KR20210018267A - 간외 전달 - Google Patents

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마틴 마이어
바산트 자다브
스튜어트 밀스테인
커크 브라운
루비나 지. 파르마
칼란토타틸 지. 라제브
무티아 마노하란
알렉산더 브이. 켈린
무투사미 자야라만
클라우스 카리스
아담 카스토레노
크리스토퍼 에스. 타일
케빈 피츠제랄드
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Abstract

본 발명은 유전자 사일런싱의 방법으로서, 선택적으로 링커 또는 담체를 통해, 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에서 치료적 유효량의 친유성 모이어티-접합 이중-가닥 iRNA를 이를 필요로 하는 세포 또는 피험자에 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

Description

간외 전달
본 출원은 2018년 5월 7일에 출원된 U.S. 가출원 62/668,072; 2018년 9월 28일에 출원된 U.S. 가출원 62/738,747; 및 2018년 11월 29일에 출원된 U.S. 가출원 62/773,082에 대한 우선권 이익을 청구하며, 모두 그 전체가 원용에 의해 본원에 포함된다.
생체내에서 세포로 iRNA 제제의 효율적인 전달에는 세포외 환경, 특히, 혈청 단백질로부터의 실질적인 보호 및 특이적 타겟화가 필요하다. RNAi-기반 치료법은 간-관련 장애의 치료를 위한 유망한 임상 데이터를 보여준다. 그러나, 간외 조직으로의 siRNA 전달은 여전히 난관으로 남아 siRNA-기반 요법의 이용에 한계가 있다.
생체내에서 iRNA 제제의 실험 및 치료적 적용을 제한하는 요인 중 하나는 온전한 siRNA를 효율적으로 전달하는 능력이다. 특정 어려움은 생체내에서 망막으로의 비-바이러스성 유전자 전달과 관련이 있다. 난제들 중 하나는 망막의 형질감염을 방해하는 내부 경계막을 극복하는 것이다. 또한, 유리체의 음으로 하전된 당은 양성 DNA-형질감염 시약 복합체와 상호 작용하여 이들의 응집을 촉진하는데, 이는 확산 및 세포 흡수를 방해하는 것으로 밝혀졌다.
중추 신경계(central nervous system: CNS)로의 올리고뉴클레오타이드 전달은 자유 올리고뉴클레오타이드가 지나갈 수 없는 혈액 뇌 장벽(blood brain barrier: BBB)으로 인해 특정 문제를 제기한다. CNS로 올리고뉴클레오타이드를 전달하기 위한 한 가지 수단은 척수강내 전달에 의한 것이다. 그러나, 올리고뉴클레오타이드는 또한 요망되는 치료 효과를 달성하기 위해 CNS의 타겟 세포로 효율적으로 내재화될 필요가 있다. 종래 연구는 전형적으로 뉴런 기원의 세포로 올리고뉴클레오타이드의 세포내 내재화를 돕기 위해 전달 시약, 예컨대, 리포좀, 양이온성 지질 및 나노입자를 사용하여 복합체를 형성시키는 것이었다.
따라서, iRNA 제제의 치료적 잠재력을 달성하고 향상시키기 위해 조직 전달 시약의 사용 없이 생체내에서 siRNA 분자를 전달하기 위한 신규하고 개선된 방법이 계속해서 요구되고 있다.
본 발명의 하나의 양태는 이중-가닥 iRNA 제제로서, 타겟 유전자와 상보적인 안티센스 가닥; 상기 안티센스 가닥과 상보적인 센스 가닥; 및 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에, 선택적으로 링커 또는 담체를 통해, 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 포함하는, 이중-가닥 iRNA 제제를 제공한다.
일부 구현예에서, 옥탄올-물 분배 계수 logKow에 의해 측정되는 친유성 모이어티의 친유성은 0초과이다. 친유성 모이어티는 1 초과, 1.5 초과, 2 초과, 3 초과, 4 초과, 5 초과, 또는 10초과의 logKow를 지닐 수 있다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제의 혈장 단백질 결합 검정에서 비결합 분율에 의해 측정되는 이중-가닥 iRNA 제제의 소수성은 0.2 초과이다. 일 구현예에서, 결정되는 혈장 단백질 결합 검정은 인간 혈청 알부민 단백질을 이용하여 전기영동 이동성 변화 검정(electrophoretic mobility shift assay: EMSA)이다. 결합 검정에서 비결합 siRNA의 분율에 의해 측정되는 이중-가닥 iRNA 제제의 소수성은 siRNA의 생체내 전달 향상을 위해 0.15 초과, 0.2 초과, 0.25 초과, 0.3 초과, 0.35 초과, 0.4 초과, 0.45 초과, 또는 0.5 초과이다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 지방족, 사이클릭, 예컨대, 비사이클릭, 또는 폴리사이클릭, 예컨대, 폴리비사이클릭 화합물, 예컨대, 스테로이드(예를 들어, 스테롤) 또는 선형 또는 분지형 지방족 탄화수소이다. 예시적인 친유성 모이어티는 지질, 콜레스테롤, 레티노산, 콜릭산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥시아놀, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜릭산, O3-(올레오일)콜렌산, 이부프로펜, 나프록센, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진이다.
적합한 친유성 모이어티는 또한 포화되거나 불포화된 C4-C30 탄화수소 사슬(예를 들어, C4-C30 알킬 또는 알케닐), 및 하이드록실, 아민, 카르복실산, 설포네이트, 포스페이트, 티올, 아자이드, 및 알카인으로 이루어진 군으로부터 선택된 선택적 작용기를 함유하는 것들을 포함한다. 작용기는 iRNA 제제에 친유성 모이어티를 부착시키는 데 유용하다. 일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 포화되거나 불포화된 C6-C18 탄화수소 사슬(예를 들어, 선형 C6-C18 알킬 또는 알케닐)을 함유한다. 일 구현예에서, 친유성 모이어티는 포화되거나 불포화된 C16 탄화수소 사슬(예를 들어, 선형 C16 알킬 또는 알케닐)을 함유한다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 C6-C30 산(예를 들어, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산, 트리데칸산, 테트라데칸산, 펜타데칸산, 헥사데칸산, 헵타데칸산, 옥타데칸산, 올레산, 리놀레산, 아라키돈산, 시스-4,7,10,13,16,19-도코사헥산산, 비타민 A, 비타민 E, 콜레스테롤 등) 또는 C6-C30 알코올(예를 들어, 헥산올, 헵탄올, 옥탄올, 노난올, 데칸올, 운데칸올, 도데칸올, 트리데칸올, 테트라데칸올, 펜타데칸올, 헥사데칸올, 헵타데칸올, 옥타데칸올, 올레일 알코올, 리놀레일 알코올, 아라키돈 알코올, 시스-4,7,10,13,16,19-도코사헥산올, 레티놀, 비타민 E, 콜레스테롤 등)이다.
친유성 모이어티는 iRNA 제제의 리보당에 대한 직접 부착을 통해 iRNA 제제에 접합될 수 있다. 대안적으로, 친유성 모이어티는 링커 또는 담체를 통해 iRNA 제제에 접합될 수 있다.
소정의 구현예에서, 친유성 모이어티는 하나 이상의 링커(테터)를 통해 iRNA 제제에 접합된다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 에테르, 티오에테르, 우레아, 카르보네이트, 아민, 아미드, 말레이미드-티오에테르, 디설파이드, 포스포디에스테르, 설폰아미드 결합, 클릭 반응의 산물(예를 들어, 아자이드-알카인의 첨가환화로부터의 트리아졸), 또는 카르바메이트를 함유하는 링커를 통해 이중-가닥 iRNA 제제에 접합된다.
일부 구현예에서, 링커(테터) 중 적어도 하나는 산화환원 분해형 링커(예컨대, 환원 분해형 링커; 예를 들어, 디설파이드 기), 산 분해형 링커(예를 들어, 하이드라존 기, 에스테르 기, 아세탈 기, 또는 케탈 기), 에스테라제 분해형 링커(예를 들어, 에스테르 기), 포스파타제 분해형 링커(예를 들어, 포스페이트 기), 또는 펩티다제 분해형 링커(예를 들어, 펩타이드 결합)이다.
다른 구현예에서, 링커(테터) 중 하나는 갈락토사민, 글루코사민, 글루코스, 갈락토스, 만노스, 및 이들의 조합의 DNA, RNA, 디설파이드, 아미드, 작용화 단당류 또는 올리고당류로 이루어진 군으로부터 선택된 생분해형 링커이다.
소정의 구현예에서, 친유성 모이어티는 하나 이상의 뉴클레오타이드(들)를 치환하는 담체를 통해 이중-가닥 iRNA 제제에 접합된다. 담체는 사이클릭 기 또는 비사이클릭 기일 수 있다. 일 구현예에서, 사이클릭 기는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔란, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸릴, 및 데칼린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 비사이클릭 기는 세리놀 백본 또는 디에탄올아민 백본을 기반으로 한 모이어티이다.
일부 구현예에서, 담체는 이중-가닥 iRNA 제제의 내부 위치(들)에서 하나 이상의 뉴클레오타이드(들)를 치환한다.
다른 구현예에서, 담체는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 말단에서 뉴클레오타이드를 치환한다. 일 구현예에서, 담체는 센스 가닥의 3' 말단의 말단 뉴클레오타이드를 치환하고, 이에 의해 센스 가닥의 3' 말단을 보호하는 말단 캡으로서 작용한다. 일 구현예에서, 담체는 아민을 갖는 사이클릭 기이고, 예를 들어, 담체는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐, 또는 데칼리닐일 수 있다.
일 구현예에서, 친유성 모이어티는, 가닥의 각 말단으로부터 말단 두 개의 위치를 제외한 모든 위치를 포함하는, 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에 접합된다. 일 구현예에서, 친유성 모이어티는, 가닥의 각 단부로부터 말단 세 개의 위치를 제외한 모든 위치를 포함하는, 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에 접합된다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 친유성 모이어티는, 듀플렉스 영역 내 모든 위치를 포함하지만 센스 가닥의 3' 말단의 말단 뉴클레오타이드를 치환하는 담체 또는 오버행 영역을 포함하지 않는, 듀플렉스 영역의 적어도 하나의 말단의 하나 이상의 위치에 접합된다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 친유성 모이어티는 듀플렉스 영역의 안티센스 가닥의 5'-말단에서 처음 다섯 개의 염기쌍 내의 센스 가닥 상에서 접합된다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 친유성 모이어티는 듀플렉스 영역의 안티센스 가닥의 5'-말단에서 처음 네 개의 염기쌍 내의 센스 가닥 상에서 접합된다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 친유성 모이어티는 듀플렉스 영역의 안티센스 가닥의 5'-말단에서 처음 세 개의 염기쌍 내의 센스 가닥 상에서 접합된다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 친유성 모이어티는 듀플렉스 영역의 안티센스 가닥의 5'-말단에서 처음 두 개의 염기쌍 내의 센스 가닥 상에서 접합된다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 친유성 모이어티는 듀플렉스 영역의 안티센스 가닥의 5'-말단에서 처음 염기쌍 내의 센스 가닥 상에서 접합된다.
일 구현예에서, 친유성 모이어티는, 센스 가닥의 분해 부위 영역을 배제하는, 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에 접합된다. 예를 들어, 내부 위치는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 9번 내지 12번 위치를 배제한다. 예를 들어, 내부 위치는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 9번 내지 11번 위치를 배제한다. 대안적으로, 내부 위치는 센스 가닥의 3'-말단으로부터 계수하여 11번 내지 13번 위치를 배제한다.
일 구현예에서, 친유성 모이어티는, 안티센스 가닥의 분해 부위 영역을 배제하는, 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에 접합된다. 예를 들어, 내부 위치는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 12번 내지 14번 위치를 배제한다.
일 구현예에서, 친유성 모이어티는, 3'-말단으로부터 계수하여 센스 가닥의 11번 내지 13번 위치, 및 5'-말단으로부터 계수하여 12번 내지 14번 위치를 배제하는, 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에 접합된다.
일 구현예에서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 다음 내부 위치 중 하나 이상에 접합된다: 각 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여, 센스 가닥의 4번 내지 8번 및 13번 내지 18번 위치, 및 안티센스 가닥의 6번 내지 10번 및 15번 내지 18번 위치.
일 구현예에서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 다음 내부 위치 중 하나 이상에 접합된다: 각 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여, 센스 가닥의 5번, 6번, 7번, 15번, 및 17번 위치, 및 안티센스 가닥의 15번 및 17번 위치.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 15개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이이다.
일 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 19개 내지 25개 뉴클레오타이드 길이이다.
일 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 21개 내지 23개 뉴클레오타이드 길이이다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 말단의 적어도 하나에 단일-가닥 오버행, 예를 들어, 1개 내지 10개 뉴클레오타이드 길이의 3' 및/또는 5' 오버행(들), 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개 뉴클레오타이드의 오버행을 포함한다. 일부 구현예에서, 둘 모두의 가닥은 이중 가닥 영역에서 1개 내지 5개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개)의 단일-가닥 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 스트레치를 갖는다. 일 구현예에서, 단일-가닥 오버행은 1개, 2개, 또는 3개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 또한 안티센스 가닥의 5'-말단(또는 센스 가닥의 3'-말단)에 위치하거나 또는 그 반대로 위치하는 블런트 말단을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 안티센스 가닥의 3'-말단에 3' 오버행, 및 선택적으로 안티센스 가닥의 5'-말단에 블런트 말단을 포함한다. 일 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 센스 가닥의 5'-말단에 5' 오버행, 및 선택적으로 안티센스 가닥의 5'-말단에 블런트 말단을 갖는다. 일 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 iRNA 듀플렉스의 양 말단에 두 개의 블런트 말단을 갖는다.
일 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제의 센스 가닥은 21개-뉴클레오타이드 길이이고, 안티센스 가닥은 23개-뉴클레오타이드 길이이고, 여기서 가닥은 3'-말단에 2개-뉴클레오타이드 길이의 단일 가닥 오버행을 갖는 21개 연속 염기쌍의 이중-가닥 영역을 형성한다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 이중-가닥 iRNA 제제의 뉴클레오베이스, 당 모이어티, 또는 뉴클레오사이드간 결합에 접합된다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 안티센스 가닥의 5'-말단에 포스페이트 또는 포스페이트 모방체를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 포스페이트 모방체는 5'-비닐 포스포네이트(VP)이다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제의 안티센스 가닥의 5'-말단은 5'-비닐 포스포네이트(VP)를 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 적어도 하나의 말단 키랄 인 원자를 추가로 포함한다.
뉴클레오타이드간 결합에 대한 위치 특이적 키랄 변형은 가닥의 5' 말단, 3' 말단, 또는 5' 말단과 3' 말단 둘 모두에서 발생할 수 있다. 이는 본원에서 "말단" 키랄 변형으로 지칭된다. 말단 변형은 말단 영역의 3' 또는 5' 말단 위치에서, 예를 들어, 말단 뉴클레오타이드의 위치에서, 또는 가닥의 마지막 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 뉴클레오타이드 내에서 발생할 수 있다. 키랄 변형은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 모두에서 발생할 수 있다. 각각의 키랄 순수 인 원자는 Rp 배치 또는 Sp 배치, 및 이들의 조합일 수 있다. 키랄 변형 및 키랄-변형된 dsRNA 제제에 관한 더 많은 세부사항은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 "Chirally-Modified Double-Stranded RNA Agents,"라는 명칭으로 2018년 12월 21일에 출원된 PCT/US18/67103에서 찾아볼 수 있다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 Sp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형; Rp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 말단에 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형; 및 Rp 배치 또는 Sp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 말단에 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 Sp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에 제1 및 제2 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형; Rp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 말단에 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형; 및 Rp 배치 또는 Sp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 말단에 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 Sp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에 제1, 제2, 및 제3 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형; Rp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 말단에 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형; 및 Rp 배치 또는 Sp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 말단에 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 Sp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에 제1 및 제2 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형; Rp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에 제3 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형; Rp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 말단에 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형; 및 Rp 배치 또는 Sp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 말단에 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 Sp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에 제1 및 제2 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형; Rp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 말단에 제1, 및 제2 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형; 및 Rp 배치 또는 Sp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 말단에 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 안티센스 가닥의 제1의 다섯 개 뉴클레오타이드에서 적어도 두 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 갖는다(5' 말단으로부터 계수하여).
일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 또는 18개 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합으로 분리되는 1개, 2개, 또는 3개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합의 두 개의 블록을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 특이적 CNS 조직에 대한 전달을 매개하는 수용체를 타겟화하는 타겟화 리간드를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 타겟화 리간드는 Angiopep-2, 지질단백질 수용체 관련 단백질(lipoprotein receptor related protein: LRP) 리간드, bEnd.3 세포 결합 리간드, 트랜스페린 수용체(transferrin receptor: TfR) 리간드, 만노스 수용체 리간드, 글루코스 운반체 단백질, 및 LDL 수용체 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 안구 조직에 대한 전달을 매개하는 수용체를 타겟화하는 타겟화 리간드를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 타겟화 리간드는 트랜스-레티놀, RGD 펩타이드, LDL 수용체 리간드, 및 탄수화물-기재 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 타겟화 리간드는 RGD 펩타이드, 예컨대, H-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-Cys-OH 또는 사이클로(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)이다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 간 조직을 타겟화하는 타겟화 리간드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 타겟화 리간드는 탄수화물-기재 리간드이다. 일 구현예에서, 타겟화 리간드는 GalNAc 접합체이다.
상기 양태 및 구현예 모두는 올리고뉴클레오타이드의 하나 이상의 내부 위치에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오타이드에 적용 가능할 것이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드의 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35% 또는 30%가 변형된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 50%가 변형되는 경우, 올리고뉴클레오타이드에 존재하는 모든 뉴클레오타이드의 50%가 본원에 기재된 바와 같은 변형을 함유한다.
일 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 이중-가닥 dsRNA 제제이고, 이중-가닥 dsRNA 제제의 적어도 50%의 뉴클레오타이드는 독립적으로 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-데옥시, 또는 2'-플루오로로 변형된다.
일 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 안티센스이고, 안티센스의 적어도 50%의 뉴클레오타이드는 독립적으로 LNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 또는 2'-데옥시로 변형된다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 센스 가닥에 2'-F 변형을 12개 미만, 10개 미만, 8개 미만, 6개 미만, 4개 미만, 2개 미만 갖거나, 2'-F 변형을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 안티센스 가닥에 2'-F 변형을 12개 미만, 10개 미만, 8개 미만, 6개 미만, 4개 미만, 2개 미만 갖거나, 2'-F 변형을 갖지 않는다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 임의의 위치에 하나 이상의 2'-F 변형을 갖는다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만의 비-천연 뉴클레오타이드를 갖거나, 비-천연 뉴클레오타이드를 실질적으로 갖지 않는다. 비-천연 뉴클레오타이드의 예는 비사이클릭 뉴클레오타이드, LNA, HNA, CeNA, 2'-O-메톡시알킬(예를 들어, 2'-O-메톡시메틸, 2'-O-메톡시에틸, 또는 2'-O-2-메톡시프로파닐), 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA), 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸(2'-O-DMAEOE), 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-아라-F, L-뉴클레오사이드 변형(예컨대, 2'-변형된 L-뉴클레오사이드, 예를 들어, 2'-데옥시-L-뉴클레오사이드), BNA 무염기 당, 무염기 사이클릭 및 열린-사슬 알킬을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 또는 거의 100%의 천연 뉴클레오타이드를 갖는다. 이러한 구현예의 목적 상, 천연 뉴클레오타이드는 2'-OH, 2'-데옥시, 및 2'-OMe를 갖는 것들을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 15개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이를 갖는 센스 가닥 및 안티센스 가닥; 안티센스 가닥의 제1의 5개 뉴클레오타이드에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 포함하고(5' 말단으로부터 계수하여); 여기서 듀플렉스 영역은 19개 내지 25개 염기쌍(바람직하게는 19개, 20개, 21개 또는 22개)이고; 이중-가닥 iRNA 제제는 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만의 비-천연 뉴클레오타이드를 갖거나, 비-천연 뉴클레오타이드를 실질적으로 갖지 않는다.
일 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 15개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이를 갖는 센스 가닥 및 안티센스 가닥; 안티센스 가닥의 제1의 5개 뉴클레오타이드에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 포함하고(5' 말단으로부터 계수하여); 여기서 듀플렉스 영역은 19개 내지 25개 염기쌍(바람직하게는 19개, 20개, 21개 또는 22개)이고; 이중-가닥 iRNA 제제는 2'-OH, 2'-데옥시, 또는 2'-OMe를 갖는 것과 같이, 80% 초과, 85% 초과, 95% 초과, 또는 거의 100%의 천연 뉴클레오타이드를 갖는다.
본 발명의 또 다른 양태는 세포에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 타겟 유전자와 상보적인 안티센스 가닥; 상기 안티센스 가닥과 상보적인 센스 가닥; 및 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에, 선택적으로 링커 또는 담체를 통해, 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 포함하는, 이중-가닥 iRNA 제제와 상기 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
이중-가닥 iRNA 제제와 관련된 본 발명의 첫 번째 양태에서 친유성 모이어티 및 이중-가닥 iRNA 제제에 대한 이들의 접합에 대한 상기 구현예 모두는 세포에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는 방법에 관한 본 발명의 양태에 적합하다.
일 구현예에서, 세포는 간외 세포이다.
본 발명의 또 다른 양태는 피험자에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 타겟 유전자와 상보적인 안티센스 가닥; 상기 안티센스 가닥과 상보적인 센스 가닥; 및 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에, 선택적으로 링커 또는 담체를 통해, 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 포함하는, 이중-가닥 iRNA 제제와 상기 세포를 접촉시키는 단계를 포함하여 이중-가닥 iRNA 제제를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
이중-가닥 iRNA 제제와 관련된 본 발명의 첫 번째 양태에서 친유성 모이어티 및 이중-가닥 iRNA 제제에 대한 이들의 접합에 대한 상기 구현예 모두는 피험자에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는 방법에 관한 본 발명의 양태에 적합하다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 간외로 투여된다.
일 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 척수강내로 투여된다. 이중-가닥 iRNA 제제의 척수강내 투여에 의해, 방법은 뇌 또는 척추 조직, 예를 들어, 피질, 소뇌, 경추, 요추 및 흉추에서 타겟 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 예시적인 타겟 유전자는 APP, ATXN2, C9orf72, TARDBP, MAPT(Tau), HTT, SNCA, FUS, ATXN3, ATXN1, SCA1, SCA7, SCA8, MeCP2, PRNP, SOD1, DMPK, 및 TTR이다. 피험자에서 이러한 타겟 유전자의 발현을 감소시키기 위해, 이중-가닥 iRNA 제제는 유리체내로 투여될 수 있다. 이중-가닥 iRNA 제제의 유리체내 투여에 의해, 방법은 안구 조직에서 타겟 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 CNS 장애를 갖는 피험자를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 이중-가닥 RNAi 제제를 피험자에게 투여하고, 이에 의해 피험자를 치료하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 이중-가닥 RNAi 제제는 타겟 유전자와 상보적인 안티센스 가닥; 상기 안티센스 가닥과 상보적인 센스 가닥; 및 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에, 선택적으로 링커 또는 담체를 통해, 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 포함한다.
이중-가닥 iRNA 제제와 관련된 본 발명의 첫 번째 양태에서 친유성 모이어티 및 이중-가닥 iRNA 제제에 대한 이들의 접합에 대한 상기 구현예 모두는 CNS 장애를 갖는 피험자를 치료하는 방법에 관한 본 발명의 양태에 적합하다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 예시적인 CNS 장애는 알츠하이머(alzheimer), 근위축성 축삭 경화증(amyotrophic lateral schlerosis: ALS), 전측두엽 치매(frontotemporal dementia), 헌팅턴(huntington), 파킨슨(Parkinson), 척수소뇌 (spinocerebellar), 프리온(prion) 및 라포라(lafora)를 포함한다.
도 1은 센스 또는 안티센스 가닥의 내부 위치(즉, siRNA 서열내 어느 곳)에서 siRNA에 접합된 리간드, 예컨대, 친유성 모이어티를 나타내는 도식이다.
도 2는 센스 또는 안티센스 가닥의 3'- 및/또는 5'-말단에서 링커 또는 담체를 통해 siRNA에 접합된, 친유성 모이어티와 같은, 리간드를 나타내는 도식이다.
도 3은 생분해형 링커를 통해 siRNA에 접합된, 친유성 모이어티와 같은, 리간드를 나타내는 도식이다.
도 4는 마우스에서 다양한 예시적인 siRNA 접합체의 유리체내 주사에 의한 베타 카테닌 유전자(안구 CTNNB1) 사일런싱의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 스프래그 다우리 래트의 피질에서 다양한 예시적인 siRNA 접합체의 단회 척추강내 주사에 의한 SOD1 mRNA 사일런싱의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 스프래그 다우리 래트의 소뇌에서 다양한 예시적인 siRNA 접합체의 단회 척추강내 주사에 의한 SOD1 mRNA 사일런싱의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 스프래그 다우리 래트의 경추에서 다양한 예시적인 siRNA 접합체의 단회 척추강내 주사에 의한 SOD1 mRNA 사일런싱의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 스프래그 다우리 래트의 요추에서 다양한 예시적인 siRNA 접합체의 단회 척추강내 주사에 의한 SOD1 mRNA 사일런싱의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 스프래그 다우리 래트의 흉추에서 다양한 예시적인 siRNA 접합체의 단회 척추강내 주사에 의한 SOD1 mRNA 사일런싱의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 RT-qPCR을 사용하여 24시간 후 F12 mRNA 수준을 측정함으로써 2.5 및 250 nM 농도에서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥의 각 위치에 친유성 모이어티(C16)를 접합함으로써 변형된 F12 siRNA와 인큐베이션된 세포에 대한 일차 사이노 간세포 (PCH) 유리 흡수(형질감염제 부재)의 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 RT-qPCR을 사용하여 24시간 후 F12 mRNA 수준을 측정함으로써 2.5 및 250 nM 농도에서, 안티센스 가닥 및 센스 가닥의 각 위치에 친유성 모이어티(C16)를 접합함으로써 변형된 F12 siRNA와 인큐베이션된 세포에 대한 일차 사이노 간세포 (PCH) 유리 흡수(형질감염제 부재)의 결과를 나타낸 것이다.
도 12는, 각 siRNA 접합체가 인간 혈청 알부민과 인큐베이션된 후 전기영동 이동도 변화 검정을 이용하여 비결합 분율을 측정함으로써 결정된, 안티센스 가닥 및 센스 가닥의 각 위치에 친유성 모이어티(C16)를 접합함으로써 변형된 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥 및 센스 가닥의 각 위치에 대한 상대 소수성의 결과를 나타낸 것이다.
도 13a 내지 도 13c는 시험된 뇌 및 척수의 모든 영역에서 보이는 지속적인 SOD1 mRNA 사일런싱을 나타낸 것이다. 도 13a는 각각 요추, 흉추, 및 경추 영역에 대한 래트에서 다양한 예시적인 siRNA 접합체의 단회 척추강내 주사에 의한 SOD1 mRNA 사일런싱의 결과를 나타낸 것이다. 도 13b는 래트의 CNS에서 시험된 다양한 조직의 개략적 도식이다. 도 13c는 각각 소뇌, 전두 피질, 및 나머지 뇌 영역에 대한 래트에서 다양한 예시적인 siRNA 접합체의 단회 척추강내 주사에 의한 SOD1 mRNA 사일런싱의 결과를 나타낸 것이다.
도 14a 내지 도 14b는 단회 척추강내 투여 후 β-카테닌의 사일런싱 결과를 나타낸 것이다. 도 14a는 각각 요추, 흉추, 및 경추 영역에 대한 래트에서 다양한 예시적인 siRNA 접합체의 β-카테닌 사일런싱의 결과를 나타낸 것이다. 도 14b는 각각 소뇌, 전두 피질, 및 나머지 뇌 영역에 대한 래트에서 다양한 예시적인 siRNA 접합체의 β-카테닌 사일런싱 결과를 나타낸 것이다.
도 15a 내지 도 15c는, SOD1 siRNA 접합체로 뇌에서 관찰된 더 높은 약물 수준 및 강력한 사일런싱을 지시하는, 래트에서 예시적인 siRNA 듀플렉스의 단회 척추강내 투여 후 SOD1의 사일런싱 결과를 나타낸 것이다. 도 15a는 비접합된 siRNA 수준과 비교하는, CSF에서 접합된 siRNA 수준을 나타낸 것이다. 도 15b는 비접합된 siRNA 수준과 비교하는, 뇌에서 접합된 siRNA 수준을 나타낸 것이다. 도 15c는 비접합된 siRNA 수준 및 대조 siRNA 수준과 비교하는, 소뇌에서 접합된 siRNA 수준을 나타낸 것이다.
도 16a 내지 도 16b는 다양한 용량에서 상이한 화학 변형이 있는 SOD1의 사일런싱 결과를 나타낸 것이다. 도 16a는 각각 요추, 흉추, 및 경추 영역에 대한 래트에서 SOD1 사일런싱 결과를 나타낸 것이다. 도 16b는 각각 소뇌, 전두 피질, 및 나머지 뇌 영역에 대한 래트에서 SOD1 사일런싱의 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 31일째에 비-인간 영장류(NHP)의 다양한 영역에서 예시적인 siRNA 듀플렉스의 단회 척추강내(IT) 투여 후 β-카테닌 siRNA 수준의 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 31일째에 다양한 조직에서 β-카테닌 mRNA의 강력한 유전자 사일런싱 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 단회 IT 투여 후 NHP에서 CNS 전체에 걸쳐 분포되어 있는 siRNA를 도시하는 사진을 나타낸 것이다.
도 20은 단회 IT 투여 후 뉴런에 국부화된 siRNA 접합체를 도시하는 사진을 나타낸 것이다. MAP2는 뉴런 마커이다.
도 21은 단회 IT 투여 후 소교세포에 국부화된 siRNA 접합체를 도시하는 사진을 나타낸 것이다. Iba1은 소교세포 마커이다.
도 22는 단회 IT 투여 후 성상세포에 국부화된 siRNA 접합체를 도시하는 사진을 나타낸 것이다.
도 23은 구획 규모 용량으로 래트 및 NHP에서 관찰된 유전자 사일런싱 활성을 비교하는 그래프를 나타낸 것이다.
도 24는 3 μg 또는 7.5 μg의 투약량으로 표 7에 나타나 있는 다양한 예시적인 siRNA 듀플렉스를 투여한 후 14일째에 마우스의 눈에서 TTR mRNA 수준의 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 7.5 μg의 투약량으로 표 7에 나타나 있는 다양한 예시적인 siRNA 듀플렉스를 투여한 후 14일째에 마우스의 눈에서 TTR mRNA 수준의 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 7.5 μg의 투약량으로 표 7에 나타나 있는 다양한 예시적인 siRNA 듀플렉스의 유리체내 투여 후 14일째에 마우스의 눈에서 TTR mRNA 수준의 결과를 나타낸 것이다.
본 발명자들은, 특히, 이중-가닥 iRNA 제제의 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에 친유성 모이어티를 접합시키는 것이 놀랍게도 생체내에서 이중-가닥 iRNA의 유리체내 전달 및 척추강내 전달로 CNS 조직 및 안구 조직의 효율적인 진입을 야기하고, CNS계 및 안구계의 세포로 효과적으로 내재화되는 우수한 결과를 제공한다는 것을 발견하였다.
본 발명의 하나의 양태는 이중-가닥 iRNA 제제로서, 타겟 유전자와 상보적인 안티센스 가닥; 상기 안티센스 가닥과 상보적인 센스 가닥; 및 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에, 선택적으로 링커 또는 담체를 통해, 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 포함하는, 이중-가닥 iRNA 제제를 제공한다.
용어 "친유성제" 또는 "친유성 모이어티"는 광범위하게 지질에 대한 친화성을 갖는 임의의 화합물 또는 화학적 모이어티를 지칭한다. 친유성 모이어티의 친유성을 특성규명하는 한 가지 방법은 옥탄올-물 분배 계수, logKow에 의한 것이며, 여기서 Kow는 평형 상태인 2-상 시스템의 수성 상 중 이의 농도에 대한 옥탄올-상 중 화학물질 농도의 비율이다. 옥탄올-물 분배 계수는 물질의 실험실-측정 성질이다. 그러나, 이는 또한 1차-원리 또는 경험적 방법을 이용하여 계산되는 화학물질의 구조적 성분에 기여하는 계수를 이용함으로써 예측될 수 있다(예를 들어, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 문헌[Tetko et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci. 41:1407-21 (2001)] 참조). 이는 비-수성 또는 물보다 유성인 환경을 선호하는 물질의 경향에 대한 열역학적 척도를 제공한다(즉, 이의 친수성/친유성 균형). 원칙적으로, 화학 물질의 성질은 이의 logKow가 0을 초과할 때 친유성이다. 전형적으로, 친유성 모이어티는 1 초과, 1.5 초과, 2 초과, 3 초과, 4 초과, 5 초과, 또는 10초과의 logKow를 지닌다. 예를 들어, 6-아미노 헥산올의 logKow는, 예를 들어, 대략 0.7인 것으로 예측된다. 동일한 방법을 이용하여, 콜레스테릴 N-(헥산-6-올) 카르바메이트의 logKow는 10.7인 것으로 예측된다.
분자의 친유성은 분자가 지니고 있는 작용기에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 친유성 모이어티의 말단에 하이드록실 기 또는 아민 기를 첨가하는 것은 친유성 모이어티의 분배 계수(예를 들어, logKow)를 증가시키거나 감소시킬 수 있다.
대안적으로, 하나 이상의 친유성 모이어티에 접합된 이중-가닥 iRNA 제제의 소수성은 이의 단백질 결합 특징에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 이중-가닥 iRNA 제제의 혈장 단백질 결합 검정에서 비결합 분율은 이중-가닥 iRNA 제제의 상대 소수성과 양의 상관관계가 있는 것(이는 이중-가닥 iRNA 제제의 사일런싱 활성과 양의 상관관계가 있을 수 있음)으로 결정될 수 있다.
일 구현예에서, 결정되는 혈장 단백질 결합 검정은 인간 혈청 알부민 단백질을 이용하여 전기영동 이동성 변화 검정(EMSA)이다. 이러한 결합 검정의 예시적인 프로토콜은 실시예 14에서 상세하게 예시된다. 결합 검정에서 비결합 siRNA의 분율에 의해 측정되는 이중-가닥 iRNA 제제의 소수성은 siRNA의 생체내 전달 향상을 위해 0.15 초과, 0.2 초과, 0.25 초과, 0.3 초과, 0.35 초과, 0.4 초과, 0.45 초과, 또는 0.5 초과이다.
이에 따라, 이중-가닥 iRNA 제제의 내부 위치(들)에 친유성 모이어티를 접합시키는 것은 siRNA의 생체내 전달 향상을 위해 최적의 소수성을 제공한다.
소정의 구현예에서, 친유성 모이어티는 지방족, 사이클릭, 예컨대, 비사이클릭, 또는 폴리사이클릭, 예컨대, 폴리비사이클릭 화합물, 예컨대, 스테로이드(예를 들어, 스테롤) 또는 선형 또는 분지형 지방족 탄화수소이다. 친유성 모이어티는 일반적으로 사이클릭 또는 비사이클릭일 수 있는 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 탄화수소 사슬은 다양한 치환기 및/또는 하나 이상의 헤테로원자, 예컨대, 산소 또는 질소 원자를 포함할 수 있다. 그러한 친유성 지방족 모이어티는, 제한 없이, 포화되거나 불포화된 C4-C30 탄화수소(예를 들어, C6-C18 탄화수소), 포화되거나 불포화된 지방산, 왁스(예를 들어, 지방산 및 지방 디아미드의 일가 알코올 에스테르), 테르펜(예를 들어, C10 테르펜, C15 세스퀴테르펜, C20 디테르펜, C30 트리테르펜, 및 C40 테트라테르펜), 및 그 밖의 폴리비사이클릭 탄화수소를 포함한다. 예를 들어, 친유성 모이어티는 C4-C30 탄화수소 사슬(예를 들어, C4-C30 알킬 또는 알케닐)을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 포화되거나 불포화된 C6-C18 탄화수소 사슬(예를 들어, 선형 C6-C18 알킬 또는 알케닐)을 함유한다. 일 구현예에서, 친유성 모이어티는 포화되거나 불포화된 C16 탄화수소 사슬(예를 들어, 선형 C16 알킬 또는 알케닐)을 함유한다.
친유성 모이어티는, 이미 친유성 모이어티에 존재하거나 iRNA 제제에 도입된 작용기, 예컨대, 하이드록시 기(예를 들어, -CO-CH2-OH)에 의한 것을 포함하여, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 iRNA 제제에 부착될 수 있다. 이미 친유성 모이어티에 존재하거나 iRNA 제제에 도입된 작용기는 하이드록실, 아민, 카르복실산, 설포네이트, 포스페이트, 티올, 아자이드, 및 알카인을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
iRNA 제제와 친유성 모이어티의 접합은, 예를 들어, 하이드록시와 알킬 기 R-, 알칸오일 기 RCO- 또는 치환된 카르바모일 기 RNHCO- 간의 에테르 또는 카르복실 또는 카르바모일 에스테르 결합의 형성을 통해 이루어질 수 있다. 알킬 기 R은 사이클릭(예를 들어, 사이클로헥실) 또는 비사이클릭(예를 들어, 직쇄 또는 분지형; 및 포화 또는 불포화)일 수 있다. 알킬 기 R은 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실, 헥사데실, 헵타데실 또는 옥타데실 기 등일 수 있다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 에테르, 티오에테르, 우레아, 카르보네이트, 아민, 아미드, 말레이미드-티오에테르, 디설파이드, 포스포디에스테르, 설폰아미드 결합, 클릭 반응의 산물(예를 들어, 아자이드-알카인의 첨가환화로부터의 트리아졸), 또는 카르바메이트를 함유하는 링커를 통해 이중-가닥 iRNA 제제에 접합된다.
또 다른 구현예에서, 친유성 모이어티는 스테로이드, 예컨대, 스테롤이다. 스테로이드는 퍼하이드로-1,2-사이클로펜타노페난트렌 고리 시스템을 함유하는 폴리사이클릭 화합물이다. 스테로이드는, 제한 없이, 담즙산(예를 들어, 콜릭산, 데옥시콜릭산 및 데하이드로콜릭산), 코르티손, 디곡시게닌, 테스토스테론, 콜레스테롤, 및 양이온성 스테로이드, 예컨대, 코르티손을 포함한다. "콜레스테롤 유도체"는, 예를 들어, 치환기의 치환, 첨가 또는 제거에 의해 콜레스테롤로부터 얻어진 화합물을 지칭한다.
또 다른 구현예에서, 친유성 모이어티는 방향족 모이어티이다. 이러한 맥락에서, 용어 "방향족"은 대체적으로 단일- 및 다중방향족 탄화수소를 지칭한다. 방향족 기는, 제한 없이, 선택적으로 치환될 수 있는 1개 내지 3개의 방향족 고리를 포함하는 C6-C14 아릴 모이어티; 어느 하나가 독립적으로 선택적으로 치환되거나 비치환될 수 있는 알킬 기에 공유 결합된 아릴 기를 포함하는 "아르알킬" 또는 "아릴알킬" 기; 및 "헤테로아릴" 기를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "헤테로아릴"은 5개 내지 14개의 고리 원자, 바람직하게는 5개, 6개, 9개, 또는 10개의 고리 원자를 갖고; 사이클릭 배열에 공유된 6, 10, 또는 14π 전자를 갖고, 탄소 원자 이외에, 질소(N), 산소(O), 및 황(S)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 내지 약 3개의 헤테로원자를 갖는 기를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "치환된" 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 또는 헤테로사이클릭 기는 1개 내지 약 4개, 바람직하게는 1개 내지 약 3개, 더욱 바람직하게는 1개 또는 2개의 비-수소 치환기를 갖는 것이다. 적합한 치환기는, 제한 없이, 할로, 하이드록시, 니트로, 할로알킬, 알킬, 알크아릴, 아릴, 아르알킬, 알콕시, 아릴옥시, 아미노, 아실아미노, 알킬카르바모일, 아릴카르바모일, 아미노알킬, 알콕시카르보닐, 카르복시, 하이드록시알킬, 알칸설포닐, 아렌설포닐, 알칸설폰아미도, 아렌설폰아미도, 아르알킬설폰아미도, 알킬카르보닐, 아실옥시, 시아노, 및 우레이도 기를 포함한다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 아르알킬 기, 예를 들어, 2-아릴프로판오일 모이어티이다. 아르알킬 기의 구조적 특징은 친유성 모이어티가 생체내에서 적어도 하나의 단백질을 결합하도록 선택된다. 소정의 구현예에서, 아르알킬 기의 구조적 특징은 친유성 모이어티가 혈청, 혈관, 또는 세포 단백질에 결합하도록 선택된다. 소정의 구현예에서, 아르알킬 기의 구조적 특징은 알부민, 면역글로불린, 지질단백질, α-2-마크로글로불린, 또는 α-1-당단백질에 대한 결합을 촉진한다.
소정의 구현예에서, 리간드는 나프록센 또는 나프록센의 구조적 유도체이다. 나프록센의 합성을 위한 절차는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 No. 3,904,682 및 미국 특허 No. 4,009,197에서 찾아볼 수 있다. 나프록센은 화학명 (S)-6-메톡시-α-메틸-2-나프탈렌아세트산을 갖고, 구조는
Figure pct00001
이다.
소정의 구현예에서, 리간드는 이부프로펜 또는 이부프로펜의 구조적 유도체이다. 이부프로펜의 합성을 위한 절차는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 No. 3,228,831에서 찾아볼 수 있다. 이부프로펜의 구조는
Figure pct00002
이다.
추가의 예시적인 아르알킬 기는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 No. 7,626,014에 예시되어 있다.
또 다른 구현예에서, 적합한 친유성 모이어티는 지질, 콜레스테롤, 레티노산, 콜릭산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥시아놀, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜릭산, O3-(올레오일)콜렌산, 이부프로펜, 나프록센, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진을 포함한다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 C6-C30 산(예를 들어, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산, 트리데칸산, 테트라데칸산, 펜타데칸산, 헥사데칸산, 헵타데칸산, 옥타데칸산, 올레산, 리놀레산, 아라키돈산, 시스-4,7,10,13,16,19-도코사헥산산, 비타민 A, 비타민 E, 콜레스테롤 등) 또는 C6-C30 알코올(예를 들어, 헥산올, 헵탄올, 옥탄올, 노난올, 데칸올, 운데칸올, 도데칸올, 트리데칸올, 테트라데칸올, 펜타데칸올, 헥사데칸올, 헵타데칸올, 옥타데칸올, 올레일 알코올, 리놀레일 알코올, 아라키돈 알코올, 시스-4,7,10,13,16,19-도코사헥산올, 레티놀, 비타민 E, 콜레스테롤 등)이다.
소정의 구현예에서, 하나보다 많은 친유성 모이어티는 특히 친유성 모이어티가 낮은 친유성 또는 소수성을 가질 때 이중-가닥 iRNA 제제에 도입될 수 있다. 일 구현예에서, 둘 이상의 친유성 모이어티는 이중-가닥 iRNA 제제의 동일한 가닥에 도입된다. 일 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제의 각 가닥에는 하나 이상의 친유성 모이어티가 도입된다. 일 구현예에서, 둘 이상의 친유성 모이어티는 이중-가닥 iRNA 제제의 동일한 위치(즉, 동일한 뉴클레오베이스, 동일한 당 모이어티, 또는 동일한 뉴클레오사이드간 결합)에 도입된다. 이는, 예를 들어, 담체를 통해 둘 이상의 친유성 모이어티를 접합하고/접합하거나, 분지형 링커를 통해 둘 이상의 친유성 모이어티를 접합하고/접합하거나, 하나 이상의 링커를 통해, 친유성 모이어티를 연속하여 연결하는 하나 이상의 링커로, 둘 이상의 친유성 모이어티를 접합함으로써 달성될 수 있다.
친유성 모이어티는 iRNA 제제의 리보당에 대한 직접 부착을 통해 iRNA 제제에 접합될 수 있다. 대안적으로, 친유성 모이어티는 링커 또는 담체를 통해 이중-가닥 iRNA 제제에 접합될 수 있다.
소정의 구현예에서, 친유성 모이어티는 하나 이상의 링커(테터)를 통해 iRNA 제제에 접합될 수 있다.
일 구현예에서, 친유성 모이어티는 에테르, 티오에테르, 우레아, 카르보네이트, 아민, 아미드, 말레이미드-티오에테르, 디설파이드, 포스포디에스테르, 설폰아미드 결합, 클릭 반응의 산물(예를 들어, 아자이드-알카인의 첨가환화로부터의 트리아졸), 또는 카르바메이트를 함유하는 링커를 통해 이중-가닥 iRNA 제제에 접합된다. 일부 예시적인 결합은 도 1, 실시예 2, 실시예 3, 실시예 5, 실시예 6, 및 실시예 7에서 예시된다.
링커/테터
링커/테터는 "테터링 부착점(TAP)"에서 친유성 모이어티에 연결된다. 링커/테터는 임의의 C1-C100 탄소-함유 모이어티(예를 들어, C1-C75, C1-C50, C1-C20, C1-C10; C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, 또는 C10)를 포함할 수 있고, 적어도 하나의 질소 원자를 가질 수 있다. 소정의 구현예에서, 질소 원자는, 친유성 모이어티에 대한 연결점으로서 작용할 수 있는 링커/테터의 말단 아미노 또는 아미도(NHC(O)-) 기의 일부를 형성한다. 링커/테터(밑줄 그어짐)의 비-제한적 예는 TAP-(CH 2 ) n NH-; TAP-C(O)(CH 2 ) n NH-; TAP-NR''''(CH 2 ) n NH-, TAP-C(O)-(CH 2 ) n -C(O)-; TAP-C(O)-(CH 2 ) n -C(O)O-; TAP-C(O)-O-; TAP-C(O)-(CH 2 ) n -NH-C(O)-; TAP-C(O)-(CH 2 ) n -; TAP-C(O)-NH-; TAP-C(O)-; TAP-(CH 2 ) n -C(O)-; TAP-(CH 2 ) n -C(O)O-; TAP-(CH 2 ) n -; 또는 TAP-(CH 2 ) n -NH-C(O)-를 포함하고, 여기서 n은 1 내지 20(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20)이고, R''''는 C1-C6 알킬이다. 바람직하게는, n은 5, 6, 또는 11이다. 다른 구현예에서, 질소는 말단 옥시아미노 기, 예를 들어, -ONH2, 또는 하이드라지노 기, -NHNH2의 일부를 형성할 수 있다. 링커/테터는, 예를 들어, 하이드록시, 알콕시, 퍼할로알킬로 선택적으로 치환되고/치환되거나, 하나 이상의 추가 헤테로원자, 예를 들어, N, O, 또는 S가 선택적으로 삽입될 수 있다. 바람직한 테터링된 리간드는, 예를 들어, TAP-(CH 2 ) n NH(리간드); TAP-C(O)(CH 2 ) n NH(리간드); TAP-NR''''(CH 2 ) n NH(리간드); TAP-(CH 2 ) n ONH(리간드); TAP-C(O)(CH 2 ) n ONH(리간드); TAP-NR''''(CH 2 ) n ONH(리간드); TAP-(CH 2 ) n NHNH 2 (리간드), TAP-C(O)(CH 2 ) n NHNH 2 (리간드); TAP-NR''''(CH 2 ) n NHNH 2 (리간드); TAP-C(O)-(CH 2 ) n -C(O)(리간드); TAP-C(O)-(CH 2 ) n -C(O)O(리간드); TAP-C(O)-O(리간드); TAP-C(O)-(CH 2 ) n -NH-C(O)(리간드); TAP-C(O)-(CH 2 ) n (리간드); TAP-C(O)-NH(리간드); TAP-C(O)(리간드); TAP-(CH 2 ) n -C(O)(리간드); TAP-(CH 2 ) n -C(O)O(리간드); TAP-(CH 2 ) n (리간드); 또는 TAP-(CH 2 ) n -NH-C(O)(리간드)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노 말단 링커/테터(예를 들어, NH2, ONH2, NH2NH2)는 리간드와 이미노 결합(즉, C=N)을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노 말단 링커/테터(예를 들어, NH2, ONH2, NH2NH2)는, 예를 들어, C(O)CF3로 아실화될 수 있다.
일부 구현예에서, 링커/테터는 머캅토 기(즉, SH) 또는 올레핀(예를 들어, CH=CH2)으로 종결될 수 있다. 예를 들어, 테터는 TAP-(CH 2 ) n -SH, TAP-C(O)(CH 2 ) n SH, TAP-(CH 2 ) n -(CH=CH 2 ), 또는 TAP-C(O)(CH 2 ) n (CH=CH 2 )일 수 있고, 여기서 n은 다른 곳에 기재된 바와 같을 수 있다. 테터는, 예를 들어, 하이드록시, 알콕시, 퍼할로알킬로 선택적으로 치환되고/거나, 하나 이상의 추가 헤테로원자, 예를 들어, N, O, 또는 S가 선택적으로 삽입될 수 있다. 이중 결합은 시스 또는 트랜스 또는 E 또는 Z일 수 있다.
다른 구현예에서, 링커/테터는 바람직하게는 링커/테터의 말단 위치에 친전자성 모이어티를 포함할 수 있다. 예시적인 친전자성 모이어티는, 예를 들어, 알데하이드, 알킬 할라이드, 메실레이트, 토실레이트, 노실레이트, 또는 브로실레이트, 또는 활성화된 카르복실산 에스테르, 예를 들어, NHS 에스테르, 또는 펜타플루오로페닐 에스테르를 포함한다. 바람직한 링커/테터(밑줄 그어짐)는 TAP-(CH 2 ) n CHO; TAP-C(O)(CH 2 ) n CHO; 또는 TAP-NR''''(CH 2 ) n CHO(여기서, n은 1 내지 6이고, R''''는 C1-C6 알킬임); 또는 TAP-(CH 2 ) n C(O)ONHS; TAP-C(O)(CH 2 ) n C(O)ONHS; 또는 TAP-NR''''(CH 2 ) n C(O)ONHS(여기서, n은 1 내지 6이고, R''''는 C1-C6 알킬임); TAP-(CH 2 ) n C(O)OC 6 F 5 ; TAP-C(O)(CH 2 ) n C(O) OC 6 F 5 ; 또는 TAP-NR''''(CH 2 ) n C(O) OC 6 F 5 (여기서, n은 1 내지 11이고, R''''는 C1-C6 알킬임); 또는 -(CH 2 ) n CH 2 LG; TAP-C(O)(CH 2 ) n CH 2 LG; 또는 TAP-NR''''(CH 2 ) n CH 2 LG(여기서, n은 다른 곳에 기재된 바와 같을 수 있고, R''''는 C1-C6 알킬임)(LG는 이탈 기, 예를 들어, 할라이드, 메실레이트, 토실레이트, 노실레이트, 브로실레이트일 수 있음)를 포함한다. 테터링은 리간드의 친핵성 기, 예를 들어, 티올 또는 아미노 기를 테터의 친전자성 기와 커플링시킴으로써 수행될 수 있다.
다른 구현예에서, 단량체는 링커/테터의 말단 위치에 프탈이미도 기(K)를 포함하는 것이 바람직할 수 있다
Figure pct00003
.
다른 구현예에서, 다른 보호된 아미노 기는 링커/테터의 말단 위치, 예를 들어, alloc, 모노메톡시 트리틸(MMT), 트리플루오로아세틸, Fmoc, 또는 아릴 설포닐에 있을 수 있다(예를 들어, 아릴 부분은 오르토-니트로페닐 또는 오르토, 파라-디니트로페닐일 수 있음).
본원에 기재된 임의의 링커/테터는 하나 이상의 추가 연결 기, 예를 들어, -O-(CH2)n-, -(CH2)n-SS-, -(CH2)n-, 또는 -(CH=CH)-를 추가로 포함할 수 있다.
분해형 링커/테터
일부 구현예에서, 링커/테터 중 적어도 하나는 산화환원 분해형 링커, 산 분해형 링커, 에스테라제 분해형 링커, 포스파타제 분해형 링커, 또는 펩티다제 분해형 링커일 수 있다.
일 구현예에서, 링커/테터 중 적어도 하나는 환원 분해형 링커(예를 들어, 디설파이드 기)일 수 있다.
일 구현예에서, 링커/테터 중 적어도 하나는 산 분해형 링커(예를 들어, 하이드라존 기, 에스테르 기, 아세탈 기, 또는 케탈 기)일 수 있다.
일 구현예에서, 링커/테터 중 적어도 하나는 에스테라제 분해형 링커(예를 들어, 에스테르 기)일 수 있다.
일 구현예에서, 링커/테터 중 적어도 하나는 포스파타제 분해형 링커(예를 들어, 포스페이트 기)일 수 있다.
일 구현예에서, 링커/테터 중 적어도 하나는 펩티다제 분해형 링커(예를 들어, 펩타이드 결합)일 수 있다.
분해형 연결 기는 분해 제제, 예를 들어, pH, 산화환원 퍼텐셜 또는 분해성 분자의 존재에 취약하다. 일반적으로, 분해 제제는 혈청 또는 혈액에서보다 세포 내에서 더욱 만연하거나 보다 높은 수준 또는 활성으로 발견된다. 이런 분해성 제제의 예로는, 환원에 의해 산화환원 분해형 연결 기를 분해할 수 있으며, 세포에 존재하는 예를 들어, 산화 또는 환원 효소 또는 머캅탄과 같은 환원제를 비롯하여 특정 기질에 선택되거나 또는 기질 특이성을 가지지 않는 산화환원 제제; 에스테라제; 엔도좀 또는 산성 환경을 만들 수 있는 제제, 예를 들어, pH가 5 이하로 되게 하는 제제; 일반 산으로서 작용함으로써 산 분해형 연결 기를 가수분해하거나 또는 분해할 수 있는 효소, (기질 특이성일 수 있는) 펩티다제, 및 포스파타제를 포함한다.
이황화 결합과 같은 분해형 연결 기는 pH에 취약할 수 있다. 인간 혈청의 pH는 7.4이며, 평균 세포내 pH는 약간 더 낮아 약 7.1 내지 7.3의 범위이다. 엔도좀은 5.5 내지 6.0 범위의 보다 산성의 pH를 가지며, 리소좀은 약 5.0의 보다 더 산성인 pH를 가진다. 일부 테터들은 바람직한 pH에서 분해되는 분해형 연결 기를 가질 것이며, 이로써 세포 내에서 리간드(예를 들어, 타겟화 또는 세포-침투성 리간드, 예컨대, 콜레스테롤)로부터 또는 세포의 목적하는 구획으로 iRNA 제제를 방출할 것이다.
리간드를 iRNA 제제에 연결하는 화학적 접합(예를 들어, 연결 기)은 이황화 결합을 포함할 수 있다. iRNA 제제/리간드 복합체가 엔도시토시스에 의해 세포에 삼켜질 때, 엔도좀의 산성 환경은 이황화 결합이 분해되게 하고, 이에 의해 리간드로부터 iRNA 제제를 방출할 것이다(Quintana et al.,　Pharm Res.　19:1310-1316, 2002; Patri et al.,　Curr. Opin. Curr. Biol.　6:466-471, 2002). 리간드는 iRNA 제제의 치료 효과를 보완할 수 있는 제2 치료제 또는 타겟화 리간드일 수 있다.
테터는 특정 효소에 의해 분해될 수 있는 분해형 연결 기를 포함할 수 있다. 테터에 혼입되는 연결 기의 유형은 iRNA 제제에 의해 타겟화되는 세포에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 간 세포에서 mRNA를 타겟화하는 iRNA 제제는 에스테르기를 포함하는 테터에 접합될 수 있다. 간세포는 에스테라제가 풍부하므로, 테터는 에스테라제가 풍부하지 않은 세포 유형에서보다 간세포에서 보다 효율적으로 분해될 것이다. 테터의 분해는 테터의 원위 말단에 부착되는 리간드로부터 iRNA 제제를 방출하고, 이에 의해 iRNA 제제의 사일런싱 활성을 잠재적으로 향상시킨다. 에스테라제가 풍부한 다른 세포 유형으로는, 폐세포, 신피질 세포, 및 고환 세포를 포함한다.
펩타이드 결합을 함유하는 테터는, 간세포 및 활막세포와 같이 펩티다제가 풍부한 세포 유형을 타겟화하기 위해 iRNA 제제에 접합될수 있다. 예를 들어, 염증성 질환(예를 들어, 류마티스 관절염)의 치료를 위한 것과 같이 활막세포에 타겟화되는 iRNA 제제는 펩타이드 결합을 함유하는 테터에 접합될 수 있다.
