KR20100123214A - ｓｉＲＮＡ 접합체 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 siRNA(small interfering RNA)와 고분자 화합물의 접합체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 siRNA의 생체내 안정성 향상을 위해 siRNA와 고분자 화합물을 공유결합으로 연결시킨 하이브리드 접합체 및 상기 하이브리드 접합체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 접합체는 siRNA의 생체내 안정성을 향상시킴으로써 세포내로 치료용 siRNA를 효율적으로 전달할 수 있으며, 또한 비교적 낮은 농도의 투여량으로도 siRNA의 활성을 나타낼 수 있어, 암 및 다른 감염성 질환을 위한 siRNA 치료용 도구 뿐만 아니라, 새로운 형태의 siRNA 전달 시스템으로 유용하게 사용될 수 있다.
siRNA와 고분자 화합물의 접합체, siRNA 치료용 도구, siRNA 전달 시스템

Description

ｓｉＲＮＡ 접합체 및 그 제조방법{SiRNA conjugate and preparing method thereof}
본 발명은 암 및 다른 감염성 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있는 siRNA의 전달을 향상시키는 고분자 화합물을 분해성 또는 비분해성 결합을 이용하여 siRNA에 접합시킨 접합체, 상기 접합체의 제조방법 및 상기 접합체를 이용한 siRNA 전달방법에 관한 것이다.
RNA 간섭현상은 유전자의 발현과정에서 이중가닥의 RNA(dsRNA)에 의하여 염기서열 특이적으로 전사 후 유전자 발현을 조절하는 기작으로, 이와 같은 기작은 처음 발견된 C. elegans를 비롯하여 식물, 초파리, 포유동물에도 공통적으로 존재한다(Fire et al., Nature, 391:806-811, 1998; Novina & Sharp, Nature, 430:161-164, 2004). RNA 간섭현상이 일어나는 과정은 19-25bp의 dsRNA가 세포내로 들어오면 RISC(RNA-induced silencing complex) 복합체와 결합하고 안티센스(가이드) 가닥만이 mRNA와 염기서열 상보적으로 결합하여 RISC 복합체에 존재하는 엔도뉴클라제 도메인에 의하여 표적 mRNA를 분해하는 것으로 알려져 있다(Rana, T.M., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 8: 23-36, 2007; Tomari, Y. and Zamore, P.D., Genes Dev., 19: 517-529, 2005).
dsRNA가 세포내에 전달되면 상기 dsRNA가 표적 mRNA 서열에 특이적으로 결합하여 그 mRNA를 분해하기 때문에, 이를 이용하여 유전자의 발현을 조절할 수 있는 새로운 도구로 여겨지고 있다. 그런데 인간의 경우 dsRNA를 세포에 도입할 때 항바이러스성 인터페론 기작(antiviral interferon pathway)이 유발되어 RNA 간섭효과를 보기가 힘들었는데, 2001년 Elbashir와 Tuschl 등에 의해 21 nt(nucleotide)의 작은 dsRNA를 인간 세포에 도입하는 경우에는 인터페론 경로가 유발되지 않고 표적 mRNA를 특이적으로 분해시킨다는 것이 밝혀졌다(Elbashir,S.M., Harborth,J., Lendeckel,W., Yalcin,A., Weber, K., Tuschl,T., Nature, 411, 494-498, 2001; Elbashir,S.M., Lendeckel,W., Tuschl,T., Genes ＆ Dev., 15, 188-200, 2001; Elbashir,S.M., Martinez,J., Patkaniowska,A., Lendeckel,W., Tuschl,T., EMBO J., 20, 6877-6888, 2001). 이후 21 nt의 dsRNA는 siRNA(small interfering RNA)라는 이름으로 새로운 기능유전체학(functional genomics)의 도구로서 각광을 받기 시작하였다.
siRNA는 최근 동물세포에서 특정 유전자의 발현을 저해시키는데 탁월한 효과를 나타내는 것으로 밝혀져 유전자 치료제로 각광을 받고 있고, 이들의 높은 활성과 정밀한 유전자 선택성으로 인해 지난 20년간 연구되어 현재 치료제로 활용 중인 안티센스 올리고뉴클레오티드(ODN)를 대체할 치료제로 기대되고 있다(Dana J. Gary et al. Journal of Controlled Release 121:64-73, 2007). 특히 치료를 목적으로 siRNA 기법은 다른 의약품에 비하여 쉽게 디자인이 가능하고, 높은 목표 선택성과 특정 유전자의 발현을 저해하는 특징을 갖기 때문에 큰 장점을 갖는다. 또한 RNA 간섭에 의한 유전자 발현 억제는 생체내에서 자연적으로 존재하는 기작을 이용하는 것이므로 독성이 낮다. 최근 OPKO사에서 개발된 황반변성(wet Age-Related Macular disease)의 치료제로 개발된 'Bevasiranib'은 신생혈관 발생을 유발하는 VEGF(vascular endotherial growth factor)에 선택적으로 작용하여 VEGF의 발현을 저해하는 siRNA로서 임상 3상의 과정을 거치고 있다(Dejneka NS et al., Mol Vis., 28(14):997-1005, 2008). 그 외에도 다양한 유전자를 표적으로 하는 siRNA를 포함하는 질병 치료제는 현재 개발 중에 있다(Ryan P. Million, Nature Reviews Drug Discovery 7: 115 - 116, 2008).
RNA 간섭을 통해 in vivo 상에서 특이적인 발현 저해를 유발한 여러가지 결과가 있음에도 불구하고, in vivo siRNA 전달을 위해서는 혈액 내의 효소에 의한 분해, 혈액 내 요소들과 상호작용 및 비특이적으로 세포에 전달되는 것과 같이 해결되어야 하는 많은 문제점을 갖는다(Shigeru Kawakami and Mitsuru Hashida, Drug Metab. Pharmacokinet. 22(3): 142-151, 2007). 이러한 문제점들은 부분적으로 핵산 분해효소 저항성 유사체를 이용하거나 전달 기술을 개선하는 것으로 극복하려는 시도가 진행 중이다.
개선된 전달 기술의 예로서, 아데노바이러스, 레트로바이러스 등 바이러스를 이용한 유전자 전달기술과 리포좀과 양이온성 지질 그리고 양이온성 고분자 화합물을 이용한 비바이러스성 벡터(non-viral vector)에 의한 유전자 전달 기술들이 개발되어왔다. 그러나 바이러스성 전달체는 전달된 유전자가 숙주의 염색체에 이입 되어 숙주 유전자의 정상기능에 이상을 유도하거나 발암 유전자를 활성화시킬 가능성도 배제할 수 없기 때문에 안전성에 문제점이 있으며, 바이러스 유전자가 적은 양이라도 계속 발현이 되어 자가 면역증을 유발하거나, 바이러스 전달체로부터 변형된 형태의 바이러스 감염이 유발되는 경우 효율적인 방어 면역을 일으키지 못할 수 있다. 한편, 비바이러스성 전달체는 바이러스성 전달체에 비하여 효율성이 떨어지지만, 생체내 안전성과 경제성을 고려해 볼 때 부작용이 적고 생산 가격이 저렴하다는 장점은 있다(Lehrman S. Nature. 401(6753): 517-518, 1999). 또한, 비바이러스성 전달방법에서는 siRNA를 포함한 RNA 분자의 전달을 이루기 위해 효소 또는 비효소적인 분해에 대해 효과적으로 방어할 수 있는 방법이 요구되는데, 이 중 한 방법이 shRNA(short hairpin RNA)를 암호화한 DNA 발현 플라스미드를 활용하는 것으로, DNA를 통한 시스템은 발현벡터가 존재하는 동안에만 siRNA가 발현되는 장점을 갖는다. 더욱이 최근 siRNA를 화학적으로 변형시키는 연구를 통해 핵산 분해효소에 대한 불안정성 및 세포내 낮은 흡수율을 개선하는 방법이 제안되고 있다(Shigery Kawakami and Mitsuru Hashida. Drug Metab. Parmacokinet. 22(3): 142-151, 2007).
siRNA의 화학적인 변형 방법 중, 핵산 분해효소에 의해 분해되는 부분인 인산디에스테르 결합(phosphorodiester bond)을 인산황화결합(phosphorothioate linkage)로 변형하거나, 5탄당의 2' 부분을 2'-O-meRNA, 2'-디옥시-2'-플루오로유리딘(2'-디옥시-2'-fluouridine) 또는 2'와 4'을 연결하여 LNA(locked nucleic acid)의 형태로 변경하여 혈청내 안정성을 증진시킨 결과를 얻었다(Braasch D. A. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:1139-1143, 2003; Chiu Y. L. and Rana T. M., RNA, 9:1034-1048, 2003; Amarzguioui M. et al. Nucleic Acid Res. 31:589-595, 2003). 다른 형태의 화학적인 변형방법으로 센스(안티-가이드) 가닥의 3' 말단 부위에 작용기를 연결하여 대조군에 비하여 증진된 약동학적 특징을 갖게 하고, siRNA의 친수성/소수성의 균형을 통해 in vivo에 적용시 높은 효율을 유도할 수 있다는 것을 파악할 수 있었다(Soutschek J. et al. Nature 432:173-178. 2004).
그러나 상기 방법들은 siRNA를 분해효소로부터 보호하고, 효율적인 세포막 투과를 위해서는 여전히 미흡한 점이 많았다.
