CN110592083A - 呼吸疾病相关基因特异性siRNA、含有siRNA的双螺旋寡RNA结构及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及与呼吸疾病相关的基因特异性siRNA，具体涉及与特发性肺纤维化和慢性阻塞性肺病(COPD)相关的基因特异性siRNA，以及含有所述基因特异性siRNA的高度有效的双螺旋寡RNA结构，其中所述双螺旋寡RNA结构具有如下结构，其中亲水性和疏水性材料用简单共价键或接头介导的共价键结合至双螺旋RNA结构(siRNA)的两端，从而有效转入细胞中，并且所述亲水性和疏水性材料能够通过溶液中双螺旋寡RNA结构的疏水作用转换为纳米颗粒。合意的是双螺旋寡RNA结构中含有的siRNA是对CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA，所述CTGF、Cyr61或Plekho1是与呼吸疾病尤其是特发性肺纤维化和COPD相关的基因。此外，本发明涉及用于产生双螺旋寡RNA结构的方法以及用于预防或治疗呼吸疾病(尤其是特发性肺纤维化和COPD)的含有双螺旋寡RNA结构的药物组合物。
Description
本申请是中国申请号为201480048988.7、发明名称为“呼吸疾病相关基因特异性siRNA、含有siRNA的双螺旋寡RNA结构、含有它们的组合物用于预防或治疗呼吸疾病”且申请日为2014年7月4日的专利申请(PCT申请号为PCT/KR2014/006033)的分案申请。
技术领域
本发明涉及呼吸疾病相关基因特异性siRNA和高效结构，其包含含有所述siRNA的双螺旋寡RNA(“双螺旋寡RNA结构”)。所述双螺旋寡RNA结构具有这样的结构，在该结构中亲水性材料和疏水性材料通过使用简单共价键或接头介导的共价键而缀合至双螺旋RNA(siRNA)的两端，从而有效递送至细胞中，其中所述结构可以通过水溶液中双螺旋寡RNA结构的疏水作用转换为纳米颗粒形式。双螺旋寡RNA结构中含有的siRNA优选为对于CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA(下文称为CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA)，其是与呼吸疾病相关的，尤其是与特发性肺纤维化和慢性阻塞性肺病(COPD)相关的基因。
此外，本发明涉及用于产生双螺旋寡RNA结构的方法和含有所述双螺旋寡RNA结构用于预防或治疗呼吸疾病(尤其是特发性肺纤维化和COPD)的药物组合物。
背景技术
用于抑制基因表达的技术在用于治疗疾病的治疗剂开发和靶标确认中是重要的工具。在这些技术中，由于发现了RNA干扰(下文称“RNAi”)的作用，发现RNA干扰对多种哺乳动物细胞中的序列特异性的mRNA起作用(Silence of the transcripts:RNAinterference in medicine.J.Mol.Med.(2005)83:764-773)。当长链双链RNA被送入细胞，被送入的双链RNA转变为小干扰RNA(下文称“siRNA”)，其被Dicer核酸内切酶加工为21-23个碱基对(bp)。siRNA结合至RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)，藉此使前导(反义)链识别并分解靶mRNA，从而序列特异性地抑制靶基因的表达(NUCLEIC-ACID THERAPEUTICS:BASIC PRINCIPLES AND RECENT APPLICATIONS.NatureReviews Drug Discovery.2002.1,503-514)。
Bertrand等发现，与同一靶基因上的反义寡核苷酸(ASO)相比，siRNA在体内和体外具有显著抑制mRNA表达的作用，并且相应的作用维持长时间(Comparison of antisenseoligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo.Biochem.Biophys.Res.Commun.2002.296:1000-1004)。此外，由于siRNA互补地与靶mRNA偶联从而序列特异性地调控靶基因的表达，所以siRNA的机制具有的优势在于：与现有的基于抗体的药物产品或化学药物(小分子药物)相比，其可应用的靶标可以显著地增加(Progress Towards in VivoUse of siRNAs.MOLECULAR THERAPY.2006 13(4):664-670)。
为了将siRNA开发为治疗剂，甚至具有siRNA的优良效果和不同的适用范围，需要将siRNA有效地递送入具有改进的稳定性和更有效的细胞siRNA递送的靶细胞(HarnessingIn Vivo siRNA Delivery for Drug Discovery and Therapeutic Development.DrugDiscov.Today.2006Jan；11(1-2):67-73)。
为了解决这个问题，人们主动尝试了一些研究来修饰一些核苷酸或siRNA骨架从而具有核酸裂合酶抗性，或用载体如病毒载体、脂质体载体或纳米颗粒等来改进体内稳定性。
使用病毒载体如腺病毒、慢病毒等的递送系统具有高转染效力，并且还具有高免疫原性和致肿瘤性。同时，包含纳米颗粒的非病毒递送系统与病毒递送系统相比细胞递送效率低，但体内稳定性高，并且可能是靶标特异性地递送的，具有高度改进的递送效果，如将RNAi寡核苷酸吸收、内化等进入细胞或组织，并且极少具有毒性和免疫刺激，因此非病毒递送系统目前被认为是与病毒递送系统相比可行的递送方法(Nonviral delivery ofsynthetic siRNA s in vivo.J Clin Invest.2007December 3；117(12):3623-3632)。
