RU2558258C2 - Конъюгат мирнк и способ его получения - Google Patents
Конъюгат мирнк и способ его получения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2558258C2 RU2558258C2 RU2011150787/10A RU2011150787A RU2558258C2 RU 2558258 C2 RU2558258 C2 RU 2558258C2 RU 2011150787/10 A RU2011150787/10 A RU 2011150787/10A RU 2011150787 A RU2011150787 A RU 2011150787A RU 2558258 C2 RU2558258 C2 RU 2558258C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sirna
- bond
- conjugate
- polymer compound
- compound
- Prior art date
Links
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 198
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 192
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 50
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 31
- 102000000763 Survivin Human genes 0.000 claims abstract description 24
- -1 cholesterol Chemical class 0.000 claims abstract description 19
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims abstract description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 107
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 103
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 98
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 claims description 28
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 11
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 claims description 10
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 claims description 10
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 9
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims description 5
- 125000004404 heteroalkyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 4
- 229920000765 poly(2-oxazolines) Polymers 0.000 claims description 4
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 4
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 4
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 4
- 125000002103 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)(C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H])C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 3
- 229920000831 ionic polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- 125000001805 pentosyl group Chemical group 0.000 claims 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 150000002433 hydrophilic molecules Chemical class 0.000 abstract 3
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 abstract 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 44
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 38
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 36
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 36
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 33
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 32
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 27
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 26
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 description 24
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 23
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 13
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 13
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 13
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 13
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 13
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 13
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 10
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 9
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 9
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 8
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 7
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 7
- GHYOCDFICYLMRF-UTIIJYGPSA-N (2S,3R)-N-[(2S)-3-(cyclopenten-1-yl)-1-[(2R)-2-methyloxiran-2-yl]-1-oxopropan-2-yl]-3-hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)-2-[[(2S)-2-[(2-morpholin-4-ylacetyl)amino]propanoyl]amino]propanamide Chemical compound C1(=CCCC1)C[C@@H](C(=O)[C@@]1(OC1)C)NC([C@H]([C@@H](C1=CC=C(C=C1)OC)O)NC([C@H](C)NC(CN1CCOCC1)=O)=O)=O GHYOCDFICYLMRF-UTIIJYGPSA-N 0.000 description 6
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 6
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 6
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940125797 compound 12 Drugs 0.000 description 6
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N protoneodioscin Natural products O(C[C@@H](CC[C@]1(O)[C@H](C)[C@@H]2[C@]3(C)[C@H]([C@H]4[C@@H]([C@]5(C)C(=CC4)C[C@@H](O[C@@H]4[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]6[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O6)[C@H](CO)O4)CC5)CC3)C[C@@H]2O1)C)[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 LVTJOONKWUXEFR-FZRMHRINSA-N 0.000 description 6
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- MZSAMHOCTRNOIZ-UHFFFAOYSA-N 3-[4-(aminomethyl)-6-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl]oxy-N-phenylaniline Chemical compound NCC1=CC(=NC(=C1)C(F)(F)F)OC=1C=C(NC2=CC=CC=C2)C=CC=1 MZSAMHOCTRNOIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100037935 Polyubiquitin-C Human genes 0.000 description 5
- 108010056354 Ubiquitin C Proteins 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 5
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 5
- QFLWZFQWSBQYPS-AWRAUJHKSA-N (3S)-3-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[5-[(3aS,6aR)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-[1-bis(4-chlorophenoxy)phosphorylbutylamino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CCCC(NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](Cc1ccc(O)cc1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CCCCC1SC[C@@H]2NC(=O)N[C@H]12)C(C)C)P(=O)(Oc1ccc(Cl)cc1)Oc1ccc(Cl)cc1 QFLWZFQWSBQYPS-AWRAUJHKSA-N 0.000 description 4
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- RRSNDVCODIMOFX-MPKOGUQCSA-N Fc1c(Cl)cccc1[C@H]1[C@@H](NC2(CCCCC2)[C@@]11C(=O)Nc2cc(Cl)ccc12)C(=O)Nc1ccc(cc1)C(=O)NCCCCCc1cccc2C(=O)N(Cc12)C1CCC(=O)NC1=O Chemical compound Fc1c(Cl)cccc1[C@H]1[C@@H](NC2(CCCCC2)[C@@]11C(=O)Nc2cc(Cl)ccc12)C(=O)Nc1ccc(cc1)C(=O)NCCCCCc1cccc2C(=O)N(Cc12)C1CCC(=O)NC1=O RRSNDVCODIMOFX-MPKOGUQCSA-N 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 4
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 229940125773 compound 10 Drugs 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N jdtic Chemical compound C1([C@]2(C)CCN(C[C@@H]2C)C[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]2NCC3=CC(O)=CC=C3C2)=CC=CC(O)=C1 ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NXLNNXIXOYSCMB-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) carbonochloridate Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(OC(Cl)=O)C=C1 NXLNNXIXOYSCMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KZEVSDGEBAJOTK-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-2-[5-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]ethanone Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)C(CC=1OC(=NN=1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)=O KZEVSDGEBAJOTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro-(4-methoxyphenyl)-phenylmethyl]-4-methoxybenzene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=CC=C1 JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100040685 14-3-3 protein zeta/delta Human genes 0.000 description 3
- CONKBQPVFMXDOV-QHCPKHFHSA-N 6-[(5S)-5-[[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]methyl]-2-oxo-1,3-oxazolidin-3-yl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)C[C@H]1CN(C(O1)=O)C1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 CONKBQPVFMXDOV-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000964898 Homo sapiens 14-3-3 protein zeta/delta Proteins 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 3
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 3
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000001046 green dye Substances 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 3
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- SZUVGFMDDVSKSI-WIFOCOSTSA-N (1s,2s,3s,5r)-1-(carboxymethyl)-3,5-bis[(4-phenoxyphenyl)methyl-propylcarbamoyl]cyclopentane-1,2-dicarboxylic acid Chemical compound O=C([C@@H]1[C@@H]([C@](CC(O)=O)([C@H](C(=O)N(CCC)CC=2C=CC(OC=3C=CC=CC=3)=CC=2)C1)C(O)=O)C(O)=O)N(CCC)CC(C=C1)=CC=C1OC1=CC=CC=C1 SZUVGFMDDVSKSI-WIFOCOSTSA-N 0.000 description 2
- YJLUBHOZZTYQIP-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1=NN=C(O1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 YJLUBHOZZTYQIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxyphosphonamidous acid Chemical compound NP(O)OCCC#N KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 101000988834 Homo sapiens Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102100029098 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N N-[1-oxo-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propan-2-yl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(C(C)NC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 MKYBYDHXWVHEJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 241000271569 Rhea Species 0.000 description 2
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 2
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 150000003973 alkyl amines Chemical class 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000000306 component Substances 0.000 description 2
- 229940126543 compound 14 Drugs 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- CKFGINPQOCXMAZ-UHFFFAOYSA-N methanediol Chemical compound OCO CKFGINPQOCXMAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHCAAFJSYLFLPX-UHFFFAOYSA-N nitrocyclohexatriene Chemical group [O-][N+](=O)C1=CC=C=C[CH]1 ZHCAAFJSYLFLPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- RZJRJXONCZWCBN-UHFFFAOYSA-N octadecane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC RZJRJXONCZWCBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 208000024719 uterine cervix neoplasm Diseases 0.000 description 2
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JQMFQLVAJGZSQS-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]-N-(2-oxo-3H-1,3-benzoxazol-6-yl)acetamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)NC1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 JQMFQLVAJGZSQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxybenzothiazole Chemical compound C1=CC=C2SC(O)=NC2=C1 YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GDSLUYKCPYECNN-UHFFFAOYSA-N 3-[4-(aminomethyl)-6-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl]oxy-N-[(4-fluorophenyl)methyl]benzamide Chemical compound NCC1=CC(=NC(=C1)C(F)(F)F)OC=1C=C(C(=O)NCC2=CC=C(C=C2)F)C=CC=1 GDSLUYKCPYECNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMCQQCBOZIGNRV-UHFFFAOYSA-N 3-[4-(aminomethyl)-6-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl]oxy-N-[2-(1,2,4-triazol-1-yl)ethyl]benzamide Chemical compound NCC1=CC(OC2=CC=CC(=C2)C(=O)NCCN2C=NC=N2)=NC(=C1)C(F)(F)F ZMCQQCBOZIGNRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 1
- DFGKGUXTPFWHIX-UHFFFAOYSA-N 6-[2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]acetyl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)N1CCN(CC1)CC(=O)C1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1 DFGKGUXTPFWHIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 0 C[C@]1C=*(C)*C1 Chemical compound C[C@]1C=*(C)*C1 0.000 description 1
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011394 anticancer treatment Methods 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- RROBIDXNTUAHFW-UHFFFAOYSA-N benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphanium Chemical compound C1=CC=C2N(O[P+](N(C)C)(N(C)C)N(C)C)N=NC2=C1 RROBIDXNTUAHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- PRYZSLKPMFOUNL-MHIBGBBJSA-N bevasiranib Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)O[C@@H]2[C@H](O[C@H](C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2COP(O)(=O)O[C@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]2CO)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)N2C(N=C(N)C=C2)=O)O)N2C(N=C(N)C=C2)=O)O)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)N2C(N=C(N)C=C2)=O)O)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)N2C(N=C(N)C=C2)=O)O)N2C(N=C(N)C=C2)=O)O)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)O)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)O)N2C(N=C(N)C=C2)=O)O)N2C(N=C(N)C=C2)=O)O)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)O)N2C(N=C(N)C=C2)=O)O)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)N2C(N=C(N)C=C2)=O)O)[C@@H](O)C1 PRYZSLKPMFOUNL-MHIBGBBJSA-N 0.000 description 1
- 229950006615 bevasiranib Drugs 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N chelidonic acid Natural products OC(=O)C1=CC(=O)C=C(C(O)=O)O1 PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 1
- 229940125782 compound 2 Drugs 0.000 description 1
- 229940125898 compound 5 Drugs 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 235000019256 formaldehyde Nutrition 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 description 1
- 229940038384 octadecane Drugs 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000008884 pinocytosis Effects 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 229930195734 saturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- RINCXYDBBGOEEQ-UHFFFAOYSA-N succinic anhydride Chemical compound O=C1CCC(=O)O1 RINCXYDBBGOEEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F7/00—Compounds containing elements of Groups 4 or 14 of the Periodic Table
- C07F7/02—Silicon compounds
- C07F7/08—Compounds having one or more C—Si linkages
- C07F7/0834—Compounds having one or more O-Si linkage
- C07F7/0836—Compounds with one or more Si-OH or Si-O-metal linkage
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
- A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
- C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
- C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
- C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
- C08G65/335—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing phosphorus
- C08G65/3356—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing phosphorus having nitrogen in addition to phosphorus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
- C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
- C12N2320/51—Methods for regulating/modulating their activity modulating the chemical stability, e.g. nuclease-resistance
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S977/00—Nanotechnology
- Y10S977/70—Nanostructure
- Y10S977/773—Nanoparticle, i.e. structure having three dimensions of 100 nm or less
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S977/00—Nanotechnology
- Y10S977/902—Specified use of nanostructure
- Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
- Y10S977/906—Drug delivery
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Virology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)
- Polyethers (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой конъюгат для внутриклеточной доставки миРНК, содержащий миРНК, которая посредством ковалентной связи конъюгирована с одной стороны с гидрофильным соединением, например, с ПЭГ, а с другой стороны с гидрофобным соединением, например с холестерином. Такие конъюгаты способны путем самосборки формировать гомогенные наночастицы, мицеллы, в которых гидрофобные соединения пакуются внутри мицеллы, миРНК - между гидрофобными и гидрофильными соединениями, а гидрофильные соединения - снаружи. Настоящее изобретение также раскрывает способы получения указанного конъюгата, фармацевтические композиции, содержащие указанные наночастицы, для генотерапии различных заболеваний в зависимости от конкретной доставляемой миРНК. В том числе раскрыта фармацевтическая композиция для лечения рака, которая содержит наночастицы, содержащие сурвивин-специфическую миРНК. Настоящее изобретение позволяет повышать устойчивость миРНК в живом организме, обеспечивая тем самым эффективную доставку лечебной миРНК в клетки и проявление активности миРНК даже в малой дозе относительно низкой концентрации. 10 н. и 15 з.п. ф-лы, 19 ил., 1 табл., 6 пр.
Description
Область техники, к которой отнсится изобретение
Настоящее изобретение относится к конъюгату, в котором полимерное соединение, улучшающее доставку миРНК, используемой в генной терапии онкологических заболеваний и других инфекционных заболеваний, конъюгировано с миРНК посредством расщепляемой или нерасщепляемой связи, к способу получения указанного конъюгата и к способу доставки миРНК с использованием указанного конъюгата.
Уровень техники
Интерференция РНК означает механизм, который представляет собой посттранскрипционное подавление генов, индуцированное двухцепочечной РНК (дцРНК) специфичным для последовательности нуклеотидов способом в процессе экспрессии генов, и этот механизм впервые был обнаружен у круглого червя и обычно встречается у растений, плодовой мушки дрозофилы и позвоночных животных (Fire и др., Nature, 1998 г., т. 391, с. 806-811; Novina & Sharp, Nature, 2004 г., т. 430, с. 161-164). Как известно, интерференция РНК происходит таким образом, что дцРНК 19-25 п.о. при входе в клетку образует связь с РИКП (РНК-индуцированный комплекс подавления), и лишь антисмысловая (направляющая) цепь связана с мРНК так, что является комплементарной последовательности нуклеотидов мРНК, расщепляя тем самым мишеневую мРНК доменами эндонуклеазы, существующими в РИКП (Rana, T.M., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2007 г., т. 8, с. 23-36; Tomari, Y. & Zamore, P.D., Genes Dev., 2005 г., т. 19, с. 517-529).
Когда дцРНК попадает в клетку, она образует специфическую связь с мишеневой последовательностью мРНК, чтобы разложить мРНК, и поэтому ее рассматривают в качестве нового инструмента, способного регулировать экспрессию генов. Однако в случае человека было трудно получить эффект интерференции РНК вследствие воздействия транспорта интерферона на введение дцРНК в клетки человека. В 2001 г. Elbashir, Tuschl и др. обнаружили, что введение малой дцРНК длиной в 21 нт. (нуклеотид) в клетки человека не привело к транспорту интерферона, но специфически разрушило целевую мРНК (Elbashir, S.M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., Tuschl, T., Nature, 2001 г., т. 411, с. 494-498; Elbashir, S.M., Lendeckel, W., Tuschl, T., Genes & Dev., 2001 г., т. 15, с. 188-200; Elbashir, S.M., Martinez, J., Patkaniowska, A., Lendeckel, W., Tuschl, T., EMBO J., 2001 г., т. 20, с. 6877-6888). Впоследствии дцРНК длиной в 21 нт. приняли как инструмент новой функциональной геномики и назвали термином «малая интерферирующая РНК» (миРНК).
