JP2022547790A - Ｓｎｐを標的とする化学修飾オリゴヌクレオチド - Google Patents

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Abstract

対応する野生型遺伝子の発現に比して、一塩基多型(ＳＮＰ)を含む遺伝子の発現のサイレンシングを増強する、新規オリゴヌクレオチドが提供される。対応する野生型遺伝子の発現に比して、ＳＮＰを含む遺伝子の発現のサイレンシングを増強する新規オリゴヌクレオチドを使用する方法が提供される。

Description

関連出願
本出願は、２０１９年８月９日出願の米国仮特許出願６２／８８５,０６６および２０２０年２月１３日出願の米国仮特許出願６２／９７６,１６８に基づく優先権を主張する。これら出願の内容全体を、引用により本明細書に包含させる。
連邦政府の資金による研究の声明
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により与えられる認可番号ＮＳ１０４０２２およびＧＭ１０８８０３による政府助成下になされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
背景
ＲＮＡ干渉は、遺伝子の機能を阻害するための単純かつ有効なツールである。ＲＮＡサイレンシング剤は、高度な配列特異性で特定のタンパク質の発現をノックダウンするその能力により、研究ツールおよび治療剤として特に興味が持たれている。ＲＮＡサイレンシング剤の配列特異性は、特定の遺伝子の１個の変異体と１個の野生型コピーを担持するヘテロ接合体における優性変異により引き起こされる疾患の処置に特に有用である。しかしながら、野生型アレルの発現に影響することなく(または最少の影響下に)、変異体、疾患原因アレル発現を優先的にサイレンスできる、ＲＮＡサイレンシング剤の必要性が残っている。
概要
本発明は、少なくとも一部、一塩基多型(ＳＮＰ)(例えば、ヘテロ接合型ＳＮＰ)を含む遺伝子の発現のサイレンシングを、ヘテロ接合体における対応する野生型遺伝子の発現に比して、例えば、１００倍を超えるまで増強する新規オリゴヌクレオチドの驚くべき発見に基づく。ある態様において、ＳＮＰ含有核酸を優先的に分解の標的とするオリゴヌクレオチド(例えば、ｄｓＲＮＡ)が提供され、ここで、オリゴヌクレオチド(例えば、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ))は対応する野生型(非ＳＮＰ含有)核酸を分解の標的としないかまたは標的とする程度が少ない。ある態様において、本発明のオリゴヌクレオチド(例えば、ｄｓＲＮＡ)は、１)標的核酸のＳＮＰ位置と相補的である；および２)ＳＮＰに対して標的核酸の特定の位置に１個のミスマッチを含むものである。ある実施態様において、オリゴヌクレオチド(例えば、ｄｓＲＮＡ)は、対応する野生型標的核酸配列に比して、１)野生型ＳＮＰ位置；および２)野生型ＳＮＰ位置に対する標的核酸配列の特定の位置の２個のミスマッチを含む。従って、例示的オリゴヌクレオチド(例えば、ｄｓＲＮＡ)は、ＳＮＰ含有標的に対する１個のミスマッチおよび対応する野生型配列に対する２個のミスマッチを含む、そうして、対応する野生型配列に比してＳＮＰ含有標的の優先的開裂をもたらす。
ある態様において、５’末端、３’末端およびアレル多型を含む遺伝子の領域に相補性であるシード領域を有する核酸{ここで、核酸はシード領域内の位置に一塩基多型(ＳＮＰ)位置ヌクレオチド(ここで、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、遺伝子におけるヌクレオチドとミスマッチであるミスマッチ(ＭＭ)位置であるアレル多型に相補性である)およびＳＮＰ位置ヌクレオチドの何れかの側に少なくとも１個の修飾ヌクレオチド(Ｘ)(ここで、各ＸはＳＮＰ位置ヌクレオチドから４、３または２ヌクレオチド以内に位置する)を含む}が提供される。ある実施態様において、各ＸはＳＮＰ位置ヌクレオチドから４ヌクレオチド以内に位置する。ある実施態様において、各ＸはＳＮＰ位置ヌクレオチドから３ヌクレオチド以内に位置する。ある実施態様において、各ＸはＳＮＰ位置ヌクレオチドから２ヌクレオチド以内に位置する。
ある例示的実施態様において、各Ｘは、独立して２’－Ｏ－メチル(２’－ＯＭｅ)、２’－フルオロ(２’－Ｆ)、２’－リボ、２’－デオキシリボ、２’－Ｆ－４’－チオアラビノ(２’－Ｆ－ＡＮＡ)、２’－Ｏ－(２－メトキシエチル)(２’－ＭＯＥ)、４’－Ｓ－ＲＮＡ、ロックド核酸(ＬＮＡ)、４’－Ｓ－Ｆ－ＡＮＡ、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｏ－エチルアミン、２’－Ｏ－シアノエチル－ＲＮＡ(ＣＮｅｔ－ＲＮＡ)、トリシクロ－ＤＮＡ、シクロヘキセニル核酸(ＣｅＮＡ)、アラビノ核酸(ＡＮＡ)およびヘキシトール核酸(ＨＮＡ)からなる群から選択される糖修飾を含む。
ある例示的実施態様において、Ｘは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの５’側に隣接またはＳＮＰ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する。ある例示的実施態様において、Ｘは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの５’側に隣接およびＳＮＰ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する。
ある例示的実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２位～６位(例えば、５’末端から２位、５’末端から３位、５’末端から４位、５’末端から５位または５’末端から６位)に存在する。ある例示的実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から３位～６位(例えば、５’末端から３位、５’末端から４位、５’末端から５位または５’末端から６位)に存在する。ある実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から４位～６位(例えば、５’末端から４位、５’末端から５位または５’末端から６位)に存在する。ある実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２位～５位(例えば、５’末端から２位、５’末端から３位、５’末端から４位または５’末端から５位)に存在する。ある実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から３位～５位(例えば、５’末端から３位、５’末端から４位または５’末端から５位)に存在する。ある実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２位～４位(例えば、５’末端から２位、５’末端から３位または５’末端から４位)に存在する。
ある実施態様において、ＭＭ位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～１１ヌクレオチドに位置する。例えば、ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから３ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから４ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから５ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから６ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから７ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから８ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから９ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから１０ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから１１ヌクレオチドに位置する。
ある実施態様において、ＭＭ位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～６ヌクレオチドに位置する。例えば、ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから３ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから４ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから５ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから６ヌクレオチドに位置する。
他の態様において、５’末端、３’末端およびアレル多型を含む遺伝子の領域に相補性であるシード領域を有する核酸{ここで、核酸はシード領域内の位置にＳＮＰ位置ヌクレオチド(ここで、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、遺伝子におけるヌクレオチドとミスマッチであるＭＭ位置であるアレル多型に相補性である)およびＭＭ位置ヌクレオチドの何れかの側に少なくとも１個の修飾ヌクレオチド(Ｙ)(ここで、各ＹはＭＭ位置ヌクレオチドから４、３または２ヌクレオチド以内に位置する)を含む}が提供される。ある実施態様において、各Ｙは、ＭＭ位置ヌクレオチドから４ヌクレオチド以内に位置する。ある実施態様において、各Ｙは、ＭＭ位置ヌクレオチドから３ヌクレオチド以内に位置する。ある実施態様において、各Ｙは、ＭＭ位置ヌクレオチドから２ヌクレオチド以内に位置する。
ある実施態様において、各Ｙは、独立して２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、２’－リボ、２’－デオキシリボ、２’－Ｆ－ＡＮＡ、２’－ＭＯＥ、４’－Ｓ－ＲＮＡ、ＬＮＡ、４’－Ｓ－Ｆ－ＡＮＡ、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｏ－エチルアミン、ＣＮｅｔ－ＲＮＡ、トリシクロ－ＤＮＡ、ＣｅＮＡ、ＡＮＡおよびＨＮＡからなる群から選択される糖修飾を含む。
ある実施態様において、Ｙは、ＭＭ位置ヌクレオチドの５’側に隣接またはＭＭ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する。ある例示的実施態様において、Ｙは、ＭＭ位置ヌクレオチドの５’側に隣接およびＭＭ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する。
ある例示的実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２位～６位(例えば、５’末端から２位、５’末端から３位、５’末端から４位、５’末端から５位または５’末端から６位)に存在する。ある実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から３位～６位(例えば、５’末端から３位、５’末端から４位、５’末端から５位または５’末端から６位)に存在する。ある実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から４位～６位(例えば、５’末端から４位、５’末端から５位または５’末端から６位)に存在する。ある実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２位～５位(例えば、５’末端から２位、５’末端から３位、５’末端から４位または５’末端から５位)に存在する。ある実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から３位～５位(例えば、５’末端から３位、５’末端から４位または５’末端から５位)に存在する。ある実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２位～４位(例えば、５’末端から２位、５’末端から３位または５’末端から４位)に存在する。
ある実施態様において、ＭＭ位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～１１ヌクレオチドに位置する。例えば、ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから３ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから４ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから５ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから６ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから７ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから８ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから９ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから１０ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから１１ヌクレオチドに位置する。
ある実施態様において、ＭＭ位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～６ヌクレオチドに位置する。例えば、ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから３ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから４ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから５ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから６ヌクレオチドに位置する。
他の態様において、５’末端、３’末端およびアレル多型を含む遺伝子の領域に相補性であるシード領域を有する核酸{ここで、核酸はシード領域内の位置にＳＮＰ位置ヌクレオチド(ここで、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、遺伝子におけるヌクレオチドとミスマッチであるＭＭ位置であるアレル多型に相補性である)およびＳＮＰ位置ヌクレオチドの何れかの側に少なくとも１個の修飾ヌクレオチド(Ｘ)(ここで、各ＸはＳＮＰ位置ヌクレオチドから４、３または２ヌクレオチド以内に位置する)およびＭＭ位置ヌクレオチドの何れかの側に少なくとも１個の修飾ヌクレオチド(Ｙ)(ここで、各ＹはＭＭ位置ヌクレオチドから４、３または２ヌクレオチド以内に位置する)を含む}が提供される。ある実施態様において、各ＸはＳＮＰ位置ヌクレオチドから４ヌクレオチド以内に位置する。ある実施態様において、各ＸはＳＮＰ位置ヌクレオチドから３ヌクレオチド以内に位置する。ある実施態様において、各ＸはＳＮＰ位置ヌクレオチドから２ヌクレオチド以内に位置する。ある実施態様において、各Ｙは、ＭＭ位置ヌクレオチドから４ヌクレオチド以内に位置する。ある実施態様において、各Ｙは、ＭＭ位置ヌクレオチドから３ヌクレオチド以内に位置する。ある実施態様において、各Ｙは、ＭＭ位置ヌクレオチドから２ヌクレオチド以内に位置する。
ある実施態様において、各Ｘは、独立して２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、２’－リボ、２’－デオキシリボ、２’－Ｆ－ＡＮＡ、２’－ＭＯＥ、４’－Ｓ－ＲＮＡ、ＬＮＡ、４’－Ｓ－Ｆ－ＡＮＡ、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｏ－エチルアミン、ＣＮｅｔ－ＲＮＡ、トリシクロ－ＤＮＡ、ＣｅＮＡ、ＡＮＡおよびＨＮＡからなる群から選択される糖修飾を含む。ある実施態様において、各Ｙは、独立して２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、２’－リボ、２’－デオキシリボ、２’－Ｆ－ＡＮＡ、２’－ＭＯＥ、４’－Ｓ－ＲＮＡ、ＬＮＡ、４’－Ｓ－Ｆ－ＡＮＡ、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｏ－エチルアミン、ＣＮｅｔ－ＲＮＡ、トリシクロ－ＤＮＡ、ＣｅＮＡ、ＡＮＡおよびＨＮＡからなる群から選択される糖修飾を含む。
ある例示的実施態様において、Ｘは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの５’側に隣接またはＳＮＰ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する。ある例示的実施態様において、Ｘは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの５’側に隣接およびＳＮＰ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する。
ある例示的実施態様において、Ｙは、ＭＭ位置ヌクレオチドの５’側に隣接またはＭＭ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する。ある例示的実施態様において、Ｙは、ＭＭ位置ヌクレオチドの５’側に隣接およびＭＭ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する。
ある例示的実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２位～６位(例えば、５’末端から２位、５’末端から３位、５’末端から４位、５’末端から５位または５’末端から６位)に存在する。ある実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から３位～６位(例えば、５’末端から３位、５’末端から４位、５’末端から５位または５’末端から６位)に存在する。ある実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から４位～６位(例えば、５’末端から４位、５’末端から５位または５’末端から６位)に存在する。ある実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２位～５位(例えば、５’末端から２位、５’末端から３位、５’末端から４位または５’末端から５位)に存在する。ある実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から３位～５位(例えば、５’末端から３位、５’末端から４位または５’末端から５位)に存在する。ある実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２位～４位(例えば、５’末端から２位、５’末端から３位または５’末端から４位)に存在する。
ある実施態様において、ＭＭ位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～１１ヌクレオチドに位置する。例えば、ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから３ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから４ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから５ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから６ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから７ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから８ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから９ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから１０ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから１１ヌクレオチドに位置する。
実施態様、ＭＭ位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～６ヌクレオチドに位置する。例えば、ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから３ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから４ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから５ヌクレオチドに位置する。ある実施態様において、ＭＭ位置は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから６ヌクレオチドに位置する。
ある実施態様において、ＸおよびＹは同じである。
他の態様において、アレル多型を含む遺伝子の領域と相補性である５’末端および３’末端を有する核酸{ここで、核酸は、アレル多型に相補性であるＳＮＰ位置ヌクレオチド、遺伝子におけるヌクレオチドとミスマッチであるＭＭ位置ヌクレオチド、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの何れかの側に少なくとも１個の２’－フルオロ－リボヌクレオチド(ここで、各２’－フルオロ－リボヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから４、３または２ヌクレオチド以内に位置する)およびＭＭ位置ヌクレオチドの何れかの側に少なくとも１個の２’－メトキシ－リボヌクレオチド(ここで、各２’－メトキシ－リボヌクレオチドは、ＭＭ位置ヌクレオチドから４、３または２ヌクレオチド以内に位置する)を含む}が提供される。
ある例示的実施態様において、２’－フルオロ－リボヌクレオチドはＳＮＰ位置ヌクレオチドの５’側に隣接して位置するまたは２’－フルオロ－リボヌクレオチドはＳＮＰ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する。
ある例示的実施態様において、２’－フルオロ－リボヌクレオチドはＳＮＰ位置ヌクレオチドの５’側に隣接して位置するおよび２’－フルオロ－リボヌクレオチドはＳＮＰ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する。
ある例示的実施態様において、２’－メトキシ－リボヌクレオチドはＭＭ位置ヌクレオチドの５’側に隣接して位置するまたは２’－メトキシ－リボヌクレオチドはＭＭ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する。ある例示的実施態様において、２’－メトキシ－リボヌクレオチドはＭＭ位置ヌクレオチドの５’側に隣接して位置するおよび２’－メトキシ－リボヌクレオチドはＭＭ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する。
ある例示的実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドはシード領域に存在し、ＭＭ位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～１１ヌクレオチドに位置する(例えば、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２ヌクレオチド、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから３ヌクレオチド、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから４ヌクレオチド、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから５ヌクレオチド、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから６ヌクレオチド、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから７ヌクレオチド、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから８ヌクレオチド、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから９ヌクレオチド、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから１０ヌクレオチドまたはＳＮＰ位置ヌクレオチドから１１ヌクレオチド)。
ある例示的実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは５’末端から２位～６位に存在し、ＭＭ位置ヌクレオチドはＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～６ヌクレオチドに位置する。
ある例示的実施態様において、核酸は、３個、４個、５個または６個の２’－フルオロ－リボヌクレオチドを含む。ある例示的実施態様において、核酸は、３個、４個、５個または６個の２’－メトキシ－リボヌクレオチドを含む。
他の態様において、アレル多型を含む遺伝子の領域と相補性である５’末端および３’末端を有する核酸(ここで、核酸はアレル多型に相補性であるＳＮＰ位置ヌクレオチド、遺伝子におけるヌクレオチドとミスマッチであるＭＭ位置ヌクレオチド、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから４、３または２ヌクレオチド以内に位置する少なくとも３個の２’－フルオロ－リボヌクレオチドおよびＭＭ位置ヌクレオチドから４、３または２ヌクレオチド以内に位置する少なくとも３個の２’－メトキシ－リボヌクレオチドを含む)が提供される。
ある例示的実施態様において、２’－フルオロ－リボヌクレオチドはＳＮＰ位置ヌクレオチドの５’側に隣接して位置するまたは２’－フルオロ－リボヌクレオチドはＳＮＰ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する。ある例示的実施態様において、２’－フルオロ－リボヌクレオチドはＳＮＰ位置ヌクレオチドの５’側に隣接して位置するおよび２’－フルオロ－リボヌクレオチドはＳＮＰ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する。
ある例示的実施態様において、２’－メトキシ－リボヌクレオチドはＭＭ位置ヌクレオチドの５’側に隣接して位置するまたは２’－メトキシ－リボヌクレオチドはＭＭ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する。
ある例示的実施態様において、２’－メトキシ－リボヌクレオチドはＭＭ位置ヌクレオチドの５’側に隣接して位置するおよび２’－メトキシ－リボヌクレオチドはＭＭ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する。
ある例示的実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドはシード領域に存在し、ＭＭ位置ヌクレオチドはＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～１１ヌクレオチドに位置する。
ある例示的実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは５’末端から２位～６位に存在し、ここで、ＭＭ位置ヌクレオチドはＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～６ヌクレオチドに位置する。
さらなる態様において、ｓｉＲＮＡ分子は標的遺伝子に相補性を有するセンス鎖およびセンス鎖に相補性を有するアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は前記態様または実施態様の何れかの核酸を含むものが提供される。
ある実施態様において、センス鎖は１３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ～１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１３、１４、１５、１６または１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長)の長さを有する。
ある実施態様において、アンチセンス鎖は１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ～２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１８、１９、２０、２１または２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長)の長さを有する。
ある実施態様において、センス鎖は１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有し、アンチセンス鎖は２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。
ある実施態様において、センス鎖は１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有し、アンチセンス鎖は２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。
さらなる態様において、各ｓｉＲＮＡ分子が、独立して、先の態様または実施態様の何れかのｓｉＲＮＡ分子である、互いに共有結合した２以上のｓｉＲＮＡ分子を含む分岐オリゴヌクレオチドが提供される。
ある実施態様において、分岐オリゴヌクレオチドは互いに共有結合した２個のｓｉＲＮＡ分子を含む。
ある実施態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、互いにリンカーを介して共有結合される。
本発明の前記および他の特性および利点は、添付する図面と共に説明的実施態様の以下の詳細な記載からより完全に理解される。特許または出願書類は、カラーの図面を少なくとも１つ含む。カラー図面を伴うこの特許または特許出願公報のコピーは、請求および必要な費用の支払いにより、庁から提供される。
図１は、ｈｔｔの野生型領域またはＳＮＰを伴うｈｔｔの同じ領域、ｒｓ３６２２７３を含むｐｓｉＣＨＥＣＫレポータープラスミドを示す。
図２は種々の位置にＳＮＰヌクレオチドを有するｈｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞におけるｐｓｉＣＨＥＣＫレポータープラスミドアッセイによるルシフェラーゼ活性を示す棒グラフである。この一次スクリーニングは、複数の効果的な疎水性修飾ｉＲＮＡ(ｈｓｉＲＮＡ)配列をもたらした。
図３は、ｐｓｉＣＨＥＣＫレポータープラスミド上の３個の例示的ｈｓｉＲＮＡの用量応答曲線を示す。
図４は、ｈｔｔ ｍＲＮＡのサイレンシングに対する２個のｈｓｉＲＮＡの有効性を示す用量応答曲線を示す。
図５は、種々の位置に第二ミスマッチを有するｈｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞におけるｐｓｉＣＨＥＣＫレポータープラスミドアッセイに従うルシフェラーゼ活性を示す棒グラフを示す。
図６は、付加的ミスマッチを伴う(ｍｍ２－７)または伴わない(ｍｍ２－０)ＳＮＰ２ ｈｓｉＲＮＡのサイレンシング効果を比較する用量応答曲線を示す。
図７は、付加的ミスマッチを伴うまたは伴わないＳＮＰ４ ｈｓｉＲＮＡのサイレンシング効果を含む用量応答曲線を示す。
図８は付加的ミスマッチを伴うまたは伴わないＳＮＰ６のサイレンシング効果を比較する用量応答曲線を示す。
図９は、付加的ミスマッチを有するＳＮＰ４またはＳＮＰ６ ｈｓｉＲＮＡ(それぞれＳＮＰ４－７およびＳＮＰ６－１１)のサイレンシング効果の、付加的ミスマッチを伴わない(ＳＮＰ４－０およびＳＮＰ４－１１)同じｈｓｉＲＮＡと比較した、用量応答曲線を示す。２個のレポータープラスミドの一方でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を動的取込によりｈｓｉＲＮＡで逆トランスフェクトし、７２時間処理した。レポーター発現をデュアルルシフェラーゼアッセイで測定した。
図１０は、付加的ミスマッチを有するｈｓｉＲＮＡのサイレンシング有効性を測定するｈｔｔ ｍＲＮＡ発現の用量応答曲線を示す。
図１１は、一部実施態様に従うｈｓｉＲＮＡおよび例示的修飾を模式的に示す。
図１２Ａ～図１２Ｃは、それぞれＳＮＰ２、ＳＮＰ４およびＳＮＰ６ ｈｓｉＲＮＡライブラリーを示す。アンチセンス鎖は５’から３’方向に記載し、ＳＮＰ部位は赤色およびミスマッチは青色である。
図１３は、ある実施態様に従う種々のｈｓｉＲＮＡ構築物のアンチセンスおよびセンス鎖配列および修飾パターンを示す。ｍｍ４－７およびｍｍ６－１１は、優れたＳＮＰ識別を示し、さらなるスクリーニングのために選択した。
図１４は、ジ－ｓｉＲＮＡとして設計した例示的ＳＮＰ選択的化合物を示す。
図１５は、ある例示的実施態様による主鎖結合を示す。オリゴヌクレオチド主鎖はホスフェート、ホスホロチオエート(ラセミ混合物または立体特異的)、ジホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ペプチド核酸(ＰＮＡ)、ボラノホスフェート、２’－５’－ホスホジエステル、アミド、ホスホノアセテート、モルホリノなどの１個または何らかの組み合わせを含み得る。
図１６は、ある例示的実施態様による糖修飾を示す。糖修飾は２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－リボ、２’－デオキシリボ、２’－Ｆ－ＡＮＡ、ＭＯＥ、４’－Ｓ－ＲＮＡ、ＬＮＡ、４’－Ｓ－Ｆ－ＡＮＡ、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｏ－エチルアミン、ＣＮｅｔ－ＲＮＡ、トリシクロ－ＤＮＡ、ＣｅＮＡ、ＡＮＡ、ＨＮＡなどの１つまたは何らかの組み合わせを含む。
図１７は、ある例示的実施態様によるヌクレオチド間結合を示す。可能性のあるヌクレオチド間結合は、任意のオリゴヌクレオチド鎖の５’または３’末端の最初の２ヌクレオチド間であり得て、記載する部分の何れかを安定化できる。
図１８は、ある例示的実施態様による５’安定化修飾を示す。適当な５’安定化修飾はホスフェート、無ホスフェート、ビニルホスホネート、Ｃ５－メチル(ＲまたはＳまたはラセミ)、ビニル上のＣ５－メチル、還元ビニル(例えば、３炭素アルキル)などであり得る。
図１９は、ある例示的実施態様によるコンジュゲート部分を示す。適当なコンジュゲート部分は、あらゆる長さのアルキル鎖、ビタミン、リガンド、ペプチドまたは生物活性コンジュゲート、例えば、グリコスフィンゴリピド、多価不飽和脂肪酸、セコステロイド、ステロイドホルモン、ステロイド脂質などであり得る。
図２０は、５’末端から６位にＳＮＰ位置ヌクレオチドおよび５’末端から１１位に位置するミスマッチ位置ヌクレオチドを含む足場を識別するＳＮＰの活性が配列非依存的であることを、グラフ的に示す。
図２１は、ここに記載するビニルホスホネート(ＶＰ)修飾サブユニット間結合の代表的合成を示す。
図２２は、ＶＰ修飾サブユニット間結合を有するオリゴヌクレオチドの調製方法を示す。
図２３は、ある例示的実施態様によるＶＰ修飾ＲＮＡの図的記述である。
図２４は、ある例示的実施態様により合成したＶＰ修飾オリゴヌクレオチドの配列を示す。
図２５はｓｉＲＮＡ有効性の比較試験の概要である。
図２６は、ＳＮＰ部位ｒｓ３６２２７３を囲むＨＴＴ配列に対して整列したｈｓｉＲＮＡアンチセンス足場の図であり、ここで、緑色四角はＳＮＰ部位の位置を示す。
図２７Ａおよび２７Ｂは、ｓｉＲＮＡ配列におけるミスマッチ付加が、変異体アレルのサイレンシングを損なうことなくアレル識別を改善する効果を示す。
図２８Ａおよび２８Ｂは、シンセサイザーにより調製したＶＰ修飾配列を示す。
図２９は、ここに提供されるＶＰ修飾オリゴヌクレオチドの他の調製方法を示す。
図３０は、ＶＰ修飾結合のＳＮＰ選択的ｓｉＲＮＡの標的／非標的識別に対する効果を示す。
図３１は、二分岐ｓｉＲＮＡ化学足場例を示す。
図３２Ａは、ＨＴＴタンパク質レベルの測定のために実施したウェスタンブロットを示す。図３２Ｂは、ビンキュリンに対して正規化したタンパク質レベルを示す。
図３３は、ＳＮＰ部位でＡではなくＧをターゲティングするオリゴヌクレオチドのサイレンシング効果を比較する用量応答曲線を示す。
図３４は、用量応答について先に選択した配列における単一ミスマッチを導入する配列例を示す。
図３５は、多数の例示的オリゴヌクレオチド主鎖修飾を示す。
図３６は、ある例示的実施態様によるオリゴヌクレオチド分岐モチーフを示す。二重らせんはオリゴヌクレオチドを示す。種々のリンカー、スペーサーおよび分岐点の組み合わせにより、多種多様な分岐ｈｓｉＲＮＡ構造の産生が可能となる。
図３７は、コンジュゲート生物活性部分を有する例示的分岐オリゴヌクレオチドを示す。
図３８は、例示的アミダイトリンカー、スペーサーおよび分岐部分を示す。
図３９は、代替的ＳＮＰ部位ｒｓ３６２２７３を囲むＨＴＴ配列に対して整列したｈｓｉＲＮＡアンチセンス足場の図を示す。
