KR20150064065A - 엠피레귤린 특이적 이중 나선 올리고 rna, 그러한 이중나선 올리고 rna 를 포함하는 이중나선 올리고 rna 구조체 및 이를 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

엠피레귤린 특이적 이중 나선 올리고 rna, 그러한 이중나선 올리고 rna 를 포함하는 이중나선 올리고 rna 구조체 및 이를 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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윤평오
김미나
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Abstract

본 발명은 호흡기 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 고효율의 엠피레귤린 발현 저해제인 엠피레귤린 특이적 이중나선 올리고 RNA에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 엠피레귤린 특이적 이중나선 올리고 RNA의 생체 내 안정성 향상 및 세포전달 효율을 개선하기 위해 친수성 및 소수성 물질을 단순 공유결합 또는 링커-매개 공유결합 시킨 엠피레귤린 특이적 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이들로 이루어진 나노입자에 관한 것이다. 본 발명에 따른 엠피레귤린 특이적 이중나선 올리고 RNA 구조체는 엠피레귤린 특이적 이중나선 올리고 RNA의 기능을 저해하지 않으면서 엠피레귤린 특이적 이중나선 올리고 RNA의 안정성을 향상시킴과 동시에, 효율적으로 세포막 투과 기능을 향상시킬 수 있으므로, 엠피레귤린 특이적 이중나선 올리고 RNA 구조체를 사용할 경우, 비교적 낮은 농도의 투여량으로도 엠피레귤린 특이적 이중나선 올리고 RNA를 효율적으로 세포 내로 전달할 수 있어 호흡기 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

엠피레귤린 특이적 이중 나선 올리고 RNA, 그러한 이중나선 올리고 RNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이를 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 조성물 {AMPHIREGULIN-SPECIFIC DOUBLE-HELICAL OLIGO-RNA, DOUBLE-HELICAL OLIGO-RNA STRUCTURE COMPRISING DOUBLE-HELICAL OLIGO-RNA, AND COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING RESPlRATORY DISEASES CONTAINING SAME}
본 발명은 호흡기 질환 연관 유전자 특이적 이중나선 올리고 RNA 및 이를 포함하는 고효율 이중나선 올리고 RNA 구조체에 관한 것으로, 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체는 세포 내로 효율적으로 전달되도록 하기 위하여 이중나선 RNA(siRNA)의 양 말단에 친수성 물질 및 소수성 물질을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합을 이용하여 접합된 형태의 구조를 가지며, 수용액에서 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체들의 소수성 상호작용에 의해 나노입자 형태로 전환될 수 있다. 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체에 포함된 이중나선 올리고 RNA는 호흡기 질환 연관 유전자인 앰피레귤린(Amphiregulin)에 특이적인 것이 바람직하며, 특히 앰피레귤린 특이적 siRNA인 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조방법 및 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 호흡기 질환, 특히 만성 폐쇄성 페질환(CPOPD) 및/또는 특발성 폐섬유화증(IPF)를 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.
유전자의 발현을 억제하는 기술은 질병치료를 위한 치료제 개발 및 표적 검증에서 중요한 도구이다. 표적 유전자의 발현을 억제하는 종래의 기술로는 표적 유전자에 대한 전이 유전자를 도입하는 기술이 개시되어 있는데, 프로모터를 기준으로 역방향(antisense)으로 전이 유전자를 도입하는 방법(Sheehy et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:8805-8808, 1988; Smith et al., Nature, 334:724-726, 1988)과 프로모터 기준으로 정방향(sense)으로 이식 유전자를 도입하는 방법(Napoli et al., Plant Cell, 2:279-289, 1990; van der Krol et al., Plant Cell, 2:291-299, 1990; 미국특허 제5,034,323호; 미국특허 제5,231,020호; 및, 미국특허 제5,283,184호)이다.
한편, 최근에 20 내지 25 염기쌍을 갖는 이중가닥 RNA 단편의 축적에 의해 전사 후 유전자의 억제 또는 RNA 간섭(RNAi) 현상이 일어나며, 상기 이중가닥 RNA는 RNA 주형으로부터 합성된다는 사실이 보고된 바 있다(Hamilton ＆ Baulcumbe, Science, 286:950-952, 1999). 상기 이중가닥 RNA 단편은 "작은 간섭 RNA(small interfering RNA, 이하 siRNA라고 한다)"라고 명명되었다. 이후, 포유동물을 포함한 다양한 생명체에서 siRNA는 유전자의 발현을 억제하는 중요한 요소라는 사실이 명백해지고 있다(Fire et al., Nature, 391:806-811, 1998; Timmons ＆ Fire, Nature, 395:854, 1998; Kennerdell ＆ Carthew, Cell, 95:1017-1026, 1998; Elbashir et al., Nature, 411:494- 497, 2001; WO 99/32619). 또한, 이중가닥 siRNA는 세포 내에서 RISC(RNA-induced silencing complex) 단백질 복합체에 의해 단일가닥 RNA로 전환되고, 이후 타깃 mRNA와 결합하여 mRNA를 불활성화 시키는 것으로 알려져 있다(Novina ＆ Sharp, Nature, 430:161-164, 2004). 상기한 바와 같이 siRNA를 이용한 유전자의 발현 억제 기술은 표적 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제시키고 이로 인한 변화를 관찰하는 것으로, 표적 세포에서의 표적 유전자의 기능을 규명하는 연구에 유용하게 사용된다. 특히, 감염성 바이러스 또는 암세포 등에서 표적 유전자의 기능을 억제하는 것은 해당 질병의 치료 방법을 개발하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예측된다. 생체 외(in vitro)에서의 연구 및 실험동물을 이용한 생체 내 (in vivo)연구를 수행한 결과, siRNA에 의한 표적 유전자의 발현억제가 가능하다고 보고된 바 있다(McCaffrey et al., Nature Biotechnology, 21:639-644, 2003; Giladi et al., Molecular Therapy, 8:769-776, 2003; Konishi et al., epatology, 38:842-850, 2003; Sen et al., Virus Research, 96:27-35, 2003; Yokota et al., EMBO Reports, 4:602-608, 2003; Song et al., Nature Medicine, 9:347-351, 2003; McCaffrey et al., Nature, 418:38-39, 2002). 일례로, 국제특허공개공보 WO 03/070969호에는 siRNA를 이용하여 암세포에서 Bcl2 단백질의 발현을 억제시킴으로써, 암세포를 치료하는 방법이 개시되어 있고, WO 04/009769호에는 siRNA를 이용하여 혈관신생을 유발하는 VEGF 단백질의 발현을 억제시킴으로써, 암세포를 치료하는 방법이 개시되어 있다.
또한, siRNA의 작용 기작은 타겟 mRNA와 상보적으로 결합하여 서열 특이적으로 타깃 유전자의 발현을 조절하기 때문에, 기존의 항체 기반 의약품이나 화학물질(small molecule drug)에 비하여 적용할 수 있는 대상이 획기적으로 확대될 수 있다는 장점을 가진다(Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 2006 13(4):664-670).
siRNA의 뛰어난 효과 및 다양한 사용범위에도 불구하고, siRNA가 치료제로 개발되기 위해서는 체내에서의 siRNA의 안정성(stability) 개선과 세포 전달 효율 개선을 통해 siRNA가 타겟 세포에 효과적으로 전달되도록 되어야 한다(Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development. Drug Discov Today. 2006 Jan; 11(1-2):67-73).
상기 체내 안정성 향상 및 siRNA의 비특이적인 세포 면역반응(innate immune stimulation) 문제 해결을 위하여, siRNA의 일부 뉴클레오티드 또는 골격(backbone)을 핵산분해효소 저항성을 가지도록 변형(modification)하거나 바이러스성 벡터(viral vector), 리포좀 또는 나노입자(nanoparticle) 등의 전달체의 이용 등에 대한 연구가 활발하게 시도되고 있다.
아데노바이러스나 레트로바이러스 등의 바이러스성) 벡터를 이용한 전달 시스템은 형질주입 효율(transfection efficiency)이 높지만, 면역원성(immunogenicity) 및 발암성(oncogenicity)이 높다. 반면에 나노입자를 포함하는 비바이러스성(non-viral) 전달 시스템은 바이러스성 전달 시스템에 비하여 세포전달효율은 낮은 편이지만, 생체 내(in vivo)에서의 안전성이 높고, 타겟 특이적으로 전달이 가능하며, 내포되어 있는 RNAi 올리고뉴클레오타이드를 세포 또는 조직으로 흡수(uptake) 및 내재화(internalization) 등의 개선된 전달 효과가 높을 뿐 아니라, 세포독성 및 면역 유발(immune stimulation)이 거의 없다는 장점을 가지고 있어, 현재는 바이러스성 전달 시스템에 비해 유력한 전달방법으로 평가되어지고 있다 (Nonviral delivery of synthetic siRNAs in vivo. J Clin Invest. 2007 December 3; 117(12): 3623-3632).
상기 비바이러스성 전달 시스템 중에서 나노전달체(nanocarrier)를 이용하는 방법은 리포좀, 양이온 고분자 복합체 등의 다양한 고분자를 사용함으로써 나노입자를 형성하고, siRNA를 이러한 나노입자(nanoparticle), 즉 나노전달체(nanocarrier)에 담지하여 세포에 전달하는 형태를 가진다. 나노전달체를 이용하는 방법 중 주로 활용되는 방법은 고분자 나노입자(polymeric nanoparticle), 고분자 미셀(polymer micelle), 리포플렉스(lipoplex) 등이 있는데, 이 중에서 리포플렉스를 이용한 방법은 양이온성 지질로 구성되어 세포의 엔도좀(endosome)의 음이온성 지질과 상호작용하여 엔도좀의 탈 안정화 효과를 유발하여 세포 내로 전달하는 역할을 한다(Proc. Natl. Acad. Sci. 15; 93(21):11493-8, 1996).
