KR20220115579A - 표적화된 핵산 전달을 위한 펩티드 도킹 비히클 - Google Patents

표적화된 핵산 전달을 위한 펩티드 도킹 비히클 Download PDF

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KR20220115579A
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샤오용 루
패트릭 와이. 루
데이비드 엠. 에반스
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서나오믹스, 인크.
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Abstract

siRNA 분자 등의 치료적 화합물 및 표적화 리간드를 함유하는 펩티드 도킹 비히클 조성물이 이의 제조 및 사용 방법과 함께 제공된다. 조성물 및 방법은 표적화 리간드를 화합물에 결합하여 증강된 치료 이익을 제공함으로써 대상체에 대한 치료 화합물의 표적화된 세포/조직 전달을 가능하게 한다. 대상체는 동물 또는 인간일 수도 있다.

Description

표적화된 핵산 전달을 위한 펩티드 도킹 비히클
단일 또는 복수 핵산이 엔도솜 방출 펩티드(endosomal releasing peptide)에 공유 접합되고, 적어도 하나의 소분자 리간드에 추가로 공유 결합된 전달 시스템이 제공된다. 당해 신규 조성물은 이의 그 제조 및 사용 방법과 함께 제공된다. 선택된 리간드 및 링커(linker)를 사용하여, 조성물 및 시스템은 간 및 기타 조직에 핵산 분자의 표적화된 전달을 제공한다.
이본쇄(double-stranded) RNA는 유전자 발현을 침묵시키는 것으로 밝혀졌고[참조: Fire et. al., Nature 391:806-811(1998), and Elbashir et. al., Nature, 411, 494-498(2001)], 이러한 현상은 RNA 간섭 또는 "RNAi" 또는 간섭 RNA 분자(RNAi)로 명명되었다. 짧은 간섭 RNA(siRNA) 유도된 RNAi 조절은 암으로부터 다른 전통적 약물 치료가 불가능한 질환까지 다양한 인간 질환을 치료할 수 있는 큰 가능성을 나타낸다. 종래의 소분자 및 항체 치료에 비해 RNA 기반 치료에는 3개의 주요 이점이 있다. 첫째, 특정 세포 유형 또는 조직으로의 전달이 고안되면(예: 간세포에 대한 siRNA/안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드(ASO) 전달; CNS에 대한 ASO 전달), 해당 세포 유형의 모든 질환-촉진 유전자를 표적화할 수 있다. 둘째, RNA 치료는 단일 유전자를 선택적으로 표적화할 수 있고, 표적외 유전자의 조절을 회피하기 위해 용이하게 조작할 수 있는 반면, 소분자 억제제는 종종 복수의 표적을 대상으로 하고, 미지의 표적외 부작용이 있다. 셋째, 정적(static) 소분자 및 항체와 달리, RNA 치료는, 예를 들면, 암의 돌연변이 또는 팬데믹 인플루엔자에 대응하기 위해, 이들의 서열을 약물진화시킬 수 있다. 이러한 속성은, 전달이 적절하게 해결될 수 있는 경우, RNA 기반 치료에, 약물 투여가 불가능한 인간 질환을 치료할 수 있는 큰 가능성을 제공한다.
이 분야에서, ASO, RNAi 및 mRNA 화학은 진보하여 안정성의 개선을 가능하게 하고, 자연 면역 반응을 회피하게 한다. 또한, 항체 또는 소분자 개발과 비교하여 비교적 저렴한 비용으로 자동화 합성에 의해 대규모로 치료적 ASO 및 RNA 화합물을 산업적 규모로 생산할 수 있다. 그러나, 2개의 분야는 여전히 추가 개발이 필요하다: (a) 특정 세포 유형 또는 조직에 대한 이러한 분자의 표적화; (b) 무독성 엔도솜 탈출제의 고안[참조: Dowdy, Nature Biotechnology, 35:222-229 (2017)].
시판되는 ASO 또는 RNAi 약물에는 2종류의 효과적 전달 방법이 사용된다. 하나는 복수의 성분을 포함하는 리포솜이라고 하는 지질 기반 나노입자를 사용한다. 다른 하나는 GalNAc 분자-접합된 ASGPR-표적화(아시알로당단백질 수용체(asialoglycoprotein receptor)) 접근법을 사용한다.
RNA-기반 치료의 주요 과제는 세포로 전달하기 위한 모든 경로가 최종적으로 엔도솜 탈출을 유도한다는 것이다. 간으로의 ASO 및 siRNA 전달은 간세포로 거대분자 약물의 전달에 적합한 ASGPR의 특성으로 인해 ASGPR-표적화 GalNAc-siRNA 접합체를 사용하여 달성할 수 있다. 특히, 간세포는 이들의 세포 표면에 수백만 개의 ASGPR 카피를 발현하고, 이는 10 내지 15분마다 급속하게 순환한다. 이러한 특성으로 인해, 추정 엔도솜 탈출율이 <0.01%인 경우에도, GalNAc-기반 전달 접근법이 효과적이다. 대조적으로, 다른 조직으로 ASO 또는 RNA의 효과적 전달은 달성되지 않았다. 다른 리간드-수용체 시스템은 ASGPR과 같이 높은 수준에서 수용체를 발현하지 않고, 엔도솜으로 급속하게 순환하지도 않는다. 실제로, 대부분의 세포 표면 수용체는 세포당 10,000-100,000(또는 그 이하) 범위로 발현되고, 카베올린 및 클라트린-매개 엔도사이토시스는 통상 90분마다 순환한다[참조: Juliano, Nucleic Acids Res. 44, 6518-6548 (2016)].
엔도솜 탈출은 모든 RNA-기반 치료에 적용되는 문제로 남아 있다. 간 간세포를 넘어서 세포 또는 조직을 표적화하기 위해, 신규한 화학물질 및 재료를 개발하여 엔도솜 탈출을 개발하는 것이 필요하다. 클로로퀸 등의 소분자 엔도솜 분해제는 엔도솜을 파괴 또는 용해하기 위해 사용되었지만, 유효 농도에서 이러한 약제는 세포 내의 모든 유형의 엔도솜을 항상 용해하여 실질적 독성을 초래한다.
대안의 엔도솜 탈출 접근법은 엔도솜 용해성 펩티드 또는 분자를 RNA에 직접 접합시키는 것이고, 이는 RNA 치료를 함유하는 엔도솜에 대한 이들의 작용을 엄격하게 제한한다. 콜레스테롤 또는 용해성 멜리틴 펩티드를 함유하는 2분자 동적 폴리접합(Dynamic Polyconjugate; DPC) 시스템을 사용하여 엔도솜을 탈출시키는 다양한 임상 실험은 독성 효과로 인해 중단되었다[참조: Wooddell, et al., Mol. Ther. 21, 973-985(2013); Hou et al., Biotechnol. Adv. 33, 931-940 (2015)].
하기에 기재된 조성물 및 방법은 올리고뉴클레오티드 및 표적화 리간드에 접합된 엔도솜 방출 펩티드를 사용한다. 작제물(construct)은 무독성 방식으로 세포의 세포질로 올리고뉴클레오티드 카고의 탈출을 증강시킨다. 본 발명의 작제물은 본 명세서에서 "펩티드 도킹 비히클"(PDoV)로 지칭된다.
(a) 표적화 모이어티(targeting moiety), 및 (b) 제1 치료적 올리고뉴클레오티드(first therapeutic oligonucleotide)에 공유 결합된 펩티드 도킹 비히클(Peptide Docking Vehicle; PDoV)을 함유하는 화학적 작제물(chemical construct)이 제공된다. 작제물은 제1 치료적 올리고뉴클레오티드와 동일하거나 또는 상이한 제2 치료적 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있다. PDoV는 히스티딘과 라이신의 복수의 반복 단위를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 표적화 모이어티는 아시알로당단백질 수용체에 결합한다. 올리고뉴클레오티드는 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, miRNA, saRNA, shRNA, 앱타머(aptamer), RNA자임(RNAzyme), DNA자임, 유인(decoy) 올리고뉴클레오티드 또는 CpG 모티프(motif)를 포함할 수 있다.
이들 작제물에서, PDoV 작제물은 동일한 또는 상이한 적어도 2개의 표적화 모이어티 및/또는 동일한 또는 상이한 적어도 2개의 치료적 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있는 엔도솜 방출 모티프를 함유할 수 있다.
작제물은 하기에 나타낸 구조 중 하나를 갖고, 여기서 유형 X 부위는 표적화 리간드를 접합하기 위해 사용되고; 유형 Y 부위는 올리고뉴클레오티드를 접합하기 위해 사용되고, X 및 Y는 동일하거나 상이할 수 있고; A는 H, K, R, HH, HHH, HHHH, HHK, HHHK 또는 최대 약 5개의 아미노산을 함유하는 임의의 다른 엔도솜 방출 짧은 펩티드의 펩티드 서열이고; B는 H, K, R, HH, HHH, HHHH, HHK, HHHK, 또는 최대 약 5개의 아미노산, 임의의 다른 아미노산 또는 아미노산과 링커의 조합을 함유하는 임의의 다른 짧은 펩티드의 펩티드 서열이고; D는 올리고뉴클레오티드이고; RL은 리간드이고; RS는 올리고뉴클레오티드에 대한 링커이다.
Figure pct00001
D는 siRNA, mRNA 또는 앱타머일 수 있다.
이들 작제물에서, PDoV 펩티드 작제물은 KHHHCKH, HKHHHCKH, HHKHHHCKH, HHHKHHHKCHHHKHHH, HHHKHHCKHHH, HHHKHHCRHHH, HKHHCKH, HKHCH, HKHCKH, HKHC, HHHK(S)HHCKHHH 및 HHK(S)HHKCHH(S)HHH로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 함유하는 구조를 갖고, 여기서 RL은 시스테인 잔기의 측쇄에 결합되고, RS는 라이신 잔기의 측쇄에 결합되고, (S)는
Figure pct00002
이다.
다른 실시형태에서, PDoV 펩티드 작제물은 하기 구조를 갖고, 여기서 3개의 리간드는 펩티드 상에 개별적으로 접합되어 있다.
