；以及美国序列号15/814,350和美国专利No.9,862,350，其各自出于所有目的通过引用整体并入本文。
例如，本文中所述的寡核苷酸可设计成di-siRNA(参见例如图14)。本文中所述的寡核苷酸可包括一个或更多个不同的骨架键联(参见例如图15)。本文中所述的寡核苷酸可包括多种糖修饰(参见例如图16)。本文中所述的寡核苷酸可包括多种核苷酸间键(参见例如图17)。本文中所述的寡核苷酸可包括一种或更多种5’稳定化修饰(参见例如图18)。本文中所述的寡核苷酸可包括一个或更多个缀合部分(参见例如图19)。图35示出了许多示例性寡核苷酸骨架修饰。
本文中所述的寡核苷酸可有效地用于简单地通过改变SNP位的碱基来靶向SNP位点处的G。如在图33中看到的，第二次合成化合物SNP6-11，这次是靶向SNP位点处的G而不是A。这允许选择性地沉默任一等位基因，这一策略对于在同一SNP位点具有不同杂合性的患者非常有用。
在某些示例性实施方案中，在SNP位核苷酸、MM位核苷酸、5’端、3’端或这些的任何组合处使用一种或更多种无碱基核苷酸。
在某些示例性实施方案中，合成在错配周围具有不同糖修饰以提高等位基因特异性的hsiRNA，例如2’FANA而不是2’F；SNP/错配位周围的三个2’F或三个2’OMe。
实施例5：HTT小鼠模型
BAC97-HD是指转基因小鼠，其包含人细菌人工染色体(bacterial artificialchromosome，BAC)转基因插入物，该转基因插入物含有通过用编码连续多聚谷氨酰胺(polyQ)段的含有97个混合CAA-CAG重复的loxP侧翼人突变htt外显子1序列替代人htt外显子1进行修饰的整个致病性170kb人亨廷顿(htt)基因组基因座。
将先导化合物(SNP6-11)合成为具有图31中所示结构的双分支化学支架，并随后在8周龄的BAC97-HD雌性小鼠中通过40nmol双侧脑室内(ICV)注射(每侧20nmol)进行体内测试。小鼠具有两个拷贝的在SNP rs362273处具有G的正常小鼠htt基因和在SNPrs362273A处具有A的致病性人htt基因的转基因插入物。还将在RNA转录组中没有靶匹配的无义序列合成到相同的双分支支架中，并作为阴性对照(NTC)注射到小鼠中。
在注射之后1个月从小鼠收集数个脑区域用于RNA和蛋白质分析，并使用Ab1抗体通过Western印迹测量HTT蛋白水平。图32A是对收集的纹状体组织进行的western印迹，并且图32B中示出了相对于黏着斑蛋白进行归一化的蛋白质水平。
实施例6：SNP靶向是序列非依赖性的
评估了先导化合物的SNP辨别力是否是序列依赖性的。使用疏水修饰RNA(hsiRNA)，其设计成与含有rs362273中U到G错配或C到A错配的亨廷顿蛋白(htt)mRNA互补。与U到G错配互补的6-11 hsiRNA和与C到A错配互补的6-11 hsiRNA二者均优先切割靶SNP(图20)。
实施例7：乙烯基膦酸酯修饰的亚基间键联的合成
图21和29中示出了本文中讨论的乙烯基次膦酸酯修饰的亚基间键联的代表性合成。图21的合成步骤详述如下。
化合物3a的合成
向化合物2a(16.6g，20.8mmol)在吡啶(100mL)中的无水溶液添加无水DIPEA(6.5mL，37.4mmol)和苯甲酰氯(3.6mL，31.2mm0l)。在室温下搅拌混合物4小时之后，蒸发过量的吡啶并用CH2Cl2稀释。将有机溶液用饱和aq.NaHCO3洗涤。收集有机层，经MgSO4干燥，过滤并蒸发。将获得的粗物质通过硅胶柱色谱法(己烷-乙酸乙酯，4∶1至1∶1)纯化，得到作为淡黄色泡沫状物的化合物3a(14.5g，78％)；
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.88-7.87(m，2H)，7.84(d，1H，J＝8.3Hz)，7.67-7.58(m，5H)，7.48-7.45(m，4H)，7.39-7.32(m，4H)，7.25-7.23(m，3H)，7.18-7.17(m，2H)，7.12-7.07(m，4H)，6.80-6.75(m，4H)，6.08(dd，1H，JHH＝1.5Hz，JHF＝15.2Hz)，5.14，(d，1H，JHH＝8.3Hz)，4.59(ddd，1H，JHH＝3.7，1.5Hz，JHF＝51.9Hz)，4.43(ddd，1H，HHH＝7.4，4.0Hz，JHF＝19.1Hz)，4.24-4.23(m，1H)，3.79(s，6H)，3.62(dd，1H，JHH＝11.2，2.0Hz)，3.35(dd，1H，JHH＝11.1，2.0Hz)，1.00(s，9H)；13C NMR(126Hz，CDCl3)δ168.4，161.8，158.72，158.66，148.9，143.9，139.4，135.71. 135.70，135.1，134.8，134.7，132.3，132.2，131.3，130.4，130.2，130.1，129.1，128.2，128.0，127.91，127.89，127.2，113.19，113.16，102.2，92.5(d，JCF＝194.4Hz)，87.7(d，JCF＝34.5Hz)，87.2，82.4，70.0(d，JCF＝15.4Hz)，60.7，60.4，55.2，26.6.