또한, siRNA 패신저(passenger; 센스(sense)) 가닥의 말단 부위에 화학물질 등을 연결하여 증진된 약동력학(pharmacokinetics)적 특징을 갖도록 하여 생체 내(in vivo)에서 높은 효율을 유도할 수 있다는 것이 알려져 있다(Nature 11; 432(7014):173-8, 2004). 이 때 siRNA 센스(sense; 패신저(passenger)) 또는 안티센스 (antisence; 가이드(guide)) 가닥의 말단에 결합된 화학 물질의 성질에 따라 siRNA의 안정성이 달라진다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 같은 고분자 화합물이 접합된 형태의 siRNA는 양이온성 물질이 존재하는 조건에서 siRNA의 음이온성 인산기와 상호작용하여 복합체를 형성함으로써, 개선된 siRNA 안정성을 가진 전달체가 된다(J Control Release 129(2):107-16, 2008). 특히 고분자 복합체로 구성된 미셀(micelle)들은 약물 전달 운반체로 쓰이는 다른 시스템인, 미소구체(microsphere) 또는 나노입자(nanoparticle) 등에 비해 그 크기가 극히 작으면서도 분포가 매우 일정하고, 자발적으로 형성되는 구조이므로 제제의 품질 관리 및 재현성 확보가 용이하다는 장점이 있다.
또한, siRNA의 세포 내 전달 효율성을 향상시키기 위해, siRNA에 생체 적합성 고분자인 친수성 물질(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG))을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합으로 접합시킨 siRNA 접합체를 통해, siRNA의 안정성 확보 및 효율적인 세포막 투과성을 위한 기술이 개발되었다(대한민국 등록특허 제883471호). 하지만 siRNA의 화학적 변형 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 접합시키는 것(PEGylation)만으로는 생체 내에서의 낮은 안정성과 타깃 장기로의 전달이 원활하지 못하다는 단점은 여전히 가진다. 이러한 단점을 해결하기 위하여 올리고뉴클레오티드, 특히 siRNA와 같은 이중나선 올리고 RNA에 친수성 및 소수성 물질이 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체가 개발되었는데, 상기 구조체는 소수성 물질의 소수성 상호작용에 의하여 SAMiRNATM(Self Assembled Micelle Inhibitory RNA)라고 명명된 자가조립 나노입자를 형성하게 되는데(대한민국 등록 특허 제1224828호 참조), SAMiRNATM 기술은 기존의 전달기술들에 비해 매우 사이즈가 작으면서도 균일한(homogenous) 나노입자를 수득할 수 있다는 장점을 가진다.
한편, 엠피레귤린은 상피세포성장인자 수용체에 결합하여 상피세포 수용체 경로(EGFR pathway)를 활성화 시키며, 세포증식에 관여한다는 사실이 알려져 있고, 엠피레귤린 특이적 siRNA에 의해 엠피레귤린의 발현을 저해시킬 수 있으며, 이는 특정 타입의 유방암에서 치료효과를 나타낸다고 개시되었다(Cancer Res. 2008; 68:225-2265). 또한, 엠피레귤린에 대한 shRNA를 이용하여 염증성 유방암에서의 세포 침투를 억제할 수 있으며(J Cell Physiol. 2011 226(10):2691-2701), 엠피레귤린 특이적 shRNA를 이용하여 엠피레귤린 발현을 억제하면 담배연기에 노출된 쥐에서의 허파동맥 재형성(pulmonary artery remodeling)이 억제된다는 사실이 개시되어 있다(Arch Biochem Biophys, 1;508(1):93-100). 기도평활근(airway smooth muscle; ASM) 과증식(hyperplasia)과 혈관신생에 엠피레귤린이 관련이 있으며, 특히 천신환자의 기도 재형성(airway remodeling)을 촉진한다는 것(J Korean Med Sci 2008; 23: 857-863)과 급성 천식에 따른 조직 재형성에서 과다 분비되는 표피세포 성장인자(EGF)와 엠피레귤린이 관여하는 것이 개시되어 있다(J Alergy Clin Immunol 2009;124:913-920).
천식과 함께 대표적인 폐질환의 하나인 만성폐쇄성폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, 이하 'COPD'라고 함)은 비가역적인 기도의 폐색을 동반한다는 점에서 천식과 다르며 반복되는 감염, 유해한 입자나 가스의 흡입이나 흡연에 에 의해 발생하는 폐의 비정상적인 염증반응과 이와 동반하여 완전히 가역적이지 않으며 점차 진행하는 기류제한을 보이는 호흡기 질환이다(Am J Respir Crit Care Med, 163:1256-1276, 2001). 전세계적으로 COPD의 심각성이 강조되고 있는데 이는 COPD가 1990년 전체 사망 질환 중 6위였으나 2020년에는 3위가 되리라 예측되고, 10대 질환 중 유일하게 그 발병률이 증가하는 중요한 질환이다. 또 질환으로 인한 장애의 원인으로는 4위가 되리라 예측되므로 COPD로 인한 사회, 경제적 질병부담이 급격히 증가할 것으로 예상된다(Lancet, 349:1498-1504, 1997). 만성폐쇄성폐질환은 기도 및 폐실질 염증에 의한 세기관지 및 폐실질의 병리학적 변화에 의해 발생하는 병으로, 폐쇄성 세기관지염 및 폐기종(폐실질 파괴)을 특징으로 한다. 만성폐쇄성폐질환의 종류에는 만성폐쇄성기관지염(Chronic obstructive bronchitis), 만성세기관지염(Chronic bronchiolitis) 및 폐기종(Emphysema)이 있다. 만성폐쇄성폐질환의 경우 호중구의 수가 증가하며, GM-CSF, TNF-α, IL-8, MIP-2와 같은 사이토카인이 분비된다. 기도에 염증이 생기고, 근육 벽이 두꺼워지며, 점액 분비가 증가하여 기관지 폐쇄가 나타난다. 기관지가 폐쇄되면 폐포는 확장되고 손상되어 산소와 이산화탄소의 교환능력이 손상을 받게 되고, 호흡부전발생이 높아진다. 이미 국내 45세 이상인 성인의 8%가 만성폐쇄성폐질환 환자임에도 불구하고 폐암에만 관심이 치우쳐 있고, 만성폐쇄성폐질환을 치료하는 종래의 방법은 항염증 작용을 갖는 치료제나 기관지확장 효과를 갖는 치료제를 이용하는 정도로, 유전자 치료제에 의한 본질적인 만성폐쇄성폐질환의 예방 및 치료는 미미한 실정이다. 상기 항염증 작용을 갖는 대표적인 치료제는 글루코콜티코이드(glucocorticoid), 루코트리엔 모디파이어(leukotriene modifiers), 데오필린(theophylline) 등이 있다. 그러나 상기 글루코콜티코이드(glucocorticoid)는 효과 면에서는 강력하나 약물부작용이 문제가 되어 흡입 치료를 시행하고 있고, 치료 효과도 선택적으로 작용하는 것이 아니라 모든 면역반응과 항염증반응을 억제하기 때문에 경우에 따라서 필요한 면역반응까지 억제하는 문제점이 있다. 상기 루코트리엔 모디파이어(leukotriene modifiers)는 부작용은 적지만 효과 면에서 한계가 있어 단독으로 사용 시에는 천식을 조절할 수 없다. 따라서 대부분 보조적으로 사용하고 있는 문제점이 있다. 상기 테오필린(theophylline)은 효과 면에서도 뛰어나지 못하며 부작용의 우려가 있는 문제점이 있다. 따라서 만성폐쇄성폐질환을 예방하고 치료할 수 있는 효과가 뛰어나고 부작용이 적은 새로운 치료제에 대한 수요가 절실한 상황이다.
한편, 특발성 폐섬유화증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis, 이하 ‘IPF’라고 함)은 폐포(허파꽈리) 벽에 만성염증 세포들이 침투하면서 폐를 딱딱하게 하는 여러 변화가 발생하면서 폐조직의 심한 구조적 변화를 야기하며 점차 폐기능 저하되어 결국에는 사망하게 되는 질환으로, 아직까지는 효과적인 치료방법이 없어 대개 증상이 나타나서 진단을 하게 되면 중앙 생존기간이 3~5년 정도밖에 안되는 아주 예후가 나쁜 질병이다. 발생빈도는 외국의 경우 인구 10만명 당 약 3-5명 정도로 보고되고 있으며 대개 50대 이후에 발병율이 높고 남자가 여자보다 2배 가량 발생율이 높은 것으로 알려져 있다.
IPF의 발병원인은 아직 명확하게 규명되지는 않았는데, 흡연자에서 빈도가 높고, 항우울제, 위-식도역류에 의한 만성적 폐 흡입, 금속분진, 목재분진, 또는 용매제 흡입 등이 IPF의 발생과 연관이 있는 위험인자들로 보고된 바 있으나, 대부분의 환자들에서는 확실한 인과관계가 있는 인자들을 찾을 수 없다.