Figure pct00003
또는
Figure pct00004
리간드 모이어티 RL은 링커-1을 포함할 수 있고, 여기서 링커-1은 하기 구조 중 하나를 포함할 수 있다:
Figure pct00005
,여기서, n은 1, 2 또는 3이고, OCH2 단위를 갖는 1,5-트리아졸 환을 통해 브릿지(bridge)에 결합된다; 또는
Figure pct00006
,여기서, n은 1, 2 또는 3이고, CH2OCH2 단위를 갖는 1,5-트리아졸 환을 통해 브릿지에 결합된다; 또는
Figure pct00007
,여기서, n은 1, 2 또는 3이고, CH2OCH2 단위를 갖는 1,5-트리아졸 환을 통해 브릿지에 결합된다.
PDoV 펩티드에 부착된 리간드(들) 사이의 링커는 폴리에틸렌 글리콜 쇄 -(CH2CH2O)n─ 또는 -(CH2CH2)n─ 쇄를 포함하고, 여기서 n은 2 내지 15의 정수이다. 리간드 RL은 티오에테르, 아미드 또는 트리아졸 결합을 포함할 수 있는 링커를 통해 PDoV 펩티드에 결합될 수 있다.
다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 구조 Rs-링커2-올리고뉴클레오티드를 갖는 모이어티를 통해 결합되고, 여기서 링커 2는 지방족 쇄, 폴리에틸렌 글리콜 쇄, 소수성 지질 쇄 또는 친수성 쇄이다. 말단 부위의 그룹 2는 siRNA 말단과의 화학적 접합을 위한 반응성 부위이다.
링커 2는
Figure pct00008
이고,
그룹 2는
Figure pct00009
이다.
올리고뉴클레오티드는 10 내지 29개의 길이를 갖는 일본쇄(single-stranded) 올리고뉴클레오티드인 RNAi 분자일 수 있거나, 각각 10 내지 29개 염기 또는 19 내지 27개 염기의 길이를 갖는 2개의 상보적(complimentary) 일본쇄 올리고뉴클레오티드의 이중쇄(duplex)일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 적어도 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 siRNA 분자를 함유할 수 있고, 예를 들면, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로, 2'-O-메톡시에틸, 2'-O-알릴 또는 2'-H의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
다른 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는,
Figure pct00010
또는
Figure pct00011
인 적어도 하나의 화학적으로 변형된 결합을 함유하는 siRNA 분자를 함유할 수 있다.
다른 실시형태에서, siRNA 또는 올리고뉴클레오티드는 링커 3으로 위치 5' 또는 3'에서 추가로 화학적으로 변형되고, 여기서 링커 3은 링커 2와 공유 반응하여 리간드-PDoV 및 뉴클레오티드를 결합할 수 있는 상보적 접합 부위 그룹 3을 함유한다.
추가 실시형태에서, 작제물은 하기에 나타낸 바와 같은 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00012
이들 작제물 각각에서, 표적화 리간드는 N-아세틸-갈락토사민(GalNAc), 갈락토오스, 갈락토사민, N-포르말-갈락토소아민, N-프로피오닐-갈락토사민, N-부타노일갈락토사민 및 앱타머로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 다른 실시형태에서, 표적화 리간드는 사이클릭(c) RGD, APRPG, NGR, F3 펩티드, CGKRK, LyP-1, iRGD(CRGDRCPDC), iNGR, T7 펩티드(HAIYPRH), MMP2-절단가능한 옥타펩티드(GPLGIAGQ), CP15(VHLGYAT), FSH(FSH-β, 33-53 아미노산, YTRDLVKDPARPKIQKTCTF), LHRH(QHTSYkcLRP), 가스트린-방출 펩티드(GRP)(CGGNHWAVGHLM), RVG(YTWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG), FMDV20 펩티드 서열(NAVPNLRGDLQVLAQKVART) 및 GLP로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩티드이거나 엽산이다.
임의의 이들 작제물에서, 펩티드는 아미노산 서열 -HHK, -KHH, -HHH, -HHHK, -KHHH, -HHHHK, -KHHHH, -K(HHHK)n (n = 1-8), -K(HHHHK)n(HHHK)m (n = 1-4, m = 1-8), K(HHHHK)n(HHHK)m- (n = 1-4, m = 1-8)을 함유할 수 있고, 예를 들면, 작제물은 서열 -K(HHHHK)n(HHHK)m 또는 K(HHHHK)n(HHHK)m-을 갖는 펩티드(여기서, n은 1이고, m은 3이다)를 함유할 수 있다. 펩티드는 엔도솜 방출 펩티드일 수 있거나, 세포 투과 펩티드(cell penetrating peptide)일 수 있다.
또한, 화학식 (HnKm)oXpYq를 갖는 펩티드(여기서, H는 히스티딘이고, K는 라이신이고, X 및 Y는 아미노산 및 링커로부터 선택되는 기능성 단위(functional unit)이고, n은 1 내지 10이고, m은 1 내지 10이고, o는 1 내지 10이고, p는 1 내지 5이고, q는 1 내지 4이다)가 제공된다. 펩티드는 표적화 리간드를 부착하기 위한 적어도 2개의 접합 부위를 포함할 수 있다. 유리하게는, 접합 부위는 라이신 또는 시스테인이다. 펩티드는 올리고뉴클레오티드를 부착하기 위한 적어도 2개의 접합 부위를 함유할 수 있다. 작제물은 화학식 (HnKm)oXpYq의 펩티드, 및 적어도 하나의 접합 부위를 통해 펩티드에 결합된 적어도 하나의 표적화 리간드를 함유할 수 있다. 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 접합 부위를 통해 펩티드에 결합될 수 있다. 표적화 리간드는 사이클릭(c) RGD, APRPG, NGR, F3 펩티드, CGKRK, LyP-1, iRGD(CRGDRCPDC), iNGR, T7 펩티드(HAIYPRH), MMP2-절단가능한 옥타펩티드(GPLGIAGQ), CP15(VHLGYAT), FSH(FSH-β, 33-53 아미노산, YTRDLVKDPARPKIQKTCTF), LHRH(QHTSYkcLRP), 가스트린-방출 펩티드(GRP)(CGGNHWAVGHLM), RVG(YTWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG), FMDV20 펩티드 서열(NAVPNLRGDLQVLAQKVART) 및 GLP로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, miRNA, saRNA, shRNA, 앱타머, RNA자임, DNA자임, 유인 올리고뉴클레오티드 및 CpG 모티프로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
또한, 상기 청구범위에 기재된 작제물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물이 제공된다. 약제학적으로 허용되는 담체는 히스티딘-리신 풍부 폴리펩티드 HKP, HKP(H) 또는 리포펙타민을 함유할 수 있고/있거나, 물, 및 인산칼륨 1염기성 무수 NF, 염화나트륨 USP, 인산나트륨 2염기성 7수화물 USP, 글루코스 및 인산염 완충 생리식염수(PBS)로 이루어진 그룹 중 하나 이상을 함유할 수 있다.
또한, 세포를 상기 기재된 바와 같은 작제물 또는 약제학적 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 올리고뉴클레오티드를 세포에 전달하는 방법이 제공된다.
또한, 세포를 상기 기재된 바와 같은 작제물과 접촉시키는 것을 포함하는, 올리고뉴클레오티드를 간세포에 전달하는 방법이 제공된다.
이들 방법에서, 올리고뉴클레오티드는 siRNA 분자일 수 있고, 생체내에서 포유동물 세포 또는 간세포에 전달될 수 있다. 세포는 인간 세포일 수 있다.
또한, 포유동물이 임의로 인간인 경우, 포유동물에게 치료학적 유효량의 상기 기재된 바와 같은 작제물을 투여함으로써 포유동물에서 유전자 요법(gene therapy)의 방법이 제공된다.
또한, 포유동물에게 치료학적 유효량의 상기 기재된 바와 같은 작제물을 투여하는 것을 포함하는, 인간 등의 포유동물에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 암은 고형 종양(solid tumor)일 수 있다. 암은 간암, 결장암 또는 췌장암일 수 있다. 간암은 간세포 암종, 전이성 결장암 또는 전이성 췌장암일 수 있다. 작제물은 암 세포를 포함하는 종양에 직접 주사할 수 있다.
도 1은 [GalNAc] 펩티드 도킹 비히클(G-PDoV)의 설계를 카툰(cartoon)으로 나타낸 것이다. 3가 GalNAc는 하나의 도킹 부위 A에 공유 접합되었다. 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA는 다른 1개 또는 2개의 도킹 부위 B에 각각 접합되었다.
도 2는 [리간드] 펩티드 도킹 비히클의 대체 설계를 카툰으로 나타낸 것이다. 1가 GalNAc는 1 내지 4개의 도킹 부위 A에서 공유 접합되었다. 올리고뉴클레오티드 또는 siRNA는 각각 다른 1개 또는 2개의 도킹 부위 B에서 접합되었다.
도 3은 펩티드 도킹 비히클(PDoV)의 설계를 나타낸다: 이는 히스티딘(H), 라이신(K)의 복수의 반복 단위 및 기능성 단위 X 및 Y(아미노산 또는 기능적 링커)를 갖는 (HnKm)oXpYq 펩티드 골격(여기서, n = 1-10, m = 1-10, o = 1-10, p = 1-5, q = 1-5)을 갖는다. HK 반복 단위는 우수한 세포 투과 능력을 갖는 것으로 밝혀졌고, 엔도솜 방출을 촉진하기 위해, 라이신 또는 다양한 기능성 단위 X 또는 Y는 리간드 접합을 위한 도킹 부위로서 선택되고, Y는 상이한 공유 결합을 통한 올리고뉴클레오티드의 접합을 위한 도킹 부위로서 선택된다. 예를 들면, 부위 ①는 GalNAc 등의 리간드 또는 기타 표적화 리간드의 존재하에서만 반응할 수 있다. 부위 ③은 특정한 조건하에서만 올리고뉴클레오티드 및 siRNA와 접합할 수 있다.