在非病毒递送系统中使用纳米载体的方法中，使用多种聚合物如脂质体、阳离子聚合物复合材料等来形成纳米颗粒，并且将siRNA支撑于纳米颗粒(即纳米载体)上，从而递送入细胞中。在这些使用纳米载体的方法中，主要使用的是使用聚合纳米颗粒、聚合物胶束、脂质-核酸复合物(lipoplex)等等，其中所述脂质-核酸复合物由阳离子脂质组成与细胞核内体的阴离子脂质相互作用，由此引发核内体的去稳定效果以将siRNA递送入细胞中(Proc.Natl.Acad.Sci.15；93(21):11493-8,1996)。
此外，已知化学材料等与siRNA过客(有义)链的末端部分连接，从而提供促进的药代动力学特征，从而可以体内诱导高效力(Nature 11；432(7014):173-8,2004)。在此，siRNA的稳定性可能依赖于结合至siRNA有义(过客)链或反义(前导)链末端的化学材料的特性而变化。例如，聚合物化合物如聚乙二醇(PEG)所缀合的siRNA与siRNA的阴离子磷酸基团在存在阴离子材料的条件下相互作用，从而形成复合物，由此成为具有改进的siRNA稳定性的载体(J.Control Release 129(2):107-16,2008)。具体而言，由聚合物复合物组成的胶束具有极小的尺寸，显著均匀的分布，并且处于自然形式，从而与用作药物递送载体的其他系统(如微球、纳米颗粒等)相比容易控制制剂的质量并确保可再现性。
此外，为了提高siRNA的细胞内递送效率，开发了使用siRNA缀合于亲水性材料中的技术，所述亲水性材料是生物相容性的聚合物(例如聚乙二醇(PEG))，其通过简单共价键或接头介导的共价键缀合至siRNA，从而确保siRNA的稳定性并且具有有效的细胞膜通透性(参见韩国专利公开号883471)。然而，siRNA的化学修饰和与聚乙二醇(PEG)的缀合(聚乙二醇化)仍然具有劣势，即体内稳定性低及向靶器官中的递送不顺利。为了解决这个弊端，开发了这样的双螺旋寡RNA结构，其中亲水性材料和疏水性材料与寡核苷酸结合，具体而言是双螺旋RNA如siRNA，其中所述双螺旋寡RNA结构形成自我装配的纳米颗粒，称为通过疏水性材料的疏水作用自我装配的胶束抑制性RNA(SAMiRNATM)(参见韩国专利公开号1224828)，SAMiRNATM技术具有的优势在于能够获得具有显著小尺寸的均质的纳米颗粒(与现有的递送技术相比)。
作为SAMiRNATM技术的具体例子，PEG(聚乙二醇)用作亲水性材料，其中PEG是合成的聚合物，其用于增加药物(例如蛋白质)的溶解度，以及用于控制药代动力学特性。PEG是多分散的(polydisperse)材料，在由不同数量的单体之和组成的一批中的聚合物，分子量显示于正态(Gaussian)曲线中，并且多分散性值(Mw/Mn)表示了材料的同质性程度。即，当PEG具有低分子量(3至5kDa)时，多分散值为约1.01，而当PEG具有高分子量时(20kDa)，多分散性值为约1.2，这个值是高的，因此随着分子量越高，材料的同质性相对越低(F.M.Veronese.Peptide and protein PEGylation:a review of problems andsolutions.Biomaterials(2001)22:405-417)。因而，当PEG与药物结合时，PEG的多分散的特征反映在缀合物上，因而其不容易进行单一物质的验证，并且因而，通过PEG合成对具有低多分散性值的材料的生产和纯化工艺的改进处于上升趋势，但仍然存在问题，这是由于材料的多分散的特征，尤其是当PEG与具有小分子量的材料结合时，很难确认这种结合是否容易进行，等等(Francesco M.Veronese and Gianfranco Pasut.PEGylation,successfulapproach to drug delivery.DRUG DISCOVERY TODAY(2005)10(21):1451-1458)。
因而在近期，正如改进的SAMiRNATM的技术(其是现有的自我装配的纳米颗粒)一样，具有与现有的SAMiRNATM相比显著小尺寸和明显改进的多分散性的新形式的载体的技术已经开发，所述开发是通过阻断双螺旋RNA结构的亲水性材料形成SAMiRNATM作为基本单元，其包含1-15个统一形式的单体，所述单体具有根据需要预先确定的分子量和接头，并使用根据需要合适数量的被阻断的亲水性材料。
同时，由于生物药品特异性地作用于靶基因序列或蛋白结构，为了评估非临床替代模型中的效力和安全性，以与人中对应的生物药品相同的机制起作用的材料是额外需要的，甚至在替代模型的物种中也是如此。因此，为了避免另行寻找含有与人相同的机制的材料的困难，需要开发在人(治疗靶标)和在小鼠(非临床替代模型)中以相同机制起作用的材料。
特发性肺纤维化(下文中简称“IPF”)是一种疾病，其中慢性炎症细胞透入肺泡壁形成的壁(肺泡)，从而使肺变硬，引起严重的肺组织结构变化，从而使肺功能逐渐降低至诱发死亡。然而，目前还没有对其有效的治疗，并且特发性肺纤维化通常在最终出现症状时才诊断出来，并且预后极差，这是由于中位生存期仅有约3至5年。据报道，外国的发病率为每100,000人中约3-5人，并且已知在50岁后发病率普遍高，且男性发病率比女性高两倍。
IPF的病因尚未明确鉴定出来，并且仅报道过在吸烟者中频率高，抗抑郁药、由于胃食管反流的慢性肺吸入、金属粉尘、木屑、溶剂吸入等等被看作与IPF发生相关的风险因素。然而，在大多数患者中无法找到决定性的因果要素(causal factor)。
已知IPF连续恶化而没有治疗，且约50％的患者在3-5年内死亡，并且一旦肺随着疾病进展经纤维化而完全硬化，尽管任何治疗没有改善，并且因而据预测，早期治疗增加效力。正如目前使用的治疗剂，已经知晓了使用甾类和硫唑嘌呤或环磷酰胺的联合治疗方法，但难以说有特殊效果，并且在动物实验和小组患者中数种纤维化抑制物的尝试未能证实明显的效果。具体而言，在晚期IPF患者中除肺移植外术没有其他有效治疗。因此，亟需开发针对IPF更有效的治疗剂。
