KR20130080727A - 리간드가 결합된 이중나선 올리고 ｒｎａ 구조체 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 질병 특히 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있는 이중나선 올리고 RNA의 전달을 향상시키는 고분자 화합물을 공유결합으로 결합시킨 이중나선 올리고 RNA 구조체에 타겟 특이적 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 그 제조방법과 상기 구조를 통한 타겟 특이적 이중나선 올리고 RNA 전달 기술을 제공한다. 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자는 타겟에 이중나선 올리고 RNA를 효율적으로 전달하여 비교적 낮은 농도의 이중나선 올리고 RNA 투여량으로도 타겟 세포에서 이중나선 올리고 RNA의 활성을 나타낼 수 있으며, 타 장기 및 세포로의 비 특이적인 이중나선 올리고 RNA의 전달을 막아 줄 수 있어, 다양한 질병 특히, 암에 대한 이중나선 올리고 RNA 치료용 도구일 뿐만 아니라, 새로운 형태의 이중나선 올리고 RNA 전달 시스템으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

리간드가 결합된 이중나선 올리고 ＲＮＡ 구조체 및 그 제조방법 {Double stranded oligo RNA molecule with a targeting ligand and method of preparing the same}
본 발명은 암 및 감염성 질병 등의 치료에 유용하게 사용될 수 있는 이중나선 올리고 RNA의 전달을 향상시키는 친수성 및 소수성 물질이 결합되어 있는 새로운 구조의 이중나선 올리고 RNA 구조체의 친수성 물질에 타겟 특이적 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체, 상기의 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자, 상기 구조체를 포함하는 약제학적 조성물과 상기 구조체로 이루어진 나노입자를 포함하는 약제학적 조성물 및 상기 구조체를 제조하는 방법과 상기 구조체로 이루어진 나노입자를 제조하는 방법과 상기 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 전달 기술에 관한 것이다.
간섭 RNA(RNA interference, 이하 'RNAi'라고 한다)는 그 역할이 발견된 이후로, 다양한 종류의 포유동물 세포(mammalian cell)에서 서열 특이적 mRNA에 작용한다는 사실이 밝혀졌다 (Silence of the transcripts: RNA interference in medicine. J Mol Med (2005) 83: 764-773). 긴 사슬의 RNA 이중가닥이 세포로 전달되면, 전달된 RNA 이중가닥은 Dicer라는 엔도뉴클라아제(endonuclease)에 의하여 21 내지 23 이중가닥(base pair, bp)으로 프로세싱된 짧은 간섭 RNA (small interfering RNA, 이하 'siRNA'라고 한다)로 변환된다. siRNA는 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합하여 안티센스 가닥이 타겟 mRNA를 인식하여 분해하는 과정을 통해 타겟 유전자의 발현을 서열 특이적으로 저해한다 (NUCLEIC-ACID THERAPEUTICS: BASIC PRINCIPLES AND RECENT APPLICATIONS. Nature Reviews Drug Discovery. 2002. 1, 503-514).
베르트랑(Bertrand) 연구진의 연구에 따르면, 동일한 타겟 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드(Antisense oligonucleotide, ASO)에 비하여 siRNA가 생체 내/외(in vitro 및 in vivo)에서 mRNA 발현의 저해효과가 뛰어나고, 해당 효과가 오랫동안 지속되는 효과를 가지는 것으로 밝혀졌다(Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem.Biophys.Res.Commun.2002. 296: 1000-1004). 또한 siRNA의 작용 기작은 타겟 mRNA와 상보적으로 결합하여 서열 특이적으로 타겟 유전자의 발현을 조절하기 때문에, 기존의 항체 기반 의약품이나 화학물질 (small molecule drug)에 비하여 적용할 수 있는 대상이 획기적으로 확대될 수 있다는 장점을 가진다(Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 2006 13(4):664-670).
siRNA의 뛰어난 효과 및 다양한 사용범위에도 불구하고, siRNA가 치료제로 개발되기 위해서는 siRNA의 안정성 개선과 세포 전달 효율 개선을 통해 siRNA가 타겟 세포에 효과적으로 전달되어야 한다(Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development. Drug Discov Today. 2006 Jan; 11(1-2):67-73).
상기의 문제점을 부분적으로 핵산분해효소 저항성 유사체를 이용하거나 바이러스 벡터, 리포좀 또는 나노입자(nanoparticle) 등의 전달체를 이용하는 것으로 극복하려는 시도가 진행 중이다.
아데노바이러스나 레트로바이러스 등의 바이러스성(viral) 전달 시스템은 형질주입 효율(transfection efficacy)이 높지만, 면역원성(immunogenicity) 및 발암성(oncogenicity)이 높다. 반면에 나노입자를 포함하는 비바이러스성(non-viral) 전달 시스템은 바이러스성 전달 시스템에 비하여 세포전달효율은 낮게 평가되지만, 생체 내(in vivo)에서의 높은 안전성, 타겟 특이적인 전달, 내포되어 있는 RNAi 올리고뉴클레오타이드를 세포 또는 조직으로 흡수(uptake) 및 내재화(internalization) 등의 개선된 전달 효과 및 낮은 세포독성 및 면역 유발(immune stimulation)등의 장점을 가짐으로써, 효과적인 타겟 유전자의 발현 저해를 유발하여 가장 유력한 전달방법으로 평가되어지고 있다 (Nonviral delivery of synthetic siRNAs in vivo. J Clin Invest. 2007 December 3; 117(12): 3623??3632).
다양한 나노입자를 이용한 전달시스템들이 암 특이적 전달을 위하여 개발되고 있는데, 이러한 나노입자 시스템은 혈액 내에서 오랫동안 순환하기 위해 표면이 친수성 물질로 코팅이 되어있고, 내포작용(endocytosis)을 높이기 위해 양전하를 띄도록 설계되는 것이 보통이다(Active targeting schemes for nanoparticle systems in cancer therapeutics. Advanced Drug Delivery Reviews 60 (2008) 1615??1626). 한편, 종양(tumor)의 조직은 매우 견고하여 정상 조직에 비하여 확산 제한(diffusion-limitation)을 가지는데, 이러한 확산 제한은 종양 성장에 필요한 영양분, 산소 및 이산화탄소 같은 노폐물의 이동에 악영향을 주기 때문에, 혈관신생(angiogenesis)을 통해 주변에 혈관을 형성함으로써 확산 제한을 극복한다. 혈관신생을 통해 형성된 종양 조직 내 혈관은 종양의 종류에 따라 100 nm 내지 2 um 가량의 틈을 가진 헐거운 혈관 구조(leaky and defective blood vessel)가진다.
따라서 나노입자는 정상조직의 조직화된 모세 혈관에 비하여 헐거운 혈관 구조를 가지는 암 조직의 모세혈관 내피(capillary endothelium)를 잘 통과하게 되어 혈액 내 순환 과정 중에 종양 간질(tumor interstitium)에 접근이 용이해지고, 또한 종양 조직 안에는 림프관(lymphatic drainage)이 없어 약물이 축적되는 결과를 나타내는데, 이를 EPR(enhanced permeation and retention) 효과라고 한다. 나노입자가 이러한 효과에 의해 종양조직 특이적으로 잘 전달되는 것을 수동적 타겟팅(passive targeting)이라고 한다(Nanoparticles for drug delivery in cancer treatment. Urol Oncol. 2008 Jan-Feb; 26(1):57-64).
항암제를 포함한 치료약물의 비 특이적 생체 내 분포와 타겟팅, 난용성 (lack of water solubility) 등을 극복하기 위해, 치료약물이 적재(loading)된 나노입자의 크기를 최적화하거나 표면을 변형하여 혈액 내의 순환 시간을 증진시키는 연구가 진행되고 있다. 특히, 항암제와 고분자 접합체(polymer-drug conjugates)를 이용한 고분자 나노입자(polymeric nanoparticle)는 알부민(albumin), 폴리-L-글루타메이트(poly-L-glutamate, PGA)나 N-(2-하이드로시프로필)- 메탁실아미드 코폴리머(N-(2-hydroxypropyl)-methacrylamide copolymer)와 같은 수용성(water-soluble), 생분해(biodegradable)가 가능한 특성을 가진 물질과 항암제를 연결하여 항암제의 종양 특이적 전달을 개선시킨 연구가 진행되고 있다(Therapeutic Nanoparticles for Drug Delivery in Cancer. Clin Cancer Res 2008; 14: 1310-1316). 또한 항암제에 양친매성(amphiphilic)인 물질을 결합하여 통상적으로 소수성인 항암제로 구성된 코어(core)와 친수성 외피(shell)로 쌓인 고분자 미셀(polymeric micelle)의 형성을 통한 항암제의 전달 연구도 진행되고 있다(Development of the polymer micelle carrier system for doxorubicin. J Control Release 2001; 74: 295-302).
따라서 항암제 등과 같은 치료약물에 추가적으로 소수성 물질을 결합시켜 코어의 응집력을 증진시키는 경우, 낮은 농도에서도 미셀을 형성할 수 있는 특징을 가지며 외피에 존재하는 친수성 물질에 의해 더욱 안정적인 형태의 고분자(polymer) 미셀을 형성할 수 있다. 소수성 및 친수성 물질이 양쪽 말단에 생분해성 결합으로 부여된 치료약물은 개선된 형태의 고분자 미셀을 형성하게 되어 안정적으로 타겟 장기인 암 조직(tissue)에 치료약물을 전달할 수 있게 된다.
최근 이중나선 올리고 RNA를 전달하는 기술로 핵산 말단에 결합된 물질의 특성을 통해 형성된 자가조립 나노입자인 SAMiRNA 형성 기술이 개발되었다(대한민국 공개특허 공보2009-0042297호). SAMiRNA 는 이중나선 올리고 RNA의 전달을 향상시키는 친수성 및 소수성 고분자가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 자가조립나노입자이며, SAMiRNA 형성 기술은 이중나선 올리고 RNA의 세포 내로 전달을 개선시킨 기술이라 할 수 있다
SAMiRNA 에 형광 표지를 붙여 종양이 이식되어 있는 쥐 모델 (tumor xenograft mouse model)에 미 정맥(tail vein)으로 투여한 경우, 앞서 언급한 수동적 타겟팅에 의해 종양 특이적으로 나노입자가 전달되는 것이 확인되었다(도 2 참조).
한편, 능동적 타겟팅(active targeting)은 표적물질(targeting moiety)이 나노입자에 결합된 경우로, 나노입자를 타겟 조직에서의 축적을 증진(preferential accumulation)시키거나, 타겟 세포 안으로 나노입자가 전달되는 내재화(internalization)를 개선하는 것이 보고되었다 (Does a targeting ligand influence nanoparticle tumor localization or uptake Trends Biotechnol. 2008 Oct; 26(10):552-8. Epub 2008 Aug 21).