図４０は、図３９のｈｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞におけるｐｓｉＣＨＥＣＫレポータープラスミドアッセイに従うルシフェラーゼ活性を示す棒グラフを示す。「ＳＮＰ」後の数値は、ｓｉＲＮＡにおけるＳＮＰの位置を示す。
図４１は、ＳＮＰ３部位のＣまたはＴをターゲティングする図３９のオリゴヌクレオチドのサイレンシング効果を比較する用量応答曲線を示す。
図４２は、種々の位置の第二ミスマッチを特徴とするよう修飾された、図３９のｈｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞におけるｐｓｉＣＨＥＣＫレポータープラスミドアッセイに従うルシフェラーゼ活性を示す棒グラフを示す。
図４３は、修飾サブユニット間リンカー例を示す。
図４４Ａは、ここに提供する修飾ホスフィナート含有オリゴヌクレオチドのためのモノマーを調製する代表例を示す。図４４Ｂは、ここに提供する修飾ホスフィナート含有オリゴヌクレオチドのための他のモノマーを調製する代表例を示す。図４４Ｃは、ここに提供する修飾ホスフィナート含有オリゴヌクレオチドを調製する代表例を示す。
図４５は、ＨＴＴ遺伝子内の例示的ＳＮＰを示す(配列番号１～１０(上から下に番号付け))。
図４６は、ＳＮＰ識別ｓｉＲＮＡの産生および選択の方法を説明するフローチャートを示す。
図４７は、ｓｉＲＮＡ内のＳＮＰの位置を示す命名規則を示す。
図４８Ａ～図４８Ｄは、ｓｉＲＮＡのＳＮＰ位置ヌクレオチドおよびＭＭ位置ヌクレオチドに隣接する２’－フルオロ／２’－メトキシ含量の改変により介在される、標的および非標的結合および開裂の有効性および識別をグラフ的に示す。(Ａ)は、多様なＳＮＰ ６－１１バリアントの結果を示す。(Ｂ)は、６－１１対修飾ｆｆｍｆｆパターン(６位のＳＮＰ近くに４個の２’－フルオロ－リボヌクレオチドおよび２’－メトキシ－リボヌクレオチド)を有する６－１１の結果を示す。(Ｃ)は、６－１１対修飾ｍｍｍ１１パターン(１１位のＭＭ近くに３個の２’－メトキシ－リボヌクレオチド)を有する６－１１の結果を示す。(Ｄ)は６－１１対修飾ｆｆｆ６ｍｍｍ１１パターン(６位のＳＮＰ近くに３個の２’－フルオロ－リボヌクレオチドおよび１１位のＭＭ近くに３個の２’－メトキシ－リボヌクレオチド)を有する６－１１の結果を示す。ＨｅＬａ細胞を２個のレポータープラスミドの一方でトランスフェクトし、動的取込によりｈｓｉＲＮＡで逆トランスフェクトし、７２時間処理した。レポーター発現をデュアル－ルシフェラーゼアッセイを使用して測定した。
詳細な記載
本発明は、変異体タンパク質をコードする遺伝子内に位置するアレル多型のサイレンシングに有用である、オリゴヌクレオチド、例えば、ＲＮＡサイレンシング剤、例えば、二本鎖ＲＮＡ(「ｄｓＲＮＡ」)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(「ＡＳＯ」)などのＲＮＡを含む、組成物に関する。特定の態様において、オリゴヌクレオチド、例えば、ＲＮＡ、サイレンシング剤は、ヌクレオチド特異性および選択性を伴い対応する変異体ｍＲＮＡ(例えば、ＳＮＰ含有ｍＲＮＡ)を破壊する、ここに提供するｄｓＲＮＡ剤である。ここに開示するオリゴヌクレオチド、例えば、ＲＮＡ、サイレンシング剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤は、変異体遺伝子の多型領域に対応するｍＲＮＡを標的とし、変異体ｍＲＮＡを開裂させ、ハンチンチンタンパク質などの対応する変異体タンパク質、例えば、機能獲得型変異体タンパク質の合成を阻止する。
定義
ここで他に定義しない限り、ここで使用する科学および技術用語は、当業者に共通して理解されている意味を有する。何らかの不明確である可能性がある場合、ここに提供する定義は、すべての辞書または他の外因性定義に優先する。文脈から他の解釈が必要でない限り、単数表現は複数を含み、かつ複数表現は単数を含む。「または」の使用は、特記されない限り、「および／または」を意味する。用語「含む」ならびに「含み」および「含まれる」などの他の形態の使用は、非限定的である。
オリゴヌクレオチド配列の文脈においてここで使用する、「Ａ」は塩基アデニン(例えば、アデノシンまたはその化学修飾誘導体)を含むヌクレオシドを表し、「Ｇ」は塩基グアニン(例えば、グアノシンまたはその化学修飾誘導体)を含むヌクレオシドを表し、「Ｕ」は塩基ウラシル(例えば、ウリジンまたはその化学修飾誘導体)を表し、「Ｃ」は塩基アデニン(例えば、シチジンまたはその化学修飾誘導体)を含むヌクレオシドを表す。
ここで使用する用語「キャッピング基」は、アルコール(ＲＯＨ)、カルボン酸(ＲＣＯ２Ｈ)またはアミン(ＲＮＨ２)などの官能基における水素原子を置換する化学基をいう。キャッピング基の非限定的例は、アルキル(例えば、メチル、３級－ブチル)；アルケニル(例えば、ビニル、アリル)；カルボキシル(例えば、アセチル、ベンゾイル)；カルバモイル；ホスフェート；およびホスホネート(例えば、ビニルホスホネート)を含む。他の適当なキャッピング基は、当業者に知られる。
用語「ヌクレオチドアナログ」または「改変ヌクレオチド」または「修飾ヌクレオチド」は、天然に存在しないリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む、非標準的ヌクレオチドをいう。例示的ヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドアナログが意図される機能を発揮する能力を維持しながら、ヌクレオチドのある化学性質を変えるようなあらゆる位置で修飾される。誘導体化され得るヌクレオチドの位置の例は、５位、例えば、５－(２－アミノ)プロピルウリジン、５－ブロモウリジン、５－プロピンウリジン、５－プロペニルウリジンなど；６位、例えば、６－(２－アミノ)プロピルウリジン；アデノシンおよび／またはグアノシンについては８位、例えば、８－ブロモグアノシン、８－クロログアノシン、８－フルオログアノシンなどを含み得る。ヌクレオチドアナログは、デアザヌクレオチド、例えば、７－デアザ－アデノシン；Ｏ－およびＮ修飾(例えば、アルキル化、例えば、Ｎ６－メチルアデノシンまたは当分野で他に知られる)ヌクレオチド；およびHerdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 Aug. 10(4):297-310に記載のものなどの他のヘテロ環修飾ヌクレオチドアナログも含む。
用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログの短ポリマーをいう。用語「ＲＮＡアナログ」は、対応する非改変または非修飾ＲＮＡと比較して、少なくとも１個の改変または修飾ヌクレオチドを有するが、対応する非改変または非修飾ＲＮＡと同じまたは類似の性質または機能を維持するポリヌクレオチド(例えば、化学合成ポリヌクレオチド)をいう。上記のとおり、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合を有するＲＮＡ分子と比較して、ＲＮＡアナログの加水分解の速度を低減させる、結合で結合され得る。例えば、アナログのヌクレオチドは、メチレンジオール、エチレンジオール、オキシメチルチオ、オキシエチルチオ、オキシカルボニルオキシ、ホスホロジアミデート、ホスホロアミデートおよび／またはホスホロチオエート結合を含み得る。具体的実施態様において、ＲＮＡアナログは、糖および／または主鎖修飾リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含む。このような改変または修飾は、ＲＮＡの末端または内部(ＲＮＡの１以上のヌクレオチド)になど、さらに非ヌクレオチド物質の付加を含み得る。ＲＮＡアナログは、ＲＮＡ干渉に介在する能力を有する点で、天然ＲＮＡと十分に類似していることのみ必要である。
ここで使用する例示的オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲガイド、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＡＡＶオリゴヌクレオチド、ギャップマー、ミックスマー、ｍｉＲＮＡ阻害剤、ＳＳＯ、ＰＭＯ、ＰＮＡなどを含むが、これらに限定されない。
ここで使用する用語「ＲＮＡ干渉」(「ＲＮＡｉ」)は、ＲＮＡの選択的細胞内分解をいう。ＲＮＡｉは、外来ＲＮＡ(例えば、ウイルスＲＮＡ)を除去するために細胞で天然に生ずる。天然ＲＮＡｉは、他の類似ＲＮＡ配列の分解機構を指示する、遊離ｄｓＲＮＡから開裂されたフラグメントを介して進む。あるいは、ＲＮＡｉは、例えば、標的遺伝子の発現をサイレンシングするために、人の手により起動され得る。
ここで使用する用語「ｈｓｉＲＮＡ」は、ここに提供する二本鎖ＲＮＡの実施態様をいい、ここで、ＲＮＡ分子は、ここに記載のとおり、１以上の疎水性修飾を含む、完全化学修飾される。
「標的特異的ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)を指示するために標的ｍＲＮＡ配列と十分に相補性の配列」である鎖を有するＲＮＡｉ剤、例えば、ＲＮＡサイレンシング剤は、鎖がＲＮＡｉ機構または過程による標的ｍＲＮＡ破壊を誘導するのに十分な配列を有することを意味する。
ここで使用する用語「単離ＲＮＡ」(例えば、「単離ｓｉＲＮＡ」または「単離ｓｉＲＮＡ前駆体」)は、組み換え技術により産生されたとき、他の細胞物質または培養培地が実質的にないまたは化学合成されたとき化学前駆体もしくは他の化学物質が実質的にない、ＲＮＡ分子をいう。
ここで使用する用語「ＲＮＡサイレンシング」は、対応するタンパク質コード化遺伝子の発現の阻害または抑制をもたらす、ＲＮＡ分子により介在される、配列特異的制御機構の群(例えばＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)、転写遺伝子サイレンシング(ＴＧＳ)、転写後遺伝子サイレンシング(ＰＴＧＳ)、抑圧、共抑制、翻訳抑制など)をいう。ＲＮＡサイレンシングは、植物、動物および真菌を含む、多くのタイプの生物で観察されている。
用語「識別的ＲＮＡサイレンシング」は、ＲＮＡ分子が、例えば、両ポリヌクレオチド配列が同じ細胞に存在するとき、「第一」または「標的」ポリヌクレオチド配列の発現を実質的に阻害し、他方、「第二」または「非標的」ポリヌクレオチド配列の発現を実質的に阻害しない能力をいう。ある実施態様において、標的ポリヌクレオチド配列は標的遺伝子に対応し、他方非標的ポリヌクレオチド配列は非標的遺伝子に対応する。他の実施態様において、標的ポリヌクレオチド配列は標的アレルに対応し、他方非標的ポリヌクレオチド配列は非標的アレルに対応する。ある実施態様において、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子の制御領域(例えば、プロモーターまたはエンハンサー要素)をコードするＤＮＡ配列である。他の実施態様において、標的ポリヌクレオチド配列は、標的遺伝子によりコードされる標的ｍＲＮＡである。
疾患または障害に「関与する」遺伝子は、正常なもしくは異常な発現もしくは機能が、疾患もしくは障害または該疾患もしくは障害の少なくとも１つの症状に影響するまたは引き起こす遺伝子である。
ここで使用する用語「標的遺伝子」(例えば、ヘテロ接合型多型の変異体アレル、例えば、ヘテロ接合型ＳＮＰ)は、発現が実質的に阻害または「サイレンシング」されるべき遺伝子である。このサイレンシングは、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡ開裂または標的遺伝子の翻訳抑制による、ＲＮＡサイレンシングにより達成され得る。用語「非標的遺伝子」(例えば、野生型アレル)は、発現が実質的にサイレンシングされるべきでない遺伝子をいう。ある実施態様において、標的および非標的遺伝子のポリヌクレオチド配列(例えば、標的および非標的遺伝子によりコードされるｍＲＮＡ)は、１以上のヌクレオチドにより異なり得る。他の実施態様において、標的および非標的遺伝子は、１以上の多型(例えば、一塩基多型またはＳＮＰ)により異なり得る。他の実施態様において、標的および非標的遺伝子は、１００％未満の配列同一性を共有し得る。他の実施態様において、非標的遺伝子は、標的遺伝子のホモログ(例えば、オルソログまたはパラログ)であり得る。
「標的アレル」は、発現が選択的に阻害または「サイレンシング」されるべき、アレル(例えば、ＳＮＰアレル)である。このサイレンシングは、例えば、ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子のｍＲＮＡまたは標的アレルの開裂による、ＲＮＡサイレンシングにより達成され得る。用語「非標的アレル」は、発現が実質的にサイレンシングされるべきではないアレル(例えば、対応する野生型アレル)をいう。ある実施態様において、標的および非標的アレルは、同じ標的遺伝子に対応する。他の実施態様において、標的アレルは、標的遺伝子に対応するかまたは関連し、非標的アレルは、非標的遺伝子に対応するかまたは関連する。ある実施態様において、標的および非標的アレルのポリヌクレオチド配列は、１以上のヌクレオチドにより異なり得る。他の実施態様において、標的および非標的アレルは、１以上のアレル多型(例えば、１以上のＳＮＰ)により異なり得る。他の実施態様において、標的および非標的アレルは、１００％未満の配列同一性を共有し得る。
ここで使用する用語「多型」は、異なる起源または対象からの(しかし同じ生物からの)同じ遺伝子配列を比較したとき、同定または検出される遺伝子配列における変動(例えば、１以上の欠失、挿入または置換)をいう。例えば、多型は、異なる対象からの同じ遺伝子配列を比較したとき、同定され得る。このような多型の同定は当分野で日常的であり、方法は、例えば、乳癌点変異の検出に使用されるものに類似する。同定は、例えば、対象のリンパ球から抽出したＤＮＡから、その後の該多型領域への特異的プライマーを使用する多型領域の増幅により、なされ得る。あるいは、多型は、同じ遺伝子の２個のアレルを比較したとき、同定され得る。
具体的実施態様において、多型は一塩基多型(ＳＮＰ)である。生物内の同じ遺伝子の２個のアレル間の配列の変動を、ここでは「アレル多型」と称する。ある実施態様において、アレル多型はＳＮＰアレルに対応する。例えば、アレル多型は、ここでヘテロ接合型ＳＮＰとも称する、ＳＮＰの２アレル間の単一ヌクレオチド変動を含み得る。多型は、コード領域内のヌクレオチドであり得るが、遺伝子コードの縮重により、違うアミノ酸配列はコードされない。あるいは、多型配列は、特定の位置で異なるアミノ酸をコードし得るが、アミノ酸の変化は、タンパク質機能に影響しない。多型領域はまた遺伝子の非コード化領域にも見られ得る。具体的実施態様において、多型は、遺伝子のコード領域または遺伝子の非翻訳領域(例えば、５’ ＵＴＲまたは３’ ＵＴＲ)に見られる。
ここで使用する用語「アレル頻度」は、個体集団における単一座位でのアレル(例えば、ＳＮＰアレル)の相対頻度の指標(例えば、比率またはパーセンテージ)である。例えば、個体集団が、体細胞の各々に特定の染色体座位(および座位を占拠する遺伝子)のｎ座位を有するならば、アレルのアレル頻度は、該アレルが集団内で占める座位の分数またはパーセンテージである。具体的実施態様において、アレル(例えばＳＮＰアレル)のアレル頻度は、サンプル集団において少なくとも１０％(例えば、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％またはそれ以上)である。
ここで使用する用語「機能獲得型変異」は、遺伝子によりコードされるタンパク質(すなわち、変異体タンパク質)が、通常該タンパク質(すなわち、野生型タンパク質)と関連しない疾患または障害を引き起こすまたは寄与する機能を獲得した、該遺伝子におけるあらゆる変異をいう。機能獲得型変異は、コード化タンパク質における機能の変化を起こす、遺伝子における１以上のヌクレオチドの欠失、付加または置換であり得る。ある実施態様において、機能獲得型変異は、変異体タンパク質の機能を変化させるかまたは他のタンパク質との相互作用を引き起こす。他の実施態様において、機能獲得型変異は、例えば、改変、変異体タンパク質と正常野生型タンパク質の相互作用により、該正常野生型タンパク質の減少または排除を引き起こす。
ここで使用する用語「機能獲得型障害」は、機能獲得型変異により特徴づけられる障害をいう。ある実施態様において、機能獲得型障害は、機能獲得型変異により引き起こされる神経変性疾患、例えば、ポリグルタミン障害および／またはトリヌクレオチド反復障害、例えば、ハンチントン病である。他の実施態様において、機能獲得型障害は、変異遺伝子産物が機能獲得型変異体である癌遺伝子により機能獲得型により引き起こされ、例えば、ｒｅｔ癌遺伝子(例えば、ｒｅｔ－１)の変異により引き起こされる癌、例えば、内分泌腫瘍、甲状腺髄様腫瘍、副甲状腺ホルモン腫瘍、多発性内分泌腺腫症２型などである。付加的例示的機能獲得型障害は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ)、ヒト免疫不全障害(ＨＩＶ)およびスローチャネル型先天性筋無力症候群(ＳＣＣＭＳ)を含むが、これらに限定されない。
ここで使用する用語「トリヌクレオチド反復障害」は、遺伝子内に位置する伸張トリヌクレオチド反復領域により特徴づけられ、伸張トリヌクレオチド反復が疾患または障害の原因である、あらゆる疾患または障害をいう。トリヌクレオチド反復障害の例は、脊髄小脳失調症１２型、脊髄小脳失調症８型、脆弱Ｘ症候群、脆弱ＸＥ精神遅滞、フリードライヒ運動失調症および筋緊張性ジストロフィーを含むが、これらに限定されない。本発明により処置するための例示的トリヌクレオチド反復障害は、疾患または障害を引き起こすまたは原因である変異体タンパク質をコードする遺伝子である、遺伝子のコード領域の５’末端での伸張トリヌクレオチド反復障害により特徴づけられるまたは引き起こされるものである。あるトリヌクレオチド疾患、例えば、変異がコード領域と関連しない脆弱Ｘ症候群は、ＲＮＡｉにより標的とすべき適当なｍＲＮＡが存在しないため、本発明の方法による処置に適し得ない。対照的に、フリードライヒ運動失調症などの疾患は、原因変異はコード領域内にはなく(すなわち、イントロン内にある)、変異は、例えば、ｍＲＮＡ前駆体(例えば、組み換え前のｍＲＮＡ前駆体)内であり得るため、本発明の方法による処置に適し得る。
ここで使用する用語「ポリグルタミン障害」は、コード領域の５’末端の(ＣＡＧ)ｎ反復の伸張(故にコード化タンパク質における伸張ポリグルタミン領域をコードする)により特徴づけられるあらゆる疾患または障害をいう。ある実施態様において、ポリグルタミン障害は、神経細胞の進行性変性により特徴づけられる。ポリグルタミン障害の例は、ハンチントン病、脊髄小脳失調症１型、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症３型(マシャド・ジョセフ病としても知られる)および脊髄小脳失調症６型、脊髄小脳失調症７型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮などを含むが、これらに限定されない。
用語「一塩基多型障害」または「ＳＮＰ障害」は、ＳＮＰ、例えば、ヘテロ接合型ＳＮＰの存在により特徴づけられる障害をいう。ＳＮＰ障害は、フェニルケトン尿症、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、白化症、ハンチントン病、筋緊張性ジストロフィー１型、高コレステロール血症(常染色体優性、Ｂ型)、神経線維腫症(１型)、多嚢胞性腎疾患(１および２)、血友病Ａ、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、Ｘ染色体性低リン酸塩血症性くる病、レット症候群、非閉塞性精子産生不全などを含むが、これらに限定されない。例示的ヘテロ接合型ＳＮＰ障害はハンチントン病である。
ある態様において、アレル多型を含む遺伝子の領域と相補性である約１５～３５ヌクレオチドの第一鎖および第一鎖の少なくとも一部と相補性である約１５～３５ヌクレオチドの第二鎖を含み、ここで、第一鎖は５’末端の２～７位にアレル多型に相補性である一塩基多型(ＳＮＰ)位置ヌクレオチド；および遺伝子におけるヌクレオチドとミスマッチであるＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～１１ヌクレオチドに位置するミスマッチ(ＭＭ)位置ヌクレオチドを含む、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)が提供される。例示的実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは５’末端から２位、４位または６位であり、ミスマッチ(ＭＭ)位置ヌクレオチドはＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～６ヌクレオチドに位置する。
ここで使用する「一塩基多型位置ヌクレオチド」または「ＳＮＰ位置ヌクレオチド」は、標的核酸配列の多型位置(すなわち、ＳＮＰアレルに対応する変異体ヌクレオチドまたは野生型アレルに対応する野生型ヌクレオチドの何れか)に対応する、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｄｓＲＮＡの第一鎖)に対応する位置をいう。例えば、鎖は「ＳＮＰ２」、「ＳＮＰ３」または「ＳＮＰ４」を表示し、鎖の５’末端から２、３または４ヌクレオチドとしてＳＮＰの位置を指定する。
ある例示的実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドはシード領域内である。ある例示的実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２位～７位、５’末端から２位～６位または５’末端から２位～５位に位置する。ある例示的実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｄｓＲＮＡの第一鎖)の５’末端から２位、５’末端から３位、５’末端から４位、５’末端から５位、５’末端から６位または５’末端から７位に位置する。ある例示的実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは表５～７に示す位置に位置する。
ここで使用する用語「シード領域」は、ＲＮＡ鎖の５’末端から２～７位に対応する６ヌクレオチドストレッチをいう。標的ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ認識は、そのアンチセンス鎖のシード領域により付与されると考えられる。
ここで使用する「ミスマッチ位置ヌクレオチド」または「ＭＭ位置ヌクレオチド」は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドと対応しない位置にある、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｄｓＲＮＡの第一鎖)の位置をいう。ＭＭ位置ヌクレオチドは、ここに記載するＲＮＡの５’末端または３’末端(例えば、ｄｓＲＮＡの第一鎖の５’または３’末端)からの位置により規定されまたはここに記載するＲＮＡ(例えば、ｄｓＲＮＡの第一鎖)のＳＮＰ位置ヌクレオチドに対する位置により規定され得る。
ある例示的実施態様において、ＭＭ位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～１１ヌクレオチド、２～１０ヌクレオチド、２～９ヌクレオチド、２～８ヌクレオチド、２～７ヌクレオチドまたは２～６ヌクレオチドに位置する。ある例示的実施態様において、ＭＭ位置ヌクレオチドは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから１１ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、９ヌクレオチド、８ヌクレオチド、７ヌクレオチド、６ヌクレオチド、５ヌクレオチド、４ヌクレオチド、３ヌクレオチドまたは２ヌクレオチドに位置する。ある例示的実施態様において、ＭＭ位置ヌクレオチドは表５～７に示す位置に位置する。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｄｓＲＮＡの第一鎖)は、アレル多型に対応するヌクレオチドの特定の位置での１ミスマッチオリゴヌクレオチド以外、アレル多型と相同である。ある実施態様において、ミスマッチは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの約６ヌクレオチド以内、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの約５ヌクレオチド以内、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの約４ヌクレオチド以内、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの約３ヌクレオチド以内、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの約２ヌクレオチド以内またはＳＮＰ位置ヌクレオチドの約１ヌクレオチド以内である。具体的実施態様において、ミスマッチは、ＳＮＰ位置ヌクレオチドに隣接しない。
他の実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは、５’末端から２位、３位、４位、５位または６位である。ある実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは５’末端から２位である。ある実施態様において、は５’末端から３位である。ある実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは５’末端から４位である。ある実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは５’末端から５位である。ある実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは５’末端から６位である。
ある例示的実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｄｓＲＮＡの第一鎖)は、５’末端から５位、７位、８位、１１位、１４位、１５位または１６位にＭＭ位置ヌクレオチドを含む。ある例示的実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｄｓＲＮＡの第一鎖)は、ＳＮＰ位置ヌクレオチドから１、２、３、４、５、８、９、１０または１１ヌクレオチドにＭＭ位置ヌクレオチドを含む。
ある例示的実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｄｓＲＮＡの第一鎖)は、２－７、４－７、４－８、４－１５、６－５、６－８、６－１１、６－１４、６－１６、３－５、３－７および３－８から選択される、ＳＮＰ位置ヌクレオチド(５’末端から参照)－ＭＭ位置ヌクレオチド(５’末端から参照)組み合わせを含む。
具体的例示的実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｄｓＲＮＡの第一鎖)は、５’末端から６位にＳＮＰ位置ヌクレオチドおよび５’末端から１１位にＭＭ位置ヌクレオチドを含む。他の具体的例示的実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｄｓＲＮＡの第一鎖)は、５’末端から４位にＳＮＰ位置ヌクレオチドおよび５’末端から７位にミスマッチを含む。
ある態様において、ここに提供する二本鎖ＲＮＡは、アレル多型を有する変異体アレルを選択的にサイレンシングする。ある実施態様において、ここに提供する二本鎖ＲＮＡは、アレル多型を有する変異体アレルをサイレンシングし、同じ遺伝子の野生型アレルに影響しない。他の実施態様において、ここに提供する二本鎖ＲＮＡは、アレル多型を有する変異体アレルをサイレンシングし、同じ遺伝子の野生型アレルを、変異体アレルより少ない程度でサイレンシングする。
従って、ある態様において、本発明は、アレル多型と関連する変異体タンパク質により特徴づけられるまたは引き起こされる疾患を有するまたは有するリスクにある対象を処置する方法であって、該対象に、疾患の有効な処置をもたらす遺伝子の配列特異的干渉が生ずるように、有効量の変異体タンパク質(例えば、ハンチンチンタンパク質)をコードする遺伝子内のアレル多型をターゲティングするＲＮＡｉ剤を投与することを含む、方法を提供する。
ある態様において、ここに開示するＲＮＡサイレンシング剤は、多型を含む変異体アレルを、対応する野生型アレルより効率的に優先的にサイレンシングする。ある例示的実施態様において、ここに開示するｄｓＲＮＡは、多型を含むアレルを、対応する野生型アレルより約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％または約９０％多くサイレンシングする。ある実施態様において、ここに開示するＲＮＡサイレンシング剤は、多型を含むアレルを対応する野生型アレルより少なくとも約５０％多くサイレンシングする。ある例示的実施態様において、ここに開示するｄｓＲＮＡは、多型を含むアレルを、対応する野生型アレルのサイレンシングレベルより少なくとも約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍、約５０倍、約５５倍、約６０倍、約６５倍、約７０倍、約７５倍、約８０倍、約８５倍、約９０倍、約９５倍、約１００倍、約１１０倍、約１２０倍、約１３０倍、約１４０倍、約１５０倍、約１６０倍、約１７０倍、約１８０倍、約１９０倍、約２００倍、約２５０倍、約３００倍、約３５０倍、約４００倍、約４５０倍または最大約５００倍のレベルでサイレンシングする。
ここで使用するＲＮＡサイレンシング剤、例えば、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡサイレンシング剤の「アンチセンス鎖」なる用語は、サイレンシングの標的遺伝子のｍＲＮＡの約１０～５０ヌクレオチド、例えば、約１５～３０、１６～２５、１８～２３または１９～２２ヌクレオチドのセクションに実質的に相補性である鎖をいう。アンチセンス鎖または第一鎖は標的特異的サイレンシングを指示するために所望の標的ｍＲＮＡ配列に十分に相補性、例えば、ＲＮＡｉ機構または過程(ＲＮＡｉ干渉)による所望の標的ｍＲＮＡの破壊の誘導のためにまたは所望の標的ｍＲＮＡの翻訳抑制の誘導のために十分に相補性である配列を有する。
ＲＮＡサイレンシング剤の「センス鎖」または「第二鎖」、例えば、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡサイレンシング剤のなる用語は、アンチセンス鎖または第一鎖に相補性である鎖をいう。アンチセンスおよびセンス鎖は第一鎖または第二鎖とも呼んでよく、第一鎖または第二鎖は標的配列に相同性を有し、各第二または第一鎖は該第一鎖または第二鎖に相同性を有する。ｍｉＲＮＡ二重鎖中間体またはｓｉＲＮＡ様二重鎖はサイレンシングの標的遺伝子のｍＲＮＡの約１０～５０ヌクレオチドのセクションに十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ鎖およびｍｉＲＮＡ鎖と二重鎖を形成するために十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ＊鎖を含む。
ここで使用する用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「ＡＳＯ」は、標的ＲＮＡの領域を効果的な方法で、例えば、標的ｍＲＮＡの翻訳および／または標的プレｍＲＮＡのスプライシングを阻害するのに有効な方法で遮断するために、ＲＮＡ(例えば、ＳＮＰ含有ｍＲＮＡまたはＳＮＰ含有プレｍＲＮＡ)を標的とするのに十分な配列相補性を有する、核酸(例えば、ＲＮＡ)をいう。「標的ＲＮＡに十分に相補性の配列」を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス剤がスプライシングをそれ以外の方法で調節するタンパク質の結合部位を遮断するのに十分な配列を有するおよび／またはアンチセンス剤がリボソームの結合部位を遮断するのに十分な配列を有するおよび／またはアンチセンス剤がスプライシングおよび／または翻訳を阻止するために標的化ＲＮＡの三次構造を変えるのに十分な配列を有することを意味する。
ここで使用するアンチセンス鎖の５’末端における「５’末端」は、５’末端ヌクレオチド、例えば、アンチセンス鎖の５’末端の１～約５ヌクレオチドをいう。ここで使用するセンス鎖の３’末端における「３’末端」は、相補性アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドと相補性である領域、例えば、１～約５ヌクレオチドの領域をいう。
ここで使用する用語「塩基対」は、オリゴヌクレオチド二重鎖(例えば、ＲＮＡサイレンシング剤の鎖と標的ｍＲＮＡ配列により形成された二重鎖)の対面する鎖のヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)対間の、主に該ヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)間のＨ結合、ファンデルワールス相互作用などによる、相互作用をいう。ここで使用する用語「結合強度」または「塩基対強度」は、塩基対の強度をいう。
ここで使用する用語「ミスマッチ塩基対」は、例えば、正常相補性Ｇ：Ｃ、Ａ：ＴまたはＡ：Ｕ塩基対ではない、非相補性または非ワトソン・クリック塩基対からなる塩基対をいう。ここで使用する用語「曖昧塩基対」(非識別的塩基対としても知られる)は、普遍的ヌクレオチドから形成される塩基対をいう。
本発明のコンジュゲート化合物に有用なリンカーは、グリコール鎖(例えば、ポリエチレングリコール)、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびこれらの組み合わせをいう。ここで使用する略語「ＴＥＧ」は、トリエチレングリコールをいう。
オリゴヌクレオチドの設計
ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチド、例えば、ｓｉＲＮＡは、センス鎖および相補性アンチセンス鎖を含む二重鎖であり、アンチセンス鎖はＲＮＡｉに介在するためにアレル多型を含む標的ｍＲＮＡに十分な相補性を有する。例示的実施態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、約１０～５０またはそれ以上のヌクレオチド長を有し、すなわち、各鎖は１０～５０ヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)を有する。具体的例示的実施態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、各鎖約１５～３５、例えば、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４または約３５ヌクレオチド長を有し、ここで、鎖の一方は標的領域に十分に相補性である。
例示的実施態様において、鎖は鎖をアニールしたとき、二重鎖の一端または両端に１、２または３残基のオーバーハングが生ずるように、整列しない(すなわち、対面する鎖に相補性塩基がない)少なくとも１、２または３塩基が鎖の末端にあるように整列される。例示的実施態様において、ｓｉＲＮＡ分子は約１０～５０またはそれ以上のヌクレオチド長を有し、すなわち、各鎖は１０～５０ヌクレオチド(またはヌクレオチドアナログ)含む。具体的例示的実施態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、各鎖約１５～３５、例えば、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４または約３５ヌクレオチド長を有し、ここで、鎖の一方は、アレル多型を含む標的配列に実質的に相補性であり、他方の鎖は第一鎖に相補性または実質的に相補性である。ある実施態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、アレル多型を含む標的配列に、二次ミスマッチとしても知られる１つの付加的ミスマッチ以外、完全相補性である。
ある実施態様において、各鎖は１０～５０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたは５０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)含む。ある実施態様において、各鎖は１０～４９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたは４９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)含む。ある実施態様において、各鎖は１０～４８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたは４８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)含む。ある実施態様において、各鎖は１０～４７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたは４７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)含む。ある実施態様において、各鎖は１０～４６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたは４６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)含む。ある実施態様において、各鎖は１０～４５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３５
ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたは４５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)含む。ある実施態様において、各鎖は１０～４４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたは４４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)含む。ある実施態様において、各鎖は１０～４３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたは４３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)含む。ある実施態様において、各鎖は１０～４２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたは４２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)含む。ある実施態様において、各鎖は１０～４１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、４０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたは４１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)含む。ある実施態様において、各鎖は１０～４０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたは４０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)含む。ある実施態様において、各鎖は１０～３９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたは３９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)含む。ある実施態様において、各鎖は１０～３８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナロ
グ、２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたは３８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)含む。ある実施態様において、各鎖は１０～３７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたは３７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)含む。ある実施態様において、各鎖は１０～３６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたは３６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)含む。ある実施態様において、各鎖は１０～３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたは３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)含む。ある実施態様において、各鎖は１１～３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたは３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)含む。ある実施態様において、各鎖は１２～３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたは３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)含む。ある実施態様において、各鎖は１３～３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたは３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)含む。ある実施態様において、各鎖は１４～３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたは３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)含む。ある実施態様において、各鎖は１５～３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ(例えば、１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、２９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、３４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたは３５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ)含む。
ある実施態様において、ｓｉＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖(例えば、上記のとおり)を含み、アンチセンス鎖は１５～２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長、例えば１６～２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長、１７～２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長、１８～２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長または１９～２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、アンチセンス鎖は１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、アンチセンス鎖は１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、アンチセンス鎖は１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、アンチセンス鎖は１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、アンチセンス鎖は１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、アンチセンス鎖は２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、アンチセンス鎖は２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、アンチセンス鎖は２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、アンチセンス鎖は２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、アンチセンス鎖は２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。
ある実施態様において、ｓｉＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖(例えば、上記のとおり)を含み、センス鎖は１０～２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長、例えば、１１～１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長、１２～１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長、１３～１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長または１４～１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、センス鎖は１０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、センス鎖は１１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、センス鎖は１２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、センス鎖は１３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、センス鎖は１４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、センス鎖は１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、センス鎖は１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、センス鎖は１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、センス鎖は１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、センス鎖は１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、センス鎖は２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。
ある実施態様において、ｓｉＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖(例えば、上記のとおり)を含み、ここで、アンチセンス鎖は１５～２５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有し、センス鎖は１０～２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、アンチセンス鎖は１６～２４ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有し、センス鎖は１１～１９ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、アンチセンス鎖は１７～２３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有し、センス鎖は１２～１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、アンチセンス鎖は１８～２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有し、センス鎖は１３～１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。ある実施態様において、アンチセンス鎖は１９～２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有し、センス鎖は１４～１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。
ある実施態様において、ｓｉＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖(例えば、上記のとおり)を含み、ここで、アンチセンス鎖は２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有し、センス鎖は１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。
ある実施態様において、ｓｉＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖(例えば、上記のとおり)を含み、ここで、アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有し、センス鎖は１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。
ある実施態様において、ｓｉＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖(例えば、上記のとおり)を含み、ここで、アンチセンス鎖は２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有し、センス鎖は１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。
ある実施態様において、ｓｉＲＮＡはセンス鎖およびアンチセンス鎖(例えば、上記のとおり)を含み、ここで、アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有し、センス鎖は１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する。
一般に、ｓｉＲＮＡは、当分野で知られる何れかの方法を使用して、例えば、次のプロトコールを使用して、設計され得る：
１. ｓｉＲＮＡは、アレル多型を含む標的配列に特異的であり得る。例示的実施態様において、第一鎖は、アレル多型を含む標的配列に対して１ミスマッチを有して、アレル多型を含む標的配列に実質的に相補性であり、他方の鎖は第一鎖に実質的に相補性である。ある実施態様において、標的配列は標的遺伝子のコード領域外である。例示的標的配列は、標的遺伝子の５’非翻訳領域(５’－ＵＴＲ)またはイントロン領域から選択される。ｍＲＮＡのこれらの部位での開裂は、対応する変異体タンパク質の翻訳を排除すべきである。ｈｔｔ遺伝子の他の領域からの標的配列も、ターゲティングに適する。センス鎖は標的配列に基づき設計される。さらに、低Ｇ／Ｃ含量(３５～５５％)のｓｉＲＮＡは、５５％より高いＧ／Ｃ含量よりさらに活性であり得る。故に、ある実施態様において、本発明は、３５～５５％Ｇ／Ｃ含量を有する核酸分子を含む。
２. ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、選択した標的部位の配列およびアレル多型の位置に基づき設計される。例示的実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ＰＫＲ応答を誘発しない(すなわち、十分に長さが短い)。しかしながら、長いＲＮＡサイレンシング剤は、例えば、ＰＫＲ応答を生じることができない細胞型またはＰＫＲ応答が別の方法で下方制御または弱められている状況で、有用であり得る。
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡがＲＮＡｉに介在できるよう、標的配列と十分な相補性を有する。一般に、標的遺伝子のＲＩＳＣ介在開裂を行うのに標的遺伝子の標的配列部分と十分に同一であるヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡが使用される。従って、ある例示的実施態様において、ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、アレル多型を含む標的の部分と十分に同一である配列を有するよう設計される。本発明は、ＲＮＡｉの効率および特異性を増強するために、ある配列変動に寛容であることができるとの利点を有する。ある態様において、センス鎖は、野生型および変異体アレル、例えば、機能獲得型変異を含む標的領域の間の少なくとも１個の塩基対により異なる標的領域などのアレル多型を含む標的領域と１個のミスマッチヌクレオチドを有し、他方の鎖は第一鎖と同一または実質的に同一である。ある実施態様において、ミスマッチは、アレル多型に対応するヌクレオチドの４ヌクレオチド上流、３ヌクレオチド上流、アレル多型に対応するヌクレオチドの２ヌクレオチド上流、１ヌクレオチド上流、アレル多型に対応するヌクレオチドの１ヌクレオチド下流、アレル多型に対応するヌクレオチドの２ヌクレオチド下流、アレル多型に対応するヌクレオチドの３ヌクレオチド下流、アレル多型に対応するヌクレオチドの４ヌクレオチド下流またはアレル多型に対応するヌクレオチドの５ヌクレオチド下流である。ある実施態様において、ミスマッチは、アレル多型に対応するヌクレオチドに隣接しない。さらに、１または２ヌクレオチドの小さな挿入または欠失を有するｓｉＲＮＡ配列もＲＮＡｉの介在に有効であり得る。あるいは、ヌクレオチドアナログ置換または挿入を有するｓｉＲＮＡ配列は、阻害に有効であり得る。
配列同一性は、当分野で知られる配列比較およびアラインメントアルゴリズムにより決定し得る。２核酸配列(または２アミノ酸配列)のパーセント同一性を決定するために、配列を、最適比較目的で整列させる(例えば、最適アラインメントのために、第一配列または第二配列にギャップを導入してよい)。次いで、対応するヌクレオチド(またはアミノ酸)位置のヌクレオチド(またはアミノ酸残基)を比較する。第一配列におけるある位置が第二配列における対応する位置と同じ残基で選挙されているならば、これら分子はその位置で同一である。２配列間のパーセント同一性は、これら配列により共有される同一位置の数の関数であり(すなわち、パーセント(％)相同性＝同一位置数／位置総数×１００)、所望により導入したギャップ数および／または導入したギャップ長に対するスコアのペナルティーを科す。
２配列の比較およびそれら配列のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。ある実施態様において、アラインメントを、整列させた配列の十分な同一性を有するある部分にわたり作成するが、同一性の程度が低い部分ではそうしない(すなわち、非重要(local)アラインメント)。配列比較に利用する非重要アラインメントアルゴリズムの例示的、非限定的例は、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77により改変された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＢＬＡＳＴプログラム(version 2.0)に組み込まれる。
他の実施態様において、アラインメントは、適切なギャップの導入により最適化され、パーセント同一性は、整列した配列長にわたり決定される(すなわち、ギャップ付アラインメント)。比較目的でギャップ付アラインメントを得るために、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のとおり、ギャップ付ＢＬＡＳＴを利用し得る。他の実施態様において、アラインメントは適切なギャップの導入により最適化され、パーセント同一性は、整列した配列の長さ全体にわたり決定される(すなわち、包括的アラインメント)。配列の包括的比較に利用するための数学的アルゴリズムの例示的、非限定的例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である整列プログラム(version 2.0)に組み込まれる。アミノ酸配列比較のために整列プログラムを使用するとき、ＰＡＭ１２０荷重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４が使用され得る。
３. ｓｉＲＮＡのアンチセンスまたはガイド鎖は、通常はセンス鎖と同じ長さであり、相補性ヌクレオチドを含む。ある実施態様において、ガイドおよびセンス鎖は完全相補性であり、鎖は、整列またはアニールしたとき、平滑末端である。他の実施態様において、ｓｉＲＮＡの鎖は、１～４、例えば、２、ヌクレオチドの３’オーバーハングを有するような方法で対合され得る。オーバーハングは、標的遺伝子配列(またはその相補体)に対応するヌクレオチドを含み得る(または該ヌクレオチドからなり得る))。あるいは、オーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド、例えばｄＴｓまたはヌクレオチドアナログまたは他の適当な非ヌクレオチド物質を含み得る(またはそれからなり得る)。故に、他の実施態様において、核酸分子は、ＴＴなどの２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含み得る。オーバーハンギングヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。上記のとおり、変異体：野生型ミスマッチがプリン：プリンミスマッチである標的領域の選択が望ましい。
４. 当分野で知られる何れかの方法を使用して、潜在的標的を適切なゲノムデータベース(ヒト、マウス、ラットなど)と比較し、他のコード配列と相当な相同性を有するあらゆる標的配列を検討から除く。このような配列相同性サーチのための方法は、National Center for Biotechnology Informationウェブサイトで利用可能なＢＬＡＳＴとして知られる。
５. 評価基準を満たす１以上の配列を選択。
ｓｉＲＮＡの設計および使用に関するさらなる一般的情報は、The Max-Plank-Institut fur Biophysikalishe Chemieウェブサイトで利用可能な「The siRNA User Guide」に見られ得る。
あるいは、ｓｉＲＮＡを、標的配列とハイブリダイズできるヌクレオチド配列(またはオリゴヌクレオチド配列)として機能的に定義し得る(例えば、４００mM ＮａＣｌ、４０mM ＰＩＰＥＳ ｐＨ６.４、１mM ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃ハイブリダイゼーションで１２～１６時間；続く洗浄)。付加的例示的ハイブリダイゼーション条件は、１×ＳＳＣで７０℃または１×ＳＳＣで５０℃、５０％ホルムアミドでハイブリダイゼーション、続く０.３×ＳＳＣで７０℃の洗浄または４×ＳＳＣで７０℃または４×ＳＳＣで５０℃、５０％ホルムアミドのハイブリダイゼーション、続く１×ＳＳＣで６７℃の洗浄を含む。５０塩基対未満の長さと推定されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度(Ｔｍ)より５～１０℃低くすべきであり、ここで、Ｔｍは、次の式に従い、決定される。１８塩基対未満の長さのハイブリッドについて、Ｔｍ(℃)＝２(Ａ＋Ｔ塩基の数)＋４(Ｇ＋Ｃ塩基の数)。１８～４９塩基対の長さのハイブリッドについて、Ｔｍ(℃)＝８１.５＋１６.６(ｌｏｇ１０[Ｎａ＋])＋０.４１(％Ｇ＋Ｃ)－(６００／Ｎ)、ここで、Ｎはハイブリッドにおける塩基数であり、[Ｎａ＋]はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である(１×ＳＳＣの[Ｎａ＋]＝０.１６５Ｍ)。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件のさらなる例は、Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11, and Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4に提供され、全ての目的で、引用により全体としてここに包含させる。
陰性対照ｓｉＲＮＡは、適切なゲノムと相当な配列相補性がない以外、選択したｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するべきである。このような陰性対照は、選択したｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列の無作為化により設計され得る。相同性サーチを実施して、陰性対照が適切なゲノムにおけるあらゆる他の遺伝子と相同性を欠くことを確認し得る。さらに、陰性対照ｓｉＲＮＡを、配列に１以上の塩基ミスマッチを導入することにより設計し得る。
６. ｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡ(例えば、野生型または変異体ハンチンチンｍＲＮＡ)を破壊する有効性を検証するために、ｓｉＲＮＡを、ショウジョウバエベースのインビトロｍＲＮＡ発現系で標的ｃＤＮＡ(例えば、ハンチンチンｃＤＮＡ)とインキュベートし得る。３２Ｐで放射標識された、新たに合成された標的ｍＲＮＡ(例えば、ハンチンチンｍＲＮＡ)を、アガロースゲルでオートラジオグラフィーにより検出する。開裂標的ｍＲＮＡの存在は、ｍＲＮＡヌクレアーゼ活性を示す。適当な対照は、ｓｉＲＮＡの脱落および非標的ｃＤＮＡの使用を含む。あるいは、適切な標的遺伝子に相当な配列相補性がない以外、選択したｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有する対照ｓｉＲＮＡを選択する。このような陰性対照は、選択したｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列の無作為化により設計され得る。相同性サーチを実施して、陰性対照が適切なゲノムにおけるあらゆる他の遺伝子と相同性を欠くことを確認し得る。さらに、陰性対照ｓｉＲＮＡを、配列に１以上の塩基ミスマッチを導入することにより、設計し得る。
ｓｉＲＮＡを、上記標的配列の何れかを標的とするよう設計し得る。該ｓｉＲＮＡは、標的配列のサイレンシングに介在するために標的配列と十分相補性であるアンチセンス鎖を含む。ある実施態様において、ＲＮＡサイレンシング剤はｓｉＲＮＡである。
最適ｍＲＮＡ特異性および最大ｍＲＮＡ開裂をもたらすｓｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ相補性の部位が選択される。
ｓｉＲＮＡ様分子
本発明のｓｉＲＮＡ様分子は、ＲＮＡｉまたは翻訳抑制により遺伝子サイレンシングを支持するために標的配列のｍＲＮＡ(例えばｈｔｔ ｍＲＮＡ)と、「十分に相補性」である配列を有する(すなわち、配列を有する鎖を有する)。ｓｉＲＮＡ様分子は、センス鎖と標的ＲＮＡの間の配列同一性の程度がｍｉＲＮＡとその標的の間で観察されるものに近似する以外、ｓｉＲＮＡ分子と同じ方法で設計される。一般に、ｍｉＲＮＡ配列と対応する標的遺伝子配列の間の配列同一性の程度が減るにつれて、ＲＮＡｉではなく翻訳抑制により転写後遺伝子サイレンシングに介在する傾向が上がる。それ故に、別の実施態様において、標的遺伝子の翻訳抑制による転写後遺伝子サイレンシングが望ましいとき、ｍｉＲＮＡ配列は、標的遺伝子配列と部分的相補性を有する。ある実施態様において、ｍｉＲＮＡ配列は、標的ｍＲＮＡ内に分散する１以上の短配列(相補性部位)と部分的相補性を有する(例えば、標的ｍＲＮＡの３’－ＵＴＲ内)(Hutvagner and Zamore, Science, 2002; Zeng et al., Mol. Cell, 2002; Zeng et al., RNA, 2003; Doench et al., Genes & Dev., 2003)。翻訳抑制の機構が協調的であるため、ある実施態様において複数相補性部位(例えば、２、３、４、５または６)が標的化され得る。
ｓｉＲＮＡ様二重鎖がＲＮＡｉまたは翻訳抑制に介在する能力は、相補性の部位での標的遺伝子配列とサイレンシング剤のヌクレオチド配列の間の非同一ヌクレオチドの分布により予測し得る。ある実施態様において、翻訳抑制による遺伝子サイレンシングが望ましいとき、ｍｉＲＮＡガイド鎖と標的ｍＲＮＡにより形成された二重鎖が中央突出部「バルジ」(bulge)を含むように、相補性部位の中央部分に少なくとも１個の非同一ヌクレオチドが存在する(Doench J G et al., Genes & Dev., 2003)。他の実施態様において、２、３、４、５または６連続または非連続非同一ヌクレオチドが導入される。揺らぎ塩基対(例えば、Ｇ：Ｕ)またはミスマッチ塩基対(Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：Ｃ、Ｕ：Ｕ)を形成するように、非同一ヌクレオチドが選択され得る。さらなる例示的実施態様において、突出部は、ｍｉＲＮＡ分子の５’末端からヌクレオチド位置１２および１３を中心とする。
修飾ＲＮＡサイレンシング剤
本発明のある態様において、上記の本発明のＲＮＡサイレンシング剤(またはその何らかの部分)は、該剤の活性がさらに改善されるよう、修飾され得る。例えば、上記ＲＮＡサイレンシング剤を、上記修飾の何れかで修飾し得る。修飾は、一部、さらに標的識別を増強する、該剤の安定性を増強する(例えば、分解を阻止する)、細胞取り込みを促進する、標的効率を増強する、結合(例えば、標的への)の有効性を改善する、該剤への患者耐容性を改善するおよび／または毒性を低減するために作用し得る。
１)標的識別を増強するための修飾
ある実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、単一ヌクレオチド標的識別を増強するために、不安定化ヌクレオチドで置換し得る(両者とも引用により本明細書に包含させる２００７年１月２５日出願の米国出願１１／６９８,６８９および２００６年１月２５日出願の米国仮出願６０／７６２,２２５参照)。このような修飾は、標的ｍＲＮＡ(例えば機能獲得型変異体ｍＲＮＡ)へのＲＮＡサイレンシング剤の特異性に明らかにに影響することなく、非標的ｍＲＮＡ(例えば野生型ｍＲＮＡ)に対するＲＮＡサイレンシング剤の特異性をなくすのに十分であり得る。
ある例示的実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、そのアンチセンス鎖における少なくとも１個の普遍的ヌクレオチドの導入により修飾される。普遍的ヌクレオチドは、４種の慣用ヌクレオチド塩基(例えばＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕ)の何れかと無差別に塩基対形成できる塩基部分を含む。普遍的ヌクレオチドは、一般にＲＮＡ二重鎖またはＲＮＡサイレンシング剤のガイド鎖と標的ｍＲＮＡの間で形成された二重鎖の安定性への影響が比較的小さいため、利用される。例示的普遍的ヌクレオチドは、イノシン塩基部分またはデオキシイノシン(例えば２’－デオキシイノシン)、７－デアザ－２’－デオキシイノシン、２’－アザ－２’－デオキシイノシン、ＰＮＡ－イノシン、モルホリノ－イノシン、ＬＮＡ－イノシン、ホスホロアミデート－イノシン、２’－Ｏ－メトキシエチル－イノシンおよび２’－ＯＭｅ－イノシンからなる群から選択されるイノシンアナログ塩基部分を有するものを含む。具体的例示的実施態様において、普遍的ヌクレオチドはイノシン残基またはその天然に存在するアナログである。
ある実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、特異性決定ヌクレオチドから１１ヌクレオチド以内(例えば、疾患関連多型(例えば、ＳＮＰ位置ヌクレオチド)を認識するヌクレオチドから１１ヌクレオチド以内)の少なくとも１個の不安定化ヌクレオチドの導入により修飾される。例えば、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドから１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ヌクレオチド以内の位置に導入され得る。例示的実施態様において、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドから３ヌクレオチドである位置に(すなわち、不安定化ヌクレオチドと特異性決定ヌクレオチドの間に２個の安定化ヌクレオチドがあるように)導入される。２個の鎖または鎖部分を有するＲＮＡサイレンシング剤(例えば、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ)において、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドを含まない鎖または鎖部分に導入され得る。具体的例示的実施態様において、不安定化ヌクレオチドは、特異性決定ヌクレオチドを含むのと同じ鎖または鎖部分に導入される。
ある実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、式１：
Figure 2022547790000001
 〔式中、
ＤはＯ、ＯＣＨ２、ＯＣＨ、ＣＨ２およびＣＨからなる群から選択され；
ＣはＯ－、ＯＨ、ＯＲ１、ＮＨ－、ＮＨ２、Ｓ－およびＳＨからなる群から選択され；
ＡはＯおよびＣＨ２からなる群から選択され；
Ｒ１は保護基であり；
---は任意の二重結合であり；そして
サブユニット間は、２個の所望により修飾されたヌクレオシドで架橋される。〕
の修飾サブユニット間結合の導入により修飾される。
ある実施態様において、ＣがＯ－であるとき、ＡまたはＤはＯではない。
ある実施態様において、ＤはＣＨ２である。他の実施態様において、式VIIIの修飾サブユニット間結合は、式２
Figure 2022547790000002
 の修飾サブユニット間結合である。
ある実施態様において、ＤはＯである。他の実施態様において、式VIIIの修飾サブユニット間結合は、式３
Figure 2022547790000003
 の修飾サブユニット間結合である。
ある実施態様において、ＤはＣＨである。他の実施態様において、式VIIIの修飾サブユニット間結合は、式４
Figure 2022547790000004
 の修飾サブユニット間結合である。
他の実施態様において、修飾サブユニット間結合は、式５
Figure 2022547790000005
 の修飾サブユニット間結合である。
ある実施態様において、ＤはＯＣＨ２である。他の実施態様において、修飾サブユニット間結合は、式６
Figure 2022547790000006
 の修飾サブユニット間結合である。
他の実施態様において、式VIIの修飾サブユニット間結合は、式７
Figure 2022547790000007
 の修飾サブユニット間結合である。
ある実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、図４３のサブユニット間リンカーの１以上の導入により修飾される。ある例示的実施態様において、図４３のサブユニット間リンカーを、ＳＮＰ位置ヌクレオチドと、アンチセンス鎖のＳＮＰ位置ヌクレオチドに直接隣接し、何れかの側にある位置のヌクレオチドの間に挿入する。
ある実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、次の式
Figure 2022547790000008
 を有するサブユニット間リンカーの１以上のビニルホスホネート(ＶＰ)モチーフの導入により、修飾される。
ある実施態様において、ＶＰモチーフは、オリゴヌクレオチド、例えば、ＲＮＡの任意の位置に挿入される。例えば、２０ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドについて、ＶＰモチーフを、位置１－２、２－３、３－４、４－５、５－６、６－７、７－８、８－９、９－１０、１０－１１、１１－１２、１２－１３、１３－１４、１４－１５、１５－１６、１６－１７、１７－１８、１８－１９または１９－２０およびこれらの任意の組み合わせに挿入できる。
ある例示的実施態様において、ＶＰモチーフを、アンチセンス鎖の１－２、５－６、６－７、１０－１１、１８－１９および／または１９－２０の一か所以上に挿入する。
他の例示的実施態様において、ＶＰモチーフをアンチセンス鎖の１－２、６－７、１０－１１および／または１９－２０の一か所以上に挿入する。
ある例示的実施態様において、ＶＰモチーフは、アンチセンス鎖のＳＮＰ位置ヌクレオチドの隣(すなわち、ＳＮＰ位置ヌクレオチドと、ＳＮＰ位置ヌクレオチドに直接隣接し、何れかの側の位置のヌクレオチドの間)に挿入する。他の例示的実施態様において、ＶＰモチーフをアンチセンス鎖のＭＭ位置ヌクレオチドの隣(すなわち、ＭＭ位置ヌクレオチドと、ＭＭ位置ヌクレオチドに直接隣接し、何れかの側の位置のヌクレオチドの間)に挿入する。
２)有効性および特異性を増強するための修飾
ある実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、非対称性設計基準に従いＲＮＡｉ介在における有効性および特異性の増強を促進するために改変し得る(米国特許８,３０９,７０４、７,７５０,１４４、８,３０４,５３０、８,３２９,８９２および８,３０９,７０５参照)。このような改変は、アンチセンス鎖が優先的に標的ｍＲＮＡの開裂または翻訳抑制をガイドし、そうして、標的開裂およびサイレンシングの効率を増加または改善するように、センス鎖に優先して、ｓｉＲＮＡ(例えば、本発明の方法を使用して設計されたｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡから産生されたｓｉＲＮＡ)のアンチセンス鎖のＲＩＳＣへの侵入を促進する。例示的実施態様において、ＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、ＲＮＡサイレンシング剤のアンチセンス鎖３’末端(ＡＳ ３’)とセンス鎖５’末端(Ｓ ’５)間の結合強度または塩基対強度に比して、該ＲＮＡサイレンシング剤のアンチセンス鎖５’末端(ＡＳ ５’)とセンス鎖３’末端(Ｓ ３’)の間の塩基対強度を低減することにより増強される。