同时，COPD是代表性的肺疾病及哮喘的一种，其与哮喘的不同之处在于其伴随不可逆的气道阻塞，并且是一种呼吸疾病，其伴随由反复感染、有害颗粒、进气口或吸烟引起的肺异常炎症反应，并且是不完全可逆的，但显示出逐渐进展的气流限制(Pauwels等,Am JRespir Crit Care Med,163:1256-1276,2001)。COPD是通过气道和肺实质炎症由细支气管和肺实质的病理学变化引起的疾病，并且其特征为阻塞性细支气管炎和气肿(毁坏肺实质)。COPD的种类包括慢性阻塞性支气管炎，慢性支气管炎和气肿。在COPD中，中性粒细胞的数量增加，并且细胞因子如GM-CSF、TNF-α，IL-8和MIP-2的分泌增加。此外，还显示了由于粘液分泌增加的气道炎症，增厚的肌壁，支气管闭合。当支气管闭合时，肺泡扩张并被破坏，使氧气和二氧化碳的交换能力受损，增加呼吸衰竭。
COPD的严重程度在世界上逐渐显现，因为据预测，在1990年疾病致死原因中COPD排名第6，但在2020年会排到第三，并且是10种疾病中唯一发病率增加的。COPD的患病率很高，导致呼吸病症，并需要大量的直接医疗费用，用于诊断和治疗COPD，和显著量的间接费用，如因呼吸困难和请假造成的损失或由于过早死亡造成的损失，这是一个社会和经济问题(慢性阻塞性肺病(COPD)治疗指南2005，慢性阻塞性气道疾病临床研究中心，第30-31页)。
现存的治疗药物尚未被确证为在长时间中缓解肺功能降低，所述肺功能降低是COPD的特征。因而，COPD中的药物治疗的主要目的在于降低症状或并发症。在治疗药物中，支气管扩张剂是通常的COPD对抗疗法药物，且通常会开出抗炎症药物或皮质甾类，但效果并不显著，应用范围窄，且存在对副作用的极大关注。作为其他药物，已知仅流感疫苗在COPD患者中减少约50％的严重症状和死亡(慢性阻塞性肺病(COPD)治疗指南2005，慢性阻塞性气道疾病临床研究中心，第52-58页)。
同时，许多遗传因素被评估为增加(或减少)个体COPD的风险。目前已证实的一个遗传风险因素是α1-抗胰蛋白酶的遗传学缺乏。吸烟显著增加COPD的风险，但具有显著遗传缺陷的吸烟者和非吸烟者均显示在幼年迅速进展的全小叶型肺气肿(panlobularemphysema)的发生和肺功能的降低。虽然除α1-抗胰蛋白酶之外尚不存在其他经证实与COPD发病机理相关的基因，但用于鉴定所述疾病的生物标记物以用于通过对COPD患者中主要显示的细胞、分子和遗传异常状态的研究来进行诊断的尝试或者用于找到新的治疗方法的尝试正在进展(P.J.Barnes和R.A.Stockely.COPD:current therapeuticinterventions and future approaches.Eur Respir J.(2005)25:1084-1106)。具体而言，已经在积极进行对于COPD诊断和用于治疗的靶标的选择的研究，所述诊断和选择是通过方法如基因微阵列、蛋白质组学等等进行，并且主要进行了对用于获得COPD敏感性(易感性)的遗传因子的分析以及使吸烟诱导的COPD症状恶化的原因(Peter J.Castaldi等，TheCOPD genetic association compendium.Human Molecular Genetics,2010,Vol.19,No.3526-534)。
CTGF(结缔组织生长因子，CCN2)，是CCN家族中包括的基质细胞蛋白的一种，已知其是涉及多种生物过程的分泌细胞因子，所述生物过程例如细胞粘附、迁移、增殖、血管发生，创伤修复等。CTGF过表达被视为一些症状如硬皮病、纤维化疾病、及瘢痕形成的主要原因(Brigstock DR.Connective tissue growth factor(CCN2,CTGF)and organ fibrosis:lessons from transgenic animals.J Cell Commun Signal(2010)4(1):1-4)。具体而言，对于纤维化，已知CTGF以及TGF-β(转化生长因子-β)在引起纤维形成的条件下引起持续的纤维化或促进ECM(细胞外基质)的产生，并且最近已知CTGF能治疗由CTGF异常表达引起的眼病症或肌肉萎缩，所述治疗是通过处理阻碍CTGF表达或其抑制作用的样品或材料来进行的，但尚未表明与呼吸疾病的关联(美国专利号7,622,454，和美国专利申请公开号20120164151)。
CYR61(富半胱氨酸血管生成诱导物61(Cysteine-rich angiogenic inducer61))是一种CCN家族中包括的细胞外基质(ECM)相关的信号传导蛋白，已知其控制多种细胞活动，如细胞粘附、迁移、增殖、分化、凋亡等。纯化的CYR61以与纤连蛋白相似的方式促进内皮细胞的附接和散布，并且不具有促有丝分裂活性，但用于加强成纤维细胞生长因子的丝分裂原作用(MARIA L.KIREEVA et al.Cyr61,a Product of a Growth Factor-InducibleImmediate-Early Gene,Promotes Cell Proliferation,Migration,andAdhesion.MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY,Apr.1996,p.1326-1334)。