이에 본 발명자들은 siRNA에 친수성 또는 소수성 고분자 화합물을 분해성 또는 비분해성 결합을 이용하여 접합시킨 접합체가 siRNA의 생체내 안정성을 향상시키는 것을 발견하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 siRNA의 세포내 전달 효율성을 향상시키기 위해, siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 말단에 생체 적합성 고분자 화합물인 친수성 고분자 또는 소수성 고분자 화합물을 분해성 또는 비분해성 결합을 이용하여 접합시킨 접합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 고분자 화합물, 특히 인체 적용시 그 안정성이 입증된 고분자 화합물, 예컨대 PEG를 포함하고 있는 고형 지지체 및 상기 지지체를 이용하여 3'에 PEG가 결합된 RNA, DNA, RNA-DNA 키메라(chimera) 및 유사체(analog) 를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 siRNA 접합체의 제조방법 및 상기 siRNA 접합체를 이용한 siRNA의 전달방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 달성하기 위한 본 발명의 제1은 하기 구조의 siRNA와 고분자 화합물 접합체를 제공한다:
A-X-R-Y-B
(상기에서 A 및 B는 각각 독립적으로 친수성 고분자 또는 소수성 고분자 화합물, X, Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며, R은 siRNA를 나타낸다.)
또한, 본 발명의 제2는 하기 구조의 siRNA와 고분자 화합물 접합체를 제공한다:
A-X-R
(상기에서 A는 소수성 고분자 화합물이고, X는 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며, R은 siRNA를 나타낸다.)
또한, 본 발명의 제3은 상기 siRNA(R)의 단일가닥이 19 내지 31 개의 뉴클레오티드로 구성되는 접합체를 제공한다.
또한, 본 발명의 제4는 상기 소수성 고분자 화합물(A)이 분자량 250 내지 1,000인 소수성 고분자 화합물인 것을 특징으로 하는 접합체를 제공한다.
또한, 본 발명의 제5는 상기 소수성 고분자 화합물(A)이 C16-C50의 포화탄화수소 또는 콜레스테롤인 접합체를 제공한다.
또한, 본 발명의 제6은 상기 공유결합(X,Y)이 비분해성 결합 또는 분해성 결합인 접합체를 제공한다.
또한, 본 발명의 제7은 상기 비분해성 결합이 아미드 결합 또는 포스페이트 결합인 접합체를 제공한다.
또한, 본 발명의 제8은 상기 분해성 결합이 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 및 효소 분해성 결합 중에서 선택되는 접합체를 제공한다.
또한, 본 발명의 제9는 상기 친수성 고분자 화합물(A 또는 B)이 분자량 1,000 내지 10,000인 비이온성 고분자 화합물인 접합체를 제공한다.
또한, 본 발명의 제10은 상기 친수성 고분자 화합물이 폴리에틸렌글리콜(PEG, polyethylene glycol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone), 폴리옥사졸린(polyoxazoline)으로 구성된 군으로부터 선택되는 접합체를 제공한다.
또한, 본 발명의 제11은 하기 구조의 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체를 제공한다:
Figure 112009029086020-PAT00001
[상기에서 R은 알킬(alkyl), 알케닐(alkenyl), 알키닐(alkynyl), 아 릴(aryl), 아릴알킬(arylalkyl), 헤테로알킬(heteroalkyl) 또는 헤테로아릴(heteroaryl)이며; m은 2 내지 18의 정수이고, n은 5~120까지의 정수이고; X는 4,4'-디메톡시트리틸기(4,4'-dimethoxytrityl group)이다.]
또한, 본 발명의 제12는 상기 고형 지지체가 CPG(controlled pore glass)인인 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체를 제공한다.
또한, 본 발명의 제13은 상기 CPG는 직경이 40~180 ㎛이고 공극 크기 500Å~3000Å를 갖는 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체를 제공한다.
또한, 본 발명의 제14는 하기 구조를 갖는 3'-PEG(polyethylene glycol)-CPG인 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체를 제공한다:
Figure 112009029086020-PAT00002
또한, 본 발명의 제15는
1) CPG에 3-아미노프로필트리에톡시실란을 반응시켜 LCAA-CPG(Long Chain Alkyl Amine Controlled Pore Glass)를 형성하는 단계;
2) 폴리에틸렌글리콜에 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드를 반응시켜 2-[비스-(4-디메톡시트리틸-폴리(에틸렌글리콜)을 형성하는 단계;
3) 상기 2)에서 형성된 화합물과 하기 화학식 1의 화합물을 반응시켜 하기 구조식 Ⅰ의 화합물을 형성하는 단계;
4) 상기 형성된 하기 구조식 Ⅰ의 화합물과 4-니트로페닐클로로포르메이트를 반응시켜 하기 구조식 Ⅱ의 화합물을 형성하는 단계;
5) 상기 3)에서 형성된 하기 구조식 Ⅰ의 화합물과 N-숙신이미딜트리플루오로아세트산를 반응시켜 하기 구조식 Ⅲ의 화합물을 형성하는 단계;
6) 상기 1)에서 형성된 LCAA-CPG 화합물을 상기 3) 내지 5)에서 각각 형성된 하기 구조식 Ⅰ,Ⅱ 또는 Ⅲ의 화합물과 각각 반응시키는 단계를 포함하는 상기 제15의 3'-PEG-CPG의 제조방법:
[화학식 1]
Figure 112009029086020-PAT00003
[구조식 Ⅰ]
Figure 112009029086020-PAT00004
[구조식 Ⅱ]
Figure 112009029086020-PAT00005
[구조식 Ⅲ]
Figure 112009029086020-PAT00006
[구조식 Ⅳ]
Figure 112009029086020-PAT00007
[상기에서, R은 알킬(alkyl), 알케닐(alkenyl), 알키닐(alkynyl), 아릴(aryl), 아릴알킬(arylalkyl), 헤테로알킬(heteroalkyl) 또는 헤테로아릴(heteroaryl)이며; n은 5 이상 120 이하의 정수이다.]
또한, 본 발명의 제16은
1) 상기 제11의 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체를 이용하여 표적 유전자에 대한 siRNA를 제조하는 단계;
2) siRNA의 말단기와 폴리에틸렌글리콜을 공유결합으로 연결하는 단계를 포함하는 상기 siRNA 접합체의 제조방법.
또한, 본 발명의 제17은 상기 제1 또는 제2의 siRNA 접합체로 구성된 나노입자를 제공한다.
또한, 본 발명의 제18은
1) 상기 제17의 나노입자를 준비하는 단계; 및
2) 상기 나노입자를 동물의 체내로 투입하는 단계를 포함하는 유전자 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 제19는 상기 나노입자가 경구투여 또는 정맥주사의 방법으로 체내에 투여되는 것을 특징으로 하는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 제20은 상기 제1 또는 제2의 siRNA 접합체의 약학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 제21은 상기 제17의 나노입자의 약학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 구조의 siRNA와 고분자 화합물 접합체를 제공한다:
A-X-R-Y-B
상기에서 A 및 B는 각각 독립적으로 친수성 고분자 또는 소수성 고분자 화합물이고, X,Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며, R은 siRNA를 나타낸다.
또한, 본 발명은 하기 구조의 siRNA와 고분자 화합물 접합체를 제공한다:
A-X-R
상기에서 A는 소수성 고분자 화합물이고, X는 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며, R은 siRNA를 나타낸다.
본 발명의 접합체에 있어서, 상기 siRNA의 올리고 가닥은 19 내지 31 개의 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용가능한 siRNA는 유전자 치료용 또는 연구용으로 사용되거나 사용될 가능성이 있는 어떠한 유전자 유래의 siRNA도 채택될 수 있다.
상기 소수성 고분자 화합물은 분자량 250 내지 1,000인 소수성 고분자 화합물인 것이 바람직하다. 상기 소수성 고분자 화합물의 예로는 포화탄화수소, 바람직하게는 C16 내지 C50의 포화탄화수소, 콜레스테롤을 들 수 있다. 이때 소수성 고분자 화합물은 상기 포화탄화수소 및 콜레스테롤에만 한정되는 것은 아니다.
상기 소수성 고분자 화합물은 소수성 상호작용을 일으켜 siRNA와 소수성 고분자 화합물 접합체로 구성된 미셀을 형성하게 하는 역할을 수행한다. 상기 소수성 고분자 화합물 중에서도 특히 포화탄화수소의 경우, siRNA의 제조 단계에서 용이하게 접합시킬 수 있는 장점을 가지고 있어 본 발명의 접합체 제조에 매우 적합하다.
또한, 상기 공유결합(즉, X,Y)은 비분해성 결합 또는 분해성 결합 중 어느것이어도 무방하다. 이때, 비분해성 결합으로는 아미드 결합 또는 포스페이트 결합이 있고, 분해성 결합으로는 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합 등이 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 결합을 매개하는 링커는 친수성 고분자(또는 소수성 고분자)와 siRNA로 부터 유래된 잔기의 말단기를 공유적으로 결합시키며, 필요에 따라 소정의 환경에서 분해가 가능한 결합을 제공하는 한 특별히 한정되는 것은 아니다. 따라서, 상기 링커는 접합체의 제조과정 중 siRNA 및/또는 친수성 고분자(또는 소수성 고분자)를 활성화하기 위해 결합시키는 어떠한 화합물도 포함할 수 있다.
또한, 상기 친수성 고분자 화합물은 분자량 1,000 내지 10,000인 비이온성 고분자 화합물인 것이 바람직하다. 예를 들어, 친수성 고분자 화합물로는 폴리에틸렌글리콜(PEG, polyethylene glycol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone), 폴리옥사졸린(polyoxazoline) 등의 비이온성 친수성 고분자 화합물을 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 친수성 고분자 화합물의 기능기는 필요에 따라 다른 기능기로 치환되어도 무방하다. 상기 친수성 고분자 화합물 중에서도 특히 PEG는 다양한 분자량과 작용기를 도입할 수 있는 말단을 갖고 있으며, 생체내 친화성이 좋고 면역반응을 유도하지 않으며, 물에 대한 용해도를 증가시켜 생체내에서의 유전자 전달 효율을 증가 시키므로 본 발명의 접합체의 제조에 매우 적합하다.
또한, 본 발명은 하기 구조의 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체를 제공한다.