化合物4a的合成
将化合物3a(14.5g，16.3mmol)溶解到含有三乙基硅烷(8.0mL，50.1mmol)的3％三氯乙酸/CH2Cl2溶液(200mL)中并在室温下搅拌1小时。在将溶液用饱和aq.NaHCO3洗涤三次之后，将收集的有机层经MgSO4干燥、过滤、蒸发。将获得的粗物质通过硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯，4∶1至3∶7)纯化，得到作为白色泡沫状物的化合物4a(8.67g，91％)；
1H NMR(500MHz，CDCl3)57.89-7.88(m，2H)，7.68-7.64(6H，m)，7.51-7.45(m，4H)，7.42-7.38(4H，m)，5.93(dd，1H，JHH＝2.9Hz，JHF＝15.1Hz)，5.73(d，1H，JHH＝8.2Hz)，4.74(ddd，1H，JHH＝4.1，3.2Hz，JHF＝52.2Hz)，4.31(ddd，1H，JHH＝5.8，4.7，JHF＝15.4Hz)，4.11-4.09(m，1H)，3.82-3.79(m，1H)，3.39(ddd，1H，JHH＝12.1，5.6，1.5Hz)，1.64(br，1H)，1.11(s，9H)；13C NMR(126Hz，CDCl3)δ168.3，161.8，149.0，140.5，135.7，135.2，132.8，132.3，131.3，130.5，130.4，130.3，129.2，128.02，127.96，102.4，91.8(d，JCF＝91.8Hz)，89.5(d，JCF＝33.6Hz)，69.5(d，JCF＝69.5Hz)，60.3，26.8.
化合物6a的合成
向化合物4a(6.5g，11.0mmol)的无水溶液添加IBX(7.7g，27.6mmol)并在85℃下搅拌2小时。在冰浴中冷却混合物之后，通过硅藻土滤出溶液中的沉淀。蒸发收集的洗脱液，在氩气氛下与无水CH3CN共蒸发3次，获得的为白色泡沫状物的化合物5a无需进一步纯化即可使用。在单独的烧瓶中，在0℃下向含有CBr4(7.3g，22.1mmol)的无水CH2Cl2(25mL)溶液添加PPh3(11.6g，44.2mmol)，并在0℃下搅拌0.5小时。在0℃下向该溶液逐滴添加(10分钟)化合物5a的无水CH2Cl2溶液(25mL)并在0℃下搅拌2小时。在用CH2Cl2稀释之后，将有机溶液用aq.sat.NH4Cl洗涤，经MgSO4干燥，过滤并蒸发。将获得的物质溶解在最少量的乙醚中，并在0℃下在剧烈搅拌下逐滴添加至过量的乙醚溶液。通过硅藻土滤出溶液中的沉淀并蒸发洗脱液。将获得的粗物质通过硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯，9∶1至1∶1)纯化，得到作为白色泡沫状物的化合物6a(4.3g，52％)。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.68-7.84(m，2H)，7.70-7.65(m，3H)，7.60-7.58(m，2H)，7.52-7.49(m，2H)，7.42-7.36(m，4H)，7.31-7.28(m，2H)，7.09(d，1H，J＝8.2Hz)，6.25(d，1H，J＝8.9Hz)，5.75(dd，1H，HHF＝8.24Hz)，5.49(dd，1H，JHF＝21.4Hz)，4.77(t，1H，JHH＝8.5Hz，JHF＝8.5Hz)，4.38(dd，1H，JHH＝4.1Hz，JHH＝52.1Hz)，4.25(ddd，1H，JHH＝8.1，4.9Hz，JHF＝19.4Hz)，1.10(s，9H)；13C NMR(126Hz，CDCl3)d 167.9，161.6，148.3，141.4，135.8，134.7(d，JC-Br＝139.0Hz)，132.5，132.2，131.1，130.5，130.3，130.2，129.2，127.9，102.7，97.3，93.3(d，JCF＝39.1Hz)，91.5(d，JCF＝190.7Hz)，82.4，73.9(d，JCF＝16.4Hz)，26.7.
化合物7a-E和7a-Z的合成
在0℃下，向化合物6a(4.2g，5.66mmol)在DMF(25mL)中的无水溶液添加亚磷酸二甲酯(2.09mL，22.6mmol)和三乙胺(1.58mL，11.3mmol)，然后在室温下搅拌过夜。在将溶液用乙酸乙酯稀释之后，将有机溶液用aq.sat.NH4Cl和盐水洗涤。然后将有机溶液经MgSO4干燥、过滤并蒸发。将获得的粗物质通过硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯，9∶1至1∶1)重复纯化，直至分开收集所有纯的异构体化合物，得到化合物
7a-E(1.95g，52％)，1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.87-7.85(m，2H)，7.89-7.85(m，3H)，7.61-7.59(m，2H)，7.52-7.48(m，2H)，7.45-7.32(m，6H)，7.08(d，1H，JHH＝8.2)，6.49(d，1H，JHH＝13.7)，5.99(dd，1H，JHH＝13.7Hz，8.1Hz)，5.75(d，1H，JHH＝8.2)，5.63(d，1H，JHF＝19.8Hz)，4.43(dd，1H，JHF＝52.6Hz，JHH＝4.3Hz)，4.42(t，1H，JHH＝8.0Hz)，4.07(ddd，JHH＝7.8，4.7Hz，JHF＝19.5Hz)，1.08(s，9H)；13C NMR(126Hz，CDCl3)δ148.4，140.4，135.8，135.7，135.3，133.3，132.3，132.4，132.1，131.1，130.5、130.4，130.3，129.2，127，95，127.93，112.4，102.7，91.7(d，JCF＝36.3Hz)，91.6(d，JCF＝191.6Hz)，82.8，73.9(d，JCF＝16.4Hz)，26.7，19.1；和7a-Z(0.58g，15％)；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.87-7.85(m，2H)，7.68-7.65(m，3H)，7.61-7.59(m，2H)，7.52-7.48(m，2H)，7.42-7.39(m，2H)，7.34-7.29(m，4H)，7.12(d，1H，JHH＝8.2Hz)，6.51(d，1H，JHH＝7.4Hz)，5.96(dd，1H，JHH＝8.4Hz，7.4Hz)，5.75(d，1H，JHH＝8.2Hz)，5.57(dd，1H，JHH＝1.2Hz，JHF＝20.6Hz)，5.04(dd，1H，JHH＝8.2Hz)，4.48(JHH＝3.5Hz，JHF＝53.1Hz)，4.24(ddd，1H，JHH＝7.8，4.9Hz，JHF＝18.6Hz)，1.09(s，9H)；13C NMR(126Hz，CDCl3)δ168.0，161.7，148.4，141.4，135.9，135.8，135.2，132.6，132.5，131.2，130.6，130.5，130.2，130.1，129.2，127.8，127.7，114.5，102.6，93.0(d，JCF＝37.2Hz)，91.6(d，JCF＝191.6Hz)，80.3，74.3(d，JCF＝16.4Hz)，26.7，19.1.