도 4는 3개의 리간드 접합 부위 및 복수의 올리고뉴클레오티드 부위를 갖는 펩티드 도킹 비히클(PDoV))의 설계를 나타낸다: 이는 히스티딘(H), 라이신(K)의 복수의 반복 단위 및 기능성 단위 X 및 Y(아미노산, 또는 기능적 링커)를 갖는 (HnKm)oXpYq 펩티드 골격(여기서, n = 1-10, m = 1-10, o = 1-10, p = 1-5, q = 1-5)을 갖는다. HK 반복 단위는 우수한 세포 투과 능력을 갖고 엔도솜 방출을 촉진하는 것으로 입증되었다. 라이신 잔기 또는 다양한 기능적 단위 X는 리간드 접합을 위한 도킹 부위로서 선택되고, Y는 상이한 공유 결합을 통한 올리고뉴클레오티드 접합을 위한 도킹 부위(들)로서 선택된다. 예를 들면, 부위 ①은 GalNAc 등의 리간드 또는 기타 표적 리간드의 존재하에서만 반응할 수 있다. 부위 ③은 특정한 조건하에서만 올리고뉴클레오티드 및 siRNA와 접합할 수 있다.
도 5는 PDoV 작제물의 구조를 나타낸다. PDoV 작제물은 복수의 접합 부위 X 및 Y가 삽입된 세포 침투/엔도솜 방출 펩티드이다. 부위 X는 표적 리간드를 접합하기 위해 사용되고, 부위 Y는 복수의 올리고뉴클레오티드 또는 핵산을 접합하기 위해 사용된다. PDoV에 대한 일부 작제물 예에는 이하가 포함된다: A는 펩티드 서열 K, R, H, HH, HHH, HHHH, HHK, HHHK 또는 기타 짧은 펩티드를 나타내고; B는 펩티드 서열 K, R, H, HH, HHH, HHHH, HHK, HHHK 또는 기타 짧은 펩티드, 기타 아미노산 또는 조합을 나타내고; D는 올리고뉴클레오티드, siRNA, mRNA, 앱타머를 나타내고; RL은 리간드를 나타내고; RS는 올리고뉴클레오티드에 대한 링커를 나타낸다.
도 6은 1 또는 2개의 올리고뉴클레오티드 부위와 1개의 리간드 접합 부위를 포함하는 1세대 PDoV 구조의 예를 나타낸다.
도 7은 2개의 올리고뉴클레오티드 부위와 1개의 다가(multivalent) 리간드 접합 부위를 포함하는 2세대 PDoV 구조의 예를 나타낸다.
도 8은 2개의 올리고뉴클레오티드 부위와 1개의 다가 리간드 접합 부위를 포함하는 PDoV의 대체 구조의 예를 나타낸다. 리간드는 PDoV 골격에 1개씩 개별적으로 접합시킬 수 있다.
도 9A는 접합 부위에 대한 결합 선택을 나타낸다. 화학 그룹 Rs는 올리고뉴클레오티드를 PDoV 펩티드 비히클과 접합시키기 위한 "클릭" 유사 반응성 모이어티를 나타낸다. 반응성 모이어티는 아민, 하이드라진, N-하이드록시숙신이미드, 아지도, 알킨, 카복실산, 티올, 말레이미드, 또는 당해 기술분야에 공지된 기타 화학적 반응성 모이어티일 수 있다.
도 9B는 결합의 대표적 예를 나타낸다.
도 9C는 접합 Rs-링커2-siRNA의 링커 2가 펩티드와 접합 부위 사이의 화학적 스페이서이고, 접합 부위를 링커의 말단 부위에 부착시키는 방법을 나타낸다. 링커 2는 지방족 쇄 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄, 또는 기타 소수성 지질 또는 친수성 쇄일 수 있다. 말단 부위의 그룹 2는 siRNA 말단과의 화학적 접합을 위한 반응성 부위이다.
도 10은 리간드 접합 부위에 대한 결합 선택의 예를 나타낸다. 리간드 접합 RL에 대한 결합은 1가 GalNAc 분자, 2가 GalNAc 분자 및 3가 GalNAc 분자에 기초한 선택일 수 있다. 접합 부위는 말레이미드/티올이거나, 도 9에 도시된 그룹 2 목록으로부터 선택될 수 있다.
도 11은 siRNA-PDoV-리간드 화합물 1의 작제의 대표적 예를 나타낸다.
도 12는 siRNA-PDoV-리간드 화합물 2의 작제의 대표적 예를 나타낸다.
도 13은 siRNA-PDoV-리간드 화합물 3의 작제의 대표적 예를 나타낸다.
도 14는 일부 가능한 siRNA 서열 및 구조 변형의 목록을 나타낸다.
도 15A는 mTTR1-PDoV3-GalNAc3의 접합체에 대한 시험관내 연속 희석 데이터를 나타낸다. 도 15B는 mTTR1-PDoV2-GalNAc3 접합체에 대한 시험관내 연속 희석 데이터를 나타낸다. 도 15C는 mTTR2-GalNAc3 양성 대조군 접합체에 대한 연속 희석 데이터를 나타낸다. 도 15D는 Aha1-GalNAc3 양성 대조군 접합체에 대한 시험관내 연속 희석 데이터를 나타낸다.
정의:
본 명세서에 사용된 바와 같이, "올리고뉴클레오티드"는 100개 뉴클레오티드 미만(예를 들면, 50개 미만, 30개 미만, 또는 25개 미만의 뉴클레오티드)의 길이를 갖는 화학적으로 변형된 또는 비변형된 핵산 분자(RNA 또는 DNA)를 지칭한다. 이는 siRNA, 마이크로RNA, 항 마이크로RNA, 마이크로RNA 모방체, dsRNA, ssRNA, 앱타머, 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드, 앱타머일 수 있다. 일 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 RNAi제이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "siRNA 분자" 또는 "RNAi 분자"는, 분자가 세포 내로 도입된 후, 세포에서 유전자의 발현을 방해하는 짧은 이본쇄 폴리뉴클레오티드인 이본쇄 올리고뉴클레오티드이다. 예를 들면, siRNA 분자는 일본쇄 표적 RNA 분자의 상보적 뉴클레오티드 서열을 표적화하고 결합한다. 관례에 따르면, siRNA 분자가 특정 뉴클레오티드 서열에 의해 식별되는 경우, 그 서열은 이중쇄 분자의 센스 쇄를 지칭한다. 분자를 구성하는 하나 이상의 리보뉴클레오티드는 당해 기술분야에 공지된 기술에 의해 화학적으로 변형시킬 수 있다. 이의 개별 뉴클레오티드의 하나 이상의 수준에서 변형되는 것에 추가하여, 올리고뉴클레오티드의 골격을 변형시킬 수 있다. 추가 변형에는 siRNA 분자에 접합시키기 위한 소분자(예: 당 분자), 아미노산, 펩티드, 콜레스테롤 및 기타 큰 분자의 사용이 포함된다.
"펩티드 도킹 비히클"(PDoV)은, 하나 이상의 표적화 리간드 및 하나 이상의 올리고뉴클레오티드와의 접합을 가능하게 하는 복수의 접합 부위를 함유하는, 정의된 서열의 합성 펩티드를 지칭한다. 이는 소수성 쇄 또는 pH 민감성 잔기 등의 관능기를 함유하고, 이는 접합된 PDoV를 세포로 전달한 후, 세포의 엔도솜 내부에 포획된 올리고뉴클레오티드 페이로드의 방출을 촉진한다.
증강된 치료 이점을 갖는 간섭 RNA 분자를 사용하는 조성물 및 방법이 제공된다. 조성물 및 방법은 표적화 리간드를 화합물에 결합시킴으로써 대상체에게 siRNA 분자 등의 치료 화합물의 표적화된 세포/조직 전달을 가능하게 한다. 대상체는 동물 또는 인간일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적화 리간드는 직교 생체접합 방법을 통해 엔도솜 방출 펩티드에 접합시킬 수 있다. 표적화 리간드는 특히 간 등의 선택된 표적에 대한 RNAi 분자의 전달을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 표적화 리간드(들)는 다른 조직, 예를 들면, 피부 및 뇌에 대한 RNAi 분자의 표적화된 전달을 가능하게 한다.
본 명세서에 기재된 표적화 리간드는 하나 이상의 표적화 모이어티 및 하나 이상의 링커를 포함할 수 있다. 링커는 클릭 화학, 티올/말레이미드 화학 또는 기타 생체직교 화학을 통해 siRNA 및 표적 리간드와 공유 결합한다. 링커는 유리하게는 친수성이고, 예를 들면, 충분히 안정하고, 하나 이상의 표적화 모이어티(들) 사이의 잠재적 상호작용을 제한하는 수용성의 가요성 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다. PEG는 임상 시험으로부터 치료 목적으로 안전하고 호환성이 있는 것으로 검증되었다. 일부 실시형태에서, 링커는 정의된 분자량의 폴리(L-락티드)n(여기서, n = 5-20)일 수 있고, 여기서 에스테르 결합은 효소적으로 또는 가수분해적으로 불안정하다.
