JP2013230148A - ｓｉＲＮＡ接合体及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【解決手段】ｓｉＲＮＡと高分子化合物の接合体及びその製造方法に関し、より詳細には、ｓｉＲＮＡの生体内安定性の向上のために、ｓｉＲＮＡと高分子化合物を共有結合で連結させたハイブリッド接合体及び前記ハイブリッド接合体の製造方法に関する。
【効果】サバイビン特異的なｓｉＲＮＡ−高分子化合物接合体であり、ｓｉＲＮＡの生体内安定性を向上させることにより、細胞内に治療用ｓｉＲＮＡを効率的に伝達することができ、また、比較的低い濃度の投与量でもｓｉＲＮＡの活性を示すことができるため、癌及び他の感染性疾患のためのｓｉＲＮＡ治療用道具だけでなく、新しい形態のｓｉＲＮＡ伝達システムとして用いることができる。
【選択図】図１９

Description

本発明は、癌及び他の感染性遺伝子治療に有用に用いられることができるｓｉＲＮＡの伝達を向上させる高分子化合物を分解性または非分解性結合を利用してｓｉＲＮＡに結合させた接合体、前記接合体の製造方法及び前記接合体を用いたｓｉＲＮＡの伝達方法に関する。

ＲＮＡ干渉現象は、遺伝子の発現過程で二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって塩基配列特異的に転写後遺伝子発現を調節する機作であり、このような機作は、最初に発見されたＣ．ｅｌｅｇａｎｓを始め、植物、ショウジョウバエ、哺乳動物にも共通的に存在する（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６−８１１，１９９８；Ｎｏｖｉｎａ＆Ｓｈａｒｐ，Ｎａｔｕｒｅ、４３０：１６１−１６４、２００４）。ＲＮＡ干渉現象が起こる過程は、１９−２５ｂｐのｄｓＲＮＡが細胞内に入ると、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）接合体と結合し、アンチセンス（ガイド）鎖のみがｍＲＮＡと塩基配列相補的に結合して、ＲＩＳＣ接合体に存在するエンドヌクレアーゼドメインによって標的ｍＲＮＡを分解すると知られている（Ｒａｎａ，Ｔ．Ｍ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，８：２３−３６、２００７；Ｔｏｍａｒｉ，Ｙ．ａｎｄ Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１９：５１７−５２９，２００５）。

ｄｓＲＮＡが細胞内に伝達されると、前記ｄｓＲＮＡが標的ｍＲＮＡ配列に特異的に結合してそのｍＲＮＡを分解するため、これを利用して、遺伝子の発現を調節できる新しい道具として思われている。しかし、人間の場合、ｄｓＲＮＡを細胞に導入する際に抗ウイルス性インターフェロン機作（ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｐａｔｈｗａｙ）が誘発され、ＲＮＡ干渉効果を得ることが困難であったが、２００１年ＥｌｂａｓｈｉｒとＴｕｓｃｈｌなどにより、２１ｎｔ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の小さなｄｓＲＮＡを人間細胞に導入する場合にはインターフェロン経路が誘発されず、標的ｍＲＮＡを特異的に分解させるということが明らかになった（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｈａｒｂｏｒｔｈ，Ｊ．，Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，Ｗ．，Ｙａｌｃｉｎ，Ａ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｋ．，Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８，２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，Ｗ．，Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．，１５，１８８−２００，２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．，Ｐａｔｋａｎｉｏｗｓｋａ，Ａ．，Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，Ｗ．，Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，２０，６８７７−６８８８，２００１）。以後、２１ｎｔのｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）という名称で新しい機能ゲノム科学（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ）の道具として脚光を浴び始めた。

ｓｉＲＮＡは、最近動物細胞で特定遺伝子の発現を阻害させるのに優れた効果を示すことが明らかになって遺伝子治療剤として脚光を浴びており、これらの高い活性と精密な遺伝子選択性によりここ２０年間研究され、現在治療剤として活用されているアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）に代替可能な治療剤として期待されている（Ｄａｎａ Ｊ．Ｇａｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ
１２１：６４−７３，２００７）。特に、治療を目的とするｓｉＲＮＡ技法は、他の医薬品に比べデザインが容易であり、高い標的選択性及び特定遺伝子の発現阻害の特徴を有するため大きい長所がある。また、ＲＮＡ干渉による遺伝子発現の抑制は、生体内で自然に存在する機作を利用するため毒性が低い。最近、ＯＰＫＯ社により黄斑変性（ｗｅｔ Ａｇｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｍａｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ）の治療剤として開発された「Ｂｅｖａｓｉｒａｎｉｂ」は、新生血管の発生を誘発するＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ
ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）に選択的に作用し、ＶＥＧＦの発現を阻害するｓｉＲＮＡであり、臨床３相試験中である（Ｄｅｊｎｅｋａ ＮＳ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｖｉｓ．，２８（１４）：９９７−１００５，２００８）。その他にも、多様な遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを含む疾病治療剤が現在開発中である（Ｒｙａｎ Ｐ．Ｍｉｌｌｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ７：１１５−１１６，２００８）。

ＲＮＡ干渉により、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で特異的な発現の阻害を誘発した多様な結果があるにも関わらず、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ｓｉＲＮＡ伝達のためには、血液内の酵素による分解、血液内の尿素との相互作用及び非特異的な細胞への伝達などの解決すべきの問題を多く有している（Ｓｈｉｇｅｒｕ Ｋａｗａｋａｍｉ ａｎｄ Ｍｉｔｓｕｒｕ Ｈａｓｈｉｄａ，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２２（３）：１４２−１５１，２００７）。このような問題を克服するために、部分的に核酸分解酵素抵抗性類似体を利用したり、伝達技術を改善するなどの方法が試されている。

改善された伝達技術の例として、アデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスを利用した遺伝子伝達技術と、リポソームとカチオン性脂質及びカチオン性高分子化合物を利用した非ウイルス性ベクター（ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）による遺伝子伝達技術が開発されてきた。しかし、ウイルス性伝達体は、伝達された遺伝子が宿主の染色体に移入され、宿主遺伝子の正常機能に異常を誘導したり、発癌遺伝子を活性化させる可能性も排除できないため安全性に問題点があり、ウイルス遺伝子が少量でも引き続き発現されて自己免疫症を誘発したり、ウイルス伝達体から変形された形態のウイルス感染が誘発される場合、効率的な防御免疫を起こすことができないこともある。一方、非ウイルス性伝達体は、ウイルス性伝達体に比べ効率性が劣るが、生体内安全性と経済性を考慮すると、副作用が少なく、生産コストが安価であるという長所がある（Ｌｅｈｒｍａｎ Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ．４０１（６７５３）：５１７−５１８，１９９９）。また、非ウイルス性伝達方法では、ｓｉＲＮＡを含むＲＮＡ分子の伝達をなすために酵素または非酵素的な分解に対して効果的に防御できる方法が求められるが、その方法の一つがｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ
ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）をコードしたＤＮＡ発現プラスミドを活用するものであり、ＤＮＡによるシステムは発現ベクターが存在する間にのみｓｉＲＮＡが発現されるという長所を有する。さらに、最近、ｓｉＲＮＡを化学的に修飾させる研究により、核酸分解酵素に対する不安定性及び細胞内の低い吸収率を改善する方法が提案されている（Ｓｈｉｇｅｒｕ Ｋａｗａｋａｍｉ ａｎｄ Ｍｉｔｓｕｒｕ Ｈａｓｈｉｄａ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｐａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２２（３）：１４２−１５１，２００７）。

ｓｉＲＮＡの化学的な修飾方法のうち、核酸分解酵素により分解される部分であるホスホジエステル結合（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ ｂｏｎｄ）をホスホロチオアート結合（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｌｉｎｋａｇｅ）に変形したり、五炭糖の２’部分を、２’−Ｏ−ｍｅＲＮＡ、２’−ジオキシ−２’−フルオロウリジン（２’−ｄｉｏｘｙ−２’−ｆｌｕｏｕｒｉｄｉｎｅ）または２’と４’を連結してＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）の形態に変更して、血清内の安定性を増加させた結果を得た（Ｂｒａａｓｃｈ Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：１１３９−１１４３，２００３；Ｃｈｉｕ Ｙ．Ｌ．ａｎｄ Ｒａｎａ Ｔ．Ｍ．，ＲＮＡ，９：１０３４−１０４８，２００３；Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ Ｍ．ｅｔ
ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３１：５８９−５９５，２００３）。他の形態の化学的な変形方法として、センス（アンチ−ガイド）鎖の３’末端部位に官能基を連結して対照群に比べ増加された薬力学的特性を有するようにし、ｓｉＲＮＡの親水性／疎水性の均衡により、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）に適用する際高い効率を誘導することができることが把握された（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３−１７８．２００４）。

しかし、上記の方法は、分解酵素からｓｉＲＮＡを保護し、効率的な細胞膜透過のためには未だに不十分な点が多かった。

そこで本発明者らは、ｓｉＲＮＡに親水性または疎水性高分子化合物を分解性または非分解性結合を利用して結合させた接合体が、ｓｉＲＮＡの生体内安定性を向上させることを見い出し、それに基き本発明を完成するに至った。

Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６−８１１，１９９８ Ｎｏｖｉｎａ＆Ｓｈａｒｐ，Ｎａｔｕｒｅ、４３０：１６１−１６４、２００４ Ｒａｎａ，Ｔ．Ｍ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，８：２３−３６、２００７ Ｔｏｍａｒｉ，Ｙ．ａｎｄ Ｚａｍｏｒｅ，Ｐ．Ｄ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１９：５１７−５２９，２００５ Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｈａｒｂｏｒｔｈ，Ｊ．，Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，Ｗ．，Ｙａｌｃｉｎ，Ａ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｋ．，Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８，２００１ Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，Ｗ．，Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．，１５，１８８−２００，２００１ Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｊ．，Ｐａｔｋａｎｉｏｗｓｋａ，Ａ．，Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌ，Ｗ．，Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，２０，６８７７−６８８８，２００１ Ｄａｎａ Ｊ．Ｇａｒｙ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２１：６４−７３，２００７Ｄｅｊｎｅｋａ ＮＳ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｖｉｓ．，２８（１４）：９９７−１００５，２００８ Ｒｙａｎ Ｐ．Ｍｉｌｌｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ７：１１５−１１６，２００８ Ｓｈｉｇｅｒｕ Ｋａｗａｋａｍｉ ａｎｄ Ｍｉｔｓｕｒｕ Ｈａｓｈｉｄａ，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２２（３）：１４２−１５１，２００７ Ｌｅｈｒｍａｎ Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ．４０１（６７５３）：５１７−５１８，１９９９ Ｓｈｉｇｅｒｕ Ｋａｗａｋａｍｉ ａｎｄ Ｍｉｔｓｕｒｕ Ｈａｓｈｉｄａ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｐａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２２（３）：１４２−１５１，２００７ Ｂｒａａｓｃｈ Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：１１３９−１１４３，２００３ Ｃｈｉｕ Ｙ．Ｌ．ａｎｄ Ｒａｎａ Ｔ．Ｍ．，ＲＮＡ，９：１０３４−１０４８，２００３ Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３１：５８９−５９５，２００３ Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３−１７８．２００４

本発明の目的は、ｓｉＲＮＡの細胞内伝達効率性を向上させるために、ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の末端に生体適合性高分子化合物である親水性高分子または疎水性高分子化合物を分解性または非分解性結合を利用して結合させた接合体を提供することにある。

本発明の他の目的は、高分子化合物、特に人体に適用する際にその安定性が立証された高分子化合物、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含んでいる固形支持体及び前記支持体を利用して３’にＰＥＧが結合されたＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）及び類似体（ａｎａｌｏｇ）を含むオリゴヌクレオチドを効率的に製造する方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記ｓｉＲＮＡ接合体の製造方法及び前記ｓｉＲＮＡ接合体を利用したｓｉＲＮＡの伝達方法を提供することにある。

前記課題を果たすための本発明の第１は、下記構造のｓｉＲＮＡと高分子化合物接合体を提供するものである。
Ａ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ
（上記で、Ａ及びＢはそれぞれ独立に、親水性高分子または疎水性高分子化合物、Ｘ、Ｙはそれぞれ独立に、リンカーが媒介されていない共有結合またはリンカーが媒介された共有結合であり、ＲはｓｉＲＮＡを示す。）

また、本発明の第２は、下記構造のｓｉＲＮＡと高分子化合物接合体を提供するものである。
Ａ−Ｘ−Ｒ
（上記で、Ａは疎水性高分子化合物であり、Ｘはリンカーが媒介されていない共有結合またはリンカーが媒介された共有結合であり、ＲはｓｉＲＮＡを示す。）

また、本発明の第３は、前記ｓｉＲＮＡ（Ｒ）の一本鎖が１９〜３１個のヌクレオチドで構成される接合体を提供するものである。

また、本発明の第４は、前記疎水性高分子化合物（Ａ）が、分子量２５０〜１，０００の疎水性高分子化合物であることを特徴とする接合体を提供するものである。

また、本発明の第５は、前記疎水性高分子化合物（Ａ）が、Ｃ_１６−Ｃ_５０の飽和炭化水素またはコレステロールである接合体を提供するものである。

また、本発明の第６は、前記共有結合（Ｘ、Ｙ）が、非分解性結合または分解性結合である接合体を提供するものである。

また、本発明の第７は、前記非分解性結合が、アミド結合またはリン酸結合である接合体を提供するものである。

また、本発明の第８は、前記分解性結合が、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンヒドリド結合、生分解性結合及び酵素分解性結合から選択される接合体を提供するものである。

また、本発明の第９は、前記親水性高分子化合物（ＡまたはＢ）が、分子量１，０００〜１０，０００の非イオン性高分子化合物である接合体を提供するものである。

また、本発明の第１０は、前記親水性高分子化合物が、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリオキサゾリンで構成された群から選択される接合体を提供するものである。

また、本発明の第１１は、下記構造のポリエチレングリコールが結合された固形支持体を提供するものである。
（上記で、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロアリールであり；ｍは、２〜１８の整数であり、ｎは５〜１２０の整数であり、Ｘは、水素、４−モノメトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、４，４’，４”−トリメトキシトリチル基である。）

また、本発明の第１２は、前記固形支持体がＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）である、ポリエチレングリコールが結合された固形支持体を提供するものである。

また、本発明の第１３は、前記ＣＰＧは、直径が４０〜１８０μｍであり、空隙サイズが５００Å〜３０００Åである、ポリエチレングリコールが結合された固形支持体を提供するものである。

また、本発明の第１４は、下記構造式IV表される構造を有する３’−ＰＥＧ−ＣＰＧである、ポリエチレングリコールが結合された固形支持体を提供するものである。

［構造式IV］

また、本発明の第１５は、
１）ＣＰＧに３−アミノプロピルトリエトキシシランを反応させて、ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（Ｌｏｎｇ Ｃｈａｉｎ Ａｌｋｙｌ Ａｍｉｎｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）を形成する段階と、２）ポリエチレングリコールに４，４’−ジメトキシトリチルクロライドを反応させて、２−［ビス−（４−ジメトキシトリチル）−ポリ（エチレングリコール）］を形成する段階と、３）前記２）で形成された化合物と下記化学式１の化合物とを反応させて、下記構造式Ｉで表される化合物を形成する段階と、４）前記形成された下記構造式Ｉの化合物とクロロギ酸４−ニトロフェニルとを反応させて、下記構造式II表される化合物を形成する段階と、５）前記３）で形成された下記構造式Ｉの化合物とＮ−スクシンイミジルトリフルオロ酢酸とを反応させて、下記構造式IIIで表される化
合物を形成する段階と、６）前記１）で形成されたＬＣＡＡ−ＣＰＧ化合物を、前記３）から５）でそれぞれ形成された下記構造式Ｉ、IIまたはIIIの化合物とそれぞれ反応させ
る段階と、を含む前記第１５に記載の３’−ＰＥＧ−ＣＰＧの製造方法を提供するものである。

［化学式１］

［構造式Ｉ］

［構造式II］

［構造式III］

［構造式IV］
（上記で、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロアリールであり；ｎは５以上１２０以下の整数である。）

また、本発明の第１６は、１）前記第１１に記載のポリエチレングリコールが結合された固形支持体を利用して、標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡを製造する段階と、２）ｓｉＲＮＡの末端基とポリエチレングリコールとを共有結合で連結する段階と、を含む前記ｓｉＲＮＡ接合体の製造方法を提供するものである。

また、本発明の第１７は、前記第１または第２に記載のｓｉＲＮＡ接合体で構成されたナノ粒子を提供するものである。

また、本発明の第１８は、１）前記第１７に記載のナノ粒子を準備する段階と、２）前記ナノ粒子を動物の体内に投入する段階と、を含む遺伝子治療方法を提供するものである。

また、本発明の第１９は、前記ナノ粒子が経口投与または静脈注射の方法で体内に投与されることを特徴とする治療方法を提供するものである。

また、本発明の第２０は、前記第１または第２に記載のｓｉＲＮＡ接合体の薬学的有効量を含む薬学的組成物を提供するものである。

また、本発明の第２１は、前記第１７のナノ粒子の薬学的有効量を含む薬学的組成物を提供するものである。

以下、本発明をより詳細に説明する。

本発明は、下記構造のｓｉＲＮＡと高分子化合物接合体を提供する、。
Ａ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ
上記で、Ａ及びＢはそれぞれ独立に、親水性高分子または疎水性高分子化合物であり、Ｘ、Ｙはそれぞれ独立に、リンカーが媒介されていない共有結合またはリンカーが媒介された共有結合であり、ＲはｓｉＲＮＡを示す。

また、本発明は、下記構造のｓｉＲＮＡと高分子化合物接合体を提供する。
Ａ−Ｘ−Ｒ
上記で、Ａは疎水性高分子化合物であり、Ｘはリンカーが媒介されていない共有結合またはリンカーが媒介された共有結合であり、ＲはｓｉＲＮＡを示す。

本発明の接合体において、前記ｓｉＲＮＡのオリゴ鎖は、１９〜３１個のヌクレオチドを含むことが好ましい。本発明において使用可能なｓｉＲＮＡは、遺伝子治療用または研究用に用いられるか用いられる可能性のある如何なる遺伝者由来のｓｉＲＮＡも採択されることができる。

前記疎水性高分子化合物は、分子量２５０〜１，０００の疎水性高分子化合物であることが好ましい。前記疎水性高分子化合物の例としては、飽和炭化水素、好ましくはＣ_１６〜Ｃ_５０の飽和炭化水素、コレステロールが挙げられる。この際、疎水性高分子化合物は、前記飽和炭化水素及びコレステロールにのみ限定されるものではない。

前記疎水性高分子化合物は、疎水性相互作用を起こし、ｓｉＲＮＡと疎水性高分子化合物接合体で構成されたミセルを形成させる機能をする。前記疎水性高分子化合物のうちでも特に飽和炭化水素の場合、ｓｉＲＮＡの製造段階で容易に接合させることができる長所を有しているため、本発明に係る接合体の製造において非常に適する。

