JP2015532100A - アンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴrna、そのような二重鎖オリゴrnaを含む二重鎖オリゴrnaの構造体及びこれを含む呼吸器疾患の予防または治療用の組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は呼吸器疾患の予防または治療に有用に使用することができる高効率のアンフィレギュリンの発現阻害剤であるアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴRNAに関するものである。また、本発明は上記のアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴRNAの生体内の安定性の向上及び細胞伝達の効率を改善するために親水性及び疎水性の物質を単純共有結合またはリンカ−媒介の共有結合させてアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴRNAの構造体及びこれらでなっているナノ粒子に関するものである。
Description
発明の分野
本発明は呼吸器疾患の連関遺伝子の特異的な二重鎖オリゴRNA及びこれを含む高効率の二重鎖オリゴRNAの構造体に関するもので、上記の二重鎖オリゴRNAの構造体は細胞内へ効率的に伝達されるようにするために二重鎖RNA(siRNA)の両末端に親水性の物質及び疎水性の物質を単純共有結合またはリンーカ‐媒介(linker−mediated)の共有結合を用いて接合された形態の構造を持ち、水溶液で上記の二重鎖オリゴRNAの構造体らの疎水性の相互作用によりナノ粒子の形態に転換されることができる。上記の二重鎖オリゴRNAの構造体に含まれた二重鎖オリゴRNAは呼吸器疾患の連関遺伝子であるアンフィレギュリン(Amphiregulin)に特異的であることが望ましく、特にアンフィレギュリンに特異的なsiRNAであることが望ましい。
本発明は呼吸器疾患の連関遺伝子の特異的な二重鎖オリゴRNA及びこれを含む高効率の二重鎖オリゴRNAの構造体に関するもので、上記の二重鎖オリゴRNAの構造体は細胞内へ効率的に伝達されるようにするために二重鎖RNA(siRNA)の両末端に親水性の物質及び疎水性の物質を単純共有結合またはリンーカ‐媒介(linker−mediated)の共有結合を用いて接合された形態の構造を持ち、水溶液で上記の二重鎖オリゴRNAの構造体らの疎水性の相互作用によりナノ粒子の形態に転換されることができる。上記の二重鎖オリゴRNAの構造体に含まれた二重鎖オリゴRNAは呼吸器疾患の連関遺伝子であるアンフィレギュリン(Amphiregulin)に特異的であることが望ましく、特にアンフィレギュリンに特異的なsiRNAであることが望ましい。
また、本発明は上記の二重鎖オリゴRNAの構造体の製造方法及び上記の二重鎖オリゴRNAの構造体を含む呼吸器疾患、特に慢性閉鎖性肺疾患(CPOPD)及び/または特発性肺繊維症(IPF)を予防または治療するための薬剤学的の組成物に関するものである。
背景技術
遺伝子の発現を抑制する技術は疾病治療のための治療剤の開発及び標的検証で重要な道具である。標的遺伝子の発現を抑制する従来の技術としては標的遺伝子に対する転移遺伝子を導入する技術が開示されており、プロモーターを基準にして逆方向(antisense)へ転移遺伝子を導入する方法(Sheehy et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:8805−8808, 1988; Smith et al.,Nature, 334:724−726, 1988)とプロモーターを基準にして正方向(sense)へ移植の 遺伝子を導入する方法(Napoli et al., Plant Cell, 2:279−289, 1990; van der Krol et al., Plant Cell, 2:291−299, 1990; 米国特許第 5,034,323号; 米国特許第5,231,020号;及び、米国特許第5,283,184号)で ある。
遺伝子の発現を抑制する技術は疾病治療のための治療剤の開発及び標的検証で重要な道具である。標的遺伝子の発現を抑制する従来の技術としては標的遺伝子に対する転移遺伝子を導入する技術が開示されており、プロモーターを基準にして逆方向(antisense)へ転移遺伝子を導入する方法(Sheehy et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:8805−8808, 1988; Smith et al.,Nature, 334:724−726, 1988)とプロモーターを基準にして正方向(sense)へ移植の 遺伝子を導入する方法(Napoli et al., Plant Cell, 2:279−289, 1990; van der Krol et al., Plant Cell, 2:291−299, 1990; 米国特許第 5,034,323号; 米国特許第5,231,020号;及び、米国特許第5,283,184号)で ある。
一方、最近に20ないし25塩基対を持つ二重鎖のRNA断片の蓄積により転写後遺伝子の抑制またはRNA干渉(RNAi)の現象が起こり、上記の二重鎖のRNAはRNAの鋳型から合成されるという事実が報告されたことがあった(Hamilton & Baulcumbe, Science, 286:950−952, 1999)。上記の二重鎖のRNA断片は゛小さい干渉RNA(small interfering RNA, 以下 siRNAという)”と命名された。この後、哺乳動物を含んだ多様な生命体でsiRNAは遺伝子の発現を抑制する重要な要素であるという事実が明らかになっている(Fire et al., Nature, 391:806−811, 1998; Timmons & Fire, Nature, 395:854, 1998; Kennerdell & Carthew, Cell, 95:1017−1026, 1998; Elbashir et al., Nature, 411:494− 497, 2001; WO 99/32619)。また、二重鎖のsiRNAは細胞内でRISC(RNA−induced silencing complex)タンパク質複合体により単一鎖のRNAに転換され、この後ターゲット mRNAと結合してmRNAを不活性化させることとして知られている(Novina & Sharp, Nature, 430:161−164, 2004)。上記したようにsiRNAを用いた遺伝子の発現抑制技術は標的細胞で標的遺伝子の発現を抑制させて、これによる変化を観察することで、標的細胞での標的遺伝子の機能を究明する研究に有用に用いられる。特に、感染性のウィルスまたは癌細胞などで標的遺伝子の機能を抑制するものは該当の疾病の治療方法を開発するのに有用に活用されることとして予測される。生体外(in vitro)での研究及び実験動物を用いた生体内(in vivo)の研究を行った結果、siRNAによる標的遺伝子の発現抑制が可能であると報告されたことである(McCaffrey et al., Nature Biotechnology, 21:639−644, 2003; Giladi et al., Molecular Therapy, 8:769−776, 2003; Konishi et al., epatology, 38:842−850, 2003; Sen et al., Virus Research, 96:27−35, 2003; Yokota et al., EMBO Reports, 4:602−608, 2003; Song et al., Nature Medicine, 9:347−351, 2003; McCaffrey et al., Nature, 418:38−39, 2002)。一例で、国際特許公開公報WO 03/070969号にはsiRNAを用いて癌細胞でBcl2タンパク質の発現を抑制させることによって、癌細胞を治療する方法が開示されており、WO 04/009769号にはsiRNAを用いて血管新生を誘発するVEGFタンパク質の発現を抑制させることによって、癌細胞を治療する方法が開示されている。
また、siRNAの作用機序はターゲットmRNAと相補的に結合して配列特異的にターゲット遺伝子の発現を調節するために、既存の抗体基盤の医薬品か化学物質(small molecule drug)に比べて適用できる対象が画期的に拡大できるという長所を持つ(Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 2006 13(4):664−670)。
siRNAの優れた効果及び多様な使用範囲にも関わらず、siRNAが治療剤で開発されるためには体内でのsiRNAの安定性(stability)の改善と細胞伝達の効率改善を通じてsiRNAがターゲットの細胞へ効果的に伝達されなければならない(Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development. Drug Discov Today. 2006 Jan; 11(1−2):67−73)。
上記の体内安定性の向上及びsiRNAの非特異的な細胞免疫反応(innate immune stimulation)の問題解決のために、siRNAの一部ヌクレオチドまたは 骨格 (backbone)を核酸分解酵素の抵抗性を持つように変形(modification)するか、ウィルス性のベクター(viral vector)、リポソームまたはナノ粒子(nanoparticle)などの伝達体の利用などに対する研究が活発に試みられている。
アデノウィルスかレトロウィルスなどのウィルス性のベクターを用いた伝達システムは形質注入の効率(transfection efficiency)が高いが、免疫原性(immunogenicity)及び発癌性(oncogenicity)が高い。もう一方、ナノ粒子を含む非ウィルス性(non−viral)の伝達システムはウィルス性の伝達システムに比べて細胞伝達の効率は低い方であるが、生体内(in vivo)での安全性が高く、ターゲット特異的に伝達が可能で、内包されているRNAiオリゴヌクレオチドを細胞または組織へ吸収(uptake)及び内在化(internalization)などの改善された伝達効果が高いだけではなく、細胞毒性及び免疫誘発(immune stimulation)が殆どないという長所を持っており、現在はウィルス性の伝達システムに比べて有力な伝達方法として評価されている(Nonviral delivery of synthetic siRNAs in vivo. J Clin Invest. 2007 December 3; 117(12): 3623-3632)。
上記の非ウィルス性の伝達システムの中でナノ伝達体(nanocarrier)を用いる方法はリポソーム、陽イオンの高分子の複合体などの多様な高分子を用いることでナノ粒子を形成して、siRNAをこのようなナノ粒子(nanoparticle)、即ちナノ伝達体(nanocarrier)に担持して細胞へ伝達する形態を持つ。ナノ伝達体を用いる方法の中主に活用される方法は高分子のナノ粒子(polymeric nanoparticle)、高分子のミセル(polymer micelle)、リポプレックス(lipoplex)などがあり、この中でリポプレックスを用いた方法は陽イオン性の脂質で構成されて細胞のエンドソーム(endosome)の陰イオン性の脂質と相互作用してエンドソームの脱安定化効果を誘発して細胞内へ伝達する役割をする(Proc. Natl. Acad. Sci. 15; 93(21):11493−8, 1996)。
また、siRNAのパッセンジャー (passenger;センス(sense))鎖の末端部位に化学物質などを連結して増進された薬動力学(pharmacokinetics)的の特徴を持つようにして生体内(in vivo)で高い効率を誘導できるということが知られている(Nature 11; 432(7014):173−8, 2004)。この時siRNAのセンス(sense;パッセンジャー(passenger))またはアンチセンス(antisence;ガイド(guide))鎖の末端に結合された化学物質の性質に従ってsiRNAの安定性が異なる。例えば、ポリエチレングリコール(polyethylene glycol, PEG)のような高分子の化合物が接合された形態のsiRNAは陽イオン性の物質が存在する条件でsiRNAの陰イオン性のリン酸基と相互作用して複合体を形成することによって、改善されたsiRNAの安定性を持った伝達体になる(J Control Release 129(2):107−16, 2008)。特に高分子の複合体で構成されたミセル(micelle)らは薬物伝達の運搬体として用いられるほかのシステムであるマイクロスフィア(microsphere)またはナノ粒子(nanoparticle)などに比べ、その大きさが極めて小さくても分布が非常に一定で、自発的に形成される構造なので製剤の品質管理及び再現性の確保が容易であるという長所がある。
また、siRNAの細胞内伝達の効率性を向上させるために、siRNAに生体適合性の高分子である親水性の物質(たとえば、ポリエチレングリコール(polyethylene glycol, PEG))を単純共有結合またはリンカー−媒介(linker−mediated)の共有結合で接合させたsiRNAの接合体を通じて、siRNAの安定性の確保及び効率的な細胞膜の透過性のための技術が開発された(大韓民国登録特許第883471号)。しかしながら siRNAの化学的な変形及びポリエチレングリコール(polyethylene glycol, PEG)を接合させること(PEGylation)だけでは生体内での低い安定性とターゲット臓器への伝達が円滑でないという短所は依然として持っている。このような短所を解決するためにオリゴヌクレオチド、特にsiRNAのような二重鎖オリゴRNAに親水性及び疎水性の物質が結合された二重鎖オリゴRNAの構造体が開発されて、上記の構造体は疎水性物質の疎水性の相互作用によりSAMiRNATM(Self Assembled Micelle Inhibitory RNA)と命名された自家組立のナノ粒子を形成することになり(大韓民国登録特許第1224828号参照)、SAMiRNATM技術は既存の伝達技術と比べて非常にサイズが小さくても均一な(homogenous)ナノ粒子を収得できるという長所を持つ。
一方、アンフィレギュリンは上皮細胞の成長因子の受容体に結合して上皮細胞の受容体の経路(EGFR pathway)を活性化させて、細胞増殖に関与するという事実が知られており、アンフィレギュリンに特異的なsiRNAによりアンフィレギュリンンの発現を阻害させることができ、これは特定タイプの乳房癌で治療効果を示すと開示された(Cancer Res. 2008; 68:225−2265)。また、アンフィレギュリンに対するshRNAを用いて炎症性の乳房癌での細胞浸透を抑制できて(J Cell Physiol. 2011 226(10):2691−2701)、アンフィレギュリンに特異的なshRNAを用いてアンフィレギュリンの発現を抑制するとタバコ煙に露出されたねずみでの肺動脈の再形成(pulmonary artery remodeling)が抑制されたという事実が開示されている(Arch Biochem Biophys, 1;508(1):93−100)。気道平滑筋(airway smooth muscle; ASM)の過形成(hyperplasia)と血管新生にアンフィレギュリンの関連があり、特に喘息患者の気道再形成(airway remodeling)を促進するということ(J Korean Med Sci 2008; 23: 857−863)と急性喘息に従う組織の再形成で過多分泌される表皮細胞の成長因子(EGF)とアンフィレギュリンが関与するということが開示されている(J Alergy Clin Immunol 2009;124:913−920)。
喘息をともに代表的な肺疾患のひとつである慢性閉鎖性肺疾患(Chronic Obstructive Pulmonary Disease、以下、 ‘COPD’という)は非可逆的な気道の閉鎖を伴うという点で喘息と異なり、繰返される感染、有害な粒子とかガスの吸入とか喫煙により発生する肺の非正常的な炎症反応とこれに伴って完全に可逆的ではなく徐々に進行する気流制限を示す呼吸器の疾患である(Am J Respir Crit Care Med, 163:1256−1276, 2001)。全世界的にCOPDの深刻性が強調されていてこれはCOPDが1990年全体の死亡疾患の中6位であったが2020年には3位になると予測され、10大疾患の中唯一にその発病率が増加する重要な疾患である。また、疾患による障害の原因としては4位になると予測されるのでCOPDによる社会、経済的な疾病の負担が急激に増加することと予想される(Lancet, 349:1498−1504, 1997)。慢性閉鎖性肺疾患は気道及び肺実質の炎症による細気管支及び肺実質の病理学的な変化により発生する病気で、閉鎖性細気管支炎及び肺気腫(肺実質の破壊)を特徴にする。慢性閉鎖性肺疾患の種類には慢性閉鎖性気管支炎(Chronic obstructive bronchitis)、慢性細気管支炎(Chronic bronchiolitis)及び肺気腫(Emphysema)などがある。慢性閉鎖性肺疾患の場合好中球の数が増加して、GM−CSF、TNF−α、IL−8、MIP−2のようなサイトカインが分泌される。気道に炎症が起こり、筋肉壁が厚くなって、粘液の分泌が増加して気管支の閉鎖が現れる。気管支が閉鎖されると肺胞は拡張されて損傷になり酸素と二酸化炭素の交換能力が損傷を受けることになり、呼吸不全の発生が高くなる。すでに国内45歳以上の成人の8%が慢性閉鎖性肺疾患の患者であるにもかかわらず肺ガンだけに関心が偏っていて、慢性閉鎖性肺疾患を治療する従来の方法は抗炎症作用を持つ治療剤か気管支拡張の効果を持つ治療剤を利用する程で、遺伝子治療剤による本質的な慢性閉鎖性肺疾患の予防及び治療はかすかな実情である。上記の抗炎症作用を持つ代表的な治療剤はグルココルチコイド(glucocorticoid)、ロイコトリエンモディファイヤー(leukotriene modifiers)、テオフィリン(theophylline)などがある。しかしながら、上記のグルココルチコイド(glucocorticoid)は効果面では強力だが薬物副作用が問題になり吸入治療を行っており、治療効果も選択的に作用するものではなくすべての免疫反応と抗炎症の反応を抑制するために場合によって、必要な免疫反応まで抑制する問題点がある。上記のロイコトリエンモディファイヤー(leukotriene modifiers)は副作用は少ないが効果面で限界があり、単独で使用するときには喘息を調節することができない。従って大部分補助的に使用している問題点がある。上記のテオフィリン(theophylline)は効果面でも優れてないし副作用の恐れがあるという問題点がある。従って、慢性閉鎖性肺疾患を予防して治療できる効果が優れて副作用の少ない新しい治療剤に対する需要が切実な状況である。
一方、特発性肺繊維症(Idiopathic Pulmonary Fibrosis、以下‘IPF’という)は肺胞 (気胞)の壁に慢性炎症の細胞らが浸透しながら肺を固くさせる色々な変化が発生しながら肺組織のひどい構造的な変化を引き起こして徐々に肺機能が低下されて結局には死亡になる疾患で、 今のところは効果的な治療方法がなくて大抵に症状が現れて診断を受けると生存期間中央値が3〜5年程度しかならないとても予後が悪い疾病である。発生頻度は外国の場合人口10万名当たり約3−5名程度で報告されており 大抵に50代以後に発病率が高く男子が女子より2倍ぐらい発生率が高いことで知られている。
