KR20210063137A

KR20210063137A - Ctgf 유전자 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 섬유증 관련 질환 및 호흡기 관련 질환 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20210063137A
Application number: KR1020190151673A
Authority: KR
Inventors: 박한오; 김태림; 고영호; 윤성일; 박준홍
Original assignee: (주)바이오니아
Priority date: 2019-11-22
Filing date: 2019-11-22
Publication date: 2021-06-01
Also published as: CA3158896A1; MX2022006122A; EP4063504A4; AU2020388330A1; US20230042493A1; BR112022009834A2; JP2023503121A; CN114981433A; JP7464709B2; WO2021101113A1; EP4063504A1

Abstract

본 발명은 CTGF 발현을 매우 특이적이고 높은 효율로 저해할 수 있는 이중가닥 올리고뉴클레오티드, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 및 나노입자와 이의 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

Description

CTGF 유전자 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 섬유증 관련 질환 및 호흡기 관련 질환 예방 및 치료용 조성물{A double-stranded oligonucleotide comprising CTGF specific sequence and a composition for treating and preventing fibrosis related diseases and respiratory related diseases}

본 발명은 CTGF 발현을 매우 특이적이고 높은 효율로 저해할 수 있는 이중가닥 올리고뉴클레오티드, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 및 나노입자, 및 이의 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

1995년 Guo와 Kemphues는 C. elegans에서 antisense를 이용한 유전자 발현을 억제하는데 antisense RNA와 마찬가지로 sense RNA도 유효하다는 것을 발견함으로써 그 원인을 규명하기 위한 연구가 진행되었으며, 1998년 Fire 등이 처음으로 double stranded RNA (dsRNA)를 주입하여 그에 대응하는 mRNA가 특이적으로 분해되어 유전자의 발현이 억제되는 현상을 확인하였고 이를 RNA interference (RNAi) 로 명명하였다. RNAi는 유전자 발현을 억제하기 위해 사용되는 방법으로 간편하면서 적은 비용으로 유전자 억제 효과를 뚜렷하게 볼 수 있기 때문에 그 기술의 응용 분야가 다양해지고 있다.

이러한 유전자의 발현을 억제하는 기술은 특정 유전자의 발현을 조절할 수 있기 때문에 특정 유전자의 과잉 발현이 원인이 되는 암, 유전 질환 등의 표적 유전자를 mRNA 수준에서 제거할 수 있어, 질병치료를 위한 치료제 개발 및 표적 검증의 중요한 도구로 활용될 수 있다. 표적 유전자의 발현을 억제하는 종래의 기술로는 표적 유전자에 대한 전이유전자를 도입하는 기술이 개시되어 있는데, 프로모터를 기준으로 역방향(antisense)으로 전이 유전자를 도입하는 방법과 프로모터 기준으로 정방향(sense)으로 이식 유전자를 도입하는 방법이 있다.

이러한 RNA를 표적으로 하는 RNA 치료법은 표적 RNA에 대한 올리고뉴클레오티드를 이용하여 해당 유전자의 기능을 제거하는 방법으로 기존의 항체와 화합물 (small molecule) 같은 종래의 치료제가 주로 단백질을 표적으로 하는 것과는 다르다고 할 수 있다. RNA를 표적으로 하는 접근법에는 크게 두 가지가 존재하는데, 하나는 이중나선-RNA가 매개된 RNAi이고 다른 하나는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)이다. 현재 다양한 질병에서 RNA를 표적으로 하여 임상이 시도되고 있다.

안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO, 이하 'ASO'라고 한다)는 왓슨-크릭 염기 반응에 따라 목적 유전자에 결합되도록 디자인된 짧은 길이의 합성 DNA 로서, 유전자의 특정 염기 서열의 발현을 특이적으로 억제할 수 있어 유전자의 기능을 연구하고 암과 같은 질환을 분자 수준에서 치료할 수 있는 치료제를 개발하는데 이용되어 왔다. 이러한 ASO는 유전자 발현을 억제하는 목표를 다양하게 설정하여 용이하게 제작될 수 있는 장점이 있어, 발암 유전자의 발현과 암세포의 성장을 억제하는데 활용하고자 하는 연구가 있어 왔다. ASO가 특정 유전자의 발현을 억제하는 과정은 상보적인 mRNA 서열과 결합하여 RNase H 활성을 유도하여 mRNA를 제거하거나 단백질 번역을 위한 리보좀 복합체의 형성 및 진행을 방해함으로써 이루어진다. 또한 ASO는 게놈 DNA와 결합하여 트리플-헬릭스 (Triple helix) 구조를 형성함으로 유전자의 전사를 억제한다고도 보고되었다. ASO는 위와 같은 잠재적 가능성이 있으나, 이를 임상에 활용되기 위해서는 뉴클레아제(nuclease)에 대한 안정성을 향상시키고, 목적 유전자의 염기 서열에 특이적으로 결합하도록 표적 조직이나 세포내로 효율적으로 전달되어야 한다. 또한, 유전자 mRNA 의 2차 및 3차 구조는 ASO의 특이적 결합에 중요한 요소로, mRNA 2차 구조가 적은 부분이 ASO가 접근하는데 매우 유리하므로, ASO를 합성하기 전에 mRNA 2차 구조가 적게 생성되는 영역을 체계적으로 분석하여 생체 외 뿐 아니라 생체 내에서도 유전자-특이적 억제를 효과적으로 달성하기 위해 노력해왔다. 이러한 ASO는 RNA의 종류인 siRNA 보다 매우 안정적이고 물과 생리 식염수 등에 잘 용해되는 장점을 가지고 있으며, 현재 세 개의 ASO가 Federal Drug Administration (FDA)에 승인 되었다(Jessica, C., J Postdoc Res, 4:35-50, 2016).

간섭 RNA(RNA interference, 이하 'RNAi'라고 한다)는 그 역할이 발견된 이후로, 다양한 종류의 포유동물 세포(mammalian cell)에서 서열 특이적 mRNA에 작용한다는 사실이 밝혀졌다 (Barik, S., J Mol. Med. (2005) 83: 764-773). 긴 사슬의 RNA 이중가닥이 세포로 전달되면, 전달된 RNA 이중가닥은 Dicer라는 엔도뉴클라아제(endonuclease)에 의하여 21 내지 23개의 이중가닥(base pair, bp)으로 프로세싱된 짧은 간섭 RNA (small interfering RNA, 이하 'siRNA'라고 한다)로 변환되며, siRNA는 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합하여 가이드(안티센스) 가닥이 타겟 mRNA를 인식하여 분해하는 과정을 통해 타겟 유전자의 발현을 서열 특이적으로 저해한다. SiRNA를 이용한 유전자의 발현 억제 기술은 표적 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제시키고 이로 인한 변화를 관찰하는 것으로 표적 세포에서의 표적 유전자의 기능을 규명하는 연구에 유용하게 사용된다, 특히, 감염성 바이러스 또는 암세포 등에서 표적 유전자의 기능을 억제하는 것은 해당 질병의 치료 방법을 개발하는데 유용하게 활용될 수 있을 것이며, 생체 외(in vitro)에서의 연구 및 실험동물을 이용한 생체 내 (in vivo) 연구를 수행한 결과, siRNA에 의한 표적 유전자의 발현 억제가 가능하다고 보고된 바 있다.

베르트랑(Bertrand) 연구진에 따르면 동일한 타겟 유전자에 대한 siRNA가 안티센스 올리고뉴클레오티드(Antisense oligonucleotide, ASO)에 비하여 생체 내/외(in vitro 및 in vivo)에서 mRNA 발현의 저해효과가 뛰어나고, 해당 효과가 오랫동안 지속되는 효과를 가지는 것으로 밝혀졌다. 또한 siRNA의 작용 기작은 타겟 mRNA와 상보적으로 결합하여 서열 특이적으로 타겟 유전자의 발현을 조절하기 때문에, 기존의 항체 기반 의약품이나 화학물질 의약품(small molecule drug)에 비하여 적용할 수 있는 대상이 획기적으로 확대될 수 있다는 장점을 가진다(MA Behlke, MOLECULAR THERAPY. 2006 13(4):664-670).

siRNA의 뛰어난 효과 및 다양한 사용범위에도 불구하고, siRNA가 치료제로 개발되기 위해서는 체내에서의 siRNA의 안정성(stability) 개선과 세포 전달 효율 개선을 통해 siRNA가 타겟 세포에 효과적으로 전달되어야 한다(FY Xie, Drug Discov. Today. 2006 Jan; 11(1-2):67-73). 체내 안정성 향상 및 siRNA의 비특이적인 세포 면역 반응(innate immune stimulation) 문제 해결을 위하여 siRNA의 일부 뉴클레오티드 또는 골격(backbone)을 핵산분해효소 저항성을 가지도록 변형(modification)하거나 바이러스성 벡터(viral vector), 리포좀 또는 나노입자(nanoparticle) 등의 전달체를 이용하는 등, 이에 대한 연구가 활발하게 시도되고 있다.

아데노바이러스나 레트로바이러스 등의 바이러스성 벡터를 이용한 전달 시스템은 형질주입 효율(transfection efficacy)이 높지만, 면역원성(immunogenicity) 및 발암성(oncogenicity)이 높다. 반면에 나노입자를 포함하는 비바이러스성(non-viral) 전달 시스템은 바이러스성 전달 시스템에 비하여 세포전달효율은 낮은 편이지만, 생체 내(in vivo)에서의 안정성(stability)이 높고, 타겟 특이적으로 전달이 가능하며, 내포되어 있는 RNAi 올리고뉴클레오타이드를 세포 또는 조직으로 흡수(uptake) 및 내재화(internalization)하고, 세포독성 및 면역 유발(immune stimulation)이 거의 없다는 장점을 가지고 있어, 현재는 바이러스성 전달 시스템에 비해 유력한 전달방법으로 평가되고 있다(Akhtar S, J Clin Invest. 2007 December 3; 117(12): 3623-3632).

비바이러스성 전달 시스템 중에서 나노전달체(nanocarrier)를 이용하는 방법은 리포좀, 양이온 고분자 복합체 등의 다양한 고분자를 사용함으로써 나노입자를 형성하고, siRNA를 이러한 나노입자(nanoparticle), 즉 나노전달체(nanocarrier)에 담지하여 세포에 전달하는 방법이다. 나노전달체를 이용하는 방법 중 주로 활용되는 방법은 고분자 나노입자(polymeric nanoparticle), 고분자 미셀(polymer micelle), 리포플렉스(lipoplex) 등이 있는데, 이 중에서 리포플렉스를 이용한 방법은 양이온성 지질로 구성되어 세포의 엔도좀(endosome)의 음이온성 지질과 상호작용하여 엔도좀의 탈 안정화 효과를 유발하여 세포 내로 전달하는 역할을 한다.

또한, siRNA 패신저(passenger; 센스(sense)) 가닥의 말단 부위에 화학물질 등을 연결하여 증진된 약동력학(pharmacokinetics)적 특징을 갖도록 하여 생체 내(in vivo)에서 높은 효율을 유도할 수 있다는 것이 알려져 있다(J Soutschek, Nature 11; 432(7014):173-8, 2004). 이 때 siRNA 센스(sense; 패신저(passenger)) 또는 안티센스(antisence; 가이드(guide)) 가닥의 말단에 결합된 화학 물질의 성질에 따라 siRNA의 안정성이 달라진다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 같은 고분자 화합물이 접합된 형태의 siRNA는 양이온성 물질이 존재하는 조건에서 siRNA의 음이온성 인산기와 상호작용하여 복합체를 형성함으로써, 개선된 siRNA 안정성을 가진 전달체가 된다(SH Kim, J Control Release 129(2):107-16, 2008). 특히 고분자 복합체로 구성된 미셀(micelle)들은 약물 전달 운반체로 쓰이는 다른 시스템인, 미소구체(microsphere) 또는 나노입자(nanoparticle) 등에 비해 그 크기가 극히 작으면서도 분포가 매우 일정하고, 자발적으로 형성되는 구조이므로 제제의 품질 관리 및 재현성 확보가 용이하다는 장점이 있다.

siRNA의 세포 내 전달 효율성을 향상시키기 위해, siRNA에 생체 적합성 고분자인 친수성 물질(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG))을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합으로 접합시킨 siRNA 접합체를 통해, siRNA의 안정성 확보 및 효율적인 세포막 투과성을 위한 기술이 개발되었다(대한민국 등록특허 제883471호). 하지만 siRNA의 화학적 변형 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 접합시키는것(PEGylation) 만으로는 생체 내에서의 낮은 안정성과 표적 장기로의 전달이 원활하지 못하다는 단점은 여전히 가진다. 이러한 단점을 해결하기 위하여 올리고뉴클레오티드, 특히 siRNA와 같은 이중가닥 올리고 RNA에 친수성 및 소수성 물질이 결합된 이중가닥 올리고 RNA 구조체가 개발되었는데, 상기 구조체는 소수성 물질의 소수성 상호작용에 의하여 SAMiRNA™(self assembled micelle inhibitory RNA) 라고 명명된 자가조립 나노입자를 형성하게 되는데(대한민국 등록 특허 제1224828호), SAMiRNA™기술은 기존의 전달기술들에 비해 매우 사이즈가 작으면서도 균일한(homogenous) 나노입자를 수득할 수 있다는 장점을 가진다.

