WO2015002513A2 - 호흡기 질환 연관 유전자 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이를 포함하는 호흡기 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

호흡기 질환 연관 유전자 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이를 포함하는 호흡기 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • C12N2320/51—Methods for regulating/modulating their activity modulating the chemical stability, e.g. nuclease-resistance

Definitions

  • the present invention relates to a respiratory disease associated gene-specific siRNA and a high-efficiency double-stranded oligo RNA structure comprising the same, wherein the double-stranded oligo RNA structure is hydrophilic at both ends of the double-stranded RNA (siRNA) in order to be efficiently delivered into cells.
  • the material and the hydrophobic material have a structure of the conjugated form using simple covalent bonds or linker-mediated covalent bonds, and are converted into nanoparticle form by hydrophobic interaction of the double-stranded oligo RNA structures in aqueous solution. Can be.
  • SiRNA contained in the double-stranded oligo RNA structure is a specific gene associated with respiratory diseases, particularly idiopathic pulmonary fibrosis and chronic obstructive pulmonary disease (hereinafter referred to as 'COPD'), in particular CTGF, Cyr61 or Plekho-1. It is preferred that it is siRNA.
  • the present invention also relates to a method for preparing the double-stranded oligo RNA structure and a pharmaceutical composition for preventing or treating respiratory diseases, in particular idiopathic pulmonary fibrosis and COPD, comprising the double-stranded oligo RNA structure.
  • RNA interference interfering RNA
  • 'RNAi' interfering RNA
  • RNA is converted into RNA, hereinafter called siRNA, and siRNA binds to an RNA-induced silencing complex (RISC), whereby the guide (antisense) strand recognizes and degrades the target mRNA to sequence-express the expression of the target gene.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • siRNA against the same target gene is superior to antisense oligonucleotides (ASOs) in inhibiting mRNA expression in vitro and in vivo , and the effect lasts for a long time.
  • ASOs antisense oligonucleotides
  • the siRNA action mechanism complementarily binds to the target mRNA and regulates the expression of the target gene in a sequence-specific manner, thus making it possible to apply targets to conventional antibody-based or small molecule drugs.
  • siRNAs must be effectively delivered to target cells by improving their stability and improving cell delivery efficiency in order for siRNAs to be developed as therapeutic agents (Harnessing in vivo siRNAs). delivery for drug discovery and therapeutic development.Drug Discov Today. 2006 Jan; 11 (1-2): 67-73).
  • nucleotides or backbones of siRNA are modified to have nuclease resistance or viral vectors, liposomes or nanoparticles, etc., to improve the stability in the body. Research into the use of the carrier is actively attempted.
  • Non-viral delivery systems containing nanoparticles have lower cell delivery efficiency than viral delivery systems, but have high stability in vivo and target specificity. It is possible to deliver to the cell, and to improve the effect of delivering uptake and internalization of the contained RNAi oligonucleotides into cells or tissues, as well as having little cytotoxicity and immune stimulation. It is currently evaluated as a viable delivery method compared to viral delivery systems (Nonviral delivery of synthetic siRNAs in vivo . J Clin Invest. 2007 December 3; 117 (12): 3623-3632).
  • a method of using a nanocarrier is used to form nanoparticles by using various polymers such as liposomes and cationic polymer complexes, and siRNA is added to these nanoparticles, that is, nanocarriers. It has a form to be supported and delivered to the cell.
  • polymer nanoparticles, polymer micelles, lipoplexes, etc. are mainly used.
  • lipoplexes are composed of cationic lipids. It interacts with the anionic lipids of the endosome of endosome, induces the destabilizing effect of the endosome and delivers it into cells (Proc. Natl. Acad. Sci. 15; 93 (21): 11493-8, 1996).
  • siRNAs in the form of conjugated polymer compounds such as polyethylene glycol (PEG)
  • PEG polyethylene glycol
  • micelles composed of polymer complexes are extremely uniform in size and spontaneously formed, compared to other systems used as drug delivery vehicles, such as microspheres or nanoparticles. There is an advantage that it is easy to ensure the quality control and reproducibility of the formulation.
  • siRNA conjugate conjugated to a technique for securing the stability of the siRNA and efficient cell membrane permeability has been developed (Korean Patent No. 883471).
  • a hydrophilic material e.g., polyethylene glycol, PEG
  • PEGylation polyethylene glycol
  • a double-stranded oligo RNA structure in which hydrophilic and hydrophobic materials are coupled to oligonucleotides, especially double-stranded oligo RNA such as siRNA, has been developed.
  • the structure is prepared by SAMiRNA TM (self assembled) by hydrophobic interaction of hydrophobic materials. self-assembled nanoparticles called micelle inhibitory RNA) (Korea Patent No. 1224828).
  • SAMiRNA TM technology is very small in size compared to conventional delivery technologies, and can produce homogenous nanoparticles. Has the advantage that it can.
  • polyethylene glycol is used as a hydrophilic substance, which is a synthetic polymer, which is often used to increase the solubility of pharmaceuticals, especially proteins, and to control pharmacokinetics.
  • PEG polyethylene glycol
  • one batch of polymers is made up of the sum of different numbers of monomers, resulting in a Gaussian shape with a molecular weight of polydisperse (Mw / Mn). Expresses the degree of homogeneity of the substance.
  • PEG exhibits a polydispersity index of about 1.01 when the molecular weight is low (3 to 5 kDa) and a high polydispersity index of about 1.2 when the molecular weight is high (20 kDa) .
  • the higher the molecular weight, the lower the homogeneity of the material. FM Veronese.Peptide and protein PEGylation: a review of problems and solutions.Biomaterials (2001) 22: 405-417). Therefore, when PEG is bound to pharmaceuticals, the polydispersity of PEG is reflected in the conjugates, which makes it difficult to verify a single substance. Therefore, the production of substances having low polydispersity index through the synthesis and purification of PEG is improved.
  • the self-assembled nanoparticles are an improved form of the SAMiRNA TM technology.
  • the hydrophilic material of the double-stranded RNA structure constituting SAMiRNA TM has a uniform molecular weight of 1 to 15 monomers, and, if necessary, By blocking the basic unit containing the linker and using the appropriate number as necessary, a new type of carrier having a smaller size and dramatically improved polydispersity compared to the existing SAMiRNA TM Technology was developed.
  • bio-drugs act specifically on target gene sequences or protein structures, in order to evaluate efficacy and safety in non-clinical surrogate models, the species of surrogate models are the same as the bio-drugs in humans.
  • substances that act as mechanisms Therefore, in order to avoid the difficulty of finding a substance containing the same mechanism as in humans, it is necessary to develop a substance that can act as the same mechanism in a human being treated and a mouse in a non-clinical surrogate model.
  • Idiopathic Pulmonary Fibrosis causes severe structural changes in the lung tissue as the chronic inflammatory cells infiltrate the alveolar (lungary) walls and cause several changes that harden the lungs. It is a disease that eventually leads to pulmonary deterioration, and there are no effective treatments yet. Symptoms usually appear when diagnosed, and the median survival is only 3 to 5 years. The incidence rate is reported to be about 3-5 people per 100,000 population in foreign countries, and it is generally known that the incidence rate is higher after 50s and men are twice as high as women.
  • IPF IPF
  • IPF is known to continually worsen when not treated, causing more than 50% of patients to die within 3-5 years, and once the disease has progressed to complete fibrosis, no treatment can improve the treatment. If you do this, the early treatment is likely to be effective.
  • Therapies currently in use include steroids, azathioprine, or cyclophosphamide, but it is difficult to see any particular effect. Trials have been attempted in animal studies and small-scale patients, but no clear effects have been demonstrated. In particular, there is no effective treatment other than lung transplantation in terminal IPF patients. Therefore, there is an urgent need to develop more efficient IPF therapeutics.
  • COPD which is one of the representative lung diseases in combination with asthma, is different from asthma in that it is accompanied by irreversible airway obstruction and abnormal inflammatory reactions of the lung caused by repeated infections, inhalation of harmful particles or gases, or smoking. Respiratory diseases that are not completely reversible and have progressive airflow limitations (Pauwels et al, Am J Respir Crit Care Med , 163: 1256-1276, 2001). COPD is a disease caused by pathological changes in bronchioles and pulmonary parenchyma by airway and lung parenchymal inflammation, characterized by obstructive bronchiolitis and emphysema (pulmonary parenchymal destruction).
  • Types of COPD include chronic obstructive bronchitis, chronic bronchiolitis and emphysema.
  • COPD chronic obstructive bronchitis
  • chronic bronchiolitis emphysema
  • cytokines such as GM-CSF, TNF- ⁇ , IL-8, and MIP-2
  • the airways become inflamed, the muscle walls thicken, mucus secretion increases, and bronchial obstruction appears.
  • the alveoli expand and become damaged, impairing the exchange capacity of oxygen and carbon dioxide and increasing the incidence of respiratory failure.
  • COPD chronic Obstructive Pulmonary Disease
  • COPD chronic Obstructive Pulmonary Disease
  • CTGF connective tissue growth factor
  • CCN connective tissue growth factor
  • CTGF in relation to fibrosis, CTGF, along with TGF- ⁇ (Transforming growth factor- ⁇ ), is known to play a role in promoting the production of ECM (extracelluar matrix) in conditions that cause sustained fibrosis or fibrosis.
  • ECM extracelluar matrix
  • treatment of samples or substances that inhibit the expression of CTGF or inhibit the action of ocular disorders or Muscular Dystrophy caused by abnormal expression of CTGF can be treated. No relevance has been suggested (US Patent No. 7622454, US Publication No. 20120164151).
  • Cysteine-rich angiogenic inducer 61 is also an extracelluar matrix (ECM) signaling protein belonging to the CCN family, which includes cell adhesion, migration, proliferation, differentiation, It is known to regulate various cellular activities such as apoptosis.
  • ECM extracelluar matrix
  • Purified CYR61 promotes the attachment and spreading of endothelial cells in a similar way to fibronectin and enhances the mitogen effect of fibroblast growth factor with no mitogenic activity.
  • MARIA L. KIREEVA et al. Cyr 61, a Product of a Growth Factor-Inducible Immediate-Early Gene, Promotes Cell Proliferation, Migration, and Adhesion.MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Apr. 1996, p. 1326-1334 is also an extracelluar matrix (ECM) signaling protein belonging to the CCN family, which includes cell adhesion, migration, proliferation, differentiation, It is known to regulate various cellular activities such as apop
  • Plekho1 Pulstrin homology domain-containing family O member 1
  • Plekho1 is present in the plasma membrane or nucleus and is a non-enzymatic regulator of protein kinase CK2 ⁇ 1 (Casein kinase 2, alpha 1). It acts as an -enzymatic regulator and is reported to be involved in apoptosis by inhibiting AP-1 action produced by C-terminal fragments when degraded by Caspase 3 (Denis G. Bosc et al. Identification).
  • CKIP-1 a Novel Pleckstrin Homology Domain-containing Protein That Interacts with Protein Kinase CK2.
  • An object of the present invention is to solve the above problems, novel siRNA and double-stranded oligo RNA structure comprising the same and specific double-stranded oligonucleotide that can inhibit the expression of CTGF, Cyr61 or Plekho1 with very high efficiency It is to provide a method for producing an RNA structure.
  • another object of the present invention is a pharmaceutical for preventing or treating respiratory diseases, in particular idiopathic pulmonary fibrosis and COPD, comprising the CTGF, Cyr61 or Plekho1-specific siRNA or a double-stranded oligo RNA structure comprising such siRNA as an active ingredient. It is to provide a composition.
  • the first oligonucleotide having a sense strand comprising any sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 600 and 602 to 604 and an antisense strand comprising a complementary sequence thereof
  • a CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA, which is a respiratory disease associated gene consisting of 2 oligonucleotides, is provided.
  • SiRNA in the present invention is a concept that includes all substances having a general RNAi (RNA interference) action, the CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA is also included in the CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific shRNA is that the present invention belongs It is obvious to those skilled in the art.
  • RNAi RNA interference
  • SEQ ID NO: 1 to 100 or 602 to 604 is a sense strand sequence of siRNA specific to CTGF ( Homo sapiens )
  • SEQ ID NO: 101 to 200 is a sense strand sequence of siRNA specific to Cyr61 ( Homo sapiens )
  • SEQ ID NO: 201 to 300 are sense strand sequences of siRNA specific to Plekho1 ( Homo sapiens )
  • SEQ ID NOs: 301 to 400 are sense strand sequences of siRNA specific to CTGF ( Mus musculus )
  • SEQ ID NOs: 401 to 500 are Cyr61 ( Mus musculus)
  • SEQ ID NO: 501 to 600 is a sense strand sequence of siRNA specific to Plekho1 ( Mus musculus ).
  • SiRNA according to the invention is preferably any one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 10, 35, 42, 59, 602, 603, 604, 301 to 303, 305 to 307, 309, 317, 323 and 329 CTGF specific siRNA comprising the sequence of the sense strand,
  • Plekho1 specific siRNA comprising a sense strand of any one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 201 to 210, 212, 218, 221, 223, 504 to 507, 514, 515 and 522 to 525.
  • CTGF comprising any one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4, 5, 8, 9, 35, 42, 59, 601, 602, 604, 301, 303, 307 and 323 as a sense strand Specific siRNA,
  • a Cry61 specific siRNA comprising a sense strand of any one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 102, 104, 107, 108, 124, 153, 166, 187, 197, 410, 422, and 424; or
  • Plekho1 specific siRNA comprising a sense strand of any one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 206 to 209, 212, 218, 221, 223, 507, 515, and 525,
  • CTGF specific siRNA comprising the sense strand of any one of the sequences according to SEQ ID NO: 42, 59, 602 or 323
  • Cry61 specific siRNA comprising a sense strand of any sequence according to SEQ ID NOs: 124, 153, 187, 197 or 424
  • Plekho1 specific siRNA comprising the sense strand of any one of SEQ ID NOs: 212, 218, 221, 223 or 525.
  • the siRNA capable of simultaneously suppressing human and mouse CTGF, Cyr61 or Plekho1 expression is preferably a Cyr61 specific strand according to the sense strand of CTGF specific siRNA according to SEQ ID NO: 6 or 8, SEQ ID NO: 102, 104 or 105 the sense strand of the siRNA, or the sense strand of the Plekho1 specific siRNA according to SEQ ID NOs: 204, 207 or 208.
  • the sense strand or antisense strand of the siRNA according to the present invention preferably comprises 19 to 31 nucleotides, and includes a sense strand comprising any one sequence selected from SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 604 and an antisense strand complementary thereto. do.
  • CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA provided in the present invention has a base sequence designed to complementarily bind to the mRNA encoding the gene, it is characterized in that it can effectively suppress the expression of the gene.
  • the siRNA may include an overhang, which is a structure including one or two or more unpaired nucleotides at the 3 ′ end of the siRNA,
  • the siRNA in order to improve the stability of the siRNA in vivo, it may include various modifications for imparting nuclease resistance and reducing non-specific immune responses.
  • Modifications of the first or second oligonucleotides constituting the siRNA may include -CH 3 (methyl), -OCH 3 (methoxy), -NH 2, -F (-OH) at the 2 ′ carbon position of the sugar structure in one or more nucleotides.
  • CTGF, Cyr61 and / or Plekho1 specific siRNAs provided in the present invention not only inhibit the expression of the gene, but also significantly inhibit the expression of the protein.
  • a conjugate in which a hydrophilic material and a hydrophobic material are conjugated to both ends of an siRNA for efficient delivery and stability of respiratory disease associated genes, particularly CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA, in vivo. do.
  • siRNA conjugate in which a hydrophilic material and a hydrophobic material are bound to siRNA, self-assembled nanoparticles are formed by hydrophobic interaction of the hydrophobic material (Korean Patent Registration No. 1224828). Not only is the delivery efficiency and stability in the body extremely excellent, but also the particle size is uniform, so that the QC (Quality Control) is easy, so there is an advantage that the manufacturing process as a drug is simple.
  • the double-stranded oligo RNA structure comprising CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA according to the present invention preferably has a structure as shown in the following structural formula (1).
  • A is a hydrophilic substance
  • B is a hydrophobic substance
  • X and Y are each independently a simple covalent bond or a linker mediated covalent bond
  • R represents CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA.
  • the double-stranded oligo RNA structure comprising CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA according to the present invention has the structure of the following structural formula (2).
  • A, B, X and Y are the same as the definitions in the above formula (1), S is the sense strand of CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA, AS is CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA Means the antisense strand of.
  • the double-stranded oligo RNA construct comprising CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA has the structure of the following structural formula (3) or (4).
  • A, B, S, AS, X and Y are the same as the definitions in the above formula (1), and 5 'and 3' are CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA sense Means the 5 'end and the 3' end of the strand.
  • One to three phosphate groups are bound to the 5 ′ end of the antisense strand of the double-stranded oligo RNA structure comprising the CTGF, Cyr61, or Plekho1 specific siRNAs in the above formulas (1) to (4). It will be apparent to those skilled in the art that shRNA may be used instead of siRNA.
  • the hydrophilic materials in the above formulas (1) to (4) are preferably cationic or nonionic polymer materials having a molecular weight of 200 to 10,000, and more preferably 1,000 to 2,000 nonionic polymer materials.
  • a nonionic hydrophilic polymer compound such as polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, polyoxazoline, etc. as the hydrophilic polymer material, but is not necessarily limited thereto.
  • the hydrophilic material (A) in the formulas (1) to (4) may be used in the form of a hydrophilic material block in the form of the following formula (5) or formula (6), which block
  • n in Structural Formula (5) or Structural Formula (6) it is possible to greatly improve the problem due to polydispersity that may occur when using a general synthetic polymer material or the like.
  • a ' is a hydrophilic monomer
  • J is a linker for connecting between m hydrophilic monomers or m hydrophilic monomers and siRNA
  • m is an integer of 1 to 15
  • n is 1 to
  • the repeating unit represented by (A ' m -J) or (J-A' m ) corresponds to the basic unit of the hydrophilic material block.
  • the double-stranded oligo RNA construct comprising CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA according to the present invention is represented by the following formula (7) or formula (8) It may have a structure such as.
  • the hydrophilic material monomer (A ′) in the structural formula (5) and the structural formula (6) can be used without limitation as long as it meets the object of the present invention among the monomers of the nonionic hydrophilic polymer, and preferably the compound of Table 1 ( Monomers selected from 1) to compound (3), more preferably monomers of compound (1) can be used, and in compound (1) G can preferably be selected from CH 2 , O, S and NH.
  • the monomer represented by the compound (1) can introduce various functional groups, and has excellent bio-compatibility such as good in vivo affinity and induces an immune response, It has the advantage of increasing the in vivo stability of the oligonucleotides contained in the structure according to the structure (7) or the structure (8) and the delivery efficiency, which is very suitable for the preparation of the structure according to the present invention.
  • the hydrophilic substances in the above structural formulas (5) to (8) have a total molecular weight in the range of 1,000 to 2,000.
  • hexaethylene glycol (Hexaethylene glycol) according to compound (1) in the formula (7) and formula (8) that is, when a substance of G is O and m is 6 is used hexaethylene glycol spacer ( Since the molecular weight of the spacer) is 344, it is preferable that the number of repetitions n is 3 to 5.
  • the present invention is the structural formula (5) and Formula (6) in (A 'm -J) or (J-A' m) n repeating units, or hydrophilic material block (block) of the hydrophilic groups represented as needed It can be used as an appropriate number denoted by n.
  • the hydrophilic material monomer A and the linker J included in each of the hydrophilic material blocks may be the same as or different from each of the hydrophilic material blocks independently.
  • the first block contains the hydrophilic monomer according to compound (1)
  • the second block contains the hydrophilic monomer according to compound (2)
  • the third block contains Other hydrophilic material monomers may be used for every hydrophilic material block, such as a hydrophilic material monomer according to compound (3), and any hydrophilic material monomer selected from compounds (1) to (3) may be used for every hydrophilic material block.
  • One hydrophilic monomer may equally be used.
  • the linker that mediates the binding of the hydrophilic material monomer may be the same linker for each hydrophilic material block, or different linkers may be used for each hydrophilic material block.
  • the linker (J) is preferably selected from the group consisting of PO 3 ⁇ , SO 3, and CO 2 , but is not limited thereto.
  • the linker (J) may meet the object of the present invention according to the monomer of the hydrophilic material used. As long as any linker can be used, it will be apparent to those skilled in the art.
  • hydrophobic substances (B) in the above formulas (1) to (4), (7) and (8) are represented by the formulas (1) to (4), (7) and (7) through hydrophobic interactions. It serves to form a nanoparticle consisting of the oligonucleotide structure according to 8).
  • the hydrophobic material has a molecular weight of 250 to 1,000, a steroid derivative, a glyceride derivative, a glycerol ether, a polypropylene glycol, an unsaturated of C 12 to C 50 or Saturated hydrocarbons, diacylphosphatidylcholine, fatty acids, phospholipids, lipopolyamines, and the like may be used, but are not limited thereto, and may be used as long as they meet the object of the present invention. It is obvious to those skilled in the art that hydrophobic materials can also be used.
  • the steroid derivative may be selected from the group consisting of cholesterol, cholestanol, cholic acid, cholesteryl formate, cotestanyl formate and colistanylamine, and the glyceride derivatives are mono-, di- And tri-glycerides and the like, wherein the fatty acid of glyceride is preferably C 12 to C 50 unsaturated or saturated fatty acid.
  • saturated or unsaturated hydrocarbons or cholesterols are preferable in that they have an advantage of being easily bonded in the synthesis step of the oligonucleotide structure according to the present invention, and tetramethyl containing C 24 hydrocarbons, especially disulfide bonds, is preferable.
  • dodosan tetradocosane
  • the hydrophobic material is bound to the distal end of the hydrophilic material, and may be bonded at any position of the sense strand or the antisense strand of the siRNA.
  • the hydrophilic or hydrophobic material and the CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA in the formulas (1) to (4), (7) and (8) according to the present invention are simple covalent or linker-mediated covalent bonds. Bound by (X or Y).
  • the linker that mediates the covalent bond is covalently bonded to the hydrophilic material or the hydrophobic material at the ends of the CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA, and is not particularly limited as long as it provides a bond capable of degrading in a specific environment.
  • the linker may be used any compound that binds to activate CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA and / or hydrophilic material (or hydrophobic material) during the preparation of the double helix oligo RNA structure according to the present invention.
  • the covalent bonds may be either non-degradable bonds or degradable bonds.
  • the non-degradable bonds include amide bonds or phosphorylation bonds
  • the degradable bonds include disulfide bonds, acid decomposable bonds, ester bonds, anhydride bonds, biodegradable bonds or enzymatic bonds, but are not limited thereto. .
  • CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNAs represented by R (or S and AS) in the above formulas (1) to (4), (7) and (8) are specific to CTGF, Cyr61 or Plekho1.
  • Any siRNA having a property capable of binding to each other can be used without limitation, and in the present invention, the sense strand comprising any one sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 600 and 602 to 604 and its complement It consists of an antisense strand comprising the host sequence.
  • siRNAs included in the above formulas (1) to (4), (7) and (8) according to the present invention are preferably SEQ ID NOs: 1 to 10, 35, 42, 59, 602 to 604 or 301 CTGF specific siRNA comprising a sense strand of any one selected from the group consisting of 303, 305 to 307, 309, 317, 323 and 329,
  • Plekho1 specific siRNA comprising a sense strand of any one selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 201 to 210, 212, 218, 221, 223, 504 to 507, 514, 515 and 522 to 525.
  • CTGF comprising any one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4, 5, 8, 9, 35, 42, 59, 602, 603, 604, 301, 303, 307 and 323 as a sense strand Specific siRNA
  • a Cry61 specific siRNA comprising a sense strand of any one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 102, 104, 107, 108, 124, 153, 166, 187, 197, 410, 422, and 424; or
  • Plekho1 specific siRNA comprising a sense strand of any one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 206 to 209, 212, 218, 221, 223, 507, 515, and 525,
  • CTGF specific siRNA comprising the sense strand of any one of the sequences according to SEQ ID NO: 42, 59, 602 or 323
  • a Cry61 specific siRNA comprising the sense strand of any one of SEQ ID NOs: 124, 153, 187, 197 or 424, or
  • Plekho1 specific siRNA comprising the sense strand of any one of SEQ ID NOs: 212, 218, 221, 223 or 525.
  • CTGF specific siRNA sense strands for humans and mice according to SEQ ID NO: 6 or 8 Cyr61 specific siRNA sense strands for humans and mice according to SEQ ID NO: 102, 104 or 105, or SEQ ID NOs: 204, 207
  • siRNA comprising a Plekho1 specific siRNA sense strand for humans and mice according to No. 208 wherein the siRNA having the sequence in the sense strand will simultaneously inhibit CTGF, Cyr61 or Plekho1 expression in humans and mice.
  • CTGF specific siRNA sense strands for humans and mice according to SEQ ID NO: 6 Cyr61 specific siRNA sense strands for humans and mice according to SEQ ID NO: 102, or SEQ ID NO: 207
  • siRNAs comprising Plekho1 specific siRNA sense strands for human and mouse accordingly.
  • the present invention also provides a double-stranded oligo RNA structure comprising CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA according to the present invention, wherein the amine group or polyhistidine group is located at the opposite terminal portion of the structure in which the hydrophilic substance is bound to the siRNA. This may be introduced further.
  • the primary amine group modified at the end or the outside of the transporter forms a conjugate by electrostatic interaction with negatively charged genes while being protonated at pH in vivo, and has a buffering effect at the low pH of the endosome after inflow. It has been known that internal tertiary amines can protect the transporter from degradation of lysosomes as the endosomes escape easily (inhibition of gene transfer and expression using polymer-based hybrid materials. Polymer Sci.Technol., Vol. 23, No. 3, pp254-259),
  • Histidine one of the non-essential amino acids, has imidazoling (pKa3 6.04) at residue (-R), which increases the buffering capacity in endosomes and lysosomes. It is known that histidine modifications can be used to enhance endosomal escape efficiency in non-viral gene carriers (Novel histidine-conjugated galactosylated cationic liposomes for efficient hepatocyte selective gene transfer in human hepatoma HepG2 cells.J. Controlled Release 118, pp 262-270).
  • the amine group or polyhistidine group can be linked with a hydrophilic material or block of hydrophilic material through one or more linkers.
  • an amine group or a polyhistidine group is introduced into the hydrophilic material of the double-stranded oligo RNA structure according to Structural Formula (1) of the present invention, it may have a structure as shown in Structural Formula (7).
  • J 1 and J 2 is a linker
  • J 1 and J 2 are independently a simple covalent bond
  • J 2 is a simple covalent bond or PO 3 ⁇
  • J 1 is C 6 alkyl, but is not limited thereto.
  • J 2 is preferably a simple covalent bond or PO 3 ⁇
  • J 1 is preferably Compound (4) in the formula (9), but is not limited thereto.
  • hydrophilic material of the double-stranded oligo RNA structure according to formula (9) is a hydrophilic substance block according to formula (5) or formula (6), and when an amine group or polyhistidine group is introduced thereto, 10) or structure (11).
  • the hydrophilic substance is preferably in the form bound to the 3 'end of the CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA sense strand, in this case the formulas (9) to (11) may have the form of the following structural formulas (12) to (14).
  • amine groups that can be introduced in the present invention primary to tertiary amine groups may be used, and primary amine groups are particularly preferably used.
  • the introduced amine group may be present as an amine salt, for example the salt of the primary amine group may be present in the form of NH 3+ .
  • polyhistidine groups which can be introduced in the present invention preferably include 3 to 10 histidines, and particularly preferably 5 to 8, most preferably 6 histidines.
  • one or more cysteines may be included.
  • a double-stranded oligo RNA structure comprising CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA according to the present invention and the nanoparticles formed therefrom are provided with a targeting moiety, they efficiently promote delivery to target cells, thereby providing a relatively low concentration. It can also be delivered to target cells to exhibit high target gene expression regulating function and to prevent delivery of non-specific CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA to other organs and cells.
  • the present invention targets the ligands (L), in particular receptor-mediated endocytosis (RME), to the structures according to the above formulas (1) to (4), (7) and (8).
  • L receptor-mediated endocytosis
  • It provides a double-stranded oligo RNA, a structure additionally bound to a ligand having a characteristic of specifically binding to a receptor that promotes cell internalization, for example, a double-stranded oligo RNA structure according to formula (1)
  • the form in which the ligand is bound to has the structure shown in the following structural formula (15).
  • L is the target cell internalization through receptor-mediated endocytosis (RME)
  • RME receptor-mediated endocytosis
  • i is an integer from 1 to 5, preferably an integer from 1 to 3.
  • the ligand in the formula (15) is preferably a target receptor specific antibody, aptamer, peptide having RME properties to enhance the internalization of the target cell specific;
  • folic acid Folate, in general, folate and folic acid are used interchangeably with each other, folic acid in the present invention means folate that is active in the natural state or human body), N-acetyl galactosamine (N-acetyl Galactosamine, NAG Hexamine (hexoamine), glucose (glucose), mannose, and other chemicals such as sugar or carbohydrate (carbohydrate), such as, but is not limited thereto.
  • hydrophilic material A in the formula (15) may be used in the form of a hydrophilic material block according to formula (5) and formula (6).
  • the present invention provides a method for preparing a double-stranded oligo RNA structure comprising the CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA.
  • the process for preparing a double helix oligo RNA construct comprising CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA according to the present invention is, for example,
  • Solid support in the present invention is preferably Controlled Pore Glass (CPG), but is not limited thereto.
  • CPG Controlled Pore Glass
  • Polystyrene, silica gel, cellulose paper, or the like may be used.
  • the diameter is preferably 40 to 180 ⁇ m, and preferably has a pore size of 500 to 3000 ⁇ m.
  • RNA single strand comprising the RNA single strand and the complementary sequence synthesized in step (2) may be a manufacturing method characterized in that used in the form of a phosphate group bonded to the 5 'end.
  • the present invention provides a method for producing a double-stranded oligo RNA structure in which ligand is additionally added to a double-stranded oligo RNA structure comprising CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA of the present invention.
  • the ligand-RNA-polymer structure and the RNA single strand of the complementary sequence are separated and purified, and then the desired ligand-RNA-polymer structure and complement by measuring the molecular weight by MALDI-TOF mass spectrometer. You can check whether the RNA is prepared.
  • Ligand-double-stranded oligo RNA structures can be prepared by annealing RNA single strands of sequences complementary to the prepared ligand-RNA-polymer constructs.
  • the step (4) of synthesizing the RNA single strand of the sequence complementary to the sequence of the RNA single strand synthesized in step (3) is an independent synthesis process before (1) or (1) to ( 6) may be performed during any of the steps.
  • a nanoparticle comprising a double helix oligo RNA construct comprising CTGF, Cyr61 and / or Plekho1 specific siRNA.
  • the double-stranded oligo RNA structure comprising CTGF, Cyr61 or Plekho1-specific siRNA is amphiphilic including both hydrophobic and hydrophilic substances, and the hydrophilic portion includes hydrogen molecules and water bonds in the body. Through interactions, they have affinity and are directed outwards, and hydrophobic materials are directed inwards through hydrophobic interactions between them, forming thermodynamically stable nanoparticles. That is, the hydrophobic material is located in the center of the nanoparticles, and the hydrophilic material is located outward of the CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA to form a nanoparticle that protects the CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA. .
  • the nanoparticles thus formed enhance the intracellular delivery of CTGF, Cyr61 and / or Plekho1 specific siRNAs and improve siRNA efficacy.
  • Nanoparticles according to the invention may be formed of a double helix oligo RNA structure containing siRNA having the same sequence, or may be composed of a double helix oligo RNA structure comprising siRNA having a different sequence
  • siRNAs having different sequences in the present invention may be other target genes, for example, CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNAs, and are interpreted to include cases where the sequences have different target gene specificities.
  • double-stranded oligo RNA constructs comprising other respiratory disease related gene-specific siRNAs in addition to CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNAs may be included in the nanoparticles according to the present invention.
  • the present invention provides a respiratory disease, particularly idiopathic, comprising CTGF, Cyr61 and / or Plekho1 specific siRNA, a double helix oligo RNA construct comprising the same and / or nanoparticles consisting of the double helix oligo RNA construct.
  • a respiratory disease particularly idiopathic, comprising CTGF, Cyr61 and / or Plekho1 specific siRNA, a double helix oligo RNA construct comprising the same and / or nanoparticles consisting of the double helix oligo RNA construct.
  • a respiratory disease particularly idiopathic, comprising CTGF, Cyr61 and / or Plekho1 specific siRNA, a double helix oligo RNA construct comprising the same and / or nanoparticles consisting of the double helix oligo RNA construct.
  • compositions for preventing or treating pulmonary fibrosis and COPD are provided.
  • CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA according to the present invention a double-stranded oligo RNA structure comprising the same and / or a composition comprising nanoparticles consisting of the double-stranded oligo RNA structure as an active ingredient is pulmonary artery remodeling )
  • CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA of the present invention by inhibiting airway remodeling or a composition comprising the same is effective for the prevention or treatment of respiratory diseases.
  • composition for preventing or treating respiratory diseases comprising the double-stranded oligo RNA structure according to the present invention
  • Double helix oligo RNA constructs comprising siRNAs;
  • any one sequence selected from SEQ ID NOs 101-200 and 401-500 preferably SEQ ID NOs 101-110, 124, 153, 166, 187, 197, 409, 410, 415, 417, 418, 420, 422 , 424, 427 and 429, any one selected from the group consisting of SEQ ID NO: 102, 104, 107, 108, 124, 153, 166, 187, 197, 410, 422 and 424
  • a duplex comprising a Cyr61 specific siRNA comprising a sense strand comprising a sequence of any one selected from most preferably, SEQ ID NOs: 124, 153, 187, 197 or 424 and an antisense strand comprising a sequence complementary thereto Helix oligo RNA constructs; or,
  • any one sequence selected from SEQ ID NOs: 201 to 300 and 501 to 600 preferably to SEQ ID NOs: 201 to 210, 212, 218, 221, 223, 504 to 507, 514, 515 and 522 to 525
  • Any one sequence selected from the group consisting of, more preferably, any one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 206 to 209, 212, 218, 221, 223, 507, 515 and 525, most preferably SEQ ID NO: 212 A double-stranded oligo RNA construct comprising a Plekho1 specific siRNA comprising a sense strand comprising a sequence of 218, 221, 223, or 525 and an antisense strand comprising a sequence complementary thereto; May be included.
  • CTGF specific siRNA comprising a sequence of SEQ ID NO: 6 or 8, preferably an antisense strand comprising a siRNA sense strand specific to both human and mouse CTGF according to SEQ ID NO: 6 and a sequence complementary thereto.
  • Double-stranded oligo RNA constructs comprising a CTGF specific siRNA comprising a sequence of SEQ ID NO: 6 or 8, preferably an antisense strand comprising a siRNA sense strand specific to both human and mouse CTGF according to SEQ ID NO: 6 and a sequence complementary thereto.
  • Cyr61 comprising an antisense strand comprising an siRNA sense strand specific to both human and mouse Cyr61 according to SEQ ID NO: 102, 104 or 105, preferably a human and mouse Cyr61 according to SEQ ID NO: 102 and a sequence complementary thereto Double-stranded oligostructures comprising specific siRNAs; or,
  • Plekho1 comprising an antisense strand comprising an siRNA sense strand specific to both human and mouse Plekho1 according to SEQ ID NO: 204, 207 or 208, preferably the human and mouse Plekho1 according to SEQ ID NO: 207 Double-stranded oligostructures comprising specific siRNAs; May be included.
  • the double helix oligo RNA structure comprising the CTGF-specific siRNA may be included in a mixed form.
  • siRNA specific to a respiratory disease related gene other than CTGF, Cry61 or Plekho1, or a double-stranded oligo RNA structure comprising the same may be additionally included in the composition according to the present invention.
  • the double helix oligo RNA construct comprising the CTGF, Cry61 and / or Plekho1 specific siRNA, additionally comprises another respiratory disease associated gene specific siRNA.
  • a composition for preventing or treating a respiratory disease including all of the double-stranded oligo RNA structures synergistic effects may be obtained as in combination therapy.
  • Respiratory diseases that the composition according to the present invention can prevent or treat include idiopathic pulmonary fibrosis, asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), acute bronchitis, allergic rhinitis, antitussive expectoration, acute lower respiratory tract infection (bronchitis and bronchiolitis), sore throat
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • Acute upper respiratory tract infections such as tonsillitis and laryngitis, may be exemplified, but is not limited thereto.
  • any of the nanoparticles included in the composition for preventing or treating respiratory diseases comprising nanoparticles consisting of a double-stranded oligo RNA structure according to the present invention is selected from a double-stranded oligo RNA structure comprising CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA. It may be purely composed of only one structure, or may be composed of a mixture of two or more double-stranded oligo RNA structures including CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA.
  • composition of the present invention may be prepared by including at least one pharmaceutically acceptable carrier in addition to the above-mentioned effective ingredient.
  • Pharmaceutically acceptable carriers must be compatible with the active ingredients of the present invention and include saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these ingredients. It can mix and use, and if needed, other conventional additives, such as antioxidant, buffer, and bacteriostatic agent, can be added.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may be additionally added to formulate injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • it may be preferably formulated according to each disease or component by a suitable method in the art or using a method disclosed in Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA.
  • composition of the present invention can be determined by a person of ordinary skill in the art based on the symptoms and severity of the disease of a typical patient. It may also be formulated in various forms, such as powders, tablets, capsules, solutions, injections, ointments, syrups, and the like, and may also be provided in unit-dose or multi-dose containers, such as sealed ampoules and bottles.
  • composition of the present invention can be administered orally or parenterally.
  • Routes of administration of the compositions according to the invention are not limited to, for example, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intestinal, sublingual Or topical administration is possible. Administration to the lungs via intrabronchial instillation is also possible, particularly for the treatment of respiratory diseases.
  • the dosage of the composition according to the present invention may vary in the range depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method, excretion rate or severity of the disease, etc. of the patient, and is easily available to those skilled in the art. Can decide.
  • the compositions of the present invention can be formulated into suitable formulations using known techniques for clinical administration.
  • the present invention also provides a method for preventing and treating respiratory diseases, in particular idiopathic pulmonary fibrosis and COPD, comprising administering a double-stranded oligo RNA structure according to the present invention, and nanoparticles comprising the same to a patient in need thereof. do.
  • compositions comprising CTGF, Cyr61 or Plekho1 specific siRNA according to the present invention, and double-stranded oligo RNA constructs comprising the same, inhibit the expression of CTGF, Cyr61 or Plekho1 with high efficiency without side effects, thereby respiratory diseases, in particular idiopathic pulmonary fibrosis. It can be used for the treatment of respiratory diseases, especially idiopathic pulmonary fibrosis and COPD.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a nanoparticle consisting of a double helix oligomeric polymer structure according to the present invention.
  • Figure 2 shows the confirmed target gene expression inhibition after transforming the human fibroblast cell line with siRNA having the sequence according to SEQ ID NOS 1 to 10, 101 to 110, 201 to 210 according to the present invention as a sense strand graph
  • A Graph of CTGF expression according to siRNA 5 or 20 nM treatment having the sequence of SEQ ID NO: 1 to 10 as a sense strand
  • A Graph of CTGF expression according to siRNA 0.2 or 1 nM treatment having the sequence number 1, 3, 4, 8, 9 or 10 as a sense strand
  • RNA 4 is a human siRNA having a sense strand having a sequence according to SEQ ID NOs: 35, 42, 59, 602, 603, 604, 124, 153, 166, 187, 197, 212, 218, 221 or 223 according to the present invention.
  • Figure 5 is a graph showing the target gene expression inhibitory amount confirmed after transforming human lung cancer cell lines with SAMiRNA having the sequence according to SEQ ID NO: 42, 59, 602 according to the present invention as a sense strand
  • FIG. 6 is a graph showing the target gene expression inhibition rate confirmed after transforming a mouse fibroblast cell line with siRNA having a sequence of SEQ ID NOs: 301 to 330, 401 to 430, and 501 to 530 as sense strands of the present invention.
  • Target gene expression inhibition graph confirmed after transforming mouse fibroblast cell line with siRNA having a sense strand
  • A Graph of Cyr61 expression according to siRNA 5 nM treatment having a sense strand having a sequence of SEQ ID NOs: 404 to 406, 408 to 410, 414 to 418, 420 to 422, 424, 427, 429, and 430
  • Figure 8 shows the transformation of the mouse fibroblast cell line with siRNA having the sense strand of SEQ ID NO: 301, 303, 307, 323, 410, 422, 424, 507, 515 or 525 of the present invention, and then identified the target gene Expression inhibition graph
  • A Graph of CTGF expression according to 0.2, 1, 5 nM treatment of siRNA having a sequence of SEQ ID NO: 301, 303, 307 or 323 as a sense strand
  • Figure 9 shows the sequence of SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 9, 102, 104, 105, 107, 108, 109, 202, 204, 206 to 209, 307, 424 or 525 of the present invention as a sense strand Graph of confirmed target gene expression inhibition after transforming mouse fibroblast cell line with siRNA
  • A Graph of CTGF expression according to siRNA 5nM treatment having the sequence number 4, 5, 6, 8, 9 or 307 as a sense strand
  • Cyr61 expression graph according to siRNA 5nM treatment having the sequence of SEQ ID NO: 102, 104, 105, 107, 108, 109 or 424 as sense strand
  • Figure 10 is confirmed after transforming the mouse fibroblast cell line with siRNA having the sequence of SEQ ID NO: 6, 8, 102, 104, 105, 204, 207, 208, 307, 424 or 525 in the sense strand of the present invention, Target Gene Expression Inhibition Graph
  • A Graph of CTGF expression according to siRNA 5 or 20 nM treatment having a sequence of SEQ ID NO: 6, 8 or 307 as a sense strand
  • the siRNA for the respiratory disease related gene according to the present invention is a double-stranded structure consisting of a sense strand consisting of 19 nucleotides and an antisense strand complementary thereto.
  • siCONT SEQ ID NO: 601 has a sense strand
  • siRNA having a sequence that does not inhibit the expression of any gene was prepared.
  • the siRNA was prepared by linking phosphodiester bonds forming an RNA backbone structure using ⁇ -cyanoethyl phosphoramidite (Nucleic Acids Research, 12: 4539-4557, 1984). Specifically, using an RNA synthesizer (384 Synthesizer, BIONEER, Korea), a series of processes consisting of deblocking, coupling, oxidation, and capping on a solid support to which nucleotides are attached was repeated to obtain a reaction containing RNA of the desired length.
  • RNA synthesizer 384 Synthesizer, BIONEER, Korea
  • the reaction was isolated and purified by HPLC LC918 (Japan Analytical Industry, Japan) equipped with Daisogel C18 (Daiso, Japan) column and matched with target sequence using MALDI-TOF mass spectrometer (Shimadzu, Japan). Confirmed. Then, the desired double-stranded siRNA (SEQ ID NOS: 1 to 604) was prepared by combining the sense and antisense RNA strands.
  • the double-stranded oligo RNA structure (PEG-SAMiRNA) prepared in the present invention has a structure as shown in the following structural formula (16).
  • S is the sense strand of the siRNA
  • AS is an antisense strand of siRNA
  • PEG is a hydrophilic material
  • polyethylene glycol is a hydrophobic material tetradocosane containing disulfide
  • 5 'and 3' means the orientation of the double helix oligo RNA terminus.
  • the double-stranded oligo RNA of the sense strand in which polyethylene glycol is bound to the 3 'end After synthesis of the hydrophilic material structure, the tetradocoic acid containing disulfide bond was bound to the 5 'end to prepare a sense strand of the desired RNA-polymer structure.
  • the antisense strand to be annealed with the strand, the antisense strand of the sequence complementary to the sense strand was prepared through the reaction mentioned above.
  • RNA single strand and RNA polymer construct synthesized by treating 28% (v / v) ammonia in a 60 ° C. water bath were separated from the CPG, and then deprotected. The protective residue was removed through.
  • RNA single-stranded and RNA-polymerized structures with no protective residues were added in a volume ratio of N-methylpyrrolidon, triethylamine and triethylaminetrihydrofluoride in an oven at 70 ° C. 2 'TBDMS (tert-butuldimethylsilyl) was removed by treatment at a ratio of 10: 3: 4.
  • the reaction was isolated and purified by HPLC LC918 (Japan Analytical Industry, Japan) equipped with Daisogel C18 (Daiso, Japan) column and matched with target sequence using MALDI-TOF mass spectrometer (Shimadzu, Japan). Confirmed. Then, to prepare the respective double-stranded oligo RNA structure, the same amount of the sense strand and the antisense strand were mixed by 1X annealing buffer (30 mM HEPES, 100 mM Potassium acetate, 2 mM magnesium acetate, pH 7.0).
  • Double-stranded oligo RNA construct comprising siRNA having a 525 or 601 sequence as a sense strand (hereinafter referred to as SAMiRNALP-hCTGF, SAMiRNALP-hCyr, SAMiRNALP-hPlek, SAMiRNALP-mCTGF, SAMiRNALP-mCyr, SAMiRNALP-mPlek SAMiRNALP-CONT
  • SAMiRNALP-hCTGF siRNA having a 525 or 601 sequence as a sense strand
  • RNA structure is a hydrophilic substance is a hydrophilic material blocks the PEG rather than - the term [PO 3 - hexaethylene glycol] 4 (hereinafter, 'Mono-HEG-SAMiRNA' , structural formula (17) ) Has the same structure as the following structural formula (17).
  • S is the sense strand of the siRNA
  • AS is an antisense strand of siRNA
  • Hexa Ethylene Glycol 4 is a hydrophilic monomer
  • C 24 is a hydrophobic material tetradocosane containing disulfide
  • 5 'and 3' means the orientation of the end of the double helix oligo RNA sense strand.
  • the structure of the Mono-HEG SAMiRNA according to Structural Formula (17) can be represented by the following Structural Formula (18).
  • the reaction was isolated and purified by HPLC LC918 (Japan Analytical Industry, Japan) equipped with Daisogel C 18 (Daiso, Japan) column and matched with target sequence using MALDI-TOF mass spectrometer (Shimadzu, Japan). It was confirmed. Then, to prepare the respective double-stranded oligo RNA structure, the same amount of the sense strand and the antisense strand were mixed by 1X annealing buffer (30 mM HEPES, 100 mM Potassium acetate, 2 mM magnesium acetate, pH 7.0).
  • Double-stranded oligo RNA constructs comprising siRNA having sense strand 525 or 601 (hereinafter referred to as Mono-HEG-SAMiRNALP-hCTGF, Mono-HEG-SAMiRNALP-hCyr, Mono-HEG-SAMiRNALP-hPlek, Mono- HEG-SAMiRNALP-mCTGF, Mono-HEG-SAMiRNALP-mCyr, Mono-HEG-SAMiRNALP-mPlek, Mono-HEG-SAMiRNALP-CONT). It was confirmed that the prepared double helix oligo RNA structure was annealed through electrophoresis.
  • the double-stranded oligo RNA structure (Mono-HEG-SAMiRNA) prepared in Example 3 forms nanoparticles, that is, micelles by hydrophobic interaction between hydrophobic materials bound to the ends of the double-stranded oligo RNA ( 1).
  • PDI polydispersity index
  • DPBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
  • Nanoparticles consisting of Mono-HEG-SAMiRNA-hCyr, Mono-HEG-SAMiRNA-hPlek, Mono-HEG-SAMiRNA-mCTGF, Mono-HEG-SAMiRNA-mCyr, Mono-HEG-SAMiRNA-mPlek Mono-HEG-SAMiRNA-CONT Also prepared in the same manner.
  • the size of the nanoparticles was measured by zeta-potential measurement.
  • the homogenized nanoparticles prepared in Example 4-1 were sized with a zeta-potentiometer (Nano-ZS, MALVERN, UK), the refractive index of the material (Refractive index) is 1.459, the absorption index is 0.001
  • the temperature of 25 °C and the resulting viscosity (viscosity) of the solvent DPBS 1.0200 and the refractive index was measured by entering a value of 1.335.
  • One measurement consisted of a size measurement consisting of 15 repetitions, which were repeated six times.
  • the nanoparticles of the present invention were found to have a very uniform size.
  • Example 5 Confirmation of expression inhibition of target gene using target gene specific siRNA for human in human fibroblast (MRC-5) cell line.
  • Human fibroblasts which are fibroblast cell lines using siRNA having the sequence number 1 to 10, 101 to 110, 201 to 210 and 601 as sense strands prepared in Example 1 ) was transformed, and the expression pattern of the target gene was analyzed in the transformed fibroblast (MRC-5) cell line.
  • Human fibroblast (MRC-5) cell line obtained from the Korean Cell Line Bank (KCLB) (KCLB) was cultured in RPMI-1640 culture medium (GIBCO / Invitrogen, USA, 10% (v / v) fetal bovine serum, penicillin 100 units / ml and 100 ⁇ g / ml streptomycin) were incubated at 37 ° C. under 5% (v / v) CO 2 .
  • MRC-5 fetal calf serum
  • RPMI 1640 5% (v / v) CO 2
  • Opti-MEM medium GIBCO, USA
  • RNAi Max Lipofectamine TM RNAi Max, Invitrogen, USA
  • Opti-MEM medium 246.5 ⁇ l of Opti-MEM medium
  • 5 or 20 ⁇ l of siRNA (1 pmole / ⁇ l) having the sequences of SEQ ID NOs: 1 to 10, 101 to 10, 201 to 210, and 601 as sense strands was added to 230 ⁇ l of Opti-MEM medium to give a final concentration of 5 or 20 nM.
  • Phosphorous siRNA solution was prepared.
  • the lipofectamine RNAi Max mixture and the siRNA solution were mixed and reacted at room temperature for 15 minutes to prepare a solution for transfection.
  • cDNA was prepared by extracting total RNA from the cell line transfected in Example 5-2, mRNA expression of the target gene was quantified relative to each other using real-time PCR.
  • Example 5-3-1 RNA Isolation and cDNA Preparation from Transfected Cells
  • RNA reverse transcriptase (AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, Korea) the total RNA is extracted from the cell line transfected in Example 5-2, the extracted RNA is RNA reverse transcriptase (AccuPower CycleScript RT Premix / cTNA was prepared by the following method using dT20, Bioneer, Korea). Specifically, 1 ⁇ g of RNA extracted per tube was added to AccuPower CycleScript RT Premix / dT20 (Bioneer, Korea) contained in 0.25 ml Eppendorf tube, and distilled water treated with DEPC (diethyl pyrocarbonate) to have a total volume of 20 ⁇ l. Was added.
  • RNA reverse transcriptase (AccuPower CycleScript RT Premix / cTNA was prepared by the following method using dT20, Bioneer, Korea). Specifically, 1 ⁇ g of RNA extracted per tube was added to AccuPower CycleScript RT Premix / dT20 (Bioneer,
  • RNA and primer hybridize RNA and primer for 1 minute at 30 ° C, and repeat the two steps of preparing cDNA for 6 minutes at 52 ° C, and then at 90 ° C.
  • the amplification reaction was terminated by inactivating the enzyme for 5 minutes.
  • the relative amount of the mRNA associated with respiratory disease was quantified by real-time PCR in the following manner. Dilute the cDNA prepared in Example 5-3-1 with distilled water to each well of a 96-well plate with distilled water 5 times, and 3 ⁇ l of diluted cDNA and 2 ⁇ GreenStar TM PCR master mix 25 ⁇ l of BIONEER, Korea), 19 ⁇ l of distilled water, and 3 ⁇ l of qPCR primer (Table 2; F, R, 10 pmole / ⁇ l; BIONEER, Korea) were prepared.
  • HK gene housekeeping gene
  • RPL13A ribosomal protein L13a
  • HK gene housekeeping gene
  • the 96-well plate containing the mixed solution was subjected to the following reaction using Exicycler TM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block (BIONEER, Korea) as follows: Reaction of enzyme and secondary structure of cDNA were carried out at 95 ° C. for 15 minutes. After elimination, four replicates were performed: 30 seconds denaturing at 94 ° C, 30 seconds annealing at 58 ° C, 30 seconds extension at 72 ° C, and SYBR green scan. The final extension was carried out at 72 ° C.
  • the Ct (threshold cycle) value of each of the obtained target genes was obtained by calculating the Ct value of the target gene corrected through the GAPDH gene, and then siRNA of the control sequence (SEQ ID NO: 601, which does not cause gene expression inhibition). The difference of ⁇ Ct value was calculated using the experimental group treated with siCONT) as a control.
  • Fig. 2.A Relative expression levels of target genes of cells treated with CTGF ( Homo sapiens ) specific siRNA (SEQ ID NOs: 1 to 10 with sense strands) were treated using the ⁇ Ct value and Formula 2 ( ⁇ Ct ) ⁇ 100. Quantification (Fig. 2.A). In addition, relative amounts of expression of target genes of cells treated with Cyr61 ( Homo sapiens ) -specific siRNA (having the sequences of SEQ ID NOs: 101 to 110) as a sense strand were compared (Fig. 2B), and Plekho1 (Homo sapiens) specificity Relative quantification of the expression level of the target gene of the cells treated with the enemy siRNA (SEQ ID NO: 201 to 210 with the sense strand) (Fig. 2C).
  • siRNA of the present invention showed high target gene expression inhibition.
  • the mRNA expression amount of each gene was greatly reduced at 5 nM concentrations of SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 8, 9, 10, 102, 104, 105, 106, 107, 108, SiRNAs with sense strands of sequences 109, 204, 206, 207, 208, 209 and 210 were selected.
  • MRC-5 transforming human fibroblasts
  • Human fibroblast (MRC-5) cell lines obtained from the Korean Cell Line Bank (KCLB, Korea) were cultured under the same conditions as in Example 5-1.
  • 1.8 ⁇ 10 5 fibroblast (MRC-5) cell line cultured in Example 6-1 was incubated in RPMI 1640 for 18 hours in a 6-well plate under conditions of 5% (v / v) CO 2 at 37 ° C. After removing the medium, 500 ⁇ l of Opti-MEM medium (GIBCO, USA) was dispensed for each well.
  • RNAi Max Lipofectamine TM RNAi Max, Invitrogen, USA
  • Opti-MEM medium 246.5 ⁇ l of Opti-MEM medium
  • the lipofectamine RNAi Max mixture and the siRNA solution were mixed and reacted at room temperature for 15 minutes to prepare a solution for transfection.
  • RNA expression amount of the target gene using real-time PCR Relative quantification Observation of the target gene expression inhibition by the low concentration of siRNA was clearly confirmed the efficacy of each siRNA, siRNA having 8, 107 and 206 as the sense strand showed relatively high target gene expression inhibition even at very low concentrations It was confirmed (Fig. 3).
  • Example 7 Confirmation of expression inhibition of target gene using target gene specific siRNA for human in human lung cancer cell line (A549).
  • Example 1 Human lung cancer cell line (A549), which is a lung tumor cell line, was transformed, and the expression patterns of the target genes were analyzed in the transformed lung cancer cell (A549) cell line.
  • Human lung cancer cell (A549) cell lines obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) are DMEM culture medium (GIBCO / Invitrogen, USA, 10% (v / v) fetal bovine serum, penicillin 100 units / ml and streptoto Incubated at 37 ° C., 5% (v / v) CO 2 .
  • ATCC American Type Culture Collection
  • Example 7-1 the 1.2 ⁇ 10 5 cancer cells (A549) cell line was incubated in DMEM for 18 hours in a 6-well plate under conditions of 5% (v / v) CO 2 at 37 ° C., and then the medium was removed. Each well was dispensed with 500 ⁇ l of Opti-MEM medium (GIBCO, USA).
  • RNAi Max (Invitrogen, USA) and 246.5 ⁇ l of Opti-MEM medium were mixed to prepare a mixed solution, reacted for 5 minutes at room temperature, and then prepared in Example 1, respectively.
  • RNA expression amount of the target gene was quantified by real-time PCR.
  • Example 7-3-1 RNA Isolation and cDNA Preparation from Transfected Cells
  • RNA reverse transcriptase (AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, Korea) the total RNA is extracted from the cell line transfected in Example 5-2, the extracted RNA is RNA reverse transcriptase (AccuPower CycleScript RT Premix / cTNA was prepared by the following method using dT20, Bioneer, Korea). Specifically, 1 ⁇ g of RNA extracted per tube was added to AccuPower CycleScript RT Premix / dT20 (Bioneer, Korea) contained in 0.25 ml Eppendorf tube, and distilled water treated with DEPC (diethyl pyrocarbonate) to have a total volume of 20 ⁇ l. Was added.
  • RNA reverse transcriptase (AccuPower CycleScript RT Premix / cTNA was prepared by the following method using dT20, Bioneer, Korea). Specifically, 1 ⁇ g of RNA extracted per tube was added to AccuPower CycleScript RT Premix / dT20 (Bioneer,
  • RNA and primer hybridize RNA and primer for 1 minute at 30 ° C, and repeat the two steps of preparing cDNA for 6 minutes at 52 ° C, and then at 90 ° C.
  • the amplification reaction was terminated by inactivating the enzyme for 5 minutes.
  • the relative amount of respiratory disease-associated gene mRNA was quantified by real-time PCR in the following manner. Dilute the cDNA prepared in Example 6-3-1 with distilled water five times in each well of a 96-well plate, and 3 ⁇ l of the diluted cDNA and 2 ⁇ GreenStar TM PCR master mix for analysis of target gene mRNA levels. 25 ⁇ l of BIONEER, Korea), 19 ⁇ l of distilled water, and 3 ⁇ l of qPCR primer (Table 2; F, R, 10 pmole / ⁇ l; BIONEER, Korea) were prepared.
  • HK gene housekeeping gene
  • RPL13A ribosomal protein L13a
  • HK gene housekeeping gene
  • the 96-well plate containing the mixed solution was subjected to the following reaction using Exicycler TM 96 Real-Time Quantitative Thermal Block (BIONEER, Korea) as follows: Reaction of enzyme and secondary structure of cDNA were carried out at 95 ° C. for 15 minutes. After elimination, four replicates were performed: 30 seconds denaturing at 94 ° C, 30 seconds annealing at 58 ° C, 30 seconds extension at 72 ° C, and SYBR green scan. The final extension was carried out at 72 ° C.
  • the obtained Ct (threshold cycle) value of each target gene is obtained by measuring the Ct value of the target gene corrected through the GAPDH gene, and then siRNA of the control sequence that does not cause gene expression inhibition (SEQ ID NO: 601, The difference of ⁇ Ct value was calculated using the experimental group treated with siCONT) as a control.
  • siRNA of the present invention showed high target gene expression inhibition. Further, in order to select high efficiency siRNAs, mRNA expressions for each gene were greatly reduced at 5Nm and 5nM concentrations, SEQ ID NOs: 42, 59, 602, 124, 153, 187, 197, 212, 218, 221 and 223 SiRNAs were selected with the sense strand as the sequence.
  • the particles were transformed into human lung cancer cells (A549) and analyzed for expression of target genes in the transformed lung cancer cells (A549) cell line.
  • Human lung cancer (A549) cell lines obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) were cultured under the same conditions as in Example 7-1.
  • the 1.2 ⁇ 10 5 cancer cell (A549) cell line cultured in Example 8-1 was incubated in RPMI 1640 for 18 hours in a 12-well plate under conditions of 5% (v / v) CO 2 at 37 ° C., After removing the medium, an equal amount of Opti-MEM medium (GIBCO, USA) was dispensed per well. 100 ⁇ l of Opti-MEM medium and SAMiRNALP and monoSAMiRNALP prepared in Example 4-2 were added to DPBS at a concentration of 50 ⁇ g / ml, and the result was 48 hours at ⁇ 75 ° C. and 5 mTorr conditions in the same manner as in Example 5-1. Lyophilization during to prepare uniform nanoparticles.
  • RNA expression amount of the target gene using real-time PCR Relative quantification Observation of the target gene expression by the low concentration of siRNA was able to clearly confirm the efficacy of each siRNA, siRNA having 42, 59 and 602 as the sense strand showed relatively high target gene expression inhibition even at very low concentration It was confirmed that (Fig. 5).
  • Mouse fibroblasts which is a fibroblast cell line, using siRNAs having the sense strands of SEQ ID NOs: 301 to 330, 401 to 430, 501 to 530, and 601 prepared in Example 1 as strands After the transformation, the expression patterns of the target genes were analyzed in the transformed fibroblast (NIH3T3) cell line.
  • Mouse fibroblast (NIH3T3) cell line obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) was prepared using RPMI-1640 culture medium (GIBCO / Invitrogen, USA, 10% (v / v) fetal bovine serum, penicillin 100 units / ml And 100 ⁇ g / ml) of streptomycin at 37 ° C. under 5% (v / v) CO 2 .
  • fibroblast (NIH3T3) cell line cultured in Example 9-1 was incubated in RPMI 1640 for 18 hours in a 12-well plate under conditions of 5% (v / v) CO 2 at 37 ° C., After removing the medium, 500 ⁇ l of Opti-MEM medium (GIBCO, USA) was dispensed for each well.
  • RNAi Max Lipofectamine TM RNAi Max, Invitrogen, USA
  • Opti-MEM medium 248.5 ⁇ l of Opti-MEM medium
  • 5 or 20 ⁇ l of siRNA (1 pmole / ⁇ l) having the sequences of SEQ ID NOs: 301 to 330, 401 to 430, 501 to 530 and 601 as sense strands was added to 230 ⁇ l of Opti-MEM medium to give a final concentration of 5 or
  • a siRNA solution of 20 nM was prepared.
  • the lipofectamine RNAi Max (Lipofectamine TM RNAi Max) mixture and the siRNA solution were mixed and reacted for 20 minutes at room temperature to prepare a solution for transfection.
  • the expression levels of target genes of cells treated with CTGF ( Mus musculus ) -specific siRNA were relatively quantified (FIG. 6A).
  • the relative amount of expression of the target gene of the cells treated with Cyr61 ( Mus musculus ) specific siRNA was relatively quantified (FIG. 6B)
  • Plekho1 ( Mus musculus ) specificity was relative quantitative (Fig. 6C).
  • siRNA of the present invention showed high target gene expression inhibition.
  • SiRNA having the sense strand was selected, and the sequence of SEQ ID Nos. 409, 410, 415, 417, 418, 420, 422, 424, 427 or 429 was reduced in the amount of mRNA expression for Cyr61 ( Mus musculus ).
  • SiRNA was selected, and the sense strand containing the sequence of SEQ ID NOs 504, 505, 506, 507, 514, 515, 522, 523, 524, or 525 with a high decrease in mRNA expression for Plekho1 ( Mus musculus ) siRNA was selected.
  • siRNA having a sense strand having a sequence of SEQ ID NO: 301, 303, 307, or 323 with a high reduction in mRNA expression for CTGF ( Mus musculus ) at 5 nM concentration was selected to select siRNAs having more desirable efficiency.
  • Plekho1 (Mus musculus) mRNA expression amount is decreased higher sequence number for the SiRNAs with the sense strand of sequence 507, 515 or 525 were selected (FIG. 7).
  • the high efficiency siRNA was selected by analyzing the expression pattern of the target gene in.
  • NIH3T3 Mouse fibroblast (NIH3T3) cell lines obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) were cultured under the same conditions as in Example 9-1.
  • Example 10-1 1 ⁇ 10 5 fibroblasts (NIH3T3) cell line cultured in Example 10-1 was incubated in RPMI 1640 for 18 hours in a 12-well plate under conditions of 5% (v / v) CO 2 at 37 ° C., After removing the medium, 500 ⁇ l of Opti-MEM medium (GIBCO, USA) was dispensed for each well.
  • Opti-MEM medium GIBCO, USA
  • RNAi Max Lipofectamine TM RNAi Max, Invitrogen, USA
  • Opti-MEM medium 248.5 ⁇ l of Opti-MEM medium
  • SiRNA solutions having a final concentration of 0.2, 1 or 5 nM were prepared.
  • the lipofectamine RNAi Max (Lipofectamine TM RNAi Max) mixture and the siRNA solution were mixed and reacted for 20 minutes at room temperature to prepare a solution for transfection.
  • siRNAs having the sense strands of SEQ ID NOs: 307, 424, and 525 as the sense strands had relatively high target gene expression inhibition even at very low concentrations. It was confirmed that the effect was maintained and was selected as a high efficiency siRNA.
  • the site of action of the bionew drug is mainly species-specific such as protein structure or gene sequence
  • the identity of the therapeutic drug is very important for securing efficiency in the bionew drug development process.
  • Gene sequence homology between the target gene-specific siRNA and the mouse target gene for humans designed in Example 1 was selected to determine siRNA sequences to confirm target gene expression inhibition effects in mouse fibroblasts.
  • the selected siRNA sequence is SEQ ID NO: 4, 5, 6 8 9, 102, 104, 105, 107, 108, 109, 202, 204, 206, 207 which is a target gene specific siRNA for humans prepared in Example 1 above.
  • the expression patterns of target genes were analyzed in mouse fibroblast (NIH3T3) cell line, which is a fibroblast cell line, to confirm the efficacy in mouse cells of siRNAs designed based on human genes.
  • NIH3T3 Mouse fibroblast (NIH3T3) cell lines obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) were cultured under the same conditions as in Example 9-1.
  • the 1.8 ⁇ 10 5 fibroblast (NIH3T3) cell line cultured in Example 11-1 was incubated in RPMI 1640 for 18 hours in a 6-well plate under conditions of 5% (v / v) CO 2 at 37 ° C., After removing the medium, 500 ⁇ l of Opti-MEM medium (GIBCO, USA) was dispensed for each well.
  • RNAi Max Lipofectamine TM RNAi Max, Invitrogen, USA
  • Opti-MEM medium 246.5 ⁇ l of Opti-MEM medium
  • the lipofectamine RNAi Max mixture and the siRNA solution were mixed and reacted at room temperature for 15 minutes to prepare a solution for transfection.
  • mRNA expression amount of the target gene using real-time PCR (real-time PCR) Relative quantification Relative quantitative expression of target gene expression in cells treated with CTGF ( Mus musculus ) specific siRNA (SEQ ID NO: 307) or CTGF ( Homo sapiens ) specific siRNA (SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, or 9) (FIG. 9A).
  • Cyr61 ( Mus musculus ) specific siRNA (SEQ ID NO: 424 has a sense strand) or Cyr61 ( Homo sapiens ) specific siRNA (SEQ ID NO: 102, 104, 105, 107, 108 or 109 sequences Expression level of the target gene of the treated cells (Fig. 9B), Plekho1 ( Mus musculus ) specific siRNA (SEQ ID NO: 525 has a sense strand) or Plekho1 ( Homo sapiens ) specific Relative quantification of the expression levels of target genes in cells treated with siRNA (SEQ ID NO: 202, 204, 206, 207, 208 or 209 with sense strands) was performed (FIG. 9C).
  • the target gene-specific siRNAs for each human inhibited the expression of the target gene according to sequence homology, and SEQ ID NOs: 6, 8, 102, 104, 105, 204, 207, and 208
  • the siRNA having the sense strand as the sequence showed relatively high target gene expression inhibition at 20 nM.
  • the siRNAs of 6, 102 and 207 were found to have an IC50 (inhibition concentration 50%) of less than 20 nM even in mouse cell lines.
  • IC50 inhibition concentration 50%