IPFの発病の原因はまだ明確に究明されてはないが、喫煙者で頻度が高く、抗うつ剤、胃−食道逆流による慢性的な肺吸入、金属粉塵、木材粉塵、または溶媒剤吸入などがIPFの発生と連関がある危険因子と報告されたこともあるが、大部分の患者らにおいては確実な因果関係がある因子らを探すことができない。
IPFは治療をしないとき、継続的に悪化され患者の約50%以上が3−5年内に死亡すると知られており、また、一応病気が進行されて完全に繊維化で固められた後にはどのような治療を行っても好転にならないために治療するならば早期に治療する場合に効果がある可能性が高いと予測している。現在使用している治療剤としてはステロイド(steroid)とアザチオプリン(azathioprine)、またはシクロホスファミド(cyclophosphamideの併合療法を使用する方法が知られているが、特別な効果を示したと判断するには難しく、色々な繊維化抑制剤らが動物実験及び小規模の患者らに試みられたが明らかな効果が立証されたことがない状態である。特に末期IPF患者では肺移植以外の他の効果的な治療方法がない実情である。従って、より効率的なIPFの治療剤の開発が切実な状況である。
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:8805−8808, 1988
Smith et al., Nature, 334:724−726, 1988
Plant Cell, 2:279−289, 1990
Plant Cell, 2:291−299, 1990
発明の要約
本発明の目的は上記のような既存の問題点を解決しようとアンフィレギュリンに特異的でありながら非常に高い効率でその発現を阻害できる新規の二重鎖オリゴRNA、特にsiRNA及びこれを含む二重鎖オリゴRNAの構造体、そしてそのような二重鎖オリゴRNAの構造体の製造方法を提供することである。
本発明の目的は上記のような既存の問題点を解決しようとアンフィレギュリンに特異的でありながら非常に高い効率でその発現を阻害できる新規の二重鎖オリゴRNA、特にsiRNA及びこれを含む二重鎖オリゴRNAの構造体、そしてそのような二重鎖オリゴRNAの構造体の製造方法を提供することである。
また、本発明の別の目的は上記のアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴRNA、またはそのような二重鎖オリゴRNAを含む二重鎖オリゴRNAの構造体を有効成分に含む呼吸器の疾患、特にCOPD及び/またはIPFの予防または治療用の薬剤学的な組成物を提供することである。
本発明のまた別の目的は上記のアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴRNA、またはそのような二重鎖オリゴRNAを含む二重鎖オリゴRNAの構造体を用いて呼吸器の疾患、特にCOPD及び/またはIPFの予防または治療する方法を提供することである。
本発明の別の特徴及び具現の例は次の詳細な説明及び添付された特許請求の範囲からさらに明白になるはずだ。
発明の詳細な説明及び望ましい具現の例
別に定義されてない限り、本明細書で使用されたすべての技術的及び科学的な用語らは本発明の属する技術分野で熟練された専門家によって通常的に理解されるものと同一な意味を持つ。一般的に、本発明書で使用された命名法は本技術分野でよく知られており、通常的に使用されるものである。
別に定義されてない限り、本明細書で使用されたすべての技術的及び科学的な用語らは本発明の属する技術分野で熟練された専門家によって通常的に理解されるものと同一な意味を持つ。一般的に、本発明書で使用された命名法は本技術分野でよく知られており、通常的に使用されるものである。
本発明はアンフィレギュリンの発現を抑制できる二重鎖オリゴRNAを提供する。本発明に従う二重鎖オリゴRNAの形態ではsiRNA(short interfering RNA)、shRNA(short hairpin RNA) およびmiRNA(microRNA)などが望ましいがこれに限られるものではない。
また、 miRNAに対する拮抗剤(antagonist)の役割ができる単一鎖のmiRNAの阻害剤も本発明に従う二重鎖オリゴRNAに含まれるものと解釈される。
以下、本発明で提供される二重鎖オリゴRNAをsiRNAを中心に説明することにする。しかしながら、本発明で提供される二重鎖オリゴRNAはsiRNAに限定になるものではないことは通常の技術者には自明なことで、同一な特性が siRNAを除いたほかの二重鎖オリゴRNAにも適用できるという点も通常の技術者には自明なことである。
具体的に本発明では配列番号1ないし配列番号230で選択されたいずれかの配列を含むセンス鎖(sense strand)である第1オリゴヌクレオチドとその相補的な配列を含むアンチセンス鎖である第2オリゴヌクレオチドを含むアンフィレギュリンに特異的なsiRNAを提供する。
5′−ggaguaugauaaugaacca−3′(配列番号 1),
5′−caguaguagcugucacuau−3′(配列番号 2),
5′−agacucacagcgaggauga−3′(配列番号 3),
5′−cacaaauauccggcuauau−3′(配列番号 4),
5′−caccauaagcgaaaugccu−3′(配列番号 5),
5′−gauuacuuuggugaacggu−3′(配列番号 6),
5′−caguugucacuuuuuauga−3′(配列番号 7),
5′−ggaccuauccaagauugca−3′(配列番号 8),
5′−cguuaucacagugcaccuu−3′(配列番号 9),
5′−ccuagcugaggacaaugca−3′(配列番号 10),
5′−ggaagagagguuuccacca−3′(配列番号 11),
5′−cucagaggaguaugauaau−3′(配列番号 12),
5′−cgguggacuugagcuuucu−3′(配列番号 13),
5′−gguggugacaugcaauugu−3′(配列番号 14),
5′−cagggaauaugaaggagaa−3′(配列番号 15),
5′−ggaggcuucgacaagaaaa−3′(配列番号 16),
5′−ccgguggaaccaaugagaa−3′(配列番号 17),
5′−ccggcuauauuauagauga−3′(配列番号 18),
5′−agaauccaugcacugccaa−3′(配列番号 19),
5′−caaggaccuauccaagauu−3′(配列番号 20),
5′−caaauauccggcuauauua−3′(配列番号 21),
5′−gggacuacgacuacucaga−3′(配列番号 22),
5′−gcgaaugcagauacaucga−3′(配列番号 23),
5′−gccacaccggaaaugacau−3′(配列番号 24),
5′−agaguugaacaggugauua−3′(配列番号 25),
5′−gaaccacaaauauccggcu−3′(配列番号 26),
5′−cauaagcgaaaugccuucu−3′(配列番号 27),
5′−guuuccaccauaagcgaaa−3′(配列番号 28),
5′−caggugauuaagcccaaga−3′(配列番号 29),
5′−ccacaccggaaaugacauu−3′(配列番号 30),
5′−gagugaaaugccuucuagu−3′(配列番号 31),
5′−cagaguugaacagguaguu−3′(配列番号 32),
5′−cuggauuggaccucaauga−3′(配列番号 33),
5′−gaaaacucacagcaugauu−3′(配列番号 34),
5′−gaaacuucgacaagagaau−3′(配列番号 35),
5′−caggaaauaugaaggagaa−3′(配列番号 36),
5′−gcaaauauauagagcaccu−3′(配列番号 37),
5′−ggugcugucgcucuugaua−3′(配列番号 38),
5′−ucagaguugaacagguagu−3′(配列番号 39),
5′−gaaagaaacuucgacaaga−3′(配列番号 40),
5′−gacaauacgucaggaaaua−3′(配列番号 41),
5′−cggcucaggccauuaugcu−3′(配列番号 42),
5′−ggaccacagugcugaugga−3′(配列番号 43),
5′−gcugcuggauuggaccuca−3′(配列番号 44),
5′−guuauuacaguccagcuua−3′(配列番号 45),
5′−uggaccucaaugacaccua−3′(配列番号 46),
5′−cuggcuauauugucgauga−3′(配列番号 47),
5′−gacggaaagugaaaauacu−3′(配列番号 48),
5′−gcagccauagcugccuuua−3′(配列番号 49),
5′−ggagccgacuaugacuacu−3′(配列番号 50),
5′−guaugauaacgaaccacaa−3′(配列番号 51),
5′−agugaaaugccuucuagua−3′(配列番号 52),
5′−gauaacgaaccacaaauac−3′(配列番号 53),
5′−ugcauuagcagccauagcu−3′(配列番号 54),
5′−cgggagccgacuaugacua−3′(配列番号 55),
5′−ccgacuaugacuacucaga−3′(配列番号 56),
5′−gcauucacggagaaugcaa−3′(配列番号 57),
5′−ccaugaaaacucacagcau−3′(配列番号 58),
5′−cagcaugauugacaguagu−3′(配列番号 59),
5′−cuuagaagacaauacguca−3′(配列番号 60),
5′−ugacuacucagaagaguau−3′(配列番号 61),
5′−agaguugaacagguaguua−3′(配列番号 62),
5′−auauauagagcaccuggaa−3′(配列番号 63),
5′−agcagccauagcugccuuu−3′(配列番号 64),
5′−gaguugaacagguaguuaa−3′(配列番号 65),
5′−cauucacggagaaugcaaa−3′(配列番号 66),
5′−ucaggaaauaugaaggaga−3′(配列番号 67),
5′−cagaagaguaugauaacga−3′(配列番号 68),
5′−gcuguuauuacaguccagc−3′(配列番号 69),
5′−gggaagcgugaaccauuuu−3′(配列番号 70),
5′−agcugccuuuaugucugcu−3′(配列番号 71),
5′−cacagugcugauggauuug−3′(配列番号 72),
5′−agucagaguugaacaggua−3′(配列番号 73),
5′−uggaagcaguaacaugcaa−3′(配列番号 74),
5′−agaagaguaugauaacgaa−3′(配列番号 75),
5′−gaagcgugaaccauuuucu−3′(配列番号 76),
5′−ggcuauauugucgaugauu−3′(配列番号 77),
5′−gacaagagaauggaaaugu−3′(配列番号 78),
5′−ugaaaugccuucuaguagu−3′(配列番号 79),
5′−gugagugaaaugccuucua−3′(配列番号 80),
5′−gaccucaaugacaccuacu−3′(配列番号 81),
5′−ccucaaugacaccuacucu−3′(配列番号 82),
5′−gcugauggauuugagguua−3′(配列番号 83),
5′−ggaagcaguaacaugcaaa−3′(配列番号 84),
5′−caguaacaugcaaauguca−3′(配列番号 85),
5′−ggaccucaaugacaccuac−3′(配列番号 86),
5′−cagccauagcugccuuuau−3′(配列番号 87),
5′−uccaugaaaacucacagca−3′(配列番号 88),
5′−gcugccuuuaugucugcug−3′(配列番号 89),
5′−gcucuugauacucggcuca−3′(配列番号 90),
5′−ugcugcuggauuggaccuc−3′(配列番号 91),
5′−gaaccacaaauaccuggcu−3′(配列番号 92),
5′−agagcaccuggaagcagua−3′(配列番号 93),
5′−caccuggaagcaguaacau−3′(配列番号 94),
5′−cugaggaacgaaagaaacu−3′(配列番号 95),
5′−gugaaaugccuucuaguag−3′(配列番号 96),
5′−cuacucugggaagcgugaa−3′(配列番号 97),
5′−cugggaagcgugaaccauu−3′(配列番号 98),
5′−acuacucagaagaguauga−3′(配列番号 99),
5′−caugcaaaugucagcaaga−3′(配列番号 100),
5′−ugagguuaccucaagaagu−3′(配列番号 101),
5′−acucggcucaggccauuau−3′(配列番号 102),
5′−uucacggagaaugcaaaua−3′(配列番号 103),
5′−cugcuggauuggaccucaa−3′(配列番号 104),
5′−ugauucagucagaguugaa−3′(配列番号 105),
5′−ucgacaagagaauggaaau−3′(配列番号 106),
5′−cucaagaagugagaugucu−3′(配列番号 107),
5′−uucugcauucacggagaau−3′(配列番号 108),
5′−agguuaccucaagaaguga−3′(配列番号 109),
5′−aaugccuucuaguagugaa−3′(配列番号 110),
5′−augauucagucagaguuga−3′(配列番号 111),
5′−aaacaagacggaaagugaa−3′(配列番号 112),
5′−uuucugcauucacggagaa−3′(配列番号 113),
5′−caaauaccuggcuauauug−3′(配列番号 114),
5′−gaagcaguaacaugcaaau−3′(配列番号 115),
5′−gacuacucagaagaguaug−3′(配列番号 116),
5′−gaugauucagucagaguug−3′(配列番号 117),
5′−ugcauucacggagaaugca−3′(配列番号 118),
5′−gcugaggaacgaaagaaac−3′(配列番号 119),
5′−uggauuugagguuaccuca−3′(配列番号 120),
5′−agugagaugucuucaggga−3′(配列番号 121),
5′−gagguuaccucaagaagug−3′(配列番号 122),
5′−cuucgacaagagaauggaa−3′(配列番号 123),
5′−cucuugauacucggcucag−3′(配列番号 124),
5′−gucagaguugaacagguag−3′(配列番号 125),
5′−caugaaaacucacagcaug−3′(配列番号 126),
5′−ggaaauguacaugcuauag−3′(配列番号 127),
5′−cauguaaugcagaauuuca−3′(配列番号 128),
5′−gauugacaguaguuuauca−3′(配列番号 129),
5′−guccagcuuagaagacaau−3′(配列番号 130),
5′−ugcuggauuggaccucaau−3′(配列番号 131),
5′−gaagacaauacgucaggaa−3′(配列番号 132),
5′−aagacaauacgucaggaaa−3′(配列番号 133),
5′−ugaggaacgaaagaaacuu−3′(配列番号 134),
5′−uucgacaagagaauggaaa−3′(配列番号 135),
5′−ugcuguuauuacaguccag−3′(配列番号 136),
5′−gauggauuugagguuaccu−3′(配列番号 137),
5′−cucaaugacaccuacucug−3′(配列番号 138),
5′−gguuaccucaagaagugag−3′(配列番号 139),
5′−gccgacuaugacuacucag−3′(配列番号 140),
5′−caaauauauagagcaccug−3′(配列番号 141),
5′−agccgacuaugacuacuca−3′(配列番号 142),
5′−accuggcuauauugucgau−3′(配列番号 143),
5′−ccuacucugggaagcguga−3′(配列番号 144),
5′−gcauuagcagccauagcug−3′(配列番号 145),
5′−augauaacgaaccacaaau−3′(配列番号 146),
5′−gcgugaaccauuuucuggg−3′(配列番号 147),
5′−ugggaagcgugaaccauuu−3′(配列番号 148),
5′−agcaguaacaugcaaaugu−3′(配列番号 149),
5′−ugaaaacucacagcaugau−3′(配列番号 150),
5′−agacaauacgucaggaaau−3′(配列番号 151),
5′−auacucggcucaggccauu−3′(配列番号 152),
5′−auuaugcugcuggauugga−3′(配列番号 153),
5′−ugcugauggauuugagguu−3′(配列番号 154),
5′−ugugagugaaaugccuucu−3′(配列番号 155),
5′−auucagucagaguugaaca−3′(配列番号 156),
5′−aagggaggcaaaaauggaa−3′(配列番号 157),
5′−uguuauuacaguccagcuu−3′(配列番号 158),
5′−acgaaagaaacuucgacaa−3′(配列番号 159),
5′−cugcauucacggagaaugc−3′(配列番号 160),
5′−agagaauggaaauguacau−3′(配列番号 161),
5′−cgucaggaaauaugaagga−3′(配列番号 162),
5′−augcugcuggauuggaccu−3′(配列番号 163),
5′−aguaugauaacgaaccaca−3′(配列番号 164),
5′−aaccacaaauaccuggcua−3′(配列番号 165),
5′−aauauauagagcaccugga−3′(配列番号 166),
5′−aaauugcauuagcagccau−3′(配列番号 167),
5′−acgaaccacaaauaccugg−3′(配列番号 168),
5′−aagcaguaacaugcaaaug−3′(配列番号 169),
5′−cgcucuugauacucggcuc−3′(配列番号 170),
5′−guaacaugcaaaugucagc−3′(配列番号 171),
5′−aauguacaugcuauagcau−3′(配列番号 172),
5′−cacggagaaugcaaauaua−3′(配列番号 173),
5′−cuguuauuacaguccagcu−3′(配列番号 174),
5′−cgacaagagaauggaaaug−3′(配列番号 175),
5′−aaaacaagacggaaaguga−3′(配列番号 176),
5′−cuauauugucgaugauuca−3′(配列番号 177),
5′−aguccaugaaaacucacag−3′(配列番号 178),
5′−gcugucgcucuugauacuc−3′(配列番号 179),
5′−gcuauauugucgaugauuc−3′(配列番号 180),
5′−cgaaagaaacuucgacaag−3′(配列番号 181),
5′−agcgugaaccauuuucugg−3′(配列番号 182),
5′−augaaaacucacagcauga−3′(配列番号 183),
5′−acuucgacaagagaaugga−3′(配列番号 184),
