KR102208588B1 - 신규 이중 나선 올리고 rna 및 이를 포함하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 siRNA, 이를 포함하는 고효율 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 나노입자에 관한 것으로, 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체는 세포 내로 효율적으로 전달되도록 하기 위하여, 이중나선 RNA(siRNA)의 양 말단에 친수성 물질 및 소수성 물질을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합을 이용하여 접합된 형태의 구조를 가지며, 수용액에서 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체들의 소수성 상호작용에 의해 나노입자 형태로 전환될 수 있다. 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체에 포함된 siRNA는 섬유증 또는 호흡기 질환 연관 유전자, 특히 엠피레귤린 또는 스트라티핀 특이적 siRNA인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 siRNA, 이를 포함하는 고효율 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 나노입자를 유효성분으로 포함하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

Description

신규 이중 나선 올리고 RNA 및 이를 포함하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물{Novel Double Strand Oligo RNA and Pharmaceutical Compositions For Preventing or Treating Fibrosis or Respiratory Diseases Containing The Same}
본 발명은 신규 이중 나선 올리고 RNA, 바람직하게는 siRNA 및 이를 포함하는 고효율 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 나노입자에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 세포 내로 효율적으로 전달되도록 하기 위하여, 이중나선 RNA(siRNA)의 양 말단에 친수성 물질 및 소수성 물질을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합을 이용하여 접합된 형태의 구조를 가지고, 수용액에서 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체들의 소수성 상호작용에 의해 나노입자 형태로 전환될 수 있는 siRNA, 이를 포함하는 고효율 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 나노입자에 관한 것으로, 바람직하게는 siRNA가 호흡기 질환 연관 유전자인 엠피레귤린(amphiregulin) 또는 스트라티핀(stratifin)에 특이적인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 신규한 siRNA, 이를 포함하는 고효율 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 나노입자를 유효성분으로 포함하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
유전자의 발현을 억제하는 기술은 질병치료를 위한 치료제 개발 및 표적 검증에서 중요한 도구이다. 표적 유전자의 발현을 억제하는 종래의 기술로는 표적 유전자에 대한 전이 유전자를 도입하는 기술이 개시되어 있는데, 프로모터를 기준으로 역방향(antisense)으로 전이 유전자를 도입하는 방법(Sheehy et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:8805-8808, 1988; Smith et al., Nature, 334:724-726, 1988)과 프로모터 기준으로 정방향(sense)으로 이식 유전자를 도입하는 방법(Napoli et al., Plant Cell, 2:279-289, 1990; van der Krol et al., Plant Cell, 2:291-299, 1990; 미국특허 제5,034,323호; 미국특허 제5,231,020호; 및 미국특허 제5,283,184호)이다.
한편, 최근에 20 내지 25 염기쌍을 갖는 이중가닥 RNA 단편의 축적에 의해 전사 후 유전자의 억제 또는 RNA 간섭(RNAi) 현상이 일어나며, 상기 이중가닥 RNA는 RNA 주형으로부터 합성된다는 사실이 보고된 바 있다. 상기 이중가닥 RNA 단편은 "작은 간섭 RNA(small interfering RNA, 이하 siRNA라고 한다)"라고 명명되었다. 이후, 포유동물을 포함한 다양한 생명체에서 siRNA는 유전자의 발현을 억제하는 중요한 요소라는 사실이 명백해지고 있다(Fire et al., Nature, 391:806-811, 1998; Timmons & Fire, Nature, 395:854, 1998; Kennerdell & Carthew, Cell, 95:1017-1026, 1998; Elbashir et al., Nature, 411:494-497, 2001; WO99/32619). 또한, 이중가닥 siRNA는 세포 내에서 RISC(RNA-induced silencing complex) 단백질 복합체에 의해 단일가닥 RNA로 전환되고, 이후 타깃 mRNA와 결합하여 mRNA를 불활성화 시키는 것으로 알려져 있다(Novina & Sharp, Nature, 430:161-164, 2004). 상기한 바와 같이 siRNA를 이용한 유전자의 발현 억제 기술은 표적 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제시키고 이로 인한 변화를 관찰하는 것으로, 표적 세포에서의 표적 유전자의 기능을 규명하는 연구에 유용하게 사용된다. 특히, 감염성 바이러스 또는 암세포 등에서 표적 유전자의 기능을 억제하는 것은 해당 질병의 치료 방법을 개발하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예측된다. 생체 외(in vitro)에서의 연구 및 실험동물을 이용한 생체 내 (in vivo)연구를 수행한 결과, siRNA에 의한 표적 유전자의 발현억제가 가능하다고 보고된 바 있다. 일례로, 국제특허공개공보 WO 03/070969호에는 siRNA를 이용하여 암세포에서 Bcl2 단백질의 발현을 억제시킴으로써, 암세포를 치료하는 방법이 개시되어 있고, WO 04/009769호에는 siRNA를 이용하여 혈관신생을 유발하는 VEGF 단백질의 발현을 억제시킴으로써, 암세포를 치료하는 방법이 개시되어 있다.
또한, siRNA의 작용 기작은 타겟 mRNA와 상보적으로 결합하여 서열 특이적으로 타깃 유전자의 발현을 조절하기 때문에, 기존의 항체 기반 의약품이나 화학물질(small molecule drug)에 비하여 적용할 수 있는 대상이 획기적으로 확대될 수 있다는 장점을 가진다(Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 2006 13(4):664-670).
siRNA의 뛰어난 효과 및 다양한 사용범위에도 불구하고, siRNA가 치료제로 개발되기 위해서는 체내에서의 siRNA의 안정성(stability) 개선과 세포 전달 효율 개선을 통해 siRNA가 타겟 세포에 효과적으로 전달되어야 한다(Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development. Drug Discov Today. 2006 Jan; 11(1-2):67-73).
상기 체내 안정성 향상 및 siRNA의 비특이적인 세포 면역반응(innate immune stimulation) 문제 해결을 위하여, siRNA의 일부 뉴클레오티드 또는 골격(backbone)을 핵산분해효소 저항성을 가지도록 변형(modification)하거나 바이러스성 벡터(viral vector), 리포좀 또는 나노입자(nanoparticle) 등의 전달체의 이용 등에 대한 연구가 활발하게 시도되고 있다.
아데노바이러스나 레트로바이러스 등의 바이러스성 벡터를 이용한 전달 시스템은 형질주입 효율(transfection efficiency)이 높지만, 면역원성(immunogenicity) 및 발암성(oncogenicity)이 높다. 반면에 나노입자를 포함하는 비바이러스성(non-viral) 전달 시스템은 바이러스성 전달 시스템에 비하여 세포전달효율은 낮은 편이지만, 생체 내(in vivo)에서의 안전성이 높고, 타겟 특이적으로 전달이 가능하며, 내포되어 있는 RNAi 올리고뉴클레오타이드를 세포 또는 조직으로 흡수(uptake) 및 내재화(internalization) 등의 개선된 전달 효과가 높을 뿐 아니라, 세포독성 및 면역 유발(immune stimulation)이 거의 없다는 장점을 가지고 있어, 현재는 바이러스성 전달 시스템에 비해 유력한 전달방법으로 평가되어지고 있다 (Nonviral delivery of synthetic siRNA s in vivo. J Clin Invest. 2007 December 3; 117(12): 3623-632).
상기 비바이러스성 전달 시스템 중에서 나노전달체(nanocarrier)를 이용하는 방법은 리포좀, 양이온 고분자 복합체 등의 다양한 고분자를 사용함으로써 나노입자를 형성하고, siRNA를 이러한 나노입자(nanoparticle), 즉 나노전달체(nanocarrier)에 담지하여 세포에 전달하는 형태를 가진다. 나노전달체를 이용하는 방법 중 주로 활용되는 방법은 고분자 나노입자(polymeric nanoparticle), 고분자 미셀(polymer micelle), 리포플렉스(lipoplex) 등이 있는데, 이 중에서 리포플렉스를 이용한 방법은 양이온성 지질로 구성되어 세포의 엔도좀(endosome)의 음이온성 지질과 상호작용하여 엔도좀의 탈안정화 효과를 유발하여 세포 내로 전달하는 역할을 한다.
또한, siRNA 패신저(passenger; 센스(sense)) 가닥의 말단 부위에 화학물질 등을 연결하여 증진된 약동력학(pharmacokinetics)적 특징을 갖도록 하여 생체 내(in vivo)에서 높은 효율을 유도할 수 있다는 것이 알려져 있다(Nature 11; 432(7014):173-8, 2004). 이 때 siRNA 센스(sense; 패신저(passenger)) 또는 안티센스 (antisence; 가이드(guide)) 가닥의 말단에 결합된 화학 물질의 성질에 따라 siRNA의 안정성이 달라진다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 같은 고분자 화합물이 접합된 형태의 siRNA는 양이온성 물질이 존재하는 조건에서 siRNA의 음이온성 인산기와 상호작용하여 복합체를 형성함으로써, 개선된 siRNA 안정성을 가진 전달체가 된다(J Control Release 129(2):107-16, 2008). 특히 고분자 복합체로 구성된 미셀(micelle)들은 약물 전달 운반체로 쓰이는 다른 시스템인, 미소구체(microsphere) 또는 나노입자(nanoparticle) 등에 비해 그 크기가 극히 작으면서도 분포가 매우 일정하고, 자발적으로 형성되는 구조이므로 제제의 품질 관리 및 재현성 확보가 용이하다는 장점이 있다.
또한, siRNA의 세포 내 전달 효율성을 향상시키기 위해, siRNA에 생체 적합성 고분자인 친수성 물질(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG))을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합으로 접합시킨 siRNA 접합체를 통해, siRNA의 안정성 확보 및 효율적인 세포막 투과성을 위한 기술이 개발되었다(대한민국 등록특허 제883471호). 하지만 siRNA의 화학적 변형 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 접합시키는 것(PEGylation)만으로는 생체 내에서의 낮은 안정성과 타깃 장기로의 전달이 원활하지 못하다는 단점은 여전히 가진다. 이러한 단점을 해결하기 위하여 올리고뉴클레오티드, 특히 siRNA와 같은 이중나선 올리고 RNA에 친수성 및 소수성 물질이 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체가 개발되었는데, 상기 구조체는 소수성 물질의 소수성 상호작용에 의하여 SAMiRNATM(Self Assembled Micelle Inhibitory RNA)라고 명명된 자가조립 나노입자를 형성하게 되는데(대한민국 등록 특허 제1224828호 참조), SAMiRNATM 기술은 기존의 전달기술들에 비해 매우 사이즈가 작으면서도 균일한(homogenous) 나노입자를 수득할 수 있다는 장점을 가진다.
천식과 함께 대표적인 폐질환의 하나인 만성폐쇄성폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, 이하 'COPD'라고 함)은 비가역적인 기도의 폐색을 동반한다는 점에서 천식과 다르며 반복되는 감염, 유해한 입자나 가스의 흡입이나 흡연에 의해 발생하는 폐의 비정상적인 염증반응과 이와 동반하여 완전히 가역적이지 않으며 점차 진행하는 기류제한을 보이는 호흡기 질환이다(Am J Respir Crit Care Med, 163:1256-1276, 2001). 전세계적으로 COPD의 심각성이 강조되고 있는데 이는 COPD가 1990년 전체 사망 질환 중 6위였으나 2020년에는 3위가 되리라 예측되고, 10대 질환 중 유일하게 그 발병률이 증가하는 중요한 질환이다. 또 질환으로 인한 장애의 원인으로는 4위가 되리라 예측되므로 COPD로 인한 사회, 경제적 질병부담이 급격히 증가할 것으로 예상된다(Lancet, 349:1498-1504, 1997). 만성폐쇄성폐질환은 기도 및 폐실질 염증에 의한 세기관지 및 폐실질의 병리학적 변화에 의해 발생하는 병으로, 폐쇄성 세기관지염 및 폐기종(폐실질 파괴)을 특징으로 한다. 만성폐쇄성폐질환의 종류에는 만성폐쇄성기관지염(Chronic obstructive bronchitis), 만성세기관지염(Chronic bronchiolitis) 및 폐기종(Emphysema)이 있다. 만성폐쇄성폐질환의 경우 호중구의 수가 증가하며, GM-CSF, TNF-α, IL-8, MIP-2와 같은 사이토카인이 분비된다. 기도에 염증이 생기고, 근육 벽이 두꺼워지며, 점액 분비가 증가하여 기관지 폐쇄가 나타난다. 기관지가 폐쇄되면 폐포는 확장되고 손상되어 산소와 이산화탄소의 교환능력이 손상을 받게 되고, 호흡부전발생이 높아진다. 이미 국내 45세 이상인 성인의 8%가 만성폐쇄성폐질환 환자임에도 불구하고 폐암에만 관심이 치우쳐 있고, 만성폐쇄성폐질환을 치료하는 종래의 방법은 항염증 작용을 갖는 치료제나 기관지확장 효과를 갖는 치료제를 이용하는 정도로, 유전자 치료제에 의한 본질적인 만성폐쇄성폐질환의 예방 및 치료는 미미한 실정이다. 상기 항염증 작용을 갖는 대표적인 치료제는 글루코콜티코이드(glucocorticoid), 루코트리엔 모디파이어(leukotriene modifiers), 데오필린(theophylline) 등이 있다. 그러나 상기 글루코콜티코이드(glucocorticoid)는 효과 면에서는 강력하나 약물부작용이 문제가 되어 흡입 치료를 시행하고 있고, 치료 효과도 선택적으로 작용하는 것이 아니라 모든 면역반응과 항염증반응을 억제하기 때문에 경우에 따라서 필요한 면역반응까지 억제하는 문제점이 있다. 상기 루코트리엔 모디파이어(leukotriene modifiers)는 부작용은 적지만 효과 면에서 한계가 있어 단독으로 사용 시에는 천식을 조절할 수 없다. 따라서 대부분 보조적으로 사용하고 있는 문제점이 있다. 상기 테오필린(theophylline)은 효과 면에서도 뛰어나지 못하며 부작용의 우려가 있는 문제점이 있다. 따라서 만성폐쇄성폐질환을 예방하고 치료할 수 있는 효과가 뛰어나고 부작용이 적은 새로운 치료제에 대한 수요가 절실한 상황이다.
