CN103221549A - 用于递送寡核苷酸的新型简单化学实体和方法 - Google Patents

用于递送寡核苷酸的新型简单化学实体和方法 Download PDF

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Abstract

在一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在寡核苷酸的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸；3）任选地，选自SEQ ID NOs：1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头；和任选地附着至寡核苷酸的一种或多种脂质、加溶基和/或靶向配体。

Description

用于递送寡核苷酸的新型简单化学实体和方法
发明背景
集中于用于治疗目的的全身性寡核苷酸递送的科学努力正在进行中。寡核苷酸递送的三种突出方法包括1）脂质纳米颗粒（LNP）封装，2）聚合物缀合和3）简单化学缀合（single chemical conjugation）。简单化学缀合一般采用附着至寡核苷酸的靶向配体或脂质或加溶基或内体裂解肽或细胞穿透肽和/或两种或所有四种的组合。接头可以存在于缀合物以及其他官能团中。简单化学缀合物是已知的，并且寡核苷酸的附着在寡核苷酸的5'-或3'-末端、在两个末端或内部发生。参见WO2005/041859；WO2008/036825、WO2009/126933、US2010/0076056和WO2010/039548。
相当大量的文献证据支持寡核苷酸递送的主要障碍是细胞摄取和内体逃逸的假设。为了改善递送效率，可能需要在非常浓缩的拓扑学中的摄取促进肽和/或内体裂解肽和/或电荷屏蔽基团。在这点上，多功能平台和内部修饰提供满足这个要求的唯一机会。
本发明的简单化学缀合物可以在寡核苷酸的核糖环的2'-位置和/或寡核苷酸的末端3'-和/或5'-位置上含有无一、一个或多个肽，其可以视为内体裂解、细胞穿透和/或致融的。接头也可以存在于肽和寡核苷酸之间。其他官能团例如靶向配体、加溶剂、药物代谢动力学增强剂、脂质和/或掩蔽剂是任选存在的。一般地，寡核苷酸是siRNA。进一步地，寡核苷酸是siRNA的过客链或引导链。
发明概述
在一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在寡核苷酸的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的过客链。
在另一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在寡核苷酸的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的过客链。
在另一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在寡核苷酸的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的过客链。
在另一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在寡核苷酸的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的过客链。
在一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在核糖环的2'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置上附着至siRNA的过客链。
在另一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在核糖环的2'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置上附着至siRNA的过客链。
在另一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在寡核苷酸的核糖环的2'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置上附着至siRNA的过客链。
在另一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在寡核苷酸的核糖环的2'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置上附着至siRNA的过客链。
在一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在寡核苷酸的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的过客链。
在另一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在寡核苷酸的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的过客链。
在另一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在寡核苷酸的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的过客链。
在另一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在寡核苷酸的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的过客链。
附图简述
图1是在用化合物C4-1处理的HeLa细胞中的SSB mRNA水平。