IPF는 치료를 하지 않았을 때 계속적으로 악화되어 환자의 약 50%이상이 3-5년 내에 사망한다고 알려져 있고, 또 일단 병이 진행되어 완전히 섬유화로 굳어진 다음에는 어떤 치료를 하더라도 호전이 되지 않기 때문에 치료를 한다면 조기에 치료할 경우에 효과가 있을 가능성이 높을 것으로 예측하고 있다. 현재 사용되고 있는 치료제로는 스테로이드(steroid)와 아자티오프린(azathioprine), 또는 사이클로포스마이드(cyclophosphamide)의 병합요법을 사용하는 방법이 알려져는 있지만, 특별한 효과를 보인다고 보기는 어려우며, 여러 가지 섬유화 억제제들이 동물실험 및 소규모의 환자들에서 시도되었으나 뚜렷한 효과가 입증된 것이 없는 상태이다. 특히, 말기 IPF 환자에서는 폐이식 외에 다른 효과적인 치료 방법이 없는 실정이다. 따라서, 보다 효율적인 IPF의 치료제 개발이 절실한 상황이다.
선행기술문헌
특허문헌
(특허문헌 1) 미국특허 제5,034,323호
(특허문헌 2) 미국특허 제5,231,020호
(특허문헌 3) 미국특허 제5,283,184호
(특허문헌 4) 대한민국 등록특허 공보 제883471호
(특허문헌 5) 대한민국 공개특허 제2009-0042297호
비특허문헌
(비특허문헌 1) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:8805-8808, 1988
(비특허문헌 2) Smith et al., Nature, 334:724-726, 1988
(비특허문헌 3) Plant Cell, 2:279-289, 1990
(비특허문헌 4) Plant Cell, 2:291-299, 1990
발명의 요약
본 발명의 목적은 상기와 같은 기존의 문제점을 해결하고자, 앰피레귤린에 특이적이면서 매우 높은 효율로 그 발현을 저해할 수 있는 신규 이중나선 올리고 RNA, 특히 siRNA 및 이를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체, 그리고 그러한 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 앰피레귤린 특이적 이중나선 올리고 RNA, 또는 그러한 이중나선 올리고 RNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체를 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환, 특히 COPD 및/또는 IPF의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 앰피레귤린 특이적 이중나선 올리고 RNA, 또는 그러한 이중나선 올리고 RNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체를 이용하여 호흡기 질환, 특히 COPD 및/또는 IPF를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명백해 질 것이다.
도 1은 서열번호 1 내지 30을 각각 센스가닥으로 가지는 30 종의 siRNA를 20nM의 농도로 처리한 경우, 형질전환된 세포주에서의 엠피레귤린 mRNA의 상대적 발현량(%)을 나타내는 그래프이다.
NC : 엠피레귤린 특이적 siRNA가 처리되지 않은 세포주(대조군)에서 획득된 총 RNA에서의 엠피레귤린 mRNA 발현량으로서, 이를 100%로 기준으로 각 siRNA에 따른 앰피레귤린의 상대적 발현량을 측정.
도 2는 서열번호 8, 9 및 28을 각각 센스가닥으로 가지는 siRNA 처리 농도별 (0.2, 1 및 5nM) 섬유모세포 세포주에서의 엠피레귤린 mRNA의 상대적 발현량(%)을 나타내는 그래프이다.
도 3은 서열번호 31 내지 50을 각각 센스가닥으로 가지는 20 nM siRNA로 처리한 경우의 형질전환된 세포주에서의 엠피레귤린 mRNA의 상대적 발현량(%)을 나타내는 그래프이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 엠피레귤린의 발현을 억제할 수 있는 이중나선 올리고 RNA를 제공한다. 본 발명에 따른 이중나선 올리고 RNA의 형태로는 siRNA(short interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 miRNA(microRNA) 등이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, miRNA에 대한 길항제(antagonist) 역할을 할 수 있는 단일가닥의 miRNA 저해제도 본 발명에 따른 이중나선 올리고 RNA에 포함되는 것으로 해석된다.
이하, 본 발명에서 제공되는 이중나선 올리고 RNA를 siRNA를 위주로 설명하기로 한다. 하지만, 본 발명에서 제공되는 이중나선 올리고 RNA는 siRNA에 한정되는 것이 아님은 통상의 기술자에게는 자명한 것이며, 동일한 특성이 siRNA를 제외한 다른 이중나선 올리고 RNA에도 적용될 수 있다는 점 역시 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
구체적으로 본 발명에서는 서열번호 1 내지 서열번호 230에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스가닥(sense strand)인 제1 올리고뉴클레오티드와 그에 상보적 서열을 포함하는 안티센스 가닥인 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 엠피레귤린 특이적 siRNA를 제공한다.
5'-ggaguaugauaaugaacca-3'(서열번호 1),
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5'-ugaggaacgaaagaaacuu-3'(서열번호 134),
5'-uucgacaagagaauggaaa-3'(서열번호 135),
5'-ugcuguuauuacaguccag-3'(서열번호 136),
5'-gauggauuugagguuaccu-3'(서열번호 137),
5'-cucaaugacaccuacucug-3'(서열번호 138),
5'-gguuaccucaagaagugag-3'(서열번호 139),
5'-gccgacuaugacuacucag-3'(서열번호 140),
5'-caaauauauagagcaccug-3'(서열번호 141),
5'-agccgacuaugacuacuca-3'(서열번호 142),
5'-accuggcuauauugucgau-3'(서열번호 143),
5'-ccuacucugggaagcguga-3'(서열번호 144),
5'-gcauuagcagccauagcug-3'(서열번호 145),
5'-augauaacgaaccacaaau-3'(서열번호 146),
5'-gcgugaaccauuuucuggg-3'(서열번호 147),
5'-ugggaagcgugaaccauuu-3'(서열번호 148),
5'-agcaguaacaugcaaaugu-3'(서열번호 149),
5'-ugaaaacucacagcaugau-3'(서열번호 150),
5'-agacaauacgucaggaaau-3'(서열번호 151),
5'-auacucggcucaggccauu-3'(서열번호 152),
5'-auuaugcugcuggauugga-3'(서열번호 153),
5'-ugcugauggauuugagguu-3'(서열번호 154),
5'-ugugagugaaaugccuucu-3'(서열번호 155),
5'-auucagucagaguugaaca-3'(서열번호 156),
5'-aagggaggcaaaaauggaa-3'(서열번호 157),
5'-uguuauuacaguccagcuu-3'(서열번호 158),
5'-acgaaagaaacuucgacaa-3'(서열번호 159),
5'-cugcauucacggagaaugc-3'(서열번호 160),
5'-agagaauggaaauguacau-3'(서열번호 161),
5'-cgucaggaaauaugaagga-3'(서열번호 162),
5'-augcugcuggauuggaccu-3'(서열번호 163),
5'-aguaugauaacgaaccaca-3'(서열번호 164),
5'-aaccacaaauaccuggcua-3'(서열번호 165),
5'-aauauauagagcaccugga-3'(서열번호 166),
5'-aaauugcauuagcagccau-3'(서열번호 167),
5'-acgaaccacaaauaccugg-3'(서열번호 168),
5'-aagcaguaacaugcaaaug-3'(서열번호 169),
5'-cgcucuugauacucggcuc-3'(서열번호 170),
5'-guaacaugcaaaugucagc-3'(서열번호 171),
5'-aauguacaugcuauagcau-3'(서열번호 172),
5'-cacggagaaugcaaauaua-3'(서열번호 173),
5'-cuguuauuacaguccagcu-3'(서열번호 174),
5'-cgacaagagaauggaaaug-3'(서열번호 175),
5'-aaaacaagacggaaaguga-3'(서열번호 176),
5'-cuauauugucgaugauuca-3'(서열번호 177),
5'-aguccaugaaaacucacag-3'(서열번호 178),
5'-gcugucgcucuugauacuc-3'(서열번호 179),
5'-gcuauauugucgaugauuc-3'(서열번호 180),
5'-cgaaagaaacuucgacaag-3'(서열번호 181),
5'-agcgugaaccauuuucugg-3'(서열번호 182),
5'-augaaaacucacagcauga-3'(서열번호 183),
5'-acuucgacaagagaaugga-3'(서열번호 184),
5'-caguccagcuuagaagaca-3'(서열번호 185),
5'-ugcaaauauauagagcacc-3'(서열번호 186),
5'-agaagacaauacgucagga-3'(서열번호 187),
5'-gggagccgacuaugacuac-3'(서열번호 188),
5'-auggaaauguacaugcuau-3'(서열번호 189),
5'-caaaaauugcauuagcagc-3'(서열번호 190),
5'-gugcugucgcucuugauac-3'(서열번호 191),
5'-ugcugucgcucuugauacu-3'(서열번호 192),
5'-uacucggcucaggccauua-3'(서열번호 193),
5'-uggcuauauugucgaugau-3'(서열번호 194),
5'-auucacggagaaugcaaau-3'(서열번호 195),
5'-aaacucacagcaugauuga-3'(서열번호 196),
5'-auuacaguccagcuuagaa-3'(서열번호 197),
5'-ugauggauuugagguuacc-3'(서열번호 198),
5'-ucagaagaguaugauaacg-3'(서열번호 199),
5'-agaguaugauaacgaacca-3'(서열번호 200),
5'-ugauaacgaaccacaaaua-3'(서열번호 201),
5'-acggagaaugcaaauauau-3'(서열번호 202),
5'-cuaguagugaaccguccuc-3'(서열번호 203),
5'-gaagaguaugauaacgaac-3'(서열번호 204),
5'-aaaugccuucuaguaguga-3'(서열번호 205),
5'-uaacgaaccacaaauaccu-3'(서열번호 206),
5'-auugucgaugauucaguca-3'(서열번호 207),
5'-acaugcaaaugucagcaag-3'(서열번호 208),
5'-uguugcuguuauuacaguc-3'(서열번호 209),
5'-uagagcaccuggaagcagu-3'(서열번호 210),
5'-aacgaaagaaacuucgaca-3'(서열번호 211),
5'-aaauaccuggcuauauugu-3'(서열번호 212),
5'-aauacgucaggaaauauga-3'(서열번호 213),
5'-uggaaauguacaugcuaua-3'(서열번호 214),
5'-acgucaggaaauaugaagg-3'(서열번호 215),
5'-uuggaccucaaugacaccu-3'(서열번호 216),
5'-uaacaugcaaaugucagca-3'(서열번호 217),
5'-augacuacucagaagagua-3'(서열번호 218),
5'-aaauccauguaaugcagaa-3'(서열번호 219),
5'-ggaagcgugaaccauuuuc-3'(서열번호 220),
5'-ucugggaagcgugaaccau-3'(서열번호 221),
5'-uauugucgaugauucaguc-3'(서열번호 222),
5'-aguaacaugcaaaugucag-3'(서열번호 223),
5'-uuagaagacaauacgucag-3'(서열번호 224),
5'-aaaauccauguaaugcaga-3'(서열번호 225),
5'-gcuggauuggaccucaaug-3'(서열번호 226),
5'-cugauggauuugagguuac-3'(서열번호 227),
5'-ccucaagaagugagauguc-3'(서열번호 228),
5'-gagccgacuaugacuacuc-3'(서열번호 229),
5'-gauucagucagaguugaac-3'(서열번호 230)
본 발명에서의 “엠피레귤린 특이적 siRNA(s)”는 엠피레귤린 단백질을 인코딩하는 유전자에 특이적인 siRNA(s)를 의미한다. 또한, 엠피레귤린에 대한 특이성이 유지되는 한, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 230에 따른 서열을 포함하는 센스가닥 또는 이에 상보적인 안티센스 가닥에서, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 또는 삽입된 서열을 포함하는 센스가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 엠피레귤린 특이적 siRNA도 본 발명의 권리범위에 포함되는 것임은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.