능동적 표적(active targeting)은 나노입자에 항체나 리간드와 같은 표적물질(targeting moiety)을 결합시켜 개선된 타겟 세포로의 전달을 유발하는 것이다. 최근에 siRNA에 다양한 표적물질(targeting moiety)을 결합하여 원하는 조직(tissue)으로의 전달(localization)을 수행하는 연구가 진행되고 있다.
그 예로 α-토코페롤이 결합된 siRNA가 효과적이면서도 안정적으로 생체 내(in vivo)에 전달되어 타겟 유전자의 발현을 RNA 간섭현상을 통해 저해한다는 것을 발견하였고(Kazutaka Nishina et al., The American Society of Gene therapy, 2008, 16(4):734-740), 또한 콜레스테롤이 결합된 siRNA 가 siRNA전달에 주로 사용되는 세포 통과(penetration)를 촉진하는 펩타이드인 CPP(cell penetratingpeptide)보다 간 조직으로의 우수한 전달 효과를 나타냈다(US-20060014289; Moschos S.A. et al., Bioconjug. Chem. 18:1450-1459). 해당 전달 효과는 종양조직의 특이성뿐만 아니라 결합된 표적물질(targeting moiety)에 의한 타겟 세포의 특이성에 따라 그 효과가 나타난다는 결과가 보고되고 있다.
능동적 타겟팅은 타겟 세포 표면 특이적 또는 과발현 되어있는 탄수화물(carbohydrate), 수용체(receptor), 항원 (antigen)과 결합할 수 있는 능력을 가진 물질을 이용한다(Nanotechnology in cancer therapeutics: bioconjugated nanoparticles for drug delivery. Mol Cancer Ther 2006; 5(8): 1909-1917). 따라서 능동적 표적물질(targeting moiety)이 결합된 나노입자는 수동적 타겟팅에 의해 혈액 내에서 순환하는 동안 종양 조직으로 축적되며, 표적물질(targeting moiety)에 의해 나노입자의 타겟 세포 내 전달이 증가하게 되어, 세포로 전달된 약물의 치료효과가 향상된다. 이때, 표적물질(targeting moiety)로는 주로 리간드나 항체가 이용되는데, 이는 세포 표면의 수용체와 높은 친화도와 특이성(avidity and specificity)을 가지고 결합하여 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 나노입자의 내재화(internalization)를 촉진한다(Kinetic analysis of receptor-mediated endocytosis (RME) of proteins and peptides: use of RME as a drug delivery system. J Control Release 1996; 39: 191??200).
이러한 리간드 또는 항체의 타겟이 되는 세포 표면의 수용체나 항원은 타겟 세포에서 특이적 또는 과발현 되어 타겟팅 리간드의 접근이 용이해야 하고, 이를 통해 내포작용 효율(rate of endocytosis)이 높은 특징을 가지며, 또한 해당 수용체나 항원은 리간드가 결합된 나노입자를 세포 안으로 전달한 뒤 세포 표면으로 다시 표출(recycle back)되는 성향을 가진다(Receptor-mediated endocytosis: An overview of a dynamic process. J. Biosci., Vol. 6, Number 4, October 1984, pp. 535-542.). 종양 표적물질(targeting moiety)은 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor)나 저밀도 지질단백질 수용체(low-density lipoprotein receptor) 등의 타겟 세포주에서 특이적으로 발현되는 수용체나, 다양한 암 종의 세포 표면에서 과발현 되는 것으로 알려진 엽산 수용체(Folate receptor)등의 종양 특이적인 수용체에 특이적으로 결합하는 물질을 이용한다(Nanotechnology in cancer therapeutics: bioconjugated nanoparticles for drug delivery. Mol Cancer Ther 2006; 5(8): 1909-1917).
SAMiRNA에 타겟팅 모이어티 특히, 수용체 매개 내포작용 (receptor mediated endocytosis, RME) 특성을 가진 수용체에 특이적인 리간드가 결합된다면 효율적으로 타겟세포 특히, 암세포 내부로의 전달을 촉진하게 되어, 비교적 낮은 농도의 투여량으로도 타겟 세포로 전달되어 높은 이중나선 올리고 RNA의 활성을 나타낼 수 있으며 타 장기 및 세포로의 비 특이적인 이중나선 올리고 RNA의 전달을 저해할 수 있다.
대한민국 공개특허공보 2009-0042297호: siRNA 접합체 및 그 제조방법. 공개일자 2010년 11월24일, 출원인 : 바이오니아
본 발명의 목적은 치료용 약물의 세포 내 전달효율성을 향상시키기 위해 치료용 약물의 양 말단에 생체 적합성 고분자 화합물인 친수성 및 소수성 물질을 단순 공유결합 또는 링커-매개 공유결합으로 결합시킨 치료용 약물의 친수성 물질에 리간드가 결합된 치료용 약물 구조체 및 상기 구조체로 이루어진 나노입자를 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 이중나선 올리고 RNA의 세포 내 전달 효율성을 향상시키기 위해, 이중나선 올리고 RNA의 말단에 생체 적합성 고분자 화합물인 친수성 및 소수성 물질을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합으로 결합시킨 이중나선 올리고 RNA 구조체의 친수성 물질에 타겟 세포 특이적으로 세포내재화(internalization)를 증진시키는 수용체 매개 내포작용(receptor mediated endocytosis, RME) 특성을 가진 수용체에 특이적인 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체, 상기 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자 및 상기 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체 또는 상기 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이를 포함하는 나노입자의 제조방법, 및 상기 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 이용한 이중나선 올리고 RNA의 전달 기술을 제공하는 것이다.
본 발명에서의 안티센스 가닥은 RISC(RNA-induced silencing complex)에서 타겟 mRNA와 상보적으로 결합하여 타겟 mRNA를 분해하는 RNAi 활성을 나타내는 가닥이며, 센스가닥은 안티센스가닥과 상보적인 서열을 갖는 가닥을 의미한다.
본 발명에서 상보적 또는 상보적 결합의 의미는 두 서열이 서로 결합하여 이중나선 구조를 이루는 것을 말하며, 반드시 완벽한 상보적(perfect match) 결합일 필요는 없으며 일부 서열이 상이한 경우 (mismatch)도 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 식(1)의 구조를 갖는 리간드가 결합된 치료약물-고분자 구조체를 제공한다.
하기 식(1)의 구조를 갖는 리간드가 결합된 치료용 약물-고분자 구조체;
L-A-X-R-Y-B 식(1)
식(1)에서 A는 친수성 물질이고, B는 소수성 물질이며; X와 Y는 서로 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며; R은 치료용 약물이고; L은 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진 시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드(ligand)를 의미한다.
이 때, 치료용 약물은 항암제, 이중나선 올리고 RNA, 항바이러스제, 스테로이드계 소염제 (SAID), 비스테로이드계 소염제 (NSAID), 항생제, 항진균제, 비타민, 호르몬, 레티노인산, 프로스타글란딘, 프로스타사이클린, 항대사제, 축동제(micotics), 콜린 작동성 약물, 아드레날린 길항제, 항경련제, 항불안제, 정온제, 항우울제, 마취제, 진통제, 동화성 스테로이드제, 에스트로겐, 프로게스테론, 글리코사미노글리칸, 폴리뉴클레오타이드, 면역억제제, 면역촉진제 중에서 선택될 수 있다.
본 발명에서의 치료용 약물은 이중나선 올리고 RNA 또는 항암제인 것이 바람직하다. 이때, 치료용 약물이 이중나선 올리고 RNA인 경우, 상기 친수성 물질은 이중나선 올리고 RNA의 3´ 또는 5´ 말단의 어느 위치에 결합되어도 무방하다.
본 발명의 리간드가 결합된 치료약물-고분자 구조체에 있어서, 이중나선 올리고 RNA 또는 항암제에 결합된 친수성 물질의 특정위치 특히 말단에 리간드를 추가적으로 구비할 수 있다. 상기 리간드는 타겟 세포 특이적으로 세포내재화(internalization)를 증진시키는 RME 특성을 가진 타겟 수용체 특이적 항체나 앱타머{aptamer 표적분자에 높은 친화성(affinity)과 특이성(specificity)으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA, RNA 또는 변형핵산)}, 펩타이드 또는 엽산(Folate, 일반적으로 Folate와 folic acid는 서로 교차하여 사용되고 있으며, 본 발명에서의 엽산은 자연상태 또는 인체에서 활성화 형태인 Folate를 의미한다), N-아세틸 갈락토사민(N-Acetylgalactosamine, NAG), 만노스(mannose)를 비롯한 화학물질 등에서 선택될 수 있다. 이 때 리간드는 타겟 수용체 특이적으로 전달을 수행하도록 하는 물질로 상기 항체, 앱타머, 펩타이드 및 화학물질에만 한정되는 것만은 아니다.
상기 이중나선 올리고 RNA는 19 내지 31 개의 뉴클레오티드로 구성되는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용 가능한 이중나선 올리고 RNA는 유전자 치료용 또는 연구용으로 사용되거나 사용될 가능성이 있는 어떠한 유전자에 대한 이중나선 올리고 RNA도 채택될 수 있다.
상기 소수성 물질은 소수성 상호작용을 일으켜 이중나선 올리고 RNA 구조체로 구성된 나노입자를 형성하게 하는 역할을 수행한다. 상기 소수성 물질 중에서도 특히 탄소 사슬이나 콜레스테롤의 경우, 이중나선 올리고 RNA의 합성 단계에서 용이하게 접합시킬 수 있는 장점을 가지고 있어 본 발명의 구조체 제조에 매우 적합하다.
상기 소수성 물질은 분자량 250 내지 1,000인 것이 바람직한데, 특히 소수성 물질로는 스테로이드(steroid) 유도체, 글리세라이드(glyceride) 유도체, 글리세롤 에테르(glycerol ether), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), C12 내지 C50의 불포화 또는 포화 탄화수소(hydrocarbon), 디아실포스파티딜콜린(diacyl phosphatidylcholine), 지방산(fatty acid), 인지질(phospholipid), 리포폴리아민(lipopolyamine) 등이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 목적에 부합하는 것이라면 어떠한 소수성 물질도 사용 가능하다는 점은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.
특히, 상기 스테로이드(steroid) 유도체는 콜레스테롤, 콜리스탄올, 콜산, 콜리스테릴 포르메이트, 코테스타닐 모르메이트 및 콜리스타닐 아민으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 글리세라이드 유도체는 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드 등에서 선택될 수 있는데 이때, 글리세라이드의 지방산은 C12 내지 C50의 불포화 또는 포화 지방산임을 특징으로 한다.