Abstract

본 발명은 호흡기 질환, 특히 특발성폐섬유화증 및 만성폐쇄성폐질환(COPD) 연관 유전자 특이적 siRNA 및 이를 포함하는 고효율 이중나선 올리고 RNA 구조체에 관한 것으로, 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체는 세포 내로 효율적으로 전달되도록 하기 위하여 이중나선 RNA(siRNA)의 양 말단에 친수성 물질 및 소수성 물질을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합을 이용하여 접합된 형태의 구조를 가지며, 수용액에서 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체들의 소수성 상호작용에 의해 나노입자 형태로 전환될 수 있다. 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체에 포함된 siRNA는 호흡기 질환, 특히 특발성폐섬유화증 및 COPD 연관 유전자인 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA인 것이 바람직하다. 또한 본 발명은 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조방법 및 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 호흡기 질환, 특히 특발성폐섬유화증 및 COPD를 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

호흡기 질환 연관 유전자 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이를 포함하는 호흡기 질환 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 호흡기 질환 연관 유전자 특이적 siRNA 및 이를 포함하는 고효율 이중나선 올리고 RNA 구조체에 관한 것으로, 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체는 세포 내로 효율적으로 전달되도록 하기 위하여 이중나선 RNA(siRNA)의 양 말단에 친수성 물질 및 소수성 물질을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합을 이용하여 접합된 형태의 구조를 가지며, 수용액에서 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체들의 소수성 상호작용에 의해 나노입자 형태로 전환될 수 있다. 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체에 포함된 siRNA는 호흡기 질환, 특히 특발성폐섬유화증 및 만성폐쇄성폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, 이하 ‘COPD’라고 함) 연관 유전자, 특히 CTGF, Cyr61 또는 Plekho-1 특이적인 siRNA인 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조방법 및 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 호흡기 질환, 특히 특발성폐섬유화증 및 COPD를 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.
발명의 배경이 되는 기술
유전자의 발현을 억제하는 기술은 질병치료를 위한 치료제 개발 및 표적 검증에서 중요한 도구이다. 이 기술 중, 간섭 RNA(RNA interference, 이하 ‘RNAi’라고 한다)는 그 역할이 발견된 이후로, 다양한 종류의 포유동물 세포(mammalian cell)에서 서열 특이적 mRNA에 작용한다는 사실이 밝혀졌다 (Silence of the transcripts: RNA interference in medicine. J Mol Med (2005) 83: 764-773). 긴 사슬의 RNA 이중가닥이 세포로 전달되면, 전달된 RNA 이중가닥은 Dicer라는 엔도뉴클라아제(endonuclease)에 의하여 21 내지 23개의 이중가닥(base pair, bp)으로 프로세싱된 짧은 간섭 RNA (small interfering RNA, 이하 ‘siRNA’라고 한다)로 변환되며, siRNA는 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합하여 가이드(안티센스) 가닥이 타겟 mRNA를 인식하여 분해하는 과정을 통해 타겟 유전자의 발현을 서열 특이적으로 저해한다 (NUCLEIC-ACID THERAPEUTICS: BASIC PRINCIPLES AND RECENT APPLICATIONS. Nature Reviews Drug Discovery. 2002. 1, 503-514).
베르트랑(Bertrand) 연구진에 따르면 동일한 타겟 유전자에 대한 siRNA 가 안티센스 올리고뉴클레오티드(Antisense oligonucleotide, ASO)에 비하여 생체 내/외(in vitro 및 in vivo)에서 mRNA 발현의 저해효과가 뛰어나고, 해당 효과가 오랫동안 지속되는 효과를 가지는 것으로 밝혀졌다(Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem. Biophys. Res.Commun. 2002. 296: 1000-1004). 또한 siRNA의 작용 기작은 타겟 mRNA와 상보적으로 결합하여 서열 특이적으로 타겟 유전자의 발현을 조절하기 때문에, 기존의 항체 기반 의약품이나 화학물질 의약품(small molecule drug)에 비하여 적용할 수 있는 대상이 획기적으로 확대될 수 있다는 장점을 가진다(Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 2006 13(4):664-670).
siRNA의 뛰어난 효과 및 다양한 사용범위에도 불구하고, siRNA가 치료제로 개발되기 위해서는 체내에서의 siRNA의 안정성(stability) 개선과 세포 전달 효율 개선을 통해 siRNA가 타겟 세포에 효과적으로 전달되어야 한다(Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development. Drug Discov Today. 2006 Jan; 11(1-2):67-73).
상기 문제를 해결하기 위하여, 체내 안정성 개선을 위하여 siRNA의 일부 뉴클레오티드 또는 골격(backbone)을 핵산분해효소 저항성을 가지도록 변형(modification)하거나 바이러스성 벡터(viral vector), 리포좀 또는 나노입자(nanoparticle) 등의 전달체의 이용 등에 대한 연구가 활발하게 시도되고 있다.
아데노바이러스나 레트로바이러스 등의 바이러스성 벡터를 이용한 전달 시스템은 형질주입 효율(transfection efficacy)이 높지만, 면역원성(immunogenicity) 및 발암성(oncogenicity)이 높다. 반면에 나노입자를 포함하는 비바이러스성(non-viral) 전달 시스템은 바이러스성 전달 시스템에 비하여 세포전달효율은 낮은 편이지만, 생체 내(in vivo)에서의 안정성(stability)이 높고, 타겟 특이적으로 전달이 가능하며, 내포되어 있는 RNAi 올리고뉴클레오타이드를 세포 또는 조직으로 흡수(uptake) 및 내재화(internalization) 등의 개선된 전달 효과가 높을 뿐 아니라, 세포독성 및 면역 유발(immune stimulation)이 거의 없다는 장점을 가지고 있어, 현재는 바이러스성 전달 시스템에 비해 유력한 전달방법으로 평가되어지고 있다 (Nonviral delivery of synthetic siRNA s in vivo. J Clin Invest. 2007 December 3; 117(12): 3623-3632).
상기 비바이러스성 전달 시스템 중에서 나노전달체(nanocarrier)를 이용하는 방법은 리포좀, 양이온 고분자 복합체 등의 다양한 고분자를 사용함으로써 나노입자를 형성하고, siRNA를 이러한 나노입자(nanoparticle), 즉 나노전달체(nanocarrier)에 담지하여 세포에 전달하는 형태를 가진다. 나노전달체를 이용하는 방법 중 주로 활용되는 방법은 고분자 나노입자(polymeric nanoparticle), 고분자 미셀(polymer micelle), 리포플렉스(lipoplex) 등이 있는데, 이 중에서 리포플렉스를 이용한 방법은 양이온성 지질로 구성되어 세포의 엔도좀(endosome)의 음이온성 지질과 상호작용하여 엔도좀의 탈 안정화 효과를 유발하여 세포 내로 전달하는 역할을 한다(Proc. Natl. Acad. Sci. 15; 93(21):11493-8, 1996).
또한, siRNA 패신저(passenger; 센스(sense)) 가닥의 말단 부위에 화학물질 등을 연결하여 증진된 약동력학(pharmacokinetics)적 특징을 갖도록 하여 생체 내(in vivo)에서 높은 효율을 유도할 수 있다는 것이 알려져 있다(Nature 11; 432(7014):173-8, 2004). 이 때 siRNA 센스(sense; 패신저(passenger)) 또는 안티센스(antisence; 가이드(guide)) 가닥의 말단에 결합된 화학 물질의 성질에 따라 siRNA 의 안정성이 달라진다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 같은 고분자 화합물이 접합된 형태의 siRNA는 양이온성 물질이 존재하는 조건에서 siRNA의 음이온성 인산기와 상호작용하여 복합체를 형성함으로써, 개선된 siRNA 안정성을 가진 전달체가 된다(J. Control Release 129(2):107-16, 2008). 특히 고분자 복합체로 구성된 미셀(micelle)들은 약물 전달 운반체로 쓰이는 다른 시스템인, 미소구체(microsphere) 또는 나노입자(nanoparticle) 등에 비해 그 크기가 극히 작으면서도 분포가 매우 일정하고, 자발적으로 형성되는 구조이므로 제제의 품질 관리 및 재현성 확보가 용이하다는 장점이 있다.
또한, siRNA의 세포 내 전달 효율성을 향상시키기 위해, siRNA 에 생체 적합성 고분자인 친수성 물질(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG))을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합으로 접합시킨 siRNA 접합체를 통해, siRNA 의 안정성 확보 및 효율적인 세포막 투과성을 위한 기술이 개발되었다(대한민국 등록특허 제883471호). 하지만 siRNA의 화학적 변형 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 접합시키는 것(PEGylation)만으로는 생체 내에서의 낮은 안정성과 타깃 장기로의 전달이 원활하지 못하다는 단점은 여전히 가진다. 이러한 단점을 해결하기 위하여 올리고뉴클레오티드, 특히 siRNA와 같은 이중나선 올리고 RNA에 친수성 및 소수성 물질이 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체가 개발되었는데, 상기 구조체는 소수성 물질의 소수성 상호작용에 의하여 SAMiRNA™(self assembled micelle inhibitory RNA) 라고 명명된 자가조립 나노입자를 형성하게 되는데(대한민국 등록 특허 제1224828호), SAMiRNA™ 기술은 기존의 전달기술들에 비해 매우 사이즈가 작으면서도 균일한(homogenous) 나노입자를 수득할 수 있다는 장점을 가진다.
SAMiRNA™ 기술의 구체적인 예로서, 친수성 물질로서 PEG(polyethylene glycol)가 사용되는데, PEG는 합성폴리머(synthetic polymer)로 흔히 의약품 특히 단백질의 수용성(solubility) 증가 및 약물동태학(pharmacokinetics)의 조절을 위해 사용된다. PEG는 다분산계(polydisperse) 물질로, 한 배치(batch)의 폴리머는 다른 개수의 단량체(monomer)의 총 합으로 이루어져 분자량이 가우스곡선 형태를 나타내며, 다분산지수(polydisperse value, Mw/Mn)로 물질의 동질성 정도를 표현한다. 즉, PEG가 낮은 분자량(3~5kDa)일 때 약 1.01의 다분산지수를 나타내며 높은 분자량(20 kDa)일 때 약 1.2라는 높은 다분산지수를 나타내어, 높은 분자량일수록 물질의 동질성이 상대적으로 낮은 특징을 보인다 (F. M. Veronese. Peptide and protein PEGylation: a review of problems and solutions. Biomaterials (2001) 22:405-417). 따라서, PEG를 의약품에 결합시킨 경우 접합체에 PEG의 다분산적 특징이 반영되어 단일물질의 검증이 쉽지 않다는 단점이 있어 PEG의 합성 및 정제과정의 개선을 통해 낮은 다분산지수를 가지는 물질을 생산하는 추세이지만, 특히 분자량이 작은 물질에 PEG를 결합시킨 경우 결합이 용이하게 이루어졌는지 확인이 용이하지 않은 불편한 점이 있는 등 물질의 다분산성 특징에 따른 문제점 들이 존재한다. (Francesco M. Veronese and Gianfranco Pasut. PEGylation, successful approach to drug delivery. DRUG DISCOVERY TODAY(2005) 10(21):1451-1458).
이에 따라 최근에는 기존 자가조립 나노입자인 SAMiRNA™ 기술의 개량된 형태로, SAMiRNA™ 를 구성하는 이중나선 RNA 구조체의 친수성 물질을 일정한 분자량을 갖는 균일한 1~15 개의 단량체(monomer)와 필요에 따라 링커(linker)를 포함하는 기본단위를 블록(block)화 하여, 이를 필요에 따라 적절한 개수를 사용함으로써, 기존의 SAMiRNA™ 에 비해 보다 작은 크기를 가지며 또한 다분산성이 획기적으로 개선된 새로운 형태의 전달체 기술이 개발되었다..
한편, 바이오 신약은 목표 유전자 서열 또는 단백질 구조 특이적으로 작용하기 때문에, 비임상 대리모델(surrogate model)에서 효능 및 안전성을 평가하기 위해서는 대리 모델의 종(species)에서도 인간에서의 해당 바이오 신약과 동일한 메커니즘(mechanism)으로 작용하는 물질이 추가로 요구된다. 따라서, 추가적으로 인간에서와 동일한 메커니즘을 포함하는 물질을 발굴하는 어려움을 피하기 위해서 치료대상인 인간과 비임상 대리모델인 마우스에서 동일한 메커니즘으로 작용할 수 있는 물질을 개발하는 것이 필요하다.
특발성 폐섬유화증(Idiopathic Pulmonary Fibrosis, 이하 ‘IPF'라고 함)은 폐포(허파꽈리) 벽에 만성염증 세포들이 침투하면서 폐를 딱딱하게 하는 여러 변화가 발생하면서 폐조직의 심한 구조적 변화를 야기하며 점차 폐기능 저하되어 결국에는 사망하게 되는 질환으로, 아직까지는 효과적인 치료방법이 없어 대개 증상이 나타나서 진단을 하게 되면 중앙 생존기간이 3~5년 정도밖에 안되는 아주 예후가 나쁜 질병이다. 발생빈도는 외국의 경우 인구 10만명 당 약 3-5명 정도로 보고되고 있으며 대개 50대 이후에 발병율이 높고 남자가 여자보다 2배 가량 발생율이 높은 것으로 알려져 있다.
IPF의 발명원인은 아직 명확하게 규명되지는 않았는데, 흡연자에서 빈도가 높고, 항우울제, 위-식도역류에 의한 만성적 폐 흡입, 금속분진, 목재분진, 또는 용매제 흡입 등이 IPF의 발생과 연관이 있는 위험인자들로 보고된 바 있으나, 대부분의 환자들에서는 확실한 인과관계가 있는 인자들을 찾을 수 없다.
IPF는 치료를 하지 않았을 때 계속적으로 악화되어 환자의 약 50%이상이 3-5년 내에 사망한다고 알려져 있고, 또 일단 병이 진행되어 완전히 섬유화로 굳어진 다음에는 어떤 치료를 하더라도 호전이 되지 않기 때문에 치료를 한다면 조기에 치료할 경우에 효과가 있을 가능성이 높을 것으로 예측하고 있다. 현재 사용되고 있는 치료제로는 스테로이드(steroid)와 아자티오프린(azathioprine), 또는 사이클로포스마이드(cyclophosphamide)의 병합요법을 사용하는 방법이 알려져는 있지만, 특별한 효과를 보인다고 보기는 어려우며, 여러 가지 섬유화 억제제들이 동물실험 및 소규모의 환자들에서 시도되었으나 뚜렷한 효과가 입증된 것이 없는 상태이다. 특히, 말기 IPF 환자에서는 폐이식 외에 다른 효과적인 치료 방법이 없는 실정이다. 따라서, 보다 효율적인 IPF의 치료제 개발이 절실한 상황이다.
한편, 천식과 함께 대표적인 폐질환의 하나인 COPD는 비가역적인 기도의 폐색을 동반한다는 점에서 천식과 다르며 반복되는 감염, 유해한 입자나 가스의 흡입이나 흡연에 의해 발생하는 폐의 비정상적인 염증반응과 이와 동반하여 완전히 가역적이지 않으며 점차 진행하는 기류제한을 보이는 호흡기 질환이다(Pauwels et al, Am J Respir Crit Care Med, 163:1256-1276, 2001). COPD는 기도 및 폐실질 염증에 의한 세기관지 및 폐실질의 병리학적 변화에 의해 발생하는 병으로, 폐쇄성 세기관지염 및 폐기종(폐실질 파괴)을 특징으로 한다. COPD의 종류에는 만성폐쇄성기관지염(Chronic obstructive bronchitis), 만성세기관지염(Chronic bronchiolitis) 및 폐기종(Emphysema)이 있다. COPD의 경우 호중구의 수가 증가하며, GM-CSF, TNF-α, IL-8, MIP-2와 같은 사이토카인의 분비가 증가된다. 또한, 기도에 염증이 생기고, 근육 벽이 두꺼워지며, 점액 분비가 증가하여 기관지 폐쇄가 나타난다. 기관지가 폐쇄되면 폐포는 확장되고 손상되어 산소와 이산화탄소의 교환능력이 손상을 받게 되고, 호흡부전발생이 높아진다.
전세계적으로 COPD의 심각성이 부각되고 있는데 이는 COPD가 1990년 질환으로 인한 사망 원인 중 6위였으나 2020년에는 3위가 될 것이라 예측되고 있으며, 10대 질환 중 유일하게 그 발병률이 증가하는 질환이기 때문이다. COPD는 유병률이 높고, 호흡장애를 초래하며, COPD의 진단과 치료에 필요한 직접 의료비가 많이 발생할 뿐만 아니라, 호흡곤란장애 발생이나 휴직으로 발생되는 손실이나 조기 사망에 따른 손실 등의 간접의료비도 상당하기 때문에, 전세계적으로도 사회-경제적인 문제가 되고 있다(만성폐쇄성폐질환(COPD)진료지침. 2005. 만성기도폐쇄성질환 임상연구센터. p.30-31).
현존하는 어떤 치료약제도 COPD의 특징인 장기적 폐기능 감소를 완화시킨다고 확인된 바는 없다. 그러므로 COPD에서 약물요법은 주로 증상 혹은 합병증을 감소시키는 목적으로 사용한다. 이 중 기관지확장제는 대표적인 COPD 대증요법 치료제이고, 항염증제나 부신피질호르몬 등이 주로 처방되지만 그 효과가 미미하고 적용범위가 협소하며 부작용 발생 우려가 크다. 그 밖의 약물로는 인플루엔자 백신만이 COPD 환자에서 심각한 병증과 사망을 약 50%까지 감소시킬 수 있는 것으로 알려져 있다 (만성폐쇄성폐질환(COPD) 진료지침. 2005. 만성기도폐쇄성질환 임상연구센터. p.52-58).
한편, 많은 유전적 인자가 개인의 COPD 발생 위험을 증가(혹은 감소)시킨다고 추정된다. 현재까지 증명된 유전적인 위험 인자로는 α1-antitrypsin의 유전적 결핍이 있다. 흡연이 COPD 발병위험을 상당히 증가시키지만, 어린 연령에서 빠르게 진행하는 전소엽기종(panlobular emphysema)의 발생과 폐기능 감소는 심한 유전적 결핍을 보이는 흡연자와 비흡연자 모두에게서 나타난다. α1-antitrypsin 유전자 외에 COPD 병인과 관계된다고 확인된 다른 유전자는 아직 없지만, COPD 환자들에서 나타나는 기본적인 세포적, 분자적 그리고 유전자적인 비 정상적인 상태에 대한 연구를 통해 질병의 바이오마커(biomarker)를 식별하여 진단에 활용하거나, 새로운 치료방법 발굴에 활용하기 위한 시도가 진행 중이다(P.J. Barnes and R.A. Stockely. COPD: current therapeutic interventions and future approaches. Eur Respir J. (2005) 25:1084-1106). 특히 유전자 마이크로어레이(gene microarray)나 프로테오믹스(proteomics) 등의 방법을 통해 COPD의 진단 및 치료 타겟을 선정하는 연구가 활발하게 진행되고 있는데, COPD 민감성(susceptibility)을 갖게 하는 유전인자 분석 및 흡연으로 유발되는 COPD 증상의 악화의 원인에 대한 분석이 주로 이루어지고 있다(Peter J. Castaldi et al. The COPD genetic association compendium. Human Molecular Genetics, 2010, Vol. 19, No. 3 526-534).
CTGF(connective tissue growth factor; CCN2)는 CCN family에 속한 matricellular 단백질 중 하나로, 세포 결합(cell adhesion), 이동(migration), 증식(proliferation), 혈관형성(angiogenesis), 상처 회복(wound repair) 등의 다양한 생물학적 과정(biological processes)에 관여하는 것으로 알려진 분비 사이토카인으로, CTGF의 과발현은 공피증(scleroderma), 섬유증(fibrotic disease) 및 흉터형성과 같은 증상의 주요 원인으로 여겨진다(Brigstock DR. Connective tissue growth factor (CCN2, CTGF) and organ fibrosis: lessons from transgenic animals. J Cell Commun Signal (2010) 4 (1): 1-4). 특히 섬유증과 관련하여 CTGF는 TGF-β (Transforming growth factor-β)와 함께 만성 섬유증(sustained fibrosis)를 유발하거나 섬유 형성을 유발하는 조건에서 ECM(extracelluar matrix) 생산을 촉진시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 근래에 CTGF의 발현을 저해하거나, 작용을 억제하는 시료나 물질을 처리함으로써 비 정상적인 CTGF의 발현으로 인한 시각장애(ocular disorders)나 근위축증(Muscular Dystrophy)을 치료할 수 있다고 알려져 있지만, 호흡기 질환과의 관련성은 제시된 바가 없다 (미국 등록특허 번호 제 7622454호, 미국 공개특허 번호 제20120164151 호).
CYR61(Cysteine-rich angiogenic inducer 61) 또한 CCN family에 속한 ECM(extracelluar matrix) 연관 신호 단백질(signaling protein)로, 세포 결합(cell adhesion), 이동(migration), 증식(proliferation), 분화(differentiation), 세포자살(apoptosis) 등의 다양한 세포활동(cellular activities)을 조절하는 것으로 알려져 있다. 정제된 CYR61은 fibronectin과 유사한 방식으로 내피세포(endothelial cells)의 부착(attachment)과 확산(spreading)을 촉진하고, mitogenic activity는 없지만 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor)의 mitogen 효과를 강화하는 작용을 한다(MARIA L. KIREEVA et al. Cyr61, a Product of a Growth Factor-Inducible Immediate-Early Gene, Promotes Cell Proliferation, Migration, and Adhesion. MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Apr. 1996, p. 1326-1334).
Plekho1(Pleckstrin homology domain-containing family O member 1)은 plasma 막(membrane)이나 핵(nucleus)에 존재하며 단백질 인산화효소(protein kinase) CK2α1(Casein kinase 2, alpha 1)의 비효소적 조절인자(non-enzymatic regulator)로 작용하며, Caspase 3에 의해 분해되었을 때 생성된 C-말단조각이 AP-1 작용을 억제함으로써 세포자살(Apoptosis)에 관여하는 것으로 보고되어 있다(Denis G. Bosc et al. Identification and Characterization of CKIP-1, a Novel Pleckstrin Homology Domain-containing Protein That Interacts with Protein Kinase CK2. The Journal of Biological Chemistry(2000) 275, 14295-14306; Lingqiang Zhang et al. Role for the pleckstrin homology domaincontaining protein CKIP-1 in AP-1 regulation and apoptosis. The EMBO Journal (2005) 24, 766-778).
상기 살핀 바와 같이 호흡기 질환, 특히 특발성폐섬유화증 및 COPD의 유병율이 높아지고 있는 상황이지만, 아직 근본적으로 특발성폐섬유화증 및 COPD를 예방 및 치료할 수 있는 효과를 가지는 치료제는 없는 상황이다. 따라서, 부작용 없이 높은 예방 및 치료효과를 포함하는 특발성폐섬유화증 및 COPD 치료제에 대한 시장의 수요는 매우 큰 상황이다.
발명의 내용
해결하고자 하는 과제
본 발명의 목적은 상기와 같은 문제점을 해결하고자, CTGF, Cyr61 또는 Plekho1에 특이적이면서 매우 높은 효율로 그 발현을 저해할 수 있는 신규 siRNA 및 이를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체, 그리고 그러한 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1특이적인 siRNA 또는 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체를 유효성분으로 포함하는 호흡기 질환, 특히 특발성폐섬유화증 및 COPD 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적인 siRNA 또는 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체를 이용하여 호흡기 질환, 특히 특발성폐섬유화증 및 COPD를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
과제의 해결 수단
본 발명에서는 서열번호 1 내지 600번 및 602번 내지 604번으로 구성된군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스가닥(sense strand)인 제1 올리고뉴클레오티드와 그에 상보적 서열을 포함하는 안티센스 가닥인 제2 올리고뉴클레오티드로 이루어진 호흡기 질환 연관 유전자인 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA를 제공한다.
본 발명에서의 siRNA는 일반적인 RNAi(RNA interference) 작용을 가지는 모든 물질을 포함하는 개념으로, 상기 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA에는 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 shRNA 등도 포함되는 것임은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.
상기 서열번호 1 내지 100번 또는 602 내지 604번은 CTGF(Homo sapiens)에 특이적인 siRNA의 센스가닥 서열이고, 서열번호 101 내지 200번은 Cyr61(Homo sapiens)에 특이적인 siRNA의 센스가닥 서열이며, 서열번호 201 내지 300번은 Plekho1(Homo sapiens)에 특이적인 siRNA의 센스가닥 서열이고, 서열번호 301 내지 400번은 CTGF(Mus musculus)에 특이적인 siRNA의 센스가닥 서열이며, 서열번호 401 내지 500번은 Cyr61(Mus musculus)에 특이적인 siRNA의 센스가닥 서열이고, 서열번호 501 내지 600번은 Plekho1(Mus musculus)에 특이적인 siRNA의 센스가닥 서열이다.
본 발명에 따른 siRNA는 바람직하게는 서열번호 1 내지 10, 35, 42, 59, 602, 603, 604, 301 내지 303, 305 내지 307, 309, 317, 323및 329번으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 포함하는 CTGF 특이적 siRNA,
서열번호 101 내지 110, 124, 153, 166, 187, 197, 409, 410, 415, 417, 418, 420, 422, 424, 427 및 429번으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 포함하는 Cyr61 특이적 siRNA, 또는
서열번호 201 내지 210번, 212, 218, 221, 223, 504 내지 507, 514, 515 및 522 내지 525번으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 포함하는 Plekho1 특이적인 siRNA이다.
더욱 바람직하게는 서열번호 4, 5, 8, 9, 35, 42, 59, 601, 602, 604, 301, 303, 307 및 323번으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 포함하는 CTGF 특이적 siRNA,
서열번호 102, 104, 107, 108, 124, 153, 166, 187, 197, 410, 422 및 424번으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 포함하는 Cry61 특이적 siRNA, 또는
서열번호 206 내지 209, 212, 218, 221, 223, 507, 515 및 525번으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 포함하는 Plekho1 특이적 siRNA이며,
가장 바람직하게는 서열번호 42, 59, 602 또는 323번에 따른 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 포함하는 CTGF 특이적 siRNA
서열번호 124, 153, 187, 197 또는 424번에 따른 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 포함하는 Cry61 특이적 siRNA
또는 서열번호 212, 218, 221, 223 또는 525번에 따른 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 포함하는 Plekho1 특이적 siRNA이다.
특히, 본 발명에 따른 인간 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA 중 일부는 마우스 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1의 발현을 동시에 저해할 수 있는 효과를 가지고 있음이 확인되었다.
상기 인간 및 마우스 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 발현을 동시에 억제할 수 있는 siRNA는 바람직하게는 서열번호 6 또는 8번에 따른 CTGF 특이적인 siRNA의 센스가닥, 서열번호 102, 104 또는 105번에 따른 Cyr61 특이적인 siRNA의 센스가닥, 또는 서열번호 204, 207 또는 208번에 따른 Plekho1 특이적인 siRNA의 센스가닥을 포함한다.
가장 바람직하게는 서열번호 6번에 따른 CTGF 특이적인 siRNA의 센스가닥, 서열번호 102번에 따른 Cyr61 특이적인 siRNA의 센스가닥, 또는 서열번호 207번에 따른 Plekho1 특이적인 siRNA의 센스가닥을 포함한다.
본 발명에 따른 siRNA의 센스가닥 또는 안티센스 가닥은 19 내지 31개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 것이 바람직하며, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 604에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스가닥 및 이에 상보적인 안티센스 가닥을 포함한다.
본 발명에서 제공되는 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA는 해당 유전자를 암호화하는 mRNA와 상보적으로 결합할 수 있도록 설계된 염기서열을 가지므로, 해당 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 것이 특징이다. 또한, 상기 siRNA 의 3’ 말단에 하나 또는 두 개 이상의 비결합(unpaired)된 뉴클레오티드를 포함하는 구조인 오버행(overhang)을 포함할 수 있으며,
또한, 상기 siRNA의 생체 내 안정성 향상을 위해, 핵산 분해효소 저항성 부여 및 비 특이적 면역반응 감소를 위한 다양한 변형(modification)을 포함할 수 있다. 상기 siRNA 를 구성하는 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드의 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2´ 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸), -OCH3(methoxy), -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형; 뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 또는 뉴클레오티드결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형에서 선택된 하나 이상의 변형이 조합되어 사용될 수 있으며, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형도 사용이 가능하다(Ann. Rev. Med. 55, 61-65 2004; US 5,660,985; US 5,958,691; US 6,531,584; US 5,808,023; US 6,326,358; US 6,175,001; Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:1139-1143, 2003; RNA, 9:1034-1048, 2003; Nucleic Acid Res. 31:589-595, 2003; Nucleic Acids Research, 38(17) 5761-5773, 2010; Nucleic Acids Research, 39(5) 1823-1832, 2011).
본 발명에서 제공되는 CTGF, Cyr61 및/또는 Plekho1 특이적 siRNA는 해당 유전자의 발현을 저해시킬 뿐만 아니라, 해당 단백질의 발현을 현저하게 저해시킨다.
본 발명의 다른 양태로서, 호흡기 질환 연관 유전자, 특히 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA의 생체 내로의 효율적인 전달 및 안정성 향상을 위하여 siRNA의 양 말단에 친수성 물질 및 소수성 물질이 접합된 형태의 접합체를 제공한다.
상기와 같이 siRNA에 친수성 물질 및 소수성 물질이 결합된 siRNA 접합체의 경우 소수성 물질의 소수성 상호작용에 의하여 자가조립 나노입자를 형성하게 되는데(대한민국 특허 등록번호 제 1224828 호), 이러한 나노입자는 체내로의 전달효율 및 체내에서의 안정성이 극히 우수할 뿐 아니라, 입자 크기가 균일성이 우수하여 QC(Quality control)이 용이하므로 약물로서의 제조 공정이 간단하다는 장점이 있다.
하나의 바람직한 구체예로서, 본 발명에 따른 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체는 하기 구조식 (1)과 같은 구조를 가지는 것이 바람직하다.
구조식 1
Figure PCTKR2014006033-appb-I000001
상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA를 나타낸다.
보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체는 하기 구조식 (2)의 구조를 가진다.
구조식 2
Figure PCTKR2014006033-appb-I000002
상기 구조식 (2)에서 A, B, X 및 Y는 상기 구조식 (1)에서의 정의와 동일하며, S는 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA의 센스가닥, AS는 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA의 안티센스 가닥을 의미한다.
보다 바람직하게는 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체는 하기 구조식 (3) 또는 (4)의 구조를 가진다.
구조식 3
Figure PCTKR2014006033-appb-I000003
구조식 4
Figure PCTKR2014006033-appb-I000004
상기 구조식 (3) 및 구조식 (4)에서 A, B, S, AS, X 및 Y는 상기 구조식 (1)에서의 정의와 동일하며, 5’ 및 3’ 은 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA 센스가닥의 5’ 말단 및 3’ 말단을 의미한다.
상기, 구조식 (1) 내지 구조식 (4)에서의 상기 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체의 안티센스 가닥의 5´ 말단에 인산기(phosphate group)가 한 개 내지 세 개 결합될 수 있으며, siRNA 대신에 shRNA가 사용될 수도 있음은 본 발명의 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.
상기 구조식 (1) 내지 구조식 (4)에서의 친수성 물질은 분자량이 200 내지 10,000 인 양이온성 또는 비이온성 고분자 물질인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1,000 내지 2,000인 비이온성 고분자 물질이다. 예를 들어, 친수성 고분자 물질로는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥사졸린 등의 비이온성 친수성 고분자 화합물을 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
특히, 구조식 (1) 내지 구조식 (4)에서의 친수성 물질(A)은 하기 구조식 (5) 또는 구조식 (6)과 같은 형태의 친수성 물질 블록(block) 형태로 이용될 수 있는데, 이러한 친수성 물질 블록을 필요에 따라 적절한 개수(구조식 (5) 또는 구조식 (6)에서의 n)를 사용함으로써 일반 합성 고분자 물질 등을 사용하는 경우에 발생할 수 있는 다분산성으로 인한 문제점을 크게 개선할 수 있다.
구조식 5
Figure PCTKR2014006033-appb-I000005
구조식 6
Figure PCTKR2014006033-appb-I000006
상기 구조식 (5)에서 A’은 친수성 물질 단량체(monomer), J는 m개의 친수성 물질 단량체 간 또는 m개의 친수성 물질 단량체와 siRNA를 서로 연결하는 링커, m은 1 내지 15의 정수, n은 1 내지 10의 정수를 의미하며, (A’m-J) 또는 (J-A’m)로 표시되는 반복단위가 친수성 물질 블록의 기본단위에 해당된다.
상기 구조식 (5) 또는 구조식 (6)과 같은 친수성 물질 블록을 가질 경우, 본 발명에 따른 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체는 하기 구조식 (7) 또는 구조식 (8)과 같은 구조를 가질 수 있다.
구조식 7
Figure PCTKR2014006033-appb-I000007
구조식 8
Figure PCTKR2014006033-appb-I000008
상기 구조식 (7) 및 구조식 (8)에서, X, R, Y 및 B는 구조식 (1)에서의 정의와 동일하고, A’, J. m 및 n은 구조식 (5) 및 구조식 (6)에서의 정의와 동일하다.
상기 구조식 (5) 및 구조식 (6)에서 친수성 물질 단량체(A’)는 비이온성 친수성 고분자의 단량체 중에서 본 발명의 목적에 부합하는 것이라면 제한없이 사용이 가능하며, 바람직하게는 표 1에 기재된 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에서 선택된 단량체, 더욱 바람직하게는 화합물(1)의 단량체가 사용될 수 있으며, 화합물 (1)에서 G는 바람직하게는 CH2, O, S 및 NH에서 선택될 수 있다.
특히, 친수성 물질 단량체 중에서도 특히 화합물 (1)로 표시되는 단량체는 다양한 기능기를 도입할 수 있으며, 생체 내 친화성이 좋고 면역반응을 적게 유도하는 등 생체 적합성(bio-compatibility)이 우수할 뿐 아니라, 구조식 (7) 또는 구조식 (8) 따른 구조체 내에 포함된 올리고뉴클레오타이드의 생체 내 안정성을 증가시키고, 전달 효율을 증가시킬 수 있다는 장점을 가지고 있어 본 발명에 따른 구조체의 제조에 매우 적합하다.
표 1
Figure PCTKR2014006033-appb-T000001
상기 구조식 (5) 내지 구조식 (8)에서의 친수성 물질은 총 분자량이 1,000 내지 2,000에 범위 내인 것이 특히 바람직하다. 따라서, 예를 들어, 구조식 (7) 및 구조식 (8)에서 화합물 (1)에 따른 헥사에틸렌 글리콜(Hexaethylene glycol), 즉 G가 O이고, m이 6인 물질 이 사용되는 경우 헥사에틸렌글리콜 스페이서(spacer)의 분자량이 344이므로, 반복 횟수(n)는 3 내지 5인 것이 바람직하다. 특히, 본 발명은 필요에 따라 상기 구조식 (5) 및 구조식 (6)에서 (A’m-J)으로 또는 (J-A’m)n 표시되는 친수성 그룹의 반복단위, 즉 친수성 물질 블록(block)이 n으로 표시되는 적절한 개수로 사용될 수 있음을 특징으로 한다. 상기 각 친수성 물질 블록 내에 포함되는 친수성 물질 단량체인 A와 링커인 J는 독립적으로 각 친수성 물질 블록간에 동일할 수도 있고, 상이할 수도 있다. 즉, 친수성 물질 블록이 3개 사용될 경우(n=3), 첫 번째 블록에는 화합물 (1)에 따른 친수성 물질 단량체가, 두 번째 블록에는 화합물 (2)에 따른 친수성 물질 단량체가, 세 번째 블록에는 화합물 (3)에 따른 친수성 물질 단량체가 사용되는 등, 모든 친수성 물질 블록별로 다른 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있고, 모든 친수성 물질 블록에 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에 따른 친수성 물질 단량체에서 선택된 어느 하나의 친수성 물질 단량체가 동일하게 사용될 수도 있다. 마찬가지로, 친수성 물질 단량체의 결합을 매개하는 링커 역시 각 친수성 물질 블록별로 모두 동일한 링커가 사용될 수도 있고, 각 친수성 물질 블록별로 상이한 링커가 사용될 수도 있다. 또한, 친수성 물질 단량체의 개수인 m 역시 각 친수성 물질 블록간에 동일할 수도 있고, 상이할 수도 있다. 즉, 첫 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 3개 연결(m=3)되고, 두 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 5개(m=5), 세 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 4개 연결(m=4)되는 등, 서로 다른 개수의 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있고, 모든 친수성 물질 블록에서 동일한 개수의 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있다.
또한, 본 발명에서 상기 링커(J)는 PO3 -, SO3 및 CO2로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 사용되는 친수성 물질의 단량체 등에 따라 본 발명의 목적에 부합하는 한 어떠한 링커라도 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
상기 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8) 에서의 소수성 물질(B)은 소수성 상호작용을 통해 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8)에 따른 올리고뉴클레오티드 구조체로 구성된 나노입자를 형성하는 역할을 수행한다. 상기 소수성 물질은 분자량이 250 내지 1,000인 것이 바람직하며, 스테로이드(steroid) 유도체, 글리세라이드(glyceride) 유도체, 글리세롤 에테르(glycerol ether), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), C12 내지 C50의 불포화 또는 포화 탄화수소(hydrocarbon), 디아실포스파티딜콜린 (diacylphosphatidylcholine), 지방산(fatty acid), 인지질(phospholipid), 리포폴리아민(lipopolyamine) 등이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 목적에 부합하는 것이라면 어떠한 소수성 물질도 사용 가능하다는 점은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.
상기 스테로이드(steroid) 유도체는 콜레스테롤, 콜레스탄올, 콜산, 콜리스테릴 포르메이트, 코테스타닐 포르메이트 및 콜리스타닐아민으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 글리세라이드 유도체는 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드 등에서 선택될 수 있는데 이때, 글리세라이드의 지방산은 C12 내지 C50의 불포화 또는 포화 지방산이 바람직하다.