표적화 리간드는 하나 이상의 표적화 모이어티, 링커 반응성 결합 모이어티를 갖는 하나 이상의 그룹을 포함할 수 있다. 이들은 클릭 화학, 티올/말레이미드 화학 또는 기타 생체직교 화학을 통해 siRNA 및 표적화 리간드와 공유 접합된다. 링커 반응성 결합 모이어티는 티올-말레이미드 결합, 알킨과 아지드의 반응에 의해 형성된 트리아졸 결합, 및 아민-NHS 에스테르 결합으로부터 형성된 아미드일 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 이들 결합 각각은 표적 리간드와 치료 화합물 모두를 공유 결합시키는 데 적합하다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 표적화 리간드는 하나 이상의 표적화 모이어티, 반응성 결합 모이어티를 갖는 하나 이상의 링커를 포함한다. 링커는 티올 모이어티, 또는 말레이미드 모이어티, 카복실산 또는 아민, 아지도 그룹, 알킨 그룹 등을 함유한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 표적화 특이적 RNA 화합물은 RNA의 3' 또는 5' 말단을 통해 엔도솜 방출 도킹 펩티드에 직접 접합시킬 수 있다. 표적화 리간드(예: N-아세틸-갈락토사민)도 호환성이 있는 방법으로 동일한 도킹 펩티드와 접합된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 표적화 특이적 RNA 화합물은 또한, 예를 들면, RNA의 3' 또는 5' 말단을 통해 표적화 리간드(예를 들면, N-아세틸-갈락토사민)에 직접 접합시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA는 3'-OMe, 3'-F 또는 3'-MOE 등의 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA는 RNAi제, 예를 들면, 이본쇄 RNAi제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 표적화 리간드는 이본쇄 RNAi제의 센스 쇄의 5' 또는 3' 말단 또는 이본쇄 RNAi제의 안티센스 쇄의 5' 또는 3' 말단에 결합된다. 또는, 표적화 리간드는 이본쇄 RNAi제의 센스 및 안티센스 쇄의 3'/3", 3'/5' 또는 5'/5' 말단 둘 모두에 결합될 수 있다.
표적화 리간드는, 예를 들면, 이본쇄 RNAi제의 센스 쇄의 3' 또는 5' 말단에서 포스페이트, 포스포로티오에이트 또는 포스포네이트 그룹을 통해 RNAi 분자에 공유 결합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 표적화 특이적 RNA 화합물은 TGF β1 또는 ApoB100, mRNA 발현-억제 특이적 화합물이다.
PDoV는 무독성 방식으로 거대분자 카고의 세포 세포질로의 탈출을 증강시킨다. 이것은, 예를 들면, RNAi 치료제의 효과적 전달을 가능하게 한다. 무독성 방식으로 siRNA 분자 등의 거대분자 카고의 세포질 내로의 탈출을 증강시키는, 엔도솜 탈출 펩티드(PDoV)가 제공된다. PDoV 플랫폼의 다양한 예가 도 1 내지 4에 도시되어 있다. PDoV에서, 엔도솜 탈출 펩티드는 또한 RNA의 도킹 부위 링커와 표적화 리간드로서 둘 다 기능한다. 복수의 RNA 분자를 동일한 작제물과 접합시켜, 상이한 표적 mRNA에 대한 siRNA 분자의 공전달을 달성할 수 있고, 이에 의해 복수의 질환 관련 유전자를 침묵시키기 위한 상승적 이점을 제공할 수 있다. 히스티딘 및 라이신 풍부 폴리펩티드 또는 선형 히스티딘 및 라이신 풍부 펩티드는 RNA 전달에서 효과적 세포 투과성 및 엔도솜 방출제인 것으로 밝혀졌다. 펩티드는 히스티딘 풍부 도메인을 포함하고, 여기서 히스티딘 잔기의 이미다졸 환은 낮은 pH 값(pH < ~6)에서 양성자화되고, 엔도솜 내부에서 양성자 스펀지로서 작용하고, 이는 엔도솜 지질 이중층의 용해 및 RNA의 방출을 유도한다. PDoV의 접합 부위는 하기에 상세하게 설명되어 있다.
하기 몇몇 섹션에서, RNAi제, 표적화 리간드, RNAi와 펩티드 사이의 링커, 리간드와 펩티드 사이의 링커, 엔도솜 방출 도킹 펩티드를 포함한 각 구성요소에 대해 상세히 설명한다.
RNAi제
RNAi 분자는 이본쇄 화합물이다. 예를 들면, 이본쇄 siRNA는 항-TGFβ1 또는 항-ApoB100일 수 있고, 예를 들면, 2'-OCH3, 2'-F 또는 2'-O-MOE로 2' 위치에서, 또는 -P(O)2=S로 5' 위치에서 변형되지 않거나 화학적으로 변형될 수 있다. 다른 화학적 변형은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, RNAi의 전체적 안정성 및 생체이용률을 개선하기 위한 페길화(pegylation) 또는 지질 기능화를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 이본쇄 siRNA는 도 14의 이중쇄 중 임의의 하나 이상의 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17 또는 16개의 인접 염기쌍으로 이루어진 이중쇄로부터 유래할 수 있다.
표적화 리간드
표적화 리간드 모이어티는, 예를 들면, N-아세틸-갈락토사민(GalNAc), 갈락토오스, 갈락토사민, N-포르말-갈락토사민, N-프로피오닐-갈락토사민, N-부타노일갈락토사민, cRGD, GLP 펩티드 또는 기타 소분자일 수 있다. 표적화 리간드는 공유 결합에 의해 펩티드에 공유 결합된다. 리간드의 수는 1, 2 또는 3일 수 있다. 본 명세서에 개시된 표적화 리간드는 하기와 같이 표시되는 구조를 갖는다:
Figure pct00013
RNAi와 펩티드 사이의 링커
리간드 접합 Rs에 대한 결합: 화학 그룹 Rs는 올리고뉴클레오티드를 PDoV 펩티드 비히클과 접합시키기 위해 사용되는 다양한 "클릭" 유사 반응성 모이어티의 하나일 수 있다. Rs는 아민, 하이드라진, N-하이드록시숙신이미드, 아지도, 알킨, 카복실산, 티올 또는 말레이미드, 또는 당해 기술분야에 공지된 기타 화학적 반응성 모이어티일 수 있다. 대표적 예는 도 9에 도시되어 있다.
접합 Rs-링커2-siRNA의 링커 2는 펩티드와 접합 부위 사이에 위치하는 화학 스페이서이고, 이는 접합 부위를 링커의 말단 부위에 부착시킬 수 있다. 링커 2는 지방족 쇄 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄, 또는 기타 소수성 지질 또는 친수성 쇄일 수 있다. 말단 부위의 그룹 2는 siRNA 말단과의 화학적 접합을 위한 반응성 부위이다.
리간드와 펩티드 사이의 링커
본 명세서에 개시된 표적화 리간드 및 RNAi 모이어티는 siRNA(센스 쇄의 3' 또는 5' 말단)를 직접 결합하는 링커-1, 및 센스 쇄의 3' 또는 5' 말단에 의해 RNAi에 연결되는 링커3-리간드를 포함하는 브릿지를 함유한다. 링커-1의 간격은 선형 폴리에틸렌 글리콜(여기서, 에틸렌 글리콜 단위의 수 n은 1 내지 50이다), 또는 폴리(L-락티드)(여기서, 에틸 에스테르의 반복 단위 수 n은 11 내지 50이거나, 평균 분자량은 100 내지 3500이다)로부터 선택된 구조이다. 접합 부위는 말레이미드/티올이거나, 도 10의 그룹 2 목록으로부터 선택될 수 있다.
엔도솜 방출 도킹 펩티드
펩티드 도킹 비히클(PDoV)은 유리하게는 복수의 올리고뉴클레오티드 부위와 함께 하나의 리간드 접합 부위를 갖는다. PDoV는 히스티딘(H) 및 라이신(K)의 복수의 반복 단위 및 기능성 단위 X 및 Y를 갖는 일반 구조: (HnKm)oXpYq을 갖는 펩티드 골격(여기서, X 또는 Y는 아미노산, 또는 링커 1 및 도 10에 도시된 관능기로부터 선택된 아미노산 유도체이고, n = 1-10, m = 1-10, o = 1-10, p = 1-5 및 q = 1-5이다)을 갖는다. PDoV의 문맥에서 Y는 아미노산 티로신을 지칭하지 않고, 기능적 아미노산 또는 링커를 정의하는 것에 주의한다. HK 반복 단위는 엔도솜 방출을 촉진하는 것으로 입증되었다. 라이신 잔기 또는 기능성 단위(들) X는 리간드의 접합을 위한 도킹 부위로서 사용될 수 있고, Y는 상이한 공유 결합을 통해 올리고뉴클레오티드의 접합을 위한 도킹 부위를 제공한다. 도 3은 PDoV가 접합될 수 있는 방법의 개략도를 나타낸다. 예를 들면, 부위 ①은 GalNAc 등의 리간드 또는 기타 표적 리간드의 존재하에서만 반응할 수 있다. 부위 ③은 도 10에 예시된 바와 같이 선택된 조건하에 올리고뉴클레오티드 및 siRNA와만 접합할 수 있다.
또는, PDoV는 3개의 리간드 접합 부위와 복수의 올리고뉴클레오티드 부위를 가질 수 있다(도 4 참조): (HnKm)oXpYq 펩티드 골격은 히스티딘(H) 및 라이신(K)의 복수-반복 단위 및 기능성 단위 X 및 Y(아미노산 또는 기능적 링커)를 갖고, 여기서 n = 1-10, m = 1-10, o = 1-10, p = 1-5, q = 1-5이다. HK 반복 단위는 우수한 세포 투과 능력을 갖고, 엔도솜 방출을 촉진하는 것으로 입증되었다. 라이신 또는 다양한 기능성 단위 X는 리간드의 접합을 위한 도킹 부위로서 선택되고, Y는 상이한 공유 결합을 통한 올리고뉴클레오티드 접합을 위한 도킹 부위로서 선택된다. 예를 들면, 부위 ①은 GalNAc 등의 리간드 또는 기타 표적 리간드의 존재하에서만 반응할 수 있다. 부위 ③은 특정한 조건하에서만 올리고뉴클레오티드 및 siRNA와 결합할 수 있다. 도 4를 참조한다.
구조 설계에서, PDoV 작제물은 복수의 접합 부위 X 및 Y가 삽입된 엔도솜 방출 펩티드이다. 부위 X는 표적 리간드를 접합하기 위해 사용되고, 부위 Y는 복수의 올리고뉴클레오티드 또는 핵산을 접합하기 위해 사용된다. PDoV에 대한 작제물의 일부 예는 도 5에 도시되어 있고, 여기서 A는 펩티드 서열 K, R, H, HH, HHH, HHHH, HHK, HHHK 또는 기타 짧은 펩티드를 나타내고; B는 펩티드 서열 K, R, H, HH, HHH, HHHH, HHK, HHHK, 또는 기타 짧은 펩티드 또는 기타 아미노산 또는 조합을 나타내고; D는 올리고뉴클레오티드, siRNA, mRNA 또는 앱타머를 나타내고; RL은 리간드를 나타내고; RS는 올리고뉴클레오티드에 대한 링커를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 펩티드는 5 내지 15개의 아미노산을 함유한다.