图2是在用化合物C4-5处理的HeLa细胞中的SSB mRNA水平。
图3是在用化合物C4-8处理的HeLa细胞中的SSB mRNA水平。
图4是在用化合物C4-10处理的HeLa细胞中的SSB mRNA水平。
图5是在用化合物C6-1处理的HeLa细胞中的SSB mRNA水平。
图6是在用化合物C6-2处理的HeLa细胞中的SSB mRNA水平。
图7是在用化合物C7-1处理的HeLa细胞中的SSB mRNA水平。
图8是在用化合物C8-1处理的HeLa细胞中的SSB mRNA水平。
图9是在用化合物C10-7处理的HeLa细胞中的SSB mRNA水平。
图10是在用化合物C10-8处理的HeLa细胞中的SSB mRNA水平。
图11是大鼠视网膜中的SSB mRNA水平。
发明详述
在一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在寡核苷酸的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的过客链。
在另一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在寡核苷酸的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的过客链。
在另一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在寡核苷酸的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的过客链。
在另一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在寡核苷酸的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的过客链。
在一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在核糖环的2'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置上附着至siRNA的过客链。
在另一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在核糖环的2'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置上附着至siRNA的过客链。
在另一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在寡核苷酸的核糖环的2'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置上附着至siRNA的过客链。
在另一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在寡核苷酸的核糖环的2'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置上附着至siRNA的过客链。
在一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在寡核苷酸的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的过客链。
在另一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在寡核苷酸的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的过客链。
在另一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表1的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在寡核苷酸的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的过客链。
在另一个实施方案中，本发明公开了包含下述的模块组合物：1）寡核苷酸；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在寡核苷酸的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：28、29、33、36、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58和59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至接头。
在上文实施方案中，寡核苷酸是siRNA。
在上文实施方案中，接头在引导链的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的引导链。
在上文实施方案中，接头在过客链的核糖环的2'-位置排除末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的过客链。
在上文实施方案的子实施方案中，模块组合物进一步包含一个或多个脂质。
在上文实施方案的另一个子实施方案中，模块组合物进一步包含一个或多个脂质，其中所述脂质在核糖环的2'-位置或寡核苷酸的3'-位置上附着至寡核苷酸。
在上文实施方案的另一个子实施方案中，模块组合物进一步包含一个或多个脂质，其中所述脂质在寡核苷酸的3'-位置上附着。
在上文实施方案的另一个子实施方案中，模块组合物进一步包含一个或多个脂质，其中所述脂质在引导链的3'-位置上附着。
在上文实施方案的另一个子实施方案中，模块组合物进一步包含一个或多个脂质，其中所述脂质在核糖环的2'-位置和/或寡核苷酸的末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸。