5′−caguccagcuuagaagaca−3′(配列番号 185),
5′−ugcaaauauauagagcacc−3′(配列番号 186),
5′−agaagacaauacgucagga−3′(配列番号 187),
5′−gggagccgacuaugacuac−3′(配列番号 188),
5′−auggaaauguacaugcuau−3′(配列番号 189),
5′−caaaaauugcauuagcagc−3′(配列番号 190),
5′−gugcugucgcucuugauac−3′(配列番号 191),
5′−ugcugucgcucuugauacu−3′(配列番号 192),
5′−uacucggcucaggccauua−3′(配列番号 193),
5′−uggcuauauugucgaugau−3′(配列番号 194),
5′−auucacggagaaugcaaau−3′(配列番号 195),
5′−aaacucacagcaugauuga−3′(配列番号 196),
5′−auuacaguccagcuuagaa−3′(配列番号 197),
5′−ugauggauuugagguuacc−3′(配列番号 198),
5′−ucagaagaguaugauaacg−3′(配列番号 199),
5′−agaguaugauaacgaacca−3′(配列番号 200),
5′−ugauaacgaaccacaaaua−3′(配列番号 201),
5′−acggagaaugcaaauauau−3′(配列番号 202),
5′−cuaguagugaaccguccuc−3′(配列番号 203),
5′−gaagaguaugauaacgaac−3′(配列番号 204),
5′−aaaugccuucuaguaguga−3′(配列番号 205),
5′−uaacgaaccacaaauaccu−3′(配列番号 206),
5′−auugucgaugauucaguca−3′(配列番号 207),
5′−acaugcaaaugucagcaag−3′(配列番号 208),
5′−uguugcuguuauuacaguc−3′(配列番号 209),
5′−uagagcaccuggaagcagu−3′(配列番号 210),
5′−aacgaaagaaacuucgaca−3′(配列番号 211),
5′−aaauaccuggcuauauugu−3′(配列番号 212),
5′−aauacgucaggaaauauga−3′(配列番号 213),
5′−uggaaauguacaugcuaua−3′(配列番号 214),
5′−acgucaggaaauaugaagg−3′(配列番号 215),
5′−uuggaccucaaugacaccu−3′(配列番号 216),
5′−uaacaugcaaaugucagca−3′(配列番号 217),
5′−augacuacucagaagagua−3′(配列番号 218),
5′−aaauccauguaaugcagaa−3′(配列番号 219),
5′−ggaagcgugaaccauuuuc−3′(配列番号 220),
5′−ucugggaagcgugaaccau−3′(配列番号 221),
5′−uauugucgaugauucaguc−3′(配列番号 222),
5′−aguaacaugcaaaugucag−3′(配列番号 223),
5′−uuagaagacaauacgucag−3′(配列番号 224),
5′−aaaauccauguaaugcaga−3′(配列番号 225),
5′−gcuggauuggaccucaaug−3′(配列番号 226),
5′−cugauggauuugagguuac−3′(配列番号 227),
5′−ccucaagaagugagauguc−3′(配列番号 228),
5′−gagccgacuaugacuacuc−3′(配列番号 229),
5′−gauucagucagaguugaac−3′(配列番号 230)
本発明での“アンフィレギュリンに特異的なsiRNA(s)”はアンフィレギュリンのタンパク質をエンコーディングする遺伝子に特異的なsiRNA(s)を意味する。また、アンフィレギュリンに対する特異性が維持される限り、上記の配列番号1ないし配列番号230に従う配列を含むセンス鎖またこれに相補的なアンチセンス鎖で、一つ以上の塩基が置換、欠失、または挿入された配列を含むセンス鎖及びアンチセンス鎖を含むアンフィレギュリンに特異的なsiRNAも本発明の権利の範囲に含まれるということは本発明の属する技術分野で通常の知識を持っている者には自明なことである。
5′−caguaguagcugucacuau−3′(配列番号 2),
5′−agacucacagcgaggauga−3′(配列番号 3),
5′−cacaaauauccggcuauau−3′(配列番号 4),
5′−caccauaagcgaaaugccu−3′(配列番号 5),
5′−gauuacuuuggugaacggu−3′(配列番号 6),
5′−caguugucacuuuuuauga−3′(配列番号 7),
5′−ggaccuauccaagauugca−3′(配列番号 8),
5′−cguuaucacagugcaccuu−3′(配列番号 9),
5′−ccuagcugaggacaaugca−3′(配列番号 10),
5′−ggaagagagguuuccacca−3′(配列番号 11),
5′−cucagaggaguaugauaau−3′(配列番号 12),
5′−cgguggacuugagcuuucu−3′(配列番号 13),
5′−gguggugacaugcaauugu−3′(配列番号 14),
5′−cagggaauaugaaggagaa−3′(配列番号 15),
5′−ggaggcuucgacaagaaaa−3′(配列番号 16),
5′−ccgguggaaccaaugagaa−3′(配列番号 17),
5′−ccggcuauauuauagauga−3′(配列番号 18),
5′−agaauccaugcacugccaa−3′(配列番号 19),
5′−caaggaccuauccaagauu−3′(配列番号 20),
5′−caaauauccggcuauauua−3′(配列番号 21),
5′−gggacuacgacuacucaga−3′(配列番号 22),
5′−gcgaaugcagauacaucga−3′(配列番号 23),
5′−gccacaccggaaaugacau−3′(配列番号 24),
5′−agaguugaacaggugauua−3′(配列番号 25),
5′−gaaccacaaauauccggcu−3′(配列番号 26),
5′−cauaagcgaaaugccuucu−3′(配列番号 27),
5′−guuuccaccauaagcgaaa−3′(配列番号 28),
5′−caggugauuaagcccaaga−3′(配列番号 29),
5′−ccacaccggaaaugacauu−3′(配列番号 30),
5′−gagugaaaugccuucuagu−3′(配列番号 31),
5′−cagaguugaacagguaguu−3′(配列番号 32),
5′−cuggauuggaccucaauga−3′(配列番号 33),
5′−gaaaacucacagcaugauu−3′(配列番号 34),
5′−gaaacuucgacaagagaau−3′(配列番号 35),
5′−caggaaauaugaaggagaa−3′(配列番号 36),
5′−gcaaauauauagagcaccu−3′(配列番号 37),
5′−ggugcugucgcucuugaua−3′(配列番号 38),
5′−ucagaguugaacagguagu−3′(配列番号 39),
5′−gaaagaaacuucgacaaga−3′(配列番号 40),
5′−gacaauacgucaggaaaua−3′(配列番号 41),
5′−cggcucaggccauuaugcu−3′(配列番号 42),
5′−ggaccacagugcugaugga−3′(配列番号 43),
5′−gcugcuggauuggaccuca−3′(配列番号 44),
5′−guuauuacaguccagcuua−3′(配列番号 45),
5′−uggaccucaaugacaccua−3′(配列番号 46),
5′−cuggcuauauugucgauga−3′(配列番号 47),
5′−gacggaaagugaaaauacu−3′(配列番号 48),
5′−gcagccauagcugccuuua−3′(配列番号 49),
5′−ggagccgacuaugacuacu−3′(配列番号 50),
5′−guaugauaacgaaccacaa−3′(配列番号 51),
5′−agugaaaugccuucuagua−3′(配列番号 52),
5′−gauaacgaaccacaaauac−3′(配列番号 53),
5′−ugcauuagcagccauagcu−3′(配列番号 54),
5′−cgggagccgacuaugacua−3′(配列番号 55),
5′−ccgacuaugacuacucaga−3′(配列番号 56),
5′−gcauucacggagaaugcaa−3′(配列番号 57),
5′−ccaugaaaacucacagcau−3′(配列番号 58),
5′−cagcaugauugacaguagu−3′(配列番号 59),
5′−cuuagaagacaauacguca−3′(配列番号 60),
5′−ugacuacucagaagaguau−3′(配列番号 61),
5′−agaguugaacagguaguua−3′(配列番号 62),
5′−auauauagagcaccuggaa−3′(配列番号 63),
5′−agcagccauagcugccuuu−3′(配列番号 64),
5′−gaguugaacagguaguuaa−3′(配列番号 65),
5′−cauucacggagaaugcaaa−3′(配列番号 66),
5′−ucaggaaauaugaaggaga−3′(配列番号 67),
5′−cagaagaguaugauaacga−3′(配列番号 68),
5′−gcuguuauuacaguccagc−3′(配列番号 69),
5′−gggaagcgugaaccauuuu−3′(配列番号 70),
5′−agcugccuuuaugucugcu−3′(配列番号 71),
5′−cacagugcugauggauuug−3′(配列番号 72),
5′−agucagaguugaacaggua−3′(配列番号 73),
5′−uggaagcaguaacaugcaa−3′(配列番号 74),
5′−agaagaguaugauaacgaa−3′(配列番号 75),
5′−gaagcgugaaccauuuucu−3′(配列番号 76),
5′−ggcuauauugucgaugauu−3′(配列番号 77),
5′−gacaagagaauggaaaugu−3′(配列番号 78),
5′−ugaaaugccuucuaguagu−3′(配列番号 79),
5′−gugagugaaaugccuucua−3′(配列番号 80),
5′−gaccucaaugacaccuacu−3′(配列番号 81),
5′−ccucaaugacaccuacucu−3′(配列番号 82),
5′−gcugauggauuugagguua−3′(配列番号 83),
5′−ggaagcaguaacaugcaaa−3′(配列番号 84),
5′−caguaacaugcaaauguca−3′(配列番号 85),
5′−ggaccucaaugacaccuac−3′(配列番号 86),
5′−cagccauagcugccuuuau−3′(配列番号 87),
5′−uccaugaaaacucacagca−3′(配列番号 88),
5′−gcugccuuuaugucugcug−3′(配列番号 89),
5′−gcucuugauacucggcuca−3′(配列番号 90),
5′−ugcugcuggauuggaccuc−3′(配列番号 91),
5′−gaaccacaaauaccuggcu−3′(配列番号 92),
5′−agagcaccuggaagcagua−3′(配列番号 93),
5′−caccuggaagcaguaacau−3′(配列番号 94),
5′−cugaggaacgaaagaaacu−3′(配列番号 95),
5′−gugaaaugccuucuaguag−3′(配列番号 96),
5′−cuacucugggaagcgugaa−3′(配列番号 97),
5′−cugggaagcgugaaccauu−3′(配列番号 98),
5′−acuacucagaagaguauga−3′(配列番号 99),
5′−caugcaaaugucagcaaga−3′(配列番号 100),
5′−ugagguuaccucaagaagu−3′(配列番号 101),
5′−acucggcucaggccauuau−3′(配列番号 102),
5′−uucacggagaaugcaaaua−3′(配列番号 103),
5′−cugcuggauuggaccucaa−3′(配列番号 104),
5′−ugauucagucagaguugaa−3′(配列番号 105),
5′−ucgacaagagaauggaaau−3′(配列番号 106),
5′−cucaagaagugagaugucu−3′(配列番号 107),
5′−uucugcauucacggagaau−3′(配列番号 108),
5′−agguuaccucaagaaguga−3′(配列番号 109),
5′−aaugccuucuaguagugaa−3′(配列番号 110),
5′−augauucagucagaguuga−3′(配列番号 111),
5′−aaacaagacggaaagugaa−3′(配列番号 112),
5′−uuucugcauucacggagaa−3′(配列番号 113),
5′−caaauaccuggcuauauug−3′(配列番号 114),
5′−gaagcaguaacaugcaaau−3′(配列番号 115),
5′−gacuacucagaagaguaug−3′(配列番号 116),
5′−gaugauucagucagaguug−3′(配列番号 117),
5′−ugcauucacggagaaugca−3′(配列番号 118),
5′−gcugaggaacgaaagaaac−3′(配列番号 119),
5′−uggauuugagguuaccuca−3′(配列番号 120),
5′−agugagaugucuucaggga−3′(配列番号 121),
5′−gagguuaccucaagaagug−3′(配列番号 122),
5′−cuucgacaagagaauggaa−3′(配列番号 123),
5′−cucuugauacucggcucag−3′(配列番号 124),
5′−gucagaguugaacagguag−3′(配列番号 125),
5′−caugaaaacucacagcaug−3′(配列番号 126),
5′−ggaaauguacaugcuauag−3′(配列番号 127),
5′−cauguaaugcagaauuuca−3′(配列番号 128),
5′−gauugacaguaguuuauca−3′(配列番号 129),
5′−guccagcuuagaagacaau−3′(配列番号 130),
5′−ugcuggauuggaccucaau−3′(配列番号 131),
5′−gaagacaauacgucaggaa−3′(配列番号 132),
5′−aagacaauacgucaggaaa−3′(配列番号 133),
5′−ugaggaacgaaagaaacuu−3′(配列番号 134),
5′−uucgacaagagaauggaaa−3′(配列番号 135),
5′−ugcuguuauuacaguccag−3′(配列番号 136),
5′−gauggauuugagguuaccu−3′(配列番号 137),
5′−cucaaugacaccuacucug−3′(配列番号 138),
5′−gguuaccucaagaagugag−3′(配列番号 139),
5′−gccgacuaugacuacucag−3′(配列番号 140),
5′−caaauauauagagcaccug−3′(配列番号 141),
5′−agccgacuaugacuacuca−3′(配列番号 142),
5′−accuggcuauauugucgau−3′(配列番号 143),
5′−ccuacucugggaagcguga−3′(配列番号 144),
5′−gcauuagcagccauagcug−3′(配列番号 145),
5′−augauaacgaaccacaaau−3′(配列番号 146),
5′−gcgugaaccauuuucuggg−3′(配列番号 147),
5′−ugggaagcgugaaccauuu−3′(配列番号 148),
5′−agcaguaacaugcaaaugu−3′(配列番号 149),
5′−ugaaaacucacagcaugau−3′(配列番号 150),
5′−agacaauacgucaggaaau−3′(配列番号 151),
5′−auacucggcucaggccauu−3′(配列番号 152),
5′−auuaugcugcuggauugga−3′(配列番号 153),
5′−ugcugauggauuugagguu−3′(配列番号 154),
5′−ugugagugaaaugccuucu−3′(配列番号 155),
5′−auucagucagaguugaaca−3′(配列番号 156),
5′−aagggaggcaaaaauggaa−3′(配列番号 157),
5′−uguuauuacaguccagcuu−3′(配列番号 158),
5′−acgaaagaaacuucgacaa−3′(配列番号 159),
5′−cugcauucacggagaaugc−3′(配列番号 160),
5′−agagaauggaaauguacau−3′(配列番号 161),
5′−cgucaggaaauaugaagga−3′(配列番号 162),
5′−augcugcuggauuggaccu−3′(配列番号 163),
5′−aguaugauaacgaaccaca−3′(配列番号 164),
5′−aaccacaaauaccuggcua−3′(配列番号 165),
5′−aauauauagagcaccugga−3′(配列番号 166),
5′−aaauugcauuagcagccau−3′(配列番号 167),
5′−acgaaccacaaauaccugg−3′(配列番号 168),
5′−aagcaguaacaugcaaaug−3′(配列番号 169),
5′−cgcucuugauacucggcuc−3′(配列番号 170),
5′−guaacaugcaaaugucagc−3′(配列番号 171),
5′−aauguacaugcuauagcau−3′(配列番号 172),
5′−cacggagaaugcaaauaua−3′(配列番号 173),
5′−cuguuauuacaguccagcu−3′(配列番号 174),
5′−cgacaagagaauggaaaug−3′(配列番号 175),
5′−aaaacaagacggaaaguga−3′(配列番号 176),
5′−cuauauugucgaugauuca−3′(配列番号 177),
5′−aguccaugaaaacucacag−3′(配列番号 178),
5′−gcugucgcucuugauacuc−3′(配列番号 179),
5′−gcuauauugucgaugauuc−3′(配列番号 180),
5′−cgaaagaaacuucgacaag−3′(配列番号 181),
5′−agcgugaaccauuuucugg−3′(配列番号 182),
5′−augaaaacucacagcauga−3′(配列番号 183),
5′−acuucgacaagagaaugga−3′(配列番号 184),
5′−caguccagcuuagaagaca−3′(配列番号 185),
5′−ugcaaauauauagagcacc−3′(配列番号 186),
5′−agaagacaauacgucagga−3′(配列番号 187),
5′−gggagccgacuaugacuac−3′(配列番号 188),