SAMiRNA™기술의 구체적인 예로서, 친수성 물질로서 PEG(polyethyleneglycol) 또는 HEG(Hexaethylenglycol)가 사용되는데, PEG는 합성 폴리머(synthetic polymer)로 흔히 의약품 특히 단백질의 수용성(solubility) 증가 및 약물동태학(pharmacokinetics)의 조절을 위해 사용된다. PEG는 다분산계(polydisperse) 물질로, 한 배치(batch)의 폴리머는 다른 개수의 단량체(monomer)의 총 합으로 이루어져 분자량이 가우스 곡선 형태를 나타내며, 다분산지수(polydisperse value, Mw/Mn)로 물질의 동질성 정도를 표현한다. 즉, PEG가 낮은 분자량(3~5kDa)일 때 약 1.01의 다분산지수를 나타내며 높은 분자량(20 kDa)일 때 약 1.2라는 높은 다분산지수를 나타내어, 높은 분자량일수록 물질의 동질성이 상대적으로 낮은 특징을 보인다. 따라서, PEG를 의약품에 결합시킨 경우 접합체에 PEG의 다분산적 특징이 반영되어 단일물질의 검증이 쉽지 않다는 단점이 있어 PEG의 합성 및 정제과정의 개선을 통해 낮은 다분산지수를 가지는 물질을 생산하는 추세이지만, 특히 분자량이 작은 물질에 PEG를 결합시킨 경우 결합이 용이하게 이루어졌는지 확인이 용이하지 않은 불편한 점이 있는 등 물질의 다분산성 특징에 따른 문제점 들이 존재한다. (Francesco M. VDRUG DISCOVERY TODAY(2005) 10(21):1451-1458).

이에 따라 최근에는 기존 자가조립 나노입자인 SAMiRNA™기술의 개량된 형태로, SAMiRNA™를 구성하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체의 친수성 물질을 일정한 분자량을 갖는 균일한 1~15개의 단량체(monomer)와 필요에 따라 링커(linker)를 포함하는 기본단위를 블록(block)화 하여, 이를 필요에 따라 적절한 개수를 사용함으로써, 기존의 SAMiRNA™에 비해 보다 작은 크기를 가지며 또한 다분산성이 획기적으로 개선된 새로운 형태의 전달체 기술이 개발되었다. 또한 체내로 siRNA를 주입하였을 경우, 혈액 내에 존재하는 여러 다양한 효소들에 의해 siRNA가 급속하게 분해되어 표적 세포 또는 조직 등으로 전달 효율이 좋지 않음이 이미 알려져 있듯이 개량된 SAMiRNA™에서도 표적 유전자에 따라 안정성 및 발현 저해율의 편차가 나타났다. 따라서, 본 발명자들은 개량된 자가조립 나노입자인 SAMiRNA™를 이용하여 표적 유전자를 보다 안정적이고 효과적으로 발현 저해하기 위해 가이드인 센스 가닥은 ASO인 DNA 서열을, 패신저인 안티센스 가닥은 RNA 서열을 이용하여 DNA-RNA hybrid 형태의 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 적용함으로써 표적 유전자에 대한 발현 저해 효과와 안정성을 증진시키고자 하였다.

천식과 함께 대표적인 폐질환의 하나인 만성폐쇄성폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, 이하 'COPD'라 함)는 비가역적인 기도의 폐색을 동반한다는 점에서 천식과 다르며 반복되는 감염, 유해한 입자나 가스의 흡입이나 흡연에 의해 발생하는 폐의 비정상적인 염증반응과 이와 동반하여 완전히 가역적이지 않으며 점차 진행하는 기류제한을 보이는 호흡기 질환이다(Pauwels et al, Am J Respir Crit Care Med, 163:1256-1276, 2001). COPD는 기도 및 폐실질 염증에 의한 세기관지 및 폐실질의 병리학적 변화에 의해 발생하는 병으로, 폐쇄성 세기관지염 및 폐기종(폐실질 파괴)을 특징으로 한다. COPD의 종류에는 만성폐쇄성기관지염(Chronic obstructive bronchitis), 만성세기관지염(Chronic bronchiolitis) 및 폐기종(Emphysema)이 있다. COPD의 경우 호중구의 수가 증가하며, GM-CSF, TNF-α, IL-8, MIP-2와 같은 사이토카인의 분비가 증가된다. 또한, 기도에 염증이 생기고, 근육 벽이 두꺼워지며, 점액 분비가 증가하여 기관지 폐쇄가 나타난다. 기관지가 폐쇄되면 폐포는 확장되고 손상되어 산소와 이산화탄소의 교환능력이 손상을 받게 되고, 호흡부전발생이 높아진다.

전세계적으로 COPD의 심각성이 부각되고 있는데 이는 COPD가 1990년 질환으로 인한 사망 원인 중 6위였으나 2020년에는 3위가 될 것이라 예측되고 있으며, 10대 질환 중 유일하게 그 발병률이 증가하는 질환이기 때문이다. COPD는 유병률이 높고, 호흡장애를 초래하며, COPD의 진단과 치료에 필요한 직접 의료비가 많이 발생할 뿐만 아니라, 호흡곤란장애 발생이나 휴직으로 발생되는 손실이나 조기 사망에 따른 손실 등의 간접의료비도 상당하기 때문에, 전세계적으로도 사회-경제적인 문제가 되고 있다(만성폐쇄성폐질환(COPD)진료지침. 2005. 만성기도폐쇄성질환 임상연구센터. p.30-31).

현존하는 어떤 치료약제도 COPD의 특징인 장기적 폐기능 감소를 완화시킨다고 확인된 바는 없다. 그러므로 COPD에서 약물요법은 주로 증상 혹은 합병증을 감소시키는 목적으로 사용한다. 이 중 기관지확장제는 대표적인 COPD 대증요법 치료제이고, 항염증제나 부신피질호르몬 등이 주로 처방되지만 그 효과가 미미하고 적용범위가 협소하며 부작용 발생 우려가 크다. 그 밖의 약물로는 인플루엔자 백신만이 COPD 환자에서 심각한 병증과 사망을 약 50%까지 감소시킬 수 있는 것으로 알려져 있다 (만성폐쇄성폐질환(COPD)진료지침. 2005. 만성기도폐쇄성질환 임상연구센터. p.52-58).

한편, 많은 유전적 인자가 개인의 COPD 발생 위험을 증가(혹은 감소)시킨다고 추정된다. 현재까지 증명된 유전적인 위험 인자로는 α1-antitrypsin의 유전적 결핍이 있다. 흡연이 COPD 발병위험을 상당히 증가시키지만, 어린 연령에서 빠르게 진행하는 전소엽기종(panlobular emphysema)의 발생과 폐기능 감소는 심한 유전적 결핍을 보이는 흡연자와 비흡연자 모두에게서 나타난다. α1-antitrypsin 유전자 외에 COPD 병인과 관계된다고 확인된 다른 유전자는 아직 없지만, COPD 환자들에서 나타나는 기본적인 세포적, 분자적 그리고 유전자적인 비 정상적인 상태에 대한 연구를 통해 질병의 바이오마커(biomarker)를 식별하여 진단에 활용하거나, 새로운 치료방법 발굴에 활용하기 위한 시도가 진행 중이다(P.J. Barnes and R.A. Stockely. Eur Respir J. (2005) 25:1084-1106). 특히 유전자 마이크로어레이(gene microarray)나 프로테오믹스(proteomics) 등의 방법을 통해 COPD의 진단 및 치료 타겟을 선정하는 연구가 활발하게 진행되고 있는데, COPD 민감성(susceptibility)을 갖게 하는 유전인자 분석 및 흡연으로 유발되는 COPD 증상의 악화의 원인에 대한 분석이 주로 이루어지고 있다(Peter J. Castaldi et al. Human Molecular Genetics, 2010, Vol. 19, No. 3 526?534).

섬유증(Fibrosis)의 한 종류인 특발성폐섬유화증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis, 이하 'IPF'라고 함)은 폐포(허파꽈리) 벽에 만성염증 세포들이 침투하면서 폐를 딱딱하게 하는 여러 변화가 발생하면서 폐조직의 심한 구조적 변화를 야기하며 점차 폐기능이 저하되어 결국에는 사망하게 되는 질환으로, 아직까지는 효과적인 치료방법이 없어 대개 증상이 나타나서 진단을 하게 되면 평균 생존기간이 3~5년 정도밖에 안되는 아주 예후가 나쁜 질병이다. 발생빈도는 외국의 경우 인구 10만명 당 약 3-5명 정도로 보고되고 있으며 대개 50대 이후에 발병율이 높고 남자가 여자보다 2배 가량 발병율이 높은 것으로 알려져 있다.

IPF의 발병원인은 아직 명확하게 규명되지는 않았는데, 흡연자에서 빈도가 높고, 항우울제, 위-식도역류에 의한 만성적 폐 흡입, 금속분진, 목재분진, 또는 용매제 흡입 등이 IPF의 발생과 연관이 있는 위험인자들로 보고된 바 있으나, 대부분의 환자들에서는 확실한 인과관계가 있는 인자들이 보고된 바 없다. 가장 많이 언급되는 인자로는 어떤 원인이든 Th1/Th2 반응, coagulation cascades 등이 활성화되면, 이들에 의해서 섬유화성 사이토카인 (cytokine)이 분비되고 활성화된 사이토카인은 섬유아세포를 자극하여 ECM(Extracellular Matrix)을 증가시켜 폐 섬유화가 일어난다고 알려져 있다. 물론 이 과정에서 폐의 염증을 동반하게 되고 이로 인하여 폐의 섬유화를 일으킬 수 있지만, 최근에는 폐의 염증과 관계없이 직접적으로 폐 섬유화를 일으킬 수 있다는 의견이 더 지배적이다. 최근의 가설은 Epithelial-mesenchymal interaction (상피-중간엽 세포 상호관계)의 비정상적인 신호전달 체계로 인하여 상처 치유 과정에서 병리적인 폐 섬유화가 일어난다는 것이다. 상피세포가 손상을 입으면 상피세포의 apoptosis가 증가하고 이동이 제한되며 분화 조절이 되지 않고 증식이 억제되어 soluble factors (TGF, HGF, KGF, angiotensin II, ROS 등)가 분비되고 ECM과 함께 중간엽세포의 apoptosis가 억제되어 근섬유아세포의 분화 증가, ECM 침착에 관하여 폐 섬유화를 유발하거나 혹은 상피세포를 다시 자극하게 된다. 즉, 폐의 염증이 폐섬유화를 직접적으로 일으킨다고는 할 수 없으며 다만 먼저 폐의 염증이 선행되고 이어 정상 조직으로 치유되는 과정에서 IPF 환자와 정상인의 차이에 의해 폐 섬유화가 일어남을 의미한다. 또한, IPF는 Th1/Th2 사이토카인의 부조화에 의해 유발될 수 있는데, Th1 사이토카인 반응은 세포 매개성 면역에 관계하는 것으로 조직회복에 관한 손상부위를 정상적으로 회복시켜주는 반면 Th2 사이토카인은 섬유아세포의 활성화와 증식을 통해 ECM의 침착 및 섬유화를 유발한다. bleomycin을 이용한 폐섬유화 모델에서 IFN-γ를 투여하면 TGF-β와 procollagen의 mRNA를 감소시켜 폐 섬유화를 막을 수 있다는 보고가 있으나, 병인에 대해 정확히 알려져 있지 않아 추후 섬유화를 일으키는 초기의 원인 인자를 규명하여 IPF와 관련된 유전자 및 TGF-β신호전달체계를 억제할 수 있는 물질 개발 등이 필요하다.

IPF는 치료를 하지 않았을 때 계속적으로 악화되어 환자의 약 50% 이상이 3-5년 내에 사망한다고 알려져 있고, 또 일단 병이 진행되어 완전히 섬유화로 굳어진 다음에는 어떤 치료를 하더라도 호전이 되지 않기 때문에 치료를 한다면 조기에 치료할 경우에 효과가 있을 가능성이 높을 것으로 예측하고 있다. 현재 사용되고 있는 치료제로는 스테로이드(steroid)와 아자티오프린(azathioprine), 또는 사이클로포스마이드(cyclophosphamide)의 병합요법을 사용하는 방법이 알려져는 있지만, 특별한 효과를 보인다고 보기는 어려우며, 여러 가지 섬유화 억제제들이 동물실험 및 소규모의 환자들에서 시도되었으나 뚜렷한 효과가 입증된 것이 없는 상태이다. 특히, 말기 IPF 환자에서는 폐이식 외에 다른 효과적인 치료 방법이 없는 실정이다. 따라서, 보다 효율적인 IPF의 치료제 개발이 절실한 상황이다.

섬유증(Fibrosis)은 어떠한 이유로 인해 조직이나 장기가 결합조직의 과잉 섬유화로 인하여 단단하게 굳게 되는 병증을 통칭하는데, 섬유화가 일어나는 모든 과정은 부위를 막론하고 흉터가 치료되는 과정과 동일한 경로로 이루어진다. 섬유화 증세는 현재까지 완치 방법이 거의 없으며, 치료방법이 개발 및 연구 중이다. 효과적인 섬유화 치료제는 대표적인 섬유증인 간경변(cirrhosis), 간 섬유증(liver fibrosis), 골수섬유증(myelofibrosis), 심근섬유증(myocardial fibrosis), 신장 섬유증(renal fibrosis), 폐섬유증 (pulmonary fibrosis) 뿐만 아니라 섬유증이 동반되는 다양한 질병에 적용이 가능하므로 효율적인 섬유증의 치료제 개발이 절실한 상황이다.

CTGF(connective tissue growth factor; CCN2)는 CCN family에 속한 matricellular 단백질 중 하나로, 세포 결합(cell adhesion), 이동(migration), 증식(proliferation), 혈관형성(angiogenesis), 상처 회복(wound repair) 등의 다양한 생물학적 과정(biological processes)에 관여하는 것으로 알려진 분비 사이토카인으로, CTGF의 과발현은 공피증(scleroderma), 섬유증(fibrotic disease) 및 흉터형성과 같은 증상의 주요 원인으로 여겨진다(Brigstock DR. J Cell Commun Signal (2010) 4 (1): 1-4). 특히 섬유증과 관련하여 CTGF는 TGF-β growth factor-β와 함께 만성 섬유증(sustained fibrosis)를 유발하거나 섬유 형성을 유발하는 조건에서 ECM(extracelluar matrix) 생산을 촉진시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 근래에 CTGF의 발현을 저해하거나, 작용을 억제하는 시료나 물질을 처리함으로써 비 정상적인 CTGF의 발현으로 인한 시각장애(ocular disorders)나 근위축증(Muscular Dystrophy)을 치료할 수 있다고 알려져 있다 (미국 등록특허 제7622454호, 미국 공개특허 제20120164151호).