在上文实施方案的另一个子实施方案中，模块组合物进一步包含一个或多个脂质，其中所述脂质在核糖环的2'-位置排除寡核苷酸的末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸。
在上文实施方案的另一个子实施方案中，模块组合物进一步包含脂质。
在上文实施方案的另一个子实施方案中，模块组合物进一步包含脂质，其中所述脂质在核糖环的2'-位置或寡核苷酸的3'-位置上附着至寡核苷酸。
在上文实施方案的另一个子实施方案中，模块组合物进一步包含脂质，其中所述脂质在寡核苷酸的3'-位置上附着。
在上文实施方案的另一个子实施方案中，模块组合物进一步包含脂质，其中所述脂质在引导链的3'-位置上附着。
在上文实施方案的另一个子实施方案中，模块组合物进一步包含脂质，其中所述脂质在核糖环的2'-位置和/或寡核苷酸的末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸。
在上文实施方案的另一个子实施方案中，模块组合物进一步包含脂质，其中所述脂质在核糖环的2'-位置排除寡核苷酸的末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸。
在上文实施方案的另一个子实施方案中，模块组合物进一步包含脂质，其中所述脂质在引导链的3'-位置上附着。
在上文实施方案的另一个子实施方案中，模块组合物进一步包含胆固醇。
在上文实施方案的另一个子实施方案中，模块组合物进一步包含胆固醇，其中胆固醇在核糖环的2'-位置或寡核苷酸的3'-位置上附着至寡核苷酸。
在上文实施方案的另一个子实施方案中，模块组合物进一步包含胆固醇，其中胆固醇在寡核苷酸的3'-位置上附着。
在上文实施方案的另一个子实施方案中，模块组合物进一步包含胆固醇，其中胆固醇在引导链的3'-位置上附着。
在上文实施方案的另一个子实施方案中，模块组合物进一步包含胆固醇，其中胆固醇在核糖环的2'-位置和/或寡核苷酸的末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸。
在上文实施方案的另一个子实施方案中，模块组合物进一步包含胆固醇，其中胆固醇在核糖环的2'-位置排除寡核苷酸的末端3'-和/或5'-位置上附着至寡核苷酸。
在上文实施方案的另一个子实施方案中，模块组合物进一步包含胆固醇，其中胆固醇在引导链的3'-位置上附着。
为了经由草图（cartoon）举例说明本发明，本发明特征在于模块组合物，其包含寡核苷酸（[O1][O2][O3]……[On]）、一个或多个接头（L）、一个或多个肽（P）以及任选一个或多个脂质（X）、一个或多个靶向配体（X）和/或一个或多个加溶基（X）。
在一个实施方案中，模块组合物可以具有式：
P-L- [O1][O2][O3]……[On] -L-P。
在另一个实施方案中，模块组合物可以具有式：
P-L- [O1][O2][O3]……[On] –X。
模块组合物的例子是：
Figure 429913DEST_PATH_IMAGE001
模块组合物的另一个代表是：
Figure 409370DEST_PATH_IMAGE002
这些例子用作指导。本领域技术人员将认识到存在用于将所需组分置于过客和引导链的多种排列。
任何数目的接头和因此任何数目的肽都可以附着至寡核苷酸。接头数目的优选范围是1-8。接头数目的更优选范围是1-4。肽数目的优选范围是1-8。肽数目的更优选范围是1-4。
两条链分别含有n和n'个核苷酸。数目n和n'可以是相等或不同的。数目是范围为8-50的整数。优选地，数目是范围为12-28的整数。更优选地，数目是范围为19-21的整数。
作为例子，含有接头（L-P和/或L-X）的每个核苷酸[On]或[On']具有下述草图中所示的一般结构：
Figure 189107DEST_PATH_IMAGE003
。
对于每个核苷酸，1）E = 氧（O）或硫（S）；2）碱基 = A、U、G或C，其可以是修饰或未修饰的；3）D是在核糖环和接头L之间的连接点，D = 氧（O）、硫（S、S（O）或S（O）2）、氮（N-R，其中R = H、烷基、L-P或L-X）、碳（CH-R，其中R = H、烷基、L-P或L-X）或磷（P（O）R或P（O）（OR），其中 R = 烷基、L-P或L-X）。优选地，D = 氧（O）。
两个核苷酸[On-1]和[On]或[On'-1]和[On']经由磷酸二酯或硫代磷酸二酯键连接。
当寡核苷酸是双链寡核苷酸时，“P-L”和脂质、靶向配体和/或加溶基可以位于相同链或不同链上。
在某些实施方案中，“P-L”和脂质、靶向配体和/或加溶基在相同链上。
在某些实施方案中，“P-L”和脂质、靶向配体和/或加溶基在过客链上。
在某些实施方案中，“P-L”和脂质、靶向配体和/或加溶基在引导链上。
在某些实施方案中，“P-L”和脂质、靶向配体和/或加溶基在不同链上。
在某些实施方案中，“P-L”在过客链上，而脂质、靶向配体和/或加溶基在引导链上。
在某些实施方案中，“P-L”和脂质、靶向配体和/或加溶基在不同链上，但在双链寡核苷酸的相同末端上。
在某些实施方案中，“P-L”和脂质、靶向配体和/或加溶基在不同链上，并且在双链寡核苷酸的相反末端上。
在某些实施方案中，等同或不同性质的另外“P-L”可以用于代替上述实施方案中提到的脂质、靶向配体和/或加溶基。
在某些实施方案中，“P-L”可以位于过客或引导链的多个末端上，并且脂质、靶向配体和/或加溶基可以位于过客和引导链的剩余末端上。
在某些实施方案中，一个“P-L”和两个或更多个脂质、靶向配体和/或加溶基存在于寡核苷酸上。
在某些实施方案中，两个或更多个“P-L”和两个或更多个脂质、靶向配体和/或加溶基存在于寡核苷酸上。
在某些实施方案中，当寡核苷酸是双链寡核苷酸，并且存在多个“P-L”组分和/或脂质、靶向配体和/或加溶基时，此类多个“P-L”组分和/或脂质、靶向配体和/或加溶基可以都存在于双链寡核苷酸的一条链或两条链中。