5′−auggaaauguacaugcuau−3′(配列番号 189),
5′−caaaaauugcauuagcagc−3′(配列番号 190),
5′−gugcugucgcucuugauac−3′(配列番号 191),
5′−ugcugucgcucuugauacu−3′(配列番号 192),
5′−uacucggcucaggccauua−3′(配列番号 193),
5′−uggcuauauugucgaugau−3′(配列番号 194),
5′−auucacggagaaugcaaau−3′(配列番号 195),
5′−aaacucacagcaugauuga−3′(配列番号 196),
5′−auuacaguccagcuuagaa−3′(配列番号 197),
5′−ugauggauuugagguuacc−3′(配列番号 198),
5′−ucagaagaguaugauaacg−3′(配列番号 199),
5′−agaguaugauaacgaacca−3′(配列番号 200),
5′−ugauaacgaaccacaaaua−3′(配列番号 201),
5′−acggagaaugcaaauauau−3′(配列番号 202),
5′−cuaguagugaaccguccuc−3′(配列番号 203),
5′−gaagaguaugauaacgaac−3′(配列番号 204),
5′−aaaugccuucuaguaguga−3′(配列番号 205),
5′−uaacgaaccacaaauaccu−3′(配列番号 206),
5′−auugucgaugauucaguca−3′(配列番号 207),
5′−acaugcaaaugucagcaag−3′(配列番号 208),
5′−uguugcuguuauuacaguc−3′(配列番号 209),
5′−uagagcaccuggaagcagu−3′(配列番号 210),
5′−aacgaaagaaacuucgaca−3′(配列番号 211),
5′−aaauaccuggcuauauugu−3′(配列番号 212),
5′−aauacgucaggaaauauga−3′(配列番号 213),
5′−uggaaauguacaugcuaua−3′(配列番号 214),
5′−acgucaggaaauaugaagg−3′(配列番号 215),
5′−uuggaccucaaugacaccu−3′(配列番号 216),
5′−uaacaugcaaaugucagca−3′(配列番号 217),
5′−augacuacucagaagagua−3′(配列番号 218),
5′−aaauccauguaaugcagaa−3′(配列番号 219),
5′−ggaagcgugaaccauuuuc−3′(配列番号 220),
5′−ucugggaagcgugaaccau−3′(配列番号 221),
5′−uauugucgaugauucaguc−3′(配列番号 222),
5′−aguaacaugcaaaugucag−3′(配列番号 223),
5′−uuagaagacaauacgucag−3′(配列番号 224),
5′−aaaauccauguaaugcaga−3′(配列番号 225),
5′−gcuggauuggaccucaaug−3′(配列番号 226),
5′−cugauggauuugagguuac−3′(配列番号 227),
5′−ccucaagaagugagauguc−3′(配列番号 228),
5′−gagccgacuaugacuacuc−3′(配列番号 229),
5′−gauucagucagaguugaac−3′(配列番号 230)
本発明での“アンフィレギュリンに特異的なsiRNA(s)”はアンフィレギュリンのタンパク質をエンコーディングする遺伝子に特異的なsiRNA(s)を意味する。また、アンフィレギュリンに対する特異性が維持される限り、上記の配列番号1ないし配列番号230に従う配列を含むセンス鎖またこれに相補的なアンチセンス鎖で、一つ以上の塩基が置換、欠失、または挿入された配列を含むセンス鎖及びアンチセンス鎖を含むアンフィレギュリンに特異的なsiRNAも本発明の権利の範囲に含まれるということは本発明の属する技術分野で通常の知識を持っている者には自明なことである。
本発明で提供されるアンフィレギュリンに特異的なsiRNAはアンフィレギュリンを暗号化するmRNAと相補的に結合できるように設計された塩基配列だから、アンフィレギュリンの発現を効果的に抑制できるというのが特徴で、上記のsiRNAは一つなたは両方鎖の3′末端に一つまたは二つ以上の非結合(unpaired)されたヌクレオチドを含む構造のオーバハング(overhang)を含むことができる。
また、上記のsiRNAの生体内の安定性の向上のために、核酸分解酵素の抵抗性の付与及び非特異的な免疫反応の減少のための多様な変形(modification)を含むことができる。上記のsiRNAを構成する第1または第2のオリゴヌクレオチドの変形は一つ以上のヌクレオチド内の糖構造の2´炭素位置で −OH基が-CH3(メチル)、−OCH3(methoxy)、−NH2、−F(フッ素)、 −O−2−メトキシエチル−O−プロピル、 −O−2−メチルチオエチル(methylthioethyl)、−O−3−アミノプロピル、−O−3−ジメチルアミノプロピル、−O−N−メチルアセトアミドまたは−O−ジメチルアミドオキシエチルへの置換による変形;ヌクレオチド内の糖(sugar)構造内の酸素が硫黄に置換された変形;またはヌクレオチド結合のホスホロチオエート(phosphorothioate)またはボラノリン酸(boranophosphate)、メチルホスホン酸(methyl phosphonate)結合への変形で選択された一つ以上の変形が組合されて用いることができて、PNA(peptide nucleic acid)、LNA(locked nucleic acid)またはUNA(unlocked nucleic acid)形態への変形も使用するこ とができる(Ann. Rev. Med. 55, 61−65 2004; US 5,660,985; US 5,958,691; US 6,531,584; US 5,808,023; US 6,326,358; US 6,175,001; Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:1139−1143, 2003; RNA, 9:1034−1048, 2003; Nucleic Acid Res. 31:589−595, 2003; Nucleic Acids Research, 38(17) 5761-5773, 2010; Nucleic Acids Research, 39(5) 1823-1832, 2011)。
本発明で提供されるアンフィレギュリンに特異的なsiRNAの中で、配列番号1ないし30に従う配列を含むセンス鎖を有するsiRNAはマウスのアンフィレギュリンに特異的なもので、配列番号31ないし230に従う配列を含むセンス鎖を有するsiRNAは人間のアンフィレギュリンに特異的なものである。本発明の配列番号1ないし230に従う配列を含むセンス鎖を有するsiRNAはすべてアンフィレギュリンの発現を効果的に抑制できる効能があるもので確認された。
本発明のほかの様態はアンフィレギュリンに特異的なsiRNAの生体内への効率的な伝達及び安定性の向上のためのsiRNAの両末端に各々の一つ以上の親水性の高分子及び疎水性の高分子が接合された形態のsiRNAの接合体である二重鎖オリゴRNAの構造体に対するもである。本発明での‘二重鎖オリゴRNAの構造体’はsiRNAまたはshRNAの両末端に各々の一つ以上の親水性の高分子及び疎水性の高分子が接合された二重鎖形態のオリゴRNAの構造体を意味する。
上記の二重鎖オリゴRNAの構造体の場合疎水性物質の疎水性の相互作用によって自己組立のナノ粒子を形成することになって(大韓民国公開特許公報第2010−123214号参照)、このような接合体は体内への伝達効率及び体内での安定性が非常に優れることだけではなく、粒子の大きさの均一性が優れてQC(Quality control)が容易なので薬物としての製造工程が簡単であるという長所がある。
具体的に本発明に従うアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴRNAの構造体は下記の構造式(1)のような構造を持つのが望ましい。
A−X−R−Y−B 構造式 (1)
上記の構造式(1)でAは親水性物質、Bは疎水性物質、X及びYは各々の独立的に単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合を意味し、Rはアンフィレギュリンに特異的siRNAを意味する。
上記の構造式(1)でAは親水性物質、Bは疎水性物質、X及びYは各々の独立的に単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合を意味し、Rはアンフィレギュリンに特異的siRNAを意味する。
より望ましいのは本発明に従うアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴRNAの構造体は下記の構造式(2)の構造を持つ。
上記の構造式(2)でAは親水性物質、Bは疎水性物質、X及びYは各々の独立的に単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合を意味し、Sはアンフィレギュリンに特異的siRNAのセンス鎖、ASはアンフィレギュリンに特異的siRNAのアンチセンスの鎖を意味する。
より望ましいのはアンフィレギュリンに特異的なsiRNAを含む二重鎖オリゴRNAの構造体は下記の構造式(3)の構造を持つ。
上記の構造式(3)でAは親水性物質、Bは疎水性物質、X及びYは各々の独立的に単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合を意味し、Sはアンフィレギュリンに特異的なsiRNAのセンス鎖、ASはアンフィレギュリンに特異的なsiRNAのアンチセンスの鎖を意味する。
上記、構造式(1)ないし構造式(3)での上記のアンフィレギュリンに特異的なsiRNAを含む二重鎖オリゴRNAの構造体のアンチセンス鎖 5´末端に燐酸基(phosphate group)が一つないし三つ結合することができる。
また、上記の構造式(1)ないし(3)でsiRNAの代わりにshRNAが用いることができるということも本発明の属する技術分野で通常の知識を持っている者には自明なことである。
上記の構造式(1)ないし構造式(3)での親水性物質は分子量が200ないし10,000である陽イオン性または非イオン性の高分子の物質であることが望ましく、より望ましいことには1,000ないし2,000の非イオン性の高分子の物質である。たとえば、親水性の高分子の物質としてはポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリオキサゾリンなどの非イオン性の親水性の高分子化合物を用いるのが望ましいが、必ずこれに限られるものではない。
上記の構造式(1)ないし構造式(3)での疎水性の物質(B) は疎水性の相互作用を通じて構造式(1)に従うオリゴヌクレオチドの構造体で構成されたナノ粒子を形成する役割を遂行する。上記の疎水性物質は分子量が250ないし1,000であるのが望ましく、ステロイド(steroid)誘導体、グリセリド(glyceride)誘導体、グリセロールエーテル(glycerol ether)、ポリプロピレングリコール(polypropylene glycol)、 C12ないしC50の不飽和または飽和炭化水素(hydrocarbon)、ジアシルホスファチジルコリン(diacylphosphatidylcholine)、脂肪酸(fatty acid)、リン脂質(phospholipid)、リポポリアミン(lipopolyamine)などが使用できるが、これに制限されるものではなく、本発明の目的に符合することならばどのような疎水性の物質でも使用できるという点は本発明の属する技術分野で通常の知識を持っている者には自明なことである。
上記のステロイド(steroid)の誘導体はコレステロール、コレスタノール、コール酸、 コレステリルホルマート、 コレスタニルホルマート及びコレスタニルアミンで構成された群から選択することができて、上記のグリセリドの誘導体はモノ−、ジ−及びトリ−グリセリドなどで選択することができてこの時、グリセリドの脂肪酸はC12ないしC50の不飽和または飽和脂肪酸が望ましい。
特に、上記の疎水性の物質の中でも飽和または不飽和炭化水素かコレステロールが本発明に従うオリゴヌクレオチド構造体の合成段階で容易に結合させることができるという長所を持っている点で望ましい。上記の疎水性の物質は親水性の物質の反対方の末端(distal end)に結合され、siRNAのセンス鎖またはアンチセンス鎖のどの位置に結合されても構わない。
本発明に従う構造式(1)ないし構造式(3)での親水性の物質または疎水性の物質とアンフィレギュリンに特異的なsiRNAは単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合(XまたはY)によって結合される。上記の共有結合を媒介するリンカーは親水性の物質、または疎水性の物質とアンフィレギュリンに特異的なsiRNAの末端で共有結合して、必要に従って特定の環境で分解の可能な結合を提供する限り特別に限定されることではない。従って、上記のリンカーは本発明に従う二重鎖オリゴRNAの構造体の製造過程中アンフィレギュリンに特異的なsiRNA及び/または親水性の物質(または疎水性の物質)を活性化するために結合させるどのような化合物も使用することができる。上記の共有結合は非分解性の結合または分解性の結合中どんなものでも構わない。この時、非分解性の結合ではアミド結合またはリン酸化結合があり、分解性の結合ではジスルフィド結合、酸分解性の結合、エステル結合、無水物の結合、生分解性の結合または酵素分解性結合などがあるが、これに限られるものではない。
また、上記の構造式(1)ないし構造式(3)でのR(またはS及びAS)で表示されるアンフィレギュリンに特異的なsiRNAはアンフィレギュリンと特異的に結合できるという特性を持っているsiRNAであればすべてが制限なしに使用可能で、望ましいことには本発明では配列番号1ないし配列番号230で選択されたどの一つの配列を含むセンス鎖(sense strand)とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖で構成される。
本発明のまた別の様態として、アンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴRNAの構造体を含むナノ粒子を提供する。
すでに前で説明したようにアンフィレギュリンに特異的なsiRNAを含む二重鎖オリゴRNAの構造体は疎水性及び親水性の物質をすべて含んでいる両親媒性で、親水性の部分は体内に存在する水分子らと水素結合などの相互作用を通じて親和力を有しており、外側の方に向けるようになり、疎水性の物質らはそれらの間で疎水性の相互作用(hydrophobic interaction)を通じて内側の方に向けるようになり、熱力学的に安定なナノ粒子を形成するようになる。即ち、ナノ粒子の中心に疎水性の物質が位置するようになり、アンフィレギュリンに特異的なsiRNAの外側の方向に親水性の物質が位置してアンフィレギュリンに特異的なsiRNAを保護する形態のナノ粒子を形成する。このように形成されたナノ粒子はアンフィレギュリンに特異的なsiRNAの細胞内伝達向上及びアンフィレギュリンに特異的なsiRNAの効能を向上させる。
本発明に従うナノ粒子は同一な配列を有するsiRNAを含む二重鎖オリゴRNAの構造体だけで形成されることもあり、互いに異なる配列を含むsiRNAを含む二重鎖オリゴRNAの構造体で構成されることもありえるという特徴にする。即ち、同一なアンフィレギュリンに対する特異性を持ちながらその配列が違う場合も含まれることに解釈される。また、アンフィレギュリンの以外に別のガン特異的なターゲット遺伝子の特異的なsiRNAを含む二重鎖オリゴRNAの構造体が本発明に従うナノ粒子に含まれることもできる。
上記の本発明に従うナノ粒子を構成する二重鎖オリゴRNAの構造体に含まれるアンフィレギュリンに特異的なsiRNAは配列番号1ないし230で選択されたされたどの一つの配列をセンス鎖として有し、これに相補的な配列をアンチセンス鎖として有するのが望ましいが、これに限定されるものではなく、アンフィレギュリンに特異性を有しながら本発明の目的に符合するどのようなsiRNAも使用できるということは通常の技術者には自明なことである。
また、本発明は上記のアンフィレギュリンに特異的なsiRNA、またはこれを含む二重鎖オリゴRNAの構造体及び/または上記の二重鎖オリゴRNAの構造体でなっているナノ粒子を含む呼吸器疾患の予防または治療用の組成物を提供する。
本発明のアンフィレギュリンに特異的なsiRNA、またはこれを含む二重鎖オリゴRNAの構造体及び/または上記の二重鎖オリゴRNAの構造体でなっているナノ粒子を含む組成物は肺動脈の再形成(pulmonary artery remodeling)及び気道再形成(airway remodeling)を抑制して呼吸器疾患の予防または治療に効果を示すことである。従って本発明に従う組成物は呼吸器疾患である喘息、慢性閉鎖性肺疾患(COPD)、特発性肺繊維症(IPF)、急慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、急性下気道感染症(気管支炎及び細気管支炎)、咽喉炎、へんとう炎、喉頭炎のような急性上気道感染症などの予防または治療に効果があることである。
本発明の組成物には投与のために上記の記載された有効成分の他に追加で薬剤学的に許容可能な担体を1種以上含めて製造することができる。薬剤学的に許容可能な担体は本発明の有効成分と両立可能でなければならないことで、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれら成分の中、一つの成分または二つ以上の成分を混合して使用することができ、必要に従って抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を加えることができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用の製剤で製剤化することができる。特に、凍結された(lyophilized)形態の製剤で製剤化して提供することが望ましい。凍結乾燥の製剤の製造のために本発明の属する技術分野で通常的に知られている方法を使用することができて、凍結乾燥のための安定化剤が追加されることもできる。さらに、当分野の適正な方法でまたはレミントンの薬学科学(Remington’s pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)に開示されている方法を用いて各疾病に従ってまたは成分に従って望ましく製剤化することができる。
本発明の組成物は通常の患者の症候と疾病の深刻度に基づいて本技術分野の通常の専門家が決定することができる。また、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、軟膏剤、シロップ剤などの多様な形態に製剤化することができて、単位−投与量または多−投与量の容器、例えば密封されたアンプル及び瓶などで提供することができる。
本発明の組成物は経口または非経口の投与ができる。本発明に従う組成物の投与経路はこれらに限定されることではないが、例えば、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下または局所投与ができる。特別に呼吸器疾患の治療のために気管支内の点滴注入を通じた肺への投与も可能である。本発明に従う組成物の投与量は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、方法、排泄率または疾病の重症度などに従い、その範囲が多様で、本技術分野の通常の専門家が容易に決定することができる。また、臨床投与のため公知の技術を用いて本発明の組成物を適合な製剤に製剤化することができる。