상기 살핀 바와 같이 아직까지 CTGF에 대한 RNAi 치료제 및 이의 전달기술에 대한 기술개발은 미미한 상황으로, 특이적이고 고효율로 CTGF 발현을 저해할 수 있는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 치료제 및 이의 전달기술에 대한 시장의 수요는 매우 높은 상황이다.

이에 본 발명자들은 COPD를 비롯한 호흡기질환 및 IPF를 비롯한 섬유화증과 관련된 유전자로 CTGF를 선정하였고, CTGF를 표적으로 하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 선별하여 CTGF 발현을 저해할 수 있는 RNAi 치료제 및 그 전달체를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

미국 등록특허 제7622454호 미국 공개특허 제20120164151호

Jessica, C., J Postdoc Res, 4:35-50, 2016 Barik, S., J Mol. Med. (2005) 83: 764-773 MA Behlke, MOLECULAR THERAPY. 2006 13(4):664-670 FY Xie, Drug Discov. Today. 2006 Jan; 11(1-2):67-73 Akhtar S, J Clin Invest. 2007 December 3; 117(12): 3623-3632 J Soutschek, Nature 11; 432(7014):173-8, 2004 Francesco M. VDRUG DISCOVERY TODAY(2005) 10(21):1451-1458 Peter J. Castaldi et al. Human Molecular Genetics, 2010, Vol. 19, No. 3 526-534 Brigstock DR. J Cell Commun Signal (2010) 4 (1): 1-4

본 발명의 목적은 CTGF의 발현을 매우 특이적이고 높은 효율로 저해할 수 있는 이중가닥 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 RNA/RNA, DNA/DNA, 또는 DNA/RNA hybrid 형태, 가장 바람직하게는 DNA/RNA hybrid 형태의 서열을 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 및 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 및/또는 상기 나노입자를 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환 및 섬유증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 및/또는 상기 나노입자를 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 이중가닥 올리고뉴클레오티드, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 및 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자의 용도를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 상기 약학적 조성물의 용도를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료를 위한 약물의 제조를 위한 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 및 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자의 용도를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 16으로 구성된 군, 바람직하게는 서열번호 1, 2, 10 및 15로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열, 더욱 바람직하게는 서열번호 10으로 표시되는 서열을 포함하는 센스 가닥(sense strand)과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥(anti-sense strand)을 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 및; 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 16로 구성된 군, 바람직하게는 서열번호 1, 2, 10 및 15로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열, 더욱 바람직하게는 서열번호 10으로 표시되는 서열을 포함하는 센스 가닥(sense strand)과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥(anti-sense strand)을 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체, 및/또는 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자를 포함하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 및/또는 상기 나노입자를 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명에 따른 서열번호 1 내지 16로 구성된 군, 바람직하게는 서열번호 1, 2, 10 및 15로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열, 더욱 바람직하게는 서열번호 10으로 표시되는 서열을 포함하는 센스 가닥(sense strand)과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥(anti-sense strand)을 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체, 그리고 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자 각각은 CTGF의 발현을 매우 효율적으로 저해할 수 있으므로, 본 발명에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 및 상기 나노입자는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 제공되는 바람직한 이중가닥 올리고뉴클레오티드에 포함되는 서열번호 1, 2, 10 및 15의 서열은 다음과 같다

5'-ATGTACAGTTATCTAAGTT-3' (서열번호 1)

5'-TGTACAGTTATCTAAGTTA-3' (서열번호 2)

5'-TGATTTCAGTAGCACAAGT-3' (서열번호 10)

5'-TCAGTAGCACAAGTTATTT-3' (서열번호 15)

본 발명에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드는 일반적인 RNAi(RNA interference) 작용을 가지는 모든 물질을 포함하는 개념으로, 상기 CTGF 단백질을 인코딩하는 mRNA 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드에는 CTGF 특이적 shRNA 등도 포함되는 것임은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다. 즉, 상기 올리고뉴클레오티드는 siRNA, shRNA 또는 miRNA인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한 CTGF에 대한 특이성이 유지되는 한, 상기 서열번호 1, 2, 10 및 15로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥 또는 이에 상보적인 안티센스 가닥에서, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 또는 삽입된 서열을 포함하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 CTGF 특이적 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드도 본 발명의 권리범위에 포함되는 것임은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 센스 또는 안티센스 가닥은 독립적으로 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 할 수 있으며, 또한 센스 가닥은 DNA, 안티센스 가닥은 RNA이거나, 센스 가닥은 RNA, 안티센스 가닥은 DNA인 하이브리드(hybrid) 형태가 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1, 2, 10 및 15는 DNA 형태로 기재되어 있지만, RNA 형태가 사용될 경우, 서열번호 1, 2, 10 및 15의 서열은 이와 대응되는 RNA 서열, 즉 T가 U로 변경된 서열이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드는 CTGF에 대한 특이성이 유지되는 한, 서열의 센스 가닥이 CTGF 유전자의 결합부위와 100% 상보적인 염기서열인 경우, 즉 완전 일치(perfect match)하는 것뿐만 아니라, 일부 염기서열이 일치하지 않는 경우, 즉 불완전 일치(mismatch)가 있는 것도 포함한다.

본 발명에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 양쪽 가닥의 3' 말단에 하나 또는 그 이상의 비결합된(unpaired) 뉴클레오티드를 포함하는 구조인 오버행(overhang)을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 바람직하게는 19 내지 31개의 뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 서열번호 1, 2, 10 및 15로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드는 CTGF(connective tissue growth factor)에 특이적인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 생체 내 안정성 향상을 위해, 또는 핵산 분해효소 저항성 부여 및 비특이적 면역반응 감소를 위해, 다양한 화학적 변형(chemical modification)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 화학적 변형은 뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조의 2' 탄소 위치에서 수산화기(-OH)가 메틸기(-CH₃), 메톡시기(-OCH₃), 아민기(-NH₂), 불소(-F), O-2-메톡시에틸기, O-프로필기, O-2-메틸티오에틸기, O-3-아미노프로필기, O-3-디메틸아미노프로필기, O-N-메틸아세트아미도기 및 O-디메틸아미도옥시에틸로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나로 치환되는 변형; 뉴클레오티드 내 당 구조의 산소가 황으로 치환되는 변형; 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합, 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합 및 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 결합이 되는 변형; 및 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 및 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형; DNA-RNA hybrid 형태로의 변형;으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나(Ann. Rev. Med. 55, 61-65 2004; US 5,660,985; US 5,958,691; US 6,531,584; US 5,808,023; US 6,326,358; US 6,175,001; Bioorg . Med . Chem . Lett . 14:1139-1143, 2003; RNA, 9:1034-1048, 2003; Nucleic Acid Res. 31:589-595, 2003; Nucleic Acids Research, 38(17) 5761-773, 2010; Nucleic Acids Research, 39(5):1823-1832, 2011), 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 이중가닥 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥의 5' 말단에 하나 이상의 인산기(Phosphate group)가 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 3개의 인산기가 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 하기 구조식 (1)의 구조를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체에 관한 것으로, 하기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.

A-X-R-Y-B 구조식 (1)

하나의 바람직한 구체예로서, 본 발명에 따른 CTGF 특이적 서열을 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체는 구조식 (1)과 같은 구조를 가지는 것이 바람직하다.

A-X-R-Y-B 구조식 (1)

상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.

본 발명에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드의 형태로는 DNA-RNA hybrid, siRNA(short interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 miRNA(microRNA) 등이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, miRNA에 대한 길항제(antagonist) 역할을 할 수 있는 단일가닥의 miRNA 저해제도 포함되는 것이다.

이하, 본 발명에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드는 RNA를 중심으로 설명되나, 본 발명의 이중가닥 올리고뉴클레오티드와 동일한 특성을 가지는 다른 이중가닥 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, DNA/RNA 하이브리드)에도 적용될 수 있다는 것은 당업계의 통상의 기술자에게 있어서 자명한 것이다.

보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체는 하기 구조식 (2)의 구조를 가진다.

A-X-S-Y-B

AS 구조식 (2)

상기 구조식 (2)에서 A, B, X 및 Y는 상기 구조식 (1)에서의 정의와 동일하며, S는 CTGF 특이적 뉴클레오티드 서열의 센스 가닥, AS는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥을 의미한다.

보다 바람직하게는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체는 하기 구조식 (3) 또는 (4)의 구조를 가진다.

상기 구조식 (3) 및 구조식 (4)에서 A, B, S, AS, X 및 Y는 상기 구조식 (2)에서의 정의와 동일하며, 5' 및 3' 은 CTGF 특이적 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 센스 가닥의 5' 말단 및 3' 말단을 의미한다 .

상기 친수성 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐피롤리돈 및 폴리옥사 졸린로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

상기, 구조식 (1) 내지 구조식 (4)에서의 상기 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체는 안티센스 가닥의 5´말단에 인산기(phosphate group)가 한 개 내지 세 개 결합될 수 있으며, RNA 대신에 shRNA가 사용될 수도 있음은 본 발명의 속하는 기술분야에서 통상의 지 식을 가진 자에게는 자명한 것이다.

상기 구조식 (1) 내지 구조식 (4)에서의 친수성 물질은 분자량이 200 내지 10,000 인 고분자 물질인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게 는 1,000 내지 2,000인 고분자 물질이다. 예를 들어, 친수성 고분자 물질로는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥사졸린 등의 비이온성 친수성 고분자 화합물을 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

특히, 구조식 (1) 내지 구조식 (4)에서의 친수성 물질(A)은 하기 구조식 (5) 또는 구조식 (6)과 같은 형태의 친수성 물질 블록(block) 형태로 이용될 수 있는데, 이러한 친수성 물질 블록을 필요에 따라 적절한 개수(구조식 (5) 또는 구조식(6)에서의 n)를 사용함으로써 일반 합성 고분자 물질 등을 사용하는 경우에 발생할 수 있는 다분산성으로 인 한 문제점을 크게 개선할 수 있다.

(A'_m-J)_n 구조식 (5)

(J-A' _m)_n 구조식 (6)

상기 구조식 (5)에서 A'은 친수성 물질 단량체(monom er), J는 m개의 친수성 물질 단량체 간 또는 m개의 친수성 물질 단량체와 올리고뉴클레오티드를 서로 연결하는 링커, m은 1 내지 15의 정 수, n은 1 내지 10의 정수를 의미하며, (A'_m-J) 또는 (J-A'_m)로 표시되는 반복단위가 친수성 물질 블록의 기본단위에 해당된다.

상기 구조식 (5) 또는 구조식 (6)과 같은 친수성 물질 블록을 가질 경우, 본 발명에 따른 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체는 하기 구조식 (7) 또는 구조식 (8)과 같은 구조를 가질 수 있다.

(A'_m-J)_n-X-R-Y-B 구조식 (7)

(J-A'_m)_n-X-R-Y-B 구조식 (8)

상기 구조식 (7) 및 구조식 (8)에서, X, R, Y 및 B는 구조식 (1)에서의 정의와 동일하고, A', J. m 및 n은 구조식 (5) 및 구조식 (6)에서의 정의와 동일하다.

상기 구조식 (5) 및 구조식 (6)에서 친수성 물질 단량체(A')는 비이온성 친 수성 고분자의 단량체 중에서 본 발명의 목적에 부합하는 것이라면 제한없이 사용이 가능하며, 바람직하게는 표 1에 기재된 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에서 선택된 단량체, 더욱 바람직하게는 화합물(1)의 단량체가 사용될 수 있으며, 화합물 (1)에서 G는 바람직하게는 O, S 및 NH에서 선택될 수 있다.

특히, 친수성 물질 단량체 중에서도 특히 화합물 (1)로 표시되는 단량체는 다양한 기능기를 도입할 수 있으며, 생체 내 친화성이 좋고 면역반응을 적게 유도하는 등 생체 적합성(bio-compatibility)이 우수할 뿐 아니라, 구조식 (7) 또는 구조식 (8 )에 따른 구조체 내에 포함된 이중가닥 올리고뉴클레오티드의 생체 내 안정성을 증가시키고, 전달 효율을 증가시킬 수 있다는 장점을 가지고 있어 본 발명에 따른 구조체의 제조에 매우 적합하다.

본 발명에서의 친수성 물질 단량체 구조

화합물 (1)	화합물 (2)	화합물 (3)
G는 O, S 또는 NH

상기 구조식 (5) 내지 구조식 (8)에서의 친수성 물질은 총 분자량이 1,000 내지 2,000에 범위 내인 것이 특히 바람직하다. 따라서, 예를 들어, 구조식 (7) 및 구조식 (8)에서 화합물 (1)에 따른 헥사에틸렌 글리콜(Hexaethylene glycol), 즉 G가 O이고, m이 6인 물질이 사용되는 경우 헥사에틸렌글리콜 스페이서(spacer)의 분자량이 344이므로, 반복 횟수(n)는 3 내지 5인 것이 바람직하다. 특히, 본 발명은 필요에 따라 상기 구조식 (5) 및 구조식 (6)에서 (A'_m-J)_n으로 또는 (J-A'_m)_n 표시되는 친수성 그룹의 반복단위, 즉 친수성 물질 블록(block)이 n으로 표시되는 적절한 개수로 사용될 수 있음을 특징으로 한다. 상기 각 친수성 물질 블록 내에 포함되는 친수성 물질 단량체인 A와 링커인 J은 독립적으로 각 친수성 물질 블록간에 동일할 수도 있고, 상이할 수도 있다. 즉, 친수성 물질 블록이 3개 사용될 경우(n=3), 첫 번째 블록에는 화합물 (1)에 따른 친수성 물질 단량체가, 두 번째 블록에는 화합물 (2)에 따른 친수성 물질 단량체가, 세 번째 블록에는 화합물 (3)에 따른 친수성 물질 단량체가 사용되는 등, 모든 친수성 물질 블록별로 다른 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있고, 모든 친수성 물질 블록에 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에 따른 친수성 물질 단량체에서 선택된 어느 하나의 친수성 물질 단량체가 동일하게 사용될 수도 있다. 마찬가지로, 친수성 물질 단량체의 결합을 매개하는 링커 역시 각 친수성 물질 블록별로 모두 동일한 링커가 사용될 수도 있고, 각 친수성 물질 블록 별로 상이한 링커가 사용될 수도 있다. 또한, 친수성 물질 단량체의 개수인 m 역시 각 친수성 물질 블록간에 동일할 수도 있고, 상이할 수도 있다. 즉, 첫 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 3개 연결(m=3)되고, 두 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 5개(m=5), 세 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 4개 연결(m=4)되는 등, 서로 다른 개수의 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있고, 모든 친수성 물질 블록에서 동일한 개수의 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있다.