据报道，Plekho1(含Pleckstrin同源域家族O成员1(Pleckstrin homologydomain-containing family O member 1))存在于质膜或核中，作为蛋白激酶CK2α1(酪蛋白激酶2，α1)的非酶调控子起作用，并涉及通过抑制AP-1作用的凋亡，所述抑制是通过C末端片段进行的，所述C末端片段在被胱天蛋白酶3(Caspase 3)分解时产生(Denis G.Bosc等，Identification and Characterization of CKIP-1,a Novel Pleckstrin HomologyDomain-containing Protein That Interacts with Protein Kinase CK2.The Journalof Biological Chemistry(2000)275,14295-14306；Lingqiang Zhang等，Role for thepleckstrin homology domain containing protein CKIP-1in AP-1regulation andapoptosis.The EMBO Journal(2005)24,766-778)。
如上所述，呼吸系统疾病尤其是特发性肺纤维化和COPD的流行已增加，但尚不存在能从根本上预防和治疗特发性肺纤维化和COPD的治疗剂。因此，市场上明显极大地存在对于特发性肺纤维化和COPD显示出高水平的预防和治疗效果而没有副作用的治疗剂的需要。
发明内容
本发明的一个目的是提供新的对于CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA(下文称为CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA)(该siRNA能以显著高的效率抑制所述基因的表达)、含有所述siRNA的双螺旋寡RNA结构、和用于产生所述双螺旋寡RNA结构的方法。
本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，其包含所述CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA或含有所述siRNA作为有效组分的双螺旋寡RNA结构，其用于预防或治疗呼吸疾病，具体而言是特发性肺纤维化和COPD。
本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗呼吸疾病(特发性肺纤维化和COPD)的方法，所述方法通过使用CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA或含有所述siRNA的双螺旋寡RNA结构来进行。
附图简述
图1是根据本发明的由双螺旋寡聚物结构形成的纳米颗粒的示意图。
图2是显示靶基因表达的抑制量的图，其在用具有本发明的序列SEQ ID NO:1至10，101至110，和201至210作为有义链的siRNA转化人成纤维细胞系后得以确认。
A：显示CTGF表达量的图，所述表达量根据5或20nM的具有序列SEQ ID NO:1至10作为有义链的siRNA处理而得。
B：显示Cyr61表达量的图，所述表达量根据5或20nM的具有序列SEQ ID NO:101至110作为有义链的siRNA处理而得。
C：显示Plekho1表达量的图，所述表达量根据5或20nM的具有序列SEQ ID NO:201至210作为有义链的siRNA处理而得。
图3是显示靶基因表达的抑制量的图，其在用具有本发明的序列SEQ ID NO:1，3，4，8，9，10，102，104，105，106，107，108，109，204，206，207，208，209或210作为有义链的siRNA转化人成纤维细胞系后得以确认。
A：显示CTGF表达量的图，所述表达量根据0.2或1nM的具有序列SEQ ID NO:1，3，4，8，9或10作为有义链的siRNA处理而得。
B：显示Cyr61表达量的图，所述表达量根据0.2或1nM的具有序列SEQ ID NO:102，104，105，106，107，108或109作为有义链的siRNA处理而得。
C：显示Plekho1表达量的图，所述表达量根据0.2或1nM的具有序列SEQ ID NO:204，206，207，208，209或210作为有义链的siRNA处理而得。
图4是显示靶基因表达的抑制量的图，其在用具有本发明的序列SEQ ID NO:35，42，59，602，603，604，124，153，166，187，197，212，218，221或223作为有义链的siRNA转化人肺癌细胞系后得以确认。
A：显示CTGF表达量的图，所述表达量根据0.04、0.2或1nM的具有序列SEQ ID NO:35、42、59、602、603或604作为有义链的siRNA处理而得。
B：显示Cyr61表达量的图，所述表达量根据0.5、1或5nM的具有序列SEQ ID NO:124、153、166、187或197作为有义链的siRNA处理而得。
C：显示Plekho1表达量的图，所述表达量根据0.5、1或5nM的具有序列SEQ ID NO:212、218、221或223作为有义链的siRNA处理而得。
图5是显示靶基因表达的抑制量的图，其在用具有本发明的序列SEQ ID NO:42，59或602作为有义链的SAMiRNA转化人肺癌细胞系后得以确认。
图6是显示靶基因表达的抑制量的图，其在用具有本发明的序列SEQ ID NO:301至330，401至430，501至530作为有义链的siRNA转化小鼠成纤维细胞系后得以确认。
A：显示CTGF表达量的图，所述表达量根据20nM的具有序列SEQ ID NO:301至330作为有义链的siRNA处理而得。
B：显示Cyr61表达量的图，所述表达量根据20nM的具有序列SEQ ID NO:401至430作为有义链的siRNA处理而得。
C：显示Plekho1表达量的图，所述表达量根据20nM的具有序列SEQ ID NO:501至530作为有义链的siRNA处理而得。