Малая интерферирующая РНК представляет собой вещество, привлекающее большой интерес в качестве средства генной терапии с тех пор, как был показан ее поразительный эффект ингибирования экспрессии определенных генов в клетках животных. Фактически, вследствие ее высокой активности и точной генной селективности, ожидают, что миРНК станет лекарственным средством, альтернативным антисмысловому олигодеоксинуклеотиду (ОДН), который в настоящее время используют в качестве лекарственного средства, в результате двадцатилетних исследований (Dana J. Gary и др., Journal of Controlled Release, 2007 г., т. 121, с. 64-73,). Применение миРНК в методах лечения имеет большие преимущества, которые заключаются в ее легком конструировании по сравнению с другими лекарственными средствами, и высокой селективностью к мишени и свойством ингибирования экспрессии определенного гена. Кроме того, миРНК менее токсична, потому что интерференция РНК подавляет экспрессию генов с использованием механизма, который естественным образом существует в живой системе. Бевасираниб (Bevasiranib), недавно разработанный компанией OPKO Inc. в качестве средства лечения влажной формы возрастной макулодистрофии, представляет собой миРНК, которая селективно воздействует на фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС), включая неоваскуляризацию, для ингибирования экспрессии ФРЭС, и в настоящее время проходит трехфазное клиническое исследование (Dejneka N.S. и др., Mol. Vis., 2008 г., т. 28, № 14, с. 997-1005). Кроме того, недавно были разработаны лекарственные средства, включающие миРНК и нацеленные на различные гены (Ryan P. Million, Nature Reviews Drug Discovery, 2008, т. 7, с. 115-116).
Несмотря на разнообразные результаты, показывающие, что специфическое ингибирование экспрессии индуцируется в живом организме посредством интерференции РНК, в живом организме доставка миРНК требует решения многочисленных проблем, включая разрушение ферментами крови, взаимодействие с компонентами крови и неспецифическую доставку в клетки (Shigeru Kawakami & Mitsuru Hashida, Drug Metab. Pharmacokinet., 2007 г., т. 22, № 3, с. 142-151). Предпринимаются попытки решения этих проблем, в частности, путем использования устойчивых к нуклеазе аналогов нуклеозидов или усовершенствованием способов доставки.
Примеры усовершенствованных способов доставки включают способы доставки генов с использованием вирусов, в том числе аденовирусов, ретровирусов и т.д., и способы доставки генов невирусными носителями с использованием липосом, катионных липидов и катионных полимерных соединений. Однако с вирусными носителями связана проблема безопасности, потому что доставленные гены могут внедриться в хромосомы хозяина и создать аномалии в нормальном функционировании генов хозяина и активации онкогенов, и кроме того, могут вызывать аутоиммунные заболевания вследствие последующей экспрессии вирусных генов в малых количествах или могут не приводить к эффективному защитному иммунитету в том случае, когда модифицированная вирусная инфекция вызвана вирусными носителями. При этом невирусные носители являются менее эффективными, чем вирусные носители, но имеют преимущества низкого уровня побочных эффектов и недорогого производства, принимая во внимание безопасность для живого организма и экономическую осуществимость (Lehrman S., Nature, 1999 г., т. 401, № 6753, с. 517-518). Кроме того, невирусные способы доставки требуют эффективной защиты от ферментативного или неферментативного разложения, для того, чтобы доставлять молекулы РНК, включая миРНК, причем один из способов заключается в использовании экспрессионной плазмиды ДНК, кодирующей короткие образующие шпильки РНК (кшРНК). Преимущество системы с участием ДНК заключается в экспрессии миРНК только при наличии вектора экспрессии. Кроме того, в недавнем исследовании химической модификации миРНК был предложен способ повышения устойчивости к нуклеазам и снижения внутриклеточного поглощения (Shigeru Kawakami & Mitsuru Hashida, Drug Metab. Pharmacokinet., 2007 г., т. 22, № 3, с. 142-151).
В одном из типов химической модификации миРНК фосфордиэфирную связь, которая представляет собой часть, разлагаемую нуклеазой, модифицировали фософоротиоатной связью или части 2' пентозы модифицировали 2'-O-меРНК, 2'-деокси-2'-флуоридином или закрытой нуклеиновой кислотой (ЗНК), образованной связыванием части 2' и части 4', и в результате повысилась устойчивость сыворотки (Braasch D. A. и др., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003 г., т. 14, с. 1139-1143; Chiu Y.L. & Rana T.M., RNA, 2003 г., т. 9, с. 1034-1048; Amarzguioui M. и др., Nucleic Acid Res., 2003 г., т. 31, с. 589-595). При химической модификации другого типа функциональная группа связана с концевой областью 3'-смысловой (с противоположным направлением) цепи, приводя у улучшению фармакокинетических характеристик по сравнению с контролем, и высокая эффективность индуцируется во время использования в живом организме посредством баланса гидрофильности и гидрофобности миРНК (Soutschek J. и др., Nature, 2004 г., т. 432, с. 173-178).
Однако приведенные выше способы все же оставляют желать лучшего в отношении защиты миРНК от нуклеаз и повышения эффективности проницаемости клеточной мембраны.
По этой причине авторы настоящего изобретения обнаружили, что конъюгат, в котором гидрофильное или гидрофобное полимерное соединение конъюгировано с миРНК с использованием расщепляемой или нерасщепляемой связи, повышает устойчивость в живом организме миРНК, и на этом основании было создано настоящее изобретение.
Описание
Техническая задача
Целью настоящего изобретения является конъюгат, в котором гидрофильное или гидрофобное полимерное соединение, которое представляет собой биосовместимое полимерное соединение, конъюгировано к концу смысловой цепи или антисмысловой цепи миРНК с использованием расщепляемой или нерасщепляемой связи, для улучшения эффективности внутриклеточной доставки миРНК.
Другой целью настоящего изобретения является твердая подложка, содержащая полимерное соединение, в частности, полимерное соединение, устойчивость которого доказана при введении в организм человека, например, полиэтиленгликоль (ПЭГ), и способ эффективного получение олигонуклеотида, включающего РНК, ДНК, химеру РНК-ДНК и их аналог, в котором ПЭГ связан с его концом 3' с использованием подложки.
Еще одной целью настоящего изобретения является способ получения конъюгата миРНК и способ доставки миРНК с использованием конъюгата миРНК.
Техническое решение
Для достижения перечисленных выше задач, в первом пункте настоящего изобретения предложен конъюгат миРНК и полимерного соединения, имеющий следующую структуру:
A-X-R-Y-B
(где A и B независимо представляют собой гидрофильное полимерное или гидрофобное полимерное соединение; X и Y независимо представляют собой простую ковалентную связь или ковалентную связь через промежуточный линкер; и R представляет собой миРНК).
Во втором пункте настоящего изобретения предложен конъюгат миРНК и полимерного соединения, имеющий следующую структуру:
A-X-R
(где A представляет собой гидрофобное полимерное соединение; X представляет собой простую ковалентную связь или ковалентную связь через промежуточный линкер; и R представляет собой миРНК).
В третьем пункте настоящего изобретения предложен конъюгат, в котором одинарная цепь миРНК (R) включает от 19 до 31 нуклеотида.
В четвертом пункте настоящего изобретения предложен конъюгат, в котором гидрофобное полимерное соединение (A) имеет молекулярную массу от 250 до 1000.
В пятом пункте настоящего изобретения предложен конъюгат, в котором гидрофобное полимерное соединение (A) представляет собой углеводород C16-C50 или холестерин.
В шестом пункте настоящего изобретения предложен конъюгат, в котором ковалентная связь (X, Y) представляет собой нерасщепляемую связь или расщепляемую связь.
В седьмом пункте настоящего изобретения предложен конъюгат, в котором нерасщепляемая связь представляет собой амидную связь или фосфатную связь.
В восьмом пункте настоящего изобретения предложен конъюгат, в котором расщепляемая связь выбрана из дисульфидной связи, расщепляемой кислотой связи, сложноэфирной связи, ангидридной связи, биорасщепляемой связи и расщепляемой ферментом связи.
В девятом пункте настоящего изобретения предложен конъюгат, в котором гидрофильное полимерное соединение (A или B) представляет собой неионное полимерное соединение, имеющее молекулярную массу от 1000 до 10000.
В десятом пункте настоящего изобретения предложен конъюгат, в котором гидрофильное полимерное соединение выбрано из группы, в которую входят полиэтиленгликоль (ПЭГ), поливинилпирролидон и полиоксазолин.
В одиннадцатом пункте настоящего изобретения предложена связанная с полиэтиленгликолем твердая подложка, имеющая следующую структуру:
(где R представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил, арилалкил, гетероалкил или гетероарил; m представляет собой целое число от 2 до 18; n представляет собой целое число от 5 до 120; и X представляет собой атом водорода, 4-монометокситритил, 4,4'-диметокситритил или 4,4',4"-триметокситритил).
В двенадцатом пункте настоящего изобретения предложена связанная с полиэтиленгликолем твердая подложка, где твердая подложка представляет собой стекло с контролируемым размером пор (СКП).
В тринадцатом пункте настоящего изобретения предложена связанная с полиэтиленгликолем твердая подложка, в которой СКП имеет диаметр от 40 до 180 мкм и размер пор от 500 до 3000 Å.
В четырнадцатом пункте настоящего изобретения предложена связанная с полиэтиленгликолем твердая подложка, в которой связанная с полиэтиленгликолем твердая подложка представляет собой соединение 3'-ПЭГ(полиэтиленгликоль)-СКП, имеющее следующую структурную формулу IV:
[Структурная формула IV]
В пятнадцатом пункте настоящего изобретения предложен способ получения соединения 3'-ПЭГ-СКП, имеющего следующую структурную формулу IV, причем способ предусматривает:
1) реакцию СКП с 3-аминопропилтриэтоксисиланом, в которой образуется соединение длинноцепного алкиламина и стекла с контролируемым размером пор (ДЦАА-СКП);
2) реакцию полиэтиленгликоля с 4,4'-диметокситритилхлоридом, в которой образуется 2-[бис-(4-диметокситритил)полиэтиленгликоль];
3) реакцию соединения, полученного на стадии (2), с соединением, имеющим следующую химическую формулу 1, в которой образуется соединение, имеющее следующую структурную формулу I;
4) реакцию полученного соединения, имеющего следующую структурную формулу I, с 4-нитрофенилхлорформиатом, в которой образуется соединение, имеющее следующую структурную формулу II;
5) реакцию соединения, имеющего следующую структурную формулу I и полученного на стадии (3), с N-сукцинимидилтрифторуксусной кислотой, в которой образуется соединение, имеющее следующую структурную формулу III; и
6) реакцию соединения ДЦАА-СКП, полученного на стадии (1), с соединениями, имеющими следующие структурные формулы I, II и III, соответственно, и полученными на стадиях (3)-(5), соответственно.
[Химическая формула 1]
[Структурная формула I]
[Структурная формула II]
[Структурная формула III]
[Структурная формула IV]
(где R представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил, арилалкил, гетероалкил или гетероарил; и n представляет собой целое число, составляющее не менее чем 5 и не более чем 120).
В шестнадцатом пункте настоящего изобретения предложен способ получения конъюгата миРНК, причем способ предусматривает:
1) получение миРНК против гена-мишени с использованием связанной с полиэтиленгликолем твердой подложки согласно одиннадцатому пункту настоящего изобретения; и
2) соединение концевой группы миРНК и полиэтиленгликоля ковалентной связью.
В семнадцатом пункте настоящего изобретения предложена наночастица, состоящая из конъюгатов миРНК согласно первому или второму пункту настоящего изобретения.
В восемнадцатом пункте настоящего изобретения предложен способ генной терапии, причем способ предусматривает:
1) получение наночастиц согласно семнадцатому пункту настоящего изобретения; и
2) введение наночастиц в организм животного.
В девятнадцатом пункте настоящего изобретения предложен способ генной терапии, в котором наночастицы вводят в организм путем перорального приема или внутривенной инъекции.
В двадцатом пункте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически эффективное количество конъюгатов миРНК согласно первому или второму пунктам настоящего изобретения.
В двадцать первом пункте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически эффективное количество наночастиц согласно семнадцатому пункту настоящего изобретения.
Далее настоящее изобретение будет описано подробно.
Настоящее изобретение относится к конъюгату миРНК и полимерного соединения, имеющему следующую структуру:
A-X-R-Y-B.
В описании заявки A и B независимо представляют собой гидрофильное полимерное или гидрофобное полимерное соединение; X и Y независимо представляют собой простую ковалентную связь или ковалентную связь через промежуточный линкер; и R представляет собой миРНК.
Кроме того, настоящее изобретение относится к конъюгату миРНК и полимерного соединения, имеющему следующую структуру:
A-X-R.
В описании заявки A представляет собой гидрофобное полимерное соединение; X представляет собой простую ковалентную связь или ковалентную связь через промежуточный линкер; и R представляет собой миРНК.
В конъюгате по настоящему изобретению олигонуклеотидная цепь миРНК может содержать от 19 до 31 нуклеотида. Любую миРНК, полученную из генов, которую используют или могут использовать для генной терапии или исследования, можно использовать в качестве миРНК, подходящей для настоящего изобретения.
Гидрофобное полимерное соединение может представлять собой гидрофобное полимерное соединение, имеющее молекулярную массу от 250 до 1000. Примеры гидрофобного полимерного соединения могут включать углеводород, предпочтительно, углеводород C16-C50, и холестерин. В данном документе гидрофобное полимерное соединение не ограничено только углеводородом и холестерином.
Гидрофобное полимерное соединение заставляет функционировать гидрофобное взаимодействие, в котором образуется мицелла, состоящая из конъюгатов миРНК и гидрофобного полимерного соединения. Среди гидрофобных полимерных соединений, в частности, насыщенный углеводород имеет преимущество в том, что он может быть легко конъюгирован к миРНК в процессе производства миРНК, и, таким образом, он является в высокой степени подходящим для получения конъюгатов по настоящему изобретению.
Кроме того, ковалентная связь (т.е. X, Y) может представлять собой одну из нерасщепляемой или расщепляемой связи. В данном случае может существовать амидная связь или фосфатная связь в качестве нерасщепляемой связи, и может существовать дисульфидная связь, расщепляемая кислотой связь, сложноэфирная связь, ангидридная связь, биорасщепляемая связь и расщепляемая ферментом связь в качестве расщепляемой связи. Однако нерасщепляемая или расщепляемая связь не ограничена перечисленными выше примерами.