특히, 상기 소수성 물질 중에서도 포화 또는 불포화 탄화수소나 콜레스테롤이 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 구조체의 합성 단계에서 용이하게 결합시킬 수 있는 장점을 가지고 있다는 점에서 바람직하며, C24 탄화수소, 특히 disulfide bond를 포함하는 테트라도코산(tetradocosane)이 가장 바람직하다.
상기 소수성 물질은 친수성 물질의 반대쪽 말단(distal end)에 결합되며, siRNA의 센스가닥 또는 안티센스 가닥의 어느 위치에 결합되어도 무방하다.
본 발명에 따른 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8)에서의 친수성 물질 또는 소수성 물질과 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA는 단순 공유 결합 또는 링커가 매개된 공유결합(X 또는 Y)에 의해 결합된다. 상기 공유결합을 매개하는 링커는 친수성 물질, 또는 소수성 물질과 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA의 말단에서 공유결합하며, 필요에 따라 특정 환경에서 분해가 가능한 결합을 제공하는 한 특별히 한정되는 것은 아니다. 따라서, 상기 링커는 본 발명에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조과정 중 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA 및/또는 친수성 물질(또는 소수성 물질)을 활성화하기 위해 결합시키는 어떠한 화합물도 사용될 수 있다. 상기 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합 중 어느 것이어도 무방하다. 이때, 비분해성 결합으로는 아미드 결합 또는 인산화 결합이 있고, 분해성 결합으로는 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8)에서의 R(또는 S 및 AS)로 표시되는 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA는 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1와 특이적으로 결합할 수 있는 특성을 지니는 siRNA라면 모두 제한 없이 사용가능하며, 바람직하게는 본 발명에서는 서열번호 1 내지 600번 및 602번 내지 604번에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스가닥과 그에 상보적 서열을 포함하는 안티센스 가닥으로 구성된다.
특히 본 발명에 따른 상기 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8)에 포함되는 siRNA는 바람직하게는 서열번호 1 내지 10, 35, 42, 59, 602 내지 604 또는 301 내지 303, 305 내지 307, 309, 317, 323 및 329번으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 포함하는 CTGF 특이적 siRNA,
서열번호 101 내지 110, 124, 153, 166, 187, 197, 409, 410, 415, 417, 418, 420, 422, 424, 427 및 429번으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 포함하는 Cyr61 특이적 siRNA, 또는
서열번호 201 내지 210번, 212, 218, 221, 223, 504 내지 507, 514, 515 및 522 내지 525번으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 포함하는 Plekho1 특이적인 siRNA이다.
더욱 바람직하게는 서열번호 4, 5, 8, 9, 35, 42, 59, 602, 603, 604, 301, 303, 307 및 323번으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 포함하는 CTGF 특이적 siRNA,
서열번호 102, 104, 107, 108, 124, 153, 166, 187, 197, 410, 422 및 424번으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 포함하는 Cry61 특이적 siRNA, 또는
서열번호 206 내지 209, 212, 218, 221, 223, 507, 515 및 525번으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 포함하는 Plekho1 특이적 siRNA이며,
가장 바람직하게는 서열번호 42, 59, 602 또는 323번에 따른 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 포함하는 CTGF 특이적 siRNA
서열번호 124, 153, 187, 197 또는 424번에 따른 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 포함하는 Cry61 특이적 siRNA, 또는
또는 서열번호 212, 218, 221, 223 또는 525번에 따른 어느 하나의 서열을 센스가닥으로 포함하는 Plekho1 특이적 siRNA이다.
또한, 서열번호 6 또는 8번에 따른 인간 및 마우스에 대한 CTGF 특이적 siRNA 센스가닥, 서열번호 102, 104 또는 105번에 따른 인간 및 마우스에 대한 Cyr61 특이적인 siRNA 센스가닥, 또는 서열번호 204, 207 또는 208번에 따른 인간 및 마우스에 대한 Plekho1 특이적인 siRNA 센스가닥을 포함하는 siRNA도 특히 바람직한데, 이는 상기 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA가 인간 및 마우스에 대한 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 발현을 동시에 억제할 수 있는 효과를 가지기 때문으로, 서열번호 6번에 따른 인간 및 마우스에 대한 CTGF 특이적 siRNA 센스가닥, 서열번호 102번에 따른 인간 및 마우스에 대한 Cyr61 특이적인 siRNA 센스가닥, 또는 서열번호 207번에 따른 인간 및 마우스에 대한 Plekho1 특이적인 siRNA 센스가닥을 포함하는 siRNA가 가장 바람직하다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체에 있어서, 상기 구조체 내의 친수성 물질의 siRNA와 결합된 반대편 말단 부위에 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 추가적으로 도입될 수 있다.
이는 본 발명에 따른 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체의 세포내 도입과 엔도좀 탈출을 용이하게 하기 위한 것으로, 이미 Quantum dot, Dendrimer, liposome 등의 전달체의 세포내 도입과 엔도좀 탈출을 용이하게 하기 위해서 아민 그룹의 도입과 폴리히스티딘 그룹이 이용할 수 있다는 점 및 그 효과가 보고된 바 있다.
구체적으로 전달체의 말단 혹은 바깥쪽에 수식된 일차 아민기는 생체 내 pH에서 양성자화되면서 음전하를 띠는 유전자와 정전기적 상호작용에 의해 결합체를 형성하며, 세포내 유입 후에 엔도좀의 낮은 pH에서 완충 효과를 갖는 내부 삼차 아민으로 인해 엔도좀의 탈출이 용이해 짐에 따라 라이소좀의 분해로부터 전달체를 보호할 수 있다고 알려져 있고(고분자 기반 하이브리드 물질을 이용한 유전자 전달 및 발현 억제. Polymer Sci. Technol., Vol. 23, No.3, pp254-259),
비필수 아미노산의 하나인 히스티딘은 잔기(-R)에 이미다졸링(pKa3 6.04)을 가지므로 엔도좀과 라이소좀에서 완충능력(buffering capacity)을 증가시키는 효과가 있어, 리포좀을 비롯한 비바이러스성 유전자전달체(non-viral gene carrier)들에서 엔도좀 탈출효율을 높이기 위해서 히스티딘 수식을 이용될 수 있다는 점이 알려져 있다 (Novel histidine-conjugated galactosylated cationic liposomes for efficient hepatocyte selective gene transfer in human hepatoma HepG2 cells. J. Controlled Release 118, pp262-270).
상기 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹은 하나 이상의 링커를 통해 친수성 물질 또는 친수성 물질 블록과 연결될 수 있다.
본 발명의 구조식 (1)에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체의 친수성 물질에 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 도입되는 경우에는 구조식 (7)과 같은 구조를 가질 수 있다.
구조식 9
Figure PCTKR2014006033-appb-I000009
상기 구조식 (9)에서 A, B, R, X 는 Y 구조식 (1)에서의 정의와 동일하고,
P는 아민기 또는 폴리히스티딘 그룹을 의미하며, J1과 J2는 링커로서, J1 및 J2는 독립적으로 단순 공유결합, PO3 -, SO3, CO2, C2-12 알킬, 알케닐, 알키닐에서 선택될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며, 사용되는 친수성 물질에 따라 본 발명의 목적에 부합하는 J1과 J2는 어떠한 링커라도 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
바람직하게는 아민기가 도입된 경우에는, J2는 단순 공유결합 또는 PO3 -, J1은 C6 알킬인 것이 바람직하지만, 이에 한정되지는 않는다.
또한, 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 도입된 경우에는 구조식 (9)에서는 J2는 단순 공유결합 또는 PO3 -, J1은 화합물 (4)가 바람직하지만, 이에 한정되지는 않는다.
화합물 (4)
Figure PCTKR2014006033-appb-I000010
또한, 구조식 (9)에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체의 친수성 물질이 구조식 (5) 또는 구조식 (6)에 따른 친수성 물질 블록이고, 이에 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 도입되는 경우에는 구조식 (10) 또는 구조식 (11)과 같은 구조를 가질 수 있다.
구조식 10
Figure PCTKR2014006033-appb-I000011
구조식 11
Figure PCTKR2014006033-appb-I000012
상기 구조식 (10) 및 구조식 (11)에서, X, R, Y, B, A’, J, m 및 n은 구조식 (5) 또는 구조식 (6)에서의 정의와 동일하며, P, J1 및 J2는 구조식 (9)에서의 정의와 동일하다.
특히, 상기 구조식 (10) 및 구조식 (11)에 있어서, 친수성 물질은 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA 센스가닥의 3’ 말단에 결합된 형태인 것이 바람직하며, 이 경우 상기 구조식 (9) 내지 구조식 (11)은 다음 구조식 (12) 내지 구조식 (14)의 형태를 가질 수 있다.
구조식 12
Figure PCTKR2014006033-appb-I000013
구조식 13
Figure PCTKR2014006033-appb-I000014
구조식 14
Figure PCTKR2014006033-appb-I000015
상기 구조식 (12) 내지 구조식 (14)에서 X, R, Y, B, A, A’ J, m, n. P, J1 및 J2는 상기 구조식 (9) 내지 구조식 (11)에서의 정의와 동일하며, 5’ 및 3’ 은 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA 센스가닥의 5’ 말단 및 3’ 말단을 의미한다.
본 발명에서 도입될 수 있는 아민기로는 1차 내지 3차 아민기가 사용될 수 있으며, 1차 아민기가 사용되는 것이 특히 바람직하다. 상기 도입된 아민기는 아민염으로 존재할 수도 있는데, 예를 들어 1차 아민기의 염은 NH3+ 의 형태로 존재할 수 있다.
또한, 본 발명에서 도입될 수 있는 폴리히스티딘 그룹은 3 내지 10개의 히스티딘을 포함하는 것이 바람직하며, 특히 바람직하게는 5 내지 8개, 가장 바람직하게는 6개의 히스티딘을 포함할 수 있다. 추가적으로 히스티딘 이외에 하나 이상의 시스테인이 포함될 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이로부터 형성된 나노입자에 타겟팅 모이어티가 구비된다면, 효율적으로 타겟 세포로의 전달을 촉진하여, 비교적 낮은 농도의 투여량으로도 타겟 세포로 전달되어 높은 타겟 유전자 발현 조절 기능을 나타낼 수 있으며, 타 장기 및 세포로의 비 특이적인 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA의 전달을 방지할 수 있다.
이에 따라 본 발명은 상기 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8)에 따른 구조체에 리간드(L), 특히 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드(ligand)가 추가적으로 결합된 이중나선 올리고 RNA, 구조체를 제공하며, 예를 들어 구조식 (1)에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체에 리간드가 결합된 형태는 하기 구조식 (15)과 같은 구조를 가진다.
구조식 15
Figure PCTKR2014006033-appb-I000016
상기 구조식 (15)에서, A, B, X 및 Y는 상기 구조식 (1)에서의 정의와 동일하며, L은 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드를 의미하며, i는 1 내지 5의 정수, 바람직하게는 1 내지 3의 정수이다.
상기 구조식 (15)에서의 리간드는 바람직하게는 타겟 세포 특이적으로 세포내재화 (internalization)을 증진시키는 RME 특성을 가진 타겟 수용체 특이적 항체나 앱타머, 펩타이드; 또는 엽산(Folate, 일반적으로 folate와 folic acid는 서로 교차 사용되고 있으며, 본 발명에서의 엽산은 자연 상태 또는 인체에서 활성화 상태인 folate를 의미한다), N-아세틸 갈락토사민(N-acetyl Galactosamine, NAG) 등의 헥소아민(hexoamine), 포도당(glucose), 만노스(mannose)를 비롯한 당이나 탄수화물(carbohydrate) 등의 화학물질 등에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 구조식 (15)에서의 친수성 물질 A는 구조식 (5) 및 구조식 (6)에 따른 친수성 물질 블록의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 과정은 예를 들어,
(1) 고형지지체(solid support)를 기반으로 친수성 물질을 결합 시키는 단계;
(2) 상기 친수성 물질이 결합된 고형지지체를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;
(3) 상기 RNA 단일가닥 5´ 말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
(4) 상기 RNA 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;
(5) 합성이 완료되면 고형지지체로부터 RNA-고분자 구조체 및 RNA 단일 가닥을 분리 정제하는 단계;
(6) 제조된 RNA-고분자 구조체와 상보적인 서열의 RNA 단일가닥의 어닐링을 통해 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 단계;
를 포함하여 이루어질 수 있다.
본 발명에서의 고형지지체(solid support)는 Controlled Pore Glass(CPG)가 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 폴리스티렌, 실리카겔, 셀룰로오스 페이퍼 등이 사용될 수 있다. CPG인 경우 직경은 40~180 ㎛인 것이 바람직하며, 500~3000Å의 공극 크기를 가지는 것이 바람직하다. 상기 단계 (5) 이후, 제조가 완료 되면 정제된 RNA-고분자 구조체 및 RNA 단일가닥은 MALDI-TOF 질량분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 RNA-고분자 구조체 및 RNA 단일가닥이 제조되었는지를 확인할 수 있다. 상기 제조방법에 있어서 (2) 단계에서 합성된 RNA 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 합성하는 단계 (4)는 (1) 단계 이전 또는 (1) 단계 내지 (5) 단계 중 어느 한 과정 중에 수행되어도 무방하다.
또한, (2) 단계에서 합성된 RNA 단일가닥과 상보적 서열을 포함하는 RNA 단일가닥은 5´ 말단에 인산기가 결합된 형태로 이용된 것을 특징으로 하는 제조방법도 될 수 있다.
한편, 본 발명의 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체에 추가적으로 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조방법을 제공한다.
리간드가 결합된 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA를 포함하는 올리고 RNA 구조체를 제조하는 방법은 예를 들어,
(1) 기능기가 결합되어 있는 고형지지체에 친수성 물질을 결합시키는 단계;
(2) 기능기-친수성 물질이 결합되어있는 고형지지체를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;
(3) 상기 RNA 단일가닥의 5´ 말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 과정으로 합성하는 단계;
(4) 상기 RNA 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 RNA 단일 가닥을 합성하는 단계;
(5) 합성이 완료되면 고형지지체로부터 기능기-RNA-고분자 구조체 및 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 분리하는 단계;
(6) 상기 기능기를 이용하여 친수성 물질 말단에 리간드를 결합하여 리간드-RNA-고분자 구조체 단일가닥을 제조하는 단계;
(7) 제조된 리간드-RNA-고분자 구조체와 상보적인 서열의 RNA 단일가닥의 어닐링의 통해 리간드-이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 단계;
를 포함하여 이루어질 수 있다.
상기 (6) 단계 이후, 제조가 완료되면 리간드-RNA-고분자 구조체 및 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 분리 정제한 뒤 MALDI-TOF 질량 분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 리간드-RNA-고분자 구조체 및 상보적인 RNA가 제조되었는지를 확인 할 수 있다. 제조된 리간드-RNA-고분자 구조체와 상보적인 서열의 RNA 단일가닥의 어닐링을 통해 리간드-이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조할 수 있다. 상기 제조방법에 있어서 (3) 단계에서 합성된 RNA 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 합성하는 단계 (4)는 독립적인 합성과정으로서 (1) 단계 이전 또는 (1) 단계 내지 (6) 단계 중 어느 한 과정 중에 수행되어도 무방하다.
본 발명의 또 다른 양태로서, CTGF, Cyr61 및/또는 Plekho1 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 나노입자를 제공한다.
이미 앞서 설명한 바와 같이 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체는 소수성 및 친수성 물질을 모두 포함하고 있는 양친매성이며, 친수성 부분은 체내에 존재하는 물 분자들과 수소결합 등의 상호작용을 통해 친화력을 가지고 있어 바깥쪽으로 향하게 되고, 소수성 물질들은 그들 간의 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)을 통해 안쪽으로 향하게 되어 열역학적으로 안정한 나노입자를 형성하게 된다. 즉, 나노입자의 중심에 소수성 물질이 위치하게 되고, CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA 의 바깥쪽 방향에 친수성 물질이 위치하여 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA를 보호하는 형태의 나노입자를 형성한다. 이렇게 형성된 나노입자는 CTGF, Cyr61 및/또는 Plekho1 특이적 siRNA의 세포 내 전달 향상 및 siRNA 효능을 향상시킨다.
본 발명에 따른 나노입자는 동일한 서열을 가지는 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체만으로 형성될 수도 있고, 서로 다른 서열을 가지는 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체로 구성 구성될 수도 있음을 특징으로 하는데, 본 발명에서의 서로 다른 서열을 가지는 siRNA는 다른 타겟 유전자, 예를 들어 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적인 siRNA 일수도 있고, 동일한 타겟 유전자 특이성을 가지면서 그 서열이 다른 경우도 포함되는 것으로 해석된다.
또한, CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적인 siRNA 이외에 다른 호흡기질환 연관 유전자 특이적인 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체가 본 발명에 따른 나노입자에 포함될 수도 있다.
또한, 본 발명은 또 다른 양태로서, CTGF, Cyr61 및/또는 Plekho1 특이적 siRNA, 이를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및/또는 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자를 포함하는 호흡기 질환, 특히 특발성폐섬유화증 및 COPD 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA, 이를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및/또는 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자를 유효성분으로 포함하는 조성물은 허파동맥 재형성(pulmonary artery remodeling) 및 기도 재형성(airway remodeling)을 억제하여 본 발명의 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA 또는 이를 포함하는 조성물은 호흡기 질환의 예방 또는 치료에 효과를 나타내는 것이다.
특히, 본 발명에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 호흡기 질환 예방 또는 치료용 조성물에는
서열번호 1 내지 100번 또는 602 내지 604번 및 301 내지 400번으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 서열, 바람직하게는 서열번호 1 내지 10, 35, 42, 59, 602 내지 604, 301 내지 303, 305 내지 307, 309, 317, 323 및 329번으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열, 더욱 바람직하게는 서열번호 4, 5, 8, 9, 35, 42, 59, 602 내지 604, 301, 303, 307 및 323번으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열, 가장 바람직하게는 서열번호 42, 59, 602 또는 323번에 따른 서열을 포함하는 센스가닥 및 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 CTGF 특이적인 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체;
서열번호 101 내지 200번 및 401 내지 500번에서 선택된 어느 하나의 서열, 바람직하게는 서열번호 101 내지 110, 124, 153, 166, 187, 197, 409, 410, 415, 417, 418, 420, 422, 424, 427 및 429번으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열, 더욱 바람직하게는 서열번호 102, 104, 107, 108, 124, 153, 166, 187, 197, 410, 422 및 424번으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열, 가장 바람직하게는 서열번호 124, 153, 187, 197 또는 424의 서열을 포함하는 센스가닥 및 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 Cyr61 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체; 또는,
서열번호 201 내지 300번 및 501번 내지 600번에서 선택된 어느 하나의 서열, 바람직하게는 서열번호 201 내지 210번, 212, 218, 221, 223, 504 내지 507, 514, 515 및 522 내지 525번으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열, 더욱 바람직하게는 서열번호 206 내지 209, 212, 218, 221, 223, 507, 515 및 525번으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열, 가장 바람직하게는 서열번호 212, 218, 221, 223, 또는 525번의 서열을 포함하는 센스가닥 및 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 Plekho1 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체; 가 포함될 수 있다.
또한, 서열번호 6 또는 8번의 서열, 바람직하게는 서열번호 6번에 따른 인간 및 마우스 CTGF 모두에 특이적인 siRNA 센스가닥 및 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 CTGF 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체;
서열번호 102, 104 또는 105번에서 선택되는 어느 하나의 서열, 바람직하게는 서열번호 102번에 따른 인간 및 마우스 Cyr61 모두에 특이적인 siRNA 센스가닥 및 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 Cyr61 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 구조체; 또는,
서열번호 204, 207 또는 208번에서 선택되는 어느 하나의 서열, 바람직하게는 서열번호 207번에 따른 인간 및 마우스 Plekho1 모두에 특이적인 siRNA 센스가닥 및 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 Plekho1 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 구조체; 가 포함될 수 있다.
또한, 상기 CTGF 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체, Cyr61 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및/또는 Plekho1 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체가 혼합된 형태로 포함될 수도 있으며, 추가적으로 CTGF, Cry61이나 Plekho1 이외의 다른 호흡기 질환 연관 유전자에 특이적인 siRNA, 또는 이를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체가 본 발명에 따른 조성물에 추가적으로 포함될 수 있다.
상기와 같이 CTGF, Cry61 및/또는 Plekho1 특이적 siRNA,, 또는 상기 CTGF, Cry61 및/또는 Plekho1 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체와 함께, 추가적으로 다른 호흡기 질환 연관 유전자 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체를 모두 포함하는 호흡기 질환 예방 또는 치료용 조성물을 이용할 경우, 병용 요법(combination therapy)과 같이 상승적인 효과를 거둘 수 있다.
본 발명에 따른 조성물이 예방 또는 치료할 수 있는 호흡기 질환으로는 특발성폐섬유화증, 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 급만성기관지염, 알레르기 비염, 진해 거담, 급성하기도 감염증(기관지염 및 세기관지염), 인후염, 편도염, 후두염과 같은 급성상기도감염증 등을 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자를 포함하는 호흡기 질환 예방 또는 치료용 조성물에 포함되는 나노입자도 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체에서 선택된 어느 하나의 구조체로만 순수하게 구성될 수도 있고, CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체가 2종 이상 혼합된 형태로 구성될 수도 있다.
본 발명의 조성물에는 상기의 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 특히, 동결건조(lyophilized)된 형태의 제형으로 제제화하여 제공하는 것이 바람직하다. 동결건조 제형 제조를 위해서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 방법이 사용될 수 있으며, 동결건조를 위한 안정화제가 추가될 수도 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍톤 약학 과학(Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질병에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분 등의 함량 및 투여방법은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 특별히 호흡기 질환 치료를 위해 기관지내 점적주입을 통한 폐로의 투여 또한 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 또는 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 임상 투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 본 발명의 조성물을 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체, 이를 포함하는 나노입자를 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 호흡기질환 특히, 특발성폐섬유화증 및 COPD의 예방 및 치료방법을 제공한다.
발명의 효과
본 발명에 따른 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA, 이를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 치료용 조성물은 부작용 없이 높은 효율로 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1의 발현을 억제하여 호흡기 질환, 특히 특발성폐섬유화증 및 COPD 치료효과를 거둘 수 있으므로, 현재 적절한 치료제가 없는 호흡기 질환, 특히 특발성폐섬유화증 및 COPD 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 이중나선 올리고 고분자 구조체로 구성된 나노입자의 모식도.
도 2는 본 발명에 따른 서열번호 1 내지 10, 101 내지 110, 201 내지 210번에 따른 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA로 인간 섬유모세포 세포주를 형질전환 시킨 후, 확인된 타겟 유전자 발현 저해량을 나타내는 그래프
A : 서열번호 1 내지 10번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA 5 또는 20 nM 처리에 따른 CTGF 발현량 그래프
B : 서열번호 101 내지 110번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA의 5 또는 20 nM 처리에 따른 Cyr61 발현량 그래프
C : 서열번호 201 내지 210번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA의 5 또는 20 nM 처리에 따른 Plekho1 발현량 그래프
도 3은 본 발명의 서열번호 1, 3, 4, 8, 9, 10, 102, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 204, 206, 207, 208, 209 또는 210번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA로 인간 섬유모세포 세포주를 형질전환 시킨 후, 확인된 타겟 유전자 발현 저해량 그래프
A : 서열번호 1, 3, 4, 8, 9 또는 10번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA 0.2 또는 1 nM 처리에 따른 CTGF 발현량 그래프
B : 서열번호 102, 104, 105, 106, 107, 108 또는 109번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA 0.2 또는 1 nM 처리에 따른 Cyr61 발현량 그래프
C : 서열번호 204, 206, 207, 208, 209, 210의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA 0.2 또는 1 nM 처리에 따른 Plekho1 발현량 그래프
도 4는 본 발명에 따른 서열번호 35, 42, 59, 602, 603, 604, 124, 153, 166, 187, 197, 212, 218, 221 또는 223번에 따른 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA로 인간 폐암 세포주를 형질전환 시킨 후, 확인된 타겟 유전자 발현 저해량을 나타내는 그래프
A : 서열번호 35, 42, 59, 602, 603, 604번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA 0.04, 0.2 또는 1 nM 처리에 따른 CTGF 발현량 그래프
B : 서열번호 124, 153, 166, 187, 197번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA의 0.5, 1 또는 5 nM 처리에 따른 Cyr61 발현량 그래프
C : 서열번호 212, 218, 221 또는 223번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA의 0.5, 1 또는 5 nM 처리에 따른 Plekho1 발현량 그래프
도 5는 본 발명에 따른 서열번호 42, 59, 602번에 따른 서열을 센스가닥으로 갖는 SAMiRNA로 인간 폐암세포주를 형질전환 시킨 후, 확인된 타겟 유전자 발현 저해량을 나타내는 그래프
도 6는 본 발명의 서열번호 301 내지 330, 401번 내지 430, 501 내지 530 번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA로 마우스 섬유모세포 세포주를 형질전환시킨 후, 확인된 타겟 유전자 발현저해량 그래프
A : 서열번호 301 내지 330번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA의 20 nM처리에 따른 CTGF 발현량 그래프
B : 서열번호 401번 내지 430번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA의 20 nM처리에 따른 Cyr61 발현량 그래프
C : 서열번호 501 내지 530번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA의 20 nM처리에 따른 Plekho1 발현량 그래프
도 7는 본 발명의 서열번호 404 내지 406, 408 내지 410, 414 내지 418, 420 내지 422, 424, 427, 429, 430, 503 내지 509, 514 내지 517, 519, 521 내지 526 또는 528번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA로 마우스 섬유모세포 세포주를 형질전환시킨 후, 확인된 타겟 유전자 발현저해량 그래프
A : 서열번호 404 내지 406, 408 내지 410, 414 내지 418, 420 내지 422, 424, 427, 429, 430번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA 5 nM처리에 따른 Cyr61 발현량 그래프
B : 서열번호 503 내지 509, 514 내지 517, 519, 521 내지 526 또는 528 번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA 5 nM처리에 따른 Plekho1 발현량 그래프
도 8은 본 발명의 서열번호 301, 303, 307, 323, 410, 422, 424, 507, 515 또는 525번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA로 마우스 섬유모세포 세포주를 형질전환 시킨 후, 확인된 타겟 유전자 발현저해량 그래프
A : 서열번호 301, 303, 307 또는 323번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA의 0.2, 1, 5nM처리에 따른 CTGF 발현량 그래프
B : 서열번호 410, 422 또는 424번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA 0.2, 1, 5nM 처리에 따른 Cyr61 발현량 그래프
C : 서열번호 507, 515 또는 525번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA 0.2, 1, 5nM 처리에 따른 Plekho1 발현량 그래프
도 9은 본 발명의 서열번호 4, 5, 6, 8, 9, 102, 104, 105, 107, 108, 109, 202, 204, 206 내지 209, 307, 424 또는 525번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA로 마우스 섬유모세포 세포주를 형질전환시킨 후, 확인된 타겟유전자 발현 저해량 그래프
A : 서열번호 4, 5, 6, 8, 9 또는 307번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA 5nM처리에 따른 CTGF 발현량 그래프
B : 서열번호 102, 104, 105, 107, 108, 109 또는 424번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA 5nM 처리에 따른 Cyr61 발현량 그래프
C : 서열번호 202, 204, 206 내지 209 또는 525번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA 5nM 처리에 따른 Plekho1 발현량 그래프
도 10은 본 발명의 서열번호 6, 8, 102, 104, 105, 204, 207, 208, 307, 424 또는 525번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA로 마우스 섬유모세포 세포주를 형질전환 시킨 후, 확인된 타겟유전자 발현 저해량 그래프
A : 서열번호 6, 8 또는 307번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA 5 또는 20 nM처리에 따른 CTGF 발현량 그래프
B : 서열번호 102, 104, 105 또는 424번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA 5 또는 20 nM 처리에 따른 Cyr61 발현량 그래프
C : 서열번호 204, 207, 208 또는 525번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA 5 또는 20 nM 처리에 따른 Plekho1 발현량 그래프
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. CTGF, Cyr61 또는 Plekho1의 목표 염기서열 디자인 및 siRNA의 제조
CTGF(Homo sapiens) 유전자의 mRNA 서열(NM_001901), Cyr61(Homo sapiens) 유전자의 mRNA 서열(NM_001554), Plekho1(Homo sapiens) 유전자의 mRNA 서열(NM_016274), CTGF(Mus musculus) 유전자의 mRNA 서열(NM_010217), Cyr61(Mus musculus) 유전자의 mRNA 서열(NM_010516), 또는 Plekho1(Mus musculus) 유전자의 mRNA 서열(NM_023320)에 결합할 수 있는 목표 염기서열(센스가닥)을 604 종을 디자인하고, 상기 목표 염기서열의 상보적 서열인 안티센스 가닥의 siRNA를 제조하였다.
우선, 바이오니아(주)에서 개발된 유전자 디자인 프로그램(Turbo si-Designer)을 사용하여, 해당 유전자들의 mRNA 서열에서 siRNA가 결합할 수 있는 목표 염기서열을 디자인하였다. 본 발명에 따른 호흡기 질환 연관 유전자에 대한 siRNA 는 19개의 뉴클레오티드로 구성된 센스 가닥과 이에 상보적인 안티센스 가닥으로 구성된 이중가닥 구조이다. 또한 어떠한 유전자의 발현을 저해하지 않는 서열의 siRNA인 siCONT(서열번호 601을 센스가닥으로 가짐)을 제조하였다. 상기 siRNA는 β-시아노에틸 포스포라미다이트(β-cyanoethyl phosphoramidite)를 이용하여 RNA 골격 구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결하여 제조하였다 (Nucleic Acids Research, 12:4539-4557, 1984). 구체적으로, RNA 합성기(384 Synthesizer, BIONEER, Korea)를 사용하여, 뉴클레오티드가 부착된 고형 지지체 상에서, 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 산화(oxidation) 및 캐핑(capping)으로 이루어지는 일련의 과정을 반복하여 원하는 길이의 RNA를 포함하는 반응물을 수득하였다. 상기 반응물을 Daisogel C18(Daiso, Japan) 칼럼이 장착된 HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan)로 RNA를 분리 및 정제하고 이를 MALDI-TOF 질량 분석기(Shimadzu, Japan)를 이용하여 목표 염기서열과 부합하는지 확인하였다. 이후, 센스와 안티센스 RNA 가닥을 결합시켜 목적하는 이중가닥 siRNA(서열번호 1 내지 604)을 제조하였다.
실시예 2. 이중나선 올리고 RNA 구조체(PEG-SAMiRNA)의 제조
본 발명에서 제조한 이중나선 올리고 RNA 구조체(PEG-SAMiRNA)는 하기 구조식 (16)과 같은 구조를 갖는다.
구조식 16
Figure PCTKR2014006033-appb-I000017
상기 구조식 (16)에서, S는 siRNA의 센스가닥; AS는 siRNA의 안티센스 가닥; PEG는 친수성 물질로 폴리에텔렌 글리콜(polyethylene glycol); C24는 소수성 물질로 이황화결합(disulfide)이 포함된 테트라도코산(tetradocosane); 5’ 및 3’은 이중나선 올리고 RNA 말단의 방향성을 의미한다.
상기 구조식 (16)에서의 siRNA의 센스가닥은 대한민국 공개특허공보 제2012-0119212호의 실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조된 3’ 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG, Mn=2,000)-CPG를 지지체로 하여 앞서 언급한 방식대로 β-시아노에틸포스포아미다이트를 이용하여 RNA 골격구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해가는 방법을 통해 3’말단부위에 폴리에틸렌 글리콜이 결합된 센스가닥의 이중나선 올리고 RNA-친수성 물질 구조체를 합성한 뒤, 이황화 결합이 포함되어있는 테트라도코산을 5’ 말단에 결합하여 원하는 RNA-고분자 구조체의 센스가닥을 제조하였다. 상기 가닥과 어닐링을 수행할 안티센스 가닥의 경우, 앞서 언급한 반응을 통해 센스가닥과 상보적인 서열의 안티센스 가닥을 제조하였다.