ある実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、第一またはアンチセンス鎖の３’末端とセンス鎖部分の５’末端の間より、第一またはアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端の間に存在するＧ：Ｃ塩基対が少ないように増強され得る。他の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、第一またはアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端の間に少なくとも１個のミスマッチ塩基対が存在するように増強され得る。ある例示的実施態様において、ミスマッチ塩基対は、Ｇ：Ａ、Ｃ：Ａ、Ｃ：Ｕ、Ｇ：Ｇ、Ａ：Ａ、Ｃ：ＣおよびＵ：Ｕからなる群から選択される。他の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、第一またはアンチセンス鎖の５’末端とセンス鎖部分の３’末端の間に、少なくとも１個の揺らぎ塩基対、例えば、Ｇ：Ｕが存在するように、増強され得る。他の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、希ヌクレオチド、例えば、イノシン(Ｉ)を含む少なくとも１個の塩基対が存在するように、増強され得る。例示的実施態様において、塩基対は、Ｉ：Ａ、Ｉ：ＵおよびＩ：Ｃからなる群から選択される。さらに他の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の非対称性は、修飾ヌクレオチドを含む少なくとも１個の塩基対が存在するように、増強され得る。具体的実施態様において、修飾ヌクレオチドは、２－アミノ－Ｇ、２－アミノ－Ａ、２,６－ジアミノ－Ｇおよび２,６－ジアミノ－Ａからなる群から選択される。
ある実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、次の式
Figure 2022547790000009
 を有するビニルホスホネート(ＶＰ)モチーフの導入により、オリゴヌクレオチドにおける１以上のサブユニット間結合が改変される。
３)安定性が増強されたＲＮＡサイレンシング剤
本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、血清または細胞培養のための増殖培地での安定性を改善するよう修飾され得る。安定性を増強するために、３’残基を分解に対して安定化でき、例えば、プリンヌクレオチド、特にアデノシンまたはグアノシンヌクレオチドからなるように選択され得る。あるいは、ピリミジンヌクレオチドの修飾アナログによる置換、例えば、ウリジンの２’－デオキシチミジンによる置換は寛容性であり、ＲＮＡ干渉の効率に影響しない。
特定の態様において、本発明は、対応する非修飾ＲＮＡサイレンシング剤と比較してインビボ安定性が増強されるように、第二鎖および／または第一鎖が修飾ヌクレオチドでの内部ヌクレオチドの置換により修飾されている、第一鎖および第二鎖を含むＲＮＡサイレンシング剤に関する。ここに定義する「内部」ヌクレオチドは、核酸分子、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端以外のどこかの位置のものである。内部ヌクレオチドは、一本鎖分子内または二重鎖もしくは二本鎖分子の鎖内であり得る。ある実施態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、少なくとも１個の内部ヌクレオチドの置換により修飾される。他の実施態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上の内部ヌクレオチドの置換により修飾される。他の実施態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、内部ヌクレオチドの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の置換により修飾される。さらに他の実施態様において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、全内部ヌクレオチドの置換により修飾される。
本発明の特定の実施態様において、ＲＮＡサイレンシング剤は、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドアナログを含み得る。ヌクレオチドアナログは、標的特異的サイレンシング活性、例えば、ＲＮＡｉ介在活性または翻訳抑制活性が実質的に影響されない位置、例えば、ｓｉＲＮＡ分子の５’末端および／または３’末端の領域に位置し得る。特に、末端は、修飾ヌクレオチドアナログの組み込みにより安定化し得る。
ある実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、次の式
Figure 2022547790000010
 のビニルホスホネート(ＶＰ)モチーフの導入により、オリゴヌクレオチドの１以上のサブユニット間結合が改変される。
多様なオリゴヌクレオチドタイプ(例えば、ギャップマー、ミックスマー、ｍｉＲＮＡ阻害剤、スプライス－スイッチングオリゴヌクレオチド(「ＳＳＯ」)、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド(「ＰＭＯ」)、ペプチド核酸(「ＰＮＡ」)など)を、ここに記載するオリゴヌクレオチドに、所望により、ここにおよび、例えば、米国出願１５／０８９,４２３；米国出願１５／２３６,０５１；米国出願１５／４１９,５９３；米国出願１５／６９７,１２０および米国特許９,８０９,８１７；および米国出願１５／８１４,３５０および米国特許９,８６２,３５０(各々全ての目的で、引用により全体としてここに包含させる)に記載の種々の修飾(例えば、化学修飾)および／またはコンジュゲーションの組み合わせを利用して、使用できる。
例示的ヌクレオチドアナログは、糖および／または主鎖修飾リボヌクレオチドを含む(すなわち、ホスフェート－糖主鎖の修飾を含む)。例えば、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合を、少なくとも１個の窒素または硫黄ヘテロ原子を含むよう修飾し得る。例示的主鎖修飾リボヌクレオチドにおいて、隣接リボヌクレオチドに接続するホスホエステル基を、例えば、ホスホチオエート基の修飾基で置き換える。例示的糖修飾リボヌクレオチドにおいて、２’ ＯＨ基を、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＯＮ(式中、ＲはＣ１－Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである)から選択される基で置き換える。
具体的実施態様において、修飾は２’－フルオロ、２’－アミノおよび／または２’－チオ修飾である。特に例示的修飾は、２’－フルオロ－シチジン、２’－フルオロ－ウリジン、２’－フルオロ－アデノシン、２’－フルオロ－グアノシン、２’－アミノ－シチジン、２’－アミノ－ウリジン、２’－アミノ－アデノシン、２’－アミノ－グアノシン、２,６－ジアミノプリン、４－チオ－ウリジンおよび／または５－アミノ－アリル－ウリジンを含む。特定の実施態様において、２’－フルオロリボヌクレオチドは、全ウリジンおよびシチジンである。付加的例示的修飾は、５－ブロモ－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、５－メチル－シチジン、リボ－チミジン、２－アミノプリン、２’－アミノ－ブチリル－ピレン－ウリジン、５－フルオロ－シチジンおよび５－フルオロ－ウリジンである。２’－デオキシ－ヌクレオチドおよび２’－Ｏｍｅヌクレオチドも、本発明の修飾ＲＮＡ－サイレンシング剤部分内に使用され得る。付加的修飾残基は、デオキシ－脱塩基、イノシン、Ｎ３－メチル－ウリジン、Ｎ６,Ｎ６－ジメチル－アデノシン、シュードウリジン、プリンリボヌクレオシドおよびリバビリンを含む。具体的例示的実施態様において、２’部分は、連結部分が２’－Ｏ－メチルオリゴヌクレオチドであるように、メチル基である。
ある例示的実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ロックド核酸(ＬＮＡ)を含む。ＬＮＡは、ヌクレアーゼ活性に耐え(高度に安定)、ｍＲＮＡの単一ヌクレオチド識別を有する、糖修飾ヌクレオチドである(Elmen et al., Nucleic Acids Res., (2005), 33(1): 439-447; Braasch et al. (2003) Biochemistry 42:7967-7975, Petersen et al. (2003) Trends Biotechnol. 21:74-81)。これら分子は、２’－デオキシ－２’’－フルオロウリジンなどで修飾される可能性がある、２’－Ｏ,４’－Ｃ－エチレン架橋核酸を有する。さらに、ＬＮＡは、糖部分を３’末端立体配座に拘縮し、それにより、ヌクレオチドを塩基対形成のために予め編成され、オリゴヌクレオチドの融解温度を、塩基あたり１０℃ほども増加させることにより、オリゴヌクレオチドの特異性を増加させる。
他の例示的実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤はペプチド核酸(ＰＮＡ)を含む。ＰＮＡは、ヌクレオチドの糖－ホスフェート部分が、ヌクレアーゼ消化に高度に耐性であり、分子の結合特異性を改善させる、ポリアミド主鎖の形成ができる中性２－アミノエチルグリシン部分で置き換えられた修飾ヌクレオチドを含む(Nielsen, et al., Science, (2001), 254: 1497-1500)。
ある例示的実施態様において、天然に存在する核酸塩基ではなく、少なくとも１個の天然に存在しない核酸塩基を含む、核酸塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち、リボヌクレオチドが使用される。塩基は、アデノシンデアミナーゼ活性を遮断するために修飾され得る。例示的修飾核酸塩基は、５位のウリジンおよび／またはシチジン修飾、例えば、５－(２－アミノ)プロピルウリジン、５－ブロモウリジン；８位のアデノシンおよび／またはグアノシン修飾、例えば、８－ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、７－デアザ－アデノシン；Ｏ－およびＮ－アルキル化ヌクレオチド、例えば、Ｎ６－メチルアデノシンを含むが、これらに限定されないものも適当である。上記修飾を組み合わせ得ることに留意すべきである。
他の実施態様において、交差架橋を、ＲＮＡサイレンシング剤の薬物動態の改変、例えば、体内の半減期の延長のために用い得る。故に、本発明は、２個の鎖が交差架橋されている、核酸の２個の相補性鎖を有するＲＮＡサイレンシング剤を含む。本発明はまた、他の部分(例えばペプチドなどの非核酸部分)、有機化合物(例えば、色素)など)にコンジュゲートされたまたはコンジュゲートされていない(例えば、３’末端で)ＲＮＡサイレンシング剤を含む。ｓｉＲＮＡ誘導体のこの方法の修飾は得られたｓｉＲＮＡ誘導体の対応するｓｉＲＮＡと比較した細胞取り込みの改善または細胞ターゲティング活性の増強が可能であり、細胞におけるｓｉＲＮＡ誘導体の追跡に有用でありまたは対応するｓｉＲＮＡと比較してｓｉＲＮＡ誘導体の安定性を改善する。
他の例示的修飾は、(ａ)２’修飾、例えば、センスまたはアンチセンス鎖であるが、特にセンス鎖のＵにおける２’－ＯＭｅ部分の提供または３’オーバーハング、例えば、３’末端における２’－ＯＭｅ部分の提供(３’末端は、文脈から示されるとおり、分子の３’原子または最も３’部分、例えば、最も３’ Ｐまたは２’位置を意味する)；(ｂ)例えば、ホスフェート主鎖におけるＯのＳでの置換による主鎖の修飾、例えば、特にアンチセンス鎖ＵまたはＡまたは両者のホスホロチオエート修飾の提供；例えば、ＰのＳでの置換による；(ｃ)ＵのＣ５アミノリンカーでの置換；(ｄ)ＡのＧでの置換(ほとんどの場合、配列変化はセンス鎖に位置し、アンチセンス鎖にはない)；および(ｄ)２’、６’、７’または８’位置の修飾を含む。例示的実施態様は、これらの修飾の１以上がセンスに存在するが、アンチセンス鎖にはないまたはアンチセンス鎖にこのような修飾が少ない実施態様である。さらに他の例示的修飾は、３’オーバーハング、例えば、３’末端のメチル化Ｐの使用；２’修飾、例えば、２’－ＯＭｅ部分の提供および例えば、ＰのＳでの置換による主鎖の修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾の提供または３’オーバーハング、例えば、３’末端でのメチル化Ｐの使用の組み合わせ；３’アルキルでの修飾；３’オーバーハング、例えば、３’末端における非塩基性ピロリドンでの修飾；ナプロキセン、イブプロフェンまたは３’末端での分解を阻止する他の部分での修飾を含む。
４)細胞取り込みを増強するための修飾
他の実施態様において、ＲＮＡサイレンシング剤は、例えば、標的細胞(例えば、神経性細胞)による細胞取り込みを増強するため、化学的部分での修飾をし得る。故に、本発明は、他の部分(例えばペプチドなどの非核酸部分)、有機化合物(例えば、色素)などにコンジュゲートしたまたはコンジュゲートしていない(例えば、その３’末端)ＲＮＡサイレンシング剤を含む。コンジュゲーションは、当分野で知られる方法により、例えば、Lambert et al., Drug Deliv. Rev.: 47(1), 99-112 (2001)(ポリアルキルシアノアクリレート(ＰＡＣＡ)ナノ粒子に充填された核酸を記載)；Fattal et al., J. Control Release 53(1-3):137-43 (1998)(ナノ粒子に結合した核酸を記載)；Schwab et al., Ann. Oncol. 5 Suppl. 4:55-8 (1994)(インターカレーター、疎水性基、ポリカチオンまたはＰＡＣＡナノ粒子に結合した核酸を記載)；およびGodard et al., Eur. J. Biochem. 232(2):404-10 (1995)(ナノ粒子に結合した核酸を記載)の方法を使用して、達成される。
特定の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の修飾は、オリゴヌクレオチドの１以上のサブユニット間リンカーにおけるビニルホスホネート(ＶＰ)モチーフを含み、ここで、ＶＰモチーフは、次の式を有する。
Figure 2022547790000011
特定の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、親油性部分にコンジュゲートされる。ある実施態様において、親油性部分は、カチオン性基を含むリガンドである。他の実施態様において、親油性部分は、ｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖に結合する。ある例示的実施態様において、親油性部分は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の一端に結合する。他の例示的実施態様において、親油性部分はセンス鎖の３’末端に結合する。ある実施態様において、親油性部分は、コレステロール、ビタミン、ビタミンＫ、ビタミンＡ、葉酸またはカチオン性色素(例えば、Ｃｙ３)からなる群から選択される。ある例示的実施態様において、親油性部分はコレステロールである。他の親油性部分は、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１,３－ビス－Ｏ(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１,３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－(オレオイル)リトコール酸、Ｏ３－(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジンを含む。
５)繋留リガンド
他のものを、本発明のＲＮＡサイレンシング剤に繋留し得る。例えば、標的核酸とのハイブリダイゼーション熱力学的安定性、特定の組織または細胞型へのターゲティングまたは、例えばエンドサイトーシス依存的または非依存的機構による細胞透過性の改善のための、ＲＮＡサイレンシング剤に繋留されたリガンドがある。リガンドおよび関連修飾は、配列特異性を増加させ、結果として、オフサイトターゲティングを減少させることもできる。繋留リガンドは、インターカレーターとして機能できる１以上の修飾塩基または糖を含み得る。ある例示的実施態様において、これらは、ＲＮＡサイレンシング剤／標的二重鎖の突出部などの内部領域に位置する。インターカレーターは、芳香族、例えば、多環式芳香族またはヘテロ環式芳香族化合物であり得る。多環式インターカレーターは積重ね強度を有し得て、２、３または４縮合環の系を含み得る。ここに記載する普遍的塩基は、リガンドに含まれ得る。ある実施態様において、リガンドは、標的核酸の開裂により標的遺伝子阻害に寄与する脱離基を含み得る。脱離基は、例えば、ブレオマイシン(例えば、ブレオマイシン－Ａ５、ブレオマイシン－Ａ２またはブレオマイシン－Ｂ２)、ピレン、フェナントロリン(例えば、Ｏ－フェナントロリン)、ポリアミン、トリペプチド(例えば、ｌｙｓ－ｔｙｒ－ｌｙｓトリペプチド)または金属イオンキレート基であり得る。金属イオンキレート基は、Ｌｕ(III)などの遊離金属イオンにより突出部の部位での標的ＲＮＡの選択的開裂を促進できる、例えば、Ｌｕ(III)またはＥＵ(III)巨大環状錯体、Ｚｎ(II)２,９－ジメチルフェナントロリン誘導体、Ｃｕ(II)テルピリジンまたはアクリジンを含み得る。ある実施態様において、ペプチドリガンドは、例えば、突出部領域での標的ＲＮＡの開裂を促進するために、ＲＮＡサイレンシング剤に繋留される。例えば、１,８－ジメチル－１,３,６,８,１０,１３－ヘキサアザシクロテトラデカン(サイクラム)を、標的ＲＮＡ開裂を促進するために、ペプチドにコンジュゲートし得る(例えば、アミノ酸誘導体により)。繋留リガンドは、ＲＮＡサイレンシング剤のハイブリダイゼーション性質を改善するまたは配列特異性を改善することができる、アミノグリコシドリガンドである。例示的アミノグリコシドは、グリコシル化ポリリシン、ガラクトシル化ポリリシン、ネオマイシンＢ、トブラマイシン、カナマイシンＡならびにアミノグリコシドのアクリジンコンジュゲート、例えば、Ｎｅｏ－Ｎ－アクリジン、Ｎｅｏ－Ｓ－アクリジン、Ｎｅｏ－Ｃ－アクリジン、Ｔｏｂｒａ－Ｎ－アクリジンおよびＫａｎａＡ－Ｎ－アクリジンを含む。アクリジンアナログの使用は、配列特異性を増加させ得る。例えば、ネオマイシンＢは、ＤＮＡと比較してＲＮＡに高親和性を有するが、低配列特異性である。アクリジンアナログ、ｎｅｏ－５－アクリジンは、ＨＩＶ Ｒｅｖ－応答要素(ＲＲＥ)への増加した親和性を有する。ある実施態様において、アミノグリコシドリガンドのグアニジンアナログ(グアニジノグリコシド)は、ＲＮＡサイレンシング剤に繋留される。グアニジノグリコシドにおいて、アミノ酸アミン基は、グアニジン基について交換される。グアニジンアナログの結合は、ＲＮＡサイレンシング剤の細胞透過性を増加できる。繋留リガンドは、オリゴヌクレオチド剤の細胞取り込みを増強できる、ポリ－アルギニンペプチド、ペプトイドまたはペプチド模倣体であり得る。
例示的リガンドは、リガンド－コンジュゲート担体に、直接的にまたは介在繋留部を介して間接的に、一般に共有結合により結合される。例示的実施態様において、リガンドは、介在繋留部を介して担体に結合させる。例示的実施態様において、リガンドは、取り込まれたＲＮＡサイレンシング剤の分布、ターゲティングまたは寿命を変える。例示的実施態様において、リガンドは、例えば、このようなリガンドがない種と比較して、選択標的、例えば、分子、細胞または細胞型、区画、例えば、体の細胞または臓器区画、組織、臓器または領域への親和性を増強する。
例示的リガンドは、ここに記載するモノマーおよび／または天然または修飾リボヌクレオチドの何らかの組み合わせを含む得られた天然または修飾ＲＮＡサイレンシング剤またはポリマー分子の輸送、ハイブリダイゼーションおよび特異性を改善でき、またヌクレアーゼ抵抗性も改善し得る。リガンドは、一般に、例えば、取り込みを増強するための治療修飾因子；例えば、分布をモニタリングするための診断化合物またはレポーター基；交差架橋剤；ヌクレアーゼ抵抗性付与部分；および天然または異常核酸塩基を含むことができる。一般的例は、親油性基、脂質、ステロイド(例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン)、テルペン(例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデリノール誘導化リトコール酸)、ビタミン(例えば、葉酸、ビタミンＡ、ビオチン、ピリドキサール)、炭水化物、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリンターゲティング分子、ポリカチオン性基、ペプチド、ポリアミンおよびペプチド模倣体を含む。リガンドは、天然に存在する物質(例えば、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)、低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)またはグロブリン)；炭水化物(例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸)；アミノ酸または脂質を含み得る。リガンドはまた、組み換えまたは合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸などの合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例は、ポリリシン(ＰＬＬ)、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－マレイン酸無水物コポリマー、ポリ(Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド)コポリマー、ジビニルエーテル－マレイン無水物コポリマー、Ｎ－(２－ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー(ＨＭＰＡ)、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリウレタン、ポリ(２－エチルアクリル酸)、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンを含む。ポリアミンの例は、ポリエチレンイミン、ポリリシン(ＰＬＬ)、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣体ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの４級塩またはアルファらせん形ペプチドを含む。
リガンドは、ターゲティング基、例えば、細胞または組織ターゲティング剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、腎臓細胞などの特定細胞型に結合する抗体も含み得る。ターゲティング基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、フォレート、ビタミンＢ１２、ビオチンまたはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。リガンドの他の例は、色素、インターカレーター(例えばアクリジンおよび置換アクリジン)、クロスリンカー(例えばソラレン、マイトマイシンＣ)、ポルフィリン(ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン)、多環式芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン、フェナントロリン、ピレン)、ｌｙｓ－ｔｙｒ－ｌｙｓトリペプチド、アミノグリコシド、グアニジウムアミノグリコシド、人工エンドヌクレアーゼ(例えばＥＤＴＡ)、親油性分子、例えば、コレステロール(およびそのチオアナログ)、コール酸、コラン酸、リトコール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、グリセロール(例えば、エステル(例えば、モノ、ビスまたはトリス脂肪酸エステル、例えば、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９またはＣ２０脂肪酸)およびそのエーテル、例えば、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９またはＣ２０アルキル；例えば、１,３－ビス－Ｏ(ヘキサデシル)グリセロール、１,３－ビス－Ｏ(オクタデシル)グリセロール)、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１,３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ステアリン酸(例えば、ジステアリン酸グリセリル)、オレイン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－(オレオイル)リトコール酸、Ｏ３－(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジン)およびペプチドコンジュゲート(例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド)、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ(例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ)、ＭＰＥＧ、[ＭＰＥＧ]２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン(例えばビオチン)、輸送／吸収促進因子(例えば、アスピリン、ナプロキセン、ビタミン、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ(例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋錯体)、ジニトロフェニル、ＨＲＰまたはＡＰであり得る。
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質またはペプチド、例えば、コ－リガンドに特異的親和性を有する分子または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞または骨細胞などの特定細胞型に結合する抗体であり得る。リガンドは、ホルモンおよびホルモン受容体も含み得る。脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノースまたは多価フコースなどの非ペプチドも含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼアクティベーターまたはＮＦ－κＢアクティベーターであり得る。
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格の破壊により、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメントおよび／または中間径フィラメントの半壊により、細胞へのＲＮＡサイレンシング剤の取り込みを増加できる物質、例えば、薬物であり得る。薬物は、例えば、タキサン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシンまたはミオセルビンであり得る。リガンドは、例えば、炎症性応答の活性化により、ＲＮＡサイレンシング剤の細胞への取り込みを増加し得る。このような効果を有する例示的リガンドは、腫瘍壊死因子アルファ(ＴＮＦα)、インターロイキン－１ベータまたはガンマインターフェロンを含む。
ある態様において、リガンドは、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、一般に血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、コンジュゲートが体の標的組織、例えば、非腎臓標的組織に分布することを可能とする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。ＨＳＡに結合できる他の分子も、リガンドとして使用できる。例えば、ナプロキセンまたはアスピリンが使用され得る。脂質または脂質ベースのリガンドは、(ａ)コンジュゲートの分解に対する抵抗性を増加できる、(ｂ)標的細胞または細胞膜へのターゲティングまたは輸送を増加できるおよび／または(ｃ)血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合の調節のために使用できる。脂質ベースのリガンドを使用して、コンジュゲートの標的組織への結合を調節、例えば、制御できる。特定の実施態様において、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに結合する。しかしながら、親和性が、ＨＳＡ－リガンド結合が可逆的でなくなるほど強くないことが望ましい。他の例示的実施態様において、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに弱く結合するかまたは全く結合しない。
他の態様において、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖中の細胞に取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性または非悪性タイプ、例えば、癌細胞の望まない細胞増殖により特徴づけられる障害の処置に特に有用である。例示的ビタミンは、ビタミンＡ、ＥおよびＫを含む。他の例示的ビタミンは、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールまたは癌細胞により取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素を含む。ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)も含まれる。
他の態様において、リガンドは、細胞透過剤、一般にらせん状細胞透過剤である。ある例示的実施態様において、薬剤は両親媒性である。例示的薬剤は、ｔａｔまたはアンテナペディアなどのペプチドである。薬剤がペプチドであるならば、ペプチジル模倣体、逆転異性体、非ペプチドまたはシュード－ペプチド結合およびＤ－アミノ酸の使用を含み、修飾され得る。らせん状剤は、一般に、親油性面および疎油性面を一般に有するアルファ－らせん状剤である。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体(ここではオリゴペプチド模倣体とも称する)は、天然ペプチドに類似する規定の三次構造に折りたたまれ得る分子である。ペプチドおよびペプチド模倣体のオリゴヌクレオチド剤への結合は、細胞認識および吸収増強によるなど、ＲＮＡサイレンシング剤の薬物動態分布に影響し得る。ペプチドまたはペプチド模倣体部分は、約５～５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸長であり得る。ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチドまたは疎水性ペプチド(例えば、主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる)であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチドまたは交差架橋ペプチドであり得る。ペプチド部分は、Ｌ－ペプチドまたはＤ－ペプチドであり得る。他の選択肢として、ペプチド部は、疎水性膜転座配列(ＭＴＳ)を含み得る。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリーまたは１ビーズ１化合物(ＯＢＯＣ)コンビナトリアルアリブラリーから同定されたペプチドなど、ＤＮＡのランダム配列によりコードされる(Lam et al., Nature 354:82-84, 1991)。例示的実施態様において、取り込まれたモノマー単位を介してＲＮＡサイレンシング剤に繋留されたペプチドまたはペプチド模倣体は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸(ＲＧＤ)－ペプチドまたはＲＧＤ模倣体などの細胞ターゲティングペプチドである。ペプチド部分は、約５アミノ酸～約４０アミノ酸の範囲の長さであり得る。ペプチド部分は、安定性を増加させるため立体配座性を指示するため、構造的修飾され得る。下記構造的修飾の何れも利用され得る。
６)疎水性部分
ここに提供する二本鎖ＲＮＡのある実施態様において、ＲＮＡ分子は、１以上の疎水性部分にコンジュゲートする(引用により本明細書に包含させるＰＣＴ公開ＷＯ２０１８／０３１９３３参照)。ある実施態様において、疎水性部分は、低密度リポタンパク質および／または中間密度リポタンパク質に親和性を有する。関連実施態様において、疎水性部分は、飽和部分であるかまたは二重結合が３個より少ない不飽和部分である。
他の実施態様において、疎水性部分は、高密度リポタンパク質に親和性を有する。関連実施態様において、疎水性部分は、３個以上の二重結合を有する(例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の二重結合を有する)多価不飽和部分である。特定の実施態様において、疎水性部分は、３個の二重結合を有する多価不飽和部分である。特定の実施態様において、疎水性部分は、４個の二重結合を有する多価不飽和部分である。特定の実施態様において、疎水性部分は、５個の二重結合を有する多価不飽和部分である。特定の実施態様において、疎水性部分は、６個の二重結合を有する多価不飽和部分である。
他の実施態様において、疎水性部分は、脂肪酸、ステロイド、セコステロイド、脂質、ガングリオシドおよびヌクレオシドアナログおよびエンドカンナビノイドからなる群から選択される。
他の実施態様において、疎水性部分は、神経調節性脂質、例えば、エンドカンナビノイドである。エンドカンナビノイドの非限定的例は、アナンダミド、アラキドノイルエタノールアミン、２－アラキドニルグリセリルエーテル(ノラジンエーテル)、２－アラキドノイルグリセロールおよびＮ－アラキドノイルドーパミンを含む。
他の実施態様において、疎水性部分は、オメガ－３脂肪酸である。オメガ－３脂肪酸の非限定的例は、ヘキサデカトリエン酸(ＨＴＡ)、アルファ－リノレン酸(ＡＬＡ)、ステアリドン酸(ＳＤＡ)、エイコサトリエン酸(ＥＴＥ)、エイコサテトラエン酸(ＥＴＡ)、エイコサペンタエン酸(ＥＰＡ、ティムノドン酸)、ヘンエイコサペンタエン酸(ＨＰＡ)、ドコサペンタエン酸(ＤＰＡ、クルパノドン酸)、ドコサヘキサエン酸(ＤＨＡ、セルボン酸)、テトラコサペンタエン酸およびテトラコサヘキサエン酸(ニシン酸)を含むが、これらに限定されない。
他の実施態様において、疎水性部分は、オメガ－６脂肪酸である。オメガ－６脂肪酸の例は、リノール酸、ガンマ－リノレン酸(ＧＬＡ)、エイコサジエン酸、ジホモ－ガンマ－リノレン酸(ＤＧＬＡ)、アラキドン酸(ＡＡ)、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸(オズボンド酸)、テトラコサテトラエン酸およびテトラコサペンタエン酸を含むが、これらに限定されない。
他の実施態様において、疎水性部分は、オメガ－９脂肪酸である。オメガ－９脂肪酸の例は、オレイン酸、エイコサエン酸、ミード酸、エルカ酸およびネルボン酸を含むが、これらに限定されない。
他の実施態様において、疎水性部分は、コンジュゲートリノレン酸である。コンジュゲートリノレン酸の非限定的例は、α－カレンジン酸、β－カレンジン酸、ジャカル酸、α－エレオステアリン酸、β－エレオステアリン酸、カタルプ酸およびプニカ酸を含むが、これらに限定されない。
他の実施態様において、疎水性部分は、飽和脂肪酸である。飽和脂肪酸の例は、カプリル酸、カプリン酸、ドコサン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸およびセロチン酸を含むが、これらに限定されない。
他の実施態様において、疎水性部分は、ルメレン酸、α－パリナリン酸、β－パリナリン酸、ボセオペンタエン酸、ピノレン酸およびポドカルピン酸からなる群から選択される、酸である。
他の実施態様において、疎水性部分は、ドコサン酸(ＤＣＡ)、ドコサヘキサエン酸(ＤＨＡ)およびエイコサペンタエン酸(ＥＰＡ)からなる群から選択される。特定の実施態様において、疎水性部分はドコサン酸(ＤＣＡ)である。他の特定の実施態様において、疎水性部分はＤＨＡである。他の特定の実施態様において、疎水性部分はＥＰＡである。
他の実施態様において、疎水性部分はセコステロイドである。特定の実施態様において、疎水性部分はカルシフェロールである。他の実施態様において、疎水性部分は、コレステロール以外のステロイドである。
特定の実施態様において、疎水性部分はコレステロールではない。
他の実施態様において、疎水性部分は、グリコスフィンゴリピド、多価不飽和脂肪酸、セコステロイド、ステロイドホルモンまたはステロール脂質を含むが、これらに限定されないアルキル鎖、ビタミン、ペプチドまたは生物活性コンジュゲートである。
ある実施態様において、ここに提供する二本鎖ＲＮＡは、１以上の化学修飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施態様において、二本鎖ＲＮＡは、交互の２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドを含む。他の特定の実施態様において、二本鎖ＲＮＡの１以上のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合により隣接ヌクレオチドに結合する。ここに開示するｄｓＲＮＡのある実施態様において、ミスマッチヌクレオチドおよびミスマッチヌクレオチドに隣接するヌクレオチドは、２’－メトキシ－リボヌクレオチドである。
他の特定の実施態様において、ここに提供する二本鎖ＲＮＡの３’末端から１位および２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合により隣接ヌクレオチドに結合する。さらに他の特定の実施態様において、二本鎖ＲＮＡの３’末端から１位および２位のヌクレオチドおよび二本鎖ＲＮＡの５’末端から１位および２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合により隣接ヌクレオチドに結合する。
