KR20220047989A - Snp를 표적화하는 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드 - Google Patents

Snp를 표적화하는 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드 Download PDF

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닐 아로닌
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Abstract

해당하는 야생형 유전자의 발현에 비해 단일 뉴클레오타이드 다형태 (SNP)를 포함하는 유전자의 발현의 침묵화를 향상시키는 신규한 올리고뉴클레오타이드가 제공된다. 해당하는 야생형 유전자의 발현에 비해 SNP를 포함하는 유전자의 발현의 침묵화를 향상시키는 신규한 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 방법이 제공된다.

Description

SNP를 표적화하는 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오타이드
관련 출원
본 출원은 2019년 8월 9일에 출원된 미국 가출원 제 62/885,066호 및 2020년 2월 13일에 출원된 미국 가출원 제 62/976,168호에 대한 우선권을 주장한다. 이들 출원의 전문은 본 명세서에 참조로 포함된다.
미국 연방 지원 연구 성명서
본 발명은 미국 국립 보건원에서 수여한 허가 번호 NS104022 및 GM108803에 따른 미국 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
RNA 간섭은 유전자 기능을 억제하기 위한 간단하고 효과적인 도구로 나타난다. RNA 침묵화 제제는 높은 수준의 서열 특이성을 갖는 특정 단백질의 발현을 녹다운시키는 능력으로 인해 연구 도구 및 치료제로서 특히 관심을 받아왔다. RNA 침묵화 제제의 서열 특이성은 특정 유전자의 돌연변이 하나와 야생형 카피 하나를 보유하는 이형 접합체의 우성 돌연변이에 의해 유발되는 질병의 치료에 특히 유용하다. 그러나, 야생형 대립유전자의 발현에 영향을 미치지 않으면서 (또는 최소한으로만 미치면서) 돌연변이, 질병 유발 대립유전자 발현을 우선적으로 침묵화시킬 수 있는 RNA 침묵화 제제에 대한 필요성이 남아 있다.
본 개시내용은 적어도 부분적으로, 예를 들어, 100배 초과까지 이형접합체에서 해당하는 야생형 유전자의 발현에 비해 단일 뉴클레오타이드 다형태 (SNP) (예를 들어, 이형접합 SNP)를 포함하는 유전자의 발현의 침묵화를 향상시키는 신규한 올리고뉴클레오타이드의 놀라운 발견에 적어도 부분적으로 기반한다. 특정 양상에서, 분해를 위해 SNP-포함 핵산을 우선적으로 표적화하는 올리고뉴클레오타이드 (예를 들어, dsRNA)가 제공되며, 올리고뉴클레오타이드 (예를 들어, 이중 가닥 RNA (dsRNA))는 분해에 대한 해당 야생형 (SNP 비포함) 핵산을 표적화하지 않거나 더 낮은 정도로 표적화한다. 특정 양상에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드 (예를 들어, dsRNA)는 1) 표적 핵산에서 SNP 위치에 상보적이고; 2) SNP에 대한 표적 핵산의 특정 위치에서 미스매치(mismatch)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드 (예를 들어, dsRNA)는 해당 야생형 표적 핵산 서열에 대해 2개의 미스매치를 포함한다: 1) 야생형 SNP 위치; 및 2) 야생형 SNP 위치에 대한 표적 핵산 서열의 특정 위치. 따라서, 예시적인 올리고뉴클레오타이드 (예를 들어, dsRNA)는 SNP-포함 표적에 대한 하나의 미스매치 및 해당 야생형 서열에 대한 2개의 미스매치를 포함하여, 해당 야생형 서열에 대한 SNP-포함 표적의 우선적 절단을 초래한다.
일 양상에서, 대립유전자 다형태(allelic polymorphism)를 포함하는 유전자의 영역에 대해 상보적인 5' 말단(5' end), 3' 말단 및 시드 영역(seed region)을 갖는 핵산이 제공되며, 본 핵산은 SNP 위치 뉴클레오타이드가 대립유전자 다형태에 상보적인 시드 영역 내의 위치의 단일 뉴클레오타이드 다형태 (SNP) 위치 뉴클레오타이드, 유전자 내의 뉴클레오타이드와의 미스매치가 있는 미스매치 (MM) 위치, 및 SNP 위치 뉴클레오타이드의 어느 한 쪽의 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드 (X) (각각의 X는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 4, 3 또는 2개의 뉴클레오타이드 내에 위치함)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 X는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 4개 뉴클레오타이드 내에 위치한다. 일부 실시양태에서, 각각의 X는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 3개 뉴클레오타이드 내에 위치한다. 일부 실시양태에서, 각각의 X는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2개 뉴클레오타이드 내에 위치한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, 각각의 X는 독립적으로 2'-O-메틸 (2'-OMe), 2'-플루오로 (2'-F), 2'-리보, 2'-데옥시리보, 2'-F-4'-티오아라비노 (2'-F-ANA), 2'-O-(2-메톡시에틸) (2'-MOE), 4'-S-RNA, 잠금(locked) 핵산 (LNA), 4'-S-F-ANA, 2'-O-알릴, 2'-O-에틸아민, 2'-O-시아노에틸-RNA (CNet-RNA), 트리사이클로-DNA, 사이클로헥세닐 핵산 (CeNA), 아라비노 핵산 (ANA), 및 헥시톨 핵산 (HNA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 당 변형(sugar modification)을 포함한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, X는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 또는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치한다. 특정의 예시적인 실시양태에서, X는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 및 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2 내지 위치 6 (예를 들어, 5' 말단으로부터 위치 2, 5' 말단으로부터 위치 3, 5' 말단으로부터 위치 4, 5' 말단으로부터 위치 5, 또는 5' 말단으로부터 위치 6)에 존재한다. 특정의 예시적인 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 3 내지 위치 6 (예를 들어, 5' 말단으로부터 위치 3, 5' 말단으로부터 위치 4, 5' 말단으로부터 위치 5, 또는 5' 말단으로부터 위치 6)에 존재한다. 일부 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 4 내지 위치 6 (예를 들어, 5' 말단으로부터 위치 4, 5' 말단으로부터 위치 5, 또는 5' 말단으로부터 위치 6)에 존재한다. 일부 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2 내지 위치 5 (예를 들어, 5' 말단으로부터 위치 2, 5' 말단으로부터 위치 3, 5' 말단으로부터 위치 4, 또는 5' 말단으로부터 위치 5)에 존재한다. 일부 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 3 내지 위치 5 (예를 들어, 5' 말단으로부터 위치 3, 5' 말단으로부터 위치 4, 또는 5' 말단으로부터 위치 5)에 존재한다. 일부 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2 내지 위치 4 (예를 들어, 5' 말단으로부터 위치 2, 5' 말단으로부터 위치 3, 또는 5' 말단으로부터 위치 4)에 존재한다.
일부 실시양태에서, MM 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 11개 뉴클레오타이드에 위치한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 3개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 4개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 5개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 6개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 7개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 8개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 9개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 10개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 11개 뉴클레오타이드에 위치한다.
일부 실시양태에서, MM 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 6개 뉴클레오타이드에 위치한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 3개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 4개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 5개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 6개 뉴클레오타이드에 위치한다.
또 다른 양상에서, 대립유전자 다형태를 포함하는 유전자의 영역에 대해 상보적인 5' 말단, 3' 말단 및 시드 영역을 갖는 핵산이 제공되며, 본 핵산은 SNP 위치 뉴클레오타이드가 대립유전자 다형태에 상보적인 시드 영역 내의 위치의 SNP 위치 뉴클레오타이드, 유전자 내의 뉴클레오타이드와의 미스매치가 있는 MM 위치, 및 MM 위치 뉴클레오타이드의 어느 한 쪽의 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드 (Y) (각각의 Y는 MM 위치 뉴클레오타이드로부터 4, 3 또는 2개의 뉴클레오타이드 내에 위치함)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 Y는 MM 위치 뉴클레오타이드로부터 4개 뉴클레오타이드 내에 위치한다. 일부 실시양태에서, 각각의 Y는 MM 위치 뉴클레오타이드로부터 3개 뉴클레오타이드 내에 위치한다. 일부 실시양태에서, 각각의 Y는 MM 위치 뉴클레오타이드로부터 2개 뉴클레오타이드 내에 위치한다.
일부 실시양태에서, 각각의 Y는 독립적으로 2'-OMe, 2'-F, 2'-리보, 2'-데옥시리보, 2'-F-ANA, 2'-MOE, 4'-S-RNA, LNA, 4'-S-F-ANA, 2'-O-알릴, 2'-O-에틸아민, CNet-RNA, 트리사이클로-DNA, CeNA, ANA, 및 HNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 당 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, Y는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 또는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치한다. 특정의 예시적인 실시양태에서, Y는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 및 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2 내지 위치 6 (예를 들어, 5' 말단으로부터 위치 2, 5' 말단으로부터 위치 3, 5' 말단으로부터 위치 4, 5' 말단으로부터 위치 5, 또는 5' 말단으로부터 위치 6)에 존재한다. 일부 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 3 내지 위치 6 (예를 들어, 5' 말단으로부터 위치 3, 5' 말단으로부터 위치 4, 5' 말단으로부터 위치 5, 또는 5' 말단으로부터 위치 6)에 존재한다. 일부 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 4 내지 위치 6 (예를 들어, 5' 말단으로부터 위치 4, 5' 말단으로부터 위치 5, 또는 5' 말단으로부터 위치 6)에 존재한다. 일부 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2 내지 위치 5 (예를 들어, 5' 말단으로부터 위치 2, 5' 말단으로부터 위치 3, 5' 말단으로부터 위치 4, 또는 5' 말단으로부터 위치 5)에 존재한다. 일부 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 3 내지 위치 5 (예를 들어, 5' 말단으로부터 위치 3, 5' 말단으로부터 위치 4, 또는 5' 말단으로부터 위치 5)에 존재한다. 일부 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2 내지 위치 4 (예를 들어, 5' 말단으로부터 위치 2, 5' 말단으로부터 위치 3, 또는 5' 말단으로부터 위치 4)에 존재한다.
일부 실시양태에서, MM 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 11개 뉴클레오타이드에 위치한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 3개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 4개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 5개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 6개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 7개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 8개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 9개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 10개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 11개 뉴클레오타이드에 위치한다.
일부 실시양태에서, MM 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 6개 뉴클레오타이드에 위치한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 3개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 4개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 5개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 6개 뉴클레오타이드에 위치한다.
또 다른 양상에서, 대립유전자 다형태를 포함하는 유전자의 영역에 대해 상보적인 5' 말단, 3' 말단 및 시드 영역을 갖는 핵산이 제공되며, 본 핵산은, SNP 위치 뉴클레오타이드가 대립유전자 다형태에 상보적인 시드 영역 내의 위치의 SNP 위치 뉴클레오타이드, 유전자 내의 뉴클레오타이드와의 미스매치가 있는 MM 위치, 및 SNP 위치 뉴클레오타이드의 어느 한 쪽의 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드 (X) (각각의 X는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 4, 3 또는 2개의 뉴클레오타이드 내에 위치함) 및 MM 위치 뉴클레오타이드의 어느 한 쪽의 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드 (Y) (각각의 Y는 MM 위치 뉴클레오타이드로부터 4, 3 또는 2개의 뉴클레오타이드 내에 위치함)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 X는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 4개 뉴클레오타이드 내에 위치한다. 일부 실시양태에서, 각각의 X는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 3개 뉴클레오타이드 내에 위치한다. 일부 실시양태에서, 각각의 X는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2개 뉴클레오타이드 내에 위치한다. 일부 실시양태에서, 각각의 Y는 MM 위치 뉴클레오타이드로부터 4개 뉴클레오타이드 내에 위치한다. 일부 실시양태에서, 각각의 Y는 MM 위치 뉴클레오타이드로부터 3개 뉴클레오타이드 내에 위치한다. 일부 실시양태에서, 각각의 Y는 MM 위치 뉴클레오타이드로부터 2개 뉴클레오타이드 내에 위치한다.
일부 실시양태에서, 각각의 X는 독립적으로 2'-OMe, 2'-F, 2'-리보, 2'-데옥시리보, 2'-F-ANA, 2'-MOE, 4'-S-RNA, LNA, 4'-S-F-ANA, 2'-O-알릴, 2'-O-에틸아민, CNet-RNA, 트리사이클로-DNA, CeNA, ANA, 및 HNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 당 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 Y는 독립적으로 2'-OMe, 2'-F, 2'-리보, 2'-데옥시리보, 2'-F-ANA, 2'-MOE, 4'-S-RNA, LNA, 4'-S-F-ANA, 2'-O-알릴, 2'-O-에틸아민, CNet-RNA, 트리사이클로-DNA, CeNA, ANA, 및 HNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 당 변형을 포함한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, X는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 또는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치한다. 특정의 예시적인 실시양태에서, X는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 및 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, Y는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 또는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치한다. 특정의 예시적인 실시양태에서, Y는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 및 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2 내지 위치 6 (예를 들어, 5' 말단으로부터 위치 2, 5' 말단으로부터 위치 3, 5' 말단으로부터 위치 4, 5' 말단으로부터 위치 5, 또는 5' 말단으로부터 위치 6)에 존재한다. 일부 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 3 내지 위치 6 (예를 들어, 5' 말단으로부터 위치 3, 5' 말단으로부터 위치 4, 5' 말단으로부터 위치 5, 또는 5' 말단으로부터 위치 6)에 존재한다. 일부 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 4 내지 위치 6 (예를 들어, 5' 말단으로부터 위치 4, 5' 말단으로부터 위치 5, 또는 5' 말단으로부터 위치 6)에 존재한다. 일부 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2 내지 위치 5 (예를 들어, 5' 말단으로부터 위치 2, 5' 말단으로부터 위치 3, 5' 말단으로부터 위치 4, 또는 5' 말단으로부터 위치 5)에 존재한다. 일부 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 3 내지 위치 5 (예를 들어, 5' 말단으로부터 위치 3, 5' 말단으로부터 위치 4, 또는 5' 말단으로부터 위치 5)에 존재한다. 일부 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2 내지 위치 4 (예를 들어, 5' 말단으로부터 위치 2, 5' 말단으로부터 위치 3, 또는 5' 말단으로부터 위치 4)에 존재한다.
일부 실시양태에서, MM 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 11개 뉴클레오타이드에 위치한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 3개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 4개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 5개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 6개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 7개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 8개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 9개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 10개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 11개 뉴클레오타이드에 위치한다.
실시양태에서, MM 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 6개 뉴클레오타이드에 위치한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 3개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 4개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 5개 뉴클레오타이드에 위치한다. 일부 실시양태에서, MM 위치는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 6개 뉴클레오타이드에 위치한다.
일부 실시양태에서, X 및 Y는 동일한다.
또 다른 양상에서, 대립유전자 다형태를 포함하는 유전자의 영역에 대해 상보적인 5' 말단 및 3' 말단을 갖는 핵산이 제공되고, 본 핵산은 대립유전자 다형태에 상보적인 SNP 위치 뉴클레오타이드, 유전자 내의 뉴클레오타이드와의 미스매치가 있는 MM 위치 뉴클레오타이드, SNP 위치 뉴클레오타이드의 어느 한쪽의 적어도 하나의 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드 (각각의 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 4, 3 또는 2개의 뉴클레오타이드 내에 위치함), 및 MM 위치 뉴클레오타이드의 어느 한쪽의 적어도 하나의 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드 (각각의 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드는 MM 위치 뉴클레오타이드로부터 4, 3 또는 2개의 뉴클레오타이드 내에 위치함)를 포함한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 위치하거나 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 위치하고 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 위치하거나, 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치한다. 특정의 예시적인 실시양태에서, 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 위치하고, 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 시드 영역 내에 존재하고, MM 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 11개 뉴클레오타이드 (예를 들어, SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2개 뉴클레오타이드, SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 3개 뉴클레오타이드, SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 4개 뉴클레오타이드, SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 5개 뉴클레오타이드, SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 6개 뉴클레오타이드, SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 7개 뉴클레오타이드, SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 8개 뉴클레오타이드, SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 9개 뉴클레오타이드, SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 10개 뉴클레오타이드, 또는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 11개 뉴클레오타이드)에 위치한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2 내지 위치 6에 존재하고, MM 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 6개 뉴클레오타이드에 위치한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, 본 핵산은 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드를 포함한다. 특정의 예시적인 실시양태에서, 본 핵산은 3, 4, 5 또는 6개의 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드를 포함한다.
또 다른 양상에서, 대립유전자 다형태를 포함하는 유전자의 영역에 대해 상보적인 5' 말단 및 3' 말단을 갖는 핵산이 제공되고, 본 핵산은 대립유전자 다형태에 상보적인 SNP 위치 뉴클레오타이드, 유전자 내의 뉴클레오타이드와의 미스매치가 있는 MM 위치 뉴클레오타이드, SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 4, 3 또는 2개의 뉴클레오타이드 내에 위치하는 적어도 3개의 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드, 및 MM 위치 뉴클레오타이드로부터 4, 3 또는 2개의 뉴클레오타이드 내에 위치하는 적어도 3개의 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드를 포함한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 위치하거나 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치한다. 특정의 예시적인 실시양태에서, 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 위치하고 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 위치하거나, 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 위치하고, 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 시드 영역 내에 존재하고, MM 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 11개 뉴클레오타이드에 위치한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2 내지 위치 6에 존재하고, MM 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 6개 뉴클레오타이드에 위치한다.
추가 양상에서, siRNA 분자는 표적 유전자(target gene)에 대해 상보성을 갖는 센스 가닥(sense strand) 및 센스 가닥에 대해 상보성을 갖는 안티센스 가닥을 포함하고, 안티센스 가닥은 전술한 양상 또는 실시양태 중 어느 하나의 핵산을 포함하는 것이 제공된다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥은 13개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 내지 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 13, 14, 15, 16, 또는 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)의 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 내지 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 18, 19, 20, 21, 또는 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)의 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥은 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖고 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, 센스 가닥은 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖고 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다.
추가 양상에서, 서로 공유결합된 2개 이상의 siRNA 분자를 포함하는 분지형(branched) 올리고뉴클레오타이드가 제공되며, 각각의 siRNA 분자는 독립적으로 선행 양상 또는 실시양태 중 어느 하나의 siRNA 분자이다.
일부 실시양태에서, 분지형 올리고뉴클레오타이드는 서로 공유 결합된 2개의 siRNA 분자를 포함한다.
일부 실시양태에서, siRNA 분자는 링커(linker)에 의해 서로 공유결합된다.
본 발명의 상기 및 기타 특징 및 이점은 첨부 도면과 함께 확인되는 예시적인 실시양태의 다음의 상세한 설명으로부터 더욱 완전하게 이해될 것이다. 본 특허 또는 출원 파일에는 컬러로 구현된 적어도 하나의 도면이 포함되어 있다. 컬러 도면 (들)이 첨부된 본 특허 또는 특허 출원 공보물의 사본은 요청 및 필요한 수수료 지불 시 특허청에서 제공한다.
도 1은 야생형 htt 영역 또는 SNP, rs362273을 갖는 htt의 동일한 영역을 포함하는 psiCHECK 리포터 플라스미드를 도시한다.
도 2는 다양한 위치에서 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 hsiRNA로 형질감염된 HeLa 세포에서 psiCHECK 리포터 플라스미드 분석 후 루시퍼라제 활성을 보여주는 막대 그래프를 도시한다. 이 1차 스크린은 다수의 효과적인 소수성으로 변형된 siRNA (hsiRNA) 서열을 산출하였다.
도 3은 psiCHECK 리포터 플라스미드에 대한 3개의 예시적인 hsiRNA의 침묵화 효과를 나타내는 투여량 반응 곡선을 도시한다.
도 4는 htt mRNA를 침묵화시키는 것에 대한 2개의 hsiRNA의 효능을 보여주는 투여량 반응 곡선을 도시한다.
도 5는 다양한 위치에서 제2 미스매치를 갖는 hsiRNA로 형질감염된 HeLa 세포에서 psiCHECK 리포터 플라스미드 분석 후 루시퍼라제 활성을 보여주는 막대 그래프를 도시한다.
도 6은 추가 미스매치의 존재 (mm2-7) 또는 부재 (mm2-0) 하의 SNP2 hsiRNA의 침묵화 효과를 비교하는 투여량 반응 곡선을 도시한다.
도 7은 추가 미스매치의 존재 또는 부재 하의 SNP4 hsiRNA의 침묵화 효과를 비교하는 투여량 반응 곡선을 도시한다.
도 8은 추가 미스매치의 존재 또는 부재 하의 SNP6 hsiRNA의 침묵화 효과를 비교하는 투여량 반응 곡선을 도시한다.
도 9는 추가 미스매치의 존재 하의 SNP4 또는 SNP6 hsiRNA (각각 SNP4-7 및 SNP6-11)의 침묵화 효과를 추가 미스매치의 부재 하의 동일한 hsiRNA (SNP4-0 및 SNP4-11)와 비교한 투여량 반응 곡선을 도시한다. 2개의 리포터 플라스미드 중 하나로 형질감염된 HeLa 세포를 수동적 흡수에 의해 hsiRNA로 역 형질감염시키고 72시간 동안 처리하였다. 리포터 발현은 이중 루시퍼라제 분석으로 측정되었다.
도 10은 추가 미스매치의 존재 하의 hsiRNA의 침묵화 효능을 측정하는 htt mRNA 발현의 투여량 반응 곡선을 도시한다.
도 11은 일부 실시양태에 따른 hsiRNA 및 예시적인 변형을 개략적으로 도시한다.
도 12a 내지 도 12c는 각각 SNP2, SNP4 및 SNP6 hsiRNA 라이브러리를 도시한다. 안티센스 가닥은 5'에서 3'으로 표시되며 SNP 부위는 적색으로, 미스매치는 청색으로 표시된다.
도 13은 특정 실시양태에 따른 다양한 hsiRNA 작제물에 대한 안티센스 및 센스 가닥 서열 및 변형 패턴을 도시한다. mm4-7 및 mm6-11은 우수한 SNP 확인을 보여주었으며 추가 스크리닝을 위해 선택되었다.
도 14는 di-siRNA로 설계된 예시적인 SNP-선택성 화합물을 도시한다.
도 15는 특정 예시적인 실시양태에 따른 골격 연결을 도시한다. 올리고뉴클레오타이드 골격은 포스페이트, 포스포로티오에이트 (라세미 혼합물 또는 입체특이적), 디포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 펩타이드 핵산 (PNA), 보라노포스페이트, 2'-5'-포스포디에스테르, 아미드, 포스포노아세테이트, 모르폴리노 등의 하나 또는 임의의 조합을 포함할 수 있다.
도 16은 특정 예시적인 실시양태에 따른 당 변형을 도시한다. 당 변형은 2'-O-메틸, 2'-플루오로, 2'-리보, 2'-데옥시리보, 2'-F-ANA, MOE, 4'-S-RNA, LNA, 4'-S-F-ANA, 2'-O-알릴, 2'-O-에틸아민, CNet-RNA, 트리사이클로-DNA, CeNA, ANA, HNA 등 중 하나 또는 임의의 조합을 포함한다.
도 17은 특정 예시적 실시양태에 따른 뉴클레오타이드간 결합을 도시한다. 잠재적인 뉴클레오타이드간 결합은 임의의 소정의 올리고뉴클레오타이드 가닥의 5' 또는 3' 말단에서 처음 두 뉴클레오타이드 사이에 있을 수 있으며 도시된 모이어티 중 하나로 안정화될 수 있다.
도 18은 특정 예시적인 실시양태에 따른 5' 안정화 변형을 도시한다. 적합한 5' 안정화 변형은 포스페이트, 포스페이트 무함유, 비닐 포스포네이트, C5-메틸 (R 또는 S 또는 라세미체), 비닐 상의 C5-메틸, 환원된 비닐 (예를 들어, 3개의 탄소 알킬) 등일 수 있다.
도 19는 특정 예시적인 실시양태에 따른 접합체 모이어티를 도시한다. 적합한 접합된 모이어티는 임의의 길이의 알킬 사슬, 비타민, 리간드, 펩타이드 또는 생리활성 접합체, 예를 들어 글리코스핑고리피드, 다중불포화 지방산, 세코스테로이드, 스테로이드 호르몬, 스테로이드 지질 등일 수 있다.
도 20은 5' 말단으로부터 위치 6의 SNP 위치 뉴클레오타이드 및 5' 말단으로부터 위치 11에 위치한 미스매치 위치 뉴클레오타이드를 포함하는 SNP 확인 스캐폴드의 활성이 서열 비의존적임을 그래프로 나타낸다.
도 21은 본 명세서에 기재된 비닐 포스포네이트 (VP)-변형된 하위단위간 연결의 대표적인 합성을 도시한다.
도 22는 VP-변형된 하위단위간 연결을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 방법을 도시한다.
도 23은 특정 예시적인 실시양태에 따른 VP-변형된 RNA의 도식이다.
도 24는 특정 예시적인 실시양태에 따라 합성된 VP-변형된 올리고뉴클레오타이드의 서열을 도시한다.
도 25는 siRNA 효능의 비교 연구의 요약이다.
도 26은 SNP 부위 rs362273 주위의 HTT 서열에 정렬된 hsiRNA 안티센스 스캐폴드의 개략도이며, 녹색 상자는 SNP 부위의 위치를 나타낸다.
도 27a 및 도 27b는 돌연변이 대립유전자의 침묵화를 손상시키지 않으면서 대립유전자 확인을 개선시키는 siRNA 서열에 미스매치를 추가하는 효과를 도시한다.
도 28a 및 도 28b는 합성기에 의해 제조된 VP-변형된 서열을 도시한다.
도 29는 본 명세서에 제공된 VP-변형된 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위한 또 다른 방법을 나타낸다.
도 30은 VP-변형된 연결이 SNP-선택적 siRNA의 표적/비표적 확인에 미치는 영향을 나타낸다.
도 31은 예시적인 이분지형 siRNA 화학적 스캐폴드를 도시한다.
도 32a는 HTT 단백질 수준을 측정하기 위해 수행된 웨스턴 블롯이다. 도 32b는 빈쿨린 (vinculin)에 대해 정규화된 단백질 수준을 나타낸다.
도 33은 A 대신 SNP 부위에서 G를 표적화하는 올리고뉴클레오타이드에 대한 침묵화 효과를 비교하는 투여량 반응 곡선을 도시한다.
도 34는 투여량 반응을 위해 이전에 선택된 서열에 단일 미스매치를 도입하는 예시적인 서열을 도시한다.
도 35는 다수의 예시적인 올리고뉴클레오타이드 골격 변형을 도시한다.
도 36은 특정 예시적 실시양태에 따른 올리고뉴클레오타이드 분지 모티프를 나타낸다. 이중 나선은 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다. 다른 링커, 스페이서 (들) 및 분지점의 조합으로 다양한 분지형 hsiRNA 구조를 생성할 수 있다.
도 37은 접합된 생활성 모이어티를 갖는 예시적인 분지형 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다.
도 38은 예시적인 아미다이트 링커, 스페이서 및 분지 모이어티를 나타낸다.
도 39는 대체 SNP 부위 rs362273 주위의 HTT 서열에 정렬된 hsiRNA 안티센스 스캐폴드의 개략도이다.
도 40은 도 39의 hsiRNA로 형질감염된 HeLa 세포에서 psiCHECK 리포터 플라스미드 분석 후 루시퍼라제 활성을 보여주는 막대 그래프를 도시한다. "SNP" 다음의 숫자는 siRNA에서 SNP의 위치를 나타낸다.
도 41은 SNP3 부위에서 C 또는 T를 표적화하는 도 39의 올리고뉴클레오타이드에 대한 침묵화 효과를 비교하는 투여량 반응 곡선을 도시한다.
도 42는 다양한 위치에서 제2 미스매치를 특징으로 하도록 변형된 도 39의 hsiRNA로 형질감염된 HeLa 세포에서 psiCHECK 리포터 플라스미드 분석 후 루시페라제 활성을 보여주는 막대 그래프를 도시한다.
도 43은 예시적인 변형된 하위단위간 링커를 도시한다.
도 44a는 본 명세서에 제공된 변형된 포스피네이트-포함 올리고뉴클레오타이드를 위한 단량체를 제조하기 위한 대표적인 예를 보여준다. 도 44b는 본 명세서에 제공된 변형된 포스피네이트-포함 올리고뉴클레오타이드를 위한 또 다른 단량체를 제조하기 위한 대표적인 예를 보여준다. 도 44c는 본 명세서에 제공된 변형된 포스피네이트-포함 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위한 대표적인 예를 보여준다.
도 45는 HTT 유전자 (서열번호 1 내지 10 (위에서 아래로 번호지정)) 내의 예시적인 SNP를 도시한다.
도 46은 SNP-확인 siRNA를 생성 및 선택하기 위한 방법론을 예시하는 흐름도이다.
도 47은 siRNA 내에서 SNP의 위치를 나타내는 명명 규칙을 나타낸다.
도 48a 내지 도 48d는 siRNA의 SNP 위치 뉴클레오타이드 및 MM 위치 뉴클레오타이드에 인접한 2'-플루오로/2'-메톡시 함량을 변이함으로써 매개되는 표적 및 비표적 결합 및 절단의 효능 및 확인을 그래프로 도시한다. (A)는 다양한 SNP 6-11 변이체에 대한 결과를 나타낸다. (B)는 변형된 ffmff 패턴을 갖는 6-11 대 6-11에 대한 결과를 나타낸다 (위치 6의 SNP 근처의 4개의 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드 및 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드). (C)는 변형된 mmm11 패턴을 갖는 6-11 대 6-11에 대한 결과를 도시한다 (위치 11에서 MM 근처의 3개의 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드). (D)는 변형된 fff6mmm11 패턴을 갖는 6-11 대 6-11에 대한 결과를 도시한다 (위치 6의 SNP 근처의 3개의 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드, 및 위치 11의 MM 근처의 3개의 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드). HeLa 세포를 2개의 리포터 플라스미드 중 하나로 형질감염시키고 수동적 흡수에 의해 siRNA로 역형질감염시키고 72시간 동안 처리하였다. 이중 루시퍼라제 분석을 사용하여 리포터 발현을 측정하였다.
본 개시내용은 돌연변이 단백질을 인코딩하는 유전자 내에 위치한 대립유전자 다형태의 침묵화에 유용한 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 RNA 침묵화 제제, 예를 들어, RNA, 예컨대 이중 가닥 RNA ("dsRNA"), 안티센스 올리고뉴클레오타이드 ("ASO") 등을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정 양상에서, 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 RNA 침묵화 제제는 뉴클레오타이드 특이성 및 선택성으로 해당 돌연변이 mRNA (예를 들어, SNP-포함 mRNA)를 파괴하는 본 명세서에 제공된 dsRNA 제제이다. 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, RNA 침묵화 제제, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 dsRNA 제제는 돌연변이 유전자의 다형태 영역에 해당하는 mRNA를 표적화하여 돌연변이 mRNA의 절단을 초래하고 해당하는 돌연변이 단백질, 예를 들어, 헌팅틴 단백질과 같은 기능 획득 돌연변이 단백질의 합성을 방지한다.
정의
본 명세서에서 달리 규정되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 과학 및 기술 용어는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 잠재적인 모호성이 있는 경우 본 명세서에 제공된 정의가 임의의 사전 또는 외부 정의보다 우선한다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다. "또는"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. "~를 포함하는"이라는 용어와 "~를 포함하다" 및 "~를 포함하였다"와 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다.
올리고뉴클레오타이드 서열의 맥락에서 본 명세서에 사용된 바와 같이, "A"는 염기 아데닌을 포함하는 뉴클레오사이드 (예를 들어, 아데노신 또는 이의 화학적으로 변형된 유도체)를 나타내고, "G"는 염기 구아닌을 포함하는 뉴클레오사이드 (예를 들어, 구아노신 또는 이의 화학적으로 변형된 유도체)를 나타내고, "U"는 염기 우라실을 포함하는 뉴클레오사이드 (예를 들어, 우리딘 또는 이의 화학적으로 변형된 유도체)를 나타내고, "C"는 염기 아데닌 을 포함하는 뉴클레오사이드(예를 들어, 시티딘 또는 이의 화학적으로 변형된 유도체)를 나타낸다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "캡핑기 (capping group)"는 알코올 (ROH), 카복실산 (RCO2H), 또는 아민 (RNH2)과 같은 작용기에서 수소 원자를 대체하는 화학적 모이어티를 지칭한다. 캡핑기의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 알킬 (예를 들어, 메틸, 3차-부틸); 알케닐 (예를 들어, 비닐, 알릴); 카복실 (예를 들어, 아세틸, 벤조일); 카바모일; 포스페이트; 및 포스포네이트 (예를 들어, 비닐포스포네이트). 다른 적합한 캡핑기는 당업자에게 공지되어 있다.
용어 "뉴클레오타이드 유사체" 또는 "변이된 뉴클레오타이드" 또는 "변이된 뉴클레오타이드"는 비-천연 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함하는 비표준 뉴클레오타이드를 지칭한다. 예시적인 뉴클레오타이드 유사체는 뉴클레오타이드의 특정 화학적 특성을 변이시키면서도 의도된 기능을 수행하는 뉴클레오타이드 유사체의 능력을 유지시키는 임의의 위치에서 변형된다. 유도체화될 수 있는 뉴클레오타이드의 위치의 예는 5-위치, 예를 들어 5-(2-아미노)프로필 우리딘, 5-브로모 우리딘, 5-프로핀 우리딘, 5-프로페닐 우리딘 등; 6 위치, 예를 들어 6-(2-아미노)프로필 우리딘; 아데노신 및/또는 구아노신에 대한 8-위치, 예를 들어 8-브로모 구아노신, 8-클로로 구아노신, 8-플루오로구아노신 등을 포함한다. 뉴클레오타이드 유사체에는 또한 데아자 뉴클레오타이드, 예를 들어 7-데아자-아데노신; O- 및 N-변형된 (예를 들어, 알킬화된, 예를 들어 N6-메틸 아데노신, 또는 당업계에 달리 공지된 바와 같음) 뉴클레오타이드; 및 문헌[Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 Aug. 10 (4):297-310]에 기재된 것과 같은 다른 헤테로사이클릭 변형된 뉴클레오타이드 유사체를 포함한다.