当存在多个“P-L”组分和/或脂质、靶向配体和/或加溶基时，它们可以都是相同的或不同的。
在一些实施方案中，“P-L”仅在内部核苷酸上（即排除寡核苷酸的3'-和5'-末端）。
在另一个方面，本发明包括将寡核苷酸递送给细胞的方法。该方法包括（a）提供或获得本发明的模块组合物；（b）使细胞与模块组合物接触；和（c）允许细胞将模块组合物内化。
该方法可以在体外、先体外后体内（ex vivo）或在体内执行，例如以治疗鉴定为需要寡核苷酸的受试者，例如需要下调或沉默一种或多种基因例如与病症有关的基因表达的人。
在一个方面，本发明提供了用于抑制一种或多种基因表达的方法。该方法包括使一种或多种细胞与有效量的寡核苷酸接触，其中所述有效量是抑制一种或多种基因表达的量。该方法可以在体外、先体外后体内或在体内执行。
本发明的方法和组合物例如本文描述的模块组合物可以与本领域已知的寡核苷酸一起使用。此外，本发明的方法和组合物可以用于治疗本领域已知的任何疾病或病症，和用于治疗任何受试者，例如任何动物、任何哺乳动物例如人。本领域普通技术人员还将认识到本发明的方法和组合物可以用于治疗将获益于下调或沉默一种或多种基因的任何疾病。
本发明的方法和组合物例如本文描述的模块组合物可以以本文描述的任何剂量和/或制剂或本领域已知的任何剂量或制剂一起使用。除本文描述的施用途径外，普通技术人员还应理解其他施用途径可以用于施用本发明的模块组合物。
寡核苷酸
如本文使用的，“寡核苷酸”是多链、双链或单链、未经修饰或经修饰的RNA、PNA或DNA。经修饰的RNAs的例子包括比未经修饰的RNAs对核酸酶降解具有更大抵抗力的那些。进一步例子包括具有2'糖修饰，碱基修饰，单链突出端例如3'单链突出端中的修饰，或特别地如果是单链的、那么包括一个或多个磷酸基或一个或多个磷酸基类似物的5'修饰的那些。寡核苷酸的例子和进一步描述可以在在此引入作为参考的WO2009/126933中发现。
在一个实施方案中，寡核苷酸是反义、miRNA或siRNA。优选寡核苷酸是siRNA。另一种优选寡核苷酸是siRNA的过客链。另一种优选寡核苷酸是siRNA的引导链。
siRNA
siRNA通过称为RNA干扰（RNAi）的过程指导mRNA的序列特异性沉默。该过程在广泛多样的生物包括哺乳动物及其他脊椎动物中发生。用于制备且施用siRNA的方法及其用于特异性灭活基因功能的用途是已知的。siRNA包括经修饰的和未经修饰的siRNA。siRNA的例子和进一步描述可以在在此引入作为参考的WO2009/126933中发现。
可以用于将siRNA施用于受试者的许多示例性递送途径是已知的。此外，siRNA可以根据本领域已知的任何示例性方法进行配制。siRNA制剂和施用的例子和进一步描述可以在在此引入作为参考的WO2009/126933中发现。
肽
对于不能容易地跨越双层膜的大分子药物和亲水性药物分子，在细胞的内体/溶酶体区室中的诱陷被认为是有效递送至其作用部位的最大障碍。不希望受理论束缚，认为肽的使用将促进寡核苷酸自这些胞内体/溶酶体区室逃出或寡核苷酸易位跨越细胞膜且释放到细胞溶质区室内。在特定实施方案中，本发明的肽可以是聚阳离子或两亲或聚阴离子肽或拟肽，其显示pH依赖性膜活性和/或融合性（fusogenicity）。拟肽可以是设计为模拟肽的小蛋白质样链。
在某些实施方案中，肽是细胞渗透剂，优选螺旋细胞渗透剂。这些肽通常被称为细胞渗透肽。参见例如，“Handbook of Cell Penetrating Peptides”编辑，Langel，U.；2007，CRC Press，Boca Raton，Florida。优选地，组分是两亲的。螺旋试剂优选是α-螺旋试剂，其优选具有亲脂和疏脂相。细胞渗透剂可以是例如细胞渗透肽、阳离子肽、例如主要由Tyr、Trp和Phe组成的两亲肽或疏水肽、树枝状肽、限制性肽（constrained peptide）或交联肽。细胞渗透肽的例子包括Tat、Penetratin和MPG。对于本发明，认为细胞渗透肽可以是“递送”肽，其可以携带大的极性分子包括肽、寡核苷酸和蛋白质跨越细胞膜。细胞渗透肽可以是线性或环状的，并且包括D-氨基酸、“反转型（retro-inverso）”序列、非肽或假肽键、肽基模拟物。此外，肽和肽模拟物可以是经修饰的，例如糖基化的、聚乙二醇化的或甲基化的。肽的例子和进一步描述可以在在此引入作为参考的WO2009/126933中发现。肽的合成是本领域众所周知的。
肽可以通过半胱氨酸或其他含硫醇部分对于C或N末端的添加在任一末端或两个末端缀合。当在N末端上未官能化时，肽可以通过乙酰基加帽，或可以用脂质、PEG或靶向部分加帽。当肽的C末端是未缀合或未官能化的时，它可以作为酰胺加帽，或可以用脂质、PEG或靶向部分加帽。
本发明的肽是：
Figure 895901DEST_PATH_IMAGE004
Figure 772590DEST_PATH_IMAGE005
其中所述肽任选通过半胱氨酸或其他含硫醇部分对于C或N末端的添加在任一末端缀合；或当在N末端上未官能化时，肽任选通过乙酰基、脂质、peg或靶向部分加帽；或当在C末端上未官能化时，肽任选通过酰胺、脂质、peg或靶向部分加帽。
优选的肽（P）是：
Figure 408102DEST_PATH_IMAGE006
Figure 737452DEST_PATH_IMAGE007
其中所述肽任选通过半胱氨酸或其他含硫醇部分对于C或N末端的添加在任一末端缀合；或当在N末端上未官能化时，肽任选通过乙酰基、脂质、peg或靶向部分加帽；或当在C末端上未官能化时，肽任选通过酰胺、脂质、peg或靶向部分加帽。
接头
在本发明的模块组合物的肽和寡核苷酸之间的共价键通过接头介导。这种接头可以是可切割的或不可切割的，取决于应用。在特定实施方案中，可切割接头可以用于在从内体转移到细胞质后释放寡核苷酸。缀合或偶联相互作用的预期性质或所需生物学效应将决定接头基团的选择。接头基团可以是组合的或分支的，以提供更复杂的体系结构。接头的例子和进一步描述可以在在此引入作为参考的WO2009/126933中发现。