본 발명에서 제공되는 엠피레귤린 특이적 siRNA는 엠피레귤린을 암호화하는 mRNA와 상보적으로 결합할 수 있도록 설계된 염기서열이므로, 엠피레귤린의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 것이 특징이며, 상기 siRNA는 하나 또는 양쪽 가닥의 3′말단에 하나 또는 두 개 이상의 비결합(unpaired)된 뉴클레오티드를 포함하는 구조인 오버행(overhang)을 포함할 수 있다.
또한, 상기 siRNA의 생체 내 안정성 향상을 위해, 핵산 분해효소 저항성 부여 및 비 특이적 면역반응 감소를 위한 다양한 변형(modification)을 포함할 수 있다 상기 siRNA 를 구성하는 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드의 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸), -OCH3(methoxy),-NH2,-F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형; 뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 또는 뉴클레오티드결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형에서 선택된 하나 이상의 변형이 조합되어 사용될 수 있으며, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형도 사용이 가능하다(Ann. Rev. Med. 55, 61-65 2004; US 5,660,985; US 5,958,691; US 6,531,584; US 5,808,023; US 6,326,358; US 6,175,001; Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:1139-1143, 2003; RNA, 9:1034-1048, 2003; Nucleic Acid Res. 31:589-595, 2003; Nucleic Acids Research, 38(17) 5761-5773, 2010; Nucleic Acids Research, 39(5) 1823-1832, 2011).
본 발명에서 제공되는 앰피레귤린 특이적 siRNA 중에서, 서열번호 1 내지 30에 따른 서열을 포함하는 센스가닥을 가지는 siRNA는 마우스 엠페레귤린에 특이적인 것이며, 서열번호 31 내지 230에 따른 서열을 포함하는 센스가닥을 가지는 siRNA는 인간 엠피레귤린에 특이적인 것이다. 본 발명의 서열번호 1 내지 230에 따른 서열을 포함하는 센스가닥을 가지는 siRNA는 모두 엠피레귤린의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 효능이 있는 것으로 확인되었다.
본 발명의 다른 양태는 엠피레귤린 특이적 siRNA의 생체 내로의 효율적인 전달 및 안정성 향상을 위하여 siRNA의 양 말단에 각각 하나 이상의 친수성 고분자 및 소수성 고분자가 접합된 형태의 siRNA 접합체인 이중나선 올리고 RNA 구조체에 대한 것이다. 본 발명에서의 "이중나선 올리고 RNA 구조체"는 siRNA 또는 shRNA의 양 말단에 각각 하나 이상의 친수성 고분자 및 소수성 고분자가 접합된 이중나선 형태의 올리고 RNA 구조체를 의미한다.
상기 이중나선 올리고 RNA 구조체의 경우 소수성 물질의 소수성 상호작용에 의하여 자기조립 나노입자를 형성하게 되는데(대한민국 공개 특허 공보 제2010-123214호 참조), 이러한 접합체는 체내로의 전달효율 및 체내에서의 안정성이 극히 우수할 뿐 아니라, 입자 크기가 균일성이 우수하여 QC(Quality control)이 용이하므로 약물로서의 제조 공정이 간단하다는 장점이 있다.
구체적으로 본 발명에 따른 엠피레귤린 특이적 이중나선 올리고 RNA 구조체는 하기 구조식 (1)과 같은 구조를 가지는 것이 바람직하다.
구조식 1
Figure pct00001
상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 엠피레귤린 특이적 siRNA를 의미한다.
보다 바람직하게는 본 발명에 따른 엠피레귤린 특이적 이중나선 올리고 RNA 구조체는 하기 구조식 (2)의 구조를 가진다.
구조식 2
Figure pct00002
상기 구조식 (2)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, S는 엠피레귤린 특이적 siRNA의 센스가닥, AS는 엠피레귤린 특이적 siRNA의 안티센스 가닥을 의미한다.
보다 바람직하게는 엠피레귤린 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체는 하기 구조식 (3)의 구조를 가진다.
구조식 3
Figure pct00003
상기 구조식 (3)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, S는 엠피레귤린 특이적 siRNA의 센스가닥, AS는 엠피레귤린 특이적 siRNA의 안티센스 가닥을 의미한다.
상기, 구조식 (1) 내지 구조식 (3)에서의 상기 엠피레귤린 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체의 안티센스 가닥 5' 말단에 인산기(phosphate group)가 한 개 내지 세 개 결합될 수 있다.
또한, 상기 구조식 (1) 내지 (3)에서 siRNA 대신에 shRNA가 사용될 수도 있음은 본 발명의 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.
상기 구조식 (1) 내지 구조식 (3)에서의 친수성 물질은 분자량이 200 내지 10,000 인 양이온성 또는 비이온성 고분자 물질인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1,000 내지 2,000인 비이온성 고분자 물질이다. 예를 들어, 친수성 고분자 물질로는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥사졸린 등의 비이온성 친수성 고분자 화합물을 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 구조식 (1) 내지 구조식 (3)에서의 소수성 물질(B)은 소수성 상호작용을 통해 구조식(1)에 따른 올리고뉴클레오티드 구조체로 구성된 나노입자를 형성하는 역할을 수행한다. 상기 소수성 물질은 분자량이 250 내지 1,000인 것이 바람직하며, 스테로이드(steroid) 유도체, 글리세라이드(glyceride) 유도체, 글리세롤 에테르(glycerol ether), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), C12내지 C50의 불포화 또는 포화 탄화수소(hydrocarbon), 디아실포스파티딜콜린 (diacylphosphatidylcholine), 지방산(fatty acid), 인지질(phospholipid), 리포폴리아민(lipopolyamine) 등이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 목적에 부합하는 것이라면 어떠한 소수성 물질도 사용 가능하다는 점은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.
상기 스테로이드(steroid) 유도체는 콜레스테롤, 콜레스탄올, 콜산, 콜리스테릴포르메이트, 코테스타닐 포르메이트 및 콜리스타닐아민으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 글리세라이드 유도체는 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드 등에서 선택될 수 있는데 이때, 글리세라이드의 지방산은 C12내지 C50의 불포화 또는 포화 지방산이 바람직하다.
특히, 상기 소수성 물질 중에서도 포화 또는 불포화 탄화수소나 콜레스테롤이 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 구조체의 합성 단계에서 용이하게 결합시킬 수 있는 장점을 가지고 있다는 점에서 바람직하다. 상기 소수성 물질은 친수성 물질의 반대쪽 말단(distal end)에 결합되며, siRNA 의 센스가닥 또는 안티센스 가닥의 어느 위치에 결합되어도 무방하다.