용어 "올리고뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드 및/또는 뉴클레오타이드 유사체의 짧은 중합체를 지칭한다. 용어 "RNA 유사체"는 해당하는 비변이 또는 비변형 RNA와 비교하여 적어도 하나의 변이되거나 변형된 뉴클레오타이드를 갖지만 해당하는 비변이 또는 비변형 RNA와 동일하거나 유사한 성질 또는 기능을 유지하는 폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오타이드)를 지칭한다. 상기 논의된 바와 같이, 올리고뉴클레오타이드는 연결과 연결될 수 있으며, 이는 포스포디에스테르 연결을 갖는 RNA 분자와 비교하여 RNA 유사체의 더 낮은 가수분해 속도를 초래한다. 예를 들어, 유사체의 뉴클레오타이드는 메틸렌디올, 에틸렌 디올, 옥시메틸티오, 옥시에틸티오, 옥시카보닐옥시, 포스포로디아미데이트, 포스포로아미데이트, 및/또는 포스포로티오에이트 결합을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, RNA 유사체는 당- 및/또는 골격-변형된 리보뉴클레오타이드 및/또는 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함한다. 그러한 변이 또는 변형은 RNA의 말단 (들) 또는 내부 (RNA의 하나 이상의 뉴클레오타이드)와 같은 비-뉴클레오타이드 물질의 추가를 추가로 포함할 수 있다. RNA 유사체는 RNA 간섭을 매개 (매개)할 수 있는 능력이 있는 천연 RNA와 충분히 유사하면 된다.
본 명세서에 사용된 예시적인 올리고뉴클레오타이드는 다음에 제한되는 것은 아니나, siRNA, miRNA, shRNA, CRISPR 가이드, DNA 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, AAV 올리고뉴클레오타이드, 갭 인자, 혼합 인자, miRNA 억제제, SSO, PMO, PNA 등을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "RNA 간섭" ("RNAi")은 RNA의 선택적 세포내 분해를 지칭한다. RNAi는 외부 RNA (예를 들어, 바이러스 RNA)를 제거하기 위해 세포에서 자연적으로 발생한다. 천연 RNAi는 분해 기전을 다른 유사한 RNA 서열로 유도하는 유리 dsRNA로부터 절단된 단편을 통해 진행된다. 대안적으로, RNAi는 예를 들어 표적 유전자의 발현을 침묵화시키기 위해 인위적 작업에 의해 개시될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "hsiRNA"는 본 명세서에 제공된 이중 가닥 RNA의 실시양태를 지칭하며, RNA 분자는 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 소수성 변형을 포함하여 완전히 화학적으로 변형된다.
"표적 특이적 RNA 간섭 (RNAi)을 유도하기 위해 표적 mRNA 서열에 충분히 상보적인 서열"인 가닥을 갖는 RNAi 제제, 예를 들어 RNA 침묵화 제제는 가닥이 RNAi 기전 또는 과정에 의한 표적 mRNA의 파괴를 촉발하기에 충분한 서열을 갖는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된 RNA" (예를 들어, "단리된 siRNA" 또는 "단리된 siRNA 전구체")는 재조합 기술에 의해 생성될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 부재하거나 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 부재하는 RNA 분자를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "RNA 침묵화"는 RNA 분자에 의해 매개되는 서열 특이적 조절 기전 (예를 들어, RNA 간섭 (RNAi), 전사 유전자 침묵화 (TGS), 전사후 유전자 침묵화 (PTGS), 켈링 (quelling), 공-억제, 번역 억제 등)의 그룹을 지칭하며, 이는 해당하는 단백질 코딩 유전자 발현의 억제 또는 "침묵화"를 초래한다. RNA 침묵화는 식물, 동물 및 균류를 포함한 많은 유형의 유기체에서 관찰되었다.
"확인적 RNA 침묵화"라는 용어는 예를 들어 두 폴리뉴클레오타이드 서열이 동일한 세포에 존재할 때 "제1" 또는 "표적" 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 실질적으로 억제하지 않으면서 "제2" 또는 "비-표적" 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 실질적으로 억제하지 않는 RNA 분자의 능력을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 표적 유전자에 해당하고, 비-표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 비-표적 유전자에 해당한다. 다른 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 표적 대립유전자에 해당하고, 비-표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 비-표적 대립유전자에 해당한다. 특정 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 표적 유전자의 조절 영역 (예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 요소)을 인코딩하는 DNA 서열이다. 다른 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 표적 유전자에 의해 인코딩되는 표적 mRNA이다.
질병 또는 장애에 "연관된" 유전자는 정상 또는 이상 발현 또는 기능이 질병 또는 장애 또는 상기 질병 또는 장애의 적어도 하나의 증상에 영향을 미치거나 이를 유발하는 유전자를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "표적 유전자" (예를 들어, 이형접합 다형태의 돌연변이 대립유전자, 예를 들어, 이형접합 SNP)는 이의 발현이 실질적으로 억제되거나 "침묵화"되어야 하는 유전자이다. 이러한 침묵화는 RNA 침묵화에 의해, 예를 들어 표적 유전자의 mRNA를 절단하거나 표적 유전자의 번역 억제에 의해 달성될 수 있다. 용어 "비표적 유전자" (예를 들어, 야생형 대립유전자)는 발현이 실질적으로 침묵화되지 않아야 하는 유전자이다. 일 실시양태에서, 표적 및 비-표적 유전자의 폴리뉴클레오타이드 서열 (예를 들어, 표적 및 비-표적 유전자에 의해 인코딩된 mRNA)은 하나 이상의 뉴클레오타이드만큼 상이할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 표적 및 비-표적 유전자는 하나 이상의 다형태 (예를 들어, 단일 뉴클레오타이드 다형태 또는 SNP)가 상이할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 표적 및 비-표적 유전자는 100% 미만의 서열 동일성을 공유할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 비-표적 유전자는 표적 유전자의 상동체 (예를 들어, 이종상동체 또는 파라로그 (paralog))일 수 있다.
"표적 대립유전자"는 이의 발현이 선택적으로 억제되거나 "침묵화"되어야 하는 대립유전자 (예를 들어, SNP 대립유전자)이다. 이러한 침묵화는 RNA 침묵화에 의해, 예를 들어 siRNA에 의해 표적 유전자 또는 표적 대립유전자의 mRNA의 절단에 의해 달성될 수 있다. 용어 "비표적 대립유전자"는 발현이 실질적으로 침묵화되지 않아야 하는 대립유전자 (예를 들어, 해당하는 야생형 대립유전자)이다. 특정 실시양태에서, 표적 및 비-표적 대립유전자는 동일한 표적 유전자에 해당할 수 있다. 다른 실시양태에서, 표적 대립유전자는 표적 유전자에 대응하거나 이와 연관되고, 비표적 대립유전자는 비표적 유전자에 대응하거나 이와 연관된다. 일 실시양태에서, 표적 및 비-표적 대립유전자의 폴리뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 뉴클레오타이드가 상이할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 표적 및 비-표적 대립유전자는 하나 이상의 대립유전자 다형태 (예를 들어, 하나 이상의 SNP)가 상이할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 표적 및 비-표적 대립유전자는 100% 미만의 서열 동일성을 공유할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "다형태"는 상이한 공급원 또는 대상체로부터 (그러나 동일한 유기체로부터)의 동일한 유전자 서열이 비교되는 경우, 확인되거나 검출된 유전자 서열 내의 변이 (예를 들어, 하나 이상의 결실, 삽입 또는 치환)를 지칭한다. 예를 들어, 다형태는 다른 대상체의 동일한 유전자 서열을 비교할 때 확인될 수 있다. 이러한 다형태의 확인은 당업계에서 통상적이며, 방법론은 예를 들어 유방암 점 돌연변이를 검출하는데 사용되는 것과 유사한다. 예를 들어, 대상체의 림프구로부터 추출된 DNA로부터 확인이 이루어질 수 있으며, 이어서 상기 다형태 영역에 대한 특이적 프라이머를 사용하여 다형태 영역을 증폭할 수 있다. 대안적으로, 동일한 유전자의 두 대립유전자를 비교할 때 다형태를 확인할 수 있다.
특정 실시양태에서, 다형태는 단일 뉴클레오타이드 다형태 (SNP)이다. 유기체 내에서 동일한 유전자의 2개의 대립유전자 사이의 서열 변이는 본 명세서에서 "대립형 다형태"로 지칭된다. 특정 실시양태에서, 대립유전자 다형태는 SNP 대립유전자에 해당한다. 예를 들어, 대립유전자 다형태는 본 명세서에서 이형접합 SNP로도 지칭되는 SNP의 2개의 대립유전자 사이의 단일 뉴클레오타이드 변이를 포함할 수 있다. 다형태는 코딩 영역 내의 뉴클레오타이드에 존재할 수 있지만 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 아미노산 서열의 변화는 인코딩되지 않는다. 대안적으로, 다형태 서열은 특정 위치에서 상이한 아미노산을 인코딩할 수 있지만, 아미노산의 변화는 단백질 기능에 영향을 미치지 않는다. 다형태 영역은 또한 유전자의 비인코딩 영역에 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 다형태는 유전자의 코딩 영역 또는 유전자의 비번역 영역 (예를 들어, 5' UTR 또는 3' UTR)에 존재한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "대립유전자 빈도"는 개체 집합의 단일 유전자좌에서 대립유전자 (예를 들어, SNP 대립유전자)의 상대 빈도의 척도 (예를 들어, 비율 또는 백분율)이다. 예를 들어, 개체 집합이 각각의 체세포에서 특정 염색체 유전자좌 (및 유전자좌를 차지하는 유전자)의 n 유전자좌를 갖고 있는 경우, 대립유전자의 대립유전자 빈도는 대립유전자가 집합 내에서 차지하는 유전자좌의 비율 또는 백분율이다. 특정 실시양태에서, 대립유전자 (예를 들어, SNP 대립유전자)의 대립유전자 빈도는 샘플 집합에서 적어도 10% (예를 들어, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% 이상)이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "기능 획득 돌연변이"는 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질 (즉, 돌연변이 단백질)이 질병 또는 장애를 유발하거나 이에 관여하는 단백질 (즉, 야생형 단백질)과 정상적으로 연관되지 않는 기능을 획득하는 유전자의 임의의 돌연변이를 지칭한다. 기능 획득 돌연변이는 인코딩된 단백질의 기능에 변화를 일으키는 유전자의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드의 결실, 추가 또는 치환일 수 있다. 일 실시양태에서, 기능 획득 돌연변이는 돌연변이 단백질의 기능을 변화시키거나 다른 단백질과의 상호작용을 야기한다. 또 다른 실시양태에서, 기능 획득 돌연변이는 예를 들어 변이된 돌연변이 단백질과 상기 정상 야생형 단백질의 상호작용에 의해 정상 야생형 단백질의 감소 또는 제거를 야기한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "기능 획득 장애"는 기능 획득 돌연변이를 특징으로 하는 장애를 지칭한다. 일 실시양태에서, 기능 획득 장애는 기능 획득 돌연변이에 의해 야기되는 신경퇴행성 질병, 예를 들어 폴리글루타민 장애 및/또는 트리뉴클레오타이드 반복 질병, 예를 들어 헌팅턴병 (Huntington's disease)이다. 또 다른 실시양태에서, 기능 획득 장애는 기능 획득 돌연변이인 돌연변이 유전자 산물인 종양유전자의 기능 획득에 의해 유발되고, 예를 들어 ret 종양유전자 (예를 들어, ret-1)의 돌연변이에 의해 유발되는 암, 예를 들어 내분비 종양 (endocrine tumor), 갑상선 수질 종양 (medullary thyroid tumor), 부갑상선 호르몬 종양 (parathyroid hormone tumor), 다발성 내분비 종양 2형 (multiple endocrine neoplasia type2) 등이다. 추가의 예시적인 기능 획득 장애에는 다음에 제한되는 것은 아니나, 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 근위축성 측삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis) (ALS), 인간 면역결핍 장애 (human immunodeficiency disorder) (HIV), 및 느린 채널 선천 근무력 증후군 (slow channel congenital myasthenic syndrome) (SCCMS)이 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "트리뉴클레오타이드 반복 질병"은 유전자 내에 위치한 연장된 트리뉴클레오타이드 반복 영역을 특징으로 하는 임의의 질병 또는 장애를 지칭하며, 연장된 트리뉴클레오타이드 반복 영역은 상기 질병 또는 장애의 원인이 된다. 트리뉴클레오타이드 반복 질병의 예에는 다음에 제한되는 것은 아니나, 척수-소뇌 운동실조 12형 (spino-cerebellar ataxia type 12), 척수-소뇌 운동실조 8형, 취약 X 증후군, (fragile X syndrome) 취약 XE 정신 지체, (fragile XE Mental Retardation) 프리드라이히 운동실조 (Friedreich's ataxia) 및 근긴장성 이영양증이 (myotonic dystrophy) 포함된다. 본 개시내용에 따른 치료를 위한 예시적인 트리뉴클레오타이드 반복 질병은 질병 또는 장애를 유발하거나 그 원인이 되는 돌연변이 단백질을 인코딩하는 유전자인 유전자의 코딩 영역의 5' 말단에서 연장된 트리뉴클레오타이드 반복 영역에 의해 특징지어지거나 유발되는 것들이다. 돌연변이가 코딩 영역과 연관되지 않은 특정 트리뉴클레오타이드 질병, 예를 들어 취약 X 증후군은 RNAi에 의해 표적화될 적절한 mRNA가 없기 때문에 본 개시내용의 방법론에 따른 치료에 적합하지 않을 수 있다. 이와 달리, 프리드리히 운동실조와 같은 질병은 원인 돌연변이가 코딩 영역 내에 있지 않지만 (즉, 인트론 내에 있음) 돌연변이가 예를 들어, mRNA 전구체 (예를 들어, 미리 스플라이싱된 mRNA 전구체) 내에 있을지라도, 본 개시내용의 방법론에 따른 치료에 적합할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리글루타민 장애"는 코딩 영역의 5' 말단에서 (CAG)n 반복의 연장을 특징으로 하는 임의의 질병 또는 장애를 지칭한다 (따라서 인코딩된 단백질에서 연장된 폴리글루타민 영역을 인코딩함). 일 실시양태에서, 폴리글루타민 장애는 신경 세포의 진행성 변성을 특징으로 한다. 폴리글루타민 장애의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 헌팅턴병, 척수-소뇌 운동실조 1형, 척수-소뇌 운동실조 2형, 척수-소뇌 운동실조 3형 (마차도-조셉병병 (Machado-Joseph disease)으로도 알려짐), 및 척수-소뇌 운동실조 6형, 척수-소뇌 실조증 7형, 치아우측-창백색 위축증 등을 포함한다.
용어 "단일 뉴클레오타이드 다형태 장애" 또는 "SNP 장애"는 SNP, 예를 들어 이형접합 SNP의 존재를 특징으로 하는 장애를 지칭한다. SNP 장애에는 다음에 제한되는 것은 아니나, 페닐케톤뇨증 (phenylketonuria), 낭포성 섬유증 (cystic fibrosis), 겸상적혈구 빈혈 (sickle-cell anemia), 백색증 (albinism), 헌팅턴병, 근긴장성 이영양증 1형 (myotonic dystrophy type 1), 고콜레스테롤혈증 (hypercholesterolemia) (상염색체 우성, B형), 신경섬유종증 (neurofibromatosis) (1형), 다낭성 신장 질병 (polycystic kidney disease) (1 및 2) A형 혈우병 (hemophilia A), 뒤센형 근이영양증 (Duchenne's muscular dystrophy), X-연관 저인산혈증 구루병 (X-linked hypophosphatemic rickets), 레트 증후군 (Rett's syndrome), 비폐쇄성 정자형성부전 (non-obstructive spermatogenic failure) 등을 포함한다. 예시적인 이형접합 SNP 장애는 헌팅턴병이다.
특정 양상에서, 대립유전자 다형태를 포함하는 유전자의 영역에 상보적인 약 15 내지 35개 뉴클레오타이드의 제1 가닥, 및 제1 가닥의 적어도 일부에 상보적인 약 15 내지 35개 뉴클레오타이드의 제2 가닥을 포함하는 이중 가닥 RNA (dsRNA)가 제공되고, 제1 가닥은 대립유전자 다형태에 상보적인 5' 말단으로부터 위치 2 내지 7에 단일 뉴클레오타이드 다형태 (SNP) 위치 뉴클레오타이드 및 유전자의 뉴클레오타이드와 미스매치가 있는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 11개의 뉴클레오타이드에 위치한 미스매치 (MM) 위치 뉴클레오타이드를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2, 4 또는 6에 있고 미스매치 (MM) 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 6개 뉴클레오타이드에 위치한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "단일 뉴클레오타이드 다형태 위치 뉴클레오타이드" 또는 "SNP 위치 뉴클레오타이드"는 표적 핵산 서열 (즉, SNP 대립유전자에 해당하는 돌연변이 뉴클레오타이드 또는 야생형 대립유전자에 해당하는 야생형 뉴클레오타이드)의 다형태 위치에 해당하는 본 명세서에 기재된 RNA (예를 들어, dsRNA의 제1 가닥)의 위치를 지칭한다. 예를 들어, 가닥은 " 가닥의 5' 말단으로부터 2, 3 또는 4개 뉴클레오타이드인 SNP의 위치를 나타내기 위해 "SNP2," "SNP3," 또는 "SNP4"로 표지될 수 있다.
특정의 예시적인 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 시드 영역 내에 있다. 특정의 예시적인 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2 내지 위치 7, 5' 말단으로부터 위치 2 내지 위치 6, 또는 5' 말단으로부터 위치 2 내지 위치 5 내에 위치한다. 특정의 예시적인 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 l본 명세서에 기재된 RNA (예를 들어, dsRNA의 제1 가닥)의 5' 말단으로부터 위치 2, 5' 말단으로부터 위치 3, 5' 말단으로부터 위치 4, 5' 말단으로부터 위치 5, 5' 말단으로부터 위치 6, 또는 5' 말단으로부터 위치 7에 위치한다. 특정의 예시적인 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 표 5 내지 표 7에 제시된 위치에 위치한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "시드 영역"은 RNA 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 내지 7에 해당하는 6-뉴클레오타이드 가닥을 지칭한다. 표적 mRNA의 siRNA 인식은 안티센스 가닥의 시드 영역에 의해 부여되는 것으로 여겨진다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "미스매치 위치 뉴클레오타이드" 또는 "MM 위치 뉴클레오타이드"는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 해당하지 않는 위치에 있는 본 명세서에 기재된 RNA (예를 들어, dsRNA의 제1 가닥)의 위치를 지칭한다. MM 위치 뉴클레오타이드는 본 명세서에 기술된 RNA의 5' 말단 또는 3' 말단 (예를 들어, dsRNA의 제1 가닥의 5' 또는 3' 말단)으로부터의 위치에 의해 규정되거나 본 명세서에 기재된 RNA (예를 들어, dsRNA의 제1 가닥)의 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대비한 위치에 의해 규정될 수 있다.
특정의 예시적인 실시양태에서, MM 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 11개 뉴클레오타이드, 2 내지 10개 뉴클레오타이드, 2 내지 9개 뉴클레오타이드, 2 내지 8개 뉴클레오타이드, 2 내지 7개 뉴클레오타이드, 또는 2 내지 6개 뉴클레오타이드에 위치한다. 특정의 예시적인 실시양태에서, MM 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 11개 뉴클레오타이드, 10개 뉴클레오타이드, 9개 뉴클레오타이드, 8개 뉴클레오타이드, 7개 뉴클레오타이드, 6개 뉴클레오타이드, 5개 뉴클레오타이드, 4개 뉴클레오타이드, 3개 뉴클레오타이드 또는 2개 뉴클레오타이드에 위치한다. 특정의 예시적인 실시양태에서, MM 위치 뉴클레오타이드는 표 5 내지 표 7에 제시된 위치에 위치한다.
일 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 RNA (예를 들어, dsRNA의 제1 가닥)는 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드에 대비한 특정 위치의 하나의 미스매치된 올리고뉴클레오타이드를 제외하고 대립유전자 다형태에 상동성이다. 특정 실시양태에서, 미스매치는 SNP 위치 뉴클레오타이드의 약 6개 뉴클레오타이드 내, SNP 위치 뉴클레오타이드의 약 5개 뉴클레오타이드 내, SNP 위치 뉴클레오타이드의 약 4개 뉴클레오타이드 내, SNP 위치 뉴클레오타이드의 약 3개 뉴클레오타이드 내, SNP 위치 뉴클레오타이드의 약 2개 뉴클레오타이드 내, 또는 SNP 위치 뉴클레오타이드의 약 1개 뉴클레오타이드 내에 위치한다. 특정 실시양태에서, 미스매치는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 인접하지 않는다.
또 다른 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2, 3, 4, 5, 또는 6에 존재한다. 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2에 존재한다. 실시양태에서, 5' 말단으로부터 위치 3에 존재한다. 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 4에 존재한다. 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 5에 존재한다. 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 6에 존재한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 RNA (예를 들어, dsRNA의 제1 가닥)는 5' 말단으로부터 위치 5, 7, 8, 11, 14, 15 또는 16의 MM 위치 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정의 예시적인 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 RNA (예를 들어, dsRNA의 제1 가닥)는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10 또는 11개 뉴클레오타이드에 MM 위치 뉴클레오타이드를 포함한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 RNA (예를 들어, dsRNA의 제1 가닥)는 2-7, 4-7, 4-8, 4-15, 6-5, 6-8, 6-11, 6-14, 6-16, 3-5, 3-7 및 3-8로 이루어진 군으로부터 선택되는 SNP 위치 뉴클레오타이드 (5' 말단으로부터 지칭됨) - MM 위치 뉴클레오타이드 (5' 말단으로부터 지칭됨) 조합을 포함한다.
특정의 예시적인 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 RNA (예를 들어, dsRNA의 제1 가닥)는 5' 말단으로부터 위치 6의 SNP 위치 뉴클레오타이드 및 5' 말단으로부터 위치 11의 MM 위치 뉴클레오타이드를 포함한다. 또 다른 특정의 예시적인 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 RNA (예를 들어, dsRNA의 제1 가닥)는 5' 말단으로부터 위치 4의 SNP 위치 뉴클레오타이드 및 5' 말단으로부터 위치 7의 미스매치를 포함한다.
일 양상에서, 본 명세서에 제공되는 이중 가닥 RNA는 대립유전자 다형태를 갖는 돌연변이 대립유전자를 선택적으로 침묵화시킨다. 일 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 이중 가닥 RNA는 대립유전자 다형태를 갖는 돌연변이 대립유전자를 침묵화시키고 동일한 유전자의 야생형 대립유전자에 영향을 미치지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 이중 가닥 RNA는 대립유전자 다형태를 갖는 돌연변이 대립유전자를 침묵화시키고 돌연변이 대립유전자보다 적은 정도로 동일한 유전자의 야생형 대립유전자를 침묵화시킨다.
따라서, 일 양상에서, 본 개시내용은 대상체에게 돌연변이 단백질 (예를 들어, 헌팅틴 단백질)을 인코딩하는 유전자 내의 대립유전자 다형태를 표적화하는 RNAi 제제의 유효량을 투여함으로써 유전자의 서열-특이적 간섭이 발생하여 질병에 대한 효과적인 치료를 초래하는 대립유전자 다형태와 연관된 돌연변이 단백질을 특징으로 하거나 이에 의해 야기되는 질병을 갖거나 가질 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
일 양상에서, 본 명세서에 개시된 RNA 침묵화 제제는 해당하는 야생형 대립유전자보다 더 효율적으로 다형태를 포함하는 돌연변이 대립유전자를 우선적으로 침묵화시킨다. 특정 예시적 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 dsRNA는 해당하는 야생형 대립유전자보다 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 또는 약 90% 초과하여 다형태를 포함하는 대립유전자를 침묵화시킨다. 일 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 RNA 침묵화 제제는 해당하는 야생형 대립유전자보다 적어도 약 50% 초과하여 다형태를 포함하는 대립유전자를 침묵화시킨다. 특정 예시적인 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 dsRNA는 해당하는 야생형 대립유전자의 침묵화 수준의 적어도 약 5배, 약 10배, 약 15배, 약 20배, 약 25배, 약 30배, 약 35배, 약 40배, 약 45배, 약 50배, 약 55배, 약 60배, 약 65배, 약 70배, 약 75배, 약 80배, 약 85배, 약 90배, 약 95배, 약 100배, 약 110배, 약 120배, 약 130배, 약 140배, 약 150배, 약 160배, 약 170배, 약 180배, 약 190배, 약 200배, 약 250배, 약 300배, 약 350배, 약 400배, 약 450배, 또는 최대 약 500배만큼 다형태를 포함하는 대립유전자를 침묵화시킨다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, RNA 침묵화 제제, 예를 들어, siRNA 또는 RNA 침묵화 제제의 "안티센스 가닥"이라는 용어는 침묵화를 위해 표적화된 유전자의 mRNA의 약 10 내지 50개 뉴클레오타이드, 예를 들어, 약 15 내지 30, 16 내지 25, 18 내지 23 또는 19 내지 22개 뉴클레오타이드의 절편에 실질적으로 상보적인 가닥을 지칭한다. 안티센스 가닥 또는 제1 가닥은 표적 특이적 침묵화를 유도하기 위해 적절한 표적 mRNA 서열에 충분히 상보적인 서열, 예를 들어 RNAi 기전 또는 과정 (RNAi 간섭)에 의한 적절한 표적 mRNA의 파괴를 촉발하기에 충분한 상보성 또는 적절한 표적 mRNA의 번역 억제를 유발하기에 충분한 상보성을 갖는다.
RNA 침묵화 제제, 예를 들어, siRNA 또는 RNA 침묵화 제제의 "센스 가닥" 또는 "제2 가닥"이라는 용어는 안티센스 가닥 또는 제1 가닥에 상보적인 가닥을 지칭한다. 안티센스 및 센스 가닥은 또한 제1 또는 제2 가닥으로 지칭될 수 있고, 제1 또는 제2 가닥은 표적 서열에 대해 상보성을 갖고 각각의 제2 또는 제1 가닥은 상기 제1 또는 제2 가닥에 대해 상보성을 갖는다. miRNA 이중체 중간체 또는 siRNA-유사 이중체는 침묵화를 위해 표적화된 유전자의 mRNA의 약 10 내지 50개 뉴클레오타이드 절편에 충분한 상보성을 갖는 miRNA 가닥 및 miRNA 가닥과 이중체를 형성하기에 충분한 상보성을 갖는 miRNA* 가닥을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드" 또는 "ASO"는 효과적인 방식, 예를 들어, 표적 mRNA의 번역 및/또는 표적 pre-mRNA의 스플라이싱을 억제하는 효과적인 방식으로 표적 RNA의 영역을 차단하기 위해 표적 RNA (예를 들어, SNP-포함 mRNA 또는 SNP-포함 pre-mRNA)에 충분한 서열 상보성을 갖는 핵산 (예를 들어, RNA)을 지칭한다. "표적 RNA에 충분히 상보적인 서열"을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 제제가 그렇지 않으면 스플라이싱을 조절할 단백질의 결합 부위를 차폐하기에 충분한 서열을 갖고/거나 안티센스 제제가 리보솜에 대한 결합 부위를 차폐하기에 충분한 서열을 갖고/거나, 안티센스 제제가 스플라이싱 및/또는 번역을 방지하기 위해 표적화된 RNA의 3차원 구조를 변이하기에 충분한 서열을 가짐을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 안티센스 가닥의 5' 말단에서와 같은 "5' 말단"은 예를 들어 안티센스 가닥의 5' 말단에서 1 내지 약 5개의 뉴클레오타이드 사이의 5' 말단 뉴클레오타이드를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 센스 가닥의 3' 말단에서와 같은 "53 말단"은 예를 들어 상보적인 안티센스 가닥의 5' 말단의 뉴클레오타이드에 상보적인 1 내지 약 5개의 뉴클레오타이드 사이의 영역과 같은 영역을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "염기쌍"은 H-결합, 반 데르 발스 상호작용 등으로 인한 올리고뉴클레오타이드 이중체 (예를 들어, RNA 침묵화 제제의 가닥 및 표적 mRNA 서열에 의해 형성된 이중체)의 다른 한 가닥의 뉴클레오타이드 (또는 뉴클레오타이드 유사체) 쌍 사이 및 상기 뉴클레오타이드 (또는 뉴클레오타이드 유사체) 사이의 상호작용을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "결합 강도" 또는 "염기 쌍 강도"는 염기 쌍의 강도를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "미스매치 염기쌍"은 예를 들어 정상 상보적 G:C, A:T 또는 A:U 염기쌍이 아닌 비-상보적 또는 비-왓슨-크릭 염기쌍 (non-Watson-Crick base pair)으로 이루어진 염기쌍을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "비식별 염기쌍" (비-확인 염기쌍으로도 언급됨)은 통상적인 뉴클레오타이드에 의해 형성된 염기쌍을 지칭한다.
본 개시내용의 접합 화합물에 유용한 링커는 글리콜 사슬 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜), 알킬 사슬, 펩타이드, RNA, DNA, 및 이의 조합을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 약어 "TEG"는 트리에틸렌 글리콜을 지칭한다.
올리고뉴클레오타이드의 설계
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 siRNA는 센스 가닥 및 상보적 안티센스 가닥을 포함하는 이중체이고, 안티센스 가닥은 RNAi를 매개하는 대립유전자 다형태를 포함하는 표적 mRNA에 대해 충분한 상보성을 갖는다. 예시적인 실시양태에서, siRNA 분자는 약 10 내지 50개 이상의 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 즉, 각 가닥은 10 내지 50개의 뉴클레오타이드 (또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 특정의 예시적인 실시양태에서, siRNA 분자는 각각의 가닥에 약 15 내지 35, 예를 들어, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34 또는 약 35개 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 가닥 중 하나는 표적 영역에 대해 충분히 상보적이다.
예시적인 실시양태에서, 가닥은 정렬되지 않는 (즉, 다른 한 가닥에 상보적 염기가 존재하지 않는) 가닥의 말단에 적어도 1, 2, 또는 3개의 염기가 존재하여, 가닥이 어닐링될 때 이중체의 한쪽 또는 양쪽 말단에 1, 2 또는 3개 잔기의 오버행 (overhang)이 존재하도록 정렬된다. 예시적인 실시양태에서, siRNA 분자는 약 10 내지 50개 이상의 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 즉, 각각의 가닥은 10 내지 50개 뉴클레오타이드 (또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 특정의 예시적인 실시양태에서, siRNA 분자는 각각의 가닥에 약 15 내지 35, 예를 들어, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34 또는 약 35개 뉴클레오타이드의 길이를 갖고, 가닥 중 하나는 대립유전자 다형태를 포함하는 표적 서열에 실질적으로 상보적이고, 다른 가닥은 제1 가닥에 상보적이거나 실질적으로 상보적이다. 실시양태에서, siRNA 분자는 또한 제2 미스매치로도 언급되는 하나의 추가의 미스매치를 제외하고 대립유전자 다형태를 포함하는 표적 서열에 완전히 상보적이다.
일부 실시양태에서, 각각의 가닥은 10 내지 50개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 10개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 11개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 12개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 13개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 14개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 26개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 27개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 28개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 29개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 30개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 31개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 32개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 33개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 34개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 36개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 37개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 38개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 39개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 40개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 41개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 42개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 43개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 44개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 45개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 46개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 47개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 48개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 49개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 50개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 가닥은 10 내지 49개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 10개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 11개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 12개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 13개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 14개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 26개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 27개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 28개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 29개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 30개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 31개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 32개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 33개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 34개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 36개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 37개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 38개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 39개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 40개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 41개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 42개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 43개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 44개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 45개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 46개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 47개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 48개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 49개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 가닥은 10 내지 48개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 10개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 11개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 12개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 13개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 14개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 26개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 27개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 28개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 29개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 30개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 31개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 32개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 33개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 34개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 36개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 37개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 38개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 39개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 40개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 41개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 42개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 43개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 44개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 45개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 46개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 47개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 48개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 가닥은 10 내지 47개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 10개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 11개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 12개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 13개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 14개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 26개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 27개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 28개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 29개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 30개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 31개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 32개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 33개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 34개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 36개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 37개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 38개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 39개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 40개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 41개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 42개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 43개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 44개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 45개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 46개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 47개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 가닥은 10 내지 46개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 10개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 11개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 12개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 13개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 14개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 26개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 27개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 28개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 29개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 30개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 31개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 32개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 33개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 34개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 36개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 37개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 38개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 39개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 40개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 41개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 42개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 43개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 44개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 45개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 46개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 가닥은 10 내지 45개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 10개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 11개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 12개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 13개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 14개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 26개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 27개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 28개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 29개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 30개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 31개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 32개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 33개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 34개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 36개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 37개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 38개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 39개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 40개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 41개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 42개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 43개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 44개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 45개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 가닥은 10 내지 44개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 10개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 11개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 12개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 13개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 14개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 26개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 27개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 28개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 29개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 30개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 31개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 32개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 33개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 34개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 36개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 37개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 38개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 39개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 40개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 41개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 42개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 43개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 44개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 가닥은 10 내지 43개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 10개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 11개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 12개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 13개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 14개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 26개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 27개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 28개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 29개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 30개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 31개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 32개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 33개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 34개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 36개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 37개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 38개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 39개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 40개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 41개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 42개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 43개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 가닥은 10 내지 42개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 10개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 11개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 12개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 13개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 14개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 26개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 27개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 28개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 29개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 30개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 31개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 32개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 33개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 34개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 36개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 37개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 38개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 39개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 40개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 41개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 42개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 가닥은 10 내지 41개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 10개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 11개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 12개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 13개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 14개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 26개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 27개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 28개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 29개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 30개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 31개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 32개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 33개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 34개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 36개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 37개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 38개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 39개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 40개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 41개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 가닥은 10 내지 40개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 10개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 11개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 12개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 13개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 14개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 26개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 27개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 28개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 29개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 30개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 31개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 32개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 33개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 34개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 36개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 37개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 38개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 39개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 40개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 가닥은 10 내지 39개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 10개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 11개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 12개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 13개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 14개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 26개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 27개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 28개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 29개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 30개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 31개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 32개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 33개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 34개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 36개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 37개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 38개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 39개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 가닥은 10 내지 38개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 10개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 11개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 12개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 13개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 14개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 26개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 27개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 28개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 29개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 30개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 31개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 32개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 33개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 34개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 36개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 37개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 38개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 가닥은 10 내지 37개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 10개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 11개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 12개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 13개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 14개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 26개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 27개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 28개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 29개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 30개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 31개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 32개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 33개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 34개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 36개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 37개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 가닥은 10 내지 36개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 10개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 11개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 12개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 13개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 14개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 26개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 27개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 28개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 29개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 30개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 31개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 32개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 33개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 34개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 36개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 가닥은 10 내지 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 10개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 11개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 12개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 13개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 14개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 26개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 27개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 28개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 29개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 30개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 31개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 32개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 33개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 34개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 가닥은 11 내지 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 11개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 12개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 13개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 14개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 26개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 27개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 28개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 29개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 30개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 31개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 32개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 33개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 34개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 가닥은 12 내지 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 12개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 13개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 14개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 26개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 27개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 28개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 29개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 30개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 31개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 32개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 33개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 34개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 가닥은 13 내지 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 13개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 14개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 26개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 27개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 28개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 29개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 30개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 31개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 32개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 33개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 34개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 가닥은 14 내지 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 14개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 26개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 27개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 28개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 29개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 30개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 31개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 32개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 33개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 34개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 가닥은 15 내지 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 (예를 들어, 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 26개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 27개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 28개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 29개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 30개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 31개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 32개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 33개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 34개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 35개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함한다.