また、本発明では本発明に従うアンフィレギュリンに特異的なsiRNA、上記のsiRNAを含む二重鎖オリゴRNAの構造体、これを含む組成物またはナノ粒子を呼吸器疾患の予防または治療のための薬剤の製造に利用する用途を提供して、また、本発明では本発明に従う二重鎖オリゴRNAの構造体、これを含む組成物またはナノ粒子を予防または治療を必要にする患者に投与することを含む呼吸器疾患の予防及び治療方法を提供する。
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例により制限されるものではないことは当該の技術分野で通常の知識をもっている者において自明なことである。
実施例1. 目標の塩基配列のデザイン及びsiRNAの製造
マウスのアンフィレギュリンmRNAの配列(NM_009704)でsiRNAが結合できる目標の塩基配列(センス鎖)をデザインして、上記目標の塩基配列の相補的な配列であるアンチセンス鎖のsiRNAを製造した。まず、バイオニア(株)で開発された遺伝子のデザインプログラム(Turbo si−Designer)を用いて、アンフィレギュリンのmRNAの配列(NM_009704)でsiRNAが結合できる目標の塩基配列をデザインした。本発明のアンフィレギュリンのsiRNAは19個のヌクレオチドで構成されたセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖で構成された二重鎖の構造である。上記のsiRNAはβ−シアノエチルホスホラミダイト(β−cyanoethyl phosphoramidite)を用いてRNAの骨格構造を構成するホスホジエステル結合を連結して製造した(Nucleic Acids Research,12:4539−4557, 1984)。具体的に、RNA合成器(384 Synthesizer, BIONEER,韓国)を用いて、ヌクレオチドが付着された固形支持体の上で、遮断除去(deblocking)、結合(coupling)、酸化(oxidation)及びキャッピング(capping)でなっている一連の過程を繰返して、望む長さのRNAを含む反応物を収得した。上記の反応物をDaiso gel C18(Daiso, Japan)カラムが装着された HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan)でRNAを分離及び精製してこれをMALDI−TOF質量分析器(Shimadzu, Japan)を用いて目標の塩基配列と符合するかを確認した。その後、センスとアンチセンスのRNA鎖を結合させて目的する配列番号1ないし配列番号30で選択されたどの一つの配列をセンス鎖として有するsiRNAを製造した。
マウスのアンフィレギュリンmRNAの配列(NM_009704)でsiRNAが結合できる目標の塩基配列(センス鎖)をデザインして、上記目標の塩基配列の相補的な配列であるアンチセンス鎖のsiRNAを製造した。まず、バイオニア(株)で開発された遺伝子のデザインプログラム(Turbo si−Designer)を用いて、アンフィレギュリンのmRNAの配列(NM_009704)でsiRNAが結合できる目標の塩基配列をデザインした。本発明のアンフィレギュリンのsiRNAは19個のヌクレオチドで構成されたセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖で構成された二重鎖の構造である。上記のsiRNAはβ−シアノエチルホスホラミダイト(β−cyanoethyl phosphoramidite)を用いてRNAの骨格構造を構成するホスホジエステル結合を連結して製造した(Nucleic Acids Research,12:4539−4557, 1984)。具体的に、RNA合成器(384 Synthesizer, BIONEER,韓国)を用いて、ヌクレオチドが付着された固形支持体の上で、遮断除去(deblocking)、結合(coupling)、酸化(oxidation)及びキャッピング(capping)でなっている一連の過程を繰返して、望む長さのRNAを含む反応物を収得した。上記の反応物をDaiso gel C18(Daiso, Japan)カラムが装着された HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan)でRNAを分離及び精製してこれをMALDI−TOF質量分析器(Shimadzu, Japan)を用いて目標の塩基配列と符合するかを確認した。その後、センスとアンチセンスのRNA鎖を結合させて目的する配列番号1ないし配列番号30で選択されたどの一つの配列をセンス鎖として有するsiRNAを製造した。
実施例2. 繊維母細胞(NIH3T3)の細胞株でsiRNAを用いたアンフィレギュリンの発現抑制
上記の実施例1で製造された配列番号1ないし配列番号30を各々のセンス鎖として有するアンフィレギュリンに特異的なsiRNAを用いて繊維芽細胞株のマウスの繊維母細胞(NIH3T3)を形質転換させて、上記の形質転換された繊維母細胞(NIH3T3)の細胞株でアンフィレギュリンの発現様相、即ち上記のsiRNAによる発現抑制の程度を分析した。
上記の実施例1で製造された配列番号1ないし配列番号30を各々のセンス鎖として有するアンフィレギュリンに特異的なsiRNAを用いて繊維芽細胞株のマウスの繊維母細胞(NIH3T3)を形質転換させて、上記の形質転換された繊維母細胞(NIH3T3)の細胞株でアンフィレギュリンの発現様相、即ち上記のsiRNAによる発現抑制の程度を分析した。
2−1:繊維母細胞の細胞株の培養
アメリカ合衆国種菌協会(American Type Culture Collection, ATCC)から 入手したマウスの繊維母細胞の細胞株(NIH3T3)をRPMI−1640培養培地 (GIBCO/ Invitrogen, USA, 10%(v/v)ウシ胎仔血清、ペニシリン100units/ml及びスト レプトマイシン100μg/ml)で37℃、5%(v/v) CO2の条件下で培養した。
アメリカ合衆国種菌協会(American Type Culture Collection, ATCC)から 入手したマウスの繊維母細胞の細胞株(NIH3T3)をRPMI−1640培養培地 (GIBCO/ Invitrogen, USA, 10%(v/v)ウシ胎仔血清、ペニシリン100units/ml及びスト レプトマイシン100μg/ml)で37℃、5%(v/v) CO2の条件下で培養した。
2−2: 繊維母細胞の細胞株で目標siRNAの形質注入(transfection)
上記の実施例2−1で培養された1×105繊維母細胞の細胞株を37℃で5 %(v/v) CO2の条件下で12−ウェルプレートで18時間の間RPMI 1640で培養した後、培地を除去した後各のウェル当たり500μlの Opti−MEM培地(GIBCO、米国)を分注した。
上記の実施例2−1で培養された1×105繊維母細胞の細胞株を37℃で5 %(v/v) CO2の条件下で12−ウェルプレートで18時間の間RPMI 1640で培養した後、培地を除去した後各のウェル当たり500μlの Opti−MEM培地(GIBCO、米国)を分注した。
一方、リポフェクタミン2000(LipofectamineTM 2000、Invitrogen、米国) 2μlと Opti−MEM培地248μlを混合して混合液を製造して室温で5分間反応させた後、上記の実施例1で製造した各々の配列番号1ないし30の中どの一つの配列をセンス鎖として有するsiRNA(1pmole/μl) 20μlをOpti−MEM培地230μlに添加して最終濃度が20nMであるsiRNA溶液を製造した。上記のリポフェクタミン2000(LipofectamineTM 2000)混合液とsiRNA溶液を混合して室温で20分間反応させて形質注入用の溶液を製造した。
その後、Opti−MEMが分注された腫瘍細胞株の各ウェルに形質注入用の溶液を各々500μlずつ分注して6時間の間培養した後、Opti−MEM培地を除去した。ここに RPMI 1640培養培地1mlずつ分注した後24時間の間37℃で 5%(v/v) CO2の条件下で培養した。
2−3:アンフィレギュリンのmRNAの定量分析
上記の実施例2−2で形質注入された細胞株から全体のRNAを抽出してcDNAを製造した後、リアルタイムPCR(real−time PCR)を用いてアンフィレギュリン遺伝子のmRNAの発現量を相対定量した。
上記の実施例2−2で形質注入された細胞株から全体のRNAを抽出してcDNAを製造した後、リアルタイムPCR(real−time PCR)を用いてアンフィレギュリン遺伝子のmRNAの発現量を相対定量した。
2−3−1:形質注入された細胞からRNAの分離及びcDNAの製造
RNA抽出キット(AccuPrep Cell total RNA extraction kit、BIONEER、 韓国)を用いて、上記の実施例2−2で形質注入された細胞株から全体のRNAを抽 出して、抽出されたRNAはRNA逆転写酵素(AccuPower Cycle ScriptRT Premix/dT20, Bioneer、韓国) を用いて、下記のような方法でcDNAを製造した。具体的に、0.25mlのエッペンチューブに入っているAccuPower CycleScript RT Premix/dT20 (Bioneer、韓国)に一つのチューブ当たり抽出された1μgずつのRNAを入れて総体積が20μlになるようにDEPC(diethyl pyrocarbonate) で処理された蒸留水を添加した。これを遺伝子増幅器(MyGenieTM 96 Gradient Thermal Block、BIONEER、韓国)で30℃で1分間RNAとプライマーを混成化して、52℃で4分間cDNAを製造する二つの過程を6回繰返した後、95℃で5分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
RNA抽出キット(AccuPrep Cell total RNA extraction kit、BIONEER、 韓国)を用いて、上記の実施例2−2で形質注入された細胞株から全体のRNAを抽 出して、抽出されたRNAはRNA逆転写酵素(AccuPower Cycle ScriptRT Premix/dT20, Bioneer、韓国) を用いて、下記のような方法でcDNAを製造した。具体的に、0.25mlのエッペンチューブに入っているAccuPower CycleScript RT Premix/dT20 (Bioneer、韓国)に一つのチューブ当たり抽出された1μgずつのRNAを入れて総体積が20μlになるようにDEPC(diethyl pyrocarbonate) で処理された蒸留水を添加した。これを遺伝子増幅器(MyGenieTM 96 Gradient Thermal Block、BIONEER、韓国)で30℃で1分間RNAとプライマーを混成化して、52℃で4分間cDNAを製造する二つの過程を6回繰返した後、95℃で5分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
2−3−2:アンフィレギュリンのmRNAの相対定量の分析
上記の実施例2−3−1で製造されたcDNAを鋳型にしてリアルタイムPCRを通じてアンフィレギュリンのmRNAの相対的な量を下記のような方法で定量した。96−ウェルプレートの各ウェルに上記の実施例2−3−1で製造されたcDNAを蒸留水で5倍希釈して、アンフィレギュリンの mRNAの発現量の分析のために希釈されたcDNA 3μlと2×GreenStarTM PCR master mix(BIONEER、韓国)を10μl、蒸留水6μl、アンフィレギュリンqPCRプライマーr(10pmole/μl各々、BIONEER、韓国)を1μl 入れ、混合液を作った。一方、アンフィレギュリンのmRNAの発現量を正規化するためにハウスキーピングの遺伝子(housekeeping gene、以下HK遺伝子)である GAPDH(Glyceraldehyde 3−phosphate dehydrogenase)を標準遺伝子とした。上記の混合液の入った96−ウェルプレートをExicyclerTM96 Real−Time Quantitative Thermal Block(BIONEER、韓国)を用いて下記のような反応を行った; 95℃で15分間反応して酵素の活性化及びcDNAの二次構造をなくした後、94 ℃で30秒の変性(denaturing)、 58℃で30秒のアニーリング(annealing)、72℃で30秒の延長(extension)、SYBRグリーンスキャン(SYBR green scan)の四つの過程を42回繰返して行い、72℃で3分間の最終延長を行った後、55℃で1分間温度を維持して、55℃から95℃まで融解曲線(melting curve)を分析した。PCRが終了された後、各々の収得したアンフィレギュリンのCt(threshold cycle)値はGAPDH遺伝子を通じて正規化されたmRNA値(normalization factor、NF)を計算して補正されたアンフィレギュリンのCt値を求めた後、形質注入の物質だけで処理された実験群を対照群にしてΔCt値の差を求めた。上記のΔCt値と計算式2(−ΔCt)×100を用いて配列番号1ないし配列番号30を各々のセンス鎖として有するアンフィレギュリンに特異的なsiRNAに従うアンフィレギュリンのmRNAの発現量を相対定量した(図1参照)。
上記の実施例2−3−1で製造されたcDNAを鋳型にしてリアルタイムPCRを通じてアンフィレギュリンのmRNAの相対的な量を下記のような方法で定量した。96−ウェルプレートの各ウェルに上記の実施例2−3−1で製造されたcDNAを蒸留水で5倍希釈して、アンフィレギュリンの mRNAの発現量の分析のために希釈されたcDNA 3μlと2×GreenStarTM PCR master mix(BIONEER、韓国)を10μl、蒸留水6μl、アンフィレギュリンqPCRプライマーr(10pmole/μl各々、BIONEER、韓国)を1μl 入れ、混合液を作った。一方、アンフィレギュリンのmRNAの発現量を正規化するためにハウスキーピングの遺伝子(housekeeping gene、以下HK遺伝子)である GAPDH(Glyceraldehyde 3−phosphate dehydrogenase)を標準遺伝子とした。上記の混合液の入った96−ウェルプレートをExicyclerTM96 Real−Time Quantitative Thermal Block(BIONEER、韓国)を用いて下記のような反応を行った; 95℃で15分間反応して酵素の活性化及びcDNAの二次構造をなくした後、94 ℃で30秒の変性(denaturing)、 58℃で30秒のアニーリング(annealing)、72℃で30秒の延長(extension)、SYBRグリーンスキャン(SYBR green scan)の四つの過程を42回繰返して行い、72℃で3分間の最終延長を行った後、55℃で1分間温度を維持して、55℃から95℃まで融解曲線(melting curve)を分析した。PCRが終了された後、各々の収得したアンフィレギュリンのCt(threshold cycle)値はGAPDH遺伝子を通じて正規化されたmRNA値(normalization factor、NF)を計算して補正されたアンフィレギュリンのCt値を求めた後、形質注入の物質だけで処理された実験群を対照群にしてΔCt値の差を求めた。上記のΔCt値と計算式2(−ΔCt)×100を用いて配列番号1ないし配列番号30を各々のセンス鎖として有するアンフィレギュリンに特異的なsiRNAに従うアンフィレギュリンのmRNAの発現量を相対定量した(図1参照)。
高効率のsiRNAを選別するために最終濃度20nMの濃度でアンフィレギュリンのmRNAの発現量が対照群と対比して70%以上の発現量の減少を示し、配列番号2、6ないし9、11、17ないし21、23、24、28及び29を各々のセンス鎖として有するsiRNAの15種を選別した。
実施例3. 繊維母細胞(NIH3T3)の細胞株で選別されたsiRNAを用いたアンフィレギュリンの発現抑制
上記の実施例2で選別された配列番号2、6ないし9、11、17ないし21、23、24、28及び29を各々のセンス鎖として有するsiRNAを用いて繊維雅細胞株であるマウスの繊維母細胞(NIH3T3)を形質転換させて、上記の形質転換された繊維母細胞(NIH3T3)の細胞株でアンフィレギュリンのmRNAの発現様相を分析した。
上記の実施例2で選別された配列番号2、6ないし9、11、17ないし21、23、24、28及び29を各々のセンス鎖として有するsiRNAを用いて繊維雅細胞株であるマウスの繊維母細胞(NIH3T3)を形質転換させて、上記の形質転換された繊維母細胞(NIH3T3)の細胞株でアンフィレギュリンのmRNAの発現様相を分析した。
3−1:繊維母細胞の細胞株の培養
アメリカ合衆国種菌協会(American Type Culture Collection、ATCC)から入手したマウスの繊維母細胞の細胞株(NIH3T3)をRPMI−1640培養培地(GIBCO/Invitrogen、USA、10%(v/v)ウシ胎仔血清、ペニシリン100units/ml及びストレプトマイシン100μg/ml)で37℃、5%(v/v)CO2の条件下で培養した。
アメリカ合衆国種菌協会(American Type Culture Collection、ATCC)から入手したマウスの繊維母細胞の細胞株(NIH3T3)をRPMI−1640培養培地(GIBCO/Invitrogen、USA、10%(v/v)ウシ胎仔血清、ペニシリン100units/ml及びストレプトマイシン100μg/ml)で37℃、5%(v/v)CO2の条件下で培養した。
3−2:繊維母細胞の細胞株で目標siRNAの形質注入
上記の実施例2−1で培養された1×105繊維母細胞の細胞株を37℃で5 %(v/v) CO2の条件下で12−ウェルプレートで18時間の間RPMI 1640で培養した後、培地を除去した後各のウェル当たり500μlのOpti−MEM培地(GIBCO、米国)を分注した。
上記の実施例2−1で培養された1×105繊維母細胞の細胞株を37℃で5 %(v/v) CO2の条件下で12−ウェルプレートで18時間の間RPMI 1640で培養した後、培地を除去した後各のウェル当たり500μlのOpti−MEM培地(GIBCO、米国)を分注した。
一方、リポフェクタミン2000(LipofectamineTM 2000、Invitrogen、米国) 2μlとOpti−MEM培地248μlを混合して混合液を製造して、室温で5分間反応させた後、上記の実施例2で選別された配列番号2、6ないし9、11、17ないし21、23、24、28及び29を各々のセンス鎖として有するsiRNA(1pmole/μl) 5μlをOpti−MEM培地245μlに添加して最終濃度が5nMであるsiRNA溶液を製造した。上記のリポフェクタミン2000(LipofectamineTM 2000)混合液とsiRNA溶液を混合して室温で20分間反応させて形質注入用の溶液を製造した。
その後、Opti−MEMが分注された腫瘍細胞株の各のウェルに形質注入用の溶液を各々500μlずつ分注して6時間の間培養した後、Opti−MEM培地を除去した。ここにRPMI 1640培養培地1mlずつ分注した後24時間の間37℃で5%(v/v) CO2の条件下で培養した。
3−3:アンフィレギュリンのmRNAの定量分析
上記の実施例3−2で形質注入された細胞株から全体のRNAを抽出してcDNAを製造した後、リアルタイムPCR(real−time PCR)を用いてアンフィレギュリンの遺伝子のmRNAの発現を相対定量した。