일반적으로, 후보물질 분해형 연결 기의 적합성은 분해성 제제(또는 조건)가 후보물질 연결 기를 분해하는 능력을 시험함으로써 평가될 수 있다. 혈액, 또는 기타 비-타겟 조직과 접촉한 경우의 분해에 대해 저항성을 나타내는 능력에 대해 후보물질 분해형 연결 기를 또한 시험하는 것도 바람직할 것이고, 예를 들어, iRNA 제제의 조직은 피험자에 투여될 때 노출될 것이다. 따라서, 당업자는 제1 조건과 제2 조건 사이에서 분해에 대한 상대적인 취약성을 측정할 수 있으며, 제1 조건은 타겟 세포에서의 분해의 지표인 것으로 선택되며 제2 조건은 기타 조직 또는 혈액이나 혈청과 같은 생물학적 유체에서의 분해의 지표인 것으로 선택된다. 평가는 세포 무함유 시스템, 세포, 세포 배양물, 기관 또는 조직 배양물, 또는 전체 동물에서 수행될 수 있다. 세포-무함유 또는 배양 조건에서 초기 평가를 하고 전체 동물에서 추가로 평가하여 확인하는 것이 유용할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 유용한 후보물질 화합물은 혈액 또는 혈청(또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하)과 비교해 세포(또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하)에서 적어도 2, 4, 10 또는 100배 더 빠르게 분해된다.
산화환원 분해형 연결 기
분해형 연결 기의 일 클래스는 환원 또는 산화 시 분해되는 산화환원 분해형 연결 기이다. 환원 분해형 연결 기의 일 예는 디설파이드 연결기(-S-S-)이다. 후보물질인 분해형 연결기가 적절한 "환원 분해형 연결기"이거나 또는 예를 들어 특정 iRNA 모이어티 및 특정 타겟화 제제와 사용하기에 적절한지 결정하기 위해, 당업자는 본원에서 기술된 방법을 고찰할 수 있다. 예를 들어, 후보물질은, 타겟 세포와 같은 세포에서 관찰되는 분해의 속도를 모방하는, 디티오트레이톨(DTT) 또는 당해 기술분야에 공지된 시약을 사용하는 기타 환원제와 함께 인큐베이션함으로써 평가될 수 있다. 후보물질은 또한, 혈액 또는 혈청 조건을 모방하도록 선택된 조건 하에 평가될 수도 있다. 바람직한 구현예에서, 후보물질 화합물은 혈액에서 10% 이하 분해된다. 바람직한 구현예에서, 유용한 후보물질 화합물은, 혈액(또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하)과 비교해 세포(또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하)에서 적어도 2배, 4배, 10배 또는 100배 더 빠르게 분해된다. 후보물질 화합물의 분해 속도는 세포내 배지를 모방하도록 선택된 조건 하에서 표준 효소 카이네틱스 분석법을 이용해 측정되며, 세포외 배지를 모방하도록 선택된 조건과 비교될 수 있다.
포스페이트-기재의 분해형 연결기
포스페이트-기재의 분해형 연결기는 포스페이트기를 분해하거나 또는 가수분해하는 제제에 의해 분해된다. 세포에서 포스페이트기를 분해하는 제제의 일 예는, 세포에서 포스파타제와 같은 효소이다. 포스페이트-기재의 연결 기의 예는, ―O―P(O)(ORk)-O―, ―O―P(S)(ORk)-O―, ―O―P(S)(SRk)-O―, ―S―P(O)(ORk)-O―, ―O―P(O)(ORk)-S―, ―S―P(O)(ORk)-S―, ―O―P(S)(ORk)-S―, ―S―P(S)(ORk)-O―, ―O―P(O)(Rk)-O―, ―O―P(S)(Rk)-O―, ―S―P(O)(Rk)-O―, ―S―P(S)(Rk)-O―, ―S―P(O)(Rk)-S―, ―O―P(S)(Rk)-S―이다. 바람직한 구현예는 ―O―P(O)(OH)―O―, ―O―P(S)(OH)―O―, ―O―P(S)(SH)―O―, ―S―P(O)(OH)―O―, ―O―P(O)(OH)―S―, ―S―P(O)(OH)―S―, ―O―P(S)(OH)―S―, ―S―P(S)(OH)―O―, ―O―P(O)(H)―O―, ―O―P(S)(H)―O―, ―S―P(O)(H)―O―, ―S―P(S)(H)―O―, ―S―P(O)(H)―S―, ―O―P(S)(H)―S―이다. 바람직한 구현예는 ―O―P(O)(OH)―O―이다. 이들 후보물질은 전술한 것들과 유사한 방법을 이용해 평가될 수 있다.
산 분해형 연결 기
산 분해형 연결 기는 산성 조건 하에 분해되는 연결 기이다. 바람직한 구현예에서, 산 분해형 연결 기는, pH가 약 6.5 이하(예를 들어, 약 6.0, 5.5, 5.0 이하)인 산성 환경에서, 또는 일반 산(general acid)으로서 작용할 수 있는 효소와 같은 제제에 의해 분해된다. 세포에서, 엔도좀 및 리소좀과 같이 pH가 낮은 특정 세포소기관은 산 분해형 연결 기에 대해 분해 환경을 제공할 수 있다. 산 분해형 연결 기의 예로는, 하이드라존, 케탈, 아세탈, 에스테르, 및 아미노산의 에스테르를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 산 분해 기는 일반식 -C=NN-, C(O)O, 또는 -OC(O)을 가질 수 있다. 바람직한 구현예는, 에스테르의 산소에 부착된 탄소(알콕시기)가 아릴기, 치환된 알킬기, 또는 디메틸 펜틸 또는 t-부틸과 같은 3차 알킬기인 경우이다. 이들 후보물질은 전술한 것들과 유사한 방법을 이용해 평가될 수 있다.
에스테르-기재의 연결 기
에스테르-기재의 연결기는 세포 내 에스테라제 및 아미다제와 같은 효소에 의해 분해된다. 에스테르-기재의 분해형 연결기의 예로는, 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌 기의 에스테르를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 에스테르 분해형 연결 기는 일반식 -C(O)O-, 또는 -OC(O)-를 가진다. 이들 후보물질은 전술한 것들과 유사한 방법을 이용해 평가될 수 있다.
펩타이드-기재의 분해기
펩타이드-기재 연결기는 세포 내 펩티다제 및 프로테아제와 같은 효소에 의해 분해된다. 펩타이드-기재의 분해형 연결기는 아미노산들 사이에 형성되어 올리고펩타이드(예를 들어, 디펩타이드, 트리펩타이드 등) 및 폴리펩타이드를 제공하는 펩타이드 결합이다. 펩타이드-기재의 분해 기는 아미드기(-C(O)NH-)를 포함하지 않는다. 아미드기는 임의의 알킬렌, 알케닐렌 또는 알킨렌 간에 형성될 수 있다. 펩타이드 결합은 아미노산들 간에 형성되어 펩타이드 및 단백질을 제공하는 아미드 결합의 특수한 유형이다. 펩타이드-기재의 분해 기는 일반적으로, 아미노산들 간에 형성되어 펩타이드 및 단백질을 제공하는 펩타이드 결합(즉, 아미드 결합)으로 한정되며, 전체의 아미드 작용기를 포함하지 않는다. 펩타이드 분해형 연결기는 화학식 -NHCHR1C(O)NHCHR2C(O)-를 가지며, 여기서, R1 및 R2는 2개의 인접한 아미노산의 R 기이다. 이들 후보물질은 전술한 것들과 유사한 방법을 이용해 평가될 수 있다.
생분해형 링커/테터
링커는 또한 분자의 두 부분, 예를 들어, 비스(siRNA)를 생성시키는 두 개의 개별 siRNA 분자 중 하나 또는 둘 모두의 가닥을 연결하는 뉴클레오타이드 및 비-뉴클레오타이드 링커 또는 이들의 조합인 생분해형 링커를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 두 개의 개별 siRNA 간의 단순한 정전 또는 적층 상호작용은 링커를 나타낼 수 있다. 비-뉴클레오타이드 링커는 지방족, 비사이클릭, 헤테로사이클릭, 및 이들의 조합인, 단당류, 이당류, 올리고당류, 및 이들의 유도체로부터 얻어진 테터 또는 링커를 포함한다.
일부 구현예에서, 링커(테터) 중 적어도 하나는 갈락토사민, 글루코사민, 글루코스, 갈락토스, 및 만노스, 및 이들의 조합의 DNA, RNA, 디설파이드, 아미드, 작용화 단당류 또는 올리고당류로 이루어진 군으로부터 선택된 생분해형 링커이다.
일 구현예에서, 생분해형 탄수화물 링커는, 두 개의 siRNA 단위를 연결할 수 있는 적어도 하나의 아노머 결합을 갖는, 1개 내지 10개 당류 단위를 가질 수 있다. 둘 이이상의 당류가 존재하는 경우, 이들 단위는 1개 내지 3개, 1개 내지 4개, 또는 1개 내지 6개의 당 결합을 통해, 또는 알킬 사슬을 통해 연결될 수 있다.
예시적인 생분해형 링커는 하기를 포함한다:
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
추가의 예시적인 생분해형 링커는 반응식 28 내지 반응식 30에 예시되어 있다.
생분해형 링커에 대한 더 많은 논의는 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 2018년 1월 18일에 출원된 "Endosomal Cleavable Linkers,"라는 명칭의 PCT 출원 No. PCT/US18/14213에서 찾아볼 수 있다.
담체
소정의 구현예에서, 친유성 모이어티는 하나 이상의 뉴클레오타이드(들)를 치환하는 담체를 통해 iRNA 제제에 접합된다.
담체는 사이클릭 기 또는 비사이클릭 기일 수 있다. 일 구현예에서, 사이클릭 기는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔란, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸릴, 및 데칼린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 비사이클릭 기는 세리놀 백본 또는 디에탄올아민 백본을 기반으로 한 모이어티이다.
일부 구현예에서, 담체는 이중-가닥 iRNA 제제의 내부 위치(들)에서 하나 이상의 뉴클레오타이드(들)를 치환한다.
다른 구현예에서, 담체는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 말단에서 뉴클레오타이드를 치환한다. 일 구현예에서, 담체는 센스 가닥의 3' 말단 상의 말단 뉴클레오타이드를 치환하고, 이에 의해 센스 가닥의 3' 말단을 보호하는 말단 캡으로서 작용한다. 일 구현예에서, 담체는 아민을 갖는 사이클릭 기이고, 예를 들어, 담체는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐, 또는 데칼리닐일 수 있다.
하위단위의 리보스 당이 이와 같이 치환되는 리보뉴클레오타이드 하위단위는 본원에서 리보스 치환 변형 하위단위(RRMS)로 지칭된다. 담체는 사이클릭 또는 비사이클릭 모이어티일 수 있고, 두 개의 "백본 부착점"(예를 들어, 하이드록실 기) 및 리간드(예를 들어, 친유성 모이어티)를 포함한다. 친유성 모이어티는 담체에 직접 부착되거나, 상술된 바와 같이 개입하는 링커/테터에 의해 담체에 간접적으로 부착될 수 있다.
Figure pct00007
리간드-접합 단량체 하위단위는 iRNA 분자의 5' 또는 3' 말단 하위단위일 수 있다. 즉, 두 개의 "W" 기 중 하나는 하이드록실 기일 수 있고, 다른 "W" 기는 둘 이상의 비변형 또는 변형 리보뉴클레오타이드의 사슬일 수 있다. 대안적으로, 리간드-접합 단량체 하위단위는 임의의 내부 위치를 점유할 수 있고, 둘 모두의 "W" 기는 하나 이상의 비변형 또는 변형 리보뉴클레오타이드일 수 있다. 하나보다 많은 리간드-접합 단량체 하위단위는 iRNA 제제에 존재할 수 있다.
당 치환-기재 단량체, 예를 들어, 리간드-접합 단량체(사이클릭)
사이클릭 당 치환-기재 단량체, 예를 들어, 당 치환-기재 리간드-접합 단량체는 또한 본원에서 RRMS 단량체 화합물로 지칭된다. 담체는 하기에서 제공되는 일반식(LCM-2)를 가질 수 있다(상기 구조에서, 바람직한 백본 부착점은 R1 또는 R2; R3 또는 R4; 또는 Y가 CR9R10에 존재하는 경우 R9 및 R10으로부터 선택될 수 있음(두 개의 위치는 두 개의 백본 부착점, 예를 들어, R1과 R4, 또는 R4와 R9를 제공하도록 선택됨)). 바람직한 테터링 부착점은 R7; X가 CH2인 경우 R5 또는 R6을 포함한다. 담체는 가닥으로 도입될 수 있는 엔터티(entity)로서 후술된다. 따라서, 구조는 또한 부착점의 하나(말단 위치의 경우) 또는 두 개(내부 위치의 경우), 예를 들어, R1 또는 R2; R3 또는 R4; 또는 R9 또는 R10(Y가 CR9R10일 때)은 포스페이트, 또는 변형 포스페이트, 예를 들어, 황 함유 백본에 연결되는 상황을 포괄하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 상기 명명된 R 기들 중 하나는 -CH2-일 수 있고, 여기서 하나의 결합이 담체에 연결되고, 하나가 백본 원자, 예를 들어, 연결 산소 또는 중앙 인 원자에 연결된다.
Figure pct00008
식에서,
X는 N(CO)R7, NR7 또는 CH2이고;
Y는 NR8, O, S, CR9R10이고;
Z는 CR11R12이거나 부재이고;
각각의 R1, R2, R3, R4, R9, 및 R10은 독립적으로 H, ORa, 또는 (CH2)nORb이고, 단, R1, R2, R3, R4, R9, 및 R10 중 적어도 두 개는 ORa 및/또는 (CH2)nORb이고;
각각의 R5, R6, R11, 및 R12는 독립적으로 리간드, H, 1개 내지 3개의 R13로 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, 또는 C(O)NHR7이거나; R5와 R11은 함께 R14로 선택적으로 치환된 C3-C8 사이클로알킬이고;
R7은 리간드일 수 있고, 예를 들어, R7은 Rd일 수 있거나, R7은, 예를 들어, 테터링 모이어티를 통해 담체에 간접적으로 테터링된 리간드, 예를 들어, NRcRd로 치환된 C1-C20 알킬; 또는 NHC(O)Rd로 치환된 C1-C20 알킬일 수 있고;
R8은 H 또는 C1-C6 알킬이고;
R13은 하이드록시, C1-C4 알콕시, 또는 할로이고;
R14은 NRcR7이고;
R15은 시아노로 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, 또는 C2-C6 알케닐이고;
R16은 C1-C10 알킬이고;
R17은 액체 또는 고체 상 지지 시약이고;
L은 -C(O)(CH2)qC(O)-, 또는 -C(O)(CH2)qS-이고;
Ra는 보호 기, 예를 들어, CAr3;(예를 들어, 디메톡시트리틸 기) 또는 Si(X5')(X5'')(X5''')(여기서, (X5'), (X5''), 및 (X5''')는 다른 곳에서 기재된 바와 같음)이고;
Rb는 P(O)(O-)H, P(OR15)N(R16)2 또는 L-R17이고;
Rc는 H 또는 C1-C6 알킬이고;
Rd는 H 또는 리간드이고;
각 Ar은, 독립적으로, C1-C4 알콕시로 선택적으로 치환된 C6-C10 아릴이고;
n은 1 내지 4이고; q는 0 내지 4이다.
예시적인 담체는, 예를 들어, X가 N(CO)R7 또는 NR7이고, Y가 CR9R10이고, Z가 부재인 것; 또는 X가 N(CO)R7 또는 NR7이고, Y가 CR9R10이고, Z가 CR11R12인 것; 또는 X가 N(CO)R7 또는 NR7이고, Y가 NR8이고, Z가 CR11R12인 것; 또는 X가 N(CO)R7 또는 NR7이고, Y가 O이고, Z가 CR11R12인 것; 또는 X가 CH2이고; Y가 CR9R10이고; Z가 CR11R12이고, R5와 R11이 함께 C6 사이클로알킬을 형성하는 것(H, z = 2), 예를 들어, X가 CH2; Y가 CR9R10이고; Z가 CR11R12이고, R5와 R11이 함께 C5 사이클로알킬을 형성하는 인단 고리 시스템(H, z = 1)을 포함한다.
소정의 구현예에서, 담체는 피롤린 고리 시스템, 또는, 예를 들어, X가 N(CO)R7 또는 NR7이고, Y가 CR9R10이고, Z가 부재인 4-하이드록시프롤린 고리 시스템(D)을 기반으로 할 수 있다
Figure pct00009
. OFG1은 바람직하게는, 5-원 고리에서 탄소 중 하나에 연결되는, 일차 탄소, 예를 들어, 엑소사이클릭 알킬렌 기, 예를 들어, 메틸렌 기에 부착된다(D에서 -CH2OFG1). OFG2는 바람직하게는 5-원 고리에서 탄소 중 하나에 직접 부착된다(D에서 -OFG2). 피롤린-기재 담체의 경우, -CH2OFG1은 C-2에 부착될 수 있고, OFG2는 C-3에 부착될 수 있거나; -CH2OFG1은 C-3에 부착될 수 있고, OFG2는 C-4에 부착될 수 있다. 소정의 구현예에서, CH2OFG1 및 OFG2는 상기 언급된 탄소 중 하나에 같은 자리로 치환될 수 있다. 3-하이드록시프롤린-기재 담체의 경우, -CH2OFG1은 C-2에 부착될 수 있고, OFG2는 C-4에 부착될 수 있다. 피롤린- 및 4-하이드록시프롤린-기재 단량체는 따라서 결합(예를 들어, 탄소-탄소 결합)을 함유할 수 있고, 여기서 결합 회전은 특정 결합에 대해서 제한되고, 예를 들어, 고리의 존재로부터 제한이 일어난다. 따라서, CH2OFG1 및 OFG2는 상기 기재된 임의의 페어링에서 서로에 대해 시스 또는 트랜스일 수 있다. 이에 따라서, 모든 시스/트랜스 이성질체가 명백히 포함된다. 또한, 단량체는 하나 이상의 비대칭 중심을 함유할 수 있고, 따라서 라세미체 및 라세미 혼합물, 단일 거울상이성질체, 개별 부분입체이성질체 및 부분입체 이성질체 혼합물로서 발생한다. 단량체의 이러한 이성질체 형태 모두는 명시적으로 포함된다(예를 들어, CH2OFG1 및 OFG2를 갖는 중심은 둘 모두 R 배치를 가질 수 있거나; 둘 모두 S 배치를 가질 수 있거나; 하나의 중심이 R 배치를 가질 수 있고, 다른 중심이 S 배치를 가질 수 있으며, 그 반대일 수 있음). 테터링 부착점은 바람직하게는 질소이다. 담체 D의 바람직한 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00010
.
소정의 구현예에서, 담체는, 예를 들어, X가 N(CO)R7 또는 NR7이고, Y가 CR9R10이고, Z가 CR11R12인 피페리딘 고리 시스템(E)을 기반으로 할 수 있다
Figure pct00011
. OFG1은 바람직하게는, 6-원 고리에서 탄소 중 하나에 연결되는, 일차 탄소, 예를 들어, 엑소사이클릭 알킬렌 기, 예를 들어, 메틸렌 기(n=1) 또는 에틸렌 기(n=2)에 부착된다[E에서 -(CH2)nOFG1]. OFG2는 바람직하게는 6-원 고리에서 탄소 중 하나에 직접 부착된다(E에서 -OFG2). -(CH2)nOFG1 및 OFG2는 고리에 같은 자리로 배치될 수 있다. 즉, 둘 모두의 기가, 예를 들어, C-2, C-3, 또는 C-4에서 동일한 탄소에 부착될 수 있다. 대안적으로, -(CH2)nOFG1 및 OFG2는 고리에서 이웃 자리로 배치될 수 있다. 즉, 둘 모두의 기가 인접한 고리 탄소 원자에 부착될 수 있는데, 예를 들어, -(CH2)nOFG1은 C-2에 부착될 수 있고, OFG2는 C-3에 부착될 수 있거나; -(CH2)nOFG1은 C-3에 부착될 수 있고, OFG2는 C-2에 부착될 수 있거나; -(CH2)nOFG1은 C-3에 부착될 수 있고, OFG2는 C-4에 부착될 수 있거나; -(CH2)nOFG1은 C-4에 부착될 수 있고, OFG2는 C-3에 부착될 수 있다. 피페리딘-기재 단량체는 따라서 결합(예를 들어, 탄소-탄소 결합)을 함유할 수 있고, 여기서 결합 회전은 특정 결합에 대해서 제한되고, 예를 들어, 고리의 존재로부터 제한이 일어난다. 따라서, -(CH2)nOFG1 및 OFG2는 상기 기재된 임의의 페어링에서 서로에 대해 시스 또는 트랜스일 수 있다. 이에 따라, 모든 시스/트랜스 이성질체가 명시적으로 포함된다. 또한, 단량체는 하나 이상의 비대칭 중심을 함유할 수 있고, 따라서 라세미체 및 라세미 혼합물, 단일 거울상이성질체, 개별 부분입체이성질체 및 부분입체 이성질체 혼합물로서 발생한다. 단량체의 이러한 이성질체 형태 모두는 명시적으로 포함된다(예를 들어, CH2OFG1 및 OFG2를 갖는 중심은 둘 모두 R 배치를 가질 수 있거나; 둘 모두 S 배치를 가질 수 있거나; 하나의 중심이 R 배치를 가질 수 있고, 다른 중심이 S 배치를 가질 수 있으며, 그 반대일 수 있음). 테터링 부착점은 바람직하게는 질소이다.
소정의 구현예에서, 담체는, 예를 들어, X가 N(CO)R7 또는 NR7이고, Y가 NR8이고, Z가 CR11R12인 피레라진 고리 시스템(F), 또는 X가 N(CO)R7 또는NR7이고, Y가 O이고, Z가 CR11R12인 모르폴린 고리 시스템(G)을 기반으로 할 수 있다
Figure pct00012
. OFG1은 바람직하게는, 6-원 고리에서 탄소 중 하나에 연결되는, 일차 탄소, 예를 들어, 엑소사이클릭 알킬렌 기, 예를 들어, 메틸렌 기에 부착된다(F 또는 G에서 -CH2OFG1). OFG2는 바람직하게는 6-원 고리에서 탄소 중 하나에 직접 부착된다(F 또는 G에서 -OFG2). F와 G 둘 모두의 경우, -CH2OFG1은 C-2에 부착될 수 있고, OFG2는 C-3에 부착될 수 있거나; 이의 반대일 수 있다. 소정의 구현예에서, CH2OFG1 및 OFG2는 상기 언급된 탄소 중 하나에 같은 자리로 치환될 수 있다. 피페라진- 및 모르폴린-기재 단량체는 따라서 결합(예를 들어, 탄소-탄소 결합)을 함유할 수 있고, 여기서 결합 회전은 특정 결합에 대해서 제한되고, 예를 들어, 고리의 존재로부터 제한이 일어난다. 따라서, CH2OFG1 및 OFG2는 상기 기재된 임의의 페어링에서 서로에 대해 시스 또는 트랜스일 수 있다. 이에 따라, 모든 시스/트랜스 이성질체가 명시적으로 포함된다. 또한, 단량체는 하나 이상의 비대칭 중심을 함유할 수 있고, 따라서 라세미체 및 라세미 혼합물, 단일 거울상이성질체, 개별 부분입체이성질체 및 부분입체 이성질체 혼합물로서 발생한다. 단량체의 이러한 이성질체 형태 모두는 명시적으로 포함된다(예를 들어, CH2OFG1 및 OFG2를 갖는 중심은 둘 모두 R 배치를 가질 수 있거나; 둘 모두 S 배치를 가질 수 있거나; 하나의 중심이 R 배치를 가질 수 있고, 다른 중심이 S 배치를 가질 수 있으며, 그 반대일 수 있음). R'''은, 예를 들어, C1-C6 알킬, 바람직하게는 CH3일 수 있다. 테터링 부착점은 바람직하게는 F와 G 둘 모두에서 질소이다.
소정의 구현예에서, 담체는, 예를 들어, X가 CH2이고; Y가 CR9R10이고; Z가 CR11R12이고, R5와 R11이 함께 C6 사이클로알킬을 형성하는 데칼린 고리 시스템(H, z = 2), 또는, 예를 들어, X가 CH2이고; Y가 CR9R10이고; Z가 CR11R12이고, R5와 R11이 함께 C5 사이클로알킬을 형성하는 인단 고리 시스템(H, z = 1)을 기반으로 할 수 있다.
Figure pct00013
. OFG1는 바람직하게는, C-2, C-3, C-4, 또는 C-5 중 하나에 연결되는, 일차 탄소, 예를 들어, 엑소사이클릭 메틸렌 기(n=1) 또는 에틸렌 기(n=2)에 부착된다[H에서 -(CH2)nOFG1]. OFG2는 바람직하게는 C-2, C-3, C-4, 또는 C-5 중 하나에 직접 부착된다(H에서 -OFG2). -(CH2)nOFG1 및 OFG2는 고리에 같은 자리로 배치될 수 있다. 즉, 둘 모두의 기가, 예를 들어, C-2, C-3, C-4, 또는 C-5에서 동일한 탄소에 부착될 수 있다. 대안적으로, -(CH2)nOFG1 및 OFG2는 고리에서 이웃 자리로 배치될 수 있다. 즉, 둘 모두의 기가 인접한 고리 탄소 원자에 부착될 수 있는데, 예를 들어, -(CH2)nOFG1은 C-2에 부착될 수 있고, OFG2는 C-3에 부착될 수 있거나; -(CH2)nOFG1은 C-3에 부착될 수 있고, OFG2는 C-2에 부착될 수 있거나; -(CH2)nOFG1은 C-3에 부착될 수 있고, OFG2는 C-4에 부착될 수 있거나; -(CH2)nOFG1은 C-4에 부착될 수 있고, OFG2는 C-3에 부착될 수 있거나; -(CH2)nOFG1는 C-5에 부착될 수 있고, OFG2는 C-4에 부착될 수 있다. 데칼린 또는 인단-기재 단량체는 따라서 결합(예를 들어, 탄소-탄소 결합)을 함유할 수 있고, 여기서 결합 회전은 특정 결합에 대해서 제한되고, 예를 들어, 고리의 존재로부터 제한이 일어난다. 따라서, -(CH2)nOFG1 및 OFG2는 상기 기재된 임의의 페어링에서 서로에 대해 시스 또는 트랜스일 수 있다. 이에 따라, 모든 시스/트랜스 이성질체가 명시적으로 포함된다. 또한, 단량체는 하나 이상의 비대칭 중심을 함유할 수 있고, 따라서 라세미체 및 라세미 혼합물, 단일 거울상이성질체, 개별 부분입체이성질체 및 부분입체 이성질체 혼합물로서 발생한다. 단량체의 이러한 이성질체 형태 모두는 명시적으로 포함된다(예를 들어, CH2OFG1 및 OFG2를 갖는 중심은 둘 모두 R 배치를 가질 수 있거나; 둘 모두 S 배치를 가질 수 있거나; 하나의 중심이 R 배치를 가질 수 있고, 다른 중심이 S 배치를 가질 수 있으며, 그 반대일 수 있음). 바람직한 구현예에서, C-1 및 C-6에서 치환기는 서로에 대해 트랜스이다. 테터링 부착점은 바람직하게는 C-6 또는 C-7이다.
다른 담체는 3-하이드록시프롤린(J)을 기반으로 한 것들을 포함할 수 있다
Figure pct00014
. 따라서, -(CH2)nOFG1 및 OFG2는 서로에 대해 시스 또는 트랜스일 수 있다. 이에 따라, 모든 시스/트랜스 이성질체가 명시적으로 포함된다. 또한, 단량체는 하나 이상의 비대칭 중심을 함유할 수 있고, 따라서 라세미체 및 라세미 혼합물, 단일 거울상이성질체, 개별 부분입체이성질체 및 부분입체 이성질체 혼합물로서 발생한다. 단량체의 이러한 이성질체 형태 모두는 명시적으로 포함된다(예를 들어, CH2OFG1 및 OFG2를 갖는 중심은 둘 모두 R 배치를 가질 수 있거나; 둘 모두 S 배치를 가질 수 있거나; 하나의 중심이 R 배치를 가질 수 있고, 다른 중심이 S 배치를 가질 수 있으며, 그 반대일 수 있음). 테터링 부착점은 바람직하게는 질소이다.
더 많은 대표적인 사이클릭, 당 치환-기재 담체에 대한 세부 사항은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 No. 7,745,608 및 8,017,762에서 찾아볼 수 있다.
당 치환-기재 단량체(비사이클릭)
비사이클릭 당 치환-기재 단량체, 예를 들어, 당 치환-기재 리간드-접합 단량체는 또한 본원에서 리보스 치환 단량체 하위단위(RRMS) 단량체 화합물로 지칭된다. 바람직한 비사이클릭 담체는 화학식 LCM-3 또는 LCM-4를 가질 수 있다:
Figure pct00015
.
일부 구현예에서, 각각의 x, y, 및 z는 서로 독립적으로 0, 1, 2, 또는 3일 수 있다. 화학식 LCM-3에서, y와 z가 상이할 때, 삼차 탄소는 R 배치 또는 S 배치를 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서, x는 0(제로)이고, y 및 z는 각각 화학식 LCM-3(예를 들어, 세리놀 기반)에서 1이고, y 및 z는 각각 화학식 LCM-3에서 1이다. 각각의 하기 화학식 LCM-3 또는 LCM-4는, 예를 들어, 하이드록시, 알콕시, 퍼할로알킬로 선택적으로 치환될 수 있다.
더 많은 대표적인 비사이클릭, 당 치환-기재 담체에 대한 세부 사항은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 No. 7,745,608 및 8,017,762에서 찾아볼 수 있다.
일부 구현예에서, 이중 가닥 iRNA 제제는 센스 가닥의 5' 말단 또는 안티센스 가닥의 5' 말단에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 포함한다.
소정의 구현예에서, 친유성 모이어티는 담체 및/또는 링커를 통해 가닥의 5'-말단에 접합된다. 일 구현예에서, 친유성 모이어티는 다음 화학식의 담체를 통해 가닥의 5'-말단에 접합된다:
Figure pct00016
Figure pct00017
. R은 리간드, 예컨대, 친유성 모이어티이다.
일부 구현예에서, 이중 가닥 iRNA 제제는 센스 가닥의 3' 말단 또는 안티센스 가닥의 3' 말단에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 포함한다.
소정의 구현예에서, 친유성 모이어티는 담체 및/또는 링커를 통해 가닥의 3'-말단에 접합된다. 일 구현예에서, 친유성 모이어티는 다음 화학식의 담체를 통해 가닥의 3'-말단에 접합된다:
Figure pct00018
Figure pct00019
R은 리간드, 예컨대, 친유성 모이어티이다.
일부 구현예에서, 이중 가닥 iRNA 제제는 센스 가닥의 양 말단에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, 이중 가닥 iRNA 제제는 안티센스 가닥의 양 말단에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, 이중 가닥 iRNA 제제는 센스 가닥의 5' 말단 또는 3' 말단에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티, 및 안티센스 가닥의 5' 말단 또는 3' 말단에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 포함한다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 하나 이상의 링커(테터) 및/또는 담체를 통해 가닥의 말단에 접합된다.
일 구현예에서, 친유성 모이어티는 하나 이상의 링커(테터)를 통해 가닥의 말단에 접합된다.
일 구현예에서, 친유성 모이어티는 사이클릭 담체를 통해, 선택적으로 하나 이상의 개입 링커(테터)를 통해 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 5' 말단에 접합된다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에 접합된다. 가닥의 내부 위치는, 가닥의 3' 말단 및 5' 말단으로부터의 말단 위치를 제외한(예를 들어, 두 개의 위치: 3' 말단으로부터 계수하여 1번 위치 및 5' 말단으로부터 계수하여 1번 위치 배제) 가닥의 임의의 위치의 뉴클레오타이드를 지칭한다.
일 구현예에서, 친유성 모이어티는 가닥의 각 단부로부터 말단 두 개의 위치를 제외한(예를 들어, 네 개의 위치: 3' 말단으로부터 계수하여 1번 위치 및 2번 위치 및 5' 말단으로부터 계수하여 1번 위치 및 2번 위치 배제) 모든 위치를 포함하는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에 접합된다. 일 구현예에서, 친유성 모이어티는 가닥의 각 단부로부터 말단 세 개의 위치를 제외한(예를 들어, 여섯 개의 위치: 3' 말단으로부터 계수하여 1번 위치, 2번 위치 및 3번 위치 및 5' 말단으로부터 계수하여 1번 위치, 2번 위치 및 3번 위치 배제) 모든 위치를 포함하는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에 접합된다.
일 구현예에서, 친유성 모이어티는 센스 가닥의 분해 부위 영역을 제외한 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에 접합되는데, 예를 들어, 친유성 모이어티는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 9번 내지 12번 위치에 접합되지 않으며, 예를 들어, 친유성 모이어티는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 9번 내지 11번 위치에 접합되지 않는다. 대안적으로, 내부 위치는 센스 가닥의 3'-말단으로부터 계수하여 11번 내지 13번 위치를 배제한다.
일 구현예에서, 친유성 모이어티는 안티센스 가닥의 분해 부위 영역을 배제하는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에 접합된다. 예를 들어, 내부 위치는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 12번 내지 14번 위치를 배제한다.
일 구현예에서, 친유성 모이어티는, 3'-말단으로부터 계수하여 센스 가닥의 11번 내지 13번 위치, 및 5'-말단으로부터 계수하여 안티센스 가닥의 12번 내지 14번 위치를 배제하는, 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에 접합된다.
일 구현예에서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 다음 내부 위치 중 하나 이상에 접합된다: 각 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여, 센스 가닥의 4번 내지 8번 및 13번 내지 18번 위치, 및 안티센스 가닥의 6번 내지 10번 및 15번 내지 18번 위치.
일 구현예에서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 다음 내부 위치 중 하나 이상에 접합된다: 각 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여, 센스 가닥의 5번, 6번, 7번, 15번, 및 17번 위치, 및 안티센스 가닥의 15번 및 17번 위치.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 이중-가닥 iRNA 제제의 뉴클레오베이스, 당 모이어티, 또는 뉴클레오사이드간 결합에 접합된다.
정의
구체적인 정의가 제공되지 않는 한, 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 약제 및 제약 화학과 연관하여 사용되는 명명법 및 이들의 절차 및 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 당업계에서 일반적으로 사용되는 것들이다. 표준 기법이 화학적 합성, 및 화학적 분석에 사용될 수 있다. 특정의 그러한 기법 및 절차는, 예를 들어, 임의의 목적 상 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 문헌["Carbohydrate Modifications in Antisense Research" Edited by Sangvi and Cook, American Chemical Society, Washington D.C., 1994; "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., 18th edition, 1990; 및 "Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications" Edited by Stanley T. Crooke, CRC Press, Boca Raton, Fla.; 및 Sambrook et al., "Molecular Cloning, A laboratory Manual," 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]에서 찾아볼 수 있다. 허용되는 경우, 본원의 개시 전반에 걸쳐 언급된 모든 특허, 출원, 공개 출원 및 기타 간행물 및 기타 데이터는 그 전체가 원용에 의해 포함된다.
달리 지시되지 않는 한, 하기 용어들은 하기 의미들을 갖는다:
본원에서 사용되는 용어 "타겟 핵산"은 발현 또는 활성이 siRNA 화합물에 의해 조절될 수 있는 임의의 핵산 분자를 지칭한다. 타겟 핵산은 타겟 단백질을 코딩하는 DNA로부터 번역되는 RNA(pre-mRNA 및 mRNA 또는 이들의 일부를 포함하나, 이로 한정되지 않음), 및 또한 그러한 RNA, 및 miRNA로부터 유래된 cDNA를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 예를 들어, 타겟 핵산은 발현이 특정 장애 또는 질환 상태와 관련이 있는 세포 유전자(또는 유전자로부터 번역된 mRNA)일 수 있다. 일부 구현예에서, 타겟 핵산은 감염원으로부터의 핵산 분자일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "iRNA"는 RNA 전사물의 타겟화된 분해를 매개하는 제제를 지칭한다. 이러한 제제는 RNAi-유도 사일런싱 복합체(RNAi-induced silencing complex: RISC)로도 알려진 세포질 다중-단백질 복합체와 관련된다. RNA 간섭을 유도하는 데 효과적인 제제가 또한 본원에서 siRNA, RNAi 작용제 또는 iRNA 제제로 지칭된다. 따라서, 이러한 용어들은 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 iRNA는 마이크로RNA 및 전-마이크로RNA를 포함한다. 또한, 본원에서 사용되는 본 발명의 "화합물" 또는 "화합물들"은 또한 iRNA 제제를 지칭하며, iRNA 제제와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
iRNA 제제는 타겟 유전자에 충분한 상동성의 영역을 포함하고, iRNA 제제, 또는 이의 단편이 타겟 유전자의 하향조절을 매개할 수 있도록 뉴클레오타이드의 측면에서 충분한 길이어야 한다. (설명의 용이성을 위해, 예를 들어, 용어 뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드는 때때로 본원에서 iRNA 제제의 하나 이상의 단량체 하위단위에 대한 언급에서 사용된다. 본원에서 용어 "리보뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드"의 사용은 변형 RNA 또는 뉴클레오타이드 서로게이트의 경우에 또한 하나 이상의 위치에서 변형 뉴클레오타이드, 또는 서로게이트 치환 모이어티를 지칭할 수 있다는 것이 이해될 것이다.) 따라서, iRNA 제제는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로, 및 일부 구현예에서 완전히 상보적인 영역이거나 이를 포함한다. iRNA 제제와 타겟 사이가 완전 상보적일 필요는 없지만, 대응물이 iRNA 제제, 또는 이들의 분해 산물로 하여금, 예를 들어, 타겟 RNA, 예를 들어, mRNA의 RNAi 분해에 의해 서열 특이적 사일런싱을 유도할 수 있게 하기에 충분해야 한다. 안티센스에서는 타겟 가닥과의 상보성, 또는 상동성 정도가 가장 중요하다. 특히 안티센스 가닥에서 완전 상보성이 흔히 바람직하지만, 일부 구현예는 특히 안티센스 가닥에서, 하나 이상, 또는 예를 들어, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 또는 그 미만의 미스매치(타겟 RNA에 대해)를 포함할 수 있다. 센스 가닥은 안티센스 가닥과 충분히 상보적이어야만 분자의 모든 이중 가닥 특징을 유지한다.
iRNA 제제는 인터페론 반응을 촉발시키기에 충분히 긴 분자(이는 다이서에 의해 분해되고(Bernstein et al. 2001. Nature, 409:363-366) RISC(RNAi-유도 사일런싱 복합체)에 진입할 수 있음); 및 인터페론 반응을 촉발시키지 않게 충분히 짧은 분자(분자는 또한 다이서에 의해 분해되고/분해되거나 RISC에 진입할 수 있음), 예를 들어, RISC에 대한 진입이 가능한 크기의 분자, 예를 들어, 다이서-분해 산물과 유사한 분자를 포함한다. 인터페론 반응을 촉발시키지 않게 충분히 짧은 분자는 본원에서 siRNA 제제 또는 더 짧은 iRNA 제제로 칭해진다. 본원에서 사용되는 "siRNA 제제 또는 더 짧은 iRNA 제제"는 인간 세포에서 유해한 인터페론 반응을 유도하지 않기에 충분히 짧은, 60개, 50개, 40개, 또는 30개 미만의 뉴클레오타이드 쌍의 듀플렉스 영역을 갖는, iRNA 제제, 예를 들어, 이중 가닥 RNA 제제 또는 단일 가닥 제제를 지칭한다. siRNA 제제, 또는 이의 분해 산물은, 예를 들어, 타겟 RNA에 대해 RNAi를 유도함으로써 타겟 유전자를 하향 조절할 수 있고, 여기서 타겟은 내생성 또는 병원성 타겟 RNA를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "단일 가닥 iRNA 제제"는 단일 분자로 구성되는 iRNA 제제이다. 이는 가닥내 페어링에 의해 형성된 듀플렉스 영역을 포함할 수 있는데, 예를 들어, 이는 헤어핀 또는 팬-핸들 구조일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다. 단일 가닥 iRNA 제제는 타겟 분자에 대해 안티센스일 수 있다. 단일 가닥 iRNA 제제는 RISC에 진입하거나 타겟 mRNA의 RISC 매개 분해에 관여할 수 있도록 충분히 길 수 있다. 단일 가닥 iRNA 제제는 적어도 14개, 및 다른 구현예에서, 적어도 15개, 20개, 25개, 29개, 35개, 40개, 또는 50개 뉴클레오타이드 길이이다. 소정의 구현예에서, 이는 200개, 100개, 또는 60개 미만 뉴클레오타이드 길이이다.
루프는 iRNA 가닥의 한 섹션이 또 다른 가닥 또는 동일한 가닥의 또 다른 섹션과 염기쌍을 형성할 때 듀플렉스에서 대항하는 뉴클레오타이드와 짝을 이루지 않는 iRNA 가닥의 영역을 지칭한다.
헤어핀 iRNA 제제는 17개, 18개, 19개, 29개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개 이상의 뉴클레오타이드 쌍의 듀플렉스 영역을 가질 것이다. 듀플렉스 영역은 200개, 100개, 또는 50개 이하의 길이일 수 있을 것이다. 소정의 구현예에서, 듀플렉스 영역에 대한 범위는 15개 내지 30개, 17개 내지 23개, 19개 내지 23개, 및 19개 내지 21개 뉴클레오타이드 쌍 길이이다. 헤어핀은 일부 구현예에서 3'에서, 및 소정의 구현예에서 헤어핀의 안티센스 측에서 단일 가닥 오버행 또는 말단의 쌍을 이루지 않은 영역을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 오버행은 2개 내지 3개 뉴클레오타이드 길이이다.
본원에서 사용되는 "이중 가닥(ds) iRNA 제제"는 사슬간 혼성화가 듀플렉스 구조의 영역을 형성할 수 있는 하나보다 많은, 및 일부 경우에 두 개의 가닥을 포함하는 iRNA 제제이다.
본원에서 사용되는 용어 "siRNA 활성" 및 "RNAi 활성"은 siRNA에 의한 유전자 사일런싱을 지칭한다.
본원에서 사용되는 RNA 간섭 분자에 의한 "유전자 사일런싱"은 타겟 유전자에 대한 세포에서 mRNA 수준의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 100% 이하, 및 miRNA 또는 RNA 간섭 분자의 존재 없이 세포에서 확인되는 mRNA 수준의 그 사이의 임의의 정수로의 감소를 지칭한다. 하나의 바람직한 구현예에서, mRNA 수준은 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 100% 이하, 및 5% 내지 100% 사이의 임의의 정수로 감소된다.
본원에서 사용되는 용어 "유전자 발현을 조절하다"는 유전자의 발현, 또는 RNA 분자 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위를 코딩하는 등가의 RNA 분자의 수준이 조절제의 부재에서 관찰되는 발현, 수준, 또는 활성보다 크도록 또는 낮도록 상향 조절되거나 하향 조절된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 용어 "조절하다"는 "억제하다"를 의미할 수 있지만, 단어 "조절하다"의 사용은 이러한 정의로 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 유전자 발현 조절은 유전자의 발현, 또는 RNA 분자 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위를 코딩하는 등가의 RNA 분자의 수준이 siRNA, 예를 들어, RNAi 제제의 부재에서 관찰되는 것과 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배 이상 상이할 때 발생한다. % 및/또는 배수 차이는 대조 또는 비-대조에 비해서 계산될 수 있고, 예를 들어, 하기와 같다:
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유전자 발현과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "억제하다", "하향 조절하다", 또는 "감소하다"는 유전자의 발현, 또는 RNA 분자 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위를 코딩하는 등가의 RNA 분자의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위의 활성이 조절제의 부재에서 관찰되는 것보다 적게 감소된다는 것을 의미한다. 유전자 발현은 유전자의 발현, 또는 RNA 분자 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위를 코딩하는 등가의 RNA 분자의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위의 활성이 상응하는 비조절된 대조에 비해 적어도 10% 더 낮게, 및 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 가장 바람직하게는 100%(즉, 유전자 발현 없음) 감소될 때 하향조절된 것이다.
유전자 발현과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "증가시키다" 또는 "상향 조절하다"는 유전자의 발현, 또는 RNA 분자 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위를 코딩하는 등가의 RNA 분자의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위의 활성이 조절제의 부재에서 관찰되는 것보다 높게 증가된다는 것을 의미한다. 유전자 발현은 유전자의 발현, 또는 RNA 분자 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위를 코딩하는 등가의 RNA 분자의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위의 활성이 상응하는 비조절된 대조에 비해 적어도 10%, 및 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 100%, 1.1-배, 1.25-배, 1.5-배, 1.75-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 50-배, 100-배 이상 증가될 때 상향 조절된 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "증가된" 또는 "증가하다"는 일반적으로 통계적으로 유의한 양으로의 증가를 의미하고; 어떠한 의심도 피하기 위해, "증가된"은 참조 수준에 비해 적어도 10% 증가, 예를 들어, 참조 수준에 비해 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 100% 이하 증가 또는 10% 내지 100% 사이의 임의의 증가, 또는 참조 수준에 비해 적어도 약 2-배, 또는 적어도 약 3-배, 또는 적어도 약 4-배, 또는 적어도 약 5-배 또는 적어도 약 10-배, 또는 2-배 내지 10-배 이상 사이의 임의의 증가를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "감소된" 또는 "감소하다"는 일반적으로 통계적으로 유의한 양으로의 감소를 의미한다. 그러나, 의심을 피하기 위해, "감소된"은 참조 수준에 비해 적어도 10% 감소, 예를 들어, 참조 수준에 비해 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 감소 또는 100% 이하 감소(즉, 참조 샘플에 비해 부재 수준), 또는 10% 내지 100% 사이의 임의의 감소를 의미한다.
이중-가닥 iRNA는 듀플렉스 구조를 형성하도록 혼성화되기에 충분히 상보적인 두 개의 올리고뉴클레오타이드 가닥을 포함한다. 일반적으로, 듀플렉스 구조는 15개 내지 30개, 더욱 일반적으로 18개 내지 25개, 더욱 더 일반적으로 19개 내지 24개, 및 가장 일반적으로 19개 내지 21개 염기쌍 길이이다. 일부 구현예에서, 25개 내지 30개 염기쌍 길이의 더 긴 이중-가닥 iRNA가 바람직하다. 일부 구현예에서, 10개 내지 15개 염기쌍 길이의 더 짧은 이중-가닥 iRNA가 바람직하다. 또 다른 구현예에서, 이중-가닥 iRNA는 적어도 21개 뉴클레오타이드 길이이다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 RNA 가닥은 타겟 서열의 적어도 일부와 상보적인 상보성 영역을 갖고, 듀플렉스 영역은 14개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이이다. 유사하게, 타겟 서열과 상보적인 영역은 14개 내지 30개, 더욱 일반적으로 18개 내지 25개, 더욱 더 일반적으로 19개 내지 24개, 및 가장 일반적으로 19개 내지 21개 뉴클레오타이드 길이이다.
본원에서 사용되는 문구 "안티센스 가닥"은 관심 대상의 타겟 서열에 실질적으로 또는 100% 상보적인 올리고머 화합물을 지칭한다. 문구 "안티센스 가닥"은 헤어핀 또는 덤벨 타입 구조를 형성할 수 있는 단분자성 올리고머 화합물뿐만 아니라, 두 개의 별개의 가닥으로부터 형성된 올리고머 화합물 둘 모두의 안티센스 영역을 포함한다. 용어 "안티센스 가닥" 및 "가이드 가닥"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
문구 "센스 가닥"은 타겟 서열, 예컨대, 메신저 RNA 또는 DNA의 서열과 전부 또는 일부 동일한 뉴클레오사이드 서열을 갖는 올리고머 화합물을 지칭한다. 용어 "센스 가닥"과 "패신저 가닥"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서, "특이적으로 혼성화할 수 있는" 및 "상보적인"은 핵산이 전형적인 왓슨-크릭 또는 다른 비-전형적인 타입에 의해 또 다른 핵산 서열로 수소 결합(들)을 형성할 수 있다는 것을 의미한다. 본 발명의 핵 분자에 관하여, 이의 상보적 서열을 갖는 핵산 분자에 대한 결합 자유 에너지는 핵산의 관련 기능, 예를 들어, RNAi 활성을 진행시킬 수 있기에 충분하다. 핵산 분자에 대한 결합 자유 에너지의 측정은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Turner et al, 1987, CSH Symp. Quant. Biol. LII pp.123-133; Frier et al., 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377; Turner et al., 1987, /. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785] 참조). 상보성 퍼센트는 제2 핵산 서열과 수소 결합(예를 들어, 왓슨-크릭 염기 페이링)을 형성할 수 있는 핵산 분자에서 인접 잔기의 백분율을 지시한다(예를 들어, 10개 중 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개가 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 100% 상보성임). "완전 상보성" 또는 100% 상보성은 핵산 서열의 인접 잔기 모두가 제2 핵산 서열에서 동일한 수의 인접 잔기와 수소 결합할 것임을 의미한다. 완전 상보성보다 적은은 두 가닥의 뉴클레오사이드 단위 전부는 아니지만 일부가 서로 수소 결합할 수 있는 상황을 지칭한다. "실질적으로 상보적인"은 비상보적이 되도록 선택되는 오버행과 같은 폴리뉴클레오타이드 가닥의 영역을 배제하고 90% 이상 상보성을 나타내는 폴리뉴클레오타이드 가닥을 지칭한다. 특이적 결합은 특이적 결합이 요망되는 조건 하에, 즉, 생체내 검정 또는 치료적 처지의 경우에 생리학적 조건 하에, 또는 시험관내 검정의 경우에 검정이 수행되는 조건 하에 비-타겟 서열에 대한 올리고머 화합물의 비-특이적 결합을 방지하도록 충분한 정도의 상보성을 필요로 한다. 비-타겟 서열은 전형적으로 뉴클레오타이드와 적어도 5개 상이하다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제의 이중-가닥 영역은 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개 이상 뉴클레오타이드 쌍 길이이거나 그 초과이다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제의 안티센스 가닥은 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개 뉴클레오타이드 길이이거나 그 초과이다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제의 센스 가닥은 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개 뉴클레오타이드 길이이거나 그 초과이다.
일 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 15개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이이다.
일 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 19개 내지 25개 뉴클레오타이드 길이이다.
일 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 21개 내지 23개 뉴클레오타이드 길이이다.
일부 구현예에서, 하나의 가닥은 이중 가닥 영역에서 1개 내지 5개의 단일-가닥 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 스트레치를 갖는다. "이중-가닥 영역에서 단일-가닥 뉴클레오타이드의 스트레치"는 단일-가닥 스트레치의 양 말단에 적어도 하나의 뉴클레오타이드 염기쌍이 존재한다는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 둘 모두의 가닥은 이중 가닥 영역에서 1개 내지 5개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개)의 단일-가닥 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 스트레치를 갖는다. 두 가닥 모두가 이중 가닥 영역에서 1개 내지 5개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개)의 단일-가닥 뉴클레오타이드의 스트레치를 갖는 경우, 그러한 단일-가닥 뉴클레오타이드는 서로 대립될 수 있거나(예를 들어, 미스매치 스트레치), 이들은 제2 가닥이 제1 가닥의 단일-가닥 iRNA에 대립되는 단일-가닥 뉴클레오타이드를 갖지 않도록 위치될 수 있고, 이의 반대일 수 있다(예를 들어, 단일-가닥 루프). 일부 구현예에서, 단일-가닥 뉴클레오타이드는 양 말단으로부터 8개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 두 가닥 사이의 상보적 영역의 5' 또는 3' 말단으로부터 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 또는 2개의 뉴클레오타이드 내에 존재한다.
일 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 말단 중 적어도 하나에 단일-가닥 오버행을 포함한다. 일 구현예에서, 단일-가닥 오버행은 1개, 2개, 또는 3개 뉴클레오타이드 길이이다.
일 구현예에서, iRNA 제제의 센스 가닥은 21개-뉴클레오타이드 길이이고, 안티센스 가닥은 23개-뉴클레오타이드 길이이고, 여기서 가닥은 3'-말단에 2개-뉴클레오타이드 길이의 단일 가닥 오버행을 갖는 21개의 연속 염기쌍의 이중-가닥 영역을 형성한다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA의 각 가닥은, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 PCT 공보 No. 2004080406에 기재된 바와 같이, ZXY 구조를 갖는다.
소정의 구현예에서, 이중-가닥 올리고머 화합물의 두 가닥은 서로 연결될 수 있다. 두 가닥은 양 말단에, 또는 단지 하나의 말단에 서로 연결될 수 있다. 하나의 말단에 연결하는 것은 제1 가닥의 5'-말단이 제2 가닥의 3'-말단에 연결되거나 제1 가닥의 3'-말단이 제2 가닥의 5'-말단에 연결된다는 것을 의미한다. 두 가닥이 양 말단에서 서로 연결되는 경우, 제1 가닥의 5'-말단은 제2 가닥의 3'-말단에 연결되고, 제1 가닥의 3'-말단은 제2 가닥의 5'-말단에 연결된다. 두 가닥은 (N)n을 포함하나, 이로 한정되지 않는 올리고뉴클레오타이드 링커에 의해 함께 연결될 수 있으며, 여기서 N은 독립적으로 변형 또는 비변형 뉴클레오타이드이고, n은 3 내지 23이다. 일부 구현예에서, n은 3 내지 10, 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드 링커는 GNRA, (G)4, (U)4, 및 (dT)4로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 N은 변형 또는 비변형 뉴클레오타이드이고, R은 변형 또는 비변형 퓨린 뉴클레오타이드이다. 링커의 뉴클레오타이드 중 일부는 링커의 다른 뉴클레오타이드와 염기-쌍 상호작용에 관여할 수 있다. 두 가닥은 또한 비-뉴클레오사이드 링커, 예를 들어, 본원에 기재된 링커에 의해 함께 연결될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 올리고뉴클레오타이드 화학적 변형 또는 변화가 올리고뉴클레오타이드 링커에서 사용될 수 있다는 것이 당업자에게 인지될 것이다.
헤어핀 및 덤벨 타입 올리고머 화합물은 14개, 15개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 29개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개 이상의 뉴클레오타이드 쌍의 듀플렉스 영역을 가질 것이다. 듀플렉스 영역은 200개, 100개, 또는 50개 이하 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 듀플렉스 영역에 대한 범위는 15개 내지 30개, 17개 내지 23개, 19개 내지 23개, 및 19개 내지 21개 뉴클레오타이드 쌍 길이이다.
헤어핀 올리고머 화합물은 일부 구현예에서 3'에서, 및 일부 구현예에서 헤어핀의 안티센스에서 단일 가닥 오버행 또는 말단의 쌍을 이루지 않은 영역을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 오버행은 1개 내지 4개, 더욱 일반적으로 2개 내지 3개 뉴클레오타이드 길이이다. RNA 간섭을 포함할 수 있는 헤어핀 올리고머 화합물은 또한 본원에서 "shRNA"로 지칭된다.
소정의 구현예에서, 두 개의 올리고머 가닥은 특이적 결합이 요망되는 조건 하에, 즉, 생체내 검정 또는 치료적 처지의 경우에 생리학적 조건 하에, 및 시험관내 검정의 경우에 검정이 수행되는 조건 하에 비-타겟 핵산 서열에 대한 안티센스 화합물의 비-특이적 결합을 방지하도록 충분한 정도의 상보성이 존재할 때 특이적으로 혼성화된다.
본원에서 사용되는 "엄격한 혼성화 조건" 또는 "엄격한 조건"은 안티센스 화합물이 이의 타겟 서열에 혼성화되지만 다른 서열에는 최소수로만 혼성화될 조건을 지칭한다. 염격한 조건은 서열-의존적이고, 상이한 환경에서 상이할 것이며, 안티센스 화합물이 타겟 서열에 혼성화되는 "엄격한 조건"은 안티센트 화합물의 성질 및 조성 및 이들을 연구할 검정에 의해 결정된다.