한편, 섬유증(Fibrosis)의 한 종류인 특발성 폐섬유화증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis, 이하 'IPF'라고 함)은 폐포(허파꽈리) 벽에 만성염증 세포들이 침투하면서 폐를 딱딱하게 하는 여러 변화가 발생하면서 폐조직의 심한 구조적 변화를 야기하며 점차 폐기능 저하되어 결국에는 사망하게 되는 질환으로, 아직까지는 효과적인 치료방법이 없어 대개 증상이 나타나서 진단을 하게 되면 중앙 생존기간이 3~5년 정도밖에 안되는 아주 예후가 나쁜 질병이다. 발생빈도는 외국의 경우 인구 10만명 당 약 3-5명 정도로 보고되고 있으며 대개 50대 이후에 발병율이 높고 남자가 여자보다 2배 가량 발생율이 높은 것으로 알려져 있다.
IPF의 발명원인은 아직 명확하게 규명되지는 않았는데, 흡연자에서 빈도가 높고, 항우울제, 위-식도역류에 의한 만성적 폐 흡입, 금속분진, 목재분진, 또는 용매제 흡입 등이 IPF의 발생과 연관이 있는 위험인자들로 보고된 바 있으나, 대부분의 환자들에서는 확실한 인과관계가 있는 인자들을 찾을 수 없다.
IPF는 치료를 하지 않았을 때 계속적으로 악화되어 환자의 약 50%이상이 3-5년 내에 사망한다고 알려져 있고, 또 일단 병이 진행되어 완전히 섬유화로 굳어진 다음에는 어떤 치료를 하더라도 호전이 되지 않기 때문에 치료를 한다면 조기에 치료할 경우에 효과가 있을 가능성이 높을 것으로 예측하고 있다. 현재 사용되고 있는 치료제로는 스테로이드(steroid)와 아자티오프린(azathioprine), 또는 사이클로포스마이드(cyclophosphamide)의 병합요법을 사용하는 방법이 알려져는 있지만, 특별한 효과를 보인다고 보기는 어려우며, 여러 가지 섬유화 억제제들이 동물실험 및 소규모의 환자들에서 시도되었으나 뚜렷한 효과가 입증된 것이 없는 상태이다. 특히,　말기 IPF 환자에서는 폐이식 외에 다른 효과적인 치료 방법이 없는 실정이다. 따라서, 보다 효율적인 IPF의 치료제 개발이 절실한 상황이다.
섬유증(Fibrosis)는 어떠한 이유로 인해 조직이나 장기가 결합조직의 과잉 섬유화로 인하여 단단하게 굳게 되는 병증을 통칭하는데, 섬유화가 일어나는 모든 과정은 부위를 막론하고 흉터가 치료되는 과정과 동일한 경로로 이루어진다. 섬유화증세는 현재까지 완치 방법이 거의 없으며, 치료방법은 개발 및 연구 중이다. 효과적인 섬유화 치료제는 대표적인 섬유증인 간경변(cirrhosis), 골수섬유증(myelofibrosis), 심근섬유증(myocardial fibrosis), 신장 섬유증(renal fibrosis), 폐섬유증 (pulmonary fibrosis) 뿐만 아니라 섬유증이 동반되는 다양한 질병에 적용이 가능하다. 따라서 효율적인 섬유증의 치료제 개발이 절실한 상황이다.
한편, 엠피레귤린은 상피세포성장인자 수용체에 결합하여 상피세포 수용체 경로(EGFR pathway)를 활성화 시키며, 세포증식에 관여한다는 사실이 알려져 있고, 엠피레귤린 특이적 siRNA에 의해 엠피레귤린의 발현을 저해시킬 수 있으며, 이는 특정 타입의 유방암에서 치료효과를 나타낸다고 개시되었다(Cancer Res. 2008;68:225-2265). 또한, 엠피레귤린에 대한 shRNA를 이용하여 염증성 유방암에서의 세포 침투를 억제할 수 있으며(J Cell Physiol. 2011 226(10):2691-2701), 엠피레귤린 특이적 shRNA를 이용하여 엠피레귤린 발현을 억제하면 담배연기에 노출된 쥐에서의 허파동맥 재형성(pulmonary artery remodeling)이 억제된다는 사실이 보고된 바 있다. 기도평활근(airway smooth muscle; ASM) 과증식(hyperplasia)과 혈관신생에 엠피레귤린이 관련이 있으며, 특히 천식환자의 기도 재형성(airway remodeling)을 촉진한다는 것과 급성 천식에 따른 조직 재형성에서 과다 분비되는 표피세포성장인자(EGF)와 엠피레귤린이 관여하는 것이 보고된 바 있다.
또한, 스트라티핀(14-3-3 sigma protein 또는 SFN)은 cell cycle, 세포사멸(apoptosis), 신호전달 기전 조절, 세포적 소통과정(cellular trafficking), 세포증식 및 분화, 세포 생존(cell survival)등의 다양한 세포내 기능에 관여한다는 사실이 알려져 있고(Mol Cell Biochem; 2007 305:255-64), 스트라티핀 특이적 siRNA를 이용하여 TGF-beta 1-매개 성장 저해에 관여한다고 개시되었다(Mol. Cell, 2010; .2; 305-309). 또한 천식에서의 기도 재형성 (Airway remodeling)은 콜라겐의 생성 및 분해를 조절하는 인자가 관여하고 있으며, 특히 MMP(metalloproteinase-1)이 콜라겐의 분해에 중요한 기능을 한다는 점 및 MMP-1의 기도에서의 발현을 조절하는 중요한 인자 중 하나가 스타라티핀이라는 점이 보고된 바 있다.
상기 살핀 바와 같이 엠피레귤린과 스트라티핀의 호흡기질환 및 섬유증, 특히 COPD 및 특발성폐섬유화증 치료제 타겟으로서의 가능성이 제시되어 있는 상황이지만, 아직까지 엠피레귤린과 스트라티핀에 대한 siRNA 치료제 및 이의 전달기술에 대한 기술개발은 미미한 상황으로, 특이적이며 고효율로 엠피래귤린과 스트라티핀의 발현을 저해할 수 있는 siRNA 치료제 및 이의 전달기술에 대한 시장의 수요는 매우 높은 상황이다.
본 발명의 목적은 특정 유전자에 특이적이면서 매우 높은 효율로 발현을 저해할 수 있는 신규한 이중나선 올리고 RNA, 바람직하게는 siRNA, 및 이를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 나노입자를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 siRNA, 이를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 나노입자를 유효성분으로 함유하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 330으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥(sense strand)과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥(anti-sense strand)을 포함하는 siRNA을 제공한다.
본 발명은 또한, 하기 구조식 1의 구조를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제공하며, 하기 구조식 1에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 siRNA를 의미한다:
[구조식 1]
Figure 112015033503767-pat00001
;
본 발명은 또한, 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 나노입자를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 siRNA, 이중나선 올리고 RNA 구조체 또는 나노입자를 포함하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에 따른 siRNA는 호흡기 질환 연관 유전자, 특히 엠피레귤린 또는 스트라티핀의 발현을 매우 효율적으로 저해할 수 있으므로, 본 발명에 따른 siRNA, 이를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 나노입자는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 나노입자의 모식도이다.
도 2는 실시예 4의 엠피레귤린 mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 서열번호 1 내지 30을 각각 센스 가닥으로 가지는 30종의 마우스 엠피레귤린 특이적 siRNA를 20nM의 농도로 처리한 경우, 마우스 섬유모세포 세포주를 형질전환시킨 후 확인된 엠피레귤린 mRNA의 상대적인 발현량(%)을 나타낸 그래프이다. NC는 마우스 엠피레귤린 특이적 siRNA가 처리되지 않은 세포주(대조군)에서 획득한 총 RNA에서의 엠피레귤린 mRNA 발현량으로서, 이를 기준으로(100%) 각 siRNA에 따른 엠피레귤린의 상대적인 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 6의 엠피레귤린 mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 서열번호 8, 9 또는 28을 각각 센스 가닥으로 가지는 siRNA를 농도를 달리하여(0.2, 1 및 5 nM) 처리한 경우, 마우스 섬유모세포 세포주를 형질전환시킨 후 확인된 엠피레귤린 mRNA의 상대적인 발현량(%)을 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 7의 엠피레귤린 mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 서열번호 31 내지 130을 각각 센스 가닥으로 가지는 100종의 인간 엠피레귤린 특이적 siRNA를 1nM 처리한 경우, 인간 폐 종양세포주를 형질전환시킨 후 확인된 엠피레귤린 mRNA의 상대적인 발현량(%)을 나타낸 그래프이다.
도 5는 실시예 7의 스트라티핀 mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 서열번호 231 내지 330을 각각 센스 가닥으로 가지는 100종의 인간 스트라티핀 특이적 siRNA를 1nM 처리한 경우, 인간 폐 종양세포주를 형질전환시킨 후 확인된 스트라티핀 mRNA의 상대적인 발현량(%)을 나타낸 그래프이다.
도 6은 실시예 8의 엠피레귤린 mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 서열번호 40, 42, 43, 45, 46, 52, 53, 58, 59, 61, 63, 65, 69, 75, 79, 80, 81, 91, 92, 94, 98, 102, 115, 117, 120 또는 128을 각각 센스 가닥으로 가지는 26종의 인간 엠피레귤린 특이적 siRNA를 0.2nM 처리한 경우, 형질전환된 세포주에서의 엠피레귤린 mRNA의 상대적인 발현량(%)을 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 8의 스트라티핀 mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 서열번호 231, 234, 238, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 257, 258, 260, 261, 262, 263, 267, 268, 270, 272, 273, 275, 278, 283, 284, 290, 297, 299, 300, 302, 303, 307, 311, 314, 320, 324, 326, 327 또는 328을 각각 센스 가닥으로 가지는 47종의 인간 스트라티핀 특이적 siRNA를 0.2nM 처리한 경우, 형질전환된 세포주에서의 스트라티핀 mRNA의 상대적인 발현량(%)을 나타낸 그래프이다.
도 8은 실시예 9의 엠피레귤린 mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 서열번호 79, 80 또는 91을 각각 센스 가닥으로 가지는 3종의 인간 엠피레귤린 특이적 SAMiRNA를 농도별(100, 200, 500 nM) 처리한 경우, 형질전환된 세포주에서의 엠피레귤린 mRNA의 상대적인 발현량(%)을 나타낸 그래프이다.
도 9는 실시예 9의 스트라티핀 mRNA 발현량의 정량분석 결과를 나타낸 것으로, 본 발명의 서열번호 248, 257, 268, 290 또는 327을 각각 센스 가닥으로 가지는 5 종의 인간 스트라티핀 특이적 SAMiRNA를 농도별 (50, 100, 200 nM) 처리한 경우, 형질전환된 세포주에서의 스트라티핀 mRNA의 상대적인 발현량(%)을 나타낸 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, 신규한 엠피레귤린(amphiregulin) 또는 스트라티핀(stratifin) 특이적 siRNA를 제조하였다. 그 결과, 상기 신규한 엠피레귤린 또는 스트라티핀 특이적 siRNA는 엠피레귤린 또는 스트라티핀을 암호화하는 mRNA와 상보적으로 결합할 수 있도록 설계된 염기서열이므로, 엠피레귤린 또는 스트라티핀의 발현을 효과적으로 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1 내지 330으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥(sense strand; 제1올리고뉴클레오티드)과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥(anti-sense strand; 제2올리고뉴클레오티드)을 포함하는 siRNA에 관한 것이다.