二本鎖ＲＮＡのある実施態様において、第一オリゴヌクレオチドは、少なくとも１６連続ヌクレオチド、５’末端、３’末端を含み、標的に対して相補性を有し、ここで、
(１)第一オリゴヌクレオチドは交互の２’－メトキシ－ヌクレオチドおよび２’－フルオロ－ヌクレオチドを含む；
(２)５’末端から２位および１４位のヌクレオチドは２’－メトキシ－ヌクレオチドではない；
(３)ヌクレオチドはホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を介して結合する；および
(４)３’末端から１～６位または３’末端から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合する。
７)進歩的安定化パターン
ここに提供する二本鎖ＲＮＡのある実施態様において：
(１)第一オリゴヌクレオチドは交互の２’－メトキシ－リボヌクレオチドおよび２’－フルオロ－リボヌクレオチドを含み、ここで、各ヌクレオチドは２’－メトキシ－リボヌクレオチドまたは２’－フルオロ－リボヌクレオチドである；および第一オリゴヌクレオチドの５’末端から２位および１４位のヌクレオチドは２’－メトキシ－リボヌクレオチドではない；
(２)第二オリゴヌクレオチドは交互の２’－メトキシ－リボヌクレオチドおよび２’－フルオロ－リボヌクレオチドを含み、ここで、各ヌクレオチドは２’－メトキシ－リボヌクレオチドまたは２’－フルオロ－リボヌクレオチドである；および第二オリゴヌクレオチドの５’末端から２位および１４位のヌクレオチドは２’－メトキシ－リボヌクレオチドである；
(３)第一オリゴヌクレオチドのヌクレオチドはホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合し、ここで、３’末端から１～６位または３’末端から１～７位のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合する；および
(４)第二オリゴヌクレオチドのヌクレオチドはホスホジエステルまたはホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合し、ここで、３’末端から１位および２位のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに結合する。
二本鎖ＲＮＡのある実施態様において、第一オリゴヌクレオチドは、第二オリゴヌクレオチドより３～７個多くリボヌクレオチドを有する。
ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡは１１～１６塩基対二重鎖を含み、ここで、各塩基対二重鎖のヌクレオチドは異なる化学修飾有する(例えば、一方のヌクレオチドは２’－フルオロ修飾を有し、他方のヌクレオチドは２’－メトキシを有する)。
二本鎖ＲＮＡのある実施態様において、第一オリゴヌクレオチドは、第二オリゴヌクレオチドより３～７個多くリボヌクレオチドを有する。他の実施態様において。
ある実施態様において、第一オリゴヌクレオチドはアンチセンス鎖であり、第二オリゴヌクレオチドはセンス鎖である。引用により本明細書に包含させるＰＣＴ公開ＷＯ２０１６／１６１３８８参照。
ある実施態様において、第一または第二オリゴヌクレオチドは、次の式
Figure 2022547790000012
 を有する１以上のＶＰサブユニット間修飾を含む。
８)分岐オリゴヌクレオチド
上記の２以上のＲＮＡサイレンシング剤、例えばｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチド構築物は、２以上のＲＮＡサイレンシング剤を含む分岐オリゴヌクレオチドを形成するリンカー、スペーサーおよび分岐点から独立して選択される１以上の部分により互いに結合され得る。図３１は、２個のｓｉＲＮＡの送達のためのジ－ｓｉＲＮ二分岐足場の例を示す。代表的実施態様において、分岐オリゴヌクレオチドの核酸は各々アンチセンス鎖(またはその一部)を含み、ここで、アンチセンス鎖は、ＲＮＡ介在サイレンシング機構(例えばＲＮＡｉ)に介在するためにヘテロ接合型一塩基多型に十分な相補性を有する。他の実施態様において、アンチセンス転写物をサイレンシングするためのセンス鎖(またはその一部)を含む、核酸を特徴する第二タイプの分岐オリゴヌクレオチドが提供され、ここで、センス鎖は、ＲＮＡ介在サイレンシング機構に介在するためにアンチセンス転写物と十分な相補性を有する。さらなる実施態様において、両タイプの核酸、すなわち、アンチセンス鎖(またはその一部)を含む核酸およびセンス鎖(またはその一部)を含むオリゴヌクレオチドを含む、第三タイプの分岐オリゴヌクレオチドが提供される。
例示的実施態様において、分岐オリゴヌクレオチドは、リンカーを介して結合した２～８個のＲＮＡサイレンシング剤を有し得る。リンカーは疎水性であり得る。特定の実施態様において、本出願の分岐オリゴヌクレオチドは、２～３個のオリゴヌクレオチドを有する。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、独立して相当な化学的安定化を有する(例えば、構成塩基の少なくとも４０％が化学修飾されている)。特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドは完全な化学的安定化を有する(すなわち、構成塩基全てが化学的に修飾されている)。ある実施態様において、分岐オリゴヌクレオチドは１以上の一本鎖ホスホロチオエート化テイルを含み、各々独立して、２～２０個のヌクレオチドを有する。特定の実施態様において、各一本鎖テイルは、８～１０個のヌクレオチドを有する。
ある実施態様において、分岐オリゴヌクレオチドは、(１)分岐構造、(２)完全代謝安定化および(３)ホスホロチオエートリンカーを含む一本鎖テイルの存在の３個の性質により特徴づけられる。特異的実施態様において、分岐オリゴヌクレオチドは、２個または３個の分岐を有する。分岐構造の全体的サイズの増加が、取り込み増加を促進すると考えられる。また、特定の活性理論に拘束されないが、複数の隣接した分岐(例えば、２または３)は、各分岐が協調的に作用することを可能とし、そうして、内在化、輸送および放出の速度を劇的に促進すると考えられる。
分岐オリゴヌクレオチドは、種々の構造的に多様な実施態様で提供される。図３６に示すとおり、例えば、ある実施態様において、分岐点に結合する核酸は、一本鎖であり、ｍｉＲＮＡ阻害剤、ギャップマー、ミックスマー、ＳＳＯ、ＰＭＯまたはＰＮＡからなる。これら一本鎖は、その３’または５’末端で結合できる。ｓｉＲＮＡと一本鎖オリゴヌクレオチドの組み合わせも、デュアル機能のために使用され得る。他の実施態様において、ギャップマー、ミックスマー、ｍｉＲＮＡ阻害剤、ＳＳＯ、ＰＭＯおよびＰＮＡへの短核酸相補性を使用して、これら活性一本鎖核酸を使用し、分布および細胞内在化を増強させる。短二重鎖領域は、細胞への分岐構造の内在化後の速い解離のために低融解温度(Ｔｍ約３７℃)を有する。
図３７に示すとおり、Di－ｓｉＲＮＡ分岐オリゴヌクレオチドは、化学的に多様なコンジュゲートを含み得る。コンジュゲート生物活性リガンドを使用して、細胞特異性を増強し、膜結合、内在化および血清タンパク質結合を促進し得る。コンジュゲーションのために使用する生物活性部分の例は、ＤＨＡｇ２、ＤＨＡ、ＧａｌＮＡｃおよびコレステロールを含む。これら部分を、接続リンカーもしくはスペーサーを介してまたは他の遊離ｓｉＲＮＡ末端に結合した付加的リンカーもしくはスペーサーを介する付加により、Di－ｓｉＲＮＡに結合できる。
分岐構造の存在は、同一化学組成の非分岐化合物に比して、脳における組織保持レベルを１００倍を超えて改善し、細胞保持および分布の新機構を示唆する。分岐オリゴヌクレオチドは、脊髄および脳全体に予想外に均一に分布される。さらに、分岐オリゴヌクレオチドは、多様な組織に予想外に効率的に全身送達され、組織蓄積が極めて高レベルである。
分岐オリゴヌクレオチドは、ＡＳＯ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤、スプライススイッチング、ＰＭＯ、ＰＮＡを含む、多様な治療核酸を含む。ある実施態様において、分岐オリゴヌクレオチドは、さらにコンジュゲート疎水性部分を含み、インビトロおよびインビボでかつてないサイレンシングおよび有効性を示す。
リンカー
分岐オリゴヌクレオチドのある実施態様において、各リンカーは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロアミデート、エステル、アミド、トリアゾールおよびこれらの組み合わせから独立して選択され；ここで、リンカーの何れかの炭素または酸素原子は所望により窒素原子で置き換えられ、ヒドロキシル置換基を有しまたはオキソ置換基を有する。ある実施態様において、各リンカーはエチレングリコール鎖である。他の実施態様において、各リンカーはアルキル鎖である。他の実施態様において、各リンカーはペプチドである。他の実施態様において、各リンカーはＲＮＡである。他の実施態様において、各リンカーはＤＮＡである。他の実施態様において、各リンカーはホスフェートである。他の実施態様において、各リンカーはホスホネートである。他の実施態様において、各リンカーはホスホロアミデートである。他の実施態様において、各リンカーはエステルである。他の実施態様において、各リンカーはアミドである。他の実施態様において、各リンカーはトリアゾールである。他の実施態様において、各リンカーは、図３７の式から選択される構造である。
９)式(Ｉ)の化合物
他の態様において、式(Ｉ)
Figure 2022547790000013
 の分岐オリゴヌクレオチド化合物が提供され、
式中、Ｌはエチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロアミデート、エステル、アミド、トリアゾールおよびこれらの組み合わせから選択され、ここで、式(Ｉ)は、所望によりさらに１以上の分岐点Ｂおよび１以上のスペーサーＳを含み；ここで、Ｂは、各場合独立して多価有機種またはその誘導体であり；Ｓは、各場合独立してエチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロアミデート、エステル、アミド、トリアゾールおよびこれらの組み合わせから選択され；Ｎはセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡ二重鎖であり、ここで、アンチセンス鎖は、アレル多型を含む遺伝子の領域に実質的に相補性である相補性領域を含み、ここで、アンチセンス鎖は、５’末端から２～７位にアレル多型に相補性である一塩基多型(ＳＮＰ)位置ヌクレオチド；および遺伝子におけるヌクレオチドとミスマッチであるＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～１１ヌクレオチドに位置するミスマッチ(ＭＭ)位置ヌクレオチドを含む。例示的実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは５’末端から２位、４位または６位であり、ミスマッチ(ＭＭ)位置ヌクレオチドはＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～６ヌクレオチドに位置する。
センス鎖およびアンチセンス鎖は、各々独立して１以上の化学修飾を含み；そしてｎは２、３、４、５、６、７または８である。
ある実施態様において、式(Ｉ)の化合物は、表１の式(Ｉ－１)～(Ｉ－９)から選択される構造を有する。
Figure 2022547790000014
ある実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(Ｉ－１)である。他の実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(Ｉ－２)である。他の実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(Ｉ－３)である。他の実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(Ｉ－４)である。他の実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(Ｉ－５)である。他の実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(Ｉ－６)である。他の実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(Ｉ－７)である。他の実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(Ｉ－８)である。他の実施態様において、式(Ｉ)の化合物は式(Ｉ－９)である。
式(Ｉ)の化合物のある実施態様において、各リンカーは、エチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロアミデート、エステル、アミド、トリアゾールおよびこれらの組み合わせから独立して選択され；ここで、リンカーのあらゆる炭素または酸素原子は所望により窒素原子で置き換えられ、ヒドロキシル置換基を有しまたはオキソ置換基を有する。式(Ｉ)の化合物のある実施態様において、各リンカーはエチレングリコール鎖である。他の実施態様において、各リンカーはアルキル鎖である。式(Ｉ)の化合物の他の実施態様において、各リンカーはペプチドである。式(Ｉ)の化合物の他の実施態様において、各リンカーはＲＮＡである。式(Ｉ)の化合物の他の実施態様において、各リンカーはＤＮＡである。式(Ｉ)の化合物の他の実施態様において、各リンカーはホスフェートである。他の実施態様において、各リンカーはホスホネートである。式(Ｉ)の化合物の他の実施態様において、各リンカーはホスホロアミデートである。式(Ｉ)の化合物の他の実施態様において、各リンカーはエステルである。式(Ｉ)の化合物の他の実施態様において、各リンカーはアミドである。式(Ｉ)の化合物の他の実施態様において、各リンカーはトリアゾールである。式(Ｉ)の化合物の他の実施態様において、各リンカー図３６および図３８の式から選択される構造である。
式(Ｉ)の化合物のある実施態様において、Ｂは多価有機種である。式(Ｉ)の化合物の他の実施態様において、Ｂは多価有機種の誘導体である。式(Ｉ)の化合物のある実施態様において、Ｂはトリオールまたはテトラオール誘導体である。他の実施態様において、Ｂはトリ－またはテトラ－カルボン酸誘導体である。他の実施態様において、Ｂはアミン誘導体である。他の実施態様において、Ｂはトリ－またはテトラ－アミン誘導体である。他の実施態様において、Ｂはアミノ酸誘導体である。式(Ｉ)の化合物の他の実施態様において、Ｂは図３８の式から選択される。
多価有機種は、炭素および３以上の原子価(すなわち、上に定義したとおり、Ｓ、ＬまたはＮなどの部分との結合点)を含む、部分である。多価有機種の非限定的例は、トリオール(例えば、グリセロール、フロログルシノールなど)、テトラオール(例えば、リボース、ペンタエリトリトール、１,２,３,５－テトラヒドロキシベンゼンなど)、トリ－カルボン酸(例えば、クエン酸、１,３,５－シクロヘキサントリカルボン酸、トリメシン酸など)、テトラ－カルボン酸(例えば、エチレンジアミン四酢酸、ピロメリット酸など)、３級アミン(例えば、トリプロパルギルアミン、トリエタノールアミンなど)、トリアミン(例えば、ジエチレントリアミンなど)、テトラミンおよびヒドロキシル、チオール、アミノおよび／またはカルボキシル部分の組み合わせを含む種(例えば、リシン、セリン、システインなどのアミノ酸)を含む。
式(Ｉ)の化合物のある実施態様において、各核酸は、１以上の化学修飾されたヌクレオチドを含む。式(Ｉ)の化合物のある実施態様において、各核酸は、化学修飾されたヌクレオチドからなる。式(Ｉ)の化合物のある実施態様において、各核酸の＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％または＞５０％は化学修飾されたヌクレオチドを含む。
ある実施態様において、各アンチセンス鎖は、独立して、表２の基から選択される、５’末端基Ｒを含む。
Figure 2022547790000015
ある実施態様において、ＲはＲ１である。他の実施態様において、ＲはＲ２である。他の実施態様において、ＲはＲ３である。他の実施態様において、ＲはＲ４である。他の実施態様において、ＲはＲ５である。他の実施態様において、ＲはＲ６である。他の実施態様において、ＲはＲ７である。他の実施態様において、ＲはＲ８である。
式(II)の構造
ある実施態様において、式(Ｉ)の化合物は、式(II)
Figure 2022547790000016
 〔式中、Ｘは、各場合、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびその化学修飾誘導体から独立して選択され；Ｙは、各場合、独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびその化学修飾誘導体から選択され；－はホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し；＝はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し；そして－－－は、各場合、独立して、塩基対形成相互作用またはミスマッチを表す。〕
の構造を有する。
ある実施態様において、式(II)の構造は、ミスマッチを含まない。ある実施態様において、式(II)の構造は、１個のミスマッチを含む。他の実施態様において、式(II)の化合物は、２個のミスマッチを含む。他の実施態様において、式(II)の化合物は、３個のミスマッチを含む。他の実施態様において、式(II)の化合物は、４個のミスマッチを含む。ある実施態様において、各核酸は、化学修飾されたヌクレオチドからなる。
ある実施態様において、式(II)の構造のＸ’の＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％または＞５０％が化学修飾されているヌクレオチドである。他の実施態様において、式(II)の構造のＸ’の＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％または＞５０％が化学修飾されているヌクレオチドである。
式(III)の構造
ある実施態様において、式(Ｉ)の化合物は、式(III)
Figure 2022547790000017
 の構造を有し、
式中、Ｘは、各場合、独立して、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；Ｘは、各場合、独立して、２’－Ｏ－メチル修飾を含むヌクレオチドであり；Ｙは、各場合、独立して、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；そしてＹは、各場合、独立して、２’－Ｏ－メチル修飾を含むヌクレオチドである。
ある実施態様において、Ｘは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。ある実施態様において、Ｘは、２’－Ｏ－メチル修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。ある実施態様において、Ｙは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。ある実施態様において、Ｙは、２’－Ｏ－メチル修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。
ある実施態様において、式(III)の構造は、ミスマッチを含まない。ある実施態様において、式(III)の構造は、１個のミスマッチを含む。他の実施態様において、式(III)の化合物は、２個のミスマッチを含む。他の実施態様において、式(III)の化合物は、３個のミスマッチを含む。他の実施態様において、式(III)の化合物は、４個のミスマッチを含む。
式(IV)の構造
ある実施態様において、式(Ｉ)の化合物は、式(IV)
Figure 2022547790000018
 〔式中、Ｘは、各場合、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびその化学修飾誘導体から独立して選択され；Ｙは、各場合、独立して、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびその化学修飾誘導体から選択され；－はホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し；＝はホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し；そして－－－は、各場合、独立して、塩基対形成相互作用またはミスマッチを表す。〕
の構造を有する。
ある実施態様において、式(IV)の構造は、ミスマッチを含まない。ある実施態様において、式(IV)の構造は、１個のミスマッチを含む。他の実施態様において、式(IV)の化合物は、２個のミスマッチを含む。他の実施態様において、式(IV)の化合物は、３個のミスマッチを含む。他の実施態様において、式(IV)の化合物は、４個のミスマッチを含む。ある実施態様において、各核酸は、化学修飾されたヌクレオチドからなる。
ある実施態様において、式(IV)の構造のＸ’の＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％または＞５０％が化学修飾されているヌクレオチドである。他の実施態様において、式(IV)の構造のＸ’の＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％または＞５０％が化学修飾されているヌクレオチドである。
式(Ｖ)の構造
ある実施態様において、式(Ｉ)の化合物は、式(Ｖ)
Figure 2022547790000019
 〔式中、Ｘは、各場合、独立して、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；Ｘは、各場合、独立して、２’－Ｏ－メチル修飾を含むヌクレオチドであり；Ｙは、各場合、独立して、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾を含むヌクレオチドであり；そしてＹは、各場合、独立して、２’－Ｏ－メチル修飾を含むヌクレオチドである。〕
の構造を有する。
ある実施態様において、Ｘは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。ある実施態様において、Ｘは、２’－Ｏ－メチル修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。ある実施態様において、Ｙは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。ある実施態様において、Ｙは、２’－Ｏ－メチル修飾アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジンからなる群から選択される。
ある実施態様において、式(Ｖ)の構造は、ミスマッチを含まない。ある実施態様において、式(Ｖ)の構造は、１個のミスマッチを含む。他の実施態様において、式(Ｖ)の化合物は、２個のミスマッチを含む。他の実施態様において、式(Ｖ)の化合物は、３個のミスマッチを含む。他の実施態様において、式(Ｖ)の化合物は、４個のミスマッチを含む。
可変リンカー
式(Ｉ)の化合物のある実施態様において、Ｌは、Ｌ１
Figure 2022547790000020
 の構造を有する。
Ｌ１のある実施態様において、ＲはＲ３であり、ｎは２である。
式(II)の構造のある実施態様において、Ｌは、Ｌ１の構造を有する。式(III)の構造のある実施態様において、Ｌは、Ｌ１の構造を有する。式(IV)の構造のある実施態様において、Ｌは、Ｌ１の構造を有する。式(Ｖ)の構造のある実施態様において、Ｌは、Ｌ１の構造を有する。式(VI)の構造のある実施態様において、Ｌは、Ｌ１の構造を有する。式(VI)の構造のある実施態様において、Ｌは、Ｌ１の構造を有する。
式(Ｉ)の化合物のある実施態様において、Ｌは、Ｌ２
Figure 2022547790000021
 の構造を有する。
Ｌ２のある実施態様において、ＲはＲ３であり、ｎは２である。式(II)の構造のある実施態様において、Ｌは、Ｌ２の構造を有する。式(III)の構造のある実施態様において、Ｌは、Ｌ２の構造を有する。式(IV)の構造のある実施態様において、Ｌは、Ｌ２の構造を有する。式(Ｖ)の構造のある実施態様において、Ｌは、Ｌ２の構造を有する。式(VI)の構造のある実施態様において、Ｌは、Ｌ２の構造を有する。式(VI)の構造のある実施態様において、Ｌは、Ｌ２の構造を有する。
１０)送達系
さらなる態様において、式(VI)
Figure 2022547790000022
 〔式中、Ｌはエチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロアミデート、エステル、アミド、トリアゾールおよびこれらの組み合わせから選択され、ここで、式(VI)は、所望によりさらに１以上の分岐点Ｂおよび１以上のスペーサーＳを含み；ここで、Ｂは、各場合独立して多価有機種またはその誘導体であり；Ｓは、各場合独立してエチレングリコール鎖、アルキル鎖、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ホスフェート、ホスホネート、ホスホロアミデート、エステル、アミド、トリアゾールおよびこれらの組み合わせから選択され；各ｃＮＡは、独立して、１以上の化学修飾を含む担体核酸であり；そしてｎは２、３、４、５、６、７または８である。〕
の構造を有する治療核酸のための送達系が提供される。
送達系のある実施態様において、Ｌはエチレングリコール鎖である。送達系の他の実施態様において、Ｌはアルキル鎖である。送達系の他の実施態様において、Ｌはペプチドである。送達系の他の実施態様において、ＬはＲＮＡである。送達系の他の実施態様において、ＬはＤＮＡである。送達系の他の実施態様において、Ｌはホスフェートである。送達系の他の実施態様において、Ｌはホスホネートである。送達系の他の実施態様において、Ｌはホスホロアミデートである。送達系の他の実施態様において、Ｌはエステルである。送達系の他の実施態様において、Ｌはアミドである。送達系の他の実施態様において、Ｌはトリアゾールである。
送達系のある実施態様において、Ｓはエチレングリコール鎖である。他の実施態様において、Ｓはアルキル鎖である。送達系の他の実施態様において、Ｓはペプチドである。他の実施態様において、ＳはＲＮＡである。送達系の他の実施態様において、ＳはＤＮＡである。送達系の他の実施態様において、Ｓはホスフェートである。送達系の他の実施態様において、Ｓはホスホネートである。送達系の他の実施態様において、Ｓはホスホロアミデートである。送達系の他の実施態様において、Ｓはエステルである。他の実施態様において、Ｓはアミドである。他の実施態様において、Ｓはトリアゾールである。
送達系のある実施態様において、ｎは２である。送達系の他の実施態様において、ｎは３である。送達系の他の実施態様において、ｎは４である。送達系の他の実施態様において、ｎは５である。送達系の他の実施態様において、ｎは６である。送達系の他の実施態様において、ｎは７である。送達系の他の実施態様において、ｎは８である。
ある実施態様において、各ｃＮＡは、化学修飾されたヌクレオチドを＞９５％、＞９０％、＞８５％、＞８０％、＞７５％、＞７０％、＞６５％、＞６０％、＞５５％または＞５０％含む。
ある実施態様において、式(VI)の化合物は、表３の式(VI－１)～(VI－９)から選択される構造を有する。
Figure 2022547790000023
ある実施態様において、式(VI)の化合物は、式(VI－１)の構造である。ある実施態様において、式(VI)の化合物は、式(VI－２)の構造である。ある実施態様において、式(VI)の化合物は、式(VI－３)の構造である。ある実施態様において、式(VI)の化合物は、式(VI－４)の構造である。ある実施態様において、式(VI)の化合物は、式(VI－５)の構造である。ある実施態様において、式(VI)の化合物は、式(VI－６)の構造である。ある実施態様において、式(VI)の化合物は、式(VI－７)の構造である。ある実施態様において、式(VI)の化合物は、式(VI－８)の構造である。ある実施態様において、式(VI)の化合物は、式(VI－９)の構造である。
ある実施態様において、式(VI)の化合物(例えば、式(VI－１)～(VI－９)を含む)で、各ｃＮＡは、独立して少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む。ある実施態様において、各ｃＮＡは、独立して、化学修飾されたヌクレオチドからなる。
ある実施態様において、送達系はさらにｎ個の治療核酸(ＮＡ)を含み、ここで、各ＮＡは、アレル多型を含む遺伝子の領域に実質的に相補性である相補性領域を含み、ここで、アンチセンス鎖は、５’末端から２～７位にアレル多型に相補性である一塩基多型(ＳＮＰ)位置ヌクレオチド；および遺伝子におけるヌクレオチドとミスマッチであるＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～１１ヌクレオチドに位置するミスマッチ(ＭＭ)位置ヌクレオチドを含む。例示的実施態様において、ＳＮＰ位置ヌクレオチドは５’末端から２位、４位または６位であり、ミスマッチ(ＭＭ)位置ヌクレオチドはＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～６ヌクレオチドに位置する。また、各ＮＡは、少なくとも１個のｃＮＡにハイブリダイズする。ある実施態様において、送達系は、２個のＮＡからなる。他の実施態様において、送達系は、３個のＮＡからなる。他の実施態様において、送達系は、４個のＮＡからなる。他の実施態様において、送達系は、５個のＮＡからなる。他の実施態様において、送達系は、６個のＮＡからなる。他の実施態様において、送達系は、７個のＮＡからなる。他の実施態様において、送達系は、８個のＮＡからなる。
ある実施態様において、各ＮＡは、独立して少なくとも１６連続ヌクレオチドを含む。ある実施態様において、各ＮＡは、独立して１６－２０連続ヌクレオチドを含む。ある実施態様において、各ＮＡは、独立して１６連続ヌクレオチドを含む。他の実施態様において、各ＮＡは、独立して１７連続ヌクレオチドを含む。他の実施態様において、各ＮＡは、独立して１８連続ヌクレオチドを含む。他の実施態様において、各ＮＡは、独立して１９連続ヌクレオチドを含む。他の実施態様において、各ＮＡは、独立して２０連続ヌクレオチドを含む。
ある実施態様において、各ＮＡは、少なくとも２ヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。他の実施態様において、各ＮＡは、少なくとも３ヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。他の実施態様において、各ＮＡは、少なくとも４ヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。他の実施態様において、各ＮＡは、少なくとも５ヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。他の実施態様において、各ＮＡは、少なくとも６ヌクレオチドの不対オーバーハングを含む。ある実施態様において、オーバーハングのヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を介して結合される。
ある実施態様において、各ＮＡは、独立して、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ａｎｔａｇｏｍｉＲ、ｍｉＲＮＡ、ギャップマー、ミックスマーまたはガイドＲＮＡからなる群から選択される。ある実施態様において、各ＮＡは、独立して、ＤＮＡである。他の実施態様において、各ＮＡは、独立して、ｓｉＲＮＡである。他の実施態様において、各ＮＡは、独立して、ａｎｔａｇｏｍｉＲである。他の実施態様において、各ＮＡは、独立して、ｍｉＲＮＡである。他の実施態様において、各ＮＡは、独立して、ギャップマーである。他の実施態様において、各ＮＡは、独立して、ミックスマーである。他の実施態様において、各ＮＡは、独立して、ガイドＲＮＡである。ある実施態様において、各ＮＡは同じである。ある実施態様において、各ＮＡは同じではない。
ある実施態様において、さらにｎ個の治療核酸(ＮＡ)を含む送達系は、式(Ｉ)、(II)、(III)、(IV)、(Ｖ)、(VI)およびここに記載するそれらの実施態様から選択される構造を有する。ある実施態様において、送達系は、さらに２治療核酸(ＮＡ)を含む、式(Ｉ)、(II)、(III)、(IV)、(Ｖ)、(VI)およびここに記載するそれらの実施態様から選択される構造を有する。他の実施態様において、送達系は、さらに３治療核酸(ＮＡ)を含む、式(Ｉ)、(II)、(III)、(IV)、(Ｖ)、(VI)およびここに記載するそれらの実施態様から選択される構造を有する。ある実施態様において、送達系は、さらに４治療核酸(ＮＡ)を含む、式(Ｉ)、(II)、(III)、(IV)、(Ｖ)、(VI)およびここに記載するそれらの実施態様から選択される構造を有する。ある実施態様において、送達系は、さらに５治療核酸(ＮＡ)を含む、式(Ｉ)、(II)、(III)、(IV)、(Ｖ)、(VI)およびここに記載するそれらの実施態様から選択される構造を有する。ある実施態様において、送達系は、さらに６治療核酸(ＮＡ)を含む、式(Ｉ)、(II)、(III)、(IV)、(Ｖ)、(VI)およびここに記載するそれらの実施態様から選択される構造を有する。ある実施態様において、送達系は、さらに７治療核酸(ＮＡ)を含む、式(Ｉ)、(II)、(III)、(IV)、(Ｖ)、(VI)およびここに記載するそれらの実施態様から選択される構造を有する。ある実施態様において、送達系は、さらに８治療核酸(ＮＡ)を含む、式(Ｉ)、(II)、(III)、(IV)、(Ｖ)、(VI)およびここに記載するそれらの実施態様から選択される構造を有する。
ある実施態様において、送達系は、式(Ｉ)、(II)、(III)、(IV)、(Ｖ)、(VI)から選択される構造を有し、さらに構造Ｌ１またはＬ２のリンカーを含み、ここで、ＲはＲ３であり、ｎは２である。他の実施態様において、送達系は式(Ｉ)、(II)、(III)、(IV)、(Ｖ)、(VI)から選択される構造を有し、さらに構造Ｌ１のリンカーを含み、ここで、ＲはＲ３であり、ｎは２である。他の実施態様において、送達系は式(Ｉ)、(II)、(III)、(IV)、(Ｖ)、(VI)から選択される構造を有し、さらに構造Ｌ２のリンカーを含み、ここで、ＲはＲ３であり、ｎは２である。
医薬組成物および投与方法
ある態様において、治療有効量の１以上のここに記載する化合物、オリゴヌクレオチドまたは核酸および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が、ここに提供される。ある実施態様において、医薬組成物は、１以上のここに記載する二本鎖の、化学修飾された核酸および薬学的に許容される担体を含む。特定の実施態様において、医薬組成物は、１個のここに記載する二本鎖の、化学修飾された核酸および薬学的に許容される担体を含む。他の特定の実施態様において、医薬組成物は、２個のここに記載する二本鎖の、化学修飾された核酸および薬学的に許容される担体を含む。
特定の実施態様において、医薬組成物は、ヘテロ接合型ＳＮＰ変異体タンパク質をコードする遺伝子の領域に相補性の約１５～３５ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ分子を含み、該領域はアレル多型を含み、第二鎖は、第一鎖に相補性の約１５～３５ヌクレオチドを含み、ここで、ｄｓＲＮＡ分子は、アレル多型の位置ではないミスマッチを含み；そしてミスマッチおよび多型に対応するヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡ分子の中心にはない。
ある実施態様において、ミスマッチは、４ヌクレオチド上流、アレル多型に対応するヌクレオチドの３ヌクレオチド上流、アレル多型に対応するヌクレオチドの２ヌクレオチド上流、１ヌクレオチド上流、アレル多型に対応するヌクレオチドの１ヌクレオチド下流、アレル多型に対応するヌクレオチドの２ヌクレオチド下流、アレル多型に対応するヌクレオチドの３ヌクレオチド下流、アレル多型に対応するヌクレオチドの４ヌクレオチド下流またはアレル多型に対応するヌクレオチドの５ヌクレオチド下流である。ある実施態様において、ミスマッチは、アレル多型に対応するヌクレオチドに隣接しない。
医薬組成物の他の実施態様において、二本鎖ＲＮＡは、５’末端から２位、３位、４位、５位または６位であるアレル多型に対応するヌクレオチドを含む。ある実施態様において、アレル多型に対応するヌクレオチドは、５’末端から２位である。ある実施態様において、アレル多型に対応するヌクレオチドは、５’末端から３位である。ある実施態様において、アレル多型に対応するヌクレオチドは、５’末端から４位である。ある実施態様において、アレル多型に対応するヌクレオチドは、５’末端から５位である。ある実施態様において、アレル多型に対応するヌクレオチドは、５’末端から６位である。
医薬組成物のある実施態様において、二本鎖ＲＮＡは、アレル多型を有する変異体アレル、例えば、ヘテロ接合型ＳＮＰを選択的にサイレンシングする。医薬組成物のある実施態様において、二本鎖ＲＮＡはアレル多型を有する変異体アレルをサイレンシングし、同じ遺伝子の野生型アレルに影響しない。医薬組成物の他の実施態様において、ここに提供する二本鎖ＲＮＡはアレル多型を有する変異体アレルをサイレンシングし、同じ遺伝子の野生型アレルを変異体アレルより少ない程度サイレンシングする。