图7是显示靶基因表达的抑制量的图，其在用具有本发明的序列SEQ ID NO:404至406，408至410，414至418，420至422，424，427，429，430，503至509，514至517，519，521至526或528作为有义链的siRNA转化小鼠成纤维细胞系后得以确认。
A：显示Cyr61表达量的图，所述表达量根据5nM的具有序列SEQ ID NO:404至406，408至410，414至418，420至422，424，427，429或430作为有义链的siRNA处理而得。
B：显示Plekho1表达量的图，所述表达量根据5nM的具有序列SEQ ID NO:503至509，514至517，519，521至526或528作为有义链的siRNA处理而得。
图8是显示靶基因表达的抑制量的图，其在用具有本发明的序列SEQ ID NO:301，303，307，323，410，422，424，507，515或525作为有义链的siRNA转化小鼠成纤维细胞系后得以确认。
A：显示CTGF表达量的图，所述表达量根据0.2、1或5nM的具有序列SEQ ID NO:301，303，307或323作为有义链的siRNA处理而得。
B：显示Cyr61表达量的图，所述表达量根据0.2、1或5nM的具有序列SEQ ID NO:410，422或424作为有义链的siRNA处理而得。
C：显示Plekho1表达量的图，所述表达量根据0.2、1或5nM的具有序列SEQ ID NO:507，515或525作为有义链的siRNA处理而得。
图9是显示靶基因表达的抑制量的图，其在用具有本发明的序列SEQ ID NO:4，5，6，8，9，102，104，105，107，108，109，202，204，206至209，307，424或525作为有义链的siRNA转化小鼠成纤维细胞系后得以确认。
A：显示CTGF表达量的图，所述表达量根据5nM的具有序列SEQ ID NO:4，5，6，8，9或307作为有义链的siRNA处理而得。
B：显示Cyr61表达量的图，所述表达量根据5nM的具有序列SEQ ID NO:102，104，105，107，108，109或424作为有义链的siRNA处理而得。
C：显示Plekho1表达量的图，所述表达量根据5nM的具有序列SEQ ID NO:202，204，206至209或525作为有义链的siRNA处理而得。
图10是显示靶基因表达的抑制量的图，其在用具有本发明的序列SEQ ID NO:6，8，102，104，105，204，207，208，307，424或525作为有义链的siRNA转化小鼠成纤维细胞系后得以确认。
A：显示CTGF表达量的图，所述表达量根据5或20nM的具有序列SEQ ID NO:6，8或307作为有义链的siRNA处理而得。
B：显示Cyr61表达量的图，所述表达量根据5或20nM的具有序列SEQ ID NO:102，104，105或424作为有义链的siRNA处理而得。
C：显示Plekho1表达量的图，所述表达量根据5或20nM的具有序列SEQ ID NO:204，207，208或525作为有义链的siRNA处理而得。
发明最佳实施方式
为了达到上述目标，本发明提供CTGF、Cyr61或Plekho1(呼吸疾病相关基因)特异性的siRNA，其由第一寡核苷酸和第二寡核苷酸组成，所述第一寡核苷酸是包含选自SEQ IDNO:1至600和602至604任一项的有义链，而所述第二寡核苷酸是包含其互补序列的反义链。
本发明中的siRNA包括所有具有一般RNAi(RNA干扰)作用的材料，并且因此，CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA包括CTGF、Cyr61或Plekho1特异性的shRNA等，这对于本领域技术人员是显而易见的。
SEQ ID NO:1至100，或602至604是CTGF(人)特异性siRNA的有义链序列，SEQ IDNO:101至200是Cyr61(人)特异性siRNA的有义链序列，SEQ ID NO:201至300是Plekho1(人)特异性siRNA的有义链序列，SEQ ID NO:301至400是CTGF(小鼠)特异性siRNA的有义链序列，SEQ ID NO:401至500是Cyr61(小鼠)特异性siRNA的有义链序列，SEQ ID NO:501至600是Plekho1(小鼠)特异性siRNA的有义链序列。
本发明的siRNA优选为CTGF特异性siRNA，其包含选自下组的任一个序列：SEQ IDNO:1至10，35，42，59，602，603，604，301至303，305至307，309，317，323和329，作为有义链，
Cyr61特异性siRNA，其包含选自下组的任一个序列：SEQ ID NO:101至110，124，153，166，187，197，409，410，415，417，418，420，422，424，427和429，作为有义链，或
Plekho1特异性siRNA，其包含选自下组的任一个序列：SEQ ID NO:201至210，212，218，221，223，504至507，514，515和522至525，作为有义链。
更优选地，根据本发明的siRNA是CTGF特异性siRNA，其包含选自下组的任一个序列：SEQ ID NO:4，5，8，9，35，42，59，601，602，604，301，303，307和323，作为有义链，
Cyr61特异性siRNA，其包含选自下组的任一个序列：SEQ ID NO:102，104，107，108，124，153，166，187，197，410，422和424，作为有义链，或
Plekho1特异性siRNA，其包含选自下组的任一个序列：SEQ ID NO:206至209，212，218，221，223，507，515和525，作为有义链。
最优选地，本发明的siRNA是CTGF特异性siRNA，其包含选自下组的任一个序列：SEQ ID NO:42，59，602和323，作为有义链，
