KR20130085004A - 자성나노입자-SAMiRNA 복합체 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이중나선 올리고 RNA 및 자성나노입자를 세포 내로 효율적으로 전달할 수 있는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체 및 이를 포함하는 암 등의 질병의 진단과 치료를 동시에 수행할 수 있는 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 이중나선 올리고 RNA와 친수성 물질 및 제2소수성 물질을 단순 공유 결합 또는 링커 매개(linker mediated) 공유결합으로 연결시킨 이중나선 올리고 RNA-고분자 구조체와 제1소수성 물질이 자성물질의 표면에 결합된 자성나노입자가 핵(core)으로 이루어진 SAMiRNA-자성나노입자 복합체에 관한 것이다.
본 발명의 제1소수성 물질은 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제2소수성 물질과 소수성 상호작용을 수행하여 균질한 크기의 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 형성하도록 한다.
또한, 이중나선 올리고 RNA 구조체에 결합된 친수성 물질 및 제2소수성 물질은 이중나선 올리고 RNA의 생체 내 안정성을 향상시키며, 추가적으로 결합된 리간드(ligand)는 비교적 낮은 농도의 투여량에서도 타겟 세포에 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 전달할 수 있도록 하고, 자성나노입자의 자성물질은 진단을 위한 조영제로 사용될 수 있다.

Description

자성나노입자-SAMiRNA 복합체 및 그 제조방법 {Magnetic nanoparticles-SAMiRNA complex and method of preparing the same}
본 발명은 암 및 감염성 질병 등의 치료에 유용하게 사용될 수 있는 이중나선 올리고 RNA의 전달을 향상시킬 수 있도록 친수성 및 소수성 물질이 결합되어 있는 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자인 SAMiRNA와 진단에 사용되는 자성나노입자로 이루어진 SAMiRNA-자성나노입자 복합체, 이러한 복합체를 제조하는 방법 및 상기 복합체를 이용한 이중나선 올리고 RNA의 전달 및 암과 감염성 질병을 포함하는 질병의 치료 및/또는 진단 기술에 관한 것이다.
진단 및 치료는 질병의 임상 적용에서 두 가지 주요 범주이며, 최근에 항암제에 영상 기능을 활용한 진단(diagnosis)과 치료(therapy)를 동시에 수행하는 기술인 테라그노시스(theragnosis)라는 개념이 도입되었다. 성공적인 테라그노시스(theragnosis)를 위해서는 조영제(imaging agent)와 약물(drug)이 목표 질병 부위에 효과적으로 전달되어야 한다. 약물 전달(drug delivery) 과정에서 타겟 질병 부위에 약효를 나타낼 수 있을 정도로 약물이 전달되지 않아 임상치료에서 실효를 거두지 못하는 경우가 많은데, 심각한 경우 약물이 체내로 투여(administration)되어 약물이 해당 조직(tissue)이 아닌, 정상 조직에 전달되어 중증의 부작용(severe side effect)을 유발하기도 한다. 또한, 조영제(imaging agent)가 목표 부위 특이적으로 전달이 되어야 해당 질병의 진단이 가능해지므로, 이러한 약물 및 조영제를 목표부위로 효과적으로 전달하는 방법이 요구된다(Acc. Chem. Res., 2011, 44 (10), pp 1018-1028). 영상촬영(imaging modality)에는 형광(fluorescence optical imaging), 자기공명영상(Magnetic Resonance Imaging; MRI), 양전자 단층촬영(Positron-Emission Tomography PET) 및 컴퓨터 단층촬영(Computed Tomography; CT) 등이 활용되고 있으며, 상기의 영상촬영 기기에 사용되는 조영제(imaging agent)가 다양하게 개발되어 왔다. 특히, 질병의 진단 및 치료 측면에서 볼 때 자성나노입자는 독성이 없고, 생체 적합성(biocompatibility)이 우수하며 혈관을 통한 주사가 가능할 뿐만 아니라 인체조직(tissue)내에 높은 함량을 축적시킬 수 있다는 장점이 있다(김태억, 나노바이오테크놀러지, 생명공학정책연구센터, 2009).
나노-바이오 분야에서 자성나노입자들은 생체 물질의 분리, 자기공명 영상 진단 조영제, 거대자기저항센서(Giant Magneto Resistive Sensor)를 포함한 바이오센서, 약물/유전자 전달, 및 자성 고온치료 등의 넓은 응용범위에 걸쳐 사용되고 있다. 구체적으로 자성나노입자는 분자 자기공명영상의 진단을 위한 조영제로 사용될 수 있다. 자성나노입자는 나노입자 주변의 물 분자의 수소원자의 스핀-스핀 이완시간을 단축시켜 자기공명영상 신호를 증폭시키는 효과를 나타내 지금까지 공명 영상 진단에 널리 사용되고 있다. 또한, 자성나노입자는 약물 또는 유전자의 전달을 통한 생체 치료에도 사용될 수 있다. 자성나노입자에 화학적인 결합 또는 흡착을 통해 약물 또는 유전자를 싣고 외부 자기장을 이용하여 원하는 위치로 이동시켜 특정 부위에 약물 및 유전자를 방출을 가능하게 하여 선택적인 치료효과를 가져올 수 있게 한다(대한민국 공개특허 공보 제0819378호 참조). 현재 자성나노입자를 이용해서 약물을 전달하는 수단으로 자성 리포좀(magnetic liposome)이 가장 유력한 도구로 떠오르고 있다. 자성 리포좀은 자성나노입자가 인지질 층으로 둘러싸인 리포좀 속에 들어있는 형태로, 리포좀 안에 치료용 약물이나 유전자 등을 포함시켜 특정 부위에 전달할 수 있다는 장점이 있다(Toshihiro Matsuo et al., J. Biomedical Materials Research Part A, 66A(4): 747 - 754, 2003). 또한 리포좀 표면을 화학적으로 처리해서 특정 조직을 추적할 수 있는 기능을 갖게 할 수도 있다. 최근 자성리포좀이 암세포를 효과적으로 추적하기 위해서 생체 조직 내에 흡착 및 축척 특성을 증진시키는 자성 양이온 리포좀(MCL, magnetic cationic liposome)이 개발되었다(XiaoliZhenget al., International J. Pharmaceutics, 366:211-217, 2009) 하지만 여전히 생체 적합성 및 안정성이 증진된 안정정인 형태의 자성나노입자가 요구되고 있다. 또한, 나노입자를 생체 내로 주입할 경우, 혈액 속에서 응집되지 않고 잘 분산되어 적당한 시간 동안 순환할 수 있는 특성(long circulating property)이 요구된다. 그러나 나노입자는 표면적이 크기 때문에 다양한 혈장 단백질 및 염 등이 잘 달라붙는 생물결합(biofouling) 현상 때문에 응집이 잘 일어나 간의 쿠퍼(Kuffer) 세포나 비장의 대식세포(macrophage)와 같은 망상내피세포(reticuloendothlial system, RES)에 의해 쉽게 제거될 수 있다. 따라서 나노입자를 몸속에 투여한 후 수 분 이내에 혈액에서 없어지게 되어 원하는 조직(tissue)에 도달할 수 없게 만든다. 또한 산화철 나노입자의 경우, 생체 내에서 충분히 안정적이지 않으면 본래의 구조가 변하여 자기(磁氣)적 특성이 변하거나 빠르게 생분해가 일어날 수 있다. 따라서 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 같은 고분자를 이용하여 나노입자 표면을 코팅 처리하여 생체 적합성 및 안정성을 증가시키는 기술이 연구되고 있다 (고분자과학과 기술. 제 19권 2호. 2008. 116-124).
한편, siRNA는 동물세포에서 특정 유전자의 발현을 저해시키는데 탁월한 효과를 나타내는 것으로 밝혀져 유전자 치료제로 각광을 받고 있고, 이들의 높은 활성과 정밀한 유전자 선택성으로 인해 지난 20년간 연구되어 현재 치료제로 활용 중인 안티센스 올리고뉴클레오티드(ODN)를 대체할 치료제로 기대되고 있다(Dana J. Gary et al. Journal of Controlled Release 121:64-73, 2007).
특히 치료를 목적으로 이용되는 siRNA 기법은 다른 의약품에 비하여 쉽게 디자인이 가능하고, 높은 목표 선택성과 특정 유전자의 발현을 효과적으로 저해하는 특징을 갖기 때문에 큰 장점을 가지며, siRNA 등의 RNAi에 의한 유전자 발현 억제는 생체 내에서 자연적으로 존재하는 기작을 이용하는 것이므로 독성이 낮다는 장점 또한 가진다. 또한, 특정 부위에 존재하는 수용체와 결합할 수 있는 물질 및 암세포 등을 죽일 수 있는 약물을 결합시킨 형태의 나노입자는 특정 세포를 타겟하여 약물을 전달할 수 있는 수단이 될 수 있다.