上記の実施例3−2で形質注入された細胞株から全体のRNAを抽出してcDNAを製造した後、リアルタイムPCR(real−time PCR)を用いてアンフィレギュリンの遺伝子のmRNAの発現を相対定量した。
3−3−1:形質注入された細胞からRNAの分離及びcDNAの製造
RNA抽出キット(AccuPrep Cell total RNA extraction kit、BIONEER、韓国)を用いて、上記の実施例2−2で形質注入された細胞株 から全体のRNAを抽出して、抽出されたRNAはRNA逆転写酵素(AccuPower CycleScript RT Premix/dT20, Bioneer、韓国)を用いて、下記のような方法 でcDNAを製造した。具体的に、0.25mlのエッペンチューブに入っているAccuPower CycleScript RT Premix/dT20 (Bioneer、韓国)に一つのチューブ当たり抽出された1μgずつのRNAを入れて総体積が20μlになるようにDEPC(diethyl pyrocarbonate)で処理された蒸留水を添加した。これを遺伝子増幅器(MyGenieTM 96 Gradient Thermal Block、BIONEER、韓国)で30℃で1分間RNAとプライマーを混成化して、52℃で4分間cDNAを製造する二つの過程を6回繰返した後、95℃で5分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
RNA抽出キット(AccuPrep Cell total RNA extraction kit、BIONEER、韓国)を用いて、上記の実施例2−2で形質注入された細胞株 から全体のRNAを抽出して、抽出されたRNAはRNA逆転写酵素(AccuPower CycleScript RT Premix/dT20, Bioneer、韓国)を用いて、下記のような方法 でcDNAを製造した。具体的に、0.25mlのエッペンチューブに入っているAccuPower CycleScript RT Premix/dT20 (Bioneer、韓国)に一つのチューブ当たり抽出された1μgずつのRNAを入れて総体積が20μlになるようにDEPC(diethyl pyrocarbonate)で処理された蒸留水を添加した。これを遺伝子増幅器(MyGenieTM 96 Gradient Thermal Block、BIONEER、韓国)で30℃で1分間RNAとプライマーを混成化して、52℃で4分間cDNAを製造する二つの過程を6回繰返した後、95℃で5分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
3−3−2:アンフィレギュリンのmRNAの相対定量の分析
上記の実施例3−3−1で製造されたcDNAを鋳型にしてリアルタイムPCRを通じてアンフィレギュリンのmRNAの相対的な量を下記のような方法で定量した。96−ウェルプレートの各ウェルに上記の実施例3−3−1で製造されたcDNAを蒸留水で5倍希釈して、アンフィレギュリンのmRNAの発現量の分析のために希釈されたcDNA 3μlと2×GreenStarTM PCR master mix(BIONEER、韓国)を10μl、蒸留水6μl、アンフィレギュリンqPCRプライマーr(10pmole/μl各々、BIONEER、韓国)を1μl入れ、混合液を作った。一方、アンフィレギュリンのmRNAの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子(housekeeping gene、以下HK遺伝子)であるGAPDH(Glyceraldehyde 3−phosphate dehydrogenase)を標準遺伝子とした。上記の混合液が入った96−ウェルプレートをExicyclerTM96 Real−Time Quantitative Thermal Block(BIONEER、韓国)を用いて下記のような反応を行った; 95℃で15分間反応して酵素の活性化及びcDNAの二次構造をなくした後、94℃で30秒の変性(denaturing)、58℃で30秒のアニーリング(annealing)、72℃で30秒の延長(extension)、SYBRグリーンスキャン(SYBR green scan)の四つの過程を42回繰返して行い、72℃で3分間の最終延長を行った後、55℃で1分間温度を維持して、55℃から95℃まで融解曲線(melting curve)を分析した。PCRが終了された後、各々の収得したアンフィレギュリンのCt(threshold cycle)値はGAPDH遺伝子を通じて正規化されたmRNA値(normalization factor、NF)を計算して補正されたアンフィレギュリンのCt値を求めた後、形質注入の物質だけ処理された実験群を対照群にしてΔCt値の差を求めた。上記のΔCt値と計算式2(−ΔCt)×100を用いて配列番号2、6ないし9、11、17ないし21、23、24、28及び29を各々のセンス鎖として有するアンフィレギュリンに特異的なsiRNAによるmRNAの発現量の変化を相対定量した。
上記の実施例3−3−1で製造されたcDNAを鋳型にしてリアルタイムPCRを通じてアンフィレギュリンのmRNAの相対的な量を下記のような方法で定量した。96−ウェルプレートの各ウェルに上記の実施例3−3−1で製造されたcDNAを蒸留水で5倍希釈して、アンフィレギュリンのmRNAの発現量の分析のために希釈されたcDNA 3μlと2×GreenStarTM PCR master mix(BIONEER、韓国)を10μl、蒸留水6μl、アンフィレギュリンqPCRプライマーr(10pmole/μl各々、BIONEER、韓国)を1μl入れ、混合液を作った。一方、アンフィレギュリンのmRNAの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子(housekeeping gene、以下HK遺伝子)であるGAPDH(Glyceraldehyde 3−phosphate dehydrogenase)を標準遺伝子とした。上記の混合液が入った96−ウェルプレートをExicyclerTM96 Real−Time Quantitative Thermal Block(BIONEER、韓国)を用いて下記のような反応を行った; 95℃で15分間反応して酵素の活性化及びcDNAの二次構造をなくした後、94℃で30秒の変性(denaturing)、58℃で30秒のアニーリング(annealing)、72℃で30秒の延長(extension)、SYBRグリーンスキャン(SYBR green scan)の四つの過程を42回繰返して行い、72℃で3分間の最終延長を行った後、55℃で1分間温度を維持して、55℃から95℃まで融解曲線(melting curve)を分析した。PCRが終了された後、各々の収得したアンフィレギュリンのCt(threshold cycle)値はGAPDH遺伝子を通じて正規化されたmRNA値(normalization factor、NF)を計算して補正されたアンフィレギュリンのCt値を求めた後、形質注入の物質だけ処理された実験群を対照群にしてΔCt値の差を求めた。上記のΔCt値と計算式2(−ΔCt)×100を用いて配列番号2、6ないし9、11、17ないし21、23、24、28及び29を各々のセンス鎖として有するアンフィレギュリンに特異的なsiRNAによるmRNAの発現量の変化を相対定量した。
高効率のsiRNAを選別するためにsiRNAを処理した後ターゲット遺伝子の発現が50%抑制される値であるIC50を確認するために最終濃度5nMの濃度でアンフィレギュリンのmRNAの発現量が対照群と対比して最も大きな発現量の減少を示す配列番号8、9及び28を各々のセンス鎖として有するsiRNAの3種を選別した。
実施例4。繊維母細胞(NIH3T3)の細胞株で選別されたsiRNAを用いたアンフィレギュリンの発現抑制
上記の実施例3で選別された配列番号8、9及び28を各々のセンス鎖として有するsiRNAを用いて繊維雅細胞株であるマウスの繊維母細胞(NIH3T3)を形質転換させて、上記の形質転換された繊維母細胞(NIH3T3)の細胞株でアンフィレギュリンのmRNAの発現様相を分析してsiRNAのIC50値を確認した。
上記の実施例3で選別された配列番号8、9及び28を各々のセンス鎖として有するsiRNAを用いて繊維雅細胞株であるマウスの繊維母細胞(NIH3T3)を形質転換させて、上記の形質転換された繊維母細胞(NIH3T3)の細胞株でアンフィレギュリンのmRNAの発現様相を分析してsiRNAのIC50値を確認した。
4−1:繊維母細胞の細胞株の培養
アメリカ合衆国種菌協会(American Type Culture Collection、ATCC)から入手したマウスの繊維母細胞の細胞株(NIH3T3)をRPMI−1640培養培地(GIBCO/ Invitrogen、USA、10%(v/v)ウシ胎仔血清、ペニシリン100units/ml及びストレプトマイシン100μg/ml)で37℃、5%(v/v)CO2の条件下で培養した。
アメリカ合衆国種菌協会(American Type Culture Collection、ATCC)から入手したマウスの繊維母細胞の細胞株(NIH3T3)をRPMI−1640培養培地(GIBCO/ Invitrogen、USA、10%(v/v)ウシ胎仔血清、ペニシリン100units/ml及びストレプトマイシン100μg/ml)で37℃、5%(v/v)CO2の条件下で培養した。
4−2:繊維母細胞の細胞株で目標siRNAの形質注入
上記の実施例2−1で培養された1×105繊維母細胞の細胞株を37℃で5%(v/v) CO2の条件下で12−ウェルプレートで18時間の間RPMI 1640で培養した後、培地を除去した後各のウェル当たり500μlのOpti−MEM培地(GIBCO、米国)を分注した。
上記の実施例2−1で培養された1×105繊維母細胞の細胞株を37℃で5%(v/v) CO2の条件下で12−ウェルプレートで18時間の間RPMI 1640で培養した後、培地を除去した後各のウェル当たり500μlのOpti−MEM培地(GIBCO、米国)を分注した。
一方、リポフェクタミン2000(LipofectamineTM 2000、Invitrogen、米国) 2μlと Opti−MEM培地248μlを混合して混合液を製造し、室温で5分間反応させた後、上記の実施例3で選別された配列番号8、9及び28を各々のセンス鎖として有するsiRNA(1pmole/μl)0.2、1、5μlをOpti−MEM培地249.8、249、245μlに添加して最終濃度が0.2、1、5nMであるsiRNA溶液を製造した。上記のリポフェクタミン2000(LipofectamineTM 2000)混合液とsiRNA溶液を混合して室温で20分間反応させて形質注入用の溶液を製造した。
その後、Opti−MEMが分注された腫瘍細胞株の各のウェルに形質注入用の溶液を各々500μlずつ分注して6時間の間培養した後、Opti−MEM培地を除去した。ここに RPMI 1640培養培地1mlずつ分注した後24時間の間37℃で5%(v/v)CO2の条件下で培養した。
4−3:アンフィレギュリンのmRNAの定量分析
上記の実施例4−2で形質注入された細胞株から全体のRNAを抽出してcDNAを製造した後、リアルタイムPCR(real−time PCR)を用いてアンフィレギュリンの遺伝子のmRNAの発現量を相対定量した。
上記の実施例4−2で形質注入された細胞株から全体のRNAを抽出してcDNAを製造した後、リアルタイムPCR(real−time PCR)を用いてアンフィレギュリンの遺伝子のmRNAの発現量を相対定量した。
4−3−1:形質注入された細胞からRNAの分離及びcDNAの製造
RNA抽出キット(AccuPrep Cell total RNA extraction kit、BIONEER、 韓国)を用いて、上記の実施例2−2で形質注入された細胞株全体のRNAを 抽出して、抽出されたRNAはRNA逆転写酵素 (AccuPower CycleScript RT Premix/dT20, Bioneer、韓国)を用いて、下記のような方法でcDNAを製造し た。具体的に、0.25mlのエッペンチューブに入っているAccuPower CycleScript RT Premix/dT20 (Bioneer、韓国)に一つのチューブ当たり抽出された1μgずつのRNAを入れて総体積が20μlになるようにDEPC(diethyl pyrocarbonate)で処理された蒸留水を添加した。これを遺伝子増幅器(MyGenieTM 96 Gradient Thermal Block、BIONEER、韓国)で30℃で1分間RNAとプライマーを混成化して、52℃で4分間cDNAを製造する二つの過程を6回繰返した後、95℃で5分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
RNA抽出キット(AccuPrep Cell total RNA extraction kit、BIONEER、 韓国)を用いて、上記の実施例2−2で形質注入された細胞株全体のRNAを 抽出して、抽出されたRNAはRNA逆転写酵素 (AccuPower CycleScript RT Premix/dT20, Bioneer、韓国)を用いて、下記のような方法でcDNAを製造し た。具体的に、0.25mlのエッペンチューブに入っているAccuPower CycleScript RT Premix/dT20 (Bioneer、韓国)に一つのチューブ当たり抽出された1μgずつのRNAを入れて総体積が20μlになるようにDEPC(diethyl pyrocarbonate)で処理された蒸留水を添加した。これを遺伝子増幅器(MyGenieTM 96 Gradient Thermal Block、BIONEER、韓国)で30℃で1分間RNAとプライマーを混成化して、52℃で4分間cDNAを製造する二つの過程を6回繰返した後、95℃で5分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
4−3−2:アンフィレギュリンのmRNAの相対定量の分析
上記の実施例4−3−1で製造されたcDNAを鋳型にしてリアルタイムPCRを通じてアンフィレギュリンのmRNAの相対的な量を下記のような方法で定量した。96−ウェルプレートの各ウェルに上記の実施例4−3−1で製造されたcDNAを蒸留水で5倍希釈して、アンフィレギュリンのmRNAの発現量の分析のために希釈されたcDNA 3μlと2×GreenStarTM PCR master mix(BIONEER、韓国)を10μl、蒸留水6μl、アンフィレギュリンqPCRプライマーr(10pmole/μl各々、BIONEER、韓国)を1μl入れ、混合液を作った。一方、アンフィレギュリンのmRNAの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子(housekeeping gene、以下HK遺伝子)である GAPDH(Glyceraldehyde 3−phosphate dehydrogenase)を標準遺伝子とした。上記の混合液が入った96−ウェルプレートをExicyclerTM96 Real−Time Quantitative Thermal Block(BIONEER、韓国)を用いて下記のような反応を行った; 95℃で15分間反応して酵素の活性化及びcDNAの二次構造をなくした後、94℃で30秒の変性(denaturing)、58℃で30秒のアニーリング(annealing)、72℃で30秒の延長(extension)、SYBRグリーンスキャン(SYBR green scan)の四つの過程を42回繰返して行い、72℃で3分間の最終延長を遂行した後、55℃で1分間温度を維持して、55℃から95℃まで融解曲線(melting curve)を分析した。PCRが終了された後、各々の収得したアンフィレギュリンのCt(threshold cycle)値はGAPDH遺伝子を通じて正規化されたmRNA値(normalization factor、NF)を計算して補正されたアンフィレギュリンのCt値を求めた後、形質注入の物質だけ処理された実験群を対照群にしてΔCt値の差を求めた。上記のΔCt値と計算式2(−ΔCt)×100を用いて各アンフィレギュリンに特異的なsiRNAの濃度別の処理に従うmRNAの発現量の変化を相対定量した(図2参照)。
上記の実施例4−3−1で製造されたcDNAを鋳型にしてリアルタイムPCRを通じてアンフィレギュリンのmRNAの相対的な量を下記のような方法で定量した。96−ウェルプレートの各ウェルに上記の実施例4−3−1で製造されたcDNAを蒸留水で5倍希釈して、アンフィレギュリンのmRNAの発現量の分析のために希釈されたcDNA 3μlと2×GreenStarTM PCR master mix(BIONEER、韓国)を10μl、蒸留水6μl、アンフィレギュリンqPCRプライマーr(10pmole/μl各々、BIONEER、韓国)を1μl入れ、混合液を作った。一方、アンフィレギュリンのmRNAの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子(housekeeping gene、以下HK遺伝子)である GAPDH(Glyceraldehyde 3−phosphate dehydrogenase)を標準遺伝子とした。上記の混合液が入った96−ウェルプレートをExicyclerTM96 Real−Time Quantitative Thermal Block(BIONEER、韓国)を用いて下記のような反応を行った; 95℃で15分間反応して酵素の活性化及びcDNAの二次構造をなくした後、94℃で30秒の変性(denaturing)、58℃で30秒のアニーリング(annealing)、72℃で30秒の延長(extension)、SYBRグリーンスキャン(SYBR green scan)の四つの過程を42回繰返して行い、72℃で3分間の最終延長を遂行した後、55℃で1分間温度を維持して、55℃から95℃まで融解曲線(melting curve)を分析した。PCRが終了された後、各々の収得したアンフィレギュリンのCt(threshold cycle)値はGAPDH遺伝子を通じて正規化されたmRNA値(normalization factor、NF)を計算して補正されたアンフィレギュリンのCt値を求めた後、形質注入の物質だけ処理された実験群を対照群にしてΔCt値の差を求めた。上記のΔCt値と計算式2(−ΔCt)×100を用いて各アンフィレギュリンに特異的なsiRNAの濃度別の処理に従うmRNAの発現量の変化を相対定量した(図2参照)。
その結果、配列番号8、9及び28を各々のセンス鎖として有するアンフィレギュリンに特異的なsiRNAのすべて0.2nMの低濃度でも50%以上のアンフィレギュリンのmRNAの発現量の減少を示し非常に高効率でアンフィレギュリンの発現を阻害する効果を示したことを確認した。
実施例5:目標の塩基配列のデザイン及びsiRNAの製造