化合物9a的合成
将无水化合物7a-E(1.95g，2.94mmol)和Pd(OAc)2(125mg，0.59mmol)和[1，1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II)(652mg，1.18mmol)用氩气吹扫，然后溶解在无水THF(50mL)中。在添加环氧丙烷(2.06mL，29.4mmol)之后，将化合物8a(2.07g，3.24mmol)一次性添加并在70℃下搅拌4小时。在减压下除去溶剂之后，将粗混合物通过硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯，50∶50至0∶100)纯化，并将获得的含有化合物9a的级分进一步通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2-MeOH，0％至5％)纯化，得到作为非对映异构体混合物的化合物9a(2.04g，57％)；31P NMR(202MHz，CDCl3)δ18，3.
化合物10a的合成
向在无水THF(22.5mL)中的化合物9a(2.0g，1.64mmol)添加1.0M TBAF-THF(2.5mL，2.5mmol)并在环境温度下搅拌30分钟。在用CH2Cl2(120mL)稀释之后，将有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，然后蒸发。将获得的粗物质通过硅胶柱色谱法(1％TEA-CH2Cl2/MeOH，0％至6％)纯化，得到化合物10a(1.52g，94％)；31P NMR(202MHz，CDCl3)δ19.0，18.7.
化合物11a的合成
化合物10a(589.7mg，0.6mmol)通过与无水CH3CN反复共蒸发而使其无水，然后溶解在无水CH2Cl2(6.0mL)中。在0℃下向该溶液添加N，N-二异丙基乙胺(0.31mL，1.8mmol)和2-氰基乙基N，N-二异丙基氯亚磷酰胺(0.16mL，0.72mmol)。在0℃下搅拌30分钟之后，将反应混合物用过量CH2Cl2稀释。将有机层用aq.sat.NaHCO3反复洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并蒸发。将获得的粗物质通过硅胶柱色谱法(1％TEA-CH2Cl2/MeOH，从100％到4％)纯化，得到作为白色泡沫状物的化合物11a(570mg，80％)；
31P NMR(202MHz，CDCl3)δ150.3，151.2，151.1，151.0，18.72，18.65，18.55，18.3.
化合物4b的合成
向化合物3b(1.35g，2.0mmol)在吡啶(10mL)中的无水溶液添加DIPEA(0.63mL，3.6mmol)和苯甲酰氯(0.35mL，3.0mmol)，并在室温下搅拌3小时。在用过量的CH2Cl2稀释之后，将有机溶液用aq.sat.NaHCO3和盐水洗涤。在经MgSO4干燥、过滤并蒸发之后，将获得的粗物质无需进一步纯化即用于下一步反应。向获得的含有化合物3b的粗物质添加在CH2Cl2(25mL)中的3％三氯乙酸以及三乙基硅烷(1mL，6.26mmol)，并在室温下搅拌1小时。在将反应混合物用CH2Cl2稀释之后，将溶液用sat.NaHCO3 aq.洗涤三次，经MgSO4干燥，过滤，然后蒸发。将获得的粗物质通过硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯，4∶1至1∶4)纯化，得到纯化合物4b(596.7mg，63％，2步骤)；
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ8.13(d，1H，JHH＝8.2Hz)，7.95(d，2H，JHH＝7.3Hz)，7.81(t，1H，JHH＝7.5Hz)，7.69-7.68(m，2H)，7.64-7.59(m，4H)，7.49-7.42(m，6H)，5.93(d，1H，JHH＝4.6Hz)，5.26(t，1H，JHH＝4.6Hz)，4.36(dd，1H，JHH＝4.6，4.6Hz)，4.02-4.00(m，1H)，3.65-3.61(m，1H)，3.54(dd，1H，JHH＝4.6，4.6Hz)，3.09(s，3H)，1.03(s，9H)；13C NMR(126Hz，DMSO-d6)169.8，162.1，149.5，141.3，136.1，135.9，135.8，133.4，133.2，131.5，130.7，130.52，130.48，130.0，128.4，128.3，102.1，86.7，85.6，82.8，79.7，70.8，60.2，57.8，27.2，19.4；
C33H35N2O7Si-[M-H]-的HRMS(ESI)m/z，计算值：m/z 599.2219，实测值：m/z599.2258。
化合物6b的合成
向化合物4b(300.4mg，0.5mmol)在CH3CN(5mL)中的无水溶液添加IBX(350mg，1.3mmol)并在85℃下搅拌2小时。将溶液在0℃下冷却之后，通过硅藻土过滤滤出沉淀。将获得的含有化合物5b的洗脱液蒸发，通过与无水CH3CN的重复共蒸发使其无水，并且无需进一步纯化即用于下一步反应。在0℃下向CBr4(331.6mg，1.0mmol)在CH2Cl2(5.0mL)中的分离制备的无水溶液一次性添加三苯膦(524.6mg，2.0mmol)并在0℃下搅拌30分钟。在0℃向该溶液逐滴添加(10分钟)在无水CH2Cl2(1.5mL)中的化合物5b并在0℃下搅拌2小时。然后将溶液用CH2Cl2稀释并用sat.NaHCO3 aq.和盐水洗涤。在将有机溶液经MgSO4干燥、过滤并蒸发之后，将获得的粗物质通过硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯，9∶1至4∶6)纯化，得到化合物6b(210.9mg，56％)；
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.88(d，2H，JHH＝7.3Hz)，7.70-762(5H，m)，7.51-7.38(m，9H)，7.08(d，1H，JHH＝8.2Hz)，6.26(d，1H，JHH＝8.6Hz)，5.75(d，1H，JHH＝8.2Hz)，5.68(d，1H，JHH＝0.8Hz)，4.84(dd，1H，JHH＝8.6Hz，8.6Hz)，3.86(dd，1H，JHH＝7.5Hz，5.0Hz)，3.30(s，3H)，3.18(br，1H)，1.11(s，9H)；13C NMR(126Hz，CDCl3)168.3，161.7，148.6，138.9，i35.9，135.8，134.3，132.6，132.4，131.2，130.5，130.4，130.3，129.2，128.0，127.9，102.4，97.5，90.0，82.44，82.39，74.4，58.2，26.7，19.1；