본 발명에 따른 구조식 (1) 내지 구조식 (3)에서의 친수성 물질 또는 소수성 물질과 엠피레귤린 특이적 siRNA는 단순 공유 결합 또는 링커가 매개된 공유결합(X 또는 Y)에 의해 결합된다. 상기 공유결합을 매개하는 링커는 친수성 물질, 또는 소수성 물질과 엠피레귤린 특이적 siRNA의 말단에서 공유결합하며, 필요에 따라 특정 환경에서 분해가 가능한 결합을 제공하는 한 특별히 한정되는 것은 아니다. 따라서, 상기 링커는 본 발명에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조과정 중 엠피레귤린 특이적 siRNA 및/또는 친수성 물질(또는 소수성 물질)을 활성화하기 위해 결합시키는 어떠한 화합물도 사용될 수 있다. 상기 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합 중 어느 것이어도 무방하다. 이때, 비분해성 결합으로는 아미드 결합 또는 인산화 결합이 있고, 분해성 결합으로는 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 구조식 (1) 내지 구조식 (3)에서의 R(또는 S 및 AS)로 표시되는 엠피레귤린 특이적 siRNA는 엠피레귤린과 특이적으로 결합할 수 있는 특성을 지니는 siRNA라면 모두 제한없이 사용가능하며, 바람직하게는 본 발명에서는 서열번호 1 내지 서열번호 230 에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스가닥(sense strand)과 그에 상보적 서열을 포함하는 안티센스 가닥으로 구성된다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 엠피레귤린 특이적 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 나노입자를 제공한다.
이미 앞서 설명한 바와 같이 엠피레귤린 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체는 소수성 및 친수성 물질을 모두 포함하고 있는 양친매성이며, 친수성 부분은 체내에 존재하는 물 분자들과 수소결합 등의 상호작용을 통해 친화력을 가지고 있어 바깥쪽으로 향하게 되고, 소수성 물질들은 그들 간의 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)을 통해 안쪽으로 향하게 되어 열역학적으로 안정한 나노입자를 형성하게 된다. 즉, 나노입자의 중심에 소수성 물질이 위치하게 되고, 엠피레귤린 특이적 siRNA의 바깥쪽 방향에 친수성 물질이 위치하여 엠피레귤린 특이적 siRNA를 보호하는 형태의 나노입자를 형성한다. 이렇게 형성된 나노입자는 엠피레귤린 특이적 siRNA의 세포 내 전달 향상 및 엠피레귤린 특이적 siRNA의 효능을 향상시킨다.
본 발명에 따른 나노입자는 동일한 서열을 가지는 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체만으로 형성될 수도 있고, 서로 다른 서열을 포함하는 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체로 구성될 수도 있음을 특징으로 한다. 즉, 동일한 앰피레귤린에 대한 특이성을 가지면서 그 서열이 다른 경우도 포함되는 것으로 해석된다. 또한, 앰피레귤린 이외에 다른 암 특이적 타겟 유전자 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체가 본 발명에 따른 나노입자에 포함될 수도 있다.
상기 본 발명에 따른 나노입자를 구성하는 이중나선 올리고 RNA 구조체에 포함되는 앰피레귤린 특이적 siRNA는 서열번호 1 내지 230에서 선택된 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 가지며, 이에 상보적인 서열을 안티센스 가닥으로 가지는 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 앰피레귤린에 특이성을 가지면서 본 발명의 목적에 부합하는 어떠한 siRNA도 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 엠피레귤린 특이적 siRNA, 또는 이를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및/또는 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자를 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 엠피레귤린 특이적 siRNA, 또는 이를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및/또는 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자를 포함하는 조성물은 허파동맥 재형성(pulmonary artery remodeling) 및 기도 재형성(airway remodeling)을 억제하여 호흡기 질환의 예방 또는 치료에 효과를 나타내는 것이다. 따라서 본 발명에 따른 조성물은 호흡기 질환인 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 특발성 폐섬유화증(IPF), 급만성기관지염, 알레르기 비염, 진해 거담, 급성하기도 감염증(기관지염 및 세기관지염), 인후염, 편도염, 후두염과 같은 급성상기도감염증 등의 예방 또는 치료에 효과가 있는 것이다.
본 발명의 조성물에는 투여를 위하여 상기 기재된 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 특히, 동결건조(lyophilized)된 형태의 제형으로 제제화하여 제공하는 것이 바람직하다. 동결건조 제형 제조를 위해서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 방법이 사용될 수 있으며, 동결건조를 위한 안정화제가 추가될 수도 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍톤 약학 과학(Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질병에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공 될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 특별히 호흡기 질환 치료를 위해 기관지내 점적주입을 통한 폐로의 투여 또한 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 또는 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 임상 투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 본 발명의 조성물을 적합한 제형으로 제제화 할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 본 발명에 따른 앰피레귤린 특이적 siRNA, 상기 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체, 이를 포함하는 조성물 또는 나노입자를 호흡기 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 이용하는 용도를 제공하며, 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체, 이를 포함하는 조성물 또는 나노입자를 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 호흡기 질환의 예방 및 치료방법을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 목표 염기서열의 디자인 및 siRNA의 제조
마우스 엠피레귤린 mRNA 서열(NM_009704)에서 siRNA가 결합할 수 있는 목표 염기서열(센스가닥)을 디자인하고, 상기 목표 염기서열의 상보적 서열인 안티센스 가닥의 siRNA를 제조하였다. 우선, 바이오니아(주)에서 개발된 유전자 디자인 프로그램(Turbo si-Designer)을 사용하여, 엠피레귤린 mRNA 서열 (NM_009704)에서 siRNA가 결합할 수 있는 목표 염기서열을 디자인하였다. 본 발명의 엠피레귤린 siRNA는 19개의 뉴클레오티드로 구성된 센스 가닥과 이에 상보적인 안티센스 가닥으로 구성된 이중가닥 구조이다. 상기 siRNA는 β-시아노에틸 포스포라미다이트(β-cyanoethyl phosphoramidite)를 이용하여 RNA 골격 구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결하여 제조하였다 (Nucleic Acids Research,12:4539-4557, 1984). 구체적으로, RNA 합성기(384 Synthesizer, BIONEER, 한국)를 사용하여, 뉴클레오티드가 부착된 고형 지지체 상에서, 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 산화(oxidation) 및 캐핑(capping)으로 이루어지는 일련의 과정을 반복하여 원하는 길이의 RNA를 포함하는 반응물을 수득하였다. 상기 반응물을 Daiso gel C18(Daiso, Japan) 칼럼이 장착된 HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan)로 RNA를 분리 및 정제하고 이를 MALDI-TOF 질량 분석기(Shimadzu, Japan)를 이용하여 목표 염기서열과 부합하는지 확인하였다. 이후, 센스와 안티센스 RNA가닥을 결합시켜 목적하는 서열번호 1 내지 서열번호 30에서 선택된 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 가지는 siRNA를 제조하였다.
실시예 2. 섬유모세포(NIH3T3) 세포주에서 siRNA를 이용한 엠피레귤린의 발현억제
상기 실시예 1에서 제조된 서열번호 1 내지 서열번호 30을 각각 센스가닥으로 가지는 엠피레귤린 특이적 siRNA를 이용하여 섬유아세포주인 마우스 섬유모세포(NIH3T3)를 형질전환시키고, 상기 형질전환된 섬유모세포(NIH3T3) 세포주에서 앰피레귤린의 발현양상, 즉 상기 siRNA에 의한 발현 억제 정도를 분석하였다.
2-1: 섬유모세포 세포주의 배양
미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 마우스 섬유모세포 세포주(NIH3T3)를 RPMI-1640 배양배지(GIBCO/Invitrogen, USA, 10%(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100 units/㎖ 및 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖)에서 37 ℃, 5%(v/v) CO2의 조건 하에 배양하였다.
2-2: 섬유모세포 세포주에서 목표 siRNA의 형질주입(transfection)
상기 실시예 2-1에서 배양된 1×105 섬유모세포 세포주를 37℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 12-웰 플레이트에서 18시간 동안 RPMI 1640에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰당 500㎕의 Opti-MEM 배지(GIBCO, 미국)를 분주하였다.
한편, 리포펙타민 2000(Lipofectamine™ 2000, Invitrogen, 미국) 2㎕와 Opti-MEM 배지 248㎕를 혼합하여 혼합액을 제조하였고, 실온에서 5분간 반응시킨 다음, 상기 실시예 1에서 제조한 각각의 서열번호 1 내지 30 중 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 가지는 siRNA(1pmole/㎕) 20㎕를 Opti-MEM 배지 230㎕에 첨가하여 최종 농도가 20 nM인 siRNA 용액을 제조하였다. 상기 리포펙타민 2000(Lipofectamine™ 2000) 혼합액과 siRNA 용액을 혼합하여 실온에서 20분간 반응시켜 형질주입용 용액을 제조하였다.
그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰에 형질주입용 용액을 각각 500㎕씩 분주하고 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하였다. 여기에 RPMI 1640 배양배지 1㎖씩 분주한 다음 24시간동안 37℃에서 5%(v/v) CO2의 조건 하에서 배양하였다.
2-3: 엠피레귤린 mRNA의 정량분석
상기 실시예 2-2에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 엠피레귤린 유전자의 mRNA 발현량을 상대정량 하였다.
2-3-1: 형질주입된 세포로부터 RNA 분리 및 cDNA 제조
RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, 한국)를 이용하여, 상기 실시예 2-2에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower CycleScript RT Premix/dT20, Bioneer, 한국)를 이용하여, 하기와 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다. 구체적으로, 0.25㎖ 에펜도르프 튜브에 담겨있는 AccuPower CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer, 한국)에 한 튜브 당 추출된 1㎍씩의 RNA를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 첨가하였다. 이를 유전자 증폭기(MyGenie™ 96 Gradient Thermal Block, BIONEER, 한국)로 30℃에서 1분 동안 RNA와 프라이머를 혼성화하고, 52℃에서 4분간 cDNA를 제조하는 두 과정을 6번 반복한 뒤, 95℃에서 5분 동안 효소를 불활성화시켜 증폭 반응을 종료하였다.