本発明の医薬組成物は、意図される投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例は、非経腸、例えば、静脈内(ＩＶ)、皮内、皮下(ＳＣまたはＳＱ)、腹腔内、筋肉内、経口(例えば、吸入)、経皮(局所)および経粘膜投与を含む。非経腸、皮内または皮下適用に使用する溶液または懸濁液は、次の成分を含み得る：注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸、クエン酸またはリン酸などの緩衝液および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性調節剤。ｐＨを、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節できる。非経腸調製物を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入できる。
注射用に適する医薬組成物は、無菌水溶液(水可溶性であるとき)または分散体および無菌注射用溶液または分散体の即時の調製のための無菌粉末を含む。静脈内投与のために、適当な担体は、生理食塩水、静菌性水、Cremophor ELTM(BASF, Parsippany, N.J.)またはリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)を含む。全ての場合、組成物は無菌でなければならず、容易に注射針を通過しなければならない。製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)および適当なこれらの混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散体の場合必要な粒子径の維持によりおよび界面活性剤の使用により、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成され得る。多くの場合、組成物に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを入れるのが望ましい。注射用組成物の長期吸収は、組成物に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを入れることによりもたらされ得る。
無菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、上記成分の１つまたは組み合わせを必要に応じて含む適切な溶媒に入れ、続いて濾過滅菌することにより、調製され得る。一般に、分散体は、活性化合物を、基本分散媒体および上記からの必要な他の成分を含む無菌媒体に入れることにより、調製される。無菌注射用溶液の調製用無菌粉末の場合、典型的調製方法は、活性成分と予め無菌濾過した溶液からの何らかの付加的な所望の成分の粉末をもたらす、真空乾燥およびフリーズドライである。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータを、ヒトにおける使用のための投与量範囲の計算に使用できる。このような化合物の投与量は、一般に、毒性がほとんどまたは全くなく、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に入る。投与量は、用いる剤形および利用する投与経路により、この範囲内で変わり得る。本発明の方法で使用するあらゆる化合物について、治療有効用量は、まず細胞培養アッセイから推定され得る。動物モデルで、細胞培養で決定したＥＣ５０(すなわち、最大応答の半分を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成するよう、用量が計算され得る。このような情報を使用して、ヒトで有用な用量をより正確に決定できる。血漿レベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定し得る。
処置方法
本発明は、全てまたは一部アレル多型(例えば、ヘテロ接合型ＳＮＰ)が原因の疾患または障害のリスクのある(または疑われる)対象の予防および治療両者の方法を提供する。ある実施態様において、疾患または障害は、トリヌクレオチド反復病または障害である。他の実施態様において、疾患または障害は、ポリグルタミン病である。ある実施態様において、方法は、治療有効量のここに提供する二本鎖ＲＮＡ分子の投与を含む。ある実施態様において、疾患または障害は、臨床的顕在化がハンチントン病患者に見られるような、ハンチンチンの発現に関連し、ハンチンチンの改変、特にＣＡＧ反復コピー数の増幅が、ハンチンチン遺伝子(構造または機能)またはハンチンチンタンパク質(構造または機能または発現)の欠損に至る障害である。
方法の実施態様において、ここに開示する二本鎖ＲＮＡは、アレル多型に対応するヌクレオチドの特定の位置での１ミスマッチオリゴヌクレオチド以外、アレル多型と相同である。ある実施態様において、ミスマッチは、アレル多型に対応するヌクレオチドの約６ヌクレオチド以内、アレル多型に対応するヌクレオチドの約５ヌクレオチド以内、アレル多型に対応するヌクレオチドの約４ヌクレオチド以内アレル多型に対応するヌクレオチドの約３ヌクレオチド以内、アレル多型に対応するヌクレオチドの約２ヌクレオチド以内またはアレル多型に対応するヌクレオチドの約１ヌクレオチド以内である。具体的例示的実施態様において、ミスマッチは、アレル多型に対応するヌクレオチドに隣接しない。
方法の他の実施態様において、二本鎖ＲＮＡは、５’末端から２位、３位、４位、５位または６位であるアレル多型に対応するヌクレオチドを含む。ある実施態様において、アレル多型に対応するヌクレオチドは、５’末端から２位である。ある実施態様において、アレル多型に対応するヌクレオチドは、５’末端から３位である。ある実施態様において、アレル多型に対応するヌクレオチドは、５’末端から４位である。ある実施態様において、アレル多型に対応するヌクレオチドは、５’末端から５位である。ある実施態様において、アレル多型に対応するヌクレオチドは、５’末端から６位である。
方法のある実施態様において、ｄｓＲＮＡは、５’末端から６位に多型に対応するヌクレオチドおよび５’末端から１１位にミスマッチを含む。方法のある実施態様において、ｄｓＲＮＡは、５’末端から４位に多型に対応するヌクレオチドおよび５’末端から７位にミスマッチを含む。
方法の他の実施態様において、二本鎖ＲＮＡは、アレル多型を有する変異体アレルを選択的にサイレンシングする。ある実施態様において、二本鎖ＲＮＡはアレル多型を有する変異体アレルをサイレンシングし、同じ遺伝子の野生型アレルに影響しない。他の実施態様において、二本鎖ＲＮＡはアレル多型を有する変異体アレルをサイレンシングし、同じ遺伝子の野生型アレルを変異体アレルより少ない程度サイレンシングする。
方法のある実施態様において、ｄｓＲＮＡは１以上のＶＰサブユニット間結合修飾を含み、ここで、サブユニット間結合は次の式を有する。
Figure 2022547790000024
さらなる実施態様において、ｄｓＲＮＡは、図４３に記載するサブユニット間結合修飾の１以上を含む。
ここで使用する「処置」または「処置する」は、治療剤(例えば、ＲＮＡ剤またはそれをコードするベクターもしくは導入遺伝子)の患者への適用または投与または患者からの単離組織または細胞株への治療剤の適用または投与と定義され、患者は、疾患または障害、疾患または障害の症状または疾患または障害の素因を有し、疾患または障害、疾患または障害の症状または疾患の素因を治癒、治療、軽減、緩和、改変、矯正、改良、改善または是正することを目的とする。
ある態様において、対象に治療剤(例えば、ＲＮＡｉ剤またはそれをコードするベクターもしくは導入遺伝子)を投与することによる、対象における上記疾患または障害を予防する方法が提供される。疾患のリスクにある対象は、例えば、ここに記載する診断または予後診断アッセイの何れかまたは組み合わせにより同定され得る。予防剤の投与は、疾患または障害が予防されるあるいはその進行が遅延されるように、該疾患または障害の特徴的症状の顕在化前に実施し得る。
本発明の他の態様は、治療的に対象を処置する、すなわち、疾患または障害の症状の発症を変える、方法に関する。ある例示的実施態様において、本発明の調節性方法は、機能獲得型変異体を発現する細胞と、該遺伝子内の１以上の標的配列に特異的である治療剤(例えば、ＲＮＡｉ剤またはそれをコードするベクターもしくは導入遺伝子)を、該遺伝子での配列特異的干渉が達成されるように接触することを含む。これらの方法は、インビトロ(例えば、細胞を薬剤と共に培養することにより)、あるいは、インビボ(例えば、薬剤を対象に投与することにより)で実施し得る。
神経細胞への取り込みの増強のために修飾されたＲＮＡサイレンシング剤を、約１.４mg／体重kg未満または１０、５、２、１、０.５、０.１、０.０５、０.０１、０.００５、０.００１、０.０００５、０.０００１、０.００００５または０.００００１mg／体重kg未満および２００nmoleのＲＮＡ剤(例えば、約４.４×１０１６コピー)／体重kg未満または１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７.５、１.５、０.７５、０.１５、０.０７５、０.０１５、０.００７５、０.００１５、０.０００７５または０.０００１５nmoleのＲＮＡサイレンシング剤／体重kg未満の単位用量で投与し得る。単位用量は、例えば、注射(例えば、静脈内または筋肉内、髄腔内または直接脳に)、吸入用量または局所適用により投与され得る。例示的実施態様において、投与量は、２、１または０.１mg／kg体重未満である。
ＲＮＡサイレンシング剤の直接臓器(例えば、直接脳)への送達は、約０.００００１mg～約３mg／臓器または約０.０００１～０.００１mg／臓器、約０.０３～３.０mg／臓器、約０.１～３.０mg／臓器または約０.３～３.０mg／臓器の桁の投与量であり得る。投与量は、神経学疾患または障害(例えば、ハンチントン病)の処置または予防に有効な量であり得る。ある実施態様において、単位用量を、１日１回未満、例えば、２日毎、４日毎、８日毎または３０日毎未満の頻度で投与する。他の実施態様において、単位用量はある頻度で投与されない(例えば、一定頻度ではない)。例えば、単位用量は、１回に投与され得る。ある実施態様において、有効用量は、他の伝統的治療モダリティと共に投与される。
ある実施態様において、対象に、ＲＮＡサイレンシング剤の初期用量および１以上の維持用量が投与される。１以上の維持用量は、一般に初期用量より低い、例えば、初期用量の半量である。維持レジメンは、対象を、０.０１μg～１.４mg／kg体重／日、例えば、１０、１、０.１、０.０１、０.００１または０.００００１mg／体重kg／日の１以上の用量で処置することを含む。維持用量は、一般に５日毎、１０日毎または３０日毎に１回未満で投与される。さらに、処置レジメンは、特定の疾患の性質、その重症度および患者の全体的状態により変わる期間継続得る。具体的実施態様において、投与量は、１日１回未満、例えば、２４時間、３６時間、４８時間またはそれ以上毎に１回未満、例えば、５日または８日毎に１回未満送達され得る。処置後、患者は、状態の変化および疾患状態の症状軽減についてモニターし得る。化合物の投与量は、患者が現在の投与量レベルに有意に応答しないとき、増加させてよく、または用量は、疾患状態の症状軽減が観察されるか、疾患状態が取り除かれるかまたは望まない副作用が観察されるならば、減少させてよい。
ハンチントン病
本発明のある態様において、ＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチントン病処置のための変異体ヒトハンチンチンタンパク質(ｈｔｔ)における標的多型(例えば、ヘテロ接合型一塩基多型)に対して設計される。従って、他の態様において、ハンチントン病を処置または管理する方法であって、そのような処置または管理を必要とする患者に治療有効量のここに記載する化合物、オリゴヌクレオチドまたは核酸または該化合物、オリゴヌクレオチドもしくは核酸を含む医薬組成物を投与することを含む、方法が提供される。
ハンチントン病は、常染色体優性疾患として遺伝され、認知障害および運動疾患をもたらす。患者は、飢餓または感染により早期に死亡する前、１０年を超えて重度に衰弱して生存し得る。疾患は、大部分４０代または５０代で発症するが、患者のサブセットは、疾患を１０代で発症し得る。ハンチントン病の遺伝子変異は、ハンチンチン遺伝子のＣＡＧ反復伸張である。ＣＡＧ反復の数は、正常個体で８～３５コピーで変わる(Kremer et al., 1994)。遺伝子変異(例えば、正常ハンチンチン遺伝子の３６未満のＣＡＧ反復の長さから、疾患の３６を超える長さへの延長)は、３６を超える連続ポリグルタミン残基を有する変異体ハンチンチンタンパク質の合成と関連する(Aronin et al., 1995)。一般に、３６以上のＣＡＧ反復を有する個体は、ハンチントン病となる。根底の変異として伸張ＣＡＧを有する２０ほどの他の疾患のプロトタイプとして、ハンチントン病には、なお有効な治療はない。多様な介入 － 例えば、アポトーシス経路の中断、ミトコンドリア効率をブーストするための薬剤の付加およびＮＭＤＡ受容体遮断 － は、細胞培養およびハンチントン病のマウスモデルで有望であることが示されている。しかしながら、これらのアプローチは、せいぜい、細胞または動物生存をわずかに延長するだけである。
ハンチントン病に関連する疾患遺伝子は、ハンチンチンまたは(ｈｔｔ)と称される。ハンチンチン座位は大きく、１８０kbにわたり、６７エクソンからなる。ハンチンチン遺伝子は広範に発現され、正常な発育に必要である。種々の胎児および成体組織における相対的量が違う、２つの別のポリアデニル化形態として発現される。大きいほうの転写物は約１３.７kbであり、主に成体および胎児脳で発現され、約１０.３kbの小さいほうの転写物は、より広く発現される。２種の転写物は、３’非翻訳領域が異なる(Lin et al., 1993)。両メッセージは、３１４４アミノ酸を含む３４８キロダルトンタンパク質をコードすると予測される。ハンチントン病に至る遺伝子欠損は、ｍＲＮＡに新しい性質を付与するかまたはタンパク質の機能を変えると考えられる。
ハンチントン病は、遺伝学のセントラルドグマが実施済である：変異体遺伝子は、変異体ｍＲＮＡ産生の鋳型として作用する；その後、変異体ｍＲＮＡは、変異体タンパク質の合成を指示する(Aronin et al., 1995; DiFiglia et al., 1997)。変異体ハンチンチン(タンパク質)は、線条体および皮質における選択的神経細胞に蓄積し、未確定細胞活性を破壊し、神経細胞機能不全および死を引き起こす可能性がある(Aronin et al., 1999; Laforet et al., 2001)。１コピーの変異体遺伝子がハンチントン病を引き起こすのに十分であるため、最も倹約処置は、変異体遺伝子を無効にすることである。理論的アプローチは、変異体ハンチンチンの遺伝子転写停止、変異体ｍＲＮＡ破壊および翻訳遮断を含む。各々、同じアウトカム－ 変異体ハンチンチンの喪失 － となる。
ハンチントンＳＮＰ
ある例示的実施態様によるターゲティングに適するハンチンチン遺伝子配列の例示的ＳＮＰを、下表４に開示する。各ＳＮＰ部位のゲノム配列は、例えば、ＮＣＢＩが維持する公的に利用可能な「SNP Entrez」データベースに見ることができる。ＨＤ患者および対照ＤＮＡの各ＳＮＰ部位のヘテロ接合性の頻度を、表４にさらに示す。高頻度ヘテロ接合型ＳＮＰの組み合わせのターゲティングは、比較的少数のアレル特異的ＲＮＡサイレンシング剤のＨＤ集団の使用で、個体の大部分を処置することを可能とする。
Figure 2022547790000025
ある実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、表４に挙げるＳＮＰ部位の１以上をターゲティングできる。ある実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチンチンｍＲＮＡのｒｓ３６３１２５ ＳＮＰ部位をターゲティングできる。他の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチンチンｍＲＮＡのｒｓ３６２２７３ ＳＮＰ部位をターゲティングできる。他の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチンチンｍＲＮＡのｒｓ３６２３０７ ＳＮＰ部位をターゲティングできる。他の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチンチンｍＲＮＡのｒｓ３６２３３６ ＳＮＰ部位をターゲティングできる。他の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチンチンｍＲＮＡのｒｓ３６２３３１ ＳＮＰ部位をターゲティングできる。他の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチンチンｍＲＮＡのｒｓ３６２２７２ ＳＮＰ部位をターゲティングできる。他の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチンチンｍＲＮＡのｒｓ３６２３０６ ＳＮＰ部位をターゲティングできる。他の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチンチンｍＲＮＡのｒｓ３６２２６８ ＳＮＰ部位をターゲティングできる。他の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチンチンｍＲＮＡのｒｓ３６２２６７ ＳＮＰ部位をターゲティングできる。他の実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤は、ハンチンチンｍＲＮＡのｒｓ３６３０９９ ＳＮＰ部位をターゲティングできる。ある実施態様において、ＲＮＡサイレンシング剤により標的化されるＳＮＰ部位は、ハンチントン病と関連する。具体的例示的実施態様において、ＲＮＡサイレンシング剤により標的化されるＳＮＰ部位は、ハンチントン病と有意に関連する。
さらなる例示的実施態様において、ＲＮＡサイレンシング剤は、表５～７の配列の１以上を含む。
Figure 2022547790000026

Figure 2022547790000027

Figure 2022547790000028
表５～７のある実施態様において、ＵヌクレオチドはＴヌクレオチドに置き換え得る。
核酸を送達する方法
本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、細胞(例えば、神経細胞)に直接導入できる(すなわち、細胞内)；または細胞外に、生物の腔、間質性空間、循環に、経口で導入できまたは細胞または生物を、核酸含有溶液に浸漬することにより、導入し得る。血管または血管外循環、血液またはリンパ系および脳脊髄液は、核酸を導入し得る、部位である。
本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、核酸含有溶液の注入、核酸で被覆された粒子の照射、核酸溶液への細胞または生物の浸漬または核酸存在下での細胞膜のエレクトロポレーションを含む、当分野で知られる核酸送達方法を使用して、導入できる。脂質介在担体輸送、化学介在輸送およびリン酸カルシウムなどのカチオン性リポソームトランスフェクションなどの核酸を細胞に導入するための当分野で知られる他の方法を使用し得る。核酸を、次の活性の１以上を実施する他の成分と共に導入し得る：細胞による核酸取り込み増強または他に標的遺伝子の阻害を増加。
核酸を導入する物理的方法は、ＲＮＡ含有溶液の注入、ＲＮＡで被覆された粒子の照射、ＲＮＡ溶液への細胞または生物の浸漬またはＲＮＡ存在下での細胞膜のエレクトロポレーションを含む。ウイルス粒子に包装されたウイルス構築物は、細胞への発現構築物の効率的導入および発現構築物によりコードされるＲＮＡの転写の両方を達成する。脂質介在担体輸送、リン酸カルシウムなどの化学－ＩＳ介在輸送などのＲＮＡを細胞に導入するための当分野で知られる他の方法を使用し得る。故に、ＲＮＡを、次の活性の１以上を実施する他の成分と共に導入し得る：細胞によるＲＮＡ取り込み増強、一本鎖のアニーリング阻害、一本鎖安定化または他に標的遺伝子の阻害を増加。
ＲＮＡ剤を、細胞(例えば、神経細胞)に直接導入できる(すなわち、細胞内)または細胞外に、生物の腔、間質性空間、循環に、経口で導入できまたは細胞または生物を、ＲＮＡ含有溶液に浸漬することにより、導入し得る。血管または血管外循環、血液またはリンパ系および脳脊髄液は、ＲＮＡを導入し得る、部位である。
標的遺伝子を有する細胞は、生殖細胞系または体細胞、分化全能性または多能性、分裂または非分裂、柔組織または上皮、不死化または形質転換などに由来し得る。細胞は、幹細胞または分化細胞であり得る。分化である細胞型は、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮、神経細胞、グリア細胞、血液細胞、巨核細胞、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞および内分泌または外分泌腺の細胞を含む。
特定の標的遺伝子および送達する二本鎖ＲＮＡ物質の用量によって、この過程は、標的遺伝子の部分的または完全機能喪失を提供し得る。標的細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％またはそれ以上の遺伝子発現の低減または喪失が代表的である。遺伝子発現の阻害は、標的遺伝子からのタンパク質および／またはｍＲＮＡ産物レベルの欠如(または観察可能な減少)をいう。特異性は、細胞の他の遺伝子への影響の発現なく、標的遺伝子を阻害する能力をいう。阻害の結果は、細胞または生物の外側の性質の試験(実施例に下記のとおり)またはＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノーザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイでの遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)、ウェスタンブロッティング、放射免疫アッセイ(ＲＩＡ)、他の免疫アッセイ、蛍光活性化細胞分析(ＦＡＣＳ)などの生化学的技術などにより、確認できる。
細胞株または生物全体のＲＮＡ介在阻害について、遺伝子発現は、好都合にはタンパク質産物が容易にアッセイされるレポーターまたは薬物耐性遺伝子の使用により、アッセイされる。このようなレポーター遺伝子は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ＡＨＡＳ)、アルカリホスファターゼ(ＡＰ)、ベータガラクトシダーゼ(ＬａｃＺ)、ベータグルクロニダーゼ(ＧＵＳ)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)、ルシフェラーゼ(Ｌｕｃ)、ノパリンシンターゼ(ＮＯＳ)、オクトピンシンターゼ(ＯＣＳ)およびその誘導体を含む。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノスリシン、ピューロマイシンおよびテトラサイクリンへの体制を付与する複数の選択可能マーカーが利用可能である。アッセイによって、遺伝子発現量の定量により、本発明により処置されない細胞と比較して、１０％、３３％、５０％、９０％、９５％または９９％より大きい、阻害の程度を決定できる。注入物質の量が低いおよびＲＮＡｉ剤投与の後時間が長いことにより、阻害される細胞の割合が少ないかもしれない(例えば、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、５０％、７５％、９０％または９５％)。細胞の遺伝子発現の定量は、標的ｍＲＮＡの蓄積または標的タンパク質の翻訳レベルで類似量の阻害を示し得る。一例として、阻害効率は、細胞における遺伝子産物の量の評価により決定し得る。ｍＲＮＡは、阻害性二本鎖ＲＮＡのために使用される領域外のヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブで検出できまたは翻訳ポリペプチドをその領域のポリペプチド配列に対して誘導した抗体で検出し得る。
ＲＮＡを、少なくとも１コピー／細胞の送達を可能とする量で導入し得る。高用量(例えば、少なくとも５、１０、１００、５００または１０００コピー／細胞)の物質は、有効に阻害し得る；特定の適用で低用量も有用であり得る。
特定の態様において、本発明のＲＮＡｉ剤(例えば、変異体遺伝子の多型をターゲティングするｓｉＲＮＡ)の有効性を、細胞、特に、神経細胞(例えば、線条体または皮質神経細胞クローン系および／または初代神経細胞)における変異体ｍＲＮＡ(例えば、変異体ｈｔｔ ｍＲＮＡおよび／または変異体ハンチンチンタンパク質の産生)を特異的に分解する能力について試験する。細胞ベースの検証アッセイでまた適当なのは、他の容易にトランスフェクト可能な細胞、例えば、ＨｅＬａ細胞またはＣＯＳ細胞である。細胞を、ヒト野生型または変異体ｃＤＮＡ(例えば、ヒト野生型または変異体ハンチンチンｃＤＮＡ)でトランスフェクトする。ＵループｍＲＮＡからｓｉＲＮＡを産生可能な標準的ｓｉＲＮＡ、修飾ｉＲＮＡまたはベクターを共トランスフェクトする。変異体ｍＲＮＡ(例えば、変異体ハンチンチンｍＲＮＡ)および／または変異体タンパク質(例えば、変異体ハンチンチン)の選択的低減を測定する。変異体ｍＲＮＡまたはタンパク質の低減を、正常ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルと比較し得る。外因的に導入した正常ｍＲＮＡまたはタンパク質(または内因性正常ｍＲＮＡまたはタンパク質)を、比較目的でアッセイし得る。標準的トランスフェクション技術に幾分抵抗性であることが知られる神経性細胞を利用するとき、ＲＮＡｉ剤(例えば、ｓｉＲＮＡ)を動的取込により導入することが望ましいかもしれない。
ある例示的実施態様において、本発明のＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤を含む組成物を、多様な経路で対象の神経系に送達できる。例示的経路は、髄腔内、実質(例えば、脳)、経鼻および眼送達を含む。組成物はまた、例えば、静脈内、皮下または筋肉内注射により全身送達もでき、これは、末梢神経細胞へのＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤の送達に特に有用である。例示的送達経路は、脳、例えば、脳室または視床下部または脳側面または背部に直接である。神経細胞送達のためのＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤は、投与に適する医薬組成物に包含され得る。
例えば、組成物は、ＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤の１以上の種および薬学的に許容される担体を含み得る。本発明の医薬組成物を、局所または全身いずれの処置が望ましいかおよび処置する領域により、多数の方法で投与し得る。投与は、局所(眼、鼻腔内、経皮を含む)、経口または非経腸を含む。非経腸投与は、静脈内点滴、皮下、腹腔内または筋肉内注射、髄腔内または脳室内(例えば、側脳室内)投与を含む。ある例示的実施態様において、本発明のＲＮＡサイレンシング剤を、ここに記載する多様な適当な組成物および方法を使用して、血液－脳－関門(ＢＢＢ)を通過させる。
送達経路は、患者の障害に依存し得る。例えば、ハンチントン病と診断された対象に、本発明の抗ｈｔｔ ＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤を、脳に直接投与し得る(例えば、大脳基底核の淡蒼球または線条体および線条体の中型有棘神経細胞付近)。本発明のＲＮＡサイレンシング剤に加えて、患者に、第二治療、例えば、緩和治療および／または疾患特異的治療を投与し得る。二次治療は、例えば、対症的(例えば、症状軽減のため)、神経保護的(例えば、疾患進行遅延または停止のため)または修復的(例えば、疾患過程逆転のため)であり得る。ハンチントン病処置のため、例えば、対症的治療は、薬物ハロペリドール、カルバマゼピンまたはバロプロエートを含む。他の治療は、心理療法、理学療法、言語療法、コミュニケーションおよび記憶補助、社会支援サービスおよび食事指導を含む。
ＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤を、脳の神経細胞に送達し得る。組成物の血液－脳関門の通過を必要としない送達方法が利用され得る。例えば、ＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物を、疾患罹患細胞を含む領域への直接注射により、患者に送達し得る。例えば、医薬組成物を、脳への直接注射により送達し得る。注射は、脳の特定の領域(例えば、黒質、皮質、海馬、線条体または淡蒼球)への定位固定注射により売る。ＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤を、中枢神経系の複数領域(例えば、脳の複数領域および／または脊髄)に送達し得る。ＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤を、脳の汎発性領域に送達し得る(例えば、脳の皮質への汎発性送達)。
ある実施態様において、ＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤を、組織、例えば、脳、例えば、脳の黒質、皮質、海馬、線条体または淡蒼球にインプラントされる一端を有するカニューレまたは他の送達デバイスの方法で送達できる。カニューレＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤のリザーバーに接続し得る。流れまたは送達は、ポンプ、例えば、浸透圧ポンプまたはミニポンプ、例えばAlzetポンプ(Durect, Cupertino, CA)により介在され得る。ある実施態様において、ポンプおよびリザーバを組織から遠位、例えば、腹部にインプラントし、送達を、ポンプまたはリザーバーから放出部位に至る導管により実施する。脳への送達のためのデバイスは、例えば、米国特許６,０９３,１８０および５,８１４,０１４に記載される。
本発明のＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤を、血液脳関門を横断できるよう、さらに修飾し得る。例えば、ＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤を薬剤の関門通過を可能とする分子にコンジュゲートさせ得る。このような修飾ＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤を、脳室内または筋肉内注射または、例えば肺送達によるなど、何らかの所望の方法により投与し得る。
ある実施態様において、エクソソームを使用して、本発明のＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤を送達し得る。エクソソームはＢＢＢを通過でき、全身注射後、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、化学療法剤およびタンパク質を、神経細胞に特異的に送達する(Alvarez-Erviti L, Seow Y, Yin H, Betts C, Lakhal S, Wood MJ. (2011). Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol. 2011 Apr;29(4):341-5. doi: 10.1038/nbt.1807; El-Andaloussi S, Lee Y, Lakhal-Littleton S, Li J, Seow Y, Gardiner C, Alvarez-Erviti L, Sargent IL, Wood MJ.(2011). Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nat Protoc. 2012 Dec;7(12):2112-26. doi: 10.1038/nprot.2012.131; EL Andaloussi S, Mager I, Breakefield XO, Wood MJ. (2013). Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov. 2013 May;12(5):347-57. doi: 10.1038/nrd3978; El Andaloussi S, Lakhal S, Maeger I, Wood MJ. (2013). Exosomes for targeted siRNA delivery across biological barriers. Adv. Drug Deliv Rev. 2013 Mar;65(3):391-7. doi: 10.1016/j.addr.2012.08.008参照)。
ある実施態様において、１以上の親油性分子が、本発明のＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤のＢＢＢを通る送達を可能とするため、使用される(Alvarez-Ervit (2011))。その後、ＲＮＡサイレンシング剤は、活性形態で薬物を放出するために、例えば、親油性隠蔽の酵素分解により、活性化される。
ある実施態様において、１以上の受容体介在透過性化化合物を使用して、本発明のＲＮＡサイレンシング剤の送達を可能とするために、ＢＢＢの透過性を増加させ得る。これらの薬物は、内皮細胞間の密着結合を緩める血液の浸透圧の増加により、ＢＢＢの透過性を一時的に増加させる((El-Andaloussi (2012))。密着結合を緩めることにより、ＲＮＡサイレンシング剤の通常の静脈内注射が実施され得る。
ある実施態様において、ナノ粒子ベースの送達系を使用して、本発明のＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤が、ＢＢＢを通過して送達される。ここで使用する「ナノ粒子」は、薬物または遺伝子担体として広く調査されている、一般に固体、生分解性、コロイド系であるポリマーナノ粒子をいう(S. P. Egusquiaguirre, M. Igartua, R. M. Hernandez, and J. L. Pedraz, “Nanoparticle delivery systems for cancer therapy: advances in clinical and preclinical research,” Clinical and Translational Oncology, vol. 14, no. 2, pp. 83-93, 2012)。ポリマーナノ粒子は、天然ポリマーおよび合成ポリマーの２つの大きなカテゴリーに分類される。ｓｉＲＮＡ送達のための天然ポリマーは、シクロデキストリン、キトサンおよびアテロコラーゲンを含むが、これらに限定されない(Y. Wang, Z. Li, Y. Han, L. H. Liang, and A. Ji, “Nanoparticle-based delivery system for application of siRNA in vivo,” Current Drug Metabolism, vol. 11, no. 2, pp. 182-196, 2010)。合成ポリマーは、徹底的に調査されているポリエチレンイミン(ＰＥＩ)、ポリ(ｄｌ－ラクチド－コ－グリコリド)(ＰＬＧＡ)およびデンドリマーを含むが、これらに限定されない(X. Yuan, S. Naguib, and Z. Wu, “Recent advances of siRNA delivery by nanoparticles,” Expert Opinion on Drug Delivery, vol. 8, no. 4, pp. 521-536, 2011)。ナノ粒子および他の適当な送達系のレビューのために、Jong-Min Lee, Tae-Jong Yoon, and Young-Seok Cho, “Recent Developments in Nanoparticle-Based siRNA Delivery for Cancer Therapy,” BioMed Research International, vol. 2013, Article ID 782041, 10 pages, 2013. doi:10.1155/2013/782041を参照のこと(引用により全体として本明細書に包含させる)。
本発明のＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤を、網膜障害、例えば、網膜症の処置のためなどに、眼に投与し得る。例えば、医薬組成物を、眼表面または近隣組織、例えば、瞼の内側に適用し得る。それらは、局所的に、例えば、液滴噴霧により、洗眼液または軟膏として、適用し得る。軟膏または滴下可能液体を、塗布器または点眼器など当分野で知られる眼送達系により送達し得る。このような組成物は、ヒアルロン酸、硫酸コンドロイチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリ(ビニルアルコール)などのムコミメティックス、ソルビン酸、ＥＤＴＡまたはベンジルクロニウムクロライドなどの防腐剤および通常の量の希釈剤および／または担体を含み得る。医薬組成物はまた眼の内部に投与でき、選択領域または構造に導入できる針または他の送達デバイスにより導入され得る。ＲＮＡサイレンシング剤を含む組成物は、眼パッチを介しても適用され得る。