また、前記共有結合（即ち、Ｘ、Ｙ）は、非分解性結合または分解性結合のうち何れであってもよい。この際、非分解性結合としてはアミド結合またはリン酸結合が挙げられ、分解性結合としてはジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンヒドリド結合、生分解性結合、または酵素分解性結合などが挙げられるが、必ずしもこれに限定されるものではない。

前記結合を媒介するリンカーは、親水性高分子（または疎水性高分子）とｓｉＲＮＡから由来した残基の末端基を共有的に結合させ、必要に応じて、所定の環境で分解が可能な結合を提供する限り、特に限定されるものではない。従って、前記リンカーは、接合体の製造過程中ｓｉＲＮＡ及び／または親水性高分子（または疎水性高分子）を活性化するために結合させる如何なる化合物も含むことができる。

また、前記親水性高分子化合物は、分子量１，０００〜１０，０００の非イオン性高分子化合物であることが好ましい。例えば、親水性高分子化合物としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリオキサゾリンなどの非イオン性親水性高分子化合物を用いることが好ましいが、必ずしもこれに限定されるものではない。

前記親水性高分子化合物の官能基は、必要に応じて他の官能基に置換されてもよい。前記親水性高分子化合物のうちでも、特にＰＥＧは多様な分子量と官能基を導入することができる末端を有しており、生体内親和性が良好であり、免疫反応を誘導することなく、水に対する溶解度を増加させて生体内での遺伝子伝達の効率を増加させるため、本発明に係る接合体の製造において非常に適する。

また、本発明は、下記構造のポリエチレングリコールが結合された固形支持体を提供する。
上記で、固形支持体（ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ）は、例えば、ＣＰＧ、ポリスチレン、シリカゲル、セルロース紙などを含むが、これに制限されず、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロアリールであり；ｍは２〜１８の整数であり、ｎは５〜１２０（Ｍｏｌａｒ ｍａｓｓ２８２〜５３００）までの整数であり；Ｘは、４−モノメトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、または４，４’，４”−トリメトキシトリチル基であって、酸で処理された後除去されて水素となる。固形支持体がＣＰＧである場合、直径は４０〜１８０μｍであることが好ましく、５００Å〜３０００Åの空隙サイズを有することが好ましい。

また、本発明は、下記構造式IVで表される構造を有する３’−ＰＥＧ−ＣＰＧであるポリエチレングリコールが結合された固形支持体を提供する。

［構造式IV］

また、本発明は、下記の段階を含む構造式IVの３’−ＰＥＧ−ＣＰＧの製造方法を提供する。

１）ＣＰＧに３−アミノプロピルトリエトキシシランを反応させて、ＬＣＡＡ−ＣＰＧを形成する段階と、
２）ポリエチレングリコールに４，４’−ジメトキシトリチルクロライドを反応させて、２−［ビス−（４−ジメトキシトリチル）−ポリ（エチレングリコール）］を形成する段階と、
３）前記２）で形成された化合物と下記化学式１の化合物とを反応させて、下記構造式Ｉで表される化合物を形成する段階と、
４）前記形成された下記構造式Ｉの化合物とクロロギ酸４−ニトロフェニルとを反応させて、下記構造式IIで表される化合物を形成する段階と、
５）前記３）で形成された下記構造式Ｉの化合物とＮ−スクシンイミジルトリフルオロ酢酸とを反応させて、下記構造式IIIで表される化合物を形成する段階と、
６）前記１）で形成されたＬＣＡＡ−ＣＰＧ化合物を、前記３）〜５）でそれぞれ形成された下記構造式Ｉ、IIまたはIIIの化合物とそれぞれ反応させる段階と、を含む下記構造
式IVの３’−ＰＥＧ−ＣＰＧの製造方法を提供する。

［化学式１］

［構造式Ｉ］

［構造式II］

［構造式III］

［構造式IV］
（上記で、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロアリールであり；ｎは５以上１２０以下の整数である。）

また、本発明は、前記ポリエチレングリコールが結合された固形支持体を利用して、ｓｉＲＮＡとＰＥＧとの接合体を製造する方法を提供する。具体的には、
１）前記ポリエチレングリコールが結合された固形支持体を利用して、標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡを製造する段階と、
２）ｓｉＲＮＡの末端基とポリエチレングリコールとを共有結合で連結する段階と、を含む前記ｓｉＲＮＡ接合体の製造方法を提供する。これにより、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ及び類似体を含むオリゴヌクレオチドを効率的に製造することができる。

また、本発明の好ましい一例によると、前記ｓｉＲＮＡは、β−シアノエチルホスホラミダイト（β−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）を利用してＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結していく方法により製造することができる（Ｓｈｉｎａ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：４５３９−４５５７，１９８４）。例えば、ＲＮＡ合成器を使用して、ヌクレオチドが付着された固形支持体上で、脱ブロック化（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）、カップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）、酸化（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）及びキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）からなる一連の過程を繰り返して、所望の長さのＲＮＡを含む反応物が得られるが、これに限定されるものではない。

また、本発明は、前記ｓｉＲＮＡ接合体で構成されたナノ粒子を提供する。

本発明のｓｉＲＮＡと高分子化合物接合体は、相互作用によってナノ粒子構造を形成することができ、このように形成されたｓｉＲＮＡと高分子化合物接合体とｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体で構成されたナノ粒子は、ｓｉＲＮＡの細胞内伝達を向上させ、これを疾病モデルの治療の目的に応用することが可能である。より具体的な接合体の製造、接合体で構成されたナノ粒子の特徴、細胞伝達の効率及び効果は、後述する実施例においてより詳細に説明する。

また、本発明は、前記ナノ粒子を利用した遺伝子治療方法を提供する。

具体的には、前記ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体で構成されたナノ粒子を準備する段階と、前記ナノ粒子を動物の体内に投入する段階と、を含む遺伝子治療方法を提供する。

また、本発明は、前記ｓｉＲＮＡ接合体で構成されたナノ粒子の薬学的有効量を含む薬学的組成物を提供する。

本発明の組成物は、投与のために、前記記載の有効成分の他に薬学的に許容される１種以上の担体をさらに含んで製造することができる。薬学的に許容される担体は、本発明の有効成分と両立可能でなければならず、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれら成分のうち１種以上を混合して用いることができ、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤をさらに添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形に製剤化することができる。さらには、当分野の適正な方法で、またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’s
ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）に開示されている方法を利用して、各疾患に応じて、または成分に応じて好ましく製剤化することができる。

本発明の薬学的組成物は、通常の患者症侯と疾病の深刻さに基いて本技術分野の通常の専門家が決定することができる。また、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、軟膏剤、シロップ剤などの多様な形態に製剤化することができ、単位−投与量または多−投与量容器、例えば、密封されたアンプル及び瓶などで提供することもできる。

本発明の薬学的組成物は、経口または非経口投与が可能である。本発明による薬学的組成物の投与経路は、これらに限定されるものではないが、例えば、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髓内、硬膜内、心臓内、硬皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下、または局所投与が可能である。

このような臨床投与のために、本発明の薬学的組成物は、公知の技術を利用して適した剤形に製剤化することができる。本発明の組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度などによってその範囲が多様であり、本技術分野の通常の専門家が容易に決定することができる。

本発明のｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体で構成されたナノ粒子は、ｓｉＲＮＡの生体内安定性を向上させることにより、細胞内に治療用ｓｉＲＮＡを効率的に伝達することができる。また、トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）物質がなくても比較的低い濃度の投与量でｓｉＲＮＡの活性を示すことができるため、癌及び他の感染性疾患のためのｓｉＲＮＡ治療用道具だけでなく、新しい形態のｓｉＲＮＡ伝達システムとして生命工学のための基礎研究及び医学産業上、非常に有用に用いられることができる。