합성이 완료되면 60℃의 온탕기(water bath)에서 28%(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 합성된 RNA 단일가닥과 RNA 고분자 구조체를 CPG로부터 떼어낸 뒤, 탈보호(deprotection) 반응을 통해 보호잔기를 제거하였다. 보호잔기가 제거된 RNA 단일가닥 및 RNA-고분자 구조체는 70 ℃의 오븐에서 엔-메틸피롤리돈(N-methylpyrrolidon), 트리에틸아민(triethylamine) 및 트리에틸아민트리하이드로플로라이드 (triethylaminetrihydrofluoride)를 부피비 10:3:4의 비율로 처리하여 2’TBDMS(tert-butuldimethylsilyl)를 제거하였다.
상기 반응물을 Daisogel C18(Daiso, Japan) 칼럼이 장착된 HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan)로 RNA를 분리 및 정제하고 이를 MALDI-TOF 질량 분석기(Shimadzu, Japan)를 이용하여 목표 염기서열과 부합하는지 확인하였다. 이후, 각각의 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하기 위하여 센스가닥과 안티센스가닥을 동량 혼합하여 1X 어닐링 버퍼(30 mM HEPES, 100 mM 칼륨 아세테이트(Potassium acetate), 2 mM 마그네슘 아세테이트(Magnesium acetate), pH 7.0∼7.5)에 넣고, 90℃ 항온수조에서 3분 반응시킨 후 다시 37℃에서 반응시켜, 서열번호 42, 59, 602, 124, 153, 187, 197, 212, 218, 221, 223, 323, 424, 525 또는 601 번의 서열을 센스가닥으로 가지는 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체(이하, 각각 SAMiRNALP-hCTGF, SAMiRNALP-hCyr, SAMiRNALP-hPlek, SAMiRNALP-mCTGF, SAMiRNALP-mCyr, SAMiRNALP-mPlek SAMiRNALP-CONT라 함)를 각각 제조하였다. 제조된 이중나선 올리고 RNA 구조체는 전기영동을 통하여 어닐링 되었음을 확인하였다.
실시예 3. 개선된 이중나선 올리고 RNA 구조체(Mono-HEG-SAMiRNA)의 제조
본 발명에서 제조한 개선된 이중나선 올리고 RNA 구조체는 친수성 물질을 PEG 대신에 친수성 물질 블록인 [PO3 --헥사 에틸렌 글리콜]4 (이하, ‘Mono-HEG-SAMiRNA’라 함, 구조식 (17) 참조)을 사용한 것으로, 는 하기 구조식 (17)과 같은 구조를 갖는다.
구조식 17
Figure PCTKR2014006033-appb-I000018
상기 구조식 (17)에서, S는 siRNA의 센스가닥; AS는 siRNA의 안티센스 가닥; [Hexa Ethylene Glycol]4는 친수성 물질 단량체이며; C24는 소수성 물질로 이황화결합(disulfide) 이 포함된 테트라도코산(tetradocosane); 5’ 및 3’은 이중나선 올리고 RNA 센스 가닥 말단의 방향성을 의미한다.
상기 구조식 (17)에 따른 Mono-HEG SAMiRNA의 구조는 다음 구조식 (18)과 같이 나타낼 수 있다.
구조식 18
Figure PCTKR2014006033-appb-I000019
상기 반응물을 Daisogel C18(Daiso, Japan) 칼럼이 장착된 HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan)로 RNA를 분리 및 정제하고 이를 MALDI-TOF 질량 분석기(Shimadzu, Japan)를 이용하여 목표 염기서열과 부합하는지 확인하였다. 이후, 각각의 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하기 위하여 센스가닥과 안티센스가닥을 동량 혼합하여 1X 어닐링 버퍼(30 mM HEPES, 100 mM 칼륨 아세테이트(Potassium acetate), 2 mM 마그네슘 아세테이트(Magnesium acetate), pH 7.0∼7.5)에 넣고, 90 ℃ 항온수조에서 3분 반응시킨 후 다시 37 ℃에서 반응시켜, 서열번호 42, 59, 602, 124, 153, 187, 197, 212, 218, 221, 223, 323, 424, 525 또는 601 번의 서열을 센스가닥으로 가지는 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체(이하, 각각 Mono-HEG-SAMiRNALP-hCTGF, Mono-HEG-SAMiRNALP-hCyr, Mono-HEG-SAMiRNALP-hPlek, Mono-HEG-SAMiRNALP-mCTGF, Mono-HEG-SAMiRNALP-mCyr, Mono-HEG-SAMiRNALP-mPlek, Mono-HEG-SAMiRNALP-CONT라 함)를 각각 제조하였다. 제조된 이중나선 올리고 RNA 구조체는 전기영동을 통하여 어닐링 되었음을 확인하였다.
실시예 4. 개선된 이중나선 올리고 RNA 구조체 Mono-HEG-SAMiRNA)로 이루어진 나노입자의 제조 및 크기 측정
상기 실시예 3에서 제조된 이중나선 올리고 RNA 구조체(Mono-HEG-SAMiRNA)는 이중나선 올리고 RNA의 말단에 결합된 소수성 물질 간의 소수성 상호작용에 의하여 나노입자, 즉 미셀(micelle)을 형성하게 된다(도 1).
Mono-HEG-SAMiRNA-hCTGF, Mono-HEG-SAMiRNA-hCyr, Mono-HEG-SAMiRNA-hPlek, Mono-HEG-SAMiRNA-mCTGF, Mono-HEG-SAMiRNA-mCyr, Mono-HEG-SAMiRNA-mPlek Mono-HEG-SAMiRNA-CONT로 이루어진 나노입자 크기 PDI(polydispersity index) 분석을 통해 해당 Mono-HEG-SAMiRNA로 구성된 나노입자(SAMiRNA)의 형성을 확인하였다.
실시예 4-1. 나노입자의 제조
상기 Mono-HEG-SAMiRNA-hCTGF를 1.5 ㎖ DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)에 50 ㎍/㎖ 의 농도로 녹인 뒤, -75℃, 5mTorr 조건에서 48시간 동안 동결건조를 통해 나노입자 파우더를 제조한 뒤, 용매인 DPBS에 녹여 균질화된 나노입자를 제조하였다. Mono-HEG-SAMiRNA-hCyr, Mono-HEG-SAMiRNA-hPlek, Mono-HEG-SAMiRNA-mCTGF, Mono-HEG-SAMiRNA-mCyr, Mono-HEG-SAMiRNA-mPlek Mono-HEG-SAMiRNA-CONT로 이루어진 나노입자도 동일한 방법으로 제조하였다.
실시예 4-2. 나노입자의 크기 및 다분산지수(polydispersity index, PDI) 측정
제타-전위 측정기(zeta-potential measurement)를 통하여 상기 나노입자의 크기를 측정하였다. 실시예 4-1에서 제조된 균질화된 나노입자는 제타-전위 측정기(Nano-ZS, MALVERN, 영국)로 크기를 측정하였는데, 물질에 대한 굴절률(Refractive index)은 1.459, 흡수율(Absorption index)은 0.001로 하고, 용매인 DPBS의 온도 25 ℃ 및 그에 따른 점도(viscosity)는 1.0200 및 굴절률은 1.335의 값을 입력하여 측정하였다. 1회 측정은 15 번 반복으로 구성된 크기 측정으로 이루어졌고, 이를 6 회 반복하였다.
PDI 값이 낮을수록 해당 입자가 고르게 분포하고 있음을 나타내는 수치로, 본 발명의 나노입자는 매우 균일한 크기로 형성됨을 알 수 있었다.
실시예 5. 인간 섬유모세포(MRC-5) 세포주에서 인간에 대한 타겟유전자 특이적 siRNA를 이용한 타겟 유전자의 발현억제 확인.
상기 실시예 1에서 제조된 서열번호 1번 내지 10번, 101번 내지 110번, 201번 내지 210번 및 601번의 서열을 센스가닥으로 가지는 siRNA를 이용하여 섬유아 세포주인 인간 섬유모세포(MRC-5)를 형질전환 시키고, 상기 형질전환된 섬유모세포(MRC-5) 세포주에서 목표 유전자의 발현양상을 분석하였다
실시예 5-1. 인간 섬유모세포 세포주의 배양
한국세포주은행(KCLB, Korean Cell line bank, Korea)으로부터 입수한 인간 섬유모세포(MRC-5) 세포주를 RPMI-1640 배양배지(GIBCO/Invitrogen, USA, 10%(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100 units/㎖ 및 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖)에서 37 ℃, 5%(v/v) CO2의 조건 하에 배양하였다.
실시예 5-2. 인간 섬유모세포 세포주로의 목표 siRNA의 형질주입(transfection)
상기 실시예 5-1에서 배양된 1.8×105 섬유모세포(MRC-5) 세포주를 37℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 6-well 플레이트에서 18시간 동안 RPMI 1640에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 well당 500㎕의 Opti-MEM 배지(GIBCO, USA)를 분주하였다.
한편, 리포펙타민 RNAi 맥스(Lipofectamine™ RNAi Max, Invitrogen, USA) 3.5㎕와 Opti-MEM 배지 246.5㎕를 혼합하여 혼합액을 제조하였고, 실온에서 5분간 반응시킨 다음, 상기 실시예 1에서 제조한 각각의 서열번호 1 내지 10, 101 내지 10, 201 내지 210 및 601번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA (1pmole/㎕) 5 또는 20㎕를 Opti-MEM 배지 230㎕에 첨가하여 최종 농도가 5 또는 20 nM인 siRNA 용액을 제조하였다. 상기 리포펙타민 RNAi 맥스 혼합액과 siRNA 용액을 혼합하여 실온에서 15분간 반응시켜 형질주입용 용액을 제조하였다.
그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 well에 형질주입용 용액을 각각 500㎕씩 분주하고 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하였다. 여기에 RPMI 1640 배양배지 1㎖씩 분주한 다음 24시간 동안 37℃에서 5%(v/v) CO2의 조건 하에서 배양하였다.
실시예 5-3. 타겟 유전자 mRNA의 정량분석
상기 실시예 5-2에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 타겟 유전자의 mRNA 발현량을 상대정량 하였다.
실시예 5-3-1. 형질주입된 세포로부터 RNA 분리 및 cDNA 제조
RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, Korea)를 이용하여, 상기 실시예 5-2에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower CycleScript RT Premix/dT20, Bioneer, Korea)를 이용하여, 하기와 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다. 구체적으로, 0.25㎖ 에펜도르프 튜브에 담겨있는 AccuPower CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer, Korea)에 한 튜브 당 추출된 1 ㎍씩의 RNA를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 첨가하였다. 이를 유전자 증폭기(MyGenie™ 96 Gradient Thermal Block, BIONEER, Korea)로 30℃에서 1분 동안 RNA와 프라이머를 혼성화하고, 52℃에서 4분간 cDNA를 제조하는 두 과정을 6번 반복한 뒤, 90℃에서 5분 동안 효소를 불활성화 시켜 증폭 반응을 종료하였다.
실시예 5-3-2. 타겟 유전자 mRNA의 상대정량 분석
상기 실시예 5-3-1에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 통해 호흡기 질환 연관 유전자 mRNA의 상대적인 양을 하기와 같은 방법으로 정량하였다. 96-well 플레이트의 각 well에 상기 실시예 5-3-1에서 제조된 cDNA를 증류수로 5배 희석하고, 타겟유전자 mRNA 발현량 분석을 위해서 희석된 cDNA 3㎕와 2× GreenStar™ PCR master mix(BIONEER, Korea)를 25㎕, 증류수 19㎕, qPCR 프라이머(표 2; F, R 각각 10pmole/㎕; BIONEER, Korea)을 3㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, 타겟유전자 mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스키핑 유전자(housekeeping gene, 이하 HK 유전자)인 RPL13A(ribosomal protein L13a)를 표준 유전자로 하였다. 상기 혼합액이 담긴 96-well 플레이트를 Exicycler™96 Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER, Korea) 을 이용하여 하기와 같은 반응을 수행하였다: 95℃에서 15분간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94 ℃에서 30초 변성(denaturing), 58℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42 회 반복 수행하고, 72℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55℃에서 1분간 온도를 유지하고, 55℃에서 95℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다. PCR이 종료된 후, 각각 수득한 타겟유전자의 Ct(threshold cycle) 값은 GAPDH 유전자를 통해 보정된 타겟유전자의 Ct 값을 구한 뒤, 유전자 발현저해를 일으키지 않는 컨트롤 서열의 siRNA(서열번호 601번, siCONT)가 처리된 실험군을 대조군으로 하여 ΔCt값의 차이를 구했다.
상기 ΔCt 값과 계산식 2(-ΔCt)× 100을 이용하여 CTGF(Homo sapiens) 특이적 siRNA (서열번호 1번 내지 10번의 서열을 센스가닥으로 가짐)가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였다(도 2.A). 또한, Cyr61(Homo sapiens) 특이적 siRNA (서열번호 101번 내지 110번의 서열을 센스가닥으로 가짐)가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였고(도 2B), Plekho1(Homo sapiens) 특이적 siRNA (서열번호 201번 내지 210번의 서열을 센스가닥으로 가짐)가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였다(도 2C).
그 결과, 본 발명의 몇 종의 siRNA는 높은 목표유전자 발현 저해를 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, 고효율의 siRNA 를 선별하기 위하여 5 nM 농도에서 각 유전자에 대한 mRNA 발현양이 높게 감소된 서열번호 1, 3, 4, 8, 9, 10, 102, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 204, 206, 207, 208, 209 및 210번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA를 선택하였다.
표 2
Figure PCTKR2014006033-appb-T000002
실시예 6. 인간 섬유모세포(MRC-5) 세포주에서 고효율의 인간에 대한 타겟유전자 특이적 siRNA 선정.
상기 실시예 5-3-2에서 선정된 서열번호 1, 3, 4, 8, 9, 10, 102, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 204, 206, 207, 208, 209, 210 및 601번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA를 이용하여 인간 섬유모세포(MRC-5)를 형질전환시키고, 상기 형질전환된 섬유모세포(MRC-5) 세포주에서 타겟 유전자의 발현 양상을 분석하여 고효율의 siRNA를 선정하였다.
실시예 6-1. 인간 섬유모세포 세포주의 배양
한국세포주은행(KCLB, Korean Cell line bank, Korea)으로부터 입수한 인간 섬유모세포(MRC-5) 세포주는 실시예 5-1과 동일한 조건에서 배양하였다.
실시예 6-2. 인간 섬유모세포 세포주로의 목표 siRNA의 형질주입(transfection)
상기 실시예 6-1에서 배양된 1.8× 105 섬유모세포(MRC-5) 세포주를 37℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 6-well 플레이트에서 18시간 동안 RPMI 1640에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 well 당 500㎕의 Opti-MEM 배지(GIBCO, USA)를 분주하였다.
한편, 리포펙타민 RNAi 맥스(Lipofectamine™ RNAi Max, Invitrogen, USA) 3.5㎕와 Opti-MEM 배지 246.5㎕를 혼합하여 혼합액을 제조하였고, 실온에서 5분간 반응시킨 다음, 상기 실시예 1에서 제조한 각각의 서열번호 1, 3, 4, 8, 9, 10, 102, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 204, 206, 207, 208, 209, 210 및 601번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA (1pmole/㎕) 0.2 또는 1㎕를 Opti-MEM 배지 230㎕에 첨가하여 최종 농도가 0.2 또는 1 nM인 siRNA 용액을 제조하였다. 상기 리포펙타민 RNAi 맥스 혼합액과 siRNA 용액을 혼합하여 실온에서 15분간 반응시켜 형질주입용 용액을 제조하였다.
그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 well에 형질주입용 용액을 각각 500㎕씩 분주하고 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하였다. 여기에 RPMI 1640 배양배지 1㎖씩 분주한 다음 24시간 동안 37℃에서 5%(v/v) CO2의 조건 하에서 배양하였다.
실시예 6-3. 타겟 유전자 mRNA의 정량분석
상기 실시예 6-2에서 형질주입된 세포주로부터 상기 실시예 4-3과 동일한 방법으로 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 타겟 유전자의 mRNA 발현량을 상대정량 하였다. siRNA의 저농도 처리에 따른 타겟 유전자 발현 저해량 관찰을 통해 각 siRNA의 효능을 명확하게 확인할 수 있었으며, 8, 107 및 206번을 센스가닥으로 가지는 siRNA는 매우 낮은 농도에서도 비교적 높은 타겟 유전자 발현 저해를 나타내는 것을 확인하였다(도3).
실시예 7. 인간 폐암 세포주(A549)에서 인간에 대한 타겟유전자 특이적 siRNA를 이용한 타겟 유전자의 발현억제 확인.
상기 실시예 1에서 제조된 서열번호 35, 42, 59, 602, 603, 604, 124, 153, 166, 187, 197, 212, 218, 221, 223 및 601번의 서열을 센스가닥으로 가지는 siRNA를 이용하여 폐종양 세포주인 인간 폐암세포주(A549)를 형질전환 시키고, 상기 형질전환된 폐암세포(A549) 세포주에서 목표 유전자의 발현양상을 분석하였다
실시예 7-1. 인간 폐암세포 세포주의 배양
미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 폐암세포(A549) 세포주는 DMEM 배양배지(GIBCO/Invitrogen, USA, 10%(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100 units/㎖ 및 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖)에서 37℃, 5%(v/v) CO2의 조건 하에 배양하였다.
실시예 7-2. 인간 폐암세포 세포주로의 목표 siRNA의 형질주입 (transfection)
상기 실시예 7-1에서 1.2×105 페암세포(A549) 세포주를 37℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 6-well 플레이트에서 18시간 동안 DMEM에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 웰(well)당 500㎕의 Opti-MEM 배지(GIBCO, USA)를 분주하였다.
한편, 리포펙타민 RNAi 맥스(Lipofectamine™ RNAi Max, Invitrogen, USA) 3.5㎕와 Opti-MEM 배지 246.5㎕를 혼합하여 혼합액을 제조하였고, 실온에서 5분간 반응시킨 다음, 실시예 1에서 제조한 각각의 서열번호 35, 42, 59, 602, 603, 604, 124, 153, 166, 187, 197, 212, 218, 221 및 223번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA (1pmole/㎕) 1 ㎕를 Opti-MEM 배지 230㎕에 첨가하여 최종 농도가 5nM, 1nM, 0.5nM, 0.2nM 및 0.04nM인 siRNA 용액을 제조하였다. 상기 리포펙타민 RNAi 맥스 혼합액과 siRNA 용액을 혼합하여 실온에서 15 분간 반응시켜 형질주입용 용액을 제조하였다.
그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 웰(well)에 형질주입용 용액을 각각 500㎕씩 분주하고 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하였다. 여기에 RPMI 1640 배양배지 1㎖씩 분주한 다음 24시간 동안 37℃에서 5%(v/v) CO2의 조건 하에서 배양하였다.
실시예 7-3. 타겟 유전자 mRNA의 정량분석
상기 실시예 7-2에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 타겟 유전자의 mRNA 발현량을 상대정량 하였다.
실시예 7-3-1. 형질주입된 세포로부터 RNA 분리 및 cDNA 제조
RNA 추출 키트(AccuPrep Cell total RNA extraction kit, BIONEER, Korea)를 이용하여, 상기 실시예 5-2에서 형질주입된 세포주로부터 전체 RNA를 추출하고, 추출된 RNA는 RNA 역전사 효소(AccuPower CycleScript RT Premix/dT20, Bioneer, Korea)를 이용하여, 하기와 같은 방법으로 cDNA를 제조하였다. 구체적으로, 0.25㎖ 에펜도르프 튜브에 담겨있는 AccuPower CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer, Korea)에 한 튜브 당 추출된 1 ㎍씩의 RNA를 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수를 첨가하였다. 이를 유전자 증폭기(MyGenie™ 96 Gradient Thermal Block, BIONEER, Korea)로 30℃에서 1분 동안 RNA와 프라이머를 혼성화하고, 52℃에서 4분간 cDNA를 제조하는 두 과정을 6번 반복한 뒤, 90℃에서 5분 동안 효소를 불활성화 시켜 증폭 반응을 종료하였다.
실시예 7-3-2. 타겟 유전자 mRNA의 상대정량 분석
상기 실시예 7-3-1에서 제조된 cDNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 통해 호흡기 질환 연관 유전자 mRNA의 상대적인 양을 하기와 같은 방법으로 정량하였다. 96-well 플레이트의 각 well에 상기 실시예 6-3-1에서 제조된 cDNA를 증류수로 5배 희석하고, 타겟유전자 mRNA 발현량 분석을 위해서 희석된 cDNA 3㎕와 2× GreenStar™ PCR master mix(BIONEER, Korea)를 25㎕, 증류수 19㎕, qPCR 프라이머(표 2; F, R 각각 10pmole/㎕; BIONEER, Korea)을 3㎕ 넣어 혼합액을 만들었다. 한편, 타겟유전자 mRNA의 발현량을 정규화하기 위해 하우스키핑 유전자(housekeeping gene, 이하 HK 유전자)인 RPL13A(ribosomal protein L13a)를 표준 유전자로 하였다. 상기 혼합액이 담긴 96-well 플레이트를 Exicycler™96 Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER, Korea) 을 이용하여 하기와 같은 반응을 수행하였다: 95℃에서 15분간 반응하여 효소의 활성화 및 cDNA의 이차구조를 없앤 뒤, 94 ℃에서 30초 변성(denaturing), 58℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension), SYBR 그린 스캔(SYBR green scan)의 4개의 과정을 42 회 반복 수행하고, 72℃에서 3분간 최종 연장을 수행한 뒤, 55℃에서 1분간 온도를 유지하고, 55℃에서 95℃까지 멜팅 커브(melting curve)를 분석하였다. PCR이 종료된 후, 각각 수득한 타겟 유전자의 Ct(threshold cycle) 값은 GAPDH 유전자를 통해 보정된 타겟유전자의 Ct 값을 구한 뒤, 유전자 발현저해를 일으키지 않는 컨트롤 서열의 siRNA(서열번호 601번, siCONT)가 처리된 실험군을 대조군으로 하여 ΔCt값의 차이를 구했다.
상기 ΔCt 값과 계산식 2(-ΔCt)× 100을 이용하여 CTGF(Homo sapiens) 특이적 siRNA (서열번호 132, 42, 59, 602, 603, 604번의 서열을 센스가닥으로 가짐)가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였다(도 4.A). 또한, Cyr61(Homo sapiens) 특이적 siRNA (서열번호 124, 153, 166, 187, 197번의 서열을 센스가닥으로 가짐)가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였고(도 4B), Plekho1(Homo sapiens) 특이적 siRNA (서열번호 212, 218, 221, 223번의 서열을 센스가닥으로 가짐)가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였다(도 4C).
그 결과, 본 발명의 몇 종의 siRNA는 높은 목표유전자 발현 저해를 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, 고효율의 siRNA 를 선별하기 위하여 5Nm 농도 및 5 nM 농도에서 각 유전자에 대한 mRNA 발현양이 높게 감소된 서열번호 42, 59, 602, 124, 153, 187, 197, 212, 218, 221 및 223번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA를 선택하였다.
실시예 8. 이중나선 올리고 고분자 구조체로 이루어진 나노입자(SAMiRNA)에 의한 인간 폐암세포(A549) 세포주에서 타겟 유전자의 발현 저해.
상기 실시예 7-3-2에서 선정된 서열번호 42, 59, 602, 124, 153, 187, 197, 212, 218, 221 및 223번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA를 포함하는 SAMiRNA LP로 이루어진 나노입자를 이용하여 인간 폐암세포(A549)를 형질전환시키고 상기 형질전환된 폐암세포(A549) 세포주에서 타겟 유전자의 발현 양상을 분석하였다.
실시예 8-1. 인간 폐암세포 세포주의 배양
미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 인간 폐암세포(A549) 세포주는 실시예 7-1과 동일한 조건에서 배양하였다.
실시예 8-2. 인간 폐암세포 세포주로의 목표 SAMiRNA의 형질주입(transfection)
상기 실시예 8-1에서 배양된 1.2×105 페암세포(A549) 세포주를 37℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 12-well 플레이트에서 18시간 동안 RPMI 1640에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 well당 동량의 Opti-MEM 배지(GIBCO, USA)를 분주하였다. Opti-MEM배지 100㎕와 상기 실시예 4-2에서 제조한 SAMiRNALP및 monoSAMiRNALP를 50 ㎍/㎖의 농도로 DPBS에 첨가하여, 실시예 5-1과 동일한 방법으로 -75℃, 5mTorr 조건에서 48시간 동안 동결건조하여 균일한 나노입자를 제조하였다. 그 후, Opti-MEM이분주된 종양세포주의 각 웰에 형질주입(transfection) 용 용액을 200 nM의 농도로 처리하고, 37 ℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 총 48 시간 동안 배양하였다
실시예 8-3. 타겟 유전자의 mRNA의 상대적 정량분석
상기 실시예 8-2에서 형질주입된 세포주로부터 상기 실시예 6-3과 동일한 방법으로 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 타겟 유전자의 mRNA 발현량을 상대정량 하였다. siRNA의 저농도 처리에 따른 타겟 유전자 발현 저해량 관찰을 통해 각 siRNA의 효능을 명확하게 확인할 수 있었으며, 42, 59 및 602번을 센스가닥으로 가지는 siRNA는 매우 낮은 농도에서도 비교적 높은 타겟 유전자 발현 저해를 나타내는 것을 확인하였다(도5).
실시예 9. 마우스 섬유모세포(NIH3T3) 세포주에서 마우스에 대한 타겟유전자 특이적 siRNA를 이용한 타겟 유전자의 발현억제 확인.
상기 실시예 1에서 제조된 서열번호 301번 내지 330번, 401번 내지 430번, 501번 내지 530번 및 601번의 서열을 센스가닥으로 가지는 siRNA를 이용하여 섬유아 세포주인 마우스 섬유모세포(NIH3T3)를 형질전환 시키고, 상기 형질전환된 섬유모세포(NIH3T3) 세포주에서 목표 유전자의 발현양상을 분석하였다.
실시예 9-1. 마우스 섬유모세포 세포주의 배양
미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 마우스 섬유모세포(NIH3T3) 세포주를 RPMI-1640 배양배지(GIBCO/Invitrogen, USA, 10%(v/v) 우태아 혈청, 페니실린 100 units/㎖ 및 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖)에서 37 ℃, 5%(v/v) CO2의 조건 하에 배양하였다.
실시예 9-2. 마우스 섬유모세포 세포주로의 목표 siRNA의 형질주입(transfection)
상기 실시예 9-1에서 배양된 1×105 섬유모세포(NIH3T3) 세포주를 37℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 12-well 플레이트에서 18시간 동안 RPMI 1640에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 well당 500㎕의 Opti-MEM 배지(GIBCO, 미국)를 분주하였다.
한편, 리포펙타민 RNAi 맥스(Lipofectamine™ RNAi Max, Invitrogen, USA) 1.5㎕와 Opti-MEM 배지 248.5㎕를 혼합하여 혼합액을 제조하였고, 실온에서 5분간 반응시킨 다음, 상기 실시예 1에서 제조한 각각의 서열번호 301 내지 330, 401 내지 430, 501내지 530번 및 601번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA (1 pmole/㎕) 5 또는 20 ㎕를 Opti-MEM 배지 230 ㎕에 첨가하여 최종 농도가 5 또는 20nM인 siRNA 용액을 제조하였다. 상기 리포펙타민 RNAi 맥스 (Lipofectamine™ RNAi Max) 혼합액과 siRNA 용액을 혼합하여 실온에서 20분간 반응시켜 형질주입용 용액을 제조하였다.
그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 well에 형질주입용 용액을 각각 500㎕씩 분주하고 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하였다. 여기에 RPMI 1640 배양배지 1㎖씩 분주한 다음 24시간동안 37℃에서 5%(v/v) CO2의 조건 하에서 배양하였다.
실시예 9-3. 타겟 유전자 mRNA의 정량분석
상기 실시예 9-2에서 형질주입된 세포주로부터 상기 실시예 5-3과 동일한 방법으로 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 타겟 유전자의 mRNA 발현량을 상대정량 하였다.
CTGF(Mus musculus) 특이적 siRNA (서열번호 301번 내지 330번의 서열을 센스가닥으로 가짐)가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였다(도 6A). 또한, Cyr61(Mus musculus) 특이적 siRNA (서열번호 401번 내지 430번의 서열을 센스가닥으로 가짐)가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였고(도 6B), Plekho1(Mus musculus) 특이적 siRNA (서열번호 501번 내지 530번의 서열을 센스가닥으로 가짐)가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였다(도 6C).
그 결과, 본 발명의 몇 종의 siRNA는 높은 목표유전자 발현 저해를 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, 고효율의 siRNA 를 선별하기 위하여 20 nM 농도에서 CTGF(Mus musculus)에 대한 mRNA 발현양이 높게 감소된 서열번호 301, 302, 303, 305, 306, 307, 309, 317, 323 또는 329번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA를 선택하였고, Cyr61(Mus musculus)에 대한 mRNA 발현양이 높게 감소된 서열번호 409, 410, 415, 417, 418, 420, 422, 424, 427 또는 429번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA를 선택하였고, Plekho1(Mus musculus)에 대한 mRNA 발현양이 높게 감소된 서열번호 504, 505, 506, 507, 514, 515, 522, 523, 524 또는 525번의 서열을 센스가닥으로 포함하는 siRNA를 선택하였다.
또한, 더욱 바람직한 효율을 가지는 siRNA를 선별하기 위해 5 nM 농도에서 CTGF(Mus musculus)에 대한 mRNA 발현양이 높게 감소된 서열번호 301, 303, 307 또는 323번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA를 선택하였고, Cyr61(Mus musculus)에 대한 mRNA 발현양이 높게 감소된 서열번호 410, 422 또는 424번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA를 선택하였고, Plekho1(Mus musculus)에 대한 mRNA 발현양이 높게 감소된 서열번호 507, 515 또는 525번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA를 선택하였다(도 7).
실시예 10. 마우스 섬유모세포(NIH3T3) 세포주에서 고효율의 마우스에 대한 타겟유전자 특이적 siRNA 선정.
상기 실시예 9-3에서 선정된 서열번호 301, 303, 307, 323, 410, 422, 424, 507, 515, 525 및 601번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA를 이용하여 마우스 섬유모세포(NIH3T3) 세포주에서 타겟 유전자의 발현 양상을 분석하여 고효율의 siRNA를 선정하였다.
실시예 10-1. 마우스 섬유모세포 세포주의 배양
미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 마우스 섬유모세포(NIH3T3) 세포주는 상기 실시예 9-1과 동일한 조건으로 배양하였다.
실시예 10-2. 마우스 섬유모세포 세포주로의 목표 siRNA의 형질주입(transfection)
상기 실시예 10-1에서 배양된 1×105 섬유모세포(NIH3T3) 세포주를 37℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 12-well 플레이트에서 18시간 동안 RPMI 1640에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 well당 500㎕의 Opti-MEM 배지(GIBCO, USA)를 분주하였다.
한편, 리포펙타민 RNAi 맥스(Lipofectamine™ RNAi Max, Invitrogen, USA) 1.5㎕와 Opti-MEM 배지 248.5㎕를 혼합하여 혼합액을 제조하였고, 실온에서 5분간 반응시킨 다음, 상기 실시예 1에서 제조한 각각의 301, 303, 307, 323, 410, 422, 424, 507, 515, 525 및 601번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA (1pmole/㎕) 0.2, 1 또는 5㎕를 Opti-MEM 배지 230㎕에 첨가하여 최종 농도가 0.2, 1 또는 5nM인 siRNA 용액을 제조하였다. 상기 리포펙타민 RNAi 맥스 (Lipofectamine™ RNAi Max) 혼합액과 siRNA 용액을 혼합하여 실온에서 20분간 반응시켜 형질주입용 용액을 제조하였다.
그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 well에 형질주입용 용액을 각각 500㎕씩 분주하고 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하였다. 여기에 RPMI 1640 배양배지 1㎖씩 분주한 다음 24시간동안 37℃에서 5%(v/v) CO2의 조건 하에서 배양하였다.
실시예 10-3. 타겟 유전자 mRNA의 정량분석
상기 실시예 10-2에서 형질주입된 세포주로부터 상기 실시예 5-3과 동일한 방법으로 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 타겟 유전자의 mRNA 발현량을 상대정량 하였다. CTGF(Mus musculus) 특이적 siRNA (서열번호 301, 303, 307, 323번의 서열을 센스가닥으로 가짐)가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였다(도 8A). 또한, Cyr61(Mus musculus) 특이적 siRNA (서열번호 410, 422, 424번의 서열을 센스가닥으로 가짐)가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였고(도 8B), Plekho1(Mus musculus) 특이적 siRNA(서열번호 507, 515, 525번의 서열을 센스가닥으로 가짐)가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였다(도 8C).
그 결과, 각 타겟유전자 특이적인 siRNA들은 농도 의존적으로 타겟유전자의 발현을 저해함이 확인되었으며, 서열번호 307, 424 및 525번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA는 매우 낮은 농도에서도 비교적 높은 목표유전자 발현저해 효과가 유지되는 것이 확인되어 고효율의 siRNA로 선정되었다.
실시예 11. 마우스 섬유모세포(NIH3T3) 세포주에서 인간에 대한 목표유전자 특이적 siRNA를 이용한 타겟 유전자의 발현억제 확인.
바이오 신약의 작용부위가 주로 단백질 구조나 유전자 서열과 같이 종(species) 특이적이기 때문에, 바이오 신약 개발 과정에서 효율성 확보를 위해서는 치료 약물의 동일성이 매우 중요하다. 상기 실시예 1에서 설계된 인간에 대하 타겟 유전자 특이적인 siRNA와 마우스 타겟유전자 간의 유전자 서열 상동성(homology)를 분석하여 마우스 섬유모세포에서 타겟 유전자 발현 저해효과를 확인할 siRNA 서열을 선정하였다.
선정된 siRNA 서열은 상기 실시예 1에서 제조된 인간에 대한 목표유전자 특이적인 siRNA인 서열번호 4, 5, 6 8 9, 102, 104, 105, 107, 108, 109, 202, 204, 206, 207, 208 및 209번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA, 마우스에 대한 목표유전자 특이적인 siRNA인 서열번호 307, 424 및 525의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA 및 대조군인 601번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA으로, 이를 이용하여 섬유아 세포주인 마우스 섬유모세포(NIH3T3) 세포주에서 타겟 유전자의 발현 양상을 분석하여 인간 유전자를 기반으로 설계된 siRNA의 마우스 세포에서 효능을 확인하였다.
실시예 11-1. 마우스 섬유모세포 세포주의 배양
미합중국 종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수한 마우스 섬유모세포(NIH3T3) 세포주는 상기 실시예 9-1과 동일한 조건으로 배양하였다.
실시예 11-2. 마우스 섬유모세포 세포주로의 목표 siRNA의 형질주입(transfection)
상기 실시예 11-1에서 배양된 1.8×105 섬유모세포(NIH3T3) 세포주를 37℃에서 5 %(v/v) CO2의 조건하에 6-well 플레이트에서 18시간 동안 RPMI 1640에서 배양한 뒤, 배지를 제거한 후 각 well당 500㎕의 Opti-MEM 배지(GIBCO, USA)를 분주하였다.
한편, 리포펙타민 RNAi 맥스(Lipofectamine™ RNAi Max, Invitrogen, USA) 3.5㎕와 Opti-MEM 배지 246.5㎕를 혼합하여 혼합액을 제조하였고, 실온에서 5분간 반응시킨 다음, 상기 실시예 1에서 제조한 각각의 서열번호 4, 5, 6 8 9, 102, 104, 105, 107, 108, 109, 202, 204, 206, 207, 208, 209, 307, 424, 525 및 601번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA (1pmole/㎕) 5 또는 20㎕를 Opti-MEM 배지 230㎕에 첨가하여 최종 농도가 5 또는 20 nM인 siRNA 용액을 제조하였다. 상기 리포펙타민 RNAi 맥스 혼합액과 siRNA 용액을 혼합하여 실온에서 15분간 반응시켜 형질주입용 용액을 제조하였다.
그 후, Opti-MEM이 분주된 종양세포주의 각 well에 형질주입용 용액을 각각 500㎕씩 분주하고 6시간 동안 배양한 후, Opti-MEM 배지를 제거하였다. 여기에 RPMI 1640 배양배지 1㎖씩 분주한 다음 24시간 동안 37℃에서 5%(v/v) CO2의 조건 하에서 배양하였다.
실시예 11-3. 타겟 유전자 mRNA의 정량분석
상기 실시예 11-2에서 형질주입된 세포주로부터 상기 실시예 5-3과 동일한 방법으로 전체 RNA를 추출하여 cDNA를 제조한 뒤, 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 타겟 유전자의 mRNA 발현량을 상대정량 하였다. CTGF(Mus musculus) 특이적 siRNA (서열번호 307번) 또는 CTGF(Homo sapiens) 특이적 siRNA(서열번호 4, 5, 6, 8 또는 9번)가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였다(도 9A). 또한, Cyr61(Mus musculus) 특이적 siRNA (서열번호 424번의 서열을 센스가닥으로 가짐) 또는 Cyr61(Homo sapiens) 특이적 siRNA(서열번호 102, 104, 105, 107, 108 또는 109 번의 서열을 센스가닥으로 가짐)가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였고(도 9B), Plekho1(Mus musculus) 특이적 siRNA (서열번호 525번의 서열을 센스가닥으로 가짐) 또는 Plekho1(Homo sapiens) 특이적 siRNA (서열번호 202, 204, 206, 207, 208 또는 209의 서열을 센스가닥으로 가짐)가 처리된 세포의 타겟 유전자의 발현량을 상대정량 하였다(도 9C).
그 결과, 각 인간에 대한 타겟유전자 특이적인 siRNA들은 서열 상동성(sequence homology)에 따라 타겟 유전자의 발현을 저해함이 확인되었으며, 서열번호 6, 8, 102, 104, 105, 204, 207 및 208번의 서열을 센스가닥으로 갖는 siRNA는 20nM에서 비교적 높은 목표 유전자 발현저해를 나타내었으며, 이중에서도 6, 102 및 207번 siRNA는 마우스 세포주에서도 IC50(inhibition concentration 50%)가 20nM 미만으로 확인되어, 낮은 농도에서도 비교적 높은 목표유전자 발현저해 효과가 유지되어 고효율의 siRNA임이 확인되었다(도 10).
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Claims (36)