C34H33Br2N2O6Si-[M-H]-的HRMS(ESI)m/z，计算值：m/z 751.0480[M-H]-，实测值：m/z 753.6495。
7b-E和7b-Z的合成
在0℃下向化合物6b(6.11g，8.1mmol)在DMF(35mL)中的无水溶液添加亚磷酸二甲酯(2.97mL，34.0mmol)和三乙胺(2.26mL，17.0mmol)，然后在室温下搅拌过夜。在将溶液用乙酸乙酯稀释之后，将有机溶液用sat.NH4Cl aq.和盐水洗涤洗涤。然后将有机溶液经MgSO4干燥、过滤并蒸发，并将获得的粗物质通过硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯，9∶1至1∶1)重复纯化，直到分开收集所有纯的异构化合物，得到化合物
7b-E(3.0g，55％)；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.89-7.87(m，2H)，7.70-7.62(m，5H)，7.51-7.39(m，8H)，7.10(d，1H，JHH＝8.3Hz)，6.47(dd，1H，JHH＝13.6，0.8Hz)，6.01(dd，1H，JHH＝13.6，7.9Hz)，5.76-5.74(m，2H)，4.51(dd，1H，JHH＝7.8，7.8Hz)，7.36(dd，1H，JHH＝7.8Hz，4.9Hz)，3.34(s，3H)，3.17(dd，1H，JHH＝4.7，1.2Hz)，1.09(s，9H)；13C NMR(126Hz，CDCl3)δ168.3，161.7，148.7，138.4，135.9，135.8，135.3，133.8，132.6，132.4，131.2，130.5，130.4，130.3，129.2，128.0，127.9，112.1，102.3，88.9，82.8，82.6，77.2，74.2，58.1，26.8，19.1；和7b-Z(1.23g，22％)；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.89-7.87(m，2H)，7.72-7.70(m，2H)，7.68-7.63(m，3H)，7.51-7.44(m，4H)，7.41-7.37(m，4H)，7.16(d，1H，J-8.2Hz)，6.53(dd，1H，JHH＝7.4，0.6Hz)，6.03(dd，1H，JHH＝8.5，7.4Hz)，5.75-5.73(m，2H)，5.12(t，1H，JHH＝8.1Hz)，3.93(dd，1H，JHH＝6.9，5.0Hz)，3.32(br，1H)，3.26(s，3H)，1.10(s，9H)；13C NMR(126Hz，CDCl3)δ168.3，161.8，148.7，139.3，135.91，135.85，135.22，132.74，132.71，131.2，130.8，130.5，130.23，130.16，129.2，127.78，127.75，114.6，102.2，90.1，82.4，80.6，77.2，74.8，58.1，26.8，19.2.
化合物8b的合成
将无水5’-O-DMTr-2’-脱氧-2’-氟-3’-[甲基-N，N-(二异丙基)氨基]氨基磷酸酯(4.26g，6.0mmol)溶解在0.45M 1H-四唑/CH3CN溶液(27mL，12mmol)中并在室温下搅拌30分钟。向该溶液添加H2O(3.6mL)并在室温下搅拌30分钟。在用乙酸乙酯稀释之后，将有机溶液用盐水洗涤六次、经MgSO4干燥、过滤，然后蒸发。将获得的含有少量杂质的化合物8b无需进一步纯化即用于下一步反应；
31P NMR(CDCl3，202MHz)δ8.92，8.28.
化合物9b的合成
将无水化合物7b-E(2.84g，4.20mmol)和Pd(OAc)2(188.6mg，0.84mmol)和[1，1’-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II)(931.4mg，1.68mmol)用氩气吹扫，然后溶解在无水THF(50mL)中。在添加环氧丙烷(2.94mL，42.0mmol)之后，将化合物9b(3.16g，5.04mmol)一次性添加并在70℃下搅拌4小时。在减压下除去溶剂之后，将粗混合物通过硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯，50∶50至0∶100)纯化，并将获得的含有化合物9b的级分进一步通过硅胶柱色谱法(1％TEA-CH2Cl2/MeOH，0％至5％)纯化，得到作为非对映异构体混合物的化合物9b(3.3g，64％)；
31P NMR(202MHz，CDCl3)δ19.31，18.72.
化合物10b的合成
向在无水THF(36.5mL)中的化合物9b(3.3g，2.70mmol)添加1.0M TBAF-THF(4.05mL，4.05mmol)并在环境温度下搅拌30分钟。在用CH2Cl2(150mL)稀释之后，将有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，然后蒸发。将获得的粗物质通过硅胶柱色谱法(1％TEA-CH2Cl2/MeOH，0％至8％)纯化，得到化合物10b(1.25g，47％)；
31P NMR(202MHz，CDCl3)δ19.8，19.1.
化合物11b的合成
化合物10b(393.2mg，0.4mmol)通过与无水CH3CN反复共蒸发而使其无水，然后溶解在无水CH2Cl2(4.0mL)中。在0℃下向该溶液添加N，N-二异丙基乙胺(0.21mL，1.2mmol)和2-氰基乙基N，N-二异丙基氯亚磷酰胺(0.11mL，0.48mmol)。在0℃下搅拌30分钟之后，将反应混合物用过量CH2Cl2稀释。将有机层用aq.sat.NaHCO3反复洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并蒸发。将获得的粗物质通过硅胶柱色谱法(1％TEA-CH2Cl2/MeOH，从100％到4％)纯化，得到作为白色泡沫状物的化合物11b(319.6mg，68％)；
31P NMR(202MHz，CDCl3)δ150.7，150.4，150.3，19.9，19.5，19.4，18.8.