製造された３’−ＰＥＧ−ＣＰＧの構造式である。 実施例１で得られた化合物の^１Ｈ ＮＭＲデータである。 実施例１において、ＬＣＡＡ−ＣＰＧとの結合のための３’−ＰＥＧ試薬である［化合物Ａ］の^１Ｈ ＮＭＲデータである。 実施例１において、ＬＣＡＡ−ＣＰＧとの結合のための３’−ＰＥＧ試薬である［化合物Ｂ］の^１Ｈ ＮＭＲデータである。 実施例１において、ＬＣＡＡ−ＣＰＧとの結合のための３’−ＰＥＧ試薬である［化合物Ｃ］の^１Ｈ ＮＭＲデータである。 実施例１−３において、３’−ＰＥＧ−ＣＰＧとオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）の製造後のＭａｌｄｉ−Ｔｏｆ分子量データである。 実施例１−４において、３’−ＰＥＧ−ＣＰＧとオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）の製造後のＭａｌｄｉ−Ｔｏｆ分子量データである。 高分子化合物が結合していない未修飾ｓｉＲＮＡと、親水性または疎水性高分子化合物が結合した形態のｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体の電気泳動写真である。ｓｉＲＮＡは未修飾（ｎａｋｅｄ）ｓｉＲＮＡを意味し、各接合体は表１に示されたｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体を示す。また、１９、２３、２７、３１ｍｅｒはそれぞれ１９、２３、２７、３１個のヌクレオチドで構成されたｓｉＲＮＡを意味し、全部ｓｉＲＮＡ接合体４の構造でｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体を製造した。 高分子化合物が結合していない未修飾ｓｉＲＮＡと、親水性高分子化合物であるＰＥＧが結合した形態のｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体の血液内安定性の評価のために、血清タンパク質が存在する環境下で時間によるｓｉＲＮＡの分解程度を示す電気泳動写真である。 ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体が形成するナノ粒子の模式図である。 高分子化合物が結合していない未修飾ｓｉＲＮＡ（ｎａｋｅｄ ｓｉＲＮＡ）ナノ粒子の粒子サイズをゼータ電位測定器により測定して示したものである。 ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体９で構成されたナノ粒子の粒子サイズをゼータ電位測定器により測定して示したものである。 ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体１０で構成されたナノ粒子の粒子サイズをゼータ電位測定器により測定して示したものである。 ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体１１で構成されたナノ粒子の粒子サイズをゼータ電位測定器により測定して示したものである。 ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体１２で構成されたナノ粒子の粒子サイズをゼータ電位測定器により測定して示したものである。 ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体１３で構成されたナノ粒子の粒子サイズをゼータ電位測定器により測定して示したものである。 未修飾ｓｉＲＮＡと、親水性高分子化合物であるＰＥＧが結合した形態のｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体のＲＮＡｉ効果を分析するために、トランスフェクション物質とともにトランスフェクションさせた後、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）遺伝子のｍＲＮＡ発現程度を比較したグラフである。 未修飾ｓｉＲＮＡと、ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体４の構造に修飾された長い配列のｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ効果を分析するために、トランスフェクション物質とともにトランスフェクションさせた後、サバイビン遺伝子のｍＲＮＡ発現程度を比較したグラフである。 未修飾ｓｉＲＮＡと、ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体１〜５及び９〜１４に修飾されたｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体のＲＮＡｉ効果を分析するために、トランスフェクション物質がない条件でトランスフェクションさせた後、サバイビン遺伝子のｍＲＮＡ発現の阻害程度を比較したグラフである。

［発明を実施するための具体的な内容］
以下、本発明を実施例を挙げて説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。

実施例１：３’−ＰＥＧオリゴヌクレオチドを製造するための固形支持体の製造

実施例１−１：ＬＣＡＡ−ＣＰＧとの結合のための３’−ＰＥＧ試薬（化合物Ａ、Ｂ、Ｃ）の製造

以後の実施例において、下記反応式で表されるように３’−ＰＥＧ−ＣＰＧを製造した。

実施例１−１−１：２−［ビス−（４−ジメトキシトリチル）−ポリ（エチレングリコール）］の製造
出発物質ポリエチレングリコール２０００（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ、ドイツ）３０ｇ（１５ｍｍｏｌ）をピリジン（ｐｙｒｉｄｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）２７０ｍｌに溶かし、これに、トリエチルアミン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）３．５５ｍｌ（２５．５ｍｍｏｌ）と４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（ＧＬ ｂｉｏｃｈｅｍ、中国）７．１２ｇ（２１ｍｍｏｌ）を入れて常温で２０時間反応させた。反応が終了された反応混合物を濃縮し、エチルアセテート４５０ｍｌと水４５０ｍｌで抽出して、減圧濃縮した後真空乾燥して２−［ビス−（４−ジメトキシトリチル）−ポリ（エチレングリコール）］２３ｇ（６６％）を得た。

前記化合物の^１Ｈ ＮＭＲデータを図２に示した。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）；δ１．９３（ｂｒ，１，ＯＨ），３．２０−３．８０（ｍ，１８６，ＰＥＧ，ＤＭＴ−ＯＣＨ_３），６．８０−６．８３（ｍ，４，ＤＭＴ），７．１９−７．４７（ｍ，９，ＤＭＴ）

実施例１−１−２：コハク酸２−［ビス−（４−ジメトキシトリチル）−ポリ（エチレングリコール）］［化合物Ａ］の製造
前記実施例１−１−１で得られた２−［ビス−（４−ジメトキシトリチル）−ポリ（エチレングリコール）３．９ｇ（１．６７２ｍｍｏｌ）をピリジン２０ｍｌに溶かした後、０℃に冷却した。前記反応物に無水コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ、Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、米国）３５１ｍｇ（３．５１２ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）４２．５ｍｇ（０．３３４ｍｍｏｌ）を添加し、５０℃で３日間撹拌した後反応を終了した。反応が終了された反応混合物を減圧濃縮して、コハク酸２−［ビス−（４−ジメトキシトリチル）−ポリ（エチレングリコール）［化合物Ａ］３．６５ｇ（９０％、白色固体）を得た。

前記化合物の^１Ｈ ＮＭＲデータを図３に示した。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）；δ２．６５（ｍ，２，ＣＨ_２ＣＯ），３．２０−３．８８（ｍ，１８６，ＰＥＧ，ＤＭＴ−ＯＣＨ_３），４．２５（ｍ，２，ＣＨ_２ＣＯ），６．８０−６．８２（ｍ，４，ＤＭＴ），７．１９−７．４７（ｍ，９，ＤＭＴ）。

実施例１−１−３：パラ−ニトロフェニルコハク酸２−ビス−（ジメトキシトリチル）−ポリ（エチレングリコール）［化合物Ｂ］の製造
前記実施例１−１−２で得られた化合物Ａ１ｇ（０．４１１ｍｍｏｌ）をメチレンクロライド（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ、大然化学、韓国）２０ｍｌに溶かした後、０℃に冷却した。前記反応物にトリエチルアミン１４３μｌ（１．０３ｍｍｏｌ）を入れて、クロロギ酸４−ニトロフェニル（４−ｎｉｔｒｏ ｐｈｅｎｙｌ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）１４９ｍｇ（０．７４０ｍｍｏｌ）を添加し、３０分間常温に温度を上げて、４時間撹拌した後反応を終了した。反応が終了された反応混合物をＮａＨＣＯ_３飽和水溶液２０ｍｌと０℃〜４℃に冷却した１Ｍクエン酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）５ｍｌで１回洗浄した後、Ｎａ_２ＳＯ_４（Ｓａｍｃｈｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，韓国）で乾燥した。これを濾過フラスコ（ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ ｆｌａｓｋ）、吸引濾過器（ｂｕｃｈｎｅｒ ｆｕｎｎｅｌ）、真空装置（ａｓｐｉｒａｔｏｒ）を利用して濾過した後減圧濃縮し、パラ−ニトロフェニルコハク酸２−ビス−（ジメトキシトリチル）−ポリ（エチレングリコール）（ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ２−［ｂｉｓ−（４−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）−ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）［化合物Ｂ］１．０ｇ（９４％、淡色固体）を得た。

前記化合物の^１Ｈ ＮＭＲデータを図４に示した。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）；δ２．８０−２．９０（ｍ，２，ＣＨ_２ＣＯ），３．２０−３．８７（ｍ，１８６，ＰＥＧ，ＤＭＴ−ＯＣＨ_３），４．２５（ｍ，２，ＣＨ_２ＣＯ），６．８０−６．８２（ｍ，４，ＤＭＴ），７．１９−７．４７（ｍ，９，ＤＭＴ）

実施例１−１−４：２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルコハク酸２−ビス−（４−ジメトキシトリチル）−ポリ（エチレングリコール）［化合物Ｃ］の製造
前記実施例１−１−２で得られた化合物Ａ５００ｍｇ（０．２０６ｍｍｏｌ）をメチレンクロライド１０ｍｌに溶かした後、ピリジン８３．１４μｌ（１．０３ｍｍｏｌ）を入れた。これに、Ｎ−スクシンイミジルトリフルオロ酢酸（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ tｒｉｆｌｕｏｒｏ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）１
６５ｍｇ（０．７８１ｍｍｏｌ）を添加し、常温で７時間撹拌した後反応を終了した。反応が終了された反応混合物を減圧濃縮し、２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルコハク酸２−ビス−（４−ジメトキシトリチル）−ポリ（エチレングリコール）（２，５−ｄｉｏｘｏ−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ−１−ｙｌ ｅｓｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ２−［ｂｉｓ−（４−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）−ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）［化合物Ｃ］４９０ｍｇ（９４％、白色固体）を得た。

前記化合物の^１Ｈ ＮＭＲデータを図５に示した。
^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）；δ２．７２−２．９７（ｍ，６，ＣＨ_２ＣＯ，ＣＨ_２ＣＨ_２），３．２０−３．８７（ｍ，１８６，ＰＥＧ，ＤＭＴ−ＯＣＨ_３），４．２７−４．２８（ｍ，２，ＣＨ_２ＣＯ），６．８０−６．８３（ｍ，４，ＤＭＴ），７．２０−７．４７（ｍ，９，ＤＭＴ）

実施例１−２：ＬＣＡＡ−ＣＰＧと３’−ＰＥＧ試薬（化合物Ａ）の結合

以後の実施例において、下記反応式で表されるようにＣＰＧと３’−ＰＥＧ試薬を結合させた。

実施例１−２−１：ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（２０００Å）の製造
直径４０〜７５μｍ、空隙サイズ２０００ÅのＣＰＧ（Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ Ｉｎｃ．、カナダ）１０ｇをトルエン１００ｍｌに均一に混合して濡らした後、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ、ＴＣＩ Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ、日本）２ｍｌを入れて混合し、常温で８時間反応させた。反応が終了された混合物を濾過し、メタノール、水、メチレンクロライドで順に洗浄した後、真空乾燥してＬＣＡＡ−ＣＰＧ（２０００Å）１０ｇを得た。