또한, 본 발명에서 상기 링커(J)는 -PO₃ ^--, - SO₃-및 -CO₂-로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 사용되는 친수성 물질의 단량체 등에 따라 본 발명의 목적에 부합하는 한 어떠한 링커라도 사용될 수 있음 은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.

상기 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8) 에서의 소수성 물질(B)은 소수성 상호작용을 통해 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8)에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체로 구성된 나노입자를 형성하는 역할을 수행한다. 상기 소수성 물질은 분자량이 250 내지 1,000인 것이 바람직하며, 스테로이드(steroid) 유도체, 글리세라이드(glyceride) 유도체, 글리세롤 에테르(glycerol ether), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), C₁₂ 내지 C₅₀ 의 불포화 또는 포화 탄화수소(hydrocarbon), 디아실포스파티딜콜린 (diacylphosphatidylcholine), 지방산(fatty acid), 인지질(phospholipid), 리포폴 리아민(lipopolyamine) 등이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발 명의 목적에 부합하는 것이라면 어떠한 소수성 물질도 사용 가능하다는 점은 본 발 명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.

상기 스테로이드(steroid) 유도 체는 콜레스테롤, 콜레스탄올, 콜산, 콜리스테릴 포르메이트, 코테스타닐 포르메이트 및 콜리스타닐아민으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 상기 글리세라이드 유도체는 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드 등에서 선택될 수 있는데 이때, 글리세라이드의 지방산은 C₁₂ 내지 C₅₀의 불포화 또는 포화 지방산이 바람직하다.

특히, 상기 소수성 물질 중에서도 포화 또는 불포화 탄화수소나 콜레스테롤이 본 발명에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체의 합성 단계에서 용이하게 결합 시킬 수 있는 장점을 가지고 있다는 점에서 바람직하며, C₂₄ 탄화수소, 특히 disulfide bond를 포함하는 형태가 가장 바람직하다.

상기 소수성 물질은 친수성 물질의 반대쪽 말단(distal end)에 결합되며, siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 어느 위치에 결합되어도 무방하다.

본 발명에 따른 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조 식 (8)에서의 친수성 물질 또는 소수성 물질과 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드는 단순 공유 결합 또는 링커가 매개된 공유결합(X 또는 Y)에 의해 결합된다. 상기 공유결합을 매개하는 링커는 친수성 물질, 또는 소수성 물질과 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드의 말단에서 공유결합하며, 필요에 따라 특정 환경에서 분해가 가능한 결합을 제공하는 한 특별히 한정되는 것은 아니다. 따라서, 상기 링커는 본 발명에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체의 제조과정에서 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 및/또는 친수성 물질(또는 소수성 물질)을 활성화하기 위해 결합시키는 어떠한 화합물도 사용될 수 있다. 상기 공유 결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합 중 어느 것이어도 무방하다. 이때, 비분해성 결합으로는 아미드 결합 또는 인산화 결합이 있고, 분해성 결합으로는 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한 상기 구조식(1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8)에서의 R(또는 S 및 AS)로 표시되는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드는 CTGF의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 특성을 지니는 이중가닥 올리고뉴클레오티드라면 모두 제한없이 사용 가능하며, 바람직하게는 본 발명에서는 서열번호 1, 2, 10 및 15번에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥과 그에 상보적 서열을 포함하는 안티센스 가닥으로 구성된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체에 있어서, 상기 구조체 내의 친수성 물질의 올리고뉴클레오티드와 결합된 반대편 말단 부위에 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 추가적으로 도입될 수 있다.

이는 본 발명에 따른 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체의 전달체의 세포내 도입과 엔도좀 탈출을 용이하게 하기 위한 것으로, 이미 Quantum dot, Dendrimer, liposome 등의 전달체의 세포내 도입과 엔도좀 탈출을 용이하게 하기 위해서 아민 그룹의 도입과 폴리히스티딘 그룹이 이용할 수 있다는 점 및 그 효과가 보고된 바 있다.

구체적으로 전달체의 말단 혹은 바깥쪽에 수식된 일차 아민기는 생체 내 pH에서 양성자화되면서 음전하를 띠는 유전자와 정전기적 상호작용에 의해 결합체를 형성하며, 세포내 유입 후에 엔도좀의 낮은 pH에서 완충 효과를 갖는 내부 삼차 아 민으로 인해 엔도좀의 탈출이 용이해짐에 따라 라이소좀의 분해로부터 전달체를 보호할 수 있다고 알려져 있고(고분자 기반 하이브리드 물질을 이용한 유전자 전달 및 발현 억제. Polymer Sci . Technol., Vol. 23, No.3, pp254-259),

비필수 아미노산의 하나인 히스티딘은 잔기(-R)에 이미다졸링(pKa3 6.04)을 가지므로 엔도좀과 라이소좀에서 완충능력(buffering capacity)을 증가시키는 효과가 있어, 리포좀을 비롯한 비바이러스성 유전자전달체(non-viral gene carrier)들에서 엔도좀 탈출효율을 높이기 위해서 히스티딘 수식을 이용될 수 있다는 점이 알려져 있다 (Novel histidine-conjugated galactosylated cationic liposomes for efficient hepatocyte selective gene transfer in human hepatoma HepG2 cells. J. Controlled Release 118, pp262-270).

상기 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹은 하나 이상의 링커를 통해 친수성 물질 또는 친수성 물질 블록과 연결될 수 있다.

본 발명의 구조식 (1)에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체의 친수성 물질에 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 도입되는 경우에는 구조식 (9)와 같은 구조를 가질 수 있다.

P-J₁-J₂-A-X-R-Y-B 구조식 (9)

상기 구조식 (9)에서 A, B, R, X 는 Y 구조식 (1)에서의 정의와 동일하고,

P는 아민기 또는 폴리히스티딘 그룹을 의미하며, J₁과 J₂는 링커로서, J₁은 및 J₂는 독립적으로 단순 공유결합, PO₃ ^-, SO₃, CO ₂, C_2-12 알킬, 알케닐, 알키닐에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 사용되는 친수성 물질에 따라 본 발명의 목적에 부합하는 J₁과 J₂는 어떠한 링커라도 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.

바람직하게는 아민기가 도입된 경우 에는, J₂는 단순 공유결합 또는 PO₃ ^-, J₁은 C₆ 알킬인 것이 바람직하지만, 이에 한정되지는 않는다.

또한, 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 도입된 경우에는 구조식 (9)에서는 J₂는 단순 공유결합 또는 PO₃ ^-, J₁은 화합물 (4)가 바람직하지만, 이에 한정되지는 않는다.

화합물 (4)

또한, 구조식 (9)에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체의 친수성 물질이 구조식 (5) 또는 구조식 (6)에 따른 친수성 물질 블록이고, 이에 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 도입되는 경우에는 구조식 (10) 또는 구조식 (11)과 같은 구조를 가질 수 있다.

P-J₁-J₂- (A'_m-J)_n -X-R-Y-B 구조식 (10)

P-J₁-J₂- (J-A'_m)_n -X-R-Y-B 구조식 (11)

상기 구조식 (10) 및 구조식 (11)에서, X, R, Y, B, A', J, m 및 n은 구조식 (5) 또는 구조식 (6)에서의 정의와 동일하며, P, J₁및 J₂는 구조식 (9)에서의 정의와 동일하다.

특히, 상기 구조식 (10) 및 구조식 (11)에 있어서, 친수성 물질은 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 센스 가닥의 3' 말단에 결합된 형태인 것이 바람직하며, 이 경우 상기 구조식 (9) 내지 구조식 (11)은 다음 구조식 (12) 내지 구조식 (14)의 형태를 가질 수 있다.

구조식 (12)

구조식 (13)

구조식 (14)

상기 구조식 (12) 내지 구조식 (14)에서 X, R, Y, B, A, A' J, m, n. P, J₁및 J₂는 상기 구조식 (9) 내지 구조식 (11)에서의 정의와 동일하며, 5' 및 3' 은 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 센스 가닥의 5' 말단 및 3' 말단을 의미한다.

본 발명에서 도입될 수 있는 아민기로는 1차 내지 3차 아민기가 사용될 수 있으며, 1차 아민기가 사용되는 것이 특히 바람직하다. 상기 도입된 아민기는 아민 염으로 존재할 수도 있는데, 예를 들어 1차 아민기의 염은 NH₃ ⁺ 의 형태로 존재 할 수 있다.

또한, 본 발명에서 도입될 수 있는 폴리히스티딘 그룹은 3 내지 10개의 히스티딘을 포함하는 것이 바람직하며, 특히 바람직하게는 5 내지 8개, 가장 바람직하게는 6개의 히스티딘을 포함할 수 있다. 추가적으로 히스티딘 이외에 하나 이상의 시스테인이 포함될 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 및 이로부터 형성된 나노입자에 타겟팅 모이어티가 구비된다면, 효율적으로 타겟 세포로의 전달을 촉진하여, 비교적 낮은 농도의 투여량으로도 타겟 세포로 전달되어 높은 타겟 유전자 발현 조절 기능을 나타낼 수 있으며, 타 장기 및 세포로의 비특이적인 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드의 전달을 방지할 수 있다.

이에 따라 본 발명은 상기 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8)에 따른 구조체에 리간드(L), 특히 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드(ligand)가 추가적으로 결합된 이중가닥 올리고 RNA, 구조체를 제공하며, 예를 들어 구조식 (1)에 따른 이중가닥 올리고 RNA 구조체에 리간드가 결합된 형태는 하기 구조식 (15)과 같은 구조를 가진다.

(L_i -Z)-A-X-R-Y-B 구조식 (15)

상기 구조식 (15)에서, A, B, X 및 Y는 상기 구조식 (1)에서의 정의와 동일하며, L은 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드를 의미하며, i는 1 내지 5의 정수, 바람직하게는 1 내지 3의 정수이다.

상기 구조식 (15)에서의 리간드는 바람직하게는 타겟 세포 특이적으로 세포 내재화 (internalization)을 증진시키는 RME 특성을 가진 타겟 수용체 특이적 항체나 앱타머, 펩타이드; 또는 엽산(Folate, 일반적으로 folate와 folic acid는 서로 교차 사용되고 있으며, 본 발명에서의 엽산은 자연 상태 또는 인체에서 활성화 상 태인 folate를 의미한다), N-아세틸 갈락토사민(N-acetyl Galactosamine, NAG) 등 의 헥소아민(hexoamine), 포도당(glucose), 만노스(mannose)를 비롯한 당이나 탄수화물(carbohydrate) 등의 화학물질 등에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 구조식 (15)에서의 친수성 물질 A는 구조식 (5) 및 구조식 (6)에 따른 친수성 물질 블록의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 제조하는 과정은 예를 들어,

(1) 고형지지체(solid support)를 기반으로 친수성 물질을 결합시키는 단계;

(2) 상기 친수성 물질이 결합된 고형지지체를 기반으로 올리고뉴클레오티드 단일가닥을 합성하는 단계;

(3) 상기 올리고뉴클레오티드 단일가닥 5´말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;

(4) 상기 올리고뉴클레오디트 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 올리고뉴클레오티드 단일가닥을 합성하는 단계;

(5) 합성이 완료되면 고형지지체로부터 올리고뉴클레오티드 -고분자 구조체 및 올리고뉴클레오티드 단일 가닥을 분리 정제하는 단계;

(6) 제조된 올리고뉴클레오티드 -고분자 구조체와 상보적인 서열의 올리고뉴클레오티드 단일가닥의 어닐링을 통해 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 제조하는 단계; 를 포함하여 이루어질 수 있다.

본 발명에서의 고형지지체(solid support)는 Controlled Pore Glass(CPG)가 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 폴리스티렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 실리카겔, 셀룰로오스 페이퍼 등이 사용될 수 있다. CPG인 경우 직경은 40~180 ㎛인 것이 바람직하며, 500~3000Å의 공극 크기를 가지는 것이 바람직하다. 상기 단계 (5) 이후, 제조가 완료되면 정제된 RNA-고분자 구조체 및 올리고뉴클레오티드 단일가닥은 MALDI-TOF 질량분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 올리고뉴클레오티드-고분자 구조체 및 올리고뉴클레오티드 단일가닥이 제조되었는지를 확인할 수 있다. 상기 제조방법에 있어서 (2) 단계에서 합성된 올리고뉴클레오티드 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 올리고뉴클레오티드 단일가닥을 합성하는 단계 (4)는 (1) 단계 이전 또는 (1) 단계 내지 (5) 단계 중 어느 한 과정 중에 수행되어도 무방하다.

또한, (2) 단계에서 합성된 올리고뉴클레오티드 단일가닥과 상보적 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 단일가닥은 5´말단에 인산기가 결합된 형태로 이용 된 것을 특징으로 하는 제조방법도 될 수 있다.

한편, 본 발명의 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체에 추가적으로 리간드가 결합된 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체의 제조방법을 제공한다.

리간드가 결합된 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 제조하는 방법은 예를 들어,

(1) 기능기가 결합되어 있는 고형지지체에 친수성 물질을 결합시키는 단계;

(2) 기능기-친수성 물질이 결합되어 있는 고형지지체를 기반으로 올리고뉴클레오티드 단일가닥을 합성하는 단계;

(3) 상기 올리고뉴클레오티드 단일가닥의 5´말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 과정으로 합성하는 단계;

(4) 상기 올리고뉴클레오티드 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 올 리고뉴클레오티드 단일 가닥을 합성하는 단계;

(5) 합성이 완료되면 고형지지체로부터 기능기- 올리고뉴클레오티드 -고분자 구조체 및 상보적인 서열의 올리고뉴클레오티드 단일가닥을 분리하는 단계;

(6) 상기 기능기를 이용하여 친수성 물질 말단에 리간드를 결합하여 리간드- 올리고뉴클레오티드 -고분자 구조체 단일가닥을 제조하는 단계;

(7) 제조된 리간드- 올리고뉴클레오티드 -고분자 구조체와 상보적인 서열의 올리고뉴클레오티드 단일가닥의 어닐링의 통해 리간드 -이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 제조하는 단계;

를 포함하여 이루어질 수 있다.