2-3-2: 엠피레귤린 mRNA의 상대정량 분석
상기 실시예 2-3-1에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 통해 엠피레귤린 mRNA의 상대적인 양을 하기와 같은 방법으로 정량하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 상기 실시예 2-3-1에서 제조된 cDNA를 증류수로 5배 희석하고, 엠피레귤린 mRNA 발현량 분석을 위해서 희석된 cDNA 3㎕와 2×GreenStar™ PCR master mix(BIONEER, 한국)를 10㎕, 증류수 6㎕, 엠피레귤린 qPCR 프라이머r(10pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)을 1㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, 엠피레귤린 mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스키핑 유전자(housekeeping gene, 이하 HK 유전자)인 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 표준 유전자로 하였다. 상기 혼합액이 담긴 96-웰 플레이트를 Exicycler™96 Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER, 한국) 을 이용하여 하기와 같은 반응을 수행하였다: 95℃에서 15분간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94 ℃에서 30초 변성(denaturing), 58℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42 회 반복 수행하고, 72℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55℃에서 1분간 온도를 유지하고, 55℃에서 95℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다. PCR이 종료된 후, 각각 수득한 엠피레귤린의 Ct(threshold cycle)값은 GAPDH 유전자를 통해 정규화된 mRNA 값(normalization factor, NF)을 계산하여 보정된 엠피레귤린의 Ct 값을 구한 뒤, 형질주입 물질만 처리된 실험군을 대조군으로 하여 ΔCt값의 차이를 구했다. 상기 ΔCt 값과 계산식 2(-ΔCt)×100을 이용하여 서열번호 1 내지 서열번호 30을 각각 센스가닥으로 가지는 엠피레귤린 특이적 siRNA에 따른 앰피레귤린 mRNA의 발현량을 상대정량 하였다(도 1 참조).
고효율의 siRNA를 선별하기 위하여 최종 농도 20nM의 농도에서 엠피레귤린 mRNA 발현양이 대조군과 대비하여 70% 이상의 발현양의 감소를 보이며, 서열번호 2, 6 내지 9, 11, 17 내지 21, 23, 24, 28 및 29를 각각 센스가닥으로 가지는 siRNA 15종을 선별하였다.
실시예 3. 섬유모세포(NIH3T3) 세포주에서 선별된 siRNA를 이용한 엠피레귤린의 발현억제
상기 실시예 2에서 선별된 서열번호 2, 6 내지 9, 11, 17 내지 21, 23, 24, 28 및 29를 각각 센스가닥으로 가지는 siRNA를 이용하여 섬유아 세포주인 마우스 섬유모세포(NIH3T3)를 형질전환 시키고, 상기 형질전환된 섬유모세포(NIH3T3) 세포주에서 엠피레귤린 mRNA의 발현양상을 분석하였다.
3-1: 섬유모세포 세포주의 배양
미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 마우스 섬유모세포 세포주(NIH3T3)를 RPMI-1640 배양배지(GIBCO/Invitrogen, USA, 10%(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100 units/㎖ 및 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖)에서 37 ℃, 5%(v/v) CO2의 조건 하에 배양하였다.
3-2: 섬유모세포 세포주에서 목표 siRNA의 형질주입
상기 실시예 2-1에서 배양된 1×105 섬유모세포 세포주를 37℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 12-웰 플레이트에서 18시간 동안 RPMI 1640에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰당 500㎕의 Opti-MEM 배지(GIBCO, 미국)를 분주하였다.
한편, 리포펙타민 2000(Lipofectamine™ 2000, Invitrogen, 미국) 2㎕와 Opti-MEM 배지 248㎕를 혼합하여 혼합액을 제조하였고, 실온에서 5분간 반응시킨 다음, 상기 실시예 2에서 선별된 서열번호 2, 6 내지 9, 11, 17 내지 21, 23, 24, 28 및 29를 각각 센스가닥으로 가지는 siRNA(1pmole/㎕) 5㎕를 Opti-MEM 배지 245㎕에 첨가하여 최종 농도가 5 nM인 siRNA 용액을 제조하였다. 상기 리포펙타민 2000(Lipofectamine™ 2000) 혼합액과 siRNA 용액을 혼합하여 실온에서 20분간 반응시켜 형질주입용 용액을 제조하였다.
그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰에 형질주입용 용액을 각각 500㎕씩 분주하고 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하였다. 여기에 RPMI 1640 배양배지 1㎖씩 분주한 다음 24시간동안 37℃에서 5%(v/v) CO2의 조건 하에서 배양하였다.
3-3: 엠피레귤린 mRNA의 정량분석
상기 실시예 3-2에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 엠피레귤린 유전자의 mRNA 발현을 상대정량 하였다.
3-3-1: 형질주입된 세포로부터 RNA 분리 및 cDNA 제조
RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, 한국)를 이용하여, 상기 실시예 2-2에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower CycleScript RT Premix/dT20, Bioneer, 한국)를 이용하여, 하기와 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다. 구체적으로, 0.25㎖ 에펜도르프 튜브에 담겨있는 AccuPower CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer, 한국)에 한 튜브 당 추출된 1㎍씩의 RNA를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 첨가하였다. 이를 유전자 증폭기(MyGenie™ 96 Gradient Thermal Block, BIONEER, 한국)로 30℃에서 1 분 동안 RNA와 프라이머를 혼성화하고, 52℃에서 4분간 cDNA를 제조하는 두 과정을 6번 반복한 뒤, 95℃에서 5분 동안 효소를 불활성화 시켜 증폭 반응을 종료하였다.
3-3-2: 엠피레귤린 mRNA의 상대정량 분석
상기 실시예 3-3-1에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 통해 엠피레귤린 mRNA의 상대적인 양을 하기와 같은 방법으로 정량하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 상기 실시예 3-3-1에서 제조된 cDNA를 증류수로 5배 희석하고, 엠피레귤린 mRNA 발현량 분석을 위해서 희석된 cDNA 3㎕와 2× GreenStar™ PCR master mix(BIONEER, 한국)를 10㎕, 증류수 6㎕, 엠피레귤린 qPCR 프라이머r(10pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)을 1㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, 엠피레귤린 mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스키핑 유전자(housekeeping gene, 이하 HK 유전자)인 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 표준 유전자로 하였다. 상기 혼합액이 담긴 96-웰 플레이트를 Exicycler™96 Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER, 한국) 을 이용하여 하기와 같은 반응을 수행하였다: 95℃에서 15분간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94 ℃에서 30초 변성(denaturing), 58℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42 회 반복 수행하고, 72℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55℃에서 1 분간 온도를 유지하고, 55℃에서 95℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다. PCR이 종료된 후, 각각 수득한 엠피레귤린의 Ct(threshold cycle)값은 GAPDH 유전자를 통해 정규화된 mRNA 값(normalization factor, NF)을 계산하여 보정된 엠피레귤린의 Ct 값을 구한 뒤, 형질주입 물질만 처리된 실험군을 대조군으로 하여 ΔCt값의 차이를 구했다. 상기 ΔCt 값과 계산식 2(-ΔCt)×100을 이용하여 서열번호 2, 6 내지 9, 11, 17 내지 21, 23, 24, 28 및 29를 각각 센스가닥으로 가지는 엠피레귤린 특이적 siRNA에 의한 mRNA의 발현량 변화를 상대정량 하였다.
고효율의 siRNA를 선별하기 위하여 siRNA를 처리한 후 타겟 유전자의 발현이 50% 억제되는 값인 IC50를 확인하기 위하여 최종 농도 5nM의 농도에서 엠피레귤린 mRNA 발현양이 대조군과 대비하여 가장 큰 발현양의 감소를 보이는 서열번호 8, 9 및 28을 각각 센스가닥으로 가지는 siRNA 3종을 선별하였다.
실시예 4. 섬유모세포(NIH3T3) 세포주에서 선별된 siRNA를 이용한 엠피레귤린의 발현억제
상기 실시예 3에서 선별된 서열번호 8, 9 및 28을 각각 센스가닥으로 가지는 siRNA를 이용하여 섬유아 세포주인 마우스 섬유모세포(NIH3T3)를 형질전환 시키고, 상기 형질전환된 섬유모세포(NIH3T3) 세포주에서 엠피레귤린 mRNA의 발현양상을 분석하여 siRNA의 IC50값을 확인하였다.
4-1: 섬유모세포 세포주의 배양
미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 마우스 섬유모세포 세포주(NIH3T3)를 RPMI-1640 배양배지(GIBCO/Invitrogen, USA, 10%(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100 units/㎖ 및 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖)에서 37 ℃, 5%(v/v) CO2의 조건 하에 배양하였다.
4-2: 섬유모세포 세포주에서 목표 siRNA의 형질주입
상기 실시예 2-1에서 배양된 1×105 섬유모세포 세포주를 37℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 12-웰 플레이트에서 18시간 동안 RPMI 1640에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰당 500㎕의 Opti-MEM 배지(GIBCO, 미국)를 분주하였다.