本发明的接头显示于表1中：
表1
Figure 247937DEST_PATH_IMAGE008
Figure 979132DEST_PATH_IMAGE009
优选接头显示于表2中：
表2
商业接头包括所述接头的组合可从多个供应商例如Pierce或Quanta Biodesign获得。接头还可以是组合的，以产生容纳1 – 8种肽的更复杂的分支体系结构，如下文一个此类例子中举例说明的。
靶向配体
本发明的模块组合物可以包含靶向配体。在某些实施方案中，这种靶向配体可以将模块组合物导向特定细胞。例如，靶向配体可以与靶细胞表面上的分子特异性或非特异性结合。靶向部分可以是对于靶细胞具有特异性亲和力的分子。靶向部分可以包括针对靶细胞的表面上发现的蛋白质的抗体，或对于在靶细胞的表面上发现的分子的配体或配体的受体结合部分。靶向配体的例子和进一步描述可以在在此引入作为参考的WO2009/126933中发现。
靶向配体选自抗体、受体的配体结合部分、关于受体的配体、适体、D-半乳糖、N-乙酰-D-半乳糖（GalNAc）、多价N-乙酰-D-半乳糖、D-甘露糖、胆固醇、脂肪酸、脂蛋白、叶酸酯、促甲状腺素、促黑细胞激素、表面活性蛋白A、粘蛋白、碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰-半乳糖胺、N-乙酰-葡糖胺、多价甘露糖、多价果糖、糖基化聚氨基酸、转铁蛋白（transferin）、双膦酸酯、聚谷氨酸盐、聚天冬氨酸盐、增强血浆蛋白质结合的亲脂部分、类固醇、胆酸、维生素B12、生物素、RGD肽、RGD肽模拟物、布洛芬、萘普生、阿司匹林、叶酸酯及其类似物和衍生物。
优选靶向配体选自RGD肽、RGD肽模拟物、D-半乳糖、N-乙酰-D-半乳糖胺（GalNAc）、GalNAc2和GalNAc3、胆固醇、叶酸酯及其类似物和衍生物。
脂质
当附着至高度亲水分子例如核酸时，亲脂部分例如胆固醇或脂肪酸可以实质上增强血浆蛋白质结合且因而增强循环半衰期。此外，亲脂基团可以增加细胞摄取。例如，脂质可以结合特定血浆蛋白质，例如脂蛋白，其因而已显示增加表达相应脂蛋白受体（例如LDL-受体或清除受体SR-B1）的特异性组织中的摄取。亲脂性缀合物还可以视为靶向递送方法，并且其细胞内运输可以潜在地通过与内体裂解性试剂组合得到进一步改善。
增强血浆蛋白质结合的示例性亲脂部分包括但不限于类固醇、胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、双氢睾酮、1,3-双-O（十六烷基）甘油、香叶基氧代己基、十六烷基甘油、莰醇、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-（油酰基）石胆酸、O3-（油酰基）胆烯酸、二甲氧三苯甲基、吩噁嗪、阿司匹林、萘普生、布洛芬、维生素E和生物素等。脂质的例子和进一步描述可以在在此引入作为参考的WO2009/126933中发现。
脂质的例子包括：
优选脂质是胆固醇。
加溶剂
模块组合物可以包含可以增强水可溶性、循环半衰期和/或细胞摄取的一种或多种其他部分/配体。这些可以包括天然存在的物质，例如蛋白质（例如人血清白蛋白（HSA）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）或球蛋白）；或碳水化合物（例如葡聚糖、支链淀粉、壳多糖、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸）。这些部分还可以是重组或合成分子，例如合成聚合物或合成聚氨基酸。例子包括聚赖氨酸（PLL）、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、L-丙交酯乙交酯共聚物、二乙烯醚-马来酸酐共聚物、N-（2-羟丙基）甲基丙烯酰胺共聚物（HMPA）、聚乙二醇（PEG例如PEG-0.5K、PEG-2K、PEG-5K、PEG-10K、PEG-12K、PEG-15K、PEG-20K、PEG--40K）、甲基- PEG（mPEG）、[mPEG]2、聚乙烯醇（PVA）、聚氨基甲酸酯、聚（2乙基丙烯酸（acryllic acid））、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。加溶剂的例子和进一步描述可以在在此引入作为参考的WO2009/126933中发现。
优选加溶基是PEG 0.5K至30K。
治疗方法
在一个方面，本发明的特征在于治疗处于疾病危险中或受疾病折磨的受试者的方法，所述疾病可以获益于本发明的模块组合物的施用。该方法包括给有此需要的受试者施用本发明的模块组合物，从而治疗受试者。施用的寡核苷酸将取决于待治疗的疾病。例如，本发明的缀合物用于治疗癌症。关于有关特异性适应症的治疗方法的另外细节参见WO2009/126933。
制剂
存在用于制备寡核苷酸化合物的缀合物的众多方法。该技术对于本领域技术人员应是熟悉的。关于此类反应的有用参考文献是Bioconjugate Techniques，Hermanson，G. T.，Academic Press，San Diego，CA，1996。其他参考文献包括WO2005/041859；WO2008/036825和WO2009/126933。
实施例
本发明通过下述实施例进一步举例说明，所述实施例不应解释为进一步的限制。本申请自始至终引用的所有参考文献、悬而未决的专利申请和公开专利的内容在此特别引入作为参考。本文描述的siRNAs设计为靶向遍在表达的基因SSB（干燥综合征抗原B；NM_009278.4）。
寡核苷酸合成是本领域众所周知的。（参见美国专利申请：US 2006/0083780、US 2006/0240554、US 2008/0020058、US 2009/0263407和US 2009/0285881以及PCT专利申请：WO 2009/086558、WO2009/127060、WO2009/132131、WO2010/042877、WO2010/054384、WO2010/054401、WO2010/054405和WO2010/054406）。实施例中公开且利用的siRNAs经由标准固相程序合成。