뉴클레오타이드 친화성 변형의 도입은 비변형 화합물에 비해 더 많은 수의 미스매치를 허용할 수 있는 것으로 당업계에서 이해된다. 유사하게, 특정 올리고뉴클레오타이드 서열은 다른 올리고뉴클레오타이드 서열보다 미스매치를 더 허용할 수 있다. 당업자는, 예컨대, 용융 온도(Tm)를 결정함으로써 올리고뉴클레오타이들 간, 또는 올리고뉴클레오타이드와 타겟 핵산 간의 적절한 수의 미스매치를 결정할 수 있다. Tm 또는 ΔTm은 당업자에게 익숙한 기술에 의해 계산될 수 있다. 예를 들어, Freier 등의 문헌[Nucleic Acids Research, 1997, 25, 22: 4429-4443]에 기재된 기술에 의해 당업자가 뉴클레오타이드 변형을, RNA:DNA 듀플렉스의 용융 온도를 증가시키는 이들의 능력에 대하여 평가하는 것이 가능하다.
siRNA 설계
일 구현예에서, 본 발명의 iRNA 제제는 길이가 19 nt인 이중 말단 블런트머(double ended bluntmer)로서, 센스 가닥은 5' 말단으로부터 7번, 8번, 9번 위치에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 3 개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유한다. 안티센스 가닥은 5'말단으로부터 11번, 12번, 13번 위치에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유한다.
일 구현예에서, 본 발명의 iRNA 제제는 길이가 20 nt인 이중 말단 블런트머로서, 센스 가닥은 5' 말단으로부터 8번, 9번, 10번 위치에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 3 개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유한다. 안티센스 가닥은 5'말단으로부터 11번, 12번, 13번 위치에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유한다.
일 구현예에서, 본 발명의 iRNA 제제는 길이가 21 nt인 이중 말단 블런트머로서, 센스 가닥은 5' 말단으로부터 9번, 10번, 11번 위치에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 3 개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유한다. 안티센스 가닥은 5'말단으로부터 11번, 12번, 13번 위치에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 21개 뉴클레오타이드(nt) 센스 가닥 및 23개 뉴클레오타이드(nt) 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서, 센스 가닥은 5' 말단으로부터 9번, 10번, 11번 위치에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 3 개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유하고; 안티센스 가닥은 5'말단으로부터 11번, 12번, 13번 위치에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유하고, iRNA의 한 말단은 블런트인 반면, 다른 말단은 2 nt 오버행을 포함한다. 바람직하게는, 2 nt 오버행은 안티센스의 3'-말단에 있다. 선택적으로, iRNA 제제는 리간드(예를 들어, GalNAc3)를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서, 센스 가닥은 25개 내지 30개 뉴클레오타이드 잔기 길이이고, 5' 말단 뉴클레오타이드(1번 위치)로부터 시작해서, 상기 제1 가닥의 1번 내지 23번 위치는 8개 이상의 리보뉴클레오타이드를 포함하고; 안티센스 가닥은 36개 내지 66개 뉴클레오타이드 잔기 길이이며, 3' 말단 뉴클레오타이드로부터 시작해서, 센스 가닥의 1번 내지 23번 위치와 쌍을 이룬 위치에서 8개 이상의 리보뉴클레오타이드를 포함하여 듀플렉스를 형성하고; 안티센스 가닥의 적어도 3' 말단 뉴클레오타이드는 센스 가닥과 쌍을 이루지 않고, 최대 6개의 연속 3' 말단 뉴클레오타이드는 센스 가닥과 쌍을 이루지 않음으로써 1개 내지 6개 뉴클레오타이드의 3' 단일-가닥 오버행을 형성하고; 안티센스 가닥의 5' 말단은 센스 가닥과 쌍을 이루지 않는 10개 내지 30개의 연속 뉴클레오타이드를 포함함으로써 10개 내지 30개 뉴클레오타이드의 단일-가닥 5' 오버행을 형성하고; 센스 및 안티센스 가닥이 최적 상보성을 위해 정렬된 경우 적어도 센스 가닥의 5' 말단 및 3' 말단 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드와 염기쌍을 이룸으로써 센스 및 안티센스 가닥 간에 실질적으로 듀플렉스화된 영역을 형성하고; 안티센스 가닥은 안티센스 가닥 길이의 19개 이상의 리보뉴클레오타이드를 따라 타겟 RNA와 충분히 상보적이어서 상기 이중-가닥 핵산이 포유류 세포 내로 도입되는 경우 타겟 유전자 발현을 감소시키고; 센스 가닥은 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유하고, 모티프 중 적어도 하나는 분해 부위에서 또는 그 근처에서 발생한다. 안티센스 가닥은 분해 부위에서 또는 그 근처에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하며, 상기 dsRNA 제제는 25개 이상 29개 이하의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 제1 가닥 및 5' 말단으로부터 11번, 12번, 13번 위치에 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 갖는 30개 이하의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 제2 가닥을 포함하고; 상기 제1 가닥의 상기 3' 말단 및 상기 제2 가닥의 상기 5' 말단은 블런트 말단을 형성하고, 상기 제2 가닥은 제1 가닥보다 그 3' 말단이 1개 내지 4개 뉴클레오타이드가 더 길고, 25개 이상의 뉴클레오타이드 길이인 듀플렉스 영역에서, 상기 제2 가닥은 상기 제2 가닥 길이의 19개 이상의 nt를 따라 타겟 mRNA와 충분히 상보적이어서 상기 iRNA 제제가 포유류 세포 내로 도입되는 경우 타겟 유전자 발현을 감소시키며, 상기 iRNA의 다이서 분해는 우선적으로 상기 제2 가닥의 상기 3' 말단을 포함하는 siRNA를 생성함으로써 포유류에서 타겟 유전자의 발현을 감소시킨다. 선택적으로, iRNA 제제는 리간드(예를 들어, GalNAc3)를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, iRNA 제제의 센스 가닥은 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유하고, 여기서 모티프 중 하나는 센스 가닥에서 분해 부위에서 발생한다. 예를 들어, 센스 가닥은 5'말단으로부터 7개 내지 15개 위치 내에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유할 수 있다.
일 구현예에서, iRNA 제제의 안티센스 가닥은 또한 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유할 수 있고, 여기서 모티프 중 하나는 안티센스 가닥에서 분해 부위에서 또는 그 근처에서 발생한다. 예를 들어, 안티센스 가닥은 5'말단으로부터 9개 내지 15개 위치 내에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유할 수 있다.
길이가 17 nt 내지 23 nt인 듀플렉스 영역을 갖는 iRNA 제제의 경우, 안티센스 가닥의 분해 부위는 전형적으로 5'-말단에서 10개, 11개 및 12개 위치 주위에 있다. 따라서, 세 개의 동일한 변형의 모티프는 안티센스 가닥의 9개, 10개, 11개 위치; 10개, 11개, 12개의 위치; 11개, 12개, 13개 위치; 12개, 13개, 14개 위치; 또는 13개, 14개, 15개 위치에서 발생할 수 있고, 계수는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 제1 뉴클레오타이드로부터 시작하거나, 계수는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내에 제1 쌍을 이룬 뉴클레오타이드로부터 시작한다. 안티센스 가닥에서 분해 부위는 또한 5'-말단으로부터 iRNA의 듀플렉스 영역의 길이에 따라 변할 수 있다.
일부 구현예에서, iRNA 제제는 14개 내지 30개의 뉴클레오타이드를 각각 갖는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오타이드에 3개의 동일한 변형의 적어도 2개의 모티프를 함유하고, 모티프 중 적어도 하나는 가닥 내에서 분해 부위에서 또는 그 근처에서 발생하고, 모티프 중 적어도 하나는 적어도 하나의 뉴클레오타이드에 의해 분해 부위에서 모티프와 분리되는 가닥의 또 다른 부분에서 발생한다. 일 구현예에서, 안티센스 가닥은 또한 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유하고, 여기서 모티프 중 하나는 가닥 내 분해 부위에서 또는 그 근처에서 발생한다. 센스 가닥 내 분해 부위에서 또는 그 근처에서 발생하는 모티프의 변형은 안티센스 가닥 내 분해 부위에서 또는 그 근처에서 발생하는 모티프의 변형과 상이하다.
일부 구현예에서, iRNA 제제는 14개 내지 30개의 뉴클레오타이드를 각각 갖는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오타이드에 3개의 2'-F 변형의 적어도 1개의 모티프를 함유하고, 모티프 중 적어도 하나는 가닥 내에서 분해 부위에서 또는 그 근처에서 발생한다. 일 구현예에서, 안티센스 가닥은 또한 분해 부위에서 또는 그 근처에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유한다.
일부 구현예에서, iRNA 제제는 14개 내지 30개의 뉴클레오타이드를 각각 갖는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 5'말단으로부터 9번, 10번, 11번 위치에서 3개의 연속 뉴클레오타이드에 3개의 2'-F 변형의 적어도 1개의 모티프를 함유하고, 안티센스 가닥은 5'말단으로부터 11번, 12번, 13번 위치에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유한다.
일 구현예에서, 본 발명의 iRNA 제제는 듀플렉스 내에서 타겟과 미스매치(들), 또는 이들의 조합을 포함한다. 미스매치는 오버행 영역 또는 듀플렉스 영역에서 발생할 수 있다. 염기쌍은 해리 또는 용융을 촉진하는 이들의 특성을 토대로 순위가 매겨질 수 있다(예를 들어, 특정 페어링의 결합 또는 해리의 자유 에너지에서, 가장 간단한 방법은 개별 쌍 기준으로 쌍을 시험하지만, 옆의 인접한 또는 유사한 분석이 또한 사용될 수 있음). 해리의 촉진 면에서, A:U는 G:C보다 바람직하며; G:U는 G:C보다 바람직하고; I:C는 G:C보다 바람직하다(I=이노신). 미스매치, 예를 들어, 비-원형(canonical) 또는 원형 페어링 이외의 페어링(본원의 다른 곳에 기재된 바와 같음)은 원형(A:T, A:U, G:C) 페어링보다 바람직하며; 보편적인 염기를 포함하는 페어링이 원형 페어링보다 바람직하다.
일 구현예에서, 본 발명의 iRNA 제제는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내에 제1의 염기쌍 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 중 하나 이상을 포함하며, 듀플렉스의 5' 말단에서 안티센스 가닥의 해리를 촉진하기 위해, 독립적으로 A:U, G:U, I:C, 및 미스매칭된 쌍, 예를 들어, 비-원형 또는 원형 페어링 이외의 페어링 또는 보편적인 염기를 포함하는 페어링의 군으로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 1번 위치의 뉴클레오타이드는 A, dA, dU, U, 및 dT로 이루어진 군으로부터 선택된다. 대안적으로, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 제1의 염기쌍 1개, 2개 또는 3개 중 적어도 하나는 AU 염기쌍이다. 예를 들어, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 제1 염기쌍은 AU 염기쌍이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 타겟 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 RNA(dsRNA) 제제에 관한 것이다. dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 각각의 가닥은 14개 내지 40개 뉴클레오타이드를 갖는다. dsRNA 제제는 화학식 I로 나타낸다:
[화학식 I]
Figure pct00021
화학식 I에서, B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4'은 각각 독립적으로 2'-O-알킬, 2'-치환 알콕시, 2'-치환 알킬, 2'-할로, ENA, 및 BNA/LNA로 구성된 군으로부터 선택되는 변형을 함유하는 뉴클레오타이드이다. 일 구현예에서, B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4'은 각각 2'-OMe 변형을 함유한다. 일 구현예에서, B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4'은 각각 2'-OMe 또는 2'-F 변형을 함유한다. 일 구현예에서, B1, B2, B3, B1', B2', B3', 및 B4' 중 하나 이상은 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 변형을 함유한다.
C1은 안티센스 가닥의 씨드 영역(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 2번 내지 8번 위치)과 반대되는 부위에 배치된 열적 탈안정화 뉴클레오타이드이다. 예를 들어, C1은 안티센스 가닥의 5'-말단의 2번 내지 8번 위치에서 뉴클레오타이드와 쌍을 이루는 센스 가닥의 위치에 있다. 일 예에서, C1은 센스 가닥의 5'-말단으로부터 15번 위치에 있다. C1 뉴클레오타이드는 무염기 변형을 포함할 수 있는 열적 탈안정화 변형; 듀플렉스에서 대항하는 뉴클레오타이드와의 미스매치; 및 당 변형, 예컨대 2'-데옥시 변형 또는 비사이클릭 뉴클레오타이드, 예를 들어 비잠김 핵산(UNA) 또는 글리세롤 핵산(GNA)을 보유한다. 일 구현예에서, C1은 i) 안티센스 가닥에서 대항하는 뉴클레오타이드와의 미스매치; ii)
Figure pct00022
으로 구성된 군으로부터 선택된 무염기 변형; 및 iii)
Figure pct00023
, 및
Figure pct00024
으로 구성된 군으로부터 선택된 당 변형으로 구성된 군으로부터 선택되는 열적 탈안정화 변형을 가지며, 식에서, B는 변형 또는 비변형 뉴클레오베이스이고, R1 및 R2는 독립적으로 H, 할로겐, OR3, 또는 알킬이고; R3은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당이다. 일 구현예에서, C1에서의 열적 탈안정화 변형은 G:G, G:A, G:U, G:T, A:A, A:C, C:C, C:U, C:T, U:U, T:T, 및 U:T로 구성된 군으로부터 선택된 미스매치이며; 선택적으로, 미스매치 쌍에서 뉴클레오베이스 중 하나 이상은 2'-데옥시 뉴클레오베이스이다. 일 예에서, C1에서의 열적 탈안정화 변형은 GNA 또는
Figure pct00025
이다.
T1, T1', T2', 및 T3'은 각각 독립적으로 2'-OMe 변형의 입체 장애와 동등 이하인 입체 장애의 뉴클레오타이드를 제공하는 변형을 포함하는 뉴클레오타이드를 나타낸다. 입체 장애는 변형의 입체 효과의 합을 나타낸다. 뉴클레오타이드 변형의 입체 장애의 결정 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 변형은 뉴클레오타이드 리보스 당의 2' 위치에 있거나, 또는 리보스 당의 2' 위치와 유사하거나 동등하고 2'-OMe 변형의 입체 장애와 동등 이하인 입체 장애를 뉴클레오타이드에 제공하는 비-리보스 뉴클레오타이드에 대한 변형, 비사이클릭 뉴클레오타이드, 또는 뉴클레오타이드 백본일 수 있다. 예를 들어, T1, T1', T2', 및 T3'은 각각 독립적으로 DNA, RNA, LNA, 2'-F, 및 2'-F-5'-메틸로부터 선택된다. 일 구현예에서, T1은 DNA이다. 일 구현예에서, T1'은 DNA, RNA 또는 LNA이다. 일 구현예에서, T2'은 DNA 또는 RNA이다. 일 구현예에서, T3'은 DNA 또는 RNA이다.
n1, n3, 및 q1은 독립적으로 4개 내지 15개 뉴클레오타이드 길이이다.
n5, q3, 및 q7은 독립적으로 1개 내지 6개 뉴클레오타이드(들) 길이이다.
n4, q2, 및 q6은 독립적으로 1개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이다; 대안적으로, n4는 0이다.
q5는 독립적으로 0개 내지 10개 뉴클레오타이드(들) 길이이다.
n2 및 q4 는 독립적으로 0개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이다.
대안적으로, n4는 0개 내지 3개 뉴클레오타이드(들) 길이이다.
일 구현예에서, n4는 0일 수 있다. 일 예에서, n4는 0이고, q2 및 q6은 1이다. 또 다른 예에서, n4는 0이고, q2 및 q6은 1이고, (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다.
일 구현예에서, n4, q2, 및 q6은 각각 1이다.
일 구현예에서, n2, n4, q2, q4, 및 q6은 각각 1이다.
일 구현예에서, C1은 센스 가닥의 5'-말단의 14번 내지 17번 위치에 있고, 센스 가닥이 19개 내지 22개 뉴클레오타이드 길이인 경우, n4는 1이다. 일 구현예에서, C1은 센스 가닥의 5'-말단의 15번 위치에 있다.
일 구현예에서, T3'은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 2번 위치에서 시작된다. 일 예에서, T3'은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 2번 위치에 있고 q6은 1이다.
일 구현예에서, T1'은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 14번 위치에서 시작된다. 일 예에서, T1'은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 14번 위치에 있고 q2는 1이다.
예시적인 구현예에서, T3'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 2번 위치로부터 시작하고, T1'은 안티센스 가닥의 5' 말단의 14번 위치로부터 시작한다. 일 예에서, T3'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 2번 위치로부터 시작하고 q6은 1이며, T1'은 안티센스 가닥의 5' 말단의 14번 위치로부터 시작하고 q2는 1이다.
일 구현예에서, T1' 및 T3'은 11개 뉴클레오타이드 길이에 의해 분리된다(즉, T1' 및 T3' 뉴클레오타이드는 계수하지 않음).
일 구현예에서, T1'은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 14번 위치에 있다. 일 예에서, T1'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 14번 위치에 있고 q2는 1이며, 비-리보스, 비사이클릭 또는 백본 내 2' 위치 또는 위치들에서의 변형은 2'-OMe 리보스보다 작은 입체 장애를 제공한다.
일 구현예에서, T3'은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 2번 위치에 있다. 일 예에서, T3'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 2번 위치에 있고 q6은 1이며, 비-리보스, 비사이클릭 또는 백본 내 2' 위치 또는 위치들에서의 변형은 2'-OMe 리보스와 동등 이하의 입체 장애를 제공한다.
일 구현예에서, T1은 센스 가닥의 분해 부위에 있다. 일 예에서, T1은 센스 가닥의 5' 말단으로부터 11번 위치에 있으며, 센스 가닥이 19개 내지 22개 뉴클레오타이드 길이인 경우, n2는 1이다. 예시적 구현예에서, T1은 센스 가닥의 분해 부위에서 센스 가닥의 5' 말단으로부터 11번 위치에 있으며, 센스 가닥이 19개 내지 22개 뉴클레오타이드 길이인 경우, n2는 1이다,
일 구현예에서, T2'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 6번 위치에서 시작된다. 일 예에서, T2'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 6번 내지 10번 위치에 있고 q4는 1이다.
예시적 구현예에서, T1은 센스 가닥의 분해 부위, 예를 들어 센스 가닥의 5' 말단으로부터 11번 위치에 있으며, 센스 가닥이 19개 내지 22개 뉴클레오타이드 길이인 경우, n2는 1이다; T1'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 14번 위치에 있으며, q2는 1이고, T1'에 대한 변형은 리보스 당의 2' 위치 또는 2'-OMe 리보스보다 작은 입체 장애를 제공하는 비-리보스, 비사이클릭 또는 백본에서의 위치들에 있으며; T2'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 6번 내지 10번 위치에 있고, q4는 1이고; T3'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터의 2번 위치에 있고, q6은 1이고, T3'에 대한 변형은 2'-OMe 리보스와 동등 이하의 입체 장애를 제공하는 2' 위치 또는 비-리보스, 비사이클릭 또는 백본에서의 위치들에 있다.
일 구현예에서, T2'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 8번 위치에서 시작된다. 일 예에서, T2'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 8번 위치에서 시작되고 q4는 2이다.
일 구현예에서, T2'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 9번 위치에서 시작된다. 일 예에서, T2'은 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 9번 위치에 있고, q4는 1이다.
일 구현예에서, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 1이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 6이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다.
일 구현예에서, n4 는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 1이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 6이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 6이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 7이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 6이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 7이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 1이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 6이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 1이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 6이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 5이고, T2'은 2'-F이고, q4는 1이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 선택적으로 안티센스 가닥의 3'-말단에서 2개 이상의 추가 TT를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 5이고, T2'은 2'-F이고, q4는 1이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; 선택적으로 안티센스 가닥의 3'-말단에 2개 이상의 추가 TT를 포함하고, (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다.
dsRNA 제제는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 5'-말단에 인-함유 기를 포함할 수 있다. 5'-말단 인-함유기는 5'-말단 포스페이트(5'-P), 5'-말단 포스포로티오에이트(5'-PS), 5'-말단 포스포로디티오에이트(5'-PS2), 5'-말단 비닐포스포네이트(5'-VP), 5'-말단 메틸포스포네이트(MePhos), 또는 5'-데옥시-5'-C-말로닐(
Figure pct00026
)일 수 있다. 5'-말단 인-함유기가 5'-말단 비닐포스포네이트(5'-VP)인 경우, 5'-VP는 5'-E-VP 이성질체(즉, 트랜스-비닐포스페이트,
Figure pct00027
), 5'-Z-VP 이성질체(즉, 시스-비닐포스페이트,
Figure pct00028
), 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 센스 가닥의 5'-말단에 인-함유 기를 포함한다. 일 구현예에서, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 5'-말단에 인-함유 기를 포함한다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 5'-P를 포함한다. 일 구현예에서, dsRNA 제제는 안티센스 가닥에 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 5'-PS를 포함한다. 일 구현예에서, dsRNA 제제는 안티센스 가닥에 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 5'-VP를 포함한다. 일 구현예에서, dsRNA 제제는 안티센스 가닥에 5'-VP를 포함한다. 일 구현예에서, dsRNA 제제는 안티센스 가닥에 5'-E-VP를 포함한다. 일 구현예에서, dsRNA 제제는 안티센스 가닥에 5'-Z-VP를 포함한다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 5'-PS2를 포함한다. 일 구현예에서, dsRNA 제제는 안티센스 가닥에 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 5'-PS2를 포함한다. 일 구현예에서, dsRNA 제제는 안티센스 가닥에 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-P를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP를 포함한다. 5'-VP는 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2를 포함한다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제의 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35% 또는 30%가 변형된다. 예를 들어, dsRNA 제제의 50%가 변형되는 경우, dsRNA 제제에 존재하는 모든 뉴클레오타이드의 50%가 본원에 기재된 바와 같은 변형을 함유한다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 비사이클릭 뉴클레오타이드, LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-데옥시, 2'-플루오로, 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA), 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸(2'-O-DMAEOE), 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 또는 2'-ara-F로 변형된다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 2개 이상의 상이한 변형을 함유한다.
일 구현예에서, 화학식 I의 dsRNA 제제는 1개 내지 10개 뉴클레오타이드 길이의 3' 및/또는 5' 오버행(들)을 추가로 포함한다. 일 예에서, 화학식 I의 dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3' 말단에 3' 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 포함한다. 또 다른 예에서, dsRNA 제제는 센스 가닥의 5'-말단에 5' 오버행을 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 임의의 2'-F 변형을 함유하지 않는다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 하나 이상의 블록을 포함한다. 일 예에서, 센스 가닥은 2개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 1개의 블록을 포함한다. 일 예에서, 안티센스 가닥은 2개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 2개의 블록을 포함한다. 예를 들어, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 2개의 블록은 16개 내지 18개 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합에 의해 분리된다.
일 구현예에서, dsRNA 제제의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 15개 내지 30개 뉴클레오타이드를 갖는다. 일 예에서, 센스 가닥은 19개 내지 22개 뉴클레오타이드를 가지며, 안티센스 가닥은 19개 내지 25개 뉴클레오타이드를 갖는다. 또 다른 예에서, 센스 가닥은 21개 뉴클레오타이드를 가지며, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오타이드를 갖는다.
일 구현예에서, 듀플렉스에서 안티센스 가닥의 5' 말단의 1번 위치의 뉴클레오타이드는 A, dA, dU, U, 및 dT로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 제1, 제2, 및 제3 염기쌍 중 하나 이상은 AU 염기쌍이다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제의 안티센스 가닥은 이에 혼성화하는 타겟 RNA와 100% 상보적이며 RNA 간섭을 통해 그 발현을 억제한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제의 안티센스 가닥은 타겟 RNA와 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 65% 이상, 60% 이상, 55% 이상, 또는 50% 이상 상보적이다.
일 양태에서, 본 발명은 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있는 본원에 정의된 dsRNA 제제에 관한 것이다. dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 각각의 가닥은 14개 내지 40개 뉴클레오타이드를 갖는다. 센스 가닥은 하나 이상의 열적 탈안정화 뉴클레오타이드를 함유하며, 하나 이상의 상기 열적 탈안정화 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 씨드 영역(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 2번 내지 8번 위치에)과 반대 부위에 또는 그 근처에서 발생한다. 화학식 I로 나타내는 dsRNA에 관해 본 명세서에 기재된 구현예 및 양태는 각각 열적 탈안정화 뉴클레오타이드를 함유하는 dsRNA에도 적용할 수 있다.
열적 탈안정화 뉴클레오타이드는, 예를 들어 센스 가닥이 21개 뉴클레오타이드 길이인 경우, 센스 가닥의 5'-말단의 14번 내지 17번 위치에서 발생할 수 있다. 안티센스 가닥은 입체적으로 까다로운 2'-OMe 변형보다 작은 2개 이상의 변형 핵산을 함유한다. 바람직하게는 입체적으로 까다로운 2'-OMe보다 작은 2개의 변형 핵산은 11개 뉴클레오타이드 길이에 의해 분리된다. 예를 들어, 2개의 변형 핵산은 안티센스 가닥의 5' 말단의 2번 및 14번 위치에 있다.
일 구현예에서, dsRNA 제제는 하나 이상의 ASGPR 리간드를 추가로 포함한다. 예를 들어, ASGPR 리간드는 다음과 같은 2가 또는 3가 분지화 링커를 통해 부착된 하나 이상의 GalNAc 유도체이다:
Figure pct00029
. 일 예에서, ASGPR 리간드는 센스 가닥의 3' 말단에 부착된다.
예를 들어, 본원에 정의된 dsRNA 제제는 i) 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 5'-말단에 인-함유 기; ii) (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개; 및 iii) 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 5'-말단 또는 3'-말단에 리간드, 예컨대 ASGPR 리간드(예를 들어, 하나 이상의 GalNAc 유도체)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있을 수 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-P 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-P는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP(예를 들어, 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합), 및 타겟화 리간드를 포함한다 일 구현예에서, 5'-VP는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS2는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-데옥시-5'-C-말로닐은 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-P 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-P는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP(예를 들어, 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합), 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-VP는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS2는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-OMe이고, q7은 1이고; (5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-데옥시-5'-C-말로닐은 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-P 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-P는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP(예를 들어, 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합), 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-VP는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS2는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, T2'은 2'-F이고, q4는 2이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 5이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-데옥시-5'-C-말로닐은 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-P 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-P는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-VP(예를 들어, 5'-E-VP, 5'-Z-VP, 또는 이들의 조합), 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-VP는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-PS2 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-PS2는 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
일 구현예에서, B1은 2'-OMe 또는 2'-F이고, n1은 8이고, T1은 2'F이고, n2는 3이고, B2는 2'-OMe이고, n3은 7이고, n4는 0이고, B3은 2'-OMe이고, n5는 3이고, B1'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q1은 9이고, T1'은 2'-F이고, q2는 1이고, B2'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q3은 4이고, q4는 0이고, B3'은 2'-OMe 또는 2'-F이고, q5는 7이고, T3'은 2'-F이고, q6은 1이고, B4'은 2'-F이고, q7은 1이고; (센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 센스 가닥의 1번 내지 5번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개, 및 (안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여) 안티센스 가닥의 1번 및 2번 위치에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개 및 18번 내지 23번 위치 내에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합 변형 2개를 포함한다. dsRNA 제제는 또한 5'-데옥시-5'-C-말로닐 및 타겟화 리간드를 포함한다. 일 구현예에서, 5'-데옥시-5'-C-말로닐은 안티센스 가닥의 5'-말단에 있으며, 타겟화 리간드는 센스 가닥의 3'-말단에 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 선택적으로 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 3가 분지화 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, 리간드; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 3번, 5번, 7번, 9번 내지 11번, 13번, 17번, 19번, 및 21번 위치에서의 2'-F 변형, 및 2번, 4번, 6번, 8번, 12번, 14번 내지 16번, 18번, 및 20번 위치에서의 2'-OMe 변형
을 갖는 센스 가닥, 및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 3번, 5번, 9번, 11번 내지 13번, 15번, 17번, 19번, 21번, 및 23번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 2번, 4번, 6번 내지 8번, 10번, 14번, 16번, 18번, 20번, 및 22번 위치에서의 2'F 변형; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 21번 및 22번 위치 사이 및 뉴클레오타이드 22번 및 23번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개 뉴클레오타이드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 선택적으로 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 3가 분지화 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, 리간드;
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 3번, 5번, 7번, 9번 내지 11번, 13번, 15번, 17번, 19번, 및 21번 위치에서의 2'-F 변형, 및 2번, 4번, 6번, 8번, 12번, 14번, 16번, 18번, 및 20번 위치에서의 2'-OMe 변형; 및
(iv) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이 및 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 센스 가닥, 및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 3번, 5번, 7번, 9번, 11번 내지 13번, 15번, 17번, 19번, 및 21번 내지 23번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 2번, 4번, 6번, 8번, 10번, 14번, 16번, 18번, 및 20번 위치에서의 2' F 변형; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이, 뉴클레오타이드 21번 및 22번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 22번 및 23번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개 뉴클레오타이드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 선택적으로 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 3가 분지화 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, 리간드;
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번 내지 6번, 8번, 10번, 및 12번 내지 21번 위치에서의 2'-OMe 변형, 7번 및 9번 위치에서의 2'-F 변형 및 11번 위치에서의 데옥시-뉴클레오타이드(예를 들어, dT); 및
(iv) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이 및 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 센스 가닥, 및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 3번, 7번, 9번, 11번, 13번, 15번, 17번, 및 19번 내지 23번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 2번, 4번 내지 6번, 8번, 10번, 12번, 14번, 16번, 및 18번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이, 뉴클레오타이드 21번 및 22번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 22번 및 23번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개 뉴클레오타이드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 선택적으로 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 3가 분지화 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, 리간드;
(iii) 1번 내지 6번, 8번, 10번, 12번, 14번, 및 16번 내지 21번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 7번, 9번, 11번, 13번, 및 15번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iv) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이 및 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 센스 가닥, 및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 5번, 7번, 9번, 11번, 13번, 15번, 17번, 19번, 및 21번 내지 23번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 2번 내지 4번, 6번, 8번, 10번, 12번, 14번, 16번, 18번, 및 20번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이, 뉴클레오타이드 21번 및 22번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 22번 및 23번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개 뉴클레오타이드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 선택적으로 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 3가 분지화 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, 리간드;
(iii) 1번 내지 9번, 및 12번 내지 21번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 10번, 및 11번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iv) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이 및 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 센스 가닥, 및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 3번, 5번, 7번, 9번, 11번 내지 13번, 15번, 17번, 19번, 및 21번 내지 23번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 2번, 4번, 6번, 8번, 10번, 14번, 16번, 18번, 및 20번 위치에서의 2' F 변형; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이, 뉴클레오타이드 21번 및 22번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 22번 및 23번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개 뉴클레오타이드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 선택적으로 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 3가 분지화 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, 리간드;
(iii) 1번, 3번, 5번, 7번, 9번 내지 11번, 및 13번 위치에서의 2'-F 변형, 및 2번, 4번, 6번, 8번, 12번, 및 14번 내지 21번 위치에서의 2'-OMe 변형; 및
(iv) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이 및 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 센스 가닥, 및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 3번, 5번 내지 7번, 9번, 11번 내지 13번, 15번, 17번 내지 19번, 및 21번 내지 23번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 2번, 4번, 8번, 10번, 14번, 16번, 및 20번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이, 뉴클레오타이드 21번 및 22번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 22번 및 23번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개 뉴클레오타이드 오버행, 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 선택적으로 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 3가 분지화 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, 리간드;
(iii) 1번, 2번, 4번, 6번, 8번, 12번, 14번, 15번, 17번, 및 19번 내지 21번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 3번, 5번, 7번, 9번 내지 11번, 13번, 16번, 및 18번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iv) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이 및 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 센스 가닥, 및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 25개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 4번, 6번, 7번, 9번, 11번 내지 13번, 15번, 17번, 및 19번 내지 23번 위치에서의 2'-OMe 변형, 2번, 3번, 5번, 8번, 10번, 14번, 16번, 및 18번 위치에서의 2'-F 변형, 및 24번 및 25번 위치에서의 데스옥시-뉴클레오타이드(예를 들어, dT); 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이, 뉴클레오타이드 21번 및 22번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 22번 및 23번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3' 말단에 4개 뉴클레오타이드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 선택적으로 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 3가 분지화 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, 리간드;
(iii) 1번 내지 6번, 8번, 및 12번 내지 21번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 7번, 및 9번 내지 11번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iv) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 센스 가닥, 및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 3번 내지 5번, 7번, 8번, 10번 내지 13번, 15번, 및 17번 내지 23번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 2번, 6번, 9번, 14번, 및 16번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이, 뉴클레오타이드 21번 및 22번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 22번 및 23번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개 뉴클레오타이드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 선택적으로 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 3가 분지화 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, 리간드;
(iii) 1번 내지 6번, 8번, 및 12번 내지 21번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 7번, 및 9번 내지 11번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iv) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 센스 가닥, 및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 23개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 3번 내지 5번, 7번, 10번 내지 13번, 15번, 및 17번 내지 23번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 2번, 6번, 8번, 9번, 14번, 및 16번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이, 뉴클레오타이드 21번 및 22번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 22번 및 23번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개 뉴클레오타이드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 갖는다.
또 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 19개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 선택적으로 3'-말단에 부착된 ASGPR 리간드로서, 3가 분지화 링커를 통해 부착된 3개의 GalNAc 유도체를 포함하는, 리간드;
(iii) 1번 내지 4번, 6번, 및 10번 내지 19번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 5번, 및 7번 내지 9번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iv) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 센스 가닥, 및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 21개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) (5' 말단으로부터 계수하여) 1번, 3번 내지 5번, 7번, 10번 내지 13번, 15번, 및 17번 내지 21번 위치에서의 2'-OMe 변형, 및 2번, 6번, 8번, 9번, 14번, 및 16번 위치에서의 2'-F 변형; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 뉴클레오타이드 1번 및 2번 위치 사이, 뉴클레오타이드 2번 및 3번 위치 사이, 뉴클레오타이드 19번 및 20번 위치 사이, 및 뉴클레오타이드 20번 및 21번 위치 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 3' 말단에 2개 뉴클레오타이드 오버행 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 블런트 말단을 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 18개 내지 23개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 7번 내지 15번 위치에서 3개의 연속적인 2'-F 변형
을 갖는 센스 가닥, 및
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 18개 내지 23개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 가닥의 임의의 위치에서 적어도 2'-F 변형; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 제1의 5개의 뉴클레오타이드에서 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 위치에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 갖고; 각각 안티센스 가닥의 3'-말단에 두 개의 뉴클레오타이드 오버행, 및 안티센스 가닥의 5'-말단에서 블런트 말단; 또는 듀플렉스의 블럭트 말단의 양 말단을 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 18개 내지 23개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 4개 미만의 2'-F 변형
을 갖는 센스 가닥,
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 18개 내지 23개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 12개 미만의 2'-F 변형; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 제1의 5개의 뉴클레오타이드에서 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 위치에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 갖고; 각각 안티센스 가닥의 3'-말단에 두 개의 뉴클레오타이드 오버행, 및 안티센스 가닥의 5'-말단에서 블런트 말단; 또는 듀플렉스의 블럭트 말단의 양 말단을 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는
(a) 센스 가닥으로서,
(i) 19개 내지 35개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 4개 미만의 2'-F 변형
을 갖는 센스 가닥,
(b) 안티센스 가닥으로서,
(i) 19개 내지 35개 뉴클레오타이드 길이;
(ii) 12개 미만의 2'-F 변형; 및
(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 제1의 5개의 뉴클레오타이드에서 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합
을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, 듀플렉스 영역은 19개 내지 25개 염기쌍(바람직하게는, 19개, 20개, 21개 또는 22개)이고; dsRNA 제제는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 위치에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 갖고; 각각 안티센스 가닥의 3'-말단에 두 개의 뉴클레오타이드 오버행, 및 안티센스 가닥의 5'-말단에서 블런트 말단; 또는 듀플렉스의 블럭트 말단의 양 말단을 갖는다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 15개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이를 갖는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고; 안티센스 가닥의 제1의 5개 뉴클레오타이드에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합이 있고(5' 말단으로부터 계수하여); 여기서 듀플렉스 영역은 19개 내지 25개 염기쌍(바람직하게는, 19개, 20개, 21개 또는 22개)이고; dsRNA 제제는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 위치에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 갖고; dsRNA 제제는 20% 미만, 15% 미만 및 10% 미만의 비-천연 뉴클레오타이드를 갖는다.
비-천연 뉴클레오타이드의 예는 비사이클릭 뉴클레오타이드, LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-데옥시, 2'-플루오로, 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA), 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸(2'-O-DMAEOE), 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 또는 2'-아라-F 등을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 15개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이를 갖는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고; 안티센스 가닥의 제1의 5개 뉴클레오타이드에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합이 있고(5' 말단으로부터 계수하여); 여기서 듀플렉스 영역은 19개 내지 25개 염기쌍(바람직하게는, 19개, 20개, 21개 또는 22개)이고; dsRNA 제제는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 위치에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 갖고; dsRNA 제제는 80% 초과, 85% 초과 및 90% 초과의 천연 뉴클레오타이드를 갖고, 예컨대, 2'-OH, 2'-데옥시, 2'-OMe는 천연 뉴클레오타이드이다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 15개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이를 갖는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고; 안티센스 가닥의 제1의 5개 뉴클레오타이드에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합이 있고(5' 말단으로부터 계수하여); 여기서 듀플렉스 영역은 19개 내지 25개 염기쌍(바람직하게는, 19개, 20개, 21개 또는 22개)이고; dsRNA 제제는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 위치에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 갖고; dsRNA 제제는 100%의 천연 뉴클레오타이드를 갖고, 예컨대, 2'-OH, 2'-데옥시 및 2'-OMe는 천연 뉴클레오타이드이다.
친유성 모이어티의 예는 지질(포화되거나 불포화된 C4-C30 탄화수소 사슬 및 하이드록실, 아민, 카르복실산, 설포네이트, 포스페이트, 티올, 아자이드, 및 알카인으로 이루어진 군으로부터 선택된 선택적 작용기), 콜레스테롤, 레티노산, 콜릭산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥시아놀, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜릭산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 C6-C30 산(예를 들어, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산, 트리데칸산, 테트라데칸산, 펜타데칸산, 헥사데칸산, 헵타데칸산, 옥타데칸산, 올레산, 리놀레산, 아라키돈산, 시스-4,7,10,13,16,19-도코사헥산산, 비타민 A, 비타민 E, 콜레스테롤 등) 또는 C6-C30 알코올(예를 들어, 헥산올, 헵탄올, 옥탄올, 노난올, 데칸올, 운데칸올, 도데칸올, 트리데칸올, 테트라데칸올, 펜타데칸올, 헥사데칸올, 헵타데칸올, 옥타데칸올, 올레일 알코올, 리놀레일 알코올, 아라키돈 알코올, 시스-4,7,10,13,16,19-도코사헥산올, 레티놀, 비타민 E, 콜레스테롤 등)이다.
일 예에서, 친유성 모이어티는 포화되거나 불포화된 C6-C18 탄화수소 사슬이다.
일 예에서, 친유성 모이어티는 도코사헥사엔산이다.
일 구현예에서, 본 발명의 dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 각 가닥은 14개 내지 30개 뉴클레오타이드를 갖고, 센스 가닥 서열은 하기 화학식 I으로 표현된다:
[화학식 I]
Figure pct00030
식에서,
i 및 j는 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p 및 q는 각각 독립적으로 0 내지 6이고;
각각의 Na는 독립적으로 0개 내지 25개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 두 개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고;
각각의 Nb는 독립적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
각각의 np 및 nq는 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
여기서, Nb 및 Y는 동일한 변형을 갖지 않고;
XXX, YYY 및 ZZZ는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드에 3개의 동일한 변형의 1개의 모티프를 나타내고;
dsRNA 제제는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 위치에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 갖고;
dsRNA의 안티센스 가닥은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 또는 18개 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합으로 분리되는 1개, 2개, 또는 3개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합의 2개의 블록을 포함한다.
다양한 공개문헌들은 다량체성 siRNA를 기술하였으며, 모두 본 발명의 siRNA와 함께 사용될 수 있다. 이런 공개 문헌들로는, WO2007/091269, 미국 특허 No. 7858769, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887 및 WO2011/031520를 포함하며, 이들은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 iRNA 제제의 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35% 또는 30%는 변형된다.
일부 구현예에서, iRNA 제제의 각각의 센스 및 안티센스 가닥은 독립적으로 비사이클릭 뉴클레오타이드, LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-데옥시, 2'-플루오로, 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA), 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸(2'-O-DMAEOE), 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 또는 2'-아라-F로 변형된다.
일부 구현예에서, iRNA 제제의 각각의 센스 및 안티센스 가닥은 적어도 두 개의 상이한 변형을 함유한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 임의의 2'-F 변형을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 2'-F 변형(들)을 함유한다. 일 예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 9개 또는 10개의 2'-F 변형을 함유한다.
본 발명의 iRNA 제제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합을 추가로 포함할 수 있다. 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 임의의 뉴클레오타이드 또는 가닥의 임의의 위치 둘 모두에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드간 결합 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드에서 발생할 수 있거나; 각각의 뉴클레오타이드간 결합 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 교대 패턴으로 발생할 수 있거나; 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교대 패턴에서 둘 모두의 뉴클레오타이드간 결합 변형을 함유할 수 있다. 센스 가닥에서의 뉴클레오타이드간 결합 변형의 교대 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 센스 가닥에서의 뉴클레오타이드간 결합 변형의 교대 패턴은 안티센스 가닥에서의 뉴클레오타이드간 결합 변형의 교대 패턴에 대해 이동을 가질 수 있다.
일 구현예에서, iRNA 제제는 오버행 영역에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 변형을 포함한다. 예를 들어, 오버행 영역은 2개의 뉴클레오타이드 간에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합을 가지는 뉴클레오타이드를 2개 함유할 수 있다. 뉴클레오타이드간 결합 변형은 또한, 듀플렉스 영역 내의 말단 쌍의 뉴클레오타이드와 오버행 뉴클레오타이드를 연결하도록 만들어질 수 있다. 예를 들어, 2개, 3개, 4개 이상, 또는 모든 오버행 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합을 통해 연결될 수 있으며, 선택적으로, 오버행 뉴클레오타이드의 옆에 존재하는 쌍으로 된 뉴클레오타이드와 오버행 뉴클레오타이드를 연결하는 부가적인 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합이 존재할 수 있다. 예를 들어, 말단의 3개의 뉴클레오타이드 간에는 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합이 2개 이상 존재할 수 있으며, 3개의 뉴클레오타이드 중 2개는 오버행 뉴클레오타이드이며, 세번째 뉴클레오타이드는 오버행 뉴클레오타이드 옆의 쌍으로 된 뉴클레오타이드이다. 바람직하게는, 이들 말단의 뉴클레오타이드 3개는 안티센스 가닥의 3' 말단에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, iRNA 제제의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 하나 이상의 블록을 포함한다. 일 예에서, 센스 가닥은 2개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 1개의 블록을 포함한다. 일 예에서, 안티센스 가닥은 2개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 2개의 블록을 포함한다. 예를 들어, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 2개의 블록은 16개 내지 18개 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합에 의해 분리된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 IRNA 제제의 안티센스 가닥은 이에 혼성화하는 타겟 RNA와 100% 상보적이며 RNA 간섭을 통해 그 발현을 억제한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 iRNA 제제의 안티센스 가닥은 타겟 RNA와 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55%, 또는 적어도 50% 상보적이다.
일 양태에서, 본 발명은 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있는 iRNA 제제에 관한 것이다. iRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 각각의 가닥은 14개 내지 40개 뉴클레오타이드를 갖는다. 센스 가닥은 하나 이상의 열적 탈안정화 뉴클레오타이드를 함유하며, 적어도 하나의 상기 열적 탈안정화 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 씨드 영역(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 2번 내지 8번 위치에)과 반대 부위에 또는 그 근처에서 발생한다. 예를 들어, 열적 탈안정화 뉴클레오타이드는 센스 가닥이 21개 뉴클레오타이드 길이인 경우, 센스 가닥의 5'-말단의 14번 내지 17번 위치에서 발생한다. 안티센스 가닥은 입체적으로 까다로운 2'-OMe 변형보다 작은 2개 이상의 변형 핵산을 함유한다. 바람직하게는, 입체적으로 까다로운 2'-OMe보다 작은 2개의 변형 핵산은 11개 뉴클레오타이드 길이에 의해 분리된다. 예를 들어, 2개의 변형 핵산은 안티센스 가닥의 5' 말단의 2번 및 14번 위치에 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 본 발명의 화합물은 miRNA 모방체이다. 하나의 설계에서, miRNA 모방체는 이중 가닥 분자(예를 들어, 약 16개 내지 약 31개 뉴클레오타이드 길이의 듀플렉스 영역을 갖는)이고, 주어진 miRNA의 성숙 가닥과 동일성을 갖는 하나 이상의 서열을 함유한다. 이중-가닥 miRNA 모방체는 이중-가닥 iRNA에 대하여 상술된 설계와 유사한 설계를 갖는다. 일부 구현예에서, miRNA 모방체는 16개 내지 31개 뉴클레오타이드의 듀플렉스 영역, 및 다음 화학적 변형 패턴 중 하나 이상을 포함한다: 센스 가닥는 1번 및 2번 뉴클레오타이드(센스 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 계수하여)의 2'-O-메틸 및 모든 Cs 및 Us를 함유하고; 안티센스 가닥 변형은 모든 Cs 및 Us의 2' F 변형, 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단의 인산화, 및 2개의 뉴클레오타이드 3' 오버행과 관련된 안정화된 뉴클레오타이드간 결합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 본 발명의 화합물은 안티미르다. 일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 뉴클레오타이드-기재 또는 비-뉴클레오타이드-기재 링커, 예를 들어, 본 개시에 기재된 링커를 통해 서로 공유 결합되거나, 서로 비-공유 결합된 적어도 두 개의 안티미르를 포함한다. 용어 "안티미르", "마이크로RNA 억제제" 또는 "miR 억제제"는 동의어이며, 특정 miRNA의 활성을 간섭하는 올리고뉴클레오타이드 또는 변형 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 억제제는 단일 가닥, 이중 가닥(RNA/RNA 또는 RNA/DNA 듀플렉스), 및 헤어핀 설계를 포함하여 다양한 배치를 채택할 수 있고, 일반적으로, 마이크로RNA 억제제는 타겟화될 miRNA의 성숙 가닥(또는 가닥들)과 상보적이거나 부분 상보적인 서열의 일부 또는 하나 이상의 서열을 포함하고, 또한, miRNA 억제제는 또한 성숙 miRNA의 역 보체인 서열의 5' 및 3'에 위치한 추가 서열을 포함할 수 있다. 추가 서열은 성숙 miRNA가 유래된 1차-miRNA에서 성숙 miRNA에 인접한 서열의 역 보체일 수 있거나, 추가 서열이 임의 서열(A, G, C, U, 또는 dT의 혼합을 갖는)일 수 있다. 일부 구현예에서, 추가 서열들 중 하나 또는 둘 모두는 헤어핀을 형성할 수 있는 임의 서열이다. 따라서, 일부 구현예에서, miRNA의 역 보체인 서열은 헤어핀 구조에 의해 5' 측 및 3' 측에 측접된다. 마이크로RNA 억제제는, 이중 가닥일 때, 대응 가닥의 뉴클레오타이드들 간에 미스매치를 포함할 수 있다. 또한, 마이크로RNA 억제제는 세포로의 억제제 흡수를 촉진하기 위해 모이어티를 접합하도록 연결될 수 있다.
헤어핀 miRNA 억제제를 포함하는 마이크로RNA 억제제는 문헌[Vermeulen et al., "Double-Stranded Regions Are Essential Design Components Of Potent Inhibitors of RISC Function," RNA 13: 723-730 (2007)] 및 WO2007/095387 및 WO 2008/036825(각각 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨)에 상세하게 기재되어 있다. 당업자는 요망되는 miRNA를 위한 데이터베이스로부터 서열을 선택하고, 본원에 개시된 방법에 유용한 억제제를 설계할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 본 발명의 화합물은 안타고미르이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 뉴클레오타이드-기재 또는 비-뉴클레오타이드-기재 링커, 예를 들어, 본 개시에 기재된 링커를 통해 서로 공유 결합되거나, 서로 비-공유 결합된 적어도 두 개의 안타고미르를 포함한다. 안타고미르는 RNAse 보호 및 약리학적 특성에 대한 다양한 변형, 예컨대, 조직 및 세포 흡수 향상을 갖는 RNA-유사 올리고뉴클레오타이드이다. 이들은, 예를 들어, 당의 완전 2'-O-메틸화, 포스포로티오에이트 당간 결합, 및, 예를 들어, 3'-말단에서의 콜레스테롤-모이어티에 의해 정상 RNA과 구별된다. 바람직한 구현예에서, 안타고미르는 모든 뉴클레오타이드에서 2'-O-메틸 변형, 3'-말단에서의 콜레스테롤모이어티, 5'-말단에서 처음 2개의 위치에서 2개의 포스포로티오에이트 당간 결합, 및 분자의 3'-말단에서 4개의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 안타고미르는 안타고미르 및 내인성 miRNA를 포함하는 듀플렉스를 형성시킴으로써 내인성 miRNA를 효율적으로 사일런싱하고, 이에 의해 miRNA-유도 유전자 사일런싱을 막기 위해 사용될 수 있다. 안타고미르-매개 miRNA 사일런싱의 예는, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 명시적으로 포함되는 문헌[Krutzfeldt et al, Nature, 2005, 438: 685-689]에 기재된, miR-122의 사일런싱이다.
최근 연구에 따르면, dsRNA는 또한 "소형 RNA-유도 유전자 활성화(small RNA-induced gene activation)" 또는 RNAa(활성화 RNA)로 칭해지는 기전인 유전자 발현을 활성화시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 문헌[Li, L.C. et al. Proc Natl Acad Sci U S A. (2006), 103(46):17337-42 and Li L.C. (2008). "Small RNA-Mediated Gene Activation". RNA and the Regulation of Gene Expression: A Hidden Layer of Complexity. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-25-7]을 참조하라. 유전자 프로모터를 타겟화하는 dsRNA는 관련 유전자의 강력한 전사 활성화를 유도하는 것으로 밝혀졌다. RNAa를 일으키는 내인성 miRNA가 또한 인간에서 발견되었다. 문헌[E. Nature (2007). 448 (7156): 855-858]을 확인하라.
또 다른 놀라운 관찰은 RNAa에 의한 유전자 활성화가 오래 지속된다는 것이다. 유전자 발현의 유도는 10일 이상 동안 지속되는 것으로 보였다. RNAa의 연장된 효과는 dsRNA 타겟 부위에서 후성적 변화에 기인할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 활성화제는 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 증가된 유전자 발현은 생존력, 성장 발달, 및/또는 번식을 억제한다.
이에 따라, 일부 구현예에서 본원에 개시된 본 발명의 화합물은 활성화 RNA이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 뉴클레오타이드-기재 또는 비-뉴클레오타이드-기재 링커, 예를 들어, 본 개시에 기재된 링커를 통해 서로 공유 결합되거나, 서로 비-공유 결합된 적어도 두 개의 활성화 RNA를 포함한다.
이에 따라, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 본 발명의 화합물은 삼중체 형성 올리고뉴클레오타이드(TFO)이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 뉴클레오타이드-기재 또는 비-뉴클레오타이드-기재 링커, 예를 들어, 본 개시에 기재된 링커를 통해 서로 공유 결합되거나, 서로 비-공유 결합된 적어도 두 개의 TFO를 포함한다. 최근 연구에 따르면, 서열-특이적 방식으로 이중-가닥 나선형 DNA에서 폴리퓨린/폴리피리미딘 영역을 인식하고 이에 결합할 수 있는 삼중체 형성 올리고뉴클레오타이드가 설계될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 인식 법칙은 문헌[Maher III, L.J., et al., Science (1989) vol. 245, pp 725-730; Moser, H. E., et al., Science (1987) vol. 238, pp 645-630; Beal, P.A., et al., Science (1992) vol. 251, pp 1360-1363; Conney, M., et al., Science (1988) vol. 241, pp 456-459] 및 Hogan, M.E. 등의 EP 공개 375408에 개략되어 있다. 삽입제의 도입 및 당간 결합 치환, 및 결합 조건(pH 및 양이온 농도)의 최적화와 같은 올리고뉴클레오타이드의 변형은 전하 반발 및 불안정성과 같은 TFO 활성에 대한 내재하는 난관을 극복하는 데 도움이 되며, 최근 합성 올리고뉴클레오타이드는 특이적 서열로 타겟화될 수 있는 것으로 밝혀졌다(최근 보고는 문헌[Seidman and Glazer, J Clin Invest 2003;l 12:487-94] 참조). 일반적으로, 삼중체-형성 올리고뉴클레오타이드는 서열 일치를 갖는다:
올리고 3'-A G G T
듀플렉스 5'-A G C T
듀플렉스 3'-T C G A
그러나, A-AT 및 G-GC 삼중체는 최대 삼중 나선형 안정성을 갖는 것으로 밝혀졌다(Reither and Jeltsch, BMC Biochem, 2002, Seρtl2, Epub). 동일한 저자는 A-AT 및 G-GC 규칙에 따라 설계된 TFO가 비특이적 삼중체를 형성하지 않는다는 것을 입증했는데, 이는 삼중체 형성이 실제로 서열 특이적이라는 것을 지시한다.
따라서, 임의의 주어진 서열의 경우, 삼중체 형성 서열이 구상될 수 있다. 삼중체-형성 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 적어도 15개, 더욱 바람직하게는 25개, 더욱 더 바람직하게는 30개 이상의 뉴클레오타이드 길이, 최대 50개 또는 100개 뉴클레오타이드이다.
타겟 DNA를 갖는 삼중 나선 구조의 형성은 입체 및 기능적 변화를 유도하여 전사 개시 및 연장을 차단하는데, 이는 내인성 DNA에 요망되는 서열 변화의 도입을 가능하게 하고 유전자 발현의 특정 하향 조절을 야기한다. TFO로 처리된 세포에서 이러한 유전자 발현 억제의 예는 포유류 세포에서 에피좀 supFG1 및 내인성 HPRT 유전자의 녹아웃(Vasquez et al., Nucl Acids Res. 1999;27: 1176-81, 및 Puri, et al, J Biol Chem, 2001;276:28991-98), 및 전립선 암 병인에 중요한 Ets2 전사 인자 발현의 서열 및 타겟 특이적 하향조절(Carbone, et al, Nucl Acid Res. 2003 ;31:833-43), 및 염증전 ICAM-I 유전자(Besch et al, J Biol Chem, 2002;277:32473-79)를 포함한다. 또한, 최근 Vuyisich와 Beal에 의해, 서열 특이적 TFO가 dsRNA에 결합하여 RNA-의존성 키나제와 같은 dsRNA-의존성 효소의 활성을 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Vuyisich and Beal, Nuc. Acids Res 2000;28:2369-74).
또한, 상기 언급된 원칙에 따라 설계된 TFO는 DNA 복구에 영향을 미칠 수 있는 유도적 돌연변이유발을 유도하여 내인성 유전자 발현의 하향 조절과 상향 조절 둘 모두를 제공할 수 있다(Seidman and Glazer, J Clin Invest 2003; 112:487-94). 효과적인 TFO의 설계, 합성 및 투여의 상세한 설명은 전체 내용이 본 명세서에 포함되는 Froehler 등의 미국 특허 출원 No. 2003 017068 및 2003 0096980, 및 Emanuele 등의 2002 0128218 및 2002 0123476, 및 Lawn의 미국 특허 No. 5,721,138에서 찾아볼 수 있다.
핵산 변형
일부 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 본원에 기재된 적어도 하나의 핵산 변형을 포함한다. 예를 들어, 적어도 하나의 변형은 변형 뉴클레오사이드간 결합, 변형 뉴클레오베이스, 변형 당, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제한 없이, 그러한 변형은 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제에서 임의의 위치에 존재할 수 있다. 예를 들어, 변형은 RNA 분자들 중 하나에 존재할 수 있다.
핵산 변형(뉴클레오베이스)
뉴클레오사이드의 천연 생성 염기 부분은 전형적으로 헤테로사이클릭 염기이다. 두 개의 가장 흔한 부류의 그러한 헤테로사이클릭 염기는 퓨린 및 피리미딘이다. 펜토푸라노실 당을 포함하는 그러한 뉴클레오사이드의 경우, 포스페이트 기는 당의 2', 3' 또는 5' 하이드록실 모이어티에 연결될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 데 있어서, 그러한 포스페이트 기는 인접한 뉴클레오사이드를 서로에 대해 공유 연결하여 선형 폴리머 화합물을 형성한다. 올리고뉴클레오타이드 내에서, 포스페이트 기는 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오사이드간 백본을 형성하는 것으로 흔히 언급된다. RNA 및 DNA의 천연 생성 결합 또는 백본은 3'에서 5'로의 포스포디에스테르 결합이다.