实施例8：乙烯基膦酸酯修饰的寡骸苷酸的固体支持物介导的合成
具有乙烯基次膦酸酯修饰的亚基间键联的寡核苷酸的代表性合成在图22中示出。合成的VP修饰序列的实例可在图28A和图28B中找到。
核苷酸间(E)-乙烯基膦酸酯修饰的RNA寡核苷酸的合成。
在MerMade 12自动RNA合成仪(BioAutomation)上，使用2’-修饰(2’-氟、2’-O-甲基)氨基磷酸酯和乙烯基膦酸酯连接的二聚体亚磷酰胺的0.1M无水CH3CN溶液进行具有一个乙烯基膦酸酯键联的RNA寡核苷酸的合成。对于固体支持物，使用UnyLinker支持物(ChemGenes)。该合成通过标准的1.0μmol规模的RNA亚磷酰胺合成循环进行，其由(i)去三苯甲基化、(ii)偶联、(iii)封端和(iv)碘氧化组成。无水CH3CN中的5-(苄基硫基)-1H-四唑用作亚磷酰胺活化剂，并且CH2Cl2中的3％二氯乙酸用于去三苯甲基化。四氢呋喃中的16％N-甲基咪唑(Cap A)和80：10：10(v/v/v)四氢呋喃-Ac2O-2，6-二甲基吡啶(Cap B)用于封端反应。使用THF-吡啶-H2O(7∶2∶1，v/v/v)中的0.02M I2进行氧化，并且使用吡啶∶CH3CN(9∶1，v/v)中的0.1M 3-[(二甲氨基-亚甲基)氨基]-3H-1，2，4-二噻唑3-硫酮用于硫化。对于5’-末端磷酸化，使用双(2-氰基乙基)-N，N-二异丙基亚磷酰胺。对于3’-胆固醇修饰的RNA寡核苷酸合成，使用胆固醇3’-lcaa CPG
Figure BDA0003584247760000941
(ChemGenes)，并且在与用于VP修饰的RNA的条件相同的条件下进行RNA合成。在化学链延长之后，通过NH4OH-EtOH(3∶1，v/v)在26℃下进行脱保护和从固体支持物的裂解，持续48小时。在乙烯基膦酸酯修饰的RNA的情况下，固体支持物上的RNA首先在RNA合成柱中在环境温度下用TMSBr-吡啶-CH2Cl2(3∶1∶18，v/v/v)处理1小时。然后将固体支持物通过使溶液流过合成柱来通过水(1mL×3)、CH3CN(1mL×3)和CH2Cl2(1mL×3)进行洗涤，然后在真空下干燥。在将固体支持物转移到螺旋盖样品管之后，在26℃下用NH4OH-EtOH(3∶1，v/v)进行碱处理48小时。通过标准阴离子交换HPLC来纯化不含胆固醇缀合物的粗RNA寡核苷酸，而通过反相HPLC来纯化具有胆固醇缀合物的RNA。获得的所有经纯化RNA通过Sephadex G-25(GE Healthcare)脱盐并通过电喷雾电离质谱(electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS)分析进行表征。
实施例9：沉默效力
图23和图24提供了本文中研究的VP修饰的siRNA的视觉表示。图25示例了在指导链上不同位置处的亚基间键联中的一种或更多种乙烯基膦酸酯修饰对沉默的影响。从图25中的数据可看出，RISC对VP修饰非常敏感，并且在不同位置具有错配碱基对会破坏siRNA效力。
图26、图27A和图27B还示出了VP修饰的siRNA沉默突变等位基因的能力。如可通过图27A和图27B看到的，在siRNA序列中添加错配可改善等位基因辨别力而不影响突变等位基因沉默。图30表明在SNP位点旁边引入VP修饰的键联显著增强了SNP选择性siRNA的靶/非靶辨别。合成在第5位和第6位之间有或没有VP修饰的含有主要(第6位)和次要(第11位)SNP的化合物。如可在图30中看到的，VP修饰的存在对“中靶(on target)”活性没有影响，但完全消除了非靶mRNA的任何可检测到的沉默。在图25、图26、图27A和图27B中的用于生成数据的方法如下所述。
hsiRNA被动递送。
在96孔细胞培养板中将细胞以每孔8,000个细胞平板接种在含有6％FBS的Dulbecco改良的Eagle培养基中。将hsiRNA在OptiMEM(Carlsbad，CA；31985-088)中稀释至最终浓度的两倍，并将50μL稀释的hsiRNA添加至50μL细胞，最终得到3％FBS。将细胞在37℃和5％CO2下孵育72小时。体外剂量响应测定中的最大剂量是1.5μM化合物。
用于定量分析靶mRNA的方法。
使用QuantiGene 2.0测定试剂盒(Affymetrix，QS0011)从细胞中定量mRNA。在55℃下将细胞在由一份裂解混合物(Affymetrix，13228)、两份H2O和0.167μg/μL蛋白酶K(Affymetrix，QS0103)构成的250μL稀释的裂解混合物中裂解30分钟。将细胞裂解物充分混合，并在含有20μL稀释的裂解混合物、不含蛋白酶K的捕获板的每孔中添加40μL的每种裂解物。用于人HTT和HPRT(Affymetrix；#SA-50339，SA-10030)的探针组根据制造商推荐的方案来稀释和使用。数据集相对于HPRT进行归一化。
用于创建条形图的方法。
使用GraphPad Prism 7软件(GraphPad Software，Inc.，SanDiego，CA)分析数据。使用log(抑制剂)相对于响应-可变斜率(四个参数)拟合浓度依赖性IC50曲线。对于每个细胞处理板，将每个剂量的敲低水平相对于对照组(未经处理组)的平均值进行归一化。曲线的下限设置为小于5，并且曲线的上限设置为大于95。为创建条形图，通过从每种相应对照化合物的IC50值中减去每种化合物的IC50值，除以对照化合物的IC50值，并乘以100来计算差异百分比。如果差异百分比小于-500％，则人为将百分比差异设置为-500％。图的下限被削减为-300％。