일부 실시형태에서, PDoV는 도 6에 도시된 구조를 갖는다.
실시예 :
실시예 1.
siRNA-PDoV-리간드 화합물의 작제의 개략적 대표 예. 1 또는 2개의 siRNA 분자를 PDoV 펩티드와 접합시킬 수 있다.
단계 1. 펩티드 아지도(azido) 변형:
Figure pct00014
단계 2. 표적화 리간드와 펩티드의 접합
Figure pct00015
단계 3 및 단계 4. 아지도-PDoV-GalNAc3과 올리고뉴클레오티드 접합
Figure pct00016
Figure pct00017
실시예 2.
siRNA-PDoV-리간드 화합물의 작제의 개략적 대표 예.
단계 1. 펩티드 아지도 변형.
Figure pct00018
단계 2. 표적화 리간드와 펩티드의 접합.
Figure pct00019
단계 3 및 단계 4. 아지도-PDoV-GalNAc3와 올리고뉴클레오티드 접합
Figure pct00020
Figure pct00021
실시예 3.
아지도 - PDoV1(1)의 합성 및 특성화:
펩티드 아지도 - PDoV1(서열 HHH{LYS(PEG4-N3)}HHCKHHH)은 자동화된 펩티드 합성기에 의해 계약된 서비스에 의해 및 서열 내의 표준 아미노산 및 라이신-PEG4-N3 변형제를 사용하여 합성되었다. 펩티드를 C-18 역상 HPLC에 의해 정제하고, 질량 분석 및 1H NMR에 의해 특성화했다. 분석 데이터는 모두 예상된 구조와 일치했다.
실시예 4.
PDoV2 및 아지도 - PDoV2의 합성:
PDoV2(2)의 합성, 서열 HHHKHHCRHHH. 펩티드 PDoV2(HHHKHHCRHHH)는 자동화된 펩티드 합성기에 의해 계약된 서비스에 의해 및 서열 내의 표준 아미노산을 사용하여 합성되었다. 펩티드를 C-18 역상 HPLC에 의해 정제하고, 질량 분석법에 의해 특성화했다. 분석 데이터는 모두 예상된 구조와 일치했다.
아지도 - PDoV2(3)의 합성 :
Figure pct00022
아지드 링커는 아지드 링커의 에스테르 활성화된 카복실산과 PDoV2(2)의 라이신 측쇄의 1급 아민 사이의 아미드 결합 형성을 통해 펩티드 도킹 비히클 2(PDoV2)에 부착시켜 화합물 3을 형성했다. PDoV2 펩티드 HHHKHHCRHHH(42mg, 0.0280mmol)을 1.0mL DMF에 현탁시켰다. 트리에틸 아민(39uL, 10당량)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반했다. 20uL의 DMF 중의 아지도-Peg4-NHS 에스테르(54mg, 0.140mmol, 5당량)의 용액을 반응 혼합물에 첨가했다. 반응 혼합물은 30분에 걸쳐 서서히 투명한 용액으로 변했고, 추가로 실온에서 16시간 동안 교반했다. 반응 혼합물의 TLC 프로필은 PDoV2의 완전한 전체 전환의 HPLC 프로필에 의해 모니터링했다(도 1).
반응 혼합물을 물(200μL)로 ??칭하고, 회전식 증발기를 사용하여 농축하고, 조 물질을 10-90%의 완충액 B(아세토니트릴 중의 0.1% TFA)의 점증 구배를 사용하여 세미-프렙 RP-C18 컬럼 상에서 HPCL에 의해 정제했다. 아지도-PDoV2(2)는 10.5분 내지 11.5분 사이의 체류 시간으로 주요 생성물로서 분리되었다. 샘플 분획을 동결건조하여, 화합물 2의 투명한 잔류 오일(44mg, 88% 수율)을 수득했다. 이의 양성자 및 MS 분석은 다음과 같다: 1H NMR(400MHz, D2O, 도 2) δ 8.74(brd d, 8H) 및 δ 7.35(brd d, 8H)는 δ 6.00ppm 초과의 펩티드에서 8개의 히스티딘 테트라졸과 관련된 방향족 수소와 일치한다. δ 4.75-4.30(brd t, 11H)에서 모든 11개 아미노산의 알파 탄소의 메틴 수소, δ 3.90-3.75(m, 100H)에서 폴리에틸렌 그룹과 관련된 에틸렌 수소; 라이신, 아르기닌 및 시스테인의 측쇄 양성자와 관련된 δ 3.6-2.75(m, 53H) 및 δ 1.8-1.3(m, 12H) 에틸렌 수소. 합계하여, 104개의 수소가 비방향족 영역에서 관찰되고, 41개의 수소가 과량으로 존재한다. 이러한 여분의 수소는 2개의 아지도-peg4 그룹에 상당한다. NMR 데이터는 ESI-MS 데이터와 일치한다: 예상된 m/z 1775.9 Da 및 관찰된 m/z 2323.5 Da(도 3). 관찰된 질량 대 전하 비율은 예상치보다 547.6Da 단위 더 많다. 여분의 질량 단위는 2개의 아지드-링커의 질량과 일치한다.
실시예 5.
아지도 - PDoV3 펩티드(4)의 합성 및 특성화.
펩티드 아지도 - PDoV3({LYS(PEG4-N3)}HHHCHH)는 표준 아미노산과 라이신-PEG4-N3 변형제를 서열에 사용하여 고체상 자동화 합성을 사용하여 합성했다. 펩티드를 C-18 역상 HPLC에 의해 정제하고, H1 NMR 및 질량 분석법으로 특성화했다. 분석 데이터는 모두 예상된 구조와 일치했다.
실시예 6.
PDoV1 - GalNAc3(5)의 합성 및 특성화.
Figure pct00023
반응 1: PDoV1 - GalNAc3(5)의 합성.
건조 DMF(400uL) 중의 PEG6 - GalNAc3 (9)(3.0mg, 1.56μmol)을 인산염 완충액(1mL, pH=7.4) 중의 N3- PDoV1 2(3.54mg, 2.03μmol)의 용액에 첨가했다. 수득된 혼합물을 질소하에 25℃에서 밤새 교반했다. 감압하에 용매를 제거한 후, 샘플을 탈염하고, PD-10 컬럼으로 정제하여 순수한 생성물 PDoV1 - GalNAc3 5(5.1mg, 백색 고체, 수율 90%)를 수득했다. 생성물을 역상 C18 컬럼, 용매 0.1% TFA 물 및 0.1% 아세토니트릴에 의한 구배 용출을 사용하는 HPLC에 의해 분석했다. 체류 시간 Rt=4.877분, 순도 > 90%. 질량 스펙트럼 분석(ESI, 양성): C154H240N48O55S에 대한 계산치 3673.7 실측치 3674.8.
실시예 7.
PDoV2 - GalNAc3 6 및 7의 합성 및 특성화.
Figure pct00024
반응 2: PDoV2-링커-GalNAc3의 제조.
PDoV2 - Peg6 - GalNAc3(화합물 6)의 제조 : 친핵체, 화합물 2(49.8mg, 0.0243mmol)를 pH 7.4에서 1.0mL의 탈기된 PBS 완충액에 용해시켰다. 3가 GalNAc-리간드(9)(30.8mg, 0.0160mmol)를 용해시키고, 400uL의 건조 DMF에 전달했다. 반응 혼합물을 다시 건조 아르곤하에 탈기시키고, 실온에서 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 물(100μL)로 켄칭하고, 글렌 리써치(Glen Research) 권장 프로토콜에 따라 1.0μmol 세파덱스 나프(Sephadex Nap) 컬럼을 통해 탈염했다. 용출액을 동결건조하고, 조 물질을 10-90%의 완충액 B(아세토니트릴 및 물 중의 0.1% TFA)의 구배를 증가시키면서 세미-프렙 C18 역상 컬럼을 통해 HPLC에서 용출시켰다(도 7). 생성물의 체류 시간은 4.0분이고, 오일로 분리되었다(39mg, 60% 수율). 변형된 올리고의 질량 분석은 PDoV2-peg6-GalNAc3 작제물의 합성이 성공적인 것을 확인했다.
PDoV2 - Peg12 - GalNAc3(화합물 7)의 제조 : 화합물 7 아지도-PDoV2(4.9mg, 2.74 μmol)를 pH 7.4에서 탈기된 PBS 완충액 1.0mL에 용해시켰다. GalNAc-리간드(3.0mg, 1.37μmol)를 용해시키고, 400uL의 건조 DMF에 전달했다. 반응 혼합물을 다시 건조 질소하에 탈기시키고, 실온에서 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 물(100 μL)로 ??칭하고, 글렌 리써치 권장 프로토콜에 따라 1.0umol 세파덱스 나프 컬럼을 통해 탈염했다. 용출액을 동결건조하고, 조 물질은 10-90%의 완충액 B(아세토니트릴 및 물 중 0.1% TFA)의 구배를 증가시키면서 세미-프렙 C18 역상 컬럼을 통해 HPLC에서 용출시켰다(도 4). 이 생성물은, 체류 시간이 4.2분인 주요 생성물로만 형성되었고, 백색 분말로 분리되었다(4.4mg, 81% 수율). 양성자 NMR 및 MS 분석: H NMR(400MHz, D2O) δ 7.94(s, 3H, 트리아졸), δ 8.57-δ 7.19(m, 18H, 8 히스티딘 방향족), δ 4.75-4.30(m, 14H, 아미노산), δ 4.5(d, 3H, 갈락토스), δ 2.05(s, 9H). NMR 데이터는 ESI-MS 데이터와 일치한다. ESI-MS(양성 모드, m/z) C168H268N50O61S에 대한 계산치 3968.2, 관측치 3968.2.
실시예 8.
PDoV3 - GalNAc3(8)의 합성.
Figure pct00025
반응 3: PDoV3 - GalNAc3(8)의 합성.