암 등의 질병을 치료하는데 있어서 해결해야 하는 가장 큰 과제는 치료제를 함유한 나노입자를 정확하게 선택적으로 암세포 등의 목표하는 조직으로 전달할 수 있는 적절한 '표적물질(targeting agent)'을 선정해 나노입자에 결합시키는 기술이다. 나노입자에 결합된 표적물질 또는 리간드는 종양세포의 표면에 적절한 방법으로 결합되어 수용체를 작동시켜 나노입자에 포함된 항암물질을 세포 내로 이입(endocytosis)시킬 수 있어야 한다(이준웅, 암 치료를 위한 나노입자와 표적추적시스템, 첨단기술정보분석보고서, 한국과학기술정보연구원, 2004).
최근 siRNA의 세포 내 전달 효율성을 향상시키기 위해, siRNA에 생체 적합성 고분자인 친수성 물질(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG))을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합으로 접합시킨 siRNA 접합체를 통해, siRNA의 안정성 확보 및 효율적인 세포막 투과성을 위한 기술이 개발되었다(대한민국 등록특허 공보 제883471호 참조). 하지만 siRNA에 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 접합시키는 것(PEGylation)만으로는 생체 내에서의 낮은 안정성과 타겟 조직으로의 전달이 원활하지 못하다는 단점은 여전히 남아 있다.
이를 해결하기 위해, 이중나선 올리고 RNA에 친수성 및 소수성 물질이 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체가 개발되었으며, 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체는 소수성 물질의 소수성 상호작용에 의하여 자가조립 나노입자를 형성하게 된다. 상기의 자가조립 나노입자를 'SAMiRNA'라고 지칭한다(대한민국 공개특허공보 제2009-0042297호).
대한민국 공개특허 공보 제 2007-0102672호: 균일한 나노입자의 새로운 대량 생산 방법. 공개일자 2007년10월19일, 출원인: 재단법인 서울대학교산학협력재단 대한민국 공개특허공보 제 2007-0088392호: 양친매성 화합물을 이용한 자성 나노복합체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 대한민국 공개특허공보 2009-0042297호: siRNA 접합체 및 그 제조방법. 공개일자 2010년 11월24일, 출원인 : (주)바이오니아
본 발명의 목적은 치료용으로 이용될 수 있는 이중나선 올리고 RNA에 친수성 및 소수성 물질이 결합되어 있는 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자인 SAMiRNA와, 진단에 사용되는 자성나노입자로 이루어진 SAMiRNA-자성나노입자 복합체 및 이러한 복합체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에서의 이중나선 올리고 RNA 구조체의 친수성 물질에는 타겟 특이적 리간드를 추가로 결합시킴으로써 목표하는 타겟으로의 전달능력을 제고할 수 있다. 상기 SAMiRNA 내의 소수성 물질과 자성나노입자의 자성물질 표면에 코팅된 소수성 물질의 상호작용으로 SAMiRNA-자성나노입자 복합체가 형성될 수 있다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 포함하는 치료 및/또는 진단용 조성물 및 이를 이용한 질병의 치료 및/또는 진단 방법을 제공하는 것으로, 본 발명에 따른 SAMiRNA-자성나노입자 복합체는 암 및 감염성 질환을 포함한 다양한 질환의 치료 및/또는 진단에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 상기 SAMiRNA-자성나노입자 복합체에 있어, SAMiRNA 형성 기술은 이중나선 올리고 RNA 뿐 아니라, 단일나선 올리고뉴클레오티드, 특히 치료목적을 가지는 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)에도 적용될 수 있다.
본 발명은 암 등의 질병의 진단 및 치료를 동시에 수행할 수 있는 새로운 테라그노시스 기술을 제공하기 위해, 제1소수성 물질이 자성물질의 표면에 코팅된 구조를 갖는 자성나노입자 및 이중나선 올리고 RNA에 친수성 물질과 제2소수성 물질을 결합시킨 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 SAMiRNA로 이루어진 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 제공한다.
본 발명에서의 용어 '제1소수성 물질'은 자성나노입자의 자성물질 표면에 코팅된 소수성 물질을 의미하며, '제2소수성 물질'은 SAMiRNA의 이중나선 올리고 RNA 구조체 내에 공유결합 의해 연결되어 포함된 소수성 물질을 의미한다. 뒤에 보다 상세하게 설명하겠지만, 제1소수성 물질과 제2소수성 물질은 서로 동일 또는 유사한 물질일 수도 있고, 서로 상이한 물질일 수도 있다.
본 발명에서 제공되는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체는 가장 안쪽에는 제1소수성 물질이 자성물질의 표면에 코팅되어 있는 자성나노입자가 핵(core)을 이루고 있으며 자성물질의 표면에 코팅된 제1소수성 물질과 이중나선 올리고 RNA 구조체에 포함된 제2소수성 물질이 소수성 상호작용하고 있고(제2소수성 물질은 이중나선 올리고 RNA와 결합되어 있다), 이중나선 올리고 RNA의 다른 쪽 방향인 맨 바깥쪽에 친수성 물질이 이중나선 올리고 RNA에 결합되어 있는 구조를 형성하게 된다. (도 1 참조). 본 발명에서의 '코팅'은 자성물질에 제1소수성 물질이 물리적으로 흡착되거나, 화학적으로 결합되는 것을 모두 포함하는 의미이다.
또한 상기 자성나노입자-SAMiRNA 복합체에 포함된 SAMiRNA 내에서의 친수성 및 소수성 물질과 이중나선 올리고 RNA와의 결합은 바람직하게는 공유결합이지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
SAMiRNA-자성나노입자 복합체의 자성나노입자는 자성물질을 함유하고 있으므로 자기적 성질을 이용한 진단방법에 유용하게 사용될 수 있다. 구체적으로, 자기적 성질을 이용하는 자기공명영상(MRI) 진단법을 포함하는 다양한 진단방법에 적용될 수 있다.
상기 자성나노입자의 자성물질은 직경이 1 nm 내지 200 nm, 바람직하게는 2 nm 내지 100 nm인 입자라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 상기 자성물질은 자성금속 또는 자성금속 산화물인 것을 특징으로 한다.
보다 상세하게는 상기 자성 금속은 철족금속 원소(Fe, Ni, Co), 희토류 원소(La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu), 화폐금속 원소(Cu, Ag, Au), 아연족 원소(Zn, Cd, Hg), 알루미늄족원소(Al, Ga, In, Tl), 알칼리토금속 원소(Ca, Sr, Ba, Ra) 및 백금족 원소(Pt, Pd 등)에서 하나 이상 선택된 금속 또는 이들의 합금으로 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 자성금속 산화물(magnetic metal material)은 철족금속 원소(Fe, Ni, Co), 희토류 원소(La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu), 화폐금속 원소(Cu, Ag, Au), 아연족 원소(Zn, Cd, Hg), 알루미늄족 원소(Al, Ga, In, Tl), 알칼리토금속 원소(Ca, Sr, Ba, Ra) 및 백금족 원소(Pt, Pd 등)에서 하나 이상 선택된 금속의 산화물 또는 이들의 합금의 산화물로 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 자성 물질의 표면에 코팅되어 있는 제1소수성 물질은 본 발명의 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 형성시킬 수 있는 물질이면 어떤 것이라도 제한 없이 사용가능하며, 비제한적인 예로서는 탄소수가 C6 내지 C25인 방향족 화합물, 탄소수가 C6 내지 C25인 에테르, 탄소수가 C6 내지 C25인 지방족 탄화수소 및 탄소수가 C6 내지 C25인 아민일 수 있으며, 나노입자 복합체의 형성을 고려할 때 포화 또는 불포화 지방산 및/또는 알킬아민을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서의 SAMiRNA를 구성하는 이중나선 올리고 RNA 구조체는 하기 식(1)의 구조를 가진다.
A-X-R-Y-B 식(1)
상기 식(1)에서 A와 B중 하나는 친수성 물질이며, 다른 하나는 제2소수성 물질이고; R은 이중나선 올리고 RNA이며; X와 Y는 바람직하게는 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이지만, 이에 한정되지는 않는다.