일부 실시양태에서, siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 상기 기재된 바와 같음)을 포함하고, 안티센스 가닥은 15 내지 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이, 예컨대 16 내지 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이, 17 내지 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이, 18 내지 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이, 또는 19 내지 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 상기 기재된 바와 같음)을 포함하고, 센스 가닥은 10 내지 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이, 예컨대 11 내지 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이, 12 내지 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이, 13 내지 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이 또는 14 내지 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 10개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 11개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 12개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 13개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 14개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥은 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 상기 기재된 바와 같음)을 포함하고, 안티센스 가닥은 15 내지 25개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖고 센스 가닥은 10 내지 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 16 내지 24개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖고 센스 가닥은 11 내지 19개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 17 내지 23개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖고 센스 가닥은 12 내지 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 18 내지 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖고 센스 가닥은 13 내지 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 안티센스 가닥은 19 내지 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖고 센스 가닥은 14 내지 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 상기 기재된 바와 같음)을 포함하고, 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖고 센스 가닥은 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 상기 기재된 바와 같음)을 포함하고, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖고 센스 가닥은 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 상기 기재된 바와 같음)을 포함하고, 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖고 센스 가닥은 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다.
일부 실시양태에서, siRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥 (예를 들어, 상기 기재된 바와 같음)을 포함하고, 안티센스 가닥은 21개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖고 센스 가닥은 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는다.
일반적으로, siRNA는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 다음 프로토콜을 사용하여 설계할 수 있다:
1. siRNA는 대립유전자 다형태를 포함하는 표적 서열에 특이적일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 제1 가닥은 대립유전자 다형태를 포함하는 표적 서열에 대해 하나의 미스매치를 갖는 대립유전자 다형태를 포함하는 표적 서열에 실질적으로 상보적이고, 다른 가닥은 제1 가닥에 실질적으로 상보적이다. 실시양태에서, 표적 서열은 표적 유전자의 코딩 영역 외부에 존재한다. 예시적인 표적 서열은 표적 유전자의 5' 비번역 영역 (5'-UTR) 또는 인트론 영역으로부터 선택된다. 이들 부위에서 mRNA의 절단은 해당하는 돌연변이 단백질의 번역을 제거해야 한다. htt 유전자의 다른 영역의 표적 서열이 또한 표적화에 적합하다. 센스 가닥은 표적 서열을 기반으로 설계된다. 또한, 더 낮은 G/C 함량 (35 내지 55%)을 갖는 siRNA는 55%보다 높은 G/C 함량을 갖는 siRNA보다 더 활성일 수 있다. 따라서, 일 실시양태에서, 본 개시내용은 35 내지 55% G/C 함량을 갖는 핵산 분자를 포함한다.
2. siRNA의 센스 가닥은 선택된 표적 부위의 서열 및 대립유전자 다형태의 위치에 기반하여 설계된다. 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 PKR 반응을 유도하지 않는다 (즉, 충분히 짧은 길이를 가짐). 그러나 더 긴 RNA 침묵화 제제는 예를 들어 PKR 반응을 생성할 수 없는 세포 유형이나 PKR 반응이 하향 조절되거나 대체 수단에 의해 약화되는 상황에서 유용할 수 있다.
본 개시내용의 siRNA 분자는 siRNA가 RNAi를 매개할 수 있도록 표적 서열과 충분한 상보성을 갖는다. 일반적으로, 표적 유전자의 RISC-매개 절단에 영향을 미치도록 표적 유전자의 표적 서열 부분과 충분히 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 siRNA가 사용된다. 따라서, 예시적인 실시양태에서, siRNA의 센스 가닥은 대립유전자 다형태를 포함하는 표적 부분과 충분히 동일한 서열을 갖도록 설계되어야 한다. 본 개시내용은 RNAi의 효율성 및 특이성을 향상시키기 위해 특정 서열 변이가 가능할 수 있다는 이점이 있다. 일 양상에서, 센스 가닥은 대립유전자 다형태를 포함하는 표적 영역, 예를 들어 야생형 대립유전자와 돌연변이 대립유전자 사이에 적어도 하나의 염기쌍이 다른 표적 영역, 예를 들어, 기능 획득 돌연변이를 포함하는 표적 영역과 미스매치된 1개의 뉴클레오타이드를 갖고, 다른 가닥은 제1 가닥과 동일하거나 실질적으로 동일하다. 일부 실시양태에서, 미스매치는 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드의 4개의 뉴클레오타이드 상류, 3개의 뉴클레오타이드 상류, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드의 2개의 뉴클레오타이드 상류, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드의 1개의 뉴클레오타이드 상류, 1개의 뉴클레오타이드 하류, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드의 2개의 뉴클레오타이드 하류, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드의 3개의 뉴클레오타이드 하류, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드의 4개의 뉴클레오타이드 하류, 또는 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드의 5개의 뉴클레오타이드 하류에 존재한다. 일부 실시양태에서, 미스매치는 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드에 인접하지 않는다. 또한, 1개 또는 2개의 뉴클레오타이드의 작은 삽입 또는 결실을 갖는 siRNA 서열이 또한 RNAi를 매개하는데 효과적일 수 있다. 대안적으로, 뉴클레오타이드 유사체 치환 또는 삽입을 갖는 siRNA 서열은 억제에 효과적일 수 있다.
서열 동일성은 당업계에 공지된 서열 비교 및 정렬 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 2개의 핵산 서열 (또는 2개의 아미노산 서열)의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다 (예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제1 서열 또는 제2 서열에 갭이 도입될 수 있음). 그 후, 해당하는 뉴클레오타이드 (또는 아미노산) 위치에서 뉴클레오타이드 (또는 아미노산 잔기)가 비교된다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 해당 위치와 동일한 잔기에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열 사이의 동일성 퍼센트는 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수이며 (즉, 상동성 퍼센트 (%) = 동일한 위치의 수 / 총 위치 수 x 100), 선택적으로 도입된 갭의 수 및/또는 도입된 갭의 길이의 점수에 대해 패널티가 적용된다.
2개의 서열 간의 서열의 비교 및 동일성 퍼센트 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 일 실시양태에서, 충분한 동일성을 갖는 정렬된 서열의 특정 부분에 걸쳐 생성된 정렬은 동일성 정도가 낮은 부분 (즉, 국소 정렬)에 대해서는 그렇지 않다. 서열의 비교에 사용되는 국소 정렬 알고리즘의 예시적이고 비제한적인 예는 문헌[Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77]에서와 같이 변형된 문헌[Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 BLAST 프로그램 (버전 2.0)에 혼입된다.
다른 실시양태에서, 정렬은 적절한 갭을 도입함으로써 최적화되고, 동일성 퍼센트는 정렬된 서열의 길이에 걸쳐 결정된다 (즉, 갭 정렬). 비교 목적을 위한 갭 정렬을 획득하기 위해 Gapped BLAST는 문헌[Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 정렬은 적절한 갭을 도입함으로써 최적화되고 동일성 퍼센트는 정렬된 서열의 전체 길이에 걸쳐 결정된다 (즉, 전역 정렬). 서열의 전체 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 예시적이고 비제한적인 예는 문헌[Myers and Miller, CABIOS (1989)]의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 혼입된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 사용할 때, PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용할 수 있다.
3. siRNA의 안티센스 또는 가이드 가닥은 통상적으로 센스 가닥과 동일한 길이이고 상보적 뉴클레오타이드를 포함한다. 일 실시양태에서, 가이드 및 센스 가닥은 완전히 상보적이며, 즉 이 가닥은 정렬되거나 어닐링될 때 평활 말단이다. 또 다른 실시양태에서, siRNA의 가닥은 1 내지 4개, 예를 들어 2개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 갖는 방식으로 쌍을 형성할 수 있다. 오버행은 표적 유전자 서열 (또는 이의 상보체)에 해당하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다 (또는 이로 구성될 수 있음). 대안적으로, 오버행은 데옥시리보뉴클레오타이드, 예를 들어 dT, 또는 뉴클레오타이드 유사체, 또는 다른 적합한 비-뉴클레오타이드 물질을 포함할 수 있다 (또는 이로 구성될 수 있음). 따라서, 또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 TT와 같은 2개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 가질 수 있다. 오버행 뉴클레오타이드는 RNA 또는 DNA일 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 돌연변이:야생형 미스매치가 퓨린:퓨린 미스매치인 표적 영역을 선택하는 것이 바람직하다.
4. 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여, 잠재적 표적을 적절한 게놈 데이터베이스 (인간, 마우스, 랫트 등)와 비교하고 다른 코딩 서열과 상당한 상동성을 갖는 임의의 표적 서열을 고려에서 제거한다. 이러한 서열 상동성 검색을 위한 한 가지 방법은 BLAST로 알려져 있으며, 이는 미국 국립 생명공학 정보 센터 웹사이트에서 이용할 수 있다.
5. 평가 기준을 충족하는 하나 이상의 서열을 선택한다.
siRNA의 설계 및 사용에 대한 추가 일반 정보는 Max-Plank-Institut fur Biophysikalishe Chemie 웹사이트에서 이용할 수 있는 "siRNA 사용자 가이드"에서 찾을 수 있다.
대안적으로, siRNA는 표적 서열과 혼성화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열 (또는 올리고뉴클레오타이드 서열)로서 기능적으로 규정될 수 있다 (예를 들어, 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 12 내지 16시간 동안 50℃ 또는 70℃에서의 혼성화). 추가적인 예시적인 혼성화 조건은 70℃에서 1xSSC 또는 50℃에서 1xSSC 50% 포름아미드에서 혼성화 후 70℃에서 0.3xSSC로 세척 또는 70℃에서 4xSSC 또는 50℃에서 4xSSC 50% 포름아미드에서 혼성화 다음 67℃에서 1xSSC에서 세척을 포함한다. 길이가 50개 염기쌍 미만일 것으로 예상되는 혼성체의 혼성화 온도는 혼성체의 용융 온도 (Tm)보다 5 내지 10℃ 더 낮아야 하며, Tm은 다음 식에 따라 결정된다. 길이가 18개 염기쌍 미만인 혼성체의 경우, Tm (℃)=2 (A+T 염기의 수)+4 (G+C 염기의 수). 18 내지 49개 염기쌍 길이의 혼성체의 경우, Tm (℃)=81.5+16.6 (log 10[Na+])+0.41 (% G+C)-(600/N), N은 혼성체의 염기의 수이고, [Na+]는 혼성화 완충액의 나트륨 이온 농도이다 (1xSSC의 경우 [Na+]=0.165 M). 폴리뉴클레오타이드 혼성화를 위한 엄격한 조건의 추가 예는 문헌[Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11, and Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4]에 제공되며, 상기 문헌은 모든 목적을 위해 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
음성 대조군 siRNA는 선택된 siRNA와 동일한 뉴클레오타이드 조성을 가져야 하지만 적절한 게놈에 대한 상당한 서열 상보성이 없어야 한다. 이러한 음성 대조군은 선택된 siRNA의 뉴클레오타이드 서열을 무작위로 분절하여 설계할 수 있다. 음성 대조군이 적절한 게놈의 임의의 다른 유전자와 상동성이 없는지 확인하기 위해 상동성 검색을 수행할 수 있다. 또한, 하나 이상의 염기 미스매치를 서열에 도입하여 음성 대조군 siRNA를 설계할 수 있다.
6. siRNA가 표적 mRNA (예를 들어, 야생형 또는 돌연변이 헌팅틴 mRNA)를 파괴하는 효과를 검증하기 위해, siRNA를 드로소필라 (Drosophila) 기반 시험관내 mRNA 발현 시스템에서 표적 cDNA (예를 들어, 헌팅틴 cDNA)와 함께 인큐베이션할 수 있다. 32P로 방사성 표지된 새로 합성한 표적 mRNA (예를 들어, 헌팅틴 mRNA)를 아가로스 겔에서 방사선 사진으로 검출한다. 절단된 표적 mRNA의 존재는 mRNA 뉴클레아제 활성을 나타낸다. 적절한 대조군에는 siRNA의 비포함과 비표적 cDNA의 사용이 포함된다. 대안적으로, 대조군 siRNA는 선택된 siRNA와 동일한 뉴클레오타이드 조성을 갖지만 적절한 표적 유전자에 대한 상당한 서열 상보성이 없는 것으로 선택된다. 이러한 음성 대조군은 선택된 siRNA의 뉴클레오타이드 서열을 무작위로 분절하여 설계할 수 있다. 음성 대조군이 적절한 게놈의 임의의 다른 유전자와 상동성이 없는지 확인하기 위해 상동성 검색을 수행할 수 있다. 또한, 하나 이상의 염기 미스매치를 서열에 도입하여 음성 대조군 siRNA를 설계할 수 있다.
siRNA는 상기 기재된 임의의 표적 서열을 표적화하도록 설계될 수 있다. 상기 siRNA는 표적 서열의 침묵화를 매개하기 위해 표적 서열과 충분히 상보적인 안티센스 가닥을 포함한다. 특정 실시양태에서, RNA 침묵화 제제는 siRNA이다.
siRNA-mRNA 상보성 부위를 선택하고, 이는 최적의 mRNA 특이성 및 최대 mRNA 절단을 초래한다.
siRNA 유사 분자
본 개시내용의 siRNA-유사 분자는 RNAi 또는 번역 억제에 의한 유전자 침묵화를 유도하기 위해 mRNA (예를 들어, htt mRNA)의 표적 서열에 "충분히 상보적인" 서열 (즉, 서열을 갖는 가닥을 가짐)을 갖는다. siRNA 유사 분자는 siRNA 분자와 동일한 방식으로 설계되지만 센스 가닥과 표적 RNA 사이의 서열 동일성 정도는 miRNA와 표적 사이에서 관찰되는 것과 유사하다. 일반적으로 miRNA 서열과 해당 표적 유전자 서열 사이의 서열 동일성 정도가 감소할수록 RNAi보다는 번역 억제에 의해 전사 후 유전자 침묵화를 매개하는 경향이 증가한다. 따라서, 표적 유전자의 번역 억제에 의한 전사후 유전자 침묵화가 요구되는 대안적인 실시양태에서, miRNA 서열은 표적 유전자 서열과 부분적으로 상보성을 갖는다. 특정 실시양태에서, miRNA 서열은 표적 mRNA (예를 들어, 표적 mRNA의 3'-UTR) 내에 분산된 하나 이상의 짧은 서열 (상보성 부위)과 부분적으로 상보성을 갖는다 (문헌[Hutvagner and Zamore, Science, 2002; Zeng et al. al., Mol. Cell, 2002; Zeng et al., RNA, 2003; Doench et al., Genes & Dev., 2003]). 번역 억제의 기전이 협력적이기 때문에, 특정 실시양태에서 다중 상보성 부위 (예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 6)가 표적화될 수 있다.
RNAi 또는 번역 억제를 매개하는 siRNA-유사 이중체의 능력은 상보성 부위에서 표적 유전자 서열과 침묵화 제제의 뉴클레오타이드 서열 사이의 동일하지 않은 뉴클레오타이드의 분포에 의해 예측될 수 있다. 번역 억제에 의한 유전자 침묵화가 요구되는 일 실시양태에서, miRNA 가이드 가닥 및 표적 mRNA에 의해 형성된 이중체가 중심 "팽대부"를 포함하도록 상보성 부위의 중심 부분에 적어도 하나의 동일하지 않은 뉴클레오타이드가 존재한다 (문헌[Doench JG et al., Genes & Dev., 2003]). 또 다른 실시양태에서, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 인접하거나 인접하지 않은 동일하지 않은 뉴클레오타이드가 도입된다. 동일하지 않은 뉴클레오타이드는 워블 염기쌍 (wobble base pair) (예를 들어, G:U) 또는 미스매치 염기쌍 (G:A, C:A, C:U, G:G, A:A, C:C, U:U)을 형성하는 것으로 선택될 수 있다. 추가의 예시적인 실시양태에서, "팽대부"는 miRNA 분자의 5' 말단으로부터 뉴클레오타이드 위치 12 및 13에 중심을 두고 있다.
변형된 RNA 침묵화 제제
본 개시내용의 특정 양상에서, 상기 기재된 바와 같은 개시내용의 RNA 침묵화 제제 (또는 이의 임의의 부분)는 제제의 활성이 추가로 개선되도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 상기 기재된 RNA 침묵화 제제는 하기 기재된 임의의 변형으로 변형될 수 있다. 부분적으로 표적 확인을 더욱 향상시키고, 제제의 안정성을 향상시키고 (예를 들어, 분해를 방지하고), 세포 흡수를 촉진하고, 표적 효율을 향상시키고, (예를 들어, 표적에 대한) 결합에서 효능을 개선하고, 제제에 대한 환자 내성을 개선하고/거나 독성을 감소시키기 위해 변형을 수행할 수 있다.
1) 표적 확인 향상을 위한 변형
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 단일 뉴클레오타이드 표적 확인을 향상시키기 위해 불안정화 뉴클레오타이드로 치환될 수 있다 (2007년 1월 25일에 출원된 미국 출원 제 11/698,689호 및 2006년 1월 25일에 출원된 미국 가출원 제 60/762,225호 참조, 상기 문헌 둘 모두 본 명세서에 참조로 포함됨). 이러한 변형은 표적 mRNA (예를 들어, 기능 획득 돌연변이 mRNA)에 대한 RNA 침묵화 제제의 특이성에 상당한 영향을 미치지 않으면서 비표적 mRNA (예를 들어, 야생형 mRNA)에 대한 RNA 침묵화 제제의 특이성을 제거하기에 충분할 수 있다.
특정 예시적 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 이의 안티센스 가닥에 적어도 하나의 통상적인 뉴클레오타이드의 도입에 의해 변형된다. 보편적인 뉴클레오타이드는 4개의 통상적인 뉴클레오타이드 염기 (예를 들어, A, G, C, U) 중 임의의 것과 비확인적으로 염기 쌍을 형성할 수 있는 염기 부분을 포함한다. 보편적인 뉴클레오타이드는 RNA 이중체 또는 RNA 침묵화 제제의 가이드 가닥과 표적 mRNA에 의해 형성되는 이중체의 안정성에 비교적 작은 영향을 미치기 때문에 일반적으로 사용된다. 예시적인 보편적 뉴클레오타이드는 데옥시이노신 (예를 들어, 2'-데옥시이노신), 7-데아자-2'-데옥시이노신, 2'-아자-2'-데옥시이노신, PNA-이노신, 모르폴리노-이노신, LNA-이노신, 포스포라미데이트-이노신, 2'-O-메톡시에틸-이노신, 및 2'-OMe-이노신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 이노신 염기 부분 또는 이노신 유사체 염기 부분을 갖는 것을 포함한다. 특히 예시적인 실시양태에서, 보편적 뉴클레오타이드는 이노신 잔기 또는 이의 천연 유사체이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 특이성 결정 뉴클레오타이드로부터의 11개 뉴클레오타이드 내 (예를 들어, 질병-관련 다형태를 인식하는 뉴클레오타이드로부터 11개 뉴클레오타이드 (예를 들어, SNP 위치 뉴클레오타이드) 내) 적어도 하나의 불안정화 뉴클레오타이드의 도입에 의해 변형된다. 예를 들어, 불안정화 뉴클레오타이드는 특이성 결정 뉴클레오타이드로부터 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 뉴클레오타이드 (들) 이내인 위치에 도입될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 불안정화 뉴클레오타이드는 특이성 결정 뉴클레오타이드로부터 3개의 뉴클레오타이드인 위치에 도입된다 (즉, 따라서 불안정화 뉴클레오타이드와 특이성 결정 뉴클레오타이드 사이에 2개의 안정화 뉴클레오타이드가 존재할 수 있음). 2개의 가닥 또는 가닥 부분을 갖는 RNA 침묵화 제제 (예를 들어, siRNA 및 shRNA)에서, 불안정화 뉴클레오타이드는 특이성 결정 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 가닥 또는 가닥 부분에 도입될 수 있다. 특정 예시적인 실시양태에서, 불안정화 뉴클레오타이드는 특이성 결정 뉴클레오타이드를 포함하는 동일한 가닥 또는 가닥 부분에 도입된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 화학식 1의 변형된 하위단위간 연결의 도입에 의해 변형된다:
Figure pct00001
(1)
상기 식에서,
D는 O, OCH2, OCH, CH2, 및 CH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
C는 O-, OH, OR1, NH-, NH2, S-, 및 SH로 이루어진 군으로부터 선택되고;
A는 O 및 CH2로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R1은 보호기이고;
Figure pct00002
은 선택적 이중 결합이고;
하위단위간은 2개의 선택적으로 변형된 뉴클레오사이드를 연결한다
실시양태에서, C는 O-인 경우, A 또는 D는 O이 아니다.
실시양태에서, D는 CH2이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 VIII의 변형된 하위단위간 연결은 화학식 2의 변형된 하위단위간 연결이다:
Figure pct00003
(2)
실시양태에서, D는 O이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 VIII의 변형된 하위단위간 연결은 화학식 3의 변형된 하위단위간 연결이다:
Figure pct00004
(3)
실시양태에서, D는 CH이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 VIII의 변형된 하위단위간 연결은 화학식 4의 변형된 하위단위간 연결이다:
Figure pct00005
(4)
또 다른 실시양태에서, 변형된 하위단위간 연결은 화학식 5의 변형된 하위단위간 연결이다:
Figure pct00006
(5).
실시양태에서, D는 OCH2이다. 또 다른 실시양태에서, 변형된 하위단위간 연결은 화학식 6의 변형된 하위단위간 연결이다:
Figure pct00007
(6).
또 다른 실시양태에서, 화학식 VII의 변형된 하위단위간 연결은 화학식 7의 변형된 하위단위간 연결이다:
Figure pct00008
(7).
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 도 18의 하위단위간 링커 중 하나 이상의 도입에 의해 변형된다. 예시적인 실시양태에서, 도 43의 하위단위간 링커는 안티센스 가닥의 SNP 위치 뉴클레오타이드의 어느 한쪽 및 이에 바로 인접하는 위치의 뉴클레오타이드와 SNP 위치 뉴클레오타이드 사이에 삽입된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 하기 화학식을 갖는 하위단위간 링커에 하나 이상의 비닐 포스포네이트 (VP) 모티프의 도입에 의해 변형된다:
Figure pct00009
.
특정 실시양태에서, VP 모티프는 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, RNA의 임의의 위치 (들)에 삽입된다. 예를 들어, 20개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 올리고뉴클레오타이드의 경우, VP 모티프는 위치 1 내지 2, 2 내지 3, 3 내지 4, 4 내지 5, 5 내지 6, 6 내지 7, 7 내지 8, 8 내지 9, 9 내지 10, 10 내지 11, 11 내지 12, 12 내지 13, 13 내지 14, 14 내지 15, 15 내지 16, 16 내지 17, 17 내지 18, 18 내지 19 또는 19 내지 20 및 이의 임의의 조합에 삽입될 수 있다.
특정의 예시적인 실시양태에서, VP 모티프는 안티센스 가닥의 위치 1 내지 2, 5 내지 6, 6 내지 7, 10 내지 11, 18 내지 19 및/또는 19 내지 20 중 하나 이상에 삽입된다.
다른 예시적인 실시양태에서, VP 모티프는 안티센스 가닥의 위치 1 내지 2, 6 내지 7, 10 내지 11 및/또는 19 내지 20 중 하나 이상에 삽입된다.
예시적인 실시양태에서, VP 모티프는 안티센스 가닥의 SNP 위치 뉴클레오타이드 (즉, 이의 어느 한쪽 및 이에 바로 인접하는 위치의 뉴클레오타이드와 SNP 위치 뉴클레오타이드 사이) 다음에 삽입된다. 또 다른 예시적 실시양태에서, VP 모티프는 안티센스 가닥의 MM 위치 뉴클레오타이드 (즉, 이의 어느 한쪽 및 이에 바로 인접하는 위치의 뉴클레오타이드와 MM 위치 뉴클레오타이드 사이) 다음에 삽입된다.
2) 효능 및 특이성을 향상시키기 위한 변형
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 비대칭 설계 규칙에 따라 RNAi를 매개하는데 있어서 향상된 효능 및 특이성을 촉진하도록 변이될 수 있다 (미국 특허 제 8,309,704호, 제 7,750,144호, 제 8,304,530호, 제 8,329,892호 및 제 8,309,705호 참조). 이러한 변이는 안티센스 가닥이 표적 mRNA의 절단 또는 번역 억제를 우선적으로 유도하여 따라서 표적 절단 및 침묵화의 효율이 증가되거나 개선되도록 siRNA (예를 들어, 본 개시내용의 방법을 사용하여 설계된 siRNA 또는 shRNA로부터 생성된 siRNA)의 안티센스 가닥이 센스 가닥에 유리하게 RISC로 유입되는 것을 촉진한다. 예시적인 실시양태에서, RNA 침묵화 제제의 비대칭성은 RNA 침묵화 제제의 안티센스 가닥 5' 말단 (AS 5')과 센스 가닥 3' 말단 (S 3') 사이의 염기쌍 강도를 상기 RNA 침묵화 제제의 안티센스 가닥 3' 말단 (AS 3') 및 센스 가닥 5' 말단 (S '5) 사이의 결합 강도 또는 염기쌍 강도에 비해 감소시킴으로써 향상된다.
일 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제의 비대칭성은 제1 또는 안티센스 가닥의 3' 말단과 센스 가닥 부분의 5' 말단 사이보다 제1 또는 안티센스 가닥의 5' 말단과 센스 가닥 부분의 3' 말단 사이에 더 적은 G:C 염기쌍이 있도록 향상될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제의 비대칭성은 제1 또는 안티센스 가닥의 5' 말단과 센스 가닥 부분의 3' 말단 사이에 적어도 하나의 미스매치 염기쌍이 있도록 향상될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 미스매치 염기쌍은 G:A, C:A, C:U, G:G, A:A, C:C 및 U:U로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제의 비대칭성은 제1 또는 안티센스 가닥의 5' 말단과 센스 가닥 부분의 3' 말단 사이에 적어도 하나의 워블 염기쌍, 예를 들어, G:U가 있도록 향상될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제의 비대칭성은 희귀 뉴클레오타이드, 예를 들어, 이노신 (I)을 포함하는 적어도 하나의 염기쌍이 있도록 향상될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 염기쌍은 I:A, I:U 및 I:C로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제의 비대칭성은 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 염기쌍이 있도록 향상될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오타이드는 2-아미노-G, 2-아미노-A, 2,6-디아미노-G, 및 2,6-디아미노-A로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 하기 화학식을 갖는 비닐 포스포네이트 (VP) 모티프의 도입에 의해 올리고뉴클레오타이드에서 하나 이상의 하위단위간 연결에서 변이된다:
Figure pct00010
.
3) 안정성이 향상된 RNA 침묵화 제제
본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 세포 배양을 위한 혈청 또는 성장 배지에서 안정성이 개선되도록 변형될 수 있다. 안정성을 향상시키기 위해, 3'-잔기는 분해에 대해 안정화될 수 있으며, 예를 들어 퓨린 뉴클레오타이드, 특히 아데노신 또는 구아노신 뉴클레오타이드로 구성되도록 선택될 수 있다. 대안적으로, 변형된 유사체에 의한 피리미딘 뉴클레오타이드의 치환, 예를 들어 2'-데옥시티미딘에 의한 우리딘의 치환은 허용되며 RNA 간섭의 효율에 영향을 미치지 않는다.
특정 양상에서, 본 개시내용은 제1 및 제2 가닥을 포함하는 RNA 침묵화 제제를 특징으로 하며, 제2 가닥 및/또는 제1 가닥은 내부 뉴클레오타이드를 변형된 뉴클레오타이드로 치환함으로써 변형되어 생체내 안정성이 해당하는 비변형 RNA 침묵화 제제에 비교하여 향상된다. 본 명세서에 규정된 바와 같이, "내부" 뉴클레오타이드는 핵산 분자, 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 또는 3' 말단 이외의 임의의 위치에서 존재하는 것이다. 내부 뉴클레오타이드는 단일 가닥 분자 내에 또는 이중체 또는 이중 가닥 분자의 가닥 내에 있을 수 있다. 일 실시양태에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 적어도 하나의 내부 뉴클레오타이드의 치환에 의해 변형된다. 또 다른 실시양태에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상의 내부 뉴클레오타이드의 치환에 의해 변형된다. 또 다른 실시양태에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 내부 뉴클레오타이드의 치환에 의해 변형된다. 또 다른 실시양태에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 모든 내부 뉴클레오타이드의 치환에 의해 변형된다.
본 개시내용의 특정 실시양태에서, RNA 침묵화 제제는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 유사체는 표적-특이적 침묵화 활성, 예를 들어, RNAi 매개 활성 또는 번역 억제 활성이 실질적으로 영향을 받지 않는 위치, 예를 들어, siRNA 분자의 5'-말단 및/또는 3'-말단의 영역에 위치할 수 있다. 특히, 말단은 변형된 뉴클레오타이드 유사체를 혼입함으로써 안정화될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 하기 화학식을 갖는 비닐 포스포네이트 (VP) 모티프의 도입에 의해 올리고뉴클레오타이드에서 하나 이상의 하위단위간 연결에서 변이된다:
Figure pct00011
.
다양한 올리고뉴클레오타이드 유형 (예를 들어, 갭 인자, 혼합 인자, miRNA 억제제, 스플라이싱-전환 올리고뉴클레오타이드 ("SSO"), 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드 ("PMO"), 펩타이드 핵산 ("PNA") 등)은 본 명세서 및 예를 들어 미국 제 15/089,423호; 미국 제 15/236,051호; 미국 제 15/419,593;호 미국 제 15/697,120호 및 미국 특허 제 9,809,817호; 및 미국 제 15/814,350호 및 미국 특허 제 9,862,350호에 기재된 변형 (예를 들어, 화학적 변형) 및/또는 접합의 다양한 조합을 선택적으로 활용하여 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오타이드에 사용될 수 있으며, 상기 문헌은 모든 목적을 위해 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
예시적인 뉴클레오타이드 유사체는 당- 및/또는 골격-변형된 리보뉴클레오타이드 (즉, 포스페이트-당 골격에 대한 변형을 포함함)를 포함한다. 예를 들어, 천연 RNA의 포스포디에스테르 결합은 질소 또는 황 헤테로원자 중 적어도 하나를 포함하도록 변형될 수 있다. 예시적인 골격-변형된 리보뉴클레오타이드에서, 인접한 리보뉴클레오타이드에 연결되는 포스포에스테르기는 변형된 기, 예를 들어 포스포티오에이트 기로 대체된다. 예시적인 당-변형 리보뉴클레오타이드에서, 2' OH-기는 H, OR, R, 할로, SH, SR, NH2, NHR, NR2 또는 ON으로부터 선택된 기로 대체되고, R은 C1-C6 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 할로는 F, Cl, Br 또는 I이다.
특정 실시양태에서, 변형은 2'-플루오로, 2'-아미노 및/또는 2'-티오 변형이다. 특히 예시적인 변형은 2'-플루오로-시티딘, 2'-플루오로-우리딘, 2'-플루오로-아데노신, 2'-플루오로-구아노신, 2'-아미노-시티딘, 2'-아미노-우리딘, 2'-아미노-아데노신, 2'-아미노-구아노신, 2,6-디아미노퓨린, 4-티오-우리딘, 및/또는 5-아미노-알릴-우리딘을 포함한다. 특정 실시양태에서, 2'-플루오로 리보뉴클레오타이드는 모든 우리딘 및 시티딘이다. 추가적인 예시적인 변형은 5-브로모-우리딘, 5-요오도-우리딘, 5-메틸-시티딘, 리보-티미딘, 2-아미노퓨린, 2'-아미노-부티릴-피렌-우리딘, 5-플루오로-시티딘, 및 5- 플루오로 우리딘을 포함한다. 2'-데옥시-뉴클레오타이드 및 2'-Ome 뉴클레오타이드는 또한 본 개시내용의 변형된 RNA-침묵화 제제 모이어티 내에서 사용될 수 있다. 추가 변형된 잔기에는 데옥시-무염기성, 이노신, N3-메틸-우리딘, N6,N6-디메틸-아데노신, 슈도우리딘, 퓨린 리보뉴클레오사이드 및 리바비린이 포함된다. 특히 예시적인 실시양태에서, 2' 모이어티는 연결 모이어티는 메틸기이며, 따라서 2'-O-메틸 올리고뉴클레오타이드가 된다.
예시적인 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 잠금 핵산 (LNA)을 포함한다. LNA는 뉴클레아제 활성에 내성이고 (매우 안정적임) mRNA에 대한 단일 뉴클레오타이드 확인을 갖는 당-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다 (문헌[Elmen et al., Nucleic Acids Res., (2005), 33(1): 439-447; Braasch et al. (2003) Biochemistry 42:7967-7975, Petersen et al. (2003) Trends Biotechnol. 21:74-81]). 이러한 분자는 2'-데옥시-2''-플루오로우리딘과 같은 변형이 가능한 2'-O,4'-C-에틸렌 가교 핵산을 가지고 있다. 더욱이, LNA는 당 모이어티를 3'-말단 형태로 제한함으로써 올리고뉴클레오타이드의 특이성을 증가시켜 염기쌍 형성을 위해 뉴클레오타이드를 사전에 구성하고 올리고뉴클레오타이드의 용융 온도를 염기당 10℃만큼 증가시킨다.
또 다른 예시적 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 펩타이드 핵산 (PNA)을 포함한다. PNA는 뉴클레오타이드의 당 포스페이트 부분이 뉴클레아제 분해에 대해 내성이 높고 분자에 향상된 결합 특이성을 부여하는 폴리아미드 골격을 형성할 수 있는 중성 2-아미노 에틸글리신 모이어티로 대체된 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다 (문헌[Nielsen, et al., Science, (2001), 254: 1497-1500]).
특정 예시적인 실시양태에서, 천연 핵염기 대신에 적어도 하나의 비-천연 핵염기를 포함하는 핵염기-변형된 리보뉴클레오타이드, 즉, 리보뉴클레오타이드가 사용된다. 염기는 아데노신 데아미나제의 활성이 차단되도록 변형될 수 있다. 예시적인 변형된 핵염기는 다음에 제한되는 것은 아니나, 5-위치에서 변형된 우리딘 및/또는 시티딘, 예를 들어 5-(2-아미노)프로필 우리딘, 5-브로모 우리딘; 8 위치에서 변형된 아데노신 및/또는 구아노신, 예를 들어 8-브로모 구아노신; 데아자 뉴클레오타이드, 예를 들어 7-데아자-아데노신; O- 및 N-알킬화 뉴클레오타이드, 예를 들어 N6-메틸 아데노신이 적합하다. 위의 변형이 결합될 수 있음에 유의해야 한다.