5'-ggaguaugauaaugaacca-3'(서열번호 1),
5'-caguaguagcugucacuau-3'(서열번호 2),
5'-agacucacagcgaggauga-3'(서열번호 3),
5'-cacaaauauccggcuauau-3'(서열번호 4),
5'-caccauaagcgaaaugccu-3'(서열번호 5),
5'-gauuacuuuggugaacggu-3'(서열번호 6),
5'-caguugucacuuuuuauga-3'(서열번호 7),
5'-ggaccuauccaagauugca-3'(서열번호 8),
5'-cguuaucacagugcaccuu-3'(서열번호 9),
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5'-ggaagagagguuuccacca-3'(서열번호 11),
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5'-cgguggacuugagcuuucu-3'(서열번호 13),
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5'-ggaggcuucgacaagaaaa-3'(서열번호 16),
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5'-ccggcuauauuauagauga-3'(서열번호 18),
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5'-caaauauccggcuauauua-3'(서열번호 21),
5'-gggacuacgacuacucaga-3'(서열번호 22),
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5'-acggtatgaagacatggca-3'(서열번호 167),
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5'-actactaccgctacctagc-3'(서열번호 218),
5'-ttttcagtcttccactacg-3'(서열번호 219),
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5'-cagctcctgagagacaacc-3'(서열번호 224),
5'-catcgattctgcccggtca-3'(서열번호 225),
5'-gagagacaacctgacgctg-3'(서열번호 226),
5'-gcgcatcatcgattctgcc-3'(서열번호 227),
5'-gaaggtagagaccgagctc-3'(서열번호 228),
5'-tcatcgattctgcccggtc-3'(서열번호 229),
5'-gaacggtatgaagacatgg-3'(서열번호 230),
5'-cgtaggaattgaggagtgt-3'(서열번호 231),
5'-cactacgagatcgccaaca-3'(서열번호 232),
5'-gctgtccagtattgagcag-3'(서열번호 233),
5'-gaccatgtttcctctcaat-3'(서열번호 234),
5'-cgagacaacctgacactgt-3'(서열번호 235),
5'-cgtcttccactacgagatc-3'(서열번호 236),
5'-cctgcgaagagcgaaacct-3'(서열번호 237),
5'-gctgcctctgatcgtagga-3'(서열번호 238),
5'-ccaagaccactttcgacga-3'(서열번호 239),
5'-gtctgctgggtgtgaccat-3'(서열번호 240),
5'-ctctgatcgtaggaattga-3'(서열번호 241),
5'-gctgggtgtgaccatgttt-3'(서열번호 242),
5'-tggccaagaccactttcga-3'(서열번호 243),
5'-cgacaagaagcgcatcatt-3'(서열번호 244),
5'-ctgccgagaggactagtat-3'(서열번호 245),
5'-gcctctgatcgtaggaatt-3'(서열번호 246),
5'-gcgctgttcttgctccaaa-3'(서열번호 247),
5'-ctgcctctgatcgtaggaa-3'(서열번호 248),
5'-gccctgaacttttccgtct-3'(서열번호 249),
5'-tgcctctgatcgtaggaat-3'(서열번호 250),
5'-tgaccatgtttcctctcaa-3'(서열번호 251),
5'-ccatgtttcctctcaataa-3'(서열번호 252),
5'-ggtgacgacaagaagcgca-3'(서열번호 253),
5'-acttttccgtcttccacta-3'(서열번호 254),
5'-tccgtcttccactacgaga-3'(서열번호 255),
5'-ctctcctgcgaagagcgaa-3'(서열번호 256),
5'-ccaggaccaggctacttct-3'(서열번호 257),
5'-cctgctgcctctgatcgta-3'(서열번호 258),
5'-ccgaacgctatgaggacat-3'(서열번호 259),
5'-ccctgaacttttccgtctt-3'(서열번호 260),
5'-ccgtcttccactacgagat-3'(서열번호 261),
5'-gagacaacctgacactgtg-3'(서열번호 262),
5'-gcatgtctgctgggtgtga-3'(서열번호 263),
5'-tggctgagaactggacagt-3'(서열번호 264),
5'-gccgaacgctatgaggaca-3'(서열번호 265),
5'-ctgtccagtattgagcaga-3'(서열번호 266),
5'-gtattgagcagaaaagcaa-3'(서열번호 267),
5'-cagctgttgagcgcaccta-3'(서열번호 268),
5'-gacaacctgacactgtgga-3'(서열번호 269),
5'-tggagagagccagtctgat-3'(서열번호 270),
5'-cgaacgctatgaggacatg-3'(서열번호 271),
5'-ggtgctgtccagtattgag-3'(서열번호 272),
5'-gaagcgcatcattgactca-3'(서열번호 273),
5'-tcgtaggaattgaggagtg-3'(서열번호 274),
5'-gctgcgagacaacctgaca-3'(서열번호 275),
5'-tgctgtccagtattgagca-3'(서열번호 276),
5'-ctgttcttgctccaaaggg-3'(서열번호 277),
5'-cctctgatcgtaggaattg-3'(서열번호 278),
5'-ccaccggtgacgacaagaa-3'(서열번호 279),
5'-gtcttccactacgagatcg-3'(서열번호 280),
5'-ctacctgaagatgaagggt-3'(서열번호 281),
5'-ctataagaacgtggtgggc-3'(서열번호 282),
5'-ctctggccaagaccacttt-3'(서열번호 283),
5'-cgctgttcttgctccaaag-3'(서열번호 284),
5'-ccactttcgacgaggccat-3'(서열번호 285),
5'-tgagaactggacagtggca-3'(서열번호 286),
5'-ctggccaagaccactttcg-3'(서열번호 287),
5'-ttgagcagaaaagcaacga-3'(서열번호 288),
5'-tgcgagacaacctgacact-3'(서열번호 289),
5'-agctgttgagcgcacctaa-3'(서열번호 290),
5'-gaacttttccgtcttccac-3'(서열번호 291),
5'-aaaagcaacgaggagggct-3'(서열번호 292),
5'-tctcctgcgaagagcgaaa-3'(서열번호 293),
5'-ctgttgagcgcacctaacc-3'(서열번호 294),
5'-cctgaacttttccgtcttc-3'(서열번호 295),
5'-gctgttcttgctccaaagg-3'(서열번호 296),
5'-aggccgaacgctatgagga-3'(서열번호 297),
5'-attgaggagtgtcccgcct-3'(서열번호 298),
5'-gtgaccatgtttcctctca-3'(서열번호 299),
5'-caagaccactttcgacgag-3'(서열번호 300),
5'-aacttttccgtcttccact-3'(서열번호 301),
5'-tgatcgtaggaattgagga-3'(서열번호 302),
5'-ggagagagccagtctgatc-3'(서열번호 303),
5'-agcaggccgaacgctatga-3'(서열번호 304),
5'-aggacatggcagccttcat-3'(서열번호 305),
5'-acgacaagaagcgcatcat-3'(서열번호 306),
5'-accatgtttcctctcaata-3'(서열번호 307),
5'-tgccgagaggactagtatg-3'(서열번호 308),
5'-tctgatcgtaggaattgag-3'(서열번호 309),
5'-tgggtgtgaccatgtttcc-3'(서열번호 310),
5'-tgaacttttccgtcttcca-3'(서열번호 311),
5'-gaattgaggagtgtcccgc-3'(서열번호 312),
5'-tttccgtcttccactacga-3'(서열번호 313),
5'-ctgctgcctctgatcgtag-3'(서열번호 314),
5'-ggccctgaacttttccgtc-3'(서열번호 315),
5'-gccaagaccactttcgacg-3'(서열번호 316),
5'-tctggccaagaccactttc-3'(서열번호 317),
5'-ctgaacttttccgtcttcc-3'(서열번호 318),
5'-aagcgcatcattgactcag-3'(서열번호 319),
5'-tgttgagcgcacctaacca-3'(서열번호 320),
5'-tacctgaagatgaagggtg-3'(서열번호 321),
5'-accactttcgacgaggcca-3'(서열번호 322),
5'-acgaggccatggctgatct-3'(서열번호 323),
5'-gatcccactcttcttgcag-3'(서열번호 324),
5'-cttttccgtcttccactac-3'(서열번호 325),
5'-gccgagaggactagtatgg-3'(서열번호 326),
5'-gctgttgagcgcacctaac-3'(서열번호 327),
5'-caggaccaggctacttctc-3'(서열번호 328),
5'-cctataagaacgtggtggg-3'(서열번호 329),
5'-ctgggtgtgaccatgtttc-3'(서열번호 330)
본 발명에서의 "siRNA"는 특정 유전자 (예를 들어, 호흡기 질환 연관 유전자), 바람직하게는 엠피레귤린(amphiregulin) 또는 스트라티핀(stratifin) 단백질을 인코딩하는 mRNA에 특이적인 siRNA를 의미한다. 또한, 엠피레귤린 또는 스트라티핀 등 호흡기 질환 연관 유전자에 대한 특이성이 유지되는 한, 상기 서열번호 1 내지 330에 따른 서열을 포함하는 센스 가닥 또는 이에 상보적인 안티센스 가닥에서 하나 이상의 염기가 치환, 결실 또는 삽입된 서열을 포함하는 siRNA도 본 발명의 권리범위에 속하는 것은 당업계의 통상의 기술자에게 있어서 자명한 것이다.
또한, 본 발명에 따른 siRNA는 엠피레귤린 또는 스트라티핀에 대한 특이성이 유지되는 한, siRNA의 센스 가닥이 엠피레귤린 또는 스트라티핀 유전자의 결합부위와 100% 상보적인 염기서열인 경우, 즉 완전 일치(perfect match)하는 것뿐만 아니라, 일부 염기서열이 일치하지 않는 경우, 즉 불완전 일치(mismatch)가 있는 것도 포함한다.
본 발명에 따른 siRNA는 하나 또는 양쪽 가닥의 3' 말단에 하나 또는 그 이상의 비결합된(unpaired) 뉴클레오티드를 포함하는 구조인 오버행(overhang)을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 바람직하게는 19 내지 31개의 뉴클레오티드로 이루어진 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 서열번호 1 내지 130으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA는 엠피레귤린(amphiregulin)에 특이적인 것을 특징으로 할 수 있다. 엠피레귤린 특이적 siRNA는 바람직하게는 서열번호 2, 6 내지 9, 11, 17 내지 21, 23, 24, 28, 29, 40, 42, 43, 45, 46, 52, 53, 58, 59, 61, 63, 65, 69, 75, 79, 80, 81, 91, 92, 94, 98, 102, 115, 117, 120 또는 128의 서열을 포함하는 센스 가닥과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는 서열번호 8, 9, 28, 59, 75, 79, 80, 91, 92 또는 102의 서열을 포함하는 센스 가닥과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 서열번호 131 내지 330으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스 가닥과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 siRNA는 스트라티핀(stratifin) 특이적인 것을 특징으로 할 수 있다. 스트라티핀 특이적 siRNA는 바람직하게는 서열번호 231, 234, 238, 241 내지 255, 257, 258, 260 내지 263, 267, 268, 270, 272, 273, 275, 278, 283, 284, 290, 297, 299, 300, 302, 303, 307, 311, 314, 320, 324, 326, 327 또는 328의 서열을 포함하는 센스 가닥과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는 서열번호 241, 248, 257, 258, 263, 268, 290 또는 327의 서열을 포함하는 센스 가닥과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 생체 내 안정성 향상을 위해, 핵산 분해효소 저항성 부여 및 비특이적 면역반응 감소를 위한, 다양한 화학적 변형(chemical modification)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 화학적 변형은 뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조의 2' 탄소 위치에서 수산화기(-OH)가 메틸기(-CH3), 메톡시기(-OCH3), 아민기(-NH2), 불소(-F), O-2-메톡시에틸기, O-프로필기, O-2-메틸티오에틸기, O-3-아미노프로필기, O-3-디메틸아미노프로필기, O-N-메틸아세트아미도기 및 O-디메틸아미도옥시에틸로 구성된 군에서 선택된 어느 하나로 치환되는 변형; 뉴클레오티드 내 당 구조의 산소가 황으로 치환되는 변형; 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합, 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합 및 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 결합이 되는 변형; 및 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 및 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형;으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나(Ann. Rev. Med. 55, 61-65 2004; US 5,660,985; US 5,958,691; US 6,531,584; US 5,808,023; US 6,326,358; US 6,175,001; Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:1139-1143, 2003; RNA, 9:1034-1048, 2003; Nucleic Acid Res. 31:589-595, 2003; Nucleic Acids Research, 38(17) 5761-773, 2010; Nucleic Acids Research, 39(5):1823-1832, 2011), 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥의 5' 말단에 하나 이상의 인산기(Phosphate group)가 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 3개의 인산기가 결합되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 다른 관점에서, 하기 구조식 1의 구조를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체에 관한 것으로, 하기 구조식 1에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 siRNA를 의미한다.
[구조식 1]
Figure 112015033503767-pat00002
본 발명에 따른 이중나선 올리고 RNA의 형태로는 siRNA(short interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 miRNA(microRNA) 등이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, miRNA에 대한 길항제(antagonist) 역할을 할 수 있는 단일가닥의 miRNA 저해제도　포함되는 것이다.
이하, 본 발명에 따른 이중나선 올리고 RNA는 siRNA를 중심으로 설명되나, 본 발명의 이중나선 올리고 RNA와 동일한 특성을 가지는 다른 이중나선 올리고 RNA에도 적용될 수 있다는 것은 당업계의 통상의 기술자에게 있어서 자명한 것이다.