実施例１−２−２：コハク酸２−［ビス−（４−ジメトキシトリチル）−ポリ（エチレングリコール）［化合物Ａ］を用いた３’−ＰＥＧ−ＣＰＧ（２０００Å）の製造
前記実施例１−２−１で得られたＬＣＡＡ−ＣＰＧ（２０００Å）２ｇをメチレンクロライド２０ｍｌで濡らしておいた。また、化合物Ａ８０ｍｇとＴＥＡ（Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）１４μｌ、ＢＯＰ（Ｂｅｎｚｏｒｔｉａｚｏｌ−１−ｙｌｏｘｙｔｒｉｓ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＴＣＩ Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ、日本）１５ｍｇ、ＨＯＢＴ（１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ ａｎｈｙｄｒｏｕｓ、ＴＣＩ Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ、日本）５ｍｇをメチレンクロライド２ｍｌに溶かした溶液を、前記ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（２０００Å）溶液と均一に混合した。これを８時間還流反応させた後、反応が終了された混合物を濾過し、メタノール、水、メチレンクロライドで順に洗浄した後真空乾燥した。

そのうち１ｇにピリジン１０ｍｌを入れて濡らした後、１−メチルイミダゾール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）１ｍｌと無水酢酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）１．６ｍｌを入れて均一に混合し、常温で８時間反応させた。反応が終了されて得られた、キャッピング（Ｃａｐｐｉｎｇ）が終了されたＣＰＧをメタノール、水、メタノール、メチレンクロライドで順に洗浄した後、真空乾燥して３’−ＰＥＧ−ＣＰＧ１ｇを得た。

実施例１−３：ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（２０００Å）と３’−ＰＥＧ試薬（化合物Ｂ）の結合

化合物Ｂを用いて３’−ＰＥＧ−ＣＰＧ（２０００Å）の製造を行った。

具体的には、実施例１−２−１で得られたＬＣＡＡ−ＣＰＧ（２０００Å）１ｇをピリジン８ｍｌで十分濡らしておいた。また、化合物Ｂ２０５ｍｇ（２ｅｑ）とトリエチルアミン５５μｌをピリジン２ｍｌに溶かした溶液を、前記ＬＣＡＡ−ＣＰＧ溶液と均一に混合した。これを５０〜６０℃で８時間反応させた後、反応が終了された混合物を濾過し、濾過されたカップリング−ＣＰＧをメタノール、水、メチレンクロライドで順に洗浄した後、真空乾燥した。乾燥終了されたカップリング−ＣＰＧ１ｇにピリジン１０ｍｌを入れて濡らした後、１−メチルイミダゾール５００μｌと無水酢酸８００μｌを入れて均一に混合し、常温で８時間反応させた。反応が終了された混合物を濾過し、カップリング−ＣＰＧをメタノール、水、メチレンクロライドで順に洗浄した後、真空乾燥して３’−ＰＥＧ−ＣＰＧ１ｇを得た。

図６は、３’−ＰＥＧ−ＣＰＧを出発物質として用いて後述の実施例２に示すようにｓｉＲＮＡを製造した後、Ｍａｌｄｉ−Ｔｏｆ分子量を確認した結果である。

３’−ＰＥＧ−ＣＰＧの製造配列；
ｓｅｎｓｅ ５’−ＡＡＧＧＡＧＡＵＣＡＡＣＡＵＵＵＵＣＡ（ｄＴｄＴ）−ＰＥＧ（６６６４．９６Ｄａ＋２０００Ｄａ）（配列番号１）
ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ５’−ＵＧＡＡＡＡＵＧＵＵＧＡＵＣＵＣＣＵＵ（ｄＴｄＴ）−ＰＥＧ（６５９２．８４Ｄａ＋２０００Ｄａ）（配列番号５）

ＰＥＧの分子量（２０００Ｄａ）分だけＭａｌｄｉ−Ｔｏｆ分子量が増加したことを確認することができる。

実施例１−４：ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（２０００Å）と３’−ＰＥＧ試薬（化合物Ｃ）の結合

化合物Ｃを用いて３’−ＰＥＧ−ＣＰＧ（２０００Å）の製造を行った。

具体的には、前記実施例１−２−１で得られたＬＣＡＡ−ＣＰＧ（２０００Å）１ｇをピリジン８ｍｌに十分濡らしておいた。また、化合物Ｃ２００ｍｇとトリエチルアミン５５μｌをピリジン２ｍｌに溶かした溶液を、前記ＬＣＡＡ−ＣＰＧ溶液と均一に混合した。５０〜６０℃で８時間反応させた後、反応が終了された混合物を濾過し、濾過されたカップリング−ＣＰＧをメタノール、水、メチレンクロライドで順に洗浄した後真空乾燥した。乾燥終了されたカップリング−ＣＰＧ１ｇにピリジン１０ｍｌを入れて濡らした後、１−メチルイミダゾール５００μｌと無水酢酸８００μｌを入れて均一に混合し、常温で８時間反応させた。反応が終了されて得られた、キャッピングが終了されたＣＰＧをメタノール、水、メチレンクロライドで順に洗浄した後真空乾燥して、３’−ＰＥＧ−ＣＰＧ１ｇを得た。

図７は、３’−ＰＥＧ−ＣＰＧを出発物質として用いて後述の実施例２に示すようにｓｉＲＮＡを製造した結果である。

３’−ＰＥＧ−ＣＰＧ製造配列；
ｓｅｎｓｅ ５’−ＡＡＧＧＡＧＡＵＣＡＡＣＡＵＵＵＵＣＡ（ｄＴｄＴ）−ＰＥＧ（６６６４．９６Ｄａ＋２０００Ｄａ）（配列番号１）
ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ５’−ＵＧＡＡＡＡＵＧＵＵＧＡＵＣＵＣＣＵＵ（ｄＴｄＴ）−ＰＥＧ（６５９２．８４Ｄａ＋２０００Ｄａ）（配列番号５）

ＰＥＧの分子量（２０００Ｄａ）分だけＭａｌｄｉ−Ｔｏｆ分子量が増加したことを確認することができる。

実施例２：ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体の製造
以下の実施例では、サバイビンを抑制するためにサバイビンｓｉＲＮＡを用いた。サバイビンは、今までテストされた殆どの新生腫瘍や形質変異された細胞株で共通に発現されるタンパク質であり、坑癌治療において重要なターゲットとなると予測されている（Ａｂｂｒｏｓｉｎｉ Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．ｍｅｄ．３（８）：９１７−９２１，１９９７）。本発明のサバイビンｓｉＲＮＡの配列は、１９個のヌクレオチドで構成された場合、配列番号１番に記載されるセンス鎖とこれに相補的な配列のアンチセンス鎖で構成されている。その他に、２３個、２７個、３１個のヌクレオチドで構成された場合、配列番号２、３、４に記載される塩基配列を有する。

（配列番号１）５’−ＡＡＧＧＡＧＡＵＣＡＡＣＡＵＵＵＵＣＡ−３’
（配列番号２）５’−ＡＧＧＡＡＡＧＧＡＧＡＵＣＡＡＣＡＵＵＵＵＣＡ−３’
（配列番号３）５’−ＡＧＧＡＡＡＧＧＡＧＡＵＣＡＡＣＡＵＵＵＵＣＡＡＡＵＵ−３’（配列番号４）５’−ＡＡＡＧＧＡＧＡＵＣＡＡＣＡＵＵＵＵＣＡＡＡＵＵＡＧＡＵＧＵＵ−３’

前記ｓｉＲＮＡは、β−シアノエチルホスホラミダイトを利用してＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結していく方法により製造した。具体的には、ＲＮＡ合成器（３８４ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて、ヌクレオチドが付着された固形支持体上で、遮断除去、結合、酸化及びキャッピングからなる一連の過程を繰り返して、所望の長さのＲＮＡを含む反応物を得た。

追加的に、５’末端部位にＰＥＧまたは疎水性高分子化合物であるドデカン（ｄｏｄｅｃａｎｅ）リンカーを利用してヘキサデカン（ｈｅｘａｄｅｃａｎｅ、Ｃ１６）やオクタデカン（ｏｃｔａｄｅｃａｎｅ、Ｃ１８）飽和炭化水素を連結して、ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体を製造した。また、前記実施例１で製造された３’ＰＥＧ−ＣＰＧを支持体として前記反応を行い、３’末端部位にＰＥＧが付加されたｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体を製造した。

前記反応物をＨＰＬＣ（ＬＣ−２０Ａ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ、日本）を利用してＲＮＡを分離し、これをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析機（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ、日本）を利用して分子量を測定して、製造しようとする塩基配列と対応するかを確認した。その後、センスとアンチセンスＲＮＡ鎖を同量混合して１Ｘアニーリングバッファー（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ
ａｃｅｔａｔｅ、２ｍＭ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ７．０〜７．５）に入れ、９０℃恒温水槽で３分反応させた後、さらに３７℃で反応させ、目的とする二本鎖ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体をそれぞれ製造した。製造されたｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体は、表１に示す構造を有する。製造されたｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体は、電気泳動写真によりアニーリングを確認した（図８）。

実施例３：ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体の生体内条件での安定性の評価
前記実施例２で製造、分離したｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体が、高分子化合物が結合されていない元来のｓｉＲＮＡに比べ安定性が向上されたかを確認した。修飾されていない元来のｓｉＲＮＡと前記実施例２で製造したｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体１〜５を、生体内条件を模倣した形態である１０％のＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）が添加された培地でそれぞれ０、１、３、６、９、１２、２４、３６または４８時間培養した後、ｓｉＲＮＡの分解程度を電気泳動で検討した。

その結果、ＰＥＧが導入されたｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体の場合、４８時間までｓｉＲＮＡが安定性を示すことが確認された（図９）。１０％血清条件でも、１２〜２４時間までｓｉＲＮＡが安定性を示した。