또한, 상기 친수성 물질은 분자량 200 내지 10,000인 양이온성 또는 비이온성 고분자 물질인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1,000 내지 2,000인 비이온성 고분자 물질이다. 예를 들어, 친수성 물질은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥사졸린 등의 비이온성 친수성 고분자 화합물을 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 친수성 물질은 필요에 따라 리간드와의 결합을 위해 필요한 기능기를 갖도록 변경되어도 무방하다. 상기 친수성 물질 중에서도 특히 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)은 다양한 분자량과 기능기를 도입할 수 있으며, 생체 내 친화성이 좋고 면역반응을 유도하지 않는 등 생체 적합성(bio-compatibility)이 우수하며, 이중나선 올리고 RNA의 생체 내에서의 안정성을 증가시키고, 전달 효율을 증가 시키므로 본 발명의 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조에 매우 적합하다.
상기 공유결합을 매개하는 링커는 친수성 물질(또는 소수성 물질)과 이중나선 올리고 RNA로부터 유래된 잔기의 말단에서 공유결합 시키며, 필요에 따라 소정의 환경에서 분해가 가능한 결합을 제공하는 한 특별히 한정되는 것은 아니다. 따라서 상기 링커는 구조체의 제조과정 중 이중나선 올리고 RNA 및/또는 친수성 물질(또는 소수성 물질)을 활성화하기 위해 결합시키는 어떠한 화합물도 포함할 수 있다.
또한, 상기 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합 중 어느 것이어도 무방하다. 이때, 비분해성 결합은 아미드 결합 또는 인산화 결합이 있고, 분해성 결합은 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합 등이 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
하기 식 (2)와 같이 이중나선 올리고 RNA 센스 가닥의 3´ 말단에 친수성 물질이 결합되며, 친수성 물질에 리간드가 결합하고, 5´ 말단에 소수성 물질이 결합된 형태의 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제공하고, 이를 제조하는 방법은
Figure pat00001
(식(2)에서 A는 친수성 물질이고, B는 소수성 물질이며; X와 Y는 서로 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며; S는 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥이고, AS는 이중나선 올리고RNA의 안티센스 가닥이며; L은 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진 시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드(ligand)를 의미한다.)
(1) 기능기-친수성 물질이 결합된 고형지지체를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;
(2) 상기 기능기-친수성 물질이 결합된 RNA 단일가닥의 5´ 말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
(4) 상기기능기-RNA-고분자 구조체 및 별도로 합성된 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 고형지지체로부터 분리하는 단계;
(5) 상기 기능기를 통해 리간드를 친수성 물질의 말단에 결합시키는 단계;
(6) 상기 리간드가 결합된 RNA-고분자 구조체와 상보적 서열의 RNA 단일가닥은 어닐링을 통해 이중가닥을 형성하는 단계;
를 포함하는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조방법이다.
보다 바람직한 구체적인 예는, (1) 기능기가 결합되어 있는 고형지지체(CPG)에 친수성 물질을 결합시키는 단계; (2) 기능기-친수성 물질이 결합되어있는 고형지지체(CPG)에 RNA 단일가닥을 합성하는 단계; (3) 상기 RNA 단일가닥의 5′말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 과정으로 합성하는 단계; (4) 합성이 완료되면 고형지지체(CPG)로부터 기능기-RNA-고분자 구조체 및 별도로 합성된 상보적인 서열의 RNA단일가닥을 분리하는 단계; (5) 상기 기능기를 이용하여 친수성 물질 말단에 리간드가 결합된 RNA-고분자 구조체를 제조하는 단계; (6) 제조된 리간드가 결합된 RNA-고분자 구조체와 상보적인 서열의 RNA 단일가닥은 어닐링을 통해 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다. 상기 (6)단계 이후, 제조가 완료되면 고속 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 이용하여 상기 반응물들과 RNA-고분자구조체 및 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 분리 정제한 뒤 MALDI-TOF 질량 분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 RNA-고분자 구조체 및 RNA가 제조되었는지를 확인할 수 있다. 상기 제조방법에 있어서 (3) 단계에서 합성된 RNA 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 합성하는 단계는 (1)단계 이전 또는 (1)단계 내지 (6)단계 중 어느 한 과정 중에 수행되어도 무방하다.
또 다른 양태로,
하기식(3)과 같이 이중나선 올리고 RNA 센스가닥의 5´ 말단에 친수성 물질이 결합되고, 친수성 물질에 리간드가 결합되며, 3´ 말단에 소수성 물질이 결합된 형태의 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제공하며, 이를 제조하는 방법은
Figure pat00002
(1) 기능기가 결합되어 있는 고형지지체를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;
(2) 단계 (1)에서 수득된 물질에 친수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
(3) 단계 (2)에서 수득된 물질에 리간드를 공유결합 시키는 단계;
(4) 단계 (3)에서 수득된 물질을 고형지지체로부터 분리하는 단계;
(5) 단계 (4)에서 수득된 물질에 3´ 말단에 결합된 기능기를 통해 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
(6) 단계 (5)에서 수득된 물질과 상보적 서열의 RNA 단일가닥을 어닐링하여 이중가닥을 형성하는 단계;
를 포함하는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조방법이다.
보다 바람직한 구체적인 예는, (1) 기능기가 결합되어 있는 고형지지체(CPG)를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계; (2) 상기 RNA 단일가닥의 5´ 말단에 친수성 물질을 공유결합 시키는 과정으로 합성하는 단계; (3) 상기 RNA 단일가닥의 친수성 물질에 리간드가 결합된 기능기-RNA-친수성 고분자 구조체를 합성하는 단계; (4) 합성이 완료되면 고형지지체(CPG)로부터 리간드가 결합된 기능기-RNA-친수성 고분자 구조체를 분리하는 단계; (5) 기능기를 통해 소수성 물질을 결합하여 리간드가 결합된 RNA-고분자 구조체를 합성하는 단계; 및 (6) 제조된 RNA-고분자 구조체와 상보적인 서열의 RNA 단일가닥은 어닐링을 통해 이중나선 올리고 RNA-고분자 구조체를 제조하는 단계를 포함하여 이루어질 수 있다.
상기 단계 (5) 이후, 제조가 완료 되면 고속 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 이용하여 상기 반응물을 정제한 뒤 MALDI-TOF 질량분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 리간드가 RNA-고분자 구조체 및 RNA가 제조되었는지를 확인할 수 있다. 상기 제조방법에 있어서 (1)단계에서 합성된 RNA 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 합성하는 단계는 (1)단계 이전 또는 (1)단계 내지 (6)단계 중 어느 한 과정 중에 수행되어도 무방하다.
또 다른 양태로, 하기 식(4)와 같이, 이중나선 올리고 RNA 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 5´ 말단에 친수성 물질 또는 소수성 물질이 결합된 형태의 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 과정은
Figure pat00003
(상기 식(4)에서 A는 친수성 물질이고, B는 소수성 물질이며; X와 Y는 서로 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며; S는 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥이고, AS는 이중나선 올리고 RNA의 안티센스 가닥이며; L은 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진 시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드(ligand)를 의미한다.)
(1) 고형지지체를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;
(2) 상기 RNA 단일가닥의 5´ 말단에 친수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
(3) 상기 RNA 단일가닥에 친수성 물질에 리간드를 결합시키는 단계;
(4) 고형지지체로부터 리간드가 결합된 RNA-친수성 고분자 구조체 및 별도로 합성된 상보적 서열의 RNA-소수성 고분자 구조체의 단일가닥을 고형 지지체로부터 분리하는 단계;
(5) 상기 리간드가 결합된 RNA-친수성 고분자 구조체와 상보적 서열의 RNA 소수성 고분자 구조체를 어닐링하여 이중가닥을 형성하는 단계;
를 포함하는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조방법에 있어서,
(1)내지 (4)단계 중간에 (1)단계의 RNA 단일가닥과 상보적 서열로 이루어진 RNA 단일가닥을 합성한 뒤, 소수성 물질을 공유 결합시켜 소수성 물질이 결합된 형태의 RNA-소수성 고분자 구조체 단일가닥을 합성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법이다.
또한, 본 발명은 상기 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체로 구성된 나노입자 및 상기 리간드가 결합된 치료약물-고분자 구조체로 구성된 나노입자를 제공한다.
본 발명의 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체들 간의 상호작용에 의하여 나노입자(nanoparticle)를 형성하게 된다. 상세히 나노입자의 구조를 기술하면 나노입자의 중심에 소수성 물질이 위치하게 되고, 이중나선 올리고 RNA는 외부의 친수성 물질에 의해 보호되며, 리간드가 나노입자 표면에 위치하는 형태의 나노입자를 형성한다(도면 1 참조). 상기의 나노입자는 리간드를 통한 이중나선 올리고 RNA의 세포 내 전달을 가져 개선된 세포전달 효율을 가지며, 이를 질병의 치료목적으로 응용하는 것이 가능하다. 보다 구체적인 구조체의 합성과 구조체로 구성된 나노입자의 특징, 세포전달 효율 및 효과는 후술하는 실시예에서 더욱 상세히 설명한다.
또한, 본 발명은 상기 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체 또는 리간드가 결합된 치료약물-고분자 구조체로 이루어진 나노입자를 이용한 유전자 치료방법을 제공한다.
구체적으로 상기 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체로 구성된 나노입자를 준비하는 단계와 상기 나노입자를 동물의 체내로 투입하는 단계를 포함하는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체로 구성된 나노입자의 약제학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 투여를 위하여 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적절한 방법으로 또는 레밍톤 약학 과학(Remington´s pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 통상적으로 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공 될 수도 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다.