人のアンフィレギュリンのmRNAの配列(NM_001657)でsiRNAが結合できる目標の塩基配列(センス鎖)をデザインして、上記の目標の塩基配列の相補的な配列であるアンチセンス鎖のsiRNAを製造した。まず、バイオニア(株)で開発された遺伝子のデザインプログラム(Turbo si−Designer)を用いて、アンフィレギュリンのmRNAの配列(NM_001657)でsiRNAが結合できる目標の塩基配列をデザインした。本発明のアンフィレギュリンのsiRNAは19個のヌクレオチドで構成されたセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖で構成された二重鎖の構造である。また、如何な遺伝子の発現を阻害しない配列のsiRNAであるsiCONT(5’−CUUACGCUGAGUACUUCGA−3’をセンス鎖として有する)を製造した。上記のsiRNAはβ−シアノエチルホスホラミダイト(β−cyanoethyl phosphoramidite)を用いてRNAの骨格構造を構成するホスホジエステル結合を連結して製造した(Nucleic Acids Research,12:4539−4557, 1984)。具体的にRNA合成器(384 Synthesizer, BIONEER,韓国)を用いて、ヌクレオチドが付着された固形支持体の上で、遮断除去(deblocking)、結合(coupling)、酸化(oxidation)及びキャッピング(capping)からなっている一連の過程を繰返して、望む長さのRNAを含む反応物を収得した。上記の反応物をDaiso gel C18(Daiso, Japan)カラムが装着された HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan)でRNAを分離及び精製してこれをMALDI−TOF質量分析器(Shimadzu, Japan)を用いて目標の塩基配列と符合するかを確認した。この後、センスとアンチセンスのRNA鎖を結合させて配列番号31ないし230を各々のセンス鎖として有するsiRNA及びsiCONTを製造した。
人のアンフィレギュリンのmRNAの配列(NM_001657)でsiRNAが結合できる目標の塩基配列(センス鎖)をデザインして、上記の目標の塩基配列の相補的な配列であるアンチセンス鎖のsiRNAを製造した。まず、バイオニア(株)で開発された遺伝子のデザインプログラム(Turbo si−Designer)を用いて、アンフィレギュリンのmRNAの配列(NM_001657)でsiRNAが結合できる目標の塩基配列をデザインした。本発明のアンフィレギュリンのsiRNAは19個のヌクレオチドで構成されたセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖で構成された二重鎖の構造である。また、如何な遺伝子の発現を阻害しない配列のsiRNAであるsiCONT(5’−CUUACGCUGAGUACUUCGA−3’をセンス鎖として有する)を製造した。上記のsiRNAはβ−シアノエチルホスホラミダイト(β−cyanoethyl phosphoramidite)を用いてRNAの骨格構造を構成するホスホジエステル結合を連結して製造した(Nucleic Acids Research,12:4539−4557, 1984)。具体的にRNA合成器(384 Synthesizer, BIONEER,韓国)を用いて、ヌクレオチドが付着された固形支持体の上で、遮断除去(deblocking)、結合(coupling)、酸化(oxidation)及びキャッピング(capping)からなっている一連の過程を繰返して、望む長さのRNAを含む反応物を収得した。上記の反応物をDaiso gel C18(Daiso, Japan)カラムが装着された HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan)でRNAを分離及び精製してこれをMALDI−TOF質量分析器(Shimadzu, Japan)を用いて目標の塩基配列と符合するかを確認した。この後、センスとアンチセンスのRNA鎖を結合させて配列番号31ないし230を各々のセンス鎖として有するsiRNA及びsiCONTを製造した。
実施例6.人間の肺癌細胞の細胞株でsiRNAを用いたアンフィレギュリンの発現抑制
上記の実施例5で製造された配列番号31ないし230を各々のセンス鎖として有するsiRNAを用いて人間の肺癌細胞の細胞株(A549)を形質転換させて、上記の形質転換された細胞株でsiRNAの処理に従うアンフィレギュリンの発現様相を分析した。
上記の実施例5で製造された配列番号31ないし230を各々のセンス鎖として有するsiRNAを用いて人間の肺癌細胞の細胞株(A549)を形質転換させて、上記の形質転換された細胞株でsiRNAの処理に従うアンフィレギュリンの発現様相を分析した。
6−1:人間の肺癌細胞の細胞株の培養
アメリカ合衆国種菌協会(American Type Culture Collection、ATCC)から 入手した人間の肺癌細胞(A549)の細胞株はDMEM培養培地(GIBCO/Invitrogen、 USA、10%(v/v)ウシ胎仔血清、ペニシリン100units/ml及びストレプトマイシン 100μg/ml)で37℃、5%(v/v)CO2の条件下で培養した。
アメリカ合衆国種菌協会(American Type Culture Collection、ATCC)から 入手した人間の肺癌細胞(A549)の細胞株はDMEM培養培地(GIBCO/Invitrogen、 USA、10%(v/v)ウシ胎仔血清、ペニシリン100units/ml及びストレプトマイシン 100μg/ml)で37℃、5%(v/v)CO2の条件下で培養した。
6−2:人間の肺癌細胞の細胞株で目標siRNAの形質注入
上記の実施例5−1で培養された1.2×105繊維母細胞(NIH3T3)の細胞株を37℃で5%(v/v) CO2の条件下で6−ウェルプレートで18時間の間DMEMで培養した後、培地を除去した後各ウェル(well)当たり500μlのOpti−MEM培地(GIBCO、米国)を分注した。
上記の実施例5−1で培養された1.2×105繊維母細胞(NIH3T3)の細胞株を37℃で5%(v/v) CO2の条件下で6−ウェルプレートで18時間の間DMEMで培養した後、培地を除去した後各ウェル(well)当たり500μlのOpti−MEM培地(GIBCO、米国)を分注した。
一方、リポフェクタミンRNAiマックス(LipofectamineTM RNAi Max、 Invitrogen、 USA) 3.5μlとOpti−MEM培地246.5μlを混合して混合液を製造し、室温で5分間反応させた後、上記の実施例1で製造した配列番号31ないし50番の配列をセンス鎖として有するsiRNA(1pmole/μl)5または20μlをOpti−MEM培地230μlに添加して最終濃度が20nMであるsiRNA溶液を製造した。上記のリポフェクタミンRNAiマックス混合液とsiRNA溶液を混合して室温で15分間反応させて形質注入用の溶液を製造した。
その後、Opti−MEMが分注された腫瘍細胞株の各ウェル(well)に形質注入用の溶液を各々500μlずつ分注して6時間の間培養した後、Opti−MEM培地を除去した。ここに RPMI 1640培養培地1mlずつ分注した後24時間の間37℃で5%(v/v)CO2の条件下で培養した。
6−3:アンフィレギュリンのmRNAの定量分析
上記の実施例6−2で形質注入された細胞株から上記の実施例2−3−1と同一な方法で全体のRNAを抽出してcDNAを製造した後、リアルタイムPCR(real−time PCR)を用いてアンフィレギュリンのmRNAの発現量を相対定量した。
上記の実施例6−2で形質注入された細胞株から上記の実施例2−3−1と同一な方法で全体のRNAを抽出してcDNAを製造した後、リアルタイムPCR(real−time PCR)を用いてアンフィレギュリンのmRNAの発現量を相対定量した。
6−3−1:アンフィレギュリンのmRNAの相対定量の分析
上記の実施例6−2で形質注入された細胞株から上記の実施例2−3−1と同一な方法で製造されたcDNAを鋳型にしてリアルタイムPCRを通じてアンフィレギュリンのmRNAの相対的な量を下記のような方法で定量した。96−ウェルプレートの各ウェルに製造されたcDNAを蒸留水で5倍希釈して、アンフィレギュリンのmRNAの発現量の分析のために希釈されたcDNA 3μlと2×GreenStarTM PCR master mix(BIONEER、韓国)を10μl、蒸留水6μl、人間アンフィレギュリンqPCRプライマー(hAREG−F, ACACCTACTCTGGGAAGCGT; hAREG−R, GCCAGGTATTTGTGGTTCGT 10pmole/μl 各々、BIONEER、韓国)を1μl入れ、混合液を作った。一方、アンフィレギュリンのmRNAの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子(housekeeping gene、以下HK遺伝子)である GAPDH(Glyceraldehyde 3−phosphate dehydrogenase; hGAPDH−F, GGTGAAGGTCGGAGTCAACG; hGAPDH−R, ACCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG)を標準遺伝子とした。上記の混合液が入った96−ウェルプレートをExicyclerTM96 Real−Time Quantitative Thermal Block(BIONEER、韓国)を用いて下記のような反応を行った; 95℃で15分間反応して酵素の活性化及びcDNAの二次構造をなくした後、94℃で30秒の変性(denaturing)、58℃で30秒のアニーリング(annealing)、72℃で30秒の延長(extension)、SYBRグリーンスキャン(SYBR green scan)の四つの過程を42回繰返して行い、72℃で3分間の最終延長を行った後、55℃で1分間温度を維持して、55℃から95℃まで融解曲線(melting curve)を分析した。PCRが終了された後、各々の収得したアンフィレギュリンのCt(threshold cycle)値はGAPDH遺伝子を通じて正規化されたmRNA値(normalization factor、NF)を計算して補正されたアンフィレギュリンのCt値を求めた後、アンフィレギュリンに特異的なsiRNAが処理されてない細胞株の発現量を対照群にしてΔCt値の差を求めた。上記のΔCt値と計算式2(−ΔCt)×100を用いて配列番号31ないし50の配列をセンス鎖として有するアンフィレギュリンに特異的なアンフィレギュリンsiRNAの処理に従うアンフィレギュリンのmRNAの発現量を相対定量した(図3参照)。上記のアンフィレギュリンのsiRNAの殆どがアンフィレギュリンのmRNAの発現を抑制したが、対照群に比べアンフィレギュリンのmRNAの発現量が大きく減少することが確認できた。その中でも特に配列番号39ないし41、43ないし45、47、49及び50で選択されたどの一つの配列をセンス鎖として有するsiRNAが最も優秀なアンフィレギュリンのmRNAの発現の阻害能力を示した。
上記の実施例6−2で形質注入された細胞株から上記の実施例2−3−1と同一な方法で製造されたcDNAを鋳型にしてリアルタイムPCRを通じてアンフィレギュリンのmRNAの相対的な量を下記のような方法で定量した。96−ウェルプレートの各ウェルに製造されたcDNAを蒸留水で5倍希釈して、アンフィレギュリンのmRNAの発現量の分析のために希釈されたcDNA 3μlと2×GreenStarTM PCR master mix(BIONEER、韓国)を10μl、蒸留水6μl、人間アンフィレギュリンqPCRプライマー(hAREG−F, ACACCTACTCTGGGAAGCGT; hAREG−R, GCCAGGTATTTGTGGTTCGT 10pmole/μl 各々、BIONEER、韓国)を1μl入れ、混合液を作った。一方、アンフィレギュリンのmRNAの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子(housekeeping gene、以下HK遺伝子)である GAPDH(Glyceraldehyde 3−phosphate dehydrogenase; hGAPDH−F, GGTGAAGGTCGGAGTCAACG; hGAPDH−R, ACCATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG)を標準遺伝子とした。上記の混合液が入った96−ウェルプレートをExicyclerTM96 Real−Time Quantitative Thermal Block(BIONEER、韓国)を用いて下記のような反応を行った; 95℃で15分間反応して酵素の活性化及びcDNAの二次構造をなくした後、94℃で30秒の変性(denaturing)、58℃で30秒のアニーリング(annealing)、72℃で30秒の延長(extension)、SYBRグリーンスキャン(SYBR green scan)の四つの過程を42回繰返して行い、72℃で3分間の最終延長を行った後、55℃で1分間温度を維持して、55℃から95℃まで融解曲線(melting curve)を分析した。PCRが終了された後、各々の収得したアンフィレギュリンのCt(threshold cycle)値はGAPDH遺伝子を通じて正規化されたmRNA値(normalization factor、NF)を計算して補正されたアンフィレギュリンのCt値を求めた後、アンフィレギュリンに特異的なsiRNAが処理されてない細胞株の発現量を対照群にしてΔCt値の差を求めた。上記のΔCt値と計算式2(−ΔCt)×100を用いて配列番号31ないし50の配列をセンス鎖として有するアンフィレギュリンに特異的なアンフィレギュリンsiRNAの処理に従うアンフィレギュリンのmRNAの発現量を相対定量した(図3参照)。上記のアンフィレギュリンのsiRNAの殆どがアンフィレギュリンのmRNAの発現を抑制したが、対照群に比べアンフィレギュリンのmRNAの発現量が大きく減少することが確認できた。その中でも特に配列番号39ないし41、43ないし45、47、49及び50で選択されたどの一つの配列をセンス鎖として有するsiRNAが最も優秀なアンフィレギュリンのmRNAの発現の阻害能力を示した。
また、配列番号51ないし230番に従う配列を各々のセンス鎖として有するsiRNAを用いた場合でも配列番号31ないし50番に記載された配列と類似にとても効率的にアンフィレギュリンの発現が抑制できるということを確認した。
産業上の利用可能性
本発明に従うアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴRNAはアンフィレギュリンの発現を非常に効率的に抑制することができて、本発明に従うアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴRNA、これを含む二重鎖オリゴRNAの構造体、及び/または上記の二重鎖オリゴRNAの構造体で構成されたナノ粒子を含む組成物は呼吸器疾患の予防または治療に有用に使用できる。
本発明に従うアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴRNAはアンフィレギュリンの発現を非常に効率的に抑制することができて、本発明に従うアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴRNA、これを含む二重鎖オリゴRNAの構造体、及び/または上記の二重鎖オリゴRNAの構造体で構成されたナノ粒子を含む組成物は呼吸器疾患の予防または治療に有用に使用できる。
以上で、本発明の内容の特定な部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を持っている者において、このような具体的な記述は単に望ましい実施の様態だけで、これにより本発明の範囲が制限されることではない点は明白なことである。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求項らとそれらの等価物によって定義されることである。
本発明のまた別の目的は上記のアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴRNA、またはそのような二重鎖オリゴRNAを含む二重鎖オリゴRNAの構造体を用いて呼吸器の疾患、特にCOPD及び/またはIPFの予防または治療する方法を提供することである。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1) 配列番号1〜230で選択されたいずれか一つの配列を含むセンス鎖(sense strand)とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含むアンフィレギュリンに特異的なsiRNA。
(項目2) 前記siRNAのセンス鎖またはアンチセンス鎖は19〜31個のヌクレオチドからなることを特徴とする項目1に記載のアンフィレギュリンに特異的なsiRNA。
(項目3) 配列番号8、9、28、39〜41、43〜45、47、49及び50からなる群より選択されるいずれか一つの配列を含むセンス鎖とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含む項目1に記載のアンフィレギュリンに特異的なsiRNA。
(項目4) 前記siRNAのセンス鎖またはアンチセンス鎖は一つ以上の化学的な変形を含むことを特徴とする項目1〜3の中いずれか一項に記載のアンフィレギュリンに特異的なsiRNA。
(項目5) 前記化学的な変形はヌクレオチド内の糖構造の2´炭素位置で−OH基が-CH3(メチル)、−OCH3(methoxy)、−NH2、−F(フッ素)、−O−2−メトキシエチル−O−プロピル、−O−2−メチルチオエチル(methylthioethyl)、−O−3−アミノプロピル、−O−3−ジメチルアミノプロピル、−O−N−メチルアセトアミドまたは−O−ジメチルアミドオキシエチルへの置換;
ヌクレオチド内の糖構造内の酸素が硫黄に置換された変形;
ヌクレオチド結合のホスホロチオエートまたはボラノリン酸、メチルホスホン酸te)結合への変形;
PNA(peptide nucleic acid)、LNA(locked nucleic acid)またはUNA(unlocked nucleic acid)形態への変形で選択された一つ以上の変形;
から選択される一つ以上の変形であることを特徴とする項目4に記載のアンフィレギュリンに特異的なsiRNA。
(項目6) 前記siRNAのアンチセンス鎖の5‘末端に一つ以上の燐酸基が結合されていることを特徴とする項目1〜5の中いずれか一項に記載のアンフィレギュリンに特異的なsiRNA。
(項目7) 次の構造式(1)の構造を含む二重鎖オリゴRNAの構造体:
A−X−R−Y−B 構造式(1)
上記の構造式(1)でAは親水性物質、Bは疎水性物質、X及びYは各々の独立的に単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合を意味し、Rはアンフィレギュリンに特異的siRNAを意味する。
(項目8) 次の構造式(2)の構造を含む項目7に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体:
上記の構造式(2)でS及びASは各々項目7によるsiRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖を意味し、A,B,X及びYは項目7の正義と同じである。
(項目9) 次の構造式(3)の構造を含む項目8に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体:
上記の構造式(3)でA,B,X、Y、S及びASは項目8の正義と同じで、5‘及び3’はsiRNAのセンス鎖の5‘末端及び3’末端を意味する。
(項目10) 前記アンフィレギュリンに特異的なsiRNAは項目1〜6の中いずれか一項によるsiRNAであることを特徴とする項目7〜9の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
(項目11) 前記親水性物質の分子量は200〜10,000であることを特徴とする項目7〜10の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
(項目12) 前記親水性物質はポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンからなる群より選択されるいずれか一つであることを特徴とする項目11に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