상기 (6) 단계 이후, 제조가 완료되면 리간드- 올리고뉴클레오티드 -고 분자 구조체 및 상보적인 서열의 올리고뉴클레오티드 단일가닥을 분리 정제한 뒤 MALDI-TOF 질량 분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 리간드 - 올리고뉴클레오티드 -고분자 구조체 및 상보적인 올리고뉴클레오티드가 제조되었는지를 확인할 수 있다. 제조된 리간드- 올리고뉴클레오티드 -고분자 구조체와 상보적인 서열의 올리고뉴클레오티드 단일가닥의 어닐링을 통해 리간드- 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 제조할 수 있다. 상기 제조방법에 있어서 (3) 단계에서 합성된 올리고뉴클레오티드 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 올리고뉴클레오티드 단일가닥을 합성하는 단계 (4)는 독립적인 합성과정으로서 (1) 단계 이전 또는 (1) 단계 내지 (6) 단계 중 어느 한 과정 중에 수행되어도 무방하다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 이중가닥 올리 고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자에 관한 것이다. 본 발명에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체의 경우, 소수성 물질의 소수성 상호작용에 의하여 자기조립 나노입자를 형성하게 되는데 (대한민국 등록특허공보 제1224828호), 이러한 나노입자는 체내로의 전달효율 및 체내에서의 안정성이 극히 우수할 뿐만 아니라, 입자 크기의 균일성이 우수하여 QC(Quality Control)가 용이하므로 약물로서의 제조 공정이 간단하다.

본 발명에서, 상기 나노입자는 서로 다른 서열을 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체가 혼합되어 구성되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 예를 들어, 상기 나노입자는 서열번호 1, 2, 10 및 15에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 한 종류의 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으나, 또 다른 양태로서, 서열번호 1, 2, 10 및 15에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 서로 다른 종류의 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 함께 포함할 수 있으며, 본 발명에서 개시되지 않은 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 함께 포함할 수도 있을 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, 본 발명에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드, 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 또는 나노입자를 유효성분으로 함유하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물은 결합조직 재형성(tissue remodeling) 특히, 허파동맥 재형성(pulmonary artery remodeling) 및 기도 재형성(airway remodeling)을 억제하여 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료에 효과를 나타낸다.

본 발명에 있어서, 호흡기 질환은 만성폐쇄성질환(COPD), 천식, 급만 성기관지염, 알레르기 비염, 진해 거담, 기관지염, 세기관지염, 인후염, 편도염 또는 후두염인 것을 특징으로 할 수 있고, 섬유증은 특발성폐섬유화증(IPF), 간 섬유증(liver fibrosis), 간경변(cirrhosis), 골수섬유증(myelofibrosis), 심근섬유증(myocardial fibrosis), 신장 섬유증(renal fibrosis), 켈로이드(keloid), 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 심장 섬유증(cardiac fibrosis), 방사선 섬유증(radiation-induced fibrosis) 등에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 방사선 섬유증은 암, 종양 등의 치료를 위해 흔히 사용되는 방사선 요법에 의해 빈번하게 유발되는 부작용으로, 방사선 섬유화 증후군(radiation fibrosis syndrom, RFS)과 혼용되어 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물에는 투여를 위하여 상기 기재된 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균 수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 특히, 동결건조(lyophilized)된 형태의 제형으로 제제화하여 제공하는 것이 바람직하다. 동결건조 제형 제조를 위해서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 방법이 사용될 수 있으며, 동결건조를 위한 안정화제가 추가될 수도 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍톤 약학 과학(Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질병에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 조성물은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기 술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화할 수 있으며 단위-투여량 또는 다- 투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비 경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 흡입용, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 특별히 호흡기 질환 치료를 위해 기관지내 점적주입을 통한 폐로의 투여 또한 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 또는 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 임상 투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 본 발명의 조성물을 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 본 발명에 따른 약학조성물을 포함하는 동결건조 된 형태의 제형에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, 본 발명에 따른 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 호흡기 질환은 만성폐쇄성질환(COPD), 천식, 급만성기관지염, 알레르기 비염, 진해 거담, 기관지염, 세기관지염, 인후염, 편도염 또는 후두염인 것을 특징으로 할 수 있고, 섬유증은 특발성폐섬유화증(IPF), 간경변(cirrhosis), 골수섬유증(myelofibrosis), 심근섬유증(myocardial fibrosis), 신장 섬유증(renal fibrosis), 켈로이드(keloid), 폐섬유증 (pulmonary fibrosis), 심장 섬유증(cardiac fibrosis), 간 섬유증(liver fibrosis), 또는 방사선 섬유증(radiation-induced fibrosis)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 및 나노입자의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 관점에서 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 상기 약학적 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 이중가닥 올리고뉴클레오티드, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 및 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 및/또는 상기 나노입자를 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료를 위한 약물의 제조를 위한 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 및 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 또는 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따른 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물 은 부작용 없이 높은 효율로 CTGF의 발현을 억제할 수 있어, 과도한 섬유화로 인한 질병 및 호흡기 질환의 예방 및 치료에 탁월한 효과를 거둘 수 있다.

도 1은 인간 CTGF를 타겟으로 하는 1,162개의 SAMiRNA 스크리닝의 결과이며 실시예 3의 CTGF mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸다.
도 2는 실시예 4의 CTGF mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 서열번호 1, 2, 10, 15의 서열을 각각 센스 가닥으로 가지는 SAMiRNA를 농도를 달리하여(50, 100, 200, 500, 1000nM) 폐암세포주인 A549에 처리하고 CTGF mRNA의 상대적인 발현량(%)을 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 4의 CTGF mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 서열번호 10의 서열을 센스 가닥으로 가지는 SAMiRNA를 농도별로 폐암세포주인 A549에 처리했을 때 CTGF mRNA의 상대적인 발현량(%)을 분석하여 SAMiRNA의 IC₅₀값을 확인한 그래프이다.
도 4는 실시예 4의 CTGF mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 서열번호 10 및 Rxi-109의 서열을 센스 가닥으로 가지는 SAMiRNA를 처리했을 때 CTGF mRNA의 상대적인 발현량(%)을 분석하여 SAMiRNA의 IC₅₀값을 비교 분석한 그래프이다.
도 5는 실시예 5의 CTGF mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸 것으로, 선별된 CTGF 특이적 SAMiRNA를 포함하는 이중가닥 올리고 DNA/RNA hybrid 및 RNA/RNA hybrid에 의한 CTGF mRNA의 상대적인 발현량(%)을 비교한 분석 결과이다. 본 발명의 서열번호 10의 서열을 각각 센스 가닥으로 가지는 SAMiRNA를 농도를 달리하여(200 nM 또는 600 nM) 폐암세포주인 A549에 처리하고, CTGF mRNA의 상대적인 발현량(%)을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 랫드 CTGF를 타겟으로 하는 94개의 SAMiRNA 스크리닝의 결과 및 그 중 선별된 12개 후보 서열의 효과를 나타낸다.
도 7은 실시예 6의 랫드 CTGF mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 서열번호 46, 47, 48의 서열을 포함한 선별된 12개 후보 서열을 각각 센스 가닥으로 가지는 SAMiRNA를 농도를 달리하여(200 또는 500 nM) 랫드 간암세포주인 H4-II-E에 처리하고, ratCTGF mRNA의 상대적인 발현량(%)을 나타낸 그래프이다.
도 8은 실시예 6의 랫드 CTGF mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 서열 번호 46, 47, 48의 서열을 각각 센스 가닥으로 가지는 SAMiRNA를 농도를 달리하여(25, 50, 100, 200, 400, 800nM) 랫드 간암세포주인 H4-II-E에 처리하고, ratCTGF mRNA의 상대적인 발현량(%)을 분석하여 SAMiRNA의 IC₅₀값을 확인한 그래프이다.
도 9는 실시예 6의 ratCTGF mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸 것으로, 선별된 ratCTGF 특이적 SAMiRNA를 포함하는 이중가닥 올리고 DNA/RNA hybrid 및 RNA/RNA hybrid에 의한 ratCTGF mRNA의 상대적인 발현량(%)을 비교한 분석 결과이다. 본 발명의 서열번호 46, 47, 48의 서열을 각각 센스 가닥으로 가지는 SAMiRNA를 농도를 달리하여(200 nM 또는 600 nM) 간암세포주인 H4-II-E에 처리하고, ratCTGF mRNA의 상대적인 발현량(%)을 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 10은 실시예 7의 창상 유발 켈로이드 모델 쥐에 피내 투여법에 의해 SAMiRNA-rCTGF(D/R)#46 및 SAMiRNA-rCTGF(R/R)#46 1200ug으로 투여 후 피부 조직 real-time PCR 분석 결과 및 타겟 유전자 CTGF mRNA의 상대적인 발현량(%)을 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가 진 자에게 있어 자명한 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명에서는 CTGF의 발현을 저해할 수 있는 최종 한 개의 특이적인 서열을 동정하고 이들이 CTGF를 암호화하는 mRNA와 상보적으로 결합하여 CTGF의 발현을 효과적으로 억제함으로써, 섬유증과 호흡기 질환 관련 질환을 효과적으로 치료할 수 있다는 것을 확인하였다.

실시예 1. CTGF를 타겟으로 하는 SAMiRNA 스크리닝을 위한 알고리즘과 후보 서열 선정

SAMiRNA 기초 치료제 고속대량스크리닝(SAMiRNA based drug high-throughput screening)은 mRNA 전체에 대해 1-염기(1-base) 또는 2-염기(2-base) 슬라이딩 윈도우 알고리즘(sliding window algorithm)을 적용하여 가능한 모든 후보 서열을 생성하고 상동성 필터링(homology filtering)을 진행하여 불필요한 후보 서열을 제거 하고 최종적으로 선별된 모든 SAMiRNA에 대해 해당 유전자 발현 저해 정도를 확인하는 방법이다.

우선 CTGF에 대한 SAMiRNA 후보 서열에 대한 디자인 과정은 인간 CTGF mRNA인 NM_001901.2 (2,358bp)에 대해 2-염기 슬라이딩 윈도우 알고리즘(2-base sliding window algorithm)을 적용하여 19개의 염기로 구성된 1,162개의 SAMiRNA 후보 서열을 최종 선별하여 CTGF 저해 정도 실험을 수행하였다.

실시예 2. 이중가닥 올리고 RNA 구조체의 합성

본 발명에서 제조된 이중가닥 올리고 RNA 구조체(SAMiRNA)는 하기 구조식과 같은 구조를 갖는다.

C₂₄-5' S 3'- (헥사에틸렌글리콜-PO₄ ^-)₃-헥사에틸렌글리콜

AS 5'-PO4

monoSAMiRNA(n=4) 이중가닥 올리고 구조체의 센스 가닥은 3,4,6-트리아세틸-1-헥사(에틸렌글리콜)-N-아세틸 갈락토사민-씨피지 (1-Hexa(Ethylene Glycol)- N-Acetyl Galactosamine-CPG를 지지체로 하여, 친수성 물질 단량체인 DMT헥사에틸 렌글리콜 포스포아미다이트(Demethoxytrityl hexaethylene glycol p hosphoramidate) 3개를 상기 반응을 통해 연속하여 결합한 후, RNA 또는 DNA 합성을 진행한 다음, 추가적으로 5' 말단 부위에 소수성 물질인 이황화 결합이 포함되어있는 C₂₄ (C₆-S-S-C₁₈) 을 결합시켜, 3' 말단에 NAG-헥사에틸렌글리콜-(-PO₃ ^-헥사에틸렌글리콜)₃이 결합되어 있고, 5' 말단에 C₂₄ (C₆-S-S-C₁₈) 이 결합되어 있는 monoSAMiRNA(n=4)의 센스 가닥을 만들었다.

합성이 완료되면 60℃의 온탕기(water bath)에서 28 %(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 합성된 RNA 단일가닥 및 올리고(DNA 또는 RNA) -고분자 구조체를 CPG로부터 떼어낸 뒤, 탈보호(deprotection) 반응을 통해 보호 잔기를 제거하였다. 보호 잔기가 제거된 RNA 단일가닥 및 올리고(DNA 또는 RNA)- 고분자 구조체는 70℃의 오븐에서 엔-메틸피롤리돈(N-methylpyrolidon), 트리에틸아민(triethylamine) 및 트리에틸아민트리하이드로플로라이드 (triethylaminetrihydrofluoride)를 부피비 10:3:4의 비율로 처리하여 2´dimethylsilyl)를 제거하였다. 상기 반응물들로부터 고속 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)로 RNA 단일 가닥, 올리고(DNA 또는 RNA)-고분자 구조체 및 리간드가 결합된 올리고(DNA 또는 RNA) -고분자 구조체를 분리하고, 이를 MALDI-TOF 질량 분석기(MALDI TOF-MS, SHIMADZU, 일본)로 분자량을 측정하여, 합성하고자 하는 염기서열 및 올리고-고분자 구조체와 부합하는지 확인하였다. 그 후, 각각의 이중가닥 올리고 구조체를 제조하기 위하여 센스 가닥과 안티센스 가닥을 동량 혼합하여 1X 어닐링 버퍼(30 mM HEPES, 100 mM 칼륨 아세테이트(Potassium acetate), 2 mM 마그네슘 아세테이트(Magnesium acetate), pH 7.0∼에 넣고, 90℃항온수조에서 3분 반응시킨 후 다시 37 ℃에서 반응시켜, 목적하는 SAMiRNA를 제조하였다. 제조된 이중가닥 올리고 RNA 구조체들은 전기영동을 통해 어닐링을 확인하였다.