본 발명에 있어서, 하기 구조식 2의 구조를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 하기 구조식 2에서, S 및 AS는 각각 구조식 1에 따른 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 의미하며, A, B, X 및 Y는 구조식 1에서의 정의와 동일하다.
[구조식 2]
Figure 112015033503767-pat00003
본 발명에 있어서, 하기 구조식 3의 구조를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 하기 구조식 3에서, A, B, X, Y, S 및 AS는 구조식 2에서의 정의와 동일하며, 5' 및 3'은 siRNA 센스 가닥의 5' 및 3' 말단을 의미한다.
[구조식 3]
Figure 112015033503767-pat00004
본 발명에 있어서, 이중나선 올리고 RNA 구조체는 본 발명에 따른 호흡기 질환 연관 유전자 특이적 siRNA를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 상기 구조식 1 내지 3에서 siRNA 대신 shRNA가 사용될 수 있으며, 이는 당업계의 통상의 기술자에게 있어서 자명한 것이다.
본 발명에 있어서, 친수성 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리옥사졸린일 수 있고, 친수성 물질의 분자량은 바람직하게는 200 내지 10,000인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 친수성 물질은 바람직하게는 양이온성 또는 비이온성 고분자 물질인 것을 특징으로 할 수 있다.
특히, 구조식 1 내지 구조식 3에서의 친수성 물질(A)은 하기 구조식 4와 같은 형태의 친수성 물질 블록(block) 형태로 이용될 수 있는데, 이러한 친수성 물질 블록을 필요에 따라 적절한 개수(구조식 4에서의 n)를 사용함으로써 일반 합성 고분자 물질 등을 사용하는 경우에 발생할 수 있는 다분산성으로 인한 문제점을 크게 개선할 수 있다.
[구조식 4]
Figure 112015033503767-pat00005
상기 구조식 4에서 A'는 친수성 물질 단량체(monomer)를, J는 m개의 친수성 물질 단량체 간 또는 m개의 친수성 물질 단량체와 siRNA를 서로 연결하는 링커, m은 1 내지 15의 정수, n은 1 내지 10의 정수를 의미하며, (A'm-J)로 표시되는 반복단위가 친수성 물질 블록의 기본단위에 해당된다.
상기 구조식 4에서 친수성 물질 단량체(A')는 비이온성 친수성 고분자의 단량체 중에서 본 발명의 목적에 부합하는 것이라면 제한없이 사용이 가능하며, 바람직하게는 표 1에 기재된 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에서 선택된 단량체, 더욱 바람직하게는 화합물(1)의 단량체가 사용될 수 있으며, 화합물 (1)에서 G는 바람직하게는 CH2, O, S 및 NH에서 선택될 수 있다.
특히, 친수성 물질 단량체 중에서도 특히 화합물 (1)로 표시되는 단량체는 다양한 기능기를 도입할 수 있으며, 생체 내 친화성이 좋고 면역반응을 적게 유도하는 등 생체 적합성(bio-compatibility)이 우수하며, 구조식 1 내지 구조식 3에 따른 구조체 내에 포함된 올리고뉴클레오타이드의 생체 내 안정성을 증가시키고, 전달 효율을 증가시킬 수 있다는 장점을 가지고 있어 본 발명에 따른 구조체의 제조에 매우 적합하다.
[표 1] 본 발명에서의 친수성 물질 단량체 구조
Figure 112015033503767-pat00006

구조식 1 내지 구조식 3에서의 친수성 물질은 총 분자량이 1,000 내지 2,000에 범위 내인 것이 바람직하다. 따라서, 예를 들어, 화합물 (1)에 따른 헥사에틸렌 글리콜(Hexaethylene glycol)이 사용되는 경우 헥사에틸렌글리콜 스페이서(spacer)의 분자량이 344이므로, 반복 횟수(n)는 3 내지 5인 것이 바람직하다.
특히, 본 발명은 필요에 따라 상기 구조식 4에서 (A'm-J)으로 표시되는 친수성 그룹의 반복단위, 즉 친수성 물질 블록(block)이 n으로 표시되는 적절한 개수로 사용될 수 있음을 특징으로 한다. 상기 각 친수성 물질 블록 내에 포함되는 친수성 물질 단량체인 A′와 J는 독립적으로 각 친수성 물질 블록간에 동일할 수도 있고, 상이할 수도 있다. 즉, 친수성 물질 블록이 3개 사용될 경우(n=3), 첫 번째 블록에는 화합물 (1)에 따른 친수성 물질 단량체가, 두 번째 블록에는 화합물 (2)에 따른 친수성 물질 단량체가, 세 번째 블록에는 화합물 (3)에 따른 친수성 물질 단량체가 사용되는 등, 모든 친수성 물질 블록별로 다른 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있고, 모든 친수성 물질 블록에 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에 따른 친수성 물질 단량체에서 선택된 어느 하나의 친수성 물질 단량체가 동일하게 사용될 수도 있다. 마찬가지로, 친수성 물질 단량체의 결합을 매개하는 링커 역시 각 친수성 물질 블록별로 모두 동일한 링커가 사용될 수도 있고, 각 친수성 물질 블록별로 상이한 링커가 사용될 수도 있다. 또한, 친수성 물질 단량체의 개수인 m 역시 각 친수성 물질 블록간에 동일할 수도 있고, 상이할 수도 있다. 즉, 첫 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 3개 연결(m=3)되고, 두 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 5개(m=5), 세 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 4개 연결(m=4)되는 등, 서로 다른 개수의 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있고, 모든 친수성 물질 블록에서 동일한 개수의 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있다.
또한, 본 발명에서 상기 링커(J)는 PO3 -, SO3 및 CO2로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 사용되는 친수성 물질의 단량체 등에 따라 본 발명의 목적에 부합하는 한 어떠한 링커라도 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
본 발명에 있어서, 소수성 물질은 스테로이드 유도체, 글리세라이드 유도체, 글리세롤 에테르, 폴리프로필렌 글리콜, C12 내지 C50의 불포화 또는 포화탄화수소, 디아실포스파티딜콜린(diacylphosphatidylcholine), 지방산, 인지질, 리포폴리아민(lipopolyamine), 지질(lipid), 토코페롤(tocopherol) 또는 토코트라이에놀(tocotrienol)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 스테로이드 유도체는 콜레스테롤, 콜리스탄올, 콜산, 콜리스테릴포르메이트, 코테스타닐포르메이트 또는 콜리스타닐아민인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 글리세라이드 유도체는 모노-글리세라이드, 디-글리세라이드 또는 트리-글리세라이드인 것을 특징으로 할 수 있고 상기 지질은 양이온성 지질(cationic lipid), 음이온성 지질(anionic lipid), 소수성 지질(hydrophobic lipid)인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 소수성 물질의 분자량은 바람직하게는 250 내지 1,000인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 소수성 물질은 친수성 물질의 반대쪽 말단(distal end)에 결합되며, siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 어느 위치에 결합되어도 무방하다.
본 발명에 있어서, 상기 X 및 Y로 표시되는 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 비분해성 결합은 아미드 결합 또는 인산화 결합인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 분해성 결합은 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 공유결합을 매개하는 링커는 친수성 물질 또는 소수성 물질과 엠피레귤린 또는 스트라티핀 특이적 siRNA 말단에 공유결합하며, 특정 환경에서 분해가 가능한 결합을 제공하는 한 특별히 한정되는 것은 아니다. 따라서, 친수성 물질 또는 소수성 물질과 엠피레귤린 또는 스트라티핀 특이적 siRNA를 활성화하기 위해 결합시키는 어떠한 화합물도 사용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 나노입자에 관한 것이다. 본 발명에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체의 경우, 소수성 물질의 소수성 상호작용에 의하여 자기조립 나노입자를 형성하게 되는데(대한민국 등록특허공보 제1224828호), 이러한 나노입자는 체내로의 전달효율 및 체내에서의 안정성이 극히 우수할 뿐만 아니라, 입자 크기의 균일성이 우수하여 QC(Quality Control)이 용이하므로 약물로서의 제조 공정이 간단하다.
보다 구체적으로, 엠피레귤린 또는 스트라티핀 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체는 소수성 및 친수성 물질을 모두 포함하고 있는 양친매성이며, 친수성 부분은 체내에 존재하는 물 분자들과 수소결합 등의 상호작용을 통해 친화력을 가지고 있어 바깥쪽으로 향하게 되고, 소수성 물질들은 그들 간의 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)을 통해 안쪽으로 향하게 되어 열역학적으로 안정한 나노입자를 형성하게 된다. 즉, 나노입자의 중심에 소수성 물질이 위치하게 되고, 엠피레귤린 또는 스트라티핀 특이적 siRNA의 바깥쪽 방향에 친수성 물질이 위치하여 엠피레귤린 또는 스트라티핀 특이적 siRNA를 보호하는 형태의 나노입자를 형성한다. 이렇게 형성된 나노입자는 엠피레귤린 또는 스트라티핀 특이적 siRNA의 세포 내 전달 향상 및 엠피레귤린 또는 스트라티핀 특이적 siRNA의 효능을 향상시킨다.
본 발명에 있어서, 나노입자는 동일한 서열을 가지는 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체만으로 형성될 수도 있고, 서로 다른 서열을 포함하는 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체가 혼합되어 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 본 발명에 따른 siRNA, 이중나선 올리고 RNA 구조체 또는 나노입자를 유효성분으로 함유하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물은 결합조직 재형성(tissue remodeling) 특히, 허파동맥 재형성(pulmonary artery remodeling) 및 기도 재형성(airway remodeling)을 억제하여 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료에 효과를 나타낸다.
본 발명에 있어서, 호흡기 질환은 만성폐쇄성질환(COPD), 천식, 급만성기관지염, 알레르기 비염, 진해 거담, 기관지염, 세기관지염, 인후염, 편도염 또는 후두염인 것을 특징으로 할 수 있고, 섬유증은 특발성 폐섬유화증(IPF), 간경변(cirrhosis), 골수섬유증(myelofibrosis), 심근섬유증(myocardial fibrosis), 신장 섬유증(renal fibrosis), 폐섬유증 (pulmonary fibrosis) 및 폐암 등에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에는 투여를 위하여 상기 기재된 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 특히, 동결건조(lyophilized)된 형태의 제형으로 제제화하여 제공하는 것이 바람직하다. 동결건조 제형 제조를 위해서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 방법이 사용될 수 있으며, 동결건조를 위한 안정화제가 추가될 수도 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍톤 약학 과학(Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질병에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
　본 발명의 조성물은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 특별히 호흡기 질환 치료를 위해 기관지내 점적주입을 통한 폐로의 투여 또한 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 또는 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 임상 투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 본 발명의 조성물을 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 본 발명에 따른 약학조성물을 포함하는 동결건조된 형태의 제형에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 고형지지체(solid support)를 기반으로 친수성 물질을 결합시키는 단계; (b) 상기 친수성 물질이 결합된 고형지지체를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계; (c) 상기 RNA 단일가닥 5' 말단에 소수성 물질을 공유결합시키는 단계; (d) 상기 RNA 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 합성하는 단계; (e) 합성이 완료된 후 고형지지체로부터 RNA-고분자 구조체 및 RNA 단일가닥을 분리 및 정제하는 단계; 및 (f) 제조된 RNA-고분자 구조체와 상보적인 서열의 RNA 단일가닥의 어닐링을 통해 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 단계를 포함하는 호흡기 질환 연관 유전자 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 고형지지체가 조절 공극 유리(controlled pore glass; CPG), 폴리스티렌, 실리카겔, 셀룰로오스 페이퍼인 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고형지지체가 CPG인 경우, 직경은 40~180 ㎛인 것이 바람직하며, 공극크기는 500~3000Å인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계가 (a) 단계 이전; 또는 (a) 내지 (c) 단계 및 (e) 단계 중 어느 하나의 단계에서 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계 이후, 정제된 RNA-고분자 구조체 및 RNA 단일가닥은 MALDI-TOF 질량분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 RNA-고분자 구조체 및 RNA 단일가닥이 제조되었는지를 확인할 수 있다. 또한, 상기 (b) 단계에서 합성된 RNA 단일가닥과 상보적인 서열을 포함하는 RNA 단일가닥은 5' 말단에 인산기가 결합된 형태로 이용된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 본 발명에 따른 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 호흡기 질환은 만성폐쇄성질환(COPD), 천식, 급만성기관지염, 알레르기 비염, 진해 거담, 기관지염, 세기관지염, 인후염, 편도염 또는 후두염인 것을 특징으로 할 수 있고, 섬유증은 특발성 폐섬유화증(IPF), 간경변(cirrhosis), 골수섬유증(myelofibrosis), 심근섬유증(myocardial fibrosis), 신장섬유증(renal fibrosis), 폐섬유증(pulmonary fibrosis)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
실시예 1: 목표 염기서열의 디자인 및 siRNA의 제조
엠피레귤린(Homo sapiens) 유전자의 mRNA 서열(NM_001657.2), 스트라티핀(Homo sapiens) 유전자의 mRNA 서열(NM_006142.2), 엠피레귤린(Mus musculus) 유전자의 mRNA 서열(NM_009704.2), 스트라티핀(Mus musculus) 유전자의 mRNA 서열(NM_018754.2)에 결합할 수 있는 목표 염기서열(센스가닥)을 디자인하고, 상기 목표 염기서열의 상보적 서열인 안티센스 가닥의 siRNA를 제조하였다.