Линкер, посредством которого образуется связь, ковалентно связывает гидрофильный полимер (или гидрофобный полимер) и конец остатка, полученного из миРНК, и не ограничен определенным образом при том условии, что он может обеспечивать расщепляемую связь в определенной среде по мере необходимости. Следовательно, линкер может включать любое соединение, которое может быть связано с миРНК и/или гидрофильным полимером (или гидрофобным полимером), для их активации в процессе получения конъюгата.
Кроме того, гидрофильное полимерное соединение может представлять собой неионное полимерное соединение, имеющее молекулярную массу от 1000 до 10000. Например, гидрофильное полимерное соединение может включать неионное гидрофильное полимерное соединение, в том числе полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон, полиоксазолин и подобные соединения, но не ограничивается ими.
Функциональная группа гидрофильного полимерного соединения может быть замещена другой функциональной группой по мере необходимости. Среди гидрофильных полимерных соединений, в частности, ПЭГ является весьма подходящим для получения конъюгатов по настоящему изобретению, так как он имеет различные значения молекулярной массы, способен к концевому введению функциональных групп, обладает превосходной биосовместимостью, не вызывает иммунные реакции и повышает растворимость в воде, что улучшает эффективность доставки генов в живом организме.
Кроме того, настоящее изобретение относится к связанной с полиэтиленгликолем твердой подложке, имеющей следующую структуру:
В данном случае твердая подложка включает, например, СКП, полистирол, силикагель, целлюлозную бумагу и т.д., но не обязательно ограничивается этими материалами; R представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил, арилалкил, гетероалкил или гетероарил; m представляет собой целое число от 2 до 18; n представляет собой целое число от 5 до 120 (молярная масса 282-5300); и X представляет собой 4-монометокситритил, 4,4'-диметокситритил или 4,4',4"-триметокситритил и удаляется после обработки кислотой с замещением атомом водорода. В том случае, если твердая подложка представляет собой СКП, она может иметь диаметр от 40 до 180 мкм и размер пор от 500 до 3000 Å.
Кроме того, настоящее изобретение относится к связанной с полиэтиленгликолем твердой подложке, с которой связано соединение 3'-ПЭГ-СКП, имеющее следующую структурную формулу IV:
[Структурная формула IV]
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения 3'-ПЭГ-СКП со следующей структурной формулой IV, имеющей следующую структурную формулу IV, причем способ предусматривает:
1) реакцию СКП с 3-аминопропилтриэтоксисиланом, в которой образуется соединение длинноцепного алкиламина и стекла с контролируемым размером пор (ДЦАА-СКП);
2) реакцию полиэтиленгликоля с 4,4'-диметокситритилхлоридом, в которой образуется 2-[бис-(4-диметокситритил)полиэтиленгликоль];
3) реакцию соединения, полученного на стадии (2), с соединением, имеющим следующую химическую формулу 1, в которой образуется соединение, имеющее следующую структурную формулу I;
4) реакцию полученного соединения, имеющего следующую структурную формулу I, с 4-нитрофенилхлорформиатом, в которой образуется соединение, имеющее следующую структурную формулу II;
5) реакцию соединения, имеющего следующую структурную формулу I и полученного на стадии (3), с N-сукцинимидилтрифторуксусной кислотой, в которой образуется соединение, имеющее следующую структурную формулу III; и
6) реакцию соединения ДЦАА-СКП, полученного на стадии (1), с соединениями, имеющими следующие структурные формулы I, II и III, соответственно, и полученными на стадиях (3)-(5), соответственно.
[Формула 1]
[Структурная формула I]
[Структурная формула II]
[Структурная формула III]
[Структурная формула IV]
(где R представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил, арилалкил, гетероалкил или гетероарил; и n представляет собой целое число, составляющее не менее чем 5 и не более чем 120).
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения конъюгата, включающего миРНК и ПЭГ с использованием связанной с полиэтиленгликолем твердой подложки. Более конкретно, предложен способ получения конъюгата миРНК, который предусматривает:
1) получение миРНК против гена-мишени с использованием связанной с полиэтиленгликолем твердой подложки по одиннадцатому пункту настоящего изобретения; и
2) соединение концевой группы миРНК и полиэтиленгликоля ковалентной связью.
Таким способом можно эффективно получать олигонуклеотиды, включая РНК, ДНК, химеру РНК-ДНК и их аналог.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, миРНК можно получать путем формирования фосфордиэфирных связей, строящих основную структуру РНК, с использованием β-цианоэтилфосфорамидита (Shina и др., Nucleic Acids Research, 1984 г., т. 12, с. 4539-4557). Например, ряд процедур, в число которых входят разблокирование, соединение, окисление и кэппирование, повторно проводили на твердой подложке, к которой был прикреплен нуклеотид, с использованием синтезатора РНК, чтобы получить реагент, содержащий РНК желательной длины. Однако настоящее изобретение не ограничено перечисленным выше.
Кроме того, настоящее изобретение относится к наночастице, состоящей из конъюгатов миРНК.
Конъюгаты миРНК и полимерного соединения по настоящему изобретению могут образовывать структуру из наночастиц посредством взаимодействия между собой, и конъюгат миРНК и полимерного соединения и наночастицы, состоящие из полученных таким образом конъюгатов миРНК и полимерного соединения, улучшают внутриклеточную доставку миРНК, и их можно использовать для лечения модельных заболеваний. Получение конъюгатов, а также характеристики и внутриклеточная эффективная доставка и действие наночастиц, состоящих из конъюгатов, будут подробно описаны в приведенных ниже примерах.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу генной терапии с использованием наночастиц.
Более конкретно, способ генной терапии включает получение наночастиц, каждая из которых состоит из конъюгатов миРНК и полимерного соединения, и введение наночастиц в организм животного.
Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически эффективное количество наночастиц, каждая из которых состоит из конъюгатов миРНК.
Композицию по настоящему изобретению можно получить, включая один или более фармацевтически приемлемых носителей, помимо описанных выше активных компонентов, для приема. Фармацевтически приемлемый носитель должен быть совместимым с активными компонентами по настоящему изобретению. Фармацевтически приемлемый носитель можно использовать путем смешивания с физиологическим раствором, стерилизованной водой, раствором Рингера (Ringer), содержащим буфер физиологическим раствором, раствором декстрозы, раствором мальтодекстрина, глицерином и этанолом, и одним или более данных растворов, а также, по мере необходимости, можно вводить другие обычные добавки, в том числе антиоксиданты, буферные растворы, препятствующие размножению бактерий вещества или подобные вещества. Кроме того, можно дополнительно вводить разбавители, диспергаторы, поверхностно-активные вещества, связующие вещества и смазочные материалы, чтобы получать составы для инъекций, в том числе водные растворы, суспензии, эмульсии или подобные составы. Кроме того, композицию по настоящему изобретению можно предпочтительно составлять в зависимости от определенных заболеваний или компонентов, используя соответствующие способы, известные в технике, или способы, описанные в фармацевтическом справочнике Remington's Pharmaceutical Science (издательство Mack, Истон, штат Пенсильвания).
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению могут определить специалисты в данной области техники на основании синдромов и тяжести заболеваний пациентов. Кроме того, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно составлять в различных формах, включая порошки, таблетки, капсулы, жидкости, средства для инъекций, мази, сиропы и т.п., и можно выпускать в содержащем одну дозу или много доз контейнере, например, в запаянной ампуле, флаконе и т.п.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть предназначена для перорального или парентерального применения. Путь введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению может включать, но не ограничивается этим, пероральное, внутривенное, внутримышечное, интрамедуллярное, внутриоболочечное, внутрисердечное, кожное, подкожное, внутрибрюшинное, энтеральное, подъязычное или местное применение.
Для клинического применения фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно составлять в соответствующих формах, используя известные в технике способы. Дозировка композиции по настоящему изобретению имеет различные пределы в зависимости от веса, возраста, пола, состояния здоровья, диеты, срока и способа приема, скорости выделения и степени заболевания пациента, и ее могут легко определять специалисты в данной области техники.
Полезные эффекты
Наночастица, состоящая из конъюгатов миРНК и полимерного соединения по настоящему изобретению, может повышать устойчивость миРНК в живом организме в целях эффективной доставки лечебной миРНК в клетки и может оказаться очень полезной в основном исследовании в области биотехнологии и медицинской промышленности в качестве нового типа системы доставки миРНК, а также в качестве носителя миРНК для лечения онкологических заболеваний и других инфекционных заболеваний, потому что она способна проявлять активность миРНК в относительно низкой концентрации дозировки даже без трансфекционных реагентов (трансформирующих клетки вирусной ДНК).
Описание чертежей
Фиг. 1 представляет структурную формулу полученного соединения 3'-ПЭГ-СКП;
фиг. 2 представляет данные ЯМР 1H соединения, полученного в примере 1;
фиг. 3 представляет данные ЯМР 1H соединения A, которое представляет собой реагент 3'-ПЭГ для соединения с ДЦАА-СКП в примере 1;
фиг. 4 представляет данные ЯМР 1H соединения B, которое представляет собой реагент 3'-ПЭГ для соединения с ДЦАА-СКП в примере 1;
фиг. 5 представляет данные ЯМР 1H соединения C, которое представляет собой реагент 3'-ПЭГ для соединения с ДЦАА-СКП в примере 1;
фиг. 6 представляет полученные методом масс-спектрометрии МАЛДИВП данные о молекулярной массе после получения соединения 3'-ПЭГ-СКП и олигонуклеотида (миРНК) в примере 1-3;
фиг. 7 представляет полученные методом масс-спектрометрии МАЛДИВП данные о молекулярной массе после получения соединения 3'-ПЭГ-СКП и олигонуклеотида (миРНК) в примере 1-4;
фиг. 8 представляет электрофоретическую фотографию неконъюгированной миРНК, в которой ни одно из полимерных соединений не конъюгировано, и конъюгатов миРНК и полимерного соединения, в которых гидрофильное или гидрофобное полимерное соединение конъюгировано (миРНК означает неконъюгированную миРНК, и соответствующие конъюгаты представляют конъюгаты миРНК и полимерного соединения, представленные в таблице 1; кроме того, 19мер, 23мер, 27мер и 31мер означают миРНК, состоящие из 19, 23, 27 и 31 нуклеотида, соответственно, и их использовали для получения конъюгатов миРНК и полимерного соединения в структуре конъюгата миРНК 4);
фиг. 9 представляет электрофоретическую фотографию, отражающую степени разложения миРНК в зависимости от времени в присутствии сывороточного белка, чтобы оценить устойчивость в крови неконъюгированной миРНК, в которой не конъюгировано ни одно из полимерных соединений, и конъюгатов миРНК и полимерного соединения, в которых конъюгировано гидрофильное полимерное соединение, а именно ПЭГ;
фиг. 10 представляет схематичное изображение наночастицы, образованной конъюгатами миРНК и полимерного соединения;
фиг. 11 представляет распределение по размерам наночастиц, состоящих из неконъюгированных миРНК, в которых не конъюгированы полимерные соединения, согласно результатам, полученным с использованием прибора для измерения ζ-потенциала;
фиг. 12 представляет распределение по размерам наночастиц, каждая из которых состоит из конъюгатов миРНК и полимерного соединения 9, согласно результатам, полученным с использованием прибора для измерения ζ-потенциала;
фиг. 13 представляет распределение по размерам наночастиц, каждая из которых состоит из конъюгатов миРНК и полимерного соединения 10, согласно результатам, полученным с использованием прибора для измерения ζ-потенциала;
фиг. 14 представляет распределение по размерам наночастиц, каждая из которых состоит из конъюгатов миРНК и полимерного соединения 11, согласно результатам, полученным с использованием прибора для измерения ζ-потенциала;
фиг. 15 представляет распределение по размерам наночастиц, каждая из которых состоит из конъюгатов миРНК и полимерного соединения 12, согласно результатам, полученным с использованием прибора для измерения ζ-потенциала;
фиг. 16 представляет распределение по размерам наночастиц, каждая из которых состоит из конъюгатов миРНК и полимерного соединения 13, согласно результатам, полученным с использованием прибора для измерения ζ-потенциала;
фиг. 17 представляет график сравнения степеней экспрессии мРНК гена сурвивина после трансфекции вместе с осуществляющим трансфекцию реагентом, чтобы проанализировать эффекты интерференции РНК для неконъюгированной миРНК и соответствующих конъюгатов миРНК и полимерного соединения, в которых конъюгировано гидрофильное полимерное соединение, а именно ПЭГ;
фиг. 18 представляет график сравнения степеней экспрессии мРНК гена сурвивина после трансфекции вместе с осуществляющим трансфекцию реагентом, чтобы проанализировать эффекты интерференции РНК для неконъюгированной миРНК и соответствующих обладающих длинной последовательностью миРНК, преобразованных в конъюгат миРНК и полимерного соединения 4; и
фиг. 19 представляет график сравнения степеней экспрессии мРНК гена сурвивина после трансфекции при отсутствии осуществляющего трансфекцию реагента, чтобы проанализировать эффекты интерференции РНК для неконъюгированной миРНК и конъюгатов миРНК и полимерного соединения 1-5 и 9-14.
Наилучший вариант осуществления
Далее будут подробно описаны примерные варианты осуществления настоящего изобретения. Однако следующие примерные варианты осуществления описывают настоящее изобретение лишь посредством примера, но не ограничивают его.
Пример 1. Получение твердой подложки для получения олигонуклеотида 3'-ПЭГ
Пример 1-1. Получение реагентов 3'-ПЭГ (соединения A, B и C) для соединения с ДЦАА-СКП
В следующем примере 3'-ПЭГ-СКП получали таким способом, как показывает следующая схема реакции.
Пример 1-1-1. Получение 2-[бис-(4-диметокситритил)полиэтиленгликоля]
Растворяли 30 г (15 ммоль) полиэтиленгликоля 2000 (Alfa Aesar GmbH & Co. KG, Германия) в качестве исходного материала в 270 мл пиридина (Sigma Aldrich, США), затем добавляли 3,55 мл (25,5 ммоль) триэтиламина (Sigma Aldrich, США) и 7,12 г (21 ммоль) 4,4'-диметокситритилхлорида (GL Biochem, Китай) и после этого полученное вещество реагировало при комнатной температуре в течение 20 часов. Реакционную смесь после завершения реакции концентрировали и экстрагировали 450 мл этилацетата и 450 мл воды, затем путем упаривания в вакууме с последующей вакуумной сушки получали 2-[бис-(4-диметокситритил)полиэтиленгликоль] в количестве 23 г (66%).