실시예 3. 인간(Human) CTGF를 타겟으로 하여 RNAi를 유도하는 SAMiRNA 나노입자의 고속대량스크리닝 ( HTS )

3.1 SAMiRNA 나노입자의 제조

실시예 2에서 합성된 CTGF 서열을 타겟으로 하는 1,162종의 SAMiRNA를 1X Dulbe cco's Phosphate Buffered Saline(DPBS)(WELGENE, KR)에 녹여 동결건조기(LGJ-100F, CN)로 5일 동안 동결건조하였다. 동결 건조된 나노입자 파우더를 탈 염 증류수(deionized distilled water (Bioneer, KR)) 1.429 ml에 녹여 균질화하여 본 발명을 위한 실험에 사용하였다.

3.2 SAMiRNA 나노입자의 세포 내 처리 방법

CTGF의 발현을 억제하는 SAMiRNA 발굴을 위하여 인간 유래 유방암 세포주인 MDA-MB231를 이용하였으며, MDA-MB231 세포주는 10% Fetal Bovine Serum (Hyclone, US) 및 1% Penicillin-Streptomycin (Hyclone, US)이 포함된 Gibco™RPMI 1640 배지 (Thermo, US)를 이용하여 37℃5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 위와 동일한 배지를 이용하여 MDA-MB231 세포주를 96-웰 플레이트 (Costar, US)에 2X10⁴ cells/well의 조건으로 분주하고, 다음 날 상기 실시예 3.1에서 탈염 증류수(deionized distilled water)로 균질화한 SAMiRNA를 1X DPBS로 희석하여 세포에 200 nM 또는 600 nM이 되도록 처리하였다. SAMiRNA의 처리는 12시간 마다 1회씩 처리하는 조건으로 총 4회 처리하며 37 ℃5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

3.3 CTGF mRNA 발현 억제효능 분석을 통한 SAMiRNA 스크리닝

실시예 3-2에서 SAMiRNA 처리된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 CTGF 유전자의 mRNA 발현량을 상대 정량 하였다.

CTGF 유전자의 mRNA 발현량 분석을 위하여 AccuPower ^® Dual-HotStart RT-qPCR 키트(Bioneer, Korea)의 각 well에 CTGF forward primer 300 nM, CTGF reverse primer 300 nM, CTGF probe 300 nM, RPL13A forward primer 200 nM, RPL13A reverse primer 200 nM, RPL13A probe 300 nM, TBP forward primer 400 nM, TBP reverse primer 400 nM, TBP probe 300 nM이 추가되어 건조 제조 되었다(표 2). 제조된 키트의 성능은 A549 cell total RNA를 이용 검량곡선을 작성하여 PCR 증폭 효율 (표 3) 로 판정하였다. RT-qPCR은 95 ℃ 10 min, (95 ℃ 5 sec, 58 ℃ 15 sec) x 45 cylcle로 반응을 하고 각 사이클(cycle)마다 형광 값이 검출(detection)되는 프로토콜을 사용하였다.

SAMiRNA 처리된 96-웰 플레이트 (Costar, US)는 전체 RNA 추출부터 RT-qPCR 까지 자동화 장비인 ExiStation HT™Korea)에 HT DNA/RNA 추출 키트(Bioneer, Korea)와 CTGF 유전자의 mRNA 정량 분석을 위한 primer 및 probe를 포함하여 별도로 제조된 AccuPower ^® Dual-HotStart RT-qPCR 키트(Bioneer, Korea)를 사용하여 자동화 프로그램에 따라 전체 RNA 추출 및 one-step RT-qPCR이 수행되었다.

qPCR array 후 도출되는 두 유전자의 Ct값을 2(-Delta Delta C(T)) Method [Livak KJ, Schmittgen TD. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. Dec;25(4):402-8]를 통하여 상대정량 분석으로 대조군 대비 실험군인 CTGF 유전자의 mRNA 상대적인 양(%)을 계산하였다.

고속대량스크리닝 ( HTS ) 실험에 사용된 primer 및 hydrolysis probe 서열

CTGF Forward primer	CACCAGCATGAAGACATACCG(서열번호 33)
CTGF Reverse primer	CGTCAGGGCACTTGAACTC(서열번호 34)
CTGF probe	5'FAM-CCGACGGCCGATGCTGCACCCCC-3'EBQ(서열번호 35)
RPL13A Forward primer	GTGTTTGACGGCATCCCACC(서열번호 36)
RPL13A Reverse primer	TAGGCTTCAGACGCACGACC(서열번호 37)
RPL13A probe	5'TAMRA- AAGCGGATGGTGGTTCCTGCT -3'EBQ(서열번호 38)
TBP Forward primer	CACCACAGCTCTTCCACTC(서열번호 39)
TBP Reverse primer	ATCCCAGAACTCTCCGAAGC(서열번호 40)
TBP probe	5'TEXASRED - ACCCTTGCCGGGCACCACTC - 3'EBQ(서열번호 41)

3- plex RT- qPCR 증폭 효율

Name	Slope	R²	Efficiency
CTGF	Y=-0.3020X+7.6316	0.9966	100%
RPL13A	Y=-0.2977X+7.4425	0.9997	98%
TBP	Y=-0.2958X+10.5934	0.9952	99%

실시예 4. 인간(Human) CTGF를 타겟으로 하여 RNAi를 유도하는 SAMiRNA 나노입자 스크리닝

고효율의 SAMiRNA를 선별하기 위하여 최종 농도 200 nM 또는 600 nM의 농도에서 CTGF mRNA 발현양이 대조군과 대비하여 발현양의 감소 효율이 가장 좋은 서열, 즉 감소 효율이 > 60% 이상인 16종 서열(총 49종 SAMiRNA-hCTGF 에 대한 2차 스크리닝 결과)을 폐암세포주인 A549 세포주에서 500nM, 1000nM 처리하여 수행하였으며, 해당 SAMiRNA의 서열 정보는 하기 표 4와 같다.

이후 Rxi-109 (Sense: 5'-GCACCUUUCUA*G*A-chol-3' (서열번호 57) 13mer / AS: 5'-phosphate-U CUAGAAAGGUGC*A*A*A*C*A*U-3' (서열번호 58) 19mer / 볼드체 = 2'OME / 밑줄 = 2'F / asterisk = phosphorothioate / chol = cholesterol)(WO 2009/102427 참조) 대비 IC50 확인을 위해 저농도까지 처리 후 발현양의 감소 효과(Knock-down) 확인 실험을 진행하기 위하여 가장 강력한 서열 8종에 대한 3차 스크리닝을 폐암세포주인 A549세포주에서 50, 100, 200, 500, 1000nM 처리하여 수행하였다. 그 결과, 서열번호 1, 2, 10, 15의 서열을 각각 센스가닥으로 가지는 SAMiRNA 4종을 선별하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, CTGF를 표적으로 하는 1,162종의 SAMiRNA로부터, CTGF 유전자 발현을 가장 효과적으로 억제하는 SAMiRNA 4종을 최종 선별(도 2)하였다.

2-염기 슬라이딩 윈도우 스크리닝(2 base sliding window screening) 및 고속대량스크리닝(HTS)으로 선별된 CTGF 특이적 SAMiRNA 후보 서열

서열번호	Accession No.	위치	서열 (DNA/RNA)
1	NM_001901.2	1890-1908	Sense	ATGTACAGTTATCTAAGTT
17	NM_001901.2	1890-1908	Antisense	AACUUAGAUAACUGUACAU
2	NM_001901.2	1891-1909	Sense	TGTACAGTTATCTAAGTTA
18	NM_001901.2	1891-1909	Antisense	UAACUUAGAUAACUGUACA
3	NM_001901.2	1982-2000	Sense	GTACAGTTATCTAAGTTAA
19	NM_001901.2	1982-2000	Antisense	UUAACUUAGAUAACUGUAC
4	NM_001901.2	2042-2060	Sense	ATGGAAATTCTGCTCAGAT
20	NM_001901.2	2042-2060	Antisense	AUCUGAGCAGAAUUUCCAU
5	NM_001901.2	2043-2061	Sense	TGGAAATTCTGCTCAGATA
21	NM_001901.2	2043-2061	Antisense	UAUCUGAGCAGAAUUUCCA
6	NM_001901.2	2044-2062	Sense	GGAAATTCTGCTCAGATAG
22	NM_001901.2	2044-2062	Antisense	CUAUCUGAGCAGAAUUUCC
7	NM_001901.2	1332-1350	Sense	ATTTCAGTAGCACAAGTTA
23	NM_001901.2	1332-1350	Antisense	UAACUUGUGCUACUGAAAU
8	NM_001901.2	1333-1351	Sense	TTTCAGTAGCACAAGTTAT
24	NM_001901.2	1333-1351	Antisense	AUAACUUGUGCUACUGAAA
9	NM_001901.2	1334-1352	Sense	TTCAGTAGCACAAGTTATT
25	NM_001901.2	1334-1352	Antisense	AAUAACUUGUGCUACUGAA
10	NM_001901.2	1330-1348	Sense	TGATTTCAGTAGCACAAGT
26	NM_001901.2	1330-1348	Antisense	ACUUGUGCUACUGAAAUCA
11	NM_001901.2	1331-1349	Sense	GATTTCAGTAGCACAAGTT
27	NM_001901.2	1331-1349	Antisense	AACUUGUGCUACUGAAAUC
12	NM_001901.2	1324-1342	Sense	TAAAAATGATTTCAGTAGC
28	NM_001901.2	1324-1342	Antisense	GCUACUGAAAUCAUUUUUA
13	NM_001901.2	1325-1343	Sense	AAAAATGATTTCAGTAGCA
29	NM_001901.2	1325-1343	Antisense	UGCUACUGAAAUCAUUUUU
14	NM_001901.2	1326-1344	Sense	AAAATGATTTCAGTAGCAC
30	NM_001901.2	1326-1344	Antisense	GUGCUACUGAAAUCAUUUU
15	NM_001901.2	1335-1353	Sense	TCAGTAGCACAAGTTATTT
31	NM_001901.2	1335-1353	Antisense	AAAUAACUUGUGCUACUGA
16	NM_001901.2	1336-1354	Sense	CAGTAGCACAAGTTATTTA
32	NM_001901.2	1336-1354	Antisense	UAAAUAACUUGUGCUACUG

실시예 3에서 선별된 서열번호 1, 2, 10, 15의 서열을 각각 센스가닥으로 가지는 SAMiRNA를 이용하여 폐암세포주인 A549에 처리하고, 상기 세포주에서 CTGF mRNA의 발현양상을 분석하였다.

4.1 SAMiRNA 나노입자의 세포 내 처리 방법

CTGF의 발현을 억제하는 SAMiRNA 발굴을 위하여 인간 유래 폐암세포주인 A549 (ATCC^® CCL-185^™, Manassas, VA)를 이용하였으며, A549 세포주는 10% Fetal Bovine Serum (Hyclone, US) 및 1% Penicillin-Streptomycin (Hyclone, US) 가 포함된 Gibco™F-12K (Kaighn's) 배지 (Thermo, US)를 이용하여 37℃5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 위와 동일한 배지를 이용하여 A549 세포주를 12-웰 플레이트 (Costar, US)에 8X10⁴ cells/well의 조건으로 분주하고, 다음날 상기 실시예 3.1에서 탈염 증류수(deionized distilled water)로 균질화한 SAMiRNA를 1X DPBS로 희석하여 세포에 50, 100, 200, 500, 1000 nM이 되도록 처리하였다. SAMiRNA의 처리는 12시간 마다 1회씩 처리하는 조건으로 총 4회 처리하며 37℃5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

4.2 인간(Human) CTGF mRNA 발현 억제 효능 분석을 통한 SAMiRNA 스크리닝

실시예 4-1에서 SAMiRNA 처리된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 CTGF 유전자의 mRNA 발현량을 상대 정량하였다.

4-2-1 SAMiRNA 처리된 세포로부터 RNA 분리 및 cDNA 제조

RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, 한국)를 이용하여, 상기 실시예 4-1에서 SAMiRNA 처리된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower^® RocketScript™Cycle RT Premix with oligo (dT)20, Bioneer, 한국)를 이용하여, 하기와 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다. 구체적으로, 0.25 ㎖ 에펜도르프 튜브에 담겨있는 AccuPower RocketScript™RT Premix with oligo (dT)20 (Bioneer, 한국)에 한 튜브당 추출된 1㎍씩의 RNA를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 첨가하였다. 이를 유전자 증폭기(MyGenie™Gradient Thermal Block, BIONEER, 한국)로 37 ℃에서 30초 동안 RNA와 프라이머를 혼성화하고, 48℃에서 4분간 cDNA를 제조하는 두 과정을 12번 반복한 뒤, 95℃에서 5분 동안 효소를 불활성화시켜 증폭 반응을 종료하였다.

4-2-2 인간(Human) CTGF mRNA의 상대 정량 분석

실시예 4-2-1에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 SYBR green 방식의 실시간 qPCR을 통해 SAMiRNA control sample 대비로 CTGF mRNA의 상대적 발현율을 하기와 같은 방법으로 분석하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 상기 실시예 4-2-1에서 제조된 cDNA를 증류수로 5배 희석하고, CTGF mRNA 발현량 분석을 위해서 희석된 cDNA 3 ㎕와 AccuPower®GreenStar™ 한국)를 25 ㎕, 증류수 19 ㎕, CTGF qPCR 프라이머(서열번호 7 및 8 (표 5); 10 pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)를 3 ㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, CTGF mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스키핑 유전자(housekeeping gene, 이하 HK 유전자)인 GAPDH(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase)를 표준 유전자로 하였다. 상기 혼합액이 담긴 96-웰 플레이트를 Exicycler™Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER, 한국) 을 이용하여 하기와 같은 반응을 수행하였다: 95 ℃에서 15분간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94 ℃에서 30초 변성(denaturing), 58 ℃에서 30초 어닐링(annealing), 72 ℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42 회 반복 수행하고, 72 ℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55 ℃에서 1분간 온도를 유지하고, 55 ℃에서 95 ℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다.