出于任何目的，可在本申请通篇引用的所有引用的参考文献(包括文献参考物、专利、专利申请和网站)的内容在此明确地通过引用整体并入，正如其中引用的参考文献一样。除非另有说明，否则本公开内容将采用本领域公知的免疫学、分子生物学和细胞生物学的常规技术。
本公开内容可以在不背离本公开内容的精神或基本特征的情况下以其他特定形式体现。因此，认为前述实施方案在所有方面都是举例说明性的而不是限制本公开内容。因此，本公开内容的范围由所附权利要求书而不是由前述描述来指示，并且因此所有落入权利要求书的等同意义和范围内的变化旨在包含在本文中。
实施例10：初步筛选产生多个有效的SNP rs362307杂合性siRNA序列
设计成与含有替代突变SNP(rs362307)的HTT mRNA互补的siRNA(图39)均用含有目的SNP的靶区域的报道质粒进行筛选(图40)。将用两种报道质粒之一转染的HeLa细胞通过被动摄取用1.5uM hsiRNA反向转染，并处理72小时。SNP之后的数字表示SNP在siRNA中的位置。基于其周围区域的高C/C含量，预计该SNP将更难以靶向。显示出将SNP放置在第3位提供了最多的SNP辨别力，而不会丧失针对突变等位基因的效力，表明最佳SNP位置是序列特异性的(图41)。因此可进行该初步筛选过程以选择用于任何SNP的最佳SNP位置。
实施例11：当应用于SNP rs362307时，次要错配继续提高等位基因辨别力
如图42所报道，具有在所有可能的位置引入的错配的新序列的初步筛选产生了多个有效的hsiRNA，其在rs362307位置也具有提高的SNP辨别力。在第7位和第8位引入错配显示出提高了选择性，同时保留了靶沉默效力。其他次要错配提供了优异的辨别力，但总体上活性较少。
实施例12：测量包括SNP的序列中的SNP辨别力
为了测量表5至7中公开的每个序列(即每个具有特定的SNP位核苷酸和错配(MM)位核苷酸组合的hsiRNA)的SNP辨别力，制备含有htt的野生型区域或htt的具有序列SNP的相同区域的psiCHECK报道质粒，并使用双萤光素酶对其进行测试。将用两种报道质粒之一转染的HeLa细胞通过被动摄取用hsiRNA反向转染，并处理72小时。在有或没有另外的错配的测定中测量萤光素酶活性，然后在剂量响应曲线中作图并进行比较，以揭示在辨别和沉默效力方面产生最佳结果的序列。
实施例13：次膦酸酯修饰的亚基间键联的合成
用于制备次膦酸酯修饰的亚基间键联的方法总结在图44A至图44C中。该方法涉及从游离醇到相应酮的Jones氧化，随后是Wittig烯化，以得到中间体化合物3中所示的外亚甲基部分。用BOM保护酰胺，随后进行硼氢化-氧化，得到游离醇中间体5。进行甲磺酰化，随后进行改进的Finkelstein反应产生碘化中间体7，然后将其进一步官能化以得到甲基次膦酸酯单体9。
为了获得单体18，采用多种保护和脱保护步骤来获得中间体13。IBX氧化产生相应的酮，随后进行Wittig烯化得到亚甲基。再一次，进行硼氢化-氧化，随后进行甲磺酰化和Finkelstein反应，得到单体18。
在碱性条件下将单体9和18组合产生次膦酸酯连接的二聚体19。进行酸介导的和Pearlman催化的脱保护，随后进行进一步的膦胺官能化，得到二聚体22。
实施例14：改变2’-OMe/2’-F含量以改变效力和辨别力
通过改变SNP和错配位点周围的2’-O-甲基/氟骨架修饰模式，改变了siRNA的效力和辨别力(图48A至48D)。与SNP位相邻的重度2’-氟化改善了靶结合，但降低了靶辨别力。随后在错配周围添加重度2’-O-甲基化挽救了因氟化而丧失的辨别力。尽管上文所述的原始化学修饰模式有利于体内研究，但本实施例中所述的技术可用于微调本文中所述的靶向SNP的化合物，并鉴定另外的新的靶向SNP的化合物。

Claims (63)

1.核酸，其包含：
(a)5’端和3’端；
(b)与基因的包含等位基因多态性的区域互补的种子区域；
(c)在所述种子区域内的位置处的单核苷酸多态性(SNP)位核苷酸，其中所述SNP位核苷酸与所述等位基因多态性互补；
(d)与所述基因中的核苷酸错配的错配(MM)位核苷酸；和
(e)在所述SNP位核苷酸任一侧的至少一个经修饰核苷酸(X)，其中每个X位于距所述SNP位核苷酸四个、三个或两个核苷酸内。
2.核酸，其包含：
(a)5’端和3’端；
(b)与基因的包含等位基因多态性的区域互补的种子区域；
(c)在所述种子区域内的位置处的单核苷酸多态性(SNP)位核苷酸，其中所述SNP位核苷酸与所述等位基因多态性互补；
(d)与所述基因中的核苷酸错配的错配(MM)位核苷酸；和
(e)在所述MM位核苷酸任一侧的至少一个经修饰核苷酸(Y)，其中每个Y位于距所述MM位核苷酸四个、三个或两个核苷酸内。
3.权利要求1所述的核酸，其中X包含选自以下的糖修饰：2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-氟(2’-F)、2’-核糖、2’-脱氧核糖、2’-F-4’-硫代阿拉伯糖(2’-F-ANA)、2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-MOE)、4’-S-RNA、锁核酸(LNA)、4’-S-F-ANA、2’-O-烯丙基、2’-O-乙胺、2’-O-氰基乙基-RNA(CNet-RNA)、三环-DNA、环己烯基核酸(CeNA)、阿拉伯核酸(ANA)和己糖醇核酸(HNA)。
4.权利要求2所述的核酸，其中Y包含选自以下的糖修饰：2’-OMe、2’-F、2’-核糖、2’-脱氧核糖、2’-F-ANA、2’-MOE、4’-S-RNA、LNA、4’-S-F-ANA、2’-O-烯丙基、2’-O-乙胺、CNet-RNA、三环-DNA、CeNA、ANA和HNA。
5.权利要求1所述的核酸，其中X处于紧邻所述SNP位核苷酸的5’的位置或紧邻所述SNP位核苷酸的3’的位置。