다른 실시양태에서, 교차 연결은 예를 들어 체내 반감기를 증가시키기 위해 RNA 침묵화 제제의 약동학을 변이하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 핵산의 2개의 상보적 가닥을 갖는 RNA 침묵화 제제를 포함하고, 2개의 가닥은 교차 연결된다. 본 개시내용은 또한 다른 모이어티 (예를 들어, 펩타이드와 같은 비핵산 모이어티), 유기 화합물 (예를 들어, 염료) 등)에 접합되거나 접합되지 않은 (예를 들어, 3' 말단) RNA 침묵화 제제를 포함한다. 이러한 방식으로 siRNA 유도체를 변형하면 해당하는 siRNA와 비교하여 생성된 siRNA 유도체의 세포 흡수를 개선하거나 세포 표적화 활성을 향상시킬 수 있거나, 세포에서 siRNA 유도체를 추적하는데 유용하거나, 해당하는 siRNA와 비교하여 siRNA 유도체의 안정성을 개선할 수 있다.
다른 예시적인 변형은 다음을 포함한다: (a) 2' 변형, 예를 들어, 센스 또는 안티센스 가닥, 특히 센스 가닥에서 U 상의 2'-OMe 모이어티의 제공, 또는 3' 오버행, 예를 들어 3' 말단의 2'-OMe 모이어티의 제공 (관련하여 제시된 바와 같이, 3' 말단은 분자의 3' 원자 또는 가장 말단의 3' 모이어티, 예를 들어 가장 말단의 3' P 또는 2' 위치를 의미함); (b) 예를 들어, 골격의 변형, 예를 들어, 포스페이트 골격에서 0로부터 S로 대체, 특히 안티센스 가닥에서 U 또는 A 또는 둘 모두에서 포스포로티오에이트 변형 제공; 예를 들어, P로부터 S로 대체; (c) U로부터 C5 아미노 링커로의 대체; (d) A로부터 G로의 대체 (대부분의 경우 서열 변화는 안티센스 가닥이 아니라 센스 가닥에 위치함); 및 (d) 2', 6', 7' 또는 8' 위치에서의 변형. 예시적인 실시양태는 이들 변형 중 하나 이상이 센스 상에 존재하지만 안티센스 가닥에는 존재하지 않는 실시양태, 또는 안티센스 가닥이 이러한 변형을 더 적게 갖는 실시양태이다. 또 다른 예시적인 변형은 3' 오버행, 예를 들어 3' 말단에서 메틸화된 P의 사용; 2' 변형의 조합, 예를 들어 2'-OMe 모이어티의 제공 및 골격의 변형, 예를 들어 P로부터 S로의 대체, 예를 들어 포스포로티오에이트 변형의 제공, 또는 3' 오버행, 예를 들어 3' 말단에서 메틸화된 P; 3' 알킬로의 변형; 3' 오버행, 예를 들어 3' 말단에서 무염기성 피롤리돈으로의 변형; 나프록센, 이부프로펜 또는 3' 말단에서 분해를 억제하는 다른 모이어티로의 변형을 포함한다.
4) 세포 흡수를 향상시키기 위한 변형
다른 실시양태에서, RNA 침묵화 제제는 예를 들어 표적 세포 (예를 들어, 신경 세포)에 의한 세포 흡수를 향상시키기 위해 화학적 모이어티로 변형될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 다른 모이어티 (예를 들어, 펩타이드와 같은 비핵산 모이어티), 유기 화합물 (예를 들어, 염료) 등에 접합되거나 접합되지 않은 (예를 들어, 3' 말단) RNA 침묵화 제제를 포함한다. 접합은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 문헌[Lambert et al., Drug Deliv. Rev.: 47(1), 99-112 (2001) (폴리알킬시아노아크릴레이트 (PACA) 나노입자에 부가된 핵산 기재); Fattal et al., J. Control Release 53(1-3):137-43 (1998) (나노입자에 결합된 핵산 기재); Schwab et al., Ann. Oncol. 5 Suppl. 4:55-8 (1994) (혼입 제제, 소수성기, 다양이온 또는 PACA 나노입자에 연결된 핵산 기재); 및 Godard et al., Eur. J. Biochem. 232(2):404-10 (1995) (나노입자에 연결된 핵산 기재)]의 방법을 사용하여 달성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제에 대한 변형은 올리고뉴클레오타이드의 하나 이상의 하위단위간 링커에 비닐 포스포네이트 (VP) 모티프를 포함하고, VP 모티프는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00012
.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 친유성 모이어티에 접합된다. 일 실시양태에서, 친유성 모이어티는 양이온성 기를 포함하는 리간드이다. 또 다른 실시양태에서, 친유성 모이어티는 siRNA의 가닥 중 하나 또는 둘 모두에 부착된다. 예시적인 실시양태에서, 친유성 모이어티는 siRNA의 센스 가닥의 한쪽 말단에 부착된다. 다른 예시적인 실시양태에서, 친유성 모이어티는 센스 가닥의 3' 말단에 부착된다. 특정 실시양태에서, 친유성 모이어티는 콜레스테롤, 비타민 E, 비타민 K, 비타민 A, 엽산, 또는 양이온성 염료 (예를 들어, Cy3)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예시적인 실시양태에서, 친유성 모이어티는 콜레스테롤이다. 다른 친유성 모이어티에는 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O (헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥실 기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸 또는 페녹사진이 포함된다.
5) 고정된 리간드
다른 물질이 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제에 연결될 수 있다. 예를 들어, 리간드는 안정성, 표적 핵산과의 혼성화 열역학, 특정 조직 또는 세포 유형에 대한 표적화, 또는 예를 들어 세포내이입-의존성 또는 비의존성 기전에 의한 세포 투과성을 개선하기 위해 RNA 침묵화 제제에 고정된다. 리간드 및 관련 변형은 또한 서열 특이성을 증가시키고 결과적으로 부위 외 표적화를 감소시킬 수 있다. 고정된 리간드는 혼입제로 기능할 수 있는 하나 이상의 변형된 염기 또는 당을 포함할 수 있다. 특정 예시적인 실시양태에서, 이는 RNA 침묵화 제제/표적 이중체의 팽대부와 같은 내부 영역에 위치한다. 혼입제는 방향족, 예를 들어 폴리사이클릭 방향족 또는 헤테로사이클릭 방향족 화합물일 수 있다. 폴리사이클릭 혼입제는 적층 기능을 가질 수 있으며 2, 3 또는 4개의 융합된 고리가 있는 계를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 보편적 염기는 리간드에 포함될 수 있다. 일 실시양태에서, 리간드는 표적 핵산의 절단에 의한 표적 유전자 억제에 관여하는 절단 기를 포함할 수 있다. 절단기는 예를 들어 블레오마이신 (예를 들어, 블레오마이신-A5, 블레오마이신-A2 또는 블레오마이신-B2), 피렌, 페난트롤린 (예를 들어, O-페난트롤린), 폴리아민, 트리펩타이드 (예를 들어, lys-tyr-lys 트리펩타이드), 또는 금속 이온 킬레이트기) 수 있다. 금속 이온 킬레이트기는 예를 들어 Lu (III) 또는 EU (III) 마크로사이클릭 착물, Zn (II) 2,9-디메틸페난트롤린 유도체, Cu (II) 테르피리딘, 또는 아크리딘을 포함할 수 있으며, 이는 Lu (III)과 같은 자유 금속 이온에 의한 팽대부 부위의 표적 RNA의 선택적 절단을 촉진할 수 있다. 일부 실시양태에서, 펩타이드 리간드는 예를 들어 팽대부 영역에서 표적 RNA의 절단을 촉진하기 위해 RNA 침묵화 제제에 고정될 수 있다. 예를 들어, 1,8-디메틸-1,3,6,8,10,13-헥사아자사이클로테트라데칸 (사이클람)은 표적 RNA 절단을 촉진하기 위해 펩타이드에 (예를 들어, 아미노산 유도체에 의해) 접합될 수 있다. 고정된 리간드는 아미노글리코시드 리간드일 수 있으며, 이는 RNA 침묵화 제제가 개선된 혼성화 특성 또는 개선된 서열 특이성을 갖도록 할 수 있다. 예시적인 아미노글리코시드는 글리코실화 폴리리신, 갈락토실화 폴리리신, 네오마이신 B, 토브라마이신, 카나마이신 A, 및 아미노글리코사이드의 아크리딘 접합체, 예컨대 네오-N-아크리딘, 네오-S-아크리딘, 네오-C-아크리딘, 토브라-N-아크리딘, 및 KanaA-N-아크리딘을 포함한다. 아크리딘 유사체의 사용은 서열 특이성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 네오마이신 B는 DNA에 비교하여 RNA에 대한 친화도는 높지만 서열 특이성은 낮다. 아크리딘 유사체인 네오-5-아크리딘은 HIV Rev-반응 요소 (RRE)에 대한 친화도가 증가한다. 일부 실시양태에서, 아미노글리코시드 리간드의 구아니딘 유사체 (구아니디노글리코시드)는 RNA 침묵화 제제에 고정된다. 구아니디노글리코시드에서 아미노산의 아민기는 구아니딘기로 교체된다. 구아니딘 유사체의 부착은 RNA 침묵화 제제의 세포 투과성을 향상시킬 수 있다. 고정된 리간드는 올리고뉴클레오타이드 제제의 세포 흡수를 향상시킬 수 있는 폴리-아르기닌 펩타이드, 펩토이드 또는 펩타이드모방체일 수 있다.
예시적인 리간드는 일반적으로 직접적으로 또는 개재 고정기를 통해 간접적으로 공유 결합되어 리간드-접합 담체에 연결된다. 예시적인 실시양태에서, 리간드는 개재 고정기를 통해 담체에 부착된다. 예시적인 실시양태에서, 리간드는 혼입되는 RNA 침묵화 제제의 분포, 표적화 또는 수명을 변이시킨다. 예시적인 실시양태에서, 리간드는, 예를 들어 이러한 리간드가 부재하는 종에 비교하여, 예를 들어, 분자, 세포 또는 세포 유형, 구획, 예를 들어 세포 또는 기관 구획, 조직, 기관 또는 신체의 영역과 같은 선택된 표적에 대한 향상된 친화도를 제공한다.
예시적인 리간드는 생성된 천연 또는 변형된 RNA 침묵화 제제, 또는 본 명세서에 기재된 단량체 및/또는 천연 또는 변형된 리보뉴클레오타이드의 임의의 조합을 포함하는 중합체 분자의 수송, 혼성화 및 특이성 특성을 개선할 수 있고 또한 뉴클레아제 내성을 개선할 수 있다. 일반적으로 리간드는 예를 들어 흡수를 향상시키기 위한 치료적 변형제; 예를 들어 분포 모니터링을 위한 진단 화합물 또는 리포터기; 교차연결제; 뉴클레아제-내성 부여 모이어티; 및 천연 또는 특이한 핵염기를 포함할 수 있다. 일반적인 예로는 친지질, 지질, 스테로이드 (예를 들어, 우바올, 헤시게닌, 디오스게닌), 테르펜 (예를 들어, 트리테르펜, 예를 들어, 사르사사포게닌, 프리델린, 에피프리델라놀 유도체화 리토콜산), 비타민 (예를 들어, 엽산, 비타민 A, 비오틴), 피리독살, 탄수화물, 단백질, 단백질 결합제, 인테그린 표적화 분자, 다중양이온, 펩타이드, 폴리아민 및 펩타이드 모방체를 포함한다. 리간드는 천연 물질 (예를 들어, 인간 혈청 알부민 (HSA), 저밀도 지단백질 (LDL) 또는 글로불린); 탄수화물 (예를 들어, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 사이클로덱스트린 또는 히알루론산); 아미노산 또는 지질을 포함할 수 있다. 리간드는 또한 합성 중합체, 예를 들어 합성 폴리아미노산과 같은 재조합 또는 합성 분자일 수 있다. 폴리아미노산의 예는 폴리아미노산이 폴리리신 (PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리(L-락타이드-코-글리콜리드) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물, 공중합체, N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체 (HMPA), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리우레탄, 폴리 (2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체, 또는 폴리포스파진을 포함하는 것이다. 폴리아민의 예는 폴리에틸렌이민, 폴리리신 (PLL), 스페르민, 스페르미딘, 폴리아민, 슈도펩타이드-폴리아민, 펩타이드모방체 폴리아민, 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포르피린, 폴리아민의 4차 염, 또는 알파 나선 펩타이드를 포함한다.
리간드는 또한 표적화 기, 예를 들어 세포 또는 조직 표적화제, 예를 들어 렉틴, 당단백질, 지질 또는 단백질, 예를 들어, 신장 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 표적화기는 갑상선 자극 호르몬, 멜라노트로핀, 렉틴, 당단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민, 다가 만노스, 다가 푸코스, 글리코실화된 폴리아미노산, 다가 갈락토스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파테이트, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산, 엽산, 비타민 B12, 비오틴, 또는 RGD 펩타이드 또는 RGD 펩타이드 모방체일 수 있다. 리간드의 다른 예로는 염료, 삽입제 (예를 들어, 아크리딘 및 치환된 아크리딘), 교차연결제 (예를 들어, 소랄렌, 미토마이신 C), 포르피린 (TPPC4, 텍사피린, 사피린), 폴리사이클릭 방향족 탄화수소 (예를 들어, 페나진, 디하이드로페나진, 페난트롤린, 피렌), lys-tyr-lys 트리펩타이드, 아미노글리코시드, 구아니듐 아미노글리코디, 인공 엔도뉴클레아제 (예를 들어, EDTA), 친유성 분자, 예를 들어 콜레스테롤 (및 이의 티오 유사체), 콜산, 콜란산, 리토콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 글리세롤 (예를 들어, 에스테르 (예를 들어, 모노, 비스 또는 트리스 지방산 에스테르, 예를 들어, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, 또는 C20 지방산) 및 이의 에테르, 예를 들어, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, 또는 C20 알킬, 예를 들어 1,3-비스-O (헥사데실)글리세롤, 1,3-비스- O(옥타아데실)글리세롤), 게라닐옥시헥실기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 스테아르산 (예를 들어, 글리세릴 디스테아레이트), 올레산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸 또는 페녹사진) 및 펩타이드 접합체 (예를 들어, 안테나피디아 펩타이드, Tat 펩타이드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 머캅토, PEG (예를 들어, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사성 표지된 마커, 효소, 합텐 (예를 들어, 비오틴), 수송/흡수 촉진제 (예를 들어, 아스피린, 나프록센, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레아제 (예를 들어, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 접합체, 테트라아자매크로사이클의 Eu3+ 착물), 디니트로페닐, HRP 또는 AP를 포함한다.
리간드는 단백질, 예를 들어, 당단백질, 또는 펩타이드, 예를 들어 공동-리간드에 대해 특이적 친화도를 갖는 분자, 또는 항체, 예를 들어 암 세포, 내피 세포 또는 골 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 항체일 수 있다. 리간드는 또한 호르몬 및 호르몬 수용체를 포함할 수 있다. 이는 또한 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민, 보조인자, 다가 락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노스 또는 다가 푸코스와 같은 비-펩타이드 종을 포함할 수 있다. 리간드는 예를 들어 지질다당류, p38 MAP 키나제의 활성화제 또는 NF-κB의 활성화제일 수 있다.
리간드는 예를 들어 세포의 미세소관, 미세섬유 및/또는 또는 중간체 섬유를 파괴함으로써, 예를 들어 세포의 세포골격을 파괴함으로써, 세포로의 RNA 침묵화 제제의 흠수를 증가시킬 수 있는 물질, 예를 들어 약물일 수 있다. 약물은 예를 들어 탁손 (taxon), 빈크리스틴 (vincristine), 빈블라스틴 (vinblastine), 사이토칼라신 (cytochalasin), 노코다졸 (nocodazole), 자플라키놀리드 (japlakinolide), 라트룬쿨린 A (latrunculin A), 팔로이딘 (phalloidin), 스윈홀리드 A (swinholide A), 인다노신 (indanocine) 또는 미오세르빈 (myoservin)일 수 있다. 리간드는 예를 들어 염증 반응을 활성화하여 RNA 침묵화 제제의 세포내 흡수를 증가시킬 수 있다. 이러한 효과를 가질 예시적인 리간드는 종양 괴사 인자 알파 (TNFα), 인터루킨-1 베타, 또는 감마 인터페론을 포함한다.
일 양상에서, 리간드는 지질 또는 지질 기반 분자이다. 이러한 지질 또는 지질 기반 분자는 일반적으로 혈청 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민 (HSA)에 결합한다. HSA 결합 리간드는 표적 조직, 예를 들어 신체의 비-신장 표적 조직에 대한 접합체의 분포를 가능하게 한다. 예를 들어, 표적 조직은 간의 실질 세포를 포함하는 간일 수 있다. HSA에 결합할 수 있는 다른 분자를 또한 리간드로 사용할 수 있다. 예를 들어, 나프록센 (naproxen)이나 아스피린 (aspirin)을 사용할 수 있다. 지질 또는 지질 기반 리간드는 (a) 접합체의 분해에 대한 내성을 증가시키고, (b) 표적 세포 또는 세포막으로의 표적화 또는 수송을 증가시킬 수 있고/거나, (c) 혈청 단백질 예를 들어, HSA에 대한 결합을 조정하는데 사용될 수 있다. 지질 기반 리간드는 조절, 예를 들어 표적 조직에 대한 접합체의 결합을 제어하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 지질 기반 리간드는 HSA에 결합한다. 그러나, 친화도가 너무 강하여 HSA-리간드 결합이 반전될 수 없는 것이 바람직하다. 다른 예시적인 실시양태에서, 지질 기반 리간드는 HSA에 약하게 결합하거나 전혀 결합하지 않는다.
또 다른 양상에서, 리간드는 표적 세포, 예를 들어 증식 세포에 의해 흡수되는 모이어티, 예를 들어 비타민이다. 이는 예를 들어 악성 또는 비악성 유형의 부적절한 세포 증식을 특징으로 하는 장애, 예를 들어 암세포를 치료하는데 특히 유용하다. 예시적인 비타민은 비타민 A, E 및 K를 포함한다. 다른 예시적인 비타민은 B 비타민, 예를 들어 엽산, B12, 리보플라빈, 비오틴, 피리독살 또는 암세포에 의해 흡수되는 다른 비타민 또는 영양소를 포함한다. HSA와 저밀도 지단백 (LDL)이 또한 포함된다.
또 다른 양상에서, 리간드는 세포-투과제, 통상적으로 나선형 세포-투과제이다. 특정 예시적인 실시양태에서, 제제는 양친매성이다. 예시적인 제제는 tat 또는 안테노페디아와 같은 펩타이드이다. 제제가 펩타이드인 경우 펩타이드 모방체, 인버토머 (invertomer), 비펩타이드 또는 유사 펩타이드 연결, D-아미노산 사용을 포함하여 변형될 수 있다. 나선 제제는 일반적으로 친유성 면과 소수성 면을 갖는 알파-나선 제제이다.
리간드는 펩타이드 또는 펩타이드모방체일 수 있다. 펩타이드모방체 (본 명세서에서 올리고펩타이드모방체로도 지칭됨)는 천연 펩타이드와 유사한 소정의 3차원 구조로 접힐 수 있는 분자이다. 올리고뉴클레오타이드 제제에 대한 펩타이드 및 펩타이드모방체의 부착은 세포 인식 및 흡수를 향상시키는 것과 같이 RNA 침묵화 제제의 약동학적 분포에 영향을 미칠 수 있다. 펩타이드 또는 펩타이드모방 모이어티는 약 5 내지 50개 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 아미노산 길이일 수 있다. 펩타이드 또는 펩타이드모방체는 예를 들어 세포 투과 펩타이드, 양이온성 펩타이드, 양친매성 펩타이드, 또는 소수성 펩타이드 (예를 들어, 주로 Tyr, Trp 또는 Phe로 구성됨)일 수 있다. 펩타이드 모이어티는 덴드리머 펩타이드, 구속 펩타이드 또는 교차연결 펩타이드일 수 있다. 펩타이드 모이어티는 L-펩타이드 또는 D-펩타이드일 수 있다. 또 다른 대안에서, 펩타이드 모이어티는 소수성 막 전위 서열 (MTS)을 포함할 수 있다. 펩타이드 또는 펩타이드모방체는 파지 디스플레이 라이브러리 또는 원-비드-원-화합물 (one-bead-one-compound) (OBOC) 조합 라이브러리에서 확인된 펩타이드와 같은 무작위 DNA 서열에 의해 인코딩될 수 있다 (문헌[Lam et al., Nature 354:82-84, 1991]). 예시적인 실시양태에서, 혼입된 단량체 단위를 통해 RNA 침묵화 제제에 고정된 펩타이드 또는 펩타이드모방체는 아르기닌-글리신-아스파르트산 (RGD)-펩타이드 또는 RGD 모방체와 같은 세포 표적화 펩타이드이다. 펩타이드 모이어티는 약 5개 아미노산 내지 약 40개 아미노산의 길이 범위일 수 있다. 펩타이드 모이어티는 안정성을 증가시키거나 입체형태적 특성을 유도하기 위해 구조적 변형을 가질 수 있다. 아래에 기재된 임의의 구조적 변형이 활용될 수 있다.
6) 소수성 모이어티
본 명세서에 제공된 이중 가닥 RNA의 특정 실시양태에서, RNA 분자는 하나 이상의 소수성 모이어티에 접합된다 (PCT 공개 WO 2018/031933 참조, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로 포함됨). 실시양태에서, 소수성 모이어티는 저밀도 지단백질 및/또는 중간 밀도 지단백질에 대한 친화도를 갖는다. 관련된 실시양태에서, 소수성 모이어티는 3개 미만의 이중 결합을 갖는 불포화 또는 포화 모이어티이다.
다른 실시양태에서, 소수성 모이어티는 고밀도 지단백질에 대한 친화도를 갖는다. 관련된 실시양태에서, 소수성 모이어티는 3개 이상의 이중 결합을 갖는 다중불포화 모이어티이다 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 이중 결합을 가짐). 특정 실시양태에서, 소수성 모이어티는 3개의 이중 결합을 갖는 다중불포화 모이어티이다. 특정 실시양태에서, 소수성 모이어티는 4개의 이중 결합을 갖는 다중불포화 모이어티이다. 특정 실시양태에서, 소수성 모이어티는 5개의 이중 결합을 갖는 다중불포화 모이어티이다. 특정 실시양태에서, 소수성 모이어티는 6개의 이중 결합을 갖는 다중불포화 모이어티이다.
또 다른 실시양태에서, 소수성 모이어티는 지방산, 스테로이드, 세코스테로이드, 지질, 강글리오사이드 및 뉴클레오사이드 유사체, 및 엔도카나비노이드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, 소수성 모이어티는 신경조절 지질, 예를 들어, 엔도카나비노이드이다. 엔도칸나비노이드의 비제한적 예에는 아난다미드, 아라키도노일에탄올아민, 2-아라키도닐 글리세릴 에테르 (놀라딘 에테르), 2-아라키도닐 글리세릴 에테르 (놀라딘 에테르), 2-아라키도노일글리세롤, 및 N-아라키도노일 도파민이 포함된다.
다른 실시양태에서, 소수성 모이어티는 오메가-3 지방산이다. 오메가-3 지방산의 비제한적인 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 헥사데카트리엔산 (HTA), 알파-리놀렌산 (ALA), 스테아리돈산 (SDA), 에이코사트리엔산 (ETE), 에이코사테트라엔산 (ETA), 에이코사펜타엔산 (EPA, 팀노돈산), 헤네이코사펜타엔산 (HPA), 도코사펜타엔산 (DPA, 클루파노돈산), 도코사헥사엔산 (DHA, 세르본산), 테트라코사펜타엔산, 테트라코사헥사엔산 (니신산)을 포함한다.
다른 실시양태에서, 소수성 모이어티는 오메가-6 지방산이다. 오메가-6 지방산의 비제한적 예에는 다음에 제한되는 것은 아니나, 리놀레산, 감마-리놀렌산 (GLA), 에이코사디엔산, 디호모-감마-리놀렌산 (DGLA), 아라키돈산 (AA), 도코사디엔산, 아드레닉산, 도코사펜타엔산 (오스본드산), 테트라코사테트라엔산 및 테트라코사펜타엔산이 포함된다.
다른 실시양태에서, 소수성 모이어티는 오메가-9 지방산이다. 오메가-9 지방산의 비제한적 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 올레산, 에이코센산, 미드산, 에루크산 및 네르본산을 포함한다.
다른 실시양태에서, 소수성 모이어티는 접합 리놀렌산이다. 접합 리놀렌산의 비제한적 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, α-칼렌드산, β-칼렌드산, 자카르산, α-엘레오스테아르산, β-엘레오스테아르산, 카탈프산, 및 푸닉산을 포함한다.
다른 실시양태에서, 소수성 모이어티는 포화 지방산이다. 포화 지방산의 비제한적 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 카프릴산, 카프르산, 도코사노산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산, 리그노세르산, 및 세로트산을 포함한다.
다른 실시양태에서, 소수성 모이어티는 루멜렌산, α-파리나르산, β-파리나르산, 보세오펜타엔산, 피놀렌산, 및 포도카르핀산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 산이다.
또 다른 실시양태에서, 소수성 모이어티는 도코사노산 (DCA), 도코사헥사엔산 (DHA), 및 에이코사펜타엔산 (EPA)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 소수성 모이어티는 도코사노산 (DCA)이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 소수성 모이어티는 DHA이다. 또 다른 특정 실시양태에서, 소수성 모이어티는 EPA이다.
또 다른 실시양태에서, 소수성 모이어티는 세코스테로이드이다. 특정 실시양태에서, 소수성 모이어티는 칼시페롤이다. 다른 실시양태에서, 소수성 모이어티는 콜레스테롤 이외의 스테로이드이다.
특정 실시양태에서, 소수성 모이어티는 콜레스테롤이 아니다.
또 다른 실시양태에서, 소수성 모이어티는 다음에 제한되는 것은 아니나, 글리코스핑고지질, 다중불포화 지방산, 세코스테로이드, 스테로이드 호르몬, 또는 스테롤 지질을 포함하는 알킬 사슬, 비타민, 펩타이드, 또는 생리활성 접합체이다.
실시양태에서, 본 명세서에 제공되는 이중 가닥 RNA는 하나 이상의 화학적으로-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 이중 가닥 RNA는 교차되는 2'-메톡시-뉴클레오타이드 및 2'-플루오로-뉴클레오타이드를 포함한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 이중 가닥 RNA의 1개 이상의 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 연결을 통해 인접 뉴클레오타이드에 연결된다. 본 명세서에 개시된 dsRNA의 특정 실시양태에서, 미스매치 뉴클레오타이드 및 미스매치 뉴클레오타이드에 인접한 뉴클레오타이드 (들)는 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드이다.
또 다른 특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공되는 이중 가닥 RNA의 3' 말단으로부터 위치 1 및 2의 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 연결을 통해 인접 뉴클레오타이드에 연결된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 이중 가닥 RNA의 3' 말단으로부터 위치 1 및 2의 뉴클레오타이드 및 이중 가닥 RNA의 5' 말단으로부터 위치 1 및 2의 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 연결을 통해 인접 뉴클레오타이드에 연결된다.
이중 가닥 RNA의 일 실시양태에서, 제1 올리고뉴클레오타이드는 5' 말단, 3' 말단에 적어도 16개의 인접 뉴클레오타이드를 포함하고, 표적에 대해 상보성을 가지며, 상기 식에서,
(1) 제1 올리고뉴클레오타이드는 교차되는 2'-메톡시-뉴클레오타이드 및 2'-플루오로-뉴클레오타이드를 포함하고;
(2) 5' 말단으로부터 위치 2 및 14의 뉴클레오타이드는 2'-메톡시-뉴클레오타이드가 아니고;
(3) 뉴클레오타이드는 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되고;
(4) 3' 말단으로부터 위치 1 내지 6, 또는 3' 말단으로부터 위치 1 내지 7의 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 연결을 통해 인접 뉴클레오타이드에 연결된다.
7) 진보된 안정화 패턴
본 명세서에서 제공되는 이중 가닥 RNA의 일 실시양태에서
(1) 제1 올리고뉴클레오타이드는 교차되는 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드 및 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드를 포함하고, 각각의 뉴클레오타이드는 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드 또는 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드이고; 제1 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14의 뉴클레오타이드는 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드가 아니고;
(2) 제2 올리고뉴클레오타이드는 교차되는 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드 및 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드를 포함하고, 각각의 뉴클레오타이드는 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드 또는 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드이고; 제2 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 위치 2 및 14의 뉴클레오타이드는 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드이고;
(3) 제1 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드는 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 연결을 통해 인접 뉴클레오타이드에 연결되고, 3' 말단으로부터 위치 1 내지 6, 또는 3' 말단으로부터 위치 1 내지 7의 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 연결을 통해 인접 뉴클레오타이드에 연결되고;
(4) 제2 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드는 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 연결을 통해 인접 뉴클레오타이드에 연결되고, 3' 말단으로부터 위치 1 및 2의 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 연결을 통해 인접 뉴클레오타이드에 연결된다.
이중 가닥 RNA의 일 실시양태에서, 제1 올리고뉴클레오타이드는 제2 올리고뉴클레오타이드보다 3 내지 7개 더 많은 리보뉴클레오타이드를 갖는다.
일 실시양태에서, 이중 가닥 RNA는 11 내지 16개 염기쌍 이중체를 포함하고, 각각의 염기쌍 이중체의 뉴클레오타이드는 상이한 화학적 변형을 갖는다 (예를 들어, 하나의 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 변형을 갖고, 다른 뉴클레오타이드는 2'-메톡시를 가짐).
이중 가닥 RNA의 일 실시양태에서, 제1 올리고뉴클레오타이드는 제2 올리고뉴클레오타이드보다 3 내지 7개 더 많은 리보뉴클레오타이드를 갖는다. 또 다른 실시양태에서.
일 실시양태에서, 제1 올리고뉴클레오타이드는 안티센스 가닥이고, 제2 올리고뉴클레오타이드는 센스 가닥이다. PCT 공개 WO 2016/161388을 참조하며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로 포함된다.
일 실시양태에서, 제1 또는 제2 올리고뉴클레오타이드는 다음 화학식을 갖는 하나 이상의 VP 하위단위간 변형을 포함한다:
Figure pct00013
.
8) 분지형 올리고뉴클레오타이드
상기 개시된 바와 같은 2개 이상의 RNA 침묵화 제제, 예를 들어 siRNA와 같은 올리고뉴클레오타이드 작제물은 링커, 스페이서 및 분지점으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 모이어티에 의해 서로 연결되어 2개 이상의 RNA 침묵화 제제를 포함하는 분지형 올리고뉴클레오타이드를 형성할 수 있다. 도 31은 2개의 siRNA를 전달하기 위한 예시적인 di-siRNA 이분지형 지지체를 도시한다. 대표적인 실시양태에서, 분지형 올리고뉴클레오타이드의 핵산은 각각 안티센스 가닥 (또는 이의 부분)을 포함하고, 안티센스 가닥은 RNA-매개 침묵화 기전 (예를 들어, RNAi)을 매개하기 위해 이형접합 단일 뉴클레오타이드 다형태에 대해 충분히 상보적이다. 다른 실시양태에서, 안티센스 전사체를 침묵화시키기 위한 센스 가닥 (또는 이의 부분)을 포함하는 핵산을 특징으로 하는 제2 유형의 분지형 올리고뉴클레오타이드가 제공되며, 센스 가닥은 RNA-매개 침묵화 메카니즘을 매개하기 위해 안티센스 전사체에 대해 충분한 상보성을 갖는다. 추가 실시양태에서, 두 가지 유형의 핵산, 즉 안티센스 가닥 (또는 이의 일부)을 포함하는 핵산 및 센스 가닥 (또는 이의 일부)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제3 유형의 분지형 올리고뉴클레오타이드가 제공된다.
예시적인 실시양태에서, 분지형 올리고뉴클레오타이드는 링커를 통해 부착된 2 내지 8개의 RNA 침묵화 제제를 가질 수 있다. 링커는 소수성일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 출원의 분지형 올리고뉴클레오타이드는 2 내지 3개의 올리고뉴클레오타이드를 갖는다. 일 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 독립적으로 실질적인 화학적 안정화를 갖는다 (예를 들어, 구성 염기의 적어도 40%가 화학적으로 변형됨). 특정 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 완전한 화학적 안정화를 갖는다 (즉, 모든 구성 염기가 화학적으로 변형됨). 일부 실시양태에서, 분지형 올리고뉴클레오타이드는 각각 독립적으로 2 내지 20개의 뉴클레오타이드를 갖는 하나 이상의 단일 가닥 포스포로티오화 꼬리를 포함한다. 특정 실시양태에서, 각각의 단일 가닥 꼬리는 8 내지 10개의 뉴클레오타이드를 갖는다.
특정 실시양태에서, 분지형 올리고뉴클레오타이드는 (1) 분지형 구조, (2) 완전한 대사 안정화, 및 (3) 포스포로티오에이트 링커를 포함하는 단일 가닥 꼬리의 존재의 3가지 특성을 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 분지형 올리고뉴클레오타이드는 2 또는 3개의 분지를 갖는다. 분지형 구조의 증가된 전체 크기는 증가된 흡수를 촉진하는 것으로 고려된다. 또한 특정 활성 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 다수의 인접 분지 (예를 들어, 2개 또는 3개)를 통해 각 분지가 함께 작용하여 내재화, 수송 및 방출 비율을 극적으로 향상시킬 수 있다고 고려된다.
분지형 올리고뉴클레오타이드는 다수의 구조적으로 다양한 실시양태에서 제공된다. 도 36에 도시된 바와 같이, 예를 들어, 일부 실시양태에서 분지점에 부착된 핵산은 단일 가닥이고 miRNA 억제제, 갭 인자, 혼합 인자, SSO, PMO 또는 PNA로 구성된다. 이 단일 가닥은 3' 또는 5' 말단에 부착될 수 있다. siRNA와 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드의 조합도 이중 기능을 위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 갭 인자, 혼합 인자, miRNA 억제제, SSO, PMO 및 PNA에 상보적인 짧은 핵산을 사용하여 이러한 활성 단일 가닥 핵산을 운반하고 분포 및 세포 내재화를 향상시킨다. 짧은 이중체 영역은 분지 구조가 세포로 내재화될 때 빠른 해리를 위해 용융 온도 (Tm 약 37℃)가 낮다.