  1. 서열번호 1 내지 600 및 서열번호 602 내지 604로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스가닥(sense strand)과 이에 상보적 서열을 포함하는 안티센스 가닥으로 이루어진 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA.
  2. 제1항에 있어서,
    siRNA의 센스가닥 또는 안티센스 가닥은 19 내지 31개의 뉴클레오타이드로 이루어진 것을 특징으로 하는 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA.
  3. 제 1항에 있어서,
    서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 35, 42, 59, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109. 110, 124, 153, 166, 187, 197, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 212, 218, 221, 223, 301, 302, 303, 305, 306, 307, 309, 317, 323, 329, 409, 410, 415, 417, 418, 420, 422, 424, 427, 429, 504, 505, 506, 507, 514, 515, 522, 523, 524, 525, 602, 603 및 604번으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스가닥과 이에 상보적 서열을 포함하는 안티센스 가닥을 포함하는 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    siRNA의 센스가닥 또는 안티센스 가닥은 하나 이상의 화학적 변형(chemical modification)을 포함하는 것을 특징으로 하는 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 화학적 변형은
    뉴클레오티드 내 당 구조의 2´ 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸), -OCH3(methoxy), -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형;
    뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형;
    뉴클레오티드결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포페이트(boranophosphate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형;
    PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형;
    에서 선택된 하나 이상의 변형임을 특징으로 하는 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    siRNA의 안티센스 가닥의 5’ 말단에 하나 이상의 인산기(phosphate group(s))가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA.
  7. 하기 구조식 (1)의 구조를 갖는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
    구조식 1
    Figure PCTKR2014006033-appb-I000020
    상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA를 의미한다.
  8. 제7항에 있어서,
    하기 구조식 (2)의 구조를 가지는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
    구조식 2
    Figure PCTKR2014006033-appb-I000021
    상기 구조식 (2)에서, S는 제7항에 따른 siRNA의 센스가닥, AS는 안티센스가닥을 의미하며, A, B, X 및 Y는 제7항에서의 정의와 동일하다.
  9. 제8항에 있어서,
    하기 구조식 (3) 또는 구조식 (4)의 구조를 가지는 이중나선 올리고 RNA 구조체.:
    구조식 3
    Figure PCTKR2014006033-appb-I000022
    구조식 4
    Figure PCTKR2014006033-appb-I000023
    상기 구조식 (3) 및 구조식 (4)에서, A, B, X, Y, S 및 AS는 제8항에서의 정의와 동일하며, 5’ 및 3’은 siRNA 센스가닥의 5’ 말단 및 3’ 말단을 의미한다.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    CTGF, Cyr61 또는 Plekho1 특이적 siRNA는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 임을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    친수성 물질의 분자량은 200 내지 10,000 임을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  12. 제11항에 있어서,
    친수성 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐피롤리돈 및 폴리옥사졸린으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 임을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  13. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    친수성 물질은 하기 구조식 (5) 또는 구조식 (6)의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
    구조식 5
    Figure PCTKR2014006033-appb-I000024
    구조식 6
    Figure PCTKR2014006033-appb-I000025
    상기 구조식 (5) 및 구조식 (6)에서 A’은 친수성 물질 단량체(monomer)를, J는 m개의 친수성 물질 단량체 간 또는 m개의 친수성 물질 단량체와 siRNA를 서로 연결하는 링커, m은 1 내지 15의 정수, n은 1 내지 10의 정수를 의미하며,
    친수성 물질 단량체 A’은 하기 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에서 선택된 어느 하나의 화합물이며, 링커(J)는 PO3 -, SO3 및 CO2로 구성된 군에서 선택된다.
    Figure PCTKR2014006033-appb-I000026
  14. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 소수성 물질의 분자량은 250 내지 1,000인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  15. 제14항에 있어서,
    소수성 물질은 스테로이드(steroid) 유도체, 글리세라이드(glyceride) 유도체, 글리세롤 에테르(glycerol ether), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), C12 내지 C50의 불포화 또는 포화탄화수소(hydrocarbon), 디아실포스파티딜콜린(diacylphosphatidylcholine), 지방산(fatty acid), 인지질(phospholipid) 및 리포폴리아민(lipopolyamine)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 스테로이드(steroid) 유도체는 콜레스테롤, 콜리스탄올, 콜산, 콜리스테릴 포르메이트, 코테스타닐 포르메이트 및 콜리스타닐아민으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 글리세라이드 유도체는 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체
  18. 제7항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 X 및 Y로 표시되는 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 비분해성 결합은 아미드 결합 또는 인산화 결합인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 분해성 결합은 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  21. 제7항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    친수성 물질에 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드(ligand)가 추가적으로 결합된 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 리간드는 타겟 수용체 특이적 항체나 앱타머, 펩타이드, 엽산(folate), N-아세틸 갈락토사민(N-acetyl Galactosamine, NAG), 포도당(glucose) 및 만노스(mannose) 로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  23. 제7항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 친수성 물질의 siRNA와 결합된 반대편 말단 부위에 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 추가적으로 도입된 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹은 하나 이상의 링커를 통해 친수성 물질 또는 친수성 블록과 연결된 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 1차 내지 3차 아민기 중에서 선택된 어느 하나 임을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  26. 제23항에 있어서,
    상기 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹은 3 내지 10개의 히스티딘을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  27. 제7항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 나노입자(nanoparticle).
  28. 제27항에 있어서,
    서로 다른 서열을 가지는 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체가 혼합되어 구성되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  29. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 siRNA, 제7항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체, 또는 제27항 또는 제28항에 따른 나노입자를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물.
  30. 제29항에 있어서,
    호흡기 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 천식, 특발성폐섬유화증, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 급만성기관지염, 알레르기 비염, 진해 거담, 급성하기도 감염증, 기관지염, 세기관지염, 급성상기도감염증, 인후염, 편도염 및 후두염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  32. 제30항에 있어서,
    상기 호흡기 질환은 특발성폐섬유화증 또는 만성폐쇄성폐질환(COPD) 임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 동결건조된 형태의 제형.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 siRNA, 이중나선 올리고 RNA 구조체, 나노입자, 조성물 또는 제형을 예방 또는 치료를 요하는 개체에게 투여하는 것을 특징으로 하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 호흡기 질환은 천식, 특발성폐섬유화증, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 급만성기관지염, 알레르기 비염, 진해 거담, 급성하기도 감염증, 기관지염, 세기관지염, 급성상기도감염증, 인후염, 편도염 및 후두염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 호흡기 질환은 특발성폐섬유화증 또는 만성폐쇄성폐질환(COPD) 임을 특징으로 하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료 방법.
PCT/KR2014/006033 2013-07-05 2014-07-04 호흡기 질환 연관 유전자 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이를 포함하는 호흡기 질환 예방 또는 치료용 조성물 WO2015002513A2 (ko)