一般に、本発明のＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤は、あらゆる適当な方法により投与され得る。ここで使用する局所送達は、ＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤の、眼、粘膜、体腔表面を含む体のあらゆる表面またはあらゆる内部表面への直接適用をいい得る。局所投与用製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、スプレーおよび液体を含む。慣用の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、濃厚剤などが必要であるかまたは望まれるかもしれない。局所投与はまた対象の表皮または真皮またはその特定の層または根底の組織にＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤を選択的に送達する主担としても使用され得る。
髄腔内または脳室内(例えば、側脳室内)投与用組成物は、緩衝液、希釈剤および他の適当な添加剤も含み得る無菌水溶液を含み得る。髄腔内または脳室内投与用組成物は、一般に、トランスフェクション試薬または、例えば、ＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤に結合した親油性部分以外の付加的親油性部分を含まない。
非経腸投与用製剤は、緩衝液、希釈剤および他の適当な添加剤も含み得る無菌水溶液を含み得る。脳室内注射は、例えば、リザーバーに結合した、脳室内カテーテルにより促進され得る。静脈内使用のために、溶質の総濃度は、調製物を等張とするため、制御されなければならない。
本発明のＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤は、肺送達により対象に投与され得る。肺送達組成物は、分散体内の組成物が肺胞領域を介して直接血液循環に容易に吸収され得る場所である、肺に到達できるように分散体の吸入により送達され得る。肺送達は、肺疾患処置のために全身送達および局所送達両方で有効であり得る。ある実施態様において、肺送達により投与されるＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤は、血液脳関門を通過できるよう、修飾されている。
肺送達は、噴霧、エアロゾル化、ミセルおよび乾燥粉末ベースの製剤の使用を含む、種々のアプローチにより達成され得る。送達は、液体ネブライザー、エアロゾルベースの吸入器および乾燥粉末分散デバイスで達成され得る。定量デバイスが代表例である。アトマイザーまたは吸入器を使用する利益の一つは、デバイスが自給式であるため、汚染の彼末井が最小化されることである。乾燥粉末分散デバイスは、例えば、容易に乾燥粉末として製剤化され得る薬物を送達する。ＲＮＡサイレンシング剤組成物は、それ自体または適当な粉末担体との組み合わせで、凍結乾燥または噴霧乾燥粉末として安定に保管され得る。吸入のための組成物の送達は、デバイスに組み込まれたとき、エアロゾル医薬投与中の患者の用量追跡、コンプライアンスモニタリングおよび／または投与トリガーを可能とするタイマー、用量カウンター、時間計測デバイスまたは時間インジケーターを含み得る投与タイミング要素により介在され得る。
担体として有用な医薬添加物のタイプは、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)などの安定化剤、炭水化物、アミノ酸およびポリペプチドなどの充填剤；ｐＨ調節剤または緩衝液；塩化ナトリウムなどの塩などを含む。これらの担体は、結晶または非晶質形態であり得てまたは２種の混合物であり得る。
特に価値のある充填剤は、適合性炭水化物、ポリペプチド、アミノ酸またはこれらの組み合わせを含む。適当な炭水化物は、ガラクトース、Ｄ－マンノース、ソルボースなどの単糖；ラクトース、トレハロースなどの二糖；２－ヒドロキシプロピル－.ベータ.－シクロデキストリンなどのシクロデキストリン；およびラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなどの多糖；マンニトール、キシリトールなどのアルジトールなどを含む。炭水化物の例示的群は、ラクトース、トレハロース、ラフィノースマルトデキストリンおよびマンニトールを含む。適当なポリペプチドはアスパルテームを含む。アミノ酸はアラニンおよびグリシンを含み、グリシンが代表的である。
適当なｐＨ調節剤または緩衝液は、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなどの有機酸および塩基から調製された有機塩を含み；クエン酸ナトリウムが代表例である。
本発明のＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤は、経口および経鼻送達により投与され得る。例えば、これらの膜を介して投与された薬物の作用開始は速く、治療血漿レベルを提供し、肝臓代謝の初回通過効果を回避し、そして薬物が消化器(ＧＩ)環境に不利であることを回避する。付加的利点は、薬物が容易に適用、局在化および除去できるように、膜部位への容易なアクセスを含む。ある実施態様において、経口または経鼻送達により投与されるＲＮＡサイレンシング剤は、血液－脳関門を通過できるよう修飾されている。
ある実施態様において、ＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤を含む組成物の単位用量または定量が、インプラントデバイスにより分散される。デバイスは、対象内のパラメータをモニターするセンサーを含み得る。例えば、デバイスは、浸透圧ポンプなどのポンプと、所望により、関連電子機器を含み得る。
ここに記載する方法の他の適当な修飾および適応が、ここに開示する実施態様の範囲から逸脱することなく、適当な等価物を使用して為し得ることは、当業者には容易に明らかである。ある実施態様をここでは詳細に記載しており、それは、説明の目的のみのために包含され、限定的であることは意図されない、次の実施例を参照して、より明確に理解される。
実施例１：ＳＮＰ識別は、ミスマッチ位置により変わる
図４６は、ＨＴＴの場合に実行されたが、他の遺伝子のＳＮＰにも適用可能である、ＳＮＰ識別ｓｉＲＮＡを産生および選択する方法を説明するフローチャートである。一次スクリーニングを、どの位置に配置したＳＮＰが最大識別をもたらすかを決定するために実施する。次いで、最も良い結果となったミスマッチ位置を選択し、非標的アレルに対する親和性を、ｓｉＲＮＡ分子の選択性および／または効力を改善する化学および構造的最適化が選択される二次スクリーニングでさらに減少させる。
ＨＴＴ遺伝子内にＨＤ患者でヘテロ接合性が高率である数個のＳＮＰがある(図４５)。ハンチンチンのＳＮＰ特異的ＲＮＡｉ介在サイレンシングの最適化のために、ＨＴＴ ｍＲＮＡのエクソン５７のＳＮＰ ｒｓ３６２２７３を、ＳＮＰ選択的サイレンシングの最適化のモデル標的として使用した。このＳＮＰヘテロ接合性は、ＨＤ患者集団の３５％で生ずる。
ここに記載するｐｓｉＣＨＥＣＫレポータープラスミドは、Ｒｌｕｃ ３’ ＵＴＲ内にｈｔｔのエクソン５７からのＳＮＰ ｒｓ３６２２７３および部分的フランキング領域を含む。野生型ｐｓｉＣＨＥＣＫレポータープラスミドは、ＳＮＰがないｈｔｔの同じ領域を含む(図１)。
変異体ＳＮＰ(２２７３－１ (Ａ))を含むハンチンチン(ｈｔｔ)ｍＲＮＡに相補性であるよう設計した疎水性修飾ＲＮＡ(ｈｓｉＲＮＡ)を、ｐｓｉＣｈｅｃｋレポータープラスミド系で有効性についてスクリーニングした。ＳＮＰ後の数値は、ｓｉＲＮＡにおけるＳＮＰの位置を示す(図４７)。図２は、２位、４位または６位へのＳＮＰの配置が、変異体アレルに対する有効性を損なうことなく、最大ＳＮＰ識別を提供したことを示す。２個のレポータープラスミドの一方でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、動的取込により１.５μM ｈｓｉＲＮＡで逆トランスフェクトし、７２時間処理した。ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクション７２時間後に測定した(図２)。
ｈｓｉＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞における用量応答デュアルルシフェラーゼアッセイでアレル識別についてさらに試験した(図３)。複数ｈｓｉＲＮＡが、野生型レポータープラスミドと比較して、変異体ＳＮＰを含むレポータープラスミドを優先的にサイレンシングした。２個のレポータープラスミドの一方でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、動的取込により１.５μM ｈｓｉＲＮＡで逆トランスフェクトし、７２時間処理した。レポータープラスミド発現を、トランスフェクション７２時間後に測定した(図３)。
実施例２：内因性Ｈｔｔ ｍＲＮＡにおけるＳＮＰ識別
ｈｓｉＲＮＡを、ホモ接合型ｒｓ３６２２７３ ＳＮＰを含む内因性ハンチンチンｍＲＮＡに対して、有効性を試験した。ＨｅＬａ細胞がｒｓ３６２２７３でホモ接合型であり、各アレルでＡでるため、アレル識別はこのアッセイで評価しなかった。その代わり、図４は、２個のｈｓｉＲＮＡ、ＳＮＰ４－０およびＳＮＰ６－０が、正確なＳＮＰを含むｈｔｔ ｍＲＮＡのサイレンシングに高度に有効であったことを示す。ｍＲＮＡレベルを、ＨｅＬａ細胞を動的取込によりｈｓｉＲＮＡで７２時間処理後、Quantigene 2.0 bDNAアッセイを使用して、測定した。ヒトｈｔｔ ｍＲＮＡレベルを、ヒトＨＰＲＴに対して正規化した。
実施例３：アレル識別を大きくするための第二ミスマッチを有するｈｓｉＲＮＡの設計
用量応答のために予め選択した３個のｈｓｉＲＮＡ(ＳＮＰ２－０、ＳＮＰ４－０およびＳＮＰ６－０それぞれｍｍ２、ｍｍ４およびｍｍ６と命名)の各々について、１６の新規ｈｓｉＲＮＡを設計し、わずかな配列修飾を伴い合成した(図３４)。これらの配列は、第二ミスマッチが先のものより顕著にオフターゲットＳＮＰのサイレンシングを妨害し、サイレンシング標的ＳＮＰにほとんど影響しないことを試験するために、元の配列に沿った全ての可能な位置に一ミスマッチを導入した。アンチセンス鎖配列を５’から３’方向で示し、ＳＮＰ部位は赤色および新規ミスマッチは青色である(図１２)。
図１２のｈｓｉＲＮＡの有効性の一次スクリーニングは、ＳＮＰに対応するヌクレオチドの位置に対する第二ミスマッチの位置が、ＨｅＬａ細胞における種々のレベルのＳＮＰ識別をもたらしたことを示した。２個のｐｓｉＣＨＥＣＫレポータープラスミドの一方でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、動的取込により１.５μM ｈｓｉＲＮＡで逆トランスフェクトし、７２時間処理した。ルシフェラーゼ活性を、トランスフェクション７２時間後に測定した。図５は、複数ｈｓｉＲＮＡが、野生型レポータープラスミドと比較して、ＳＮＰ変異を含むレポータープラスミドを識別してサイレンシングすることを示す。
第二ミスマッチを含む最も効果的ｈｓｉＲＮＡを、ＳＮＰ識別の改善を検証するため、用量応答曲線でさらに試験した。２個のレポータープラスミドの一方でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を動的取込によりｈｓｉＲＮＡで逆トランスフェクトし、７２時間処理した。レポーター発現をデュアル－ルシフェラーゼアッセイで測定した。図６～８は、野生型レポータープラスミドに対する、ＳＮＰ変異を含むレポータープラスミドのサイレンシングについて２個のミスマッチを有するｈｓｉＲＮＡのＩＣ５０値を示す。ＳＮＰ６－１１ ｈｓｉＲＮＡ(５’末端から６位に多型に対応するヌクレオチドおよび５’末端から１１位にミスマッチを有するｈｓｉＲＮＡ分子)およびＳＮＰ４－７ ｈｓｉＲＮＡ(５’末端から４位に多型に対応するヌクレオチドおよび５’末端から７位にミスマッチを有するｈｓｉＲＮＡ分子)は、最も効果的であることが示された(図７～９参照)。驚くべきことに、ＳＮＰ周辺の修飾パターン改変は、識別を損なうことなく、第二ミスマッチ導入により失われた有効性を回復する。ＳＮＰ６－１１ ｈｓｉＲＮＡを、２’Ｏ－メチル修飾フランキングミスマッチヌクレオチド(ならびに２’Ｏ－メチル修飾を有するミスマッチヌクレオチド自体)を有するように改変した(図１０参照)。
実施例４：さらなる修飾
多様なオリゴヌクレオチドタイプ(例えば、ギャップマー、ミックスマー、ｍｉＲＮＡ阻害剤、スプライス－スイッチングオリゴヌクレオチド(「ＳＳＯ」)、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド(「ＰＭＯ」)、ペプチド核酸(「ＰＮＡ」)など)を、所望により、ここにおよび、例えば、米国出願１５／０８９,４２３；米国出願１５／２３６,０５１；米国出願１５／４１９,５９３；米国出願１５／６９７,１２０および米国特許９,８０９,８１７；および米国出願１５／８１４,３５０および米国特許９,８６２,３５０(その各々を全ての目的で、引用により全体としてここに包含させる)に記載する修飾(例えば、化学修飾)および／またはコンジュゲーションの種々の組み合わせを利用して、ここに記載するオリゴヌクレオチドに使用できる。
例えば、ここに記載するオリゴヌクレオチドは、ジ－ｓｉＲＮＡと表記し得る(例えば、図１４参照)。ここに記載するオリゴヌクレオチドは、１以上の異なる主鎖結合を有し得る(例えば、図１５参照)。ここに記載するオリゴヌクレオチドは、多様な糖修飾を含み得る(例えば、図１６参照)。ここに記載するオリゴヌクレオチドは、多様なヌクレオチド間結合を含み得る(例えば、図１７参照)。ここに記載するオリゴヌクレオチドは、１以上の５’安定化修飾を含み得る(例えば、図１８参照)。ここに記載するオリゴヌクレオチドは、１以上のコンジュゲート部分を含み得る(例えば、図１９参照)。図３５に多数の例示的オリゴヌクレオチド主鎖修飾を示す。
ここに記載するオリゴヌクレオチドを、単にＳＮＰ位置の塩基を変えることにより、ＳＮＰ部位のＧを標的とするよう効率的に使用できる。図３３に示すとおり、化合物ＳＮＰ６－１１を２回目に合成し、この回は、ＳＮＰ部位のＡではなくＧを標的とした。これにより、同じＳＮＰ部位で異なるヘテロ接合性を有する患者に極めて有用な戦略である、いずれかのアレルの選択的サイレンシングを可能とする。
ある例示的実施態様において、１以上の脱塩基ヌクレオチドを、ＳＮＰ位置ヌクレオチド、ＭＭ位置ヌクレオチド、５’末端、３’末端またはこれらの何らかの組み合わせで使用する。
ある例示的実施態様において、ｈｓｉＲＮＡを、アレル特異性を改善するためにミスマッチ周囲に種々の糖修飾、例えば、２’Ｆの代わりに２’ＦＡＮＡ；ＳＮＰ／ミスマッチ位置周囲の３重２’Ｆまたは３重２’ＯＭｅを用いて、合成する。
実施例５：ＨＴＴマウスモデル
ＢＡＣ９７－ＨＤは、ヒトｈｔｔエクソン１を連続ポリグルタミン(ｐｏｌｙＱ)ストレッチをコードする９７混合ＣＡＡ－ＣＡＧ反復を含むｌｏｘＰ隣接ヒト変異体ｈｔｔエクソン１配列で置き換えることにより修飾された病原性１７０kbヒトハンチンチン(ｈｔｔ)ゲノム座位全体を含む、ヒト細菌人工染色体(ＢＡＣ)トランスジェニックインサートを含むトランスジェニックマウスをいう。
リード化合物(ＳＮＰ６－１１)を、図３１に示す構造を有する二分岐化学足場に合成し、続いてインビボで、８週齢ＢＡＣ９７－ＨＤ雌マウスで、４０nmol両側側脳室内(ＩＣＶ)注射(各側２０nmol)により試験した。マウスは、ＳＮＰ ｒｓ３６２２７３でＧの正常マウスｈｔｔ遺伝子およびＳＮＰ ｒｓ３６２２７３ＡでＡの病原性ヒトｈｔｔ遺伝子のトランスジェニックインサートの２コピーを有した。ＲＮＡトランスクリプトームに標的マッチがないナンセンス配列も同じ二分岐足場に合成し、マウスに陰性対照(ＮＴＣ)として注射した。
注射１か月後ＲＮＡおよびプロテイン分析のためにマウスの脳領域を数か所採取し、ＨＴＴタンパク質レベルをＡｂ１抗体を使用するウェスタンブロットにより測定した。図３２Ａは、採取した線条体組織で実施したウェスタンブロットであり、ビンキュリンに対して正規化したタンパク質レベルを図３２Ｂに示す。
実施例６：ＳＮＰターゲティングは配列非依存的である
リード化合物のＳＮＰ識別が配列依存的であるか否かを評価した。ｒｓ３６２２７３におけるＵからＧミスマッチまたはＣからＡミスマッチを含むハンチンチン(ｈｔｔ)ｍＲＮＡと相補性であるよう設計した疎水性修飾ＲＮＡ(ｈｓｉＲＮＡ)を使用した。ＵからＧミスマッチに相補性の６－１１ ｈｓｉＲＮＡおよびＣからＡミスマッチに相補性の６－１１ ｈｓｉＲＮＡ両者とも優先的に標的ＳＮＰを開裂した(図２０)。
実施例７：ビニルホスホネート修飾サブユニット間結合の合成
ここに記載するビニルホスフィナート修飾サブユニット間結合の代表的合成を図２１および２９に示す。図２１の合成方法を下に詳述する。
化合物３ａの合成
ピリジン(１００mL)中の化合物２ａ(１６.６ｇ、２０.８mmol)の無水溶液に、無水ＤＩＰＥＡ(６.５mL、３７.４mmol)および塩化ベンゾイル(３.６mL、３１.２mmol)を加えた。混合物を４時間、室温で撹拌後、過剰のピリジンを蒸発させ、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。有機溶液を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄した。有機層を集め、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた粗製物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン－酢酸エチル、４：１～１：１)で精製して、化合物３ａを僅かに黄色の泡状物(１４.５ｇ、７８％)として得た；1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.88-7.87 (m, 2H), 7.84 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 7.67-7.58 (m, 5H), 7.48-7.45 (m, 4H), 7.39-7.32 (m, 4H), 7.25-7.23 (m, 3H), 7.18-7.17 (m, 2H), 7.12-7.07 (m, 4H), 6.80-6.75 (m, 4H), 6.08 (dd, 1H, JHH = 1.5 Hz, JHF = 15.2 Hz), 5.14, (d, 1H, JHH = 8.3 Hz), 4.59 (ddd, 1H, JHH = 3.7, 1.5 Hz, JHF = 51.9 Hz), 4.43 (ddd, 1H, JHH = 7.4, 4.0 Hz, JHF = 19.1 Hz), 4.24-4.23 (m, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.62 (dd, 1H, JHH = 11.2, 2.0 Hz), 3.35 (dd, 1H, JHH = 11.1, 2.0 Hz), 1.00 (s, 9H);13C NMR (126 Hz, CDCl3) δ 168.4, 161.8, 158.72, 158.66, 148.9, 143.9, 139.4, 135.71. 135.70, 135.1, 134.8, 134.7, 132.3, 132.2, 131.3, 130.4, 130.2, 130.1, 129.1, 128.2, 128.0,127.91, 127.89, 127.2, 113.19, 113.16, 102.2, 92.5 (d, JCF = 194.4 Hz), 87.7 (d, JCF = 34.5 Hz), 87.2, 82.4, 70.0 (d, JCF = 15.4 Hz), 60.7, 60.4, 55.2, 26.6
化合物４ａの合成
化合物３ａ(１４.５ｇ、１６.３mmol)を、トリエチルシラン(８.０mL、５０.１mmol)を含む３％トリクロロ酢酸／ＣＨ２Ｃｌ２溶液(２００mL)に溶解し、１時間、室温で撹拌した。溶液を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で３回洗浄後、集めた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた粗製物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン／酢酸エチル、４：１～３：７)で精製して、化合物４ａを白色泡状物(８.６７ｇ、９１％)として得た；1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.89-7.88 (m, 2H), 7.68-7.64 (6H, m), 7.51-7.45 (m, 4H), 7.42-7.38 (4H, m), 5.93 (dd, 1H, JHH = 2.9 Hz, JHF = 15.1 Hz), 5.73 (d, 1H, JHH = 8.2 Hz), 4.74 (ddd, 1H, JHH = 4.1, 3.2 Hz, JHF = 52.2 Hz), 4.31 (ddd, 1H, JHH = 5.8, 4.7, JHF = 15.4 Hz), 4.11-4.09 (m, 1H), 3.82-3.79 (m, 1H), 3.39 (ddd, 1H, JHH = 12.1, 5.6, 1.5 Hz), 1.64 (br, 1H), 1.11 (s, 9H);13C NMR (126 Hz, CDCl3) δ 168.3, 161.8, 149.0, 140.5, 135.7, 135.2, 132.8, 132.3, 131.3, 130.5, 130.4, 130.3, 129.2, 128.02, 127.96, 102.4, 91.8 (d, JCF = 91.8 Hz), 89.5 (d, JCF = 33.6 Hz), 69.5 (d, JCF = 69.5 Hz), 60.3, 26.8
化合物６ａの合成
化合物４ａ(６.５ｇ、１１.０mmol)の無水溶液にＩＢＸ(７.７ｇ、２７.６mmol)を加え、２時間、８５℃で撹拌した。混合物を氷浴で冷却後、溶液中の沈殿をセライトで濾取した。集めた溶離剤を蒸発させ、アルゴン雰囲気下、無水ＣＨ３ＣＮと３回共蒸発させ、白色泡状物として得られた化合物５ａをさらに精製することなく使用した。別のフラスコで、ＣＢｒ４(７.３ｇ、２２.１mmol)含有無水ＣＨ２Ｃｌ２(２５mL)溶液にＰＰｈ３(１１.６ｇ、４４.２mmol)を０℃で加え、０.５時間、０℃で撹拌した。この溶液に、化合物５ａの無水ＣＨ２Ｃｌ２溶液(２５mL)を０℃で滴下し(１０分間)、２時間、０℃で撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２で希釈後、有機溶液を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた物質を最小量のジエチルエーテルに溶解し、０℃で激しく撹拌しながら、過剰のジエチルエーテル溶液に滴下した。溶液中の沈殿をセライトで濾取したおよび溶離剤を蒸発させた。得られた粗製物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン／酢酸エチル、９：１～１：１)で精製して、化合物６ａを白色泡状物(４.３ｇ、５２％)として得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.68-7.84 (m, 2H), 7.70-7.65 (m, 3H), 7.60-7.58 (m, 2H), 7.52-7.49 (m, 2H), 7.42-7.36 (m ,4H), 7.31-7.28 (m, 2H), 7.09 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 6.25 (d, 1H, J = 8.9 Hz), 5.75 (dd, 1H, JHF = 8.24 Hz), 5.49 (dd, 1H, JHF = 21.4 Hz), 4.77 (t, 1H, JHH = 8.5 Hz, JHF = 8.5 Hz), 4.38 (dd, 1H, JHH = 4.1 Hz, JHF = 52.1 Hz), 4.25 (ddd, 1H, JHH = 8.1, 4.9 Hz, JHF = 19.4 Hz), 1.10 (s, 9H);13C NMR (126 Hz, CDCl3) δ 167.9, 161.6, 148.3, 141.4, 135.8, 134.7 (d, JC-Br = 139.0 Hz), 132.5, 132.2, 131.1, 130.5, 130.3, 130.2, 129.2, 127.9, 102.7, 97.3, 93.3 (d, JCF = 39.1 Hz), 91.5 (d, JCF = 190.7 Hz), 82.4, 73.9 (d, JCF = 16.4 Hz), 26.7
化合物７ａ－Ｅおよび７ａ－Ｚの合成
ＤＭＦ(２５mL)中の化合物６ａ(４.２ｇ、５.６６mmol)の無水溶液に、ジメチルホスファイト(２.０９mL、２２.６mmol)およびトリエチルアミン(１.５８mL、１１.３mmol)を０℃で加え、次いで一夜、室温で撹拌した。溶液を酢酸エチルで希釈後、有機溶液を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液および塩水で洗浄した。次いで、有機溶液をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた粗製物質を、全純粋異性体化合物が個々に集まるまで繰り返しシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン／酢酸エチル、９：１～１：１)で精製し、化合物７ａ－Ｅ(１.９５ｇ、５２％)(1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.87-7.85 (m, 2H), 7.89-7.85 (m, 3H), 7.61-7.59 (m, 2H), 7.52-7.48 (m, 2H), 7.45-7.32 (m, 6H), 7.08 (d, 1H, JHH = 8.2), 6.49 (d, 1H, JHH = 13.7), 5.99 (dd, 1H, JHH = 13.7 Hz, 8.1 Hz), 5.75 (d, 1H, JHH= 8.2), 5.63 (d, 1H, JHF = 19.8 Hz), 4.43 (dd, 1H, JHF = 52.6 Hz, JHH = 4.3 Hz), 4.42 (t, 1H, JHH = 8.0 Hz), 4.07 (ddd, JHH = 7.8, 4.7 Hz, JHF = 19.5 Hz), 1.08 (s, 9H);13C NMR (126 Hz, CDCl3) δ 148.4, 140.4, 135.8, 135.7, 135.3, 133.3, 132.3, 132.4, 132.1, 131.1, 130.5, 130.4, 130.3, 129.2, 127.95, 127.93, 112.4, 102.7, 91.7 (d, JCF = 36.3 Hz), 91.6 (d, JCF = 191.6 Hz), 82.8, 73.9 (d, JCF = 16.4 Hz), 26.7, 19.1)および７ａ－Ｚ(０.５８ｇ、１５％)(1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.87-7.85 (m, 2H), 7.68-7.65 (m, 3H), 7.61-7.59 (m, 2H), 7.52-7.48 (m, 2H), 7.42-7.39 (m, 2H), 7.34-7.29 (m, 4H), 7.12 (d, 1H, JHH = 8.2 Hz), 6.51 (d, 1H, JHH = 7.4 Hz), 5.96 (dd, 1H, JHH = 8.4 Hz, 7.4 Hz), 5.75 (d, 1H, JHH = 8.2 Hz), 5.57 (dd, 1H, JHH = 1.2 Hz, JHF = 20.6 Hz), 5.04 (dd, 1H, JHH = 8.2 Hz), 4.48 (JHH = 3.5 Hz, JHF = 53.1 Hz), 4.24 (ddd, 1H, JHH = 7.8, 4.9 Hz, JHF = 18.6 Hz), 1.09 (s, 9H);13C NMR (126 Hz, CDCl3) δ 168.0, 161.7, 148.4, 141.4, 135.9, 135.8, 135.2, 132.6, 132.5, 131.2, 130.6, 130.5, 130.2, 130.1, 129.2, 127.8, 127.7, 114.5, 102.6, 93.0 (d, JCF = 37.2 Hz), 91.6 (d, JCF =191.6 Hz), 80.3, 74.3 (d, JCF = 16.4 Hz), 26.7, 19.1)を得た。
化合物９ａの合成
無水化合物７ａ－Ｅ(１.９５ｇ、２.９４mmol)およびＰｄ(ＯＡｃ)２(１２５mg、０.５９mmol)および[１,１’－ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(II)(６５２mg、１.１８mmol)をアルゴンでパージし、次いで、無水ＴＨＦ(５０mL)に溶解した。酸化プロピレン(２.０６mL、２９.４mmol)添加後、化合物８ａ(２.０７ｇ、３.２４mmol)を一度に加え、４時間、７０℃で撹拌した。減圧下に溶媒除去後、粗製混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン／酢酸エチル、５０：５０～０：１００)で精製し、得られた化合物９ａを含むフラクションをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ＣＨ２Ｃｌ２－ＭｅＯＨ、０％～５％)でさらに精製して、化合物９ａをジアステレオ－異性体混合物(２.０４ｇ、５７％)として得た；31P NMR (202 MHz, CDCl3) δ 18.3
化合物１０ａの合成
化合物９ａ(２.０ｇ、１.６４mmol)の無水ＴＨＦ(２２.５mL)溶液に１.０Ｍ ＴＢＡＦ－ＴＨＦ(２.５mL、２.５mmol)を加え、環境温度で３０分間撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２で希釈後(１２０mL)、有機層を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、次いで蒸発させた。得られた粗製物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(１％ＴＥＡ－ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、０％～６％)で精製して、化合物１０ａ(１.５２ｇ、９４％)を得た；31P NMR (202 MHz, CDCl3) δ 19.0, 18.7
化合物１１ａの合成
化合物１０ａ(５８９.７mg、０.６mmol)を、無水ＣＨ３ＣＮと繰り返し共蒸発することにより無水とし、次いで、無水ＣＨ２Ｃｌ２(６.０mL)に溶解した。この溶液にＮ,Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン(０.３１mL、１.８mmol)および２－シアノエチルＮ,Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト(０.１６mL、０.７２mmol)を０℃で加えた。３０分間、０℃で撹拌後、反応混合物を過剰のＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で繰り返し洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた粗製物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(１％ＴＥＡ－ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、１００％～４％)で精製して、化合物１１ａを白色泡状物(５７０mg、８０％)として得た；31P NMR (202 MHz, CDCl3) δ 150.3, 151.2, 151.1, 151.0, 18.72, 18.65, 18.55, 18.3
化合物４ｂの合成
ピリジン(１０mL)中の化合物３ｂ(１.３５ｇ、２.０mmol)の無水溶液に、ＤＩＰＥＡ(０.６３mL、３.６mmol)および塩化ベンゾイル(０.３５mL、３.０mmol)を加え、３時間、室温で撹拌した。過剰のＣＨ２Ｃｌ２で希釈後有機溶液を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で洗浄した。ＭｇＳＯ４で乾燥後、濾過し、蒸発させ、得られた粗製物質をさらに精製することなく次反応で使用した。化合物３ｂを含む得られた粗製物質に３％トリクロロ酢酸のＣＨ２Ｃｌ２溶液(２５mL)およびトリエチルシラン(１mL、６.２６mmol)を加え、１時間、室温で撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈後、溶液を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で３回洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、次いで蒸発させた。得られた粗製物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン／酢酸エチル、４：１～１：４)で精製して、純粋化合物４ｂ(５９６.７mg、２工程で６３％)を得た；1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.13 (d, 1H, JHH = 8.2 Hz), 7.95 (d, 2H, JHH = 7.3 Hz), 7.81 (t, 1H, JHH = 7.5 Hz), 7.69-7.68 (m, 2H), 7.64-7.59 (m, 4H), 7.49-7.42 (m, 6H), 5.93 (d, 1H, JHH = 4.6 Hz), 5.26 (t, 1H, JHH = 4.6 Hz), 4.36 (dd, 1H, JHH = 4.6, 4.6 Hz), 4.02-4.00 (m, 1H), 3.65-3.61 (m, 1H), 3.54 (dd, 1H, JHH = 4.6, 4.6 Hz), 3.09 (s, 3H), 1.03 (s, 9H);13C NMR (126 Hz, DMSO-d6) 169.8, 162.1, 149.5, 141.3, 136.1, 135.9, 135.8, 133.4, 133.2, 131.5, 130.7, 130.52, 130.48, 130.0, 128.4, 128.3, 102.1, 86.7, 85.6, 82.8, 79.7, 70.8, 60.2, 57.8, 27.2, 19.4;HRMS (ESI) C33H35N2O7Si-のm/z計算値 [M - H]- m/z 599.2219, 実測値m/z 599.2258
化合物６ｂの合成
ＣＨ３ＣＮ(５mL)中の化合物４ｂ(３００.４mg、０.５mmol)の無水溶液に、ＩＢＸ(３５０mg、１.３mmol)を加え、２時間、８５℃で撹拌した。溶液を０℃に冷却後、沈殿をセライト濾過で濾別した。得られた化合物５ｂ含有溶離剤を蒸発させ、無水ＣＨ３ＣＮと繰り返し共蒸発することにより無水とし、さらに精製することなく次反応で使用した。別に調製したＣＢｒ４(３３１.６mg、１.０mmol)のＣＨ２Ｃｌ２(５.０mL)無水溶液にトリフェニルホスフィン(５２４.６mg、２.０mmol)を０℃で一度に加え、０℃で３０分間撹拌した。この溶液に、無水ＣＨ２Ｃｌ２(１.５mL)中の化合物５ｂを０℃で滴下し(１０分間)、２時間、０℃で撹拌した。溶液を次いでＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液および塩水で洗浄した。有機溶液をＭｇＳＯ４で乾燥後、濾過し、蒸発させ、得られた粗製物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン／酢酸エチル、９：１～４：６)で精製して、化合物６ｂ(２１０.９mg、５６％)を得た；1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.88 (d, 2H, JHH = 7.3 Hz), 7.70-7.62 (5H, m), 7.51-7.38 (m, 9H), 7.08 (d, 1H, JHH = 8.2 Hz), 6.26 (d, 1H, JHH = 8.6 Hz), 5.75 (d, 1H, JHH = 8.2 Hz), 5.68 (d, 1H, JHH = 0.8 Hz), 4.84 (dd, 1H, JHH = 8.6 Hz, 8.6 Hz), 3.86 (dd, 1H, JHH = 7.5 Hz, 5.0 Hz), 3.30 (s, 3H), 3.18 (br, 1H), 1.11 (s, 9H);13C NMR (126 Hz, CDCl3) 168.3, 161.7, 148.6, 138.9, 135.9, 135.8, 134.3, 132.6, 132.4, 131.2, 130.5, 130.4, 130.3, 129.2, 128.0, 127.9, 102.4, 97.5, 90.0, 82.44, 82.39, 74.4, 58.2, 26.7, 19.1;HRMS (ESI) C34H33Br2N2O6Si-のm/z計算値 [M - H]- m/z 751.0480 [M-H]-, 実測値m/z 753.6495
７ｂ－Ｅおよび７ｂ－Ｚの合成