우선, (주)바이오니아에서 개발된 유전자 디자인 프로그램(Turbo si-Designer)을 사용하여, 해당 유전자들의 mRNA 서열에서 siRNA가 결합할 수 있는 목표 염기서열을 디자인하였다. 본 발명의 엠피레귤린 및 스트라티핀 siRNA는 19개의 뉴클레오티드로 구성된 센스 가닥과 이에 상보적인 안티센스 가닥으로 구성된 이중가닥 구조이다. 또한 어떠한 유전자의 발현을 저해하지 않는 서열의 siRNA인 siCONT(CUUACGCUGAGUACUUCGA; 서열번호 331을 센스가닥으로 가짐)을 제조하였다. 상기 siRNA는 β-시아노에틸 포스포라미다이트(β-cyanoethyl phosphoramidite)를 이용하여 RNA 골격 구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결하여 제조하였다 (Nucleic Acids Research,12:4539-4557, 1984). 구체적으로, RNA 합성기(384 Synthesizer, BIONEER, 한국)를 사용하여, 뉴클레오티드가 부착된 고형 지지체 상에서, 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 산화(oxidation) 및 캐핑(capping)으로 이루어지는 일련의 과정을 반복하여 원하는 길이의 RNA를 포함하는 반응물을 수득하였다. 상기 반응물을 Daiso gel C18(Daiso, Japan) 칼럼이 장착된 HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan)로 RNA를 분리 및 정제하고 이를 MALDI-TOF 질량 분석기(Shimadzu, Japan)를 이용하여 목표 염기서열과 부합하는지 확인하였다. 이후, 센스와 안티센스 RNA가닥을 결합시켜 목적하는 서열번호 1 내지 서열번호 331에서 선택된 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 가지는 siRNA를 제조하였다.
실시예 2: 이중나선 올리고 RNA 구조체 (SAMiRNA LP)의 제조
본 발명에서 제조한 이중나선 올리고 RNA 구조체(SAMiRNA LP)는 하기 구조식 5와 같은 구조를 갖는다.
[구조식 5]
Figure 112015033503767-pat00007
상기 구조식 5에서, S는 siRNA의 센스가닥; AS는 siRNA의 안티센스 가닥; PEG는 친수성 물질로 폴리에텔렌 글리콜(polyethylene glycol); C24는 소수성 물질로 이황화결합(disulfide) 이 포함된 테트라도코산(tetradocosane); 5' 및 3'은 이중나선 올리고 RNA 말단의 방향성을 의미한다.
상기 구조식 5에서의 siRNA의 센스가닥은 기존 특허(대한민국 공개특허공보 제2012-0119212호)의 실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조된 3' 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG, Mn=2,000)-CPG를 지지체로 하여 앞서 언급한 방식대로 β-시아노에틸포스포아미다이트를 이용하여 RNA 골격구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해가는 방법을 통해 3'말단부위에 폴리에틸렌 글리콜이 결합된 센스가닥의 이중나선 올리고 RNA-친수성 물질 구조체를 합성한 뒤, 이황화 결합이 포함되어있는 테트라도코산을 5' 말단에 결합하여 원하는 RNA-고분자 구조체의 센스가닥을 제조하였다. 상기 가닥과 어닐링을 수행할 안티센스 가닥의 경우, 앞서 언급한 반응을 통해 센스가닥과 상보적인 서열의 안티센스 가닥을 제조하였다.
합성이 완료되면 60℃의 온탕기(water bath)에서 28%(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 합성된 RNA 단일가닥과 RNA 고분자 구조체를 CPG로부터 떼어낸 뒤, 탈보호(deprotection) 반응을 통해 보호잔기를 제거하였다. 보호잔기가 제거된 RNA 단일가닥 및 RNA-고분자 구조체는 70℃의 오븐에서 엔-메틸피롤리돈(N-methylpyrrolidon), 트리에틸아민(triethylamine) 및 트리에틸아민트리하이드로플로라이드 (triethylaminetrihydrofluoride)를 부피비 10:3:4의 비율로 처리하여 2'TBDMS(tert-butuldimethylsilyl)를 제거하였다.
상기 반응물을 Daisogel C18(Daiso, Japan) 칼럼이 장착된 HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan)로 RNA를 분리 및 정제하고 이를 MALDI-TOF 질량 분석기(Shimadzu, Japan)를 이용하여 목표 염기서열과 부합하는지 확인하였다. 이후, 각각의 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하기 위하여 센스가닥과 안티센스가닥을 동량 혼합하여 1X 어닐링 버퍼(30 mM HEPES, 100 mM 칼륨 아세테이트(Potassium acetate), 2 mM 마그네슘 아세테이트(Magnesium acetate), pH 7.0~7.5)에 넣고, 90 ℃ 항온수조에서 3분 반응시킨 후 다시 37℃에서 반응시켜, 서열번호 6, 9, 28, 59, 75, 79, 80, 91, 92, 102, 241, 248, 257, 258, 263, 268, 290　또는 327의 서열을 센스가닥으로 가지는 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체(이하, 각각 SAMiRNALP-mAR, SAMiRNALP-hAR, SAMiRNALP-hSFN 및 SAMiRNALP-CONT라 함)를 각각 제조하였다. 제조된 이중나선 올리고 RNA 구조체는 전기영동을 통하여 어닐링 되었음을 확인하였다.
실시예 3: 이중나선 올리고 RNA 구조체(SAMiRNA LP)로 이루어진 나노입자(SAMiRNA)의 제조 및 크기 측정
실시예 2에서 제조된 이중나선 올리고 RNA 구조체(SAMiRNA LP)는 이중나선 올리고 RNA의 말단에 결합된 소수성 물질 간의 소수성 상호작용에 의하여 나노입자, 즉 미셀(micelle)을 형성하게 된다(도 1).
SAMiRNALP-hAR, SAMiRNALP-hSFN, SAMiRNALP-mAR, SAMiRNALP-mSFN, SAMiRNALP-CONT로 이루어진 나노입자 크기 PDI(polydispersity index) 분석을 통해 해당 SAMiRNA LP로 구성된 나노입자(SAMiRNA)의 형성을 확인하였다.
3-1 : 나노입자의 제조
상기 SAMiRNALP-hAR를 1.5 ㎖ DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)에 50 ㎍/㎖ 의 농도로 녹인 뒤, -75℃, 5mTorr 조건에서 48시간 동안 동결건조를 통해 나노입자 파우더를 제조한 뒤, 용매인 DPBS에 녹여 균질화된 나노입자를 제조하였다.
SAMiRNALP-hSFN, SAMiRNALP-mAR, SAMiRNALP-mSFN, SAMiRNALP-CONT로 이루어진 나노입자도 동일한 방법으로 제조하였다.
3-2 : 나노입자의 크기 및 다분산지수(polydispersity index, PDI) 측정
제타-전위 측정기(zeta-potential measurement)를 통하여 상기 나노입자의 크기를 측정하였다. 실시예 3-1에서 제조된 균질화된 나노입자는 제타-전위 측정기(Nano-ZS, MALVERN, 영국)로 크기를 측정하였는데, 물질에 대한 굴절률(Refractive index)은 1.459, 흡수율(Absorption index)은 0.001로 하고, 용매인 DPBS의 온도 25 ℃ 및 그에 따른 점도(viscosity)는 1.0200 및 굴절률은 1.335의 값을 입력하여 측정하였다. 1회 측정은 15 번 반복으로 구성된 크기 측정으로 이루어졌고, 이를 6 회 반복하였다.
PDI 값이 낮을수록 해당 입자가 고르게 분포하고 있음을 나타내는 수치로, 본 발명의 나노입자는 매우 균일한 크기로 형성됨을 알 수 있었다.
실시예 4: 마우스 섬유모세포(NIH3T3) 세포주에서 마우스에 대한 타겟유전자 특이적 siRNA를 이용한 엠피레귤린의 발현억제
실시예 1에서 제조된 서열번호 1 내지 서열번호 30을 각각 센스가닥으로 가지는 엠피레귤린 특이적 siRNA를 이용하여 섬유아세포주인 마우스 섬유모세포(NIH3T3)를 형질전환시키고, 상기 형질전환된 섬유모세포(NIH3T3) 세포주에서 엠피레귤린의 발현양상, 즉 상기 siRNA에 의한 발현 억제 정도를 분석하였다.
4-1 : 섬유모세포 세포주의 배양
미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 마우스 섬유모세포 세포주(NIH3T3)를 RPMI-1640 배양배지(GIBCO/Invitrogen, USA, 10%(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100 units/㎖ 및 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖)에서 37 ℃, 5%(v/v) CO2의 조건 하에 배양하였다.
4-2 : 마우스 섬유모세포 세포주에서 목표 siRNA의 형질주입(transfection)
실시예 4-1에서 배양된 1X105 섬유모세포 세포주를 37℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 12-웰 플레이트에서 18시간 동안 RPMI 1640에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰당 500㎕의 Opti-MEM 배지(GIBCO, 미국)를 분주하였다.
한편, 리포펙타민 RNAi 맥스(LipofectamineTM RNAi Max, Invitrogen, USA) 1.5㎕와 Opti-MEM 배지 248.5㎕를 혼합하여 혼합액을 제조하였고, 실온에서 5분간 반응시킨 다음, 상기 실시예 1에서 제조한 각각의 서열번호 1 내지 30 중 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 가지는 siRNA(1pmole/㎕) 20㎕를 Opti-MEM 배지 230㎕에 첨가하여 최종 농도가 20 nM인 siRNA 용액을 제조하였다. 상기 리포펙타민 RNAi 맥스(LipofectamineTM RNAi Max) 혼합액과 siRNA 용액을 혼합하여 실온에서 20분간 반응시켜 형질주입용 용액을 제조하였다.
　그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰에 형질주입용 용액을 각각 500㎕씩 분주하고 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하였다. 여기에 RPMI 1640 배양배지 1㎖씩 분주한 다음 24시간 동안 37℃에서 5%(v/v) CO2의 조건 하에서 배양하였다.
4-3 : 엠피레귤린 mRNA의 정량분석
실시예 4-2에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 엠피레귤린 유전자의 mRNA 발현량을 상대정량 하였다.
4-3-1 : 형질주입된 세포로부터 RNA 분리 및 cDNA 제조
RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, 한국)를 이용하여, 상기 실시예 4-2에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower CycleScript RT Premix/dT20, Bioneer, 한국)를 이용하여, 하기와 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다. 구체적으로, 0.25㎖ 에펜도르프 튜브에 담겨있는 AccuPower CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer, 한국)에 한 튜브 당 추출된 1㎍씩의 RNA를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 첨가하였다. 이를 유전자 증폭기(MyGenieTM 96 Gradient Thermal Block, BIONEER, 한국)로 30℃에서 1분 동안 RNA와 프라이머를 혼성화하고, 52℃에서 4분간 cDNA를 제조하는 두 과정을 6번 반복한 뒤, 95℃에서 5분 동안 효소를 불활성화시켜 증폭 반응을 종료하였다.
4-3-2 : 엠피레귤린 mRNA의 상대정량 분석
실시예 4-3-1에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 통해 엠피레귤린 mRNA의 상대적인 양을 하기와 같은 방법으로 정량하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 상기 실시예 4-3-1에서 제조된 cDNA를 증류수로 5배 희석하고, 엠피레귤린 mRNA 발현량 분석을 위해서 희석된 cDNA 3㎕와 2XGreenStarTM PCR master mix(BIONEER, 한국)를 10㎕, 증류수 6㎕, 엠피레귤린 qPCR 프라이머(서열번호 336 및 337 (표 2); 10pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)을 1㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, 엠피레귤린mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스키핑 유전자(housekeeping gene, 이하 HK 유전자)인 RPL13A(60S Ribosomal Protein L13a)를 표준 유전자로 하였다. 상기 혼합액이 담긴 96-웰 플레이트를 ExicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER, 한국) 을 이용하여 하기와 같은 반응을 수행하였다: 95℃에서 15분간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94 ℃에서 30초 변성(denaturing), 58℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42 회 반복 수행하고, 72℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55℃에서 1분간 온도를 유지하고, 55℃에서 95℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다.
PCR이 종료된 후, 각각 수득한 타겟유전자의 Ct(threshold cycle)값은 RPL13A 유전자를 통해 보정된 타겟유전자의 Ct 값을 구한 뒤, 유전자 발현저해를 일으키지 않는 컨트롤 서열인 siRNA(siCONT)가 처리된 실험군을 대조군으로 하여 △Ct값의 차이를 구했다. 상기 △Ct 값과 계산식 2(-△Ct)ㅧ 100을 이용하여 엠피레귤린 특이적 siRNA (서열번호 1 내지 서열번호 30을 센스가닥으로 가짐)가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였다(도 2).