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JP2016523670A JP2016525346A (ja) 2013-07-05 2014-07-04 呼吸器疾患関連遺伝子特異的ｓｉＲＮＡ、そのようなｓｉＲＮＡを含む二重らせんオリゴＲＮＡ構造体およびこれを含む呼吸器疾患予防または治療用組成物
RU2016103695A RU2656154C2 (ru) 2013-07-05 2014-07-04 СВЯЗАННАЯ С РЕСПИРАТОРНЫМ ЗАБОЛЕВАНИЕМ ГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ миРНК, ДВУСПИРАЛЬНАЯ КОНСТРУКЦИЯ ОЛИГО-РНК, СОДЕРЖАЩАЯ миРНК, И СОДЕРЖАЩАЯ ЕЕ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ РЕСПИРАТОРНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ
US14/902,566 US20160122764A1 (en) 2013-07-05 2014-07-04 Respiratory disease-related gene specific sirna, double-helical oligo rna structure containing sirna, compositon containing same for preventing or treating respiratory disease
BR112016000163A BR112016000163A2 (pt) 2013-07-05 2014-07-04 sirna específico de gene relacionado à doença respiratória, estrutura de oligo rna de dupla-hélice oligo contendo o sirna, composição contendo os mesmos para prevenir ou tratar doença respiratória
EP14820458.9A EP3018209B1 (en) 2013-07-05 2014-07-04 Respiratory disease-related gene specific sirna, double-helical oligo rna structure containing sirna, compositon containing same for preventing or treating respiratory disease
CN201480048988.7A CN105683377B (zh) 2013-07-05 2014-07-04 呼吸疾病相关基因特异性siRNA、含有siRNA的双螺旋寡RNA结构、含有它们的组合物用于预防或治疗呼吸疾病
KR1020167002234A KR101867414B1 (ko) 2013-07-05 2014-07-04 호흡기 질환 연관 유전자 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이를 포함하는 호흡기 질환 예방 또는 치료용 조성물
AU2014284836A AU2014284836B2 (en) 2013-07-05 2014-07-04 Respiratory disease-related gene specific siRNA, double-helical oligo RNA structure containing siRNA, compositon containing same for preventing or treating respiratory disease
CA2917320A CA2917320C (en) 2013-07-05 2014-07-04 Respiratory disease-related gene specific sirna, double-helical oligo rna structure containing sirna, composition containing same for preventing or treating respiratory disease
MX2016000019A MX2016000019A (es) 2013-07-05 2014-07-04 (arnip) gen especifico relacionado con las enfermedades respiratorias, (arnip) que contiene la estructura arn oligo helicoidal, composicion que contiene la misma para prevencion o tratamiento de las enfermedades respiratorias.
EP19180054.9A EP3591053A1 (en) 2013-07-05 2014-07-04 Respiratory disease-related gene specific sirna, double-helical oligo rna structure containing sirna, compositon containing same for preventing or treating respiratory disease