Figure 112009029086020-PAT00008
상기에서, 고형 지지체(solid support)는 예컨대 CPG(controlled pore glass), 폴리스티렌, 실리카겔, 셀룰로오스 페이퍼 등을 포함하되 이에 제한되지 않으며; R은 알킬(alkyl), 알케닐(alkenyl), 알키닐(alkynyl), 아릴(aryl), 아릴알킬(arylalkyl), 헤테로알킬(heteroalkyl) 또는 헤테로아릴(heteroaryl)이며; m은 2 내지 18의 정수이고, n은 5~120(Molar mass 282~5300)까지의 정수이고; X는 4,4'-디메톡시트리틸기(4,4'-dimethoxytrityl group)인데 산으로 처리 후 제거된다. 고형 지지체가 CPG인 경우 직경은 40~180 ㎛인 것이 바람직하며, 500Å~3000Å의 공극 크기를 갖는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 하기 구조를 갖는 3'-PEG(polyethylene glycol)-CPG인 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체를 제공한다:
Figure 112009029086020-PAT00009
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 3'-PEG-CPG의 제조방법을 제공한다:
1) CPG에 3-아미노프로필트리에톡시실란을 반응시켜 LCAA-CPG(Long Chain Alkyl Amine Controlled Pore Glass)를 형성하는 단계;
2) 폴리에틸렌글리콜에 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드를 반응시켜 2-[비스-(4-디메톡시트리틸-폴리(에틸렌글리콜)을 형성하는 단계;
3) 상기 2)에서 형성된 화합물과 하기 화학식 1의 화합물을 반응시켜 하기 구조식 Ⅰ의 화합물을 형성하는 단계;
4) 상기 형성된 하기 구조식 Ⅰ의 화합물과 4-니트로페닐클로로포르메이트를 반응시켜 하기 구조식 Ⅱ의 화합물을 형성하는 단계;
5) 상기 3)에서 형성된 하기 구조식 Ⅰ의 화합물과 N-숙신이미딜트리플루오로아세트산를 반응시켜 하기 구조식 Ⅲ의 화합물을 형성하는 단계;
6) 상기 1)에서 형성된 LCAA-CPG 화합물을 상기 3) 내지 5)에서 각각 형성된 하기 구조식 Ⅰ,Ⅱ 또는 Ⅲ의 화합물과 각각 반응시키는 단계를 포함하는 상기 제12의 3'-PEG-CPG의 제조방법:
[화학식 1]
Figure 112009029086020-PAT00010
[구조식 Ⅰ]
Figure 112009029086020-PAT00011
[구조식 Ⅱ]
Figure 112009029086020-PAT00012
[구조식 Ⅲ]
Figure 112009029086020-PAT00013
[구조식 Ⅳ]
Figure 112009029086020-PAT00014
[상기에서, R은 알킬(alkyl), 알케닐(alkenyl), 알키닐(alkynyl), 아릴(aryl), 아릴알킬(arylalkyl), 헤테로알킬(heteroalkyl) 또는 헤테로아릴(heteroaryl)이며; n은 5 이상 120 이하의 정수이다.]
또한, 본 발명은 상기 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체를 이용하여 siRNA와 PEG간의 접합체를 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로,
1) 상기 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체를 이용하여 표적 유전자에 대한 siRNA를 제조하는 단계;
2) siRNA의 말단기와 폴리에틸렌글리콜을 공유결합으로 연결하는 단계를 포함하는 상기 siRNA 접합체의 제조방법을 제공한다. 이를 통해 RNA, DNA, RNA-DNA 키메라 및 유사체를 포함한 올리고뉴클레오티드를 효율적으로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 siRNA 접합체로 구성된 나노입자를 제공한다.
본 발명의 siRNA와 고분자 화합물 접합체는 상호작용에 의하여 나노입자 구조를 형성할 수 있으며, 이렇게 형성된 siRNA와 고분자 화합물 접합체와 siRNA 고분자 화합물 접합체로 구성된 나노입자는 siRNA의 세포내 전달을 향상시키며, 이를 질병 모델의 치료목적으로 응용하는 것이 가능하다. 보다 구체적인 접합체의 제조와 접합체로 구성된 나노입자의 특징, 세포 전달 효율 및 효과는 후술하는 실시예에서 더욱 상세히 설명한다.
또한, 본 발명은 상기 나노입자를 이용한 유전자 치료방법을 제공한다.
구체적으로 상기 siRNA 고분자 화합물 접합체로 구성된 나노입자를 준비하는 단계와 상기 나노입자를 동물의 체내로 투입하는 단계를 포함하는 유전자 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 siRNA 접합체로 구성된 나노입자의 약학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 투여를 위하여 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 오나충액, 정균제 등 다근 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's pharmaceutical Science(Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술 분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공 될 수도 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다.
이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 약제학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화 할 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술 분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 siRNA 고분자 화합물 접합체로 구성된 나노입자는 siRNA의 생체내 안정성을 향상시킴으로써 세포내로 치료용 siRNA를 효율적으로 전달할 수 있으며, 트랜스펙션(transfection) 물질 없이도 비교적 낮은 농도의 투여량에서 siRNA의 활성을 나타낼 수 있으므로, 암 및 다른 감염성 질환을 위한 siRNA 치료용 도구 뿐만 아니라, 새로운 형태의 siRNA 전달 시스템으로 생명공학을 위한 기초연구 및 의학 산업상 매우 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용을 한정하지는 않는다.
실시예 1. 3'-PEG 올리고뉴클레오티드의 제조를 위한 고형 지지체의 제조
3'-PEG 올리고뉴클레오티드의 제조를 위한 고형 지지체를 제조하였다.
실시예 1-1. LCAA-CPG(Long Chain Alkyl Amine Controlled Pore Glass)와의 결합을 위한 3'-PEG 시약(화합물 A, B, C)의 제조
이후의 실시예에서, 하기 반응식에 나타난 바와 같이 3'-PEG-CPG를 제조하였다.
Figure 112009029086020-PAT00015
실시예 1-1-1. 2-[비스-(4-디메톡시트리틸-폴리(에틸렌글리콜)의 제조
출발물질 폴리에틸렌글리콜 2000(Alfa Aesar GmbH & Co. KG, 독일) 30g(15mmol)을 피리딘(pyridine, Sigma Aldrich, 미국) 270㎖에 녹이고, 여기에 트리에틸아민(Sigma Aldrich, 미국) 3.55㎖(25.5mmol)과 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드(4,4'-dimethoxy trityl chloride, GL biochem, 중국) 7.12g(21mmol)을 넣어 상온에서 20시간 반응시켰다. 반응이 완료된 반응 혼합물을 농축하고 에틸아세테이트 450㎖와 물 450㎖로 추출하고, 감압 농축 후 진공 건조하여 2-[비스-(4-디메톡시트리틸-폴리(에틸렌글리콜)2-[Bis-(4-dimethoxytrityl)-poly(ethylene glycol) 23g(66%)을 얻었다.
상기 화합물의 1H NMR 데이터를 도 2에 나타내었다.
1H NMR(CDCl3); δ 1.93(br,1,OH), 3.20-3.80(m,186,PEG,DMT-OCH3), 6.80-6.83(m,4,DMT), 7.19-7.47(m,9,DMT)
실시예 1-1-2. 숙신산 2-[비스-(4-디메톡시트리틸)-폴리(에틸렌글리콜)][화합물 A]의 제조
상기 실시예 1-1-1에서 얻어진 2-[비스-(4-디메톡시트리틸-폴리(에틸렌글리콜) 3.9g(1.672mmol)을 피리딘 20㎖에 녹인 후 0℃로 냉각하였다. 상기 반응물에 숙신산 무수물(succinic anhydride, Acros Organics, 미국) 351mg(3.512mmol)과 DMAP(4-dimethylaminopyridine, Sigma Aldrich, 미국) 42.5mg(0.334mmol)을 첨가한 후 50℃에서 3일간 교반한 후 반응을 종결하였다. 반응이 완료된 반응 혼합물을 감압 농축하여 숙신산 2-[비스-(4-디메톡시트리틸)-폴리(에틸렌글리콜)[Succinic acid 2-[bis-(4-dimethoxytrityl)-poly(ethylene glycol)][화합물 A] 3.65g(90%, 흰색고체)를 얻었다.
상기 화합물의 1H NMR 데이터를 도 3에 나타내었다.
1H NMR(CDCl3); δ 2.65(m,2,CH2CO), 3.20-3.88(m,186,PEG,DMT-OCH3), 4.25(m,2,CH2CO), 6.80-6.82(m,4,DMT), 7.19-7.47(m,9,DMT).
실시예 1-1-3. 파라-니트로페닐숙신산 2-비스-(디메톡시트리틸)-폴리(에틸렌글리콜)[화합물 B]의 제조
상기 실시예 1-1-2에서 얻어진 화합물 A 1g(0.411mmol)을 메틸렌클로라이드(methylene chloride, 대연화학, 한국) 20㎖에 녹이고 0℃로 냉각하였다. 상기 반응물에 트리에틸아민 143㎕(1.03mmol)를 넣고, 4-니트로페닐클로로포르메이트(4-nitro phenyl chloroformate) 149mg(0.740mmol)를 첨가하여, 30분 동안 상온으로 온도를 올린 후 4시간 교반 후 반응을 종결하였다. 반응이 완료된 반응 혼합물을 수성의 포화된 NaHCO3 20㎖와 0℃~4℃로 냉각된 1M 시트르산(Sigma Aldrich, 미국) 5㎖로 1회 세정한 후, Na2SO4(Samchum Chemical Co., 한국)로 건조하였다. 이를 필터링 플라스크(filtering flask), 흡인 여과기(buchner funnel), 진공장치(aspirator)를 이용하여 여과 후 감압 농축하여 파라-니트로페닐숙신산 2-비스-(디메톡시트리틸)-폴리(에틸렌글리콜)(p-Nitrophenylsuccinic acid 2-[bis-(4- dimethoxytrityl)-poly(ethylene glycol)[화합물 B] 1.0g(94%, 미색 고체)을 얻었다.