이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 약제학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화 할 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설 율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명은 암 및 감염성 질병 등의 치료에 유용하게 사용될 수 있는 이중나선 올리고 RNA의 전달을 달성하도록 도와주는 친수성 및 소수성 물질을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합을 이용하여 결합시킨 리간드-이중나선 올리고 RNA 구조체에 타겟 특이적으로 특히, 암세포 특이적으로 세포내재화(internalization)를 증진시키는 RME(receptor-mediated endocytosis) 특성을 가진 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 상기의 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 방법과 상기 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 통해 세포표면에 발현되는 수용체 등에 특이적으로 이중나선 올리고 RNA를 전달하는 기술을 제공한다. 이중나선 올리고 RNA 구조체에 타겟 특이적 리간드가 결합되는 경우, 해당 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자는 효율적으로 타겟 세포로 전달될 수 있으므로, 비교적 낮은 농도의 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 투여해도 타겟 세포에서 이중나선 올리고 RNA의 활성을 나타낼 수 있다. 또한 리간드의 결합은 타 장기 및 세포로의 비 특이적인 이중나선 올리고 RNA의 전달을 저해 할 수 있으므로 다양한 질병에 대한 이중나선 올리고 RNA 치료용 도구일 뿐만 아니라, 새로운 형태의 이중나선 올리고 RNA 전달 시스템으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체가 형성하는 나노입자(SAMiRNA)의 모식도
도 2는 SAMiRNA의 종양 특이적 전달을 보여주는 도면. (A) 종양 이식된 쥐에 Cy5.5가 표지 된 SAMiRNA를 5 mg/kg 체중(bodyweight)의 양으로 미 정맥(tail vein)에단 회 투여한 뒤, 시간의 경과에 따른 SAMiRNA의 생체 내 분포(biodistribution)를 확인하는 사진(빨간 점선으로 표지 된 부분이 종양 이식부위임), (B) SAMiRNA의 투여 후, 48 시간이 경과한 시점에서 각 조직을 채취하여 측정한 SAMiRNA의 ex vivo사진.
도 3은 1,3,4,6-테트라아세틸-N-아세틸 갈락토사민 (1,3,4,6-Tetraacetyl-NAG) (화합물 A)의 NMR 분석 결과를 나타내는 도면. (1H NMR (300 MHz, DMSO-D6); δ7.89 ppm(1H, d, J=9.3 Hz), 5.64 ppm(1H, d, J=8.7 Hz), 5.27 ppm(1H, d, J=3.3 Hz), 5.07ppm(1H, dd, J=11.7, 3.6 Hz), 4.22 ppm(1H, t, J=6.3 Hz), 4.14-3.96 ppm(2H, m), 2.12ppm(3H, s), 2.04 ppm(3H, s), 1.99 ppm(3H, s), 1.91(3H, s), 1.78 ppm(3H, s))
도 4는 3,4,6-트리아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민 (3,4,6-Triacetyl-1-hexa(ethylene glycol)-NAG) (화합물 B)의 NMR 분석 결과를 나타내는 도면. 1H NMR (300 MHz, DMSO-D6); δ7.71 ppm(1H, d, J=9.3 Hz), 5.21 ppm(1H, d, J=3.0 Hz), 4.97 ppm(1H, dd, J=11.1, 3.0 Hz), 4.56 ppm(1H, d, J=8.7 Hz), 3.88 ppm(1H, q, J=8.7 Hz), 3.83-3.74ppm(1H, m), 3.62-3.39 ppm(25H, m), 2.10 ppm(3H, s), 2.01 ppm(3H, s), 1.89 ppm(3H, s), 1.77 ppm(3H, s)
도 5는 1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민-포스포아미디트(1-Hexa(Ethylene Glycol)-NAG-Phosphoramidite) (화합물 C)의 NMR 분석 결과를 나타내는 도면. (A) 1H NMR (300 MHz, DMSO-D6); δ 7.78 ppm(1H, d, J=9.3 Hz), 5.21 ppm(1H, d, J=3.0 Hz), 4.97 ppm(1H, dd, J=11.1, 3.6 Hz), 4.56 ppm(1H, d, J=8.1 Hz), 3.88 ppm(1H, d, J=9.0 Hz), 3.81-3.41 ppm(30H, m), 2.89 ppm(2H, t, J=5.7 Hz), 2.11 ppm(3H, s), 2.00 ppm(3H, s), 1.89 ppm(3H, s), 1.77 ppm(3H, s), 1.20-1.12 ppm(12H, m), (B) 31P NMR data (121 MHz, DMSO-D6); δ 147.32 ppm.
도 6은 RNA 단일가닥의 제조 과정을 나타내는 도면.
도 7은 이중나선 올리고 RNA의 5′ 말단에 PEG가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체 제조 반응식 및 제조결과로 (A) PEG-포스포아미디트(phosphoramidite)를 이용하여 이중나선 올리고 RNA 에 PEG를 결합하는 과정이며, (B) 5′ 말단 변형(modification)이 이루어지지 않은 단일가닥 RNA(21mer)의 질량분석(MALDI-TOF MS) 결과를 나타내는 결과도면 (서열번호 1, MW 6662.1)이며, (C) 5′말단에 PEG가 결합된 단일가닥 RNA (21mer)의 질량분석(MALDI-TOF MS) 결과를 나타내는 도면(서열번호 1, MW 8662.1).
도 8은 mono-NAG-PEG-RNA 구조체의 제조 반응식 및 제조 결과로, (A) N-아세틸 갈락토사민-포스포아미디트(phosphoramidite)를 이용하여 PEG-RNA에 N-아세틸 갈락토사민(NAG)을 결합하는 과정, (B) PEG-RNA (green, MW 8624.1)에 N-아세틸 갈락토사민이 결합된 NAG-PEG-RNA(blue, MW 9171.2) 구조체의 질량분석(MALDI-TOF MS) 결과를 나타내는 도면으로 N-아세틸 갈락토사민의 분자량(MW 547)만큼 중심피크가 움직인 것을 확인한 결과.
도 9는 Triple-NAG-PEG-RNA 구조체의 제조 반응식 및 제조결과, (A) 덴드리머 포스포아미디트(dendrimer phosphoramidite) 및 N-아세틸 갈락토사민-포스포아미디트(NAG-phosphoramidite)를 이용하여 PEG-RNA 에 N-아세틸 갈락토사민을 결합하는 과정, (B) PEG-RNA (green, M.W. 8624.1)와 N-아세틸 갈락토사민이 결합된 mono-NAG-PEG 구조체(blue, MW 9171.2) 및 triple-NAG-PEG-RNA 구조체(red, MW 10630)의 질량분석(MALDI-TOF MS) 결과를 비교하는 도면.
도 10은 5′Folate-PEG-RNA 구조체의 제조 반응식 및 제조결과, (A) NHS-Folate를 통해 PEG-RNA 에 엽산(Folate)을 결합하는 과정, (B) PEG-RNA (green, MW 8624.1)와 엽산이 결합된 Folate-PEG-RNA 구조체 (blue, MW 9277.8)의 질량분석 (MALDI-TOF MS) 결과를 비교하는 도면이며, 엽산(Folate)의 분자량(MW 615)만큼 중심 피크가 움직인 것을 확인한 결과 도면.
도 11은 5′ C24-RNA 구조체의 제조결과, (A) 서열번호 1번과 상보적인 서열의 단일가닥 RNA 의 질량분석(MALDI-TOF MS)결과 도면(MW 7349.5), (B) 서열번호 1번과 상보적인 서열의 단일가닥 5′ C24-RNA 구조체의 질량분석(MALDI-TOF MS )결과 도면(MW 7830.2).
도 12는 아민(amine)-CPG를 통한 3′ CPG-amine-PEG-RNA 구조체의 제조과정을 나타내는 도면.
도 13은 아민(amine)-CPG를 통한 3′ CPG-amine-PEG-RNA-C24 구조체의 제조과정을 나타내는 도면.
도 14는 3′ Folate-PEG-RNA 구조체의 제조반응식 및 제조결과, (A) NHS-Folate를 통해 3′ 아민(amine)-PEG-RNA 구조체에 엽산(Folate)을 결합하는 과정, (B) 3′ Folate-PEG-RNA 구조체의 질량분석(MALDI-TOF MS)결과를 나타내는 도면 (서열번호 1번, MW 9277.7).
도 15는 5′ Folate-RNA-고분자 구조체로 이루어진 나노입자(Folate-SAMiRNA)의 물성분석 결과를 나타내는 도면, (A) Folate-SAMiRNA의 크기 및 다분산지수(polydisperse index, PDI) 그래프, (B) Folate-SAMiRNA의 임계 미셀 농도 그래프
도 16은 Folate-SAMiRNA의 엽산 수용체(Folate Receptor) 과발현 세포주에서의 타겟 유전자 발현저해 향상 효과. 엽산 수용체(Folate Receptor)가 과발현 되는 세포주인 KB 종양세포에 엽산(Folate)의 존재 유무에 따른 Folate-SAMiRNA 및 SAMiRNA를 엽산(Folate)을 포함하지 않는 조건 및 엽산(Folate)을 과량 포함하는 조건에서 처리하여 48시간이 경과한 시점에서 종양 세포주 안의 타겟 유전자의 mRNA양을 qPCR로 측정함. (Without Folate in culture medium, 엽산(Folate)을 포함하지 않는 조건 With Folate in culture medium, 과량의 (1mM) 엽산(Folate)을 포함하는 조건 Con, 대조군 서열인 서열번호 2번의 이중나선 올리고 RNA-고분자 구조체로 이루어진 나노입자인 SAMiRNA-Con을 처리한 실험군 SAM, 서바이빈 서열인 서열번호 1번으로 이루어진 이중나선 올리고 RNA-고분자 구조체로 이루어진 나노입자인 SAMiRNA-Sur를 처리한 실험군 Folate-SAM, 서바이빈 서열인 서열번호 1번으로 이루어진 엽산(Folate) 리간드가 결합된 형태의 엽산(Folate)-이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자인 Folate-SAMiRNA-Sur를 처리한 실험군)
도 17은 Folate-SAMiRNA의 종양 조직 내 타겟 유전자 발현 저해 효과를 나타내는 도면. 엽산 수용체(Folate receptor)가 과발현 되는 세포주인 KB 종양 세포로 이루어진 종양을 가진 쥐에 SAMiRNA 및 Folate-SAMiRNA를 5mg/Kg body weight의 양으로 미 정맥 단 회 투여한 뒤, 48시간 또는 72시간이 경과한 시점에서 종양조직 안의 타겟 유전자(서바이빈)의 mRNA양을 qPCR로 측정함. (PBS, 음성대조군 SAMiRNA, 리간드가 결합되지 않은 서바이빈 서열인 서열번호 1번으로 이루어진 이중나선 올리고 RNA-고분자 구조체로 이루어진 나노입자인 SAMiRNA-Sur 투여군 Folate-SAMiRNA, 엽산(Folate) 리간드가 결합된 서바이빈 서열인 서열번호 1번으로 이루어진 나노입자인 Folate-SAMiRNA-Sur투여군)
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 결합 가능한 리간드 물질의 제조
리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하기 위하여 이중나선 올리고 RNA 구조체에 결합이 가능한 리간드 물질을 제조하였다.