Cyr61特异性siRNA，其包含选自下组的任一个序列：SEQ ID NO:124，153，187，197和424，作为有义链，或Plekho1特异性siRNA，其包含选自下组的任一个序列：SEQ ID NO:212，218，221，223和525，作为有义链。
具体而言，证实了本发明的人CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA的一些能够同时抑制小鼠CTGF、Cyr61或Plekho1的表达。
能够同时抑制小鼠CTGF、Cyr61或Plekho1的表达的siRNA包括根据SEQ ID NO:6或8的CTGF特异性siRNA的有义链，根据SEQ ID NO:102，104或105的Cyr61特异性siRNA的有义链，或根据SEQ ID NO:204，207或208的Plekho1特异性siRNA的有义链。
最优选地，所述siRNA包含根据SEQ ID NO:6的CTGF特异性siRNA的有义链，根据SEQ ID NO:102的Cyr61特异性siRNA的有义链，或根据SEQ ID NO:207的Plekho1特异性siRNA的有义链。
本发明的siRNA的有义链或反义链优选地具有19至31个核苷酸，且所述siRNA包括含有选自下组的任一序列：SEQ ID NO:1至604有义链和与其互补的反义链。
由于根据本发明的CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA具有碱基序列，所述碱基序列设计为能够互补地结合于编码相应基因的mRNA，所述相应基因的表达能被有效地抑制。此外，本发明的CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA可包含突出部分(overhang)，其是在siRNA的3’末端处包含1个或2个或更多未配对的碱基的结构，且可以包含多个siRNA修饰，以提供核酸裂合酶抗性，以及降低非特异性免疫响应用于提高体内稳定性。配置所述siRNA的第一寡核苷酸或第二寡核苷酸的修饰可为选自如下修饰的1个或多个组合：修饰，其中1个或多个核苷酸的糖结构中的2’碳处的–OH基团被-CH3(甲基)，-OCH3(甲氧基)，-NH2，-F(氟)，-O-2-甲氧基乙基、-O-丙基、-O-2-甲基硫乙基(methylthioethyl)、-O-3-氨基丙基、-O-3-二甲基氨基丙基、-O-N-甲基乙酰胺基或-O-二甲基氨基氧乙基取代；修饰，其中核苷酸的糖结构中的氧用硫取代；和从核酸结合修饰为硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、或甲基磷酸酯结合；或可为修饰为肽核酸(PNA)、修饰为锁核酸(LNA)、或修饰为解锁核酸(UNA)(Ann.Rev.Med.55,61-65 2004；US 5,660,985；US5,958,691；US6,531,584；US 5,808,023；US 6,326,358；US 6,175,001；Bioorg.Med.Chem.Lett.14:1139-1143,2003；RNA,9:1034-1048,2003；Nucleic Acid Res.31:589-595,2003；NucleicAcids Research,38(17)5761-5773,2010；Nucleic Acids Research,39(5)1823-1832,2011)。
本发明的CTGF，Cyr61和/或Plekho1特异性siRNA可抑制相应基因的表达，并且可显著抑制相应蛋白的表达。
本发明还提供缀合物，其中亲水性材料和疏水性材料缀合至siRNA的两端，用于体内有效递送呼吸疾病相关基因特异性的siRNA(具体为CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA)并用于提高其稳定性。
在siRNA缀合物(其中亲水性材料和疏水性材料结合至siRNA)中，自我组装的纳米颗粒通过疏水性材料的疏水作用而形成(参见韩国专利公开号1224828)，其中所述自我组装的纳米颗粒具有的优势在于内部递送效力和体内稳定性是显著优异的，并且粒径的一致性是优异的，从而容易进行质量控制(QC)，因此使生产药物的工艺简单。
在一个优选的示例性的实施方案中，根据本发明的含有CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA的双螺旋寡RNA结构优选含有如下结构式(1)代表的结构：
结构式(1)
A-X-R-Y-B
在结构式(1)中，A是亲水性材料，B是疏水性材料，X和Y各自独立为简单共价键或接头介导的共价键，且R是CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA。
更优选地，根据本发明的含有CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA的双螺旋寡RNA结构优选含有如下结构式(2)代表的结构：
结构式(2)
A-X-S-Y-B
AS
在结构式(2)中，A，B，X和Y与在结构式(1)中定义的相同，S是CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA的有义链，而AS是CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA的反义链。
更优选地，本发明的含有CTGF，Cyr61或Plekho1特异性siRNA的双螺旋寡RNA结构优选具有如下结构式(3)或(4)代表的结构：
结构式(3)
A-X-5'S3'-Y-B
AS
结构式(4)
A-X-3'S5'-Y-B
AS