PDoV3 - GalNAc3(화합물 8)의 합성 : DMF(1.5 mL) 중의 아지도 - PDoV3 화합물 4(47.0mg, 38.9μmol)를 인산염 완충액(4mL, pH 7.4) 중의 3가 GalNAc(9)(50.0mg, 25.9μmol)의 혼합물에 질소하에 25℃에서 첨가했다. 수득된 반응 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반했다. GalNAc 9가 완전히 소비될 때까지 반응을 HPLC로 모니터링했다. 용매를 동결건조에 의해 제거하고, 조 물질을 겔 투과 컬럼 크로마토그래피 PD-10 컬럼에 의해 정제하여 순수한 생성물 PDoV3 - GalNAc3 화합물 8(70mg, 수율 86.4%)을 수득했다. HPLC는 물 중 용매 0.1% TFA 및 아세토니트릴 중 0.1% TFA의 구배 용출에 의해 역상 C-18 컬럼에서 수행되었다. Rt = 5.038분. MS(ESI, 양성 모드). 화학식 C130H207N37O51S에 대한 정확한 질량: 3134.45. 관측치: 3136.35. 분석 데이터는 모두 예상된 구조와 일치했다.
실시예 9.
대조군3 - GalNAc3(11)의 합성.
Figure pct00026
반응 4: 대조군3-GalNAc3(11)의 합성.
PDoV3 - 대조군3 - GalNAc3의 제조:
화합물 아지도-대조군3 펩티드 11(서열{LYS(PEG4-N3)}SSSCSS)(2.6mg, 2.59μmol)을 pH 7.4에서 탈기된 PBS 완충액 1.0mL에 용해시켰다. GalNAc-리간드(5.0mg, 2.59μmol)를 용해시키고, 500uL의 건조 DMF에 전달했다. 반응 혼합물을 다시 건조 아르곤하에 탈기시키고, 실온에서 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 물(100μL)로 ??칭하고, 1.0μmol 세파덱스 나프(Sephadex Nap) 컬럼을 통해 탈염했다. 몇몇 용출액 분획을 수집하고, 동결건조하여 목적하는 화합물 대조군3-GalNAc3 10을 수득했다. 이 화합물을 10-90%의 완충액 B(아세토니트릴 및 물 중의 0.1% TFA)의 구배를 증가시키면서 분석용 HPLC C18 RP 컬럼을 사용하여 분석했다. 생성물의 체류 시간은 3.80분이었고, 투명한 오일로서 분리되었다(4.9mg, 67% 수율). 변형된 올리고뉴클레오티드의 질량 스펙트럼은 PDoV3-대조군3-peg6-GalNAc 작제물의 구조를 확인했다.
실시예 10.
ApoB100 - PDoV1 - GalNAc3(12)의 합성 및 특성화.
Figure pct00027
반응 5. ApoB100 - PDoV1 - GalNAc3(12)의 합성.
DMF(95μL) 중의 PDoV1-GalNAc3 5(381μg, 0.104μmol)를 RNAse 유리수(250μL) 중의 ApoB100-센스-5'-DBCO(500ug, 0.069μmol)의 용액에 첨가했다. 수득된 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반했다. 감압하에 용매를 제거한 후, 조 물질을 글렌 겔(Glen Gel) PaK 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 순수한 생성물 센스 ApoB100-PDoV3-GalNAc3 화합물 12(0.66mg, 수율 88%)를 수득했다. HPLC는 pH=11, Rt=13.015분, 순도 >85%에서 인산염 완충액을 사용하여 PA200 이온 교환 컬럼에서 수행되었다. MS(ESI, 양성 모드) 화학식 C388H510N125O208P22S에 대한 계산치 10911.66. 실측치: 10929.3 [M+H2O]. ApoB100 안티센스 쇄로 1:1 어닐링(5분 동안 95℃, 실온까지 약 1℃/분으로 냉각, 이어서 -20℃에서 보관)을 수행한 후, 최종 접합체 이중쇄 ApoB100-PDoV1-GalNAc3(12)을 수득했다. 염료 Alex-647 표지된 ApoB100-PDoV1-GalNAc3은 ApoB100 안티센스를 염료 표지된 안티센스 ApoB100-Alexa647(5'-uuuGfTaaucgucgauAfcccugcucg-Alexia647-3')로 치환함으로써 제조했다. 생성물은 HPLC 및 MS에 의해 특성화했다. 분석 데이터는 모두 예상된 구조와 일치했다.
실시예 11.
ApoB100 - PDoV2 - GalNAc3의 합성 및 특성화.
Figure pct00028
ApoB100-PDoV2-GalNAc3 13은 PDoV2-GalNAc(6 또는 7, 0.0341μmol, 1.5당량) 및 APOB100-SS-5'C6NHS(DBCO)(0.0227μmol)을 반응시킴으로써 ApoB100-PDoV1-GalNAc3 12와 유사한 방법으로 제조했다. 아지도-PDoV2-GalNAc를 먼저 DMSO 150μL당 아지드 1mg의 비율로 DMSO에 용해시켰다. 이어서, 수득된 아지드 용액을 100μL의 RNAse 유리수 중의 10 OD의 5'-DBCO 표지된 올리고에 첨가했다. 이어서, 반응 용액 혼합물을 실온에서 3 내지 4시간 동안 인큐베이팅했다. 이어서, 접합된 올리고를 글렌 겔(Glen Gel)-PakTm 탈염 컬럼에서 탈염하여 유기 용매 및 임의의 비접합된 펩티드를 제거했다. 예를 들면, PDoV2-PEG12-GalNAc 7이 반응물인 경우, 최종 ApoB100-PDoV2-GalNAc3 14가 77% 수율로 백색 고체로서 제공되었다. HPLC는 pH=11, Rt=12.077분, 순도 >85%에서 인산염 완충액을 사용하여 PA200 이온 교환 컬럼에서 수행했다. MS(ESI, 양성 모드) 계산치: 11551.4, 관찰치: 11553.5. 안티센스를 사용하여 1:1 어닐링(5분 동안 95℃, 실온까지 약 1℃/분으로 냉각, 이어서 -20℃에서 보관)하여 최종 접합체 이중쇄 ApoB100-PDoV2-GalNAc3(14)를 수득했다.
염료 Alexa -647 표지된 ApoB100 - PDoV1 - GalNAc3은 ApoB100 안티센스를 염료 표지된 안티센스 ApoB100-Alexa647(5'-uuuGfTaaucgucgauAfcccugcucg-Alexia647-3')로 치환함으로써 제조했다. 생성물을 HPLC 및 MS에 의해 특성화했다. 분석 데이터는 모두 예상된 구조와 일치했다.
실시예 12.
ApoB100 - PDoV3 - GalNAc3 15의 합성 및 특성화.
Figure pct00029
PDoV3 - GalNAc3 8(150μg, 0.148μmol)을 RNAse 유리수(200μL) 중의 5'-DBCO-C6HN-APOB100 센스 쇄(230.7μg, 0.0319μmol)의 용액에 첨가했다. 혼합물을 25℃에서 3시간 동안 교반했다. 동결건조에 의해 용매를 제거한 후, 조 물질을 글렌 겔 팩(Glen Gel Pak) 컬럼에 의해 정제하여 순수한 생성물 센스 ApoB100 - PDoV3 -GalNAc3 화합물 15(298㎍, 수율 90%)를 수득했다. HPLC는 pH=11, Rt=12.002분, 순도 >89%에서 인산염 완충액을 사용하여 PA200 이온 교환 컬럼에서 수행했다. 안티센스를 사용한 1:1 어닐링(5분 동안 95℃, 실온까지 약 1℃/분으로 냉각, 이어서 -20℃에서 보관)은 최종 접합체 이중쇄 ApoB100 - PDoV3 - GalNAc3를 제공했다. 염료 Alexa-647 표지된 ApoB100 - PDoV1 - GalNAc3은 ApoB100 안티센스를 염료 표지된 안티센스 ApoB100-Alexa647(5'-uuuGfTaaucgucgauAfcccugcucg-Alexia647-3')으로 치환함으로써 제조했다. 생성물은 HPLC 및 MS에 의해 특성화했다. 분석 데이터는 모두 예상된 구조와 일치했다.
실시예 13.
mTTR1 - PDoV2 - GalNAc3(16)의 합성 및 특성화:
Figure pct00030
mTTR1 - PDoV2 - GalNAc3는 DMSO/물 용매 중의 PDoV2-peg6-GalNAc 6(0.547mg, 0.1374μmol) 및 DBCO-표지된 mTTR1 센스 쇄(0.5mg, 0.0687μmol)를 사용하여 mTTR1-PDoV3-GalNAc3의 합성과 유사한 절차에 따라 제조되었다. 조 물질을 겔 투과 컬럼 크로마토그래피 G25 컬럼에 의해 정제하여 순수한 생성물을 수득했다. 수율은 약 78%였다. 안티센스 쇄를 사용한 1:1 어닐링(5분 동안 95℃, 실온까지 약 1℃/분으로 냉각, 이어서 -20℃에서 보관) 후, 최종 접합체 이중쇄 mTTR1 - PDoV2 - GalNAc3(16)을 수득했다.
실시예 14.
mTTR1 - PDoV3 - GalNAc3 17의 합성 및 특성화:
Figure pct00031
DMSO(99.6μL) 중의 PDoV3 - GalNAc3 8(996μg, 0.317μmol)을 RNAse 유리수(100μL) 중의 mTTR1 -센스-5'- DBCO(1.54mg, 0.212μmol)의 용액에 첨가했다. 생성된 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 감압하에 용매를 제거한 후, 조 물질을 겔 투과 컬럼 크로마토그래프 PD-10 컬럼에 의해 정제하여 순수한 생성물 센스 mTTR1 - PDoV3 - GalNAc3 화합물 17(mg, 수율 85%)을 수득했다. HPLC는 pH=11, Rt= 14.744분, 순도 >85%에서 인산염 완충액을 사용하여 PA200 이온 교환 컬럼에서 수행했다. 안티센스 쇄를 사용한 1:1 어닐링(5분 동안 95℃, 실온까지 약 1℃/분으로 냉각, 이어서 -20℃에서 보관)하여 최종 접합체 이중쇄 mTTR1 - PDoV3 - GalNAc3을 수득했다.