실시예1-1. 1-헥사(에틸렌 글리콜)- N -아세틸 갈락토사민-포스포아미디트 (1-Hexa(Ethylene Glycol)- N -Acetyl Galactosamine-Phosphoramidite) 시약 (화합물 A, B, C)의 제조
N-아세틸 갈락토사민(N-Acetyl Galactosamine, NAG)을 이중나선 올리고 RNA 구조체에 결합하기 위하여 하기 반응식 I 에 나타낸 바와 같이1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민-포스포아미디트(1-Hexa(Ethylene Glycol)-NAG-Phosphoramidite)를 제조하였다.
반응식 I
Figure pat00004

실시예 1-1-1. 1,3,4,6-테트라아세틸-NAG (1,3,4,6-Tetraacetyl-NAG) (화합물 A)의 제조
출발물질 염산 갈락토사민 (Galactosamine hydrochloride, Sigma Aldrich, 미국) (2 g, 9.27 mmol), 아세토나이트릴 (Acetonitrile, 삼전, 한국) (31 ㎖), 트리에틸아민 (Triethylamine, Sigma Aldrich, 미국) (15.42 ㎖, 111.24 mmol)을 혼합하여 1시간 동안 환류한다. 천천히 상온으로 냉각하고, 얼음물을 이용하여 0 ℃로 냉각한 후 무수초산(Acetic anhydride, Sigma Aldrich, 미국) (8.76 ㎖, 92.70 mmol)을 10분간 적가하였다. 적가가 끝난 후 얼음물을 제거하고, 24시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응이 완료되면 포화 탄산수소나트륨 (Sodium bicarbonate, 삼전, 한국) 수용액으로 pH가 중성이 될 때까지 천천히 투입하였다. pH가 중성이 된 후 2시간 동안 상온에서 교반하여 생성된 고체를 여과하고, 여과물을 에틸아세테이트(Ethyl acetate, 삼전, 한국) (100 ㎖ × 2), 증류수 (100 ㎖ × 2), 에틸아세테이트 (100 ㎖ × 1)의 순서대로 씻어주었다. 고체를 진공 건조하여 1,3,4,6-테트라아세틸- N-아세틸 갈락토사민(1.82 g, 52.3 %)을 얻었다(도 3 참조).
실시예 1-1-2. 3,4,6-트리아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)- N -아세틸 갈락토사민(3,4,6-Triacetyl-1-hexa(ethylene glycol)-NAG) (화합물 B)의 제조
상기 실시예 1-1-1에서 얻어진 1,3,4,6-테트라아세틸- N-아세틸 갈락토사민 (1.81 g, 4.82 mmol), 염화철 Ⅲ (Iron Ⅲ chloride, Sigma Aldrich, 미국) (1.02 g, 6.27 mmol), 메틸렌 클로라이드(Methylene chloride, 삼전, 한국) (48 ㎖)를 혼합하여 상온에서 교반하였다. 10분간 교반한 뒤, 헥사(에틸렌 글리콜) (Hexa(ethylene glycol), Sigma Aldrich, 미국) (1.58 ㎖, 4.82 mmol)를 투입하여 2시간동안 환류하였다. 반응이 완료되면 셀라이트(Celite, Sigma Aldrich, 미국)를 사용하여 여과하였고, 여과물을 메틸렌 클로라이드 (50 ㎖ × 2)로 씻어주었다. 여과액을 감압농축하고, 에틸아세테이트 (100 ㎖)와 증류수 (100 ㎖)를 넣고 물 층을 추출하였다. 획득된 물 층을 메틸렌 클로라이드(100 ㎖ × 3)로 추출하여 유기층을 모아서 무수황산마그네슘 (Magnesium sulfate anhydride, 삼전, 한국)으로 건조하고 여과하였다. 여과액을 감압 농축하고, 진공 건조하여 3,4,6-트리아세틸-1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민 (2.24 g, 74.9 %)을 얻었다(도 4 참조).
실시예 1-1-3, 1-헥사(에틸렌 글리콜)- N -아세틸 갈락토사민-포스포아미디트 (1-Hexa(Ethylene Glycol)-NAG-Phosphoramidite) (화합물 C)의 제조
상기 실시예 1-1-2에서 얻어진 (2.22 g, 3.71 mmol), 메틸렌 클로라이드 (37 ㎖), 트리에틸아민 (0.94 ㎖, 6.75 mmol)을 혼합하여 상온에서 교반 하였다. 10분간 교반한 뒤, 2-시아노에틸 N, N-디이소프로필 클로로포스포아미디트(2-Cyanoethyl N, N-diisopropylchlorophosphoramidite, Sigma Aldrich, 미국) (0.75 ㎖, 3.38 mmol)를 투입하여 45분 동안 교반하였다. 반응이 완료되면 감압농축하고, 에틸아세테이트 (100 ㎖)와 증류수 (100 ㎖)를 넣고 유기층을 추출하였다. 획득된 유기층을 무수 황산 마그네슘으로 건조하고, 여과하였다. 여과액을 감압농축하고, 칼럼으로 분리하여 1-헥사(에틸렌 글리콜)-N-아세틸 갈락토사민-포스포아미디트 (1.14 g, 42.2 %)를 얻었다(도 5 참조).
실시예 1-2. NHS-Folate의 제조
엽산(Folate)을 이중나선 올리고 RNA 구조체에 결합하기 위하여 하기 반응식 II 에 나타낸 바와 같이 NHS-Folate를 제조하였다.
반응식 II
Figure pat00005
출발물질 엽산(Folic acid, Sigma Aldrich, 미국) (3 g, 6.8 mmol), 디메틸 설폭시화물 (Dimethyl sulfoxide, Sigma Aldrich, 미국) (60 ㎖), N-하이드록시숙신이미드 (N-Hydroxysuccinimide, Sigma Aldrich, 미국) (0.86 g, 7.5 mmol), 1,3-디클로로헥실카보디이미드(1,3-Dicyclohexylcarbodiimide, Sigma Aldrich, 미국) (1.54 g, 7.5 mmol)를 혼합하여 18시간 상온에서 교반하였다. 반응이 완료되면 반응혼합물을 에틸아세테이트: n-헥산 (n-Hexane, 삼전, 한국)의 비율이 3:5인 용액(950 ㎖)에 10분간 적가하여 생성된 고체 NHS-Folate(3.79 g)를 여과하여 얻었다(Robert J. Lee and Philip S. Low (1994) J. Biological Chemistry. 269: 3198-3204).
실시예 1-3. 펩타이드(Peptide)의 제조
펩타이드 화합물들은 알파 아미노산(α-amino acid)을 포함하고 있기 때문에, 이와 같은 구조를 갖고 있는 펩타이드 유도체와 PEG에 존재하는 아민(amine) 작용기 간의 결합 반응을 수행하였다. 이 결합 반응의 전제조건으로 PEG와 펩타이드 유도체에 존재하는 아민 작용기는 펩타이드에 존재하는 카르복시산과의 결합 반응 시 상호 경쟁반응을 하기 때문에 펩타이드 화합물에 존재하는 아민 작용기를 보호기로 치환하는 우선 과정이 필요하였다. 펩타이드 화합물에 존재하는 아민기는 9-플루오르에닐메틸옥시카보닐(9-fluorenylmethyloxycarbonyl; Fmoc) 또는 t-부틸옥시카보닐 (tert-Butyloxycarbonyl; t-BOC)의 보호기(Protecting Group)로 치환되어 펩타이드의 카르복시산과의 반응성을 제거하여 PEG에 결합할 수 있는 형태의 펩타이드 화합물을 제조하였다.
실시예 2. 5′말단에 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조
상기 실시예 1에서 제조된 결합 가능한 리간드 물질은 실시예 1-1의 NAG 포스포아미디트(NAG-phosphoramidite)와 같이 포스포아미디트(phosphoramidite) 형태로 구성되어 일반적인 화학적 올리고 합성과정(차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)로 이루어지는 과정)을 통해 PEG 말단에 결합되거나, 실시예 1-2의 NHS-Folate와 같이 NHS-리간드 형태로 구성되어 PEG에 아민(amine)기를 결합된 뒤, 아민 PEG와 에스터(ester) 반응을 통해 5′말단에 리간드가 결합된 PEG-RNA의 형태로 결합될 수 있다. 합성된 5′말단에 리간드가 결합된PEG-RNA 구조체는 상보적인 서열의 소수성 잔기가 결합된 형태인 5′C24-RNA 구조체와 어닐링(annealing)하여 5′말단에 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 합성하였다.
실시예 2-1. 이중나선 올리고 RNA 의 제조
이하 실시예에서는 서바이빈을 억제하기 위해 서바이빈 이중나선 올리고 RNA를 사용하였다. 서바이빈은 지금까지 테스트된 대부분의 신생 종양이나 형질 변이된 세포주에서 공통적으로 발현되는 단백질로서, 항암치료에 있어서 중요한 타겟이 될 것으로 예측되고 있다(Survivin: a new target for anti-cancer therapy. Cancer Treat Rev. 2009 Nov;35(7):553-62). 본 발명의 서바이빈 이중나선 올리고 RNA는 서열번호 1번으로 기재되는 센스가닥과 이에 상보적인 서열인 안티센스가닥으로 구성되어 있으며, 대조군으로 사용되는 이중나선 올리고 RNA는 서열번호 2번으로 기재되는 센스가닥과 이에 상보적인 서열인 안티센스 가닥으로 구성되어 있다. 본 실시예에 사용된 이중나선 올리고 RNA는 하기의 염기서열로 이루어져있다.
(서열번호 1) 5′-AAG GAG AUC AAC AUU UUC A-3′
(서열번호 2) 5′-CUU ACG CUG AGU ACU UCG A-3′
이중나선 올리고 RNA는 β-시아노에틸 포스포아미디트 (tert-butyldimethylsilyl protected β-cyanoethyl phosphoramidite)를 이용하여 RNA골격 구조를 이루는 인산디에스테르(phosphodiester) 결합을 연결해 가는 방법을 사용하여, 상기 RNA 단일가닥 합성하였다 (Polymer support oligonucleotide synthesis ⅩⅧ: use of β-cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucleic Acids Res. 1984 Jun 11; 12(11): 4539-57).
합성과정은 뉴클레오사이드(nucleoside)가 결합된 고형지지체 (CPG) 상으로부터 시작하여 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)로 이루어지는 사이클(cycle)을 반복함으로써, 원하는 서열의 RNA를 얻게 된다. 해당 일련의 RNA 단일가닥의 합성과정은 RNA 합성기(384 Synthesizer, BIONEER, 한국)를 사용하여 진행하였다(도 6 참조).
실시예 2-2. 5′PEG-RNA 구조체의 제조
실시예 2-1에서 합성된 RNA에 PEG 포스포아미디트(phosphoramidite) 시약을 처리하여 일반적인 RNA 합성과정을 통해 5′PEG-RNA 구조체를 제조하였다 (도 7 참조).