(項目13) 前記疎水性物質の分子量は250〜1,000であることを特徴とする項目7〜10の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
(項目14) 前記疎水性物質はステロイド誘導体、グリセリド誘導体、グリセロールエーテル、ポリプロピレングリコール、C12〜C50の不飽和または飽和炭化水素、ジアシルホスファチジルコリン、脂肪酸、リン脂質及びリポポリアミンからなる群より選択されることを特徴とする項目13に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
(項目15) 前記ステロイド(steroid)の誘導体はコレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルマート、コレスタニルホルマート及びコレスタニルアミンからなる群より選択されることを特徴とする項目14に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
(項目16) 前記グリセリドの誘導体はモノ−、ジ−及びトリ−グリセリドから選択されることを特徴とする項目14に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
(項目17) 前記X及びYで表す共有結合は非分解性または分解性結合であることを特徴とする 項目7〜16の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
(項目18) 前記非分解性結合はアミド結合または燐酸化結合であることを特徴とする項目17に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
(項目19) 前記分解性結合はジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、無水物結合、生分解性結合または酵素分解性結合であることを特徴とする項目17に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
(項目20) 項目7〜19の中いずれか一項による二重鎖オリゴRNAの構造体を含むナノ粒子。
(項目21) 互いに違う配列を含むsiRNAを含む二重鎖オリゴRNAの構造体が混合されて構成されることを特徴とする項目20に記載のナノ粒子。
(項目22) 項目1〜6の中いずれか一項によるsiRNA、項目7〜19の中いずれか一項による二重鎖オリゴRNAの構造体または、項目20〜21の中いずれか一項によるナノ粒子を有効成分として含む薬学的な組成物。
(項目23) 呼吸器疾患の予防または治療のための項目22に記載の薬学的な組成物。
(項目24) 前記呼吸器疾患は慢性閉鎖性肺疾患(COPD)、特発性肺繊維症(IPF)、 喘息、急慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、気管支炎、細気管支炎、咽喉炎、へんとう炎または喉頭炎の中選択されることを特徴とする項目23に記載の薬学的な組成物。
(項目25) 項目22〜24の中いずれか一項による組成物を含む凍結乾燥された形態の製剤。
(項目26) 項目1〜6の中いずれか一項によるsiRNA、項目7〜19の中いずれか一項による二重鎖オリゴRNAの構造体または、項目20〜21の中いずれか一項によるナノ粒子または項目22〜25の中いずれか一項による組成物または製剤を予防または治療を要する個体に投与することを特徴とする呼吸器疾患の予防または治療方法。
(項目27) 前記呼吸器疾患は慢性閉鎖性肺疾患(COPD)、特発性肺繊維症(IPF)、喘息、急慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、気管支炎、 細気管支炎、咽喉炎、へんとう炎または喉頭炎の中選択される疾患であることを特徴とする項目26に記載の呼吸器疾患の予防または治療方法。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1) 配列番号1〜230で選択されたいずれか一つの配列を含むセンス鎖(sense strand)とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含むアンフィレギュリンに特異的なsiRNA。
(項目2) 前記siRNAのセンス鎖またはアンチセンス鎖は19〜31個のヌクレオチドからなることを特徴とする項目1に記載のアンフィレギュリンに特異的なsiRNA。
(項目3) 配列番号8、9、28、39〜41、43〜45、47、49及び50からなる群より選択されるいずれか一つの配列を含むセンス鎖とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含む項目1に記載のアンフィレギュリンに特異的なsiRNA。
(項目4) 前記siRNAのセンス鎖またはアンチセンス鎖は一つ以上の化学的な変形を含むことを特徴とする項目1〜3の中いずれか一項に記載のアンフィレギュリンに特異的なsiRNA。
(項目5) 前記化学的な変形はヌクレオチド内の糖構造の2´炭素位置で−OH基が-CH3(メチル)、−OCH3(methoxy)、−NH2、−F(フッ素)、−O−2−メトキシエチル−O−プロピル、−O−2−メチルチオエチル(methylthioethyl)、−O−3−アミノプロピル、−O−3−ジメチルアミノプロピル、−O−N−メチルアセトアミドまたは−O−ジメチルアミドオキシエチルへの置換;
ヌクレオチド内の糖構造内の酸素が硫黄に置換された変形;
ヌクレオチド結合のホスホロチオエートまたはボラノリン酸、メチルホスホン酸te)結合への変形;
PNA(peptide nucleic acid)、LNA(locked nucleic acid)またはUNA(unlocked nucleic acid)形態への変形で選択された一つ以上の変形;
から選択される一つ以上の変形であることを特徴とする項目4に記載のアンフィレギュリンに特異的なsiRNA。
(項目6) 前記siRNAのアンチセンス鎖の5‘末端に一つ以上の燐酸基が結合されていることを特徴とする項目1〜5の中いずれか一項に記載のアンフィレギュリンに特異的なsiRNA。
(項目7) 次の構造式(1)の構造を含む二重鎖オリゴRNAの構造体:
A−X−R−Y−B 構造式(1)
上記の構造式(1)でAは親水性物質、Bは疎水性物質、X及びYは各々の独立的に単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合を意味し、Rはアンフィレギュリンに特異的siRNAを意味する。
(項目8) 次の構造式(2)の構造を含む項目7に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体:
上記の構造式(2)でS及びASは各々項目7によるsiRNAのセンス鎖及びアンチセンス鎖を意味し、A,B,X及びYは項目7の正義と同じである。
(項目9) 次の構造式(3)の構造を含む項目8に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体:
上記の構造式(3)でA,B,X、Y、S及びASは項目8の正義と同じで、5‘及び3’はsiRNAのセンス鎖の5‘末端及び3’末端を意味する。
(項目10) 前記アンフィレギュリンに特異的なsiRNAは項目1〜6の中いずれか一項によるsiRNAであることを特徴とする項目7〜9の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
(項目11) 前記親水性物質の分子量は200〜10,000であることを特徴とする項目7〜10の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
(項目12) 前記親水性物質はポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンからなる群より選択されるいずれか一つであることを特徴とする項目11に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
(項目13) 前記疎水性物質の分子量は250〜1,000であることを特徴とする項目7〜10の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
(項目14) 前記疎水性物質はステロイド誘導体、グリセリド誘導体、グリセロールエーテル、ポリプロピレングリコール、C12〜C50の不飽和または飽和炭化水素、ジアシルホスファチジルコリン、脂肪酸、リン脂質及びリポポリアミンからなる群より選択されることを特徴とする項目13に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
(項目15) 前記ステロイド(steroid)の誘導体はコレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルマート、コレスタニルホルマート及びコレスタニルアミンからなる群より選択されることを特徴とする項目14に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
(項目16) 前記グリセリドの誘導体はモノ−、ジ−及びトリ−グリセリドから選択されることを特徴とする項目14に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
(項目17) 前記X及びYで表す共有結合は非分解性または分解性結合であることを特徴とする 項目7〜16の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
(項目18) 前記非分解性結合はアミド結合または燐酸化結合であることを特徴とする項目17に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
(項目19) 前記分解性結合はジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、無水物結合、生分解性結合または酵素分解性結合であることを特徴とする項目17に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
(項目20) 項目7〜19の中いずれか一項による二重鎖オリゴRNAの構造体を含むナノ粒子。
(項目21) 互いに違う配列を含むsiRNAを含む二重鎖オリゴRNAの構造体が混合されて構成されることを特徴とする項目20に記載のナノ粒子。
(項目22) 項目1〜6の中いずれか一項によるsiRNA、項目7〜19の中いずれか一項による二重鎖オリゴRNAの構造体または、項目20〜21の中いずれか一項によるナノ粒子を有効成分として含む薬学的な組成物。
(項目23) 呼吸器疾患の予防または治療のための項目22に記載の薬学的な組成物。
(項目24) 前記呼吸器疾患は慢性閉鎖性肺疾患(COPD)、特発性肺繊維症(IPF)、 喘息、急慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、気管支炎、細気管支炎、咽喉炎、へんとう炎または喉頭炎の中選択されることを特徴とする項目23に記載の薬学的な組成物。
(項目25) 項目22〜24の中いずれか一項による組成物を含む凍結乾燥された形態の製剤。
(項目26) 項目1〜6の中いずれか一項によるsiRNA、項目7〜19の中いずれか一項による二重鎖オリゴRNAの構造体または、項目20〜21の中いずれか一項によるナノ粒子または項目22〜25の中いずれか一項による組成物または製剤を予防または治療を要する個体に投与することを特徴とする呼吸器疾患の予防または治療方法。
(項目27) 前記呼吸器疾患は慢性閉鎖性肺疾患(COPD)、特発性肺繊維症(IPF)、喘息、急慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、気管支炎、 細気管支炎、咽喉炎、へんとう炎または喉頭炎の中選択される疾患であることを特徴とする項目26に記載の呼吸器疾患の予防または治療方法。
Claims (27)
- 配列番号1〜230で選択されたいずれか一つの配列を含むセンス鎖(sense strand)とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含むアンフィレギュリンに特異的なsiRNA。
- 前記siRNAのセンス鎖またはアンチセンス鎖は19〜31個のヌクレオチドからなることを特徴とする請求項1に記載のアンフィレギュリンに特異的なsiRNA。
- 配列番号8、9、28、39〜41、43〜45、47、49及び50からなる群より選択されるいずれか一つの配列を含むセンス鎖とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含む請求項1に記載のアンフィレギュリンに特異的なsiRNA。
- 前記siRNAのセンス鎖またはアンチセンス鎖は一つ以上の化学的な変形を含むことを特徴とする請求項1〜3の中いずれか一項に記載のアンフィレギュリンに特異的なsiRNA。
- 前記化学的な変形はヌクレオチド内の糖構造の2´炭素位置で−OH基が-CH3(メチル)、−OCH3(methoxy)、−NH2、−F(フッ素)、−O−2−メトキシエチル−O−プロピル、−O−2−メチルチオエチル(methylthioethyl)、−O−3−アミノプロピル、−O−3−ジメチルアミノプロピル、−O−N−メチルアセトアミドまたは−O−ジメチルアミドオキシエチルへの置換;
ヌクレオチド内の糖構造内の酸素が硫黄に置換された変形;
ヌクレオチド結合のホスホロチオエートまたはボラノリン酸、メチルホスホン酸te)結合への変形;
PNA(peptide nucleic acid)、LNA(locked nucleic acid)またはUNA(unlocked nucleic acid)形態への変形で選択された一つ以上の変形;
から選択される一つ以上の変形であることを特徴とする請求項4に記載のアンフィレギュリンに特異的なsiRNA。 - 前記siRNAのアンチセンス鎖の5‘末端に一つ以上の燐酸基が結合されていることを特徴とする請求項1〜5の中いずれか一項に記載のアンフィレギュリンに特異的なsiRNA。
- 次の構造式(1)の構造を含む二重鎖オリゴRNAの構造体:
A−X−R−Y−B 構造式(1)
上記の構造式(1)でAは親水性物質、Bは疎水性物質、X及びYは各々の独立的に単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合を意味し、Rはアンフィレギュリンに特異的siRNAを意味する。 - 次の構造式(2)の構造を含む請求項7に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体:
- 次の構造式(3)の構造を含む請求項8に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体:
- 前記アンフィレギュリンに特異的なsiRNAは請求項1〜6の中いずれか一項によるsiRNAであることを特徴とする請求項7〜9の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
- 前記親水性物質の分子量は200〜10,000であることを特徴とする請求項7〜10の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
- 前記親水性物質はポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンからなる群より選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項11に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
- 前記疎水性物質の分子量は250〜1,000であることを特徴とする請求項7〜10の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
- 前記疎水性物質はステロイド誘導体、グリセリド誘導体、グリセロールエーテル、ポリプロピレングリコール、C12〜C50の不飽和または飽和炭化水素、ジアシルホスファチジルコリン、脂肪酸、リン脂質及びリポポリアミンからなる群より選択されることを特徴とする請求項13に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
- 前記ステロイド(steroid)の誘導体はコレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルマート、コレスタニルホルマート及びコレスタニルアミンからなる群より選択されることを特徴とする請求項14に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
- 前記グリセリドの誘導体はモノ−、ジ−及びトリ−グリセリドから選択されることを特徴とする請求項14に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
- 前記X及びYで表す共有結合は非分解性または分解性結合であることを特徴とする 請求項7〜16の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
- 前記非分解性結合はアミド結合または燐酸化結合であることを特徴とする請求項17に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
- 前記分解性結合はジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、無水物結合、生分解性結合または酵素分解性結合であることを特徴とする請求項17に記載の二重鎖オリゴRNAの構造体。
- 請求項7〜19の中いずれか一項による二重鎖オリゴRNAの構造体を含むナノ粒子。
- 互いに違う配列を含むsiRNAを含む二重鎖オリゴRNAの構造体が混合されて構成されることを特徴とする請求項20に記載のナノ粒子。
- 請求項1〜6の中いずれか一項によるsiRNA、請求項7〜19の中いずれか一項による二重鎖オリゴRNAの構造体または、請求項20〜21の中いずれか一項によるナノ粒子を有効成分として含む薬学的な組成物。
- 呼吸器疾患の予防または治療のための請求項22に記載の薬学的な組成物。
- 前記呼吸器疾患は慢性閉鎖性肺疾患(COPD)、特発性肺繊維症(IPF)、 喘息、急慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、気管支炎、細気管支炎、咽喉炎、へんとう炎または喉頭炎の中選択されることを特徴とする請求項23に記載の薬学的な組成物。
- 請求項22〜24の中いずれか一項による組成物を含む凍結乾燥された形態の製剤。
- 請求項1〜6の中いずれか一項によるsiRNA、請求項7〜19の中いずれか一項による二重鎖オリゴRNAの構造体または、請求項20〜21の中いずれか一項によるナノ粒子または請求項22〜25の中いずれか一項による組成物または製剤を予防または治療を要する個体に投与することを特徴とする呼吸器疾患の予防または治療方法。
- 前記呼吸器疾患は慢性閉鎖性肺疾患(COPD)、特発性肺繊維症(IPF)、喘息、急慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、気管支炎、 細気管支炎、咽喉炎、へんとう炎または喉頭炎の中選択される疾患であることを特徴とする請求項26に記載の呼吸器疾患の予防または治療方法。
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