실시예 15.
APOB100 - PDoVn - GalNAc3 접합체의 시험관내 연구:
Alexa 647 표지된 siRNA-GalNAc 접합체(ApoB100 - PDoV1 - GalNAc3 - Alexa647 , ApoB100-PDoV2-GalNAc3-Alexa647, ApoB100 - PDoV2 - GalNAc3 - Alexa647)을 시험관내 세포 흡수 실험에 사용했다. 리포펙타민-전달된 Alexa 647 표지된 siRNA를 대조군으로 사용했다. ASGPR 과발현을 수반하는 HepG2 세포 및 Huh7 세포를 사용하여, 형질감염 실험에서 야생형 세포와 비교했다. 5000개의 세포를 96 웰 플레이트에 밤새 플레이팅했다. 세포에 50nM siRNA를 2시간, 24시간 및 48시간 동안 형질감염시켰다. 핵을 훽스트(Hoechst) 염료로 염색하고, 세포를 PBS의 Cytation 이미징 스테이션에서 이미지화했다. 이미지는 20배 배율로 촬영되었다. 수득된 데이터는, ASGPR을 과발현하는 HepG2 세포가 과발현된 ASGPR을 결여하는 야생형 HepG2 세포보다 형광 표지 물질을 훨씬 더 많이 흡수한다는 것을 나타냈다.
ASGPR을 과발현하는 Huh7 세포는 또한 ASGPR 수용체를 과발현하지 않는 Huh7 세포와 비교하여 흡수의 증가를 나타냈지만, 표지화는 야생형 HepG2 세포만큼 강력하지 않았다.
PDOV1 및 PDOV2는 모두 ASGPR을 과발현하는 HepG2 세포에 대한 표지된 siRNA의 전달을 입증했지만, 야생형 세포의 표지화는 거의 또는 전혀 나타나지 않았다. 작제물에 GalNac이 없는 경우, ASGPR 과발현 세포에 대한 어떠한 흡수도 나타나지 않았다.
후속 실험에서, ASGPR을 과발현하는 Huh7에서 PDOV1, 2 및 3 변이체를 사용한 전달을 조사했다. PDoV2 및 3은 야생형 세포와 비교하여 이들 세포에 대한 어느 정도의 흡수 특이성을 나타냈다. PDoV1은 또한 이들 세포에 대한 약간의 전달을 나타냈지만, PDoV2 및 PDoV3만큼 크지는 않았다. PDoV2는 24시간의 노출 후에 유의한 흡수를 나타냈다.
실시예 16.
1차 마우스 간세포에서 mTTR - PDoVx - GalNAc의 시험관내 연구:
GalNAc-접합된 siRNA(mTTR1-PDoV3-GalNAc3, mTTR1-PDoV2-GalNAc3, mTTR2-GalNAc3 양성 대조군, mTTR2-GalNAc3 양성 대조군)에 대한 용량-반응 스크린은 표적 TTR에 대한 1차 마우스 간세포를 사용하여 수행했다. 세포 밀도는 40000개 세포/96웰이었다. 농도는 5배 희석에서의 1μM에서 가장 높았고 3pM에서 가장 낮았다. 72시간 동안 직접 인큐베이션에 의해 세포를 형질감염시켰다. 데이터는 bDNA 검정에 의해 판독되었다. 데이터는 XLfit 소프트웨어로 분석되었다. 갭 dh로 정규화된 TTR 신호, 4중의 평균, 모의-처리된 세포 세트 = 1, IC50 값의 계산을 위한 Xlfit. 사용된 1차 간세포는 독일 프리마시트(Primacyt)(lot MH181219)로부터 구입했고, CD1 마우스로부터 유래하고, 해동 직후에 siRNA로 처리했다.
2개의 siRNA는 둘 다 3' 말단에서 3가 GalNAc 클러스터에 접합되었다(mTTR2 siRNA 서열은 완전히 변형된 서열이고, 올리고뉴클레오티드 상에서 mTTR1보다 4개 이상의 추가 PS 결합 변형이었다)[참조: Nair, et al., J. Am. Chem. Soc. 136:16958-16961(2014)]. Aha1-GaNAc3 양성 대조군은 하우스키퍼 ahsa1에 대해 표적화된 표준 대조군으로 사용되었다. 이것을 음성 및 양성 대조군으로 사용하고, 세포 용해물을 스크리닝 표적 또는 ahsa1-특이적 프로브 중 어느 하나와 하이브리드화시켰다. 표 e1은 2개의 대조군 siRNA의 서열과 GalNAc 클러스터의 구조를 수록한다.
[표 e1] 대조군 siRNA 서열 및 표적
접합체 표적 서열
mTTR2-GaNAc3 양성 대조군 마우스 TTR 센스: 5'-AfsasCfaGfuGfuUfCfUfuGfcUfcUfaUfaAf(NHC6)(GalNAc3)-3'
안티센스: 5'-usUfsaUfaGfaGfcAfagaAfcAfcUfgUfususu-3'
Aha1-GaNAc3 양성 대조군 AHSA1 Sense: 5'-uscsUfcGfuGfgCfcUfuAfaUfgAfaAf(NHC6)(GalNAc3)-3'
Antisense: 5'-UfsUfsuCfaUfuAfaGfgCfcAfcGfaGfasusu-3'
대조군 접합체 상의 3가 GalNAc3 리간드
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
[표 e2] GalNAc-접합된 siRNA 시험관내 스크리닝에 대한 용량-반응 요약.
화합물 IC50(μM) IC80(μM) Max. KD(%)
mTTR1-PDoV3-GalNAc3 0.0018 0.0048 97%
mTTR1-PDoV2-GalNAc3 0.0026 0.0071 97%
mTTR2-GalNAc3 양성 대조군 0.0001 0.0003 96%
aha1-GalNAc3 양성 대조군 0.0015 0.0059 96%
mTTR1 - PDoV3 - GalNAc3 접합체의 시험관내 연속 희석 데이터 - 도 15A 참조: IC50=1.82nM은 동일한 siRNA 서열 21 및 올리고뉴클레오티드의 화학적 변형에 대한 IC50=1.39nM의 문헌 보고에 필적한다[참조: Nair et al., 상기]. 도 15B는 mTTR1-PDoV2-GalNAc3 접합체에 대한 시험관내 연속 희석 데이터를 나타낸다. 도 15C는 mTTR2-GalNAc3 양성 대조군 접합체 시험관내 연속 희석 데이터에 대한 연속 희석 데이터를 나타낸다: mTTR2 siRNA 서열은 완전히 변형된 서열이고, 올리고뉴클레오티드 상에서 4개 이상의 추가 PS 결합 변형을 갖는다(Nair, 상기 참조). 도 15D는 Aha1-GalNAc3 양성 대조군 접합체에 대한 시험관내 연속 희석 데이터를 나타낸다.
발행된 특허 및 공개된 특허 출원을 포함하여 본 명세서에 특정된 모든 간행물, 및 url 어드레스 또는 등록 번호로 특정되는 모든 데이터베이스 항목은 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 도입된다.
본 발명이 이의 특정 실시형태와 관련하여 설명되고 예시의 목적으로 다수의 상세가 기재되었지만, 본 발명이 추가 실시형태에 영향을 받기 쉽고, 본 명세서에 기재된 특정 상세는 본 발명의 기본 원리를 벗어나지 않고서 변경될 수 있음이 당업자에게는 명백하다.

Claims (57)

  1. (a) 표적화 모이어티(targeting moiety), 및 (b) 제1 치료적 올리고뉴클레오티드(first therapeutic oligonucleotide)에 공유결합된 펩티드 도킹 비히클(Peptide Docking Vehicle; PDoV)을 포함하는, 화학적 작제물(chemical construct).
  2. 제1항에 있어서, 상기 작제물이, 제1 치료적 올리고뉴클레오티드와 동일하거나 상이한 제2 치료적 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 화학적 작제물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 PDoV가 히스티딘 및 라이신의 복수의 반복 단위를 포함하는, 화학적 작제물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 모이어티가 아시알로당단백질 수용체(asialoglycoprotein receptor)에 결합하는, 화학적 작제물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 siRNA, 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드, miRNA, saRNA, shRNA, 앱타머(aptamer), RNA자임(RNAzyme), DNA자임, 유인(decoy) 올리고뉴클레오티드, 또는 CpG 모티프(motif)를 포함하는, 화학적 작제물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 치료적 올리고뉴클레오티드가 siRNA 또는 miRNA 분자인, 화학적 작제물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PDoV 작제물이, 동일하거나 상이한 적어도 2개의 표적화 모이어티 및/또는 동일하거나 상이한 적어도 2개의 치료적 올리고뉴클레오티드를 포함하는 엔도솜 방출 모티프를 포함하는, 화학적 작제물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하기에 나타낸 구조 중 하나를 갖고, 여기서 유형 X 부위는 표적화 리간드를 접합(conjugating)하기 위해 사용되고; 유형 Y 부위는 올리고뉴클레오티드를 접합하기 위해 사용되고, X 및 Y는 동일하거나 상이할 수 있고; A는 H, K, R, HH, HHH, HHHH, HHK, HHHK 또는 최대 약 5개의 아미노산을 함유하는 임의의 다른 엔도솜 방출 짧은 펩티드의 펩티드 서열이고; B는 H, K, R, HH, HHH, HHHH, HHK, HHHK, 또는 최대 약 5개의 아미노산, 임의의 다른 아미노산 또는 아미노산과 링커(linker)의 조합을 함유하는 임의의 다른 짧은 펩티드의 펩티드 서열이고; D는 올리고뉴클레오티드이고; RL은 리간드이고; RS는 올리고뉴클레오티드에 대한 링커인, 화학적 작제물:
    Figure pct00035
    .