실시예 2-3. 5′말단에 리간드가 결합된 PEG-RNA 합성
실시예 2-3-1. N -아세틸 갈락토사민 포스포아미디트(NAG phosphoramidite)를 이용한 NAG-PEG-RNA 구조체의 제조
실시예 2-2에서 합성된 5′PEG-RNA 구조체에 실시예 1-1에서 합성된 N-아세틸 갈락토사민 포스포아미디트(NAG phosphoramidite) 시약을 이용하여 일반적인 RNA 합성과정을 통해 N-아세틸 갈락토사민을 PEG-RNA 구조체에 포스포디에스터 결합하였다. N-아세틸 갈락토사민 리간드는 덴드리머 링커 (dendrimer linker)를 활용하여 PEG에 단일분자 혹은 그 이상의 분자의 N-아세틸 갈락토사민을 결합할 수 있다.
실시예 2-3-1-1. mono NAG-PEG-RNA 구조체의 제조
실시예 2-2에서 합성된 PEG-RNA 구조체에 실시예 1-1에서 합성된 N-아세틸 갈락토사민 포스포아미디트(NAG phosphoramidite) 시약을 이용하여 일반적인 RNA 합성과정을 통해 N-아세틸 갈락토사민을 PEG-RNA 구조체에 포스포디에스터 결합하여 5′mono-NAG-PEG RNA구조체를 합성하였다(도 8 참조).
실시예 2-3-1-2. triple NAG-PEG-RNA 구조체의 제조
실시예 2-2에서 합성된 PEG-RNA 구조체에 덴드리머 포스포아미디트(Dendrimer Phosphoramdite)(Trebler Phosphoramidte, Glen research, 미국) 시약으로 합성 후, 실시예 1-1에서 합성된 NAG phosphoramidite 시약을 이용하여 일반적인 RNA 합성과정을 통해 3개의 NAG를 PEG-RNA 구조체에 포스포디에스터 결합으로 5′triple-NAG-PEG-RNA 구조체를 합성하였다(도 9 참조).
실시예 2-3-2. 엽산-폴리에틸렌 글리콜-RNA(Folate-PEG-RNA) 구조체의 제조
실시예 2-2에서 합성된 PEG-RNA 구조체에 아민 포스포아미디트 (amime phosphoramidite)시약을 이용하여 일반적인 RNA 합성과정을 통해 아민기를 PEG-RNA 구조체에 포스포디에스터 결합으로 amine-PEG-RNA 구조체를 합성하였다. 합성된 아민(amine)-PEG-RNA 구조체에 실시예 1-2에서 합성된 NHS-Folate를 에스터(ester)반응을 통해 5′Folate-PEG-RNA 구조체를 합성하였다(도 10 참조).
실시예2-3-3. 아민 변형(amine modification) 및 펩타이드 화합물을 통한 펩타이드-PEG-RNA 구조체의 제조
실시예 1-3에서 제조된 보호된 펩타이드 화합물과 실시예 2-3-2의 amine-PEG-RNA 구조체의 PEG의 아민기와 펩타이드의 카르복실기의 결합반응은 BOP(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate, Sigma Aldrich, 미국) 와 HOBT(1-Hydroxybenzotriazole, Sigma Aldrich, 미국)의 조건에서 수행되었다. 상기 결합 반응이 진행된 후 보호기의 제거를 위해 피페리딘(Piperidine, Sigma Aldrich, 미국)으로 처리하여 5′펩타이드-PEG-이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하였다.
실시예 2-4. 5′C 24 -RNA 구조체의 제조
실시예 2-3의 5′리간드가 결합된 PEG-이중나선 올리고 RNA 구조체 서열과 상보적인 서열의 RNA 구조체는 실시예 2-1의 RNA 합성 방법을 통해 합성한 뒤, 이황화 결합이 포함되어 있는 탄소 수 24개의 테트라도코산(tetradocosane) 시약을 이용하여 일반적인 RNA 합성과정을 통해 C24를 RNA 구조체에 포스포디에스터 결합으로 결합하여 5′C24-RNA 구조체를 합성하였다(도 11 참조).
실시예 2-5. 회수반응 및 어닐링(annealing)
실시예 2-1, 2-2, 2-3 및 2-4에서 합성된 RNA 단일가닥들은 60 ℃의 온탕기(water bath)에서 28 % (v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 합성된 RNA 및 RNA 구조체를 CPG로부터 떼어낸 뒤, 탈보호(deprotection)반응을 통해 보호 잔기를 제거하였다. 보호 잔기가 제거된 5′말단에 리간드가 결합된 PEG-이중나선 올리고 RNA 구조체 및 5′C24-이중나선 올리고 RNA 구조체는 70 ℃의 오븐에서 N-메틸피롤리돈(N-methylpyrolidon), 트리에틸아민(triethylamine) 및 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드(triethylamine trihydrofluoride) 는 10:3:4의 부피비율로 처리하여 2′TBDMS(tert-butyldimethylsilyl)를 제거하였다.
상기 반응물들을 고속 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)로 RNA를 분리 정제 하고, 이를 MALDI-TOF 질량 분석기(MALDI-TOF MS, SHIMADZU, 일본)로 분자량을 측정하여, 목적하는 염기서열 및 이중나선 올리고 RNA 구조체와 부합하는지 확인하였다.
그 후, 각각의 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하기 위하여 리간드가 결합된 PEG-RNA 센스 RNA와 안티센스 RNA를 동량 혼합하여 1X 어닐링 버퍼(30 mM HEPES, 100 mM Potassium acetate, 2 mM Magnesium acetate, pH 7.0∼7.5)에 넣고, 90 ℃ 항온수조에서 3분 반응시킨 후 다시 37 ℃에서 반응시켜, 목적하는 각각의 이중가닥 5´ 말단에 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하였다. 제조된 5´ 말단에 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체는 전기영동을 통하여 어닐링을 확인하였다.
실시예3. 3′말단에 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조
아민(amine)-CPG 에 PEG 포스포아미디트 시약을 이용하여 3′아민(amine)-PEG-RNA의 형태로 합성된 후, 실시예 1-2의 NHS-Folate와 같이 NHS-리간드 형태로 구성된 결합 가능한 리간드 물질과 에스터(ester)반응을 통해 3′말단에 리간드가 결합된 PEG-이중나선 올리고 RNA 구조체를 합성할 수 있다. 합성된 3′말단에 리간드가 결합된 PEG-이중나선 올리고 RNA 구조체는 소수성 물질인 C24가 결합되어 3′말단에 리간드가 결합된 PEG-RNA-C24를 형성하게 되며, 이는 상보적인 서열의 RNA와 어닐링(annealing)되어 3′말단에 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체로 합성된다.
실시예 3-1. 3′아민(amine)-PEG-RNA 구조체의 제조
아민(amine)-CPG에 폴리에틸렌 글리콜 포스포아미디트 시약을 이용하여 일반적인 RNA 합성과정을 통해 3′CPG-amine-PEG로 합성되었다. 3′CPG-amine-PEG는 실시예 2-1의 RNA 합성과정을 통해 원하는 서열의 RNA 를 가진 3′CPG-amine-PEG-RNA 구조체로 합성되었다 (도 12 참조).
실시예 3-2. 3′아민(amine)-PEG RNA-C 24 구조체의 제조
실시예 3-1에서 합성된 3′CPG-amine-PEG-RNA 구조체는 이황화 결합이 포함되어 있는 탄소 수 24개의 테트라도코산(tetradocosane) 시약을 이용하여 일반적인 RNA 합성과정을 통해 C24를 RNA에 포스포디에스터 결합하여 구조체를 합성하였다 (도 13 참조).
실시예 3-3. 3′말단에 리간드가 결합된 PEG RNA-C 24 구조체의 제조
실시예 3-2에서 합성된 3′아민(amine)-PEG-RNA-C24구조체는 60 ℃의 온탕기(water bath)에서 28 % 암모니아(ammonia)를 처리하여 합성된 3′아민(amine)-PEG-이중나선 올리고 RNA 구조체 및 3′아민(amine)-PEG-RNA-C24 구조체를 CPG로부터 떼어낸 뒤, 탈보호(deprotection)반응을 통해 보호 잔기를 제거하였다. 보호 잔기가 제거된 3′아민(amine)-PEG-RNA-C24구조체는 70 ℃의 오븐에서 N-메틸피롤리돈(N-methylpyrolidon), 트리에틸아민(triethylamine) 및 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드(triethylamine trihydrofluoride) 는 10:3:4의 부피비율로 처리하여 2′TBDMS(tert-butyldimethylsilyl)를 제거하였다. 분리된 3′아민(amine)-PEG-RNA-C24 구조체는 NHS-리간드 형태로 구성된 결합 가능한 리간드 물질과 에스터(ester)반응을 통해 3′말단에 리간드가 결합된 PEG-RNA-C24구조체로 합성되었다.
실시예 3-3-1. 3′Folate-PEG-RNA 구조체의 제조
실시예 3-2에서 합성된 3′아민(amine)-PEG-RNA-C24 구조체는 실시예 1-2에서 합성된 NHS-Folate와 에스터(ester)반응을 통해 3′Folate-PEG-RNA-C24구조체를 합성하였다(도 14 참조).
실시예 3-4. 상보적인 서열의 RNA 구조체의 제조
실시예 3-3의 3′말단에 리간드가 결합된 PEG-RNA-C24 서열과 상보적인 서열의 RNA 단일가닥은 실시예 2-1의 RNA합성 방법을 통해 합성하였다. 합성된 RNA 단일가닥들은 60 ℃의 온탕기(water bath)에서 28 % 암모니아(ammonia)를 처리하여 합성된 RNA 를 CPG로부터 떼어낸 뒤, 탈보호(deprotection)반응을 통해 보호 잔기를 제거하였다. 보호 잔기가 제거된 RNA는 70 ℃의 오븐에서 N-메틸피롤리돈(N-methylpyrolidon), 트리에틸아민(triethylamine) 및 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드(triethylamine trihydrofluoride) 는 10:3:4의 부피비율로 처리하여 2′TBDMS(2′tert-butyldimethylsilyl)를 제거하였다.
실시예 3-5. 어닐링(annealing)
상기 반응물들을 고속 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)(LC-20A Prominence, SHIMADZU, 일본)로 RNA 및 3′리간드가 결합된 PEG RNA-C24 구조체를 분리정제하고, 이를 MALDI-TOF 질량분석기(MALDI TOF-MS, SHIMADZU, 일본)로 분자량을 측정하여, 합성하고자 하는 염기서열 및 3′말단에 리간드가 결합된 PEG RNA-C24 구조체와 부합하는지 확인하였다.