도 37에 도시된 바와 같이, Di-siRNA 분지형 올리고뉴클레오타이드는 화학적으로 다양한 접합체를 포함할 수 있다. 접합된 생리활성 리간드는 세포 특이성을 향상시키고 막 결합, 내재화 및 혈청 단백질 결합을 촉진하는데 사용될 수 있다. 접합에 사용되는 생리활성 모이어티의 예에는 DHAg2, DHA, GalNAc 및 콜레스테롤이 포함된다. 이러한 모이어티는 연결 링커 또는 스페이서를 통해 Di-siRNA에 부착되거나 다른 유리 siRNA 말단에 부착된 추가 링커 또는 스페이서를 통해 추가될 수 있다.
분지 구조의 존재는 동일한 화학적 조성의 비분지 화합물과 비교하여 뇌의 조직 보유 수준을 100배 초과하여 향상시키며, 이는 세포 보유 및 분포의 새로운 기전을 시사한다. 분지형 올리고뉴클레오타이드는 척수와 뇌 전체에 특히 균일하게 분포되어 있다. 더욱이, 분지형 올리고뉴클레오타이드는 다양한 조직으로의 특히 효율적인 전신 전달 및 매우 높은 수준의 조직 축적을 나타낸다.
분지형 올리고뉴클레오타이드는 ASO, miRNA, miRNA 억제제, 스플라이싱 스위칭, PMO, PNA를 포함하는 다양한 치료 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분지형 올리고뉴클레오타이드는 접합된 소수성 모이어티를 추가로 포함하고 시험관내 및 생체내에서 비통상적인 침묵화 및 효능을 나타낸다.
링커
분지형 올리고뉴클레오타이드의 일 시시형태에서, 각각의 링커는 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩타이드, RNA, DNA, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 에스테르, 아미드, 트리아졸 및 이의 조합으로부터 독립적으로 선택되고; 링커의 임의의 탄소 또는 산소 원자는 질소 원자로 임의로 대체되거나, 하이드록실 치환기를 보유하거나, 또는 옥소 치환기를 보유한다. 일 실시양태에서, 각각의 링커는 에틸렌 글리콜 사슬이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 알킬 사슬이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 펩타이드이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 RNA이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 DNA이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 포스페이트이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 포스포네이트이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 포스포라미데이트이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 에스테르이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 아미드이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 트리아졸이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 도 37의 화학식으로부터 선택된 구조이다.
9) 화학식 (I)의 화합물
또 다른 양상에서, 본 명세서에서는 화학식 (I)의 분지형 올리고뉴클레오타이드 화합물가 제공된다:
Figure pct00014
(I)
상기 식에서, L은 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩타이드, RNA, DNA, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 에스테르, 아미드, 트리아졸, 및 이의 조합으로부터 선택되며, 화학식 (I)은 선택적으로 하나 이상의 분지점 B, 및 하나 이상의 스페이서 S를 추가로 포함하고; B는 각 경우에 독립적으로 다가 유기 종 또는 이의 유도체이고; S는 각 경우에 독립적으로 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩타이드, RNA, DNA, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 에스테르, 아미드, 트리아졸, 및 이의 조합으로부터 선택되고; N은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNA 이중체이고, 안티센스 가닥은 대립유전자 다형태를 포함하는 유전자의 영역에 실질적으로 상보적인 상보성 영역을 포함하고, 안티센스 가닥은 대립유전자 다형태에 상보적인 5' 말단으로부터 위치 2 내지 7의 단일 뉴클레오타이드 다형태 (SNP) 위치 뉴클레오타이드 ; 및 유전자 내에 뉴클레오타이드와의 미스매치가 있는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 11개 뉴클레오타이드에 위치하는 미스매치 (MM) 위치 뉴클레오타이드를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2, 4 또는 6에 존재하고, 미스매치 (MM) 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 6개 뉴클레오타이드에 위치한다.
센스 가닥 및 안티센스 가닥 각각은 독립적으로 하나 이상의 화학적 변형을 포함하고; n은 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다.
실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 표 1의 화학식 (I-1)-(I-9)으로부터 선택되는 구조를 갖는다.
Figure pct00015
일 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (I-1)이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (I-2)이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (I-3)이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (I-4)이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (I-5)이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (I-6)이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (I-7)이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (I-8)이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (I-9)이다.
화학식 (I)의 화합물의 실시양태에서, 각각의 링커는 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩타이드, RNA, DNA, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 에스테르, 아미드, 트리아졸, 및 이의 조합으로부터 독립적으로 선택되고; 링커의 임의의 탄소 또는 산소 원자는 질소 원자로 임의로 대체되거나, 하이드록실 치환기를 보유하거나, 옥소 치환기를 보유한다. 화학식 (I)의 화합물의 일 실시양태에서, 각각의 링커는 에틸렌 글리콜 사슬이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 알킬 사슬이다. 화학식 (I)의 화합물의 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 펩타이드이다. 화학식 (I)의 화합물의 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 RNA이다. 화학식 (I)의 화합물의 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 DNA이다. 화학식 (I)의 화합물의 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 포스페이트이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 포스포네이트이다. 화학식 (I)의 화합물의 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 포스포라미데이트이다. 화학식 (I)의 화합물의 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 에스테르이다. 화학식 (I)의 화합물의 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 아미드이다. 화학식 (I)의 화합물의 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 트리아졸이다. 화학식 (I)의 화합물의 또 다른 실시양태에서, 각각의 링커는 도 도 36 및 도 38의 화학식으로부터 선택된 구조이다.
화학식 (I)의 화합물의 일 실시양태에서, B는 다가 유기 종이다. 화학식 (I)의 화합물의 또 다른 실시양태에서, B는 다가 유기 종의 유도체이다. 화학식 (I)의 화합물의 일 시시형태에서, B는 트리올 또는 테트롤 유도체이다. 또 다른 실시양태에서, B는 트리- 또는 테트라-카복실산 유도체이다. 또 다른 실시양태에서, B는 아민 유도체이다. 또 다른 실시양태에서, B는 트리아민 또는 테트라아민 유도체이다. 또 다른 실시양태에서, B는 아미노산 유도체이다. 화학식 (I)의 화합물의 또 다른 실시양태에서, B는 도 38의 화학식으로부터 선택된다.
다가 유기 종은 탄소 및 3개 이상의 원자가를 포함하는 모이어티 (즉, 상기 규정된 바와 같은 S, L 또는 N과 같은 모이어티와의 부착점)이다. 다가 유기 종의 비제한적인 예는 트리올 (예를 들어, 글리세롤, 플로로글루시놀 등), 테트롤 (예를 들어, 리보스, 펜타에리트리톨, 1,2,3,5-테트라하이드록시벤젠 등), 트리-카복실산 (예를 들어, 시트르산, 1,3,5-사이클로헥산트리카복실산, 트리메스산 등), 테트라-카복실산 (예를 들어, 에틸렌디아민테트라아세트산, 피로멜리트산 등), 3차 아민 (예를 들어, 트리프로파르길아민, 트리에탄올아민, 및 등), 트리아민 (예를 들어, 디에틸렌트리아민 등), 테트라민, 및 하이드록실, 티올, 아미노 및/또는 카복실 모이어티의 조합을 포함하는 종 (예를 들어, 리신, 세린, 시스테인 등과 같은 아미노산)을 포함한다.
화학식 (I)의 화합물의 실시양태에서, 각각의 핵산은 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 화학식 (I)의 화합물의 실시양태에서, 각각의 핵산은 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드로 이루어진다. 화학식 (I)의 화합물의 특정 실시양태에서, 각 핵산의 >95%, >90%, >85%, >80%, >75%, >70%, >65%, >60%, >55% 또는 >50%는 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
실시양태에서, 각각의 안티센스 가닥은 독립적으로 표 2의 군으로부터 선택된 5' 말단 기 R을 포함한다:
Figure pct00016
일 실시양태에서, R은 R1이다. 또 다른 실시양태에서, R은 R2이다. 또 다른 실시양태에서, R은 R3이다. 또 다른 실시양태에서, R은 R4이다. 또 다른 실시양태에서, R은 R5이다. 또 다른 실시양태에서, R은 R6이다. 또 다른 실시양태에서, R은 R7이다. 또 다른 실시양태에서, R은 R8이다.
화학식 (II)의 구조
실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (II)의 구조이다:
Figure pct00017
(II)
상기 식에서, X는 각각의 경우에 독립적으로 아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘 및 이의 화학적으로 변형된 유도체로부터 선택되고; Y는 각각의 경우에 독립적으로 아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘 및 이의 화학적으로 변형된 유도체로부터 선택되고; -는 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결을 나타내고; =는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 나타내고; ---는 각 경우에 개별적으로 염기쌍 상호작용 또는 미스매치를 나타낸다.
특정 실시양태에서, 화학식 (II)의 구조는 미스매치를 포함하지 않는다. 일 실시양태에서, 화학식 (II)의 구조는 1개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 (II)의 화합물은 2개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 (II)의 화합물은 3개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 (II)의 화합물은 4개의 미스매치를 포함한다. 실시양태에서, 각 핵산은 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드로 구성된다.
특정 실시양태에서, 화학식 (II)의 구조의 X 중 >95%, >90%, >85%, >80%, >75%, >70%, >65%, >60%, >55% 또는 >50%의 X는 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드이다. 다른 실시양태에서, 화학식 (II)의 구조의 X 중 >95%, >90%, >85%, >80%, >75%, >70%, >65%, >60%, >55% 또는 >50%는 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드이다.
화학식 (III)의 구조
실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식 (III)의 구조를 갖는다:
Figure pct00018
(III)
상기 식에서, X는 각각의 경우에 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 변형을 포함하는 뉴클레오타이드이고; X는 각각의 경우에 독립적으로 2'-O-메틸 변형을 포함하는 뉴클레오타이드이고; Y는 각각의 경우에 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 변형을 포함하는 뉴클레오타이드이고; Y는 각각의 경우에 독립적으로 2'-O-메틸 변형을 포함하는 뉴클레오타이드이다.
실시양태에서, X는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, X는 2'-O-메틸 변형된 아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, Y는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 실시양태에서, Y는 2'-O-메틸 변형된 아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 화학식 (III)의 구조는 미스매치를 포함하지 않는다. 일 실시양태에서, 화학식 (III)의 구조는 1개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 (III)의 화합물은 2개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 (III)의 화합물은 3개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 (III)의 화합물은 4개의 미스매치를 포함한다.
화학식 (IV)의 구조
실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화학식 (IV)의 구조를 갖는다:
Figure pct00019
(IV)
상기 식에서, X는 각각의 경우에 독립적으로 아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘 및 이의 화학적으로 변형된 유도체로부터 선택되고; Y는 각각의 경우에 독립적으로 아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘 및 이의 화학적으로 변형된 유도체로부터 선택되고; -는 포스포디에스테르 뉴클레오사이드간 연결을 나타내고; =는 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결을 나타내고; ---는 각 경우에 개별적으로 염기쌍 상호작용 또는 미스매치를 나타낸다.
특정 실시양태에서, 화학식 (IV)의 구조는 미스매치를 포함하지 않는다. 일 실시양태에서, 화학식 (IV)의 구조는 1개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 (IV)의 화합물은 2개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 (IV)의 화합물은 3개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 (IV)의 화합물은 4개의 미스매치를 포함한다. 실시양태에서, 각 핵산은 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드로 구성된다.
특정 실시양태에서, 화학식 (II)의 구조의 X 중 >95%, >90%, >85%, >80%, >75%, >70%, >65%, >60%, >55% 또는 >50%는 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드이다. 다른 실시양태에서, 화학식 (II)의 구조의 X 중 >95%, >90%, >85%, >80%, >75%, >70%, >65%, >60%, >55% 또는 >50%는 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드이다.
화학식 (V)의 구조
실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식 (V)의 구조를 갖는다:
Figure pct00020
(V)
상기 식에서, X는 각각의 경우에 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 변형을 포함하는 뉴클레오타이드이고; X는 각각의 경우에 독립적으로 2'-O-메틸 변형을 포함하는 뉴클레오타이드이고; Y는 각각의 경우에 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 변형을 포함하는 뉴클레오타이드이고; Y는 각각의 경우에 독립적으로 2'-O-메틸 변형을 포함하는 뉴클레오타이드이다.
특정 실시양태에서, X는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시양태에서, X는 2'-O-메틸 변형된 아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시양태에서, Y는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시양태에서, Y는 2'-O-메틸 변형된 아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 화학식 (V)의 구조는 미스매치를 포함하지 않는다. 일 실시양태에서, 화학식 (V)의 구조는 1개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 (V)의 화합물은 2개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 (V)의 화합물은 3개의 미스매치를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 (V)의 화합물은 4개의 미스매치를 포함한다.
가변 링커
화학식 (I)의 화합물의 실시양태에서, L은 L1의 구조를 갖는다:
Figure pct00021
.
(L1)
L1의 실시양태에서, R은 R3이고 n은 2이다.
화학식 (II)의 구조의 실시양태에서, L은 L1의 구조를 갖는다. 화학식 (III)의 구조의 실시양태에서, L은 L1의 구조를 갖는다. 화학식 (IV)의 구조의 실시양태에서, L은 L1의 구조를 갖는다. 화학식 (V)의 구조의 실시양태에서, L은 L1의 구조를 갖는다. 화학식 (VI)의 구조의 실시양태에서, L은 L1의 구조를 갖는다. 화학식 (VI)의 구조의 실시양태에서, L은 L1의 구조를 갖는다.
화학식 (I)의 화합물의 실시양태에서, L은 L2의 구조를 갖는다:
Figure pct00022
.
(L2)
상기 식에서, L2의 실시양태에서, R은 R3이고 n은 2이다. 화학식 (II)의 구조의 실시양태에서, L은 L2의 구조를 갖는다. 화학식 (III)의 구조의 실시양태에서, L은 L2의 구조를 갖는다. 화학식 (IV)의 구조의 실시양태에서, L은 L2의 구조를 갖는다. 화학식 (V)의 구조의 실시양태에서, L은 L2의 구조를 갖는다. 화학식 (VI)의 구조의 실시양태에서, L은 L2의 구조를 갖는다. 화학식 (VI)의 구조의 실시양태에서, L은 L2의 구조를 갖는다.
10) 전달 시스템
추가 양상에서, 화학식 (VI)의 구조를 갖는 치료 핵산을 위한 전달 시스템이 본 명세서에 제공된다:
Figure pct00023
(VI)
상기 식에서, L은 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩티드, RNA, DNA, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 에스테르, 아미드, 트리아졸 및 이의 조합으로부터 선택되며, 화학식 (VI)는 선택적으로 하나 이상의 분지점 B, 및 하나 이상의 스페이서 S를 추가로 포함하고; B는 각 경우에 독립적으로 다가 유기 종 또는 이의 유도체이고; S는 각 경우에 독립적으로 에틸렌 글리콜 사슬, 알킬 사슬, 펩타이드, RNA, DNA, 포스페이트, 포스포네이트, 포스포라미데이트, 에스테르, 아미드, 트리아졸, 및 이의 조합으로부터 선택되고; 각각의 cNA는 독립적으로 하나 이상의 화학적 변형을 포함하는 담체 핵산이고; n은 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다.
전달 시스템의 일 실시양태에서, L은 에틸렌 글리콜 사슬이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, L은 알킬 사슬이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, L은 펩타이드이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, L은 RNA이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, L은 DNA이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, L은 포스페이트이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, L은 포스포네이트이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, L은 포스포라미데이트이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, L은 에스테르이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, L은 아미드이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, L은 트리아졸이다.
전달 시스템의 일 실시양태에서, S는 에틸렌 글리콜 사슬이다. 또 다른 실시양태에서, S는 알킬 사슬이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, S는 펩타이드이다. 또 다른 실시양태에서, S는 RNA이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, S는 DNA이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, S는 포스페이트이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, S는 포스포네이트이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, S는 포스포라미데이트이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, S는 에스테르이다. 또 다른 실시양태에서, S는 아미드이다. 또 다른 실시양태에서, S는 트리아졸이다.
전달 시스템의 일 실시양태에서, n은 2이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, n은 3이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, n은 4이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, n은 5이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, n은 6이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, n은 7이다. 전달 시스템의 또 다른 실시양태에서, n은 8이다.
특정 실시양태에서, 각각의 cNA는 >95%, >90%, >85%, >80%, >75%, >70%, >65%, >60%, >55% 또는 >50%의 화학적으로-변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
실시양태에서, 화학식 (VI)의 화합물은 표 3의 화학식 (VI-1)-(VI-9)으로부터 선택되는 구조를 갖는다:
Figure pct00024
실시양태에서, 화학식 (VI)의 화합물은 화학식 (VI-1)의 구조이다. 실시양태에서, 화학식 (VI)의 화합물은 화학식 (VI-2)의 구조이다. 실시양태에서, 화학식 (VI)의 화합물은 화학식 (VI-3)의 구조이다. 실시양태에서, 화학식 (VI)의 화합물은 화학식 (VI-4)의 구조이다. 실시양태에서, 화학식 (VI)의 화합물은 화학식 (VI-5)의 구조이다. 실시양태에서, 화학식 (VI)의 화합물은 화학식 (VI-6)의 구조이다. 실시양태에서, 화학식 (VI)의 화합물은 화학식 (VI-7)의 구조이다. 실시양태에서, 화학식 (VI)의 화합물은 화학식 (VI-8)의 구조이다. 실시양태에서, 화학식 (VI)의 화합물은 화학식 (VI-9)의 구조이다.
실시양태에서, 화학식 (VI)의 화합물 (예를 들어, 화학식 (VI-1)-(VI-9) 포함)에서, 각각의 cNA는 독립적으로 적어도 15개의 인접 뉴클레오타이드를 포함한다. 실시양태에서, 각각의 cNA는 독립적으로 화학적으로-변형된 뉴클레오타이드로 이루어진다.
실시양태에서, 전달 시스템은 n개의 치료적 핵산 (NA)을 추가로 포함하고, 각각의 NA는 대립유전자 다형태를 포함하는 유전자의 영역에 실질적으로 상보적인 상보성 영역을 포함하고, 안티센스 가닥은 대립유전자 다형태에 상보적인 5' 말단으로부터 위치 2 내지 7의 단일 뉴클레오타이드 다형태 (SNP) 위치 뉴클레오타이드; 및 유전자 내의 뉴클레오타이드와 미스매치가 있는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 11개의 뉴클레오타이드에 위치한 미스매치 (MM) 위치 뉴클레오타이드를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2, 4 또는 6에 있고 미스매치 (MM) 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 6개 뉴클레오타이드에 위치한다. 또한, 각각의 NA는 적어도 하나의 cNA에 혼성화된다. 일 실시예에서, 전달 시스템은 2개의 NA로 구성된다. 다른 실시양태에서, 전달 시스템은 3개의 NA로 구성된다. 다른 실시양태에서, 전달 시스템은 4개의 NA로 구성된다. 다른 실시양태에서, 전달 시스템은 5개의 NA로 구성된다. 다른 실시양태에서, 전달 시스템은 6개의 NA로 구성된다. 다른 실시양태에서, 전달 시스템은 7개의 NA로 구성된다. 다른 실시양태에서, 전달 시스템은 8개의 NA로 구성된다.
실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 적어도 16개의 인접 뉴클레오타이드를 포함한다. 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 16 내지 20개의 인접 뉴클레오타이드를 포함한다. 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 16개의 인접 뉴클레오타이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 17개의 인접 뉴클레오타이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 18개의 인접 뉴클레오타이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 19개의 인접 뉴클레오타이드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 20개의 인접 뉴클레오타이드를 포함한다.
실시양태에서, 각각의 NA는 적어도 2개 뉴클레오타이드의 비쌍형성 오버행을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 적어도 3개 뉴클레오타이드의 비쌍형성 오버행을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 적어도 4개 뉴클레오타이드의 비쌍형성 오버행을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 적어도 5개 뉴클레오타이드의 비쌍형성 오버행을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 적어도 6개 뉴클레오타이드의 비쌍형성 오버행을 포함한다. 실시양태에서, 오버행의 뉴클레오타이드는 connected via 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결된다.
실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 DNA, siRNA, antagomiR, miRNA, 갭 인자, 혼합 인자, 또는 가이드 RNA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 DNA이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 siRNA이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 antagomiR이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 miRNA이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 갭 인자이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 혼합 인자이다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 NA는 독립적으로 가이드 RNA이다. 실시양태에서, 각각의 NA는 동일한다. 실시양태에서, 각각의 NA는 동일하지 않다.
실시양태에서, n개의 치료 핵산 (NA)을 추가로 포함하는 전달 시스템은 화학식 (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), 및 본 명세서에 기재된 이의 실시양태로부터 선택되는 구조를 갖는다. 일 실시양태에서, 전달 시스템은 2개의 치료 핵산 (NA)을 추가로 포함하는 화학식 (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), 및 본 명세서에 기재된 이의 실시양태로부터 선택되는 구조를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 전달 시스템은 3개의 치료 핵산 (NA)을 추가로 포함하는 화학식 (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), 및 본 명세서에 기재된 이의 실시양태로부터 선택되는 구조를 갖는다. 일 실시양태에서, 전달 시스템은 4개의 치료 핵산 (NA)을 추가로 포함하는 화학식 (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), 및 본 명세서에 기재된 이의 실시양태로부터 선택되는 구조를 갖는다. 일 실시양태에서, 전달 시스템은 5개의 치료 핵산 (NA)을 추가로 포함하는 화학식 (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), 및 본 명세서에 기재된 이의 실시양태로부터 선택되는 구조를 갖는다. 일 실시양태에서, 전달 시스템은 6개의 치료 핵산 (NA)을 추가로 포함하는 화학식 (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), 및 본 명세서에 기재된 이의 실시양태로부터 선택되는 구조를 갖는다. 일 실시양태에서, 전달 시스템은 7개의 치료 핵산 (NA)을 추가로 포함하는 화학식 (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), 및 본 명세서에 기재된 이의 실시양태로부터 선택되는 구조를 갖는다. 일 실시양태에서, 전달 시스템은 8개의 치료 핵산 (NA)을 추가로 포함하는 화학식 (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), 및 본 명세서에 기재된 이의 실시양태로부터 선택되는 구조를 갖는다.
일 실시양태에서, 전달 시스템은 구조 L1 또는 L2 (R은 R3이고, n은 2임)의 링커를 추가로 포함하는 화학식 (I), (II), (III), (IV), (V), (VI)으로부터 선택되는 구조를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 전달 시스템은 구조 L1 (R은 R3이고, n은 2임)의 링커를 추가로 포함하는 화학식 (I), (II), (III), (IV), (V), (VI)으로부터 선택되는 구조를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 전달 시스템은 구조 L2 (R은 R3이고, n은 2임)의 링커를 추가로 포함하는 화학식 (I), (II), (III), (IV), (V), (VI)으로부터 선택되는 구조를 갖는다.
약제학적 조성물 및 투여 방법
일 양상에서, 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 화합물, 올리고뉴클레오타이드, 또는 핵산, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 제공된다. 일 실시양태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 이중 가닥의 화학적으로 변형된 핵산, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나의 이중 가닥의 화학적으로 변형된 핵산, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 2개의 이중 가닥의 화학적으로 변형된 핵산, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 약제학적 조성물은 이형접합 SNP 돌연변이 단백질을 인코딩하는 유전자의 영역에 상보적인 약 15 내지 35개의 뉴클레오타이드를 포함하는 이중 가닥 RNA 분자를 포함하고, 상기 영역은 대립유전자 다형태를 포함하고, 제2 가닥은 제1 가닥에 상보적인 약 15 내지 35개의 뉴클레오타이드를 포함하고, dsRNA 분자는 대립유전자 다형태의 위치에 없는 미스매치를 포함하고; 미스매치 및 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드는 dsRNA 분자의 중심에 존재하지 않는다.
실시양태에서, 미스매치는 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드의 4개 뉴클레오타이드 상류, 3개 뉴클레오타이드 상류, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드의 2개 뉴클레오타이드 상류, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드의 1개 뉴클레오타이드 상류, 1개 뉴클레오타이드 하류, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드의 2개 뉴클레오타이드 하류, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드의 3개 뉴클레오타이드 하류, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드의 4개 뉴클레오타이드 하류, 또는 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드의 5개 뉴클레오타이드 하류에 존재한다. 특정 실시양태에서, 미스매치는 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드에 인접하지 않는다.
약제학적 조성물의 또 다른 실시양태에서, 이중 가닥 RNA는 5' 말단으로부터 위치 2, 3, 4, 5, 또는 6에 존재하는 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 실시양태에서, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2에 존재한다. 실시양태에서, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 3에 존재한다. 실시양태에서, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 4에 존재한다. 실시양태에서, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 5에 존재한다. 실시양태에서, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 6에 존재한다.
약제학적 조성물의 시시형태에서, 이중 가닥 RNA는 대립유전자 다형태를 갖는 돌연변이 대립유전자, 예를 들어 이형접합 SNP를 선택적으로 침묵화시킨다. 약제학적 조성물의 실시양태에서, 이중 가닥 RNA는 대립유전자 다형태를 갖는 돌연변이 대립유전자를 침묵화시키고 동일한 유전자의 야생형 대립유전자에 영향을 미치지 않는다. 약제학적 조성물의 또 다른 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 이중 가닥 RNA는 대립유전자 다형태를 갖는 돌연변이 대립유전자를 침묵화시키고 돌연변이 대립유전자보다 적은 정도로 동일한 유전자의 야생형 대립유전자를 침묵화시킨다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 이의 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어 정맥내 (IV), 피내, 피하 (SC 또는 SQ), 복강내, 근육내, 경구 (예를 들어, 흡입), 경피 (국소) 및 경점막 투여를 포함한다. 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액에는 다음 성분이 포함될 수 있다: 주사용수, 식염수, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질알코올, 메틸파라벤 등의 항균제; 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충액 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 장성 조절제. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조정할 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 이루어진 다회 투여량 바이알에 내장될 수 있다.
주사용으로 적합한 약제학적 조성물은 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적절한 담체에는 생리 식염수, 정균수, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, N.J.) 또는 포스페이트 완충 식염수 (PBS)가 포함된다. 모든 경우에, 조성물은 멸균되어야 하고 용이한 주사가능성이 되는 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건에서 안정해야 하며 박테리아 및 균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 다가알코올, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 조성물에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함함으로써 야기될 수 있다.
멸균 주사용 용액은 활성 화합물을 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 하나 또는 조합하여 적절한 용매에 필요한 양으로 혼입시킨 후 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 위에 열거된 것들로부터 필요한 기타 성분을 포함하는 멸균 비히클에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 통상적인 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조로 활성 성분과 사전에 멸균 여과된 용액으로부터 임의의 추가의 적절한 성분의 분말을 생성한다.
세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 획득된 데이터는 인간에서 사용하기 위한 투여량 범위를 제형화하는데 사용할 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 일반적으로 독성이 거의 또는 전혀 없이 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있어야 한다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 다양할 수 있다. 본 개시내용의 방법에 사용된 임의의 화합물에 대해, 치료 유효량은 초기에 세포 배양 분석으로부터 추정될 수 있다. 세포 배양에서 결정된 EC50 (즉, 최대 반응의 절반을 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 투여량을 동물 모델에서 제형화할 수 있다. 이러한 정보는 인체에 유용한 투여량을 보다 정확하게 결정하는데 사용할 수 있다. 혈장 내 수준은 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
치료 방법
본 개시내용은 대립유전자 다형태 (예를 들어, 이형접합 SNP)에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 유발되는 질병 또는 장애의 위험이 있는 (또는 이에 대한 소인이 있는) 대상체를 치료하는 예방 및 치료 방법 둘 모두를 제공한다. 일 실시양태에서, 질병 또는 장애는 트리뉴클레오타이드 반복 질병 또는 장애이다. 또 다른 실시양태에서, 질병 또는 장애는 폴리글루타민 장애이다. 일 실시양태에서, 본 방법은 본 명세서에 제공된 이중 가닥 RNA 분자의 치료 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 실시양태에서, 질병 또는 장애는 헌팅틴의 발현과 관련된 장애이고, 헌팅틴의 변이, 특히 CAG 반복 카피 수의 증폭은 헌팅틴 유전자 (구조 또는 기능) 또는 헌팅틴 단백질 ( 구조 또는 기능 또는 발현)의 결함을 초래하여, 임상 징후가 헌팅턴병 환자에서 나타나는 것을 포함한다.
본 방법의 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 이중 가닥 RNA는 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드에 대한 특정 위치에서 하나의 미스매치 올리고뉴클레오타이드를 제외하고 대립유전자 다형태에 상동성이다. 특정 실시양태에서, 미스매치는 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드의 약 6개 뉴클레오타이드 내, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드의 약 5개 뉴클레오타이드 내, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드의 약 4개 뉴클레오타이드 내, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드의 약 3개 뉴클레오타이드 내, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드의 약 2개 뉴클레오타이드 내, 또는 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드의 약 1개 뉴클레오타이드 내에 존재한다. 특히 예시적인 실시양태에서, 미스매치는 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드에 인접하지 않는다.
본 방법의 또 다른 실시양태에서, 이중 가닥 RNA는 5' 말단으로부터 위치 2, 3, 4, 5, 또는 6에 있는 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 일 실시양태에서, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2에 존재한다. 일 실시양태에서, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 3에 존재한다. 일 실시양태에서, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 4에 존재한다. 일 실시양태에서, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 5에 존재한다. 일 실시양태에서, 대립유전자 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 6에 존재한다.
본 방법의 시시형태에서, dsRNA는 5' 말단으로부터 위치 6의 다형태 및 5' 말단으로부터의 위치 11의 미스매치에 해당하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 방법의 시시형태에서, dsRNA는 5' 말단으로부터 위치 4의 다형태 및 5' 말단으로부터의 위치 7의 미스매치에 해당하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 방법의 또 다른 실시양태에서, 이중 가닥 RNA는 대립유전자 다형태를 갖는 돌연변이 대립유전자를 선택적으로 침묵화시킨다. 실시양태에서, 이중 가닥 RNA는 대립유전자 다형태를 갖는 돌연변이 대립유전자를 침묵화시키고 동일한 유전자의 야생형 대립유전자에 영향을 미치지 않는다. 다른 실시양태에서, 이중 가닥 RNA는 대립유전자 다형태를 갖는 돌연변이 대립유전자를 침묵화시키고 돌연변이 대립유전자보다 적은 정도로 동일한 유전자의 야생형 대립유전자를 침묵화시킨다.
본 방법의 실시양태에서, dsRNA는 하나 이상의 VP 하위단위간 연결 변형을 포함하며, 하위단위간 연결은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00025
.
추가 실시양태에서, dsRNA는 도 43에 도시된 하위단위간 연결 변형 중 하나 이상을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는"은 환자에게 치료제 (예를 들어, RNA 제제 또는 벡터 또는 이를 인코딩하는 전이유전자)의 적용 또는 투여, 또는 질병 또는 장애, 질병 또는 장애의 증상 또는 질병에 대한 소인의 치료, 치유, 완화, 경감, 변화, 관해, 개선, 향상 또는 영향을 목적으로 질병 또는 장애, 질병 또는 장애의 증상 또는 질병 또는 장애에 대한 소인이 있는 환자로부터 단리된 조직 또는 세포주에 대한 치료제의 적용 또는 투여로서 규정된다.
일 양상에서, 본 개시내용은 대상체에게 치료제 (예를 들어, RNAi 제제 또는 이를 인코딩하는 벡터 또는 전이유전자)를 투여함으로써 대상체에서, 상기 기재된 바와 같은 질병 또는 장애를 예방하는 방법을 제공한다. 질병에 대한 위험이 있는 대상체는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 진단 또는 예후 분석 중 임의의 것 또는 이의 조합에 의해 확인될 수 있다. 예방제의 투여는 질병 또는 장애가 예방되거나 대안적으로 진행이 지연되도록 질병 또는 장애의 특징적인 증상의 징후가 나타나기 전에 이루어질 수 있다.
본 개시내용의 또 다른 양상은 대상체를 치료적으로 치료하는 방법, 즉 질병 또는 장애의 증상의 발병을 변화시키는 방법에 관한 것이다. 예시적인 실시양태에서, 본 개시내용의 조절 방법은 기능 획득 돌연변이를 발현하는 세포를, 유전자 내의 하나 이상의 표적 서열에 특이적인 치료제 (예를 들어, RNAi 제제 또는 이를 인코딩하는 벡터 또는 전이유전자)와 접촉시켜, 유전자에 대한 서열 특이적 간섭을 획득하는 단계를 포함한다. 본 방법은 시험관내 (예를 들어, 제제와 함께 세포를 배양함으로써) 또는 대안적으로 생체내 (예를 들어, 대상체에게 제제를 투여함으로써) 수행될 수 있다.
신경 세포로의 향상된 흡수를 위해 변형된 RNA 침묵화 제제는 체중 kg당 약 1.4 mg 미만, 또는 체중 kg당 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 0.0001, 0.00005 또는 0.00001 mg 미만 및 체중 kg당 200 nmole RNA 제제 (예를 들어, 약 4.4 x 1016 카피) 미만, 또는 체중 kg당 1500, 750, 300, 150, 75, 15, 7.5, 1.5, 0.75, 0.15, 0.075, 0.015, 0.0075, 0.0015, 0.00075 또는 0.00015 nmole RNA 침묵화 제제 미만의 단위 투여량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 단위 투여량은 주사 (예를 들어, 정맥내 또는 근육내, 척수강내, 또는 뇌로 직접), 흡입 투여량, 또는 국소 적용에 의해 투여될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 투여량은 체중 kg당 2, 1 또는 0.1 mg 미만이다.
RNA 침묵화 제제의 기관에 직접 (예를 들어, 뇌에 직접) 전달은 약 0.00001 mg 약 3 mg/기관, 또는 약 0.0001 내지 0.001 mg/기관, 약 0.03 내지 3.0 mg/기관, 약 0.1 내지 3.0 mg/기관 또는 약 0.3 내지 3.0 mg/기관의 순서의 투여량일 수 있다. 투여량은 신경계 질병 또는 장애 (예를 들어, 헌팅턴병)를 치료하거나 예방하는데 효과적인 양일 수 있다. 일 실시양태에서, 단위 투여량은 1일, 예를 들어, 2, 4, 8 또는 30일 미만에 1회 미만으로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 단위 투여량은 빈도로 투여되지 않는다 (예를 들어, 규칙적인 빈도가 아님). 예를 들어, 단위 투여량은 1회 투여될 수 있다. 일 실시양태에서, 유효 투여량은 다른 통상적인 치료 방식과 함께 투여된다.