고효율의 siRNA를 선별하기 위하여 최종 농도 20nM의 농도에서 엠피레귤린 mRNA 발현양이 대조군과 대비하여 70% 이상의 발현양의 감소를 보이며, 서열번호 2, 6 내지 9, 11, 17 내지 21, 23, 24, 28 및 29를 각각 센스가닥으로 가지는 siRNA 15종을 선별하였다.
[표 2] qPCR용 프라이머 서열 정보
Figure 112015033503767-pat00008
(m은 마우스, h는 인간 특이적인 서열임; AR은 엠피레귤린, SFN은 스트라티핀 특이적인 서열임; F는 정방향(forward) 프라이머, R은 역방향(reverse) 프라이머를 각각 의미함)
실시예 5: 섬유모세포(NIH3T3) 세포주에서 선별된 siRNA를 이용한 앰피레귤린의 발현억제
실시예 4에서 선별된 서열번호 2, 6 내지 9, 11, 17 내지 21, 23, 24, 28 및 29를 각각 센스가닥으로 가지는 siRNA를 이용하여 섬유아 세포주인 마우스 섬유모세포(NIH3T3)를 형질전환시키고, 상기 형질전환된 섬유모세포(NIH3T3) 세포주에서 엠피레귤린 mRNA의 발현양상을 분석하였다.
5-1 : 섬유모세포 세포주의 배양
미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 마우스 섬유모세포 세포주(NIH3T3)를 RPMI-1640 배양배지(GIBCO/Invitrogen, USA, 10%(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100 units/㎖ 및 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖)에서 37 ℃, 5%(v/v) CO2의 조건 하에 배양하였다.
5-2 : 섬유모세포 세포주에서 목표 siRNA의 형질주입
실시예 5-1에서 배양된 1X105 섬유모세포 세포주를 37℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 12-웰 플레이트에서 18시간 동안 RPMI 1640에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰당 500㎕의 Opti-MEM 배지(GIBCO, 미국)를 분주하였다.
한편, 리포펙타민 RNAi 맥스(LipofectamineTM RNAi Max, Invitrogen, 미국) 2㎕와 Opti-MEM 배지 248㎕를 혼합하여 혼합액을 제조하였고, 실온에서 5분간 반응시킨 다음, 상기 실시예 4에서 선별된 서열번호 2, 6 내지 9, 11, 17 내지 21, 23, 24, 28 및 29를 각각 센스가닥으로 가지는 siRNA(1pmole/㎕) 5㎕를 Opti-MEM 배지 245㎕에 첨가하여 최종 농도가 5 nM인 siRNA 용액을 제조하였다. 상기 리포펙타민 RNAi 맥스(LipofectamineTM RNAi Max) 혼합액과 siRNA 용액을 혼합하여 실온에서 20분간 반응시켜 형질주입용 용액을 제조하였다.
　그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰에 형질주입용 용액을 각각 500㎕씩 분주하고 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하였다. 여기에 RPMI 1640 배양배지 1㎖씩 분주한 다음 24시간 동안 37℃에서 5%(v/v) CO2의 조건 하에서 배양하였다.
5-3 : 엠피레귤린 mRNA의 정량분석
실시예 5-2에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 엠피레귤린 유전자의 mRNA 발현을 상대정량하였다.
5-3-1 : 형질주입된 세포로부터 RNA 분리 및 cDNA 제조
RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, 한국)를 이용하여, 상기 실시예 5-2에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower CycleScript RT Premix/dT20, Bioneer, 한국)를 이용하여, 하기와 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다. 구체적으로, 0.25㎖ 에펜도르프 튜브에 담겨있는 AccuPower CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer, 한국)에 한 튜브 당 추출된 1㎍씩의 RNA를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 첨가하였다. 이를 유전자 증폭기(MyGenieTM 96 Gradient Thermal Block, BIONEER, 한국)로 30℃에서 1 분 동안 RNA와 프라이머를 혼성화하고, 52℃에서 4분간 cDNA를 제조하는 두 과정을 6번 반복한 뒤, 95℃에서 5분 동안 효소를 불활성화시켜 증폭 반응을 종료하였다.
5-3-2 : 엠피레귤린 mRNA의 상대정량 분석
실시예 5-3-1에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 통해 엠피레귤린앰피레귤린 mRNA의 상대적인 양을 하기와 같은 방법으로 정량하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 실시예 5-3-1에서 제조된 cDNA를 증류수로 5배 희석하고, 엠피레귤린 mRNA 발현량 분석을 위해서 희석된 cDNA 3㎕와 2XGreenStarTM PCR master mix(BIONEER, 한국)를 10㎕, 증류수 6㎕, 엠피레귤린 qPCR 프라이머(서열번호 336 및 337 (표 2); 10pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)을 1㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, 엠피레귤린 mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스키핑 유전자인 RPL13A를 표준 유전자로 하였다. 상기 혼합액이 담긴 96-웰 플레이트를 ExicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER, 한국) 을 이용하여 하기와 같은 반응을 수행하였다: 95℃에서 15분간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94 ℃에서 30초 변성(denaturing), 58℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42 회 반복 수행하고, 72℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55℃에서 1분간 온도를 유지하고, 55℃에서 95℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다. PCR이 종료된 후, 각각 수득한 타겟유전자의 Ct(threshold cycle)값은 RPL13A 유전자를 통해 보정된 타겟유전자의 Ct 값을 구한 뒤, 유전자 발현저해를 일으키지 않는 컨트롤 서열의 siRNA(siCONT)가 처리된 실험군을 대조군으로 하여 △Ct값의 차이를 구했다. 상기 △Ct 값과 계산식 2(-△Ct)X100을 이용하여 엠피레귤린 특이적 siRNA가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량하여 서열번호 2, 6 내지 9, 11, 17 내지 21, 23, 24, 28 및 29를 각각 센스가닥으로 가지는 엠피레귤린 특이적 siRNA에 의한 mRNA의 발현량 변화를 상대정량 하였다.
고효율의 siRNA를 선별하기 위하여 siRNA를 처리한 후 타겟 유전자의 발현이 50% 억제되는 값인 IC50를 확인하기 위하여 최종 농도 5nM의 농도에서 엠피레귤린mRNA 발현양이 대조군과 대비하여 가장 큰 발현양의 감소를 보이는 서열번호 8, 9 및 28을 각각 센스가닥으로 가지는 siRNA 3종을 선별하였다.
실시예 6: 섬유모세포(NIH3T3) 세포주에서 선별된 siRNA를 이용한 엠피레규린의 발현억제
실시예 5에서 선별된 서열번호 8, 9 및 28을 각각 센스가닥으로 가지는 siRNA를 이용하여 섬유아 세포주인 마우스 섬유모세포(NIH3T3)를 형질전환 시키고, 상기 형질전환된 섬유모세포(NIH3T3) 세포주에서 엠피레귤린앰피레귤린 mRNA의 발현양상을 분석하여 siRNA의 IC50값을 확인하였다.
6-1 : 섬유모세포 세포주의 배양
미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 마우스 섬유모세포 세포주(NIH3T3)를 RPMI-1640 배양배지(GIBCO/Invitrogen, USA, 10%(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100 units/㎖ 및 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖)에서 37 ℃, 5%(v/v) CO2의 조건 하에 배양하였다.
6-2 : 섬유모세포 세포주에서 목표 siRNA의 형질주입
실시예 6-1에서 배양된 1X105 섬유모세포 세포주를 37℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건 하에 12-웰 플레이트에서 18시간 동안 RPMI 1640에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰당 500㎕의 Opti-MEM 배지(GIBCO, 미국)를 분주하였다.
한편, 리포펙타민 RNAi 맥스(LipofectamineTM RNAi Max, Invitrogen, 미국) 2㎕와 Opti-MEM 배지 248㎕를 혼합하여 혼합액을 제조하였고, 실온에서 5분간 반응시킨 다음, 실시예 5에서 선별된 서열번호 8, 9 및 28을 각각 센스가닥으로 가지는 siRNA (1pmole/㎕) 0.2, 1, 5 ㎕를 Opti-MEM 배지 249.8, 249, 245 ㎕에 첨가하여 최종 농도가 0.2, 1, 5nM인 siRNA 용액을 제조하였다. 상기 리포펙타민 RNAi 맥스(LipofectamineTM RNAi Max) 혼합액과 siRNA 용액을 혼합하여 실온에서 20분간 반응시켜 형질주입용 용액을 제조하였다.
그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰에 형질주입용 용액을 각각 500㎕ 씩 분주하고 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하였다. 여기에 RPMI 1640 배양배지 1㎖씩 분주한 다음 24시간 동안 37℃에서 5%(v/v) CO2의 조건 하에서 배양하였다.
6-3 : 엠피레귤린 mRNA의 정량분석
실시예 6-2에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 엠피레귤린 유전자의 mRNA 발현량을 상대정량하였다.
6-3-1 : 형질주입된 세포로부터 RNA 분리 및 cDNA 제조
RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, 한국)를 이용하여, 실시예 6-2에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower CycleScript RT Premix/dT20, Bioneer, 한국)를 이용하여, 하기와 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다. 구체적으로, 0.25㎖ 에펜도르프 튜브에 담겨있는 AccuPower CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer, 한국)에 한 튜브 당 추출된 1㎍씩의 RNA를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 첨가하였다. 이를 유전자 증폭기(MyGenieTM 96 Gradient Thermal Block, BIONEER, 한국)로 30℃에서 1 분 동안 RNA와 프라이머를 혼성화하고, 52℃에서 4분간 cDNA를 제조하는 두 과정을 6번 반복한 뒤, 95℃에서 5분 동안 효소를 불활성화시켜 증폭 반응을 종료하였다.
6-3-2 : 엠피레귤린 mRNA의 상대정량 분석
실시예 6-3-1에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 통해 엠피레귤린 mRNA의 상대적인 양을 하기와 같은 방법으로 정량하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 실시예 6-3-1에서 제조된 cDNA를 증류수로 5배 희석하고, 엠피레귤린 mRNA 발현량 분석을 위해서 희석된 cDNA 3㎕와 2XGreenStarTM PCR master mix(BIONEER, 한국)를 10㎕, 증류수 6㎕, 엠피레귤린 qPCR 프라이머(서열번호 336 및 337 (표 2); 10pmole/㎕ 각각, BIONEER, 한국)을 1㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, 엠피레귤린mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스키핑 유전자인 RPL13A를 표준 유전자로 하였다. 상기 혼합액이 담긴 96-웰 플레이트를 ExicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER, 한국) 을 이용하여 하기와 같은 반응을 수행하였다: 95℃에서 15분간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94 ℃에서 30초 변성(denaturing), 58℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42 회 반복 수행하고, 72℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55℃에서 1분간 온도를 유지하고, 55℃에서 95℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다. PCR이 종료된 후, 각각 수득한 타겟유전자의 Ct(threshold cycle)값은 RPL13A 유전자를 통해 보정된 타겟유전자의 Ct 값을 구한 뒤, 유전자 발현저해를 일으키지 않는 컨트롤 서열의 siRNA(siCONT)가 처리된 실험군을 대조군으로 하여 △Ct값의 차이를 구했다. 상기 △Ct 값과 계산식 2(-△Ct)X100을 이용하여 엠피레귤린 특이적 siRNA가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량하였다(도 3).
그 결과, 서열번호 8, 9 및 28을 각각 센스가닥으로 가지는 엠피레귤린 특이적 siRNA 모두 0.2nM의 저농도에서도 50% 이상의 엠피레귤린 mRNA 발현양의 감소를 보여 매우 고효율로 엠피레귤린 발현을 저해하는 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 7: 목표 염기서열의 디자인 및 siRNA의 제조
실시예 1에서 제조된 서열번호 31번 내지 130번 및 231번 내지 330번의 서열을 센스가닥으로 가지는 siRNA를 이용하여 폐종양 세포주인 인간 폐암세포주(A549)를 형질전환 시키고, 상기 형질전환된 폐암세포(A549) 세포주에서 목표 유전자의 발현양상을 분석하였다.
7-1 : 인간 폐암세포 세포주의 배양
미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 폐암세포(A549) 세포주는 DMEM 배양배지(GIBCO/Invitrogen, USA, 10%(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100 units/㎖ 및 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖)에서 37℃, 5%(v/v) CO2의 조건 하에 배양하였다.
7-2 : 인간 폐암세포 세포주로의 목표 siRNA의 형질주입
실시예 7-1에서 배양된 1.2X105 페암세포(A549) 세포주를 37℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 6-well 플레이트에서 18시간 동안 DMEM에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰(well)당 500㎕의 Opti-MEM 배지(GIBCO, USA)를 분주하였다.
한편, 리포펙타민 RNAi 맥스(LipofectamineTM RNAi Max, Invitrogen, USA) 3.5㎕와 Opti-MEM 배지 246.5㎕를 혼합하여 혼합액을 제조하였고, 실온에서 5분간 반응시킨 다음, 실시예 1에서 제조한 각각의 서열번호 31 내지 130 및 231 내지 330번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA (1pmole/㎕) 1 ㎕를 Opti-MEM 배지 230㎕에 첨가하여 최종 농도가 1 nM인 siRNA 용액을 제조하였다. 상기 리포펙타민 RNAi 맥스 혼합액과 siRNA 용액을 혼합하여 실온에서 15 분간 반응시켜 형질주입용 용액을 제조하였다.