接头基团可以在键附着点（LAP）上连接至一条或多条寡核苷酸链，并且可以包括任何含碳部分，在某些实施方案中，具有至少一个氧原子、至少一个磷原子和/或至少一个氮原子。在某些实施方案中，磷原子形成在接头基团上的末端磷酸基或硫代硫酸酯基团的部分，其可以充当用于寡核苷酸链的连接点。在特定实施方案中，氮原子形成接头基团上的末端醚、酯、氨基或酰氨基（NHC（O）-）的部分，其可以充当目的接头、内体裂解性单元、细胞渗透肽、加溶基、脂质、靶向基团或另外的目的接头的连接点。这些末端接头基团包括但不限于C6己基、C5仲羟基、C3硫醇或C6硫醇部分。来自下文描述的RNA序列的例子是C6己基：[（CH2）6 NH2 ]。
实施例1
Figure 236490DEST_PATH_IMAGE013
向NHS酯L-2（100.0 mg，0.320 mmol）的0.5 mL无水DCE溶液中加入叠氮胺L-1（253.0 mg，0.480 mmol）的0.5 mL无水DCE溶液，随后添加1.5当量三乙胺（trietthylamine）。将所得到的溶液在室温搅拌1小时，并且将反应混合物装载到二氧化硅柱上，用MeOH/DCM=0/100至10/90经过25分钟洗脱。对收集的L-3馏分实施LC-MS分析，并且结果指示产物纯度>95%。
在类似程序后，制备以>95% HPLC纯度的叠氮二硫化物L-4至L-6，L-7由多分散的SPDP-PEG-NHS酯制备。
实施例2
将粗制寡核苷酸R-1 15 mg用在3 mL DMA/水=3/1中的叠氮基-peg9-SPDP L-3（25.3 mg，0.035 mmol）和CuBr·Me2S（0.760 mg，3.70 μmol）处理。将所得到的反应混合物在室温搅拌48小时，随后添加2.0 mL 40% NH4F/水=1/1。将双相混合物在65℃搅拌1小时，随后通过C18柱体（C18 cartridges）纯化，以给出粗制白色固体R-2 ~ 5 mg。
在类似程序后，分别制备RNA二硫化物R-3 – R-11。
Figure 479384DEST_PATH_IMAGE014
Figure 721009DEST_PATH_IMAGE015
Figure 370034DEST_PATH_IMAGE016
Figure 75822DEST_PATH_IMAGE017
实施例3
将粗制寡核苷酸R-12 50 mg用在4 mL DMA/水=3/1中的叠氮基-peg9-SPDP L-3（40.0 mg，0.055 mmol）和CuBr·Me2S（2.50 mg，12 μmol）处理。将所得到的反应混合物在室温搅拌48小时，随后添加2.0 mL 40% NH4F/水=1/1。将双相混合物在65℃搅拌1小时，随后通过C18柱体纯化，以给出粗制白色固体R-13 ~ 15 mg。
在类似程序后，分别制备RNA二硫化物R-14 – R-18。
Figure 224038DEST_PATH_IMAGE018
Figure 15276DEST_PATH_IMAGE019
Figure 405675DEST_PATH_IMAGE020
实施例4
将在400 μL甲酰胺/pH=6.8 Tris缓冲液=3/1中的化合物R-2（1.50 mg，0.211 μmol）用在400 μL相同缓冲液中的肽SEQ ID NO：19（1.724 mg，0.423 μmol）处理，并且将所得到的反应混合物搅拌1小时。反应通过添加甲酰胺/pH=6.8 Tris缓冲液=3/1稀释至2.5 mL的总体积，且通过强阴离子交换层析在Resource Q柱上纯化（25-75% B的A溶液，A：甲酰胺/H2O=1/1，20 mmol Tris·HCl，pH=7.4，B：甲酰胺/H2O=1/1，20 mmol Tris·HCl，400 mmol NaClO4，pH=7.4）。将合并产物馏分用水稀释，且用MW 10,000截断膜针对水离心透析4次。将透析物冻干，以提供作为白色固体的R-19，质量= 11063。
将等摩尔量的引导链G1与化合物R-19混合，以产生相应双链双链体C4-1。双链体完整性通过CE分析进行检查，并且将缀合物提交用于生物学评估。
在类似程序后，分别制备RNA二硫化物缀合物C4-2至C4-14且提交用于生物学评估。
Figure 501304DEST_PATH_IMAGE023
Figure 446126DEST_PATH_IMAGE024
实施例5
将肽SEQ ID NO：19（10.0 mg，2.45 μmol）溶解于500 μL pH=6.5 TEAA缓冲液中，且逐滴加入在500 μL TEAA pH=6.5缓冲液中的接头L-8（38.4 mg，0.074 mmol）中。将反应搅拌2小时且通过RP HPLC 10-90% MeCN/水经过20分钟纯化。将收集的馏分冻干，以给出白色固体SEQ ID NO：19-1，其通过LC-MS分析是> 95%纯的。
将反应物R-3（2.00 mg，0.282 μmol）和TCEP（0.808 mg，2.82 μmol）溶解于pH=6.8 Tris缓冲液0.5 mL中，且搅拌2小时。LC-MS迹线指示R-3二硫键的切割，随后将反应混合物装载到PD-10脱盐柱上。将收集的馏分冻干，以给出白色固体R-20且用于接下来的反应而无需进一步纯化。
将在300 μL甲酰胺/pH=6.8 Tris缓冲液=3/1中的化合物R-20（2.00 mg，0.286 μmol）用在300 μL相同缓冲液中的肽SEQ ID NO：19-1（3.95 mg，0.859 μmol）处理，并且将所得到的反应混合物搅拌1小时。反应通过添加甲酰胺/pH=6.8 Tris缓冲液=3/1稀释至2.5 mL的总体积，且通过强阴离子交换层析在Resource Q柱上纯化（25-75% B的A溶液，A：甲酰胺/H2O=1/1，20 mmol Tris·HCl，pH=7.4，B：甲酰胺/H2O=1/1，20 mmol Tris·HCl，400 mmol NaClO4，pH=7.4）。将合并产物馏分用水稀释，且用MW 10,000截断膜针对水离心透析4次。将透析物冻干，以提供作为白色固体的R-21（0.71 mg，21.4%，>95%纯度）。