특히, 본 발명에서의 SAMiRNA를 구성하는 이중나선 올리고 RNA 구조체는 하기 식(1')의 구조를 가지는 것이 바람직하다.
Figure pat00001
상기 식(1')에서 A와 B중 하나는 친수성 물질이며, 다른 하나는 제2소수성 물질이고; X와 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며; S는 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥, AS는 이중나선 올리고 RNA의 안티센스가닥을 의미한다)
또한, 본 발명에서의 SAMiRNA를 구성하는 이중나선 올리고 RNA 구조체의 친수성 물질에 타겟 특이적 리간드(ligand)를 추가로 결합시킴으로써 목표하는 타겟으로의 전달능력을 제고할 수 있다.
본 발명에서의 리간드는 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 물질을 모두 포함하는 의미이며, 특히 타겟 특이적으로 결합하여 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 하는 타겟(target) 특이적 항체, 앱타머(aptamer), 펩타이드 또는 수용체 특이적 화학물질로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 또한 상기 수용체 특이적 화학물질은 엽산(Folate), N-아세틸 갈락토사민, 만노스(mannose)에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 한정되지 않는다.
상기 리간드 등의 물질을 결합시키기 위하여, 이중나선 올리고 RNA 구조체의 친수성 물질은 리간드 등의 물질과의 결합에 필요한 기능기를 갖도록 변형되어도 무방하다. 상기 친수성 물질 중에서도 특히, PEG(polyethylene glycol)는 다양한 분자량과 기능기를 도입할 수 있으며, 생체 내 친화성이 좋고 면역반응을 유도하지 않는 등 생체 적합성(bio-compatibility)이 우수하며, 이중나선 올리고 RNA의 생체 내에서의 안정성을 증가시키고, 전달 효율을 증가 시키므로 본 발명의 구조체의 제조에 매우 적합하다
본 발명의 이중나선 올리고 RNA 구조체에 있어서, 상기 이중나선 올리고 RNA는 19 내지 31 개의 뉴클레오티드로 구성되는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용 가능한 이중나선 올리고 RNA는 유전자 치료용 또는 연구용으로 사용되거나 사용될 가능성이 있는 어떠한 유전자 유래, 즉 그러한 유전자에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 이중나선 올리고 RNA가 채택될 수 있다.
상기 공유결합은 비 분해성 결합 또는 분해성 결합 중 어느 것이어도 무방하다. 이때, 비 분해성 결합으로는 아미드 결합(amide bond)또는 인산화 결합(phosphate bond)이 있고, 분해성 결합으로는 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합 등이 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 제2소수성 물질은 본 발명의 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 형성시킬 수 있는 물질이면 어떤 것이라도 제한없이 사용가능하며, 분자량 100 내지 2,000인 것이 바람직한데, 특히 스테로이드(steroid) 유도체, 글리세라이드(glyceride) 유도체, 글리세롤 에테르(glycerol ether), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), C12 내지 C50의 불포화 또는 포화 탄화수소(hydrocarbon), 디아실포스파티딜콜린(diacylphosphatidylcholine), 지방산(fatty acid), 인지질(phospholipid), 리포폴리아민(lipopolyamine) 등이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 목적에 부합하는 것이라면 어떠한 제2소수성 물질도 사용 가능하다는 점은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.
특히, 상기 스테로이드(steroid) 유도체는 콜레스테롤, 콜리스탄올, 콜산, 콜리스테릴포르메이트, 코테스타닐모르메이트 및 콜리스타닐아민으로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있으며, 상기 글리세라이드 유도체는 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드 등에서 선택될 수 있는데 이때, 글리세라이드의 지방산은 C12 내지 C50의 불포화 또는 포화 지방산임을 특징으로 한다.
상기 제2소수성 물질은 제1소수성 물질과의 소수성 상호작용을 일으키며, 상기의 소수성 상호작용은 자성나노입자와 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 형성하게 하는 역할을 수행하며, 상기 제1소수성 물질과 제2소수성 물질은 서로 동일하거나 또는 서로 다른 물질이어도 무방하다.
또한, 상기 친수성 물질은 분자량 1,000 내지 10,000인 비 이온성 고분자 유래인 것이 바람직하다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone), 폴리옥사졸린(polyoxazoline) 등의 비이온성 친수성 물질을 사용하는 것이 바람직 하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 설명한 바와 같이 본 발명에서의 이중나선 올리고 RNA 구조체는 이중나선 올리고 RNA의 양 말단에 친수성 물질 및 제2소수성 물질이 결합되어 있는 형태를 가지는데, 일례로, 하기 식(2)와 같이 이중나선 올리고 RNA 센스가닥의 5' 말단에 제2소수성 물질이 결합되고, 3' 말단에 친수성 물질이 결합된 형태의 이중나선 올리고 RNA 구조체가 이용될 수 있다.
Figure pat00002
상기 식(2)에서 A는 제2소수성 물질이며, B는 친수성 물질이고; S는 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥, AS는 이중나선 올리고 RNA의 안티센스 가닥이며; X와 Y는 바람직하게는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이지만, 이에 한정되지는 않는다.
상기 식(2)의 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 방법은,
(1) 친수성 물질이 결합된 고형지지체, 바람직하게는 CPG를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;
(2) 상기 RNA 단일가닥 5' 말단에 제2소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
(3) 합성이 완료되면 고형지지체(CPG)로부터 RNA-고분자 구조체를 분리하는 단계
(4) 제조된 RNA-고분자 구조체와 별도로 합성된 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 어닐링하여 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 단계;
를 포함하여 이루어질 수 있다.
상기 (3) 또는 (4) 단계 이후, 제조가 완료 되면 고속 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 이용하여 상기 반응물을 정제한 뒤 MALDI-TOF 질량분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 이중나선 올리고 RNA 및 이중나선 올리고 RNA 구조체가 제조되었는지를 확인할 수 있다.
상기 제조방법에 있어서 (1) 단계에서 합성된 RNA 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 합성하는 단계는 독립적인 합성과정으로서 (1) 단계 이전 또는 (1) 단계 내지 (4) 단계 중 어느 한 과정 중에 수행되어도 무방하다. 또한, (1)단계에서 합성된 RNA 단일가닥과 상보적 서열을 가지는 RNA 단일가닥은 5' 말단에 인산기가 결합된 형태로 이용될 수 있다.
또 다른 양태로, 하기 식(3)과 같이 올리고 RNA의 센스가닥의 5' 말단에 친수성 물질이 결합하고, 3' 말단에 제2소수성 물질이 결합된 형태의 이중나선 올리고 RNA 구조체가 이용될 수 있다.
Figure pat00003
상기 식(3)에서 A는 제2소수성 물질이며, B는 친수성 물질이고; S는 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥, AS는 이중나선 올리고 RNA의 안티센스 가닥이며; X와 Y는 바람직하게는 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이지만, 이에 한정되지는 않는다.
상기 식(3)의 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 방법은,
(1') 기능기가 결합되어있는 고형지지체, 바람직하게는 CPG를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;
(2') 상기 RNA 단일가닥의 5' 말단에 친수성 물질을 공유결합시켜 합성하는 단계;
(3') 합성이 완료되면 고형지지체(CPG)로부터 기능기가 결합된 RNA-친수성 고분자 구조체를 분리하는 단계;
(4') 상기 기능기를 통해 제2소수성 물질을 결합하여 RNA 양 말단에 친수성 물질 및 제2소수성 물질이 결합된 RNA-고분자 구조체를 합성하는 단계;
(5') 제조된 RNA-고분자 구조체와 별도로 합성된 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 어닐링하여 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 단계;
를 포함하여 이루어질 수 있다.
상기 (4') 또는 (5') 단계 이후, 제조가 완료 되면 고속 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 이용하여 상기 반응물을 정제한 뒤 MALDI-TOF 질량분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 이중나선 올리고 RNA 및 이중나선 올리고 RNA 구조체가 제조되었는지를 확인할 수 있다. 상기 제조방법에 있어서 (1') 단계에서 합성된 RNA 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 합성하는 단계는 독립적인 합성과정으로서 (1') 단계 이전 또는 (1') 단계 내지 (5') 단계 중 어느 한 과정 중에 수행되어도 무방하다. 또한, (1') 단계에서 합성된 RNA 단일가닥과 상보적 서열을 가지는 RNA 단일가닥은 5' 말단에 인산기가 결합된 형태로 이용될 수 있다.