상기 화합물의 1H NMR 데이터를 도 4에 나타내었다.
1H NMR(CDCl3); δ 2.80-2.90(m,2,CH2CO), 3.20-3.87(m,186,PEG,DMT-OCH3),4.25(m,2,CH2CO), 6.80-6.82(m,4,DMT), 7.19-7.47(m,9,DMT)
실시예 1-1-4. 2,5-디옥소-피롤리딘-1-일에스테르 숙신산 2-비스-(4-디메톡시트리틸-폴리(에틸렌글리콜)[화합물 C]의 제조
상기 실시예 1-1-2에서 얻어진 화합물 A 500mg(0.206mmol)을 메틸렌클로라이드 10㎖에 녹인 후 피리딘 83.14㎕(1.03mmol)를 넣었다. 여기에, N-숙신이미딜트리플루오로아세트산(N-succinimidyl trifluoro acetic acid, Sigma Aldrich, 미국) 165mg(0.781mmol)를 첨가하여 상온에서 7시간 교반 후 반응을 종결하였다. 반응이 완료된 반응 혼합물을 감압 농축하여 2,5-디옥소-피롤리딘-1-일에스테르 숙신산 2-비스-(4-디메톡시트리틸-폴리(에틸렌글리콜)(2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl ester succinic acid 2-[bis-(4-dimethoxytrityl)-poly(ethyleneglycol)[화합물 C] 490mg(94%, 흰색 고체)를 얻었다.
상기 화합물의 1H NMR 데이터를 도 5에 나타내었다.
1H NMR(CDCl3);δ 2.72-2.97(m,6,CH2CO,CH2CH2), 3.20-3.87(m,186,PEG,DMT-OCH3), 4.27-4.28(m,2,CH2CO), 6.80-6.83(m,4,DMT), 7.20-7.47(m,9,DMT)
실시예 1-2. LCAA-CPG와 3'-PEG 시약(화합물 A)의 결합
이후의 실시예에서, 하기 반응식에 나타난 바와 같이 CPG(Controlled Pore Glass)와 3'-PEG 시약을 결합시켰다.
Figure 112009029086020-PAT00016
실시예 1-2-1. LCAA-CPG(2000Å) 제조
직경 40~75 ㎛, 세공 2000Å의 CPG(Silicycle Inc., 캐나다) 10g을 톨루엔 100㎖에 골고루 섞어 적셔준 후, 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane, TCI Org. Chem, 일본) 2㎖를 넣어 섞고 상온에서 8시간 반응시켰다. 반응이 완료된 혼합물을 여과하고 메탄올, 물, 메틸렌클로라이드의 순서로 세정한 후 진공 건조시켜 LCAA-CPG(2000Å)를 10g을 얻었다.
실시예 1-2-2. 숙신산 2-[비스-(4-디메톡시트리틸)-폴리(에틸렌글리콜)[화합물 A]을 사용한 3'-PEG-CPG(2000Å) 제조
상기 실시예 1-2-1에서 얻어진 LCAA-CPG(2000Å) 2g을 메틸렌클로라이드 20㎖에 적셔 놓았다. 또한, 화합물 A 80mg과 TEA(Triethylamine, Sigma Aldrich, 미국) 14㎕, BOP(Benzortiazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorophosphate, TCI Org. Chem, 일본) 15mg, HOBT(1-Hydroxybenzotriazole anhydrous, TCI Org. Chem, 일본) 5mg를 메틸렌클로라이드 2㎖에 녹인 용액을 상기 LCAA-CPG(2000Å) 용액과 골고루 섞었다. 이를 8시간 동안 환류반응시킨 후 반응이 완료된 혼합물을 여과하고 메탄올, 물, 메틸렌클로라이드로 순서대로 세정한 후 진공 건조시켰다.
이 중 1g에 피리딘 10㎖를 넣어 적셔준 후 1-메틸이미다졸(Sigma Aldrich, 미국) 1㎖와 아세트산 무수물(Sigma Aldrich, 미국) 1.6㎖를 넣어 골고루 섞고, 상온에서 8시간 반응시켰다. 반응이 완료되어 얻어진 캡핑(Capping) 완료된 CPG를 메탄올, 물, 메탄올, 메틸렌클로라이드 순서로 세정한 후 진공 건조시켜 3'-PEG-CPG 1g을 얻었다.
실시예 1-3. LCAA-CPG(2000Å)와 3'-PEG 시약(화합물 B)의 결합
Figure 112009029086020-PAT00017
화합물 B를 사용하여 3'-PEG-CPG(2000Å) 제조를 수행하였다.
구체적으로 실시예 1-2-1에서 얻어진 LCAA-CPG(2000Å) 1g을 피리딘 8㎖에 충분히 적셔 놓았다. 또한, 화합물 B 205mg(2eq)과 트리에틸아민 55㎕를 피리딘 2㎖에 녹인 용액을 상기 LCAA-CPG 용액과 골고루 섞었다. 이를 50~60℃에서 8시간 반응시킨 후, 반응이 완료된 혼합물을 여과하고 여과된 커플링-CPG 를 메탄올, 물, 메틸렌클로라이드로 순서대로 세정한 후 진공 건조시켰다. 건조 완료된 커플링-CPG 1g에 피리딘 10㎖를 넣어 적셔준 후 1-메틸 이미다졸 500㎕ 아세트산 무수물 800㎕를 넣어 골고루 섞고, 상온에서 8시간 반응시켰다. 반응이 완료된 혼합물을 여과하고 커플링-CPG를 메탄올, 물, 메틸렌클로라이드로 순서대로 세정한 후 진공 건조시켜 3'-PEG-CPG 1g을 얻었다.
도 6은 3'-PEG-CPG를 출발물질로 siRNA를 제조 후 Maldi-Tof 분자량 확인 결과이다.
3'-PEG-CPG 제조 서열;
sense 5'-AAGGAGAUCAACAUUUUCA(dTdT)-PEG(6664.96Da + 2000Da)
antisense 5'-UGAAAAUGUUGAUCUCCUU(dTdT)-PEG(6592.84Da + 2000Da)
PEG의 분자량(2000Da) 만큼 Maldi-Tof 분자량이 증가하였음을 확인할 수 있다.
실시예 1-4. LCAA-CPG(2000Å)와 3'-PEG 시약(화합물 C)의 결합
Figure 112009029086020-PAT00018
화합물 C를 사용하여 3'-PEG-CPG(2000Å) 제조를 수행하였다.
구체적으로 상기 실시예 1-2-1에서 얻어진 LCAA-CPG(2000Å) 1g을 피리딘 8㎖에 충분히 적셔 놓았다. 또한, 화합물 C 200mg과 트리에틸아민 55㎕를 피리딘 2㎖에 녹인 용액을 상기 LCAA-CPG 용액과 골고루 섞었다. 50~60℃에서 8시간 반응시킨 후, 반응이 완료된 혼합물을 여과하고 여과된 커플링-CPG 를 메탄올, 물, 메틸렌클로라이드 순서로 세정한 후 진공 건조시켰다. 건조 완료된 커플링-CPG 1g에 피리딘 10㎖를 넣어 적셔준 후 1-메틸이미다졸 500㎕와 아세트산 무수물 800㎕를 넣어 골고루 섞고, 상온에서 8시간 반응시켰다. 반응이 완료되어 얻어진 캡핑완료된 CPG를 메탄올, 물, 메틸렌클로라이드 순서로 세정한 후 진공 건조시켜 3'-PEG-CPG 1g을 얻었다.
도 7은 3'-PEG-CPG를 출발물질로 siRNA를 제조한 결과이다.
3'-PEG-CPG 제조 서열;
sense 5'-AAGGAGAUCAACAUUUUCA(dTdT)-PEG(6664.96Da + 2000Da)
antisense 5'-UGAAAAUGUUGAUCUCCUU(dTdT)-PEG(6592.84Da + 2000Da)
PEG의 분자량(2000Da) 만큼 Maldi-Tof 분자량이 증가하였음을 확인할 수 있다.
실시예 2. siRNA 고분자 화합물 접합체의 제조
이하 실시예에서는 서바이빈(survivin)을 억제하기 위해 서바이빈(survivin siRNA)를 사용하였다. 서바이빈은 지금까지 테스트된 대부분의 신생 종양이나 형질변이된 세포주에서 공통적으로 발현되는 단백질로서, 항암치료에 있어서 중요한 타겟이 될 것으로 예측되고 있다(Abbrosini G. et al. Nat. Med. 3(8): 917-921, 1997). 본 발명의 서바이빈 siRNA의 서열은 19개 뉴클레오티드로 구성된 경우, 서열번호 1번으로 기재되는 센스 가닥과 이에 상보적인 서열인 안티센스 가닥으로 구성되어 있다. 그 밖에 23개, 27개, 31개의 뉴클레오티드로 구성된 경우, 서열번호 2, 3, 4로 기재되는 염기서열을 갖는다.
(서열번호 1) 5'-AAGGAGAUCAACAUUUUCA-3'
(서열번호 2) 5'-AGGAAAGGAGAUCAACAUUUUCA-3'
(서열번호 3) 5'-AGGAAAGGAGAUCAACAUUUUCAAAUU-3'
(서열번호 4) 5'-AAAGGAGAUCAACAUUUUCAAAUUAGAUGUU-3'
상기 siRNA는 β-시아노에틸 포스포라미다이트'(β-cyanoethyl phosphoramidite)를 이용하여 RNA 골격 구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해 가는 방법을 사용하여 제조하였다(Shina et al. Nucleic Acids Research, 12:4539-4557, 1984). 구체적으로, RNA 합성기(384 Synthesizer, BIONEER, 한국) 를 사용하여, 뉴클레오티드가 부착된 고형 지지체 상에서, 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 산화(oxidation) 및 캐핑(capping)으로 이루어지는 일련의 과정을 반복하여 원하는 길이의 RNA를 포함하는 반응물을 수득하였다.