"비변형" 또는 "천연" 뉴클레오베이스, 예컨대, 퓨린 뉴클레오베이스 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 뉴클레오베이스 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U) 외에, 당업자에게 알려진 다수의 변형 뉴클레오베이스 또는 뉴클레오베이스 모방체가 본원에 기재된 화합물에 적합하다. 비변형 또는 천연 뉴클레오베이스는 개선된 특성을 갖는 iRNA를 제공하도록 변형되거나 치환될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 저항성 올리고뉴클레오타이드는 이러한 염기들과 또는 합성 및 천연 뉴클레오베이스(예를 들어, 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 뉴불라린, 이소구아니신, 또는 투베르시딘) 및 본원에 기재된 올리고머 변형 중 어느 하나와 제조될 수 있다. 대안적으로, 임의의 상기 염기들 및 "보편적인 염기"의 치환되거나 변형된 유사체가 사용될 수 있다. 천연 염기가 비-천연 및/또는 보편적인 염기로 치환되는 경우, 뉴클레오타이드는 본원에서 변형된 뉴클레오베이스 및/또는 뉴클레오베이스 변형을 포함한다고 한다. 변형된 뉴클레오베이스 및/또는 뉴클레오베이스 변형은 또한 접합된 모이어티, 예를 들어, 본원에 기재된 리간드를 포함하는 천연, 비-천연 및 보편적 염기를 포함한다. 뉴클레오베이스와의 접합에 바람직한 접합 모이어티는 적절한 알킬, 알케닐 또는 아미드 결합이 있는 링커를 통해 뉴클레오베이스에 접합될 수 있는 양이온성 아미노 기를 포함한다.
본원에 기재된 올리고머 화합물은 또한 뉴클레오베이스(당업계에서 흔히 간단히 "염기로" 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "비변형" 또는 "천연" 뉴클레오베이스는 퓨린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 예시적인 변형 뉴클레오베이스는 기타 합성 및 천연 뉴클레오베이스, 예컨대, 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 뉴불라린, 이소구아니신, 튜베르시딘, 2-(할로)아데닌, 2-(알킬)아데닌, 2-(프로필)아데닌, 2-(아미노)아데닌, 2-(아미노알킬)아데닌, 2-(아미노프로필)아데닌, 2-(메틸티오)-N6-(이소펜테닐)아데닌, 6-(알킬)아데닌, 6-(메틸)아데닌, 7-(데아자)아데닌, 8-(알케닐)아데닌, 8-(알킬)아데닌, 8-(알키닐)아데닌, 8-(아미노)아데닌, 8-(할로)아데닌, 8-(하이드록실)아데닌, 8-(티오알킬)아데닌, 8-(티올)아데닌, N6-(이소펜틸)아데닌, N6-(메틸)아데닌, N6,N6-(디메틸)아데닌, 2-(알킬)구아닌, 2-(프로필)구아닌, 6-(알킬)구아닌, 6-(메틸)구아닌, 7-(알킬)구아닌, 7-(메틸)구아닌, 7-(데아자)구아닌, 8-(알킬)구아닌, 8-(알케닐)구아닌, 8-(알키닐)구아닌, 8-(아미노)구아닌, 8-(할로)구아닌, 8-(하이드록실)구아닌, 8-(티오알킬)구아닌, 8-(티올)구아닌, N-(메틸)구아닌, 2-(티오)시토신, 3-(데아자) 5-(아자)시토신, 3-(알킬)시토신, 3-(메틸)시토신, 5-(알킬)시토신, 5-(알키닐)시토신, 5-(할로)시토신, 5-(메틸)시토신, 5-(프로피닐)시토신, 5-(프로피닐)시토신, 5-(트리플루오로메틸)시토신, 6-(아조)시토신, N4-(아세틸)시토신, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우라실, 2-(티오)우라실, 5-(메틸) 2-(티오)우라실, 5-(메틸아미노메틸)-2-(티오)우라실, 4-(티오)우라실, 5-(메틸) 4-(티오)우라실, 5-(메틸아미노메틸)-4-(티오)우라실, 5-(메틸) 2,4-(디티오)우라실, 5-(메틸아미노메틸)-2,4-(디티오)우라실, 5-(2-아미노프로필)우라실, 5-(알킬)우라실, 5-(알키닐)우라실, 5-(알릴아미노)우라실, 5-(아미노알릴)우라실, 5-(아미노알킬)우라실, 5-(구아니디늄알킬)우라실, 5-(1,3-디아졸-1-알킬)우라실, 5-(시아노알킬)우라실, 5-(디알킬아미노알킬)우라실, 5-(디메틸아미노알킬)우라실, 5-(할로)우라실, 5-(메톡시)우라실, 우라실-5 옥시아세트산, 5-(메톡시카르보닐메틸)-2-(티오)우라실, 5-(메톡시카르보닐-메틸)우라실, 5-(프로피닐)우라실, 5-(프로피닐)우라실, 5-(트리플루오로메틸)우라실, 6-(아조)우라실, 디하이드로우라실, N3-(메틸)우라실, 5-우라실(즉, 유사우라실), 2-(티오)유사우라실, 4-(티오)유사우라실, 2,4-(디티오)유사우라실, 5-(알킬)유사우라실, 5-(메틸)유사우라실, 5-(알킬)-2-(티오)유사우라실, 5-(메틸)-2-(티오)유사우라실, 5-(알킬)-4-(티오)유사우라실, 5-(메틸)-4-(티오)유사우라실, 5-(알킬)-2,4-(디티오)유사우라실, 5-(메틸)-2,4-(디티오)유사우라실, 1-치환된 유사우라실, 1-치환된 2(티오)-유사우라실, 1-치환된 4-(티오)유사우라실, 1-치환된 2,4-(디티오)유사우라실, 1-(아미노카르보닐에틸레닐)-유사우라실, 1-(아미노카르보닐에틸레닐)-2(티오)-유사우라실, 1-(아미노카르보닐에틸레닐)-4-(티오)유사우라실, 1-(아미노카르보닐에틸레닐)-2,4-(디티오)유사우라실, 1-(아미노알킬아미노카르보닐에틸레닐)-유사우라실, 1-(아미노알킬아미노-카르보닐에틸레닐)-2(티오)-유사우라실, 1-(아미노알킬아미노카르보닐에틸레닐)-4-(티오)유사우라실, 1-(아미노알킬아미노카르보닐에틸레닐)-2,4-(디티오)유사우라실, 1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일, 1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진-1-일, 1,3-(디아자)-2-(옥소)-펜티아진-1-일, 1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-펜티아진-1-일, 7-치환된 1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일, 7-치환된 1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진-1-일, 7-치환된 1,3-(디아자)-2-(옥소)-펜티아진-1-일, 7-치환된 1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-펜티아진-1-일, 7-(아미노알킬하이드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일, 7-(아미노알킬하이드록시)-1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진-1-일, 7-(아미노알킬하이드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-펜티아진-1-일, 7-(아미노알킬하이드록시)-1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-펜티아진-1-일, 7-(구아니디늄알킬하이드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일, 7-(구아니디늄알킬하이드록시)-1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진-1-일, 7-(구아니디늄알킬-하이드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-펜티아진-1-일, 7-(구아니디늄알킬하이드록시)-1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-펜티아진-1-일, 1,3,5-(트리아자)-2,6-(디옥사)-나프탈렌, 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 뉴불라린, 튜베르시딘, 이소구아니신, 이노시닐, 2-아자-이노시닐, 7-데아자-이노시닐, 니트로이미다졸릴, 니트로피라졸릴, 니트로벤즈이미다졸릴, 니트로인다졸릴, 아미노인돌릴, 피롤로피리미디닐, 3-(메틸)이소카르보스티릴일, 5-(메틸)이소카르보스티릴일, 3-(메틸)-7-(프로피닐)이소카르보스티릴일, 7-(아자)인돌릴, 6-(메틸)-7-(아자)인돌릴, 이미디조피리디닐, 9-(메틸)-이미디조피리디닐, 피롤로피리지닐, 이소카르보스티릴일, 7-(프로피닐)이소카르보스티릴일, 프로피닐-7-(아자)인돌릴, 2,4,5-(트리메틸)페닐, 4-(메틸)인돌릴, 4,6-(디메틸)인돌릴, 페닐, 나프탈레닐, 안트라세닐, 페난트라세닐, 피레닐, 스틸베닐, 테트라세닐, 펜타세닐, 디플루오로톨릴, 4-(플루오로)-6-(메틸)벤즈이미다졸, 4-(메틸)벤즈이미다졸, 6-(아조)티민, 2-피리딘온, 5-니트로인돌, 3-니트로피롤, 6-(아자)피리미딘, 2-(아미노)퓨린, 2,6-(디아미노)퓨린, 5-치환된 피리미딘, N2-치환된 퓨린, N6-치환된 퓨린, O6-치환된 퓨린, 치환된 1,2,4-트리아졸, 피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 파라-치환된-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 오르토-치환된-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 비스-오르토-치환된-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 파라-(아미노알킬하이드록시)-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 오르토-(아미노알킬하이드록시)-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 비스-오르토--(아미노알킬하이드록시)-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 피리도피리미딘-3-일, 2-옥소-7-아미노-피리도피리미딘-3-일, 2-옥소-피리도피리미딘-3-일, 또는 이들의 임의의 O-알킬화된 또는 N-알킬화된 유도체를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 대안적으로, 임의의 상기 염기들 및 "보편적인 염기"의 치환되거나 변형된 유사체가 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 보편적인 뉴클레오베이스는 용융 거동, 세포내 효소의 인식 또는 iRNA 듀플렉스의 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 4개의 천연 생성 뉴클레오베이스 모두와 염기쌍이 될 수 있는 임의의 뉴클레오베이스이다. 일부 예시적인 보편적인 뉴클레오베이스는 2,4-디플루오로톨루엔, 니트로피롤릴, 니트로인돌릴, 8-아자-7-데아자아데닌, 4-플루오로-6-메틸벤즈이미다졸, 4-메틸벤즈이미다졸, 3-메틸 이소카르보스티릴일, 5-메틸 이소카르보스티릴일, 3-메틸-7-프로피닐 이소카르보스티릴일, 7-아자인돌릴, 6-메틸-7-아자인돌릴, 이미디조피리디닐, 9-메틸-이미디조피리디닐, 피롤로피리지닐, 이소카르보스티릴일, 7-프로피닐 이소카르보스티릴일, 프로피닐-7-아자인돌릴, 2,4,5-트리메틸페닐, 4-메틸이노릴, 4,6-디메틸인돌릴, 페닐, 나프탈레닐, 안트라세닐, 페난트라세닐, 피레닐, 스틸베닐, 테트라세닐, 펜타세닐, 및 이들의 구조적 유도체를 포함하나, 이로 한정되지 않는다(예를 들어, 문헌[Loakes, 2001, Nucleic Acids Research, 29, 2437-2447] 참조).
추가 뉴클레오베이스는 미국 특허 No. 3,687,808에 개시된 것들; 2009년 3월 26일에 출원된 국제 출원 No. PCT/US09/038425에 개시된 것들; 문헌[Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 858-859 쪽, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990]에 개시된 것들; 문헌[English et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613]에 개시된 것들; 문헌[Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijin, P.Ed. Wiley-VCH, 2008]에 개시된 것들; 및 문헌[Sanghvi, Y.S., 챕터 15, dsRNA Research and Applications, 289-302 쪽, Crooke, S.T. and Lebleu, B., Eds., CRC Press, 1993]에 개시된 것들을 포함한다. 상기 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
소정의 구현예에서, 변형된 뉴클레오베이스는, 예를 들어, 7-데아자 퓨린, 5-메틸 시토신, 또는 G-클램프와 같은 모 뉴클레오베이스와 구조가 매우 유사한 뉴클레오베이스이다. 소정의 구현예에서, 뉴클레오베이스 모방체는, 예를 들어, 트리사이클릭 페녹사진 뉴클레오베이스 모방체와 같이 더 복잡한 구조를 포함한다. 상기 언급된 변형 뉴클레오베이스의 제조를 위한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
핵산 변형(당)
본원에 제공된 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 변형 당 모이어티를 갖는, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하여, 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상)의 단량체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오사이드의 푸라노실 당 고리는 잠김 핵산 또는 바이사이클릭 핵산을 형셩하기 위해 치환기의 첨가, 두 개의 비-같은 자리 고리 원자의 가교를 포함하나, 이로 한정되지 않는 다수의 방식으로 변형될 수 있다. 소정의 구현예에서, 올리고머 화합물은 LNA인 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상)의 단량체를 포함한다.
잠김 핵산의 일부 구현예에서, 푸르나오실의 2' 위치는 다음으로부터 독립적으로 선택된 링커에 의해 4' 위치에 연결된다:
-[C(R1)(R2)]n-, -[C(R1)(R2)]n-O-, -[C(R1)(R2)]n-N(R1)-, -[C(R1)(R2)]n-N(R1)-O-, ―[C(R1R2)]n-O-N(R1)―, -C(R1)=C(R2)-O-, -C(R1)=N-, -C(R1)=N-O-, ―C(=NR1)-, ―C(=NR1)-O-, ―C(=O)―, ―C(=O)O―, ―C(=S)―, ―C(=S)O―, ―C(=S)S―, ―O―, ―Si(R1)2-, ―S(=O)x- 및 ―N(R1)-;
식에서,
x는 0, 1, 또는 2이고;
n은 1, 2, 3, 또는 4이고;
각각의 R1 및 R2는 독립적으로 H, 보호기, 하이드록실, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C5-C7 비사이클릭 라디칼, 치환된 C5-C7 비사이클릭 라디칼, 할로겐, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, 아실(C(=O)-H), 치환된 아실, CN, 설포닐(S(=O)2-J1), 또는 설폭실(S(=O)-J1)이고;
각각의 J1 및 J2는 독립적으로 H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 아실(C(=O)―H), 치환된 아실, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, C1-C12 아미노알킬, 치환된 C1-C12 아미노알킬 또는 보호기이다.
일부 구현예에서, LNA 화합물의 각각의 링커는 독립적으로 -[C(R1)(R2)]n-, -[C(R1)(R2)]n-O-, -C(R1R2)-N(R1)-O- 또는 -C(R1R2)-O-N(R1)-이다. 또 다른 구현예에서, 각각의 상기 링커는 독립적으로 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R1)-2' 및 4'-CH2-N(R1)-O-2'이고, 각각의 R1은 독립적으로 H, 보호기 또는 C1-C12 알킬이다.
특정 LNA는 특허 문헌뿐만 아니라 과학 문헌(문헌[Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456]; 문헌[Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630]; 문헌[Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638]; 문헌[Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222]; WO 94/14226; WO 2005/021570; 문헌[Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039])에 제조되고 개시되어 있으며; LNA가 개시되어 있는 발행된 미국 특허 및 공개 출원의 예는, 예를 들어, 미국 특허 No. 7,053,207; 6,268,490; 6,770,748; 6,794,499; 7,034,133; 및 6,525,191; 및 미국 등록전 공개 No. 2004-0171570; 2004-0219565; 2004-0014959; 2003-0207841; 2004-0143114; 및 20030082807을 포함한다.
또한, 리보실 당 고리의 2'-하이드록실 기가 당 고리의 4' 탄소 원자에 연결되고, 이에 의해 메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') 결합을 형성하여 바이사이클릭 당 모이어티를 형성하는 LNA가 본원에 제공된다(문헌[Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561]; 문헌[Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8 1-7]; 및 문헌[Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243]에 보고되어 있으며; 또한 미국 특허 No. 6,268,490 및 6,670,461 참조). 결합은 2' 산소 원자 및 4' 탄소 원자를 가교하는 메틸렌(-CH2-)일 수 있고, 여기서 용어 메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') LNA는 바이사이클릭 모이어티에 대하여 사용되고; 이러한 위치에서 에틸렌 기의 경우에, 용어 에틸렌옥시(4'-CH2CH2-O-2') LNA가 사용된다(Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456: Morita et al., Bioorganic Medicinal Chemistry, 2003, 11, 2211-2226). 메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') LNA 및 다른 바이사이클릭 당 유사체는 상보적 DNA 및 RNA와 매우 높은 듀플렉스 열 안정성(Tm=+3 내지 +10℃), 3'-엑소뉴클레오리틱 분해를 향하는 안정성 및 우수한 가용성 특성을 나타낸다. BNA를 포함하는 강력하고 비독성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 기재되어 있다(Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638).
또한 논의된 메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') LNA의 이성질체는 3'-엑소뉴클레아제에 대항하는 우수한 안정성을 갖는 것으로 밝혀진 알파-L-메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') LNA이다. 알파-L-메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') LNA는 강력한 안티센스 활성을 나타낸 안티센스 갭머 및 키메라로 도입되었다(Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') LNA 단량체 아데닌, 시토신, 구아닌, 5-메틸-시토신, 티민 및 우라실의 합성 및 제조, 이와 함께 이들의 올리고머화, 및 핵산 인식 특성이 기재되어 있다(Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). BNA 및 이의 제조가 또한 WO 98/39352 및 WO 99/14226에 기재되어 있다.
메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') LNA, 포스포로티오에이트-메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') LNA 및 2'-티오-LNA의 유사체가 또한 제조되었다(Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). 핵산 폴리머라제를 위한 기질로서 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 듀플렉스를 포함하는 잠김 뉴클레오사이드 유사체의 제조가 또한 기재되어 있다(Wengel et al., WO 99/14226). 게다가, 신규한 입체형태 제한 고친화성 올리고뉴클레오타이드 유사체인 2'-아미노-LNA의 합성이 또한 당업계에 개시되어 있다(Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). 또한, 2'-아미노- 및 2'-메틸아미노-LNA가 제조되었고, 상보적 RNA 및 DNA 가닥과 이들의 듀플렉스의 열적 안정성이 종래에 보고되었다.
변형 당 모이어티는 잘 알려져 있으며, 이의 타겟에 대한 안티센스 화합물의 친화성을 변경하고, 전형적으로 증가시키고/증가시키거나 뉴클레아제 저항성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 변형 당의 대표적인 목록은 메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') LNA 및 에틸렌옥시(4'-(CH2)2-O-2' 브릿지) ENA를 포함한 바이사이클릭 변형 당; 치환 당, 특히, 2'-F, 2'-OCH3 또는 2'-O(CH2)2-OCH3 치환기를 갖는 2'-치환기; 및 4'-티오 변형 당을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 당은 또한 특히 당 모방 기로 치환될 수 있다. 변형 당의 제조를 위한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그러한 변형 당의 제조를 교시하는 일부 대표적인 특허 및 공보는 미국 특허 No. 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; 5,700,920; 6,531,584; 및 6,600,032; 및 WO 2005/121371를 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
"옥시"-2' 하이드록실 기 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시(OR, 예를 들어, R = H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당); 폴리에틸렌글리콜(PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR, n=1-50; "잠김" 핵산(LNA)(여기서, 뉴클레오사이드의 푸라노스 부분은 푸라노스 고리의 두 개의 탄소 원자를 연결하는 브릿지를 포함하고, 이에 의해 바이사이클릭 고리 시스템을 형성함); O-아민 또는 O-(CH2)n아민(n=1-10, 아민 = NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌디아민 또는 폴리아미노); 및 O-CH2CH2(NCH2CH2NMe2)2를 포함한다.
"데옥시" 변형은 수소(즉, 데옥시리보스 당, 특히 단일-가닥 오버행과 관련); 할로(예를 들어, 플루오로); 아미노(예를 들어, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 디헤테로아릴 아미노, 또는 아미노 산); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-아민(아민 = NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노); -NHC(O)R(R = 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당); 시아노; 머캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시; 티오알킬; 알킬; 사이클로알킬; 아릴; 알케닐 및 알키닐(예를 들어, 아미노 작용기로 선택적으로 치환될 수 있음)을 포함한다.
다른 적합한 2'-변형, 예를 들어, 변형 MOE는 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 출원 공개 No. 20130130378에 기재되어 있다.
2' 위치에서의 변형은 아라비노스 배치에 존재할 수 있다. 용어 "아라비노스 배치"는 아라비노스에서의 2'-OH와 동일한 배치에 리보스의 C2'에서의 치환기의 배치를 지칭한다.
당은 당에서 동일한 탄소의 두 개의 상이한 변형, 예를 들어, 젬 변형(gem modification)을 포함할 수 있다. 당 기는 또한 리보스에서 상응하는 탄소와 반대의 입체화학적 배치를 지니는 하나 이상의 탄소를 함유할 수 있다. 따라서, 올리고머 화합물은 당으로서, 예를 들어, 아라비노스를 함유하는 하나 이상의 단량체를 포함할 수 있다. 단량체는 당의 1' 위치에서 알파 결합, 예를 들어, 알파-뉴클레오사이드를 가질 수 있다. 단량체는 또한 4'-위치에서 반대 배치를 가질 수 있고, 예를 들어, C5' 및 H4' 또는 이를 치환하는 치환기는 서로 상호교환된다. C5' 및 H4' 또는 이를 치환하는 치환기가 서로 상호교환되는 경우, 당은 4' 위치에서 변형된다고 한다.
본원에 개시된 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 또한 무염기 당, 즉, C-1'에서 뉴클레오베이스가 없는 당을 포함할 수 있거나, C1'에서 뉴클레오베이스 대신 다른 화학기를 갖는다. 예를 들어, 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 No. 5,998,203를 참조하라. 이러한 무염기 당은 또한 구성 당 원자 중 하나 이상에서 변형을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 또한 L 이성질체, 예를 들어, L-뉴클레오사이드인 하나 이상의 당을 함유할 수 있다. 당 기에 대한 변형은 또한 황, 선택적으로 치환된 질소 또는 CH2 기로의 4'-O 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, C1'과 뉴클레오베이스 간의 결합은 α 배치이다.
당 변형은 또한 비사이클릭 뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 여기서 리보스 탄소(예를 들어, C1'-C2', C2'-C3', C3'-C4', C4'-O4', C1'-O4') 간의 C-C 결합은 부재이고/부재이거나 리보스 탄소 또는 산소(예를 들어, C1', C2', C3', C4' 또는 O4') 중 적어도 하나는 독립적으로 또는 조합하여 뉴클레오타이드에서 부재이다. 일부 구현예에서, 비사이클릭 뉴클레오타이드는
Figure pct00031
이고, 여기서 B는 변형 또는 비변형 뉴클레오베이스이고, R1 및 R2는 독립적으로 H, 할로겐, OR3, 또는 알킬이고; R3는 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당이다.
일부 구현예에서, 당 변형은 아라비노스 배치에서 2'-O-Me를 갖는 2'-H, 2'-O-Me(2'-O-메틸), 2'-O-MOE(2'-O-메톡시에틸), 2'-F, 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸](2'-O-NMA), 2'-S-메틸, 2'-O-CH2-(4'-C)(LNA), 2'-O-CH2CH2-(4'-C)(ENA), 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), 2'-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE) 및 젬 2'-OMe/2'F로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 뉴클레오사이드가 이의 2'-위치를 통해 다음 뉴클레오타이드에 연결되는 경우, 본원에 기재된 당 변형은 특정 뉴클레오타이드, 예를 들어, 이의 2'-위치를 통해 연결된 뉴클레오타이드에 대한 당의 3'-위치에 위치될 수 있는 것이 이해되어야 한다. 3' 위치에서의 변형은 자일로스 배치에 존재할 수 있다. 용어 "자일로스 배치"는 자일로스 당에서의 3'-OH와 동일한 배치에 리보스의 C3'에서의 치환기의 배치를 지칭한다.
C4' 및/또는 C1'에 부착된 수소는 선형- 또는 분지형- 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐로 치환될 수 있고, 여기서 알킬, 알케닐 및 알키닐의 백본은 O, S, S(O), SO2, N(R'), C(O), N(R')C(O)O, OC(O)N(R'), CH(Z'), 인 함유 결합, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릭 또는 선택적으로 치환된 사이클로알킬 중 하나 이상을 함유할 수 있고, R'은 수소, 아실 또는 선택적으로 치환된 지방족이고, Z'는 OR11, COR11, CO2R11,
Figure pct00032
, NR21R31, CONR21R31, CON(H)NR21R31, ONR21R31, CON(H)N=CR41R51, N(R21)C(=NR31)NR21R31, N(R21)C(O)NR21R31, N(R21)C(S)NR21R31, OC(O)NR21R31, SC(O)NR21R31, N(R21)C(S)OR11, N(R21)C(O)OR11, N(R21)C(O)SR11, N(R21)N=CR41R51, ON=CR41R51, SO2R11, SOR11, SR11, 및 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릭으로 이루어진 군으로부터 선택되고; R21 및 R31는 각 경우에 독립적으로 수소, 아실, 비치환되거나 치환된 지방족, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, OR11, COR11, CO2R11, 또는 NR11R11 '이거나; R21 및 R31은 이들이 부착된 원자와 함께 헤테로사이클릭 고리를 형성하고; R41 및 R51은 각 경우에 독립적으로 수소, 아실, 비치환되거나 치환된 지방족, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, OR11, COR11, 또는 CO2R11, 또는 NR11R11'이고; R11 및 R11'은 독립적으로 수소, 지방족, 치환된 지방족, 아릴, 헤테로아릴, 또는 헤테로사이클릭이다. 일부 구현예에서, 5' 말단 뉴클레오타이드의 C4'에 부착된 수소는 치환된다.
일부 구현예에서, C4' 및 C5'는 함께 바람직하게는 적어도 하나의 -PX(Y)-를 포함하는 선택적으로 치환된 헤테로사이클릭을 형성하고, 여기서 X는 H, OH, OM, SH, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알킬티오, 선택적으로 치환된 알킬아미노 또는 선택적으로 치환된 디알킬아미노이고, M은 독립적으로 각 경우에 +1의 전체 전하를 갖는 알칼리 금속 또는 전이 금속이고; Y는 O, S, 또는 NR'이고, 여기서 R'는 수소, 선택적으로 치환된 지방족이다. 바람직하게는, 이러한 변형은 iRNA의 5 말단에 있다.
소정의 구현예에서, LNA는 하기 화학식을 갖는 바이사이클릭 뉴클레오사이드를 포함한다:
Figure pct00033
식에서,
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이고;
T1은 H 또는 하이드록실 보호기이고;
T2는 H, 하이드록실 보호기 또는 반응성 인 기이고;
Z는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알키닐, 아실, 치환된 아실, 또는 치환된 아미드이다.
일부 구현예에서, 각각의 치환된 기는 독립적으로, 할로겐, 옥소, 하이드록실, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 및 CN으로부터 독립적으로 선택된 선택적으로 보호된 치환기로 단일 또는 다중치환되고, 여기서 각각의 J1, J2 및 J3는 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고, X는 O, S 또는 NJ1이다.
소정의 그러한 구현예에서, 각각의 치환된 기는, 독립적으로, 할로겐, 옥소, 하이드록실, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, 및 NJ3C(=X)NJ1J2로부터 독립적으로 선택된 치환기로 단일 또는 다중 치환되고, 여기서 각각의 J1, J2 및 J3는, 독립적으로, H, C1-C6 알킬, 또는 치환된 C1-C6 알킬이고, X는 O 또는 NJ1이다.
소정의 구현예에서, Z 기는 하나 이상의 Xx로 치환된 C1-C6 알킬이고, 여기서 각각의 Xx는 독립적으로 OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 또는 CN이고; 각각의 J1, J2 및 J3는, 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고, X는 O, S 또는 NJ1이다. 또 다른 구현예에서, Z 기는 하나 이상의 Xx로 치환된 C1-C6 알킬이고, 여기서 각각의 Xx는 독립적으로 할로(예를 들어, 플루오로), 하이드록실, 알콕시(예를 들어, CH3O-), 치환된 알콕시 또는 아자이도이다.
소정의 구현예에서, Z 기는 -CH2Xx이고, 여기서 Xx는 OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 또는 CN이고; 각각의 J1, J2 및 J3는, 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고, X는 O, S 또는 NJ1이다. 또 다른 구현예에서, Z 기는 -CH2Xx이고, 여기서 Xx는 할로(예를 들어, 플루오로), 하이드록실, 알콕시(예를 들어, CH3O-) 또는 아자이도이다.
소정의 그러한 구현예에서, Z 기는 (R)-배치이다:
Figure pct00034
소정의 그러한 구현예에서, Z 기는 (S)-배치이다:
Figure pct00035
소정의 구현예에서, 각각의 T1 및 T2는 하이드록실 보호기이다. 하이드록실 보호기의 바람직한 목록은 벤질, 벤조일, 2,6-디클로로벤질, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 메실레이트, 토실레이트, 디메톡시트리틸(DMT), 9-페닐잔틴-9-일(픽실) 및 9-(p-메톡시페닐)잔틴-9-일(MOX)을 포함한다. 소정의 구현예에서, T1은 아세틸, 벤질, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴 및 디메톡시트리틸로부터 선택된 하이드록실 보호기이고, 여기서 더욱 바람직한 하이드록실 보호기인 T1은 4,4'-디메톡시트리틸이다.
소정의 구현예에서, T2는 반응성 인 기이고, 여기서 바람직한 반응성 인 기는 디이소프로필시아노에톡시 포스포라미다이트 및 H-포스포네이트를 포함한다. 소정의 구현예에서, T1은 4,4'-디메톡시트리틸이고, T2는 디이소프로필시아노에톡시 포스포라미다이트이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 화합물은
화학식
Figure pct00036
, 또는
화학식
Figure pct00037
, 또는
화학식
Figure pct00038
의 적어도 하나의 단량체를 포함하고,
식에서,
Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이고;
T3는 H, 하이드록실 보호기, 연결된 접합기 또는 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오사이드, 올리고뉴클레오타이드, 단량체 하위단위 또는 올리고머 화합물에 부착된 뉴클레오사이드간 연결기이고;
T4는 H, 하이드록실 보호기, 연결된 접합기 또는 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오사이드, 올리고뉴클레오타이드, 단량체 하위단위 또는 올리고머 화합물에 부착된 뉴클레오사이드간 연결기이고;
T3 및 T4 중 적어도 하나는 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오사이드, 올리고뉴클레오타이드, 단량체 하위단위 또는 올리고머 화합물에 부착된 뉴클레오사이드간 연결기이고;
Z는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알키닐, 아실, 치환된 아실, 또는 치환된 아미드이다.
일부 구현예에서, 각각의 치환된 기는, 독립적으로, 할로겐, 옥소, 하이드록실, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 및 CN으로부터 독립적으로 선택된 선택적으로 보호된 치환기로 단일 또는 다중 치환되고, 여기서 각각의 J1, J2 및 J3는, 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고, X는 O, S 또는 NJ1이다.
일부 구현예에서, 각각의 치환된 기는, 독립적으로, 할로겐, 옥소, 하이드록실, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, 및 NJ3C(=X)NJ1J2로부터 독립적으로 선택된 치환기로 단일 또는 다중 치환되고, 여기서 각각의 J1, J2 및 J3는, 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고, X는 O 또는 NJ1이다.
소정의 그러한 구현예에서, 적어도 하나의 Z는 C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이다. 소정의 구현예에서, 각각의 Z는, 독립적으로, C1-C6 알킬 또는 치환된 C1-C6 알킬이다. 소정의 구현예에서, 적어도 하나의 Z는 C1-C6 알킬이다. 소정의 구현예에서, 각각의 Z는, 독립적으로, C1-C6 알킬이다. 소정의 구현예에서, 적어도 하나의 Z는 메틸이다. 소정의 구현예에서, 각각의 Z는 메틸이다. 소정의 구현예에서, 적어도 하나의 Z는 에틸이다. 소정의 구현예에서, 각각의 Z는 에틸이다. 소정의 구현예에서, 적어도 하나의 Z는 치환된 C1-C6 알킬이다. 소정의 구현예에서, 각각의 Z는, 독립적으로, 치환된 C1-C6 알킬이다. 소정의 구현예에서, 적어도 하나의 Z는 치환된 메틸이다. 소정의 구현예에서, 각각의 Z는 치환된 메틸이다. 소정의 구현예에서, 적어도 하나의 Z는 치환된 에틸이다. 소정의 구현예에서, 각각의 Z는 치환된 에틸이다.
소정의 구현예에서, 적어도 하나의 치환기는 C1-C6 알콕시이다(예를 들어, 적어도 하나의 Z는 하나 이상의 C1-C6 알콕시로 치환된 C1-C6 알킬임). 또 다른 구현예에서, 각각의 치환기는, 독립적으로, C1-C6 알콕시이다(예를 들어, 각각의 Z는, 독립적으로, 하나 이상의 C1-C6 알콕시로 치환된 C1-C6 알킬임).
소정의 구현예에서, 적어도 하나의 C1-C6 알콕시 치환기는 CH3O-이다(예를 들어, 적어도 하나의 Z는 CH3OCH2-임). 또 다른 구현예에서, 각각의 C1-C6 알콕시 치환기는 CH3O-이다(예를 들어, 각각의 Z는 CH3OCH2-임).
소정의 구현예에서, 적어도 하나의 치환기는 할로겐이다(예를 들어, 적어도 하나의 Z는 하나 이상의 할로겐으로 치환된 C1-C6 알킬임). 소정의 구현예에서, 각각의 치환기는, 독립적으로, 할로겐이다(예를 들어, 각각의 Z는, 독립적으로, 하나 이상의 할로겐으로 치환된 C1-C6 알킬임). 소정의 구현예에서, 적어도 하나의 할로겐 치환기는 플루오로이다(예를 들어, 적어도 하나의 Z는 CH2FCH2-, CHF2CH2- 또는 CF3CH2-임). 소정의 구현예에서, 각각의 할로 치환기는 플루오로이다(예를 들어, 각각의 Z는, 독립적으로, CH2FCH2-, CHF2CH2- 또는 CF3CH2-임).
소정의 구현예에서, 적어도 하나의 치환기는 하이드록실이다(예를 들어, 적어도 하나의 Z는 하나 이상의 하이드록실로 치환된 C1-C6 알킬임). 소정의 구현예에서, 각각의 치환기는, 독립적으로, 하이드록실이다(예를 들어, 각각의 Z는, 독립적으로, 하나 이상의 하이드록실로 치환된 C1-C6 알킬임). 소정의 구현예에서, 적어도 하나의 Z는 HOCH2-이다. 또 다른 구현예에서, 각각의 Z는 HOCH2-이다.
소정의 구현예에서, 적어도 하나의 Z는 CH3-, CH3CH2-, CH2OCH3-, CH2F- 또는 HOCH2-이다. 소정의 구현예에서, 각각의 Z는, 독립적으로, CH3-, CH3CH2-, CH2OCH3-, CH2F- 또는 HOCH2-이다.
소정의 구현예에서, 적어도 하나의 Z 기는 하나 이상의 Xx로 치환된 C1-C6 알킬이고, 여기서 각각의 Xx는, 독립적으로, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 또는 CN이고; 각각의 J1, J2 및 J3는, 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고, X는 O, S 또는 NJ1이다. 또 다른 구현예에서, 적어도 하나의 Z 기는 하나 이상의 Xx로 치환된 C1-C6 알킬이고, 여기서 각각의 Xx는, 독립적으로, 할로(예를 들어, 플루오로), 하이드록실, 알콕시(예를 들어, CH3O-) 또는 아자이도이다.
소정의 구현예에서, 각각의 Z 기는, 독립적으로, 하나 이상의 Xx로 치환된 C1-C6 알킬이고, 여기서 각각의 Xx는 독립적으로 OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 또는 CN이고; 각각의 J1, J2 및 J3는, 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고, X는 O, S 또는 NJ1이다. 또 다른 구현예에서, 각각의 Z 기는, 독립적으로, 하나 이상의 Xx로 치환된 C1-C6 알킬이고, 여기서 각각의 Xx는 독립적으로 할로(예를 들어, 플루오로), 하이드록실, 알콕시(예를 들어, CH3O-) 또는 아자이도이다.
소정의 구현예에서, 적어도 하나의 Z 기는 -CH2Xx이고, 여기서 Xx는 OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 또는 CN이고; 각각의 J1, J2 및 J3는, 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고, X는 O, S 또는 NJ1이다. 소정의 구현예에서, 적어도 하나의 Z 기는 -CH2Xx이고, 여기서 Xx는 할로(예를 들어, 플루오로), 하이드록실, 알콕시(예를 들어, CH3O-) 또는 아자이도이다.
소정의 구현예에서, 각각의 Z 기는, 독립적으로, -CH2Xx이고, 여기서 각각의 Xx는, 독립적으로, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 또는 CN이고; 각각의 J1, J2 및 J3는, 독립적으로, H 또는 C1-C6 알킬이고, X는 O, S 또는 NJ1이다. 또 다른 구현예에서, 각각의 Z는, 독립적으로, -CH2Xx이고, 여기서 각각의 Xx는, 독립적으로, 할로(예를 들어, 플루오로), 하이드록실, 알콕시(예를 들어, CH3O-) 또는 아자이도이다.
소정의 구현예에서, 적어도 하나의 Z는 CH3-이다. 또 다른 구현예에서, 각각의 Z는, CH3-이다.
소정의 구현예에서, 적어도 하나의 단량체의 Z 기는
화학식
Figure pct00039
, 또는
화학식
Figure pct00040
, 또는
화학식
Figure pct00041
으로 표현되는 (R)-배치이다.
소정의 구현예에서, 화학식의 각 단량체의 Z 기는 (R)-배치이다.
소정의 구현예에서, 적어도 하나의 단량체의 Z 기는
화학식
Figure pct00042
, 또는
화학식
Figure pct00043
, 또는
화학식
Figure pct00044
으로 표현되는 (S)-배치이다.
소정의 구현예에서, 화학식의 각 단량체의 Z 기는 (S)-배치이다.
소정의 구현예에서, T3는 H 또는 하이드록실 보호기이다. 소정의 구현예에서, T4는 H 또는 하이드록실 보호기이다. 추가의 구현예에서 T3는 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 단량체 하위단위에 부착된 뉴클레오사이드간 연결기이다. 소정의 구현예에서, T4는 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 또는 단량체 하위단위에 부착된 뉴클레오사이드간 연결기이다. 소정의 구현예에서, T3는 올리고뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드에 부착된 뉴클레오사이드간 연결기이다. 소정의 구현예에서, T4는 올리고뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드에 부착된 뉴클레오사이드간 연결기이다. 소정의 구현예에서, T3는 올리고머 화합물에 부착된 뉴클레오사이드간 연결기이다. 소정의 구현예에서, T4는 올리고머 화합물에 부착된 뉴클레오사이드간 연결기이다. 소정의 구현예에서, T3 및 T4 중 하나는 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트로부터 선택된 뉴클레오사이드간 연결기를 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는
화학식
Figure pct00045
, 또는
화학식
Figure pct00046
, 또는
화학식
Figure pct00047
의 적어도 두 개의 인접 단량체의 적어도 하나의 영역을 포함한다.
소정의 그러한 구현예에서, LNA는 하기 도시된 바와 같이, (A) α-L-메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') LNA, (B) β-D-메틸렌옥시(4'-CH2-O-2') LNA, (C) 에틸레녹시(4'-(CH2)2-O-2') LNA, (D) 아미노옥시(4'-CH2-O-N(R)-2') LNA 및 (E) 옥시아미노(4'-CH2-N(R)-O-2') LNA를 포함하나, 이로 한정되지 않는다:
Figure pct00048
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 상기 화학식의 적어도 두 개의 인접 단량체의 적어도 두 개의 영역을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 갭핑 모티프를 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 약 8개 내지 약 14개의 인접 β-D-2'-데옥시리보푸라노실 뉴클레오사이드의 적어도 하나의 영역을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 약 9개 내지 약 12개의 인접 β-D-2'-데옥시리보푸라노실 뉴클레오사이드의 적어도 하나의 영역을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 화학식의 적어도 하나(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상)의 (S)-cEt 단량체를 포함한다:
Figure pct00049
식에서, Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.
소정의 구현예에서, 단량체는 당 모방체를 포함한다. 소정의 그러한 구현예에서, 모방체는 당 또는 당-뉴클레오사이드간 결합 조합 대신에 사용되고, 뉴클레오베이스는 선택된 타겟에 혼성화를 위해 유지된다. 당 모방체의 대표적인 예는 사이클로헥세닐 또는 모르폴리노를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 당-뉴클레오사이드간 결합 조합을 위한 모방체의 대표적인 예는 펩타이드 핵산(PNA) 및 비하전된 비키랄 결합에 의해 연결된 모르폴리노 기를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 일부 예에서, 모방체는 뉴클레오베이스 대신에 사용된다. 대표적인 뉴클레오베이스 모방체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 트리사이클릭 페녹사진 유사체 및 보편적인 염기를 포함하나, 이로 한정되지 않는다(Berger et al., Nuc Acid Res. 2000, 28:2911-14, 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 당, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오베이스 모방체의 합성 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
핵산 변형(당간 결합)
단량체(변형 및 비변형 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드를 포함하나, 이로 한정되지 않음)를 함께 연결하고, 이에 의해 올리고머 화합물, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 연결기가 본원에 기재된다. 그러한 연결기는 또한 당간 결합으로 지칭된다. 두 가지 주요 부류의 연결기는 인 원자의 존재 또는 부재에 의해 정의된다. 대표적인 인 함유 결합은 포스포디에스테르(P=O), 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 포스포라미데이트, 및 포스포로티오에이트(P=S)를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 대표적인 비-인 함유 연결기는 메틸렌메틸이미노(-CH2-N(CH3)-O-CH2-), 티오디에스테르(-O-C(O)-S-), 티오노카르바메이트(-O-C(O)(NH)-S-); 실록산(-O-Si(H)2-O-); 및 N,N'-디메틸하이드라진(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 천연 포스포디에스테르 결합에 비해 변형된 결합은 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레아제 저항성을 변경하기 위해, 전형적으로 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 소정의 구현예에서, 키랄 원자를 갖는 결합은 별개의 거울상이성질체로서 라세미 혼합물로서 제조될 수 있다. 대표적인 키랄 결합은 알킬포스포네이트 및 포스포로티오에이트를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 인-함유 및 비-인-함유 결합의 제조 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
연결기에서 포스페이트 기는 산소 중 하나를 상이한 치환기로 치환함으로써 변형될 수 있다. 이러한 변형의 한 가지 결과는 핵산 분해에 대한 올리고뉴클레오타이드의 저항 증가일 수 있다. 변형된 포스페이트 기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 수소 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합에서 비-가교 포스페이트 산소 원자 중 하나는 임의의 다음으로 치환될 수 있다: S, Se, BR3(R은 수소, 알킬, 아릴임), C(즉, 알킬 기, 아릴 기 등), H, NR2(R은 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 아릴임), 또는 OR(R은 선택적으로 치환된 알킬 또는 아릴임). 비변형 포스페이트 기에서 인 원자는 비키랄성이다. 그러나, 상기 원자들 또는 원자들의 군들 중 하나로 비-가교 산소 중 하나를 치환하는 것은 인 원자를 키랄성으로 만드는데; 다시 말해서, 이러한 방식으로 변형된 포스페이트 기에서 인 원자는 입체발생 중심이다. 입체발생 인 원자는 "R" 배치(본원에서 Rp) 또는 "S" 배치(본원에서 Sp)를 지닐 수 있다.
포스포로디티오에이트는 황으로 치환된 둘 모두의 비-가교 산소를 갖는다. 포스포로디티오에이트에서 인 중심은 올리고뉴클레오타이드 부분입체이성질체의 형성을 배제하는 비키랄성이다. 따라서, 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 키랄 중심을 제거하는, 둘 모두의 비-가교 산소에 대한 변형, 예를 들어, 포스포로디티오에이트 형성은 이들이 부분입체이성질체 혼합을 생성시킬 수 없다는 점에서 바람직할 수 있다. 따라서, 비-가교 산소는 독립적으로 O, S, Se, B, C, H, N, 또는 OR(R은 알킬 또는 아릴임) 중 어느 하나일 수 있다.
포스페이트 링커는 또한 질소(가교된 포스포로아미데이트), 황(가교된 포스포로티오에이트) 및 탄소(가교된 메틸렌포스포네이트)로의 가교 산소(즉, 단량체의 당에 포스페이트를 연결하는 산소) 치환에 의해 변형될 수 있다. 치환은 연결 산소 중 하나 또는 둘 모두의 연결 산소에서 발생할 수 있다. 가교 산소가 뉴클레오사이드의 3'-산소인 경우, 탄소로의 치환이 바람직하다. 가교 산소가 뉴클레오사이드의 5'-산소인 경우, 질소로의 치환이 바람직하다.
포스페이트에 연결된 산소 중 적어도 하나가 치환되거나 포스페이트 기가 비-인 기로 치환된 변형된 포스페이트 결합은 또한 "비-포스포디에스테르 당간 결합" 또는 "비-포스포디에스테르 링커"로 지칭된다.
소정의 구현예에서, 포스페이트 기는 비-인 함유 커넥터, 예를 들어, 탈포스포 링커로 치환될 수 있다. 탈포스포 링커는 또한 본원에서 비-포스포디에스테르 링커로 지칭된다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 하전된 포스포디에스테르 기는 핵산 분해에서 반응 중심이기 때문에, 중성 구조적 모방체로의 이의 치환은 뉴클레아제 안정성 향상을 제공할 것으로 사료된다. 다시, 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 일부 구현예에서, 하전된 포스페이트 기가 중성 모이어티로 치환되는 변경을 도입하는 것이 바람직할 수 있다.
포스페이트 기를 치환할 수 있는 모이어티의 예는 아미드(예를 들어, 아미드-3(3'-CH2-C(=O)-N(H)-5') 및 아미드-4-(3'-CH2-N(H)-C(=O)-5')), 하이드록실아미노, 실록산(디알킬실록산), 카르복사미드, 카르보네이트, 카르복시메틸, 카르바메이트, 카르복실레이트 에스테르, 티오에테르, 에틸렌 옥사이드 링커, 설파이드, 설포네이트, 설폰아미드, 설포네이트 에스테르, 티오포르마세탈(3'-S-CH2-O-5'), 포르마세탈(3'-O-CH2-O-5'), 옥심, 메틸렌이미노, 메티켄카르보닐아미노, 메틸렌메틸이미노(MMI, 3'-CH2-N(CH3)-O-5'), 메틸렌하이드라조, 메틸렌디메틸하이드라조, 메틸렌옥시메틸이미노, 에테르(C3'-O-C5'), 티오에테르(C3'-S-C5'), 티오아세트아미도(C3'-N(H)-C(=O)-CH2-S-C5', C3'-O-P(O)-O-SS-C5', C3'-CH2-NH-NH-C5', 3'-NHP(O)(OCH3)-O-5' 및 3'-NHP(O)(OCH3)-O-5' 및 혼합 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 함유하는 비이온성 결합을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 예를 들어, 문헌[Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi and P.D. Cook Eds. ACS Symposium Series 580; 챕터 3 및 4, (pp. 40-65)]을 참조하라. 바람직한 구현예는 메틸렌메틸이미노(MMI), 메틸렌카르보닐아미노, 아미드, 카르바메이트 및 에틸렌 옥사이드 링커를 포함한다.
당업자는 특정 예에서 비-가교 산소의 치환이 이웃하는 2'-OH에 의한 당간 결합의 분해 향상을 야기할 수 있고, 따라서, 다수 예에서 비-가교 산소의 변형은 2'-OH의 변형, 예를 들어, 이웃하는 당간 결합, 예를 들어, 아라비노스 당, 2'-O-알킬, 2'-F, LNA 및 ENA의 분해에 관여하지 않는 변형을 필요로 할 수 있다는 것을 잘 알고 있다.
바람직한 비-포스포디에스테르 당간 결합은 포스포로티오에이트, 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상의 거울상이성질체 과량의 Sp 이성질체를 갖는 포스포로티오에이트, 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상의 거울상이성질체 과량의 Rp 이성질체를 갖는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리오에스테르, 알킬-포스포네이트(예를 들어, 메틸-포스포네이트), 셀레노포스페이트, 포스포라미데이트(예를 들어, N-알킬포스포라미데이트), 및 보라노포스페이트를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 적어도 하나(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상 및 최대 모두 포함)의 변형 또는 비포스포디에스테르 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 적어도 하나(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상 및 최대 모두 포함)의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다.
포스페이트 링커 및 당이 뉴클레아제 저항성 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 서로게이트로 치환된 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제가 또한 구성될 수 있다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 반복적으로 하전된 백본의 부재는 폴리음이온을 인식하는 단백질(예를 들어, 뉴클레아제)에 대한 결합을 감소시키는 것으로 사료된다. 다시, 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 일부 구현예에서, 염기가 중성 서로게이트 백본에 의해 테터링되는 변경을 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 예로는 모르폴리노, 사이클로부틸, 피롤리딘, 펩타이드 핵산(PNA), 아미노에틸글리실 PNA(aegPNA) 및 백본-연장 피롤리딘 PNA(bepPNA) 뉴클레오사이드 서로게이트가 포함된다. 바람직한 서로게이트는 PNA 서로게이트이다.
본원에 기재된 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하나 이상의 비대칭 중심을 함유하고, 이에 따라 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 및 절대 입체화학 측면에서 (R) 또는 (S)로서, 예컨대, 아미노산의 등의 경우와 같이 당 아노머의 경우, (D) 또는 (L)로서 규정될 수 있는 다른 입체이성질체 구성을 야기할 수 있다. 본원에 제공된 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제에는 모든 그런한 가능한 이성질체, 뿐만 아니라 이들의 라세미 및 광학적으로 순수한 형태가 포함된다.
핵산 변형(말단 변형)
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 안티센스 가닥의 5'-말단에 포스페이트 또는 포스페이트 모방체를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 포스페이트 모방체는 5'-비닐 포스포네이트(VP)이다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제의 안티센스 가닥의 5'-말단은 5'-비닐 포스포네이트 (VP)를 함유하지 않는다.
본 발명의 iRNA 제제의 말단은 변형될 수 있다. 그러한 변형은 하나의 말단 또는 양 말단에서일 수 있다. 예를 들어, iRNA의 3' 및/또는 5' 말단은 다른 작용성 분자 엔터티, 예컨대, 표지 모이어티, 예를 들어, 형광단(예를 들어, 피렌, TAMRA, 플루오레세인, Cy3 또는 Cy5 염료) 또는 보호기(예를 들어, 황, 규소, 붕소 또는 에스테르 기반)에 접합될 수 있다. 작용성 분자 엔터티는 포스페이트 기 및/또는 링커를 통해 당에 부착될 수 있다. 링커의 말단 원자는 포스페이트 기 또는 당의 C-3' 또는 C-5' O, N, S 또는 C 기의 연결 원자에 연결하거나 이를 치환할 수 있다. 대안적으로, 링커는 뉴클레오타이드 서로게이트(예를 들어, PNA)의 말단 원자에 연결하거나 이를 치환할 수 있다.
링커/포스페이트-작용성 분자 엔터티-링커/포스페이트 배열이 이중 가닥 올리고머 화합물의 두 가닥 사이에 삽입되는 경우, 이러한 배열은 헤어핀-타입 올리고머 화합물에서 헤어핀 루프에 대한 대체일 수 있다.
활성을 조절하는 데 유용한 말단 변형은 포스페이트 또는 포스페이트 유사체로의 iRNA의 5' 말단 변형을 포함한다. 소정의 구현예에서, iRNA의 5' 말단은 포스포릴화되거나 포스포릴 유사체를 포함한다. 예시적인 5'-포스페이트 변형은 RISC 매개 유전자 사일런싱과 상용성인 것들을 포함한다. 5'-종결 말단에서의 변형은 또한 피험자의 면역계를 자극하거나 억제하는 데 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고머 화합물의 5'-말단은 변형
Figure pct00050
를 포함하고, 여기서 W, X 및 Y는 각각 독립적으로 O, OR(R은 수소, 알킬, 아릴임), S, Se, BR3(R은 수소, 알킬, 아릴임), BH3 -, C(즉, 알킬 기, 아릴 기 등), H, NR2(R은 수소, 알킬, 아릴임), 또는 OR(R은 수소, 알킬 또는 아릴임)로 이루어진 군으로부터 선택되고; A 및 Z는 각각 독립적으로 각 경우에 부재, O, S, CH2, NR(R은 수소, 알킬, 아릴임), 또는 선택적으로 치환된 알킬렌이고, 여기서 알킬렌의 백본은 내부적으로 및/또는 말단에서 O, S, SS 및 NR(R은 수소, 알킬, 아릴임) 중 하나 이상을 포함할 수 있고; n은 0 내지 2이다. 일부 구현예에서, n은 1 또는 2이다. A는 당의 5' 탄소에 연결된 산소를 치환하는 것으로 이해된다. n이 0일 때, W 및 Y는 이들이 부착되는 P와 함께 선택적으로 치환된 5원 내지 8원 헤테로사이클릭을 형성할 수 있고, 여기서 W 및 Y는 각각 독립적으로 O, S, NR' 또는 알킬렌이다. 바람직하게는, 헤테로사이클릭은 아릴 또는 헤테로아릴로 치환된다. 일부 구현예에서, 5'-말단 뉴클레오타이드의 C5'에서 수소 중 하나 또는 둘 모두는 할로겐, 예를 들어, F로 치환된다.
예시적인 5'-변형은 5'-모노포스페이트((HO)2(O)P-O-5'); 5'-디포스페이트 ((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-트리포스페이트((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-모노티오포스페이트(포스포로티오에이트; (HO)2(S)P-O-5'); 5'-모노디티오포스페이트(포스포로디티오에이트; (HO)(HS)(S)P-O-5'), 5'-포스포로티올레이트((HO)2(O)P-S-5'); 5'-알파-티오트리포스페이트; 5'-베타-티오트리포스페이트; 5'-감마-티오트리포스페이트; 5'-포스포라미데이트((HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5')를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 다른 5'-변형은 5'-알킬포스포네이트(R(OH)(O)P-O-5', R=알킬, 예를 들어, 메틸, 에틸, 이소프로필, 프로필 등임), 5'-알킬에테르포스포네이트(R(OH)(O)P-O-5'(R=알킬에테르, 예를 들어, 메톡시메틸(CH2OMe), 에톡시메틸 등임)을 포함한다. 다른 예시적인 5'-변형은 Z가 적어도 1회 선택적으로 치환된 알킬인 경우, 예를 들어, ((HO)2(X)P-O[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5', ((HO)2(X)P-O[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5', ((HO)2(X)P-[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5'; 디알킬 말단 포스페이트 및 포스페이트 모방체: HO[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5', H2N[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5', H[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5', Me2N[-(CH2)a-O-P(X)(OH)-O]b-5', HO[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5', H2N[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5', H[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5', Me2N[-(CH2)a-P(X)(OH)-O]b-5'를 포함하고, 여기서 a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 10이다. 다른 구현예는 BH3, BH3 - 및/또는 Se로의 산소 및/또는 황의 치환을 포함한다.
말단 변형은 또한 분포를 모니터링하는 데 유용할 수 있고, 그러한 경우에 첨가될 바람직한 기는 형광단, 예를 들어, 플루오레세인 또는 Alexa 염료, 예를 들어, Alexa 488을 포함한다. 말단 변형은 또한 흡수를 향상시키는 데 유용할 수 있으며, 이에 유용한 변형은 타겟화 리간드를 포함한다. 말단 변형은 또한 또 다른 모이어티에 올리고뉴클레오타이드를 가교시키는 데 유용할 수 있으며; 이에 유용한 변형은 미토마이신 C, 프소라렌, 및 이의 유도체를 포함한다.
열적 탈안정화 변형
본 발명의 화합물, 예컨대, iRNA 또는 dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 씨드 영역(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 2번 내지 8번 위치)에 반대되는 부위에서 센스 가닥에 열적 탈안정화 변형을 도입함으로써 iRNA 듀플렉스의 해리 또는 용융 경향성을 증가시켜(듀플렉스 회합의 자유 에너지를 감소시켜) RNA 간섭에 대해 최적화될 수 있다. 상기 변형은 듀플렉스가 안티센스 가닥의 씨드 영역에서 해리하거나 용융하는 경향성을 증가시킬 수 있다.
열적 탈안정화 변형에는 무염기 변형; 대항하는 가닥에서 대항하는 뉴클레오타이드와의 미스매치; 및 당 변형, 예컨대 2'-데옥시 변형 또는 비사이클릭 뉴클레오타이드, 예를 들어 비잠김 핵산(UNA) 또는 글리세롤 핵산(GNA)이 포함될 수 있다.