그 후, 각각의 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하기 위하여 리간드가 결합된 PEG-RNA 센스 RNA와 안티센스 RNA를 동량 혼합하여 1X 어닐링 버퍼(30 mM HEPES, 100 mM Potassium acetate, 2 mM Magnesium acetate, pH 7.0∼7.5)에 넣고, 90 ℃ 항온수조에서 3분 반응시킨 후 다시 37 ℃에서 반응시켜, 목적하는 각각의 이중가닥 3′말단에 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하였다. 제조된 3′말단에 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체는 전기영동을 통하여 어닐링을 확인하였다.
실시예 4. 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 나노입자 형성
실시예 2 및 3에서 합성된 5′말단에 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 3′말단에 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체는 이중나선 올리고 RNA의 말단에 결합된 소수성 물질 간의 소수성 상호작용에 의하여 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자, 즉 미셀(micelle)을 형성하게 된다(도 1 참조). 실시예 2에서 합성된 5′Folate-리간드-이중나선 올리고 RNA 구조체로 구성된 나노입자 크기 및 임계 미셀 농도(critical micelle concentration, CMC), 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM) 분석을 통해 나노입자의 형성을 확인하였다.
실시예 4-1. 5′Folate-이중나선 올리고 RNA 구조체의 입자크기 측정
제타 전위 측정기(zeta-potential measurement)를 통하여 상기 나노입자의 크기를 측정하였다. 구체적으로, 상기 5′Folate-이중나선 올리고 RNA 구조체를 1.5 ㎖ DPBS(Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline)에 50 ㎍/㎖ 의 농도로 녹인 뒤, 초음파 분산기(Wiseclean, DAIHAN, 한국)로 나노입자의 크기를 균질화(700 W; 진폭(amplitude) 20 %)하였다. 균질화된 나노입자는 제타 전위 측정기(Nano-ZS, MALVERN, 영국)로 크기를 측정하였는데, 물질에 대한 굴절률(Refractive index)은 1.459, 흡수율(Absorption index)은 0.001로 하고, 용매인 PBS(phosphate buffered salian)의 온도 25 ℃ 및 그에 따른 점성도(viscosity)는 1.0200 및 굴절률은 1.335의 값을 입력하여 측정하였다. 1회 측정은 20번 반복으로 구성된 크기 측정으로 이루어졌고, 이를 3회 반복하였다.
엽산(Folate)이 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자(Folate-SAMiRNA)의 경우 약 100 내지 200nm의 크기를 가지는 것이 확인되었다. 다분산지수(polydisperse index, PDI)는 낮을수록 해당 입자가 고르게 분포하고 있음을 판단할 수 있는 수치로 Folate-SAMiRNA의 PDI 값은 0.4 미만으로 측정되어, 비교적 균일한 크기의 나노입자를 형성함을 알 수 있었다. 상기 구조체로 구성된 나노입자의 크기는 내포작용(endocytosis)을 통해 세포 내로 섭취되기에 적절한 크기임을 확인하였다(Nanotoxicology: nanoparticles reconstruct lipids.Nat Nanotechnol. 2009 Feb;4(2):84-5).
실시예 4-2. 이중나선 올리고 RNA 구조체의 임계 미셀 농도 측정
단일 분자에 친유기와 친수기가 함께 들어있는 양친매성(amphiphile) 물질은 계면활성제가 될 수 있는데, 계면활성제는 수용액에 용해되면 소수성 부분은 물과의 접촉을 피하기 위해 가운데로 모이고 친수성 부분은 바깥쪽으로 향하여 미셀을 형성하게 된다. 이때, 최초로 미셀을 형성하게 되는 농도를 임계 미셀 농도(critical micelle concentration, CMC)라고 한다. 형광 염료를 이용하여 CMC를 측정하는 방법은 미셀이 형성되기 전/후에 형광염료의 형광값(intensity) 그래프 곡선의 기울기가 급격하게 변하는 특성에 근거한 것이다.
엽산(Folate)이 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자(Folate-SAMiRNA)의 임계 미셀 농도 측정을 위하여 형광염료인 0.04 mM DPH(1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatriene, Sigma Aldrich, 미국)를 준비한다. 실시예 2에서 합성된 5′Folate-이중나선 올리고 RNA 구조체 1 nmole/㎕를 0.0977 ㎍/㎖에서 최고 50 ㎍/㎖의 농도로 DPBS로 단계별로 희석하여, 총 180 ㎕의 5´ Folate-이중나선 올리고 RNA 구조체시료를 준비한다. 준비된 시료에 0.04 mM DPH와 대조군으로 쓰일 DPH의 용매인 메탄올을 각각 20 ㎕씩 첨가하여 잘 섞어준 뒤, 실시예 4-1과 동일한 방법으로 초음파 분산기(Wiseclean, DAIHAN, 한국)를 통해 나노입자의 크기를 균질화(700 W; 진폭(amplitude) 20 %)하였다. 균질화된 시료는 빛을 차단된 상온 조건에서 약 24 시간 반응 시킨 뒤, 형광값(excitation: 355 nm, emission: 428 nm, top read)을 측정하였다. 측정된 형광값들은 상대적인 형광값을 확인하는 것이기 때문에 동일 농도에서 상대적인 형광값([DPH 포함된 시료의 형광값]-[메탄올만 포함된 시료의 형광값])을 구하여(Y축) 처리한 5′Folate-이중나선 올리고 RNA 구조체 농도의 log 값(X축)에 대한 그래프로 도시하였다(도 2 (B)참조).
각 농도 별 측정된 형광값은 저 농도 구간에서 고농도 구간으로 이동하면서 급격하게 증가하게 되는데, 이렇게 급격하게 증가하는 지점의 농도가 CMC농도가 된다. 따라서 형광 량이 증가하지 않는 저 농도 구간과 형광 량이 증가한 고농도 구간을 몇 지점으로 구분하여 추세선을 그리고, 두 추세선이 만나는 교차점의 X 값이 CMC농도가 된다(도 14, (B)).측정된 Folate-이중나선 올리고 RNA 구조체의 CMC가 1.33 ㎍/㎖로 매우 낮게 형성됨이 관찰되었으며, 이로써 Folate-SAMiRNA가 매우 낮은 농도에서도 미셀을 잘 형성할 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 4-3. 이중나선 올리고 RNA 구조체의 투과전자현미경 관찰
Folate-이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자가 형성된 형태를 확인하기 위해 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM)을 통해 관찰하였다.
구체적으로 Folate-이중나선 올리고 RNA 구조체를 DPBS(Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline)에 최종 100 ng/㎖의 농도로 녹인 뒤, 초음파 분산기(Wiseclean, DAIHAN, 한국)로 나노입자의 크기를 균질화(700 W; 진폭(amplitude) 20 %)하였다. Folate-이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자는 전자밀도가 높은 물질로 음성염색(negative staining)을 통해 관찰하였다. 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM)을 통해 관찰된 나노입자는 실시예 4-1에서 측정된 나노입자의 크기와 유사한 정도로 나노입자가 잘 형성되었음이 확인되었다.
실시예 5. 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 in vitro delivery
실시예 2에서 합성된 5′엽산(Folate)-이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자(Folate-SAMiRNA)의 in vitro 조건에서의 개선된 이중나선 올리고 RNA의 효능을 확인하기 위해, 엽산 수용체(Folate receptor)가 과발현 되는 세포주인 KB 세포주를 엽산(Folate)이 존재하는 조건 유무에 따라 형질주입(transfection) 물질이 없는 상태에서 처리하여 결합된 리간드에 따른 개선된 SAMiRNA의 전달 효율 및 타겟 유전자의 발현저해 효과를 확인하였다.
실시예 5-1. 종양 세포주의 배양
미국 종균협회(American type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 구강 상피암 세포(KB)주는 엽산(Folate)을 포함하지 않는 RPMI-1640 배양배지(Gibco, 미국)에 10 %(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100 units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고 37 ℃, 5 %(v/v) CO2의 조건하에 배양하였다.
실시예 5-2. Folate-SAMiRNA을 통한 종양세포주의 형질전환
상기 실시예 5-1에서 배양된 종양 세포주(1.3 × 105/웰)를 상기 실시예의 5-1 조건으로 6-웰 플레이트에서 18시간 동안 엽산(Folate)을 포함하지 않는RPMI-1640 배양배지에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰당 동량의 Opti-MEM 배지를 분주하였다.
타겟 유전자인 서바이빈의 발현을 저해하는 이중나선 올리고 RNA 서열인 서열번호 1번을 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자(SAMiRNA-Sur), 대조군 서열의 서열번호 2번을 포함하는 이중나선 올리고 RNA-고분자 구조체로 이루어진 나노입자(SAMiRNA-Con) 및 서열번호 1번을 포함하는 엽산(Folate) 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자(Folate-SAMiRNA-Sur)는 실시예 4-1에서 동일한 방법인 50 ㎍/㎖의 농도로 DPBS에 첨가하여, 고주파음에 의한 분해(sonication)를 통하여 각 구조체들로 구성된 나노입자들을 균등화하여 제조하였다.
Opti-MEM 배지에 엽산(Folate)이 과량 존재하는 조건을 형성하기 위해 추가적으로 엽산(Folate)을 넣어 최종 1 mM의 엽산(Folate)을 포함하는 조건 및 엽산(Folate)을 추가적으로 넣어주지 않은 조건을 형성한 후, 200 nM의 농도로 시료들을 처리하고, 37 ℃, 5 %(v/v) CO2의 조건하에 총 48 시간 동안 배양하였다.
실시예 5-3. 서바이빈 유전자의 mRNA 상대적 정량 분석
상기 실시예 5-2에서 형질주입(transfection)된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 뒤, 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 통하여 서바이빈의 mRNA 발현량을 대한민국 공개특허 공보 제2009-0042297호의 방법에 따라서 상대 정량 하였다.
SAMiRNA-Con은 대조군 서열인 서열번호 2번의 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자를 처리한 실험군이며, SAMiRNA-Sur는 서바이빈 서열인 서열번호 1번으로 이루어진 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자를 처리한 실험군이다. Folate-SAMiRNA-Sur는 서바이빈 서열인 서열번호 1번으로 이루어진 엽산(Folate)리간드가 결합된 형태의 엽산(Folate)-이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자를 처리한 실험군이다.
타겟 mRNA 발현저해 정도는 SAMiRNA-Con을 처리한 시료의 타겟 유전자 발현량에 대한SAMiRNA-Sur 및 Folate-SAMiRNA-Sur를 처리한 시료의 타겟 유전자 발현량으로 상대적인 정량법(Comparative Quantitation)을 통해 계산되었다(도 16 참조).