6.权利要求1所述的核酸，其中X处于紧邻所述SNP位核苷酸的5’的位置和紧邻所述SNP位核苷酸的3’的位置。
7.权利要求2所述的核酸，其中Y处于紧邻所述MM位核苷酸的5’的位置或紧邻所述MM位核苷酸的3’的位置。
8.权利要求2所述的核酸，其中Y处于紧邻所述MM位核苷酸的5’的位置和紧邻所述MM位核苷酸的3’的位置。
9.权利要求1或2所述的核酸，其中所述SNP位核苷酸存在于从所述5’端起的第2位至第6位。
10.权利要求1或2所述的核酸，其中所述MM位核苷酸位于距所述SNP位核苷酸2至11个核苷酸处。
11.权利要求1或2所述的核酸，其中所述MM位核苷酸位于距所述SNP位核苷酸2至6个核苷酸处。
12.核酸，其包含：
(a)5’端和3’端；
(b)与基因的包含等位基因多态性的区域互补的种子区域；
(c)在所述种子区域内的位置处的单核苷酸多态性(SNP)位核苷酸，其中所述SNP位核苷酸与所述等位基因多态性互补；
(d)与所述基因中的核苷酸错配的错配(MM)位核苷酸；
(e)在所述SNP位核苷酸任一侧的至少一个经修饰核苷酸(X)，其中每个X位于距所述SNP位核苷酸四个、三个或两个核苷酸内；和
(f)在所述MM位核苷酸任一侧的至少一个经修饰核苷酸(Y)，其中每个Y位于距所述MM位核苷酸四个、三个或两个核苷酸内。
13.权利要求12所述的核酸，其中X包含选自以下的糖修饰：2’-OMe、2’-F、2’-核糖、2’-脱氧核糖、2’-F-ANA、2’-MOE、4’-S-RNA、LNA、4’-S-F-ANA、2’-O-烯丙基、2’-O-乙胺、CNet-RNA、三环-DNA、CeNA、ANA和HNA。
14.权利要求12所述的核酸，其中Y包含选自以下的糖修饰：2’-OMe、2’-F、2’-核糖、2’-脱氧核糖、2’-F-ANA、2’-MOE、4’-S-RNA、LNA、4’-S-F-ANA、2’-O-烯丙基、2’-O-乙胺、CNet-RNA、三环-DNA、CeNA、ANA和HNA。
15.权利要求12所述的核酸，其中X处于紧邻所述SNP位核苷酸的5’的位置或紧邻所述SNP位核苷酸的3’的位置。
16.权利要求12所述的核酸，其中X处于紧邻所述SNP位核苷酸的5’的位置和紧邻所述SNP位核苷酸的3’的位置。
17.权利要求12所述的核酸，其中Y处于紧邻所述MM位核苷酸的5’的位置或紧邻所述MM位核苷酸的3’的位置。
18.权利要求12所述的核酸，其中Y处于紧邻所述MM位核苷酸的5’的位置或紧邻所述MM位核苷酸的3’的位置。
19.权利要求12所述的核酸，其中所述SNP位核苷酸存在于从所述5’端起的第2位至第6位。
20.权利要求12所述的核酸，其中所述MM位核苷酸位于距所述SNP位核苷酸2至11个核苷酸处。
21.权利要求12所述的核酸，其中所述MM位核苷酸位于距所述SNP位核苷酸2至6个核苷酸处。
22.权利要求12所述的核酸，其中X和Y包含相同的核苷酸修饰。
23.权利要求12所述的核酸，其中X和Y包含不同的核苷酸修饰。
24.核酸，其包含：
(a)5’端和3’端；
(b)与基因的包含等位基因多态性的区域互补的种子区域；
(c)与所述等位基因多态性互补的单核苷酸多态性(SNP)位核苷酸；
(d)与所述基因中的核苷酸错配的错配(MM)位核苷酸；
(e)在所述SNP位核苷酸任一侧的至少一个2’-氟-核糖核苷酸，其中每个2’-氟-核糖核苷酸位于距所述SNP位核苷酸四个、三个或两个核苷酸内；和
(f)在所述MM位核苷酸任一侧的至少一个2’-甲氧基-核糖核苷酸，其中每个2’-甲氧基-核糖核苷酸位于距所述MM位核苷酸四个、三个或两个核苷酸内。
25.权利要求24所述的核酸，其中2’-氟-核糖核苷酸处于紧邻所述SNP位核苷酸的5’的位置或者2’-氟-核糖核苷酸处于紧邻所述SNP位核苷酸的3’的位置。
26.权利要求24所述的核酸，其中2’-氟-核糖核苷酸处于紧邻所述SNP位核苷酸的5’的位置并且2’-氟-核糖核苷酸处于紧邻所述SNP位核苷酸的3’的位置。
27.权利要求24所述的核酸，其中2’-甲氧基-核糖核苷酸处于紧邻所述MM位核苷酸的5’的位置或者2’-甲氧基-核糖核苷酸处于紧邻所述MM位核苷酸的3’的位置。
28.权利要求24所述的核酸，其中2’-甲氧基-核糖核苷酸处于紧邻所述MM位核苷酸的5’的位置并且2’-甲氧基-核糖核苷酸处于紧邻所述MM位核苷酸的3’的位置。
29.权利要求24所述的核酸，其中所述SNP位核苷酸存在于种子区域中，并且其中所述MM位核苷酸位于距所述SNP位核苷酸2至11个核苷酸处。
30.权利要求29所述的核酸，其中所述SNP位核苷酸存在于从所述5’端起的第2位至第6位，并且其中所述MM位核苷酸位于距所述SNP位核苷酸2至6个核苷酸处。
31.权利要求24所述的核酸，其包含三个、四个、五个或六个2’-氟-核糖核苷酸。
32.权利要求24所述的核酸，其包含三个、四个、五个或六个2’-甲氧基-核糖核苷酸。
33.核酸，其包含：
(a)5’端和3’端；
(b)与基因的包含等位基因多态性的区域互补的种子区域；
(c)与所述等位基因多态性互补的单核苷酸多态性(SNP)位核苷酸；
(d)与所述基因中的核苷酸错配的错配(MM)位核苷酸；
(e)位于距所述SNP位核苷酸四个、三个或两个核苷酸内的至少三个2’-氟-核糖核苷酸；和
(f)位于距所述MM位核苷酸四个、三个或两个核苷酸内的至少三个2’-甲氧基-核糖核苷酸。
34.权利要求33所述的核酸，其中2’-氟-核糖核苷酸处于紧邻所述SNP位核苷酸的5’的位置或者2’-氟-核糖核苷酸处于紧邻所述SNP位核苷酸的3’的位置。
35.权利要求33所述的核酸，其中2’-氟-核糖核苷酸处于紧邻所述SNP位核苷酸的5’的位置并且2’-氟-核糖核苷酸处于紧邻所述SNP位核苷酸的3’的位置。