또한, 리간드가 결합된 형태의 이중나선 올리고 RNA 구조체의 경우, 이중나선 올리고 RNA 구조체의 친수성 물질에 리간드가 결합된 형태로 이용될 수 있다. 일례로, 하기 식(4)와 같이 이중나선 올리고 RNA 센스 가닥의 3' 말단에 친수성 물질이 결합되며, 친수성 물질에 리간드가 결합하고, 5' 말단에 제2소수성 물질이 결합된 형태의 이중나선 올리고 RNA 구조체가 이용될 수 있다.
Figure pat00004
식(4)에서 A는 친수성 물질이고, B는 제2소수성 물질이며; S는 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥, AS는 이중나선 올리고 RNA의 안티센스 가닥이며; X와 Y는 바람직하게는 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이지만, 이에 한정하지는 않으며; L은 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진 시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드(ligand)를 의미한다.
상기 식(4)의 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 방법은,
(1'') 기능기가 결합되어 있는 고형지지체(CPG)에 친수성 물질을 결합시키는 단계;
(2'') 기능기-친수성 물질이 결합되어있는 고형지지체(CPG)를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;
(3'') 상기 RNA 단일가닥의 5′말단에 제2소수성 물질을 공유결합시켜 합성하는 단계;
(4'') 합성이 완료되면 고형지지체(CPG)로부터 기능기-RNA-고분자 구조체를 분리하는 단계;
(5'') 상기 기능기를 이용하여 친수성 물질 말단에 리간드를 결합시킨 RNA-고분자 구조체를 제조하는 단계;
(6'') 제조된 리간드가 결합된 RNA-고분자 구조체와 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 어닐링하여 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 단계;
를 포함하여 이루어질 수 있다.
상기 (4''), (5'') 단계 또는 (6'') 단계 이후, 제조가 완료되면 고속 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 이용하여 상기 반응물들과 RNA-고분자 구조체 및 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 분리 정제한 뒤 MALDI-TOF 질량 분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 이중나선 올리고 RNA 및 이중나선 올리고 RNA 구조체가 제조되었는지를 확인 할 수 있다.
상기 제조방법에 있어서 (3'') 단계에서 합성된 RNA 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 합성하는 단계는 독립적인 합성과정으로서 (1'') 단계 이전 또는 (1'') 단계 내지 (6'') 단계 중 어느 한 과정 중에 수행되어도 무방하다.
또 다른 양태로 하기 식(5)와 같이 이중나선 올리고 RNA 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 5' 말단에 친수성 물질 또는 제2소수성 물질이 결합된 형태의 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체가 이용될 수 있다.
Figure pat00005
상기 식(5)에서 A는 친수성 물질이고, B는 제2소수성 물질이며; S는 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥, AS는 이중나선 올리고 RNA의 안티센스 가닥이며; X와 Y는 바람직하게는 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이지만, 이에 한정되지는 않으며; L은 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진 시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드(ligand)를 의미한다.
상기 식(5)의 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 방법은,
(1''') 고형지지체를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;
(2''') 상기 RNA 단일가닥의 5' 말단에 친수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
(3''') 고형지지체로부터 리간드가 결합된 RNA-친수성 고분자 구조체 및 별도로 합성된 상보적 서열의 RNA-제2소수성 고분자 구조체의 단일가닥을 분리하는 단계;
(4''') 상기 RNA-친수성고분자 구조체와 상보적 서열의 RNA-제2소수성 고분자 구조체의 어닐링을 통하여 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 단계; 를 포함하여 이루어질 수 있다.
상기 (3''') 또는 (4''') 단계 이후, 제조가 완료 되면 고속 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography; HPLC)를 이용하여 상기 반응물을 정제한 뒤 MALDI-TOF 질량분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 및 이중나선 올리고 RNA 구조체가 제조되었는지를 확인할 수 있다.
상기 제조방법에 있어서 (1''') 단계에서 합성된 RNA 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 RNA-제2소수성 고분자 구조체를 합성하는 단계는 독립적인 합성과정으로, (1''') 단계 이전 또는 (1''') 단계 내지 (4''') 단계 중간에 (1''') 단계의 RNA 단일가닥과 상보적 서열로 이루어진 RNA 단일가닥을 합성한 뒤, 제2소수성 물질을 공유 결합시켜 제2소수성 물질이 결합된 형태의 RNA-제2소수성 고분자 구조체 단일가닥을 합성한 뒤, 고형지지체로부터 분리하는 단계를 포함하여 이루어진다.
상기 친수성 물질의 기능기는 필요에 따라 다른 기능기로 치환되어도 무방하다. 상기 친수성 물질 중에서도 특히 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)은 다양한 분자량과 작용기를 도입할 수 있는 말단을 갖고 있으며, 생체 내 친화성이 좋고 면역반응을 유도하지 않으며, 물에 대한 용해도를 증가시켜 생체 내에서의 유전자 전달 효율을 증가 시키므로 본 발명의 구조체의 제조에 매우 적합하다.
또 다른 양태로, 하기 식(6)과 같이 이중나선 올리고 RNA 센스가닥의 5' 말단에 친수성 물질이 결합되고, 친수성 물질에 리간드가 결합되며 3' 말단에 제2소수성 물질이 결합된 형태의 이중나선올리고 RNA 구조체가 이용될 수 있다.
Figure pat00006
식(6)에서 A는 친수성 물질이고, B는 제2소수성 물질이며; S는 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥이고, AS는 이중나선 올리고 RNA의 안티센스 가닥이며; X와 Y는 바람직하게는 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이지만, 이에 한정하지는 않으며; L은 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진 시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드(ligand)를 의미한다.
상기 식(6)의 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 방법은,
(1'''') 기능기가 결합되어있는 고형지지체(CPG)를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;
(2'''') 상기 RNA 단일가닥의 5' 말단에 친수성 물질을 공유결합 시키는 과정으로 합성하는 단계;
(3'''') 상기 RNA 단일가닥의 친수성 물질에 리간드가 결합된 기능기-RNA-친수성 고분자 구조체를 합성하는 단계;
(4'''') 합성이 완료되면 고형지지체(CPG)로부터 리간드가 결합된 기능기-RNA-친수성 고분자 구조체를 분리하는 단계;
(5'''') 상기 기능기를 통해 제2소수성 물질을 결합하여 리간드가 결합된 RNA-고분자 구조체를 합성하는 단계; 및
(6'''') 제조된 리간드가 결합된 RNA-고분자 구조체와 별도로 합성된 상보적 서열의 RNA 단일가닥을 어닐링하여 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 단계;
를 포함하여 이루어질 수 있다.
상기 (5'''') 또는 (6'''') 단계 이후, 제조가 완료 되면 고속 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography; HPLC)를 이용하여 상기 반응물을 정제한 뒤 MALDI-TOF 질량분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 및 RNA가 제조되었는지를 확인할 수 있다. 상기 제조방법에 있어서 (1)단계에서 합성된 RNA 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 합성하는 단계는 독립적인 합성과정으로, (1'''') 단계 이전 또는 (1'''') 단계 내지 (6'''') 단계 중 어느 한 과정 중에 수행되어도 무방하다.
또한, 본 발명에 따른 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 제조하는 방법은
(a) 친수성 물질 및 제2소수성 물질이 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 단계;
(b) 제1소수성 물질이 자성물질의 표면에 코팅된 자성나노입자를 제조하는 단계;
(c) 상기 (a) 및 (b) 단계에서 제조된 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 SAMiRNA와 제1소수성 물질이 자성물질의 표면에 코팅된 자성나노입자를 혼합시키는 단계;
를 포함하여 이루어질 수 있다.
상기 제조방법에 있어, (a) 단계와 (b) 단계는 순차적일 필요는 없으므로 순서와 무관하게 진행될 수 있다. 즉, (b) 단계가 (a) 단계 보다 앞서 수행될 수 있다. 또한 (a) 단계에서 제조되는 이중나선 올리고 RNA 구조체에는 리간드가 더 포함될 수 있다.
상기 SAMiRNA-자성나노입자 복합체에서 자성나노입자와 SAMiRNA의 질량비율은 0.01:1 내지 100:1 인 것이 바람직하며, 0.1:1 내지 10:1의 질량 비율인 것이 보다 바람직하다.
SAMiRNA-자성나노입자 복합체의 크기는 50 내지 300 nm 의 크기를 갖는 것이 바람직하고, 상기 SAMiRNA-자성나노입자 복합체의 다분산지수(polydispersity index; PDI)는 0.01 내지 0.4인 것이 바람직하며, 0.1 내지 0.3의 값을 갖는 것이 보다 더 바람직하다.