한편, 리포펙타민 2000(Lipofectamine™ 2000, Invitrogen, 미국) 2㎕와 Opti-MEM 배지 248㎕를 혼합하여 혼합액을 제조하였고, 실온에서 5분간 반응시킨 다음, 상기 실시예 3에서 선별된 서열번호 8, 9 및 28을 각각 센스가닥으로 가지는 siRNA (1pmole/㎕) 0.2, 1, 5 ㎕를 Opti-MEM 배지 249.8, 249, 245 ㎕에 첨가하여 최종 농도가 0.2, 1, 5nM인 siRNA 용액을 제조하였다. 상기 리포펙타민 2000 (Lipofectamine™ 2000) 혼합액과 siRNA 용액을 혼합하여 실온에서 20분간 반응시켜 형질주입용 용액을 제조하였다.
그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰에 형질주입용 용액을 각각 500㎕씩 분주하고 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하였다. 여기에 RPMI 1640 배양배지 1㎖씩 분주한 다음 24시간동안 37℃에서 5%(v/v) CO2의 조건 하에서 배양하였다.
4-3: 엠피레귤린 mRNA의 정량분석
상기 실시예 4-2에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 엠피레귤린 유전자의 mRNA 발현량을 상대정량 하였다.
4-3-1: 형질주입된 세포로부터 RNA 분리 및 cDNA 제조
RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, 한국)를 이용하여, 상기 실시예 2-2에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower CycleScript RT Premix/dT20, Bioneer, 한국)를 이용하여, 하기와 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다. 구체적으로, 0.25㎖ 에펜도르프 튜브에 담겨있는 AccuPower CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer, 한국)에 한 튜브 당 추출된 1㎍씩의 RNA를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 첨가하였다. 이를 유전자 증폭기(MyGenie™ 96 Gradient Thermal Block, BIONEER, 한국)로 30℃에서 1 분 동안 RNA와 프라이머를 혼성화하고, 52℃에서 4분간 cDNA를 제조하는 두 과정을 6번 반복한 뒤, 95℃에서 5분 동안 효소를 불활성화 시켜 증폭 반응을 종료하였다.
4-3-2: 엠피레귤린 mRNA의 상대정량 분석
상기 실시예 4-3-1에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 통해 엠피레귤린 mRNA의 상대적인 양을 하기와 같은 방법으로 정량하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 상기 실시예 4-3-1에서 제조된 cDNA를 증류수로 5배 희석하고, 엠피레귤린 mRNA 발현량 분석을 위해서 희석된 cDNA 3㎕와 2×GreenStar™ PCR master mix(BIONEER, 한국)를 10㎕, 증류수 6㎕, 엠피레귤린 qPCR 프라이머r(10pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)을 1㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, 엠피레귤린 mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스키핑 유전자(housekeeping gene, 이하 HK 유전자)인 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 표준 유전자로 하였다. 상기 혼합액이 담긴 96-웰 플레이트를 Exicycler™96 Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER, 한국) 을 이용하여 하기와 같은 반응을 수행하였다: 95℃에서 15분간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94 ℃에서 30초 변성(denaturing), 58℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42 회 반복 수행하고, 72℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55℃에서 1 분간 온도를 유지하고, 55℃에서 95℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다. PCR이 종료된 후, 각각 수득한 엠피레귤린의 Ct(threshold cycle)값은 GAPDH 유전자를 통해 정규화된 mRNA 값(normalization factor, NF)을 계산하여 보정된 엠피레귤린의 Ct 값을 구한 뒤, 형질주입 물질만 처리된 실험군을 대조군으로 하여 ΔCt값의 차이를 구했다. 상기 ΔCt 값과 계산식 2(-ΔCt)×100을 이용하여 각 엠피레귤린 특이적 siRNA의 농도별 처리에 따른 mRNA의 발현량 변화를 상대정량 하였다(도 2 참조).
그 결과, 서열번호 8, 9 및 28을 각각 센스가닥으로 가지는 앰피레귤린 특이적 siRNA 모두 0.2nM의 저농도에서도 50% 이상의 엠피레귤린 mRNA 발현양의 감소를 보여 매우 고효율로 엠피레귤린 발현을 저해하는 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 5. 목표 염기서열의 디자인 및 siRNA의 제조
사람 엠피레귤린 mRNA 서열(NM_001657)에서 siRNA가 결합할 수 있는 목표 염기서열(센스가닥)을 디자인하고, 상기 목표 염기서열의 상보적 서열인 안티센스 가닥의 siRNA를 제조하였다. 우선, 바이오니아(주)에서 개발된 유전자 디자인 프로그램(Turbo si-Designer)을 사용하여, 엠피레귤린 mRNA 서열(NM_001657)에서 siRNA가 결합할 수 있는 목표 염기서열을 디자인하였다. 본 발명의 엠피레귤린 siRNA는 19개의 뉴클레오티드로 구성된 센스 가닥과 이에 상보적인 안티센스 가닥으로 구성된 이중가닥 구조이다. 또한 어떠한 유전자의 발현을 저해하지 않는 서열의 siRNA인 siCONT(5’-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3’을 센스가닥으로 가짐)을 제조하였다. 상기 siRNA는 β-시아노에틸 포스포라미다이트(β-cyanoethyl phosphoramidite)를 이용하여 RNA 골격 구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결하여 제조하였다 (Nucleic Acids Research,12:4539-4557, 1984). 구체적으로, RNA 합성기(384 Synthesizer, BIONEER, 한국)를 사용하여, 뉴클레오티드가 부착된 고형 지지체 상에서, 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 산화(oxidation) 및 캐핑(capping)으로 이루어지는 일련의 과정을 반복하여 원하는 길이의 RNA를 포함하는 반응물을 수득하였다. 상기 반응물을 Daiso gel C18(Daiso, Japan) 칼럼이 장착된 HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan)로 RNA를 분리 및 정제하고 이를 MALDI-TOF 질량 분석기(Shimadzu, Japan)를 이용하여 목표 염기서열과 부합하는지 확인하였다. 이후, 센스와 안티센스 RNA 가닥을 결합시켜
서열번호 31 내지 230을 각각 센스가닥으로 가지는 siRNA 및 siCONT를 제조하였다.
실시예 6. 인간 폐암세포 세포주에서 siRNA를 이용한 엠피레귤린의 발현억제
상기 실시예 5에서 제조된 서열번호 31 내지 230을 각각 센스가닥으로 가지는 siRNA를 이용하여 인간 폐암세포 세포주(A549)를 형질전환시키고, 상기 형질전환된 세포주에서 siRNA의 처리에 따른 엠피레귤린 발현양상을 분석하였다.
6-1: 인간 폐암세포 세포주의 배양
미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 폐암세포(A549) 세포주는 DMEM 배양배지(GIBCO/Invitrogen, USA, 10%(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100 units/㎖ 및 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖)에서 37 ℃, 5%(v/v) CO2의 조건 하에 배양하였다.
6-2: 인간 폐암세포 세포주에서 목표 siRNA의 형질주입
상기 실시예 5-1에서 배양된 1.2× 105 섬유모세포(NIH3T3) 세포주를 37℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 6-well 플레이트에서 18시간 동안 DMEM에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰(well)당 500㎕의 Opti-MEM 배지(GIBCO, USA)를 분주하였다.
한편, 리포펙타민 RNAi 맥스(Lipofectamine™ RNAi Max, Invitrogen, USA) 3.5㎕와 Opti-MEM 배지 246.5㎕를 혼합하여 혼합액을 제조하였고, 실온에서 5분간 반응시킨 다음, 상기 실시예 1에서 제조한 각각의 서열번호 31 내지 50번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA (1pmole/㎕) 5 또는 20㎕를 Opti-MEM 배지 230㎕에 첨가하여 최종 농도가 20 nM인 siRNA 용액을 제조하였다. 상기 리포펙타민 RNAi 맥스 혼합액과 siRNA 용액을 혼합하여 실온에서 15 분간 반응시켜 형질주입용 용액을 제조하였다.
그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰(well)에 형질주입용 용액을 각각 500㎕씩 분주하고 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하였다. 여기에 RPMI 1640 배양배지 1㎖씩 분주한 다음 24시간 동안 37℃에서 5%(v/v) CO2의 조건 하에서 배양하였다.
6-3: 엠피레귤린 mRNA의 정량분석
상기 실시예 6-2에서 형질주입된 세포주로부터 상기 실시예 2-3-1과 동일한 방법으로 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 앰피레귤린 mRNA 발현량을 상대정량 하였다.