Данные ЯМР 1H соединения приведены на фиг. 2,
ЯМР 1H (δ, CDCl3): 1,93 (ш, 1, OH), 3,20-3,80 (м, 186, ПЭГ, ДМТ-OCH3), 6,80-6,83 (м, 4, ДМТ), 7,19-7,47 (м, 9, ДМТ).
Пример 1-1-2. Получение соединения янтарной кислоты и 2-[бис-(4-диметокситритил)полиэтиленгликоль] [соединение A]
Растворяли 3,9 г (1,672 ммоль) 2-[бис-(4-диметокситритил)полиэтиленгликоля], полученного в примере 1-1-1, в 20 мл пиридина и затем охлаждали до 0°C. К раствору реагента добавляли 351 мг (3,512 ммоль) ангидрида янтарной кислоты (Acros Organics, США) и 42,5 мг (0,334 ммоль) ДМАП (4-диметиламинопиридин, Sigma Aldrich, США) и перемешивали при 50°C в течение 3 суток, и тогда реакция завершалась. Реакционную смесь после завершения реакции упаривали в вакууме и получали соединение янтарной кислоты и 2-[бис-(4-диметокситритил)полиэтиленгликоля] [соединение A] в виде белого твердого вещества в количестве 3,65 г (90%).
Данные ЯМР 1H соединения приведены на фиг. 3.
ЯМР 1H (δ, CDCl3): 2,65 (м, 2, CH2CO), 3,20-3,88 (м, 186, ПЭГ, ДМТ-OCH3), 4,25 (м, 2, CH2CO), 6,80-6,82 (м, 4, ДМТ), 7,19-7,47 (м, 9, ДМТ).
Пример 1-1-3. Получение соединения пара-нитрофенилянтарной кислоты и 2-[бис-(диметокситритил)полиэтиленгликоля] [соединение B]
Растворяли 1 г (0,411 ммоль) соединения, полученного в примере 1-1-2, в 20 мл метиленхлорида (DaeYeon Chemicals, Co. Ltd., Корея) и охлаждали до 0°C. К раствору реагента добавляли 143 мкл (1,03 ммоль) триэтиламина и 149 мг (0,740 ммоль) 4-нитрофенилхлорформиата. Затем температуру повышали до комнатной температуры и полученное вещество перемешивали в течение 4 часов, после чего реакция закончилась. Реакционную смесь после завершения реакции однократно промывали 20 мл насыщенного водного раствора NaHCO3 и 20 мл 1 М раствора лимонной кислоты (Sigma Aldrich, США), который охлаждали до 0-4°C, и после этого сушили над Na2SO4 (Samchum Chemical Co., Корея). Полученное вещество отфильтровывали, используя колбу для фильтрования, воронку Бюхнера (Buchner) или аспиратор, после чего путем упаривания в вакууме получали соединение пара-нитрофенилянтарной кислоты и 2-[бис-(4-диметокситритил)полиэтиленгликоля] [соединение B] в виде кремового твердого вещества в количестве 1,0 г (94%.
Данные ЯМР 1H соединения приведены на фиг. 4.
ЯМР 1H (δ, CDCl3): 2,80-2,90 (м, 2, CH2CO), 3,20-3,87 (м, 186, ПЭГ, ДМТ-OCH3), 4,25 (м, 2, CH2CO), 6,80-6,82 (м, 4, ДМТ), 7,19-7,47 (м, 9, ДМТ).
Пример 1-1-4. Получение соединения 2,5-диоксопирролидин-1-илэфира янтарной кислоты и 2-[бис-(4-диметокситритил)(полиэтиленгликоля] [соединение C]
Растворяли 500 мг (0,206 ммоль) соединения, полученного в примере 1-1-2, в 10 мл метиленхлорида и затем добавляли 83,14 мкл (1,03 ммоль) пиридина. К раствору реагента добавляли 165 мг (0,781 ммоль) N-сукцинимидилтрифторуксусной кислоты (Sigma Aldrich, США) и перемешивали при комнатной температуре в течение 7 часов, после чего реакция заканчивалась. Реакционную смесь после завершения реакции упаривали в вакууме и получали соединение 2,5-диоксопирролидин-1-илэфир янтарной кислоты и 2-[бис-(4-диметокситритил)полиэтиленгликоля] [соединение C] в виде белого твердого вещества в количестве 490 мг (94%).
Данные ЯМР 1H соединения приведены на фиг. 5.
ЯМР 1H (δ, CDCl3): 2,72-2,97 (м, 6, CH2CO, CH2CH2), 3,20-3,87 (м, 186, ПЭГ, ДМТ-OCH3), 4,27-4,28 (м, 2, CH2CO), 6,80-6,83 (м, 4, ДМТ), 7,20-7,47 (м, 9, ДМТ).
Пример 1-2. Соединение ДЦАА-СКП и реагента 3'-ПЭГ (соединение A)
В следующем примере получали соединение СКП и реагента 3'-ПЭГ, как показывает следующая схема реакции.
Пример 1-2-1. Получение соединения ДЦАА-СКП (2000 Å)
Равномерно перемешивали 10 г СКП (Silicycle Inc., Канада) с диаметром частиц 40-75 мкм и размером нанопор 2000 Å и смачивали 100 мкл толуола, и затем добавляли 2 мл 3-аминопропилтриэтоксисилана (TCI Org. Chem., Япония). После этого полученное вещество при перемешивании реагировало при комнатной температуре в течение 8 часов. После завершения реакции смесь отфильтровывали и промывали метанолом, водой и метиленхлоридом в указанном порядке, затем путем вакуумной сушки получали 10 г соединения ДЦАА-СКП (2000 Å).
Пример 1-2-2. Получение соединения 3'-ПЭГ-СКП (2000 Å) с использованием соединения янтарной кислоты и 2-[бис-(4-диметокситритил)полиэтиленгликоля] [соединение A]
Смачивали 2 г соединения ДЦАА-СКП (2000 Å), полученного в примере 1-2-1, в 20 мл метиленхлорида. Кроме того, раствор ДЦАА-СКП (2000 Å) равномерно перемешивали с раствором, который содержал 80 мг соединения A, 14 мкл ТЭА (триэтиламин, Sigma Aldrich, США). Растворяли 15 мг БОФ (гексафторфосфат бензотриазол-1-илокситрис(диметиламино)фосфония, TCI Org. Chem., Япония) и 5 мг ГОБТ (безводный 1-гидроксибензотриазол, TCI Org. Chem., Япония) в 2 мл метиленхлорида. Полученное вещество реагировало при нагревании с дефлегматором в течение 8 часов, и затем смесь после завершения реакции отфильтровывали и промывали метанолом, водой и метиленгликолем в указанном порядке, затем следовала вакуумная сушка.
Смачивали 1 г полученного вещества 10 мл пиридина и затем добавляли 1 мл 1-метилимидазола (Sigma Aldrich, США) и 1,6 мл уксусного ангидрида (Sigma Aldrich, США). Полученное вещество при равномерном перемешивании реагировало при комнатной температуре в течение 8 часов. Полностью кэппированное СКП после завершения реакции промывали метанолом, водой, метанолом и метиленхлоридом в указанном порядке, затем путем вакуумной сушки получали 1 г соединения 3'-ПЭГ-СКП.
Пример 1-3. Соединение ДЦАА-СКП (2000 Å) и реагента 3'-ПЭГ (соединение B)
Получение соединения 3'-ПЭГ-СКП (2000 Å) осуществляли с использованием соединения B.
В частности, 1 г соединения ДЦАА-СКП (2000 Å), полученного в примере 1-2-1, смачивали в достаточной степени в 8 мл пиридина. Кроме того, раствор, содержащий 205 мг (2 экв.) соединения B и 55 мкл триэтиламина в 2 мл пиридина, равномерно перемешивали с раствором ДЦАА-СКП. Полученное вещество реагировало при 50-60°C в течение 8 часов, и затем смесь отфильтровывали после завершения реакции. Отфильтрованное соединение СКП промывали метанолом, водой и метиленхлоридом в указанном порядке с последующей вакуумной сушкой. После завершения сушки смачивали 1 г соединения СКП в 10 мл пиридина и затем добавляли 500 мкл 1-метилимидазола и 800 мкл уксусного ангидрида. Полученное вещество равномерно перемешивали, и затем оно реагировало при комнатной температуре в течение 8 часов. Смесь после завершения реакции отфильтровывали, и затем соединение СКП промывали метанолом, водой и метиленхлоридом в указанном порядке, и после сушки в вакууме получали 3'-ПЭГ-СКП в количестве 1 г.
Фиг. 6 представляет полученные методом МАЛДИВП масс-спектрометрии данные о распределении молекулярной массы образцов миРНК, полученных с использованием 3'-ПЭГ-СКП в качестве исходного материала, как показано в описанном далее примере 2.
Последовательность получения 3'-ПЭГ-СКП:
смысловая 5'-AAGGAGAUCAACAUUUUCA(dTdT)-ПЭГ (6664,96 Да + 2000 Да) (последовательность № 1)
антисмысловая 5'-UGAAAAUGUUGAUCUCCUU(dTdT)-ПЭГ (6592,84 Да + 2000 Да) (последовательность № 5)
Можно обнаружить, что измеренная методом МАЛДИВП молекулярная масса увеличилась на молекулярную массу ПЭГ (2000 Да).
Пример 1-4. Соединение ДЦАА-СКП (2000 Å) и реагента 3'-ПЭГ (соединение C)
Получение 3'-ПЭГ-СКП (2000 Å) осуществляли с использованием соединения C.
В частности, 1 г соединения ДЦАА-СКП (2000 Å), полученного в примере 1-2-1, смачивали в достаточной степени в 8 мл пиридина. Кроме того, раствор, содержащий 200 мг соединения C и 55 мкл триэтиламина в 2 мл пиридина, равномерно перемешивали с раствором ДЦАА-СКП. Полученное вещество реагировало при 50-60°C в течение 8 часов, и затем смесь после завершения реакции отфильтровывали. Отфильтрованное соединение СКП промывали метанолом, водой и метиленхлоридом в указанном порядке и сушили в вакууме. После завершения сушки 1 г соединения СКП смачивали в 10 мл пиридина, и затем к нему добавляли 500 мкл 1-метилимидазола и 800 мкл уксусного ангидрида. Полученное вещество равномерно перемешивали, и затем оно реагировало при комнатной температуре в течение 8 часов. Полностью кэппированное соединение СКП после завершения реакции промывали метанолом, водой и метиленхлоридом в указанном порядке, и после вакуумной сушки получали 3'-ПЭГ-СКП в количестве 1 г.
Фиг. 7 представляет данные образцов миРНК, полученных с использованием 3'-ПЭГ-СКП в качестве исходного материала, как показано в описанном далее примере 2.
Последовательность получения 3'-ПЭГ-СКП:
смысловая 5'-AAGGAGAUCAACAUUUUCA(dTdT)-ПЭГ (6664,96 Да + 2000 Да) (последовательность № 1)
антисмысловая 5'-UGAAAAUGUUGAUCUCCUU(dTdT)-ПЭГ (6592,84 Да + 2000 Да) (последовательность № 5)
Можно обнаружить, что измеренная методом МАЛДИВП молекулярная масса увеличилась на молекулярную массу ПЭГ (2000 Да).
Пример 2. Получение конъюгатов миРНК и полимерного соединения
В следующих примерах миРНК сурвивина использовали для подавления сурвивина. Сурвивин представляет собой белок, обычно проявляющий экспрессию в большинстве исследованных до настоящего времени неопластических опухолей или трансформированных клеточных линий, и, таким образом, предположено, что он станет важной мишенью в противораковом лечении (Abbrosini G. и др., Nat. Med., 1997 г., т. 3, № 8, с. 917-921). Последовательность миРНК сурвивина по настоящему изобретению, когда она содержит 19 нуклеотидов, состоит из смысловой цепи последовательности № 1 и антисмысловой цепи, имеющей последовательность, которая является комплементарной к смысловой цепи, и, кроме того, когда она содержит 23, 27 или 31 нуклеотида, имеет последовательность оснований, соответствующую последовательности № 2, 3 или 4.
(Последовательность № 1) 5'-AAGGAGAUCAACAUUUUCA-3'
(Последовательность № 2) 5'-AGGAAAGGAGAUCAACAUUUUCA-3'
(Последовательность № 3) 5'-AGGAAAGGAGAUCAACAUUUUCAAAUU-3'
(Последовательность № 4) 5'-AAAGGAGAUCAACAUUUUCAAAUUAGAUGUU-3'
Получение миРНК осуществляли образованием фосфордиэфирных связей, создающих основную структуру РНК, с использованием β-цианоэтилфосфорамидита (Shina и др., Nucleic Acids Research, 1984 г., т. 12, с. 4539-4557). В частности, ряд процедур, в число которых входят разблокирование, соединение, окисление и кэппирование, повторно выполняли на твердой подложке, к которой был прикреплен нуклеотид, с использованием синтезатора РНК (384 Synthesizer, BIONEER, Корея), чтобы получить реагент, содержащий РНК желательной длины.
Кроме того, конъюгат миРНК и полимерного соединения получали присоединением ПЭГ к концевой области 5' или насыщенного углеводорода гексадекана (C16) или октадекана (C18) к концевой области 5' с использованием додеканового линкера, который представляет собой гидрофобное полимерное соединение. Кроме того, вышеупомянутую реакцию осуществляли с использованием полученного в примере 1 3'ПЭГ-СКП в качестве подложки, чтобы получить конъюгат миРНК и полимерного соединения, в котором ПЭГ присоединен к концевой области 3'.
Было определено, что реагирующие вещества соответствовали получаемой последовательности нуклеотидов, отделением РНК от реагирующих веществ с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (жидкостной хроматограф LC-20A Prominence фирмы SHIMADZU, Япония) и измерением молекулярной массы методом МАЛДИВП (масс-спектрометр MALDI TOF-MS, SHIMADZU, Япония). После этого смысловую цепь РНК и антисмысловую цепь РНК смешивали в равных количествах и помещали в гибридизационный буфер 1X (30 мМ ГЭПЭС, 100 мМ ацетата калия, 2 мМ ацетата магния, pH 7,0-7,5). Полученное вещество реагировало на бане при постоянной температуре 90°C в течение 3 минут, и затем оно снова реагировало при 37°C, чтобы получить конъюгат двухцепочечной миРНК и полимерного соединения. Полученные конъюгаты миРНК и полимерного соединения имеют структуры, представленные в таблице 1. Гибридизацию полученных конъюгатов миРНК и полимерного соединения подтверждали с использованием электрофоретических фотографий (фиг. 8).