将等摩尔量的引导链G1与化合物R-21混合，以产生相应双链双链体C5-1。双链体完整性通过CE分析进行检查，并且将缀合物提交用于生物学评估。
Figure 110195DEST_PATH_IMAGE025
实施例6
将在300 μL甲酰胺/pH=6.8 Tris缓冲液=3/1中的化合物R-13（3.00 mg，0.382 μmol）用在300 μL相同缓冲液中的肽SEQ ID NO：19（4.98 mg，1.222 μmol）处理，并且将所得到的反应混合物搅拌1小时。反应通过添加甲酰胺/pH=6.8 Tris缓冲液=3/1稀释至2.5 mL的总体积，且通过强阴离子交换层析在Resource Q柱上纯化（25-75% B的A溶液，A：甲酰胺/H2O=1/1，20 mmol Tris·HCl，pH=7.4，B：甲酰胺/H2O=1/1，20 mmol Tris·HCl，400 mmol NaClO4，pH=7.4）。将合并产物馏分用水稀释，且用MW 10,000截断膜针对水离心透析4次。将透析物冻干，以提供作为白色固体的R-22（>90%纯度）。
将等摩尔量的引导链G1与化合物R-22混合，以产生相应双链双链体C6-1。双链体完整性通过CE分析进行检查，并且将缀合物提交用于生物学评估。
在类似程序后，分别制备RNA二硫化物缀合物C6-2至C6-6且提交用于生物学评估。
Figure 115060DEST_PATH_IMAGE026
Figure 552995DEST_PATH_IMAGE027
Figure 786661DEST_PATH_IMAGE028
实施例7
将胱胺（1.13 g，5.02 mmol）和氯甲酸胆固醇酯（4.96 g，11.04 mmol）溶解于DCM 20 mL中，随后在0℃加入TEA（3.50 ml，25.09 mmol）。将反应混合物加温至RT且搅拌1小时。去除溶剂且将残渣通过二氧化硅柱（EtOAc/己烷=0/100至50/50经过25分钟）纯化，以提供作为白色固体的L-9（2.44 g，50%）。
将L-9（440 mg，0.450 mmol）和DTT（174 mg，1.125 mmol）溶解于THF/水=20/1中且搅拌过夜。去除溶剂且将残渣通过二氧化硅柱纯化，以提供作为白色固体的硫醇L-10（300 mg，68%）。
将R-3（3.00 mg，0.423 μmol）和L-10（2.071 mg，4.23 μmol）溶解于THF/pH=6.8 Tris缓冲液= 10/1 600 μL中且搅拌3小时。通过C4 RP HPLC用TEAA作为添加剂纯化反应混合物。将收集的馏分针对3k膜透析3次且冻干，以提供白色固体R-23（0.61 mg，19%，>95%纯度）。
将等摩尔量的引导链G1与化合物R-23混合，以产生相应双链双链体C7-1。双链体完整性通过CE分析进行检查，并且将缀合物提交用于生物学评估。
Figure 321547DEST_PATH_IMAGE029
实施例8
将在0.3 mL pH=8 Tris缓冲液中的R-2（5.00 mg，0.705 μmol）溶液冷却至0℃，并且用L-11（2.76 mg，4.93 μmol）的0.3 mL MeCN溶液处理。将所得到的溶液在室温搅拌0.5小时。将粗反应用18 mL水稀释，使用MW 3K透析膜针对水离心透析四次。将透析物冻干以提供作为松散白色无定形粉末的所需产物R-24，测量的质量= 7540。
将在400 μL甲酰胺/pH=6.8 Tris缓冲液=3/1中的R-24（1.0 mg，0.133 μmol）溶液用在400 μL甲酰胺/pH=6.8 Tris缓冲液=3/1中的SEQ ID NO：19 （2.164 mg，0.530 μmol）溶液处理，并且将所得到的溶液在室温搅拌1.0小时。粗反应通过制备型阴离子交换层析在Gilson仪器上进行纯化，使用6 mL Resource Q柱和25-70%A经过B线性梯度（A = 20 mM Tris·HCl，50% 甲酰胺，pH=7.4；B = 20 mM Tris·HCl，400 mM NaClO4，50% 甲酰胺，pH=7.4）进行。将产物峰用水稀释，且使用MW 10k透析膜针对水离心透析四次。将透析物冻干以提供0.32 mg作为松散白色无定形粉末的所需缀合物R-25。
将等摩尔量的引导链G1与化合物R-25混合，以产生相应双链双链体C8-1。双链体完整性通过CE分析进行检查，并且将缀合物提交用于生物学评估。
在类似程序后，制备RNA二硫化物缀合物C8-2至C8-6且提交用于生物学评估。
Figure 746581DEST_PATH_IMAGE030
Figure 734129DEST_PATH_IMAGE031
实施例9
将粗制寡核苷酸G3 50 mg用在3 mL DMA/水=3/1中的叠氮基-peg9-SPDP L-3（38.6 mg，0.053 mmol）和CuBr·Me2S（2.74 mg，0.013 mmol）处理。将所得到的反应混合物在室温搅拌48小时，随后添加2.0 mL 40% NH4F/水=1/1。将双相混合物在65℃搅拌1小时，随后通过C18柱体纯化，以给出粗制白色固体G4。
在类似程序后，分别制备RNA二硫化物G5和G6。
实施例10