추가적으로 5'말단 부위에 PEG 또는 소수성 고분자 화합물인 도데칸(dodecane) 링커를 이용하여 헥사데칸(hexadecane, C16)이나 옥타데칸(octadecane, C18) 포화탄화수소를 이어 siRNA 고분자 화합물 접합체를 만들었다. 또한, 상기 실시예 1에서 제조된 3'PEG-CPG를 지지체로 상기 반응을 수행하여, 3' 말단 부위에 PEG가 부여된 siRNA 고분자 화합물 접합체를 제조하였다.
상기 반응물들을 HPLC(LC-20A Prominence, SHIMADZU, 일본)를 이용하여 RNA를 분리하고, 이를 MALDI-TOF 질량 흡광분석기(MALDI TOF-MS, SHIMADZU, 일본)를 이용하여 분자량을 측정하여, 제조하고자 하는 염기서열과 부합하는지 확인하였다. 그 후, 센스와 안티센스 RNA 가닥을 동량 혼합하여 1X 어닐링 버퍼(30mM HEPES, 100mM Potassium acetate, 2mM Magnesium acetate, pH 7.0~7.5)에 넣고, 90℃ 항온수조에서 3분 반응시킨 후 다시 37℃에서 반응시켜, 목적하는 이중가닥 siRNA 고분자 화합물 접합체를 각각 제조하였다. 제조된 siRNA 고분자 화합물 접합체는 표 1에 표시된 구조를 갖는다. 제조된 siRNA 고분자 화합물 접합체는 전기영동 사진을 통하여 어닐링을 확인하였다(도 8).
[표 1] siRNA 고분자 화합물 접합체의 구조 및 말단 변형 형태
접합체명 접합체 구조명 말단 변형 형태
siRNA naked siRNA Sense: none
Antisense: none
siRNA 고분자 화합물 접합체 1 5'PEG-sense siRNA Sense: 5'PEG
Antisense: none
siRNA 고분자 화합물 접합체 2 5'PEG-antisense siRNA Sense: none
Antisense: 5'PEG
siRNA 고분자 화합물 접합체 3 5'ssPEG-antisense siRNA Sense: none
Antisense: 5'ssPEG
siRNA 고분자 화합물 접합체 4 5'PEG+PEG siRNA Sense: 5'PEG
Antisense: 5'PEG
siRNA 고분자 화합물 접합체 5 5'PEG+ssPEG siRNA Sense: 5'PEG
Antisense: 5'ssPEG
siRNA 고분자 화합물 접합체 6 3'PEG-sense siRNA Sense: 3'PEG
Antisense: none
siRNA 고분자 화합물 접합체 7 3'PEG-antisense siRNA Sense: none
Antisense: 3'PEG
siRNA 고분자 화합물 접합체 8 3'PEG+PEG siRNA Sense: 3'PEG
Antisense: 3'PEG
siRNA 고분자 화합물 접합체 9 5'C18-sense siRNA Sense: 5'C18-C6-ss-C6
Antisense: none
siRNA 고분자 화합물 접합체 10 5'C18+PEG siRNA Sense: 5'C18-C6-ss-C6
Antisense: 5'PEG
siRNA 고분자 화합물 접합체 11 5'C16+PEG siRNA Sense: 5'C16-C6-ss-C6
Antisense: 5'PEG
siRNA 고분자 화합물 접합체 12 5'C18-antisense siRNA Sense: none
Antisense: 5'C18-C6-ss-C6
siRNA 고분자 화합물 접합체 13 5'C18+PEG siRNA Sense: 5'PEG
Antisense: 5'C18-C6-ss-C6
siRNA 고분자 화합물 접합체 14 5'C16+PEG siRNA Sense: 5'PEG
Antisense: 5'C16-C6-ss-C6
* 상기 접합체 구조 중 "ss"는 이황화 결합을 의미함.
실시예 3. siRNA 고분자 화합물 접합체의 생체내 조건에서의 안정성 평가
상기 실시예 2에서 제조, 분리한 siRNA 고분자 화합물 접합체가 고분자 화합물이 결합되지 않은 원래의 siRNA에 비하여 안정성이 향상되었는지를 확인하였다. 변형되지 않은 원래의 siRNA와 상기 실시예 2에서 제조한 siRNA 고분자 화합물 접합체 1 내지 5를 생체내 조건을 모방한 형태인 10 % FBS(fetal bovine serum)가 첨가된 배지에서 각각 0, 1, 3, 6, 9, 12, 24, 36 또는 48시간 동안 배양한 후 siRNA 의 분해된 정도를 전기영동으로 검토하였다.
그 결과, PEG가 도입된 siRNA 고분자 화합물 접합체의 경우 48시간까지도 siRNA가 안정성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 9). 100% 혈청 조건에서도 12시간 내지 24시간까지 siRNA가 안정성을 나타내었다.
실시예 4. siRNA 소수성 고분자 화합물 접합체의 나노입자 크기 측정
siRNA 고분자 화합물 접합체 9 내지 14의 경우 siRNA의 말단에 부여된 소수성 고분자 화합물간의 소수성 상호작용에 의하여 siRNA 고분자 화합물 접합체로 이루어진 나노입자, 즉 미셀(micelle)를 형성하게 된다(도 10). 제타 전위 측정기(zeta-potential measurement)를 통하여 상기 나노입자의 크기를 측정하였다.
상기 실시예 2에서 제조한 각각의 siRNA 고분자 화합물 접합체 9 내지 13과 siRNA의 나노입자 크기를 측정하였다.
구체적으로, 상기 siRNA 및 siRNA 고분자 화합물 접합체 2nmole을 1㎖의 증류수에 녹인 뒤, 초음파 분산기(Wiseclean, DAIHAN, 한국)로 나노입자의 크기를 균질화(200W, 40 kHz, 5sec)하였다. 균질화된 나노입자는 제타 전위 측정기(Nano-ZS, MALVERN, 영국)로 크기를 측정하였는데, 물질에 대한 굴절율(Refractive index)은 1.454 , 흡수율(Absorption index)은 0.001로 하고, 용매인 물의 온도 25℃ 및 그에 따른 점도 및 굴절율을 입력하여 측정하였다. 1회 측정은 20번 반복으로 구성된 크기 측정으로 이루어졌고, 이를 3회 반복하였다.
도 11은 siRNA 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 입자의 크기를 나타낸 결과이다. siRNA로 구성된 나노입자의 경우 142-295nm(최고점 164nm)의 크기를 가진 것이 73.5%를 차지함을 알 수 있다.
도 12는 siRNA 고분자 화합물 접합체 9로 구성된 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 입자의 크기를 나타낸 결과이다. siRNA 고분자 화합물 접합체 9로 구성된 나노입자의 경우 4.19-7.53nm(최고점 6.50nm)의 크기를 가진 것이 59.1%를 차지함을 알 수 있다.
도 13은 siRNA 고분자 화합물 접합체 10으로 구성된 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 입자의 크기를 나타낸 결과이다. siRNA 고분자 화합물 접합체 10으로 구성된 나노입자의 경우 5.61-10.1nm(최고점 8.72nm)의 크기를 가진 것이 58.9%를 차지함을 알 수 있다.
도 14는 siRNA 고분자 화합물 접합체 11로 구성된 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 입자의 크기를 나타낸 결과이다. siRNA 고분자 화합물 접합체 11로 구성된 나노입자의 경우 5.61-10.1nm(최고점 8.72nm)의 크기를 가진 것이 45.6%를 차지함을 알 수 있다.
도 15는 siRNA 고분자 화합물 접합체 12로 구성된 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 입자의 크기를 나타낸 결과이다. siRNA 고분자 화합물 접합체 12로 구성된 나노입자의 경우 4.85-5.61nm의 크기를 가진 것이 23.6%, 21.0-32.7nm의 크기를 가진 것이 23.5%, 68.1-78.8nm의 크기를 가진 것이 23.1%를 차지함을 알 수 있다.
도 16은 siRNA 고분자 화합물 접합체 13으로 구성된 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 나노입자의 크기를 나타낸 결과이다. siRNA 고분자 화합물 접합체 13로 구성된 나노입자의 경우 4.85-8.72nm(최고점 5.61nm)의 크기를 가진 것이 84.6%를 차지함을 알 수 있다.
siRNA 고분자 화합물 접합체 9 내지 13으로 구성된 나노입자의 경우 siRNA 접합체 12를 제외하고 4-8 nm의 크기를 가진 것이 대부분이었다. siRNA 접합체 12의 경우 나노입자가 가진 사이즈가 다양하게 측정되었는데, 이는 측정하는 과정에서 초음파 분산기를 통해 균질화하여도, 시간이 경과함에 따라 각 나노입자들이 응집되는 현상을 나타내기 때문인 것으로 여겨진다. 도 12 내지 16에서 알 수 있듯이 측정된 siRNA 접합체로 구성된 나노입자의 사이즈는 100nm 이하의 크기를 나타내며, 이는 음세포 작용(pinocytosis)을 통해 세포내로 섭취되기에 충분한 크기이다(Kenneth A. Dawson et al. nature nanotechnology 4:84-85, 2009).
실시예 5. siRNA 고분자 화합물 접합체와 트랜스팩션 물질(transfection reagent)을 이용한 종양 세포주에서의 목표 유전자의 발현 억제
상기 실시예 2에서 제조한 각각의 siRNA 고분자 화합물 접합체 1 내지 8을 이용하여 종양세포주인 인간 자궁암 세포주를 트랜스펙션시키고, 상기 트랜스펙션된 종양세포주에서 서바이빈 유전자의 발현 양상을 분석하였다.