일 실시양태에서, 대상체는 RNA 침묵화 제제의 초기 투여량 및 1회 이상의 유지 투여량을 투여받는다. 유지 투여량 또는 투여량들은 일반적으로 초기 투여량보다 더 낮으며, 예를 들어, 초기 투여량의 1/2 미만이다. 유지 요법은 0.01 μg 내지 1.4 mg/kg 체중/일, 예를 들어, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 또는 0.00001 mg/kg 체중/일 범위의 투여량 또는 투여량들로 대상체를 치료하는 단계를 포함할 수 있다. 유지 투여량은 일반적으로 5, 10 또는 30일마다 1회 미만으로 투여된다. 또한, 치료 요법은 특정 질병의 특성, 이의 중증도 및 환자의 전반적인 상태에 따라 달라질 기간 동안 지속될 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여량은 1일 1회 미만, 예를 들어 24, 36, 48 이상의 시간당 1회 미만, 예를 들어 5 또는 8일마다 1회 미만으로 전달될 수 있다. 치료 후 환자의 상태 변화와 질병 상태의 증상 완화를 모니터링할 수 있다. 화합물의 투여량은 환자가 현재 투여량 수준에 유의하게 반응하지 않는 경우에 증가될 수 있거나, 질병 상태의 증상 제거가 관찰된 경우 또는 부적절한 부작용이 관찰되는 경우 투여량은 감소될 수 있다.
헌팅턴병
본 개시내용의 특정 양상에서, RNA 침묵화 제제는 헌팅턴병의 치료를 위해 돌연변이 인간 헌팅틴 단백질 (htt)에서 다형태 (예를 들어, 이형접합 단일 뉴클레오타이드 다형태)를 표적화하도록 설계된다. 따라서, 또 다른 양상에서, 헌팅턴병을 치료 또는 관리하는 방법으로서, 헌팅턴병의 치료 또는 관리가 필요한 환자에게 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 화합물, 올리고뉴클레오타이드, 또는 핵산, 또는 상기 화합물, 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
상염색체 우성 질병으로 유전되는 헌팅턴병은 인지 장애 및 운동 질병을 유발한다. 환자는 심각하게 쇠약한 상태에서 10년 이상 생존한 후 기아 또는 감염으로 조기 사망할 수 있다. 질병은 대부분의 경우 40 내지 50대에 시작되지만 일부 환자는 10대에 질병을 나타낸다. 헌팅턴병의 유전적 돌연변이는 헌팅틴 유전자에서 CAG 반복이 길어지는 것이다. CAG 반복은 정상 개인에서 8 내지 35개 카피까지 그 수가 다양하다 (문헌[Kremer et al., 1994]). 유전적 돌연변이 (예를 들어, CAG 반복 길이는 정상 헌팅틴 유전자의 경우 36개 미만에서 질병의 경우 36개 초과로 증가함)는 36개 초과의 연속 폴리글루타민 잔기를 갖는 돌연변이 헌팅틴 단백질의 합성과 관련이 있다 (문헌[Aronin et al., 1995]). 일반적으로 CAG 반복이 36개 이상인 개체는 헌팅턴병이 유발된다. 기저 돌연변이로서 CAG가 증가된 20가지 다른 질병의 원형인 헌팅턴병은 여전히 효과적인 치료법이 없다. 아폽토시스 경로의 중단, 미토콘드리아 효율성을 높이기 위한 시약 추가, NMDA 수용체 차단과 같은 다양한 개입이 헌팅턴병의 세포 배양 및 마우스 모델에서 가능성을 보여주었다. 그러나 이러한 접근법은 세포 또는 동물 생존의 짧은 연장만을 보여준다.
헌팅턴병과 관련된 질병 유전자는 헌팅틴 또는 (htt)로 지칭된다. 헌팅틴 유전자좌위는 180 kb의 범위이고 67개의 엑손으로 구성되어 있다. 헌팅틴 유전자는 광범위하게 발현되며 정상적인 발달에 필요하다. 이는 다양한 태아 및 성인 조직에서 서로 다른 상대적 존재비를 나타내는 2개의 대안적으로 폴리아데닐화된 형태로 발현된다. 더 큰 전사체는 약 13.7 kb이고 성인과 태아의 뇌에서 주로 발현되고, 약 10.3 kb의 더 작은 전사체는 더 광범위하게 발현된다. 두 전사체는 3' 비번역 영역과 관련하여 상이하다 (문헌[Lin et al., 1993]). 두 메시지 모두 3144개의 아미노산을 포함하는 348 킬로달톤의 단백질을 인코딩할 것으로 예상된다. 헌팅턴병을 유발하는 유전적 결함은 mRNA에 새로운 특성을 부여하거나 단백질의 기능을 변이하는 것으로 고려된다.
헌팅턴병은 유전학의 중심 원리를 따른다: 돌연변이 유전자는 돌연변이 mRNA의 생성을 위한 주형으로 작용하고; 돌연변이 mRNA는 돌연변이 단백질의 합성을 유도한다 (문헌[Aronin et al., 1995; DiFiglia et al., 1997]). 돌연변이 헌팅틴 (단백질)은 선조체와 피질의 선택적 뉴런에 축적되어 결정된 세포 활동을 방해하고 뉴런 기능 장애와 사망을 유발할 수 있다 (문헌[Aronin et al., 1999; Laforet et al., 2001]). 돌연변이 유전자의 단일 카피로 헌팅턴병을 유발하기에 충분하기 때문에 가장 간단한 치료는 돌연변이 유전자를 불효시키는 것이다. 이론적 접근법에는 돌연변이 헌팅틴의 유전자 전사 중지, 돌연변이 mRNA 파괴, 번역 차단이 포함될 수 있다. 각각은 돌연변이 헌팅틴의 손실이라는 동일한 결과를 갖는다.
헌팅턴 SNP
특정 예시적 실시양태에 따른 표적화에 적합한 헌팅틴 유전자 서열의 예시적인 SNP는 하기 표 4에 개시되어 있다. 각 SNP 부위에 대한 게놈 서열은 예를 들어 NCBI에서 관리하는 공개적으로 사용 가능한 "SNP Entrez" 데이터베이스에서 찾을 수 있다. HD 환자 및 대조군 DNA에 대한 각 SNP 부위에 대한 이형접합의 빈도는 표 4에 추가로 설명되어 있다. 빈번한 이형접합 SNP의 조합을 표적화하면 비교적 적은 수의 대립유전자-특이적 RNA 침묵화 제제를 사용하여 HD 집합에서 많은 비율의 개체를 치료할 수 있다.
htt SNP.
rs363125 ORF, 엑손 39 11.00% GTTAAGAGATGGGGACAGTA[A/C]TTCAACGCTAGAAGAACACA (서열번호 1)
rs362273 ORF, 엑손 57 35.20% AGCCACGAGAAGCTGCTGCT[A/G]CAGATCAACCCCGAGCGGGA (서열번호 2)
rs362307 3' UTR, 엑손 67 48.60% CCGGAGCCTTTGGAAGTCTG[C/T]GCCCTTGTGCCCTGCCTCCA (서열번호 3)
rs362336 ORF, 엑손 48 37.40% CAGCCCGAGCTGCCTGCAGA[A/G]CCGGCGGCCTACTGGAGCAA (서열번호 4)
rs362331 ORF, 엑손 50 39.40% CCCACGCCTGCTCCCTCATC[C/T]ACTGTGTGCACTTCATCCTG (서열번호 5)
rs362272 ORF, 엑손 61 36.10% GGGTTGGAGCCCTGCACGGC[A/G]TCCTCTATGTGCTGGAGTGC (서열번호 6)
rs362306 3' UTR, 엑손 67 35.80% CTGCTGGTTGTTGCCAGGTT[A/G]CAGCTGCTCTTGCATCTGGG (서열번호 7)
rs362268 3' UTR, 엑손 67 35.80% TCCTCCCTCCTGCAGGCTGG[C/G]TGTTGGCCCCTSTGCTGTCC (서열번호 8)
rs362267 3' UTR, 엑손 67 35.50% GATTTGGGAGCTCTGCTTGC[C/T]GACTGGCTGTGAGACGAGGC (서열번호 9)
rs363099 ORF, 엑손 29 35.80% GAAAAGTTTGGAGGGTTTCT[C/T]CGCTCAGCCTTGGATGTTCT (서열번호 10)
일 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 표 4에 열거된 SNP 부위 중 하나 이상을 표적화할 수 있다. 일 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 헌팅틴 mRNA의 rs363125 SNP 부위를 표적화할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 헌팅틴 mRNA의 rs362273 SNP 부위를 표적화할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 헌팅틴 mRNA의 rs362307 SNP 부위를 표적화할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 헌팅틴 mRNA의 rs362336 SNP 부위를 표적화할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 헌팅틴 mRNA의 rs362331 SNP 부위를 표적화할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 헌팅틴 mRNA의 rs362272 SNP 부위를 표적화할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 헌팅틴 mRNA의 rs362306 SNP 부위를 표적화할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 헌팅틴 mRNA의 rs362268 SNP 부위를 표적화할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 헌팅틴 mRNA의 rs362267 SNP 부위를 표적화할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 헌팅틴 mRNA의 rs363099 SNP 부위를 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNA 침묵화 제제에 의해 표적화된 SNP 부위는 헌팅턴병과 연관된다. 특히 예시적인 실시양태에서, RNA 침묵화 제제에 의해 표적화된 SNP 부위는 헌팅턴병과 유의하게 연관되어 있다.
추가의 예시적인 실시양태에서, RNA 침묵화 제제는 표 5 내지 표 7의 서열 중 하나 이상을 포함한다:
서열
HTT SNP 화합물명 snp 위치 추가의 미스매치 위치 안티센스 가닥 센스 가닥
rs362273 SNP2-7 2 7 UUAGCAUCAGCUUCUCGUGG AGAAGCUGCUGCUAA
rs362273 SNP4-7 4 7 UUGUAGUAGCAGCUUCUCGU AAGCUGCUGCUACAA
rs362273 SNP4-8 4 8 UUGUAGCUGCAGCUUCUCGU AAGCUGCUGCUACAA
rs362273 SNP4-15 4 15 UUGUAGCAGCAGCUACUCGU AAGCUGCUGCUACAA
rs362273 SNP6-5A 6 5 UUCUAUAGCAGCAGCUUCUC GCUGCUGCUACAGAA
rs362273 SNP6-8 6 8 UUCUGUAUCAGCAGCUUCUC GCUGCUGCUACAGAA
rs362273 SNP6-11 6 11 UUCUGUAGCAUCAGCUUCUC GCUGCUGCUACAGAA
rs362273 SNP6-14 6 14 UUCUGUAGCAGCAUCUUCUC GCUGCUGCUACAGAA
rs362273 SNP6-16 6 16 UUCUGUAGCAGCAGCAUCUC GCUGCUGCUACAGAA
rs362307 SNP3-5G 3 5 UCGCGGACUUCCAAAGGCUC UUUGGAAGUCCGCGA
rs362307 SNP3-7G 3 7 UCGCAGGCUUCCAAAGGCUC UUUGGAAGCCUGCGA
rs362307 SNP3-8 3 8 UCGCAGAUUUCCAAAGGCUC UUUGGAAAUCUGCGA
U는 T로 대체될 수 있다
대상 SNP snp에 측접한 siRNA 서열의 설명 서열
SNP 화합물명 snp 위치 추가의 미스매치 위치 안티센스 가닥 센스 가닥
rs362273 (A) SNP2-7 2 7 UUAGCAUCAGCUUCUCGUGG AGAAGCUGCUGCUAA
rs362273 (A) SNP4-7 4 7 UUGUAGUAGCAGCUUCUCGU AAGCUGCUGCUACAA
rs362273 (A) SNP4-8 4 8 UUGUAGCUGCAGCUUCUCGU AAGCUGCUGCUACAA
rs362273 (A) SNP4-15 4 15 UUGUAGCAGCAGCUACUCGU AAGCUGCUGCUACAA
rs362273 (A) SNP6-5A 6 5 UUCUAUAGCAGCAGCUUCUC GCUGCUGCUACAGAA
rs362273 (A) SNP6-8 6 8 UUCUGUAUCAGCAGCUUCUC GCUGCUGCUACAGAA
rs362273 (A) SNP6-11 6 11 UUCUGUAGCAUCAGCUUCUC GCUGCUGCUACAGAA
rs362273 (A) SNP6-14 6 14 UUCUGUAGCAGCAUCUUCUC GCUGCUGCUACAGAA
rs362273 (A) SNP6-16 6 16 UUCUGUAGCAGCAGCAUCUC GCUGCUGCUACAGAA
rs362307 (C') SNP3-5G 3 5 UCGCGGACUUCCAAAGGCUC UUUGGAAGUCCGCGA
rs362307 (C') SNP3-7G 3 7 UCGCAGGCUUCCAAAGGCUC UUUGGAAGCCUGCGA
rs362307 (C') SNP3-8 3 8 UCGCAGAUUUCCAAAGGCUC UUUGGAAAUCUGCGA
대상 SNP snp에 측접한 siRNA 서열의 설명 서열
SNP 화합물명 snp 위치 추가의 미스매치 위치 안티센스 가닥 센스 가닥
rs362273 (G) SNP2-7 2 7 UCAGCAUCAGCUUCUCGUGG AGAAGCUGCUGCUGA
rs362273 (G) SNP4-7 4 7 UUGCAGUAGCAGCUUCUCGU AAGCUGCUGCUGCAA
rs362273 (G) SNP4-8 4 8 UUGCAGCUGCAGCUUCUCGU AAGCUGCUGCUGCAA
rs362273 (G) SNP4-15 4 15 UUGCAGCAGCAGCUACUCGU AAGCUGCUGCUGCAA
rs362273 (G) SNP6-5A 6 5 UUCUACAGCAGCAGCUUCUC GCUGCUGCUGCAGAA
rs362273 (G) SNP6-8 6 8 UUCUGCAUCAGCAGCUUCUC GCUGCUGCUGCAGAA
rs362273 (G) SNP6-11 6 11 UUCUGCAGCAUCAGCUUCUC GCUGCUGCUGCAGAA
rs362273 (G) SNP6-14 6 14 UUCUGCAGCAGCAUCUUCUC GCUGCUGCUGCAGAA
rs362307 (T) SNP3-5G 3 5 UCACGGACUUCCAAAGGCUC UUUGGAAGUCCGUGA
rs362307 (T) SNP3-7G 3 7 UCACAGGCUUCCAAAGGCUC UUUGGAAGCCUGUGA
rs362307 (T) SNP3-8 3 8 UCACAGAUUUCCAAAGGCUC UUUGGAAAUCUGUGA
표 5 내지 표 7의 특정 실시양태에서, U 뉴클레오타이드는 T 뉴클레오타이드로 대체될 수 있다.
핵산 전달 방법
본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 세포 (예를 들어, 신경 세포) 내로 (즉, 세포내로) 직접 도입되거나; 공동, 간질 공간, 유기체의 순환 내로 세포외 도입되거나, 경구로 도입되거나, 핵산을 포함하는 용액에 세포 또는 유기체를 침지시킴으로써 도입될 수 있다. 혈관 또는 혈관외 순환, 혈액 또는 림프계, 뇌척수액은 핵산이 도입될 수 있는 부위이다.
본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 핵산을 포함하는 용액의 주입, 핵산에 의해 도포된 입자에 의한 충격, 핵산 용액 중 세포 또는 유기체의 침지 또는 핵산의 존재하에서 세포막의 전기천공을 포함하는 당업계에 공지된 핵산 전달 방법을 사용하여 도입될 수 있다. 핵산을 세포에 도입하기 위한 당업계에 공지된 다른 방법, 예를 들어 지질-매개 담체 수송, 화학물질-매개 수송, 및 인산칼슘과 같은 양이온성 리포솜 형질감염 등이 사용될 수 있다. 핵산은 다음 활성 중 하나 이상을 수행하는 다른 구성요소와 함께 도입될 수 있다: 세포에 의한 핵산 흡수 증진 또는 그렇지 않으면 표적 유전자의 억제 증가.
핵산을 도입하는 물리적 방법에는 RNA를 포함하는 용액의 주입, RNA로 도포된 입자에 의한 충격, RNA의 용액 중 세포 또는 유기체의 침지, 또는 RNA의 존재하에 세포막의 전기천공법이 포함된다. 바이러스 입자에 패키징된 바이러스 작제물은 세포내로 발현 작제물의 효율적인 도입 및 발현 작제물에 의해 인코딩된 RNA의 전사 둘 모두를 달성할 것이다. 핵산을 세포에 도입하기 위해 당업계에 공지된 다른 방법, 예를 들어 지질-매개 담체 수송, 인산칼슘과 같은 화학물질-IS 매개 수송 등이 사용될 수 있다. 따라서, RNA는 다음 활성 중 하나 이상을 수행하는 구성요소와 함께 도입될 수 있다: 세포에 의한 RNA 흡수 증진, 단일 가닥의 어닐링 억제, 단일 가닥 안정화, 또는 그렇지 않으면 표적 유전자의 억제 증가.
RNA는 세포 내로 (즉, 세포내로) 직접 도입될 수 있거나, 공동, 간질 공간 내로, 유기체의 순환 내로 세포외로 도입되거나, 경구로 도입되거나, RNA를 포함하는 용액 중 세포 또는 유기체의 침지에 의해 도입될 수 있다. 혈관 또는 혈관외 순환, 혈액 또는 림프계, 뇌척수액은 RNA가 도입될 수 있는 부위이다.
표적 유전자를 갖는 세포는 생식세포 또는 체세포, 전능성 또는 다능성, 분열 또는 비분열, 실질 또는 상피, 불멸화 또는 형질전환 등으로부터 유래될 수 있다. 세포는 줄기세포 또는 분화된 세포일 수 있다. 분화되는 세포 유형에는 지방세포, 섬유아세포, 근육세포, 심근세포, 내피, 뉴런, 신경교, 혈액 세포, 거핵구, 림프구, 대식세포, 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 백혈구, 과립구, 각질 세포, 연골세포, 골아세포, 파골세포, 간세포, 내분비선 또는 외분비선의 세포가 포함된다.
특정 표적 유전자 및 전달된 이중 가닥 RNA 물질의 투여량에 따라, 이 과정은 표적 유전자에 대한 기능의 부분적 또는 완전한 손실을 제공할 수 있다. 표적화된 세포의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상에서 유전자 발현의 감소 또는 손실이 예시적이다. 유전자 발현의 억제는 표적 유전자로부터의 단백질 및/또는 mRNA 산물 수준의 부재 (또는 관찰 가능한 감소)를 지칭한다. 특이성은 세포의 다른 유전자에 대한 명백한 영향 없이 표적 유전자를 억제하는 능력을 지칭한다. 억제의 결과는 세포 또는 유기체의 외적 특성 (아래 예에서 제시됨)을 조사하거나 RNA 용액 혼성화, 뉴클레아제 보호, 노던 혼성화, 역전사, 마이크로어레이에 의한 유전자 발현 모니터링, 항체 결합, 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISA), 웨스턴 블롯팅, 방사선면역분석 (RIA), 기타 면역분석, 형광 활성화 세포 분석 (FACS) 등과 같은 생화학적 기술에 의해 확인할 수 있다.
세포주 또는 전체 유기체에서 RNA 매개 억제를 위해, 유전자 발현은 단백질 산물을 용이하게 분석하는 리포터 또는 약물 내성 유전자를 사용하여 편리하게 분석된다. 이러한 리포터 유전자에는 아세토하이드록시산 신타제 (acetohydroxyacid synthase) (AHAS), 알칼리성 포스파타제 (alkaline phosphatase) (AP), 베타 갈락토시다제 (beta galactosidase) (LacZ), 베타 글루코로니다제 (beta glucoronidase) (GUS), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (chloramphenicol acetyltransferase) (CAT), 녹색 형광 단백질 (GFP), 양고추냉이 퍼옥시다제 (horseradish peroxidase) (HRP), 루시퍼라제 (luciferase) (Luc), 노팔린 신타제 (nopaline synthase) (NOS), 옥토핀 신타제 (octopine synthase) (OCS), 및 이의 유도체를 포함한다. 암피실린 (ampicillin), 블레오마이신 (bleomycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol), 겐타마이신 (gentamycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 카나마이신 (kanamycin), 린코마이신 (lincomycin), 메토트렉세이트 (methotrexate), 포스피노트리신 (phosphinothricin), 퓨로마이신 (puromycin) 및 테트라사이클린 (tetracycline)에 대한 내성을 부여하는 다중 선택 마커를 사용할 수 있다. 분석에 따라, 유전자 발현량의 정량화를 통해 본 개시내용에 따라 처리되지 않은 세포와 비교하여 10%, 33%, 50%, 90%, 95% 또는 99%보다 더 큰 억제 정도를 결정할 수 있다. RNAi 제제 투여 후 더 적은 투여량의 주입 물질 및 더 긴 시간은 세포의 더 작은 분율 (예를 들어, 표적화된 세포의 적어도 10%, 20%, 50%, 75%, 90% 또는 95%)에서 억제를 초래할 수 있다. 세포에서 유전자 발현의 양자화는 표적 mRNA의 축적 또는 표적 단백질의 번역 수준에서 유사한 양의 억제를 나타낼 수 있다. 예로서, 억제 효율은 세포에서 유전자 산물의 양을 평가함으로써 결정될 수 있다. mRNA는 억제 이중 가닥 RNA에 사용되는 영역 외부에 뉴클레오타이드 서열을 갖는 혼성화 프로브로 검출될 수 있거나, 번역된 폴리펩타이드는 해당 영역의 폴리펩타이드 서열에 대해 생성된 항체로 검출될 수 있다.
RNA는 세포당 적어도 하나의 카피의 전달을 가능하게 하는 양으로 도입될 수 있다. 더 높은 투여량 (예를 들어, 세포당 적어도 5, 10, 100, 500 또는 1000개 카피)의 물질은 더 효과적인 억제를 유발할 수 있고; 더 낮은 투여량은 또한 특정 용도에 유용할 수 있다.
특정 양상에서, 본 개시내용의 RNAi 제제 (예를 들어, 돌연변이 유전자에서 다형태를 표적화하는 siRNA)의 효능은 세포, 특히 뉴런 (예를 들어, 선조체 또는 피질 뉴런 클론 계통 및/또는 1차 뉴런)에서 돌연변이 mRNA (예를 들어, 돌연변이 htt mRNA 및/또는 돌연변이 헌팅틴 단백질의 생성)를 특이적으로 분해하는 능력에 대해 시험된다. 또한 세포 기반 검증 분석에 적합한 것은 쉽게 형질전환 가능한 다른 세포 (예를 들어, HeLa 세포 또는 COS 세포)이다. 세포는 인간 야생형 또는 돌연변이 cDNA (예를 들어, 인간 야생형 또는 돌연변이 헌팅틴 cDNA)로 형질감염된다. 표준 siRNA, 변형된 siRNA 또는 U-루프 mRNA로부터 siRNA를 생성할 수 있는 벡터는 동시 형질감염된다. 돌연변이 mRNA (예를 들어, 돌연변이 헌팅틴 mRNA) 및/또는 돌연변이 단백질 (예를 들어, 돌연변이 헌팅틴)의 선택적 감소가 측정된다. 돌연변이 mRNA 또는 단백질의 감소는 정상 mRNA 또는 단백질의 수준과 비교할 수 있다. 외인성으로 도입된 정상 mRNA 또는 단백질 (또는 내인성 정상 mRNA 또는 단백질)은 비교 목적으로 분석될 수 있다. 표준 형질감염 기술에 일정 정도의 내성이 있는 것으로 알려진 신경 세포를 사용할 때 수동 흡수에 의해 RNAi 제제 (예를 들어, siRNA)를 도입하는 것이 바람직할 수 있다.
특정 예시적 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제를 포함하는 조성물은 다양한 경로에 의해 대상체의 신경계에 전달될 수 있다. 예시적인 경로는 경막내, 실질 (예를 들어, 뇌), 비강 및 안구 전달을 포함한다. 본 조성물은 또한 예를 들어 정맥내, 피하 또는 근육내 주사에 의해 전신적으로 전달될 수 있으며, 이는 RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제를 말초 뉴런으로 전달하는데 특히 유용하다. 예시적인 전달 경로는 뇌에 직접적으로, 예를 들어 뇌의 심실 또는 시상하부로, 또는 뇌의 측두부 또는 후두부 영역으로 이루어진다. 신경 세포 전달을 위한 RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제는 투여에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다.
예를 들어, 조성물은 하나 이상의 종의 RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지 및 치료될 부위에 따라 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소 (안구, 비강, 경피 포함), 경구 또는 비경구일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내 수액 투여, 피하, 복강내 또는 근육내 주사, 척수강내, 또는 뇌실내 (intraventricular) (예를 들어, 뇌실내 (intracerebroventricular)) 투여를 포함한다. 특정 예시적 실시양태에서, 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제는 본 명세서에 기재된 다양한 적합한 조성물 및 방법을 통해 혈액-뇌-장벽 (BBB)을 통해 전달된다.
전달 경로는 환자의 장애에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 헌팅턴병으로 진단된 대상체는 본 개시내용의 항-htt RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제를 뇌 내 (예를 들어, 기저핵의 담창구 또는 선조체 내, 및 선조체의 중간 가시 뉴런 주위)로 직접 투여할 수 있다. 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제에 추가하여, 환자에게 제2 요법, 예를 들어, 완화 요법 및/또는 질병 특이적 요법이 투여될 수 있다. 2차 요법은 예를 들어 대증요법 (예를 들어, 증상 완화), 신경보호 (예를 들어, 질병 진행 지연 또는 중단) 또는 회복 (예를 들어, 질병 진행 역전)일 수 있다. 예를 들어 헌팅턴병 치료의 경우 대증 요법에는 할로페리돌 (haloperidol), 카르바마제핀 (carbamazepine) 또는 발프로에이트 (valproate) 약물이 포함될 수 있다. 기타 요법에는 심리 요법, 물리 요법, 언어 요법, 의사 소통 및 기억 보조, 사회적 지원 서비스, 식이 요법이 포함될 수 있다.
RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제는 뇌의 신경 세포에 전달될 수 있다. 혈액-뇌 장벽을 통한 조성물의 통과가 필요하지 않는 전달 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제를 포함하는 약제학적 조성물은 질병이 발생한 세포를 포함하는 영역으로 직접 주사함으로써 환자에게 전달될 수 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 뇌에 직접 주사에 의해 전달될 수 있다. 주사는 뇌의 특정 영역 (예를 들어, 흑질, 피질, 해마, 선조체 또는 담창구)으로의 정위 주사에 의해 이루어질 수 있다. RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제는 중추 신경계의 다중 영역 내 (예를 들어, 뇌의 다중 영역 내 및/또는 척수 내)로 전달될 수 있다. RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제는 뇌의 확산 영역으로 전달될 수 있다 (예를 들어, 뇌의 피질로의 확산 전달).
일 실시양태에서, RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제는 한쪽 말단이 조직, 예를 들어 뇌, 예를 들어 뇌의 흑질, 피질, 해마, 선조체 또는 담창구에 이식된 캐뮬러 도는 다른 전달 장치에 의해 전달될 수 있다. 캐뉼러는 RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제의 용기에 연결될 수 있다. 유입 또는 전달은 펌프, 예를 들어 삼투압 펌프 또는 미니펌프, 예컨대 Alzet 펌프 (Durect, Cupertino, CA)에 의해 매개될 수 있다. 일 실시양태에서, 펌프 및 용기는 조직으로부터 멀리 떨어진 영역, 예를 들어 복부에 이식되고 전달은 펌프 또는 용기로부터 방출 부위로 이어지는 도관에 의해 수행된다. 뇌에 전달하기 위한 장치는 예를 들어 미국 특허 제6,093,180호 및 제5,814,014호에 기재되어 있다.
본 개시내용의 RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제는 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 있도록 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제는 제제가 장벽을 통과할 수 있게 하는 분자에 접합될 수 있다. 이러한 변형된 RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제는 예를 들어 심실내 또는 근육내 주사 또는 폐 전달과 같은 임의의 적절한 방법에 의해 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 엑소좀은 본 개시내용의 RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제를 전달하는데 사용된다. 엑소좀은 BBB를 통과하여 전신 주사 후 뉴런에 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 화학요법제 및 단백질을 특이적으로 전달할 수 있다 (문헌[Alvarez-Erviti L, Seow Y, Yin H, Betts C, Lakhal S, Wood MJ. (2011). Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol. 2011 Apr;29(4):341-5. doi: 10.1038/nbt.1807; El-Andaloussi S, Lee Y, Lakhal-Littleton S, Li J, Seow Y, Gardiner C, Alvarez-Erviti L, Sargent IL, Wood MJ.(2011). Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nat Protoc. 2012 Dec;7(12):2112-26. doi: 10.1038/nprot.2012.131; EL Andaloussi S, Mager I, Breakefield XO, Wood MJ. (2013). Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov. 2013 May;12(5):347-57. doi: 10.1038/nrd3978; El Andaloussi S, Lakhal S, Mager I, Wood MJ. (2013). Exosomes for targeted siRNA delivery across biological barriers. Adv. Drug Deliv Rev. 2013 Mar;65(3):391-7. doi: 10.1016/j.addr.2012.08.008] 참조).
특정 실시양태에서, 하나 이상의 친유성 분자를 사용하여 BBB를 통과하여 본 개시내용의 RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제를 전달할 수 있다 (문헌[Alvarez-Ervit (2011)]). 그런 다음 RNA 침묵화 제제는 예를 들어 친유성 위장의 효소 분해에 의해 활성화되어 약물을 활성 형태로 방출한다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 수용체-매개 투과성 화합물을 사용하여 BBB의 투과성을 증가시켜 본 개시내용의 RNA 침묵화 제제의 전달을 가능하게 할 수 있다. 이러한 약물은 혈액의 삼투압을 증가시켜 내피 세포 사이의 밀접한 접합을 느슨하게 하여 일시적으로 BBB의 투과성을 증가시킨다 (문헌[El-Andaloussi (2012)]). 밀접한 접합을 느슨하게 함으로써 RNA 침묵화 제제의 정상적인 정맥 주사를 수행할 수 있다.
특정 실시양태에서, 나노입자 기반 전달 시스템은 BBB를 통해 본 개시내용의 RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제를 전달하는데 사용된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "나노입자"는 통상적으로 약물 또는 유전자 담체로서 광범위하게 연구되어 온 고체, 생분해성, 콜로이드성 시스템인 중합체 나노입자를 지칭한다 (문헌[S. P. Egusquiaguirre, M. Igartua, R. M. Hernandez, and J. L. Pedraz, "Nanoparticle delivery systems for cancer therapy: advances in clinical and preclinical research," Clinical and Translational Oncology, vol. 14, no. 2, pp. 83-93, 2012]). 중합체 나노입자는 크게 천연 중합체와 합성중합체로 분류된다. siRNA 전달을 위한 천연 중합체에는 다음에 제한되는 것은 아니나, 사이클로덱스트린, 키토산 및 아텔로콜라겐이 포함된다 (문헌[Y. Wang, Z. Li, Y. Han, L. H. Liang, and A. Ji, "Nanoparticle-based delivery system for application of siRNA in vivo," Current Drug Metabolism, vol. 11, no. 2, pp. 182-196, 2010]). 합성 중합체에는 다음에 제한되는 것은 아니나, 폴리에틸렌이민 (PEI), 폴리 (dl-락타이드-코-글리콜라이드) (PLGA) 및 덴드리머가 포함되며, 이는 집중적으로 연구되었다 (X. Yuan, S. Naguib, and Z. Wu, "Recent advances of siRNA delivery by nanoparticles," Expert Opinion on Drug Delivery, vol. 8, no. 4, pp. 521-536, 2011). 나노입자 및 기타 적절한 전달 시스템에 대한 검토는 문헌[Jong-Min Lee, Tae-Jong Yoon, and Young-Seok Cho, "Recent Developments in Nanoparticle-Based siRNA Delivery for Cancer Therapy," BioMed Research International, vol. 2013, Article ID 782041, 10 pages, 2013. doi:10.1155/2013/782041] (상기 문헌의 전문은 본 명세서에 참조로 포함됨)을 참조한다.
본 개시내용의 RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제는 예를 들어 망막 장애, 예를 들어 망막병증을 치료하기 위해 안구로 투여될 수 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 안구의 표면 또는 주변 조직, 예를 들어 눈꺼풀의 내부에 적용될 수 있다. 이는 국소적으로, 예를 들어 스프레이, 점적, 안약 또는 연고로 적용할 수 있다. 연고 또는 점적 가능한 액체는 도포기 또는 점안기와 같은 당업계에 공지된 안구 전달 시스템에 의해 전달될 수 있다. 이러한 조성물은 히알루론산, 콘드로이틴 술페이트, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 또는 폴리(비닐 알코올)과 같은 점액 모방제, 소르브산, EDTA 또는 벤질크로늄 클로라이드와 같은 보존제, 및 통상적인 양의 희석제 및/또는 담체를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 안구의 내부에 투여될 수 있고, 이를 선택된 영역 또는 구조에 도입할 수 있는 바늘 또는 다른 전달 장치에 의해 도입될 수 있다. RNA 침묵화 제제를 포함하는 조성물은 또한 안구 패치를 통해 적용될 수 있다.
일반적으로, 본 개시내용의 RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제는 임의의 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 국소 전달은 RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제를 안구, 점막, 체강의 표면을 포함하는 신체의 임의의 표면, 또는 임의의 내부 표면에 직접 적용하는 것을 지칭할 수 있다. 국소 투여를 위한 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 젤, 점적제, 스프레이 및 액체를 포함할 수 있다. 통상적인 약제학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 베이스, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다. 국소 투여는 또한 RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제를 대상체의 표피 또는 진피, 또는 이의 특정 층, 또는 기저 조직에 선택적으로 전달하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다.
척수강내 또는 뇌실내 (예를 들어, 뇌실내) 투여를 위한 조성물은 완충액, 희석제 및 기타 적합한 첨가제를 또한 포함할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다. 경막내 또는 뇌실내 투여를 위한 조성물은 통상적으로 예를 들어 RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제에 부착된 친유성 모이어티 외에 형질감염 시약 또는 추가의 친유성 모이어티를 포함하지 않는다.
비경구 투여용 제형은 완충액, 희석제 및 기타 적합한 첨가제를 또한 포함할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다. 심실내 주사는 예를 들어 용기에 부착된 심실내 카테터에 의해 촉진될 수 있다. 정맥내 사용의 경우, 제제가 등장성이 되도록 용질의 총 농도를 조절해야 한다.
본 개시내용의 RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제는 폐 전달에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 폐 전달 조성물은 분산액의 흡입에 의해 전달되어 분산액 내의 조성물이 폐에 도달할 수 있고 폐포 영역을 통해 혈액 순환으로 직접 쉽게 흡수될 수 있다. 폐 전달은 전신 전달 및 폐 질병 치료를 위한 국소 전달 모두에 효과적일 수 있다. 일 실시양태에서, 폐 전달에 의해 투여되는 RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제는 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 있도록 변형되었다.