Таблица 1 | ||
Структуры и типы концевых модификаций конъюгатов миРНК и полимерного соединения | ||
Наименования конъюгатов | Наименования структур конъюгатов | Типы концевых модификаций |
миРНК | Неконъюгированная миРНК | Смысловая: отсутствует |
Антисмысловая: отсутствует | ||
Конъюгат миРНК и полимерного соединения 1 | 5'ПЭГ-смысловая миРНК | Смысловая: 5'ПЭГ |
Антисмысловая: отсутствует | ||
Конъюгат миРНК и полимерного соединения 2 | 5'ПЭГ-антисмысловая миРНК | Смысловая: отсутствует |
Антисмысловая: 5'ПЭГ | ||
Конъюгат миРНК и полимерного соединения 3 | 5'SSПЭГ-антисмысловая миРНК | Смысловая: отсутствует |
Антисмысловая: 5'SSПЭГ | ||
Конъюгат миРНК и полимерного соединения 4 | 5'ПЭГ+ПЭГ миРНК | Смысловая: 5'ПЭГ |
Антисмысловая: 5'ПЭГ | ||
Конъюгат миРНК и полимерного соединения 5 | 5'ПЭГ+SSПЭГ миРНК | Смысловая: 5'ПЭГ |
Антисмысловая: 5'SSПЭГ | ||
Конъюгат миРНК и полимерного соединения 6 | 3'ПЭГ-смысловая миРНК | Смысловая: 3'ПЭГ |
Антисмысловая: отсутствует | ||
Конъюгат миРНК и полимерного соединения 7 | 3'ПЭГ-антисмысловая миРНК | Смысловая: отсутствует |
Антисмысловая: 3'ПЭГ | ||
Конъюгат миРНК и полимерного соединения 8 | 3'ПЭГ+ПЭГ миРНК | Смысловая: 3'ПЭГ |
Антисмысловая: 3'ПЭГ | ||
Конъюгат миРНК и полимерного соединения 9 | 5'C18-смысловая миРНК | Смысловая: 5'C18-C6-SS-C6 |
Антисмысловая: отсутствует | ||
Конъюгат миРНК и полимерного соединения 10 | 5'C18+ПЭГ миРНК | Смысловая: 5'C18-C6-SS-C6 |
Антисмысловая: 5'ПЭГ | ||
Конъюгат миРНК и полимерного соединения 11 | 5'C16+ПЭГ миРНК | Смысловая: 5'C16-C6-SS-C6 |
Антисмысловая: 5'ПЭГ | ||
Конъюгат миРНК и полимерного соединения 12 | 5'C18-антисмысловая миРНК | Смысловая: отсутствует |
Антисмысловая: 5'C18- C6-SS-C6 | ||
Конъюгат миРНК и полимерного соединения 13 | 5'ПЭГ+C18 миРНК | Смысловая: 5'ПЭГ |
Антисмысловая: 5'C18-C6-SS-C6 | ||
Конъюгат миРНК и полимерного соединения 14 | 5'ПЭГ+C16 миРНК | Смысловая: 5'ПЭГ |
Антисмысловая: 5'C16-C6-SS-C6 | ||
* В структурах конъюгатов, ss означает дисульфидную связь, и C16 или C18 означает углеводород C16 или C18. Следовательно, C18-C6-SS-C6 и C16-C6-SS-C6 означают гидрофобные полимерные соединения. |
Пример 3. Оценка устойчивости конъюгатов миРНК и полимерного соединения в условиях живого организма
Было определено, имели ли конъюгаты миРНК и полимерного соединения, полученные и выделенные в примере 2, повышенную устойчивость по сравнению с неконъюгированной миРНК, к которой не присоединено полимерное соединение. Неконъюгированную миРНК без модификации и конъюгаты миРНК и полимерного соединения 1-5, полученные в примере 2, инкубировали в течение 0, 1, 3, 6, 9, 12, 24, 36 или 48 часов в культуральной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), которая имитирует условия живого организма, и затем оценивали степени разложения миРНК с использованием электрофореза.
Результаты показали, что конъюгаты миРНК и полимерного соединения, содержащие внедренный ПЭГ, проявляли устойчивость миРНК до 48 часов (фиг. 9). Устойчивость миРНК проявлялась в течение от 12 часов до 24 часов даже в условиях 100% сыворотки.
Пример 4. Измерение размеров наночастиц конъюгатов миРНК и гидрофобного полимерного соединения
В каждом случае конъюгатов миРНК и полимерного соединения 9-14 наночастица, состоящая из конъюгатов миРНК и полимерного соединения, то есть, скажем, мицелла, образуется посредством гидрофобного взаимодействия между гидрофобными полимерными соединениями, прикрепленными к концам миРНК (фиг. 10). Размеры наночастиц определяли с использованием прибора для измерения ζ-потенциала. Измеряли размеры наночастиц, состоящих из соответствующих конъюгатов миРНК и полимерного соединения 9-13, полученных в примере 2, и миРНК.
В частности, 2 нмоль миРНК и конъюгатов миРНК и полимерного соединения растворяли в 1 мл дистиллированной воды и затем гомогенизировали их наночастицы (200 Вт, 40 кГц, 5 с) с использованием ультразвукового гомогенизатора Wiseclean от фирмы DAIHAN (Корея). Размеры гомогенизированных наночастиц определяли с использованием прибора для измерения ζ-потенциала Nano-ZS от фирмы MALVERN (Великобритания). Здесь показатель преломления и показатель поглощения для материалов устанавливали на уровне 1,454 и 0,001, соответственно, и вводили температуру воды в качестве растворителя на уровне 25°C, а также ее вязкость и показатель преломления. Единовременное измерение состояло из 20 повторных измерений размеров, и это измерение проводили три раза.
Фиг. 11 представляет распределение по размерам наночастиц, содержащих неконъюгированную миРНК, согласно результатам, полученным с использованием прибора для измерения ζ-потенциала. Показано, что размеры от 142 до 295 нм (точка максимума: 164 нм) соответствовали 73,5% полного количества наночастиц, каждая из которых состояла из миРНК.
Фиг. 12 представляет распределение по размерам наночастиц, каждая из которых состояла из конъюгата миРНК и полимерного соединения 9, согласно результатам, полученным с использованием прибора для измерения ζ-потенциала. Показано, что размеры от 4,19 до 7,53 нм (точка максимума: 6,50 нм) соответствовали 59,1% полного количества наночастиц, каждая из которых состояла из конъюгата миРНК и полимерного соединения 9.
Фиг. 13 представляет распределение по размерам наночастиц, каждая из которых состояла из конъюгата миРНК и полимерного соединения 10, согласно результатам, полученным с использованием прибора для измерения ζ-потенциала. Показано, что размеры от 5,61 до 10,1 нм (точка максимума: 8,72 нм) соответствовали 58,9% полного количества наночастиц, каждая из которых состояла из конъюгата миРНК и полимерного соединения 10.
Фиг. 14 представляет распределение по размерам наночастиц, каждая из которых состояла из конъюгата миРНК и полимерного соединения 11, согласно результатам, полученным с использованием прибора для измерения ζ-потенциала. Показано, что размеры от 5,61 до 10,1 нм (точка максимума: 8,72 нм) соответствовали 45,6% полного количества наночастиц, каждая из которых состояла из конъюгата миРНК и полимерного соединения 11.
Фиг. 15 представляет распределение по размерам наночастиц, каждая из которых состояла из конъюгата миРНК и полимерного соединения 12, согласно результатам, полученным с использованием прибора для измерения ζ-потенциала. Показано, что размеры от 4,85 до 5,61 нм соответствовали 23,6%, размеры от 21,0 до 32,7 нм соответствовали 23,5%, и размеры от 68,1 до 78,8 нм соответствовали 23,1% полного количества наночастиц, каждая из которых состояла из конъюгата миРНК и полимерного соединения 12.
Фиг. 16 представляет распределение по размерам наночастиц, каждая из которых состояла из конъюгата миРНК и полимерного соединения 13, согласно результатам, полученным с использованием прибора для измерения ζ-потенциала. Показано, что размеры от 4,85 до 8,72 нм (точка максимума: 5,61 нм) соответствовали 84,6% полного количества наночастиц, каждая из которых состояла из конъюгата миРНК и полимерного соединения 13.
В случаях конъюгатов миРНК и полимерного соединения 9-13, за исключением конъюгата миРНК и полимерного соединения 12, размеры наночастиц составляли, главным образом от 4 до 8 нм. В случае конъюгата миРНК и полимерного соединения 12 определенные размеры наночастиц различались, причиной чего считали агрегацию соответствующих наночастиц с течением времени в процессе измерения, даже несмотря на то, что гомогенизацию осуществляли с использованием ультразвукового гомогенизатора. Как показано на фиг. 12-16, определенные размеры наночастиц, каждая из которых состояла из конъюгатов миРНК, составляли 100 нм или менее, что представляет собой достаточные размеры для эндоцитоза в клетки посредством пиноцитоза (Kenneth A. Dawson и др., Nature Nanotechnology, 2009 г., т. 4, с. 84-85).
Пример 5. Ингибирование экспрессии генов-мишеней в линиях опухолевых клеток с использованием конъюгатов миРНК и полимерного соединения с трансфекционными реагентами
Линии клеток рака шейки матки человека, которые представляют собой линии опухолевых клеток, подвергали, соответственно, трансфекции конъюгатами миРНК и полимерного соединения 1-8, полученными в примере 2, и анализировали уровни экспрессии гена сурвивина в подвергнутых трансфекции линиях опухолевых клеток.
Пример 5-1. Культура линий опухолевых клеток
Клетки опухоли шейки матки человека (HeLa), полученные из американской коллекции типовых культур (АКТП), культивировали в культуральной среде RPMI 1640 (GIBCO, Invitrogen, США), в которую добавляли 10 об.% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°C в атмосфере, содержащей 5 об.% CO2.
Пример 5-2. Ингибирование экспрессии гена-мишени с использованием конъюгатов миРНК и полимерного соединения
Линии опухолевых клеток HeLa подвергали трансфекции конъюгатами миРНК и полимерного соединения 1-8 последовательности № 1, полученными в примере 2, и анализировали уровни экспрессии гена сурвивина в подвергнутых трансфекции линиях опухолевых клеток.
Пример 5-2-1. Трансфекция линий опухолевых клеток с использованием конъюгатов миРНК и полимерного соединения
Культивировали 1,3•105 линий опухолевых клеток, культивированных в примере 5-1, в среде RPMI 1640 на 6-луночном планшете при 37°C в течение 18 часов в атмосфере, содержащей 5 об.% CO2, затем удаляли среду и в каждую лунку добавляли по 800 мкл среды Opti-MEM (GIBCO, США).
Одновременно смешивали 2 мкл липофектамина (Lipofectamine™ 2000 от фирмы Invitrogen, США) и 198 мкл среды Opti-MEM, которые затем реагировали между собой при комнатной температуре в течение 5 минут, после чего добавляли 0,8 или 4 мкл соответствующих конъюгатов миРНК и полимерного соединения (25 пмоль/мкл), полученных в примере 2 (конечная обработка при 20 или 100 нМ). После этого полученное вещество снова реагировало при комнатной температуре в течение 20 минут для приготовления раствора.
После этого по 200 мкл раствора для трансфекции поместили в каждую из лунок, в которые была помещена среда Opti-MEM, и опухолевые клетки культивировали в течение 6 часов с последующим удалением среды Opti-MEM. В лунки помещали по 2,5 мкл культуральной среды RPMI 1640, и затем опухолевые клетки культивировали при 37°C в атмосфере, содержащей 5 об.% CO2, в течение 24 часов.
Пример 5-2-2. Относительный количественный анализ мРНК гена сурвивина
Все количество РНК экстрагировали из линии клеток, подвергнутых трансфекции в примере 5-2-1, чтобы получить кДНК, и затем относительное количество мРНК гена сурвивина определяли с использованием ПЦР в реальном времени.
Пример 5-2-2-1. Отделение РНК и получение кДНК из подвергнутых трансфекции клеток
Все количество РНК экстрагировали из линии клеток, подвергнутых трансфекции в примере 5-2-1, с использованием набора для экстракции РНК (набор для полной экстракции РНК AccuPrep Cell фирмы BIONEER, Корея), и кДНК получали из экстрагированной РНК с использованием обратной транскриптазы РНК (AccuPower CycleScript RT Premix/dT20 от фирмы BIONEER, Корея) следующим образом.
В частности, по 1 мкг экстрагированной РНК помещали в каждую из пробирок Эппендорфа (Eppendorf) объемом 0,25 мл, содержащих обратную транскриптазу AccuPower CycleScript RT Premix/dT20 от фирмы BIONEER (Корея), и дистиллированную воду, обработанную диэтилпирокарбонатом (ДЭПК), добавляли, чтобы довести полный объем до 20 мкл. С использованием прибора ПЦР с блоком термического градиента MyGenie™ 96 Gradient Thermal Block от фирмы BIONEER (Корея) две стадии гибридизации затравки РНК при 30°C в течение 1 минуты и синтеза кДНК при 52°C в течение 4 минут повторяли шесть раз. Затем инактивацию фермента осуществляли при 95°C в течение 5 минут, чтобы завершить реакцию амплификации.
Пример 5-2-2-2. Относительный количественный анализ мРНК гена сурвивина
Относительное количество мРНК гена сурвивина определяли методом ПЦР в реальном времени с использованием кДНК, полученной в примере 5-2-2-1, в качестве матрицы следующим образом.
В частности, кДНК, полученную в примере 5-2-2-1, разбавляли в отношении 1/5 дистиллированной водой в каждой лунке 96-луночного планшета и затем добавляли по 3 мкл разбавленной кДНК, 10 мкл основного раствора для ПЦР 2xGreenStar™ PCR от фирмы BIONEER (Корея), 6 мкл дистиллированной воды и 1 мкл затравки кПЦР сурвивина (10 пмоль/мкл) от фирмы BIONEER (Корея), получая жидкую смесь, чтобы проанализировать уровень экспрессии сурвивина. С другой стороны, при использовании ГМБС (гидроксиметилбилансинтаза), ГФРТ1 (гипоксантинфосфорибозилтрансфераза 1), UBC (убиквитин C) и YWHAZ (ζ-полипептид белка активации тирозин-3-монооксигеназы/триптофан-5-монооксигеназы), которые представляют собой «гены домашнего хозяйства» (далее сокращенно называются «гены ДХ»), в качестве эталонного гена, чтобы нормировать уровень экспрессии мРНК, полученную в примере 5-2-2-1 кДНК разбавляли в отношении 1/5 и затем вводили по 3 мкл разбавленной кДНК, 10 мкл основного раствора для ПЦР 2xGreenStar™ PCR от фирмы BIONEER (Корея), 6 мкл дистиллированной воды и 1 мкл затравки кПЦР каждого гена ДХ (10 пмоль/мкл, BIONEER, Корея), чтобы приготовить жидкую смесь для анализа методом ПЦР в реальном времени каждого гена ДХ в каждой лунке 96-луночного планшета. Следующую реакцию осуществляли на 96-луночном планшете, содержащем жидкую смесь, с использованием прибора Exicycler™ 96 с термическим блоком для количественного анализа в реальном времени от фирмы BIONEER (Корея).