化合物６ｂ(６.１１ｇ、８.１mmol)のＤＭＦ(３５mL)中の無水溶液に、ジメチルホスファイト(２.９７mL、３４.０mmol)およびトリエチルアミン(２.２６mL、１７.０mmol)を０℃で加え、次いで、一夜、室温で撹拌した。溶液を酢酸エチルで希釈後、有機溶液を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液および塩水で洗浄した。次いで、有機溶液をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、得られた粗製物質を、全純粋異性体化合物がそれぞれ集まるまで繰り返しシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン／酢酸エチル、９：１～１：１)で精製し、化合物７ｂ－Ｅ(３.０ｇ、５５％)(1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.89-7.87 (m, 2H), 7.70-7.62 (m, 5H), 7.51-7.39 (m, 8H), 7.10 (d, 1H, JHH = 8.3 Hz), 6.47 (dd, 1H, JHH = 13.6, 0.8 Hz), 6.01 (dd, 1H, JHH = 13.6, 7.9 Hz), 5.76-5.74 (m, 2H), 4.51 (dd, 1H, JHH = 7.8, 7.8 Hz), 7.36 (dd, 1H, JHH = 7.8 Hz, 4.9 Hz), 3.34 (s, 3H), 3.17 (dd, 1H, JHH = 4.7, 1.2 Hz), 1.09 (s, 9H);13C NMR (126 Hz, CDCl3) δ 168.3, 161.7, 148.7, 138.4, 135.9, 135.8, 135.3, 133.8, 132.6, 132.4, 131.2, 130.5, 130.4, 130.3, 129.2, 128.0, 127.9, 112.1, 102.3, 88.9, 82.8, 82.6, 77.2, 74.2, 58.1, 26.8, 19.1)および７ｂ－Ｚ(１.２３ｇ、２２％)(1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.89-7.87 (m, 2H), 7.72-7.70 (m, 2H), 7.68-7.63 (m, 3H), 7.51-7.44 (m, 4H), 7.41-7.37 (m, 4H), 7.16 (d, 1H, J-8.2 Hz), 6.53 (dd, 1H, JHH = 7.4, 0.6 Hz), 6.03 (dd, 1H, JHH = 8.5, 7.4 Hz), 5.75-5.73 (m, 2H), 5.12 (t, 1H, JHH = 8.1 Hz), 3.93 (dd, 1H, JHH = 6.9, 5.0 Hz), 3.32 (br, 1H), 3.26 (s, 3H), 1.10 (s, 9H);13C NMR (126 Hz, CDCl3) δ 168.3, 161.8, 148.7, 139.3, 135.91, 135.85, 135.22, 132.74, 132.71, 131.2, 130.8, 130.5, 130.23, 130.16, 129.2, 127.78, 127.75, 114.6, 102.2, 90.1, 82.4, 80.6, 77.2, 74.8, 58.1, 26.8, 19.2)を得た。
化合物８ｂの合成
無水５’－Ｏ－ＤＭＴｒ－２’－デオキシ－２’－フルオロ－３’－[メチル－Ｎ,Ｎ－(ジイソプロピル)アミノ]ホスホロ－アミダイト(４.２６ｇ、６.０mmol)を０.４５Ｍ １Ｈ－テトラゾール／ＣＨ３ＣＮ溶液(２７mL、１２mmol)に溶解し、３０分間、室温で撹拌した。この溶液に、Ｈ２Ｏ(３.６mL)を加え、３０分間、室温で撹拌した。酢酸エチルで希釈後、有機溶液を６回塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、次いで蒸発させた。わずかな量の不純物を伴う得られた化合物８ｂをさらに精製することなく次反応で使用した；31P NMR (CDCl3, 202 MHz) δ 8.92, 8.28
化合物９ｂの合成
無水化合物７ｂ－Ｅ(２.８４ｇ、４.２０mmol)およびＰｄ(ＯＡｃ)２(１８８.６mg、０.８４mmol)および[１,１’－ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(II)(９３１.４mg、１.６８mmol)をアルゴンでパージし、次いで、無水ＴＨＦ(５０mL)に溶解した。酸化プロピレン(２.９４mL、４２.０mmol)添加後、化合物９ｂ(３.１６ｇ、５.０４mmol)を一度に加え、４時間、７０℃で撹拌した。減圧下に溶媒除去後、粗製混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン－酢酸エチル、５０：５０～０：１００)で精製し、得られた化合物９ｂを含むフラクションをシリカゲルカラムクロマトグラフィー(１％ＴＥＡ－ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、０％～５％)でさらに精製して、化合物９ｂをジアステレオ異性体混合物(３.３ｇ、６４％)として得た；31P NMR (202 MHz, CDCl3) δ 19.31, 18.72
化合物１０ｂの合成
化合物９ｂ(３.３ｇ、２.７０mmol)の無水ＴＨＦ(３６.５mL)溶液に、１.０Ｍ ＴＢＡＦ－ＴＨＦ(４.０５mL、４.０５mmol)を加え、環境温度で３０分間撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２で希釈後(１５０mL)、有機層を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、次いで蒸発させた。得られた粗製物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(１％ＴＥＡ－ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、０％～８％)で精製して、化合物１０ｂ(１.２５ｇ、４７％)を得た；31P NMR (202 MHz, CDCl3) δ 19.8, 19.1
化合物１１ｂの合成
化合物１０ｂ(３９３.２mg、０.４mmol)を、無水ＣＨ３ＣＮと繰り返し共蒸発することにより無水とし、次いで、無水ＣＨ２Ｃｌ２(４.０mL)に溶解した。この溶液にＮ,Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン(０.２１mL、１.２mmol)および２－シアノエチルＮ,Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト(０.１１mL、０.４８mmol)を０℃で加えた。３０分間、０℃で撹拌後、反応混合物を過剰のＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で繰り返し洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた粗製物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(１％ＴＥＡ－ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、１００％～４％)で精製して、化合物１１ｂを白色泡状物(３１９.６mg、６８％)として得た；31P NMR (202 MHz, CDCl3) δ150.7, 150.4, 150.3, 19.9, 19.5, 19.4, 18.8
実施例８：ビニルホスホネート修飾オリゴヌクレオチドの固体支持体介在合成
ビニルホスフィナート修飾サブユニット間結合を有するオリゴヌクレオチドの代表的合成を図２２に示す。合成したＶＰ修飾配列の例は、図２８Ａおよび２８Ｂに見ることができる。
ヌクレオチド間(Ｅ)－ビニルホスホネート修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成
１個のビニルホスホネート結合を有するＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成を、MerMade 12自動化ＲＮＡシンセサイザー(BioAutomation)で、２’修飾(２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル)ホスホノアミダイトおよびビニルホスホネート結合二量体ホスホロアミダイトの０.１Ｍ無水ＣＨ３ＣＮ溶液を使用して、合成した。固体支持体について、UnyLinker支持体(ChemGenes)を使用した。(ｉ)脱トリチル化、(ii)カップリング、(iii)キャッピングおよび(iv)ヨウ素酸化からなる標準的１.０μmol規模ＲＮＡホスホロアミダイト合成サイクルにより合成を実施した。５－(ベンジルチオ)－１Ｈ－テトラゾールの無水ＣＨ３ＣＮ溶液を、ホスホロアミダイト活性化試薬として使用し、３％ジクロロ酢酸のＣＨ２Ｃｌ２溶液を脱トリチル化に使用した。１６％Ｎ－メチルイミダゾールのテトラヒドロフラン(Ｃａｐ Ａ)溶液および８０：１０：１０(ｖ／ｖ／ｖ)テトラヒドロフラン－Ａｃ２Ｏ－２,６－ルチジン(Ｃａｐ Ｂ)を、キャッピング反応に使用した。０.０２Ｍ Ｉ２のＴＨＦ－ピリジン－Ｈ２Ｏ(７：２：１、ｖ／ｖ／ｖ)溶液を酸化に使用し、０.１Ｍ ３－[(ジメチルアミノ－メチリデン)アミノ]－３Ｈ－１,２,４－ジチアゾール３－チオンのピリジン：ＣＨ３ＣＮ(９：１、ｖ／ｖ)溶液を硫化に使用した。５’末端リン酸化のために、ビス(２－シアノエチル)－Ｎ,Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイトを使用した。３’－コレステロール修飾ＲＮＡオリゴヌクレオチド合成のために、コレステロール３’－ｌｃａａ ＣＰＧ ５００Å(ChemGenes)を使用し、ＲＮＡ合成をＶＰ修飾ＲＮＡに使用した条件と同じ条件で実施した。化学鎖伸長後、脱保護および固体支持体からの開裂を、ＮＨ４ＯＨ－ＥｔＯＨ(３：１、ｖ／ｖ)で４８時間、２６℃で実施した。ビニルホスホネート修飾ＲＮＡの場合、固体支持体上のＲＮＡをまずＴＭＳＢｒ－ピリジン－ＣＨ２Ｃｌ２(３：１：１８、ｖ／ｖ／ｖ)で１時間、環境温度でＲＮＡ合成カラム中で処理した。次いで、固体支持体を、合成カラムに溶液を流すことにより水(１mL×３)、ＣＨ３ＣＮ(１mL×３)およびＣＨ２Ｃｌ２(１mL×３)で洗浄し、次いで、減圧下乾燥させた。固体支持体をスクリューキャップ付サンプルチューブに移した後、ＮＨ４ＯＨ－ＥｔＯＨ(３：１、ｖ／ｖ)で４８時間、２６℃での塩基処理を実施した。コレステロールコンジュゲートがない粗製ＲＮＡオリゴヌクレオチドを標準的アニオン交換ＨＰＬＣで精製し、一方コレステロール－コンジュゲートがあるＲＮＡを逆相ＨＰＬＣで精製した。得られた精製ＲＮＡ全てを、Sephadex G-25(GE Healthcare)で脱塩し、エレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリー(ＥＳＩ－ＭＳ)分析により特徴づけした。
実施例９：サイレンシング有効性
図２３および２４は、ここで試験したＶＰ修飾ｉＲＮＡの視覚表示を提供する。図２５は、ガイド鎖の種々の位置でのサブユニット間結合における１以上のビニルホスホネート修飾の、サイレンシングに対する影響を例示する。図２５のデータに見られるとおり、ＲＩＳＣはＶＰ修飾に極めて感受性であり、種々の位置のミスマッチ塩基対は、ｓｉＲＮＡ効力を妨害し得る。
図２６、２７Ａおよび２７Ｂも、ＶＰ修飾ｉＲＮＡが変異体アレルをサイレンシングする能力を示す。図２７Ａおよび２７Ｂに見られるとおり、ｓｉＲＮＡ配列へのミスマッチ付加は、変異体アレルサイレンシングに影響することなく、アレル識別を改善する。図３０は、ＳＮＰ部位の隣へのＶＰ修飾結合の導入が、ＳＮＰ選択的ｓｉＲＮＡの標的／非標的識別を有意に増強したことを示す。一次(６位)および二次(１１位)ＳＮＰを含む化合物を、５位と６位の間にＶＰ修飾を伴いまたは伴わずに合成した。図３０に見られるとおり、ＶＰ修飾の存在は、「オンターゲット」活性に影響しないが、非標的ｍＲＮＡについてのあらゆる検出可能なサイレンシングを完全に排除した。図２５、２６、２７Ａおよび２７Ｂにおけるデータ作成法を下に記載する。
ｈｓｉＲＮＡ受動送達。
細胞を、６％ＦＢＳ含有ダルベッコ改変イーグル培地に、９６ウェル細胞培養プレートのウェルあたり８,０００細胞で播種した。ｈｓｉＲＮＡを、OptiMEM(Carlsbad, CA;31985-088)で最終濃度の２倍に希釈し、５０μL希釈ｈｓｉＲＮＡを５０μLの細胞に加え、最終３％ＦＢＳとした。細胞を７２時間、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。インビトロ用量応答アッセイの最大用量は１.５μM化合物であった。
標的ｍＲＮＡの定量的析法。
ｍＲＮＡを、Quantigene 2.0アッセイキット(Affymetrix, QS0011)を使用して細胞から定量した。細胞を１部溶解混合物(Affymetrix, 13228)、２部Ｈ２Ｏおよび０.１６７μg／μL プロテイナーゼＫ(Affymetrix, QS0103)からなる２５０μL希釈溶解混合物で、３０分間、５５℃で溶解した。細胞ライセートを徹底的に混合し、４０μLの各ライセートを、プロテイナーゼＫ不含２０μL希釈溶解混合物の捕捉プレートのウェルあたりに加えた。ヒトＨＴＴおよびＨＰＲＴのプローブセット(Affymetrix;#SA-50339, SA-10030)を、製造者の推奨プロトコールに従い、希釈し、使用した。データセットをＨＰＲＴに対して正規化した。
棒グラフ作成法。
データを、GraphPad Prism 7ソフトウェア(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA))を使用して分析した。濃度依存的ＩＣ５０曲線を、ｌｏｇ(阻害剤)対応答－可変傾斜を使用してフィットさせた(４パラメータ)。各細胞処置プレートについて、各用量のノックダウンレベルを、対照群(未処理群)の平均に対して正規化した。曲線の下限を５未満に設定し、曲線の上限を９５超に設定した。棒グラフを作成するために、パーセント差異を、各対応する対照化合物のＩＣ５０値から各化合物のＩＣ５０値を減じ、対照化合物のＩＣ５０値で除し、１００倍することにより計算した。パーセント差異が－５００％未満であるならば、パーセント差異を、人為的に－５００％に設定した。グラフの下限を－３００％で切った。
本明細書をとおして引用が含意される全引用文献(論文、特許、特許出願およびウェブサイトを含む)の内容を、引用によりその全体として本明細書に明示的に包含させる。本発明は、特に断らない限り、当分野で周知の免疫学、分子生物学および細胞生物学の慣用の技術を使用する。
本発明は、その精神または必須の特徴から逸脱することなく、他の特定の形態に具現化できる。前記実施態様は、それ故に、全て、本発明の限定ではなく、説明と解釈される。本発明の範囲は、故に、前記ではなく、添付する特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の均等の意味および範囲に入る全ての変化は、それ故に、ここに包含されると意図される。
実施例１０：一次スクリーニングは、ＳＮＰ ｒｓ３６２３０７ヘテロ接合性の複数の効果的なｓｉＲＮＡ配列を産生する
代替変異体ＳＮＰ(ｒｓ３６２３０７)(図３９)を含むＨＴＴ ｍＲＮＡに相補的であるよう設計したｓｉＲＮＡを、目的のＳＮＰの標的領域を含むレポータープラスミドで全てスクリーニングした(図４０)。２個のレポータープラスミドの一方でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、動的取込により１.５μM ｈｓｉＲＮＡで逆トランスフェクトし、７２時間処理した。ＳＮＰ後の数値は、ｓｉＲＮＡにおけるＳＮＰの位置を示す。このＳＮＰは、その周囲の領域のＧ／Ｃ含量が高いことから、標的になるのは困難と予測された。３位へのＳＮＰの配置は、変異体アレルに対する有効性を損なうことなく最大ＳＮＰ識別を提供すると考えられ、最良ＳＮＰ位置が配列特異的であることを示した(図４１)。この一次スクリーニング過程は、こうして、あらゆるＳＮＰについて最良ＳＮＰ位置の選択のために実施した。
実施例１１：ＳＮＰ ｒｓ３６２３０７に適用したとき、二次ミスマッチは、アレル識別を改善し続ける
図４２に記載するとおり、可能な全位置にミスマッチを有する新規配列の一次スクリーニングは、同様に位置ｒｓ３６２３０７でのＳＮＰ識別が増加した複数の効果的なｈｓｉＲＮＡをもたらした。７位および８位へのミスマッチ導入は、標的サイレンシング有効性を保持しながら、選択性を改善するように見えた。他の二次ミスマッチは優れた識別をもたらしたが、全体的に活性は低かった。
実施例１２：ＳＮＰを含む配列におけるＳＮＰ識別の測定
表５～７に開示する配列(すなわち、特定のＳＮＰ位置ヌクレオチドおよびミスマッチ(ＭＭ)位置ヌクレオチド組み合わせを有する各ｈｓｉＲＮＡ)の各々のＳＮＰ識別を測定するため、ｈｔｔの野生型領域またはＳＮＰを伴うｈｔｔの配列の同じ領域の何れかを含むｐｓｉＣＨＥＣＫレポータープラスミドを調製し、デュアル－ルシフェラーゼで試験した。２個のレポータープラスミドの一方でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、動的取込によりｈｓｉＲＮＡで逆トランスフェクトし、７２時間処理した。ルシフェラーゼ活性を、付加的ミスマッチを伴いまたは伴わずにアッセイで測定し、用量応答曲線にプロットし、識別およびサイレンシング有効性の点で、最も良い結果をもたらす配列を明らかにするため比較した。
実施例１３：ホスフィナート修飾サブユニット間結合の合成
ホスフィナート修飾サブユニット間結合を調製する方法を、図４４Ａ～４４Ｃに要約する。この方法は、遊離アルコールから対応するケトンへのジョーンズ酸化、続くウィッティヒオレフィン化により、中間体化合物３に示すエキソメチレン部分を得ることを含む。アミドのＢＯＭでの保護、続くヒドロホウ素化－酸化により、遊離アルコール中間体５を得る。メシル化、続く修飾フィンケルシュタイン反応によりヨウ素化中間体７を得て、次いで、さらに官能化して、メチルホスフィナートモノマー９を得る。
モノマー１８を得るために、種々の保護および脱保護工程を用いて、中間体１３を得る。ＩＢＸ酸化は、対応するケトンを生じ、続くウィッティヒオレフィン化してメチレンにアクセスする。再度、ヒドロホウ素化－酸化、続くメシル化およびフィンケルシュタイン反応により、モノマー１８を得る。
モノマー９と１８の塩基性条件での結合により、ホスフィナート結合二量体１９を得る。酸介在およびパールマン触媒脱保護、続くさらなるホスファミン官能化により、二量体２２を得る。
実施例１４：有効性および識別を修飾するための２’－ＯＭｅ／２’－Ｆ含量改変
ＳＮＰおよびミスマッチ部位周囲の２’－Ｏ－メチル／フルオロ主鎖修飾パターンを変えることにより、ｓｉＲＮＡの有効性および識別を修飾した(図４８Ａ～４８Ｄ)。ＳＮＰ位置隣の重度の２’－フッ素化は標的結合を改善させたが、標的識別を減少させた。続いてミスマッチ周辺への重度の２’－Ｏ－メチル化付加は、フッ素化による識別喪失を回復させた。上記の元の化学修飾パターンはインビボ試験で有益であったが、この実施例に記載する技術を使用して、ここに記載するＳＮＰ－ターゲティング化合物を微調整し、さらなる新規ＳＮＰ－ターゲティング化合物を同定できる。

Claims (63)

  1. (ａ)５’末端および３’末端；
    (ｂ)アレル多型を含む遺伝子の領域に相補性であるシード領域；
    (ｃ)シード領域内の位置での一塩基多型(ＳＮＰ)位置ヌクレオチドであって、アレル多型に相補性であるＳＮＰ位置ヌクレオチド；
    (ｄ)遺伝子におけるヌクレオチドとミスマッチであるミスマッチ(ＭＭ)位置ヌクレオチド；および
    (ｅ)ＳＮＰ位置ヌクレオチドの何れかの側に少なくとも１個の修飾ヌクレオチド(Ｘ)(ここで、各ＸはＳＮＰ位置ヌクレオチドから４、３または２ヌクレオチド以内に位置する)
    を含む、核酸。
  2. (ａ)５’末端および３’末端；
    (ｂ)アレル多型を含む遺伝子の領域に相補性であるシード領域；
    (ｃ)シード領域内の位置での一塩基多型(ＳＮＰ)位置ヌクレオチドであって、アレル多型に相補性であるＳＮＰ位置ヌクレオチド；
    (ｄ)遺伝子におけるヌクレオチドとミスマッチであるミスマッチ(ＭＭ)位置ヌクレオチド；および
    (ｅ)ＭＭ位置ヌクレオチドの何れかの側に少なくとも１個の修飾ヌクレオチド(Ｙ)(ここで、各ＹはＭＭ位置ヌクレオチドから４、３または２ヌクレオチド以内に位置する)
    を含む、核酸。
  3. Ｘが２’－Ｏ－メチル(２’－ＯＭｅ)、２’－フルオロ(２’－Ｆ)、２’－リボ、２’－デオキシリボ、２’－Ｆ－４’－チオアラビノ(２’－Ｆ－ＡＮＡ)、２’－Ｏ－(２－メトキシエチル)(２’－ＭＯＥ)、４’－Ｓ－ＲＮＡ、ロックド核酸(ＬＮＡ)、４’－Ｓ－Ｆ－ＡＮＡ、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｏ－エチルアミン、２’－Ｏ－シアノエチル－ＲＮＡ(ＣＮｅｔ－ＲＮＡ)、トリシクロ－ＤＮＡ、シクロヘキセニル核酸(ＣｅＮＡ)、アラビノ核酸(ＡＮＡ)およびヘキシトール核酸(ＨＮＡ)からなる群から選択される糖修飾を含む、請求項１の核酸。
  4. Ｙが２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、２’－リボ、２’－デオキシリボ、２’－Ｆ－ＡＮＡ、２’－ＭＯＥ、４’－Ｓ－ＲＮＡ、ＬＮＡ、４’－Ｓ－Ｆ－ＡＮＡ、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｏ－エチルアミン、ＣＮｅｔ－ＲＮＡ、トリシクロ－ＤＮＡ、ＣｅＮＡ、ＡＮＡおよびＨＮＡからなる群から選択される糖修飾を含む、請求項２の核酸。
  5. ＸがＳＮＰ位置ヌクレオチドの５’側に隣接またはＳＮＰ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する、請求項１の核酸。
  6. ＸがＳＮＰ位置ヌクレオチドの５’側に隣接およびＳＮＰ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する、請求項１の核酸。
  7. ＹがＭＭ位置ヌクレオチドの５’側に隣接またはＭＭ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する、請求項２の核酸。
  8. ＹがＭＭ位置ヌクレオチドの５’側に隣接およびＭＭ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する、請求項２の核酸。
  9. ＳＮＰ位置ヌクレオチドが５’末端から２位～６位に位置する、請求項１または２の核酸。
  10. ＭＭ位置ヌクレオチドがＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～１１ヌクレオチドに位置する、請求項１または２の核酸。
  11. ＭＭ位置ヌクレオチドがＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～６ヌクレオチドに位置する、請求項１または２の核酸。
  12. (ａ)５’末端および３’末端；
    (ｂ)アレル多型を含む遺伝子の領域に相補性であるシード領域；
    (ｃ)シード領域内の位置での一塩基多型(ＳＮＰ)位置ヌクレオチドであって、アレル多型に相補性であるＳＮＰ位置ヌクレオチド；
    (ｄ)遺伝子におけるヌクレオチドとミスマッチであるミスマッチ(ＭＭ)位置ヌクレオチド；
    (ｅ)ＳＮＰ位置ヌクレオチドの何れかの側に少なくとも１個の修飾ヌクレオチド(Ｘ)(ここで、各ＸがＳＮＰ位置ヌクレオチドから４、３または２ヌクレオチド以内に位置する)；および
    (ｆ)ＭＭ位置ヌクレオチドの何れかの側に少なくとも１個の修飾ヌクレオチド(Ｙ)(ここで、各ＹがＭＭ位置ヌクレオチドから４、３または２ヌクレオチド以内に位置する)
    を含む、核酸。
  13. Ｘが２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、２’－リボ、２’－デオキシリボ、２’－Ｆ－ＡＮＡ、２’－ＭＯＥ、４’－Ｓ－ＲＮＡ、ＬＮＡ、４’－Ｓ－Ｆ－ＡＮＡ、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｏ－エチルアミン、ＣＮｅｔ－ＲＮＡ、トリシクロ－ＤＮＡ、ＣｅＮＡ、ＡＮＡおよびＨＮＡからなる群から選択される糖修飾を含む、請求項１２の核酸。
  14. Ｙが２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、２’－リボ、２’－デオキシリボ、２’－Ｆ－ＡＮＡ、２’－ＭＯＥ、４’－Ｓ－ＲＮＡ、ＬＮＡ、４’－Ｓ－Ｆ－ＡＮＡ、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｏ－エチルアミン、ＣＮｅｔ－ＲＮＡ、トリシクロ－ＤＮＡ、ＣｅＮＡ、ＡＮＡおよびＨＮＡからなる群から選択される糖修飾を含む、請求項１２の核酸。
  15. ＸがＳＮＰ位置ヌクレオチドの５’側に隣接またはＳＮＰ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する、請求項１２の核酸。
  16. ＸがＳＮＰ位置ヌクレオチドの５’側に隣接およびＳＮＰ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する、請求項１２の核酸。
  17. ＹがＭＭ位置ヌクレオチドの５’側に隣接またはＭＭ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する、請求項１２の核酸。
  18. ＹがＭＭ位置ヌクレオチドの５’側に隣接またはＭＭ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する、請求項１２の核酸。
  19. ＳＮＰ位置ヌクレオチドが５’末端から２位～６位に位置する、請求項１２の核酸。
  20. ＭＭ位置ヌクレオチドがＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～１１ヌクレオチドに位置する、請求項１２の核酸。
  21. ＭＭ位置ヌクレオチドがＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～６ヌクレオチドに位置する、請求項１２の核酸。
  22. ＸおよびＹが同一のヌクレオチド修飾を含む、請求項１２の核酸。
  23. ＸおよびＹが異なるヌクレオチド修飾を含む、請求項１２の核酸。
  24. (ａ)５’末端および３’末端；
    (ｂ)アレル多型を含む遺伝子の領域に相補性であるシード領域；
    (ｃ)アレル多型に相補性である一塩基多型(ＳＮＰ)位置ヌクレオチド；
    (ｄ)遺伝子におけるヌクレオチドとミスマッチであるミスマッチ(ＭＭ)位置ヌクレオチド；
    (ｅ)ＳＮＰ位置ヌクレオチドの何れかの側に少なくとも１個の２’－フルオロ－リボヌクレオチド(ここで、各２’－フルオロ－リボヌクレオチドがＳＮＰ位置ヌクレオチドから４、３または２ヌクレオチド以内に位置する)；および
    (ｆ)ＭＭ位置ヌクレオチドの何れかの側に少なくとも１個の２’－メトキシ－リボヌクレオチド(ここで、各２’－メトキシ－リボヌクレオチドがＭＭ位置ヌクレオチドから４、３または２ヌクレオチド以内に位置する)
    を含む、核酸。
  25. ２’－フルオロ－リボヌクレオチドがＳＮＰ位置ヌクレオチドの５’側に隣接して位置するまたは２’－フルオロ－リボヌクレオチドがＳＮＰ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する、請求項２４の核酸。
  26. ２’－フルオロ－リボヌクレオチドがＳＮＰ位置ヌクレオチドの５’側に隣接して位置するおよび２’－フルオロ－リボヌクレオチドがＳＮＰ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する、請求項２４の核酸。
  27. ２’－メトキシ－リボヌクレオチドがＭＭ位置ヌクレオチドの５’側に隣接して位置するまたは２’－メトキシ－リボヌクレオチドがＭＭ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する、請求項２４の核酸。
  28. ２’－メトキシ－リボヌクレオチドがＭＭ位置ヌクレオチドの５’側に隣接して位置するおよび２’－メトキシ－リボヌクレオチドがＭＭ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する、請求項２４の核酸。
  29. ＳＮＰ位置ヌクレオチドがシード領域に存在し、ここで、ＭＭ位置ヌクレオチドがＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～１１ヌクレオチドに位置する、請求項２４の核酸。
  30. ＳＮＰ位置ヌクレオチドが５’末端から２位～６位に存在し、ここで、ＭＭ位置ヌクレオチドがＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～６ヌクレオチドに位置する、請求項２９の核酸。
  31. ３個、４個、５個または６個の２’－フルオロ－リボヌクレオチドを含む、請求項２４の核酸。
  32. ３個、４個、５個または６個の２’－メトキシ－リボヌクレオチドを含む、請求項２４の核酸。
  33. (ａ)５’末端および３’末端；
    (ｂ)アレル多型を含む遺伝子の領域に相補性であるシード領域；
    (ｃ)アレル多型に相補性である一塩基多型(ＳＮＰ)位置ヌクレオチド；
    (ｄ)遺伝子におけるヌクレオチドとミスマッチであるミスマッチ(ＭＭ)位置ヌクレオチド；
    (ｅ)ＳＮＰ位置ヌクレオチドから４、３または２ヌクレオチド以内に位置する少なくとも３個の２’－フルオロ－リボヌクレオチド；および
    (ｆ)ＭＭ位置ヌクレオチドから４、３または２ヌクレオチド以内に位置する少なくとも３個の２’－メトキシ－リボヌクレオチド
    を含む、核酸。
  34. ２’－フルオロ－リボヌクレオチドがＳＮＰ位置ヌクレオチドの５’側に隣接して位置するまたは２’－フルオロ－リボヌクレオチドがＳＮＰ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する、請求項３３の核酸。
  35. ２’－フルオロ－リボヌクレオチドがＳＮＰ位置ヌクレオチドの５’側に隣接して位置するおよび２’－フルオロ－リボヌクレオチドがＳＮＰ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する、請求項３３の核酸。
  36. ２’－メトキシ－リボヌクレオチドがＭＭ位置ヌクレオチドの５’側に隣接して位置するまたは２’－メトキシ－リボヌクレオチドがＭＭ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する、請求項３３の核酸。
  37. ２’－メトキシ－リボヌクレオチドがＭＭ位置ヌクレオチドの５’側に隣接して位置するおよび２’－メトキシ－リボヌクレオチドがＭＭ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置する、請求項３３の核酸。
  38. ＳＮＰ位置ヌクレオチドがシード領域に存在し、ここで、ＭＭ位置ヌクレオチドがＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～１１ヌクレオチドに位置する、請求項３３の核酸。
  39. ＳＮＰ位置ヌクレオチドが５’末端から２位～６位に存在し、ここで、ＭＭ位置ヌクレオチドがＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～６ヌクレオチドに位置する、請求項３８の核酸。
  40. 標的遺伝子に相補性を有するセンス鎖およびセンス鎖に相補性を有するアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ分子であって、アンチセンス鎖が請求項１～３９の何れかの核酸を含む、ｓｉＲＮＡ分子。
  41. センス鎖が１３ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ～１７ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する、請求項４０のｓｉＲＮＡ分子。
  42. アンチセンス鎖が１８ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ～２２ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する、請求項４０または４１のｓｉＲＮＡ分子。
  43. センス鎖が１５ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有し、アンチセンス鎖が２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する、請求項４０～４２の何れかのｓｉＲＮＡ分子。
  44. センス鎖が１６ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有し、アンチセンス鎖が２０ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ長を有する、請求項４０～４２の何れかのｓｉＲＮＡ分子。
  45. 互いに共有結合した２以上のｓｉＲＮＡ分子を含む分岐オリゴヌクレオチドであって、ここで、各ｓｉＲＮＡ分子が、独立して、請求項４０～４４の何れかのｓｉＲＮＡ分子である、分岐オリゴヌクレオチド。
  46. 分岐オリゴヌクレオチドが互いに共有結合した２個のｓｉＲＮＡ分子を含む、請求項４５の分岐オリゴヌクレオチド。
  47. ｓｉＲＮＡ分子が互いにリンカーを介して共有結合される、請求項４５または４６の分岐オリゴヌクレオチド。
  48. (ａ)ヌクレオチドの第一鎖であって、
    (ｉ)５’末端および３’末端；
    (ii)アレル多型を含む遺伝子の領域に相補性であるシード領域；
    (iii)シード領域内の位置での一塩基多型(ＳＮＰ)位置ヌクレオチドであって、アレル多型に相補性であるＳＮＰ位置ヌクレオチド；
    (iv)遺伝子におけるヌクレオチドと相補性ではないミスマッチ(ＭＭ)位置ヌクレオチド；および
    (ｖ)ＳＮＰ位置ヌクレオチドの何れかの側、ＭＭ位置ヌクレオチドの何れかの側またはこれらの組み合わせに位置する少なくとも１個の修飾ヌクレオチドであって；各修飾ヌクレオチドがＳＮＰ位置ヌクレオチドまたはＭＭ位置ヌクレオチドからそれぞれ４、３または２ヌクレオチド以内に位置するもの
    を含む、第一鎖；
    (ｂ)ヌクレオチドの第一鎖と相補性であるヌクレオチドの第二鎖
    を含む、二本鎖核酸。
  49. 修飾ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル(２’－ＯＭｅ)、２’－フルオロ(２’－Ｆ)、２’－リボ、２’－デオキシリボ、２’－Ｆ－４’－チオアラビノ(２’－Ｆ－ＡＮＡ)、２’－Ｏ－(２－メトキシエチル)(２’－ＭＯＥ)、４’－Ｓ－ＲＮＡ、ロックド核酸(ＬＮＡ)、４’－Ｓ－Ｆ－ＡＮＡ、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｏ－エチルアミン、２’－Ｏ－シアノエチル－ＲＮＡ(ＣＮｅｔ－ＲＮＡ)、トリシクロ－ＤＮＡ、シクロヘキセニル核酸(ＣｅＮＡ)、アラビノ核酸(ＡＮＡ)、ヘキシトール核酸(ＨＮＡ)およびそれらの組み合わせからなる群から選択される修飾を含む、請求項４８の二本鎖核酸。
  50. 修飾ヌクレオチドがＳＮＰ位置ヌクレオチドの５’側に隣接して位置する、ＳＮＰ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置するまたはこれらの混合である、請求項４８の核酸。
  51. 修飾ヌクレオチドがＭＭ位置ヌクレオチドの５’側に隣接して位置する、ＭＭ位置ヌクレオチドの３’側に隣接して位置するまたはこれらの混合である、請求項４８の核酸。
  52. ＳＮＰ位置ヌクレオチドがヌクレオチドの第一鎖の５’末端から２位～６位に位置する、請求項４８の核酸。
  53. ＭＭ位置ヌクレオチドがヌクレオチドの第一鎖のＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～１１ヌクレオチドに位置する、請求項４８の核酸。
  54. ＭＭ位置ヌクレオチドがヌクレオチドの第一鎖のＳＮＰ位置ヌクレオチドから２～６ヌクレオチドに位置する、請求項４８の核酸。
  55. 修飾ヌクレオチドが同一のヌクレオチド修飾、異なるヌクレオチド修飾またはこれらの混合物を含む、請求項４８の拡散。
  56. 第一鎖が１３～１７ヌクレオチド長を有する、請求項４８の核酸。
  57. 第二鎖が１８～２２ヌクレオチド長を有する、請求項４８の核酸。
  58. 第一鎖が１５ヌクレオチド長を有し、第二鎖が２０ヌクレオチド長を有する、請求項４８の核酸。
  59. 第一鎖が１６ヌクレオチド長を有し、第二鎖が２０ヌクレオチド長を有する、請求項４８の核酸。
  60. 第一鎖が第二鎖より３～７個多いヌクレオチドを有する、請求項４８の核酸。
  61. 互いに共有結合した２以上のｓｉＲＮＡ分子を含む分岐オリゴヌクレオチドであって、各ｓｉＲＮＡ分子が
    (ａ)ヌクレオチドの第一鎖であって、
    (ｉ)５’末端、３’末端；
    (ii)アレル多型を含む遺伝子の領域に相補性であるシード領域；
    (iii)シード領域内の位置での一塩基多型(ＳＮＰ)位置ヌクレオチドであって、アレル多型に相補性であるＳＮＰ位置ヌクレオチド；
    (iv)遺伝子におけるヌクレオチドと相補性ではないミスマッチ(ＭＭ)位置ヌクレオチド；および
    (ｖ)ＳＮＰ位置ヌクレオチドの何れかの側、ＭＭ位置ヌクレオチドの何れかの側またはこれらの組み合わせに位置する少なくとも１個の修飾ヌクレオチドであって；ここで、各修飾ヌクレオチドがＳＮＰ位置ヌクレオチドまたはＭＭ位置ヌクレオチドからそれぞれ４、３または２ヌクレオチド以内に位置するもの
    を含む、第一鎖；
    (ｂ)ヌクレオチドの第一鎖と相補性であるヌクレオチドの第二鎖
    を含む二本鎖核酸を含む、分岐オリゴヌクレオチド。
  62. 分岐オリゴヌクレオチドが互いに共有結合した２個のｓｉＲＮＡ分子を含む、請求項６１の分岐オリゴヌクレオチド。
  63. ｓｉＲＮＡ分子が互いにリンカーを介して共有結合される、請求項６１の分岐オリゴヌクレオチド。
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