그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰(well)에 형질주입용 용액을 각각 500㎕씩 분주하고 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하였다. 여기에 RPMI 1640 배양배지 1㎖씩 분주한 다음 24시간 동안 37℃에서 5%(v/v) CO2의 조건 하에서 배양하였다.
7-3 : 타겟 유전자 mRNA의 정량분석
실시예 7-2에서 형질주입된 세포주로부터 실시예 4-3과 동일한 방법으로 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 타겟 유전자의 mRNA 발현량을 상대정량 하였다.
7-4 : 형질주입된 세포로부터 RNA 분리 및 cDNA 제조
RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, Korea)를 이용하여, 실시예 7-2에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower CycleScript RT Premix/dT20, Bioneer, Korea)를 이용하여, 하기와 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다. 구체적으로, 0.25㎖ 에펜도르프 튜브에 담겨있는 AccuPower CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer, Korea)에 한 튜브 당 추출된 1 ㎍씩의 RNA를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 첨가하였다. 이를 유전자 증폭기(MyGenieTM 96 Gradient Thermal Block, BIONEER, Korea)로 30℃에서 1분 동안 RNA와 프라이머를 혼성화하고, 52℃에서 4분간 cDNA를 제조하는 두 과정을 6번 반복한 뒤, 90℃에서 5분 동안 효소를 불활성화시켜 증폭 반응을 종료하였다.
7-5 : 타겟 유전자 mRNA의 상대정량 분석
실시예 7-4에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 통해 호흡기 질환 연관 유전자 mRNA의 상대적인 양을 하기와 같은 방법으로 정량하였다. 96-well 플레이트의 각 well에 실시예 7-4에서 제조된 cDNA를 증류수로 5배 희석하고, 타겟유전자 mRNA 발현량 분석을 위해서 희석된 cDNA 3㎕와 2XGreenStarTM PCR master mix(BIONEER, Korea)를 25㎕, 증류수 19㎕, qPCR 프라이머(엠피레귤린 유전자, 서열번호 338 및 339; 스트라티핀 유전자, 서열번호 342 및 343; 표 2; F, R 각각 10pmole/㎕; BIONEER, Korea)을 3㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, 타겟유전자 mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스키핑 유전자(housekeeping gene, 이하 HK 유전자)인 RPL13A를 표준 유전자로 하였다. 상기 혼합액이 담긴 96-well 플레이트를 ExicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER, Korea) 을 이용하여 하기와 같은 반응을 수행하였다: 95℃에서 15분간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94 ℃에서 30초 변성(denaturing), 58℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42 회 반복 수행하고, 72℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55℃에서 1분간 온도를 유지하고, 55℃에서 95℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다. PCR이 종료된 후, 각각 수득한 타겟유전자의 Ct(threshold cycle) 값은 RPL13A 유전자를 통해 보정된 타겟유전자의 Ct 값을 구한 뒤, 유전자 발현저해를 일으키지 않는 컨트롤 서열의 siRNA(siCONT)가 처리된 실험군을 대조군으로 하여 △Ct값의 차이를 구했다.
상기 △Ct 값과 계산식 2(-△Ct)X100을 이용하여 엠피레귤린(Homo sapiens) 특이적 siRNA (서열번호 31번 내지 130번의 서열을 센스가닥으로 가짐)가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량하였다(도 4).
또한, 스트라티핀(Homo sapiens) 특이적 siRNA (서열번호 231번 내지 330번의 서열을 센스가닥으로 가짐)가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였다(도 5).
그 결과, 본 발명의 1 nM의 농도에서 50%이상의 발현 저해를 나타내는 인간 엠피레귤린 26종 및 인간 스트라티핀 47종의 siRNA는 높은 목표유전자 발현 저해를 나타냄을 확인할 수 있었다 (도 6 및 도 7 참조).
실시예 8: 인간 폐암세포(A549) 세포주에서 고효율의 인간에 대한 엠피레귤린 및 스트라티핀 특이적 siRNA 선별
실시예 7-5에서 선정된 인간 엠피레귤린 26종 및 인간 스트라티핀 47종의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA를 이용하여 인간 폐암세포(A549)를 형질전환시키고, 상기 형질전환된 폐암세포(A549) 세포주에서 타겟 유전자의 발현 양상을 분석하여 고효율의 siRNA를 선별하였다.
8-1 : 인간 폐암세포 세포주의 배양
미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 폐암세포(A549) 세포주는 실시예 7-1과 동일한 조건에서 배양하였다.
8-2 : 인간 폐암세포 세포주로의 목표 siRNA의 형질주입
실시예 8-1에서 배양된 1.2X105 페암세포(A549) 세포주를 37℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 6-well 플레이트에서 18시간 동안 DMEM에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰(well)당 500㎕의 Opti-MEM 배지(GIBCO, USA)를 분주하였다.
한편, 리포펙타민 RNAi 맥스(LipofectamineTM RNAi Max, Invitrogen, USA) 3.5㎕와 Opti-MEM 배지 246.5㎕를 혼합하여 혼합액을 제조하였고, 실온에서 5분간 반응시킨 다음, 상기 실시예 7-5에서 선별한 인간 엠피레귤린 26종 및 인간 스트라티핀 47종의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA (1pmole/㎕) 0.2㎕를 Opti-MEM 배지 230㎕에 첨가하여 최종 농도가 0.2 nM인 siRNA 용액을 제조하였다. 상기 리포펙타민 RNAi 맥스 혼합액과 siRNA 용액을 혼합하여 실온에서 15 분간 반응시켜 형질주입용 용액을 제조하였다.
그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰(well)에 형질주입용 용액을 각각 500㎕씩 분주하고 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하였다. 여기에 RPMI 1640 배양배지 1㎖씩 분주한 다음 24시간 동안 37℃에서 5%(v/v) CO2의 조건 하에서 배양하였다.
8-3 : 타겟 유전자 mRNA의 정량분석
실시예 8-2에서 형질주입된 세포주로부터 실시예 4-3과 동일한 방법으로 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 타겟 유전자의 mRNA 발현량을 상대정량 하였다.
8-4 : 형질주입된 세포로부터 RNA 분리 및 cDNA 제조
RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, Korea)를 이용하여, 실시예 8-2에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower CycleScript RT Premix/dT20, Bioneer, Korea)를 이용하여, 하기와 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다. 구체적으로, 0.25㎖ 에펜도르프 튜브에 담겨있는 AccuPower CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer, Korea)에 한 튜브 당 추출된 1 ㎍씩의 RNA를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 첨가하였다. 이를 유전자 증폭기(MyGenieTM 96 Gradient Thermal Block, BIONEER, Korea)로 30℃에서 1분 동안 RNA와 프라이머를 혼성화하고, 52℃에서 4분간 cDNA를 제조하는 두 과정을 6번 반복한 뒤, 90℃에서 5분 동안 효소를 불활성화시켜 증폭 반응을 종료하였다.
8-5 : 타겟 유전자 mRNA의 상대정량 분석
실시예 8-4에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 통해 호흡기 질환 연관 유전자 mRNA의 상대적인 양을 하기와 같은 방법으로 정량하였다. 96-well 플레이트의 각 well에 실시예 8-4에서 제조된 cDNA를 증류수로 5배 희석하고, 타겟유전자 mRNA 발현량 분석을 위해서 희석된 cDNA 3㎕와 2XGreenStarTM PCR master mix(BIONEER, Korea)를 25㎕, 증류수 19㎕, qPCR 프라이머(엠피레귤린 유전자, 서열번호 338 및 339; 스트라티핀 유전자, 서열번호 342 및 343; 표 2; F, R 각각 10pmole/㎕; BIONEER, Korea)을 3㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, 타겟유전자 mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스키핑 유전자인 RPL13A를 표준 유전자로 하였다. 상기 혼합액이 담긴 96-well 플레이트를 ExicyclerTM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER, Korea) 을 이용하여 하기와 같은 반응을 수행하였다: 95℃에서 15분간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94 ℃에서 30초 변성(denaturing), 58℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42 회 반복 수행하고, 72℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55℃에서 1분간 온도를 유지하고, 55℃에서 95℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다. PCR이 종료된 후, 각각 수득한 타겟유전자의 Ct(threshold cycle) 값은 RPL13A 유전자를 통해 보정된 타겟유전자의 Ct 값을 구한 뒤, 유전자 발현저해를 일으키지 않는 컨트롤 서열인 siRNA(siCONT)가 처리된 실험군을 대조군으로 하여 △Ct값의 차이를 구했다.
상기 △Ct값과 계산식 2(-△Ct)X100을 이용하여 엠피레귤린(Homo sapiens) 특이적 siRNA가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였다(도 6).
또한, 스트라티핀(Homo sapiens) 특이적 siRNA가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였다(도 7).
그 결과, 본 발명의 0.2 nM의 농도에서 70%이상의 발현 저해를 나타내는 고효율의 인간 엠피레귤린 서열번호 59, 75, 79, 80, 91, 92 또는 102의 7종 및 60% 이상의 발현 저해를 나타내는 고효율의 인간 스트라티핀 서열번호 241, 248, 257, 258, 263, 268, 290 또는 327의 8종의 siRNA는 높은 목표유전자 발현 저해를 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 9: SAMiRNA로 이루어진 나노입자를 이용한 종양 세포주에서의 타겟 유전자의 발현 억제
실시예 8-5에서 선정된 인간 엠피레귤린 3 종 서열(79, 80, 91) 및 인간 스트라티핀 5 종 서열(248, 257, 268, 290, 327)을 센스가닥으로 갖는 siRNA를 이용하여 상기 실시예 3-1에서 제조한 SAMiRNA로 이루어진 나노입자로 인간 폐암세포(A549)를 형질전환시키고, 형질전환된 폐암세포(A549) 세포주에서 타겟 유전자의 발현 양상을 분석하였다.
9-1 : 인간 폐암세포 세포주의 배양
미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 폐암세포(A549) 세포주는 실시예 7-1과 동일한 조건에서 배양하였다.
9-2 : SAMiRNA로 이루어진 나노입자를 이용한 인간 폐암세포 세포주의 형질전환
상기 실시예 9-1에서 배양된 0.8ㅧ105 인간 폐암세포(A549) 세포주를 37℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 12-웰(well) 플레이트에서 18시간 동안 DMEM에서 배양하였다. 실시예 3-1에서 제조된 엠피레귤린 서열 79, 80, 91 및 스트라티핀 서열 248, 257, 268, 290, 327 을 갖는 SAMiRNA를 50nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM의 형질주입(transfection)용 용액으로 만들기 위해 13.3㎕, 26.6 ㎕, 53.2 ㎕, 133.0 ㎕의 SAMiRNA와 986.7 ㎕, 973.4 ㎕, 976.8 ㎕, 867.0 ㎕의 Opti-MEM 배지(GIBCO, 미국)를 각각 혼합하여 1 ㎖을 제조하였다. 세포 배양액을 제거한 후 웰(well)당 1 ㎖의 형질주입 용액을 처리하고 37 ℃, 5 %(v/v) CO2의 조건에서 배양하였다. 형질주입은 매 12시간 마다 새로운 용액에 의해 교체되었으며 총 48시간 동안 4회 반복 진행하였다.
9-3 : 타겟 유전자 mRNA의 정량분석
실시예 9-2에서 형질주입된 세포주로부터 실시예 4-3과 동일한 방법으로 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 타겟 유전자의 mRNA 발현량을 상대정량 하였다.
9-4 : 형질주입된 세포로부터 RNA 분리 및 cDNA 제조
RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, Korea)를 이용하여, 실시예 9-2에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower RocketScript RT Premix/dT20, Bioneer, Korea)를 이용하여, 하기와 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다. 구체적으로, 0.25㎖ 에펜도르프 튜브에 담겨있는 AccuPower RocketScript RT Premix/dT20(Bioneer, Korea)에 한 튜브 당 추출된 1 ㎍씩의 RNA를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 첨가하였다. 이를 유전자 증폭기(MyGenie™ 96 Gradient Thermal Block, BIONEER, Korea)로 30℃에서 1분 동안 RNA와 프라이머를 혼성화하고, 52℃에서 4분간 cDNA를 제조하는 두 과정을 6번 반복한 뒤, 90℃에서 5분 동안 효소를 불활성화시켜 증폭 반응을 종료하였다.