실시예 5-1. 종양 세포주의 배양
미국 종균협회(American type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 자궁암 세포(Hela)는 RPMI 1640 배양배지(GIBCO, Invitorgen, 미국)에 10 %(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고 37℃, 5 %(v/v) CO2의 조건하에 배양하였다.
실시예 5-2. siRNA 고분자 화합물 접합체를 이용한 목표 유전자의 발현 억제
상기 실시예 2에서 제조한 siRNA 고분자 화합물 접합체 1 내지 8를 이용하여 종양세포주인 인간 자궁암 세포주(HeLa)를 트랜스펙션시키고, 상기 트랜스펙션된 종양세포주에서 서바이빈의 발현 양상을 분석하였다.
실시예 5-2-1. siRNA 고분자 화합물 접합체를 이용한 종양세포주의 트랜스펙션
상기 실시예 5-1에서 배양된 종양세포주 1.3 × 105 을 37℃, 5 %(v/v) CO2의 조건으로 6-웰 플레이트에서 18시간 동안 RPMI 1640에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰당 800㎕의 Opti-MEM 배지(GIBCO, 미국)를 분주하였다.
한편, Lipofectamine™ 2000(Invitrogen, 미국) 2㎕와 Opti-MEM 배지 198㎕를 혼합하고, 실온에서 5분간 반응시킨 다음, 상기 실시예 2에서 제조한 각각의 siRNA 고분자 화합물 접합체(25pmole/㎕) 0.8 또는 4㎕를 첨가하고(최종 20, 100 nM 처리), 다시 실온에서 20분간 반응시켜서 용액을 제조하였다.
그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰에 트랜스펙션용 용액을 각각 200㎕ 씩 분주하고 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하였다. 여기에 RPMI 1640 배양배지 2.5 ㎖를 분주한 다음 24 시간동안 37℃, 5%(v/v) CO2의 조건하에 배양하였다.
실시예 5-2-2. 서바이빈 유전자의 mRNA 상대적 정량 분석
상기 실시예 5-2-1에서 트랜스펙션된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 통하여 서바이빈 유전자의 mRNA 양을 상대 정량하였다.
실시예 5-2-2-1.트랜스펙션된 세포로부터 RNA 분리 및 cDNA 제조
RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, 한국)를 이용하여, 상기 실시예 5-2-1에서 트랜스펙션된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower　 CycleScript RT Premix/dT20, Bioneer, 한국)를 이용하여, 다음과 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다.
구체적으로, 0.25㎖ 에펜도르프 튜브에 담겨있는 AccuPower　 CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer, 한국)에 한 튜브당 추출된 RNA를 1㎍씩 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 첨가하였다. 이를 유 전자 증폭기기(MyGenie™ 96 Gradient Thermal Block, BIONEER, 한국)로, 30℃에서 1분 동안 RNA와 프라이머를 혼성화하고, 52℃에서 4분간 cDNA를 제조하는 두 과정을 6번 반복한 뒤, 95℃에서 5분 동안 효소를 불활성화시켜 증폭 반응을 종료하였다.
실시예 5-2-2-2. 서바이빈의 mRNA 상대적 정량 분석
상기 실시예 5-2-2-1에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 통해 서바이빈 mRNA의 상대적인 양을 다음과 같은 방법으로 정량하였다.
즉, 96-웰 플레이트의 각 웰에 상기 실시예 5-2-2-1에서 제조된 cDNA를 1/5로 증류수로 희석하고, 서바이빈의 발현량을 분석하기 위해서 희석된 cDNA 3㎕와 2× GreenStar™ PCR master mix(BIONEER, 한국)를 10㎕, 증류수 6㎕, 서바이빈 qPCR primer(10pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)을 1㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스 키핑 유전자(housekeeping gene, 이하 HK 유전자)인 HMBS(Hydroxymethyl-bilane synthase), HPRT1(Hypoxanthine phosphoribosyl-transferase1), UBC(Ubiquitin C), YWHAZ(Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activtion protein, zeta polypeptide)를 표준 유전자로 하여 상기 실시예 5-2-2-1에서 제조된 cDNA를 1/5로 희석하고, 96-웰 플레이트 각 웰에 희석된 동일한 cDNA 3㎕와 2× GreenStar™ PCR master mix(BIONEER, 한국)를 10㎕, 증류수 6㎕, 각 HK 유전자 qPCR primer(10pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)를 1㎕ 넣어 HK 유전자 실시간 PCR 혼합액을 만들었다. 혼합액이 담긴 96-웰 플레이트를 Exicycler™ 96 Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER, 한국) 을 이용하여 다음과 같은 반응을 수행하였다:
95℃에서 15분간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94℃에서 30초 변성(denaturing), 58℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42 회 반복수행하고, 72℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55℃에서 1분간 온도를 유지하고, 55℃ - 95℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다.
PCR이 종료된 후, 각각 수득한 서바이빈의 Ct(threshold cycle)값은 HK 유전자를 통해 정규화된 mRNA 값(normalization factor, NF)을 계산하여 보정된 서바이빈의 Ct 값을 구한 뒤, 트랜스펙션 물질만 처리된 실험군을 대조군으로 하여 ΔCt 값의 차이를 구했다. 상기 ΔCt 값과 계산식 2(-ΔCt) X 100을 이용하여 서바이빈의 mRNA 발현율을 비교하였다(도 17). mock은 트랜스펙션 물질만이 처리된 대조군을 의미한다.
그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이 친수성 고분자 화합물인 PEG가 접합된 형태의 siRNA 고분자 화합물 접합체의 말단 변형 형태에 따라 siRNA의 RNAi 효과에 변화가 나타남을 알 수 있다. 특히, 접합체 6 내지 8의 말단 변형 형태는 3' 말단 부위에 PEG를 접합시킨 접합체로서 변형시키지 않은 siRNA와 유사한 정도의 발현 저해를 나타내어, siRNA의 RNAi 메카니즘상 RNA-유도성 사일런싱 복합체(RNA- induced silencing complex, RISC)와 복합체를 형성하는 데 있어 입체장애(steric hindrance)를 적게 주는 것으로 예상된다. 또한, 대부분의 siRNA-PEG 접합체는 저농도(20nM) 조건이 고농도(100nM) 처리 조건에 비해 높은 목표 유전자 mRNA의 발현 저해를 나타내어, 고농도 조건일수록 PEG로 인해 siRNA가 RISC와 결합하는 것이 방해되는 것으로 예상된다.
실시예 5-3. 긴 서열의 siRNA 고분자 화합물 접합체를 이용한 목표유전자의 발현 억제
siRNA 서열번호 1 내지 4의 염기서열에 siRNA 고분자 화합물 접합체 4 구조로 말단 변형을 유도한 siRNA를 이용하여, 트랜스펙션 물질과 함께 siRNA 친수성 고분자 화합물 접합체로 세포를 트랜스펙션시켰을 때 목표 유전자의 mRNA 발현 저해를 분석하였다.
실시예 5-3-1. siRNA 고분자 화합물 접합체를 이용한 종양세포주의 트랜스펙션
상기 실시예 5-1에서 배양된 종양세포주 1.3 × 105 을 상기 37℃, 5%(v/v) CO2의 조건 6-웰 플레이트에서 24시간 동안 RPMI 1640에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰당 800㎕의 Opti-MEM 배지를 분주하였다.
한편, Lipofectamine™ 2000 2㎕와 Opti-MEM 배지 198㎕를 혼합하고, 실온에 서 5분간 반응시킨 다음, 상기 실시예 2에서 제조한 각각의 siRNA 고분자 화합물 접합체(25pmole/㎕) 0.8 또는 4㎕를 첨가하고(최종 20, 100 nM 처리), 다시 실온에서 20분간 반응시켜서 용액을 제조하였다.
그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰에 트랜스펙션용 용액을 각각 200㎕ 씩 분주하고 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하였다. 여기에 RPMI 1640 배양배지 2.5 ㎖를 분주한 다음 24 시간동안 37℃, 5%(v/v) CO2의 조건하에 배양하였다.
실시예 5-3-2. 서바이빈 유전자의 mRNA 상대적 정량 분석
상기 실시예 5-3-1에서 트랜스펙션된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 통하여 서바이빈 유전자의 mRNA 양을 상대 정량하였다.
실시예 5-3-2-1.트랜스펙션된 세포로부터 RNA 분리 및 cDNA 제조
RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, 한국)를 이용하여, 상기 실시예 5-3-1에서 트랜스펙션된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower　 CycleScript RT Premix/dT20, Bioneer, 한국)를 이용하여, 다음과 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다.
구체적으로, 0.25㎖ 에펜도르프 튜브에 담겨있는 AccuPower　 CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer, 한국)에 한 튜브당 추출된 RNA를 1㎍씩 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 첨가하였다. 이를 유전자 증폭기기(MyGenie™ 96 Gradient Thermal Block, BIONEER, 한국)로, 30℃에서 1분 동안 RNA와 프라이머를 혼성화하고, 52℃에서 4분간 cDNA를 제조하는 두 과정을 6번 반복한 뒤, 95℃에서 5분 동안 효소를 불활성화시켜 증폭 반응을 종료하였다.
실시예 5-3-2-2. 서바이빈의 mRNA 상대적 정량 분석
상기 실시예 5-3-2-1에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 통해 TRAF7 mRNA의 상대적인 양을 다음과 같은 방법으로 정량하였다.