폐 전달은 분무화, 에어로졸화, 미세세포 및 건조 분말 기반 제형의 사용을 포함하는 다양한 접근법에 의해 달성될 수 있다. 액체 분무기, 에어로졸 기반 흡입기 및 건조 분말 분산 장치를 사용하여 전달할 수 있다. 계량-투여량 장치가 예시적이다. 분무기 또는 흡입기를 사용하는 이점 중 하나는 장치가 자급식이기 때문에 오염 가능성이 최소화된다는 것이다. 예를 들어, 건조 분말 분산 장치는 건조 분말로 쉽게 제형화될 수 있는 약물을 전달한다. RNA 침묵화 제제 조성물은 그 자체로 또는 적합한 분말 담체와 조합하여 동결건조 또는 분무-건조 분말로서 안정하게 저장될 수 있다. 흡입용 조성물의 전달은 장치에 혼입될 때 에어로졸 약물 투여 중 환자에게 유발되는 투여량 추적, 순응도 모니터링 및/또는 투여량을 가능하게 하는 타이머, 투여량 카운터, 시간 측정 장치 또는 시간 표시기를 포함할 수 있는 투여 조절 요소에 의해 매개될 수 있다.
담체로서 유용한 약제학적 부형제의 유형은 인간 혈청 알부민 (HSA)과 같은 안정화제, 탄수화물, 아미노산 및 폴리펩타이드와 같은 증량제; pH 조절제 또는 완충액; 염화나트륨과 같은 염류; 등을 포함한다. 이들 담체는 결정질 또는 비정질 형태일 수 있거나 둘의 혼합물일 수 있다.
특히 유용한 증량제는 상용성 탄수화물, 폴리펩타이드, 아미노산 또는 이의 조합을 포함한다. 적합한 탄수화물은 갈락토스, D-만노스, 소르보스 등과 같은 단당류; 락토스, 트레할로스 등과 같은 이당류; 2-하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린과 같은 사이클로덱스트린; 및 라피노스, 말토덱스트린, 덱스트란 등과 같은 다당류; 만니톨, 자일리톨 등과 같은 알디톨을 포함한다. 탄수화물의 예시적인 그룹은 락토스, 트레할로스, 라피노스 말토덱스트린 및 만니톨을 포함한다. 적합한 폴리펩타이드에는 아스파탐이 포함된다. 아미노산에는 알라닌 및 글리신이 포함되며, 글리신이 대표적이다.
적합한 pH 조절제 또는 완충액은 시트르산나트륨, 아스코르브산나트륨 등과 같은 유기산 및 염기로부터 제조된 유기염을 포함하며; 시트르산나트륨이 대표적이다.
본 개시내용의 RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제는 경구 및 비강 전달에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 이러한 막을 통해 투여되는 약물은 작용 개시가 빠르고, 치료 혈장 수준을 제공하고, 간 대사의 1차 통과 효과를 방지하고, 유해한 위장 (GI) 환경에 대한 약물 노출을 방지한다. 추가적인 장점으로는 막 부위에 쉽게 접근할 수 있어 약물을 쉽게 적용, 국소화 및 제거할 수 있다는 것이다. 일 실시양태에서, 경구 또는 비강 전달에 의해 투여되는 RNA 침묵화 제제는 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있도록 변형되었다.
일 실시양태에서, RNA 제제, 예를 들어 dsRNA 제제를 포함하는 조성물의 단위 투여량 또는 측정된 투여량은 이식된 장치에 의해 분배된다. 장치는 대상체 내의 매개변수를 모니터링하는 센서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 장치는 삼투 펌프와 같은 펌프 및 선택적으로 관련 전자 장치를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 실시양태의 범위를 벗어나지 않으면서 본 명세서에 기재된 방법의 다른 적절한 변형 및 개조가 적절한 균등물을 사용하여 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 이제 특정 실시양태를 상세히 설명하였지만, 이는 단지 예시의 목적으로 포함되고 제한하려는 의도가 아닌 하기 실시예를 참조하여 더욱 명확하게 이해될 것이다.
실시예
실시예 1: 미스매치 위치에 따라 SNP 확인이 달라진다.
도 46은 HTT의 경우에 구현되었지만 다른 유전자의 SNP에도 적용 가능한 SNP-확인 siRNA의 생성 및 선택 방법을 설명하는 순서도이다. 가장 큰 확인을 생성하는 SNP가 배치된 위치를 결정하기 위해 1차 스크리닝을 수행한다. 그런 다음, 가장 적절한 결과를 산출하는 미스매치 위치를 선택하고, 비표적 대립유전자에 대한 친화도는 개선된 선택성 및/또는 효능을 가진 siRNA 분자에 대한 화학적 및 구조적 최적화가 선택되는 2차 스크리닝에서 추가로 감소된다.
HD 환자에서 높은 비율의 이형접합을 갖는 HTT 유전자 내에 다수의 SNP가 존재한다 (도 45). 헌팅틴의 SNP-특이적 RNAi 매개 침묵화의 최적화를 위해, HTT mRNA의 엑손 57에 있는 SNP rs362273을 SNP 선택적 침묵화의 최적화를 위한 모델 표적으로 사용하였다. 이 SNP 이형접합은 HD 환자 집합의 35%에서 발생한다.
본 명세서에 기재된 psiCHECK 리포터 플라스미드는 Rluc 3' UTR 내에 htt의 엑손 57로부터의 부분적 측접 영역 및 SNP rs362273을 포함한다. 야생형 psiCHECK 리포터 플라스미드는 SNP가 부재하는 동일한 htt 영역을 포함한다 (도 1).
돌연변이 SNP (2273-1 (A))를 포함하는 헌팅틴 (htt) mRNA에 상보적으로 설계된 소수성 변형 RNA (hsiRNA)를 psiCheck 리포터 플라스미드 시스템으로 효능에 대해 스크리닝하였다. SNP 다음의 숫자는 siRNA에서 SNP의 위치를 나타낸다 (도 47). 도 2는 위치 2, 4 또는 6에 SNP를 배치하는 것이 돌연변이 대립유전자에 대한 효능을 잃지 않으면서 가장 큰 SNP 확인을 제공함을 보여준다. 두 개의 리포터 플라스미드 중 하나로 형질감염된 HeLa 세포를 수동 흡수에 의해 1.5 μM hsiRNA로 역 형질감염시키고 72시간 동안 처리하였다. 루시퍼라제 활성을 형질감염 후 72시간에 측정하였다 (도 2).
hsiRNA를 HeLa 세포에서 투여량 반응 이중 루시페라제 분석에서 대립유전자 확인에 대해 추가로 시험하였다 (도 3). 다중 hsiRNA는 야생형 리포터 플라스미드와 비교하여 돌연변이 SNP를 포함하는 리포터 플라스미드를 우선적으로 침묵화시켰다. 두 개의 리포터 플라스미드 중 하나로 형질감염된 HeLa 세포를 수동 흡수에 의해 1.5 μM hsiRNA로 역 형질감염시키고 72시간 동안 처리하였다. 리포터 플라스미드 발현을 형질감염 후 72시간째에 측정하였다 (도 3).
실시예 2: 내인성 Htt mRNA에서 SNP 확인
hsiRNA를 동형접합 rs362273 SNP를 포함하는 내인성 헌팅틴 mRNA에 대한 효능에 대해 시험하였다. HeLa 세포는 rs362273에서 동형접합성이고 각 대립유전자에 A가 있으므로 이 분석에서는 대립유전자 확인이 평가되지 않았다. 대신, 도 4는 2개의 hsiRNA, SNP4-0 및 SNP6-0이 정확한 SNP를 포함하는 htt mRNA를 침묵화시키는데 매우 효과적임을 보여준다. mRNA 수준을 72시간 동안 수동 흡수를 통해 hsiRNA로 HeLa 세포를 처리한 후 Quantigene 2.0 bDNA 분석을 사용하여 측정하였다. 인간 htt mRNA 수준을 인간 HPRT에 대해 정규화하였다.
실시예 3: 더 큰 대립유전자 확인을 위한 제2 미스매치가 있는 hsiRNA 설계
투여량 반응을 위해 이전에 선택된 3개의 hsiRNA (SNP2-0, SNP4-0 및 SNP6-0, 각각 mm2, mm4 및 mm6로도 지정됨) 각각에 대해, 16개의 새로운 hsiRNA를 서열을 약간 변형시켜 설계 및 합성하였다 (도 34). 제2 미스매치가 표적 SNP를 침묵화시키는데 거의 영향을 미치지 않으면서 이전보다 훨씬 더 유의하게 표적외 SNP의 침묵화를 손상시키는지 테스트하기 위해 이러한 서열은 원래 서열을 따라 가능한 모든 위치에 단일 미스매치를 도입하였다. 안티센스 가닥 서열은 5'에서 3'으로 표시되고 SNP 부위는 적색으로 표시되고 새로운 미스매치는 청색으로 표시된다 (도 12).
도 12의 hsiRNA의 효능에 대한 1차 스크린은 SNP에 해당하는 뉴클레오타이드의 위치에 대한 제2 미스매치의 위치가 HeLa 세포에서 다양한 수준의 SNP 확인을 초래한다는 것을 보여주었다. 두 개의 psiCHECK 리포터 플라스미드 중 하나로 형질감염된 HeLa 세포를 수동 흡수에 의해 1.5 μM hsiRNA로 역 형질감염시키고 72시간 동안 처리하였다. 루시페라제 활성을 형질감염 후 72시간째에 측정하였다. 도 5는 다중 hsiRNA가 야생형 리포터 플라스미드와 비교하여 SNP 돌연변이를 포함하는 리포터 플라스미드를 확인적으로 침묵화시킴을 보여준다.
제2 미스매치를 포함하는 가장 효과적인 hsiRNA를 투여량 반응 곡선에서 추가로 테스트하여 개선된 SNP 확인을 확인하였다. 2개의 리포터 플라스미드 중 하나로 형질감염된 HeLa 세포를 수동적 흡수에 의해 hsiRNA로 역형질감염시키고 72시간 동안 처리하였다. 이중 루시퍼라제 분석으로 측정된 리포터 발현. 도 6 내지 도 8은 야생형 리포터 플라스미드에 대한 SNP 돌연변이를 포함하는 리포터 플라스미드를 침묵화시키기 위한 2개의 미스매치를 갖는 hsiRNA의 IC50 값을 보여준다. SNP6-11 hsiRNA (5' 말단으로부터 위치 6에 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드 및 5' 말단으로부터 위치 11에 미스매치가 있는 hsiRNA 분자) 및 SNP4-7 hsiRNA (5' 말단으로부터 위치 4에서의 다형태에 해당하는 뉴클레오타이드 및 5' 말단으로부터 위치 7에서의 미스매치가 있는 hsiRNA 분자)가 가장 효과적인 것으로 나타났다 (도 7 내지 도 9 참조). 놀랍게도, SNP 주변의 변형 패턴을 변이하면 확인을 손상시키지 않고 제2 미스매치를 도입하여 손실된 효능을 복원시킨다. SNP6-11 hsiRNA를 미스매치 뉴클레오타이드 (또한 2'O-메틸 변형을 갖는 미스매치 뉴클레오타이드 자체)에 측접하는 2'O-메틸 변형을 갖도록 변이시켰다 (도 10 참조).
실시예 4: 추가 변형
선택적으로, 본 명세서에서 및 예를 들어, 미국 제 15/089,423호; 미국 제 15/236,051호; 미국 제 15/419,593호; 미국 제 15/697,120호 및 미국 특허 제 9,809,817호; 및 미국 제 15/814,350호 및 미국 특허 제 9,862,350호에 기재된 변형 (예를 들어, 화학적 변형) 및/또는 접합의 다양한 조합을 사용하여, 다양한 올리고뉴클레오타이드 유형 (예를 들어, 갭 인자, 혼합 인자, miRNA 억제제, 스플라이싱-전환 올리고뉴클레오타이드 ("SSO"), 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드 ("PMO"), 펩타이드 핵산 ("PNA") 등)을 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오타이드에 사용할 수 있으며, 상기 문헌 각각은 모든 목적을 위해 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오타이드는 di-siRNA로서 설계될 수 있다 (예를 들어, 도 14 참조). 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 상이한 골격 연결을 포함할 수 있다 (예를 들어, 도 15 참조). 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오타이드는 다양한 당 변형을 포함할 수 있다 (예를 들어, 도 16 참조). 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오타이드는 다양한 뉴클레오타이드간 결합을 포함할 수 있다 (예를 들어, 도 17 참조). 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 5' 안정화 변형을 포함할 수 있다 (예를 들어, 도 18 참조). 본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 접합된 모이어티를 포함할 수 있다 (예를 들어, 도 19 참조). 다수의 예시적인 올리고뉴클레오타이드 골격 변형이 도 35에 예시되어 있다.
본 명세서에 기재된 올리고뉴클레오타이드는 단순히 SNP 위치에서 염기를 변이함으로써 SNP 부위에서 G를 표적화하는데 효과적으로 사용될 수 있다. 도 33에 도시된 바와 같이 화합물 SNP6-11을 두 번째로 합성하고, 이는 A 대신 SNP 부위의 G를 표적화하였다. 이는 대립유전자를 선택적으로 침묵화시킬 수 있게 하였으며, 이는 동일한 SNP 부위에서 상이한 이형접합을 갖는 환자에게 매우 유용한 전략이다.
특정 예시적인 실시양태에서, 하나 이상의 염기성 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드, MM 위치 뉴클레오타이드, 5' 말단, 3' 말단, 또는 이의 임의의 조합에서 이용된다.
특정 예시적인 실시양태에서, 대립유전자 특이성을 개선하기 위해 미스매치 주위에 다양한 당 변형, 예를 들어 2'F 대신 2'FANA; SNP/미스매치 위치 주변에 삼중 2'F 또는 삼중 2'OMe를 갖는 hsiRNA를 합성한다.
실시예 5: HTT 마우스 모델
BAC97-HD는 연속적인 폴리글루타민 (polyQ) 가닥을 인코딩하는 97개의 혼합 CAA-CAG 반복을 포함하는 loxP-측접 인간 돌연변이 htt 엑손 1 서열로 인간 htt 엑손 1을 대체함으로써 변형된 전체 병원성 170 kb 인간 헌팅틴 (htt) 게놈 유전자좌위를 포함하는 인간 박테리아 인공 염색체 (BAC) 트랜스제닉 삽입체를 포함하는 트랜스제닉 마우스를 지칭한다.
선두 화합물 (SNP6-11)을 도 31에 예시된 구조를 갖는 이분지형 화합물 지지체로 합성하고 이후 8주령의 BAC97-HD 암컷 마우스에서 40 nmol 양측 뇌실내 (ICV) 주사 (각 측부에 20 nmol)를 통해 생체내에서 테스트하였다. 마우스는 A SNP rs362273A를 갖는 병원성 인간 htt 유전자의 트랜스제닉 삽입물 및 G SNP rs362273을 갖는 정상 마우스 htt 유전자 카피를 가지고 있었다. RNA 전사체에서 표적 매치가 없는 넌센스 서열을 또한 동일한 이분지형 스캐폴드로 합성하여 음성 대조군 (NTC)으로 마우스에 주사하였다.
주사 후 1개월째에 RNA 및 단백질 분석을 위해 마우스로부터 다수의 뇌 영역을 수집하고, Ab1 항체를 사용하여 웨스턴블롯에 의해 HTT 단백질 수준을 측정하였다. 도 32a는 수집된 선조체 조직에 대해 수행된 웨스턴 블롯이며, 빈쿨린으로 정규화된 단백질 수준은 도 32b에 제시되어 있다.
실시예 6: SNP 표적화는 서열 비의존적이다.
선두 화합물의 SNP 확인이 서열 의존적인지를 평가하였다. rs362273에서 U 대 G의 미스매치 또는 C 대 A의 미스매치를 포함하는 헌팅틴 (htt) mRNA에 상보적으로 설계된 소수성 변형 RNA (hsiRNA)를 사용하였다. U 대 G 미스매치에 상보적인 6-11 hsiRNA 및 C 대 A 미스매치에 상보적인 6-11 hsiRNA 둘 모두 우선적으로 표적 SNP를 절단하였다 (도 20).
실시예 7: 비닐 포스포네이트 변형된 하위단위간 결합의 합성
본 명세서에서 논의된 비닐 포스피네이트 변형된 하위단위간 연결의 대표적인 합성은 도 21 내지 도 29에 예시되어 있다. 도 21의 합성 절차는 아래에 자세히 설명되어 있다.
화합물 3a의 합성
피리딘 (100 mL) 중 화합물 2a (16.6 g, 20.8 mmol)의 무수 용액에 무수 DIPEA (6.5 mL, 37.4 mmol) 및 벤조일 클로라이드 (3.6 mL, 31.2 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한 후, 과량의 피리딘을 증발시키고 CH2Cl2로 희석하였다. 유기 용액을 포화 수용액 NaHCO3으로 세척하였다. 유기층을 수집하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 획득된 미정제 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (헥산-에틸 아세테이트, 4:1 내지 1:1)로 정제하여 화합물 3a를 연황색 발포체 (14.5 g, 78%)로 획득하였다; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.88 내지 7.87 (m, 2H), 7.84 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 7.67 내지 7.58 (m, 5H), 7.48 내지 7.45 (m, 4H), 7.39 내지 7.32 (m, 4H), 7.25 내지 7.23 (m, 3H), 7.18 내지 7.17 (m, 2H), 7.12 내지 7.07 (m, 4H), 6.80 내지 6.75 (m, 4H), 6.08 (dd, 1H, J HH = 1.5 Hz, J HF = 15.2 Hz), 5.14, (d, 1H, J HH = 8.3 Hz), 4.59 (ddd, 1H, J HH = 3.7, 1.5 Hz, J HF = 51.9 Hz), 4.43 (ddd, 1H, J HH = 7.4, 4.0 Hz, J HF = 19.1 Hz), 4.24 내지 4.23 (m, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.62 (dd, 1H, J HH = 11.2, 2.0 Hz), 3.35 (dd, 1H, J HH = 11.1, 2.0 Hz), 1.00 (s, 9H); 13C NMR (126 Hz, CDCl3) δ 168.4, 161.8, 158.72, 158.66, 148.9, 143.9, 139.4, 135.71. 135.70, 135.1, 134.8, 134.7, 132.3, 132.2, 131.3, 130.4, 130.2, 130.1, 129.1, 128.2, 128.0,127.91, 127.89, 127.2, 113.19, 113.16, 102.2, 92.5 (d, JCF = 194.4 Hz), 87.7 (d, J CF = 34.5 Hz), 87.2, 82.4, 70.0 (d, J CF = 15.4 Hz), 60.7, 60.4, 55.2, 26.6.
화합물 4a의 합성
화합물 3a (14.5 g, 16.3 mmol)를 트리에틸실란 (8.0 mL, 50.1 mmol)을 포함하는 3% 트리클로로아세트산/CH2Cl2 용액 (200 mL)에 용해시키고 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용액을 포화 수용액 NaHCO3로 3회 세척한 후, 수집된 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 획득된 미정제 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (헥산/에틸 아세테이트, 4:1 내지 3:7)로 정제하여 화합물 4a를 백색 발포체 (8.67 g, 91%)로서 획득하였다; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.89 내지 7.88 (m, 2H), 7.68 내지 7.64 (6H, m), 7.51 내지 7.45 (m, 4H), 7.42 내지 7.38 (4H, m), 5.93 (dd, 1H, J HH = 2.9 Hz, J HF = 15.1 Hz), 5.73 (d, 1H, J HH = 8.2 Hz), 4.74 (ddd, 1H, J HH = 4.1, 3.2 Hz, J HF = 52.2 Hz), 4.31 (ddd, 1H, J HH = 5.8, 4.7, J HF = 15.4 Hz), 4.11 내지 4.09 (m, 1H), 3.82 내지 3.79 (m, 1H), 3.39 (ddd, 1H, J HH = 12.1, 5.6, 1.5 Hz), 1.64 (br, 1H), 1.11 (s, 9H);13C NMR (126 Hz, CDCl3) δ 168.3, 161.8, 149.0, 140.5, 135.7, 135.2, 132.8, 132.3, 131.3, 130.5, 130.4, 130.3, 129.2, 128.02, 127.96, 102.4, 91.8 (d, J CF = 91.8 Hz), 89.5 (d, J CF = 33.6 Hz), 69.5 (d, J CF = 69.5 Hz), 60.3, 26.8.
화합물 6a의 합성
화합물 4a의 무수 용액 (6.5 g, 11.0 mmol)에 IBX (7.7 g, 27.6 mmol)를 첨가하고 85℃에서 2시간 동안 교반하였다. 얼음이 채워진 용기에서 혼합물을 냉각시킨 후, 용액 내의 침전물을 셀라이트를 통해 여과하였다. 수집된 용리액을 증발시키고, 아르곤 대기 하에서 무수 CH3CN과 3회 공증발시키고, 획득된 화합물 5a를 백색 발포체로서 추가 정제 없이 사용하였다. 별도의 플라스크에 CBr4 (7.3 g, 22.1 mmol)를 포함하는 무수 CH2Cl2 (25 mL) 용액에 0℃에서 PPh3 (11.6 g, 44.2 mmol)를 첨가하고 0℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 이 용액에 화합물 5a의 무수 CH2Cl2 용액 (25 mL)을 0℃에서 적가 (10분)하고 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. CH2Cl2로 희석한 후, 유기 용액을 포화 수용액 NH4Cl로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 증발시켰다. 획득된 물질을 0℃에서 격렬하게 교반하면서 과량의 디에틸 에테르 용액에 적가하였다. 용액 중의 침전물을 셀라이트를 통해 여과하고 용리액을 증발시켰다. 획득된 미정제 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (헥산/에틸 아세테이트, 9:1 내지 1:1)로 정제하여 화합물 6a를 백색 발포체 (4.3 g, 52%)로 획득하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.68 내지 7.84 (m, 2H), 7.70 내지 7.65 (m, 3H), 7.60 내지 7.58 (m, 2H), 7.52 내지 7.49 (m, 2H), 7.42 내지 7.36 (m,4H), 7.31 내지 7.28 (m, 2H), 7.09 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 6.25 (d, 1H, J = 8.9 Hz), 5.75 (dd, 1H, J HF = 8.24 Hz), 5.49 (dd, 1H, J HF = 21.4 Hz), 4.77 (t, 1H, J HH = 8.5 Hz, J HF = 8.5 Hz), 4.38 (dd, 1H, J HH = 4.1 Hz, J HF = 52.1 Hz), 4.25 (ddd, 1H, J HH = 8.1, 4.9 Hz, J HF = 19.4 Hz), 1.10 (s, 9H); 13C NMR (126 Hz, CDCl3) δ 167.9, 161.6, 148.3, 141.4, 135.8, 134.7 (d, J C-Br = 139.0 Hz), 132.5, 132.2, 131.1, 130.5, 130.3, 130.2, 129.2, 127.9, 102.7, 97.3, 93.3 (d, J CF = 39.1 Hz), 91.5 (d, J CF = 190.7 Hz), 82.4, 73.9 (d, J CF = 16.4 Hz), 26.7.
화합물 7a-E 및 7a-Z의 합성
DMF (25 mL) 중 화합물 6a (4.2 g, 5.66 mmol)의 무수 용액에 디메틸포스파이트 (2.09 mL, 22.6 mmol) 및 트리에틸아민 (1.58 mL, 11.3 mmol)을 0℃에서 첨가한 다음, 실온에서 밤새 교반하였다. 용액을 에틸 아세테이트로 희석한 후, 유기 용액을 포화 수용액 NH4Cl 및 염수로 세척하였다. 그런 다음 유기 용액을 MgSO4로 건조시키고 여과하고 증발시켰다. 획득된 미정제 물질을 모든 순수한 이성질체 화합물이 별도로 수집될 때까지 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (헥산/에틸 아세테이트, 9:1 내지 1:1)에 의해 반복적으로 정제하여 화합물 7a-E (1.95 g, 52%)를 획득하였다; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.87 내지 7.85 (m, 2H), 7.89 내지 7.85 (m, 3H), 7.61 내지 7.59 (m, 2H), 7.52 내지 7.48 (m, 2H), 7.45 내지 7.32 (m, 6H), 7.08 (d, 1H, J HH = 8.2), 6.49 (d, 1H, J HH = 13.7), 5.99 (dd, 1H, J HH = 13.7 Hz, 8.1 Hz), 5.75 (d, 1H, J HH= 8.2), 5.63 (d, 1H, J HF = 19.8 Hz), 4.43 (dd, 1H, J HF = 52.6 Hz, J HH = 4.3 Hz), 4.42 (t, 1H, J HH = 8.0 Hz), 4.07 (ddd, J HH = 7.8, 4.7 Hz, J HF = 19.5 Hz), 1.08 (s, 9H); 13C NMR (126 Hz, CDCl3) δ 148.4, 140.4, 135.8, 135.7, 135.3, 133.3, 132.3, 132.4, 132.1, 131.1, 130.5, 130.4, 130.3, 129.2, 127.95, 127.93, 112.4, 102.7, 91.7 (d, J CF = 36.3 Hz), 91.6 (d, J CF = 191.6 Hz), 82.8, 73.9 (d, J CF = 16.4 Hz), 26.7, 19.1; 및 7a-Z (0.58 g, 15%); 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.87 내지 7.85 (m, 2H), 7.68 내지 7.65 (m, 3H), 7.61 내지 7.59 (m, 2H), 7.52 내지 7.48 (m, 2H), 7.42 내지 7.39 (m, 2H), 7.34 내지 7.29 (m, 4H), 7.12 (d, 1H, J HH = 8.2 Hz), 6.51 (d, 1H, J HH = 7.4 Hz), 5.96 (dd, 1H, J HH = 8.4 Hz, 7.4 Hz), 5.75 (d, 1H, J HH = 8.2 Hz), 5.57 (dd, 1H, J HH = 1.2 Hz, J HF = 20.6 Hz), 5.04 (dd, 1H, J HH = 8.2 Hz), 4.48 (J HH = 3.5 Hz, J HF = 53.1 Hz), 4.24 (ddd, 1H, J HH = 7.8, 4.9 Hz, J HF = 18.6 Hz), 1.09 (s, 9H); 13C NMR (126 Hz, CDCl3) δ 168.0, 161.7, 148.4, 141.4, 135.9, 135.8, 135.2, 132.6, 132.5, 131.2, 130.6, 130.5, 130.2, 130.1, 129.2, 127.8, 127.7, 114.5, 102.6, 93.0 (d, J CF = 37.2 Hz), 91.6 (d, J CF =191.6 Hz), 80.3, 74.3 (d, J CF = 16.4 Hz), 26.7, 19.1.
화합물 9a의 합성
무수 화합물 7a-E (1.95 g, 2.94 mmol) 및 Pd (OAc)2 (125 mg, 0.59 mmol) 및 [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐 (II) (652 mg, 1.18) mmol)을 아르곤으로 퍼징 (purging)한 다음, 무수 THF (50 mL)에 용해시켰다. 프로필렌 옥사이드 (2.06 mL, 29.4 mmol)를 첨가한 후, 화합물 8a (2.07 g, 3.24 mmol)를 한번에 첨가하고 70℃에서 4시간 동안 교반하였다. 감압하에 용매를 제거한 후, 미정제 혼합물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (헥산/에틸 아세테이트, 50:50 내지 0:100)로 정제하고, 획득된 화합물 9a를 포함하는 분획을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2-MeOH, 0% 내지 5%)에 의해 추가로 정제하여 부분입체 이성질체의 혼합물로서 화합물 9a를 생성하였다 (2.04 g, 57%); 31P NMR (202 MHz, CDCl3) δ 18.3.
화합물 10a의 합성
무수 THF (22.5 mL) 중 화합물 9a (2.0 g, 1.64 mmol)에 1.0 M TBAF-THF (2.5 mL, 2.5 mmol)를 첨가하고 주위 온도에서 30분 동안 교반하였다. CH2Cl2 (120 mL)로 희석한 후, 유기층을 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 증발시켰다. 획득된 미정제 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (1% TEA-CH2Cl2/MeOH, 0% 내지 6%)로 정제하여 화합물 10a (1.52 g, 94%)를 획득하였다; 31P NMR (202 MHz, CDCl3) δ 19.0, 18.7.
화합물 11a의 합성
화합물 10a (589.7 mg, 0.6 mmol)를 무수 CH3CN과의 반복적인 동시 증발에 의해 무수물로 제조한 다음 무수 CH2Cl2 (6.0 mL)에 용해시켰다. 이 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.31 mL, 1.8 mmol) 및 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포르아미다이트 (0.16 mL, 0.72 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 0℃에서 30분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 과량의 CH2Cl2로 희석하였다. 유기층을 포화 수용액 NaHCO3으로 반복적으로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 증발시켰다. 획득된 미정제 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (1% TEA-CH2Cl2/MeOH, 100%에서 4%로)로 정제하여 화합물 11a를 백색 발포체 (570 mg, 80%)로서 획득하였다; 31P NMR (202 MHz, CDCl3) δ 150.3, 151.2, 151.1, 151.0, 18.72, 18.65, 18.55, 18.3.
화합물 4b의 합성
피리딘 (10 mL) 중 화합물 3b (1.35 g, 2.0 mmol)의 무수 용액에 DIPEA (0.63 mL, 3.6 mmol) 및 벤조일 클로라이드 (0.35 mL, 3.0 mmol)를 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 과량의 CH2Cl2로 희석한 후, 유기 용액을 포화 수용액 NaHCO3 및 염수로 세척하였다. MgSO4로 건조하고, 여과하고, 증발시킨 후, 획득된 미정제 물질을 추가 정제 없이 다음 반응에 사용하였다. 화합물 3b를 포함하는 획득된 미정제 물질을 트리에틸실란 (1 mL, 6.26 mmol) 및 CH2Cl2 중 3% 트리클로로아세트산 (25 mL)에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 CH2Cl2로 희석한 후, 용액을 포화 수용액 NaHCO3으로 3회 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하여, 증발시켰다. 획득된 미정제 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (헥산/에틸 아세테이트, 4:1 내지 1:4)로 정제하여 순수한 화합물 4b (596.7 mg, 63%, 2단계)를 획득하였다; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.13 (d, 1H, J HH = 8.2 Hz), 7.95 (d, 2H, J HH = 7.3 Hz), 7.81 (t, 1H, J HH = 7.5 Hz), 7.69 내지 7.68 (m, 2H), 7.64 내지 7.59 (m, 4H), 7.49 내지 7.42 (m, 6H), 5.93 (d, 1H, J HH = 4.6 Hz), 5.26 (t, 1H, J HH = 4.6 Hz), 4.36 (dd, 1H, J HH = 4.6, 4.6 Hz), 4.02 내지 4.00 (m, 1H), 3.65 내지 3.61 (m, 1H), 3.54 (dd, 1H, J HH = 4.6, 4.6 Hz), 3.09 (s, 3H), 1.03 (s, 9H);13C NMR (126 Hz, DMSO-d6) 169.8, 162.1, 149.5, 141.3, 136.1, 135.9, 135.8, 133.4, 133.2, 131.5, 130.7, 130.52, 130.48, 130.0, 128.4, 128.3, 102.1, 86.7, 85.6, 82.8, 79.7, 70.8, 60.2, 57.8, 27.2, 19.4; HRMS (ESI) m/z 계산치 C33H35N2O7Si- [M - H]- m/z 599.2219, 실측치 m/z 599.2258.
화합물 6b의 합성
CH3CN (5 mL) 중 화합물 4b (300.4 mg, 0.5 mmol)의 무수 용액에 IBX (350 mg, 1.3 mmol)를 첨가하고 85℃에서 2시간 동안 교반하였다. 용액을 0℃로 냉각시킨 후, 침전물을 셀라이트 여과로 여과하였다. 화합물 5b를 포함하는 획득된 용리액을 증발시키고, 무수 CH3CN과의 반복적인 동시 증발에 의해 무수물을 제조하고, 추가 정제 없이 다음 반응에 사용하였다. 별도로 제조된 CH2Cl2 (5.0 mL) 중 CBr4 (331.6 mg, 1.0 mmol)의 무수 용액에 트리페닐포스핀 (524.6 mg, 2.0 mmol)을 0℃에서 한번에 첨가하고 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 이 용액에 무수 CH2Cl2 (1.5 mL) 중의 화합물 5b를 0℃에서 적가 (10분)하고 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 그 다음 용액을 CH2Cl2로 희석하고 포화 수용액 NaHCO3 및 염수로 세척하였다. 유기 용액을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 증발시킨 후, 획득된 미정제 물질을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 (헥산/에틸 아세테이트, 9:1 내지 4:6)로 정제하여 화합물 6b (210.9 mg, 56%)를 획득하였다; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.88 (d, 2H, J HH = 7.3 Hz), 7.70 내지 7.62 (5H, m), 7.51 내지 7.38 (m, 9H), 7.08 (d, 1H, J HH = 8.2 Hz), 6.26 (d, 1H, J HH = 8.6 Hz), 5.75 (d, 1H, J HH = 8.2 Hz), 5.68 (d, 1H, J HH = 0.8 Hz), 4.84 (dd, 1H, J HH = 8.6 Hz, 8.6 Hz), 3.86 (dd, 1H, J HH = 7.5 Hz, 5.0 Hz), 3.30 (s, 3H), 3.18 (br, 1H), 1.11 (s, 9H); 13C NMR (126 Hz, CDCl3) 168.3, 161.7, 148.6, 138.9, 135.9, 135.8, 134.3, 132.6, 132.4, 131.2, 130.5, 130.4, 130.3, 129.2, 128.0, 127.9, 102.4, 97.5, 90.0, 82.44, 82.39, 74.4, 58.2, 26.7, 19.1; HRMS (ESI) m/z 계산치 C34H33Br2N2O6Si- [M - H]- m/z 751.0480 [M-H]-, 실측치 m/z 753.6495.