Активацию фермента и вторичную структуру кДНК устраняли в процессе реакции при 95°C в течение 15 минут. После этого четыре стадии, включая денатурирование при 94°C в течение 30 секунд, гибридизацию при 58°C в течение 30 секунд, растяжение при 72°C в течение 30 секунд и сканирование с красителем SYBR Green, повторно осуществляли 42 раза и затем осуществляли окончательное растяжение при 72°C в течение 3 минут. После этого температуру поддерживали на уровне 55°C в течение 1 минуты и анализировали кривую плавления в интервале 55-95°C.
После окончания ПЦР полученные значения порогового цикла Ct сурвивина соответственно исправляли с использованием значений мРНК (нормировочный множитель NF), нормированных по генам ДХ, и затем получали значения ΔCt разности между значением Ct контрольной группы, обработанной только одним реагентом для трансфекции, и исправленными значениями Ct. Скорости экспрессии мРНК сурвивина сравнивали друг с другом, используя значения ΔCt и расчетное уравнение 2(-ΔCt)•100 (фиг. 17). На фиг. 17 имитация означает контрольную группу, обработанную только реагентом для трансфекции.
В результате, как показано на фиг. 17, эффект интерференции РНК миРНК изменялся в зависимости от типов концевых модификаций конъюгатов миРНК и полимерного соединения, в которых было конъюгировано гидрофильное полимерное соединение, а именно ПЭГ. В частности, каждый из конъюгатов 6-8, имеющий тип концевой модификации, в котором ПЭГ конъюгирован к конечной области 3', проявлял степени ингибирования экспрессии, аналогичные тем, которые проявляет неконъюгированная миРНК. Следовательно, ожидается, что конъюгаты 6-8 будут создавать небольшое стерическое препятствие при образовании комплекса с РНК-индуцированным комплексом подавления (РИКП) в механизме интерференции РНК с участием миРНК. Кроме того, большинство конъюгатов миРНК-ПЭГ проявляли более высокую степень ингибирования экспрессии гена-мишени мРНК в условиях обработки при низкой концентрации (20 нМ), чем в условиях обработки при высокой концентрации (100 нМ), и, таким образом, ожидается, что будет предотвращено связывание миРНК с РИКП благодаря ПЭГ в условиях повышенной концентрации конъюгата миРНК-ПЭГ.
Пример 5-3. Ингибирование экспрессии гена-мишени с использованием конъюгатов имеющей длинную последовательность миРНК и полимерного соединения
Когда клетки подвергали трансфекции конъюгатами миРНК и гидрофильного полимерного соединения вместе с реагентом для трансфекции, анализировали ингибирование экспрессии гена-мишени мРНК. Здесь использовали миРНК, в которых концевую модификацию в структуре конъюгата миРНК и полимерного соединения 4 индуцировали для каждой последовательности оснований миРНК (последовательности №№ 1-4).
Пример 5-3-1. Трансфекция линий опухолевых клеток с использованием конъюгатов миРНК и полимерного соединения
Культивировали 1,3•105 линий опухолевых клеток, культивированных в примере 5-1, в среде RPMI 1640 на 6-луночном планшете при 37°C в течение 24 часов в атмосфере, содержащей 5 об.% CO2, затем удаляли среду и в каждую лунку добавляли по 800 мкл среды Opti-MEM.
Одновременно смешивали 2 мкл липофектамина (Lipofectamine™ 2000) и 198 мкл среды Opti-MEM, которые затем реагировали между собой при комнатной температуре в течение 5 минут, после чего добавляли 0,8 или 4 мкл соответствующих конъюгатов миРНК и полимерного соединения (25 пмоль/мкл), полученных в примере 2 (конечная обработка при 20 или 100 нМ). После этого полученное вещество снова реагировало при комнатной температуре в течение 20 минут для приготовления раствора.
После этого по 200 мкл раствора для трансфекции поместили в каждую из лунок, в которые была помещена среда Opti-MEM, и опухолевые клетки культивировали в течение 6 часов с последующим удалением среды Opti-MEM. В лунки помещали по 2,5 мкл культуральной среды RPMI 1640, и затем опухолевые клетки культивировали при 37°C в атмосфере, содержащей 5 об.% CO2, в течение 24 часов.
Пример 5-3-2. Относительный количественный анализ мРНК гена сурвивина
Все количество РНК экстрагировали из линии клеток, подвергнутых трансфекции в примере 5-3-1, чтобы получить кДНК, и затем относительное количество мРНК гена сурвивина определяли с использованием ПЦР в реальном времени.
Пример 5-3-2-1. Отделение РНК и получение кДНК из подвергнутых трансфекции клеток
Все количество РНК экстрагировали из линии клеток, подвергнутых трансфекции в примере 5-3-1, с использованием набора для экстракции РНК (набор для полной экстракции РНК AccuPrep Cell фирмы BIONEER, Корея), и кДНК получали из экстрагированной РНК с использованием обратной транскриптазы РНК (AccuPower CycleScript RT Premix/dT20 от фирмы BIONEER, Корея) следующим образом.
В частности, по 1 мкг экстрагированной РНК помещали в каждую из пробирок Эппендорфа (Eppendorf) объемом 0,25 мл, содержащих обратную транскриптазу AccuPower CycleScript RT Premix/dT20 от фирмы BIONEER (Корея), и дистиллированную воду, обработанную диэтилпирокарбонатом (ДЭПК) добавляли, чтобы довести полный объем до 20 мкл. С использованием прибора ПЦР с блоком термического градиента MyGenie™ 96 Gradient Thermal Block от фирмы BIONEER (Корея) две стадии гибридизации затравки РНК при 30°C в течение 1 минуты и синтеза кДНК при 52°C в течение 4 минут повторяли шесть раз. Затем инактивацию фермента осуществляли при 95°C в течение 5 минут, чтобы завершить реакцию амплификации.
Пример 5-3-2-2. Относительный количественный анализ мРНК гена сурвивина
Относительное количество мРНК гена сурвивина определяли методом ПЦР в реальном времени с использованием кДНК, полученной в примере 5-2-2-1, в качестве матрицы следующим образом.
В частности, кДНК, полученную в примере 5-3-2-1, разбавляли в отношении 1/5 дистиллированной водой в каждой лунке 96-луночного планшета, и затем добавляли по 3 мкл разбавленной кДНК, 10 мкл основного раствора для ПЦР 2xGreenStar™ PCR от фирмы BIONEER (Корея), 6 мкл дистиллированной воды и 1 мкл затравки кПЦР сурвивина (10 пмоль/мкл) от фирмы BIONEER (Корея), получая жидкую смесь, чтобы проанализировать уровень экспрессии сурвивина. С другой стороны, при использовании ГМБС, ГФРТ1, UBC и YWHAZ, которые представляют собой гены ДХ, в качестве эталонного гена, чтобы нормировать уровень экспрессии мРНК, полученную в примере 5-3-2-1 кДНК разбавляли в отношении 1/5 и затем вводили по 3 мкл разбавленной кДНК, 10 мкл основного раствора для ПЦР 2xGreenStar™ PCR от фирмы BIONEER (Корея), 6 мкл дистиллированной воды и 1 мкл затравки кПЦР каждого гена ДХ (10 пмоль/мкл, BIONEER, Корея), чтобы приготовить жидкую смесь для анализа методом ПЦР в реальном времени каждого гена ДХ в каждой лунке 96-луночного планшета. Следующую реакцию осуществляли на 96-луночном планшете, содержащем жидкую смесь, с использованием прибора Exicycler™ 96 с термическим блоком для количественного анализа в реальном времени от фирмы BIONEER (Корея).
Активацию фермента и вторичную структуру кДНК устраняли в процессе реакции при 95°C в течение 15 минут. После этого четыре стадии, включая денатурирование при 94°C в течение 30 секунд, гибридизацию при 58°C в течение 30 секунд, растяжение при 72°C в течение 30 секунд и сканирование с красителем SYBR Green, повторно осуществляли 42 раза и затем осуществляли окончательное растяжение при 72°C в течение 3 минут. После этого температуру поддерживали на уровне 55°C в течение 1 минуты и анализировали кривую плавления в интервале 55-95°C.
После окончания ПЦР полученные значения порогового цикла Ct сурвивина соответственно исправляли с использованием значений мРНК (нормировочный множитель NF), нормированных по генам ДХ, и затем получали значения ΔCt разности между значением Ct контрольной группы, обработанной только одним реагентом для трансфекции, и исправленными значениями Ct. Скорости экспрессии мРНК сурвивина сравнивали друг с другом, используя значения ΔCt и расчетное уравнение 2(-ΔCt)•100 (фиг. 18). На фиг. 18 имитация означает контрольную группу, обработанную только реагентом для трансфекции, и 19мер, 23мер, 27мер, и 31мер представляют последовательности №№ 1-4, соответственно. 5'P+P представляет структуру конъюгата миРНК и полимерного соединения 4. Клетки обрабатывали при концентрации 20 нМ и 100 нМ, соответственно, и степени ингибирования экспрессии генов-мишеней сравнивали друг с другом.
В результате, как показано на фиг. 18, длинноцепные неконъюгированные миРНК, преобразованные в форму конъюгатов миРНК и полимерного соединения 4, проявляли меньшую разность степеней ингибирования экспрессии мРНК генов-мишеней по сравнению с неконъюгированной миРНК. Следовательно, можно обнаружить, что трансформированная длинноцепная миРНК уменьшает явление стерического затруднения, обусловленное ПЭГ, по сравнению с короткоцепной миРНК.
В частности, в случае длинноцепной миРНК, миРНК расщепляется в структуру 19+2 под действием расщепляющего фермента (дайсера) в механизме действия интерференции РНК, и расщепленная миРНК присоединяется к комплексу РИКП, приводя в действие механизма интерференции РНК. По этой причине длинноцепная миРНК, в которой ПЭГ прикреплен к обеим концевым областям, приводит к существованию большого количества миРНК без прикрепления ПЭГ и, таким образом, имеет относительно высокую степень взаимодействия с комплексом РИКП по сравнению с последовательностью № 1, которую считают поддерживающей эффект индуцирования интерференции РНК.
Пример 6. Ингибирование экспрессии гена-мишени в линиях опухолевых клеток с использованием только конъюгатов миРНК и полимерного соединения без реагентов для трансфекции
Линии опухолевых клеток HeLa подвергали трансфекции конъюгатами миРНК и полимерного соединения 1-14, полученными в примере 2, и анализировали экспрессию гена сурвивин подвергнутых трансфекции линий опухолевых клеток.
Пример 6-1. Культура линий опухолевых клеток
Клетки опухоли шейки матки человека (HeLa), полученные из американской коллекции типовых культур (АКТП), культивировали в культуральной среде RPMI 1640 (GIBCO/Invitrogen, США), в которую добавляли 10 об.% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°C в атмосфере, содержащей 5 об.% CO2.
Пример 6-2. Трансфекция линий опухолевых клеток с использованием конъюгатов миРНК и полимерного соединения
Культивировали 1,3•105 линий опухолевых клеток, культивированных в примере 6-1, в среде RPMI 1640 на 6-луночном планшете при 37°C в течение 24 часов в атмосфере, содержащей 5 об.% CO2, затем удаляли среду и в каждую лунку добавляли по 900 мкл среды Opti-MEM.
Одновременно смешивали 100 мкл среды Opti-MEM, 5 или 10 мкл соответствующих конъюгатов миРНК и полимерного соединения 1-5 (1 пмоль/мкл), полученных в примере 2 (конечная обработка при 500 нМ или 100 мкМ), и полученное вещество снова реагировало при комнатной температуре в течение 20 минут для приготовления раствора.
Одновременно 100 мкл среды Opti-MEM, 5 или 10 мкл соответствующих конъюгатов миРНК и полимерного соединения 9-14 (1 пмоль/мкл), полученных в примере 2 (конечная обработка при 500 нМ или 100 мкМ) и мицеллы, состоящие из конъюгатов миРНК и гидрофобного полимерного соединения, гомогенизировали под действием ультразвука для приготовления раствора.
После этого по 100 мкл раствора для трансфекции помещали в каждую из лунок, в которых находилась среда Opti-MEM, и опухолевые клетки культивировали в течение 24 часов с последующим добавлением 1 мл среды RPMI 1640, содержащей 20% ЭТС. Клетки далее культивировали при 37°C в течение 24 часов в атмосфере, содержащей 5 об.% CO2, обрабатывали конъюгатами миРНК и полимерного соединения и затем культивировали всего 48 часов.
Пример 6-3. Относительный количественный анализ мРНК гена сурвивина
Все количество РНК экстрагировали из линии клеток, подвергнутых трансфекции в примере 6-2, чтобы получить кДНК, и затем относительное количество мРНК гена сурвивина определяли с использованием ПЦР в реальном времени.
Пример 6-3-1. Отделение РНК и получение кДНК из подвергнутых трансфекции клеток
Все количество РНК экстрагировали из линии клеток, подвергнутых трансфекции в примере 6-2, с использованием набора для экстракции РНК (набор для полной экстракции РНК AccuPrep Cell фирмы BIONEER, Корея), и кДНК получали из экстрагированной РНК с использованием обратной транскриптазы РНК (AccuPower CycleScript RT Premix/dT20 от фирмы BIONEER, Корея) следующим образом.
В частности, по 1 мкг экстрагированной РНК помещали в каждую из пробирок Эппендорфа (Eppendorf) объемом 0,25 мл, содержащих обратную транскриптазу AccuPower CycleScript RT Premix/dT20 от фирмы BIONEER (Корея), и дистиллированную воду, обработанную диэтилпирокарбонатом (ДЭПК), добавляли, чтобы довести полный объем до 20 мкл. С использованием прибора ПЦР с блоком термического градиента MyGenie™ 96 Gradient Thermal Block от фирмы BIONEER (Корея) две стадии гибридизации затравки РНК при 30°C в течение 1 минуты и синтеза кДНК при 52°C в течение 4 минут повторяли шесть раз. Затем инактивацию фермента осуществляли при 95°C в течение 5 минут, чтобы завершить реакцию амплификации.
Пример 6-3-2. Относительный количественный анализ мРНК гена сурвивина
Относительное количество мРНК гена сурвивина определяли методом ПЦР в реальном времени с использованием кДНК, полученной в примере 6-3-1, в качестве матрицы следующим образом.