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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017178883A3 (en) * 2016-04-11 2018-08-23 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis using rna complexes that target connective tissue growth factor
US10590423B2 (en) 2015-11-16 2020-03-17 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of age-related macular degeneration using RNA complexes that target MyD88 or TLR3
US10829760B2 (en) 2010-10-22 2020-11-10 Olix Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules inducing RNA interference, and uses thereof
US10883105B2 (en) 2012-05-22 2021-01-05 Olix Pharmaceuticals, Inc. RNA-interference-inducing nucleic acid molecule able to penetrate into cells, and use therefor
US10947541B2 (en) 2016-02-02 2021-03-16 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of atopic dermatitis and asthma using RNA complexes that target IL4Rα, TRPA1, or F2RL1
US11040057B2 (en) 2016-06-29 2021-06-22 Olix Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions and methods for potentiating gene silencing
US11591600B2 (en) 2017-02-10 2023-02-28 OliX Pharmaceuticals. Inc. Long double-stranded RNA for RNA interference
EP4063504A4 (en) * 2019-11-22 2024-03-06 Bioneer Corp CTGF GENE SPECIFIC DOUBLE STRANDED OLIGONUCLEOTIDE AND COMPOSITION FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF FIBROTIC DISEASES AND RESPIRATORY DISEASES COMPRISING THE SAME