実施例４：ｓｉＲＮＡ疎水性高分子化合物接合体のナノ粒子サイズの測定
ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体９〜１４の場合、ｓｉＲＮＡの末端に付加された疎水性高分子化合物間の疎水性相互作用により、ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体からなるナノ粒子、即ち、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）が形成される（図１０）。ゼータ電位測定器（ｚｅｔａ−ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）を利用して前記ナノ粒子のサイズを測定した。

前記実施例２で製造したそれぞれのｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体９〜１３とｓｉＲＮＡのナノ粒子サイズを測定した。

具体的には、前記ｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体２ｎｍoleを１ｍｌの蒸
溜水に溶かした後、超音波分散器（Ｗｉｓｅｃｌｅａｎ、ＤＡＩＨＡＮ、韓国）でナノ粒子のサイズを均質化（２００Ｗ、４０ｋＨｚ、５ｓｅｃ）した。均質化されたナノ粒子は、ゼータ電位測定器（Ｎａｎｏ−ＺＳ、ＭＡＬＶＥＲＮ、イギリス）でそのサイズを測定したが、物質に対する屈折率（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）は１．４５４、吸収率（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）は０．００１とし、溶媒である水の温図２５℃及びそれによる粘度及び屈折率を入力して測定した。１回測定はサイズ測定を２０回繰り返すことにより行われ、これを３回繰り返した。

図１１は、未修飾（ｎａｋｅｄ）ｓｉＲＮＡナノ粒子の粒子サイズをゼータ電位測定器により測定して示した結果である。ｓｉＲＮＡで構成されたナノ粒子の場合、１４２−２９５ｎｍ（最高点１６４ｎｍ）のサイズを有するものが７３．５％を占めることが分かる。

図１２は、ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体９で構成されたナノ粒子の粒子サイズをゼータ電位測定器により測定して示した結果である。ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体９で構成されたナノ粒子の場合、４．１９−７．５３ｎｍ（最高点６．５０ｎｍ）のサイズを有するものが５９．１％を占めることが分かる。

図１３は、ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体１０で構成されたナノ粒子の粒子サイズをゼータ電位測定器により測定して示した結果である。ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体１０で構成されたナノ粒子の場合、５．６１−１０．１ｎｍ（最高点８．７２ｎｍ）のサイズを有するものが５８．９％を占めることが分かる。

図１４は、ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体１１で構成されたナノ粒子の粒子サイズをゼータ電位測定器により測定して示した結果である。ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体１１で構成されたナノ粒子の場合、５．６１−１０．１ｎｍ（最高点８．７２ｎｍ）のサイズを有するものが４５．６％を占めることが分かる。

図１５は、ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体１２で構成されたナノ粒子の粒子サイズをゼータ電位測定器により測定して示した結果である。ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体１２で構成されたナノ粒子の場合、４．８５−５．６１ｎｍのサイズを有するものが２３．６％、２１．０−３２．７ｎｍのサイズを有するものが２３．５％、６８．１−７８．８ｎｍのサイズを有するものが２３．１％を占めることが分かる。

図１６は、ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体１３で構成されたナノ粒子の粒子サイズをゼータ電位測定器により測定して示した結果である。ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体１３で構成されたナノ粒子の場合、４．８５−８．７２ｎｍ（最高点５．６１ｎｍ）のサイズを有するものが８４．６％を占めることが分かる。

ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体９〜１３で構成されたナノ粒子の場合、ｓｉＲＮＡ接合体１２を除き、４−８ｎｍのサイズを有するものが殆どであった。ｓｉＲＮＡ接合体１２の場合、ナノ粒子のサイズが多様に測定されたが、これは、測定する過程で超音波分散器を利用して均質化しても、時間が経過するにつれて各ナノ粒子が凝集される現象を示すためであると思われる。図１２〜１６から分かるように、測定されたｓｉＲＮＡ接合体で構成されたナノ粒子のサイズは１００ｎｍ以下のサイズを示し、これは、ピノサイトーシス（ｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）により細胞内に取り込ませるのに十分なサイズである（Ｋｅｎｎｅｔｈ Ａ．Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ｎａｔｕｒｅ ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：８４−８５，２００９）。

実施例５：ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体とトランスフェクション物質（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ）を利用した腫瘍細胞株での標的遺伝子の発現の抑制
前記実施例２で製造したそれぞれのｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体１〜８を利用して、腫瘍細胞株であるヒト子宮癌細胞株をトランスフェクションさせ、前記トランスフェクションされた腫瘍細胞株でサバイビン遺伝子の発現様相を分析した。

実施例５−１：腫瘍細胞株の培養
アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）から得られたヒト子宮癌細胞（ＨｅＬａ）は、ＲＰＭＩ１６４０培養培地（ＧＩＢＣＯ、Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ、米国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加して、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２の条件下で培養した。

実施例５−２：ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体を利用した標的遺伝子の発現の抑制
前記実施例２で製造された配列番号１のｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体１〜８を利用して、腫瘍細胞株であるヒト子宮癌細胞株（ＨｅＬａ）をトランスフェクションさせ、前記トランスフェクションされた腫瘍細胞株で、サバイビンの発現様相を分析した。

実施例５−２−１：ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体を利用した腫瘍細胞株のトランスフェクション
前記実施例５−１で培養された腫瘍細胞株１．３×１０^５を、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２の条件で６−ウェルプレートで１８時間ＲＰＭＩ１６４０で培養した後培地を除去し、各ウェル当り８００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、米国）を分注した。

一方、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）２μｌとＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地１９８μｌを混合し、室温で５分間反応させた後、前記実施例２で製造したそれぞれのｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体（２５ｐｍｏｌｅ／μｌ）０．８または４μｌを添加し（最終２０，１００ｎＭ処理）、さらに室温で２０分間反応させて溶液を製造した。

その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭが分注された腫瘍細胞株の各ウェルにトランスフェクション用溶液をそれぞれ２００μｌずつ分注して６時間培養した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を除去した。これに、ＲＰＭＩ１６４０培養培地２．５ｍｌを分注した後、２４時間３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２の条件下で培養した。

実施例５−２−２：サバイビン遺伝子のｍＲＮＡ相対的定量分析
前記実施例５−２−１でトランスフェクションされた細胞株から全体ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を利用してサバイビン遺伝子のｍＲＮＡ量を相対定量した。

実施例５−２−２−１：トランスフェクションされた細胞からＲＮＡ分離及びｃＤＮＡ製造
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｃｅｌｌ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を利用して前記実施例５−２−１でトランスフェクションされた細胞株から全体ＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡは、ＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ_２０、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を利用して次の方法によりｃＤＮＡを製造した。

具体的には、０．２５ｍｌのエッペンドルフチューブに入っているＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ_２０（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）に、一つのチューブ当り抽出されたＲＮＡを１μｇずつ入れて、総体積が２０μｌとなるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理された蒸溜水を添加した。これを、遺伝子増幅装置（ＭｙＧｅｎｉｅ^ＴＭ ９６ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）で、３０℃で１分間ＲＮＡとプライマーをハイブリダイゼーションし、５２℃で４分間ｃＤＮＡを製造する二つの過程を６回繰り返した後、９５℃で５分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。

実施例５−２−２−２：サバイビンのｍＲＮＡ相対的定量分析
前記実施例５−２−２−１で製造されたｃＤＮＡを鋳型とし、リアルタイムＰＣＲを利用してサバイビンｍＲＮＡの相対的量を次の方法により定量した。

即ち、９６−ウェルプレートの各ウェルに、前記実施例５−２−２−１で製造されたｃＤＮＡを蒸溜水で１／５に希薄し、サバイビンの発現量を分析するために希薄されたｃＤＮＡ３μｌと２×ＧｒｅｅｎＳｔａｒ^ＴＭＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１０μｌ、蒸溜水６μｌ、サバイビンｑＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌｅ／μｌそれぞれ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１μｌ入れて混合液を製造した。一方、ｍＲＮＡの発現量を正規化するために、ハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ、以下、ＨＫ遺伝子）であるＨＭＢＳ（Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ｂｉｌａｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＨＰＲＴ１（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１）、ＵＢＣ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ）、ＹＷＨＡＺ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ３−ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ／ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ５−ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ａｃｔｉｖｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ、ｚｅｔａ
ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を標準遺伝子とし、前記実施例５−２−２−１で製造されたｃＤＮＡを１／５に希薄し、９６−ウェルプレートの各ウェルに、希薄された同一のｃＤＮＡ３μｌと２×ＧｒｅｅｎＳｔａｒ^ＴＭ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１０μｌ、蒸溜水６μｌ、各ＨＫ遺伝子ｑＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌｅ／μｌそれぞれ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１μｌ入れて、ＨＫ遺伝子リアルタイムＰＣＲ混合液を製造した。混合液が入っている９６−ウェルプレートをＥｘｉｃｙｃｌｅｒ^ＴＭ ９６ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を利用して、次のような反応を行った。

９５℃で１５分間反応して酵素の活性化及びｃＤＮＡの二次構造を解消した後、９４℃で３０秒変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、５８℃で３０秒アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で３０秒延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、ＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎｓｃａｎ）の四つの過程を４２回繰り返して行い、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持して、５５℃−９５℃までの融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）を分析した。

ＰＣＲが終了された後、それぞれ得られたサバイビンのＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値は、ＨＫ遺伝子により正規化されたｍＲＮＡ値（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒ、ＮＦ）を計算して補正されたサバイビンのＣｔ値を求めた後、トランスフェクション物質のみが処理された実験群を対照群としてΔＣｔ値の差を求めた。前記ΔＣｔ値と計算式２^{（−ΔＣｔ）}Ｘ１００を利用してサバイビンのｍＲＮＡ発現率を比較した（図１７）。ｍｏｃｋは、トランスフェクション物質のみが処理された対照群を意味する。