예시되는 무염기 변형은 다음과 같다:
Figure pct00051
예시되는 당 변형은 다음과 같다:
Figure pct00052
용어 "비사이클릭 뉴클레오타이드"는 비사이클릭 리보스 당을 갖는 임의의 뉴클레오타이드를 나타낸다, 예를 들어 리보스 탄소 간 임의의 결합(예를 들어, C1'-C2', C2'-C3', C3'-C4', C4'-O4', 또는 C1'-O4')이 부재하고/하거나 1개 이상의 리보스 탄소 또는 산소(예를 들어, C1', C2', C3', C4' 또는 O4')가 독립적으로 또는 조합으로 뉴클레오타이드에 부재한다. 일부 구현예에서, 비사이클릭 뉴클레오타이드는
Figure pct00053
Figure pct00054
이고, B는 변형 또는 비변형 뉴클레오베이스이고, R1 및 R2는 독립적으로 H, 할로겐, OR3, 또는 알킬이고; R3은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당이다). 용어 "UNA"는 비잠김 비사이클릭 핵산을 나타내며, 임의의 당 결합이 제거되어 비잠김 "당" 잔기를 형성한다. 일 예에서, UNA는 또한 C1'-C4' 간 결합(즉, C1' 및 C4' 탄소 간 공유 탄소-산소-탄소 결합)이 제거된 단량체를 포괄한다. 또 다른 예에서, 당의 C2'-C3' 결합(즉, C2' 및 C3' 탄소 간 공유 탄소-탄소 결합)이 제거된다(문헌[Mikhailov et. al., Tetrahedron Letters, 26 (17): 2059 (1985); 및 Fluiter et al., Mol. Biosyst., 10: 1039 (2009)] 참고, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 비사이클릭 유도체는 왓슨-크릭 쌍 형성에 영향을 미치지 않고 더 큰 백본 유연성을 제공한다. 비사이클릭 뉴클레오타이드는 2'-5' 또는 3'-5' 결합을 통해 연결될 수 있다.
용어 'GNA'는 DNA 또는 RNA와 유사하지만 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 반복 글리세롤 단위로 이루어진다는 점에서 그 "백본"의 조성이 상이한 중합체인 글리콜 핵산을 나타낸다:
Figure pct00055
열적 탈안정화 변형은 dsRNA 듀플렉스 내 대항하는 가닥에서 열적 탈안정화 뉴클레오타이드 및 대항하는 뉴클레오타이드 간 미스매치(즉, 비상보적 염기쌍)일 수 있다. 예시적인 미스매치 염기쌍에는 G:G, G:A, G:U, G:T, A:A, A:C, C:C, C:U, C:T, U:U, T:T, U:T, 또는 이들의 조합이 포함된다. 당분야에 공지된 다른 미스매치 염기쌍도 본 발명에 적합하다. 미스매치는 천연 생성 뉴클레오타이드 또는 변형 뉴클레오타이드인 뉴클레오타이드 간에 발생할 수 있다, 즉 미스매치 염기쌍 형성은 뉴클레오타이드의 리보스 당의 변형과 무관하게 각각의 뉴클레오타이드로부터의 뉴클레오베이스 간에 발생할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 화합물, 예컨대, siRNA 또는 iRNA 제제는 2'-데옥시 뉴클레오베이스인 미스매치 쌍 형성에 1개 이상의 뉴클레오베이스를 함유한다; 예를 들어, 2'-데옥시 뉴클레오베이스가 센스 가닥에 있다.
무염기 뉴클레오타이드, 비사이클릭 뉴클레오타이드 변형(UNA 및 GNA 포함), 및 미스매치 변형의 더 많은 예는 WO 2011/133876에 상세히 기재되어 있으며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
열적 탈안정화 변형에는 또한 대항하는 염기와 수소 결합을 형성하는 능력이 감소되거나 폐지된 범(universal) 염기, 및 포스페이트 변형이 포함될 수 있다.
반대 가닥에서의 염기와 수소 결합을 형성하는 능력이 손상되거나 완전 폐지된 뉴클레오베이스 변형이 WO 2010/0011895에 기재된 dsRNA 듀플렉스의 중심 영역의 탈안정화에 대해 평가되었으며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 예시적인 뉴클레오베이스 변형은 다음과 같다:
Figure pct00056
천연 포스포디에스테르 결합 대비 dsRNA 듀플렉스의 열적 안정성을 감소시키는 것으로 공지된 예시적인 포스페이트 변형은 다음과 같다:
Figure pct00057
일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 2'-5' 결합(2'-H, 2'-OH 및 2'-OMe 포함 및 P=O 또는 P=S 포함)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2'-5' 결합 변형은 뉴클레아제 저항성을 촉진하기 위해 또는 안티센스 가닥에 대한 센스의 결합을 억제하기 위해 이용될 수도 있고, 또는 RISC에 의한 센스 가닥 활성화를 회피하기 위해 센스 가닥의 5' 말단에서 이용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 화합물은 L 당(예를 들어, 2'-H, 2'-OH 및 2'-OMe 포함 L 리보스, L-아라비노스)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 L 당 변형은 뉴클레아제 저항성을 촉진하기 위해 또는 안티센스 가닥에 대한 센스의 결합을 억제하기 위해 이용될 수도 있고, 또는 RISC에 의한 센스 가닥 활성화를 회피하기 위해 센스 가닥의 5' 말단에서 이용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 iRNA 제제는 담체를 통해 리간드에 접합되며, 담체는 사이클릭기 또는 비-사이클릭기일 수 있으며; 바람직하게는, 사이클릭기는 피로릴디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔란, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸릴 및 데칼린으로부터 선택되며; 바람직하게는, 비-사이클릭기는 세리놀 백본 또는 디에탄올아민 백본으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 본 발명의 iRNA 제제의 적어도 하나의 가닥은 5' 인산화되거나 5' 프라임 말단에 포스포릴 유사체가 포함된다. 5'-포스페이트 변형에는 RISC 매개 유전자 사일런싱과 상용성인 것들이 포함된다. 적합한 변형에는 5'-모노포스페이트((HO)2(O)P-O-5'); 5'-디포스페이트((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-트리포스페이트((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-구아노신 캡(7-메틸화 또는 비-메틸화)(7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-아데노신 캡(Appp), 및 임의의 변형 또는 비변형 뉴클레오타이드 캡 구조(N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-모노티오포스페이트(포스포로티오에이트; (HO)2(S)P-O-5'); 5'-모노디티오포스페이트(포스포로디티오에이트; (HO)(HS)(S)P-O-5'), 5'-포스포로티올레이트((HO)2(O)P-S-5'); 산소/황이 대체된 모노포스페이트, 디포스페이트 및 트리포스페이트의 임의의 추가 조합(예를 들어, 5'-알파-티오트리포스페이트, 5'-감마-티오트리포스페이트 등), 5'-포스포로아미데이트((HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5'), 5'-알킬포스포네이트(R=알킬=메틸, 에틸, 이소프로필, 프로필 등, 예를 들어 RP(OH)(O)-O-5'-, 5'-알케닐포스포네이트(즉, 비닐, 치환 비닐), (OH)2(O)P-5'-CH2-), 5'-알킬에테르포스포네이트(R=알킬에테르=메톡시메틸(MeOCH2-), 에톡시메틸 등, 예를 들어 RP(OH)(O)-O-5'-)가 포함된다.
타겟 유전자
제한 없이, siRNA를 위한 타겟 유전자는 원치 않는 세포 증식을 촉진하는 유전자, 성장 인자 유전자, 성장 인자 수용체 유전자, 키나제를 발현하는 유전자, 어댑터 단백질 유전자, G 단백질 수퍼 패밀리 분자를 코딩하는 유전자, 전사 인자를 코딩하는 유전자, 혈관신생을 매개하는 유전자, 바이러스 유전자, 바이러스 복제에 필요한 유전자, 바이러스 기능을 매개하는 세포 유전자, 세균성 병원체의 유전자, 아메바성 병원체의 유전자, 기생성 병원체의 유전자, 진균 병원체의 유전자, 원치 않는 면역 반응을 매개하는 유전자, 통증의 프로세싱을 매개하는 유전자, 신경 질환을 매개하는 유전자, 이형접합의 손실로 특성규명되는 세포에서 발견되는 대립 유전자, 또는 다형성 유전자의 하나의 대립 유전자를 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
siRNA를 위한 특정의 예시적인 타겟 유전자는 PCSK-9, ApoC3, AT3, AGT, ALAS1, TMPR, HAO1, AGT, C5, CCR-5, PDGF 베타 유전자; Erb-B 유전자, Src 유전자; CRK 유전자; GRB2 유전자; RAS 유전자; MEKK 유전자; JNK 유전자; RAF 유전자; Erk1/2 유전자; PCNA(p21) 유전자; MYB 유전자; c-MYC 유전자; JUN 유전자; FOS 유전자; BCL-2 유전자; 사이클린 D 유전자; VEGF 유전자; EGFR 유전자; 사이클린 A 유전자; 사이클린 E 유전자; WNT-1 유전자; 베타-카테닌 유전자; c-MET 유전자; PKC 유전자; NFKB 유전자; STAT3 유전자; 서바이빈 유전자; Her2/Neu 유전자; 토포이소머라제 I 유전자; 토포이소머라제 II 알파 유전자; p73 유전자; p21(WAF1/CIP1) 유전자, p27(KIP1) 유전자; PPM1D 유전자; 카베올린 I 유전자; MIB I 유전자; MTAI 유전자; M68 유전자; 종양 억제 유전자; p53 유전자; DN-p63 유전자; pRb 종양 억제 유전자; APC1 종양 억제 유전자; BRCA1 종양 억제 유전자; PTEN 종양 억제 유전자; MLL 융합 유전자, 예를 들어, MLL-AF9, BCR/ABL 융합 유전자; TEL/AML1 융합 유전자; EWS/FLI1 융합 유전자; TLS/FUS1 융합 유전자; PAX3/FKHR 융합 유전자; AML1/ETO 융합 유전자; 알파 v-인테그린 유전자; Flt-1 수용체 유전자; 튜불린 유전자; 인간 유두종 바이러스 유전자, 인간 유두종 바이러스 복제에 필요한 유전자, 인간 면역결핍 바이러스 유전자, 인간 면역결핍 바이러스 복제에 필요한 유전자, A형 간염 바이러스 유전자, A형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, B형 간염 바이러스 유전자, B형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, C형 간염 바이러스 유전자, C형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, D형 간염 바이러스 유전자, D형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, E형 간염 바이러스 유전자, E형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, F형 간염 바이러스 유전자, F형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, G형 간염 바이러스 유전자, G형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, H형 간염 바이러스 유전자, H형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, 호흡기 세포융합 바이러스 유전자, 호흡기 세포융합 바이러스 복제에 필요한 유전자, 단순 헤르페스 바이러스 유전자, 단순 헤르페스 바이러스 복제에 필요한 유전자, 헤르페스 거대세포바이러스 유전자, 헤르페스 거대세포바이러스 복제에 필요한 유전자, 헤르페스 엡스타인 바 바이러스 유전자, 헤르페스 엡스타인 바 바이러스 복제에 필요한 유전자, 카포시 육종-관련 헤르페스 바이러스 유전자, 카포시 육종-관련 헤르페스 바이러스 복제에 필요한 유전자, JC 바이러스 유전자, JC 바이러스 복제에 필요한 유전자, 믹소 바이러스 유전자, 믹소 바이러스 유전자 복제에 필요한 유전자, 리노바이러스 유전자, 리노바이러스 복제에 필요한 유전자, 코로나바이러스 유전자, 코로나바이러스 복제에 필요한 유전자, 웨스트 나일 바이러스 유전자, 웨스트 나일 바이러스 복제에 필요한 유전자, 세인트 루이스 뇌염 유전자, 세인트 루이스 뇌염 복제에 필요한 유전자, 진드기-매개 뇌염 바이러스 유전자, 진드기-매개 뇌염 바이러스 복제에 필요한 유전자, 무레이 밸리 뇌염 바이러스 유전자, 무레이 밸리 뇌염 바이러스 복제에 필요한 유전자, 뎅기 바이러스 유전자, 뎅기 바이러스 유전자 복제에 필요한 유전자, 시미안 바이러스 40 유전자, 시미안 바이러스 40 복제에 필요한 유전자, 인간 T 세포 림프영양성 바이러스 유전자, 인간 T 세포 림프영양성 바이러스 복제에 필요한 유전자, 몰로니-뮤린 백혈병 바이러스 유전자, 몰로니-뮤린 백혈병 바이러스 복제에 필요한 유전자, 뇌척수심근염 바이러스 유전자, 뇌척수심근염 바이러스 복제에 필요한 유전자, 홍역 바이러스 유전자, 홍역 바이러스 복제에 필요한 유전자, 수두 대상포진 바이러스 유전자, 수두 대상포진 바이러스 복제에 필요한 유전자, 아데노바이러스 유전자, 아데노바이러스 복제에 필요한 유전자, 황열 바이러스 유전자, 황열 바이러스 복제에 필요한 유전자, 폴리오바이러스 유전자, 폴리오바이러스 복제에 필요한 유전자, 폭스바이러스 유전자, 폭스바이러스 복제에 필요한 유전자, 말라리아원충 유전자, 말라리아원충 유전자 복제에 필요한 유전자, 마이코박테륨 울세란스 유전자, 마이코박테륨 울세란스 복제에 필요한 유전자, 마이코박테륨 튜버큐로시스 유전자, 마이코박테륨 튜버큐로시스 복제에 필요한 유전자, 마이코박테륨 레프라에 유전자, 마이코박테륨 레프라에 복제에 필요한 유전자, 스타필로코쿠스 아우레우스 유전자, 스타필로코쿠스 아우레우스 복제에 필요한 유전자, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 유전자, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 복제에 필요한 유전자, 스트렙토코쿠스 피오게네스 유전자, 스트렙토코쿠스 피오게네스 복제에 필요한 유전자, 클라미디아 뉴모니아에 유전자, 클라미디아 뉴모니아에 복제에 필요한 유전자, 마이코플라스마 뉴모니아에 유전자, 마이코플라스마 뉴모니아에 복제에 필요한 유전자, 인테그린 유전자, 셀렉틴 유전자, 보체계 유전자, 케모카인 유전자, 케모카인 수용체 유전자, GCSF 유전자, Gro1 유전자, Gro2 유전자, Gro3 유전자, PF4 유전자, MIG 유전자, 프로-혈소판 염기성 단백질 유전자, MIP-1I 유전자, MIP-1J 유전자, RANTES 유전자, MCP-1 유전자, MCP-2 유전자, MCP-3 유전자, CMBKR1 유전자, CMBKR2 유전자, CMBKR3 유전자, CMBKR5v, AIF-1 유전자, I-309 유전자, 이온 통로의 성분으로의 유전자, 신경전달물질 수용체로의 유전자, 신경전달물질 리간드로의 유전자, 아밀로이드-패밀리 유전자, 프레세닐린 유전자, HD 유전자, DRPLA 유전자, SCA1 유전자, SCA2 유전자, MJD1 유전자, CACNL1A4 유전자, SCA7 유전자, SCA8 유전자, 이형접합(LOH) 세포의 손실에서 발견되는 대립 유전자, 다형성 유전자의 하나의 대립 유전자 및 이들의 조합을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
이형접합(LOH)의 손실은 LOH의 부위에서 서열, 예를 들어, 유전자에 대한 반접합성을 야기할 수 있다. 이는 정상 세포와 질병-상태 세포, 예를 들어, 암 세포 간에 상당한 유전적 차이를 초래할 수 있으며, 정상 세포와 질병-상태 세포, 예를 들어, 암 세포 간에 유용한 차이를 제공한다. 이러한 차이는 유전자 또는 다른 서열이 이배체 세포에서는 이형접합성이지만 LOH를 갖는 세포에서는 반접합성이기 때문에 발생할 수 있다. LOH의 영역은 흔히 손실로 원치 않는 증식을 촉진하는 유전자, 예를 들어, 종양 억제 유전자, 및 예를 들어 다른 유전자, 일부 경우에 정상 기능, 예를 들어, 성장에 필수적인 유전자를 포함하는 다른 서열을 포함할 것이다. 본 발명의 방법은, 부분적으로, 본 발명의 조성물로 필수 유전자의 하나의 대립 유전자의 특이적 조절에 의존한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 마이크로-RNA를 조절하는 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제를 제공한다.
타겟화 CNS
일부 구현예에서, 본 발명은 조발성 가족성 알츠하이머병을 위한 APP, 척수소뇌성 실조증 2 및 ALS를 위한 ATXN2, 및 근위축성 축삭 경화증 및 전측두엽 치매를 위한 C9orf72를 타겟화하는 이중-가닥 iRNA 제제를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 ALS를 위한 TARDBP, 전측두엽 치매를 위한 MAPT(Tau), 및 헌팅턴병을 위한 HTT를 타겟화하는 이중-가닥 iRNA 제제를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 파킨슨병을 위한 SNCA, ALS를 위한 FUS, 척수소뇌성 실조증 3를 위한 ATXN3, SCA1을 위한 ATXN1, SCA7 및 SCA8를 위한 유전자, DRPLA를 위한 ATN1, XLMR을 위한 MeCP2, 프라이온병, 퇴행성 CNS 장애: 라포라병을 위한 PRNP, DM1(CNS 및 골격근)을 위한 DMPK, 및 hATTR(CNS, 안구 및 전신)을 위한 TTR을 타겟화하는 이중-가닥 iRNA 제제를 제공한다.
척수소뇌성 실조증은 유전성 뇌-기능 장애이다. SCA1-8과 같이 주로 유전되는 형태의 척수소뇌성 실조증은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 장애이다. 예시적인 타겟은 SCA2, SCA3, 및 SCA1을 포함한다.
SCA2를 위한 ATXN2 타겟화
척수소뇌성 실조증 2(SCA2)는 진행성 실조증으로서 두 번째로 가장 흔한 SCA이다. 이러한 타겟과 관련된 또 다른 질환은 근위축성 축삭 경화증(ALS)이다. 이러한 질환은 쇠약해지고 결국에는 치명적이 되는 질환-조절 요법이 없는 질환이다. SCA의 유병률은 100,000명 당 2명 내지 6명이고; ATXN2는 전 세계 SCA 인구의 15%를 유발하고, 일부 국가, 특히 쿠바(100,000명 당 40명)에서 훨씬 더 많은 SCA 인구를 유발하고 있다. ATXN2를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어 ATXN2에서 코딩 CAG 반복 확장은 척수, 뇌간 또는 소뇌와 같은 조직에서 가족성 및 산발성 SCA 및 ALS에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 ATXN2의 상염색체 우성 코딩 CAG 확장이 독성의 미스폴딩된 단백질의 발현 및 푸르키네 세포 및 뉴런 사멸을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 ATXN2 mRNA의 70% 녹다운(KD)으로 나타났으며; mATXN2 마우스 KD POC가 입증되었다. 안전성과 관련하여, mATXN2 녹아웃(KO) 마우스는 건강한 것으로 보고되었다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF CAG mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.
SCA3를 위한 ATXN3 타겟화
척수소뇌성 실조증 3(SCA3)는 진행성 실조증으로서 전 세계에서 가장 흔한 SCA이다. 이러한 질환은 쇠약해지고 결국에는 치명적이 되는 질환-조절 요법이 없는 질환이다. 이는 SCA의 가장 흔한 원인이며, SCA의 유병률은 100,000명 당 2명 내지 6명이고; ATXN3은 미국에서 SCA 인구의 21%를 유발하고, 유럽, 특히, 포르투갈에서 훨씬 더 많이 발생한다. ATXN3 타겟화는 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, ATXN3에서 코딩 CAG 반복 확장은 척수, 뇌간 또는 소뇌와 같은 조직에 가족성 및 산발성 SCA에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 ATXN3의 상염색체 우성 코딩 CAG 확장이 독성의 미스폴딩된 단백질의 발현 및 푸르키네 세포 및 뉴런 사멸을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 ATXN3 mRNA의 70% KD로 나타났으며; mATXN3 마우스 KD POC가 입증되었다. 안전성과 관련하여, mATXN3 KO 마우스는 건강한 것으로 보고되었다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF CAG mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.
SCA1를 위한 ATXN1 타겟화
척수소뇌성 실조증 1(SCA1)은 진행성 실조증으로서 1993년에 발견된 첫 번째 SCA 유전자이다. 이러한 질환은 쇠약해지고 결국에는 치명적이 되는 질환-조절 요법이 없는 질환이다. SCA의 유병률은 100,000명 당 2명 내지 6명이고; ATXN1은 미국과 전 세계에서 SCA 인구의 6%를 유발하며, 일부 국가(일본에서 25%), 특히 폴란드(64%) 및 시베리아(100%)에서는 훨씬 더 많다. ATXN1을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어 ATXN1에서 코딩 CAG 반복 확장은 척수, 뇌간 또는 소뇌와 같은 조직에 가족성 및 산발성 SCA에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 ATXN1의 상염색체 우성 코딩 CAG 확장이 독성의 미스폴딩된 단백질의 발현 및 푸르키네 세포 및 뉴런 사멸을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 ATXN1 mRNA의 70% KD로 나타났으며; mATXN1 마우스 POC가 입증되었다. 안전성과 관련하여, mATXN1 KO 마우스는 건강한 것으로 보고되었다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF CAG mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.
SCA7를 위한 ATXN7 타겟화
척수소뇌성 실조증 7(SCA7)은 진행성 운동 실조와 망막 변성을 유발한다. 이러한 질환은 쇠약해지고 결국에는 치명적인 망막 및 소뇌 장애가 되는 질환-조절 요법이 없는 질환이다. SCA의 유병률은 100,000명 당 2명 내지 6명이고; ATXN7는 전 세계 SCA 인구의 5%를 유발하고, 일부 국가, 특히 남아프리카에서는 훨씬 더 많다. ATXN7을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, ATXN7에서 코딩 CAG 반복 확장은 척수, 뇌간, 소뇌 또는 망막과 같은 조직에 가족성 및 산발성 SCA에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 ATXN1의 상염색체 우성 코딩 CAG 확장이 독성의 미스폴딩된 단백질의 발현, 추체-간체 이영양증 유발, 및 푸르키네 세포 및 뉴런 치사를 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 척수강내(IT) 및 유리체내(IVT) 투여를 통해 ATXN1 mRNA의 70% KD로 나타났다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF CAG mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.
SCA8를 위한 ATXN8 타겟화
척수소뇌성 실조증 8(SCA8)은 진행성 신경퇴행성 실조증으로서 ATXN8에서 CTG 반복 확장에 의해 초래된다. 이러한 질환은 쇠약해지고 결국에는 치명적이 되는 질환-조절 요법이 없는 질환이다. SCA의 유병률은 100,000명 당 2명 내지 6명이고; ATXN8은 전 세계 SCA 인구의 3%를 유발하고, 일부 국가, 특히 필란드에서는 훨씬 더 많다. ATXN8을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, ATXN8에서 코딩 CTG 반복 확장은 척수, 뇌간 또는 소뇌와 같은 조직에 가족성 및 산발성 SCA에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 ATXN8의 상염색체 우성 코딩 CTG 확장이 독성의 미스폴딩된 단백질의 발현, 푸르키네 세포 유발 및 뉴런 치사를 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 ATXN8 mRNA의 70% KD로 나타났다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF CTG mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.
SCA6을 위한 CACNA1A 타겟화
척수소뇌성 실조증 6(SCA6)은 진행성 실조증이다. 이러한 질환은 쇠약해지고 결국에는 치명적이 되는 질환-조절 요법이 없는 질환이다. SCA의 유병률은 100,000명 당 2명 내지 6명이고; CACNA1A는 전 세계 SCA 인구의 15%를 유발한다. CACNA1A을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, CACNA1A에서 코딩 CAG 반복 확장은 척수, 뇌간 또는 소뇌와 같은 조직에 가족성 및 산발성 SCA에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 CACNA1A의 상염색체 우성 코딩 CAG 확장이 독성의 미스폴딩된 단백질의 발현 및 푸르키네 세포 및 뉴런 사멸을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 CACNA1A CAG 발현의 70% KD로 나타났다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF CAG mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.
유전성 폴리글루타민 장애에 대한 예시적인 타겟은 헌팅턴병(HD)을 포함한다.
헌팅턴병을 위한 HTT 타겟화
헌팅턴 돌연변이는 진행성 CNS 퇴행성 질환인 HD를 유발한다. 이러한 질환은 쇠약해지고 결국에는 치명적이 되는 질환-조절 요법이 없는 질환이다. HD의 유병률은 전 세계에서 100,000명 당 5명 내지 10명이며, 특정 국가, 특히 베네수엘라에서는 훨씬 더 흔하다. HTT를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, HTT에서 코딩 CAG 반복 확장은 선조체, 또는 피질과 같은 조직에 가족성 및 산발성 HD에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 HTT의 상염색체 우성 코딩 CAG 확장이 독성의 미스폴딩 단백질의 발현 및 뉴런 사멸을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 HTT CAG 확장에서만 70% 녹다운(KD)으로 나타났으며; 뮤린 POC가 입증되었다. 안전성과 관련하여, 마우스에서 HTT의 KO는 치명적일 수 있고; 인간에서 KD가 입증되었다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.
DRPLA를 위한 ATN1 타겟화
아트로핀 1 돌연변이는 HD와 유사한 진행성 척수소뇌 장애인 치상핵적핵-담창구시상하부위축증(dentatorubral-pallidoluysian atrophy: DRPLA)을 유발한다. 이러한 질환은 쇠약해지고 결국에는 치명적이 되는 질환-조절 요법이 없는 질환이다. DRPLA의 유병률은 일본에서 1,000,000명 당 2명 내지 7명이다. ATN1을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, ATN1에서 코딩 CAG 반복 확장은 척수, 뇌간, 소뇌, 또는 피질과 같은 조직에 가족성 및 산발성 SCA에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 ATN1의 상염색체 우성 코딩 CAG 확장이 독성의 미스폴딩 단백질의 발현 및 뉴런 사멸을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 독성 ATN1의 70% KD로 나타났다. 안전성과 관련하여, ATN1 KO 마우스는 건강한 것으로 보고되었다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF CAG mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.
척수 및 숨뇌근육 위축증을 위한 AR 타겟화
안드로겐 수용체 돌연변이는 척수 및 숨뇌근육 위축증(SBMA, 케네디병), 진행성 근육 소모성 질환 및 기타 질환을 유발한다. 이러한 질환은 쇠약해지고 결국에는 치명적이 되는 질환-조절 요법이 없는 질환이다. SBMA의 유병률은 남성 100,000명 당 2명이고; 여성은 경증의 표현형을 갖는다. AR을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, AR에서 코딩 CAG 반복 확장은 척수, 또는 뇌간과 같은 조직에 가족성 SBMA에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 AR의 X-연관 코딩 CAG 확장이 독성 증가-또는-기능 및 운동 뉴런 치사를 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 AR의 70% KD로 나타났다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF CAG mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.
프리드리히 실조증을 위한 FXN 타겟화
FXN의 열성 기능 상실 GAA 확장은 진행성 퇴행성 실조증인 프리드리히 실조증(FA)을 유발한다. 이러한 질환은 쇠약해지고 결국에는 치명적이 되는 질환-조절 요법이 없는 질환이다. FA의 유병률은 전세계에서 100,000명 당 2명이다. FXN을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, FXN에서 인트론 GAA 반복 확장은 척수, 소뇌, 또는 아마도 망막 및 심장과 같은 조직에 가족성 FA에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 FXN의 상염색체 열성 비-코딩 FAA 확장이 중요한 미토콘드리아 단백질인 FXN의 발현 감소를 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 FXN 인트론 GAS 확장의 70% KD로 나타났다. 안전성과 관련하여, 인트론 GAA의 KD는 마우스에서 안전하고 효과적이다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.
FXTAS를 위한 FMR1 타겟화
성인의 운동실조 및 인지 상실의 진행성 장애인 취약 X-관련 떨림/실조 증후군(FXTAS)은 FMR1 과발현에 의해 유발된다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 쇄약해지는 질환이다. FMR1 순열의 유병률은 남성 500명 중 1명이다. FMR1을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, FMR1에서 코딩 CCG 반복 확장 선돌연변이는 척수, 소뇌, 또는 피질과 같은 조직에서 FXTAS로 발견되었다 이러한 타겟화의 기전은 FMR1의 X-연관 코딩 CCG 확장이 독성 mRNA를 유발했기 때문일 수 있다. 효능은 독성 mRNA의 70% KD로 나타났다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.
취약 X 증후군을 위한 FMR1의 상류 타겟화
진행성 정신지체 장애인 취약 X 증후군(FRAXA)은 FMR1의 상류 mRNA를 타겟화함으로써 치료될 수 있다. 이러한 질환은 쇠약해지는 질환-조절 요법이 없는 질환이다. FRAXA의 유병률은 남성 4,000명 당 1명, 여성 8,000명 당 1명이다. FMR1을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, FMR1에서 코딩 CCG 반복 확장은 CNS와 같은 조직에서 FRAXA에 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 FMR1의 X-연관 코딩 CCG 확장이 LOF를 유발하고; 정상 FMR1이 핵으로부터 특이적 mRNA를 운반하는 기능을 하기 때문일 수 있다. 효능은 독성 mRNA의 70% KD로 나타났다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.
우성 유전 근위축성 축삭 경화증은 질환-조절 요법이 없는 파괴적 장애이다. 예시적인 타겟은 C9orf72, ATXN2(또한 SCA2 유발), 및 MAPT를 포함한다.
ALS를 위한 C9orf72 타겟화
C9orf72는 근위축성 축삭 경화증(ALS) 및 전측두엽 치매(FTD)의 가장 흔한 원인이다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 운동 뉴런의 치명적인 장애이다. ALS의 유병률은 100,000명 당 2명 5명이고(10%는 가족성); C9orf72는 미국과 유럽에서 가족성 ALS의 39% 및 산발성 ALS의 7%를 유발한다. C9orf72를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, 헥사-뉴클레오타이드 확장은 상위 및 하위 운동 뉴런(ALS의 경우); 또는 피질(FTD의 경우)과 같은 조직에 가족성 및 산발성 ALS에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 상염색체 우성 헥사-뉴클레오타이드 확장이 독성 디펩타이드 반복 단백질의 반복-관련 비-AUG-의존 번역 및 뉴런 치사를 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 C9orf72의 70% KD로 나타났다. 안전성과 관련하여, C9orf72의 이형접합 LOF 돌연변이는 인간과 마우스에서 안전한 것으로 보인다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF 헥사-뉴클레오타이드 반복 mRNA 및 디펩타이드 반복 단백질을 포함한다.
ALS를 위한 TARDBP 타겟화
TARDBP 돌연변이는 ALS 및 전측두엽 치매(FTD)를 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 운동 뉴런의 치명적인 장애이다. ALS의 유병률은 100,000명 당 2명 내지 5명이고(10%는 가족성); TARDBP는 가족성 ALS의 5% 및 산발성 ALS의 1.5%를 유발한다. TARDBP를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, 돌연변이는 상위 및 하위 운동 뉴런(ALS의 경우); 또는 피질(FTD의 경우)과 같은 조직에 가족성 및 산발성 ALS에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 상염색체 우성 TRDBP 돌연변이가 독성 TRDBP 단백질 및 뉴런 치사를 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 TARDBP 돌연변이체 대립유전자의 70% KD로 나타났다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF 단백질을 포함한다.
ALS를 위한 FUS 타겟화
FUS 돌연변이는 ALS 및 FTD를 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 운동 뉴런의 치명적인 장애이다. ALS의 유병률은 100,000명 당 2명 내지 5명이고(10%는 가족성); FUS는 가족성 ALS의 5%를 유발하고; FUS 포함은 산발성 ALS에서 흔히 발견된다. FUS를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, 돌연변이는 ALS의 경우 상위 및 하위 운동 뉴런과 같은 조직에 가족성 ALS에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 상염색체 우성 FUS 돌연변이가 비정상적인 단백질 폴딩 및 뉴런 치사를 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 FUS 돌연변이체 대립유전자의 70% KD로 나타났다. 안전성과 관련하여, KO 마우스는 분투적이었지만 생존했고, ADHD 표현형을 가졌다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF 단백질을 포함한다.
ALS를 위한 SOD1 타겟화
SOD1의 우성 및 열성 돌연변이는 ALS를 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 운동 뉴런의 치명적인 장애이다. ALS의 유병률은 100,000명 당 2명 5명이고(10%는 가족성); SOD1은 가족성 ALS의 5% 내지 20%를 유발한다. SOD1을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, 다수의 SOD1 돌연변이는 ALS의 경우 상위 및 하위 운동 뉴런과 같은 조직에 가족성으로 AD 및 AR ALS와 관련이 있다. 이러한 타겟화의 효능은 돌연변이-특이적 KD를 필요로 할 수 있다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 마이오마커는 돌연변이-특이적일 수 있다.
우성 유전 전측두엽 치매 및 진행성 책상 마비. 타겟은 MAPT이 AD, 또는 C9orf72에 중요할 수 있기 때문에 MAPT를 포함한다.
FTD-17 및 PSP를 위한 미세소관-관련 단백질 Tau 타겟화
17 번 염색체와 연관된 가족성 형태의 FTD인 가족성 전측두엽 치매 17(FTD-17), 및 가족성 진행성 책상 마비는 MAPT 돌연변이에 의해 유발될 수 있는데, 이는 또한 희귀성 형태의 진행성 책상 마비, 피질기저 변성, 호흡 부전이 있는 타우병증, 발작이 있는 치매를 유발할 수 있다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 신경퇴행성 장애이다. FTD의 유병률은 100,000명 당 15명 내지 22명이고; 네덜란드에서 FTD-17의 유병률은 인구 1,000,000명 중 1명이다. MAPT를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, GOF 점 및 MAPT의 스플라이스 자리 돌연변이는 전두 또는 측두 피질과 같은 조직에 가족성 및 산발성 FTD에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 MAPT의 상염색체 우성 GOF 돌연변이가 독성 타우 펩타이드 및 뉴런 사멸을 초래하기 때문일 수 있다. 효능은 MAPT의 70% KD로 나타났다. 안전성과 관련하여, MAPT KO 마우스는 건강한 것으로 보고되었다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF Tau mRNA 및 단백질을 포함한다.
FTD 및 ALS를 위한 세퀘스토좀 1 타겟화
산발성 FTD/ALS는 우성 SQSTM1 돌연변이와 연관된다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 신경퇴행성 장애이다. 이는 매우 희귀성 질환이다. 세퀘스토좀 1을 타겟화하는 것은 전두 및 측두 피질, 또는 소뇌 및 척수와 같은 조직에 산발성 경우에 인간 분자 유전적 연관성을 통해 타당해진다. 가능한 진단은 유전자 검사; 초기 증상을 포함한다.
우성 유전 파킨슨병은 질환-조절 요법이 없는 파괴적 장애이다. 타겟은 SNCA를 포함한다.
파킨슨병을 위한 SNCA 타겟화
알파 시누클레인 돌연변이는 가족성 파킨슨병(PD) 및 루이 소체 치매를 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 신경퇴행성 장애이다. PD의 유병률은 전 세계에서 400만명이고; PD의 1/3은 가족성이고; fPD의 1%는 SNCA에 의해 유발된다. SNCA를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, SNCA 점 돌연변이 및 중복은 숨뇌; 또는 중뇌의 흑질과 같은 조직에 가족성 PD를 유발한다. 이러한 타겟화의 기전은 비정상적인 SNCA 단백질의 과발현 또는 발현이 독성 펩타이드 및 뉴런 사멸을 초래하기 때문일 수 있다. 효능은 SNCA의 70% KD로 나타났다. 안전성과 관련하여, SNCA KO 마우스는 건강했다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF SNCA mRNA 및 단백질을 포함한다.
파킨슨병을 위한 LRRK2 타겟화
류신-풍부 반복 키나제 2 돌연변이는 가족성 파킨슨병을 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 신경퇴행성 장애이다. PD의 유병률은 전 세계에서 400만명이고; PD의 1/3은 가족성이고; fPD의 3% 내지 7%는 LRRK2에 의해 유발된다. LRRK2를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, LRRK2 점 돌연변이 및 중복은 숨뇌; 또는 중뇌의 흑질과 같은 조직에 가족성 PD를 유발한다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF mRNA 및 단백질을 포함한다.
척수성 근위축증 V를 위한 GARS 타겟화
상염색체 우성 글리실-tRNA 신테타제 돌연변이는 척추성 근위축증 V(SMAV) 또는 원위 유전성 운동 신경병증 Va를 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 신경퇴행성 장애이다. 이는 매우 희귀성 질환이다. GAR를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, GARS 점 돌연변이는 척수와 같은 조직에서 가족성 SMA를 유발한다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 초기 증상을 포함한다.
척수성 근위축증을 위한 세이핀 타겟화
상염색체 우성 세이핀 돌연변이는 척수성 근위축증(SMA) 또는 원위 유전성 운동 신경병증을 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 신경퇴행성 장애이다. 이는 매우 희귀성 질환이다. 세이핀을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, 세이핀 점 돌연변이는 척수와 같은 조직에서 가족성 SMA를 유발한다. 이러한 타겟화의 기전은 아마도 GOF 및 독성 펩타이드이다. 효능은 50% KD로 나타났다. 안전성과 관련하여, 열성 LOF 돌연변이는 지방 이영양증과 함께 또는 없이 진행성 뇌병증을 유발한다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다.
우성 유전 알츠하이머병은 질환-조절 요법이 없는 파괴적 장애이다. 타겟은 가족성 질환에서 중추적인 기계적인 역할 및 일반적인 AD에서 가능한 역할 때문에 APP를 포함한다.
알츠하이머병을 위한 APP 타겟화
아밀로이드 전구체 단백질 돌연변이는 조발성 가족성 알츠하이머병(EOFAD); 다운 증후군에서의 AD; 또는 AD를 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 신경퇴행성 장애이다. EOFAD-APP의 유병률은 1% AD이고; 21번 삼중염색체의 유병률은 1% AD이고; AD의 유병률은 미국에서 약 250만명 내지 5백만명이다. APP를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, APP 중복 및 점 돌연변이는 뇌 피질 또는 해마와 같은 조직에 EOFAD를 유발한다. 이러한 타겟화의 기전은 APP 과발현 또는 독성 대사의 발현이 진행성 뉴런 사멸을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 APP의 70% KD로 나타났다. 안전성과 관련하여, KD 마우스는 일부 행동 이상증과 함께 건강한 것으로 보고되었고; KD 마우스는 일부 공간 기억 장애와 함께 건강한 것으로 보고되었다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 초기 증상; 또는 MRI를 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF APP mRNA 및 펩타이드를 포함한다.
알츠하이머병을 위한 PSEN1 타겟화
프레세닐린 1 돌연변이는 조발성 가족성 알츠하이머병(EOFAD); 또는 AD를 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 신경퇴행성 장애이다. PSEN1을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, PSEN1 점 돌연변이는 뇌 피질 또는 해마와 같은 조직에 EOFAD를 유발한다. 이러한 타겟화의 기전은 PSEN1의 상염색체 우성 돌연변이가 비정상적인 APP 대사를 유발하고 독성 펩타이드가 진행성 뉴런 사멸을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 APP KD로 나타났는데, 이는 PSEN1-특이적 요법에 대한 필요성을 없앨 수 있다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 초기 증상; 또는 MRI를 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF PSEN1 및 APP 펩타이드를 포함한다.
알츠하이머병을 위한 PSEN2 타겟화
프레세닐린 2 돌연변이는 조발성 가족성 알츠하이머병(EOFAD); 또는 AD를 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 신경퇴행성 장애이다. PSEN2를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, PSEN2 점 돌연변이는 뇌 피질 또는 해마와 같은 조직에 EOFAD를 유발한다. 이러한 타겟화의 기전은 PSEN2의 상염색체 우성 돌연변이가 비정상적인 APP 대사를 유발하고 독성 펩타이드가 진행성 뉴런 사멸을 유발하기 때문일 수 있다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 초기 증상; 또는 MRI를 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF PSEN2 및 APP 펩타이드를 포함한다.
알츠하이머병을 위한 Apo E 타겟화
아포지질단백질 E4는 노인에서 산발성 AD와 관련이 있다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 신경퇴행성 장애이다. AD의 유병률은 미국에서 250만명 내지 500만명이다. Apo E를 타겟화하는 것은 ApoE4와 AD 간의 연관성을 지지하는 게놈 증거가 다수 집단에 우수하기 때문에 효과적일 수 있다. 타겟 조직은 뇌 피질일 수 있다. Apo E4가 다수 집단에서 강력한 연관성에도 불구하고 AD의 발병에 기여하는지의 여부는 아직 명확하지 않다. 지금까지, 데이터는 Apo E4 동형접합성이 노인에서 AD 위험의 증가를 지시하지만 노인에서도 AD를 유발하기에는 충분하지 않다는 것을 지시한다. 안전성과 관련하여, CNS에서 Apo E의 KD는 Apo E의 인간 LOF 돌연변이가 명백한 신경학적 결함과 관련이 없기 때문에 안전할 수 있지만, 전신 노출은 고리포단백혈증 III형을 유발할 수 있다. 가능한 진단은 AD의 임상 진단; EOFAD 돌연변이의 배제; Apo E4 유전자형에 대한 유전자 검사를 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF APP, Tau mRNA 및 펩타이드를 포함한다.
CNS 유전자 중복 장애. 절반까지의 일관된 KD는 이러한 장애들을 개선할 수 있다. 타겟은 MeCP2를 포함한다.
X-연관 정신 지체를 위한 MeCP2 타겟화
메틸 CpG 결합 단백질 2 유전자 중복은 X-연관 정신 지체(XLMR)를 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 인지 장애이다. X-연관 MR의 1% 내지 15%는 MeCP2 중복에 의해 유발되고; 인구의 2% 내지 3%가 MR을 갖는다. MeCP2를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, MeCP2 중복은 뇌 피질과 같은 조직에 XLMR을 유발한다. 이러한 타겟화의 기전은 MeCP2 과발현이 다른 유전자의 조절장애 및 신경퇴행을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 MeCP2의 50% KD로 나타났고; 마우스 모델에서 ASO KD는 표현형을 역전시켰다. 안전성과 관련하여, MeCP2 LOF 돌연변이는 레트 증후군을 유발할 수 있다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF MeCP2 mRNA 및 펩타이드를 포함한다.
우성 유전 아밀로이드 뇌혈관병증은 질환-조절 요법이 없는 파괴적 장애이다. 타겟은 TTR을 포함한다.
hATTR CAA를 위한 TTR 타겟화
이러한 타겟화는 CNS siRNA에 대한 도입 위험성이 낮을 수 있다. 아밀로이드 뇌혈관병증(CAA) 및 뇌척수막 아밀로이드증은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 장애이다. TTR을 타겟화하는 것은 인간 유전학 및 약리학을 통해 우수해질 수 있다. 타겟 조직은 CNS 혈관계, 또는 CNS일 수 있다. 이러한 타겟화의 기전은 돌연변이 단백질이 혈관 외막에 축적되어 CNS 출혈을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 TTR의 70% KD로 나타났다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF mRNA 및 단백질을 포함한다.
CAA를 위한 ITM2B 타겟화
내재성 막 단백질 2B 돌연변이는 아밀로이드 뇌혈관병증(CAA), 영국 유형 또는 가족성 영국 치매(FBD)를 유발한다. 특이적 돌연변이가 또한 우성 망막 변성을 유발할 수 있다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 장애이다. 이는 희귀성 질환이다. ITM2B를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있다. 타겟 조직은 CNS 혈관계, 또는 CNS일 수 있다. 이러한 타겟화의 기전은 아마도 GOF 돌연변이를 수반한다. 효능은 ITM2B 돌연변이체 대립유전자의 70% KD에 의해 밝혀졌다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF mRNA 및 가능한 단백질을 포함한다.
CAA를 위한 CST3 타겟화
시스타틴 C 돌연변이는 아이슬란드 타입인 가족성 아밀로이드 뇌혈관병증을 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 장애이다. 이는 아이슬란드 및 덴마크를 제외하고 희귀성 질환이다. CST3를 타겟화하는 것은 인간 유전학을 통해 우수해질 수 있다. 타겟 조직은 CNS 혈관계일 수 있다. 이러한 타겟화의 기전은 돌연변이 단백질이 혈관 외막에 축적되어 CNS 출혈을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 돌연변이체 대립유전자의 가능하게는 70% KD로 나타났다. 안전성과 관련하여, CST3 KO 마우스는 관절염 위험이 있을 수 있다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, 가능한 CSF mRNA 및 단백질을 포함한다.
강직성 하반신마비를 위한 SPAST 타겟화
SPASTIN 돌연변이는 인지 상실과 함께 강직성 하반신마비(SP) 4를 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 하위 운동 신경퇴행성 장애이다. SP의 유병률은 인구 100,000명 당 5명이고; SP4는 우성 SP의 45%이다. SPAST를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, SPAST 트리뉴클레오타이드 돌연변이는 척수; 또는 CNS와 같은 조직에 가족성 SP를 유발한다. 이러한 타겟화의 기전은 개연성 없는 및 개연성 있는 우성-음성 돌연변이가 비정상적인 미세소관 대사 및 신경퇴행을 유발하기 때문일 수 있다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, 가능한 CSF SPAST mRNA 및 단백질을 포함한다.
강직성 하반신마비를 위한 KIF5A 타겟화
키네신 패밀리 구성원 5A 돌연변이는 말초 신경병증 및 기타 장애와 함께 강직성 하반신마비(SP) 10을 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 하위 운동 신경퇴행성 장애이다. SP의 유병률은 100,000명 당 5명이고; SP10은 1,000,000명 당 1명이다. KIF5A를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, KIF5A 아미노 말단 미스센스 돌연변이는 SP10을 유발하고; KIF5A는 CNS에서 발현되며, 미세소관 운동 단백질을 코딩한다. 타겟 조직은 척수일 수 있다. 이러한 타겟화의 기전은 상염색체 우성 미스센스 돌연변이가 SP10를 유발하고, 아마도 운동요소에 결합하는 미세소관에 영향을 미치기 때문일 수 있다. 효능은 돌연변이체 대립유전자의 가능한 한 kD에 의해 제공될 수 있다. 안전성과 관련하여, KIF5A 틀이동 돌연변이는 신생아 난치성 근육간대경련을 유발하고, 스플라이스 부위 돌연변이는 아마도 LOF 메커니즘을 통해 가족성 ALS와 관련이 있었다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, 가능한 CSF mRNA 및 단백질을 포함한다.
강직성 하반신마비를 위한 ATL1 타겟화
아틀라스틴 돌연변이는 강직성 하반신 마비 3A 및 감각 신경병증 1D, 유전성 감각 신경병증(HSN)을 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 하위 운동 신경퇴행성 장애이다. SP의 유병률은 100,000명 당 5명이고; SP3A는 희귀성 우성 형태이다. ATL1을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, ATL1 점 돌연변이는 가족성 SP를 유발한다. 타겟 조직은 척수일 수 있다. 이러한 타겟화의 기전은 우성-음성 ATL1 단백질의 상염색체 우성 발현이 SP3A를 유발하지만, LOF 돌연변이가 감각 신경병증 1D를 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 특이적 ATL1 대립유전자의 70% KD로 나타났다. 안전성과 관련하여, ATL1 이형접합 LOF 돌연변이는 HSN1D를 유발한다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF ATL1 mRNA 및 단백질을 포함한다.
강직성 하반신마비를 위한 NIPA1 타겟화
LOF NIPA1 돌연변이는 간질 및 발작과 함께 강직성 하반신마비 6을 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 하위 운동 신경퇴행성 장애이다. SP의 유병률은 100,000명 당 5명이고; SP6은 희귀성 우성 형태이다. NIPA1을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, NIPA1 점 돌연변이는 가족성 SP를 유발한다. 타겟 조직은 척수; 또는 CNS일 수 있다. 이러한 타겟화의 기전은 결함 막 단백질의 상염색체 우성 발현이 SP3A; 및 아마도 LOF를 유발하기 때문일 수 있다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, 가능한 CSF mRNA 및 단백질을 포함한다.
우성 유전 근긴장성 이영양증은 CNS 및 전신 요법이 필요한 CNS, 골격근 및 심장근의 장애이다. 타겟은 DM1을 위해 MPK를 포함한다.
근긴장성 이영양증 1을 위한 DMPK 타겟화
근긴장성 이영양증 단백질 키나제를 타겟화하는 효과적인 요법에는 CNS 및 전신 요법이 필요하다. 근긴장성 이영양증 1(DM1)은 근육 및 CNS의 퇴행성 장애이다. 이는 질환-조절 요법이 없는 치명적인 장애이다. DM1의 유병률은 전세계 8,000명 당 1명이다. DMPK를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, DMPK CTG 반복 확장은 가족성 DM1을 유발한다. 타겟 조직은 골격근, 심장근, 또는 CNS일 수 있다. 이러한 타겟화의 기전은 상염색체 우성 비-코딩 CTG 반복이 비정상적인 RNA 프로세싱 및 우성 부작용을 유발하고; 극심한 확장으로부터의 예상이 질환의 조기 발병을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 DMPK의 70%로 나타났고; ASO 효능은 마우스에서 입증되었다. 안전성은 KO 및 ASO KD로 마우스에서 입증되었다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, 혈액 및 CSF mRNA 및 단백질을 포함한다.
근긴장성 이영양증 2를 위한 ZNF9 타겟화
아연 핑거 단백질 9 돌연변이는 골격근의 퇴행성 장애인 근긴장성 이영양증 2(DM2)를 유발한다. 이는 질환-조절 요법이 없는 중증 장애이다. DM2의 유병률은 전 세계 8,000명 당 1명이고; 이는 성인에서 가장 흔한 근이영양증이다. ZNF9를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, 인트론 1에서 ZNF9 CTTG 반복 확장은 가족성 DM2를 유발한다. 타겟 조직은 골격근, 또는 심장근일 수 있다. 이러한 타겟화의 기전은 인트론 1에서 상염색체 우성 CTTG 반복 확장이 비정상적인 RNA 대사 및 우성 부작용을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 독성 ZNF9의 70% KD로 나타났다. 마우스에서 안전한 KD가 입증되었다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, 혈액 mRNA 및 단백질을 포함한다.
우성 유전 프라이온병은 유전성, 산발성 및 전염성 PRNP 장애이다. 타겟은 PRNP를 포함한다.
근긴장성 프라이온병을 위한 PRNP 타겟화
근긴장성 프라이온병은 PRNP-관련 아밀로이드 뇌혈관병증, 거스트만-슈트라우슬러-센커병(GSD), 크로이츠 펠트-야콥병(CJD), 치명적 가족성 불면증(FFI), 헌팅턴병-유사 1(HDL1), 및 쿠루 감수성을 포함하는 우성 유전 프라이온병이다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 신경퇴행성 장애이다. 이러한 유형의 질환의 유병률은 1,000,000명 당 1명이다. PRNP를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, PRNP 돌연변이는 가족성 및 산발성 프라이온병을 유발한다. 타겟 조직은 CNS일 수 있다. 이러한 타겟화의 기전은 상염색체 우성 단백질 미드-폴딩이 신경독증을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 PRNP KD의 70%로 나타났고; PRNP 다형성이 쿠루병을 막는 것으로 보였다. 안전성과 관련하여, PRNP KO 마우스는 건강한 것으로 보고되었다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF mRNA 및 단백질을 포함한다.
라포라의 근간대성 뇌전증을 위한 글리코겐 신타제 타겟화
라포린(EPM2A) 유전자 돌연변이는 유전성 진행성 발작 장애인 AR 근간대성 뇌전증을 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 발작 및 인지 기능 저하 장애이다. 이러한 질환의 유병률은 1,000,000명 당 4명이다. 글리코겐 신타제를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, 돌연변이는 라포라의 AR 가족성 근간대성 뇌전증을 유발한다. 타겟 조직은 CNS일 수 있다. 이러한 타겟화의 기전은 라포린의 상염색체 열성 기능장애가 글리코겐의 미스폴딩 및 발작의 병소를 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 글리코겐 신타제 GYS1의 70% KD로 나타났다. 안전성과 관련하여, GYS1 결핍은 골격 및 심장 근육 글리코겐 결핍을 유발하고; 생존하는 GYS1 마우스는 근육 결함을 가졌다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF mRNA 및 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 노화-관련 황반 변성(AMD)(건성 및 습성), 새발성 맥락망막병증, 우성 색소성 망막염 4, 후치 이영양증(Fuch's dystrophy), hATTR 아밀로이드증, 유전성 및 산발성 녹내장, 및 스타가르트병(stargardt's disease)을 포함하나 이로 한정되지 않는 질환을 위해 유전자를 타겟화하는 이중-가닥 iRNA를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 습성(또는 삼출성) AMD를 위해 VEGF를 타겟화하는 이중-가닥 iRNA 제제를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 건성(또는 비삼출성) AMD를 위해 C3를 타겟화하는 이중-가닥 iRNA 제제를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 건성(또는 비삼출성) AMD를 위해 CFB를 타겟화하는 이중-가닥 iRNA 제제를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 녹내장을 위해 MYOC를 타겟화하는 이중-가닥 iRNA 제제를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 녹내장을 위해 ROCK2를 타겟화하는 이중-가닥 iRNA 제제를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 녹내장을 위해 ADRB2를 타겟화하는 이중-가닥 iRNA 제제를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 녹내장을 위해 CA2를 타겟화하는 이중-가닥 iRNA 제제를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 백내장을 위해 CRYGC를 타겟화하는 이중-가닥 iRNA 제제를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 건성안 증후군을 위해 PPP3CB를 타겟화하는 이중-가닥 iRNA 제제를 제공한다.
리간드
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하나 이상의 접합기의 공유 부착에 의해 추가로 변형된다. 일반적으로, 접합기는 약력학, 약동학, 결합, 흡수, 세포 분포, 세포 흡수, 전하 및 청소율을 포함하나 이로 한정되지 않는 본 발명의 부착된 이중-가닥 iRNA 제제의 하나 이상의 성질을 변형한다. 접합기는 화학 분야에서 일상적으로 사용되며, 직접적으로 또는 선택적 연결 모이어티 또는 연결기를 통해 올리고머 화합물과 같은 모 화합물에 연결된다. 접합기의 바람직한 목록은 제한 없이 삽입제, 리포터 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 티오에테르, 폴리에테르, 콜레스테롤, 티오콜레스테롤, 콜릭산 모이어티, 엽산, 지질, 인지질, 비오틴, 페나진, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아다만탄, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린 및 염료를 포함한다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 특이적 CNS 조직에 대한 전달을 매개하는 수용체를 타겟화하는 타겟화 리간드를 추가로 포함한다. 이러한 타겟화 리간드는 특이적인 척수강내 및 전신 전달이 가능하도록 친유성 모이어티와 조합하여 접합될 수 있다.
CNS 조직에 대한 수용체 매개 전달을 타겟화하는 예시적인 타겟화 리간드는 펩타이드 리간드, 예컨대, Angiopep-2, 지질단백질 수용체 연관 단백질(LRP) 리간드, bEnd.3 세포 결합 리간드; 트랜스페린 수용체(TfR) 리간드(뇌에서 철분 수송계를 이용하고, 뇌실질로 물질을 운반할 수 있음); 만노스 수용체 리간드(후각 초성 세포, 신경교세포를 타겟화함), 글루코스 운반체 단백질, 및 LDL 수용체 리간드이다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 특이적 안구 조직에 대한 전달을 매개하는 수용체를 타겟화하는 타겟화 리간드를 추가로 포함한다. 이러한 타겟화 리간드는 특이적인 유리체내 및 전신 전달이 가능하도록 친유성 모이어티와 조합하여 접합될 수 있다. 안구 조직에 대한 수용체 매개 전달을 타겟화하는 예시적인 타겟화 리간드는 친유성 리간드, 예컨대, 모든 트랜스 레티놀(레티노산 수용체를 타겟화함); RGD 펩타이드(망막 색소 상피 세포를 타겟화함), 예컨대, H-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-Cys-OH 또는 사이클로(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys; LDL 수용체 리간드; 및 탄수화물 기반 리간드(후안방에서 내피 세포를 타겟화함)이다.
본 발명에 적합한 바람직한 접합기는 지질 모이어티, 예컨대, 콜레스테롤 모이어티(Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553); 콜릭산(Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1053); 티오에테르, 예를 들어, 헥실-S-트리틸티올(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765); 티오콜레스테롤(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533); 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49); 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄-1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777); 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969); 아다만탄 아세트산(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651); 팔미틸 모이어티(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229); 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923)를 포함한다.