PCR이 종료된 후, 각각 수득한 타겟 유전자의 Ct(threshold cycle)값은 GAPDH 유전자를 통해 보정된 타겟 유전자의 Ct 값을 구한 뒤, 유전자 발현 저해를 일으키지 않는 컨트롤 서열인 SAMiRNA(SAMiCONT) (Sense : 5'- CUUACGCUGAGUACUUCGA -3' (19mer) (서열번호 59), Antisense : 5' -UCGAAGUACUCAGCGUAAG-3' (19mer) (서열번호 60))가 처리된 실험군을 대조군으로 하여 ΔCt값의 차이를 구했다. 상기 ΔCt값과 계산식 2(-ΔCt× 100을 이용하여 CTGF 특이적 SAMiRNA가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였다.

고효율의 SAMiRNA를 선별하기 위하여 최종 농도 50, 100, 200, 500, 1000nM 의 농도에서 CTGF mRNA 발현양이 대조군과 대비하여 발현양의 감소 효율이 가장 좋은 서열, 즉 서열번호 10의 서열을 센스가닥으로 가지는 SAMiRNA#10을 최종 선별하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, CTGF을 표적으로 하는 8종의 SAMiRNA로부터, CTGF 유전자 발현을 가장 효과적으로 억제하는 SAMiRNA#10을 최종 선별하였으며, 상기 세포주에서 CTGF mRNA의 발현양상을 분석하여 SAMiRNA의 IC₅₀값을 확인하였다. 해당 SAMiRNA의 서열 정보는 하기 표 6와 같다.

그 결과, 서열번호 10의 서열을 센스 가닥으로 가지는 CTGF 특이적 SAMiRNA는 모두 50 nM의 저농도에서도 50% 이상의 CTGF mRNA 발현양의 감소를 보여 매우 고효율로 CTGF 발현을 저해하는 효과를 나타냄을 확인하였다. IC₅₀는 서열번호 10의 서열을 센스 가닥으로 가지는 CTGF 특이적 SAMiRNA의 경우 도 4에 나타난 바와 같이 30.75 nM로 확인되었으며, 가장 효과적으로 CTGF 유전자 발현을 저해하는 효과를 나타냄을 확인하였고, Rxi-109 IC₅₀대비로도 상대적으로 더 우수한 효과를 확인하였다.

qPCR용 프라이머 서열 정보

프라이머	서열	서열번호
hGAPDH-F	GGTGAAGGTCGGAGTCAACG	42
hGAPDH-R	ACCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG	43
hCTGF-F	CACCAGCATGAAGACATACCG	44
hCTGF-R	CGTCAGGGCACTTGAACTC	45

(F는 정방향(forward) 프라이머, R은 역방향(reverse) 프라이머를 각각 의미함)

CTGF 발현을 효과적으로 억제하는 SAMiRNA 서열

서열번호	Code Name	위치	센스가닥 서열
10	SAMi-CTGF#1330	1330-1348	TGATTTCAGTAGCACAAGT

실시예 5. 선별된 서열번호 10의 서열을 센스 가닥으로 포함하는 DNA/RNA hybrid 및 RNA/RNA hybrid SAMiRNA에 의한 인간(Human) CTGF의 발현 억제 비교 분석

실시예 4에서 선별된 서열번호 10의 서열을 센스 가닥으로 가지는 CTGF 특이적 SAMiRNA를 포함하는 이중가닥 올리고 DNA/RNA hybrid 및 RNA/RNA hybrid를 이용하여 폐암세포주인 A549에 처리하고, 상기 세포주에서 CTGF mRNA의 상대적인 발현량(%)을 비교 분석 하였다.

5.1 SAMiRNA 나노입자의 세포 내 처리 방법

CTGF의 발현을 억제하는 SAMiRNA 발굴을 위하여 인간 유래 폐암세포주인 A549를 이용하였으며, A549 세포주는 10% Fetal Bovine Serum (Hyclone, US) 및 1% Penicillin-Streptomycin (Hyclone, US)가 포함된 Gibco™F-12K (Kaighn's) 배지 (Thermo, US)를 이용하여 37℃5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 위와 동일한 배지를 이용하여 A549 세포주를 12-웰 플레이트 (Costar, US)에 8X10⁴ cells/well의 조건으로 분주하고, 다음날 상기 실시예 3.1에서 탈염 증류 수(deionized distilled water)로 균질화한 SAMiRNA를 1X DPBS로 희석하여 세포에 200 nM 또는 600 nM이 되도록 처리하였다. SAMiRNA의 처리는 12시간 마다 1회씩 처리하는 조건으로 총 4회 처리하며 37 ℃5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

5.2 인간(Human) CTGF mRNA 발현억제 효능 분석을 통한 SAMiRNA 스크리닝

실시예 5-1에서 SAMiRNA 처리된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 CTGF 유전자의 mRNA 발현량을 상대 정량하였다.

5-2-1 SAMiRNA 처리된 세포로부터 RNA 분리 및 cDNA 제조

RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, 한국)를 이용하여, 상기 실시예 5-1에서 SAMiRNA 처리된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower®RocketScript™oligo (dT)20, Bioneer, 한국)를 이용하여, 하기와 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다. 구체적으로, 0.25 ㎖ 에펜도르프 튜브에 담겨있는 AccuPower®RocketScript™한국)에 한 튜브 당 추출된 1㎍씩의 RNA를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 첨가하였다. 이를 유전자 증폭기(MyGenie™Gradient Thermal Block, BIONEER, 한국)로 37℃에서 30초 동안 RNA와 프라이머를 혼성화하고, 48℃에서 4분간 cDNA를 제조하는 두 과정을 12번 반복한 뒤, 95℃에서 5분 동안 효소를 불활성화시켜 증폭 반응을 종료하였다.

5-2-2 인간(Human) CTGF mRNA의 상대정량 분석

실시예 5-2-1에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 SYBR green 방식의 실시간 qPCR을 통해 SAMiRNA control sample 대비로 CTGF mRNA의 상대적 발현율을 하기와 같은 방법으로 분석하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 상기 실시예 5-2-1에서 제조된 cDNA를 증류수로 5배 희석하고, CTGF mRNA 발현량 분석을 위해서 희석된 cDNA 3 ㎕와 AccuPower®™한국)를 25 ㎕, 증류수 19 ㎕, CTGF qPCR 프라이머(서열번호 44 및 45 (표 5); 10 pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)을 3 ㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, CTGF mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스키핑 유전자(housekeeping gene, 이하 HK 유전자)인 GAPDH(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase)를 표준 유전자로 하였다. 상기 혼합액이 담긴 96-웰 플레이트를 Exicycler™Quantitative Thermal Block(BIONEER, 한국)을 이용하여 하기와 같은 반응을 수행하였다: 95℃에서 15분 간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94℃에서 30초 변성(denaturing), 58℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42회 반복 수행하고, 72℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55℃에서 1분간 온도를 유지하고, 55℃에서 95℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다.

PCR이 종료된 후, 각각 수득한 타겟 유전자의 Ct(threshold cycle)값은 GAPDH 유전자를 통해 보정된 타겟유전자의 Ct 값을 구한 뒤, 유전자 발현저해를 일으키지 않는 컨트롤 서열인 SAMiRNA(SAMiCONT)가 처리된 실험군을 대조군으로 하여 Δ값의 차이를 구했다. 상기 Δ값과 계산식 2(-Δ× 100을 이용하여 CTGF 특이적 SAMiRNA가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대 정량하였다.

이중가닥 올리고 DNA/RNA hybrid 및 RNA/RNA hybrid 중 고효율의 SAMiRNA를 선별하기 위하여 최종 농도 200 nM, 600 nM의 농도에서 CTGF mRNA 발현양이 대조군과 대비하여 발현양의 감소 효율이 가장 좋은 서열, 즉 서열번호 10의 DNA 서열을 센스 가닥으로 가지는 DNA/RNA hybrid인 SAMiRNA를 최종 선별하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 최종 선별된 CTGF 특이적 SAMiRNA를 포함하는 이중가닥 올리고 DNA/RNA hybrid 및 RNA/RNA hybrid로부터, CTGF 유전자 발현을 가장 효과적으로 억제하는 DNA/RNA hybrid SAMiRNA #10을 최종 선별하였다.

실시예 6. 랫드 (Rat) CTGF를 타겟으로 하여 RNAi를 유도하는 SAMiRNA 나노입자의 스크리닝

siRNA 치료제의 경우 서로 다른 종(Strain)에 공통 적용 가능한 최적 서열 발굴이 힘들다. 이 경우 치료 효과를 분석하는 동물 모델 (in vivo efficacy test 확인) 특이적인 siRNA 서열 (surrogate sequence; mouse gene-specific siRNA)를 디자인해서 해당 유전자의 발현 저해에 따른 약제학적 효능(pharmacologically active) 및 해당 유전자 발현저해에 따른 독성부분을 검증하도록 미 FDA 가이드라인이 존재한다 (presentation by Robert T. Dorsam Ph.D. Pharmacology/Toxicology Reviewer, FDA/CDER).

기존 알고리즘 기반 siRNA 디자인 프로그램 (자사 보유한 Turbo-si- designer)을 통해 SAMiRNA 기반 서열 발굴을 진행 하였다. 랫드 CTGF 유전자 (NM_022266.2) full transcript 서열을 대상으로 총 94개의 후보 siRNA 서열을 생성하고 해당 SAMiRNA를 합성 후 랫드 간암 유래 H4-II-E 세포주에 10% FBS가 존재하는 세포 배양 조건에서 500nM 농도로 처리하여 in vitro 발현 저해 효과를 표 8(qPCR용 프라이머 서열 정보)의 프리이머를 이용하여 1차 스크리닝 하였다. (도 6)

고효율의 SAMiRNA를 선별하기 위하여 최종 농도 500nM의 농도에서 ratCTGF mRNA 발현양이 대조군과 대비하여 발현양의 감소 효율이 가장 좋은 서열, 즉 감소 효율이 > 60% 이상인 12종 서열(총 94종 SAMiRNA-ratCTGF)에 대한 2차 스크리닝을 랫드 간암세포주인 H4-II-E세포주에서 200nM, 500nM 처리하여 수행하였다. 그 결과, 서열번호 46, 47, 48의 서열을 각각 센스가닥으로 가지는 SAMiRNA 3종을 선별하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, ratCTGF를 표적으로 하는 94종의 SAMiRNA로부터, ratCTGF 유전자 발현을 가장 효과적으로 억제하는 SAMiRNA 3종을 최종 선별(도 8)하였으며, 해당 SAMiRNA의 서열 정보는 하기 표 9와 같다.

고효율의 SAMiRNA를 선별하기 위하여 최종 농도 25, 50, 100, 200, 400, 800nM의 농도에서 ratCTGF mRNA 발현양이 대조군과 대비하여 발현양의 감소 효율이 가장 좋은 서열, 즉 서열번호 46의 서열을 센스가닥으로 가지는 SAMiRNA-ratCTGF #46을 최종 선별하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, IC₅₀는 서열번호 46의 서열을 센스 가닥으로 가지는 ratCTGF 특이적 SAMiRNA의 경우 122.9 nM로 확인되었으며, 가장 효과적으로 ratCTGF 유전자 발현을 저해하는 효과를 나타냄을 확인하였다.

또한 도 9에 나타난 바와 같이, 최종 선별된 ratCTGF 특이적 SAMiRNA를 포함하는 이중가닥 올리고 DNA/RNA hybrid 및 RNA/RNA hybrid로부터, ratCTGF 유전자 발현을 가장 효과적으로 억제하는 DNA/RNA hybrid SAMiRNA #46를 최종 선별하였다.

(F는 정방향(forward) 프라이머 , R은 역방향(reverse) 프라이머를 각각 의미 함)

프라이머	서열
rat-GAPDH-F	AACATCATCCCTGCATCCAC (서열번호 49)
rat-GAPDH-R	CGGATACATTGGGGGTAGGA (서열번호 50)
rat-CTGF-F	CAAGGGTCTCTTCTGCGAC (서열번호 51)
rat-CTGF-R	ATTTGCAACTGCTTTGGAAGG (서열번호 52)

서열번호	Code Name	위치	센스가닥 서열
46	SAMi-rCTGF#46	195-213	GACACTGGTTTCGAGACAG
47	SAMi-rCTGF#47	182-200	CCTGTCAATCTCAGACACT
48	SAMi-rCTGF#48	984-1002	CATCCGGACGCCTAAAATT

실시예 7. 창상 유발 켈로이드성 동물 모델에서 피내 투여법에 의한 SAMiRNA-ratCTGF의 효능 검증

　8mm 바이옵시 펀치 (Biopsy punch, BP-80F, Kai, 일본)로 유발한 창상에서 SAMi-rCTGF에 효능분석을 실시하였다. 실험을 위하여 7주령의 랫드를 입수 (SD Rat, 나라바이오텍, 강남, 대한민국) 하여 1주간 순화시켰다. 8mm 바이옵시 펀치를 이용하여 등 피부에 창상을 만들었다. 음성대조군에 생리식염액 (PBS)를 투여한 군, 실험군에 SAMiRNA-rCTGF#46 DNA/RNA(D/R)를 투여한 군, 실험군에 SAMiRNA-rCTGF#46 RNA/RNA(R/R)를 투여한 군에 창상 유발 2일 전 및 창상 당일에 1200ug/site 을 피내에 총 2회 투여하였다. 창상 유발 후 3일 되는 날에 랫드를 희생시켰다.

7-1. 창상 유발 켈로이드성 동물 모델에서의 SAMiRNA에 대한 유전자 발현분석

SAMiRNA 처리된 쥐의 피부 조직을 얻어 액체 질소와 막자 사발을 이용하여 1차 분쇄하였다. 분쇄된 조직은 RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, 한국)의 Lysis buffer에 넣어 homogenizer로 2차 분쇄하였다. 이후 제조사 매뉴얼에 따라 전체 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower^® RocketScript™RT Premix with oligo (dT)20, Bioneer, 한국)를 이용하여, 하기와 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다.