6-3-1: 엠피레귤린 mRNA의 상대정량 분석
상기 실시예 6-2에서 형질주입된 세포주로부터 상기 실시예 2-3-1과 동일한 방법으로 제조된 cDNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 통해 엠피레귤린 mRNA의 상대적인 양을 하기와 같은 방법으로 정량하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 제조된 cDNA를 증류수로 5배 희석하고, 엠피레귤린 mRNA 발현량 분석을 위해서 희석된 cDNA 3㎕와 2×GreenStar™ PCR master mix(BIONEER, 한국)를 10㎕, 증류수 6㎕, 인간 엠피레귤린 qPCR 프라이머 (hAREG-F, ACACCTACTCTGGGAAGCGT; hAREG-R, GCCAGGTATTTGTGGTTCGT10pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)을 1㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, 엠피레귤린 mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스키핑 유전자(housekeeping gene, 이하 HK 유전자)인 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; hGAPDH-F, GGTGAAGGTCGGAGTCAACG; hGAPDH-R, ACCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG)를 표준 유전자로 하였다. 상기 혼합액이 담긴 96-웰 플레이트를 Exicycler™96 Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER, 한국)을 이용하여 하기와 같은 반응을 수행하였다: 95℃에서 15분 간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94 ℃에서 30초 변 성(denaturing), 58℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42 회 반복 수행하고, 72℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55℃에서 1분간 온도를 유지하고, 55℃에서 95℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다. PCR이 종료된 후, 각 각 수득한 엠피레귤린의 Ct(threshold cycle) 값은 GAPDH 유전자를 통해 정규화된 mRNA 값(normalization factor, NF)을 계산하여 보정된 엠피레귤린의 Ct 값을 구한 뒤, 엠피레귤린 특이적 siRNA가 처리되지 않은 세포주의 발현양을 대조군으로 하여 ΔCt값의 차이를 구했다. 상기 ΔCt 값과 계산식 2(-ΔCt)×100을 이용하여 서열번호 31 내지 50의 서열을 센스가닥으로 가지는 앰피레귤린 특이적 엠피레귤린 siRNA 처리에 따른 앰피레귤린 mRNA의 발현량을 상대정량하였다 (도 3 참조). 상기 앰피레귤린 siRNA 거의 모두가 앰피레귤린 mRNA 발현을 억제하였는데, 대조군에 비해 엠피레귤린 mRNA 발현양이 크게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 그 중에서도 특히 서열번호 39 내지 41, 43 내지 45, 47, 49 및 50에서 선택된 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 가지는 siRNA가 가장 우수한 앰피레귤린 mRNA 발현 저해능력을 나타내었다.
또한 서열번호 51 내지 230 번에 따른 서열을 각각 센스가닥으로 가지는 siRNA를 사용한 경우에도 서열번호 31 내지 50번에 기재된 서열과 유사하게 매우 효율적으로 엠피레귤린의 발현을 억제할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 엠피레귤린 특이적 이중나선 올리고 RNA는 엠피레귤린의 발현을 매우 효율적으로 억제할 수 있으며, 본 발명에 따른 엠피레귤린 특이적 이중나선 올리고 RNA, 이를 포함하는 이중 나선 올리고 RNA 구조체, 및/또는 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자를 포함하는 조성물은 호흡기 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> BIONEER CORPORATION <120> Amphiregulin-specific double stranded oligo-RNA, double-stranded oligo RNA molecules comprising the double strand oligo-RNA, and composition for the prevention or treatment of respiratory diseases comprising the same <130> PP-B1262 <150> KR10-2012-0110559 <151> 2012-10-05 <160> 230 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 1 ggaguaugau aaugaacca 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 2 caguaguagc ugucacuau 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 3 agacucacag cgaggauga 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 4 cacaaauauc cggcuauau 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 5 caccauaagc gaaaugccu 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> 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<213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 193 uacucggcuc aggccauua 19 <210> 194 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 194 uggcuauauu gucgaugau 19 <210> 195 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 195 auucacggag aaugcaaau 19 <210> 196 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 196 aaacucacag caugauuga 19 <210> 197 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 197 auuacagucc agcuuagaa 19 <210> 198 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 198 ugauggauuu gagguuacc 19 <210> 199 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 199 ucagaagagu augauaacg 19 <210> 200 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 200 agaguaugau aacgaacca 19 <210> 201 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 201 ugauaacgaa ccacaaaua 19 <210> 202 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 202 acggagaaug caaauauau 19 <210> 203 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 203 cuaguaguga accguccuc 19 <210> 204 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 204 gaagaguaug auaacgaac 19 <210> 205 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 205 aaaugccuuc uaguaguga 19 <210> 206 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 206 uaacgaacca caaauaccu 19 <210> 207 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 207 auugucgaug auucaguca 19 <210> 208 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 208 acaugcaaau gucagcaag 19 <210> 209 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 209 uguugcuguu auuacaguc 19 <210> 210 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 210 uagagcaccu ggaagcagu 19 <210> 211 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 211 aacgaaagaa acuucgaca 19 <210> 212 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 212 aaauaccugg cuauauugu 19 <210> 213 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 213 aauacgucag gaaauauga 19 <210> 214 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 214 uggaaaugua caugcuaua 19 <210> 215 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 215 acgucaggaa auaugaagg 19 <210> 216 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 216 uuggaccuca augacaccu 19 <210> 217 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 217 uaacaugcaa augucagca 19 <210> 218 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 218 augacuacuc agaagagua 19 <210> 219 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 219 aaauccaugu aaugcagaa 19 <210> 220 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 220 ggaagcguga accauuuuc 19 <210> 221 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 221 ucugggaagc gugaaccau 19 <210> 222 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 222 uauugucgau gauucaguc 19 <210> 223 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 223 aguaacaugc aaaugucag 19 <210> 224 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 224 uuagaagaca auacgucag 19 <210> 225 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 225 aaaauccaug uaaugcaga 19 <210> 226 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 226 gcuggauugg accucaaug 19 <210> 227 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 227 cugauggauu ugagguuac 19 <210> 228 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 228 ccucaagaag ugagauguc 19 <210> 229 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 229 gagccgacua ugacuacuc 19 <210> 230 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> amphiregulin-specific siRNA <400> 230 gauucaguca gaguugaac 19

Claims (27)

  1. 서열번호 1 내지 230 중에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스가닥(sense strand)과 이에 상보적 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 엠피레귤린 특이적 siRNA.
  2. 제1항에 있어서, 상기 siRNA의 센스가닥 또는 안티센스 가닥은 19 내지 31개의 뉴클레오타이드로 이루어진 것을 특징으로 하는 앰피레귤린 특이적 siRNA.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 8, 9, 28, 39 내지 41, 43 내지 45, 47, 49 및 50으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스가닥과 이에 상보적 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 앰피레귤린 특이적 siRNA.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 siRNA의 센스가닥 또는 안티센스 가닥은 하나 이상의 화학적 변형(chemical modification)을 포함하는 것을 특징으로 하는 앰피레귤린 특이적 siRNA.
  5. 제4항에 있어서, 상기 화학적 변형은 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸), -OCH3(methoxy), -NH2,-F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형;
    뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형;
    뉴클레오티드결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate), 메틸포스포네이트(methylphosphonate) 결합으로의 변형;
    PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid)또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형;
    에서 선택된 하나 이상의 변형임을 특징으로 하는 앰피레귤린 특이적 siRNA.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥의 5’말단에 하나 이상의 인산기(phosphate group(s))가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 앰피레귤린 특이적 siRNA.
  7. 하기 구조식 (1)의 구조를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
    구조식 1
    Figure pct00004

    상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 앰피레귤린 특이적 siRNA를 의미한다.
  8. 제7항에 있어서, 하기 구조식 (2)의 구조를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
    구조식 2
    Figure pct00005

    상기 구조식 (2)에서, S 및 AS는 각각 제7항에 따른 siRNA의 센스가닥 및 안티센스가닥을 의미하며, A, B, X 및 Y는 제7항에서의 정의와 동일하다.
  9. 제8항에 있어서, 하기 구조식 (3)의 구조를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
    구조식 3
    Figure pct00006

    상기 구조식 (3)에서, A, B, X, Y, S 및 AS는 제8항에서의 정의와 동일하며, 5’ 및 3’은 siRNA 센스가닥의 5’ 말단 및 3’ 말단을 의미한다.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 앰피레귤린 특이적 siRNA는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 siRNA임을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 물질의 분자량은 200 내지 10,000 임을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 친수성 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐피롤리돈 및 폴리옥사졸린으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나임을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  13. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소수성 물질의 분자량은 250 내지 1,000인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 소수성 물질은 스테로이드(steroid) 유도체, 글리세라이드(glyceride) 유도체, 글리세롤 에테르(glycerol ether), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), C12내지 C50의 불포화 또는 포화탄화수소(hydrocarbon), 디아실포스파티딜콜린(diacylphosphatidylcholine), 지방산(fatty acid), 인지질(phospholipid) 및 리포폴리아민(lipopolyamine)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 스테로이드(steroid) 유도체는 콜레스테롤, 콜리스탄올, 콜산, 콜리스테릴포르메이트, 코테스타닐포르메이트 및 콜리스타닐아민으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  16. 제14항에 있어서, 상기 글리세라이드 유도체는 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  17. 제7항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 X 및 Y로 표시되는 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 비분해성 결합은 아미드 결합 또는 인산화 결합인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체
  19. 제17항에 있어서, 상기 분해성 결합은 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  20. 제7항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 나노입자(nanoparticle).
  21. 제20항에 있어서, 서로 다른 서열을 포함하는 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체가 혼합되어 구성되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  22. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 siRNA, 제7항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체, 또는 제20항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 나노입자를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 호흡기 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 만성폐쇄성폐질환(COPD), 특발성 폐섬유화증(IPF), 천식, 급만성기관지염, 알레르기 비염, 진해 거담, 기관지염, 세기관지염, 인후염, 편도염 또는 후두염 중에서 선택된 질환인 것을 특징으로 하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 동결건조된 형태의 제형.
  26. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 siRNA, 제7항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체, 제20항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 나노입자, 또는 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제형을 예방 또는 치료를 요하는 개체에게 투여하는 것을 특징으로 하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 만성폐쇄성폐질환(COPD), 특발성 폐섬유화증(IPF), 천식, 급만성기관지염, 알레르기 비염, 진해 거담, 기관지염, 세기관지염, 인후염, 편도염 또는 후두염 중에서 선택된 질환인 것을 특징으로 하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료 방법.
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