또한, 상기 SAMiRNA-자성나노입자 복합체에 있어, SAMiRNA 형성 기술은 이중나선 올리고 RNA 뿐 아니라, 단일나선 올리고뉴클레오티드, 특히 치료목적을 가지는 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)에도 적용될 수 있다. 즉, SAMiRNA를 구성하는 이중나선 올리고 RNA 구조체에 있어서, 이중나선 올리고뉴클레오티드 대신에 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)를 포함하는 단일나선 올리고뉴클레오티드 구조체가 자성나노입자와의 복합체 형성에 이용될 수 있다.
ASO 기술은 단일가닥의 RNA 또는 DNA 가닥을 통해 mRNA를 분해하여 유전자로부터 단백질로의 정보전달을 조절하는 기술이다. 즉, 충분히 상보적, 특이적으로 혼성화하는 염기서열을 선택하여 목표 단백질의 바람직한 발현억제가 이루어지도록 하는 것이다. ASO의 결합은 목표 유전자에 서열 특이적으로 결합하므로 목표유전자 이외의 다른 유전자 발현에 영향을 주지 않는다. 따라서 ASO 기술은 특정 단백질의 생체 내 역할의 분석에서 유용한 도구일 뿐만 아니라, 특정 질병에 대한 유전자치료법으로 활용 가능성을 가진다(FASEBJ.9,1288-1296,1995). 특히, 최근에는 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드의 새로운 종류 중 하나인 안타고미어(antagomir)가 개발되어 세포 내에서 유래한 마이크로알엔에이 (microRNA)의 기능을 저해하는데 사용되고 있다. 화학적으로 합성된 짧은 RNA인 안타고미어 혹은 microRNA 저해제 (miRNA inhibitor)는 타겟이 되는 microRNA에 상보적으로 결합하여 그 기능을 저해하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 안타고미어는 분해되는 것을 방지하기 위해, 2' methoxy나 phosphothioate 등과 같은 변형된 화학구조를 가지는 것이 바람직하며, 현재 암, 심장 및 폐 섬유증을 비롯한 다양한 질병에 연관된 miRNA의 기능을 저해하는 안타고미어가 보고되어 있다("Silencing of microRNAs in vivo with 'antagomirs'" Nature, Dec. 2005, 438(7068): 685-689; "MicroRNAs as Therapeutic Targets" New England J. Medicine, 2006, 354 (11): 1194-1195; Meister G. et al., "Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing" RNA, Mar. 2004, 10 (3): 544-550).
본 발명에서의 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)는 통상적인 안티센스 뿐 아니라 안타고미어를 포함하는 특정 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 기능을 하는 모든 단일나선 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
특히, 본 발명에 따른 단일나선 올리고뉴클레오티드 구조체는 다음 식 (7)의 구조를 가진다.
A-X- ASO -Y-B 식(7)
상기 식(7)에서 A와 B중 하나는 친수성 물질이며, 다른 하나는 제2소수성 물질이고; ASO은 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드이며; X와 Y는 바람직하게는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이지만, 이에 한정되지는 않는다.
상기 식(7)에서의 친수성 물질과 제2소수성 물질, 그리고 X 및 Y로 표시되는 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합은 이미 설명한 이중나선 올리고 RNA를 이용한 SAMiRNA 구조체에서 정의된 바와 같은 특성을 가진다.
본 발명에 있어, 상기 ASO는 10 내지 50 개의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 13 내지 25개의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
또한, 생체 내 안정성을 향상시키기 위해 핵산분해효소 저항성을 갖는 다양한 변형(modification)이 이루어진 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN; oligodeoxynucleotide)형태를 포함한다. 상기 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2탄소 위치에서 -OH 기가 - CH3(메틸), -OCH3,-NH2,-F(불소), -O-2-메톡시에틸, -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형; 뉴클레오티드 내 당 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 뉴클레오티드 간 결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphophate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형 등에서 하나 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA(locked nucleic acid) 형태로의 변형도 사용 가능하다.
본 발명에서 사용 가능한 ASO는 치료용 또는 연구용으로 사용되고 있는 것으로 특별히 한정되지 않고, 유전자 치료용 또는 연구를 위해 사용되거나 사용될 가능성이 있는 어떠한 유전자에 대한 ASO도 채택될 수 있다.
또한, 본 발명에서의 ASO는 목적하는 mRNA와 완벽하게 상보적 결합(perfect match) 관계에 있는 경우뿐만 아니라, 일부 서열에서 상보적 결합을 이루지 않더라도 목적하는 mRNA와 결합하여 그러한 mRNA의 번역(translation)을 저해할 수 있는 불완전한 상보적 결합(mismatch) 관계에 있는 것도 사용 가능함은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
본 발명의 SAMiRNA-자성나노입자 복합체는 이중나선 올리고 RNA의 세포 내 전달을 향상시키며, 이를 질병 모델의 치료 및/또는 진단 목적으로 응용하는 것이 가능하다. 보다 구체적인 SAMiRNA 및 자성나노입자의 제조 및 특징, 세포 전달 효율 및 효과는 후술하는 실시예에서 더욱 상세히 설명한다.
또한, 본 발명은 상기 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 이용한 유전자 치료 및/또는 진단 방법을 제공한다. 구체적으로 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체를 합성하는 단계 제1소수성 물질이 자성물질의 표면에 코팅된 자성나노입자 및 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 준비하는 단계와 상기 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 체내로 투입하는 단계를 포함하는 암 및 감염성 질환 등을 포함하는 질병의 진단 및/또는 치료방법을 제공한다.
본 발명은 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 포함하는 치료 및/또는 진단을 위한 조성물을 제공한다. 특히 본 발명에 따른 본 발명은 SAMiRNA-자성나노입자 복합체는 치료 및 진단을 동시에 수행할 수 있는 장점을 가진다. 본 발명의 조성물은 투여를 위하여 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체가 1종 이상 포함될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효 성분과 양립이 가능해야하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세린, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상이 혼합되어 사용될 수 있고, 필요에 따라서 항산화제, 완충제, 정균제 등 다른 통상의 첨가제가 첨가될 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 포함하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화될 수 있다. 특히, 동결건조(lyophilized)된 형태의 제형으로 제제화하여 제공하는 것이 바람직하다. 동결건조 제형 제조를 위해서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 방법이 사용될 수 있으며, 동결건조를 위한 안정화제가 추가될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 투여를 위하여 상기 기재된 유효 성분 이외에 추가로 약제학적 활성성분을 1종 이상 포함하여 제조될 수 있다. 상기 본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적 활성성분이 항암제, 항생제, 호르몬, 호르몬 길항제, 인터루킨, 인터페론, 성장인자, 종양괴사인자, 엔도톡신, 림포톡신, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, RNA 분해 저해제, 알킬포스포콜린, 방사선 동위원소 표지성분, 계면활성제, 심혈관계 약물, 위장관계 약물 및 신경계 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각한 정도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한, 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며, 단회투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 앰플 및 병 등으로 제공될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다.
이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 약제학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화될 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 방법, 배설율 및 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 SAMiRNA-자성나노입자 복합체는 향상된 이중나선 올리고 RNA의 생체 안정성 및 균질한 나노입자의 크기로 인해 세포 전달 효율이 증가되어 우수한 치료효능을 나타내며, 자성나노입자의 특성으로 인해 진단목적으로의 활용 또한 가능하다. 즉, 치료와 진단이 동시에 수행될 수 있는 소위 테라그노시스(theragnosis)에 이용될 수 있으므로, 질병의 진단 및 치료를 위한 새로운 형태의 이중나선 올리고 RNA 전달 시스템으로 생명공학을 위한 기초 연구 및 의약 산업 등 다양한 산업분야에 걸쳐 매우 유용하게 사용될 수 있다.
또한 추가적으로 결합된 리간드를 통해 타겟 세포 특이적 전달을 통해 암을 포함한 타겟 세포 내로 치료용 이중나선 올리고 RNA를 효율적으로 전달할 수 있어 암의 진단과 동시에 전달된 이중나선 올리고 RNA를 통한 치료를 수행할 수 있다. 리간드가 결합된 SAMiRNA-자성나노입자 복합체는 타 장기 및 세포로의 비특이적인 전달이 저해되어 효율적이고 특이적으로 암의 진단 및 치료를 할 수 있다.