즉, 96-웰 플레이트의 각 웰에 상기 실시예 5-3-2-1에서 제조된 cDNA를 1/5로 희석하고, 서바이빈의 발현량을 분석하기 위해서 희석된 cDNA 3㎕와 2× GreenStar™ PCR master mix(BIONEER, 한국)를 10㎕, 증류수 6㎕, 서바이빈 qPCR primer(10pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)을 1㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스 키핑 유전자(housekeeping gene, 이하 HK 유전자)인 HMBS(Hydroxymethyl-bilane synthase), HPRT1(Hypoxanthine phosphoribosyl-transferase1), UBC(Ubiquitin C), YWHAZ(Tyrosine 3- monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activtion protein, zeta polypeptide)를 표준 유전자로 하여, 5-3-2-1에서 제조된 cDNA를 1/5로 희석하고 96-웰 플레이트 각 웰에 희석된 cDNA 3㎕와 2× GreenStar™ PCR master mix(BIONEER, 한국)를 10㎕, 증류수 6㎕, 각 HK 유전자 qPCR primer(10pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)를 1㎕ 넣어 HK 유전자 실시간 PCR 혼합액을 만들었다. 혼합액이 담긴 96-웰 플레이트를 Exicycler™ 96 Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER, 한국) 을 이용하여 다음과 같은 반응을 수행하였다:
95℃에서 15분간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94℃에서 30초 변성(denaturing), 58℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42 회 반복수행하고, 72℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55℃에서 1분간 온도를 유지하고, 55℃ - 95℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다.
PCR이 종료된 후, 각각 수득한 서바이빈의 Ct(threshold cycle)값은 HK 유전자를 통해 정규화된 mRNA값(normalization factor, NF)을 계산하여 보정된 서바이빈의 Ct 값을 구한 뒤, 트랜스펙션 물질만 처리된 실험군을 대조군으로 하여 ΔCt 값의 차이를 구했다. 상기 ΔCt 값과 계산식 2(-ΔCt) X 100을 이용하여 서바이빈의 mRNA 발현율을 비교하였다(도 18). mock은 트랜스펙션 물질만이 처리된 대조군을 의미하고 19mer, 23mer, 27mer, 31mer는 각각 서열번호 1 내지 4를 나타낸다. 5'P+P는 siRNA 고분자 화합물 접합체 4의 구조를 나타내며, 각 20nM, 100nM의 조건 으로 처리한 뒤 목표 유전자의 발현 저해 정도를 비교하였다.
그 결과, 도 18에 나타나는 바와 같이, 긴 사슬의 siRNA의 형태에 siRNA 고분자 화합물 접합체 4의 형태로 변형시키는 경우 원래 형태의 siRNA에 비하여 목표 유전자 mRNA의 발현 저해 효과의 차이를 나타내지 않아, 긴 사슬의 siRNA를 변형시키는 경우 짧은 사슬에 비하여 PEG로 인해 오는 입체장애 현상이 감소됨을 파악할 수 있었다. 즉, 긴 사슬의 siRNA의 경우 RNAi의 작용기전에서 다이서(dicer)에 의해 siRNA가 19+2 구조로 절단이 되어 절단된 siRNA가 RISC 복합체에 결합하여 RNAi작용 기전을 일으킨다. 이 때문에 긴 사슬의 siRNA의 양말단 부위에 PEG가 부여된 경우 서열번호 1번에 비하여 PEG가 붙어있지 않은 siRNA가 다량 존재하여 RISC 복합체와 상대적으로 높은 상호작용을 갖고, 이로부터 RNAi 유도효과가 유지되는 것으로 보인다.
실시예 6. 트랜스팩션 물질 없이 siRNA 고분자 화합물 접합체만을 이용한 종양 세포주에서의 목표 유전자의 발현 억제
상기 실시예 2에서 제조한 각각의 siRNA 고분자 화합물 접합체 1 내지 14를 이용하여 종양세포주인 인간 자궁암 세포주(HeLa)를 트랜스펙션시키고, 상기 트랜스펙션된 종양세포주의 서바이빈의 발현 양상을 분석하였다.
실시예 6-1. 종양 세포주의 배양
미국 종균협회(American type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 자궁암 세포(Hela)는 RPMI 1640 배양배지(GIBCO/Invitorgen, 미국)에 10 %(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100units/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖을 첨가하고 37℃, 5 %(v/v) CO2의 조건하에 배양하였다.
실시예 6-2. siRNA 고분자 화합물 접합체를 이용한 종양세포주의 트랜스펙션
전기 실시예 6-1에서 배양된 종양세포주 1.3 × 105 을 37℃, 5 %(v/v) CO2의 조건으로 6-웰 플레이트에서 24시간 동안 RPMI 1640에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰당 900㎕의 Opti-MEM 배지를 분주하였다.
한편, Opti-MEM 배지 100㎕와 상기 실시예 2에서 제조한 각각의 siRNA 고분자 화합물 접합체 1 내지 5(1nmole/㎕) 5 또는 10㎕를 첨가하고(최종 500nM, 1uM 처리), 다시 실온에서 20분간 반응시켜서 용액을 제조하였다.
한편, Opti-MEM 배지 100㎕와 상기 실시예 2에서 제조한 각각의 siRNA 고분자 화합물 접합체 9 내지 14(1nmole/㎕) 5 또는 10㎕를 첨가하고(최종 500nM, 1uM 처리), 고주파음에 의한 분해(sonication)를 통하여 siRNA 소수성 고분자 화합물 접합체로 구성된 미셀을 균등화하여 용액을 제조하였다.
그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰에 트랜스펙션용 용액을 각각 100㎕ 씩 분주하고 24시간 동안 배양한 후, 20% FBS가 포함된 RPMI 1640 1㎖을 첨가하였다. 여기에 24 시간동안 추가적으로 37℃, 5%(v/v) CO2의 조건하에 배양하여 , siRNA 고분자 화합물 복합체 처리 후 총 48 시간 동안 배양하였다.
실시예 6-3. 서바이빈 유전자의 mRNA 상대적 정량 분석
상기 실시예 6-2에서 트랜스펙션된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 통하여 서바이빈 유전자의 mRNA 양을 상대 정량하였다.
실시예 6-3-1.트랜스펙션된 세포로부터 RNA 분리 및 cDNA 제조
RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, 한국)를 이용하여, 상기 실시예 6-2에서 트랜스펙션된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower　 CycleScript RT Premix/dT20, Bioneer, 한국)를 이용하여, 다음과 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다.
구체적으로, 0.25㎖ 에펜도르프 튜브에 담겨있는 AccuPower　 CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer, 한국)에 한 튜브당 추출된 RNA를 1㎍씩 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 첨가하였다. 이를 유전자 증폭기기(MyGenie™ 96 Gradient Thermal Block, BIONEER, 한국)로, 30℃에서 1분 동안 RNA와 프라이머를 혼성화하고, 52℃에서 4분간 cDNA를 제조하는 두 과정을 6번 반복한 뒤, 95℃에서 5분 동안 효소를 불활성화시켜 증폭 반응을 종료하였다.
실시예 6-3-2. 서바이빈의 mRNA 상대적 정량 분석
상기 실시예 6-3-1에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 통해 TRAF7 mRNA의 상대적인 양을 다음과 같은 방법으로 정량하였다.
즉, 96-웰 플레이트의 각 웰에 상기 실시예 6-3-1에서 제조된 cDNA를 1/5로 희석하고, 서바이빈의 발현량을 분석하기 위해서 희석된 cDNA 3㎕와 2× GreenStar™ PCR master mix(BIONEER, 한국)를 10㎕, 증류수 6㎕, 서바이빈 qPCR primer(10pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)을 1㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스 키핑 유전자(housekeeping gene, 이하 HK 유전자)인 HMBS(Hydroxymethyl-bilane synthase), HPRT1(Hypoxanthine phosphoribosyl-transferase1), UBC(Ubiquitin C), YWHAZ(Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activtion protein, zeta polypeptide)를 표준 유전자로 하여, 상기 실시예 6-3-1에서 제조된 cDNA를 1/5로 희석하고 96-웰 플레이트 각 웰에 희석된 cDNA 3㎕와 2× GreenStar™ PCR master mix(BIONEER, 한국)를 10㎕, 증류수 6㎕, 각 HK 유전자 qPCR primer(10pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)를 1㎕ 넣어 HK 유전자 실시간 PCR 혼합액을 만들었다. 혼합액이 담긴 96-웰 플레이트를 Exicycler™ 96 Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER, 한국) 을 이용하여 다음과 같은 반응을 수행하였다:
95℃에서 15분간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94 ℃에서 30초 변성(denaturing), 58℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42 회 반복수행하고, 72℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55℃에서 1분간 온도를 유지하고, 55℃ - 95℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다. PCR이 종료된 후, 각각 수득한 서바이빈의 Ct(threshold cycle)값은 HK 유전자를 통해 정규화된 mRNA값(normalization factor, NF)을 계산하여 보정된 서바이빈의 Ct 값을 구한 뒤, 트랜스펙션 물질만 처리된 실험군을 대조군으로 하여 ΔCt 값의 차이를 구했다. 상기 ΔCt 값과 계산식 2(-ΔCt) X 100을 이용하여 서바이빈의 mRNA 발현율을 비교하였다(도 19).
그 결과, 도 19에 나타난 바와 같이 접합체 2 내지 5의 siRNA PEG 접합체의 경우 트랜스펙션 물질을 통해 트랜스펙션된 결과와는 다르게 siRNA 고분자 화합물 접합체 1에 비하여 서바이빈 mRNA 발현량이 많이 저해되었으며, siRNA 고분자 화합물 접합체 1 내지 5의 경우 농도가 낮은 경우(500nM)에서 높은 농도에 비하여 높은 RNAi 효과를 나타내었다. 또한, 접합체 9 내지 14의 siRNA 소수성 고분자 화합물 접합체는 siRNA 접합체 1 내지 5에 비하여 동일 농도(500nM) 처리하였을 경우, 서바이빈 mRNA 발현량 저해가 낮은 결과를 보였다. 하지만, 고농도 조건(1uM) 조건에서 처리한 경우, 특히 siRNA 고분자 화합물 접합체 14의 말단 변형 형태에서 높은 서바이빈 mRNA 발현량 저해 효과를 나타냈다.