  9. 제8항에 있어서, D가 siRNA, mRNA 또는 앱타머인, 화학적 작제물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PDoV 펩티드 작제물이 KHHHCKH, HKHHHCKH, HHKHHHCKH, HHHKHHHKCHHHKHHH, HHHKHHCKHHH, HHHKHHCRHHH, HKHHCKH, HKHCH, HKHCKH, HKHC, HHHK(S)HHCKHHH 및 HHK(S)HHKCHH(S)HHH로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 구조를 갖고, 여기서 RL은 시스테인 잔기의 측쇄에 결합되고, RS는 라이신 잔기의 측쇄에 결합되고, (S)는
    Figure pct00036
    인, 화학적 작제물.
    [청구항 10]
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PDoV 펩티드 작제물이 하기 구조를 갖고, 리간드 중 3개가 펩티드 상에 개별적으로 접합되어 있는, 화학적 작제물.
    Figure pct00037
    또는
    Figure pct00038
    .
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드 모이어티 RL이 링커-1을 포함하고, 여기서 링커-1은 하기 구조 중 하나를 포함하는, 화학적 작제물:
    Figure pct00039
    (여기서, n은 1, 2 또는 3이고, OCH2 단위를 갖는 1,5-트리아졸 환을 통해 브릿지(bridge)에 결합된다); 또는
    Figure pct00040
    (여기서, n은 1, 2 또는 3이고, CH2OCH2 단위를 갖는 1,5-트리아졸 환을 통해 브릿지에 결합된다); 또는
    Figure pct00041
    (여기서, n은 1, 2 또는 3이고, CH2OCH2 단위를 갖는 1,5-트리아졸 환을 통해 브릿지에 결합된다).
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PDoV 펩티드에 부착된 리간드(들) 사이의 링커가 폴리에틸렌 글리콜 쇄 -(CH2CH2O)n-, 또는 -(CH2CH2)n- 쇄를 포함하고, 여기서 n은 2 내지 15의 정수인, 화학적 작제물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드 RL이, 티오에테르, 아미드 또는 트리아졸 결합을 포함하는 링커를 통해 PDoV 펩티드에 결합되는, 화학적 작제물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 구조 Rs-링커2-올리고뉴클레오티드를 갖는 모이어티를 통해 결합되고, 여기서 링커 2는 지방족 쇄, 폴리에틸렌 글리콜 쇄, 소수성 지질 쇄 또는 친수성 쇄이고, 말단 부위의 그룹 2는 siRNA 말단과의 화학적 접합을 위한 반응성 부위인, 화학적 작제물.
  15. 제15항에 있어서,
    링커 2는
    Figure pct00042
    이고,
    그룹 2는
    Figure pct00043
    인, 화학적 작제물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가, 10 내지 29개의 길이를 갖는 일본쇄(single-stranded) 올리고뉴클레오티드인 RNAi 분자인, 화학적 작제물.
  17. 제6항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가, 각각 10 내지 29개 염기 또는 19 내지 27개 염기의 길이를 갖는 2개의 상보적(complementary) 일본쇄 올리고뉴클레오티드의 이중쇄(duplex)를 포함하는 siRNA 분자인, 화학적 작제물.
  18. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는, 화학적 작제물.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드를 포함하는, 화학적 작제물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드가 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는, 화학적 작제물.
  21. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 2' 위치에 적어도 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 siRNA 분자를 포함하는, 화학적 작제물.
  22. 제28항에 있어서, 상기 화학적으로 변형된 뉴클레오티드가 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로, 2'-O-메톡시에틸, 2'-O-알릴 또는 2'-H의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 화학적 작제물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가
    Figure pct00044
    또는
    Figure pct00045
    인 적어도 하나의 화학적으로 변형된 결합을 포함하는 siRNA 분자를 포함하는, 화학적 작제물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA 또는 올리고뉴클레오티드가 링커 3으로 위치 5' 또는 3'에서 추가로 화학적으로 변형되고, 여기서 링커 3은, 링커 2와 공유결합으로(covalently) 반응하여 리간드-PDoV 및 뉴클레오티드를 결합할 수 있는 상보적 접합 부위 그룹 3을 함유하는, 화학적 작제물.
  25. 제24항에 있어서, 하기 나타낸 구조를 포함하는, 화학적 작제물:
    Figure pct00046
    .
  26. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 리간드가 N-아세틸-갈락토사민(GalNAc), 갈락토오스, 갈락토사민, N-포르말-갈락토소아민, N-프로피오닐-갈락토사민, N-부타노일갈락토사민 및 앱타머로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 화학적 작제물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 표적화 리간드가 N-아세틸-갈락토사민(GalNAc)인, 화학적 작제물.
  28. 제1항에 있어서, 상기 표적화 리간드가 사이클릭(c) RGD, APRPG, NGR, F3 펩티드, CGKRK, LyP-1, iRGD(CRGDRCPDC), iNGR, T7 펩티드(HAIYPRH), MMP2-절단가능한 옥타펩티드(GPLGIAGQ), CP15(VHLGYAT), FSH(FSH-β, 33-53 아미노산, YTRDLVKDPARPKIQKTCTF), LHRH(QHTSYkcLRP), 가스트린-방출 펩티드(GRP)(CGGNHWAVGHLM), RVG(YTWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG), FMDV20 펩티드 서열(NAVPNLRGDLQVLAQKVART) 및 GLP로 이루어진 그룹으로부터 선택된 펩티드이거나 엽산인, 화학적 작제물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 표적화 리간드가 RGD 또는 GLP인, 화학적 작제물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 작제물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체가 히스티딘-리신 풍부(rich) 폴리펩티드 HKP, HKP(H), 또는 리포펙타민을 포함하는, 약제학적 조성물.
  32. 제30항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체가 물, 및 인산칼륨 1염기성 무수 NF, 염화나트륨 USP, 인산나트륨 2염기성 7수화물 USP, 글루코스, 및 인산염 완충 생리식염수(PBS)로 이루어진 그룹 중 하나 이상을 포함하는, 약제학적 조성물.
  33. 세포를 제1항에 따른 작제물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 올리고뉴클레오티드를 세포에 전달하는 방법.
  34. 세포를 제4항에 따른 작제물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 올리고뉴클레오티드를 간세포에 전달하는 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 siRNA 분자이고, 생체내에서 포유동물 세포 또는 간세포에 전달되는, 방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 인간 세포인, 방법.
  37. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포 또는 간세포가 인간 세포 또는 간세포인, 방법.
  38. 치료학적 유효량의 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 작제물 또는 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항의 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서의 유전자 요법(gene therapy)의 방법으로서, 상기 포유동물은 임의로 인간인, 방법.
  39. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 아미노산 서열 -HHK, -KHH, -HHH, -HHHK, -KHHH, -HHHHK, -KHHHH, -K(HHHK)n (n = 1-8), -K(HHHHK)n(HHHK)m (n = 1-4, m = 1-8), K(HHHHK)n(HHHK)m- (n = 1-4, m = 1-8)을 포함하는, 화학적 작제물.
  40. 제39항에 있어서, 서열 -K(HHHHK)n(HHHK)m 또는 K(HHHHK)n(HHHK)m-을 갖는 펩티드를 포함하고, 여기서 n은 1이고, m은 3인, 화학적 작제물.
  41. 제52항에 있어서, 상기 펩티드가 엔도솜 방출 펩티드(endosomal releasing peptide)인, 화학적 작제물.
  42. 제52항에 있어서, 상기 펩티드가 세포 투과 펩티드(cell penetrating peptide)인, 화학적 작제물.
  43. 화학식 (HnKm)oXpYq를 갖는 펩티드로서, 여기서 H는 히스티딘이고, K는 라이신이고, X 및 Y는 아미노산 및 링커로부터 선택되는 기능성 단위(functional unit)이고, n은 1 내지 10이고, m은 1 내지 10이고, o는 1 내지 10이고, p는 1 내지 5이고, q는 1 내지 4인, 펩티드.
  44. 제43항에 있어서, 상기 펩티드가 표적화 리간드를 부착하기 위한 적어도 2개의 접합 부위를 포함하는, 펩티드.
  45. 제44항에 있어서, 상기 접합 부위가 라이신 또는 시스테인인, 펩티드.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드가 올리고뉴클레오티드를 부착하기 위한 적어도 2개의 접합 부위를 포함하는, 펩티드.
  47. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항의 펩티드, 및 적어도 하나의 접합 부위에서 펩티드에 결합된 적어도 하나의 표적화 리간드를 포함하는, 화학적 작제물.
  48. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항의 펩티드 또는 제47항의 작제물, 및 적어도 하나의 접합 부위에서 펩티드에 결합된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 화학적 작제물.
  49. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 리간드가 사이클릭(c) RGD, APRPG, NGR, F3 펩티드, CGKRK, LyP-1, iRGD(CRGDRCPDC), iNGR, T7 펩티드(HAIYPRH), MMP2-절단가능한 옥타펩티드(GPLGIAGQ), CP15(VHLGYAT), FSH(FSH-β, 33-53 아미노산, YTRDLVKDPARPKIQKTCTF), LHRH(QHTSYkcLRP), 가스트린-방출 펩티드(GRP)(CGGNHWAVGHLM), RVG(YTWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG), FMDV20 펩티드 서열(NAVPNLRGDLQVLAQKVART), 및 GLP로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 화학적 작제물.
  50. 제1항 내지 제29항 또는 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, miRNA, saRNA, shRNA, 앱타머, RNA자임, DNA자임, 유인 올리고뉴클레오티드, 및 CpG 모티프로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 화학적 작제물.
  51. 제50항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 miRNA인, 화학적 작제물.
  52. 치료학적 유효량의 제1항 내지 제29항 또는 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항의 작제물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 암을 치료하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 암이 고형 종양(solid tumor)인, 방법.
  54. 제52항에 있어서, 상기 암이 간암(liver cancer), 결장암(colon cancer), 및 췌장암(pancreatic cancer)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 암이 간암이고, 간세포 암종, 전이성 결장암, 및 전이성 췌장암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  56. 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인, 방법.
  57. 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작제물이 암 세포를 포함하는 종양 내로 직접 주사되는, 방법.
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