특히, 자성나노입자의 생체 내 전달을 향상시키기 위해서 자성나노입자와 이중나선 올리고 RNA 구조체기 복합체를 이루는 경우, SAMiRNA에 자성나노입자를 내포시킬 수 있어 보다 균일한 형태의 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 형성할 수 있다는 장점을 가진다. 상기 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 이용하여 이중나선 올리고 RNA를 암 특이적으로 전달함으로써 비교적 낮은 농도의 투여량으로도 타겟 조직에서 이중나선 올리고 RNA의 활성을 나타낼 수 있다.
도 1은 SAMiRNA-자성나노입자 복합체의 모식도.
도 2는 실시예1-3에서 제조된 SAMiRNA-자성나노입자의 다분산지수(PDI) 그래프를 나타내는 도면.
도 3은 SAMiRNA-자성나노입자 복합체의 투과전자현미경 사진.
(A) 자성나노입자의 전자현미경사진.
(B) SAMiRNA-자성나노입자 복합체의 투과현미경 사진.
도 4는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체의 자기공명촬영 영상 (KB xenograft mouse model에 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 종양 내 투여한 뒤 MRI 촬영을 통해 암 조직(점선)의 진단을 확인)
(A) 미 투여군.
(B) SAMiRNA-자성나노입자 복합체 투여군. (MRI에서 암 조직의 영상신호는 검은색으로 표시됨. 촬영 각도- Coronal Section, 관상단면 Axial Section, 측직각 단면)
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. SAMiRNA-자성나노입자 복합체의 제조
SAMiRNA-자성나노입자 복합체는 이중나선 올리고 RNA 구조체와 제1소수성 물질이 자성물질의 표면에 코팅된 자성나노입자를 각각 제조한 뒤, 두 물질을 혼합하여 복합체의 형태로 제조되었다.
실시예 1-1. 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조
이하 실시예에서는 서바이빈을 억제하기 위해 서바이빈 이중나선 올리고 RNA를 사용하였다. 서바이빈은 지금까지 테스트된 대부분의 신생 종양이나 형질 변이된 세포주에서 공통적으로 발현되는 단백질로서, 항암치료에 있어서 중요한 타겟이 될 것으로 예측되고 있다(Survivin: a new target for anti-cancer therapy. Cancer Treat Rev. 2009 Nov; 35(7):553-62).
본 발명의 서바이빈 이중나선 올리고 RNA는 서열번호 1번으로 기재되는 센스 가닥과 이에 상보적인 서열인 안티센스 가닥으로 구성되어 있으며, 대조군으로 사용되는 이중나선 올리고 RNA는 서열번호 2번으로 기재되는 센스 가닥과 이에 상보적인 서열인 안티센스 가닥으로 구성되어 있다. 본 실시예에 사용된 이중나선 올리고 RNA는 하기의 염기서열로 이루어져 있다.
(서열번호 1) 5'-AAG GAG AUC AAC AUU UUC A-3′
(서열번호 2) 5'-CUU ACG CUG AGU ACU UCG A-3′
상기 이중나선 올리고 RNA는 β-시아노에틸포스포아미디트 (2′tert-butyldimethylsilyl protected β-cyanoethylphosphoramidite)를 이용하여 DNA골격 구조를 이루는 인산디에스테르(phosphodiester) 결합을 연결해 가는 방법을 사용하여, 상기 이중나선 올리고 RNA 단일가닥 합성하였다. 합성 과정은 뉴클레오사이드(nucleoside)가 결합된 고형지지체(CPG)로부터 시작하여 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)로 이루어지는 반복과정을 되풀이함으로써, 원하는 서열의 RNA를 얻게 된다.
구체적으로, 사이클의 첫 단계인 차단제거(deblocking) 단계는 뉴클레오티드가 결합된 고형지지체(CPG)에 3 % 트리클로로아세트산(trichloroacteic acid)을 처리하여 DMT(4,4'-dimethoxytrityl)를 제거하고, 다음 단계인 결합(coupling) 단계는 이전 단계에서 고형지지체(CPG)에 형성된 5′-수산(hydroxyl)기와 원하는 서열의 뉴클레오사이드 포스포아미디트 단량체(nucleoside phosphoramidite monomer)와 결합반응을 통해 올리고뉴클레오티드 사슬이 연결되는 단계이다.
세 번째 단계인 캐핑(capping) 단계는 결합단계에서 반응되지 않은 5′-수산기를 차단(blocking)하여 다음 사이클에서 결합 과정에서 원하지 않는 염기 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드 사슬을 배제하는 단계로, 무수초산(acetic anhydride)과 N-메틸이미다졸(N-methylimidazole)을 처리하여 아세틸화(acetylation)한다. 마지막 단계인 산화(oxidation) 단계는 결합(coupling) 단계에서 형성된 5′-수산기와 포스포아미디트 간의 결합이 아인산트리에스터(phosphitetriester) 결합을 이루는데, 이를 포스포디에스터(phosphodiester) 결합으로 변환시키는 단계로, 0.02 M 산화용액(Oxidizing solution(0.02 M-I2 in THF/Pyridine/H2O))을 처리하여 아인산(phosphite)이 인산(phosphate)으로 변경된다. 해당 일련의 RNA 단일가닥의 합성과정은 RNA 합성기(384 Synthesizer, BIONEER, 한국)를 사용하여 진행되었다.
이중나선 올리고 RNA 구조체의 이중나선 올리고 RNA센스 가닥의 경우, 앞서 언급한 방식대로 β-시아노에틸포스포아미디트를 이용하여 RNA 골격 구조를 이루는 포스포디에스테르결합을 연결해 가는 방법을 사용하여 합성을 진행한 뒤, 추가적으로 5′말단에 폴리에틸렌 글리콜(POLYETHYLENE GLYCOL, PEG) 포스포아미디트(phosphoramidite)를 이어 이중나선 올리고 RNA 구조체의 이중나선 올리고 RNA 센스 가닥을 만들었다. 상기 RNA-친수성 고분자 구조체 센스 가닥과 어닐링(annealing)을 수행할 안티센스 가닥의 경우, 앞서 언급한 방식대로 β-시아노에틸포스포아미디트를 이용하여 RNA 골격 구조를 이루는 인산디에스테르 결합을 연결해 가는 방법을 사용하여 합성을 진행한 뒤, 추가적으로 이황화 결합이 포함되어 있는 탄소수 24개의 테트라도코산(tetradocosane) 시약을 일반적인 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 캐핑(capping) 및 산화(oxidation)로 이루어지는 과정을 통해 5′말단에 결합하여 RNA-제 2소수성 고분자 구조체의 안티센스 가닥을 만들었다.
리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 경우, 앞서 언급한 방식대로 β-시아노에틸포스포아미디트를 이용하여 RNA 골격 구조를 이루는 인산디에스테르 결합을 연결해 가는 방법을 사용하여 합성을 진행한 뒤, 추가적으로 5′말단 부위에 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol, PEG) 포스포아미디트(phosphoramidite)를 결합된 뒤, 리간드가 결합된 포스포아미디트(phosphoramidite) 또는 리간드가 결합된 NHS 형태의 결합 가능한 리간드를 제조하여 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol, PEG) 말단부위에 리간드를 결합시킴으로써 리간드가 결합된 RNA-제2소수성 고분자 구조체 센스 가닥을 만들었다. 상기 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체와 어닐링(annealing)을 수행할 안티센스 가닥의 경우, 앞서 언급한 이중나선 올리고 RNA 구조체 안티센스 가닥과 동일한 방법을 통해 제조하였다.
합성이 완료되면 60 ℃의 온탕기(water bath)에서 28 %(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 합성된 RNA 및 RNA-고분자 구조체(RNA-친수성 고분자 구조체 센스 가닥, RNA-제 2소수성 고분자 구조체 안티센스 가닥, 리간드가 결합된 RNA- 친수성 고분자 구조체 센스 가닥)를 고형지지체(CPG)로부터 떼어낸 뒤, 탈보호(deprotection)반응을 통해 보호 잔기를 제거하였다. 보호 잔기가 제거된 이중나선 올리고 RNA 및 이중나선 올리고 RNA 구조체는 70 ℃의 오븐에서 엔-메틸피롤리돈(N-methylpyrolidon), 트리에틸아민(triethylamine) 및 트리에틸아민트리하이드로플로리드(triethylaminetrihydrofluoride)를 10:3:4의 부피비로 처리하여 2′ TBDMS(tert-butyldimethylsilyl)를 제거하였다.
상기 반응물들을 고속 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC) (LC-20A Prominence, SHIMADZU, 일본)로 RNA를 분리하고, 이를 MALDI-TOF 질량 분석기(MALDI-TOF MS, SHIMADZU, 일본)로 분자량을 측정하여, 합성하고자 하는 염기서열의 RNA-고분자 구조체 단일가닥 및 리간드가 결합된 RNA-고분자 구조체 단일가닥과 부합하는지 확인하였다.