일반적으로, 광범위하게 다양한 엔터티, 예를 들어, 리간드는 본원에 기재된 올리고머 화합물에 커플링될 수 있다. 리간드는 천연 생성 분자, 또는 재조합 또는 합성 분자를 포함할 수 있다. 예시적인 리간드는 폴리리신(PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말렌산 무수물 공중합체, 폴리(L-락타이드-코-글리콜라이드) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체(HMPA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG, 예를 들어, PEG-2K, PEG-5K, PEG-10K, PEG-12K, PEG-15K, PEG-20K, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체, 폴리포스파진, 폴리에틸렌이민, 양이온성 기, 스페르민, 스페르미딘, 폴리아민, 유사펩타이드-폴리아민, 펩티도미메틱 폴리아민, 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포피린, 폴리아민의 4차 염, 티로트로핀, 멜라노트로핀, 렉틴, 당단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신, 글리코실화된 폴리아미노산, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파테이트, 앱타머, 아시알로페투인, 하이알루로난, 프로콜라겐, 면역글로불린(예를 들어, 항체), 인슐린, 트랜스페린, 알부민, 당-알부민 접합체, 삽입제(예를 들어, 아크리딘), 가교제(예를 들어, 프소랄렌(psoralen), 미토마이신 C), 포피린(TPPC4, 텍사피린(texaphyrin), 사피린(Sapphyrin)), 폴리사이클릭 방향족 탄화수소(예를 들어, 페나진, 디하이드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제(예를 들어, EDTA), 친유성 분자(예를 들어, 스테로이드, 담즙산, 콜레스테롤, 콜릭산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥실 기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜릭산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진), 펩타이드(예를 들어, 알파 나선 펩타이드, 양친매성 펩타이드, RGD 펩타이드, 세포 투과 펩타이드, 엔도좀분해성/융합유도성 펩타이드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 머캅토, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사성표지 마커, 효소, 헵텐(예를 들어, 비오틴), 수송/흡수 촉진제(예를 들어, 나프록센, 아스피린, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레아제(예를 들어, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 접합체, 테트라아자마크로사이클의 Eu3+ 복합체), 디니트로페닐, HRP, AP, 항체, 호르몬 및 호르몬 수용체, 렉틴, 탄수화물, 다가 탄수화물, 비타민(예를 들어, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 K, 비타민 B, 예를 들어, 엽산, B12, 리보플라빈, 비오틴 및 피리독살), 비타민 보조인자, 리포폴리사카라이드, p38 MAP 키나제의 활성화제, NF-κB의 활성화제, 탁손(taxon), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 사이토칼라신(cytochalasin), 노코다졸(nocodazole), 야플라키놀리드(japlakinolide), 라트룬쿨린 A(latrunculin A), 팔로이딘(phalloidin), 스윈홀라이드 A(swinholide A), 인다노신(indanocine), 마이오세르빈(myoservin), 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파), 인터루킨-1 베타, 감마 인터페론, 천연 또는 재조합 저밀도 지질단백질(LDL), 천연 또는 재조합 고밀도 지질단백질(HDL), 및 세포-투과 제제(예를 들어, 나선형 세포-투과 제제)를 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
펩타이드 및 펩티도미메틱 리간드는, 천연 생성 펩타이드 또는 변형 펩타이드, 예를 들어, D 또는 L 펩타이드; α, β, 또는 γ 펩타이드; N-메틸 펩타이드; 아자펩타이드; 하나 이상의 아미드를 갖는 펩타이드, 즉, 하나 이상의 우레아, 티오우레아, 카르바메이트, 또는 설포닐 우레아 결합으로 치환된 결합을 갖는 펩타이드; 또는 사이클릭 펩타이드를 갖는 것들을 포함한다. 펩티도미메틱(본원에서 올리고펩티도미메틱으로도 지칭됨)은 천연 펩타이드와 유사한 한정된 3차원 구조로 폴딩될 수 있는 분자이다. 펩타이드 또는 펩티도미메틱 리간드는 약 5개 내지 50개 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 또는 50개 아미노산 길이일 수 있다.
예시적인 양친매성 펩타이드로는, 세크로핀(cecropin), 라이코톡신(lycotoxin), 파라닥신(paradaxin), 부포린(buforin), CPF, 봄비닌-유사(bombinin-like) 펩타이드(BLP), 카텔리시딘(cathelicidin), 세라토톡신(ceratotoxin), S. 클라바(S. clava) 펩타이드, 하그피쉬 장 항균 펩타이드(hagfish intestinal antimicrobial peptide)(HFIAP), 마가이닌(magainine), 브레비닌-2(brevinin-2), 데르마셉틴(dermaseptin), 멜리틴(melittin), 플레우로시딘(pleurocidin), H2A 펩타이드, 제노푸스(Xenopus) 펩타이드, 에스쿨렌티니스-1(esculentinis-1), 및 캐린(caerin)이 포함되나, 이로 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "엔도좀분해성 리간드"는 엔도좀분해 특성을 갖는 분자를 지칭한다. 엔도좀분해성 리간드는 세포 구획, 예컨대, 엔도좀, 리포좀, 소포체(ER), 골지(Golgi) 장치, 미세소관, 과산화체, 또는 세포 내 다른 소낭성 조직으로부터 세포의 세포질로 본 발명의 조성물, 또는 이의 성분을의 용해 및/또는 수송을 촉진한다. 일부 예시적인 엔도좀분해성 리간드는 이미다졸, 폴리 또는 올리고이미다졸, 선형 또는 분지형 폴리에틸렌이민(PEI), 선형 및 분지형 폴리아민, 예를 들어, 스페르민, 양이온성 선형 및 분지형 폴리아민, 폴리카르복실레이트, 폴리양이온, 마스킹된(masked) 올리고 또는 폴리 양이온 또는 음이온, 아세탈, 폴리아세탈, 케탈/폴리케탈, 오르토에스테르, 마스킹 또는 비-마스킹된 양이온성 또는 음이온성 전하를 갖는 선형 또는 분지형 중합체, 마스킹 또는 비-마스킹된 양이온성 또는 음이온성 전하를 가진 덴드리머, 폴리음이온성 펩타이드, 폴리음이온성 펩타이드모방체, pH-감수성 펩타이드, 천연 및 합성 융합생성 지질, 천연 및 합성 양이온성 지질을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
예시적인 엔도좀분해성/융합생성 펩타이드는 하기를 포함하나, 이로 한정되지 않는다:
AALEALAEALEALAEALEALAEAAAAGGC(GALA); AALAEALAEALAEALAEALAEALAAAAGGC(EALA); ALEALAEALEALAEA; GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYG(INF-7); GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG(Inf HA-2); GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGCGLFEAIEGFIENGWEGMID GWYGC(diINF-7); GLFEAIEGFIENGWEGMIDGGCGLFEAIEGFIENGWEGMIDGGC(diINF-3); GLFGALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAAGGSC(GLF); GLFEAIEGFIENGWEGLAEALAEALEALAAGGSC(GALA-INF3); GLF EAI EGFI ENGW EGnI DG K GLF EAI EGFI ENGW EGnI DG(INF-5, n은 노르류신임); LFEALLELLESLWELLLEA(JTS-1); GLFKALLKLLKSLWKLLLKA(ppTG1); GLFRALLRLLRSLWRLLLRA(ppTG20); WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(KALA); GLFFEAIAEFIEGGWEGLIEGC(HA); GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(멜리틴); H5WYG; 및 CHK6HC.
이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 융합생성 지질은 막과 융합하고, 결과적으로 막을 탈안정화시킨다. 융합생성 지질은 일반적으로 작은 헤드 기, 및 불포화 아실 기를 갖는다. 예시적인 융합생성 지질은 1,2-디레오일-sn-3-포스포에탄올아민(DOPE), 포스파티딜에탄올아민(POPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-올(Di-Lin), N-메틸(2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔일)-1,3-디옥솔란-4-일)메탄아민(DLin-k-DMA) 및 N-메틸-2-(2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)-1,3-디옥솔란-4-일)에탄아민(본원에서 XTC로도 지칭됨)을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
본 발명에 적합한 엔도좀분해 활성을 갖는 합성 폴리머는 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 출원 공개 No. 2009/0048410; 2009/0023890; 2008/0287630; 2008/0287628; 2008/0281044; 2008/0281041; 2008/0269450; 2007/0105804; 20070036865; 및 2004/0198687에 기재되어 있다.
예시적인 세포 투과 펩타이드는 RQIKIWFQNRRMKWKK(페네트라틴); GRKKRRQRRRPPQC(Tat 단편 48 내지 60); GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV(신호 서열 기반 펩타이드); LLIILRRRIRKQAHAHSK(PVEC); GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL(트랜스포르탄); KLALKLALKALKAALKLA(양친매성 모델 펩타이드); RRRRRRRRR(Arg9); KFFKFFKFFK(세균성 세포 벽 투과 펩타이드); LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES(LL-37); SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR(세크로핀 P1); ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC(α-데펜신); DHYNCVSSGGQCLYSACPIFTKIQGTCYRGKAKCCK(β-데펜신); RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFPGKR-NH2-(PR-39); ILPWKWPWWPWRR-NH2 (인돌리시딘); AAVALLPAVLLALLAP(RFGF); AALLPVLLAAP(RFGF 유사체); 및 RKCRIVVIRVCR(박테네신)을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
예시적인 양이온성 기는, 예를 들어, O-아민(아민 = NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 폴리아미노); 아미노알콕시, 예를 들어, O(CH2)n아민, (예를 들어, 아민 = NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 폴리아미노); 아미노(예를 들어, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 디헤테로아릴 아미노, 또는 아미노산); 및 NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-아민(아민 = NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노)으로부터 유래된 양성화된 아미노 기를 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
본원에 사용되는 용어 "타겟화 리간드"는 선택된 타겟, 예를 들어, 세포, 세포 유형, 조직, 기관, 신체 부위, 또는 구획, 예를 들어, 세포, 조직 또는 기관 구획에 대해 향상된 친화성을 제공하는 임의의 분자를 지칭한다. 일부 예시적인 타겟화 리간드는 항체, 항원, 엽산, 수용체 리간드, 탄수화물, 앱타머, 인테그린 수용체 리간드, 케모카인 수용체 리간드, 트랜스페린, 비오틴, 세로토닌 수용체 리간드, PSMA, 엔도텔린, GCPII, 소마토스타틴, LDL 및 HDL 리간드를 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
탄수화물 기재 타겟화 리간드는 D-갈락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-D-갈락토사민(GalNAc), 다가 GalNAc, 예를 들어, GalNAc2 및 GalNAc3(GalNAc 및 다가 GalNAc는 본원에서 총괄하여 GalNAc 접합체로 지칭됨); D-만노스, 다가 만노스, 다가 락토스, N-아세틸-글루코사민, 글루코스, 다가 글루코스, 다가 푸코스, 글리코실화된 폴리아미노산 및 렉틴을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 용어 다가는 하나보다 많은 단당류 단위가 존재한다는 것을 지시한다. 그러한 단당류 하위단위는 글리코사이드 결합을 통해 서로 연결되거나 스캐폴드 분자에 연결될 수 있다.
리간드로서 본 발명에 용이한 다수의 엽산 및 엽산 유사체는 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 No. 2,816,110; 5,552,545; 6,335,434 및 7,128,893에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "PK 조절 리간드" 및 "PK 조절제"는 본 발명의 조성물의 약동학을 조절할 수 있는 분자를 지칭한다. 일부 예시적인 PK 조절제는 친유성 분자, 담즙산, 스테롤, 인지질 유사체, 펩타이드, 단백질 결합제, 비타민, 지방산, 페녹사진, 아스피린, 나프록센, 이부프로펜, 수프로펜, 케토프로펜, (S)-(+)-프라노프로펜, 카프로펜, PEG, 비오틴, 및 트랜스티레티아-결합 리간드(예를 들어, 테트라아이오도티로아세트산, 2, 4, 6-트리아이오도페놀 및 플루페남산)을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 다수의 포스포로티오에이트 당간 결합을 포함하는 올리고머성 화합물은 또한 혈청 단백질에 결합하는 것으로 알려져 있고, 그에 따라 짧은 올리고머 화합물, 예를 들어, 약 5개 내지 30개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 5개 내지 25개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 5개 내지 20개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개의 뉴클레오타이드)를 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 및 백본에 복수의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 것은 리간드(예를 들어, PK 조절 리간드)로서 또한 본 발명에 용이하다. PK 조절 올리고뉴클레오타이드는 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 포스포로디티오에이트 결합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, PK 조절 올리고뉴클레오타이드에서 모든 뉴클레오타이드간 결합은 포스포로티오에이트 및/또는 포스포로디티오에이트 결합이다. 또한, 혈청 구성분(예를 들어, 혈청 단백질)을 결합하는 앱타머는 또한, 본 발명에서 PK 조절 리간드로서 용이하다. 혈청 구성분(예를 들어, 혈청 단백질)에 대한 결합은 알부민 결합 검정, 예컨대, 문헌[Oravcova, et al., Journal of Chromatography B (1996), 677: 1-27]에 기재된 것들로부터 예측될 수 있다.
2개 이상의 리간드가 존재하는 경우, 리간드는 모두 동일한 특성을 가질 수 있으며, 모두 서로 다른 특성들을 가질 수 있거나, 또는 일부 리간드들은 동일한 특성들을 가지는 한편 다른 것들은 서로 다른 특성들을 가진다. 예를 들어, 리간드는 타겟화 특성을 가지거나, 엔도좀분해성 활성을 가지거나, 또는 PK 조절 특성을 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 리간드들은 모두 서로 다른 특성들을 가진다.
리간드 또는 테터링된 리간드는, 상기 단량체가 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제의 구성분(예를 들어, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제 또는 링커)에 혼입되는 경우, 상기 단량체 상에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드는, "전구체" 단량체가 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제의 구성분(예를 들어, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제 또는 링커)에 혼입된 후에, 상기 "전구체" 단량체에 커플링을 통해 혼입될 수 있다. 예를 들어, 아미노-말단화된 테터를 갖는(즉, 관련된 리간드를 갖지 않는) 단량체, 예를 들어, 링커-NH2는 본 발명의 화합물의 구성분(예를 들어, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제 또는 링커)에 혼입될 수 있다. 후속적인 작업에서, 즉, 전구체 단량체를 본 발명의 화합물의 구성분(예를 들어, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제 또는 링커)에 혼입한 후, 친전자성 기를 가지는 리간드, 예를 들어, 펜타플루오로페닐 에스테르 또는 알데하이드 기는 후속해서, 전구체 단량체의 테터의 말단 친핵성 기와 함께 리간드의 친전자성 기를 커플링함으로써 전구체 단량체에 부착될 수 있다.
또 다른 예에서, 클릭 화학 반응에 참여하는데 적절한 화학 기를 가지는 단량체, 예를 들어, 아자이드 또는 알카인 말단화된 테터/링커가 혼입될 수 있다. 후속적인 작업에서, 즉, 전구체 단량체를 가닥에 삽입한 후, 알카인 또는 아자이드와 같은 상보적인 화학 기를 가지는 리간드는 알카인 및 아자이드를 함께 커플링함으로써 전구체 단량체에 부착될 수 있다.
일부 구현예에서, 리간드는 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제의 뉴클레오베이스, 당 모이어티, 또는 뉴클레오사이드간 결합에 접합될 수 있다. 퓨린 뉴클레오베이스 또는 이의 유도체에의 접합은 엔도사이클릭 원자 및 엑소사이클릭 원자를 비롯한 임의의 위치에서 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 퓨린 뉴클레오베이스의 2-위치, 6-위치, 7-위치, 또는 8-위치는 접합체 모이어티에 부착된다. 피리미딘 뉴클레오베이스 또는 이의 유도체에의 접합은 임의의 위치에서 발생할 수도 있다. 일부 구현예에서, 피리미딘 뉴클레오베이스의 2-위치, 5-위치, 및 6-위치는 접합체 모이어티로 치환될 수 있다. 리간드가 뉴클레오베이스에 접합되는 경우, 바람직한 위치는 혼성화를 방해하지 않는, 즉, 염기 페어링에 필요한 수소 결합 상호작용을 방해하지 않는 위치이다.
뉴클레오사이드의 당 모이어티에의 접합은 임의의 탄소 원자에서 발생할 수 있다. 접합 모이어티에 부착될 수 있는 당 모이어티의 예시적인 탄소 원자는 2', 3', 및 5' 탄소 원자를 포함한다. 1' 위치는 또한, 무염기(abasic) 잔기와 같은 접합 모이어티에 부착될 수도 있다. 뉴클레오사이드간 결합은 또한, 접합 모이어티를 가질 수 있다. 인-함유 결합의 경우(예를 들어, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로아미데이트 등), 접합 모이어티는 인 원자, 또는 인 원자에 결합된 O, N, 또는 S 원자에 직접 부착될 수 있다. 아민-함유 또는 아미드-함유 뉴클레오사이드간 결합(예를 들어, PNA)의 경우, 접합 모이어티는 아민 또는 아미드의 질소 원자 또는 인접한 탄소 원자에 부착될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드의 접합체를 제조하기 위한 수많은 방법이 존재한다. 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 상의 반응성 기(예를 들어, OH, SH, 아민, 카르복실, 및 알데하이드 등)를 접합체 모이어티 상의 반응성 기와 접촉시킴으로써 접합체 모이어티에 부착된다. 일부 구현예에서, 하나의 반응성 기는 친전자성이고, 다른 기는 친핵성이다.
예를 들어, 친전자성 기는 카르보닐-함유 작용기일 수 있고, 친핵성 기는 아민 또는 티올일 수 있다. 연결기로 및 연결기 없이 핵산 및 관련 올리고머 화합물의 접합 방법은, 예를 들어, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 문헌[Manoharan in Antisense Research and Applications, Crooke and LeBleu, eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993, 챕터 17]와 같은 문헌에 잘 기술되어 있다.
리간드는 링커 또는 담체 단랑체, 예를 들어, 리간드 담체를 통해 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제에 부착될 수 있다. 담체로는, (i) 하나 이상의 "백본 부착점", 바람직하게는 2개의 "백본 부착점", 및 (ii) 하나 이상의 "테터링 부착점"을 포함한다. 본원에서 사용되는 "백본 부착점"은 하이드록실기와 같은 작용기, 또는 일반적으로 백본, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 포스페이트, 또는 변형 포스페이트, 예를 들어, 황 함유 백본으로의 담체 단량체의 혼입에 적절하며 이에 이용가능한 결합을 지칭한다. "테터링 부착점"(TAP)은 선택된 모이어티를 연결하는(백본 부착점을 제공하는 원자와 구별되는) 탄소 원자 또는 헤테로원자와 같은 사이클릭 담체의 구성원 고리 원자를 지칭한다. 선택된 모이어티는, 예를 들어, 탄수화물, 예를 들어, 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당류 및 다당류일 수 있다. 선택적으로, 선택된 모이어티는 담체 단량체에의 개입 테터에 의해 연결된다. 따라서, 담체는 종종 아미노기와 같은 작용기를 포함하거나, 또는 일반적으로 구성분 원자에의 리간드와 같은 또 다른 화학적 엔터티의 혼입 또는 테터링에 적절한 결합을 포함할 것이다.
전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함되는, 핵산의 접합체의 제조가 교시되어 있는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 No. 4,828,979; 4,948,882; 5,218, 105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,149,782; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599, 923; 5,599,928; 5,672,662; 5,688,941; 5,714,166; 6,153,737; 6,172,208; 6,300,319; 6,335,434; 6,335,437; 6,395,437; 6,444,806; 6,486,308; 6,525,031; 6,528,631; 6,559,279를 포함하나, 이로 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 간 조직을 타겟화하는 타겟화 리간드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 타겟화 리간드는 탄수화물-기재 리간드이다. 일 구현예에서, 타겟화 리간드는 GalNAc 접합체이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 도시된 구조를 갖는 리간드를 추가로 포함한다:
Figure pct00058
식에서,
LG는 독립적으로 각 경우에 리간드, 예를 들어, 탄수화물, 예를 들어, 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 다당류이고;
Z', Z'', Z''' 및 Z''''는 각각 독립적으로 각 경우에 O 또는 S이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 화학식 II, III, IV 또는 V의 리간드를 포함한다:
[화학식 II]
Figure pct00059
[화학식 III]
Figure pct00060
[화학식 IV]
Figure pct00061
, 또는
[화학식 V]
Figure pct00062
식에서,
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B 및 q5C는 독립적으로 각 경우에 0 내지 20을 나타내고, 여기서 반복 단위는 동일하거나 상이할 수 있고;
Q 및 Q'는 독립적으로 각 경우에 부재, -(P7-Q7-R7)p-T7- 또는 -T7-Q7-T7'-B-T8'-Q8-T8이고;
P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, P7, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C, T7, T7', T8 및 T8'는 각각 독립적으로 각 경우에 부재, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH 또는 CH2O이고;
B는 -CH2-N(BL)-CH2-이고;
BL은 -TB-QB-TB'-Rx이고;
Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C, Q7, Q8 및 QB는 독립적으로 각 경우에 부재, 알킬렌, 치환된 알킬렌이고, 여기서 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R')=C(R'), C≡C 또는 C(O) 중 하나 이상에 의해 중단되거나 종결될 수 있고;
TB 및 TB'는 각각 독립적으로 각 경우에 부재, CO, NH, O, S, OC(O), OC(O)O, NHC(O), NHC(O)NH, NHC(O)O, CH2, CH2NH 또는 CH2O이고;
Rx는 친유성기(예를 들어, 콜레스테롤, 콜릭산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥실 기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜릭산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진), 비타민(예를 들어, 엽산, 비타민 A, 비타민 E, 비오틴, 피리독살), 펩타이드, 탄수화물(예를 들어, 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당류, 다당류), 엔도좀분해 성분, 스테로이드(예를 들어, 우바올, 헤시게닌, 디오스게닌), 테르펜(예를 들어, 트리테르펜, 예를 들어, 사르사사포게닌, 프리델린, 에피프리델라놀 유래 리토콜릭산), 또는 양이온성 지질이고;
R1, R2, R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C, R7은 각각 독립적으로 각 경우에 부재, NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O,
Figure pct00063
Figure pct00064
또는 헤테로사이클릴이고;
L1, L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B 및 L5C는 각각 독립적으로 각 경우에 탄수화물, 예를 들어, 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당류 및 다당류이고;
R' 및 R''은 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, OH, SH, 또는 N(RN)2이고;
RN은 독립적으로 각 경우에 H, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸 또는 벤질이고;
Ra는 H 또는 아미노산 측쇄이고;
Z', Z'', Z''' 및 Z''''는 각각 독립적으로 각 경우에 O 또는 S이고;
p는 독립적으로 각 경우에 0 내지 20을 나타낸다.
상기 논의된 바와 같이, 리간드는 링커 또는 담체를 통해 iRNA 제제에 접합될 수 있기 때문에, 그리고 링커 또는 담체는 분지형 링커를 함유할 수 있기 때문에, iRNA 제제는 이후 담체에 대한 동일하거나 상이한 백본 부착점을 통해, 또는 분지형 링커(들)를 통해 다중 리간드를 함유할 수 있다. 예를 들어, 분지형 링커의 분지점은 이가, 삼가, 사가, 오가, 또는 육가 원자, 또는 그러한 다중 원자가를 나타내는 기일 수 있다. 소정의 구현예에서, 분지점은 -N, -N(Q)-C, -O-C, -S-C, -SS-C, -C(O)N(Q)-C, -OC(O)N(Q)-C, -N(Q)C(O)-C, 또는 -N(Q)C(O)O-C이고; 여기서 Q는 독립적으로 각 경우에 H 또는 선택적으로 치환된 알킬이다. 다른 구현예에서, 분지점은 글리세롤 또는 글리세롤 유도체이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드를 포함한다:
Figure pct00065
.
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드를 포함한다:
Figure pct00066
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드를 포함한다:
Figure pct00067
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드를 포함한다:
Figure pct00068
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드를 포함한다:
Figure pct00069
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드를 포함한다:
Figure pct00070
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드를 포함한다:
Figure pct00071
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드를 포함한다:
Figure pct00072
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드를 포함한다:
Figure pct00073
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드를 포함한다:
Figure pct00074
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드를 포함한다:
Figure pct00075
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00076
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드를 포함한다:
Figure pct00077
예시적인 리간드 단량체
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00078
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00079
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00080
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00081
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00082
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00083
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드를 포함한다:
Figure pct00084
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드를 포함한다:
Figure pct00085
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드를 포함한다:
Figure pct00086
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드를 포함한다:
Figure pct00087
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드를 포함한다:
Figure pct00088
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드를 포함한다:
Figure pct00089
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드를 포함한다:
Figure pct00090
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드를 포함한다:
Figure pct00091
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드를 포함한다:
Figure pct00092
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00093
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00094
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00095
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00096
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00097
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00098
일부 구현예에서, L2A와 L2B 둘 모두는 상이하다.
일부 바람직한 구현예에서, L3A와 L3B 둘 모두는 동일하다.
일부 구현예에서, L3A와 L3B 둘 모두는 상이하다.
일부 바람직한 구현예에서, L4A와 L4B 둘 모두는 동일하다.
일부 구현예에서, L4A와 L4B 둘 모두는 상이하다.
일부 바람직한 구현예에서, 모든 L5A, L5B 및 L5C는 동일하다.
일부 구현예에서, L5A, L5B 및 L5C 중 두 개는 동일하다.
일부 구현예에서, L5A와 L5B는 동일하다.
일부 구현예에서, L5A와 L5C는 동일하다.
일부 구현예에서, L5B와 L5C는 동일하다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00099
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00100
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00101
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00102
식에서, Y는 O 또는 S이고, n은 1 내지 6이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00103
식에서, Y는 O 또는 S이고, n은 1 내지 6이고, R은 수소 또는 핵산이고, R'는 핵산이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00104
식에서, Y는 O 또는 S이고, n은 1 내지 6이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제를 포함하나 이로 한정되지 않는, 본원에 기재된 올리고머 화합물은 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00105
식에서, Y는 O 또는 S이고, n은 2 내지 6이고, x는 1 내지 6이고, A는 H 또는 포스페이트 결합이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 적어도 1개, 2개, 3개 또는 4개의 단량체를 포함한다:
Figure pct00106
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00107
식에서, X는 O 또는 S이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제를 포함하나 이로 한정되지 않는, 본원에 기재된 올리고머 화합물은 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00108
식에서, x는 1 내지 12이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00109
식에서, R은 OH 또는 NHCOCH3이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00110
식에서, R은 OH 또는 NHCOCH3이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
[화학식 VII]
Figure pct00111
, 식에서, R은 O 또는 S이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00112
식에서, R은 OH 또는 NHCOCH3이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00113
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00114
식에서, R은 OH 또는 NHCOCH3이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00115
식에서, R은 OH 또는 NHCOCH3이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00116
식에서, R은 OH 또는 NHCOCH3이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00117
식에서, R은 OH 또는 NHCOCH3이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00118
상술된 단량체에서, X 및 Y는 각각 독립적으로 각 경우에 H, 보호기, 포스페이트 기, 포스포디에스테르 기, 활성화된 포스페이트 기, 활성화된 포스파이트 기, 포스포라미다이트, 고형 지지체, -P(Z')(Z'')O-뉴클레오사이드, -P(Z')(Z'')O-올리고뉴클레오타이드, 지질, PEG, 스테로이드, 중합체, 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드, 또는 올리고뉴클레오타이드이고; Z' 및 Z''는 각각 독립적으로 각 경우에 O 또는 S이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드와 접합된다:
Figure pct00119
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 리간드를 포함한다:
Figure pct00120
소정의 구현예에서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 하기 구조의 단량체를 포함한다:
Figure pct00121
상술된 리간드 및 단량체의 합성은, 예를 들어, 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 No. 8,106,022에 기재되어 있다.
후보물질 iRNA의 평가
제제 또는 변형된 분자 및 대조 분자를 적절한 조건에 노출시키고, 선택된 특성의 존재에 대하여 평가함으로써 선택된 특성에 대한 후보물질 iRNA 제제, 예를 들어, 변형된 RNA가 평가될 수 있다. 예를 들어, 분해제에 대한 저항성은 다음과 같이 평가될 수 있다. 후보물질 변형된 RNA(및 대조 분자, 일반적으로 비변형 형태)는 분해 조건에 노출, 예를 들어, 분해제, 예를 들어, 뉴클레아제를 포함하는 환경에 노출될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플, 예를 들어, 치료 용도, 예를 들어, 혈액 또는 세포 분획, 예를 들어, 무세포 균질물 또는 파괴된 세포에 주어질 수 있는 환경과 유사한 것이 사용될 수 있다. 후보물질 및 대조는 이후 임의의 다수 접근법들에 의해 분해에 대한 저항성에 대하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 후보물질 및 대조는 노출 전에, 예를 들어, 방사성 또는 효소 표지, 또는 Cy3 또는 Cy5와 같은 형광 표지로 표지될 수 있다. 대조 및 변형된 RNA는 분해제, 및 선택적으로 대조, 예를 들어, 불활성화된, 예를 들어, 열 불활성화된 분해제와 함께 인큐베이션될 수 있다. 물리적 파라미터, 예를 들어, 변형 및 대조 분자의 크기가 이후 결정된다. 이들은 분자가 이의 원래의 길이를 유지했는지를 평가하기 위해 물리적 방법, 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 사이징 컬럼에 의해 결정되거나, 기능적으로 평가될 수 있다. 대안적으로, 노던 블럿 분석은 비표지된 변형 분자의 길이를 검정하기 위해 사용될 수 있다.
기능 검정이 또한 후보물질 제제를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 기능 검정은, 변형이 유전자 발현을 사일런싱시키는 분자의 능력을 변경하는 지를 알아내기 위해 초기에 또는 조기 비-기능 검정(예를 들어, 분해 저항성에 대한 검정) 후에 적용될 수 있다. 예를 들어, 세포, 예를 들어, 마우스 또는 인간 세포와 같은 포유류 세포는 형광 단백질, 예를 들어, GFP를 발현하는 플라스미드, 및 형광 단백질을 코딩하는 전사체에 상동성인 후보물질 RNA 제제로 공동-형질감염될 수 있다(예를 들어, WO 00/44914 참조). 예를 들어, GFP mRNA에 상동성인 변형 dsiRNA는 형질감염이 후보 물질 dsiRNA를 포함하지 않은 대조 세포, 예를 들어, 제제가 첨가되지 않는 대조 및/또는 비-변형 RNA가 첨가되지 않은 대조에 비해, 세포 형광의 감소를 모니터링함으로써 GFP 발현을 억제하는 능력에 대하여 검정될 수 있다. 유전자 발현에 대한 후보물질 제제의 효능은 변형 및 비변형 dssiRNA 화합물의 존재에서 세포 형광을 비교함으로써 평가될 수 있다.
대안적인 기능 검정에서, 내인성 마우스 유전자, 예를 들어, c-mos와 같은 모체에서 발현된 유전자에 상동성인 후보물질 dssiRNA 화합물은 미성숙 마우스 난모세포에 주사되어 제제가 생체내에서 유전자 발현을 억제하는 능력을 평가할 수 있다(예를 들어, WO 01/36646 참조). 난모세포의 표현형, 예를 들어, 중기 II에서 정지를 유지하는 능력은 제제가 발현을 억제하고 있다는 지표로서 모니터링될 수 있다. 예를 들어, dssiRNA 화합물에 의한 c-mos mRNA의 분해는 난모세포가 중기 정지를 종료하고 단위생식 발달을 개시하게 할 것이다(Colledge et al. Nature 370: 65-68, 1994; Hashimoto et al. Nature, 370:68-71, 1994). 타겟 RNA 수준에 대한 변형된 제제의 효과는 음성 대조군과 비교하여, 타겟 mRNA 수준의 감소에 대해 검정하는 노던 블롯에 의해, 또는 타겟 단백질의 수준 감소에 대해 검정하는 웨스턴 블롯에 의해 검증될 수 있다. 대조군은 제제가 첨가되지 않은 세포 및/또는 비-변형 RNA가 첨가된 세포를 포함할 수 있다.
생리적 효과
본원에 기재된 siRNA 화합물은 인간 및 비-인간 동물 서열 둘 모두와 siRNA의 상보성에 의해 치료 독성의 결정이 더 용이하도록 설계될 수 있다. 이러한 방법에 의해, siRNA는 인간으로부터의 핵산 서열 및 적어도 하나의 비-인간 동물, 예를 들어, 비-인간 포유류, 예컨대, 설치류, 반추류 또는 영장류로부터의 핵산 서열과 완전 상보적인 서열로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 비-인간 포유류는 마우스, 래트, 개, 돼지, 염소, 양, 소, 원숭이, 판 파니스쿠스(Pan paniscus), 판 트로글로디테스(Pan troglodytes), 마카카 물라토(Macaca mulatto), 또는 시노몰구스(Cynomolgus) 원숭이일 수 있다. siRNA 화합물의 서열은 비-인간 포유류 및 인간의 상동성 유전자, 예를 들어, 종양유전자 또는 종양 억제 유전자 내에서 서열과 상보적일 수 있다. 비-인간 포유류에서 siRNA 화합물의 독성을 결정함으로써, 인간에서 siRNA 화합물의 독성이 추정될 수 있다. 보다 강도 높은 독성 시험의 경우, siRNA는 인간 및 하나보다 많은, 예를 들어, 2개 또는 3개 이상의 비-인간 동물과 상보적일 수 있다.
본원에 기재된 방법은 인간에 대한 siRNA 화합물의 임의의 생리적 효과, 예를 들어, 임의의 원치 않는 효과, 예컨대, 독성 효과, 또는 임의의 긍정적인 또는 요망되는 효과를 상관관계하는 데 사용될 수 있다.
siRNA의 세포 흡수 증가
siRNA의 세포 흡수 및/또는 세포내 타겟화를 증가시키는 공유 부착된 접합체를 함유하는 다양한 siRNA 조성물이 본원에 기재된다.
추가로, siRNA 화합물 및 세포 내 siRNA의 흡수에 영향을 미치는 약물을 투여하는 단계를 포함하는 본 발명의 방법이 제공된다. 약물은 siRNA 화합물이 투여되기 전에, 그 후에, 또는 동시에 투여될 수 있다. 약물은 siRNA 화합물에 공유 또는 비-공유 연결될 수 있다. 약물은, 예를 들어, 지질다당류, p38 MAP 키나제의 활성화제, 또는 NF-κB의 활성화제일 수 있다. 약물은 세포에 대한 일시적 효과를 가질 수 있다. 약물은, 예를 들어, 세포의 세포골격을 파열시킴으로써, 예를 들어, 세포의 미세소관, 미세섬유 및/또는 중간 필라멘트를 파열시킴으로써 세포의 siRNA 화합물의 흡수를 증가시킬 수 있다. 약물은 예를 들어, 탁손, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 사이토칼라신, 노코다졸, 야플라키놀리드, 라트룬쿨린 A, 팔로이딘, 스윈홀라이드 A, 인다노신, 또는 마이오세르빈일 수 있다. 약물은 또한, 예를 들어, 염증 반응을 활성화시킴으로써 siRNA 화합물의 주어진 세포 또는 조직으로의 흡수를 증가시킬 수 있다. 이러한 효과를 갖는 예시적인 약물로는, 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파), 인터루킨-1 베타, CpG 모티프, 감마 인터페론 또는 더욱 일반적으로는 톨-유사 수용체를 활성화시키는 제제를 포함한다.
siRNA 생산
siRNA는, 예를 들어, 벌크로, 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예시적인 방법은 유기 합성 및 RNA 분해, 예를 들어, 시험관내 분해를 포함한다.
유기 합성. siRNA는 개별적으로 단일 가닥 RNA 분자, 또는 이중-가닥 RNA 분자의 각각의 개개 가닥을 합성함으로써 제조될 수 있고, 그 후에 구성 가닥이 이후 어닐링될 수 있다.
대형 생물반응기, 예를 들어, Pharmacia Biotec AB(스웨덴 웁살라)로부터의 OligoPilot II는 주어진 siRNA에 대해 다량의 특정 RNA 가닥을 생성시키기 위해 사용될 수 있다. OligoPilotII 반응기는 단지 1.5 몰 과량의 포스포라미다이트 뉴클레오타이드를 사용하여 뉴클레오타이드를 효율적으로 커플링할 수 있다. RNA 가닥을 제조하기 위해, 리보뉴클레오타이드 아미다이트가 사용된다. 단량체 첨가의 표준 사이클이 siRNA에 대해 21개 내지 23개의 뉴클레오타이드 가닥을 합성하기 위해 사용될 수 있다. 전형적으로, 두 개의 상보적 가닥은 별개로 생성된 후, 예를 들어, 고형 지지체로부터의 방출 및 탈보호 후에 어닐링된다.
유기 합성은 별개의 siRNA 종을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 특정 타겟 유전자에 대한 종의 상보성은 정확하게 명시될 수 있다. 예를 들어, 종은 다형체, 예를 들어, 단일 뉴클레오타이드 다형체를 포함하는 영역과 상보적일 수 있다. 추가로, 다형체의 위치는 정확하게 규정될 수 있다. 일부 구현예에서, 다형체는 내부 영역, 예를 들어, 하나의 말단 또는 양 말단으로부터 적어도 4개, 5개, 7개, 또는 9개 뉴클레오타이드에 위치한다.
dsiRNA 분해. siRNA는 또한 보다 큰 siRNA를 분해함으로써 제조될 수 있다. 분해는 시험관내 또는 생체내에서 매개될 수 있다. 예를 들어, 시험관내에서 분해에 의해 iRNA를 생성시키기 위해, 하기 방법이 이용될 수 있다:
시험관내 전사. dsiRNA는 양 방향으로 핵산(DNA) 세그먼트를 번역함으로써 생성된다. 예를 들어, HiScribe™ RNAi 전사 키트(New England Biolabs)은 벡터를 T7 프로모터에 의해 양측에 측접된 위치에서 벡터에 클로닝된 핵산 세그먼트에 대해 dsiRNA를 생성시키기 위한 벡터 및 방법을 제공한다. 별개의 주형이 dsiRNA에 대한 두 개의 상보적 가닥의 T7 전사에 대하여 생성되었다. 주형은 T7 RNA 폴리머라제의 첨가에 의해 시험관내에서 번역되고, dsiRNA가 생성된다. PCR 및/또는 다른 RNA 폴리머라제(예를 들어, T3 또는 SP6 폴리머라제)를 사용하는 유사한 방법이 또한 재조합 효소의 제제를 오염시킬 수 있는 도톡신일 수 있다.
시험관내 분해. 일 구현예에서, 이러한 방법에 의해 생성된 RNA는, 예를 들어, 다이서 또는 필적 가능한 RNAse III-기반 활성을 이용하여 시험관내에서 siRNA로 분해되는 말단siRNA를 제거하기 위해 주의하여 정제된다. 예를 들어, dsiRNA는 초파리로부터 또는 정제된 구성분, 예를 들어, 정제된 RNAse 또는 RISC 복합체(RNA-유도 사일런싱 복합체)를 사용하여 시험관내 추출물에서 인큐베이션될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ketting et al. Genes Dev 2001 Oct 15;15(20):2654-9] 및 문헌[Hammond Science 2001 Aug 10;293(5532):1146-50]을 참조하라.
dsiRNA 분해는 일반적으로, 각각 소스 dsiRNA 분자의 특정 21 nt 내지 23 nt 단편인, 복수의 siRNA 종을 생성시킨다. 예를 들어, 소스 dsiRNA 분자의 오버랩핑 영역 및 인접 영역과 상보적인 서열을 포함하는 siRNA가 존재할 수 있다.
합성 방법에 상관없이, siRNA 제제는 제형화에 적절한 용액(예를 들어, 수용액 및/또는 유기 용액)에서 제조될 수 있다. 예를 들어, siRNA 제제는 순수한 이중-증류수에서 침전되고 재용해되고, 동결건조될 수 있다. 건조된 siRNA는 이후 의도된 제형화 공정에 적절한 용액에서 재현탁될 수 있다.
친유성 모이어티에 접합된 이중-가닥 iRNA 제제의 제조
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 뉴클레오베이스, 당 모이어티, 또는 뉴클레오사이드간 결합을 통해 이중-가닥 iRNA 제제에 접합된다.
퓨린 뉴클레오베이스 또는 이의 유도체에 대한 접합은 내향고리 및 외향 고리 원자를 포함하여 임의의 위치에서 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 퓨린 뉴클레오베이스의 2-, 6-, 7-, 또는 8-위치는 접합체 모이어티에 부착된다. 피리미딘 뉴클레오베이스 또는 이의 유도체에 대한 접합은 또한 임의의 위치에서 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 피리미딘 뉴클레오베이스의 2-, 5-, 및 6-위치는 접합체 모이어티로 치환될 수 있다. 친유성 모이어티가 뉴클레오베이스에 접합되는 경우, 바람직한 위치는 혼성화를 방해하지 않는, 즉, 염기 페이링에 필요한 수소 결합 상호작용을 방해하지 않는 위치이다. 일 구현예에서, 친유성 모이어티는 알킬, 알케닐 또는 아미드 결합을 함유하는 링커를 통해 뉴클레오베이스에 접합될 수 있다. 뉴클레오베이스에 대한 친유성 모이어티의 예시적인 접합은 도 1 및 실시예 7에서 예시된다.
뉴클레오사이드의 당 모이어티에 대한 접합은 임의의 탄소 원자에서 발생할 수 있다. 친유성 모이어티가 부착될 수 있는 당 모이어티의 예시적인 탄소 원자는 2', 3', 및 5' 탄소 원자를 포함한다. 친유성 모이어티는 또한 무염기 잔기에서와 같이 1' 위치에 부착될 수 있다. 일 구현예에서, 친유성 모이어티는 링커로 또는 링커 없이 2'-O 변형을 통해 당 모이어티에 접합될 수 있다. 당 모이어티에 대한 친유성 모이어티의 예시적인 접합(2'-O 변형을 통해)은 도 1 및 실시예 1, 실시예 2, 실시예 3, 및 실시예 6에 예시되어 있다.
뉴클레오사이드간 결합은 또한 친유성 모이어티를 가질 수 있다. 인-함유 결합(예를 들어, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오테이트, 및 포스포로아미데이트 등)을 위해, 친유성 모이어티는 직접적으로 인 원자에 또는 인 원자에 결합된 O, N, 또는 S 원자에 부착될 수 있다. 아민- 또는 아미드-함유 뉴클레오사이드간 결합(예를 들어, PNA)을 위해, 친유성 모이어티는 아민 또는 아미드의 질소 원자에 또는 인접한 탄소 원자에 부착될 수 있다.
올리고뉴클레오타이드의 접합체를 제조하기 위한 수많은 방법이 존재한다. 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 상의 반응성 기(예를 들어, OH, SH, 아민, 카르복실, 및 알데하이드 등)를 접합체 모이어티 상의 반응성 기와 접촉시킴으로써 접합체 모이어티에 부착된다. 일부 구현예에서, 하나의 반응성 기는 친전자성이고, 다른 기는 친핵성이다.
예를 들어, 친전자성 기는 카르보닐-함유 작용기일 수 있고, 친핵성 기는 아민 또는 티올일 수 있다. 연결기로 및 연결기 없이 핵산 및 관련 올리고머 화합물의 접합 방법은, 예를 들어, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 문헌[Manoharan in Antisense Research and Applications, Crooke and LeBleu, eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993, 챕터 17]와 같은 문헌에 잘 기술되어 있다.
일 구현예에서, 제1(상보적) RNA 가닥 및 제2(센스) RNA 가닥은 개별적으로 합성될 수 있고, 여기서 RNA 가닥 중 하나는 펜던트 친유성 모이어티를 포함하고, 제1 및 제2 RNA 가닥은 혼합되어 dsRNA를 형성시킨다. RNA 가닥을 합성하는 단계는 바람직하게는 고체-상 합성을 포함하며, 여기서 개별 뉴클레오타이드는 연속적인 합성 사이클에서 뉴클레오타이드간 3'-5' 포스포디에스테르 결합의 형성을 통해 말단에서 말단으로 접합된다.
일 구현예에서, 포스포라미다이트 기를 갖는 친유성 분자는 마지막 합성 사이클에서 제1(상보적) 또는 제2(센스) RNA 가닥의 3'-말단 또는 5'-말단에 커플링된다. RNA의 고체-상 합성에서, 뉴클레오타이드는 처음에 뉴클레오사이드 포스포라미다이트의 형태이다. 각 합성 사이클에서, 추가 뉴클레오사이드 포스포라미다이트는 이전에 혼입된 뉴클레오타이드의 -OH 기에 연결된다. 친유성 분자가 포스포라미다이트 기를 갖는 경우, 이는 고체-상 합성에서 이전에 합성된 RNA의 자유 OH 말단에 대한 뉴클레오사이드 포스포라미다이트와 유사한 방식으로 커플링될 수 있다. 합성은 통상적인 RNA 합성기를 이용하여 자동화된 및 표준화된 방식으로 일어날 수 있다. 포스포라미다이트 기를 갖는 친유성 분자의 합성은 포스포라미다이트 기를 생성시키기 위해 자유 하이드록실의 포스피틸화를 포함할 수 있다.
친유성 모이어티-접합된 포스포라미다이트의 합성 절차는 실시예 1, 실시예 2, 실시예 4, 실시예 5, 실시예 6, 및 실시예 7에서 예시된다. 친유성 모이어티 또는 다른 리간드의 합성 후 접합의 절차에 대한 예는 실시예 3에서 예시된다.
일반적으로, 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어, 각각 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는, 문헌[Caruthers et al., Methods in Enzymology (1992) 211:3-19]; WO 99/54459; 문헌[Wincott et al., Nucl. Acids Res. (1995) 23:2677-2684]; 문헌[Wincott et al., Methods Mol. Bio., (1997) 74:59]; 문헌[Brennan et al., Biotechnol. Bioeng. (1998) 61:33-45]; 및 미국 특허 No. 6,001,311에 기재된 바와 같이 당업계에 알려진 프로토콜을 이용하여 합성될 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드의 합성은 5'-말단에 디메톡시트리릴, 및 3'-말단에 포스포라미다이트와 같이 통상적인 핵산 보호 및 커플링기를 포함한다. 비-제한적 예에서, 소규모 합성이 ChemGenes Corporation(애슐랜드, 매사추세츠)에 의해 시판되는 리보뉴클레오사이드 포스포라미다이트를 사용하여 Applied Biosystems, Inc.(바이터슈타트, 독일)에 의해 시판되는 Expedite 8909 RNA 합성기에서 실시된다. 대안적으로, 합성은 96-웰 플레이트 합성기, 예컨대, Protogene(팰로앨토, 캘리포니아)에 의해 생산된 기기에서, 또는 각각 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 문헌[Usman et al., J. Am. Chem. Soc. (1987) 109:7845]; 문헌[Scaringe, et al., Nucl. Acids Res. (1990) 18:5433]; 문헌[Wincott, et al., Nucl. Acids Res. (1990) 23:2677-2684]; 및 문헌[Wincott, et al., Methods Mol. Bio. (1997) 74:59]에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 개별적으로 합성되고, 합성 후에, 예를 들어, 결찰(문헌[Moore et al., Science (1992) 256:9923]; WO 93/23569; 문헌[Shabarova et al., Nucl. Acids Res. (1991) 19:4247]; 문헌[Bellon et al., Nucleosides & Nucleotides (1997) 16:951]; 문헌[Bellon et al., Bioconjugate Chem. (1997) 8:204]에 의해; 또는 합성 및/또는 탈보호 후 혼성화에 의해 함께 접합될 수 있다. 핵산 분자는 통상적인 방법을 이용하여 겔 전기영동에 의해 정제될 수 있거나, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC; 그 전체가 여기서 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 상기 Wincott 등의 문헌 참조)에 의해 정제되고 물에서 재현탁될 수 있다.
약제학적 조성물
하나의 양태에서, 본 발명은 타겟 RNA와 상보적인, 예를 들어, 실질적으로 및/또는 정확히 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 타겟 RNA는 내인성 인간 유전자의 전사물일 수 있다. 일 구현예에서, siRNA 화합물은 (a)가 19개 내지 25개 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 21개 내지 23개 뉴클레오타이드이고, (b)는 내인성 타겟 RNA와 상보적이고, 선택적으로, (c)는 적어도 하나의 3' 오버행 1 nt 내지 5 nt 길이를 포함한다. 일 구현예에서, 약학적 조성물은 에멀젼, 마이크로에멀젼, 크림, 젤리, 또는 리포좀일 수 있다.
일 예에서, 약학적 조성물은 국소 전달제와 혼합된 siRNA 화합물을 포함한다. 국소 전달제는 복수의 미세 소수포일 수 있다. 미세 소수포는 리포좀일 수 있다. 일부 구현예에서, 리포좀은 양이온성 리포좀이다.
또 다른 양태에서, 약학적 조성물은 국소적 침투 증진제와 혼합된 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)를 포함한다. 일 구현예에서, 국소 침투 증진제는 지방산이다. 지방산은 아라키돈산, 올레산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 또는 C1-10 알킬 에스테르, 모노글리세라이드, 디글리세라이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 국소 침투 증진제는 담즙염이다. 담즙염은 콜릭산, 데하이드로콜릭산, 데옥시콜릭산, 글루콜릭산, 글리콜릭산, 글리코데옥시콜릭산, 타우로콜릭산, 타우로데옥시콜릭산, 케노데옥시콜릭산, 우르소데옥시콜릭산, 소듐 타우로-24,25-디하이드로-푸시데이트, 소듐 글리코디하이드로푸시데이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 침투 증진제는 킬레이팅제이다. 킬레이팅제는 EDTA, 시트르산, 살리실레이트, 콜라겐의 N-아실 유도체, 라우레쓰-9, 베타-디케톤의 N-아미노 아실 유도체 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 침투 증진제는 계면활성제, 예를 들어, 이온성 또는 비이온성 계면활성제이다. 계면활성제는 소듐 라우릴 설페이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르, 퍼플루오르화합물 에멀젼 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 침투 증진제는 불포화 사이클릭 우레아, 1-알킬-알콘, 1-알케닐아자사이클로-알카논, 스테로이드성 항-염증제 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 추가의 또 다른 구현예에서, 침투 증진제는 글리콜, 피롤, 아존, 또는 테르펜일 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 경구 전달에 적합한 형태의 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 일 구현예에서, 경구 전달은 siRNA 화합물 조성물을 위장관, 예를 들어 소장, 결장(예를 들어, 결장암 치료를 위해) 등의 세포 또는 영역에 전달하는 데 사용될 수 있다. 경구 전달 형태는 정제, 캡슐 또는 겔 캡슐일 수 있다. 일 구현예에서, 약학적 조성물의 siRNA 화합물은 세포 접착 단백질의 발현을 조절하거나, 세포 증식 속도를 조절하거나, 진핵 병원체 또는 레트로바이러스에 대항하는 생물학적 활성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 포유류 위에서 정제, 캡슐 또는 겔 캡슐의 용해를 실질적으로 방지하는 장용 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 장용 물질은 코팅이다. 코팅은 아세테이트 프탈레이트, 프로필렌 글리콜, 소르비탄 모노놀레에이트, 셀룰로스 아세테이트 트리멜리테이트, 하이드록시 프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트 또는 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 약학적 조성물의 경구 투여형은 침투 증진제를 포함한다. 침투 증진제는 담즙염 또는 지방산일 수 있다. 담즙염은 우르소데옥시콜릭산, 케노데옥시콜릭산, 및 이의 염일 수 있다. 지방산은 카프르산, 라우르산, 및 이의 염일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 약학적 조성물의 경구 투여형은 부형제를 포함한다. 일 예에서, 부형제는 폴리에틸렌글리콜이다. 또 다른 예에서, 부형제는 프레시롤이다.
또 다른 구현예에서, 약학적 조성물의 경구 투여형은 가소제를 포함한다. 가소제는 디에틸 프탈레이트, 트리아세틴 디부틸 세바케이트, 디부틸 프탈레이트 또는 트리에틸 시트레이트일 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 siRNA 화합물 및 전달 비히클을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 일 구현예에서, siRNA 화합물은 (a)가 19개 내지 25개 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 21개 내지 23개 뉴클레오타이드이고, (b)는 내인성 타겟 RNA와 상보적이고, 선택적으로, (c)는 적어도 하나의 3' 오버행 1개 내지 5개 뉴클레오타이드 길이를 포함한다.
일 구현예에서, 전달 비히클은 국소적 투여 경로에 의해 세포에 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)을 전달할 수 있다. 전달 비히클은 미세 소수포일 수 있다. 일 예에서, 미세 소수포는 리포좀이다. 일부 구현예에서, 리포좀은 양이온성 리포좀이다. 또 다른 예에서, 미세 소수포는 미셀이다. 하나의 양태에서, 본 발명은 주사용 투여형의 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 일 구현예에서, 약학적 조성물의 주사용 투여형은 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 일부 구현예에서, 멸균 용액은 희석제, 예컨대, 물; 염류 용액; 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 또는 프로필렌 글리콜을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 경구 투여형의 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 일 구현예에서, 경구 투여형은 정제, 캡슐 및 겔 캡슐로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 포유류 위에서 정제, 캡슐 또는 겔 캡슐의 용해를 실질적으로 방지하는 장용 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 장용 물질은 코팅이다. 코팅은 아세테이트 프탈레이트, 프로필렌 글리콜, 소르비탄 모놀레에이트, 셀룰로스 아세테이트 트리멜리테이트, 하이드록시 프로필 메틸 셀룰로스 프탈레이트 또는 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트일 수 있다. 일 구현예에서, 약학적 조성물의 경구 투여형은 침투 증진제, 예를 들어, 본원에 기재된 침투 증진제를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 약학적 조성물의 경구 투여형은 부형제를 포함한다. 일 예에서, 부형제는 폴리에틸렌글리콜이다. 또 다른 예에서, 부형제는 프레시롤이다.
또 다른 구현예에서, 약학적 조성물의 경구 투여형은 가소제를 포함한다. 가소제는 디에틸 프탈레이트, 트리아세틴 디부틸 세바케이트, 디부틸 프탈레이트 또는 트리에틸 시트레이트일 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 직장 투여형의 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 일 구현예에서, 직장 투여형은 관장제이다. 또 다른 구현예에서, 직장 투여형은 좌제이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 질 투여형의 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 일 구현예에서, 질 투여형은 좌제이다. 또 다른 구현예에서, 질 투여형은 발포체, 크림, 또는 겔이다.
하나의 양태에서, 본 발명은 폐 또는 비내 투여형의 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 일 구현예에서, siRNA 화합물은 입자, 예를 들어, 거대입자, 예를 들어, 미소구체로 혼입된다. 입자는 분무 건조, 동결건조, 증발, 유동층 건조, 진공 건조, 또는 이들의 조합에 의해 생성될 수 있다. 미소구체는 현탁액, 분말, 또는 이식가능한 고형물로서 제형화될 수 있다.
치료 방법 및 전달 경로
본 발명의 또 다른 양태는 세포에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 상기 세포를 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 세포는 간외 세포이다.
본 발명의 또 다른 양태는 피험자에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 CNS 장애를 갖는 피험자를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 본 발명의 이중-가닥 RNAi 제제를 피험자에게 투여하고, 이에 의해 피험자를 치료하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 예시적인 CNS 장애는 알츠하이머, 근위축성 축삭 경화증(ALS), 전측두엽 치매, 헌팅턴, 파킨슨, 척수소뇌, 프리온 및 라포라를 포함한다.
본 발명의 이중-가닥 iRNA 제제는 타겟화되는 유전자의 유형 및 치료하고자 하는 장애의 유형에 좌우하여 다양한 경로에 의해 피험자에게 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 간외로, 예컨대, 안구 투여(예를 들어, 유리체내 투여) 또는 척수강내 투여로 투여된다.
일 구현예에서, 이중 가닥 iRNA 제제는 척수강내로 투여된다. 이중-가닥 iRNA 제제의 척수강내 투여에 의해, 방법은 뇌 또는 척추 조직, 예를 들어, 피질, 소뇌, 경추, 요추 및 흉추에서 타겟 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 예시적인 타겟 유전자는 APP, ATXN2, C9orf72, TARDBP, MAPT(Tau), HTT, SNCA, FUS, ATXN3, ATXN1, SCA1, SCA7, SCA8, MeCP2, PRNP, SOD1, DMPK, 및 TTR이다. 피험자에서 이러한 타겟 유전자의 발현을 감소시키기 위해, 이중-가닥 iRNA 제제는 유리체내로 투여될 수 있다. 이중-가닥 iRNA 제제의 유리체내 투여에 의해, 방법은 안구 조직에서 타겟 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.
제형화에 대한 설명의 용이함을 위해, 본 섹션에서 조성물 및 방법은 대체로 변형 siRNA 화합물과 관련하여 논의된다. 그러나, 이러한 제형화, 조성물 및 방법은 다른 siRNA 화합물, 예를 들어, 비변형 siRNA 화합물로 실시될 수 있으며, 그러한 실시는 본 발명의 내에 있다는 것이 이해될 수 있다. iRNA를 포함하는 조성물은 다양한 경로에 의해 피험자에게 전달될 수 있다. 예시적인 경로는 정맥내, 국소, 직장, 항문, 질, 비내, 폐, 안구를 포함한다.