도 1은 제조된 3'-PEG-CPG의 구조식이다.
도 2는 실시예 1에서 얻어진 화합물의 1H NMR 데이터이다.
도 3은 실시예 1에서 LCAA-CPG와의 결합을 위한 3'-PEG 시약인 [화합물 A]의 1H NMR 데이터이다.
도 4는 실시예 1에서 LCAA-CPG와 결합을 위한 3'-PEG시약인 [화합물 B]의 1H NMR 데이터이다.
도 5는 실시예 1에서 LCAA-CPG와 결합을 위한 3'-PEG시약인 [화합물 C]의 1H NMR 데이터이다.
도 6은 실시예 3에서 3'-PEG-CPG와 올리고 제조 후 Maldi-Tof 분자량 데이터이다.
도 7은 실시예 4에서 3'-PEG-CPG와 올리고 제조 후 Maldi-Tof 분자량 데이터이다.
도 8은 고분자 화합물이 접합되지 않은 원래 형태의 siRNA와 친수성 또는 소수성 고분자 화합물이 접합된 형태의 siRNA 고분자 화합물 접합체의 전기영동 사진이다.
siRNA는 원래 형태의(naked) siRNA를 의미하고, 각 접합체는 표 1에 표시된 siRNA 고분자 화합물 접합체를 나타낸다. 또한 19, 23, 27, 31mer는 각기 19, 23, 27, 31개의 뉴클레오티드로 구성된 siRNA를 의미하고, 모두 siRNA 접합체 4의 구조로 siRNA 고분자 화합물 접합체를 제조하였다.
도 9는 고분자 화합물이 접합되지 않은 원래 형태의 siRNA와 친수성 고분자 화합물인 PEG가 접합된 형태의 siRNA 고분자 화합물 접합체의 혈액 내 안정성 평가를 위해, 혈청 단백질이 존재하는 환경 하에서 시간에 따른 siRNA의 분해정도를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 10은 siRNA 고분자 화합물 복합체가 형성하는 나노입자의 모식도이다.
도 11은 siRNA 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 나노입자의 크기를 나타낸 것이다.
도 12는 siRNA 고분자 화합물 접합체 9로 구성된 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 나노입자의 크기를 나타낸 것이다.
도 13은 siRNA 고분자 화합물 접합체 10으로 구성된 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 나노입자의 크기를 나타낸 것이다.
도 14는 siRNA 고분자 화합물 접합체 11으로 구성된 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 나노입자의 크기를 나타낸 것이다.
도 15는 siRNA 고분자 화합물 접합체 12으로 구성된 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 나노입자의 크기를 나타낸 것이다.
도 16은 siRNA 고분자 화합물 접합체 13으로 구성된 나노입자의 제타 전위 측정기를 통하여 측정된 나노입자의 크기를 나타낸 것이다.
도 17은 원래 형태의 siRNA와 친수성 고분자 화합물인 폴리에틸렌글리 콜(PEG)이 접합된 형태의 siRNA 고분자 화합물 접합체의 RNAi 효과를 분석하기 위해 트랜스펙션 물질과 함께 트랜스펙션시킨 뒤, 서바이빈 유전자의 mRNA 발현 정도를 비교한 그래프이다.
도 18은 원래 형태의 siRNA와 siRNA 고분자 화합물 접합체 4 구조로 변형된 긴 서열의 siRNA의 RNAi 효과를 분석하기 위해 트랜스펙션 물질과 함께 트랜스펙션시킨 뒤, 서바이빈 유전자의 mRNA 발현 정도를 비교한 그래프이다.
도 19는 원래 형태의 siRNA와 siRNA 고분자 화합물 접합체 1 내지 5와 9 내지 14로 변형된 siRNA 고분자 화합물 접합체의 RNAi 효과를 분석하기 위해 트랜스펙션 물질 없는 조건에서 트랜스펙션시킨 뒤, 서바이빈 유전자의 mRNA 발현 저해 정도를 비교한 그래프이다.
<110> BIONEER Corporation <120> SiRNA conjugate and preparing method thereof <130> 2009-DPA-029 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 1 aaggagauca acauuuuca 19 <210> 2 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 2 aggaaaggag aucaacauuu uca 23 <210> 3 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 3 aggaaaggag aucaacauuu ucaaauu 27 <210> 4 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 4 aaaggagauc aacauuuuca aauuagaugu u 31

Claims (21)

  1. 하기 구조의 siRNA와 고분자 화합물 접합체:
    A-X-R-Y-B.
    (상기에서 A 및 B는 각각 독립적으로 친수성 고분자 또는 소수성 고분자 화합물, X, Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며, R은 siRNA를 나타낸다.)
  2. 하기 구조의 siRNA와 고분자 화합물 접합체:
    A-X-R.
    (상기에서 A는 소수성 고분자 화합물이고, X는 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합이며, R은 siRNA를 나타낸다.)
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 siRNA(R)의 단일가닥은 19 내지 31 개의 뉴클레오티드로 구성되는 접합체.
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 소수성 고분자 화합물(A)는 분자량 250 내지 1,000인 소수성 고분자 화합물인 것을 특징으로 하는 접합체.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 소수성 고분자 화합물(A)는 C16-C50의 포화탄화수소 또는 콜레스테롤인 접합체.
  6. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 공유결합(X,Y)은 비분해성 결합 또는 분해성 결합인 접합체.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 비분해성 결합은 아미드 결합 또는 포스페이트 결합인 접합체.
  8. 청구항 6에 있어서,
    상기 분해성 결합은 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 및 효소 분해성 결합 중에서 선택되는 접합체.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 친수성 고분자 화합물(A 또는 B)는 분자량 1,000 내지 10,000인 비이온성 고분자 화합물인 접합체.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 친수성 고분자 화합물은 폴리에틸렌글리콜(PEG, polyethylene glycol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrolidone) 및 폴리옥사졸린(polyoxazoline)으로 구성된 군으로부터 선택되는 접합체.
  11. 하기 구조의 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체.
    Figure 112009029086020-PAT00019
    [상기에서, R은 알킬(alkyl), 알케닐(alkenyl), 알키닐(alkynyl), 아릴(aryl), 아릴알킬(arylalkyl), 헤테로알킬(heteroalkyl) 또는 헤테로아릴(heteroaryl)이며; m은 2 내지 18의 정수이고, n은 5~120까지의 정수이고; X는 4,4'-디메톡시트리틸기(4,4'-dimethoxytrityl group)이다.]
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 고형 지지체가 CPG(controlled pore glass)인 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 CPG는 직경이 40~180 ㎛이고, 공극 크기가 500Å~3000Å인 폴리에틸렌 글리콜이 결합된 고형 지지체.
  14. 청구항 11 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
    하기 구조를 갖는 3'-PEG(polyethylene glycol)-CPG인 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체.
    Figure 112009029086020-PAT00020
  15. 1) CPG에 3-아미노프로필트리에톡시실란을 반응시켜 LCAA-CPG(Long chain Alkyl Amine Controlled Pore Glass)를 형성하는 단계;
    2) 폴리에틸렌글리콜에 4,4'-디메톡시트리틸클로라이드를 반응시켜 2-[비스-(4-디메톡시트리틸-폴리(에틸렌글리콜)을 형성하는 단계;
    3) 상기 2)에서 형성된 화합물과 하기 화학식 1의 화합물을 반응시켜 하기 구조식 Ⅰ의 화합물을 형성하는 단계;
    4) 상기 형성된 하기 구조식 Ⅰ의 화합물과 4-니트로페닐클로로포르메이트를 반응시켜 하기 구조식 Ⅱ의 화합물을 형성하는 단계;
    5) 상기 3)에서 형성된 하기 구조식 Ⅰ의 화합물과 N-숙신이미딜트리플루오로아세트산를 반응시켜 하기 구조식 Ⅲ의 화합물을 형성하는 단계;
    6) 상기 1)에서 형성된 LCAA-CPG 화합물을 상기 3) 내지 5)에서 각각 형성된 하기 구조식 Ⅰ,Ⅱ 또는 Ⅲ의 화합물과 각각 반응시키는 단계를 포함하는 청구항 14에 기재된 3'-PEG-CPG의 제조방법:
    [화학식 1]
    Figure 112009029086020-PAT00021
    [구조식 Ⅰ]
    Figure 112009029086020-PAT00022
    [구조식 Ⅱ]
    Figure 112009029086020-PAT00023
    [구조식 Ⅲ]
    Figure 112009029086020-PAT00024
    [구조식 Ⅳ]
    Figure 112009029086020-PAT00025
    [상기에서, R은 알킬(alkyl), 알케닐(alkenyl), 알키닐(alkynyl), 아릴(aryl), 아릴알킬(arylalkyl), 헤테로알킬(heteroalkyl) 또는 헤테로아릴(heteroaryl)이며; n은 5 이상 120 이하의 정수이다.]
  16. 1) 청구항 11에 기재된 폴리에틸렌글리콜이 결합된 고형 지지체를 이용하여 표적 유전자에 대한 siRNA를 제조하는 단계;
    2) siRNA의 말단기와 폴리에틸렌글리콜을 공유결합으로 연결하는 단계를 포함하는 청구항 1 또는 청구항 2의 siRNA 접합체의 제조방법.
  17. 청구항 1 또는 청구항 2에 기재된 siRNA 접합체로 구성된 나노입자.
  18. 1) 청구항 17에 기재된 나노입자를 준비하는 단계; 및
    2) 상기 나노입자를 동물의 체내로 투입하는 단계를 포함하는 유전자 치료방법.
  19. 청구항 18에 있어서,
    상기 나노입자는 경구투여 또는 정맥주사의 방법으로 체내에 투여되는 것을 특징으로 하는 치료방법.
  20. 청구항 1 또는 청구항 2에 기재된 siRNA 접합체의 약학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물.
  21. 청구항 17에 기재된 나노입자의 약학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물.
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