배지에 엽산(Folate)이 과량 존재하는 조건의 경우 KB 세포주의 엽산 수용체(Folate Receptor)가 과량의 엽산(Folate)에 의해 포화되어 SAMiRNA에 결합되어 있는 엽산(Folate) 리간드에 의한 세포 내재화 촉진이 저해되는 효과(masking effect)를 가지게 되며, 이는 SAMiRNA 의 세포 전달효율에 영향을 끼쳐 타겟 유전자의 mRNA 발현 저해에 결정적인 역할을 할 것으로 예상되었다.
SAMiRNA-Sur를 처리한 경우, 엽산(Folate)의 존재 유무와 타겟 유전자의 발현 저해효율의 차이가 크지 않았지만, 엽산(Folate)-SAMiRNA-Sur를 처리한 경우 엽산(Folate)이 존재하지 않는 조건에서 엽산(Folate)이 과량 존재하는 경우에 비해 약 2배의 개선된 타겟 유전자 발현 저해를 확인할 수 있었다. 즉, 엽산(Folate)이 과량 존재하는 조건의 경우 엽산(Folate) 리간드 결합에 따른 타겟 유전자 발현 저해 효과의 변화가 관찰되지 않았지만, 엽산(Folate)이 존재하지 않는 조건의 경우, 엽산(Folate) 리간드 결합에 따른 타겟 유전자 발현저해 효과의 증진이 확인되었다.
따라서 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자의 경우 해당 리간드 수용체가 과발현 되어 있는 세포에서 개선된 전달효율 및 타겟 유전자 발현저해 효능 증가를 가짐을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 생체 내( in vivo ) 전달
실시예 2에서 합성된 5′엽산(Folate)-이중나선 올리고 RNA 구조체로 구성된 나노입자(Folate-SAMiRNA)의 생체 내(in vivo) 조건에서의 이중나선 올리고 RNA의 효능을 확인하기 위해, 엽산 수용체(Folate receptor)가 과발현 되는 세포주인 KB 세포주로 이루어진 종양을 가진 쥐에 투여하여, 전달된 Folate-SAMiRNA 및 SAMiRNA의 종양조직 내에 타겟 유전자의 발현저해 효과를 확인하였다.
실시예 6-1. KB xenograft model의 준비
실시예 5-1에서 배양된 KB 세포주를 1 X 106 씩 5주령 누드마우스(BALB/C nu)의 피하조직에 투여(Subcutenous injection)하였다. 투여 후 2일 간격으로 종양 장축 및 단축의 길이를 측정하여 종양의 성장을 관찰하고, 투여 후 2주 경과한 시점에서 약 150 내지 200 mm3 가량으로 종양이 성장하였음을 확인하였다.
실시예 6-2. 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 투여
실시예 6-1에서 준비된 KB xenograft model에 실시예 2에서 합성된 서열번호 1번을 포함하는 5′Folate-이중나선 올리고 RNA 구조체와 리간드가 결합되지 않은 이중나선 올리고 RNA 구조체를 실시예 4-1 과 동일한 방법으로 초음파 분산기를 통해 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자를 균질화 하였다. 균질화된 나노입자는 5 mg/kg 체중(bodyweight)의 양으로 미 정맥(tail vein) 투여를 통해 KB xenograft model에 단 회 투여하였고(n=4), 투여 후 48 시간 또는 72 시간이 경과한 시점에서 종양조직을 채취하였다. 채취된 종양조직은 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 뒤, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 통하여 서바이빈 mRNA의 발현량을 대한민국 공개특허 공보 2009-0042297호의 방법으로 상대 정량 하였다 (도 17 참조).
PBS는 음성 대조군으로 나노입자가 포함되지 않은 용매만을 투여한 실험군, SAMiRNA는 리간드가 결합되지 않은 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자가 투여된 실험군이며, Folate-SAMiRNA는 엽산(Folate) 리간드가 결합된 5′Folate-이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자가 투여된 실험군이다.
48시간이 경과한 시점에 비하여 72 시간이 경과한 시점에서 SAMiRNA에 의한 타겟 유전자 발현 저해효과가 두드러졌는데, 48 시간이 경과한 시점에서 타겟 유전자의 발현저해 정도를 비교하여 보면 리간드가 결합된 구조체(Folate-SAMiRNA)가 투여된 경우 160 %의 개선된 효율을 나타내었으며, 72시간이 경과한 시점에서도 120 % 개선된 효율을 나타내었다.
따라서 Folate 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체가 생체 내(in vivo)에서 타겟 장기인 엽산 수용체(Folate receptor)가 과발현 되는 종양 조직으로 빠르게 전달되어 개선된 이중나선 올리고 RNA효과를 나타내었으며, 해당 효과는 시간이 경과하여도 유지가 됨을 확인할 수 있었다.

Claims (20)

  1. 하기 식(1)의 구조를 갖는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체.
    L-A-X-R-Y-B 식 (1)
    (식(1)에서 A는 친수성 물질이고, B는 소수성 물질이며; X와 Y는 서로 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며; R은 치료용 약물이고; L은 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진 시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드(ligand)를 의미한다)
  2. 제 1항에 있어서,
    치료용 약물은 이중나선 올리고 RNA 또는 항암제인 것을 특징으로 하는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  3. 제 1항에 있어서,
    리간드(ligand)는 타겟 특이적으로 결합하여 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 하는 타겟(target) 특이적 항체, 앱타머(aptamer), 펩타이드 또는 수용체 특이적 화학물질로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 수용체 특이적 화학물질은 엽산(Folate), N-아세틸 갈락토사민, 만노스 (mannose)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  5. 제 2항에 있어서,
    상기 이중나선 올리고 RNA는 19 내지 31 개의 뉴클레오티드로 구성되는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 소수성 물질의 분자량은 250 내지 1,000인 것을 특징으로 하는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 소수성 물질은 스테로이드(steroid) 유도체, 글리세라이드(glyceride) 유도체, 글리세롤 에테르(glycerol ether), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), C12 내지 C50의 불포화 또는 포화 탄화수소(hydrocarbon), 디아실포스파티딜콜린(diacyl phosphatidylcholine), 지방산(fatty acid), 인지질(phospholipid), 리포폴리아민(lipopolyamine)의 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 스테로이드(steroid) 유도체는 콜레스테롤, 콜리스탄올, 콜산, 콜리스테릴 포르메이트, 코테스타닐 모르메이트 및 콜리스타닐 아민 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 글리세라이드 유도체는 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  10. 제 1항 에 있어서,
    상기 친수성 물질의 분자량은 200 내지 10,000인 것을 특징으로 하는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 친수성 물질은 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone), 및 폴리옥사졸린(polyoxalzoline) 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합인 것을 특징으로 하는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 비분해성 결합은 아미드 결합 또는 인산화 결합인 것을 특징으로 하는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 분해성 결합은 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 및 효소 분해성 결합 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  15. (1) 기능기-친수성 물질이 결합되어있는 고형지지체 기반에 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;
    (2) 상기 기능기-친수성 물질이 결합되어 있는 RNA 단일가닥의 5´ 말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
    (4) 상기 기능기-RNA-고분자 구조체 및 별도로 합성된 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 고형지지체로부터 분리하는 단계;
    (5) 상기 기능기를 통해 리간드를 친수성 물질의 말단에 결합시키는 단계;
    (6) 상기 리간드가 결합된 RNA-고분자 구조체와 상보적 서열의 RNA 단일가닥은 어닐링을 통해 이중가닥을 형성하는 단계; 를 포함하는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조방법.
  16. (1) 고형지지체를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;
    (2) 상기 RNA 단일가닥의 5´ 말단에 친수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
    (3) 상기 RNA 단일가닥에 결합된 친수성 물질에 리간드를 결합시키는 단계;
    (4) 고형지지체로부터 리간드가 결합된 RNA-친수성 고분자 구조체 및 별도로 합성된 상보적 서열의 RNA 소수성 고분자 구조체 단일가닥을 분리하는 단계;
    (5) 상기 리간드가 결합된 RNA-친수성 고분자 구조체와 상보적 서열의 RNA 소수성 고분자 구조체를 어닐링하여 이중가닥을 형성하는 단계;
    를 포함하는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조방법에 있어서,
    (1)내지 (4)단계 중간에 (1)단계의 RNA 단일가닥과 상보적 서열로 이루어진 RNA 단일가닥을 합성한 뒤, 소수성 물질을 공유 결합시켜 소수성 물질이 결합된 형태의 RNA-소수성 고분자 구조체 단일가닥을 합성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  17. (1) 기능기가 결합되어 있는 고형지지체를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;
    (2) 단계 (1)에서 수득된 물질에 친수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
    (3) 단계 (2)에서 수득된 물질에 리간드를 공유결합 시키는 단계;
    (4) 단계 (3)에서 수득된 물질을 고형지지체로부터 분리하는 단계;
    (5) 단계 (4)에서 수득된 물질에 3´ 말단에 결합된 기능기를 통해 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
    (6) 단계 (5)에서 수득된 물질과 상보적 서열의 RNA 단일가닥을 어닐링하여 이중가닥을 형성하는 단계;
    를 포함하는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조방법.
  18. 제 1항 내지 제 14항의 어느 한 항에 따른 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 나노입자.
  19. 제 1항 내지 제 14항의 어느 한 항에 따른 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 약제학적 조성물
  20. 제 18항에 따른 나노입자를 포함하는 약제학적 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20090042297A (ko) 2006-08-24 2009-04-29 알콘 리서치, 리미티드 ＩＯＰ―관련 증상을 치료하기 위한 그렘린의 ＲＮＡｉ 매개 억제
WO2010042823A1 (en) * 2008-10-09 2010-04-15 Northeastern Universtiy Multifunctional self-assembling polymeric nanosystems
WO2010131916A2 (ko) * 2009-05-14 2010-11-18 (주)바이오니아 siRNA 접합체 및 그 제조방법
WO2011054939A2 (en) * 2009-11-09 2011-05-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods for inhibiting expression of kif10 genes

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090042297A (ko) 2006-08-24 2009-04-29 알콘 리서치, 리미티드 ＩＯＰ―관련 증상을 치료하기 위한 그렘린의 ＲＮＡｉ 매개 억제
WO2010042823A1 (en) * 2008-10-09 2010-04-15 Northeastern Universtiy Multifunctional self-assembling polymeric nanosystems
WO2010131916A2 (ko) * 2009-05-14 2010-11-18 (주)바이오니아 siRNA 접합체 및 그 제조방법
WO2011054939A2 (en) * 2009-11-09 2011-05-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Compositions and methods for inhibiting expression of kif10 genes

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