36.权利要求33所述的核酸，其中2’-甲氧基-核糖核苷酸处于紧邻所述MM位核苷酸的5’的位置或者2’-甲氧基-核糖核苷酸处于紧邻所述MM位核苷酸的3’的位置。
37.权利要求33所述的核酸，其中2’-甲氧基-核糖核苷酸处于紧邻所述MM位核苷酸的5’的位置并且2’-甲氧基-核糖核苷酸处于紧邻所述MM位核苷酸的3’的位置。
38.权利要求33所述的核酸，其中所述SNP位核苷酸存在于种子区域中，并且其中所述MM位核苷酸位于距所述SNP位核苷酸2至11个核苷酸处。
39.权利要求38所述的核酸，其中所述SNP位核苷酸存在于从所述5’端起的第2位至第6位，并且其中所述MM位核苷酸位于距所述SNP位核苷酸2至6个核苷酸处。
40.siRNA分子，其包含与靶基因具有互补性的有义链和与所述有义链具有互补性的反义链，其中所述反义链包含权利要求1至39中任一项所述的核酸。
41.权利要求40所述的siRNA分子，其中所述有义链的长度为13个核苷酸或核苷酸类似物至17个核苷酸或核苷酸类似物。
42.权利要求40或41所述的siRNA分子，其中所述反义链的长度为18个核苷酸或核苷酸类似物至22个核苷酸或核苷酸类似物。
43.权利要求40至42中任一项所述的siRNA分子，其中所述有义链的长度为15个核苷酸或核苷酸类似物，并且所述反义链的长度为20个核苷酸或核苷酸类似物。
44.权利要求40至42中任一项所述的siRNA分子，其中所述有义链的长度为16个核苷酸或核苷酸类似物，并且所述反义链的长度为20个核苷酸或核苷酸类似物。
45.分支寡核苷酸，其包含彼此共价结合的两个或更多个siRNA分子，其中每个siRNA分子独立地为权利要求40至44中任一项所述的siRNA分子。
46.权利要求45所述的分支寡核苷酸，其中所述分支寡核苷酸包含彼此共价结合的两个siRNA分子。
47.权利要求45或46所述的分支寡核苷酸，其中所述siRNA分子经由接头彼此共价结合。
48.双链核酸，其包含：
(a)第一核苷酸链，其包含：
(i)5’端和3’端；
(ii)与基因的包含等位基因多态性的区域互补的种子区域；
(iii)在所述种子区域内的位置处的单核苷酸多态性(SNP)位核苷酸，其中所述SNP位核苷酸与所述等位基因多态性互补；
(iv)与所述基因中的核苷酸不互补的错配(MM)位核苷酸；和
(v)位于所述SNP位核苷酸任一侧、所述MM位核苷酸任一侧或其组合的至少一个经修饰核苷酸；其中每个经修饰核苷酸分别位于距所述SNP位核苷酸或距所述MM位核苷酸四个、三个或两个核苷酸内；
(b)与所述第一核苷酸链互补的第二核苷酸链。
49.权利要求48所述的双链核酸，其中所述经修饰核苷酸包含选自以下的修饰：2’-O-甲基(2’-OMe)、2’-氟(2’-F)、2’-核糖、2’-脱氧核糖、2’-F-4’-硫代阿拉伯糖(2’-F-ANA)、2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-MOE)、4’-S-RNA、锁核酸(LNA)、4’-S-F-ANA、2’-O-烯丙基、2’-O-乙胺、2’-O-氰基乙基-RNA(CNet-RNA)、三环-DNA、环己烯基核酸(CeNA)、阿拉伯核酸(ANA)、己糖醇核酸(HNA)，及其组合。
50.权利要求48所述的核酸，其中所述经修饰核苷酸处于紧邻所述SNP位核苷酸的5’的位置、紧邻所述SNP位核苷酸的3’的位置，或其混合。
51.权利要求48所述的核酸，其中所述经修饰核苷酸处于紧邻所述MM位核苷酸的5’的位置、紧邻所述MM位核苷酸的3’的位置，或其混合。
52.权利要求48所述的核酸，其中所述SNP位核苷酸存在于从所述第一核苷酸链的所述5’端起的第2位至第6位。
53.权利要求48所述的核酸，其中所述MM位核苷酸位于距所述第一核苷酸链的所述SNP位核苷酸2至11个核苷酸处。
54.权利要求48所述的核酸，其中所述MM位核苷酸位于距所述第一核苷酸链的所述SNP位核苷酸2至6个核苷酸处。
55.权利要求48所述的核酸，其中所述经修饰核苷酸包含相同的核苷酸修饰、不同的核苷酸修饰，或其混合。
56.权利要求48所述的核酸，其中所述第一链的长度为13至17个核苷酸。
57.权利要求48所述的核酸，其中所述第二链的长度为18至22个核苷酸。
58.权利要求48所述的核酸，其中所述第一链的长度为15个核苷酸，并且所述第二链的长度为20个核苷酸。
59.权利要求48所述的核酸，其中所述第一链的长度为16个核苷酸，并且所述第二链的长度为20个核苷酸。
60.权利要求48所述的核酸，其中所述第一链比所述第二链多3至7个核苷酸。
61.分支寡核苷酸，其包含彼此共价结合的两个或更多个siRNA分子，其中每个siRNA分子包含双链核酸，所述双链核酸包含：
(a)第一核苷酸链，其包含：
(i)5’端、3’端；
(ii)与基因的包含等位基因多态性的区域互补的种子区域；
(iii)在所述种子区域内的位置处的单核苷酸多态性(SNP)位核苷酸，其中所述SNP位核苷酸与所述等位基因多态性互补；
(iv)与所述基因中的核苷酸不互补的错配(MM)位核苷酸；和
(v)位于所述SNP位核苷酸任一侧、所述MM位核苷酸任一侧或其组合的至少一个经修饰核苷酸；其中每个经修饰核苷酸分别位于距所述SNP位核苷酸或距所述MM位核苷酸四个、三个或两个核苷酸内；
(b)与所述第一核苷酸链互补的第二核苷酸链。
62.权利要求61所述的分支寡核苷酸，其中所述分支寡核苷酸包含彼此共价结合的两个siRNA分子。
63.权利要求61所述的分支寡核苷酸，其中所述siRNA分子经由接头彼此共价结合。
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