그 후, 각각의 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하기 위하여 센스와 안티센스 RNA 가닥을 동량 혼합하여 1X 어닐링 버퍼(30 mM HEPES, 100 mM Potassium acetate, 2 mM Magnesium acetate, pH 7.0∼7.5)에 넣고, 90 ℃ 항온 수조에서 3분 반응시킨 후, 다시 37 ℃에서 반응시켜, 목적하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 각각 제조하였다. 제조된 이중나선 올리고 RNA 구조체는 전기영동을 통하여 어닐링을 확인하였다.
실시예 1-2. 제 1 소수성 물질이 자성물질의 표면에 코팅된 자성나노입자의 제조
제 1소수성 물질이 자성물질의 표면에 코팅된 자성나노입자는 i) 올레산 철착물을 형성시키기 위하여 물에 녹인 염화철을 에탄올, 증류수 및 핵산을 포함하는 용매 혼합물에 녹인 올레산나트륨과 반응시키는 단계 ii) 나노입자를 생산하기 위하여 상기 올레산 철착물을 비활성 환경 하에서 탈수된 옥타데센과 올레산 혼합물을 첨가하여 가열시키는 단계를 포함하는 방법을 통해 올레산 철착물을 완전히 분해시켜, 산화 철 나노입자를 제조하였다. 상기 반응을 통해 생성된 나노입자를 포함하는 용액이 실온에서 냉각되었고, 과량의 에탄올을 가하여 원심분리에 의해 분리 및 상층액(supernatant) 제거를 통한 세척 과정을 3회 반복한 뒤, 상기 잔여물에 포함된 에탄올을 진공 건조에 의해 제거하였다. 상기 결과로 생긴 생산물은 핵산 중에 쉽게 재 분산되어 원하는 철 나노입자를 제조하였다(대한민국 공개특허 공보 제 2007-0102672호 참조).
실시예 1-3. SAMiRNA-자성나노입자 복합체의 제조
이중나선 올리고 RNA 구조체와 제1소수성 물질이 자성물질의 표면에 코팅된 자성나노입자는 이중나선 올리고 RNA 구조체 한 쪽 말단에 결합된 제2소수성 물질 간의 소수성 상호작용에 의해 자성나노입자가 핵으로 존재하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 형성하게 된다(도 1 참조).
실시예 1-1에서 제조된 이중나선 올리고 RNA 구조체와 실시예 1-2에서 제조된 제1소수성 물질이 자성물질의 표면에 코팅된 자성나노입자는 초음파 분산기를 통해 균질화된 형태의 SAMiRNA-자성나노입자 복합체로 제조되었다. 자세히 설명하면, 이중나선 올리고 RNA 구조체 1.5 mg을 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) 2 ㎖에 녹인 뒤, 자성나노입자 (20 nm, 1 wt%, in hexane) 200 ㎕를 첨가하였다. 초음파 분산기(Wiseclean, DAIHAN, 한국)로 나노입자의 크기를 균질화(200 W, 40 kHz, on ice)한 뒤, 5000 pm으로 10분간 원심 분리하여 SAMiRNA-자성나노입자 복합체가 존재하는 중간층을 채취하였다.
실시예 2. SAMiRNA-자성나노입자 복합체의 물성분석
실시예 1-3에서 제조된 SAMiRNA-자성나노입자 복합체의 형성 및 형태를 확인하였다.
실시예 2-1. SAMiRNA-자성나노입자 복합체의 입자크기 및 다분산지수 (polydispersity index; PDI) 측정
제타전위 측정기(zeta-potential measurement)를 통하여 상기 나노입자의 크기를 측정하였다. 실시예 1-3에서 제조된 SAMiRNA-자성나노입자 복합체는 제타전위 측정기(Nano-ZS, MALVERN, 영국)로 크기를 측정하였는데, 물질에 대한 굴절률(Refractive index)은 1.454, 흡수율(Absorption index)은 0.001로 하고, 용매인 물의 온도 25 ℃ 및 그에 따른 점도 및 굴절률을 입력하여 측정하였다. 1회 측정은 20번 반복으로 구성된 크기 측정으로 이루어졌고, 이를 3 회 반복하였다.
SAMiRNA-자성나노입자 복합체의 크기는 100 nm 미만의 크기와 0.3 미만의 다분산지수(polydispersity index; PDI) 값을 관찰할 수 있었다(도 2 참조). 다분산지수(polydispersity index; PDI) 값은 낮을수록 해당 입자가 고르게 분포하고 있음을 판단할 수 있는 수치로, 상기 나노입자는 비교적 균일한 크기의 나노입자를 형성하며, 이는 내포작용(endocytosis)을 통해 세포 내로 섭취되기에 충분한 크기이다(Kenneth A. Dawson et al. nature nanotechnology 4:84-85, 2009). SAMiRNA-자성나노입자 복합체는 입자 내부에 자성나노입자가 위치하는 구조를 가지는데, 자성나노입자에 코팅되어있는 제1소수성 물질과 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제2소수성 물질간의 상호작용을 통해 SAMiRNA-자성나노입자 복합체의 구조가 안정화됨으로써 비교적 작고, 균일한 크기를 형성함을 확인할 수 있었다.
실시예 2-2. SAMiRNA-자성나노입자 복합체의 투과전자현미경 관찰
상기 SAMiRNA-자성나노입자 복합체가 형성된 형태는 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM)을 통해 관찰하였다.
구체적으로 실시예 1-3 에서 제조된 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 균질화하여 관찰하였다. TEM을 통해 관찰된 나노입자는 실시예 2-1에서 측정된 나노입자의 크기와 유사한 정도로 나노입자가 잘 형성되었음이 확인되었으며, 제1소수성 물질이 자성물질의 표면에 코팅된 자성나노입자만을 관찰한 사진과 다르게 해당 자성나노입자 표면에 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 표면이 추가로 형성되어 있음을 확인할 수 있었다(도 3 참조).
실시예 3. SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 이용한 종양 세포주에서의 목표 유전자의 발현 억제
상기 실시예 1-3에서 제조한 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 이용하여 종양세포주인 인간 자궁암 세포주(HeLa)를 형질전환 시키고, 상기 형질전환된 종양세포주에서 목표 유전자인 서바이빈 유전자의 발현 양상을 분석하였다.
실시예 3-1. 종양 세포주의 배양
미국 종균협회(American type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 자궁암 세포(HeLa)는 EMEM 배양배지(ATCC-formulated Eagle's Minimum Essential Medium, 미국)에 10 %(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100 units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고, 37 ℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 배양하였다.
실시예 3-2. SAMiRNA-자성나노입자를 이용한 종양 세포주의 형질전환
상기 실시예 3-1에서 배양된 종양 세포주를 웰당 1.3 ×105를 상기 실시예의 3-1 조건으로 6-웰 플레이트에서 18시간 동안 EMEM 배양배지에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰당 동량의 Opti-MEM 배지를 분주하였다.
Opti-MEM 배지 100㎕에 상기 실시예 1-3에서 제조한 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 첨가하여 SAMiRNA-자성나노입자 복합체 형질전환용 용액을 제조하였다. 그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰에 형질전환용 용액을 각각 100 내지 200 nM의 농도로 처리하고, 37 ℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 총 48 시간 동안 배양하였다.
실시예 3-3. 서바이빈 유전자의 mRNA 상대적 정량 분석
상기 실시예 3-2 에서 형질주입(transfection)된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 뒤, 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 통하여 서바이빈 mRNA 발현량을 대한민국 공개특허 공보 제2009-0042297호의 방법에 따라서 상대 정량 하였다.
서열번호 1번의 이중나선 올리고 RNA가 포함되어있는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체가 처리된 실험군은 서열번호 2번의 이중나선 올리고 RNA가 포함되어있는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체 대조군에 비하여 해당 나노입자에 포함되어있는 이중나선 올리고 RNA의 목표 유전자인 서바이빈 mRNA의 발현이 저해됨을 확인할 수 있었다.
실시예 4. SAMiRNA-자성나노복합체의 자기공명영상 (Magnetic Resonance Imaging, MRI) 촬영
상기 실시예 1-3과 동일한 방법으로 제조한 SAMiRNA-자성나노입자 복합체의 생체 내(in vivo) 조건에서의 자기공명영상 진단 가능성의 확인을 위해인간 구강암 상피세포인 KB 세포주로 이루어진 종양을 가진 쥐에 투여하고, MRI 촬영을 통해 암의 진단을 확인하였다.