RT parameter

Step	Temperature	Time
1	37 ^oC	30 sec
2	48 ^oC	4 min
3	55 ^oC	30 sec
4	Go to step 1	12 cycle
5	95 ^oC	5 min

제조된 cDNA를 주형으로 하여 SYBR green 방식의 실시간 qPCR을 통해 각 군의 전체 mRNA의 상대적 발현율을 하기와 같은 방법으로 분석하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 제조된 cDNA를 증류수로 10배 희석하고, CTGF mRNA 발현량 분석을 위해서 희석된 cDNA 10 ㎕와 AccuPower^® GreenStar™한국)를 25 ㎕, 증류수 20 ㎕, CTGF qPCR 프라이머(3 pmole/㎕ 각각, 표 11 참조)을 5 ㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, CTGF, Fibronectin 그리고 Col3α1 mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스키핑 유전자(housekeeping gene, 이하 HK 유전자)인 RPL13A를 표준 유전자로 하였다. qPCR이 종료된 후, 각각 수득한 타겟유전자의 Ct(thre shold cycle)값은 RPL13A 유전자를 통해 보정된 타겟 유전자의 ΔCt값 을 구한 뒤, 각 군을 대조군 비교하여 ΔΔCt값을 구했다. 상기 ΔΔCt값과 계산식 2(-ΔΔCt× 100을 이용하여 CTGF, Fibronectin 그리고 Col3α1 유전자의 발현량을 상대정량 하였다.

(F는 정방향(forward) 프라이머 , R은 역방향(reverse) 프라이머를 각각 의미함)

프라이머	서열
Rat Rpl13a F	AGGGGCAGGTTCTAGTATTG(서열번호 53)
Rat Rpl13a R	GCGTACAACCACCACCTTTC(서열번호 54)
Rat Ctgf F	AGGAGTGGGTGTGTGATGAG(서열번호 55)
Rat Ctgf R	TTGGCTCGCATCATAGTTGG(서열번호 56)

qPCR parameter

Step	Temperature	Time
1	95 ^oC	10 min
2	95 ^oC	5 sec
3	58 ^oC	25 sec
4	72 ^oC	30 sec
Scan
5	Go to step 2	40 cycle

그 결과 CTGF의 경우, 창상 모델에 생리 식염액을 처리한 군 대비 SAMiRNA-rCTGF(D/R) 1200ug을 처리한 군에서 유의성 있는 감소효과를 확인하였고, SAMiRNA-rCTGF(R/R) 1200ug을 처리한 군 대비 SAMiRNA-rCTGF(D/R) 1200ug을 처리한 군에서 통계적으로 유의성 있는 감소효과를 동시에 확인하였다.

즉, 도 10에 나타난 바와 같이, 최종 선별된 rCTGF 특이적 SAMiRNA를 포함하는 이중가닥 올리고 RNA/RNA hybrid 대비 DNA/RNA hybrid가 CTGF 유전자 발현을 가장 효과적으로 억제하는 양상을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> BIONEER CORPORATION <120> A double-stranded oligonucleotide comprising CTGF specific sequence and a composition for treating and preventing fibrosis related diseases and respiratory related diseases <130> P19-B312 <160> 60 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Sense) <400> 1 atgtacagtt atctaagtt 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Sense) <400> 2 tgtacagtta tctaagtta 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Sense) <400> 3 gtacagttat ctaagttaa 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Sense) <400> 4 atggaaattc tgctcagat 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Sense) <400> 5 tggaaattct gctcagata 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Sense) <400> 6 ggaaattctg ctcagatag 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Sense) <400> 7 atttcagtag cacaagtta 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Sense) <400> 8 tttcagtagc acaagttat 19 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Sense) <400> 9 ttcagtagca caagttatt 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Sense) <400> 10 tgatttcagt agcacaagt 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Sense) <400> 11 gatttcagta gcacaagtt 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Sense) <400> 12 taaaaatgat ttcagtagc 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Sense) <400> 13 aaaaatgatt tcagtagca 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Sense) <400> 14 aaaatgattt cagtagcac 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Sense) <400> 15 tcagtagcac aagttattt 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Sense) <400> 16 cagtagcaca agttattta 19 <210> 17 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Antisense) <400> 17 aacuuagaua acuguacau 19 <210> 18 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Antisense) <400> 18 uaacuuagau aacuguaca 19 <210> 19 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Antisense) <400> 19 uuaacuuaga uaacuguac 19 <210> 20 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Antisense) <400> 20 aucugagcag aauuuccau 19 <210> 21 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Antisense) <400> 21 uaucugagca gaauuucca 19 <210> 22 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Antisense) <400> 22 cuaucugagc agaauuucc 19 <210> 23 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Antisense) <400> 23 uaacuugugc uacugaaau 19 <210> 24 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Antisense) <400> 24 auaacuugug cuacugaaa 19 <210> 25 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Antisense) <400> 25 aauaacuugu gcuacugaa 19 <210> 26 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Antisense) <400> 26 acuugugcua cugaaauca 19 <210> 27 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Antisense) <400> 27 aacuugugcu acugaaauc 19 <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Antisense) <400> 28 gcuacugaaa ucauuuuua 19 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Antisense) <400> 29 ugcuacugaa aucauuuuu 19 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Antisense) <400> 30 gugcuacuga aaucauuuu 19 <210> 31 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Antisense) <400> 31 aaauaacuug ugcuacuga 19 <210> 32 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF Specific SAMiRNA Candidate (Antisense) <400> 32 uaaauaacuu gugcuacug 19 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 caccagcatg aagacatacc g 21 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 cgtcagggca cttgaactc 19 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 35 ccgacggccg atgctgcacc ccc 23 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 36 gtgtttgacg gcatcccacc 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 37 taggcttcag acgcacgacc 20 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 38 aagcggatgg tggttcctgc t 21 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 39 caccacagct cttccactc 19 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 40 atcccagaac tctccgaagc 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 41 acccttgccg ggcaccactc 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 42 ggtgaaggtc ggagtcaacg 20 <210> 43 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 43 accatgtagt tgaggtcaat gaagg 25 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 44 caccagcatg aagacatacc g 21 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 45 cgtcagggca cttgaactc 19 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAMi-rCTGF Sense <400> 46 gacactggtt tcgagacag 19 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAMi-rCTGF Sense <400> 47 cctgtcaatc tcagacact 19 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAMi-rCTGF Sense <400> 48 catccggacg cctaaaatt 19 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 49 aacatcatcc ctgcatccac 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 50 cggatacatt gggggtagga 20 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 51 caagggtctc ttctgcgac 19 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 52 atttgcaact gctttggaag g 21 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 53 aggggcaggt tctagtattg 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 54 gcgtacaacc accacctttc 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 55 aggagtgggt gtgtgatgag 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 56 ttggctcgca tcatagttgg 20 <210> 57 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rxi-109 Sense <400> 57 gcaccuuucu aga 13 <210> 58 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rxi-109 Antisense <400> 58 ucuagaaagg ugcaaacau 19 <210> 59 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAMiRNA(SAMiCONT) Sense <400> 59 cuuacgcuga guacuucga 19 <210> 60 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAMiRNA(SAMiCONT) Antisense <400> 60 ucgaaguacu cagcguaag 19

Claims

서열번호 1, 2, 10 및 15로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥(sense strand)과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥(anti-sense strand)을 포함하는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 19 내지 31개의 뉴클레오티드로 구성되는 것을 특징으로 하는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 siRNA, shRNA 또는 miRNA인 것을 특징으로 하는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드
제1항에 있어서, 상기 센스 또는 안티센스 가닥은 독립적으로 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 화학적 변형(chemical modification)을 포함하는 것을 특징으로 하는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드.
제5항에 있어서, 상기 화학적 변형은,
뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조의 2' 탄소 위치에서 수산화기(- OH)가 메틸기(-CH₃), 메톡시기(-OCH₃), 아민기(-NH₂), 불소(-F), O-2-메톡시에틸기, O-프로필 기, O-2-메틸티오에틸기, O-3-아미노프로필기, O-3-디메틸아미노프로필기, O-N-메 틸아세트아미도기 및 O-디메틸아미도옥시에틸로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나로 치환되는 변형;
뉴클레오티드 내 당 구조의 산소가 황으로 치환되는 변형;
뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합, 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합 및 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 결합이 되는 변형; 및
PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 및 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형;으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 상기 이중가닥 올리고뉴클레오티드의 안티센스 가닥의 5' 말단에 하나 이상의 인산기(phosphate group)가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드.
하기 구조식 1의 구조를 포함하는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체:
[구조식 (1)]

상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
제8항에 있어서, 하기 구조식 (2)의 구조를 포함하는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체:
[구조식 (2)]

상기 구조식 (2)에서, S 및 AS는 각각 제8항에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 의미하며, A, B, X 및 Y는 제8항에서의 정의와 동일하다.
제9항에 있어서, 하기 구조식 (3) 또는 구조식 (4)의 구조를 포함하는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체:

;
상기 구조식 (3) 및 (4)에서, A, B, X, Y, S 및 AS는 제9항에서의 정의와 동일하며, 5' 및 3'은 이중가닥 올리고뉴클레오티드 센스 가닥의 5' 및 3' 말단을 의미한다.
제8항에 있어서,
상기 친수성 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐피롤리돈 및 폴리옥사졸린로 구성된 군에서 선택되는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체.
제8항에 있어서,
상기 친수성 물질은 하기 구조식 (5) 또는 구조식 (6)의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체:

상기 구조식 (5) 또는 구조 식 (6)에서 A′는 친수성 물질 단량체(monomer)를, J는 m개의 친수성 물질 단량체 간 또는 m개의 친수성 물질 단량체와 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 서로 연결하는 링커, m은 1 내지 15의 정수, n은 1 내지 10의 정수를 의미하며,
친수성 물질 단량체 A'는 하기 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에서 선택된 어느 하나의 화합물이며, 링커(J)는 -PO₃ ^--, -SO₃-및 - CO₂-로 구성된 군에서 선택된다;
화합물 (1)

상기 화합물 (1)에서 G는 O, S 및 NH로 구성된 군에서 선택된다;
화합물 (2)

;
화합물 (3)

.
제12항에 있어서, 하기 구조식 (7) 또는 구조식 (8)의 구조를 갖는 것을 특 징으로 하는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체:
(A'_m-J)_n -X-R-Y-B 구조식 (7)
(J-A'_m)_n-X-R-Y-B 구조식 (8).
제8항에 있어서, 상기 친수성 물질의 분자량은 200 내지 10,000임을 특징으로 하는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체.
제8항에 있어서, 상기 소수성 물질의 분자량은 250 내지 1,000인 것을 특징으로 하는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체.
제15항에 있어서, 상기 소수성 물질은 스테로이드 유도체, 글리세라이드 유도체, 글리세롤 에테르, 폴리프로필렌 글리콜, C₁₂ 내지 C₅₀의 불포화 또는 포화 탄화수소, 디아실포스파티딜콜린(diacylphosphatidylcholine), 지방산, 인지질, 리포폴리아민(lipopolyamine), 지질(lipid), 토코페롤(tocopherol) 및 토코트라이에 놀(tocotrienol)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체.
제16항에 있어서, 상기 스테로이드 유도체는 콜레스테롤, 콜리스탄올, 콜산, 콜리스테릴포르메이트, 코테스타닐포르메이트 및 콜리스타닐아민으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체.
제16항에 있어서, 상기 글리세라이드 유도체는 모노-글리세라이드, 디-글리세라이드 및 트리-글리세라이드로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체.
제8항에 있어서, 상기 X 및 Y로 표시되는 공유 결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합인 것을 특징으로 하는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체.
제19항에 있어서, 상기 비분해성 결합은 아미드 결합 또는 인산화 결합인 것을 특징으로 하는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체.
제19항에 있어서, 상기 분해성 결합은 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테 르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 및 효소 분해성 결합으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 CTGF 특이적 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체.
제8항에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 포함하는 나노입자.
제22항에 있어서, 상기 나노입자는 서로 다른 서열을 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체가 혼합되어 구성되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 유효 성분으로 포함하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제22항에 따른 나노입자를 유효성분으로 포함하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제24항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 만성폐쇄성질환(COPD), 천식, 급만성기관지염, 알레르기 비염, 진해 거담, 기관지염, 세기관지염, 인후염, 편도염 및 후두염으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제24항에 있어서, 상기 섬유증은 특발성폐섬유화증(IPF), 간 섬유증(liver fibrosis), 간경변(cirrhosis), 골수섬유증(myelofibrosis), 심근섬유증(myocardial fibrosis), 신장 섬유증(renal fibrosis), 켈로이드(keloid), 폐섬유증 (pulmonary fibrosis), 심장 섬유증(cardiac fibrosis) 및 방사선 섬유증(radiation-induced fibrosis)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제25항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 만성폐쇄성질환(COPD), 천식, 급만성 기관지염, 알레르기 비염, 진해 거담, 기관지염, 세기관지염, 인후염, 편도염 및 후두염으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제25항에 있어서, 상기 섬유증은 특발성폐섬유화증(IPF), 간 섬유증(liver fibrosis), 간경변(cirrhosis), 골수섬유증(myelofibrosis), 심근섬유증(myocardial fibrosis), 신장 섬유증(renal fibrosis), 켈로이드(keloid), 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 심장 섬유증(cardiac fibrosis) 및 방사선 섬유증(radiation-induced fibrosis)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제24항의 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함하는 동결건조된 형태의 제형.
제25항의 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함하는 동결건조된 형태의 제형.
제8항에 따른 이중가닥 올리고뉴클레오티드 구조체를 유효 성분으로 포함하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제32항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 만성폐쇄성질환(COPD), 천식, 급만성기관지염, 알레르기 비염, 진해 거담, 기관지염, 세기관지염, 인후염, 편도염 및 후두염으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제32항에 있어서, 상기 섬유증은 특발성폐섬유화증(IPF), 간 섬유증(liver fibrosis), 간경변(cirrhosis), 골수섬유증(myelofibrosis), 심근섬유증(myocardial fibrosis), 신장 섬유증(renal fibrosis), 켈로이드(keloid), 폐섬유증 (pulmonary fibrosis), 심장 섬유증(cardiac fibrosis) 및 방사선 섬유증(radiation-induced fibrosis)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제32항의 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함하는 동결건조된 형태의 제형.