본 발명의 iRNA 분자는 투여에 적절한 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 이런 조성물은 전형적으로, siRNA 화학종 하나 이상 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본원에서, 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는, 약학적 투여와 융화성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성제 및 흡수지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 약학적 활성 성분에 대한 이런 매질 및 제제의 사용은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 임의의 종래 매질 또는 제제가 활성 화합물과 비융화성인 점을 제외하고는, 조성물에서 이의 사용이 고려된다. 보충적 활성 화합물이 또한 이 조성물에 혼입될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 국소 또는 전신 치료가 바람직한지의 여부, 및 치료 영역에 따라, 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는(안내, 질, 직장, 비내, 경피를 비롯하여) 국소 투여, 경구 투여 또는 비경구 투여일 수 있다. 비경구 투여로는, 정맥내 드립(drip), 피하, 복강내 또는 근육내 주사, 또는 척추강내 또는 뇌실내 투여를 포함한다.
투여 경로 및 부위는 타겟화를 증대시키도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 근육 세포를 타겟으로 하기 위해서는, 목적하는 근육으로 근육내 주사하는 것이 타당한 선택일 것이다. 폐세포는 iRNA를 에어로졸 형태로 투여함으로써 타겟화될 것이다. 혈관 내피 세포는 벌룬 카테터(balloon catheter)를 iRNA로 코팅하고 DNA를 기계적으로 도입함으로써 타겟화될 수 있다.
국소 투여용 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적약, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 약학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 베이스, 및 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다. 코팅된 콘돔, 및 장갑 등도 유용할 수 있다.
경구 투여용 조성물은 분말 또는 과립, 물, 시럽, 엘릭서 또는 비-수성 매질 중의 현탁액 또는 용액, 정제, 캡슐, 로젠지 또는 트로키를 포함한다. 정제의 경우에, 사용될 수 있는 담체는 락토스, 소듐 시트레이트 및 인산의 염을 포함한다. 다양한 붕해제, 예컨대, 전분, 및 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 라우릴 설페이트 및 탈크가 정제에 흔히 사용된다. 캡슐 형태의 경구 투여를 위해, 유용한 희석제는 락토스 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜이다. 수성 현탁액이 경구 사용에 필요한 경우, 핵산 조성물은 유화제 및 현탁화제와 조합될 수 있다. 요망되는 경우, 특정 감미제 및/또는 향미제가 첨가될 수 있다.
척수강내 또는 뇌실내 투여용 조성물은, 또한 완충제, 희석제 및 기타 적합한 첨가제를 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제형은, 또한 완충제, 희석제 및 기타 적합한 첨가제를 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다. 뇌실내 주사는, 예를 들어, 저장소에 부착된 뇌실내 카테터에 의해 용이해질 수 있다. 정맥내 사용을 위해, 용질의 최종 농도는 제제를 등장성으로 만들도록 제어될 수 있다.
안구 투여를 위해, 연고 또는 점적 가능한 액체는 어플리케이터 또는 점안제와 같은 당업계에 알려진 안구 전달 시스템에 의해 전달될 수 있다. 이러한 조성물은 무코모방체, 예컨대, 하이알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 또는 폴리(비닐 알코올), 보존제, 예컨대, 소르브산, EDTA 또는 벤질크로늄 클로라이드, 및 보통량의 희석제 및/또는 담체를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물 조성물의 투여는 비경구, 예를 들어, 정맥내(예를 들어, 볼루스 또는 분산형 투입), 피내, 복강내, 근육내, 척추강내, 뇌실내, 두개내, 피하, 경점막, 협측, 설하, 내시경적, 직장, 경구, 질, 국소, 폐, 비내, 요도 또는 안구이다. 투여는 피험자에 의해 또는 의료인과 같은 다른 사람에 의해 제공될 수 있다. 약제는 측정된 투약량, 또는 계량된 투약량을 전달하는 디스펜서(dispenser)로 제공될 수 있다. 선택된 전달 방식은 하기에서 보다 상세히 논의된다.
척수강내 투여. 일 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 척수강내 주사(즉, 뇌와 척수 조직을 담그는 척수액에 주사)에 의해 전달된다. 척수액으로의 iRNA 제제의 척수강내 주사는 볼루스 주사로서 또는 피부 아래에 이식될 수 있는 미니펌프를 통해 수행되어 척수액으로 siRNA의 정기적이고 지속적인 전달을 제공할 수 있다. 척수액이 생성되는 맥락막 신경총으로부터의 척수액 순환은 척수와 등쪽 뿌리 신경절 주위로 내려가 이어서 소뇌를 지나 피질 위에서 거미막 과립으로 올라가고, 여기서 유체가 CNS를 빠져나갈 수 있고, 주사된 화합물의 크기, 안정성 및 용해도에 좌우하여, 척수강내로 전달된 분자는 전체 CNS 전반에 걸쳐 타겟을 공격할 수 있다.
일부 구현예에서, 척수강내 투여는 펌프를 통해 이루어진다. 펌프는 외과적으로 이식된 삼투 펌프일 수 있다. 일 구현예에서, 삼투 펌프는 척수강내 투여를 용이하게 하기 위해 척추관의 지주막하 공간에 이식된다.
일부 구현예에서, 척수강내 투여는 소정 부피의 약학적 제제를 함유하는 저장소, 및 저장소에 함유된 약학적 제제의 일부를 전달하도록 구성된 펌프를 포함하는 약제용 척수강내 전달 시스템을 통해 이루어진다. 이러한 척수강내 전달 시스템에 관한 보다 상세한 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 2015년 1월 28일에 출원된 PCT/US2015/013253에서 찾아볼 수 있다.
척수강내에 주사된 iRNA 제제의 양은 하나의 타겟 유전자에서부터 또 다른 타겟 유전자까지 다를 수 있고, 적용되어야 하는 적절한 양은 각 타겟 유전자에 대하여 개별적으로 결정되어야 할 수 있다. 전형적으로, 이러한 양은 10 μg 내지 2 mg, 바람직하게는 50 μg 내지 1500 μg, 더욱 바람직하게는 100 μg 내지 1000 μg의 범위이다.
직장 투여. 본 발명은 또한 본원에 기재된 siRNA 화합물의 직장 투여 또는 전달을 위한 방법, 조성물, 및 키트를 제공한다.
이에 따라서, 본원에 기재된 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA), 예를 들어, 치료적 유효량의 본원에 기재된 siRNA 화합물, 예를 들어, 40개 미만, 예를 들어, 30개 미만의 뉴클레오타이드의 이중 가닥 영역을 갖고 하나 또는 두 개의 1 내지 3 뉴클레오타이드 단일 가닥 3' 오버행을 갖는 siRNA 화합물은 직장으로 투여되는, 예를 들어, 하부 또는 상부 결장으로 직장을 통해 도입될 수 있다. 이러한 접근법은 염증 장애, 원치 않는 세포 증식으로 특성규명되는 장애, 예를 들어, 폴립, 또는 결장암의 치료에 특히 유용하다.
약제는 약제의 전달을 위한 수단을 포함하는 분배 장치, 예를 들어, 결장 검사 또는 폴립 제거에 사용되는 것과 유사한 가요성 카메라-유도 장치를 도입함으로써 결장 부위에 전달될 수 있다.
siRNA 화합물의 직장 투여는 관장제에 의해 이루어진다. 관장제의 siRNA 화합물은 염류 또는 완충 용액에 용해될 수 있다. 직장 투여는 또한, 다른 성분, 예를 들어, 부형제, 예를 들어, 코코아 버터 또는 하이드로프로필메틸셀룰로스를 포함할 수 있는 좌제에 의해 이루어질 수 있다.
안구 전달. 본원에 기재된 iRNA 제제는 안구 조직에 투여될 수 있다. 예를 들어, 약제는 눈 또는 근처 조직의 표면에, 예를 들어, 눈꺼풀의 안쪽에 적용될 수 있다. 이들은 국소적으로, 예를 들어, 스프레이에 의해, 점적약에서, 세안제, 또는 연고로서 적용될 수 있다. 투여는 피험자에 의해 또는 의료인과 같은 다른 사람에 의해 제공될 수 있다. 약제는 측정된 투약량, 또는 계량된 투약량을 전달하는 디스펜서로 제공될 수 있다. 약제는 또한 눈의 안쪽에 투여될 수 있으며, 선택된 부위 또는 구조에 이를 도입할 수 있는 바늘 또는 다른 전달 장치에 의해 도입될 수 있다. 안구 치료는 눈 또는 근처 조직의 염증을 치료하는 데 특히 바람직하다.
소정의 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 눈에 직접적으로 눈주위, 결막, 테논하, 전안방내, 유리체내, 안구내, 전방 또는 후방 근접결막, 망막하, 결막하, 안구후, 또는 소관내 주사와 같이 안구 조직 주사에 의해; 카테터 또는 망막 펠릿, 안구내 삽입물, 좌제 또는 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질을 포함하는 임플란트와 같은 다른 배치 장치를 사용하여 눈에 직접 적용함으로써; 국소적 안구 점적약 또는 연고에 의해; 또는 맹낭에서 서방형 장치에 의해 전달되거나, 공막(경공막)에 인접하게 또는 공막에(공막내) 또는 눈 안에 이식될 수 있다. 전안방내 주사는 각막을 거쳐 전방 챔버로 제제가 섬유주대에 도달하게 할 수 있다. 소관내 주사는 쉴렘관을 드레이닝하는 정맥 수집 통로로 또는 쉴렘관으로 이루어질 수 있다.
일 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 의료인이 사용하기 위해 즉시 주사 가능한 형태의 예비-충전된 주사기와 같은 유리체내 주사에 의해 눈, 예를 들어, 눈의 유리체방에 투여될 수 있다.
안과 전달을 위해, 이중-가닥 iRNA 제제는 안과적으로 허용 가능한 보존제, 보조용매, 계면활성제, 점도 증진제, 침투 증진제, 완충제, 염화나트륨 또는 물과 조합되어 수성 멸균 안과 현탁액 또는 용액을 형성할 수 있다. 용액 제형은 생리적으로 허용 가능한 등장성 수성 완충액에 접합체를 용해시킴으로써 제조될 수 있다. 추가로, 용액은 이중-가닥 iRNA 제제를 용해시키는 데 도움을 주는 허용 가능한 계면활성제를 포함할 수 있다. 점도 결합제, 예컨대, 하이드록시메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 또는 폴리비닐피롤리돈 등은 이중-가닥 iRNA 제제의 보유를 향상시키기 위해 약학적 조성물에 첨가될 수 있다.
멸균 안내 연고 제형을 제조하기 위해, 이중-가닥 iRNA 제제는 적절한 비히클, 예컨대, 미네랄 오일, 액체 라놀린, 또는 백색 페트롤라툼에서 보존제와 조합된다. 멸균 안내 겔 제형은 당업계에 공지된 방법에 따라, 예를 들어, CARBOPOL®-940(BF Goodrich, 샬럿, N.C.) 등의 조합으로부터 제조된 친수성 베이스에 이중-가닥 iRNA 제제를 현탁시킴으로써 제조될 수 있다.
국소 전달. 임의의 본원에 기재된 siRNA 화합물은 피부에 직접적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 약제는 국소적으로 적용되거나, 예를 들어, 피부에 침투하지만, 예를 들어, 아래의 근육 조직에는 침투하지 않는 미세바늘 또는 미세바늘의 배터리를 사용하여 피부 층에 전달될 수 있다. siRNA 화합물 조성물의 투여는 국소적일 수 있다. 예를 들어, 국소 적용은 조성물을 피험자의 진피 또는 표피에 전달할 수 있다. 국소 투여는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적약, 좌제, 스프레이, 액체 또는 분말의 형태일 수 있다. 국소 투여용 조성물은 리포좀, 미셀, 에멀젼, 또는 기타 친유성 분자 조립체로서 제형화될 수 있다. 경피 투여는 적어도 하나의 침투 증진제로, 예컨대, 이온삼투, 음파영동, 및 초음파영동으로 적용될 수 있다.
제형화에 대한 설명의 용이함을 위해, 본 섹션에서 조성물 및 방법은 대체로 변형 siRNA 화합물과 관련하여 논의된다. 그러나, 이러한 제형화, 조성물 및 방법은 다른 siRNA 화합물, 예를 들어, 비변형 siRNA 화합물로 실시될 수 있으며, 그러한 실시는 본 발명의 내에 있다는 것이 이해될 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)은 국소 투여를 통해 피험자에게 전달된다. "국소 투여"는 피험자의 표면에 직접적으로 제형을 접촉시킴에 의한 피험자에 대한 전달을 지칭한다. 가장 일반적인 형태의 국소 전달은 피부에 대한 것이지만, 본원에 개시된 조성물은 또한 신체의 다른 표면, 예를 들어, 눈, 점막, 체강 표면 또는 내부 표면에 직접적으로 적용될 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 가장 흔한 국소 전달은 피부에 대한 것이다. 이 용어는 국소 및 경피를 포함하나 이로 한정되지 않는 여러 투여 경로를 포함한다. 이러한 투여 방식은 전형적으로 피부 투과 장벽의 침투 및 타겟 조직 또는 층으로의 효율적인 전달을 포함한다. 국소 투여는 표피 및 진피를 침투하고, 궁극적으로 조성물의 전신 전달을 달성하기 위한 수단으로 사용될 수 있다. 국소 투여는 또한 올리고뉴클레오타이드를 피험자의 표피 또는 진피, 또는 이의 특정 층, 또는 기저 조직에 선택적으로 전달하기 위한 수단으로 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "피부"는 동물의 표피 및/또는 진피를 지칭한다. 포유류 피부는 두 개의 주요한 별개의 층으로 이루어진다. 피부의 외층은 표피라 불린다. 표피는 각질층, 과립층, 척수층 및 기저층으로 구성되며, 각질층은 피부 표면에 있고 기저층은 표피의 가장 깊은 부분이다. 표피는 이의 신체 상 위치에 좌우하여 50 □m 내지 0.2 mm의 두께이다.
표피 아래에는 표피보다 상당히 더 두꺼운 진피가 있다. 진피는 주로 섬유 다발 형태의 콜라겐으로 구성된다. 콜라겐 다발은 특히 혈관, 림프 모세혈관, 땀샘, 신경 종말 및 면역학적 활성 세포에 대한 지지를 제공한다.
기관으로서의 피부의 주요 기능 중 하나는 물질의 체내 유입을 조절하는 것이다. 피부의 주요 투과 장벽은 다양한 분화 상태에 있는 여러 세포층으로부터 형성된 각질층에 의해 제공된다. 각질층에서 세포 사이의 공간은 피부 투과 장벽을 더 강화하기 위해 시일(seal)을 제공하는 격자-유사 형태로 배열된 상이한 지질로 채워진다.
피부에 의해 제공되는 투과 장벽은 약 750 Da 초과의 분자량을 갖는 분자에 대해 대체로 불투과성이도록 되어 있다. 더 큰 분자가 피부의 투과 장벽을 지나가기 위해서는 정상적인 삼투 이외의 기전이 이용되어야 한다.
여러 요인으로 투여되는 제제에 대한 피부의 투과성이 결정된다. 이러한 요소들은 치료되는 피부의 특징, 전달제의 특징, 약물과 전달제 그리고 약물과 피부 둘 모두 간의 상호작용, 적용되는 약물의 투약량, 치료 형태, 및 치료 후 요법을 포함한다. 표피 및 진피를 선택적으로 타겟화하기 위해, 미리선택된 층으로의 약물 침투를 가능하게 할 하나 이상의 침투 증진제를 포함하는 조성물을 제형화하는 것이 때때로 가능하다.
경피 전달은 지용성 치료제의 투여를 위한 중요한 경로이다. 진피는 표피보다 투과성이 더 높고, 그에 따라 마모되거나, 화상을 입거나, 벗겨진 피부를 통해 흡수가 훨씬 더 빠르다. 피부로의 혈류를 증가시키는 염증 및 기타 생리적 상태가 또한 경피 흡착을 향상시킨다. 이러한 경로를 통한 흡수는 유성 비히클(도찰제)의 사용에 의해 또는 하나 이상의 침투 증진제의 사용을 통해 증진될 수 있다. 경피 경로를 통해 본원에 개시된 조성물을 전달하는 다른 효과적인 방법은 피부의 수화 및 제어형 방출 국소 패치의 사용을 포함한다. 경피 경로는 전신 및/또는 국소 요법을 위해 본원에 개시된 조성물을 전달하는 잠재적으로 효과적인 수단을 제공한다.
또한, 이온삼투(전기장의 영향 하에 생물학적 막을 통해 이온 용질 전달)(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 163), 음파영동 또는 초음파영동(생물학적 막, 특히, 피부 및 각막에 걸쳐 다양한 치료제의 흡수 증진을 위해 초음파 사용)(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 166), 및 투여 위치 및 투여 부위에서의 머무름에 대한 비히클 특징 최적화(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 168)는 피부와 점막 부위에 걸쳐 국소적으로 적용된 조성물의 수송을 향상시키기 위한 유용한 방법일 수 있다.
제공된 조성물 및 방법은 또한 배양되거나 보존된 진피 조직에서 및 동물에서 시험관내 다양한 단백질 및 유전자의 기능을 검사하는 데 사용될 수 있다. 본 발명은 따라서 임의의 유전자의 기능을 검사하는 데 적용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 치료적으로 또는 예방적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 건선, 편평 태선, 독성 표피 괴사, 다형 홍반, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 악성 흑색종, 파제트병, 카포시 육종, 폐 섬유증, 라임병 및 피부의 바이러스, 진균 및 세균 감염과 같은 질환을 앓는 것으로 인지되거나 의심되는 동물의 치료를 위해 사용될 수 있다.
폐 전달. 임의의 본원에 기재된 siRNA 화합물은 폐기관계에 투여될 수 있다. 폐 투여는 흡입에 의해 또는 폐기관계로의 전달 장치 도입에 의해, 예를 들어, 약제를 분배할 수 있는 전달 장치를 도입함으로써 달성될 수 있다. 특정 구현예는 흡입에 의한 폐 전달 방법을 이용할 수 있다. 약제는 흡입될 수 있도록 충분히 작은 형태로, 예를 들어, 습성 또는 건성으로 약제를 전달하는 디스펜서에서 제공될 수 있다. 장치는 계량된 투약량의 약제를 전달할 수 있다. 피험자, 또는 또 다른 사람이 약제를 투여할 수 있다. 폐 전달은 폐 조직에 직접적으로 영향을 미치는 장애뿐만 아니라 다른 조직에 영향을 미치는 장애에 효과적이다. siRNA 화합물은 폐 전달을 위해 액체 또는 비액체, 예를 들어, 분말, 결정, 또는 에어로졸로서 제형화될 수 있다.
제형화에 대한 설명의 용이함을 위해, 본 섹션에서 조성물 및 방법은 대체로 변형 siRNA 화합물과 관련하여 논의된다. 그러나, 이러한 제형화, 조성물 및 방법은 다른 siRNA 화합물, 예를 들어, 비변형 siRNA 화합물로 실시될 수 있으며, 그러한 실시는 본 발명의 내에 있다는 것이 이해될 수 있다. siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)을 포함하는 조성물은 폐 전달에 의해 피험자에게 투여될 수 있다. 폐 전달 조성물은 분산액을 환자가 흡입함으로써 전달될 수 있고, 그에 따라, 분산액 내의 조성물, 예를 들어, iRNA가 폐에 도달할 수 있고, 폐에서 폐포 부위를 통해 직접 혈액 순환으로 용이하게 흡수될 수 있다. 폐 전달은 폐의 질환을 치료하기 위해 전신 전달과 국소 전달 둘 모두에 효과적일 수 있다.
폐 전달은 네뷸라이저, 에어로졸, 미세포 및 건조 분말-기반 제형의 사용을 포함하여 여러 접근법에 의해 달성될 수 있다. 전달은 액체 네뷸라이저, 에어로졸-기반 흡입기, 및 건조 분말 분산 장치로 달성될 수 있다. 투약량 계량 장치가 사용될 수 있다. 애토마이저 또는 흡입기 사용의 이점 중 하나는 장치가 자체적으로 함유되어 있기 때문에 오염 가능성이 최소화된다는 것이다. 예를 들어, 건조 분말 분산 장치는 건조 분말로서 용이하게 제형화될 수 있는 약물을 전달한다. iRNA 조성물은 동결건조되거나 분무-건조된 분말로서 단독으로 또는 적합한 분말 담체와 조합하여 안정하게 저장될 수 있다. 흡입용 조성물의 전달은, 장치에 도입될 때 에어로졸 약제의 투여 중 환자에게 용량 추적, 순응도 모니터링, 및/또는 투여 촉구를 가능하게 하는, 타이머, 용량 카운터, 시간 측정 장치, 또는 시간 표시기를 포함할 수 있는 투여 타이밍 부재에 의해 매개될 수 있다.
용어 "분말"은 자유 유동하고 흡입 장치에 용이하게 분산될 수 있고 후속적으로 피험자에 의해 흡입되어 입자가 폐에 도달하여 폐포로 침투할 수 있게 하는, 미분된 고체 입자로 이루어진 조성물을 의미한다. 따라서, 분말은 "호흡성"이라고 한다. 예를 들어, 평균 입도는 비교적 균일한 구형 모양 분포로 약 10 μm 미만의 직경이다. 일부 구현예에서, 직경은 약 7.5 μm 미만, 및 일부 구현예에서 약 5.0 μm 미만이다. 일반적으로, 입도 분포는 약 0.1 μm 내지 약 5 μm의 직경, 때때로, 약 0.3 μm 내지 약 5 μm이다.
용어 "건조"는 조성물이 약 10 중량%(% w) 미만, 일반적으로 약 5% w 미만, 및 일부 경우에 약 3% w.보다 적은 물의 수분 함량을 갖는다는 것을 의미한다. 건조 조성물은 입자가 에어로졸을 형성하도록 흡입 장치에 용이하게 분산가능하게 할 수 있다.
용어 "치료적 유효량"은 예상되는 생리적 반응을 제공하기 위해 치료하고자 하는 피험자에서 요망되는 수준의 약물을 제공하는 데 필요한 조성물에 존재하는 양이다.
용어 "생리적 유효량"은 요망되는 완화 또는 치유 효과를 제공하기 위해 피험자에게 전달되는 양이다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 담체가 폐에 대한 유의한 해로운 독성 효과 없이 폐에 취해질 수 있다는 것을 의미한다.
담체로서 유용한 유형의 약학적 부형제는 안정화제, 예컨대, 인간 혈청 알부민(HSA), 벌킹 제제, 예컨대, 탄수화물, 아미노산 및 폴리펩타이드; pH 조절제 또는 완충제; 염, 예컨대, 염화나트륨 등을 포함한다. 이러한 담체는 결정질 또는 비정질 형태일 수 있거나, 이 둘의 혼합일 수 있다.
특히 가치 있는 벌킹 제제는 상용성 탄수화물, 폴리펩타이드, 아미노산 또는 이들의 조합물을 포함한다. 적합한 탄수화물은 단당류, 예컨대, 갈락토스, D-만노스, 및 소르보스 등; 이당류, 예컨대, 락토스, 및 트레할로스 등; 사이클로덱스트린, 예컨대, 2-하이드록시프로필-.베타.-사이클로덱스트린; 및 다당류, 예컨대, 라피노스, 말토덱스트린, 및 덱스트란 등; 알디톨, 예컨대, 만니톨, 및 자일리톨 등을 포함한다. 탄수화물의 그룹은 락토스, 트레할로스, 라피노스 말토덱스트린, 및 만니톨을 포함할 수 있다. 적합한 폴리펩타이드는 아스파르탐을 포함한다. 아미노산은 아닐린 및 글리신을 포함하고, 일부 구현예에서는 글리신이 사용된다.
본 발명의 조성물의 소수 성분인 첨가제는 분무 건조 동안 형태 안정성을 위해 그리고 분말의 분산성을 향상하기 위해 포함될 수 있다. 이러한 첨가제들은 소수성 아미노산, 예컨대, 트립토판, 티로신, 류신, 및 페닐알라닌 등을 포함한다.
적합한 pH 조절제 또는 완충제는 유기산 및 염기로부터 제조된 유기염, 예컨대, 소듐 시트레이트, 및 소듐 아스코르베이트 등을 포함하고; 일부 구현예에서는 소듐 시트레이트가 사용될 수 있다.
미셀 iRNA 제형의 폐 투여는 테트라플루오로에탄, 헵타플루오로에탄, 디메틸플루오로프로판, 테트라플루오로프로판, 부탄, 이소부탄, 디메틸 에테르 및 기타 비-CFC 및 CFC 추진제와 같은 추진제가 있는 투약량 계량 스프레이 장치를 통해 달성될 수 있다.
경구 또는 비내 전달. 본원에 기재된 임의의 siRNA 화합물은 경구로, 예를 들어, 정제, 캡슐, 겔 캡슐, 로젠지, 트로키 또는 액체 시럽의 형태로 투여될 수 있다. 추가로, 조성물은 국소적으로 구강의 표면에 적용될 수 있다.
임의의 본원에 기재된 siRNA 화합물은 비내로 투여될 수 있다. 비내 투여는 비내로 전달 장치의 도입에 의해, 예를 들어, 약제를 분배할 수 있는 전달 장치를 도입함으로써 달성될 수 있다. 비내 전달 방법은, 예를 들어, 점적약에 의한, 또는 비강의 표면에 대한 국소 투여에 의한 스프레이, 에어로졸, 액체를 포함한다. 약제는 흡입될 수 있도록 충분히 작은 형태로, 예를 들어, 습성 또는 건성으로 약제를 전달하는 디스펜서에서 제공될 수 있다. 장치는 계량된 투약량의 약제를 전달할 수 있다. 피험자, 또는 또 다른 사람이 약제를 투여할 수 있다.
비내 전달은 비내 조직에 직접적으로 영향을 미치는 장애뿐만 아니라 다른 조직에 영향을 미치는 장애에 효과적이다. siRNA 화합물은 액체 또는 비액체, 예를 들어, 분말, 결정으로서 또는 비내 전달을 위해 제형화될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "결정질"은 결정의 구조 또는 특징을 갖는 고형물, 즉, 평면이 일정한 각도로 교차하고 규칙적인 내부 구조가있는 3-차원 구조의 입자를 말한다. 본 발명의 조성물은 상이한 결정질 형태를 가질 수 있다. 결정질 형태는, 예를 들어, 분무 건조를 포함하여 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다.
제형화에 대한 설명의 용이함을 위해, 본 섹션에서 조성물 및 방법은 대체로 변형 siRNA 화합물과 관련하여 논의된다. 그러나, 이러한 제형화, 조성물 및 방법은 다른 siRNA 화합물, 예를 들어, 비변형 siRNA 화합물로 실시될 수 있으며, 그러한 실시는 본 발명의 내에 있다는 것이 이해될 수 있다. 경구와 비점막 둘 모두 다른 투여 경로보다 이점을 제공한다. 예를 들어, 이러한 막들을 통해 투여되는 약물은 빠른 작용 개시를 가지며, 치료 혈장 수준을 제공하고, 간 대사의 첫 번째 통과 효과를 막고, 약물이 부적당한 위장관(GI) 환경에 노출되는 것을 막는다. 추가 이점들은 약물이 용이하게 적용되고, 국소화되고, 제거될 수 있는 막 부위로의 용이한 접근을 포함한다.
경구 전달에서, 조성물은 구강의 표면으로, 예를 들어, 혀의 앞면 및 입의 바닥의 점막을 포함하는 설하 점막 또는 볼의 내벽을 구성하는 볼 점막으로 타겟화될 수 있다. 설하 점막은 비교적 투과성이고, 그에 따라 다수 약물의 신속한 흡수 및 허용 가능한 생체이용률을 제공한다. 또한, 설하 점막은 편리하고, 허용 가능하며, 용이하게 접근가능하다.
구강 점막을 통해 침투하는 분자의 능력은 분자 크기, 지용성 및 펩타이드 단백질 이온화와 관련이 있는 것으로 보인다. 1000 달톤 미만의 소분자는 점막을 신속하게 지나가는 것으로 보인다. 분자 크기가 증가함에 따라, 투과성은 빠르게 감소한다. 지용성 화합물은 비-지용성 분자보다 더 투과성이다. 최대 흡수는 분자의 전하가 비이온화되거나 중성일 때 발생한다. 그러므로, 하전된 분자는 경구 점막을 통한 흡수에 가장 큰 난제를 제기한다.
iRNA의 약학적 조성물은 또한 투약량 계량 스프레이 디스펜서로부터 상술된 바와 같은 혼합된 미셀 약학적 제형 및 추진제를 흡입 없이 구강에 분무함으로써 인간의 구강으로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 디스펜서는 먼저 약학적 제형 및 추진제를 구강 내로 분무하기 전에 흔들어진다. 예를 들어, 약제는 구강으로 분무되거나, 예를 들어, 액체, 고체 또는 겔 형태로 구강 내 표면에 직접 적용될 수 있다. 이러한 투여는 구강, 예를 들어, 잇몸 또는 혀의 염증 치료에 특히 바람직하며, 예를 들어, 일 구현예에서, 구강 투여는, 예를 들어, 흡입 없이, 디스펜서, 예를 들어, 약학적 조성물 및 추진제를 분배하는 투약량 계량 스프레이 디스펜서로부터 구강으로 분무함으로써 이루어진다.
본 발명의 일 양태는 또한 척수강내 전달에 의해 CNS로 또는 유리체내에 의해 안구 조직으로 올리고뉴클레오타이드를 전달하는 방법에 관한 것이다.
일부 구현예는 세포에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 선택적으로 링커 또는 담체를 통해 올리고뉴클레오타이드에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오타이드와 상기 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 세포는 CNS계에서의 세포이다. 일 구현에에서, 세포는 안구 세포이다.
일부 구현예는 피험자에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 선택적으로 링커 또는 담체를 통해 올리고뉴클레오타이드에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드 접합체는 척수강내로 투여된다(뇌 또는 척추 조직에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키기 위해). 일 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드 접합체는 유리체내로 투여된다(안구 조직에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키기 위해).
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 이중-가닥이다. 일 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 타겟 유전자와 상보적인 안티센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥과 상보적인 센스 가닥을 포함하는 이중-가닥 iRNA 제제이다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 단일-가닥이다. 일 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 안티센스이다.
일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 올리고뉴클레오타이드의 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에 접합된다. 일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 올리고뉴클레오타이드의 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 말단 위치에 접합된다.
키트
소정의 다른 양태에서, 본 발명은 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)의 약학적 제형을 함유하는 적합한 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 소정의 구현예에서, 약학적 제형의 개별 성분들은 하나의 용기에서 제공될 수 있다. 대안적으로, 둘 이상의 용기, 예를 들어, siRNA 화합물 제제를 위한 하나의 용기, 및 담체 화합물을 위한 적어도 또 다른 용기에서 개별적으로 약학적 제형의 성분을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 키트는 단일 박스에 다수의 상이한 배치, 예컨대, 하나 이상의 용기에 패키징될 수 있다. 상이한 성분들이, 예를 들어, 키트와 제공되는 설명서에 따라 조합될 수 있다. 성분들은, 예를 들어, 약학적 조성물을 제조하고 투여하기 위해 본원에 기재된 방법에 따라 조합될 수 있다. 키트는 또한 전달 장치를 포함할 수 있다.
본 발명은 다음의 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가로 한정하는 것으로 여겨져서는 안된다. 본 출원 전체에 걸쳐 인용되는 모든 참조문헌, 계류중인 특허 출원 및 공개 특허의 내용들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 명시적으로 포함된다.
실시예
이제 일반적으로 기술되는 본 발명은 하기 실시예를 참조로 보다 용이하게 이해될 것이며, 실시예는 단지 본 발명의 소정의 양태 및 구현예에 대한 예시의 목적으로만 포함되고, 본 발명을 제한하려고 의도된 것이 아니다.
실시예 1: 친유성 접합체의 합성을 위한 뉴클레오사이드 포스포라미다이트의 합성
반응식 1
Figure pct00122
화합물 201의 합성: 소듐 하이드라이드(NaH)(21 g)를 건조 디메틸 포름아미드(DMF)(1500 ml) 중 2,6-디아미노 9-(B-D-리보푸라노실)퓨린 200 (105 g)에 첨가하였다. 30분 동안 교반한 후, 1-브로모헥사데칸(150 ml)을 첨가하였다. 용액을 실온에서 밤새 교반한 후, 에탄올(EtOH)(50 ml)의 첨가에 의해 켄칭하였다. 반응 혼합물을 진공에서 증발시키고, 잔여물을 메틸렌 클로라이드에 현탁시키고, 용리액으로서 5% 내지 10% MeOH/CH2Cl2를 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 산물-함유 분획을 풀링(pooling)하고, 용매를 스트립핑하여 조정제 발포체 201(95 g)를 수득하였다.
화합물 203의 합성: 상기 발포체(95 g) 및 아데노신 데아미나제(2000 mg, Sigma Chemicals 타입 II)를 0.1 M 트리스 완충액(1500 ml, pH 7.4), DMSO(1000 ml), 및 0.1 M 소듐 포스페이트 완충액(100 ml)에서 밤새 실온에서 교반하였다. 추가 분취량의 0.1 M 포스페이트 완충액(30 ml) 및 DMSO(20 ml) 중 아데노신 데아미나제(140 mg)를 첨가하고, 반응물을 10 일 동안 교반하였다. 용매를 진공에서 증발시키고, 잔여물을 0% 내지 10% MeOH/CH2Cl2를 사용하여 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피하였다. 산물-함유 분획을 진공에서 증발시켜 고형물 203(35 g)을 제공하였다.
화합물 204의 합성: 피리딘(500 ml) 중 상기 고형물(35 g)을 아이스 배쓰에서 냉각시키고, 트리메틸실릴 클로라이드(84 ml)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 교반하고, 이소부티릴 클로라이드(58 ml)를 첨가하였다. 용액을 실온에 도달하도록 4시간 동안 교반하였다. H2O를 첨가하면서(100 ml) 용액을 냉각시키고, 용액을 추가 30분 동안 교반하였다. 고농도 NH4-OH(100 ml)를 첨가하고, 용액을 진공에서 증발시켰다. 잔여물을 0% 내지 5% MeOH/DCM을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 산물을 용출시켰다. 산물-함유 분획을 증발시켜 25 g의 산물을 발포체 204로서 수득하였다.
화합물 205의 합성: N2-이소부티릴-2'-O-헥사데실구아노신 204(25 g)을 피리딘과 공동증발시킨 후, 피리딘(180 ml)에 가용화시켰다. 디메톡시트리틸 클로라이드(20 g) 및 디메틸아미노피리딘(50 mg)을 실온에서 교반하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하고, 진공에서 증발시켰다. 잔여물을 CH2C12/수성 NaHCO3 간에 분획화하였다. 유기상을 건조하고(MgSO4), 증발시켰다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피(1:1 EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 30 g의 산물 205를 수득하였다.
화합물 206의 합성: 상기 고형물 205(30 g), 비스-(N,N-디이소프로필아미노)-2-시아노에틸포스파이트(20 g), 및 N,N-디이소프로필암모늄 테트라졸리드(10 g)를 실온에서 밤새 교반하였다. 용액을 수성 NaHCO3에 대하여 분획화하고, MgSO4 상에서 건조하였다. 용매를 진공에서 증발시키고, 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피(EtOAc 중 1% TEA)에 의해 정제하여 29 g의 산물 206을 발포체로서 수득하였다.
Figure pct00123
반응식 2
Figure pct00124
화합물 208의 합성: 소듐 하이드라이드(NaH)(25 g)를 건조 디메틸 포름아미드(DMF)(1500 ml) 중 2,6-디아미노 9-(B-D-리보푸라노실)퓨린 207(125 g)에 첨가하였다. 30분 동안 교반한 후, 1-브로모헥사데칸(180 gl)을 첨가하였다. 용액을 실온에서 밤새 교반한 후, 에탄올(EtOH)(50 ml)의 첨가에 의해 켄칭하였다. 반응 혼합물을 진공에서 증발시키고, 잔여물을 메틸렌 클로라이드에 현탁시키고, 용리액으로서 0% 내지 10% MeOH/CH2Cl2를 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 산물-함유 분획을 풀링하고, 용매를 스트립핑하여 산물 208을 발포체(36 g)로서 수득하였다.
화합물 209의 합성: 피리딘(500 ml) 중 상기 고형물 208(36 g)을 아이스 배쓰에서 냉각시키고, 트리메틸실릴 클로라이드(30 ml)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 30분 동안 교반하고, 벤조일 클로라이드(20 ml)를 첨가하였다. 용액을 실온에 도달하도록 4시간 동안 교반하였다. H2O를 첨가하면서(100 ml) 용액을 냉각시키고, 용액을 추가 30분 동안 교반하였다. 고농도 NH4-OH(100 ml)를 첨가하고, 용액을 진공에서 농축시켰다. 잔여물을 0% 내지 5% MeOH/CH2Cl2를 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 산물을 용출시켰다. 산물-함유 분획을 증발시켜 32 g의 산물 209를 발포체로서 수득하였다.
화합물 210의 합성: N2-벤조일-2'-O-헥사데실아데노신 209(32 g)을 피리딘과 공동-증발시킨 후, 피리딘(180 ml)에 가용화시켰다. 디메톡시트리틸 클로라이드(20 g) 및 디메틸아미노피리딘(50 mg)을 실온에서 교반하면서 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하고, 진공에서 증발시켰다. 잔여물을 DCM/수성 NaHCO3 간에 분획화하였다. 유기상을 건조하고(MgSO4), 증발시켰다. 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피(1:1 EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 35 g의 산물 210을 수득하였다.
화합물 211의 합성: 상기 고형물 210(35 g), 비스-(N,N-디이소프로필아미노)-2-시아노에틸포스파이트(20 g) 및 N,N-디이소프로필암모늄 테트라졸리드(10 g)를 실온에서 밤새 교반하였다. 용액을 수성 NaHCO3에 대해 분획화하고, MgSO4 상에서 건조하였다. 용매를 진공에서 증발시키고, 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피(1:1 EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 37 g의 산물 211을 발포체로서 수득하였다.
Figure pct00125
반응식 3
Figure pct00126
213의 합성: 아르곤 분위기 하에 무수 피리딘(120 mL) 중 무수-화합물 212(24.0 g, 0.1 mol) 및 DMAP(0.16 g, 1.3 mmol)의 용액에 TBDPSCl(28 mL, 0.11 mol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였고, 그 후에 TLC(클로로포름: 메탄올 5:1)에 의해서 상당량의 출발 물질 212가 관찰되지 않을 수 있다. 피리딘을 감압 하에 제거하고, 잔여물을 에틸 아세테이트 및 10% 인산 간에 분획화하였다. 유기상을 분리하고, 5% 수성 NaCl 및 포화 NaCl로 연속하여 세척하고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조하였다. 수성 세척 동안 결정화가 시작되면, 제한된 양의 DCM을 첨가하여 고형물을 용해시켰다. 소듐 설페이트의 여과 후, 용액을 증발시키고, 잔여물을 800 mL의 디에틸 에테르와 2일 동안 교반하였다. 흰색 침전물을 여과하고, 디에틸 에테르로 1회 세척하고, 건조하여 40.8 g(85%)의 213을 흰색 결정질 고형물로서 수득하였다.
화합물 215f 및 215g의 합성: 0.36 mol의 헥사데칸-1-올 또는 올레일 알코올을 자석 막대, 가스 유입구, 환류 응축기, 오일 가열 배쓰, 추가 깔때기, 및 응축기 위의 기포기가 장착된 둥근 바닥 플라스크에서, Ar을 플라스크에 채우면서, 약 40분 동안 진공 하에 건조하였다. 무수 디글라임(65 mL)을 첨가하고, 이어서 헵탄(55 mL, 0.11 mmol) 중 AlMe3의 2 M 용액을 적가하였다. 혼합물을 110℃까지 가열하고, 반응의 완료를 메탄 발생의 종료까지 모니터링하였다. 혼합물을 Ar 하에 실온으까지 냉각시킨 후, 무수뉴클레오사이드 213(23.2 g, 50 mmol)를 첨가하고, 오일 배쓰를 145℃에서 밤새 가열하였다. 혼합물을 Ar 하에 실온으까지 냉각시키고, 10% H3PO4(500 mL) 및 에틸 아세테이트(250 mL) 간에 분획하였다. 유기층을 분리하고, 수성 NaCl(5%) 및 포화 NaCl으로 연속하여 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 용매를 진공에서 제거하고, 잔여물을 THF(200 mL)에 용해시키고, 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드(33 mL, 0.2 mol)로 처리하였다. 혼합물을 Ar 하에 3일 동안 교반하고, 5% 수성 NaCl(300 mL) 및 에틸아세테이트(300 mL) 간에 분획화하였다. 유기상을 분리하고, 포화 수성 NaCl로 세척하고, 용매를 증발시켰다. 잔여물을 헥산(800 mL)에 용해시키고, 90% 수성 MeOH(2 × 800 mL)로 추출하였다. 합한 메탄올 추출물을 증발시키고, 잔여물을 에틸아세테이트 및 포화 수성 NaCl 간에 분획화하였다. 유기상을 분리하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조하였다. 용매를 증발시키고, 잔여물을 DCM 중 3% 내지 10%의 메탄올 구배로 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 10.9 g(47%)의 215f(R = C16H33), 또는 13.7 g(55%)의 215 g(R = C18H35, 올레일)를 수득하였다.
화합물 216f의 합성: 아르곤 분위기 하에 무수 피리딘(70 mL) 중 무수-화합물 215f(10.61 g, 22.6 mmol), DMAP(.550g, 4.4 mmol), 및 DMTrCl(9.76 g, 29 mmol)의 용액에 트리에틸아민(4.1 mL, 29 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 1 mL의 MeOH의 첨가로 켄칭하였다. 피리딘을 진공에서 제거하고, 잔여물을 에틸 아세테이트와 5% 수성 NaCl 간에 분획화하였다. 유기상을 분리하고, 포화 NaCl로 세척하고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조하였다. 용매를 진공에서 증발시키고, 산물을 헥산 중(35% 내지 60%)의 에틸 아세테이트 구배로 실리카 겔의 컬럼 상에서 잔여물의 크로마토그래피에 의해 단리하여 14.89 g(86%)의 216f를 누르스름한 비정질 발포체로서 수득하였다.
화합물 217f의 합성: 화합물 216f(25 g), 비스-(N,N-디이소프로필아미노)- 2-시아노에틸포스파이트(15 g), 및 N,N-디이소프로필암모늄 테트라졸리드(7.5 g)를 실온에서 밤새 교반하였다. 용액을 수성 NaHCO3에 대하여 분획화하고, MgSO4 상에서 건조하였다. 용매를 진공에서 증발시키고, 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피(1:1 EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 27 g의 산물을 발포체로서 수득하였다.
Figure pct00127
화합물 216a의 합성: 216f에 대하여 기재된 절차를 이용하여, 화합물 216a를 합성하였다.
Figure pct00128
화합물 217a의 합성: 화합물 216a(4.0 g, 6.35 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 탈기시키고, 아르곤으로 퍼징시켰다. 출발 물질을 디클로로메탄에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(2.21 ml, 12.7 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(2.12 ml, 9.53 mmol)를 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응물을 TLC(70% EtOAc/헥산)에 의해 확인하고, 반응물을 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 이후 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(30% 내지 100% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압 하에 농축시켜(3.42 g, 65%)의 216a를 수득하였다.
Figure pct00129
화합물 216b의 합성: 216f에 대하여 기재된 절차를 이용하여, 화합물 216b를 합성하였다.
Figure pct00130
화합물 217b의 합성: 화합물 216b(4.0 g, 6.08 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 탈기시키고, 아르곤으로 퍼징시켰다. 출발 물질을 디클로로메탄에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(2.12 ml, 12.16 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(2.03 ml, 9.12 mmol)를 첨가하고, 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. 반응물을 TLC(70% EtOAc/헥산)에 의해 확인하고, 반응물을 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 이후 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(30% 내지 100% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압 하에 농축시켜(3.55 g, 68%)의 217b를 수득하였다.
Figure pct00131
화합물 216c의 합성: 216f에 대하여 기재된 절차를 이용하여, 화합물 216c를 합성하였다.
Figure pct00132
화합물 217c의 합성: 화합물 216c(4.0 g, 5.83 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 탈기시키고, 아르곤으로 퍼징하였다. 출발 물질을 디클로로메탄에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(2.04 ml, 11.66 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(1.95 ml, 8.75 mmol)를 첨가하고, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응물을 TLC(70% EtOAc/헥산)에 의해 확인하고, 반응물을 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 이후 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(30% 내지 100% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압 하에 농축시켜(4.20 g, 81%)의 217c를 수득하였다.
Figure pct00133
화합물 216d의 합성: 216f에 대하여 기재된 절차를 이용하여, 화합물 216d를 합성하였다.
Figure pct00134
화합물 217d의 합성: 화합물 216d(5.0 g, 6.99 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 탈기시키고, 아르곤으로 퍼징시켰다. 출발 물질을 디클로로메탄에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(2.44 ml, 14 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(2.34 ml, 10.50 mmol)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응물을 TLC(70% EtOAc/헥산)에 의해 확인하고, 반응물을 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 이후 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(30% 내지 100% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜(4.54 g, 73%)의 217d를 수득하였다.
Figure pct00135
화합물 216e의 합성: 216f에 대하여 기재된 절차를 이용하여, 화합물 216e를 합성하였다.
Figure pct00136
화합물 217e의 합성: 화합물 216e(5.0 g, 6.73 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 탈기시키고, 아르곤으로 퍼징시켰다. 출발 물질을 디클로로메탄에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(2.35 ml, 13.46 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(2.25 ml, 10.10 mmol)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응물을 TLC(70% EtOAc/헥산)에 의해 확인하고, 반응물을 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 이후 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(30% 내지 100% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압 하에 농축시켜(4.86 g, 77%)의 217e를 수득하였다.
Figure pct00137
화합물 216g의 합성: 216f에 대하여 기재된 절차를 이용하여, 화합물 216g를 합성하였다.
Figure pct00138
화합물 217g의 합성: 화합물 216 g(5.0 g, 6.28 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 탈기시키고, 아르곤으로 퍼징시켰다. 출발 물질을 디클로로메탄에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(2.19 ml, 12.56 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(2.09 ml, 9.42 mmol)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응물을 TLC(70% EtOAc/헥산)에 의해 확인하고, 반응물을 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기 층을 포화 소듐 바이카르보네이트 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 이후 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(30% 내지 100% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜(4.83 g, 77.1%)의 217g를 수득하였다.
Figure pct00139
반응식 4
Figure pct00140
화합물 218f의 합성: DMT 뉴클레오사이드 217f(30 g)를 무수 피리딘(300 ml)에 용해시켰다. 트리메틸실릴 클로라이드(20 ml)를 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 트리아졸(30 g) 및 트리에틸아민(80 ml)을 첨가하고, 0℃까지 냉각시켰다. POCl3(9 ml)를 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였다. 고농도 암모니아(100 ml)를 첨가하고, 1시간 동안 교반하였다. 물 500 ml를 첨가하고, 혼합물을 CH2Cl2(2 × 500 ml)로 농축시켰다. 합한 유기층을 증발시키고, 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피에서 정제하였다. 요망되는 산물 218f을 메탄올/CH2Cl2(0% 내지 5%)로 용출하였다. 수율: 24 g.
화합물 219f의 합성: 상기 고형물 218f(24 g)을 DMF(200 ml)에 용해시키고, 아세트산 무수물(6 ml)을 첨가하였다. 용액을 24시간 동안 교반하였다. 물(500 ml)을 첨가하고, 혼합물을 디클로로메탄(500 ml)으로 추출하였다. 유기층을 증발시키고, 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피에서 정제하였다. 요망되는 산물 219f를 메탄올/CH2Cl2(0 내지 5%)로 용출하였다. 수율: 21 g.
화합물 220f의 합성: 상기 화합물 219f(21 g), 비스-(N,N-디이소프로필아미노)-2-시아노에틸포스파이트(14 g), 및 N,N-디이소프로필암모늄 테트라졸리드(7 g)를 실온에서 밤새 교반하였다. 용액을 수성 NaHCO3에 대하여 분획화하고, MgSO4 상에서 건조하였다. 용매를 진공에서 증발시키고, 잔여물을 실리카 겔 크로마토그래피(1:1 EtOAc/헥산)에 의해 정제하여 22 g의 산물을 발포체로서 수득하였다.
Figure pct00141
실시예 2: 올리고뉴클레오타이드 합성 후 친유성 접합체를 도입하기 위해 전구체로서 사용되는 뉴클레오사이드 포스포라미다이트의 합성
반응식 5
Figure pct00142
화합물 222: 화합물 221(6 g, 8.98 mmol)을 반응 플라스크에 첨가하고, DCM에 용해시켰다. 반응물을 교반하고, 트리메틸아민(4.89 ml, 35.92 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 에틸 트리플루로아세테이트(3.19 g, 22.45 mmol)를 반응물에 적가하였다. 반응물을 TLC(5% MeOH/DCM)에 의해 확인하고, 포스포몰리브드산을 사용하여 발색시키고, 반응물을 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 이후 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시키고, 고진공에 두어 222(4.96 g 72%)를 수득하였다.
Figure pct00143
C39H43F3N6O7에 대한 질량 계산치: 764.80, 실측치: 765.3(M+H).
화합물 223: 화합물 222(4.96 g, 6.49 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하였다. 출발 물질을 디메틸포름아미드에 용해시키고, N,N-디메틸포름아미드 디메틸 아세탈 (4.31 ml, 32.45 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 반응물을 오일 배쓰에서 60℃로 3시간 동안 가열하였다. 반응물을 TLC(5% MeOH/DCM)에 의해 확인하고, 감압 하에 농축시키고, 고진공에서 밤새 건조하였다. 잔여물을 실리카 겔(0% 내지 10% MeOH/DCM) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 223(5.21 g, 98%)을 수득하였다.
Figure pct00144
C42H48F3N7O7에 대한 질량 계산치: 819.88, 실측치: 820.4(M+H).
화합물 224: 화합물 223(5.21 g, 6.36 mmol)을 반응 플라스크에 첨가하고, 탈기시키고, 아르곤으로 퍼징시켰다. 출발 물질을 디클로로메탄에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(2.21 ml, 12.72 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(2.12 ml, 9.54 mmol)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 TLC(100% EtOAc)에 의해 확인하고, 반응물을 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 이후 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(10% 내지 100% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 224(5.02 g, 77%)를 수득하였다.
Figure pct00145
반응식 6
Figure pct00146
화합물 226: 화합물 225(6 g, 9.31 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하였다. 출발 물질을 디클로로메탄에 용해시키고, 트리메틸아민(5.08 ml, 37.24 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 에틸 트리플루로아세테이트(3.31 g, 23.28 mmol)를 반응물에 적가하였다. 반응물을 TLC(100% 에틸 아세테이트)에 의해 확인하고, 포스포몰리브드산을 사용하여 발색시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 이후 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(10% 내지 100% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 226(4.22 g, 61.2%)을 수득하였다.
Figure pct00147
C38H43F3N4O8에 대한 질량 계산치: 740.78, 실측치: 739.2(M-H).
화합물 227: 화합물 226(4.22 g, 5.7 mmol)을 반응 플라스크에 첨가하고, 출발 물질을 디메틸포름아미드에 용해시키고, 벤조산 무수물(1.42 g, 6.27 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응물을 TLC(5% MeOH/DCM)에 의해 확인하고, 포스포몰리브드산을 사용하여 발색시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(0% 내지 10% MeOH/DCM) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 227(3.41 g, 71%)를 수득하였다.
Figure pct00148
C45H47F3N4O9에 대한 질량 계산치: 844.89, 실측치: 843.3(M-H).
화합물 228: 화합물 227(3.41 g, 4.04 mmol)을 반응 플라스크에 첨가하고, 탈기시키고, 아르곤으로 퍼징시켰다. 출발 물질을 디클로로메탄에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(1.4 ml, 8.08 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(1.35 ml, 6.06 mmol)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응물을 TLC(2/1 EtOAc/헥산)에 의해 확인하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 이후 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(10% 내지 100% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 228(3.81 g, 90.3%)을 수득하였다.
Figure pct00149
반응식 7
Figure pct00150
화합물 230: 화합물 229(2.5 g, 6.54 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 최소 물에 용해시키고, 메탄올로 희석하였다. 반응물을 0℃까지 냉각시키고, 트리메틸아민(14.27 ml, 104.64 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 에틸 트리플루로아세테이트(9.3 g, 65.4 mmol)를 첨가하고, pH를 모니터링하고, 약 pH 9로 조절하고, 반응물을 3일 동안 교반하였다. 반응물을 TLC(15% MeOH/DCM)에 의해 확인하고, 헤시안 염색제(Hessian stain)를 사용하여 발색시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 45분에 걸쳐 5% 내지 35% ACN/H2O의 방법을 이용하여 역상 분취용-HPLC에 의해 정제하였다. 산물은 대략 25분에 용출되었다. 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시키고, 동결건조하여 230(0.661 g, 21.1%)을 수득하였다.
Figure pct00151
C18H25F3N6O6에 대한 질량 계산치: 478.43, 실측치: 479.2(M+H).
화합물 231: 화합물 230(0.65 g, 1.36 mmol)을 반응 플라스크에 첨가하였다. 출발 물질을 디메틸포름아미드에 용해시키고, N,N-디메틸포름아미드 디메틸 아세탈(0.903 ml, 6.8 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 반응물을 오일 배쓰에서 2.5시간 동안 60℃까지 가열하였다. 반응물을 TLC(7% MeOH/DCM)에 의해 확인하고, 감압 하에 농축시키고, 고진공에서 밤새 건조하였다. 잔여물을 실리카 겔(0% 내지 10% MeOH/DCM) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 231(0.504 g, 69.5%)을 수득하였다.
Figure pct00152
C21H30F3N7O6에 대한 질량 계산치: 533.51, 실측치: 534.3(M+H).
화합물 232: 화합물 231(0.5 g, 0.938 mmol) 및 5 ml의 무수 피리딘을 반응 플라스크에 첨가하였다. 피리딘을 감압 하에 스트립핑하였다. 이를 3회 반복하고, 반응 혼합물을 고진공 하에 밤새 건조하였다. 다음 날, 4-(디메틸아미노)피리딘(0.011 g, 0.094 mmol) 및 무수 피리딘을 반응 플라스크에 첨가하였다. 반응물을 아이스 배쓰를 이용하여 0℃까지 냉각시켰다. 반응 플라스크를 탈기시키고, 아르곤으로 퍼징시켰다. 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(0.352 g, 1.04 mmol)를 무수 피리딘에 용해시키고, 생성된 용액을 시린지를 통해 반응 플라스크에 첨가하였다. 반응물이 실온에 도달하게 하고, 밤새 교반하였다. 반응물을 TLC(5% MeOH/DCM)에 의해 확인하고, 하네시안 염색제(Hanessian stain)를 사용하여 발색시켰다. 메탄올을 첨가하여 반응물을 켄칭하고, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(0% 내지 10% MeOH/DCM) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 232(0.621 g, 79%)를 수득하였다.
Figure pct00153
C42H48F3N7O8에 대한 질량 계산치: 835.88, 실측치: 836.4(M+H).
화합물 233: 화합물 232(1.20 g, 1.44 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 탈기시키고, 아르곤으로 퍼징시켰다. 출발 물질을 디클로로메탄에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(0.5 ml, 2.88 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(0.385 ml, 1.73 mmol)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응물을 TLC(100% EtOAc)에 의해 확인하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 이후 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(10% 내지 100% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 233(1.21 g, 81.2%)을 수득하였다.
Figure pct00154
반응식 8
Figure pct00155
화합물 235: 화합물 234(5 g, 7.75 mmol)을 반응 플라스크에 첨가하였다. 출발 물질을 디클로로메탄에 용해시키고, 트리메틸아민(4.23 ml, 31 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 에틸 트리플루로아세테이트(2.75 g, 19.38 mmol)를 반응물에 적가하였다. 반응물을 TLC(5% MeOH/DCM)에 의해 확인하고, 포스포몰리브드산을 사용하여 발색시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 이후 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시키고, 고진공에 두어 235(4.32 g 75%)를 수득하였다.
Figure pct00156
C38H42F3N3O9에 대한 질량 계산치: 741.76, 실측치: 740.2(M-H).
화합물 236: 화합물 235(4.3 g, 5.8 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 탈기시키고, 아르곤으로 퍼징시켰다. 출발 물질을 디클로로메탄에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(2.02 ml, 11.6 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(1.93 ml, 8.7 mmol)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 1시간 내지 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 TLC(75% EtOAc/헥산)에 의해 확인하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 에틸 아세테이트에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 이후 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(10% 내지 100% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 236(4.62 g, 85%)을 수득하였다.