9-5 : 타겟 유전자 mRNA의 상대정량 분석
실시예 9-4에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 통해 호흡기 질환 연관 유전자 mRNA의 상대적인 양을 하기와 같은 방법으로 정량하였다. 96-well 플레이트의 각 well에 실시예 9-4에서 제조된 cDNA를 증류수로 5배 희석하고, 타겟유전자 mRNA 발현량 분석을 위해서 희석된 cDNA 3㎕와 2ㅧ GreenStar™ PCR master mix(BIONEER, Korea)를 25㎕, 증류수 19㎕, qPCR 프라이머(엠피레귤린 유전자, 서열번호 338 및 339; 스트라티핀 유전자, 서열번호 342 및 343 (표 2); F, R 각각 10pmole/㎕; BIONEER, Korea)을 3㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, 타겟유전자 mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스키핑 유전자인 RPL13A를 표준 유전자로 하였다. 상기 혼합액이 담긴 96-well 플레이트를 Exicycler™96 Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER, Korea) 을 이용하여 하기와 같은 반응을 수행하였다: 95℃에서 15분간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94 ℃에서 30초 변성(denaturing), 58℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42 회 반복 수행하고, 72℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55℃에서 1분간 온도를 유지하고, 55℃에서 95℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다. PCR이 종료된 후, 각각 수득한 타겟유전자의 Ct(threshold cycle) 값은 RPL13A 유전자를 통해 보정된 타겟유전자의 Ct 값을 구한 뒤, 유전자 발현저해를 일으키지 않는 컨트롤 서열인 SAMiRNA-CONT(siCONT) 가 처리된 실험군을 대조군으로 하여 ΔCt값의 차이를 구했다.
상기 ΔCt 값과 계산식 2^(-ΔCt)ㅧ 100을 이용하여 엠피레귤린(Homo sapiens) 특이적 SAMiRNA가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였다(도 8).
또한, 스트라티핀(Homo sapiens) 특이적 SAMiRNA가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였다(도 9).
그 결과, SAMiRNA-hAR #80과 SAMiRNA-hSFN #248, #290에 의한 인간 폐암세포주(A549)의 타겟 유전자 발현은 각각 500 nM 혹은 200 nM 처리 시 70% 의 발현 저해를 나타냄을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Bioneer Corporation <120> Novel Double Strand Oligo RNA and Pharmaceutical Compositions For Preventing or Treating Fibrosis or Respiratory Diseases Containing The Same <130> P14-B113 <150> KR 14/040699 <151> 2014-04-04 <160> 343 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 1 ggaguaugau aaugaacca 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 2 caguaguagc ugucacuau 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 3 agacucacag cgaggauga 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 4 cacaaauauc cggcuauau 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 5 caccauaagc gaaaugccu 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 6 gauuacuuug gugaacggu 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 7 caguugucac uuuuuauga 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 8 ggaccuaucc aagauugca 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 9 cguuaucaca gugcaccuu 19 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 10 ccuagcugag gacaaugca 19 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 11 ccuagcugag gacaaugca 19 <210> 12 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 12 cucagaggag uaugauaau 19 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 13 cgguggacuu gagcuuucu 19 <210> 14 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 14 gguggugaca ugcaauugu 19 <210> 15 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 15 cagggaauau gaaggagaa 19 <210> 16 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 16 ggaggcuucg acaagaaaa 19 <210> 17 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 17 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cctgacact 19 <210> 290 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 290 agctgttgag cgcacctaa 19 <210> 291 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 291 gaacttttcc gtcttccac 19 <210> 292 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 292 aaaagcaacg aggagggct 19 <210> 293 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 293 tctcctgcga agagcgaaa 19 <210> 294 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 294 ctgttgagcg cacctaacc 19 <210> 295 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 295 cctgaacttt tccgtcttc 19 <210> 296 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 296 gctgttcttg ctccaaagg 19 <210> 297 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 297 aggccgaacg ctatgagga 19 <210> 298 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 298 attgaggagt gtcccgcct 19 <210> 299 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 299 gtgaccatgt ttcctctca 19 <210> 300 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 300 caagaccact ttcgacgag 19 <210> 301 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 301 aacttttccg tcttccact 19 <210> 302 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 302 tgatcgtagg aattgagga 19 <210> 303 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 303 ggagagagcc agtctgatc 19 <210> 304 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 304 agcaggccga acgctatga 19 <210> 305 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 305 aggacatggc agccttcat 19 <210> 306 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 306 acgacaagaa gcgcatcat 19 <210> 307 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 307 accatgtttc ctctcaata 19 <210> 308 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 308 tgccgagagg actagtatg 19 <210> 309 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 309 tctgatcgta ggaattgag 19 <210> 310 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 310 tgggtgtgac catgtttcc 19 <210> 311 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 311 tgaacttttc cgtcttcca 19 <210> 312 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 312 gaattgagga gtgtcccgc 19 <210> 313 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 313 tttccgtctt ccactacga 19 <210> 314 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 314 ctgctgcctc tgatcgtag 19 <210> 315 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 315 ggccctgaac ttttccgtc 19 <210> 316 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 316 gccaagacca ctttcgacg 19 <210> 317 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 317 tctggccaag accactttc 19 <210> 318 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 318 ctgaactttt ccgtcttcc 19 <210> 319 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 319 aagcgcatca ttgactcag 19 <210> 320 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 320 tgttgagcgc acctaacca 19 <210> 321 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 321 tacctgaaga tgaagggtg 19 <210> 322 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 322 accactttcg acgaggcca 19 <210> 323 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 323 acgaggccat ggctgatct 19 <210> 324 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 324 gatcccactc ttcttgcag 19 <210> 325 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 325 cttttccgtc ttccactac 19 <210> 326 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 326 gccgagagga ctagtatgg 19 <210> 327 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 327 gctgttgagc gcacctaac 19 <210> 328 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 328 caggaccagg ctacttctc 19 <210> 329 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 329 cctataagaa cgtggtggg 19 <210> 330 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 330 ctgggtgtga ccatgtttc 19 <210> 331 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siCONT <400> 331 cuuacgcuga guacuucga 19 <210> 332 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRPL13A-F <400> 332 cgatagtgca tcttggcctt t 21 <210> 333 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRPL13A-R <400> 333 cctgctgctc tcaaggttgt t 21 <210> 334 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hRPL13A-F <400> 334 agctcatgag gctacggaaa 20 <210> 335 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hRPL13A-R <400> 335 cgtacattcc agggcaaca 19 <210> 336 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAR-F <400> 336 ggtcttaggc tcaggccatt a 21 <210> 337 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAR-R <400> 337 cgcttatggt ggaaacctct 20 <210> 338 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hAR-F <400> 338 acacctactc tgggaagcgt 20 <210> 339 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hAR-R <400> 339 gccaggtatt tgtggttcgt 20 <210> 340 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mSFN-F <400> 340 gtgtgtgcga caccgtact 19 <210> 341 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mSFN-R <400> 341 ctcggctagg tagcggtag 19 <210> 342 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSFN-F <400> 342 agaagcgcat cattgactca g 21 <210> 343 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hSFN-R <400> 343 tctcgtagtg gaagacggaa a 21

Claims (40)

  1. 서열번호 107로 표시되는 서열을 포함하는 센스 가닥(sense strand)과 이에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥(anti-sense strand)을 포함하는 엠피레귤린(amphiregulin) 특이적 siRNA.
  2. 제1항에 있어서, 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 19 내지 31개의 뉴클레오티드로 이루어진 것을 특징으로 하는 siRNA.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 siRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 화학적 변형(chemical modification)을 포함하는 것을 특징으로 하는 siRNA.
  8. 제7항에 있어서, 상기 화학적 변형은 뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조의 2' 탄소 위치에서 수산화기(-OH)가 메틸기(-CH3), 메톡시기(-OCH3), 아민기(-NH2), 불소(-F), O-2-메톡시에틸기, O-프로필기, O-2-메틸티오에틸기, O-3-아미노프로필기, O-3-디메틸아미노프로필기, O-N-메틸아세트아미도기 및 O-디메틸아미도옥시에틸로 구성된 군에서 선택된 어느 하나로 치환되는 변형;
    뉴클레오티드 내 당 구조의 산소가 황으로 치환되는 변형;
    뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합, 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합 및 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 결합이 되는 변형; 및
    PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 및 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형;으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 siRNA.
  9. 제1항에 있어서, siRNA의 안티센스 가닥의 5' 말단에 하나 이상의 인산기(phosphate group)가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 siRNA.
  10. 하기 구조식 1의 구조를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체:
    [구조식 1]
    Figure 112020032797633-pat00009
    ;
    상기 구조식 1에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 제1항의 siRNA를 의미한다.
  11. 제10항에 있어서, 하기 구조식 2의 구조를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체:
    [구조식 2]
    Figure 112015033503767-pat00010
    ;
    상기 구조식 2에서, S 및 AS는 각각 제10항에 따른 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 의미하며, A, B, X 및 Y는 제10항에서의 정의와 동일하다.
  12. 제11항에 있어서, 하기 구조식 3의 구조를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체:
    [구조식 3]
    Figure 112015033503767-pat00011
    ;
    상기 구조식 3에서, A, B, X, Y, S 및 AS는 제11항에서의 정의와 동일하며, 5' 및 3'은 siRNA 센스 가닥의 5' 및 3' 말단을 의미한다.
  13. 제10항에 있어서,
    친수성 물질은 하기 구조식 4의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체;
    [구조식 4]
    Figure 112020032797633-pat00012
    ;
    상기 구조식 4에서 A′는 친수성 물질 단량체(monomer)를, J는 m개의 친수성 물질 단량체 간 또는 m개의 친수성 물질 단량체와 siRNA를 서로 연결하는 링커, m은 1 내지 15의 정수, n은 1 내지 10의 정수를 의미하며,
    친수성 물질 단량체 A'는 하기 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에서 선택된 어느 하나의 화합물이며, 링커(J)는 PO3 -, SO3 및 CO2로 구성된 군에서 선택된다;
    화합물 (1)
    Figure 112020032797633-pat00013

    상기 화합물 (1)에서 G는 CH2, O, S 및 NH로 구성된 군에서 선택된다;
    화합물 (2)
    Figure 112020032797633-pat00014
    ;
    화합물 (3)
    Figure 112020032797633-pat00015
    .

  14. 삭제
  15. 제10항에 있어서, 상기 친수성 물질의 분자량은 200 내지 10,000임을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  16. 제10항에 있어서, 상기 친수성 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐피롤리돈 및 폴리옥사졸린으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  17. 제10항에 있어서, 상기 소수성 물질의 분자량은 250 내지 1,000인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  18. 제10항에 있어서, 상기 소수성 물질은 스테로이드 유도체, 글리세라이드 유도체, 글리세롤 에테르, 폴리프로필렌 글리콜, C12 내지 C50의 불포화 또는 포화탄화수소, 디아실포스파티딜콜린(diacylphosphatidylcholine), 지방산, 인지질, 리포폴리아민(lipopolyamine), 지질(lipid), 토코페롤(tocopherol) 및 토코트라이에놀(tocotrienol)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  19. 제18항에 있어서, 상기 스테로이드 유도체는 콜레스테롤, 콜리스탄올, 콜산, 콜리스테릴포르메이트, 코테스타닐포르메이트 및 콜리스타닐아민으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  20. 제18항에 있어서, 상기 글리세라이드 유도체는 모노-글리세라이드, 디-글리세라이드 및 트리-글리세라이드로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  21. 제10항에 있어서, 상기 X 및 Y로 표시되는 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 비분해성 결합은 아미드 결합 또는 인산화 결합인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  23. 제21항에 있어서, 상기 분해성 결합은 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 및 효소 분해성 결합으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  24. 제10항 내지 제13항 및 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 나노입자.
  25. 제24항에 있어서, 서로 다른 서열을 포함하는 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체가 혼합되어 구성되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  26. 제1항, 제2항, 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 siRNA를 유효성분으로 포함하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 만성폐쇄성질환(COPD), 천식, 급만성기관지염, 알레르기 비염, 진해 거담, 기관지염, 세기관지염, 인후염, 편도염 및 후두염으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  28. 제26항에 있어서, 상기 섬유증은 특발성 폐섬유화증(IPF), 간경변(cirrhosis), 골수섬유증(myelofibrosis), 심근섬유증(myocardial fibrosis), 신장 섬유증(renal fibrosis) 및 폐섬유증 (pulmonary fibrosis)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  29. 제26항의 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 포함하는 동결건조된 형태의 제형.
  30. 제10항 내지 제13항 및 제15항 내지 제23항 중 어느 하나의 이중나선 올리고 RNA 구조체를 유효성분으로 포함하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 만성폐쇄성질환(COPD), 천식, 급만성기관지염, 알레르기 비염, 진해 거담, 기관지염, 세기관지염, 인후염, 편도염 및 후두염으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  32. 제30항에 있어서, 상기 섬유증은 특발성 폐섬유화증(IPF), 간경변(cirrhosis), 골수섬유증(myelofibrosis), 심근섬유증(myocardial fibrosis), 신장 섬유증(renal fibrosis) 및 폐섬유증 (pulmonary fibrosis)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  33. 제30항의 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 포함하는 동결건조된 형태의 제형.
  34. 제24항의 나노입자를 유효성분으로 포함하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 만성폐쇄성질환(COPD), 천식, 급만성기관지염, 알레르기 비염, 진해 거담, 기관지염, 세기관지염, 인후염, 편도염 및 후두염으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  36. 제34항에 있어서, 상기 섬유증은 특발성 폐섬유화증(IPF), 간경변(cirrhosis), 골수섬유증(myelofibrosis), 심근섬유증(myocardial fibrosis), 신장 섬유증(renal fibrosis) 및 폐섬유증 (pulmonary fibrosis)으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
  37. 제34항의 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 포함하는 동결건조된 형태의 제형.
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
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