将在300 μL甲酰胺/pH=6.8 Tris缓冲液=3/1中的化合物G4（3.00 mg，0.391 μmol）用在300 μL相同缓冲液中的肽SEQ ID NO：19 （3.19 mg，0.782 μmol）处理，并且将所得到的反应混合物搅拌0.5小时。反应通过添加甲酰胺/pH=6.8 Tris缓冲液=3/1稀释至2.5 mL的总体积，且通过强阴离子交换层析在Resource Q柱上纯化（25-75% B的A溶液，A：甲酰胺/H2O=1/1，20 mmol Tris·HCl，pH=7.4，B：甲酰胺/H2O=1/1，20 mmol Tris·HCl，400 mmol NaClO4，pH=7.4）。将合并产物馏分用水稀释，且用MW 10,000截断膜针对水离心透析4次。将透析物冻干，以提供作为白色固体的G7 3.5 mg，质量= 11640。
将等摩尔量的引导链G7与过客链R-28混合，以产生相应双链双链体C10-1。双链体完整性通过CE分析进行检查，并且将缀合物提交用于生物学评估。
在类似程序后，分别制备RNA二硫化物缀合物C10-2至C10-8且提交用于生物学评估。
Figure 179651DEST_PATH_IMAGE034
Figure 903762DEST_PATH_IMAGE035
测定
siRNA测定一般方案
本文描述的siRNAs设计为靶向遍在表达的基因SSB（干燥综合征抗原B；NM_009278.4）。使用的siRNA序列在人、小鼠和大鼠转录物中是同源的。为了测试siRNA缀合物的沉默活性，将HeLa（人宫颈癌细胞系）细胞在补充有10%胎牛血清（FCS）的培养基（DMEM）中铺平板，且允许培养过夜（37℃，5%CO2）。在第二天时，将培养基替换为含有浓度范围为10-0.0015 μM的siRNA缀合物的无血清培养基，并且留在细胞上总共72小时（37℃，5%CO2）。根据供应商的说明书（Panomics Quantigene 1.0 bDNA试剂盒# QG0002）或Luc测定，使用分支-DNA测定分析SSB mRNA水平。使用MTS测定（Promega目录# TB245）评估细胞生存，并且将所有数据针对来自未处理细胞的水平标准化。
将HeLa细胞用所示化合物以剂量依赖性方式处理72小时，并且通过b-DNA或Luc测定分析SSB mRNA水平。
如图1中所示，在HeLa细胞用化合物C4-1处理72小时后的SSB mRNA水平（37℃，5%CO2）。
如图2中所示，在HeLa细胞用化合物C4-5处理72小时后的SSB mRNA水平（37℃，5%CO2）。
如图3中所示，在HeLa细胞用化合物C4-8处理72小时后的SSB mRNA水平（37℃，5%CO2）。
如图4中所示，在HeLa细胞用化合物C4-10处理72小时后的SSB mRNA水平（37℃，5%CO2）。
如图5中所示，在HeLa细胞用化合物C6-1处理72小时后的SSB mRNA水平（37℃，5%CO2）。
如图6中所示，在HeLa细胞用化合物C6-2处理72小时后的SSB mRNA水平（37℃，5%CO2）。
如图7中所示，在HeLa细胞用化合物C7-1处理72小时后的SSB mRNA水平（37℃，5%CO2）。
如图8中所示，在HeLa细胞用化合物C8-1处理72小时后的SSB mRNA水平（37℃，5%CO2）。
如图9中所示，在HeLa细胞用化合物C10-7处理72小时后的SSB mRNA水平（37℃，5%CO2）。
如图10中所示，在HeLa细胞用化合物C10-8处理72小时后的SSB mRNA水平（37℃，5%CO2）。
体内siRNA测定一般方案
涉及动物的所有程序都依照ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research执行，并且由Merck Research Laboratories，West Point，PA的Institutional Animal Care and Use Committee（IACUC）批准。雄性Brown Norway大鼠（6-8周）购自Charles River Laboratories。将siRNAs无菌制备以使感染的危险降到最低。对于玻璃体内给药，将大鼠用氯胺酮/赛拉嗪（40-90/5-10 mg/kg，IM）麻醉，并且将1%盐酸丙美卡因（1-2滴）作为局部麻醉剂应用于眼。对于玻璃体内注射，一对清洁的镊子用于轻轻proctose且使眼在合适的位置，并且30G尖针注射器用于将5uL测试siRNA或对照媒介物注射到紧在边缘后的玻璃体内。在处死当天，将大鼠用戊巴比妥钠（150-200 mg/kg，IP）实施安乐死。在去核后，将玻璃体、视网膜和RPE/脉络膜切割且冷冻。
眼检查正好在玻璃体内注射前和正好在收获前执行。
如图11A中所示，关于缀合物C4-1、C4-2、C4-3、C4-4在大鼠视网膜中的SSB mRNA水平。
如图11B中所示，关于缀合物C6-5在大鼠视网膜中的SSB mRNA水平。
如图11C中所示，关于以2个不同剂量的缀合物C10-2在大鼠视网膜中的SSB mRNA水平。

Claims (6)

1.一种模块组合物，其包含1）寡核苷酸；2）选自表2的一个或多个接头，其可以是相同或不同的，其中所述接头在寡核苷酸的核糖环的2'-位置和/或末端3'-和/或5'-位置上附着至所述寡核苷酸；和3）选自SEQ ID NOs：1-59的一个或多个肽，其可以是相同或不同的，其中所述肽附着至所述接头。
2.根据权利要求1的模块组合物，其进一步包含胆固醇，其中胆固醇在核糖环的2'-位置或寡核苷酸的3'-位置上附着至所述寡核苷酸。
3.根据权利要求1的模块组合物，其进一步包含胆固醇，其中胆固醇在核糖环的2'-位置和/或寡核苷酸的末端3'-和/或5'-位置上附着至所述寡核苷酸。
4.根据权利要求1的模块组合物，其中所述寡核苷酸是siRNA。
5.根据权利要求4的模块组合物，其中接头在核糖环的2'-位置排除引导链的末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的引导链。
6.根据权利要求4的模块组合物，其中接头在核糖环的2'-位置排除过客链的末端3'-和/或5'-位置上附着至siRNA的过客链。
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