실시예 4-1. KB xenograft model의 준비
실시예 3-1에서 배양된 KB 세포주를 1x106 씩 5주령 누드마우스(BALB/C nu)의 등 부위 양쪽 피하조직에 투여(Subcutenous injection)하여 두 개의 종양 조직의 성장을 유도하였다. 투여 후 2일 간격으로 종양 장축 및 단축의 길이를 측정하여 종양의 성장을 관찰하고, 투여 후 2주 경과한 시점에서 약 200 내지 350mm3 가량으로 종양이 성장하였음을 확인하였다.
실시예 4-2. SAMiRNA-자성나노입자 복합체의 투여 및 MRI 촬영
실시예 4-1에서 준비된 KB xenograft model에 실시예 1-3에서 제조한 SAMiRNA-자성나노입자 복합체는 양쪽의 암 조직에 각각 (좌)300 및 (우)30 ㎍의 양으로 종양 내(intra tumor) 단 회 투여한 뒤, MRI 촬영(T4.7 MRI, Bruker, Germany)을 진행하였다. SAMiRNA-자성나노입자 복합체가 투여된 실험군(도 4의 (B) 참조,(A)는 미 투여군)의 경우 300 ㎍ 투여한 종양부위에서 암 조직의 영상신호가 검은색으로 표시되어 암조직의 존재를 확인할 수 있었으며, 이는 자성나노입자만을 투여한 실험군의 영상 신호와 유사한 정도를 나타내어 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 통한 암조직의 진단이 가능함을 확인할 수 있었다 (도 4 참조; 촬영 각도 - Coronal Section, 관상단면 Axial Section, 측직각 단면).

Claims (35)

  1. 제1소수성 물질이 자성물질의 표면에 코팅된 자성나노입자;
    및 제2소수성 물질, 이중나선 올리고 RNA 및 친수성 물질이 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체; 를 포함하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1소수성 물질과 제2소수성 물질은 서로 동일하거나 또는 서로 다른 물질인 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  3. 제1항에 있어서,
    제1소수성 물질과 제2소수성 물질의 소수성 상호작용에 의해 자성나노입자는 핵(core)에 위치하며 이중나선 올리고 RNA 구조체는 바깥쪽(shell)에 위치하는 구조인 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  4. 제1항에 있어서,
    SAMiRNA-자성나노입자 복합체에서의 자성나노입자 및 이중나선 올리고 RNA 구조체의 질량비율은 0.01:1 내지 100:1 인 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 SAMiRNA-자성나노입자 복합체의 직경은 50 내지 300 nm인 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  6. 제1항에 있어서,
    SAMiRNA-자성나노입자 복합체의 다분산지수(polydispersity index; PDI)는 0.01 내지 0.4 인 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 자성물질의 직경은 1 내지 200 nm인 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 자성물질은 자성금속 또는 자성금속 산화물인 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 자성 금속은 철족금속 원소(Fe, Ni, Co), 희토류 원소(La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu), 화폐금속 원소(Cu, Ag, Au), 아연족 원소(Zn, Cd, Hg), 알루미늄족원소(Al, Ga, In, Tl), 알칼리토금속 원소(Ca, Sr, Ba, Ra) 및 백금족 원소(Pt, Pd)에서 하나 이상 선택된 금속 또는 이들의 합금으로 이루어진 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 자성금속 산화물(magnetic metal material)은 철족금속 원소(Fe, Ni, Co), 희토류 원소(La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu), 화폐금속 원소(Cu, Ag, Au), 아연족 원소(Zn, Cd, Hg), 알루미늄족원소(Al, Ga, In, Tl), 알칼리토금속 원소(Ca, Sr, Ba, Ra) 및 백금족 원소(Pt, Pd)에서 하나 이상 선택된 금속의 산화물 또는 이들의 합금의 산화물을 포함하는 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 자성나노입자의 제1소수성 물질은 C6 내지 C25 방향족 화합물, C6 내지 C25 에테르, C6 내지 C25 지방족 탄화수소 및 C6 내지 C25 아민 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 이중나선 올리고 RNA 구조체는 하기 식(1)의 구조로 이루어진 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
    A-X-R-Y-B 식(1)
    (상기 식(1)에서 A 와 B중 하나는 친수성 물질이고, 다른 하나는 제2소수성 물질이며; X와 Y는 서로 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며; R은 이중나선 올리고 RNA를 의미한다.)
  13. 제1항에 있어서,
    상기 이중나선 올리고 RNA 구조체는 하기 식(1')의 구조로 이루어진 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
    Figure pat00007

    (상기 식(1')에서 A와 B중 하나는 친수성 물질이며, 다른 하나는 제2소수성 물질이고; X와 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며; S는 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥, AS는 이중나선 올리고 RNA의 안티센스가닥을 의미한다.)
  14. 제1항에 있어서,
    상기 이중나선 올리고 RNA 구조체는 하기 식(2)의 구조로 이루어진 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
    Figure pat00008

    (상기 식(2)에서 A는 제2소수성 물질이고, B는 친수성 물질이며, X와 Y는 각각 독립적으로 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이고, S는 이중나선 올리고 RNA의 센스가닥, AS는 이중나선 올리고 RNA의 안티센스 가닥을 의미한다.)
  15. 제1항에 있어서,
    상기 이중나선 올리고 RNA는 19 내지 31 개의 뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합인 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 비분해성 결합은 아미드 결합(amide bond) 또는 인산화 결합인 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 분해성 결합은 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 제2소수성 물질의 분자량은 100 내지 2,000임을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 제2소수성 물질은 스테로이드(steroid) 유도체, 글리세라이드(glyceride) 유도체, 글리세롤 에테르(glycerol ether), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), C12 내지 C50의 불포화 또는 포화 탄화수소(hydrocarbon), 디아실포스파티딜콜린(diacylphosphatidylcholine), 지방산(fatty acid), 인질(phospholipid), 리포폴리아민(lipopolyamine)의 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 스테로이드(steroid) 유도체는 콜레스테롤, 콜리스탄올, 콜산, 콜리스테릴포르메이트, 코테스타닐모르메이트 및 콜리스타닐 아민 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 글리세라이드 유도체는 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  23. 제1항에 있어서,
    상기 친수성 물질의 분자량은 1,000 내지 10,000인 비 이온성 고분자 화합물인 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  24. 제1항에 있어서,
    상기 친수성 물질은 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone), 및 폴리옥사졸린(polyoxalzoline)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  25. 제1항에 있어서,
    이중나선 올리고 RNA 구조체의 친수성 물질에 리간드가 결합된 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 리간드(ligand)는 타겟 특이적으로 결합하여 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 하는 타겟(target) 특이적 항체, 앱타머(aptamer), 펩타이드 또는 수용체 특이적 화학물질로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  27. 제25항에 있어서,
    상기 수용체 특이적 화학물질은 엽산(Folate), N-아세틸갈락토사민, 만노스 (mannose)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  28. 제1소수성 물질이 자성물질의 표면에 코팅된 자성나노입자;
    및 제2소수성 물질, 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO) 및 친수성 물질이 결합된 단일나선 올리고뉴클레오티드 구조체; 를 포함하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 단일나선 올리고뉴클레오티드 구조체는 식(7)의 구조로 이루어진 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.

    A-X- ASO -Y-B 식(7)

    상기 식(7)에서 A와 B중 하나는 친수성 물질이며, 다른 하나는 제2소수성 물질이고; ASO은 단일가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드이며; X와 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미한다.
  30. 제28항에 있어서,
    상기 ASO는 10 내지 50 개의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체.
  31. (1) 친수성 물질 및 제2소수성 물질이 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 단계;
    (2) 제1소수성 물질이 자성물질의 표면에 코팅된 자성나노입자를 제조하는 단계;
    (3) 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 SAMiRNA와 제1소수성 물질이 자성물질의 표면에 코팅된 자성나노입자를 혼합시키는 단계;
    를 포함하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체의 제조방법.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 이중나선 올리고 RNA 구조체의 친수성 물질에 리간드를 결합시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 SAMiRNA-자성나노입자 복합체의 제조방법.
  33. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 포함하는 약제학적 조성물.
  34. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 포함하는 진단용 조성물.
  35. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 SAMiRNA-자성나노입자 복합체를 포함하는 진단 및 치료를 동시에 수행할 수 있는 조성물.
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