Figure pct00157
실시예 3: siRNA에 대한 리간드(예를 들어, 친유성 모이어티)의 합성 후 접합
반응식 9
Figure pct00158
반응식 10
Figure pct00159
다양한 친유성 모이어티를 포함하는 다양한 리간드는 반응식 9 및 반응식 10에 나타낸 바와 같이 합성 후 접합 방법을 통해 siRNA 제제에 접합될 수 있다.
실시예 4: 5'-접합을 위한 친유성 포스포라미다이트의 합성
반응식 11
Figure pct00160
화합물 101a-g: 화합물 100(1 g)을 펩타이드 커플링 조건 하에 알킬 카르복실산으로 처리하였다. 알킬 카르복실산을 디클로로메탄에 취하고, HBTU 및 DIEA로 몇 분 동안 처리하였다. 아민을 반응 혼합물에 첨가하고, 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 TLC에 의해 모니터링하고, 수성 바이카르보네이트 용액 및 염수로 세척하였다. 유기층을 소듐 설페이트 상에서 건조하고, 조정제 산물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 101a-g를 수득하였다. 이러한 분자들의 포스포라미다이트를 실시예 1(반응식 4)에 예시된 바와 같이 DIEA의 존재에서 아미다이트 시약으로 처리함으로써 제조하여 화합물 102a-g를 생성시켰다.
반응식 12
Figure pct00161
반응식 12에 나타낸 바와 같이, 포스포라미다이트를 실시예 1에 예시된 바와 같이 포스포라미다이트 시약으로 알코올을 처리함으로써 제조하여 화합물 104a-g를 생성시켰다.
실시예 5: 티오콜레스테롤 아미다이트 및 CPG의 합성
반응식 13. 4-하이드록시-L-프롤리놀-티오콜레스테롤 포스포라미다이트의 합성
Figure pct00162
N-(6-{2-[비스-(4-메톡시-페닐)-페닐-메톡시메틸]-4-하이드록시-피롤리딘-1-일}-6-옥소-헥실)-3-(피리딘-2-일디설파닐)-프로피온아미드 7)
반응식 13에 나타낸 바와 같이, 아민 5(7.7 g, 14.5 mmol)를 무수 디클로로메탄(40 mL)에 용해시키고, 0℃까지 냉각시켰다. 용액에 트리에틸아민(3.0 g, 4.2 mL, 30 mmol) 및 3-(피리딘-2-일디설파닐)-프로피온 숙시네이트 에스테르 6(SPDP)(4.5 g, 14.4 mmol)를 연이어 첨가하였다. 반응 온도를 주위 온도로 야기하고, 추가로 16시간 동안 교반하였다. 반응의 완료를 TLC(10% MeOH/CHCl3, Rf = 0.6)에 의해 확인하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석하고, 포화 NaHCO3, 물, 및 이어서 염수로 세척하였다. 유기층을 소듐 설페이트 상에서 건조하고, 여과하고, 진공 하에 농축시켜 조정제 산물을 수득하였다. 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피 후 흰색 발포성 고형물로서 화합물 7(10.58 g, 78%)을 수득하였다.
Figure pct00163
4-하이드록시-L-프롤리놀-티오콜레스테롤-DMT-알코올(8)
화합물 7(7.5 g, 10.28 mmol)을 아르곤 하에 무수 디클로로메탄(75 mL)에 용해시키고, 0℃까지 냉각시켰다. 이 용액에 디이소프로필에틸 아민(2.71 g, 3.66 mL, 21 mmol)을 첨가하고, 이어서 티오콜레스테롤(4.145 g, 10.28 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도로 야기하고, 추가로 16시간 동안 교반하였다. 반응의 완료를 TLC(100% 에틸 아세테이트, Rf = 0.6)에 의해 확인하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 잔여물을 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피에 주어지게 하였다. 4 L의 에틸 아세테이트로 용출시킨 후, 컬럼을 5% MeOH/디클로로메탄(2 L)으로 용출시켜 화합물 8 을 흰색 발포성 고형물(8 g, 76%)로서 수득하였다.
Figure pct00164
4-하이드록시-L-프롤리놀-티오콜레스테롤 포스포라미다이트( 9 )
화합물 8(5.7 g, 5.58 mmol)을 무수 톨루엔(50 mL)과 공동증발시켰다. 잔여물에 N,N-테트라이소프로필암모늄 테트라졸리드(0.315 g, 2.79 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 진공 오븐에서 밤새 45℃로 P2O5 위에서 건조하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(20 mL)에 용해시키고, 2-시아노에틸-N,N,N',N'-테트라이소프로필포스포라미다이트(2.48 g, 2.72 mL, 8.25 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 밤새 교반하였다. 반응의 완료를 TLC(에틸 아세테이트 중 Rf = 0.9)에 의해 확인하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(50 mL)으로 희석하고, 5% NaHCO3 (50 mL) 및 염수(50 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(50:49:1, EtOAc:헥산:트리에틸아민) 상에서 정제하여 9를 흰색 발포성 고형물(6.1 g, 89%)로서 수득하였다.
Figure pct00165
반응식 14. 티오콜레스테롤로 고정된 중합체 지지체의 합성
Figure pct00166
4-하이드록시-L-프롤리놀-티오콜레스테롤-숙시네이트( 10 )
반응식 14에 나타낸 바와 같이, 화합물 8 (2.2 g, 2.15 mmol)을 숙신산 무수물 (0.323 g, 3.23 mmol) 및 DMAP(0.026 g, 0.215 mmol)와 혼합하고, 진공 하에 40℃에서 밤새 건조하였다. 혼합물을 무수 디클로로메탄(10 mL)에 용해시켰다. 그 후에, 트리에틸아민(0.708 g, 0.976 mL, 7 mmol)을 첨가하고, 용액을 아르곤 분위기 하에 16시간 동안 실온에서 교반하였다. 이를 이후 디클로로메탄(50 mL)으로 희석하고, 빙냉 수성 시트르산(5% wt., 25 mL) 및 물(2 × 25 mL)로 세척하였다. 유기상을 무수 소듐 설페이트 상에서 건조하고, 건조 상태로 농축시켰다. 조정제 산물을 플래시 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 10 을 흰색 발포성 고형물(2.2 g, 92% 수율; 10% MeOH/CHCl3 중 Rf = 0.6s)을 수득하였다.
Figure pct00167
고정된 티오콜레스테롤( 11 )로의 고체 지지체
숙시네이트 10 (2.1 g, 1.9 mmol)을 디클로로에탄(8 mL)에 용해시켰다. 상기 용액에 DMAP(0.228 g, 1.9 mmol)를 첨가하였다. 아세토니트릴/디클로로에탄(3:1, 8 mL) 중 2,2'-디티오-비스(5-니트로피리딘)(0.58 g, 1.9 mmol)을 연이어 첨가하였다. 생성된 용액에 아세토니트릴(4 ml) 중 트리페닐포스핀(0.49 g, 1.9 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물의 색은 밝은 주황색으로 변했다. 용액을 손목-동작 진탕기(5분)을 이용하여 잠시 교반하였다. 장쇄 알킬 아민-CPG(LCAA-CPG)(12 g, 1860 μmol, 155 μm/g)를 첨가하였다. 현탁액을 4시간 동안 교반하였다. CPG를 소결된 깔때기를 통해 여과하고, 아세토니트릴, 디클로로메탄, 및 에테르로 연이어 세척하였다. 미반응된 아미노기를 아세트산 무수물/피리딘을 사용하여 마스킹하였다. UV 측정을 수행함으로써 CPG 11의 로딩 용량을 측정하였다. (57 μM/g).
실시예 6: 클릭 화학에 의한 2'-O 친유성 접합체의 합성
반응식 15
Figure pct00168
화합물 22a의 합성: 상업적으로 입수 가능한 프로파길 U 20a(5.8 g, 10 mmol)를 THF(40 mL)에 용해시키고, 3차-부탄올(40 mL) 그리고 이어서 쿠퍼 설페이트(1 g)를 첨가하였다. 이 혼합물에 소듐 아스코르베이트 수용액 그리고 이어서 헥실 아자이드를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응물의 TLC는 다음 날 완료를 나타냈고, 반응물을 회전 증발기에서 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄(100 mL)에 용해시키고, 용액을 셀라이트를 통해 여과하고, 여액의 농축 및 컬럼 정제 후 순수한 산물 22a(6.99 g, 96%)을 흰색 고형물로서 제공하였다.
화합물 22b의 합성: U에 대하여 이용된 절차와 유사한 절차를 이용하여, 프로파길 C 20b(6.2 g, 10 mmol)를 상응하는 클릭 산물 22b(5.9 g, 78%)로 흰색 고형물로서 전환시켰다.
화합물 22c의 합성: U에 대하여 이용된 절차와 유사한 절차를 이용하여, 프로파길 A 20c(7.1 g, 10 mmol)를 상응하는 클릭 산물 22c(7.9 g, 96%)로 흰색 고형물로서 전환시켰다.
화합물 22d의 합성: U에 대하여 이용된 절차와 유사한 절차를 이용하여, 프로파길 G 22d(6.9 g, 10 mmol)를 상응하는 클릭 산물 22d(7.9 g, 96%)로 오프 화이트(off white) 색 분말로서 전환시켰다.
포스포라미다이트 23a-d의 합성: 화합물 22a-d를 DIEA의 존재에서 포스포라미다이트 시약으로 처리하여 23a-d를 생성시켰다.
실시예 7: 뉴클레오베이스 변형 접합체(피리미딘)의 합성
1. 5-아이오도우리딘 유도체의 합성
반응식 16. 2'-O-메틸-5-아이오도우리딘 포스포라미다이트(4)의 합성
Figure pct00169
2'-O-메틸-5-아이오도우리딘(2)
ICl(8.6 mL, 174 mmol)을 MeOH(400 mL) 중 2'-O-메틸우리딘 1(25.0 g, 96.8 mmol)의 용액에 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 15시간 동안 환류시켰다. 생성된 혼합물을 진공에서 농축시켰다. DCM(200 mL)을 수득된 조정제 잔여물(58.1 g)에 첨가한 후, 침전물을 여과에 의해 수집하고, DCM으로 세척하여 화합물 2(36.7 g, 99%)을 흰색 분말로서 수득하였다.
Figure pct00170
5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-메틸-5-아이오도우리딘(3)
Ar 분위기 하에, DMTrCl(33.9 g, 100 mmol)을 무수 피리딘(400 mL) 중 화합물 3(36.6 g, 95.3 mmol)의 용액에 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 14시간 동안 교반하였다. 그 후에, 반응물을 MeOH로 켄칭하고, EtOAc로 희석하였다. 유기층을 물 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 진공에서 농축시켰다. 조정제 잔여물(108 g)을 컬럼 크로마토그래피(n-헥산 중 0 내지 50% EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 3(53.4 g, 82%)을 흰색 발포체로서 제공하였다.
Figure pct00171
3'-O-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피노]-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-메틸-5-아이오도우리딘(4)
Ar 분위기 하에, DIPEA(1.2 mL, 7.30 mmol) 및 i-Pr2NP(Cl)O(CH2)2CN (0.39 mL, 1.75 mmol)을 무수 DCM(15 mL) 중 화합물 3(1.00 g, 1.46 mmol)의 용액에 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 이후 포화 NaHCO3로 켄칭하고, EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 진공에서 농축시켰다. 조정제 잔여물(1.46 g)을 컬럼 크로마토그래피(n-헥산 중 60% EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 4(841 mg, 65%)를 흰색 발포체로서 제공하였다.
반응식 17. 2'-데옥시-2'-(R)-플루오로-5-아이오도우리딘 포스포라미다이트(8)의 합성
Figure pct00172
2'-데옥시-2'-(R)-플루오로-5-아이오도우리딘(6)
ICl(7.3 mL, 146 mmol)을 MeOH(400 mL) 중 2'-데옥시-2'-플루오로우리딘 5(20.0 g, 81.2 mmol)의 용액에 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 17시간 동안 환류시켰다. 생성된 혼합물을 진공에서 농축시켰다. DCM(200 mL)을 수득된 조정제 잔여물(49.1 g)에 첨가한 후, 침전물을 여과에 의해 수집하고, DCM으로 세척하여 화합물 6(29.6 g, 97%)을 흰색 분말로서 수득하였다.
Figure pct00173
2'-데옥시-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-(R)-플루오로-5-아이오도우리딘(7)
Ar 분위기 하에, DMTrCl(28.1 g, 83.0 mmol)을 무수 피리딘(400 mL) 중 화합물 6(29.4 g, 79.0 mmol)의 용액에 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 그 후에, 반응물을 MeOH로 켄칭하고, EtOAc로 희석하였다. 유기층을 물 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 진공에서 농축시켰다. 조정제 잔여물(98.8 g)을 컬럼 크로마토그래피(n-헥산 중 0% 내지 50% EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 7(49.5 g, 93%)을 황색 발포체로서 제공하였다.
Figure pct00174
C30H29FIN2O7(MH+)에 대한 HRMS 계산치 675.0998.
3'-O-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피노]-2'-데옥시-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-(R)-플루오로-5-아이오도우리딘(8)
Ar 분위기 하에, DIPEA(1.5 mL, 8.90 mmol) 및 i-Pr2NP(Cl)O(CH2)2CN(0.48 mL, 2.14 mmol)을 무수 DCM(15 mL) 중 화합물 7(1.20 g, 1.78 mmol)의 용액에 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응물을 이후 포화 NaHCO3로 켄칭하고, EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 진공에서 농축시켰다. 조정제 잔여물(1.71 g)을 컬럼 크로마토그래피(n-헥산 중 60% EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 8(1.29 g, 83%)을 흰색 발포체로서 제공하였다.
반응식 18. LNA-5-아이오도우리딘 포스포라미다이트 12의 합성
Figure pct00175
화합물 12의 합성: 화합물 12(LNA 유도체)를 반응식 2에서 화합물 8과 유사한 절차를 통해 합성하였다.
2. 5-아이오도시티딘 유도체의 합성
반응식 19. 2'-O-메틸-5-아이오도시티딘 포스포라미다이트(15)의 합성
Figure pct00176
5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-메틸-5-아이오도시티딘(13)
Ar 분위기 하에, Et3N(8.1 mL, 58.2 mmol) 및 TMSCl(1.8 mL, 14.6 mmol)을 무수 MeCN(50 mL) 중 3(5.00 g, 7.28 mmol)의 용액에 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 이후 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 DCM에 용해시키고, 물 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하였다. 용매의 증발로 발포체(6.21 g)를 형성시켰고, 이를 Ar 분위기 하에서 무수 MeCN(50 mL)에 용해시켰다. 그 후에, Et3N(15.3 mL, 110 mmol), 1,2,4-트리아졸(5.04 g, 73.0 mmol), 및 POCl3(1.3 mL, 14.6 mmol)를 이 용액에 -40℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 3시간 동안 교반하고, 포화 NaHCO3로 켄칭하고, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 진공에서 농축시켰다. 그 후에, 28% 수성 NH3(3.0 mL)를 THF(18 mL) 중 수득된 조정제 물질(6.32 g)의 용액에 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM에 용해시켰다. 유기층을 물 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 진공에서 농축시켰다. 조정제 잔여물(6.10 g)을 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 0% 내지 10% MeOH)에 의해 정제하여 화합물 13(3.29 g, 3 단계로 66%)을 흰색 발포체로서 제공하였다.
N4-벤조일-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-메틸-5-아이오도시티딘(14)
Ar 분위기 하에, Bz2O(1.02 g, 4.49 mmol)를 무수 DMF(10 mL) 중 화합물 13(2.80 g, 4.08 mmol)의 용액에 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 그 후에, 반응 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 조정제 잔여물(4.14 g)을 컬럼 크로마토그래피(n-헥산 중 30% 내지 50% EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 14(1.84 g, 57%)를 황색 발포체로서 제공하였다.
N4-벤조일-3'-O-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피노]-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-O-메틸-5-아이오도시티딘(15)
Ar 분위기 하에, DIPEA(0.54 mL, 3.17 mmol) 및 i-Pr2NP(Cl)O(CH2)2CN (0.17 mL, 0.769 mmol)을 무수 DCM(5.0 mL) 중 화합물 14(500 mg, 0.633 mmol)의 용액에 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응물을 이후 포화 NaHCO3로 켄칭하고, EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 진공에서 농축시켰다. 조정제 잔여물(677 mg)을 컬럼 크로마토그래피(n-헥산 중 20% 내지 40% EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 15(400 mg, 64%)를 흰색 발포체로서 제공하였다.
반응식 20. 2'-데옥시-2'-(R)-플루오로-5-아이오도우리딘 포스포라미다이트(18)의 합성
Figure pct00177
2'-데옥시-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-(R)-플루오로-5-아이오도시티딘(16)
Ar 분위기 하에서, Et3N(3.5 mL, 24.9 mmol) 및 TMSCl(0.79 mL, 6.23 mmol)을 무수 MeCN(20 mL) 중 7(2.10 g, 3.11 mmol)의 용액에 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 이후 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 DCM에 용해시키고, 물 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하였다. 용매의 증발로 발포체(2.50 g)가 형성되었고, 이를 Ar 분위기 하에서 무수 MeCN (20 mL)에 용해시켰다. 그 후에, Et3N(6.5 mL, 46.7 mmol), 1,2,4-트리아졸(2.15 g, 31.1 mmol) 및 POCl3(0.57 mL, 6.23 mmol)를 이 용액에 -40℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 3시간 동안 교반하고, 포화 NaHCO3로 켄칭하고, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 H2O 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 진공에서 농축시켰다. 그 후에, 28% 수성 NH3(1.5 mL)를 THF(9.0 mL) 중 조정제 물질(2.49 g)의 용액에 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM에 용해시켰다. 유기층을 물 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 진공에서 농축시켰다. 조정제 잔여물(2.88 g)을 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 0% 내지 10% MeOH)에 의해 정제하여 화합물 16(1.48 g, 3 단계로 70%)을 갈색 발포체로서 제공하였다.
N4-벤조일-2'-데옥시-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-(R)-플루오로-5-아이오도시티딘(17)
Ar 분위기 하에서, Bz2O(480 mg, 2.12 mmol)를 무수 DMF(8.0 mL) 중 화합물 16(1.30 g, 1.93 mmol)의 용액에 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 그 후에, 반응 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 조정제 잔여물 (2.00 g)을 컬럼 크로마토그래피(n-헥산 중 30% 내지 50% EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 17을 황색 발포체(889 mg, 59%)로서 제공하였다.
N4-벤조일-3'-O-[2-시아노에톡시(디이소프로필아미노)포스피노]-2'-데옥시-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)-2'-(R)-플루오로-5-아이오도-시티딘(18)
Ar 분위기 하에서, DIPEA(0.29 mL, 1.67 mmol) 및 i-Pr2NP(Cl)O(CH2)2CN(90 μL, 0.401 mmol)를 무수 DCM(5.0 mL) 중 화합물 17(260 mg, 0.334 mmol)의 용액에 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응물을 이후 포화 NaHCO3로 켄칭하고, EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 물 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 진공에서 농축시켰다. 조정제 잔여물(375 mg)을 컬럼 크로마토그래피(n-헥산 중 20% 내지 40% EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 18(280 mg, 86%)을 흰색 발포체로서 제공하였다.
반응식 21. LNA-5-아이오도시티딘 포스포라미다이트(21)의 합성
Figure pct00178
화합물 21의 합성: 화합물 21을 반응식 20에서 화합물 18과 유사한 절차를 이용하여 합성하였다.
3. 리간드-접합 보론산 에스테르의 합성
반응식 22
Figure pct00179
(E)-3차-부틸 3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보로란-2-일)알킬카르바메이트(22)
Ar 분위기 하에서, 무수 DCM(100 mL) 중 프로파길아민(5.0 g, 90.8 mmol)을 무수 DCM(200 mL) 중 Et3N(25.3 mL, 182 mmol) 및 디-3차-부틸 디카르보네이트(22.9 mL, 99.9 mmol)의 용액에 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응물을 이후 포화 NH4Cl로 켄칭하고, EtOAc로 희석하였다. 유기층을 포화 NH4Cl 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 진공에서 농축시켜 조정제 N-Boc-프로파길아민(12.6 g)을 갈색 오일로서 수득하였다. 그 후에, Ar 분위기 하에서, 피나콜 보란(17.8 mL, 123 mmol), Et3N(1.1 mL, 8.18 mmol), 및 ZrCp2HCl(2.11 g, 8.18 mmol)을 이러한 조정제 물질에 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 15시간 동안 환류시켰다. 반응물을 이후 포화 NH4Cl로 0℃에서 켄칭하고, 이러한 생성된 혼합물을 EtOAc로 희석하였다. 유기층을 포화 NH4Cl 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 진공에서 농축시켰다. 조정제 잔여물(35.9 g)을 컬럼 크로마토그래피(n-헥산 중 10% 내지 20% EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 22(14.0 g, 2 단계로 54%)를 황색 오일로서 제공하였다.
반응식 23
Figure pct00180
Figure pct00181
(E)-콜레스테릴 3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보로란-2-일)알킬카르바메이트(24)
화합물 22(2.60 g, 9.18 mmol)를 CF3COOH/DCM(9:1, 100 mL)에 용해시키고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 이후 진공에서 농축시키고, 잔여 CF3COOH를 공동증발(3×톨루엔, 3×DCM)에 의해 제거하여 조정제 TFA 암모늄 염(3.01 g)을 갈색 오일로서 수득하였다. Ar 분위기 하에서, Et3N(3.8 mL, 27.5 mmol) 및 콜레스테릴 클로로포르메이트(4.33 g, 9.64 mmol)를 무수 DCM(50 mL) 중 이러한 조정제 아민의 용액에 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응물을 이후 포화 NaHCO3로 켄칭하였다. 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 진공에서 농축시켰다. 조정제 잔여물(6.90 g)을 컬럼 크로마토그래피(실리카 100 g; 용매: n-헥산 중 10% 내지 20% EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 24를 흰색 발포체(4.76 g, 2 단계로 87%)로서 제공하였다.
반응식 24
Figure pct00182
4. 스즈키-미야우라 교차-커플링에 의한 접합
반응식 25
Figure pct00183
반응식 26
Figure pct00184
반응식 25 내지 반응식 26에 나타낸 바와 같이, 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥을 리간드(예컨대, 친유성 모이어티)에 접합시키고, 산물을 정제하고, 이어서 상보적 가닥에 혼성화시켜 siRNA 접합체를 제공하였다.
반응식 27. CPG에 대한 접합
Figure pct00185
반응식 27은 CPG에 부착된 RNA에 리간드(예컨대, 친유성 모이어티)를 접합시키는 절차를 예시한 것이다.
실시예 8: 작용화 생분해형 링커 및 포스포라미다이트
반응식 28. 다양한 탄수화물(갈락토스, 갈락토사민, 글루코스, 글루코사민, 만노스, 만노사민 유도체 또는 펜토스 유도체).
Figure pct00186
Figure pct00187
도 3에 나타낸 바와 같이, siRNA 접합체를 반응식 28에서 예시된 분해형 링커 중 하나 이상의 연속 첨가, 및 상보적 가닥으로의 혼성화로 고형 지지체 상에 합성하였다.
실시예 9. 작용화 분해형 링커 및 포스포라미다이트
반응식 29. 다양한 변형 탄수화물(갈락토스, 갈락토사민, 글루코스, 글루코사민, 만노스, 만노사민 유도체의 이당류 또는 삼당류)
Figure pct00188
도 3에 나타낸 바와 같이, siRNA 접합체를 반응식 29에서 예시된 분해형 링커 중 하나 이상의 연속 첨가, 및 상보적 가닥으로의 혼성화로 고형 지지체 상에 합성하였다.
실시예 10: 작용화 프로테아제 분해형 링커 및 포스포라미다이트
반응식 30
Figure pct00189
도 3에 나타낸 바와 같이, siRNA 접합체를 반응식 30에서 예시된 분해형 링커 중 하나 이상의 연속 첨가, 및 상보적 가닥으로의 혼성화로 고형 지지체 상에 합성하였다.
실시예 11: 마우스 눈에서 mRNA 녹다운
야생형 C57BL/6 마우스(n=5) 그리고 이어서 7.5μg/눈(1.5μL)으로 유리체내 주사와 함께 14일째에 희생된 마우스에서 표 1a에 열거된 siRNA 접합체로 베타 카테닌 유전자 사일런싱을 연구하였다. 결과는 도 4에 나타나 있다.
[표 1a]
마우스에서 유리체내 주사에 사용된 siRNA 듀플렉스
Figure pct00190
Figure pct00191
Figure pct00192
[표 1b]
표 1a에 열거된 siRNA 듀플렉스에 대한 센스 가닥 변형의 간략한 설명
Figure pct00193
실시예 12: CNS에서 mRNA 녹다운
[표 2]
CNS 연구에서 척수강내 주사에 사용된 siRNA 듀플렉스
Figure pct00194
Figure pct00195
스프래그 다우리 래트의 피질에서 SOD1 mRNA(평균 ± SD 수준)의 유전자 사일런싱을, 내인성 대조군 및 베타 카테닌 처리군과 비교하여, 0.9 mg 용량의 단회 척수강내 주사 후, 표 2에 열거된 siRNA 접합체로 연구하였다. 결과는 도 5에 나타나 있다.
스프래그 다우리 래트의 소뇌에서 SOD1 mRNA(평균 ± SD 수준)의 유전자 사일런싱을 내인성 대조군 및 베타 카테닌 처리군과 비교하여, 0.9 mg 용량의 단회 척수강내 주사 후, 표 2에 열거된 siRNA 접합체로 연구하였다. 결과는 도 6에 나타나 있다.
스프래그 다우리 래트의 경추에서 SOD1 mRNA(평균 ± SD 수준)의 유전자 사일런싱을 내인성 대조군 및 베타 카테닌 처리군과 비교하여, 0.9 mg 용량의 단회 척수강내 주사 후, 표 2에 열거된 siRNA 접합체로 연구하였다. 결과는 도 7에 나타나 있다.
스프래그 다우리 래트의 요추에서 SOD1 mRNA(평균 ± SD 수준)의 유전자 사일런싱을 내인성 대조군 및 베타 카테닌 처리군과 비교하여, 0.9 mg 용량의 단회 척수강내 주사 후, 표 2에 열거된 siRNA 접합체로 연구하였다. 결과는 도 8에 나타나 있다.
스프래그 다우리 래트의 흉추에서 SOD1 mRNA(평균 ± SD 수준)의 유전자 사일런싱을 내인성 대조군 및 베타 카테닌 처리군과 비교하여, 0.9 mg 용량의 단회 척수강내 주사 후, 표 2에 열거된 siRNA 접합체로 연구하였다. 결과는 도 9에 나타나 있다.
실시예 13: siRNA 서열에 대한 친유성 변형(C16)의 위치적 영향
센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 모두의 전체 siRNA 서열에 대한 친유성 변형 위치의 영향을 GalNAc 접합체를 사용하여 마우스 간세포에서 평가하였다(표 3에 나타나 있는, 두 개의 F12 서열 기반). 세포를 비함유 흡수(형질감염제 부재) 동안 2.5 nM 및 250 nM 농도의 각 siRNA 접합체(표 3에 열거됨)와 인큐베이션하고, F12 mRNA를 RT-qPCR에 의해 24시간 후에 측정하였다(도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이). 웰 당 표 3으로부터의 2.5 μL의 각 siRNA를 384-웰-플레이트에서 약 5 × 103 개의 PMH 세포를 함유하는 40 μL의 윌리암 E 배지(William's E Medium)(Life Technology)에 첨가하였다. 세포를 RNA 정제 전 24시간 동안 5% CO2 중 37℃에서 인큐베이션하였다. 값을 미처리 대조 세포의 분율로 플롯팅하였다. 각 세포를 기술적 중복으로 실행하고, 각 점은 2 개의 생물학적 샘플 ± % 오차의 평균을 나타낸다. GAPDH는 내부 대조군으로서 작용하고, 잔여 F12 mRNA의 값을 미처리 대조군에 대해 플롯팅하였다. 일차 cyno 간세포에서 내부 위치 중 하나에서 C16 변형을 갖는 F12 siRNA의 시험관내 활성은 siRNA 듀플렉스에 C16-접합체가 용인되고 모든 위치가 동등하게 활성이 아닌 영역이 존재한다는 것을 보여주었다.
[표 3]
siRNA 서열(F12)에 대한 친유성 변형(C16)의 위치적 영향에 사용된 siRNA
Figure pct00196
Figure pct00197
Figure pct00198
Figure pct00199
Figure pct00200
Figure pct00201
Figure pct00202
Figure pct00203
Figure pct00204
실시예 14. C16 siRNA 접합체의 혈장 단백질 결합
친유성 변형을 갖는 siRNA 듀플렉스의 단백질(인간 혈청 알부민 사용) 결합 특징을 전기영동 이동성 변화 검정(EMSA)을 이용하여 결정하였다. 듀플렉스를 인간 혈청 알부민과 인큐베이션하고, 비결합 분율을 결정하였다. 프로토콜에 대한 세부사항은 다음과 같다. 10 μM의 저장 농도의 듀플렉스를 1 × PBS에서 0%, 20%, 또는 90% 혈청을 함유하는 0.5 μM(20 μL의 총 부피)의 최종 농도로 희석하였다. 샘플을 혼합하고, 30초 동안 원심분리하고, 이어서 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 완료되면, 4 μL의 6 × EMSA 겔-로딩 용액을 각 샘플에 첨가하고, 30초 동안 원심분리하고, 12 μL의 각 샘플을 26 웰 BioRad 10% PAGE(폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 상에 로딩하였다. 겔을 100 볼트에서 1시간 동안 이동시켰다. 이동 완료 후, 케이싱으로부터 겔을 꺼내고, 50 mL의 10% TBE(트리스 염기, 붕산 및 EDTA)에서 세척하였다. 세척이 완료되면, 5 μL의 SYBR Gold를 겔에 첨가하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션되게 하고, 다시 50 mL의 10% TBE에서 겔-세척하였다. Gel Doc XR+ 겔 문서화 시스템을 사용하여 다음 파라미터를 이용함으로써 겔을 판독하였다: 이미징 어플리케이션을 SYBR Gold로 설정하고, 크기를 Bio-Rad 기준 겔로 설정하고, 노출을 강한 밴드에 대해 자동으로 설정하고, 강조된 포화 픽셀을 하나로 바꾸고, 색을 회색으로 설정하였다. 검출, 분자량 분석, 및 산출량을 모두 비활성화시켰다. 선명한 겔 사진이 얻어지면, Image Lab 5.2를 사용하여 이미지를 프로세싱하였다. 밴드 강도가 측정되도록 레인 및 밴드를 자동으로 설정하였다. 각 샘플의 밴드 강도를 PBS에 대해 정상화하여 비결합 siRNA의 분율을 얻었다. 이러한 측정으로부터, 상대 소수성을 결정하고, 도 12에 플롯팅하였다. 듀플렉스의 일부 영역은 중간 단백질 결합을 나타냈고, 이를 시험관내에서 더 우수한 활성으로 변환시켰다(실시예 13 참조).
실시예 15: 혈장 단백질 결합(소수성과의 상관관계)에 대한 Kd 값의 결정-수치가 낮을수록 긴밀한 결합을 지시함.
올리고뉴클레오타이드로의 인간 혈청 알부민에 대한 Kd 결정을 위한 절차: BioRad 10% TBE 겔을 20분 동안 100 볼트에서 예비-이동시켰다. 10 μM의 저장 농도의 듀플렉스를 다양한 농도의 인간 혈청 알부민(100의 증분으로 0 μM 내지 1000 μM)을 함유하는 0.5 μM(20 μL의 총 부피)의 최종 농도로 희석하였다. 샘플을 혼합하고, 30초 동안 원심분리하고, 이어서 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 완료된 후, 4 μL의 6× EMSA 겔-로딩 용액을 각 샘플에 첨가하고, 30초 동안 원심분리하고, 12 μL의 각 샘플을 26 웰 BioRad 10% TBE 겔 상에 로딩하였다. 겔을 거의 20분 동안 50 볼트에서 이동시켜 전체 샘플이 겔 상에 로딩되게 하였다. 샘플이 완전히 로딩되면, 겔을 100 볼트에서 1시간 동안 이동시켰다. 이동의 완료 후, 케이싱으로부터 겔을 꺼내고, 50 mL의 10% TBE에서 세척하였다. 세척이 완료되면, 5 μL의 SYBR Gold를 겔에 첨가하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션되게 하고, 다시 50 mL의 10% TBE에서 겔-세척하였다. Gel Doc XR+ 겔 문서화 시스템을 사용하여 다음 파라미터를 이용함으로써 겔을 판독하였다: 이미징 어플리케이터를 SYBR Gold로 설정하고, 크기를 Bio-Rad 기준 겔로 설정하고, 노출을 강한 밴드에 대해 자동으로 설정하고, 강조된 포화 픽셀을 하나로 바꾸고, 색을 회색으로 설정하였다. 검출, 분자량 분석, 및 산출량을 모두 비활성화시켰다. 선명한 겔 사진이 얻어지면, Image Lab 5.2를 사용하여 이미지를 프로세싱하였다. 밴드 강도가 측정되도록 레인 및 밴드를 자동으로 설정하였다. 각 샘플의 밴드 강도를 HSA가 없는 듀플렉스의 것에 대해 정상화하여 HSA의 농도에 대한 결합 siRNA의 분율을 얻었다. 결과는 표 4 내지 표 5에 나타나 있다.
[표 4]
Figure pct00205
[표 5]
Figure pct00206
실시예 16: 래트에서 siRNA 접합체 - 단회 투여 시간 경과의 척수강내 전달(IT)
반응식 16-A. CNS 연구에서 척수강내 주사를 위해 이용한 프로토콜 및 siRNA 듀플렉스
Figure pct00207
래트에서 SOD1 유전자 사일런싱 및 베타-카테닌 유전자-사일런싱을, 0.9 mg 용량의 단회 척수강내 주사 후에, 상기 반응식 16-A에 나타나 있는 표에 열거된 siRNA 접합체로 연구하였다. 결과는 도 13 내지 도 15에 나타나 있다.
도 13b는 시험된 뇌 및 척수의 모든 영역을 나타낸 것이다. 도 13a 및 도 13c는 도 13b에 예시된 다양한 영역의 래트에서 siRNA 듀플렉스의 단회 IT 투여 후 SOD1의 사일런싱 결과를 나타낸 것이다. 도 13a 및 도 13c에 나타낸 바와 같이, 시험된 뇌 및 척수의 모든 영역에서 지속적인 SOD1 mRNA 사일런싱이 보인다. 도 14a 내지 도 14b는 단회 IT 투여 후 β-카테닌의 사일런싱 결과를 나타낸 것이다. 도 14a 내지 도 14b에 나타낸 바와 같이, 시험된 뇌 및 척수의 모든 영역에서 지속적인 β-카테닌 사일런싱이 보인다. 도 15는 다양한 영역의 래트에서 siRNA 듀플렉스의 단회 IT 투여 후 SOD1의 사일런싱의 결과를 나타낸 것이다. 도 15a는 비접합 siRNA 수준과 비교한 CSF에서의 접합 siRNA 수준을 나타낸 것이다. 도면에 나타낸 바와 같이, 접합 siRNA에서 CSF로부터의 빠른 siRNA 청소율이 보인다. 도 15b는 비접합 siRNA 수준과 비교한 뇌에서의 접합 siRNA 수준을 나타낸 것이다. 도면에 나타낸 바와 같이, 접합 siRNA는 비접합 siRNA에 비해 뇌에서 더 우수한 흡수 및 안정성을 갖는 것으로 보인다. 도 15c는 비접합 siRNA 수준 및 대조 siRNA 수준과 비교한 소뇌에서의 접합 siRNA 수준을 나타낸 것이다. 도면에 나타낸 바와 같이, 접합 siRNA의 뇌에서 증가된 흡수는 mRNA 녹다운의 상당한 향상을 야기하였는데, 이는 타겟화된 사일런싱을 지시하는 것이다. 도 15a 내지 도 15c는 SOD1 siRNA 접합체로 뇌에서 관찰된 더 높은 약물 수준 및 강력한 사일런싱을 예시하는 것이다.
실시예 17: SOD1 siRNA의 추가 정련
[표 6]
Figure pct00208
표 6은 상이한 화학으로 변형된 SOD1 siRNA를 나타낸 것이다. 대조군은 CSF이다. 도 16a 내지 도 16b는 다양한 용량에서 상이한 화학으로 변형된 SOD1 siRNA로의 사일런싱의 결과를 나타낸 것이다. 도 16a 내지 도 16b에 나타낸 바와 같이, 10-배 더 낮은 투약량 수준에서 모 SOD1 siRNA와 비교하여 변형된 SOD1 siRNA로 더 우수한 사일런싱이 달성되었다.
실시예 18: 비-인간 영장류(NHP)에 대한 CNS siRNA 접합체 전달의 번역 평가-단회 투여 NHP 설계
반응식 18-A. CNS 연구에서 척수강내 주사를 위해 이용된 프로토콜 및 siRNA 듀플렉스
Figure pct00209
비-인간 영장류에서 베타-카테닌 유전자-사일런싱을, 72 mg 볼루스 용량의 단회 척수강내 주사 후에, 상기 반응식 18-A에 나타나 있는 표에 열거된 siRNA 접합체로 연구하였다. 결과는 도 17 내지 도 23에 나타나 있다.
도 17은 예시적인 siRNA 듀플렉스의 단회 척수강내(IT) 투여 31일 후 비-인간 영장류(NHP)의 다양한 척수 및 뇌 영역에서 β-카테닌 siRNA 수준을 나타낸 것이다. 도면은 31일 시점에 시험된 모든 조직에 걸쳐 유의한 siRNA 수준이 여전히 존재했지만, siRNA 흡수는 다양한 CNS 영역 간에 다르고, siRNA가 또한 간에서 보였다는 것을 예시하고 있다. 도 18은 31일에 NHP에서 예시적인 siRNA 듀플렉스의 단회 척수강내 투여 후 β-카테닌 mRNA의 사일런싱에 대한 결과를 나타낸 것이다. 도면에 나타낸 바와 같이, β-카테닌을 타겟화하는 siRNA 접합체는 31일 시점에 CNS에 걸쳐 척수 및 뇌 영역 전반에 걸쳐 강력한 녹다운을 야기하였다. 도 19는 단회 IT 투여 후 비-인간 영장류의 CNS 전반에 걸친 β-카테닌 siRNA의 분포를 예시하는 이미지를 나타낸 것이다. 도 20은 뉴런에서 siRNA 흡수를 도시하는 이미지를 나타낸 것이다. 도면에 나타낸 바와 같이, MAP2는 뉴런 마커이고, β-카테닌(CTNNB) siRNA는 siRNA 항체로 프로빙되었다. 도 21은 단회 IT 투여 후 미세아교세포로 국부화된 siRNA 접합체를 예시하는 이미지를 나타낸 것이다. 도면에 나타낸 바와 같이, Ibal은 미세아교세포 마커이고, 및 β-카테닌(CTNNB) siRNA는 siRNA 항체로 프로빙되었다. 도 22는 단회 IT 투여 후 성상세포로 국부화된 siRNA 접합체를 예시하는 이미지를 나타낸 것이다. 도면에 나타나 있는 바와 같이, GFAP는 성상세포 마커이고, β-카테닌(CTNNB) siRNA는 siRNA 항체로 프로빙되었다. 도 23은 구획 규모 용량에서 래트 및 NHP에 관찰된 유전자 사일런싱 활성을 비교한 것이다.
요약하면, IT 투여 후 래트 및 NHP의 CNS에 걸쳐 타겟 mRNA의 지속적인 사일런싱이 관찰되었다. 사일런싱은 연구 종료를 넘어서 연장되었다. 상이한 화학으로 siRNA의 추가 최적화된 설계는 10-배 넘게 향상된 효능을 야기하였다. ng/g 내지 mg/g 범위의 약물 수준으로 검사된 모든 CNS 조직에서 조직 흡수가 관찰되었다. 래트와 NHP 연구 둘 모두에서, 신규한 siRNA 접합체의 척수강내 투여는 일반적으로 잘 관용되는 것으로 밝혀졌다.
실시예 19: siRNA에 대한 친유성제의 내부 접합
반응식 31
Figure pct00210
반응식 31은 siRNA 듀플렉스에 대한 친유성제의 내부 접합을 위한 합성 프로토콜을 예시한 것이다. 반응식 31에서, 친유성제 모이어티, R은 C6-C30 알코올(예를 들어, 헥산올, 헵탄올, 옥탄올, 노난올, 데칸올, 운데칸올, 도데칸올, 트리데칸올, 테트라데칸올, 펜타데칸올, 헥사데칸올, 헵타데칸올, 옥타데칸올, 올레일 알코올, 리놀레일 알코올, 아라키돈 알코올, 시스-4,7,10,13,16,19-도코사헥산올, 레티놀, 비타민 E, 콜레스테롤 등)일 수 있다.
반응식 32
Figure pct00211
반응식 32는 siRNA 듀플렉스에 대한 친유성제의 내부 접합을 위한 대안적인 합성 프로토콜을 예시한 것이다. 반응식 32에서, 친유성제 모이어티, R은 C6-C30 알코올(예를 들어, 헥산올, 헵탄올, 옥탄올, 노난올, 데칸올, 운데칸올, 도데칸올, 트리데칸올, 테트라데칸올, 펜타데칸올, 헥사데칸올, 헵타데칸올, 옥타데칸올, 올레일 알코올, 리놀레일 알코올, 아라키돈 알코올, 시스-4,7,10,13,16,19-도코사헥산올, 레티놀, 비타민 E, 콜레스테롤 등)일 수 있다.
실시예 20: siRNA에 대한 친유성 모이어티의 합성 후 접합
반응식 33
Figure pct00212
반응식 33은 siRNA 듀플렉스에 대한 친유성제의 합성 후 내부 접합을 위한 프로토콜을 예시한 것이다. 반응식 33에서, R 또는 COR = C6-C30 산(예를 들어, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산, 트리데칸산, 테트라데칸산, 펜타데칸산, 헥사데칸산, 헵타데칸산, 옥타데칸산, 올레산, 리놀레산, 아라키돈산, 시스-4,7,10,13,16,19-도코사헥산산, 비타민 A, 비타민 E, 콜레스테롤 등이다. COOR= C6-C30 알코올(예를 들어, 헥산올, 헵탄올, 옥탄올, 노난올, 데칸올, 운데칸올, 도데칸올, 트리데칸올, 테트라데칸올, 펜타데칸올, 헥사데칸올, 헵타데칸올, 옥타데칸올, 올레일 알코올, 리놀레일 알코올, 아라키돈 알코올, 시스-4,7,10,13,16,19-도코사헥산올, 레티놀, 비타민 E, 콜레스테롤 등)이다.
반응식 34
Figure pct00213
반응식 34는 siRNA 듀플렉스에 대한 친유성제의 합성 후 내부 접합을 위한 대안적인 프로토콜을 예시한 것이다. 반응식 34에서, R, COR, 또는 COOR = C6-C30 산(예를 들어, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산, 트리데칸산, 테트라데칸산, 펜타데칸산, 헥사데칸산, 헵타데칸산, 옥타데칸산, 올레산, 리놀레산, 아라키돈산, 시스-4,7,10,13,16,19-도코사헥산산, 비타민 A, 비타민 E, 콜레스테롤 등)이다. COOR= C6-C30 알코올(예를 들어, 헥산올, 헵탄올, 옥탄올, 노난올, 데칸올, 운데칸올, 도데칸올, 트리데칸올, 테트라데칸올, 펜타데칸올, 헥사데칸올, 헵타데칸올, 옥타데칸올, 올레일 알코올, 리놀레일 알코올, 아라키돈 알코올, 시스-4,7,10,13,16,19-도코사헥산올, 레티놀, 비타민 E, 콜레스테롤 등)이다.
실시예 21: 마우스에서 내부 지질 접합체의 SAR
친유성제의 내부 접합과 siRNA의 구조 활성 관계를 마우스에서 연구하였다. 본 실시예에서 서열은 하기 표 7에 나타나 있다.
[표 7]
Figure pct00214
Figure pct00215
Figure pct00216
마우스 #1에서 내부 지질 접합체의 SAR. 도 24는 3 μg 또는 7.5 μg의 투약량에서, 표 7에 나타나 있는 다양한 예시적인 siRNA 듀플렉스를 투여한 후, 14일에 마우스의 눈에서 TTR mRNA 수준의 결과를 나타낸 것이다. 상기 표 7에 나타낸 바와 같이, siRNA는 센스 가닥의 내부 위치에서 친유성 모이어티(올레일, C16, C14, C12, 또는 C10)를 접합함으로써 변형된다. 도 24에 나타낸 바와 같이, 친유성 접합으로 siRNA에 대한 TTR 녹다운 능력은 다음과 같다: 올레일(C18) ≥ C16 > C14 > C12 > C10. 이러한 결과는 siRNA의 유전자 사일런싱 활성에 대한 소수성의 영향을 예시한다.
Figure pct00217
마우스 #2에서 내부 지질 접합체의 SAR. 도 25는 7.5 μg의 투약량에서, 표 7에 나타나 있는 다양한 예시적인 siRNA 듀플렉스를 투여한 후, 14일째에 마우스의 눈에서 TTR mRNA 수준의 결과를 나타낸 것이다. 도 25에 나타낸 바와 같이, 올레일(C18), 아라키돈산, 및 비타민 A 접합체로 접합된 siRNA는 다른 접합체보다 더 우수한 TTR 녹다운 능력을 가졌다.
Figure pct00218
마우스에서 내부 C 16 접합체로의 5' AS 가닥 SAR. 도 26은 7.5 μg의 투약량에서, 표 7에 나타나 있는 다양한 예시적인 siRNA 듀플렉스의 유리체내 투여 14일 후 마우스의 눈에서 TTR mRNA 수준의 결과를 나타낸 것이다. 상기 표 7에 나타낸 바와 같이, siRNA는 센스 가닥의 내부 위치에서 친유성 모이어티(C16), 및 안티센스 가닥의 5' 말단에서 다양한 변형(예를 들어, 2개의 키랄 PS; 2'-OMe; VP; 1개의 키랄 PS; PO3; DNA; RNA; 2'-F; 포스페이트 전구약물)을 접합시킴으로써 변형된다.
Figure pct00219
참조문헌
하기 열거된 항목들을 포함하여 본원에서 언급되는 모든 간행물 및 특허는 각각의 개별 간행물 또는 특허가 원용에 의해 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시된 것처럼 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 상충되는 경우, 본원의 임의의 정의를 포함하여 본 출원이 우선될 것이다.

Claims (56)

  1. 이중-가닥 iRNA 제제로서,
    타겟 유전자와 상보적인 안티센스 가닥;
    상기 안티센스 가닥과 상보적인 센스 가닥; 및
    적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에, 선택적으로 링커 또는 담체를 통해, 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 포함하는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  2. 제1항에 있어서, logKow에 의해 측정되는, 친유성 모이어티의 친유성은 0을 초과하는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  3. 제1항에 있어서, 이중-가닥 iRNA 제제의 혈장 단백질 결합 검정에서 비결합 분율에 의해 측정되는, 이중-가닥 iRNA 제제의 소수성은 0.2 초과인, 이중-가닥 iRNA 제제.
  4. 제3항에 있어서, 혈장 단백질 결합 검정은 인간 혈청 알부민 단백질을 이용하는 전기영동 이동성 변화 검정(electrophoretic mobility shift assay)인, 이중-가닥 iRNA 제제.
  5. 제1항에 있어서, 내부 위치는 가닥의 각 말단으로부터 말단 두 개의 위치를 제외한 모든 위치를 포함하는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  6. 제5항에 있어서, 내부 위치는 가닥의 각 말단으로부터 말단 세 개의 위치를 제외한 모든 위치를 포함하는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 내부 위치는 센스 가닥의 분해 부위 영역을 배제하는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  8. 제7항에 있어서, 내부 위치는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 9번 내지 12번 위치를 배제하는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  9. 제7항에 있어서, 내부 위치는 센스 가닥의 3'-말단으로부터 계수하여 11번 내지 13번 위치를 배제하는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  10. 제5항 또는 제6항에 있어서, 내부 위치는 안티센스 가닥의 분해 부위 영역을 배제하는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  11. 제10항에 있어서, 내부 위치는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 12번 내지 14번 위치를 배제하는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  12. 제5항 또는 제6항에 있어서, 내부 위치는 3'-말단으로부터 계수하여 센스 가닥의 11번 내지 13번 위치, 및 5'-말단으로부터 계수하여 안티센스 가닥의 12번 내지 14번 위치를 배제하는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  13. 제1항에 있어서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 다음 내부 위치: 각 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여, 센스 가닥의 4번 내지 8번 및 13번 내지 18번 위치, 및 안티센스 가닥의 6번 내지 10번 및 15번 내지 18번 위치 중 하나 이상에 접합되는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  14. 제13항에 있어서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 다음 내부 위치: 각 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여, 센스 가닥의 5번, 6번, 7번, 15번, 및 17번 위치, 및 안티센스 가닥의 15번 및 17번 위치 중 하나 이상에 접합되는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 및 안티센스 가닥은 각각 15개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이인, 이중-가닥 iRNA 제제.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 및 안티센스 가닥은 각각 19개 내지 25개 뉴클레오타이드 길이인, 이중-가닥 iRNA 제제.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 및 안티센스 가닥은 각각 21개 내지 23개 뉴클레오타이드 길이인, 이중-가닥 iRNA 제제.
  18. 제17항에 있어서, 센스 가닥은 21개-뉴클레오타이드 길이이고, 안티센스 가닥은 23개-뉴클레오타이드 길이이고, 가닥은 3'-말단에 2개-뉴클레오타이드 길이의 단일-가닥 오버행을 갖는 21개의 연속 염기쌍의 이중-가닥 영역을 형성하는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  19. 제1항에 있어서, 친유성 모이어티는 지방족, 알리사이클릭, 또는 폴리알리사이클릭 화합물인, 이중-가닥 iRNA 제제.
  20. 제19항에 있어서, 친유성 모이어티는 지질, 콜레스테롤, 레티노산, 콜릭산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥시아놀, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜릭산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진인, 이중-가닥 iRNA 제제.
  21. 제19항에 있어서, 친유성 모이어티는 포화되거나 불포화된 C4-C30 탄화수소 사슬, 및 하이드록실, 아민, 카르복실산, 설포네이트, 포스페이트, 티올, 아자이드, 및 알카인으로 이루어진 군으로부터 선택된 선택적 작용기를 함유하는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  22. 제21항에 있어서, 친유성 모이어티는 포화되거나 불포화된 C6-C18 탄화수소 사슬을 함유하는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  23. 제22항에 있어서, 친유성 모이어티는 포화되거나 불포화된 C16 탄화수소 사슬을 함유하는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 친유성 모이어티는 하나 이상의 뉴클레오타이드(들)를 치환하는 담체를 통해 내부 위치(들)에 접합되는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  25. 제24항에 있어서, 담체는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐, 및 데칼리닐로 이루어진 군으로부터 선택된 사이클릭 기이거나; 세리놀 백본 또는 디에탄올아민 백본을 기반으로 한 비사이클릭 모이어티인, 이중-가닥 iRNA 제제.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 친유성 모이어티는 에테르, 티오에테르, 우레아, 카르보네이트, 아민, 아미드, 말레이미드-티오에테르, 디설파이드, 포스포디에스테르, 설폰아미드 결합, 클릭 반응의 산물, 또는 카르바메이트를 함유하는 링커를 통해 이중-가닥 iRNA 제제에 접합되는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 iRNA 제제는 말단 중 적어도 하나에 단일-가닥 오버행을 포함하는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  28. 제27항에 있어서, 상기 단일-가닥 오버행은 1개, 2개, 또는 3개 뉴클레오타이드 길이인, 이중-가닥 iRNA 제제.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 친유성 모이어티는 뉴클레오베이스, 당 모이어티, 또는 뉴클레오사이드간 결합에 접합되는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥의 5'-말단에 포스페이트 또는 포스페이트 모방체를 추가로 포함하는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  31. 제30항에 있어서, 포스페이트 모방체는 5'-비닐 포스포네이트(VP)인, 이중-가닥 iRNA 제제.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, CNS 조직에 대한 전달을 매개하는 수용체를 타겟화하는 타겟화 리간드를 추가로 포함하는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  33. 제32항에 있어서, 타겟화 리간드는 Angiopep-2, 지질단백질 수용체 관련 단백질(lipoprotein receptor related protein: LRP) 리간드, bEnd.3 세포 결합 리간드, 트랜스페린 수용체(transferrin receptor: TfR) 리간드, 만노스 수용체 리간드, 글루코스 운반체 단백질, 및 LDL 수용체 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  34. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 안구 조직에 대한 전달을 매개하는 수용체를 타겟화하는 타겟화 리간드를 추가로 포함하는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  35. 제34항에 있어서, 타겟화 리간드는 트랜스-레티놀, RGD 펩타이드, LDL 수용체 리간드, 및 탄수화물 기재 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  36. 제35항에 있어서, RGD 펩타이드는 H-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-Cys-OH 또는 사이클로(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)인, 이중-가닥 iRNA 제제.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 간 조직을 타겟화하는 타겟화 리간드를 추가로 포함하는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  38. 제37항에 있어서, 타겟화 리간드는 GalNAc 접합체인, 이중-가닥 iRNA 제제.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 친유성 모이어티 또는 타겟화 리간드는 갈락토사민, 글루코사민, 글루코스, 갈락토스, 만노스, 및 이들의 조합의 DNA, RNA, 디설파이드, 아미드, 작용화 단당류 또는 올리고당류로 이루어진 군으로부터 선택된 생분해형 링커를 통해 접합되는, 이중-가닥 iRNA 제제.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥의 3' 말단은 아민을 갖는 사이클릭 기인 말단 캡을 통해 보호되고, 상기 사이클릭 기는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐, 및 데칼리닐로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중 가닥 iRNA 제제.
  41. 세포에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 상기 세포를 이중-가닥 iRNA 제제와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 이중-가닥 iRNA 제제는
    타겟 유전자와 상보적인 안티센스 가닥;
    상기 안티센스 가닥과 상보적인 센스 가닥; 및
    적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에, 선택적으로 링커 또는 담체를 통해, 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 포함하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 세포는 간외 세포인, 방법.
  43. 제41항에 있어서, logKow에 의해 측정되는, 친유성 모이어티의 친유성은 0을 초과하는, 방법.
  44. 제41항에 있어서, 이중-가닥 iRNA 제제의 혈장 단백질 결합 검정에서 비결합 분율에 의해 측정되는, 이중-가닥 iRNA 제제의 소수성은 0.2 초과인, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 혈장 단백질 결합 검정은 인간 혈청 알부민 단백질을 이용하는 전기영동 이동성 변화 검정인, 방법.
  46. 제41항에 있어서, 친유성 모이어티는 포화되거나 불포화된 C16 탄화수소 사슬을 함유하는, 방법.
  47. 피험자에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 이중-가닥 iRNA 제제를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 이중-가닥 iRNA 제제는
    타겟 유전자와 상보적인 안티센스 가닥;
    상기 안티센스 가닥과 상보적인 센스 가닥; 및
    적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에, 선택적으로 링커 또는 담체를 통해, 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 이중-가닥 iRNA 제제는 간외로 투여되는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 이중-가닥 iRNA 제제는 척수강내로 투여되는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 뇌 또는 척추 조직에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 뇌 또는 척추 조직은 피질, 소뇌, 경추, 요추, 및 흉추로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  52. 제48항에 있어서, 타겟 유전자는 APP, ATXN2, C9orf72, TARDBP, MAPT(Tau), HTT, SNCA, FUS, ATXN3, ATXN1, SCA1, SCA7, SCA8, MeCP2, PRNP, SOD1, DMPK, 및 TTR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 이중-가닥 iRNA 제제는 유리체내로 투여되는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 안구 조직에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는, 방법.
  55. CNS 장애를 갖는 피험자를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 이중-가닥 RNAi 제제를 피험자에게 투여하고, 이에 의해 피험자를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, CNS 장애는 알츠하이머(alzheimer), 근위축성 축삭 경화증 (amyotrophic lateral schlerosis: ALS), 전측두엽 치매(frontotemporal dementia), 헌팅턴(huntington), 파킨슨(Parkinson), 척수소뇌(spinocerebellar), 프리온(prion) 및 라포라(lafora)의 군으로부터 선택되는, 방법.
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