7b-E 및 7b-Z의 합성
DMF (35 mL) 중 화합물 6b (6.11 g, 8.1 mmol)의 무수 용액에 디메틸포스파이트 (2.97 mL, 34.0 mmol) 및 트리에틸아민 (2.26 mL, 17.0 mmol)을 0℃에서 첨가한 다음, 실온에서 밤새 교반하였다. 용액을 에틸 아세테이트로 희석한 후, 유기 용액을 포화 수용액 NH4Cl 및 염수로 세척하였다. 그 다음, 유기 용액을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 증발시키고, 획득된 미정제 물질을 모든 순수한 이성질체 화합물이 별도로 수집될 때까지 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (헥산/에틸 아세테이트, 9:1 내지 1:1)로 반복적으로 정제하여 화합물 7b-E (3.0 g, 55%)를 획득하였다; 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.89 내지 7.87 (m, 2H), 7.70 내지 7.62 (m, 5H), 7.51 내지 7.39 (m, 8H), 7.10 (d, 1H, J HH = 8.3 Hz), 6.47 (dd, 1H, J HH = 13.6, 0.8 Hz), 6.01 (dd, 1H, J HH = 13.6, 7.9 Hz), 5.76 내지 5.74 (m, 2H), 4.51 (dd, 1H, J HH = 7.8, 7.8 Hz), 7.36 (dd, 1H, J HH = 7.8 Hz, 4.9 Hz), 3.34 (s, 3H), 3.17 (dd, 1H, J HH = 4.7, 1.2 Hz), 1.09 (s, 9H); 13C NMR (126 Hz, CDCl3) δ 168.3, 161.7, 148.7, 138.4, 135.9, 135.8, 135.3, 133.8, 132.6, 132.4, 131.2, 130.5, 130.4, 130.3, 129.2, 128.0, 127.9, 112.1, 102.3, 88.9, 82.8, 82.6, 77.2, 74.2, 58.1, 26.8, 19.1; 및 7b-Z (1.23 g, 22%); 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.89 내지 7.87 (m, 2H), 7.72 내지 7.70 (m, 2H), 7.68 내지 7.63 (m, 3H), 7.51 내지 7.44 (m, 4H), 7.41 내지 7.37 (m, 4H), 7.16 (d, 1H, J - 8.2 Hz), 6.53 (dd, 1H, J HH = 7.4, 0.6 Hz), 6.03 (dd, 1H, J HH = 8.5, 7.4 Hz), 5.75 내지 5.73 (m, 2H), 5.12 (t, 1H, J HH = 8.1 Hz), 3.93 (dd, 1H, J HH = 6.9, 5.0 Hz), 3.32 (br, 1H), 3.26 (s, 3H), 1.10 (s, 9H); 13C NMR (126 Hz, CDCl3) δ 168.3, 161.8, 148.7, 139.3, 135.91, 135.85, 135.22, 132.74, 132.71, 131.2, 130.8, 130.5, 130.23, 130.16, 129.2, 127.78, 127.75, 114.6, 102.2, 90.1, 82.4, 80.6, 77.2, 74.8, 58.1, 26.8, 19.2.
화합물 8b의 합성
무수 5'-O-DMTr-2'-데옥시-2'-플루오로-3'-[메틸-N,N-(디이소프로필)아미노]포스포-아미다이트 (4.26 g, 6.0 mmol)를 0.45 M 1H-테트라졸/CH3CN 용액 (27 mL, 12 mmol)에 용해시키고 실온에서 30분 동안 교반하였다. 이 용액에 H2O (3.6 mL)를 첨가하고 실온에서 30분간 교반하였다. 에틸 아세테이트로 희석한 후, 유기 용액을 염수로 6회 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 증발시켰다. 약간의 불순물을 포함하여 획득된 화합물 8b를 추가 정제 없이 다음 반응에 사용하였다; 31P NMR (CDCl3, 202 MHz) δ 8.92, 8.28.
화합물 9b의 합성
무수 화합물 7b-E (2.84 g, 4.20 mmol) 및 Pd(OAc)2 (188.6 mg, 0.84 mmol) 및 [1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]디클로로팔라듐 (II) (931.4 mg, 1.68 mmol)을 아르곤으로 퍼징한 다음, 무수 THF (50 mL)에 용해시켰다. 프로필렌 옥사이드 (2.94 mL, 42.0 mmol)를 첨가한 후, 화합물 9b (3.16 g, 5.04 mmol)를 한번에 첨가하고 70℃에서 4시간 동안 교반하였다. 감압하에 용매를 제거한 후, 미정제 화합물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (헥산-에틸 아세테이트, 50:50 내지 0:100)로 정제하고, 획득된 화합물 9b를 포함하는 분획을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (1% TEA-CH2Cl2/MeOH, 0% 내지 5%)에 의해 추가로 정제하여 부분입체이성질체의 혼합물로서 화합물 9b를 생성하였다 (3.3 g, 64%); 31P NMR (202 MHz, CDCl3) δ 19.31, 18.72.
화합물 10b의 합성
무수 THF (36.5 mL) 중 화합물 9b (3.3 g, 2.70 mmol)에 1.0 M TBAF-THF (4.05 mL, 4.05 mmol)를 첨가하고 주위 온도에서 30분 동안 교반하였다. CH2Cl2 (150 mL)로 희석한 후, 유기층을 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 증발시켰다. 획득된 미정제 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (1% TEA-CH2Cl2/MeOH, 0% 내지 8%)로 정제하여 화합물 10b (1.25 g, 47%)를 획득하였다; 31P NMR (202 MHz, CDCl3) δ 19.8, 19.1.
화합물 11b의 합성
화합물 10b (393.2 mg, 0.4 mmol)를 무수 CH3CN과의 반복적인 동시 증발에 의해 무수물을 제조한 다음, 무수 CH2Cl2 (4.0 mL)에 용해시켰다. 이 용액에 N,N-디이소프로필에틸아민 (0.21 mL, 1.2 mmol) 및 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포르아미다이트 (0.11 mL, 0.48 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 0℃에서 30분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 과량의 CH2Cl2로 희석하였다. 유기층을 포화 수용액 NaHCO3로 세척하고, MgSO4로 건조하고 여과하여 증발시켰다. 획득된 미정제 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (1% TEA-CH2Cl2/MeOH, 100% 내지 4%로)로 정제하여 화합물 11b를 백색 발포체 (319.6 mg, 68%)로서 획득하였다; 31P NMR (202 MHz, CDCl3) δ150.7, 150.4, 150.3, 19.9, 19.5, 19.4, 18.8.
실시예 8: 비닐 포스포네이트-변형된 올리고뉴클레오타이드의 고체 지지체 매개 합성
비닐 포스피네이트 변형된 하위단위간 연결을 갖는 올리고뉴클레오타이드의 대표적인 합성이 도 22에 도시되어 있다. 합성된 VP-변형된 서열의 예는 도 28a 내지 도 28b에서 찾을 수 있다.
뉴클레오타이드간 (E)-비닐 포스포네이트 변형된 RNA 올리고뉴클레오타이드의 합성.
하나의 비닐 포스포네이트 연결을 갖는 합성 RNA 올리고뉴클레오타이드의 합성을 2'-변형된 (2'-플루오로, 2'-O-메틸) 포스포아미다이트 및 비닐포스포네이트-연결 이량체 포스포르아미다이트의 0.1 M 무수 CH3CN 용액을 사용하여 MerMade 12 자동 RNA 합성기 (BioAutomation)에서 수행하였다. 고체 지지체를 위해 UnyLinker 지지체 (ChemGenes)를 사용하였다. (i) 디트리틸화, (ii) 연결, (iii) 캡핑 및 (iv) 요오드 산화로 구성된 표준 1.0 μmol 규모 RNA 포스포라미다이트 합성 사이클에 의해 합성을 수행하였다. 무수 CH3CN 중 5-(벤질티오)-1H-테트라졸을 포스포라미다이트 활성화 시약으로 사용하고, CH2Cl2 중의 3% 디클로로아세트산을 디트리틸화에 사용하였다. 테트라하이드로푸란 (Cap A) 및 80:10:10 (v/v/v) 테트라하이드로퓨란-Ac2O-2,6-루티딘 (Cap B) 중 16% N-메틸이미다졸을 캡핑 반응에 사용하였다. THF-피리딘-H2O (7:2:1, v/v/v) 중 0.02 M I2를 산화에 사용하고 피리딘:CH3CN (9:1, v/v) 중 0.1 M 3-[(디메틸아미노-메틸리덴)아미노]-3H-1,2,4-디티아졸3-티온을 황화에 사용하였다. 5'-말단 인산화를 위해 비스(2-시아노에틸)-N,N-디이소프로필 포스포르아미다이트를 사용하였다. 3'-콜레스테롤 변형 RNA 올리고뉴클레오타이드 합성을 위해 콜레스테롤 3'-lcaa CPG 500Å (ChemGenes)을 사용하였으며, RNA 합성을 VP-변형 RNA와 동일한 조건으로 수행하였다. 화학 사슬 연장 후, 26℃에서 48시간 동안 NH4OH-EtOH (3:1, v/v)에 의해 고체 지지체로부터의 탈보호 및 절단을 수행하였다. 비닐 포스포네이트 변형된 RNA의 경우, 고체 지지체 상의 RNA를 RNA 합성 컬럼에서 주위 온도에서 1시간 동안 TMSBr-피리딘-CH2Cl2 (3:1:18, v/v/v)로 먼저 처리하였다. 그런 다음 고체 지지체를 합성 컬럼을 통해 흐르는 용액에 의해 물 (1 mL x 3), CH3CN (1 mL x 3) 및 CH2Cl2 (1 mL x 3)로 세척한 다음 진공 하에 건조하였다. 고체 지지체를 돌려서 따는 뚜껑이 있는 샘플 튜브에 옮긴 후 NH4OH-EtOH (3:1, v/v)로 26℃에서 48시간 동안 염기 처리를 수행하였다. 콜레스테롤 접합체가 없는 미정제 RNA 올리고뉴클레오타이드를 표준 음이온 교환 HPLC로 정제하고, 콜레스테롤-접합체가 있는 RNA를 역상 HPLC로 정제하였다. 획득된 모든 정제된 RNA를 Sephadex G-25 (GE Healthcare)로 탈염하고 전자분무 이온화 질량 분석 (ESI-MS) 분석으로 특성화하였다.
실시예 9: 침묵화 효능
도 23 및 24는 본 명세서에서 연구된 VP-변형된 siRNA의 시각적 표시를 제공한다. 도 25는 가이드 가닥 상의 다양한 위치에서 하위단위간 연결에서 하나 이상의 비닐 포스포네이트 변형이 침묵화에 미치는 효과를 도시한다. 도 25에 도시된 바와 같이, RISC는 VP 변형에 매우 감응성이며 다양한 위치에서 미스매치 염기쌍이 있으면 siRNA 효능을 방해할 수 있다.
도 26, 도 27a, 및 도 27b는 또한 돌연변이 대립유전자를 침묵화시키는 VP-변형된 siRNA의 작용을 도시한다. 도 27a 및 27b에 도시된 바와 같이, siRNA 서열에 미스매치를 추가하면 돌연변이 대립유전자 침묵화에 영향을 미치지 않으면서 대립유전자 확인을 개선할 수 있다. 도 30은 SNP 부위 옆에 VP-변형된 연결을 도입하면 SNP-선택적 siRNA의 표적/비표적 확인을 유의하게 향상시켰음을 나타낸다. 1차 (위치 6) 및 2차 (위치 11) SNP를 포함하는 화합물을 위치 5와 6 사이에 VP-변형의 존재 또는 부재 하에 합성하였다. 도 30에 도시된 바와 같이, VP-변형의 존재는 "표적내" 활성에 영향을 미치지 않았지만, 비-표적 mRNA에 대한 임의의 검출가능한 침묵화를 완전히 제거하였다. 도 25, 26, 27a, 및 27b의 데이터 생성 방법은 하기에 기재되어 있다.
hsiRNA 수동 전달 .
세포를 96-웰 세포 배양 플레이트에서 웰당 8,000개 세포로 6% FBS를 포함하는 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에 플레이팅하였다. hsiRNA를 OptiMEM (Carlsbad, CA; 31985-088)에서 최종 농도의 2배로 희석하고 50 μL의 희석된 hsiRNA를 50 μL의 세포에 첨가하여 3% FBS 최종을 생성하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 시험관내 투여량 반응 분석에서 최대 투여량은 1.5 μM 화합물이었다.
표적 mRNA의 정량 분석 방법.
QuantiGene 2.0 분석 키트 (Affymetrix, QS0011)를 사용하여 세포로부터 mRNA를 정량화하였다. 세포를 55℃에서 30분 동안 용해 혼합물 (Affymetrix, 13228) 1부, H2O 2부 및 0.167 μg/μL 프로테나제 K (Affymetrix, QS0103)로 구성된 250μL 희석된 용해 혼합물에 용해시켰다. 세포 용해물을 완전히 혼합하고, 40 μL의 각 용해물을 프로테나제 K의 부재 하에 20 μL 희석된 용해 혼합물과 함께 포획 플레이트의 웰마다 첨가하였다. 인간 HTT 및 HPRT용 프로브 세트 (Affymetrix; #SA-50339, SA-10030)를 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 희석하여 사용하였다. 데이터 세트를 HPRT로 정규화하였다.
막대 그래프 생성 방법.
데이터를 GraphPad Prism 7 소프트웨어 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 분석하였다. 농도 의존 IC50 곡선을 log (억제제) 대 반응 - 가변 기울기 (4개의 매개변수)를 사용하여 그래프화하였다. 각 세포 처리 플레이트에 대해, 각 투여량에서의 녹다운 수준을 대조군 (미처리군)의 평균으로 정규화하였다. 곡선의 하한은 5 미만으로 설정하고, 곡선의 상한은 95보다 크게 설정하였다. 막대 그래프를 생성하기 위해 IC50 값에서 각각의 해당하는 대조군 화합물에 대한 IC50 값을 빼고 대조군 화합물에 대한 IC50 값으로 나누고 100을 곱하여 백분율 차이를 계산하였다. 백분율 차이가 -500% 미만인 경우 백분율 차이는 인위적으로 -500%로 설정하였다. 그래프의 하한은 -300%에서 종결시켰다.
본 출원 전체에 걸쳐 인용될 수 있는 모든 인용 참조문헌 (참조문헌, 특허, 특허 출원 및 웹사이트 포함)의 내용은 본 명세서에 인용된 참조문헌과 같이 임의의 목적을 위해 그 전문이 본 명세서에 참조로 명시적으로 포함된다. 본 개시내용은 달리 지시되지 않는 한, 당업계에 널리 공지된 면역학, 분자 생물학 및 세포 생물학의 통상적인 기술을 사용할 것이다.
본 개시내용은 그 사상 또는 필수적인 특징을 벗어나지 않으면서 다른 특정한 형태로 구현될 수 있다. 따라서, 전술한 실시양태는 모든 측면에서 본 개시내용을 제한하는 것이 아니라 예시적인 것으로 간주되어야 한다. 따라서 본 개시내용의 범위는 전술한 설명보다는 첨부된 청구범위에 의해 지정되고, 따라서 청구범위의 균등물의 의미 및 범위 내에 있는 모든 변형은 본 명세서에 포함되도록 의도된다.
실시예 10: 1차 스크리닝은 SNP rs362307 이형접합체에 대한 다수의 효과적인 siRNA 서열을 산출한다.
대안적인 돌연변이 SNP (rs362307) (도 39)를 포함하는 HTT mRNA에 상보적이도록 설계된 siRNA를 모두 대상 SNP에 대한 표적 영역을 포함하는 리포터 플라스미드로 스크리닝하였다 (도 40). 2개의 리포터 플라스미드 중 하나로 형질감염된 HeLa 세포를 수동 흡수에 의해 1.5 uM hsiRNA로 역 형질감염시키고 72시간 동안 처리하였다. SNP 다음의 숫자는 siRNA에서 SNP의 위치를 나타낸다. 이 SNP는 주변 영역의 높은 G/C 함량을 기반으로 표적화하기가 더 어려울 것으로 예상되었다. 위치 3에 SNP를 배치하는 것이 돌연변이 대립유전자에 대한 효능을 잃지 않으면서 최대의 SNP 확인을 제공하는 것으로 보이며, 이는 최적의 SNP 위치가 서열 특이적임을 나타낸다 (도 41). 따라서 임의의 SNP에 대한 최적의 SNP 위치를 선택하기 위해 이러한 1차 스크리닝 프로세스를 수행할 수 있다.
실시예 11: SNP rs362307에 적용할 때 2차 미스매치가 대립유전자 확인을 지속적으로 향상시킨다.
도 42에 도시된 바와 같이, 모든 가능한 위치에 미스매치가 도입된 신규 서열의 1차 스크린은 위치 rs362307에서도 SNP 확인이 증가된 다수의 효과적인 hsiRNA를 산출한다. 위치 7과 8에 미스매치를 도입하면 표적 침묵화 효능을 유지하면서 선택성이 증가하는 것으로 나타났다. 다른 2차 미스매치는 우수한 확인을 제공했지만 전반적으로 활성이 감소하였다.
실시예 12: SNP를 포함하는 서열에서 SNP 확인 측정
표 5 내지 표 7에 개시된 각각의 서열 (즉, 특정 SNP 위치 뉴클레오타이드 및 미스매치 (MM) 위치 뉴클레오타이드 조합을 갖는 각각의 hsiRNA)에 의한 SNP 확인을 측정하기 위해, htt의 야생형 영역 또는 서열의 SNP가 있는 htt의 동일한 영역을 포함하는 psiCHECK 리포터 플라스미드를 제조하고 이중 루시퍼라제를 사용하여 테스트하였다. 2개의 리포터 플라스미드 중 하나로 형질감염된 HeLa 세포를 수동 흡수에 의해 hsiRNA로 역 형질감염시키고 72시간 동안 처리하였다. 루시퍼라제 활성을 추가 미스매치의 존재 또는 부재 하에 분석에서 측정한 다음 투여량 반응 곡선에 도시되고 침묵화의 효능과 확인 측면에서 최적의 결과를 산출하는 서열을 확인하기 위해 비교한다.
실시예 13: 포스피네이트-변형된 하위단위간 연결의 합성
포스피네이트-변형된 하위단위간 연결을 제조하는 방법은 도 44a 내지 도 44c에 요약되어 있다. 이 방법은 유리 알코올에서 해당하는 케톤으로의 존스 산화 (Jones oxidation) 후 중간체 화합물 3에 나타낸 엑소메틸렌 모이어티를 확립하기 위한 위티그 올레핀화 (Wittig olefination)를 포함한다. BOM으로 아미드를 보호한 후 수소화붕소화 산화에 의해 유리 알코올 중간체 5를 생성한다. 메실화 후 변형된 Finkelstein 반응에 의해 요오드화된 중간체 7을 생성하고, 이를 메틸 포스피네이트 단량체 9를 획득하기 위해 이를 추가 작용화에 적용시킨다.
단량체 18을 확립하기 위해, 다양한 보호 및 탈보호 단계를 사용하여 단량체 13을 확립한다. IBX 산화에 의해 해당하는 케톤을 생성한 후 위티그 올레핀화를 통해 메틸렌에 접근한다. 다시 한 번, 수소화붕소화-산화 후 메실화 및 핀켈스타인 반응 (Finkelstein reaction)으로 단량체 18을 생성한다.
염기성 조건 하에 단량체 9 및 18을 조합하여 포스피네이트-연결된 이량체 19를 생성한다. 산-매개 및 펄만 (Pearlman) 촉매 탈보호 후 추가 포스파나민 작용화에 의해 이량체 22를 생성한다.
실시예 14: 효능 및 확인을 변형하기 위한 2'-OMe/2'-F 함량 변이
SNP 및 미스매치 부위 주변의 2'-O-메틸/플루오로 골격 변형 패턴을 변이함으로써, siRNA의 효능 및 확인을 변형시켰다 (도 48a 내지 도 48d). SNP 위치에 인접한 다량의 2'-플루오르화는 표적 결합을 개선했지만 표적 확인을 감소시켰다. 그 후 미스매치 주변에 다량의 2'-O-메틸화를 추가하면 플루오르화로 인해 손실된 확인이 복원된다. 위에 기재된 원래의 화학적 변형 패턴이 생체내 연구에 유익했지만, 이 실시예에 기재된 기술은 본 명세서에 기재된 SNP-표적화 화합물을 미세 조정하고 추가의 신규 SNP-표적화 화합물을 확인하는데 사용할 수 있다.

Claims (63)

  1. (a) 5' 말단(5' end) 및 3' 말단;
    (b) 대립유전자 다형태(allelic polymorphism)를 포함하는 유전자의 영역에 상보적인 시드 영역(seed region);
    (c) 단일 뉴클레오타이드 다형태 SNP 위치 뉴클레오타이드가 대립유전자 다형태에 상보적인, 시드 영역 내의 위치의 단일 뉴클레오타이드 다형태 (SNP) 위치 뉴클레오타이드;
    (d) 유전자 내의 뉴클레오타이드와의 미스매치(mismatch)가 있는 미스매치 (MM) 위치 뉴클레오타이드; 및
    (e) SNP 위치 뉴클레오타이드의 어느 한 쪽의 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드 (X) (각각의 X는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 4, 3 또는 2개의 뉴클레오타이드 내에 위치함)
    를 포함하는, 핵산.
  2. (a) 5' 말단 및 3' 말단;
    (b) 대립유전자 다형태를 포함하는 유전자의 영역에 상보적인 시드 영역;
    (c) 단일 뉴클레오타이드 다형태 (SNP) 위치 뉴클레오타이드가 대립유전자 다형태에 상보적인, 시드 영역 내의 위치의 단일 뉴클레오타이드 다형태 (SNP) 위치 뉴클레오타이드;
    (d) 유전자 내의 뉴클레오타이드와의 미스매치가 있는 미스매치 (MM) 위치 뉴클레오타이드; 및
    (e) MM 위치 뉴클레오타이드의 어느 한 쪽의 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드 (Y) (각각의 Y는 MM 위치 뉴클레오타이드로부터 4, 3 또는 2개의 뉴클레오타이드 내에 위치함)
    를 포함하는, 핵산.
  3. 제1항에 있어서, X는 2'-O-메틸 (2'-OMe), 2'-플루오로 (2'-F), 2'-리보, 2'-데옥시리보, 2'-F-4'-티오아라비노 (2'-F-ANA), 2'-O-(2-메톡시에틸) (2'-MOE), 4'-S-RNA, 잠금(locked) 핵산 (LNA), 4'-S-F-ANA, 2'-O-알릴, 2'-O-에틸아민, 2'-O-시아노에틸-RNA (CNet-RNA), 트리사이클로-DNA, 사이클로헥세닐 핵산 (CeNA), 아라비노 핵산 (ANA), 및 헥시톨 핵산 (HNA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 당 변형(sugar modification)을 포함하는, 핵산.
  4. 제2항에 있어서, Y는 2'-OMe, 2'-F, 2'-리보, 2'-데옥시리보, 2'-F-ANA, 2'-MOE, 4'-S-RNA, LNA, 4'-S-F-ANA, 2'-O-알릴, 2'-O-에틸아민, CNet-RNA, 트리사이클로-DNA, CeNA, ANA, 및 HNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 당 변형을 포함하는, 핵산.
  5. 제1항에 있어서, X는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 또는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치하는, 핵산.
  6. 제1항에 있어서, X는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 및 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치하는, 핵산.
  7. 제2항에 있어서, Y는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 또는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치하는, 핵산.
  8. 제2항에 있어서, Y는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 및 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치하는, 핵산.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2 내지 위치 6에 존재하는, 핵산.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, MM 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 11개 뉴클레오타이드에 위치하는, 핵산.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, MM 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 6개 뉴클레오타이드에 위치하는, 핵산.
  12. (a) 5' 말단 및 3' 말단;
    (b) 대립유전자 다형태를 포함하는 유전자의 영역에 상보적인 시드 영역;
    (c) SNP 위치 뉴클레오타이드가 대립유전자 다형태에 상보적인, 시드 영역 내의 위치의 단일 뉴클레오타이드 다형태 (SNP) 위치 뉴클레오타이드;
    (d) 유전자 내의 뉴클레오타이드와의 미스매치가 있는 미스매치 (MM) 위치 뉴클레오타이드;
    (e) SNP 위치 뉴클레오타이드의 어느 한 쪽의 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드 (X) (각각의 X는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 4, 3 또는 2개의 뉴클레오타이드 내에 위치함); 및
    (f) MM 위치 뉴클레오타이드의 어느 한 쪽의 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드 (Y) (각각의 Y는 MM 위치 뉴클레오타이드로부터 4, 3 또는 2개의 뉴클레오타이드 내에 위치함)
    를 포함하는, 핵산.
  13. 제12항에 있어서, X는 2'-OMe, 2'-F, 2'-리보, 2'-데옥시리보, 2'-F-ANA, 2'-MOE, 4'-S-RNA, LNA, 4'-S-F-ANA, 2'-O-알릴, 2'-O-에틸아민, CNet-RNA, 트리사이클로-DNA, CeNA, ANA, 및 HNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 당 변형을 포함하는, 핵산.
  14. 제12항에 있어서, Y는 2'-OMe, 2'-F, 2'-리보, 2'-데옥시리보, 2'-F-ANA, 2'-MOE, 4'-S-RNA, LNA, 4'-S-F-ANA, 2'-O-알릴, 2'-O-에틸아민, CNet-RNA, 트리사이클로-DNA, CeNA, ANA, 및 HNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 당 변형을 포함하는, 핵산.
  15. 제12항에 있어서, X는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 또는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치하는, 핵산.
  16. 제12항에 있어서, X는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 및 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치하는, 핵산.
  17. 제12항에 있어서, Y는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 또는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치하는, 핵산.
  18. 제12항에 있어서, Y는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 또는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치하는, 핵산.
  19. 제12항에 있어서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2 내지 위치 6에 존재하는, 핵산.
  20. 제12항에 있어서, MM 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 11개 뉴클레오타이드에 위치하는, 핵산.
  21. 제12항에 있어서, MM 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 6개 뉴클레오타이드에 위치하는, 핵산.
  22. 제12항에 있어서, X 및 Y는 동일한 뉴클레오타이드 변형을 포함하는, 핵산.
  23. 제12항에 있어서, X 및 Y는 상이한 뉴클레오타이드 변형을 포함하는, 핵산.
  24. (a) 5' 말단 및 3' 말단;
    (b) 대립유전자 다형태를 포함하는 유전자의 영역에 상보적인 시드 영역;
    (c) 대립유전자 다형태에 상보적인 단일 뉴클레오타이드 다형태 (SNP) 위치 뉴클레오타이드;
    (d) 유전자 내의 뉴클레오타이드와의 미스매치가 있는 미스매치 (MM) 위치 뉴클레오타이드;
    (e) SNP 위치 뉴클레오타이드의 어느 한쪽의 적어도 하나의 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드 (각각의 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 4, 3 또는 2개의 뉴클레오타이드 내에 위치함); 및
    (f) MM 위치 뉴클레오타이드의 어느 한쪽의 적어도 하나의 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드 (각각의 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드는 MM 위치 뉴클레오타이드로부터 4, 3 또는 2개의 뉴클레오타이드 내에 위치함)
    를 포함하는, 핵산.
  25. 제24항에 있어서, 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 위치하거나 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치하는, 핵산.
  26. 제24항에 있어서, 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 위치하고 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치하는, 핵산.
  27. 제24항에 있어서, 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 위치하거나, 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치하는, 핵산.
  28. 제24항에 있어서, 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 위치하고, 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치하는, 핵산.
  29. 제24항에 있어서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 시드 영역 내에 존재하고, MM 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 11개 뉴클레오타이드에 위치하는, 핵산.
  30. 제29항에 있어서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2 내지 위치 6에 존재하고, MM 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 6개 뉴클레오타이드에 위치하는, 핵산.
  31. 제24항에 있어서, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드를 포함하는, 핵산.
  32. 제24항에 있어서, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드를 포함하는, 핵산.
  33. (a) 5' 말단 및 3' 말단;
    (b) 대립유전자 다형태를 포함하는 유전자의 영역에 상보적인 시드 영역;
    (c) 대립유전자 다형태에 상보적인 단일 뉴클레오타이드 다형태 (SNP) 위치 뉴클레오타이드;
    (d) 유전자 내의 뉴클레오타이드와의 미스매치가 있는 미스매치 (MM) 위치 뉴클레오타이드;
    (e) SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 4, 3 또는 2개의 뉴클레오타이드 내에 위치하는 적어도 3개의 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드; 및
    (f) MM 위치 뉴클레오타이드로부터 4, 3 또는 2개의 뉴클레오타이드 내에 위치하는 적어도 3개의 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드,
    를 포함하는, 핵산.
  34. 제33항에 있어서, 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 위치하거나 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치하는, 핵산.
  35. 제33항에 있어서, 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 위치하고 2'-플루오로-리보뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치하는, 핵산.
  36. 제33항에 있어서, 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 위치하거나, 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치하는, 핵산.
  37. 제33항에 있어서, 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로 위치하고, 2'-메톡시-리보뉴클레오타이드는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로 위치하는, 핵산.
  38. 제33항에 있어서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 시드 영역 내에 존재하고, MM 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 11개 뉴클레오타이드에 위치하는, 핵산.
  39. 제38항에 있어서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 5' 말단으로부터 위치 2 내지 위치 6에 존재하고, MM 위치 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 6개 뉴클레오타이드에 위치하는, 핵산.
  40. 표적 유전자(target gene)에 대해 상보성을 갖는 센스 가닥(sense strand) 및 센스 가닥에 대해 상보성을 갖는 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA 분자로서, 안티센스 가닥은 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는, siRNA 분자.
  41. 제40항에 있어서, 센스 가닥은 13개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 내지 17개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는, siRNA 분자.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 안티센스 가닥은 18개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체 내지 22개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는, siRNA 분자.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 15개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖고 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는, siRNA 분자.
  44. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 16개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖고 안티센스 가닥은 20개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 길이를 갖는, siRNA 분자.
  45. 서로 공유결합된 2개 이상의 siRNA 분자를 포함하는 분지형(branched) 올리고뉴클레오타이드로서, 각각의 siRNA 분자는 독립적으로 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항의 siRNA 분자인, 분지형 올리고뉴클레오타이드.
  46. 제45항에 있어서, 분지형 올리고뉴클레오타이드는 서로 공유결합된 2개의 siRNA 분자를 포함하는, 분지형 올리고뉴클레오타이드.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, siRNA 분자는 링커(linker)에 의해 서로 공유결합되는, 분지형 올리고뉴클레오타이드.
  48. (a):
    (i) 5' 말단 및 3' 말단;
    (ii) 대립유전자 다형태를 포함하는 유전자의 영역에 상보적인 시드 영역;
    (iii) SNP 위치 뉴클레오타이드가 대립유전자 다형태에 상보적인, 시드 영역 내의 위치의 단일 뉴클레오타이드 다형태 (SNP) 위치 뉴클레오타이드;
    (iv) 유전자 내의 뉴클레오타이드에 상보적이 아닌 미스매치 (MM) 위치 뉴클레오타이드; 및
    (v) SNP 위치 뉴클레오타이드의 어느 한쪽, MM 위치 뉴클레오타이드의 어느 한쪽 또는 이의 조합에 위치하는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드(각각의 변형된 뉴클레오타이드는 각각 SNP 위치 뉴클레오타이드 또는 MM 위치 뉴클레오타이드로부터 4, 3 또는 2개의 뉴클레오타이드 내에 위치함)
    를 포함하는 뉴클레오타이드의 제1 가닥;
    (b) 뉴클레오타이드의 제1 가닥에 상보적인, 뉴클레오타이드의 제2 가닥
    을 포함하는, 이중 가닥 핵산(double-stranded nucleic acid).
  49. 제48항에 있어서, 변형된 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 (2'-OMe), 2'-플루오로 (2'-F), 2'-리보, 2'-데옥시리보, 2'-F-4'-티오아라비노 (2'-F-ANA), 2'-O-(2-메톡시에틸) (2'-MOE), 4'-S-RNA, 잠금 핵산 (LNA), 4'-S-F-ANA, 2'-O-알릴, 2'-O-에틸아민, 2'-O-시아노에틸-RNA (CNet-RNA), 트리사이클로-DNA, 사이클로헥세닐 핵산 (CeNA), 아라비노 핵산 (ANA), 헥시톨 핵산 (HNA), 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형을 포함하는, 이중 가닥 핵산.
  50. 제48항에 있어서, 변형된 뉴클레오타이드는 SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로, SNP 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로, 또는 이의 혼합에 존재하는, 핵산.
  51. 제48항에 있어서, 변형된 뉴클레오타이드는 MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 5'에 바로, MM 위치 뉴클레오타이드에 대해 3'에 바로, 또는 이의 혼합에 존재하는, 핵산.
  52. 제48항에 있어서, SNP 위치 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 제1 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2 내지 위치 6에 존재하는, 핵산.
  53. 제48항에 있어서, MM 위치 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 제1 가닥의 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 11개 뉴클레오타이드에 위치하는, 핵산.
  54. 제48항에 있어서, MM 위치 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 제1 가닥의 SNP 위치 뉴클레오타이드로부터 2 내지 6개 뉴클레오타이드에 위치하는, 핵산.
  55. 제48항에 있어서, 변형된 뉴클레오타이드는 동일한 뉴클레오타이드 변형, 상이한 뉴클레오타이드 변형, 또는 이의 혼합을 포함하는, 핵산.
  56. 제48항에 있어서, 제1 가닥은 13 내지 17개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는, 핵산.
  57. 제48항에 있어서, 제2 가닥은 18 내지 22개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는, 핵산.
  58. 제48항에 있어서, 제1 가닥은 15개 뉴클레오타이드의 길이를 갖고 제2 가닥은 20개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는, 핵산.
  59. 제48항에 있어서, 제1 가닥은 16개 뉴클레오타이드의 길이를 갖고 제2 가닥은 20개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는, 핵산.
  60. 제48항에 있어서, 제1 가닥은 제2 가닥보다 3 내지 7개 더 많은 뉴클레오타이드를 갖는, 핵산.
  61. 서로 공유결합된 2개 이상의 siRNA 분자를 포함하는 분지형 올리고뉴클레오타이드로서, 각각의 siRNA 분자는
    (a):
    (i) 5' 말단, 3' 말단;
    (ii) 대립유전자 다형태를 포함하는 유전자의 영역에 상보적인 시드 영역;
    (iii) 단일 뉴클레오타이드 다형태 (SNP) 위치 뉴클레오타이드가 대립유전자 다형태에 상보적인, 시드 영역 내의 위치의 단일 뉴클레오타이드 다형태 (SNP) 위치 뉴클레오타이드;
    (iv) 유전자 내의 뉴클레오타이드에 상보적이 아닌 미스매치 (MM) 위치 뉴클레오타이드; 및
    (v) SNP 위치 뉴클레오타이드의 어느 한쪽, MM 위치 뉴클레오타이드의 어느 한쪽 또는 이의 조합에 위치하는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드 (각각의 변형된 뉴클레오타이드는 각각 SNP 위치 뉴클레오타이드 또는 MM 위치 뉴클레오타이드로부터 4, 3 또는 2개의 뉴클레오타이드 내에 위치함)
    를 포함하는 뉴클레오타이드의 제1 가닥;
    (b) 뉴클레오타이드의 제1 가닥에 상보적인, 뉴클레오타이드의 제2 가닥
    을 포함하는 이중 가닥 핵산을 포함하는, 분지형 올리고뉴클레오타이드.
  62. 제61항에 있어서, 분지형 올리고뉴클레오타이드는 서로 공유결합된 2개의 siRNA 분자를 포함하는, 분지형 올리고뉴클레오타이드.
  63. 제61항에 있어서, siRNA 분자는 링커에 의해 서로 공유결합되는, 분지형 올리고뉴클레오타이드.





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