その結果、図１７に示したように、親水性高分子化合物であるＰＥＧが結合した形態のｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体の末端の修飾形態によって、ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ効果に変化が生じることが分かる。特に、接合体６〜８の末端の修飾形態は３’末端部位にＰＥＧを接合させた接合体であり、修飾されていないｓｉＲＮＡと近似した程度の発現阻害を示して、ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉメカニズム上、ＲＮＡ誘導サイレンシング接合体（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ、ＲＩＳＣ）と接合体を形成するにあたり立体障害（ｓｔｅｒｉｃ ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）が少なく生じると予想される。また、殆どのｓｉＲＮＡ−ＰＥＧ接合体は、低濃度（２０ｎＭ）条件が高濃度（１００ｎＭ）処理条件より高い標的遺伝子ｍＲＮＡの発現阻害を示し、高濃度条件であるほどＰＥＧによってｓｉＲＮＡがＲＩＳＣと結合することが妨害されると予想される。

実施例５−３：長い配列のｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体を利用した標的遺伝子の発現の抑制
ｓｉＲＮＡ配列番号１〜４の塩基配列に、ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体４の構造に末端修飾を誘導したｓｉＲＮＡを利用して、トランスフェクション物質とともにｓｉＲＮＡ親水性高分子化合物接合体で細胞をトランスフェクションさせた時の標的遺伝子のｍＲＮＡ発現の阻害を分析した。

実施例５−３−１：ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体を利用した腫瘍細胞株のトランスフェクション
前記実施例５−１で培養された腫瘍細胞株１．３×１０^５を、前記３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２の条件下で６−ウェルプレートで２４時間ＲＰＭＩ１６４０で培養した後培地を除去し、各ウェル当り８００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を分注した。

一方、２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ２０００とＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地１９８μｌを混合して、室温で５分間反応させた後、前記実施例２で製造したそれぞれのｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体（２５ｐｍｏｌｅ／μｌ）０．８または４μｌを添加し（最終２０，１００ｎＭ処理）、さらに室温で２０分間反応させて溶液を製造した。

その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭが分注された腫瘍細胞株の各ウェルにトランスフェクション用溶液をそれぞれ２００μｌずつ分注して６時間培養した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を除去した。これに、ＲＰＭＩ１６４０培養培地２．５ｍｌを分注した後、２４時間３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２の条件下で培養した。

実施例５−３−２：サバイビン遺伝子のｍＲＮＡ相対的定量分析
前記実施例５−３−１でトランスフェクションされた細胞株から全体ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ−tｉｍｅ ＰＣＲ）を利用してサ
バイビン遺伝子のｍＲＮＡ量を相対定量した。

実施例５−３−２−１：トランスフェクションされた細胞からＲＮＡ分離及びｃＤＮＡ製造
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｃｅｌｌ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を利用して前記実施例５−３−１でトランスフェクションされた細胞株から全体ＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡは、ＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ_２０、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を利用して次の方法によりｃＤＮＡを製造した。

具体的には、０．２５ｍｌのエッペンドルフチューブに入っているＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ_２０（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）に、一つのチューブ当り抽出されたＲＮＡを１μｇずつ入れて、総体積が２０μｌとなるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理された蒸溜水を添加した。これを、遺伝子増幅装置（ＭｙＧｅｎｉｅ^ＴＭ ９６ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）で、３０℃で１分間ＲＮＡとプライマーをハイブリダイゼーションし、５２℃で４分間ｃＤＮＡを製造する二つの過程を６回繰り返した後、９５℃で５分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。

実施例５−３−２−２：サバイビンのｍＲＮＡ相対的定量分析
前記実施例５−３−２−１で製造されたｃＤＮＡを鋳型とし、リアルタイムＰＣＲを利用してサバイビンｍＲＮＡの相対的な量を次の方法により定量した。

即ち、９６−ウェルプレートの各ウェルに、前記実施例５−３−２−１で製造されたｃＤＮＡを１／５に希薄し、サバイビンの発現量を分析するために希薄されたｃＤＮＡ３μｌと２×ＧｒｅｅｎＳｔａｒ^ＴＭ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１０μｌ、蒸溜水６μｌ、サバイビンｑＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌｅ／μｌそれぞれ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１μｌ入れて混合液を製造した。一方、ｍＲＮＡの発現量を正規化するために、ＨＫ遺伝子であるＨＭＢＳ、ＨＰＲＴ１、ＵＢＣ、ＹＷＨＡＺを標準遺伝子とし、前記実施例５−３−２−１で製造されたｃＤＮＡを１／５に希薄し、９６−ウェルプレートの各ウェルに、希薄されたｃＤＮＡ３μｌと２×ＧｒｅｅｎＳｔａｒ^ＴＭ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１０μｌ、蒸溜水６μｌ、各ＨＫ遺伝子ｑＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌｅ／μｌそれぞれ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１μｌ入れて、ＨＫ遺伝子リアルタイムＰＣＲ混合液を製造した。混合液が入っている９６−ウェルプレートを、Ｅｘｉｃｙｃｌｅｒ^ＴＭ ９６ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を利用して、次のような反応を行った。

９５℃で１５分間反応して酵素の活性化及びｃＤＮＡの二次構造を解消した後、９４℃で３０秒変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、５８℃で３０秒アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で３０秒延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、ＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎｓｃａｎ）の四つの過程を４２回繰り返して行い、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持して、５５℃−９５℃までの融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）を分析した。

ＰＣＲが終了された後、それぞれ得られたサバイビンのＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値は、ＨＫ遺伝子により正規化されたｍＲＮＡ値（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒ、ＮＦ）を計算して補正されたサバイビンのＣｔ値を求めた後、トランスフェクション物質のみが処理された実験群を対照群としてΔＣｔ値の差を求めた。前記ΔＣｔ値と計算式２^{（−ΔＣｔ）}Ｘ１００を利用してサバイビンのｍＲＮＡ発現率を比較した（図１８）。ｍｏｃｋはトランスフェクション物質のみが処理された対照群を意味し、１９ｍｅｒ、２３ｍｅｒ、２７ｍｅｒ、３１ｍｅｒはそれぞれ配列番号１〜４を示す。５’Ｐ＋ＰはｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体４の構造を示し、各２０ｎＭ、１００ｎＭの条件で処理した後、標的遺伝子の発現の阻害程度を比較した。

その結果、図１８に示すように、長い鎖の未修飾（ｎａｋｅｄ）ｓｉＲＮＡの形態をｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体４の形態に修飾させる場合、元来の未修飾（ｎａｋｅｄ）形態のｓｉＲＮＡに比べ、標的遺伝子ｍＲＮＡの発現の阻害効果に差が生じず、長い鎖のｓｉＲＮＡを修飾させる場合、短い鎖に比べＰＥＧによって生じる立体障害現象が減少することを把握することができた。即ち、長い鎖のｓｉＲＮＡの場合、ＲＮＡｉの作用機序でダイサー（ｄｉｃｅｒ）によってｓｉＲＮＡが１９＋２構造に切断され、切断されたｓｉＲＮＡがＲＩＳＣ接合体に結合してＲＮＡｉ作用機序を起こす。このため、長い鎖のｓｉＲＮＡの両末端部位にＰＥＧが付加された場合、配列番号１に比べＰＥＧが付いていないｓｉＲＮＡが多量存在してＲＩＳＣ接合体と相対的に高い相互作用を有し、これによりＲＮＡｉ誘導効果が維持されると思われる。

実施例６：トランスフェクション物質を用いず、ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体のみを利用した腫瘍細胞株での標的遺伝子の発現の抑制
前記実施例２で製造したそれぞれのｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体１〜１４を利用して、腫瘍細胞株であるヒト子宮癌細胞株（ＨｅＬａ）をトランスフェクションさせ、前記トランスフェクションされた腫瘍細胞株のサバイビンの発現様相を分析した。

実施例６−１：腫瘍細胞株の培養
アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃaｎ ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）から得られたヒト子宮癌細胞（ＨｅＬａ）は、ＲＰＭＩ１６４０培養培地（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ、米国）に１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加して、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２の条件下で培養した。

実施例６−２：ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体を利用した腫瘍細胞株のトランスフェクション
前記実施例６−１で培養された腫瘍細胞株１．３×１０^５を、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２の条件で６−ウェルプレートで２４時間ＲＰＭＩ１６４０で培養した後培地を除去し、各ウェル当り９００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を分注した。

一方、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地１００μｌと前記実施例２で製造したそれぞれのｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体１〜５（１ｎｍｏｌｅ／μｌ）５または１０μｌを添加し（最終５００ｎＭ、１μｍ処理）、さらに室温で２０分間反応させて溶液を製造した。

一方、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地１００μｌと前記実施例２で製造したそれぞれのｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体９〜１４（１ｎｍｏｌｅ／μｌ）５または１０μｌを添加し（最終５００ｎＭ、１μｍ処理）、超音波による分解（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）によりｓｉＲＮＡ疎水性高分子化合物接合体で構成されたミセルを均質化して溶液を製造した。

その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭが分注された腫瘍細胞株の各ウェルにトランスフェクション用溶液をそれぞれ１００μｌずつ分注して２４時間培養した後、２０％ＦＢＳが含まれたＲＰＭＩ１６４０１ｍｌを添加した。これに、２４時間３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２の条件下でさらに培養し、ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体処理後、総４８時間培養した。