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108779464B (zh) 2016-02-02 2022-05-17 奥利克斯医药有限公司 使用靶向angpt2和pdgfb的rna复合物治疗血管生成相关性疾病
KR101861738B1 (ko) * 2016-08-24 2018-05-29 (주)바이오니아 마이크로 rna를 포함하는 이중나선 올리고 rna 구조체
CN108251420A (zh) * 2016-12-28 2018-07-06 苏州瑞博生物技术有限公司 抑制人和动物中CTGF基因表达的siRNA、包含其的组合物及其应用
WO2019047914A1 (zh) 2017-09-07 2019-03-14 北京泰德制药股份有限公司 靶向ckip-1的双链rna分子及其用途
KR102141124B1 (ko) * 2018-01-30 2020-08-04 (주)바이오니아 이중 가닥 miRNA를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체 및 이의 용도
KR101993894B1 (ko) * 2018-05-21 2019-06-28 (주)바이오니아 마이크로 rna를 포함하는 이중나선 올리고 rna 구조체
KR20200014684A (ko) * 2018-07-31 2020-02-11 주식회사 레모넥스 Ctgf 발현 억제용 조성물
CN109402127B (zh) * 2018-09-29 2021-12-10 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院 一组与结缔组织生长因子特异性结合的高亲和力核酸适配体及其应用
KR102473989B1 (ko) * 2018-11-28 2022-12-07 (주)바이오니아 안드로젠 수용체 특이적 서열을 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오티드 구조체, 및 이를 포함하는 탈모 예방 및 발모용 조성물
WO2020149644A1 (ko) * 2019-01-15 2020-07-23 (주)바이오니아 Dkk1 유전자를 표적으로 하는 이중나선 올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 구조체 및 이를 포함하는 탈모 예방 또는 발모용 조성물
CN116157158A (zh) * 2020-05-14 2023-05-23 柏业公司 用于预防或治疗肥胖症相关疾病的含有双调蛋白特异性双链寡核苷酸结构的组合物
EP4306133A1 (en) * 2021-03-08 2024-01-17 Bioneer Corporation Composition for administration of double-stranded oligonucleotide structures using ultrasonic nebulizer for prevention or treatment of respiratory viral infection including covid-19, pulmonary fibrosis caused by viral infection, or respiratory diseases

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5660985A (en) 1990-06-11 1997-08-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides
US5808023A (en) 1990-07-27 1998-09-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides
US6175001B1 (en) 1998-10-16 2001-01-16 The Scripps Research Institute Functionalized pyrimidine nucleosides and nucleotides and DNA's incorporating same
US6326358B1 (en) 1998-07-14 2001-12-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate or 2′-modified oligonucleotides having alternating internucleoside linkages
US6531584B1 (en) 1990-01-11 2003-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'modified oligonucleotides
KR100883471B1 (ko) 2005-08-17 2009-02-16 (주)바이오니아 siRNA의 세포내 전달을 위한 siRNA와 친수성 고분자 간의접합체 및 그의 제조방법
US7622454B2 (en) 2004-12-23 2009-11-24 Alcon, Inc. RNAi inhibition of CTGF for treatment of ocular disorders
US20120164151A1 (en) 2009-07-02 2012-06-28 Fibrogen, Inc. Methods for Treatment of Muscular Dystrophy
KR20120119212A (ko) 2012-10-15 2012-10-30 (주)바이오니아 ｓｉＲＮＡ 접합체 및 그 제조방법
KR101224828B1 (ko) 2009-05-14 2013-01-22 (주)바이오니아 ｓｉＲＮＡ 접합체 및 그 제조방법

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000036100A1 (en) * 1998-12-17 2000-06-22 The University Of Western Ontario Protein kinase targeting protein
WO2006006948A2 (en) * 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
US8258105B2 (en) * 2003-10-07 2012-09-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides optimized for kidney targeting
US7374927B2 (en) * 2004-05-03 2008-05-20 Affymetrix, Inc. Methods of analysis of degraded nucleic acid samples
WO2005116204A1 (ja) * 2004-05-11 2005-12-08 Rnai Co., Ltd. Ｒｎａ干渉を生じさせるポリヌクレオチド、および、これを用いた遺伝子発現抑制方法
PL1905451T3 (pl) * 2004-05-31 2010-05-31 Almirall Sa Kombinacje obejmujące środki przeciwmuskarynowe i kortykosteroidy
WO2006023491A2 (en) * 2004-08-16 2006-03-02 The Cbr Institute For Biomedical Research, Inc. Method of delivering rna interference and uses thereof
US7825099B2 (en) * 2006-01-20 2010-11-02 Quark Pharmaceuticals, Inc. Treatment or prevention of oto-pathologies by inhibition of pro-apoptotic genes
JP2010507387A (ja) * 2006-10-25 2010-03-11 クアーク・ファーマスーティカルス、インコーポレイテッド 新規のｓｉＲＮＡおよびその使用方法
WO2009126933A2 (en) * 2008-04-11 2009-10-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
US20120016011A1 (en) * 2009-03-19 2012-01-19 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA Interference Mediated Inhibition of Connective Tissue Growth Factor (CTGF) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
CN104922676B (zh) * 2009-03-20 2019-03-12 Clsn实验室股份有限公司 聚胺衍生物
KR101179471B1 (ko) * 2009-05-12 2012-09-07 한국과학기술연구원 자기 집합체 고분자 나노입자를 이용한 ｓｉＲＮＡ 전달 시스템
CN101708328A (zh) 2009-11-06 2010-05-19 上海市免疫学研究所 Cyr61蛋白在制药中的应用
JP6060071B2 (ja) * 2010-03-24 2017-01-11 アールエックスアイ ファーマシューティカルズ コーポレーション 皮膚および線維症適用におけるｒｎａ干渉
US20140134181A1 (en) * 2010-11-05 2014-05-15 Kenneth E. Lipson Treatment Method For Lung Remodeling Diseases
CN102824647B (zh) * 2011-06-13 2014-07-23 香港中文大学 基于小核酸药物成骨治疗的骨靶向递送系统及其制备方法
WO2013059496A1 (en) * 2011-10-18 2013-04-25 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Amine cationic lipids and uses thereof
PL2796150T3 (pl) * 2011-12-15 2021-08-30 Bioneer Corporation Nowe koniugaty oligonukleotydowe i ich zastosowanie
KR20130068032A (ko) * 2011-12-15 2013-06-25 (주)바이오니아 안정한 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체 및 그 제조방법
CN107988227A (zh) * 2012-01-05 2018-05-04 株式会社百奥尼 高效率的纳米颗粒型双螺旋寡rna结构体及其制备方法
CN102793910A (zh) * 2012-06-07 2012-11-28 中国航天员科研训练中心 Ckip-1蛋白及其编码基因的新用途
JP2015532100A (ja) * 2012-10-05 2015-11-09 バイオニア コーポレイション アンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴｒｎａ、そのような二重鎖オリゴｒｎａを含む二重鎖オリゴｒｎａの構造体及びこれを含む呼吸器疾患の予防または治療用の組成物

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6531584B1 (en) 1990-01-11 2003-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'modified oligonucleotides
US5660985A (en) 1990-06-11 1997-08-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides
US5958691A (en) 1990-06-11 1999-09-28 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides
US5808023A (en) 1990-07-27 1998-09-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides
US6326358B1 (en) 1998-07-14 2001-12-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate or 2′-modified oligonucleotides having alternating internucleoside linkages
US6175001B1 (en) 1998-10-16 2001-01-16 The Scripps Research Institute Functionalized pyrimidine nucleosides and nucleotides and DNA's incorporating same
US7622454B2 (en) 2004-12-23 2009-11-24 Alcon, Inc. RNAi inhibition of CTGF for treatment of ocular disorders
KR100883471B1 (ko) 2005-08-17 2009-02-16 (주)바이오니아 siRNA의 세포내 전달을 위한 siRNA와 친수성 고분자 간의접합체 및 그의 제조방법
KR101224828B1 (ko) 2009-05-14 2013-01-22 (주)바이오니아 ｓｉＲＮＡ 접합체 및 그 제조방법
US20120164151A1 (en) 2009-07-02 2012-06-28 Fibrogen, Inc. Methods for Treatment of Muscular Dystrophy
KR20120119212A (ko) 2012-10-15 2012-10-30 (주)바이오니아 ｓｉＲＮＡ 접합체 및 그 제조방법

Non-Patent Citations (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) treatment guidelines", CHRONIC OBSTRUCTIVE AIRWAY DISEASE CLINICAL RESEARCH CENTER, 2005, pages 30 - 31
"chronic obstructive pulmonary disease (COPD) treatment guidelines", CHRONIC OBSTRUCTIVE AIRWAY DISEASE CLINICAL RESEARCH CENTER, 2005, pages 52 - 58
"Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN, vol. 296, 2002, pages 1000 - 1004
"Harnessing In Vivo siRNA Delivery for Drug Discovery and Therapeutic Development", DRUG DISCOV. TODAY, vol. 11, no. 1-2, January 2006 (2006-01-01), pages 67 - 73
"Nonviral delivery of synthetic siRNA s in vivo", J CLIN INVEST., vol. 117, no. 12, 3 December 2007 (2007-12-03), pages 3623 - 3632
"Novel histidine-conjugated galactosylated cationic liposomes for efficient hepatocyte selective gene transfer in human hepatoma HepG2 cells", J. CONTROLLED RELEASE, vol. 118, pages 262 - 270
"NUCLEIC-ACID THERAPEUTICS: BASIC PRINCIPLES AND RECENT APPLICATIONS", NATURE REVIEWS DRUG DISCOVERY, vol. 1, 2002, pages 503 - 514
"Progress Towards in Vivo Use of siRNAs", MOLECULAR THERAPY, vol. 13, no. 4, 2006, pages 664 - 670
"Silence of the transcripts: RNA interference in medicine", J. MOL. MED., vol. 83, 2005, pages 764 - 773
ANN. REV. MED., vol. 55, 2004, pages 61 - 65
BIOORG. MED. CHEM. LETT., vol. 14, 2003, pages 1139 - 1143
BRIGSTOCK DR: "Connective tissue growth factor (CCN2, CTGF) and organ fibrosis: lessons from transgenic animals", J CELL COMMUN SIGNAL, vol. 4, no. 1, 2010, pages 1 - 4
DENIS G. BOSC ET AL.: "Identification and Characterization of CKIP-1, a Novel Pleckstrin Homology Domain-containing Protein That Interacts with Protein Kinase CK2", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 275, 2000, pages 14295 - 14306
F. M. VERONESE: "Peptide and protein PEGylation: a review of problems and solutions", BIOMATERIALS, vol. 22, 2001, pages 405 - 417
FRANCESCO M: "Veronese and Gianfranco Pasut. PEGylation, successful approach to drug delivery", DRUG DISCOVERY TODAY, vol. 10, no. 21, 2005, pages 1451 - 1458
J. CONTROL RELEASE, vol. 129, no. 2, 2008, pages 107 - 16
LINGQIANG ZHANG ET AL.: "Role for the pleckstrin homology domain containing protein CKIP-1 in AP-1 regulation and apoptosis", THE EMBO JOURNAL, vol. 24, 2005, pages 766 - 778
MARIA L. KIREEVA ET AL.: "Cyr61, a Product of a Growth Factor-Inducible Immediate-Early Gene, Promotes Cell Proliferation, Migration, and Adhesion", MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, April 1996 (1996-04-01), pages 1326 - 1334
NATURE, vol. 432, no. 7014, 11 December 2003 (2003-12-11), pages 173 - 8
NUCLEIC ACID RES., vol. 31, 2003, pages 589 - 595
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 12, 1984, pages 4539 - 4557
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 38, no. 17, 2010, pages 5761 - 5773
NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 39, no. 5, 2011, pages 1823 - 1832
P.J. BARNES; R.A. STOCKELY: "COPD: current therapeutic interventions and future approaches", EUR RESPIR J., vol. 25, 2005, pages 1084 - 1106
PAUWELS ET AL., AM J RESPIR CRIT CARE MED, vol. 163, 2001, pages 1256 - 1276
PETER J. CASTALDI ET AL.: "The COPD genetic association compendium", HUMAN MOLECULAR GENETICS, vol. 19, no. 3, 2010, pages 526 - 534
POLYMER SCI. TECHNOL., vol. 23, no. 3, pages 254 - 259
PROC. NATL. ACAD. SCI., vol. 93, no. 21, 15 December 1995 (1995-12-15), pages 11493 - 8
RNA, vol. 9, 2003, pages 1034 - 1048
See also references of EP3018209A4

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10829760B2 (en) 2010-10-22 2020-11-10 Olix Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules inducing RNA interference, and uses thereof
US10883105B2 (en) 2012-05-22 2021-01-05 Olix Pharmaceuticals, Inc. RNA-interference-inducing nucleic acid molecule able to penetrate into cells, and use therefor
US10590423B2 (en) 2015-11-16 2020-03-17 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of age-related macular degeneration using RNA complexes that target MyD88 or TLR3
US10947541B2 (en) 2016-02-02 2021-03-16 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of atopic dermatitis and asthma using RNA complexes that target IL4Rα, TRPA1, or F2RL1
WO2017178883A3 (en) * 2016-04-11 2018-08-23 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis using rna complexes that target connective tissue growth factor
KR20180128423A (ko) * 2016-04-11 2018-12-03 올릭스 주식회사 연결 조직 성장 인자를 표적화하는 rna 복합체를 사용한 특발성 폐 섬유증의 치료 방법
US10301628B2 (en) 2016-04-11 2019-05-28 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis using RNA complexes that target connective tissue growth factor
US10829761B2 (en) 2016-04-11 2020-11-10 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis using RNA complexes that target connective tissue growth factor
KR102339886B1 (ko) 2016-04-11 2021-12-17 올릭스 주식회사 연결 조직 성장 인자를 표적화하는 rna 복합체를 사용한 특발성 폐 섬유증의 치료 방법
US11040057B2 (en) 2016-06-29 2021-06-22 Olix Pharmaceuticals, Inc. Pharmaceutical compositions and methods for potentiating gene silencing
US11591600B2 (en) 2017-02-10 2023-02-28 OliX Pharmaceuticals. Inc. Long double-stranded RNA for RNA interference
EP4063504A4 (en) * 2019-11-22 2024-03-06 Bioneer Corp CTGF GENE SPECIFIC DOUBLE STRANDED OLIGONUCLEOTIDE AND COMPOSITION FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF FIBROTIC DISEASES AND RESPIRATORY DISEASES COMPRISING THE SAME

Also Published As

Publication number Publication date
RU2016103695A (ru) 2017-08-15
CN110592082A (zh) 2019-12-20
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RU2656154C2 (ru) 2018-05-31
JP6677679B2 (ja) 2020-04-08
MX2016000019A (es) 2016-08-18
CN105683377A (zh) 2016-06-15
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CA2917320A1 (en) 2015-01-08
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AU2014284836A1 (en) 2016-02-18
CN110592083A (zh) 2019-12-20
JP2020062023A (ja) 2020-04-23
AU2014284836B2 (en) 2017-07-27
EP3018209A2 (en) 2016-05-11
US20160122764A1 (en) 2016-05-05
JP6899509B2 (ja) 2021-07-07
JP2016525346A (ja) 2016-08-25
EP3591053A1 (en) 2020-01-08
KR20160033125A (ko) 2016-03-25
WO2015002513A3 (ko) 2015-03-05
KR101867414B1 (ko) 2018-06-14

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