在结构式(3)或(4)中，A、B、S、AS、X和Y与结构式(1)中所定义的相同，而5’和3’意指CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA的有义链的5’和3’端。
对于本领域技术人员显而易见的是，在结构式(1)至(4)中，1至3个磷酸基团可结合至CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA的双螺旋寡RNA结构的反义链的5’端，并且可以用shRNA来替代用siRNA。
结构式(1)至(4)中的亲水性材料优选为分子量为200至10,000的阳离子或非离子聚合物材料，更优选的是分子量为1,000至2,000的非离子聚合物材料。例如，非离子亲水性聚合物化合物如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚噁唑啉等优选用作亲水性聚合物材料，但本发明不一定局限于此。
具体而言，结构式(1)至(4)中的亲水性材料(A)可以由如下结构式(5)或(6)代表的亲水性材料嵌段(block)形式使用，并且通过根据需要使用适当数量(结构式(5)或(6)中的n)的亲水性材料嵌段，由多分散性(其可以在使用一般合成聚合物材料等情况下发生)引起的问题可以得到极大改善。
结构式(5)
(A'm-J)n
结构式(6)
(J-A'm)n
在结构式(5)中，其中A’是亲水性材料单体，J是用于连接其间的亲水性材料单体(总和为m)的接头，或用于连接亲水性材料单体(总和为m)与siRNA的接头，m是1-15的整数，n是1-10的整数，并且由(A’m-J)或(J-A’m)代表的重复单元对应于亲水性材料嵌段的基本单元。
当亲水性材料嵌段由结构式(5)或(6)代表时，根据本发明的含有CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA的双螺旋寡RNA结构可具有由如下结构式(7)或(8)代表的结构：
结构式(7)
(A'm-J)n-X-R-Y-B
结构式(8)
(J-A'm)n-X-R-Y-B
在结构式(7)或(8)中，X，R，Y和B与在结构式(1)中所定义的相同，而A’，J，m和n与结构式(5)或(6)中所定义的相同。
在结构式(5)或(6)中，亲水性材料单体A’是可以不受限使用的非离子亲水性聚合物的单体，只要其符合本发明的目标。亲水性材料单体A’优选为选自如下表1中所示化合物(1)至(3)的单体，更优选化合物(1)的单体，而化合物(1)中的G可优选地选自CH2，O，S和NH。
具体而言，在亲水性材料单体中，化合物(1)的单体可以具有引入至其中的多种官能团和良好的体内亲和力，并诱导小免疫响应，由此具有优良的生物相容性，并且此外还可以增加结构式(7)或(8)的结构中含有的寡核苷酸的体内稳定性，并且可以增加递送效力，其显著适于产生根据本发明的结构。
表1.本发明中的亲水性材料的单体结构
具体而言，结构式(5)至(8)中的亲水性材料优选具有1,000至2,000的总分子量。因此，例如，当化合物(1)代表的六乙二醇(hexaethylene glycol)(即G是O，且m是6)用于结构式(7)和(8)中时，六乙二醇间隔区的分子量为344，从而重复数量(n)优选为3至5。具体而言，结构式(5)和(6)中的(A’m-J)或(J-A’m)n代表的亲水性基团的重复单元(即亲水性材料嵌段)能根据需要以由n代表的适当数量使用。A是亲水性材料单体，J是各亲水性材料嵌段中包含的接头，A和J可以独立地彼此相同或彼此不同。即，当使用3个亲水性材料嵌段时(n＝3)，则在第一嵌段中使用化合物(1)的亲水性材料单体，在第二嵌段中使用化合物(2)的亲水性材料单体，在第三嵌段中使用化合物(3)的亲水性材料单体，等等。即，可以对所有亲水性材料嵌段使用不同的亲水性材料单体，并且可以在所有亲水性材料嵌段中同等地使用选自化合物(1)至(3)的亲水性材料单体的任一种亲水性材料单体。类似地，对于所有亲水性材料嵌段，介导亲水性材料单体的组合的接头也可以彼此相同或彼此不同。此外，m是亲水性材料单体的数量，在所有亲水性材料嵌段中所述亲水性材料单体可以彼此相同或彼此不同。即，第一亲水性材料嵌段中有3个亲水性材料单体连结(m＝3)，第二亲水性材料嵌段中有5个亲水性材料单体连结(m＝5)，第三亲水性材料嵌段中有4个亲水性材料单体连结(m＝4)，等等。即，各自具有不同的数量或具有相同的数量的亲水性材料单体都可以用于所有亲水性材料嵌段中。
此外，在本发明中，接头(J)优选地选自下组：PO3 -,SO3和CO2，但本发明不局限于此。对于本领域技术人员显而易见的是，任何接头都可以依赖于所使用的亲水性材料单体等来使用，只要其符合本发明的目的。
结构式(1)至(4)、(7)和(8)中的疏水性材料(B)用来形成纳米颗粒，所述纳米颗粒由结构式(1)至(4)、(7)和(8)的寡核苷酸结构通过疏水作用形成。所述疏水性材料优选具有250至1,000的分子量，并且可包括甾类衍生物、甘油酯衍生物、甘油醚、聚丙二醇、C12至C50不饱和或饱和烃、二酰基磷脂酰胆碱、脂肪酸、磷脂、脂多胺(lipopolyamine)等，但本发明不局限于此。对本领域技术人员显而易见的是，可使用任何疏水性材料，只要其符合本发明的目的。
甾类衍生物可选自胆甾醇、胆甾烷醇、胆酸、胆甾醇甲酸酯(cholesterylformate)、胆甾烷醇甲酸酯(cholestanyl formate)，和胆甾醇胺，并且所述甘油酯衍生物选自甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯等，其中所述甘油酯的脂肪酸优选为C12至C50不饱和或饱和脂肪酸。
具体而言，在疏水性材料中，饱和或不饱和烃或胆甾醇是优选的，这是由于其在本发明的寡核苷酸结构的合成步骤中能容易地结合，并且最优选的是C24烃，特别是包含二硫键的四二十二烷(tetradocosane)。