実施例６−３：サバイビン遺伝子のｍＲＮＡ相対的定量分析
前記実施例６−２でトランスフェクションされた細胞株から全体ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ−tｉｍｅ ＰＣＲ）を利用してサバイ
ビン遺伝子のｍＲＮＡ量を相対定量した。

実施例６−３−１：トランスフェクションされた細胞からＲＮＡ分離及びｃＤＮＡ製造
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｃｅｌｌ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を利用して前記実施例６−２でトランスフェクションされた細胞株から全体ＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡは、ＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ_２０、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を利用して次の方法によりｃＤＮＡを製造した。

具体的には、０．２５ｍｌのエッペンドルフチューブに入っているＡｃｃｕＰｏｗｅｒ ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ_２０（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）に、一つのチューブ当り抽出されたＲＮＡを１μｇずつ入れて、総体積が２０μｌとなるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理された蒸溜水を添加した。これを、遺伝子増幅装置（ＭｙＧｅｎｉｅ^ＴＭ ９６ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）で、３０℃で１分間ＲＮＡとプライマーをハイブリダイゼーションし、５２℃で４分間ｃＤＮＡを製造する二つの過程を６回繰り返した後、９５℃で５分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。

実施例６−３−２：サバイビンのｍＲＮＡ相対的定量分析
前記実施例６−３−１で製造されたｃＤＮＡを鋳型とし、リアルタイムＰＣＲを利用してサバイビンｍＲＮＡの相対的な量を次の方法により定量した。

即ち、９６−ウェルプレートの各ウェルに、前記実施例６−３−１で製造されたｃＤＮＡを１／５に希薄し、サバイビンの発現量を分析するために希薄されたｃＤＮＡ３μｌと２×ＧｒｅｅｎＳｔａｒ^ＴＭ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１０μｌ、蒸溜水６μｌ、サバイビンｑＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌｅ／μｌそれぞれ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１μｌ入れて混合液を製造した。一方、ｍＲＮＡの発現量を正規化するために、ハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ、以下、ＨＫ遺伝子）であるＨＭＢＳ（Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ｂｉｌａｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＨＰＲＴ１（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１）、ＵＢＣ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ）、ＹＷＨＡＺ（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ３−ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ／ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ５−ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ａｃｔｉｖｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ、ｚｅｔａ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を標準遺伝子とし、前記実施例６−３−１で製造されたｃＤＮＡを１／５に希薄し、９６−ウェルプレートの各ウェルに、希薄されたｃＤＮＡ３μｌと２×ＧｒｅｅｎＳｔａｒ^ＴＭ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１０μｌ、蒸溜水６μｌ、各ＨＫ遺伝子ｑＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌｅ／μｌそれぞれ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１μｌ入れて、ＨＫ遺伝子リアルタイムＰＣＲ混合液を製造した。混合液が入っている９６−ウェルプレートを、Ｅｘｉｃｙｃｌｅｒ^ＴＭ ９６ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を利用して、次のような反応を行った。

９５℃で１５分間反応して酵素の活性化及びｃＤＮＡの二次構造を解消した後、９４℃で３０秒変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、５８℃で３０秒アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で３０秒延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、ＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎｓｃａｎ）の四つの過程を４２回繰り返して行い、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持して、５５℃−９５℃までの融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）を分析した。ＰＣＲが終了された後、それぞれ得られたサバイビンのＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値は、ＨＫ遺伝子により正規化されたｍＲＮＡ値（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ、ＮＦ）を計算して補正されたサバイビンのＣｔ値を求めた後、トランスフェクション物質のみが処理された実験群を対照群としてΔＣｔ値の差を求めた。前記ΔＣｔ値と計算式２^{（−ΔＣｔ）}Ｘ１００を利用してサバイビンのｍＲＮＡ発現率を比較した（図１９）。

その結果、図１９に示すように、接合体２〜５のｓｉＲＮＡ ＰＥＧ接合体の場合、トランスフェクション物質によりトランスフェクションされた結果とは異なって、ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体１に比べサバイビンｍＲＮＡ発現量が非常に阻害され、ｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体１〜５の場合、濃度が低い場合（５００ｎＭ）が濃度が高い場合より高いＲＮＡｉ効果を示した。また、接合体９〜１４のｓｉＲＮＡ疎水性高分子化合物接合体はｓｉＲＮＡ親水性高分子化合物接合体２〜５に比べ、同一の濃度（５００ｎＭ）処理すると、大体の場合サバイビンｍＲＮＡ発現量の阻害が高くない結果を示した。しかし、高濃度条件（１μｍ）で処理した場合、特にｓｉＲＮＡ高分子化合物接合体１４で高いサバイビンｍＲＮＡ発現量の阻害効果を示した。

Claims (21)

1. 下記構造のｓｉＲＮＡと高分子化合物接合体。
   Ａ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ
   （上記で、Ａ及びＢはそれぞれ独立に、親水性高分子または疎水性高分子化合物であり、Ｘ、Ｙはそれぞれ独立に、リンカーで媒介されていない共有結合またはリンカーで媒介された共有結合であり、ＲはｓｉＲＮＡを示す。）
2. 下記構造のｓｉＲＮＡと高分子化合物接合体。
   Ａ−Ｘ−Ｒ
   （上記で、Ａは疎水性高分子化合物であり、Ｘはリンカーで媒介されていない共有結合またはリンカーで媒介された共有結合であり、ＲはｓｉＲＮＡを示す。）
3. ｓｉＲＮＡ（Ｒ）の一本鎖は、１９〜３１個のヌクレオチドで構成される請求項１または２に記載の接合体。
4. 疎水性高分子化合物（Ａ）は、分子量２５０〜１，０００の疎水性高分子化合物であることを特徴とする請求項１または２に記載の接合体。
5. 疎水性高分子化合物（Ａ）は、Ｃ_１６−Ｃ_５０の飽和炭化水素またはコレステロールである請求項４に記載の接合体。
6. 共有結合（Ｘ、Ｙ）は、非分解性結合または分解性結合である請求項１または２に記載の接合体。
7. 非分解性結合は、アミド結合またはリン酸結合である請求項６に記載の接合体。
8. 分解性結合は、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンヒドリド結合、生分解性結合及び酵素分解性結合から選択される請求項６に記載の接合体。
9. 親水性高分子化合物（ＡまたはＢ）は、分子量１，０００〜１０，０００の非イオン性高分子化合物である請求項１に記載の接合体。
10. 親水性高分子化合物は、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリオキサゾリンからなる群から選択される請求項９に記載の接合体。
11. 下記構造のポリエチレングリコールが結合された固形支持体。
    （上記で、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロアリールであり；ｍは、２〜１８の整数であり、ｎは５〜１２０の整数であり、Ｘは、水素、４−モノメトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、または４，４’，４”−トリメトキシトリチル基である。）
12. 固形支持体がＣＰＧである請求項１１に記載のポリエチレングリコールが結合された固形支持体。
13. ＣＰＧは、直径が４０〜１８０μｍであり、空隙サイズが５００Å〜３０００Åである請求項１２に記載のポリエチレングリコールが結合された固形支持体。
14. 下記構造式IVで表される構造を有する３’−ＰＥＧ−ＣＰＧである請求項１１乃至１３の何れか一つに記載のポリエチレングリコールが結合された固形支持体。
    ［構造式IV］
    
15. １）ＣＰＧに３−アミノプロピルトリエトキシシランを反応させて、ＬＣＡＡ−ＣＰＧを形成する段階と、
    ２）ポリエチレングリコールに４，４’−ジメトキシトリチルクロライドを反応させて、２−［ビス−（４−ジメトキシトリチル）−ポリ（エチレングリコール）］を形成する段階と、
    ３）前記２）で形成された化合物と下記化学式１の化合物とを反応させて、下記構造式Ｉで表される化合物を形成する段階と、
    ４）前記形成された下記構造式Ｉの化合物とクロロギ酸４−ニトロフェニルとを反応させて、下記構造式IIで表される化合物を形成する段階と、
    ５）前記３）で形成された下記構造式Ｉの化合物とＮ−スクシンイミジルトリフルオロ酢酸とを反応させて、下記構造式IIIで表される化合物を形成する段階と、
    ６）前記１）で形成されたＬＣＡＡ−ＣＰＧ化合物を、前記３）から５）でそれぞれ形成された下記構造式Ｉ、IIまたはIIIの化合物とそれぞれ反応させる段階と、を含む下記構
    造式IVの３’−ＰＥＧ−ＣＰＧの製造方法。
    ［化学式１］
    
    ［構造式Ｉ］
    
    ［構造式II］
    
    ［構造式III］
    
    ［構造式IV］
    （上記で、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロアリールであり；ｎは５以上１２０以下の整数である。）
16. 請求項１または２に記載のｓｉＲＮＡ接合体の製造方法であって、
    １）請求項１１に記載のポリエチレングリコールが結合された固形支持体を利用して、標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡを製造する段階と、
    ２）ｓｉＲＮＡの末端基とポリエチレングリコールとを共有結合で連結する段階と、を含む、ｓｉＲＮＡ接合体の製造方法。
17. 請求項１または２に記載のｓｉＲＮＡ接合体で構成されたナノ粒子。
18. １）請求項１７に記載のナノ粒子を準備する段階と、
    ２）前記ナノ粒子を動物の体内に投入する段階と、を含む遺伝子治療方法。
19. ナノ粒子は、経口投与または静脈注射の方法で体内に投与されることを特徴とする請求項１８に記載の治療方法。
20. 請求項１または２に記載のｓｉＲＮＡ接合体の薬学的有効量を含む薬学的組成物。
21. 請求項１７に記載のナノ粒子の薬学的有効量を含む薬学的組成物。