В частности, кДНК, полученную в примере 6-3-1, разбавляли в отношении 1/5 дистиллированной водой в каждой лунке 96-луночного планшета и затем добавляли по 3 мкл разбавленной кДНК, 10 мкл основного раствора для ПЦР 2xGreenStar™ PCR от фирмы BIONEER (Корея), 6 мкл дистиллированной воды и 1 мкл затравки кПЦР сурвивина (10 пмоль/мкл) от фирмы BIONEER (Корея), получая жидкую смесь, чтобы проанализировать уровень экспрессии сурвивина. С другой стороны, при использовании ГМБС (гидроксиметилбилансинтаза), ГФРТ1 (гипоксантинфосфорибозилтрансфераза 1), UBC (убиквитин C) и YWHAZ (ζ-полипептид белка активации тирозин-3-монооксигеназы/триптофан-5-монооксигеназы), которые представляют собой «гены домашнего хозяйства» (далее сокращенно называются «гены ДХ»), в качестве эталонного гена, чтобы нормировать уровень экспрессии мРНК, полученную в примере 5-2-2-1 кДНК разбавляли в отношении 1/5 и затем вводили по 3 мкл разбавленной кДНК, 10 мкл основного раствора для ПЦР 2xGreenStar™ PCR от фирмы BIONEER (Корея), 6 мкл дистиллированной воды и 1 мкл затравки кПЦР каждого гена ДХ (10 пмоль/мкл, BIONEER, Корея), чтобы приготовить жидкую смесь для анализа методом ПЦР в реальном времени каждого гена ДХ в каждой лунке 96-луночного планшета. Следующую реакцию осуществляли на 96-луночном планшете, содержащем жидкую смесь, с использованием прибора Exicycler™ 96 с термическим блоком для количественного анализа в реальном времени от фирмы BIONEER (Корея).
Активацию фермента и вторичную структуру кДНК устраняли в процессе реакции при 95°C в течение 15 минут. После этого четыре стадии, включая денатурирование при 94°C в течение 30 секунд, гибридизацию при 58°C в течение 30 секунд, растяжение при 72°C в течение 30 секунд и сканирование с красителем SYBR Green, повторно осуществляли 42 раза и затем осуществляли окончательное растяжение при 72°C в течение 3 минут. После этого температуру поддерживали на уровне 55°C в течение 1 минуты и анализировали кривую плавления в интервале 55-95°C. После окончания ПЦР полученные значения порогового цикла Ct сурвивина соответственно исправляли с использованием значений мРНК (нормировочный множитель NF), нормированных по генам ДХ, и затем получали значения ΔCt разности между значением Ct контрольной группы, обработанной только одним реагентом для трансфекции, и исправленными значениями Ct. Скорости экспрессии мРНК сурвивина сравнивали друг с другом, используя значения ΔCt и расчетное уравнение 2(-ΔCt)•100 (фиг. 19).
В результате, как показано на фиг. 17, конъюгаты миРНК-ПЭГ 2-5 в более высокой степени ингибируют уровень экспрессии мРНК сурвивина по сравнению с конъюгатом миРНК и полимерного соединения 1, в отличие от результата в том случае, где трансфекцию осуществляли посредством реагента для трансфекции. Конъюгаты миРНК и полимерного соединения 1-5 проявляли в более высокой степени эффект интерференции РНК в низкой концентрации (500 нМ), чем в высокой концентрации. Кроме того, конъюгаты миРНК и гидрофобного полимерного соединения 9-14 проявляли меньшую степень ингибирования уровня экспрессии мРНК гена сурвивина по сравнению с конъюгатами миРНК 1-5 в случае обработки при такой же концентрации (500 нМ). Однако в случае обработки в условиях высокой концентрации (1 нМ), в частности, концевая модификация конъюгата миРНК и полимерного соединения 14 приводит к высокой степени эффекта ингибирования уровня экспрессии мРНК сурвивина.
Список последовательностей
См. список последовательностей
Claims (25)
1. Конъюгат для внутриклеточной доставки миРНК, содержащий миРНК-полимерное соединение следующей структуры:
A-X-R-Y-B,
(где один из A и B представляет собой гидрофильное полимерное соединение, а другой представляет собой гидрофобное соединение; X и Y независимо представляют собой простую ковалентную связь или ковалентную связь через промежуточный линкер; и R представляет собой миРНК),
где гидрофобное соединение представлено углеводородом C16-C50 или холестерином, имеющим молекулярную массу от 250 до 1000.
A-X-R-Y-B,
(где один из A и B представляет собой гидрофильное полимерное соединение, а другой представляет собой гидрофобное соединение; X и Y независимо представляют собой простую ковалентную связь или ковалентную связь через промежуточный линкер; и R представляет собой миРНК),
где гидрофобное соединение представлено углеводородом C16-C50 или холестерином, имеющим молекулярную массу от 250 до 1000.
2. Конъюгат по п. 1, где гидрофильное полимерное соединение и гидрофобное соединение конъюгированы к одной и той же цепи миРНК.
3. Конъюгат по п. 1, где гидрофильное полимерное соединение и гидрофобное соединение конъюгированы к обеим цепям миРНК.
4. Конъюгат по п. 1, в котором одинарная цепь миРНК (R) включает от 19 до 31 нуклеотида.
5. Конъюгат по п. 1, в котором ковалентная связь (X, Y) представляет собой нерасщепляемую связь или расщепляемую связь.
6. Конъюгат по п. 5, в котором нерасщепляемая связь представляет собой амидную связь или фосфатную связь.
7. Конъюгат по п. 5, в котором расщепляемая связь выбрана из дисульфидной связи, расщепляемой кислотой связи, сложноэфирной связи, ангидридной связи, биорасщепляемой связи и расщепляемой ферментом связи.
8. Конъюгат по п. 1, в котором гидрофильное полимерное соединение представляет собой неионное полимерное соединение, имеющее молекулярную массу от 1000 до 10000.
9. Конъюгат по п. 8, в котором гидрофильное полимерное соединение выбрано из группы, состоящей из полиэтиленгликоля (ПЭГ), поливинилпирролидона и полиоксазолина.
10. Способ получения конъюгата по п. 1,
где конъюгат по п. 1 это тот, в котором гидрофильное полимерное соединение представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ),
который предусматривает:
1) получение конъюгата одноцепочечная миРНК-PEG с использованием связанной с полиэтиленгликолем твердой подложки следующей структуры:
где R представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил, арилалкил, гетероалкил или гетероарил; m представляет собой целое число от 2 до 18; n представляет собой целое число от 5 до 120; и X представляет собой атом водорода, 4-монометокситритил, 4,4′-диметокситритил или 4,4′,4″-триметокситритил;
2) соединение гидрофобного соединения с PEG-конъюгированной цепью на дистальном конце с помощью ковалентной связи, где гидрофобное соединение представлено углеводородом C16-C50 или холестерином, имеющим молекулярную массу от 250 до 1000; и
3) отжиг цепи, где PEG и гидрофобное соединение конъюгировано на обоих концах, со своей комплементарной цепью.
где конъюгат по п. 1 это тот, в котором гидрофильное полимерное соединение представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ),
который предусматривает:
1) получение конъюгата одноцепочечная миРНК-PEG с использованием связанной с полиэтиленгликолем твердой подложки следующей структуры:
где R представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил, арилалкил, гетероалкил или гетероарил; m представляет собой целое число от 2 до 18; n представляет собой целое число от 5 до 120; и X представляет собой атом водорода, 4-монометокситритил, 4,4′-диметокситритил или 4,4′,4″-триметокситритил;
2) соединение гидрофобного соединения с PEG-конъюгированной цепью на дистальном конце с помощью ковалентной связи, где гидрофобное соединение представлено углеводородом C16-C50 или холестерином, имеющим молекулярную массу от 250 до 1000; и
3) отжиг цепи, где PEG и гидрофобное соединение конъюгировано на обоих концах, со своей комплементарной цепью.
11. Способ получения конъюгата по п. 1,
где конъюгат по п. 1 это тот, в котором гидрофильное полимерное соединение представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ), который предусматривает:
1) присоединение концевой группы одной цепи миРНК к PEG или гидрофобному соединению с помощью ковалентной связи, где гидрофобное соединение представлено углеводородом C16-C50 или холестерином, имеющим молекулярную массу от 250 до 1000;
2) присоединение другой концевой группы другой цепи миРНК к PEG (если гидрофобное соединение присоединено на стадии (1)) или к гидрофобному соединению (если PEG присоединено на стадии (1)) с помощью ковалентной связи;
3) отжиг цепи стадии (1) с другой цепью стадии (2).
где конъюгат по п. 1 это тот, в котором гидрофильное полимерное соединение представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ), который предусматривает:
1) присоединение концевой группы одной цепи миРНК к PEG или гидрофобному соединению с помощью ковалентной связи, где гидрофобное соединение представлено углеводородом C16-C50 или холестерином, имеющим молекулярную массу от 250 до 1000;
2) присоединение другой концевой группы другой цепи миРНК к PEG (если гидрофобное соединение присоединено на стадии (1)) или к гидрофобному соединению (если PEG присоединено на стадии (1)) с помощью ковалентной связи;
3) отжиг цепи стадии (1) с другой цепью стадии (2).
12. Наночастица для внутриклеточной доставки миРНК, состоящая из конъюгатов, содержащих миРНК-полимерное соединение по п. 1.
13. Фармацевтическая композиция для генотерапии, содержащая фармацевтически эффективное количество конъюгатов для внутриклеточной доставки миРНК, содержащих миРНК-полимерное соединение по п. 1.
14. Фармацевтическая композиция для генотерапии, содержащая фармацевтически эффективное количество наночастиц по п. 12.
15. Конъюгат сурвивин-специфическая миРНК и полимерное соединение для лечения рака, имеющее следующую структуру
A-X-R-Y-B,
(где один из A и B представляет собой гидрофильное полимерное соединение, а другой представляет собой гидрофобное соединение; X и Y независимо представляют собой простую ковалентную связь или ковалентную связь через промежуточный линкер; и R представляет собой сурвивин-специфическую миРНК),
где гидрофобное соединение представлено углеводородом C16-C50 или холестерином, имеющим молекулярную массу от 250 до 1000.
A-X-R-Y-B,
(где один из A и B представляет собой гидрофильное полимерное соединение, а другой представляет собой гидрофобное соединение; X и Y независимо представляют собой простую ковалентную связь или ковалентную связь через промежуточный линкер; и R представляет собой сурвивин-специфическую миРНК),
где гидрофобное соединение представлено углеводородом C16-C50 или холестерином, имеющим молекулярную массу от 250 до 1000.
16. Конъюгат по п.15, в котором одна цепь сурвивин-специфической миРНК (R) состоит из 19-31 нуклеотидов.
17. Конъюгат по п. 15, где сурвивин-специфическая миРНК (R) представляет собой любую последовательность, выбранную из любых последовательностей SEQ ID NO: 1-4.
18. Конъюгат по п. 16, где сурвивин-специфическая миРНК имеет химическую модификацию.
19. Конъюгат по п. 18, где химическая модификация включает по меньшей мере одну модификацию, выбранную из:
модифицированной фосфородиэфирной связи до фосфоротиатной связи; модифицированной -OH во 2′ положении пентозы до 2′-OCH3 или 2′-диокси-2′-фторидина; и
модифицированной -OH во 2′ положении пентозы до LNA типа, полученного путем связывания 2′-положения и 4′-положения пентозы.
модифицированной фосфородиэфирной связи до фосфоротиатной связи; модифицированной -OH во 2′ положении пентозы до 2′-OCH3 или 2′-диокси-2′-фторидина; и
модифицированной -OH во 2′ положении пентозы до LNA типа, полученного путем связывания 2′-положения и 4′-положения пентозы.
20. Конъюгат по п. 15, в котором гидрофильное полимерное соединение представляет собой неионное полимерное соединение с молекулярной массой от 1000 до 10000; и ковалентная связь является нерасщепляемой связью или расщепляемой связью.
21. Конъюгат по п. 20, в котором нерасщепляемая связь представляет собой амидную связь или фосфатную связь, и расщепляемая связь выбрана из дисульфидной связи, расщепляемой кислотой связи, сложноэфирной связи, ангидридной связи, биорасщепляемой связи и расщепляемой ферментом связи.
22. Конъюгат по п. 20, в котором гидрофильное полимерное соединение включает по меньшей мере одно соединение, выбранное из полиэтиленгликоля (ПЭГ), поливинилпирролидона и полиоксазолина.
23. Наночастица для лечения рака, содержащая конъюгат по п. 15.
24. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая конъюгат по п. 15 в качестве фармацевтически эффективного компонента.
25. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая наночастицу по п. 23 в качестве фармацевтически эффективного компонента.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2009-0042297 | 2009-05-14 | ||
KR1020090042297A KR101224828B1 (ko) | 2009-05-14 | 2009-05-14 | siRNA 접합체 및 그 제조방법 |
PCT/KR2010/003039 WO2010131916A2 (ko) | 2009-05-14 | 2010-05-13 | siRNA 접합체 및 그 제조방법 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013151977/10A Division RU2571218C2 (ru) | 2009-05-14 | 2013-11-21 | Конъюгат мирнк и способ его получения |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2011150787A RU2011150787A (ru) | 2013-06-20 |
RU2558258C2 true RU2558258C2 (ru) | 2015-07-27 |
Family
ID=43085466
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011150787/10A RU2558258C2 (ru) | 2009-05-14 | 2010-05-13 | Конъюгат мирнк и способ его получения |
RU2013151977/10A RU2571218C2 (ru) | 2009-05-14 | 2013-11-21 | Конъюгат мирнк и способ его получения |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013151977/10A RU2571218C2 (ru) | 2009-05-14 | 2013-11-21 | Конъюгат мирнк и способ его получения |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US8779114B2 (ru) |
EP (3) | EP2682466B1 (ru) |
JP (3) | JP5758381B2 (ru) |
KR (1) | KR101224828B1 (ru) |
CN (3) | CN103233003B (ru) |
AU (1) | AU2010248239B2 (ru) |
BR (1) | BRPI1012141B1 (ru) |
CA (2) | CA2761749C (ru) |
RU (2) | RU2558258C2 (ru) |
WO (1) | WO2010131916A2 (ru) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2782211C2 (ru) * | 2017-12-01 | 2022-10-24 | Сучжоу Рибо Лайф Сайенс Ко., Лтд | Нуклеиновая кислота, композиция и конъюгат, содержащие ее, а также способ их получения и применения |
US11492620B2 (en) | 2017-12-01 | 2022-11-08 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | Double-stranded oligonucleotide, composition and conjugate comprising double-stranded oligonucleotide, preparation method thereof and use thereof |
US11660347B2 (en) | 2017-12-01 | 2023-05-30 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | Nucleic acid, composition and conjugate containing same, preparation method, and use thereof |
US11896674B2 (en) | 2018-09-30 | 2024-02-13 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | SiRNA conjugate, preparation method therefor and use thereof |
US11918600B2 (en) | 2018-08-21 | 2024-03-05 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | Nucleic acid, pharmaceutical composition and conjugate containing nucleic acid, and use thereof |
Families Citing this family (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101224828B1 (ko) | 2009-05-14 | 2013-01-22 | (주)바이오니아 | siRNA 접합체 및 그 제조방법 |
RU2599449C1 (ru) * | 2011-12-15 | 2016-10-10 | Байонир Корпорейшн | Новые конъюгаты олигонуклеотидов и их применение |
KR101722948B1 (ko) * | 2012-01-05 | 2017-04-04 | (주)바이오니아 | 리간드가 결합된 이중나선 올리고 rna 구조체 및 그 제조방법 |
CN104114704A (zh) * | 2012-01-05 | 2014-10-22 | 株式会社百奥尼 | 高效率的纳米颗粒型双螺旋寡rna结构体及其制备方法 |
CN104244928B (zh) * | 2012-01-18 | 2016-08-31 | 株式会社百奥尼 | 磁性纳米颗粒-SAMiRNA复合物及其制备方法 |
PL2812091T3 (pl) | 2012-09-17 | 2021-07-19 | W.R. Grace & Co. - Conn. | Podłoża chromatograficzne i urządzenia |
JP2015532100A (ja) * | 2012-10-05 | 2015-11-09 | バイオニア コーポレイション | アンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴrna、そのような二重鎖オリゴrnaを含む二重鎖オリゴrnaの構造体及びこれを含む呼吸器疾患の予防または治療用の組成物 |
EP2930180B1 (en) * | 2012-12-06 | 2021-11-10 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Double-stranded ribonucleic acid for adjuvants |
CA2917318A1 (en) | 2013-07-05 | 2015-01-08 | Bioneer Corporation | Dengue virus related genes-specific sirna, double-stranded oligo rna molecules comprising the sirna, and composition for the inhibition of dengue virus replication comprising the same |
RU2670164C2 (ru) * | 2013-07-05 | 2018-10-18 | Байонир Корпорейшн | Улучшенная олигонуклеотидная конструкция типа наночастицы, обладающая высокой эффективностью, и способ ее получения |
RU2656154C2 (ru) * | 2013-07-05 | 2018-05-31 | Байонир Корпорейшн | СВЯЗАННАЯ С РЕСПИРАТОРНЫМ ЗАБОЛЕВАНИЕМ ГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ миРНК, ДВУСПИРАЛЬНАЯ КОНСТРУКЦИЯ ОЛИГО-РНК, СОДЕРЖАЩАЯ миРНК, И СОДЕРЖАЩАЯ ЕЕ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ РЕСПИРАТОРНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ |
KR20150006742A (ko) * | 2013-07-09 | 2015-01-19 | (주)바이오니아 | 간암 연관 유전자 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 |
KR20150006743A (ko) * | 2013-07-09 | 2015-01-19 | (주)바이오니아 | 간암 연관 유전자 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 |
CN106459974A (zh) * | 2014-04-04 | 2017-02-22 | 柏业公司 | 新颖的双链寡rna和包含它的用于预防或治疗纤维化或呼吸系统疾病的药物组合物 |
PL3137209T3 (pl) | 2014-05-02 | 2023-01-02 | W.R. Grace & Co. - Conn. | Funkcjonalizowany materiał nośnikowy i sposoby wytwarzania oraz stosowania funkcjonalizowanego materiału nośnikowego |
CA2974195A1 (en) * | 2014-10-15 | 2016-04-21 | University Of Connecticut | Bio-reducible self-assembled liquid crystalline block copolymer for drug delivery |
JP2018517559A (ja) | 2015-06-05 | 2018-07-05 | ダブリュー・アール・グレース・アンド・カンパニー−コーンW R Grace & Co−Conn | 吸着性バイオプロセス清澄化剤並びにその製造及び使用方法 |
WO2016204515A1 (ko) * | 2015-06-15 | 2016-12-22 | (주)바이오니아 | STAT3 유전자 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체, 이를 포함하는 조성물 및 이의 용도 |
KR101861738B1 (ko) | 2016-08-24 | 2018-05-29 | (주)바이오니아 | 마이크로 rna를 포함하는 이중나선 올리고 rna 구조체 |
KR20190123351A (ko) * | 2017-03-22 | 2019-10-31 | 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 개질된 올리고뉴클레오티드 및 이의 치료 용도 |
CN110945132B (zh) * | 2017-12-01 | 2024-04-05 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途 |
CN116375774A (zh) | 2017-12-29 | 2023-07-04 | 苏州瑞博生物技术股份有限公司 | 缀合物及其制备方法和用途 |
KR102141124B1 (ko) | 2018-01-30 | 2020-08-04 | (주)바이오니아 | 이중 가닥 miRNA를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체 및 이의 용도 |
BR112020023968A2 (pt) | 2018-05-25 | 2021-02-23 | Bioneer Corporation | oligonucleotídeo de fita dupla específico da anfiregulina, estrutura, nanopartícula, composição farmacêutica e formulação liofilizada compreendendo a mesma |
KR102473989B1 (ko) * | 2018-11-28 | 2022-12-07 | (주)바이오니아 | 안드로젠 수용체 특이적 서열을 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체, 및 이를 포함하는 탈모 예방 및 발모용 조성물 |
WO2020149644A1 (ko) | 2019-01-15 | 2020-07-23 | (주)바이오니아 | Dkk1 유전자를 표적으로 하는 이중나선 올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 구조체 및 이를 포함하는 탈모 예방 또는 발모용 조성물 |
KR20210063137A (ko) | 2019-11-22 | 2021-06-01 | (주)바이오니아 | Ctgf 유전자 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 섬유증 관련 질환 및 호흡기 관련 질환 예방 및 치료용 조성물 |
KR20210141399A (ko) | 2020-05-14 | 2021-11-23 | (주)바이오니아 | 엠피레귤린 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 비만 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 |
CN116157521A (zh) | 2020-05-22 | 2023-05-23 | 柏业公司 | 双链寡核苷酸和用于治疗covid-19的含有其的组合物 |
KR102272800B1 (ko) | 2020-06-30 | 2021-07-05 | 국방과학연구소 | 코로나바이러스 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 코로나바이러스 감염증-19 예방 및 치료용 조성물 |
EP4299078A1 (en) | 2021-02-25 | 2024-01-03 | Bioneer Corporation | Composition for alleviating hair graying, promoting hair growth and/or preventing or alleviating hair loss, comprising double-stranded mirna as active ingredient |
WO2022191567A1 (ko) | 2021-03-08 | 2022-09-15 | (주)바이오니아 | Covid-19를 포함하는 호흡기 바이러스 감염증, 바이러스 감염에 의한 폐섬유증, 또는 호흡기 질환 예방 또는 치료를 위한 초음파 방식 연무식 흡입기를 이용한 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 투여용 조성물 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070041932A1 (en) * | 2003-04-03 | 2007-02-22 | Jeong Et Al | Conjugate for gene transfer comprising oligonucleotide and hydrophilic polymer, polyelectrolyte complex micelles formed from the conjugate, and methods for preparation thereof |
WO2007021142A1 (en) * | 2005-08-17 | 2007-02-22 | Bioneer Corporation | Sirna-hydrophilic polymer conjugates for intracellular delivery of sirna and method thereof |
WO2009039173A2 (en) * | 2007-09-19 | 2009-03-26 | Applied Biosystems Inc. | SiRNA SEQUENCE-INDEPENDENT MODIFICATION FORMATS FOR REDUCING OFF-TARGET PHENOTYPIC EFFECTS IN RNAi, AND STABILIZED FORMS THEREOF |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5141813A (en) * | 1989-08-28 | 1992-08-25 | Clontech Laboratories, Inc. | Multifunctional controlled pore glass reagent for solid phase oligonucleotide synthesis |
US5451463A (en) * | 1989-08-28 | 1995-09-19 | Clontech Laboratories, Inc. | Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides |
WO1993005168A1 (en) * | 1991-09-06 | 1993-03-18 | Research Development Foundation | Dna sequences encoding gelonin polypeptide |
US6221959B1 (en) * | 1994-11-18 | 2001-04-24 | Supratek Pharma, Inc. | Polynucleotide compositions |
US6348583B1 (en) * | 1999-08-30 | 2002-02-19 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Poly(ether-thioether), poly(ether-sulfoxide) and poly(ether-sulfone) nucleic acids |
US7491805B2 (en) * | 2001-05-18 | 2009-02-17 | Sirna Therapeutics, Inc. | Conjugates and compositions for cellular delivery |
PT2284266E (pt) | 2002-11-14 | 2013-12-17 | Thermo Fisher Scient Biosciences Inc | Siarn contra tp53 |
US7851615B2 (en) * | 2003-04-17 | 2010-12-14 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Lipophilic conjugated iRNA agents |
CA2524495A1 (en) * | 2003-06-03 | 2005-01-13 | Eli Lilly And Company | Modulation of survivin expression |
KR101147147B1 (ko) * | 2004-04-01 | 2012-05-25 | 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 | Rna 간섭의 오프 타겟 효과 감소를 위한 변형된폴리뉴클레오타이드 |
US8101741B2 (en) | 2005-11-02 | 2012-01-24 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Modified siRNA molecules and uses thereof |
AU2007280690C1 (en) * | 2006-07-31 | 2012-08-23 | Curevac Gmbh | Nucleic acid of formula (I): GIXmGn, or (II): CIXmCn, in particular as an immune-stimulating agent/adjuvant |
EP2025348A1 (en) * | 2007-08-13 | 2009-02-18 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Targeted block copolymer micelles |
TW200927177A (en) * | 2007-10-24 | 2009-07-01 | Nat Inst Of Advanced Ind Scien | Lipid-modified double-stranded RNA having potent RNA interference effect |
KR101224828B1 (ko) | 2009-05-14 | 2013-01-22 | (주)바이오니아 | siRNA 접합체 및 그 제조방법 |
-
2009
- 2009-05-14 KR KR1020090042297A patent/KR101224828B1/ko active IP Right Grant
-
2010
- 2010-05-13 CN CN201310147988.XA patent/CN103233003B/zh active Active
- 2010-05-13 EP EP13185358.2A patent/EP2682466B1/en active Active
- 2010-05-13 CA CA2761749A patent/CA2761749C/en active Active
- 2010-05-13 AU AU2010248239A patent/AU2010248239B2/en active Active
- 2010-05-13 EP EP10775118.2A patent/EP2463371B1/en active Active
- 2010-05-13 WO PCT/KR2010/003039 patent/WO2010131916A2/ko active Application Filing
- 2010-05-13 EP EP13159602.5A patent/EP2626427A3/en not_active Withdrawn
- 2010-05-13 CN CN201080021324.3A patent/CN102439148B/zh active Active
- 2010-05-13 CN CN201210301551.2A patent/CN102888404B/zh active Active
- 2010-05-13 US US13/319,885 patent/US8779114B2/en active Active
- 2010-05-13 JP JP2012510752A patent/JP5758381B2/ja active Active
- 2010-05-13 CA CA2871888A patent/CA2871888A1/en not_active Abandoned
- 2010-05-13 BR BRPI1012141A patent/BRPI1012141B1/pt active IP Right Grant
- 2010-05-13 RU RU2011150787/10A patent/RU2558258C2/ru active
-
2012
- 2012-09-13 US US13/613,071 patent/US8772472B2/en active Active
-
2013
- 2013-05-08 JP JP2013098798A patent/JP5797688B2/ja active Active
- 2013-11-21 RU RU2013151977/10A patent/RU2571218C2/ru active
-
2014
- 2014-05-30 US US14/291,540 patent/US9211343B2/en active Active
- 2014-05-30 US US14/291,656 patent/US20140350233A1/en not_active Abandoned
- 2014-12-02 JP JP2014244541A patent/JP2015107115A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070041932A1 (en) * | 2003-04-03 | 2007-02-22 | Jeong Et Al | Conjugate for gene transfer comprising oligonucleotide and hydrophilic polymer, polyelectrolyte complex micelles formed from the conjugate, and methods for preparation thereof |
WO2007021142A1 (en) * | 2005-08-17 | 2007-02-22 | Bioneer Corporation | Sirna-hydrophilic polymer conjugates for intracellular delivery of sirna and method thereof |
WO2009039173A2 (en) * | 2007-09-19 | 2009-03-26 | Applied Biosystems Inc. | SiRNA SEQUENCE-INDEPENDENT MODIFICATION FORMATS FOR REDUCING OFF-TARGET PHENOTYPIC EFFECTS IN RNAi, AND STABILIZED FORMS THEREOF |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Теоретические основы инженерной технологии, физико-химические основы, под ред. Е.М. Сергеева, Москва, "Недра", 1985г., с.6-7. KAZUHIRO KAMI et al., Downregulation of survivin by siRNA diminishes radioresistance of pancreatic cancer cells, Surgery, August 2005. FEAST W.J., Synthesis, processing and material properties of conjugated polymers, Polymer, Vol.37, No.22, 1996, pp.5017-5047. * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2782211C2 (ru) * | 2017-12-01 | 2022-10-24 | Сучжоу Рибо Лайф Сайенс Ко., Лтд | Нуклеиновая кислота, композиция и конъюгат, содержащие ее, а также способ их получения и применения |
US11492620B2 (en) | 2017-12-01 | 2022-11-08 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | Double-stranded oligonucleotide, composition and conjugate comprising double-stranded oligonucleotide, preparation method thereof and use thereof |
US11660347B2 (en) | 2017-12-01 | 2023-05-30 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | Nucleic acid, composition and conjugate containing same, preparation method, and use thereof |
US11918600B2 (en) | 2018-08-21 | 2024-03-05 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | Nucleic acid, pharmaceutical composition and conjugate containing nucleic acid, and use thereof |
US11896674B2 (en) | 2018-09-30 | 2024-02-13 | Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. | SiRNA conjugate, preparation method therefor and use thereof |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2558258C2 (ru) | Конъюгат мирнк и способ его получения | |
CN105018492B (zh) | 不对称干扰rna的组合物及其用途 | |
JP6060178B2 (ja) | 高効率のナノ粒子型二本鎖オリゴrna構造体およびその製造方法 | |
EP3018208B1 (en) | Improved nanoparticle type oligonucleotide structure having high efficiency and method for preparing same | |
KR101241852B1 (ko) | siRNA 접합체 및 그 제조방법 | |
KR101392973B1 (ko) | siRNA 접합체 및 그 제조방법 | |
AU2015200143A1 (en) | Sirna conjugate and preparation method thereof |