将疏水性材料结合至亲水性材料的远端，并且亲水性材料是否结合至siRNA的有义链或反义链的任何位置不重要。
本发明结构式(1)至(4)、(7)和(8)中的亲水性材料或疏水性材料通过简单共价键或接头介导的共价键(X或Y)结合至CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA。此外，将介导共价键的接头共价结合至CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA末端处的亲水性材料或疏水性材料，并且其不受特定限制，只要所述结合(其可能在特定环境中分解)是按照需要提供的。因此，在根据本发明的双螺旋寡RNA结构的生产中，用于结合以激活CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA的任何化合物和/或亲水性材料(或疏水性材料)可以用作接头。共价键可以是不可降解的键或可降解的键中的任一个。此处，不可降解的键的例子可包括酰胺键或磷酸键，而可降解的键的例子可包括二硫键、酸可降解键、酯键、酸酐键、生物可降解键或酶可降解键等，但本发明不局限于此。
此外，可以无限制地使用结构式(1)至(4)、(7)和(8)中R(或S和AS)所代表的任何CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA，只要其是能与CTGF、Cyr61或Plekho1特异性结合的siRNA。优选地，所述CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA由有义链和反义链组成，所述有义链包含选自SEQ ID NO:1至600和602至604的任一序列，而所述反义链包含其互补序列。
具体而言，根据本发明的结构式(1)至(4)、(7)和(8)中包含的siRNA优选为包含选自下组的任一序列作为有义链的CTGF特异性siRNA：SEQ ID NO:1至10，35，42，59，602至604或301至303，305至307，309，317，323和329，
包含选自下组的任一序列作为有义链的Cyr61特异性siRNA：SEQ ID NO:101至110，124，153，166，187，197，409，410，415，417，418，420，422，424，427和429，或
包含选自下组的任一序列作为有义链的Plekho1特异性siRNA：SEQ ID NO:201至210，212，218，221，223，504至507，514，515和522至525。
更优选地，根据本发明的siRNA是CTGF特异性的siRNA，其包含选自下组的任一序列作为有义链：SEQ ID NO:4，5，8，9，35，42，59，602，603，604，301，303，307和323，
Cyr61特异性siRNA，其包含选自下组的任一序列作为有义链：SEQ ID NO:102，104，107，108，124，153，166，187，197，410，422和424，或
Plekho1特异性siRNA，其包含选自下组的任一序列作为有义链：SEQ ID NO:206至209，212，218，221，223，507，515和525。
最优选地，本发明的siRNA是CTGF特异性siRNA，其包含SEQ ID NO:42，59，602或323的任一序列作为有义链，
Cry61特异性siRNA，其包含SEQ ID NO:124，153，187，197或424的任一序列作为有义链，或
Plekho1特异性siRNA，其包含SEQ ID NO:212，218，221，223或525的任一序列作为有义链。
此外，包含SEQ ID NO:6或8的人和小鼠CTGF特异性siRNA有义链的siRNA、包含SEQID NO:102，104或105的人或小鼠Cyr61特异性siRNA有义链的siRNA、和包含SEQ ID NO:204，207或208的人或小鼠Plekho1特异性siRNA有义链的siRNA是尤其优选的，这是因为具有所述有义链的序列的siRNA具有同时抑制人或小鼠CTGF、Cyr61或Plekho1表达的作用，因此包含SEQ ID NO:6的人和小鼠CTGF特异性siRNA有义链的siRNA、包含SEQ ID NO:102的人和小鼠Cyr61特异性siRNA有义链的siRNA、和包含SEQ ID NO:207的人和小鼠Plekho1特异性siRNA有义链的siRNA是最优选的。
在本发明的含有CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA的双螺旋寡RNA结构中，可以额外将胺基基团或多组氨酸基团引入所述结构中与亲水性材料的siRNA结合的远端部分中。
这使得能够容易地进行细胞间导入和从本发明的含有CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA的双螺旋寡RNA结构的核内体(endosome)逃脱，并且已经报道了引入氨基基团和使用多组氨酸基团以容易进行载体的细胞间导入和从核内体逃脱的可能性及其效果，所述载体如量子点(Quantum dot)、树形分子(Dendrimer)、脂质体等。
具体而言，已知载体末端或外部表现出的伯胺基团在体内pH质子化以通过静电相互作用与带负电荷的基因形成缀合物，且从核内体逃脱是容易进行的，这是由于内部叔胺在引入细胞后在核内体的低pH具有缓冲作用，从而能够保护载体不被溶酶体分解(genedelivery and expression inhibition using a polymer-based hybridmaterial.Polymer Sci.Technol.，Vol.23,No.3,pp254-259)。
此外，已知组氨酸是一种非必需氨基酸，其在残基(-R)处具有咪唑环(pKa36.04)，以增加核内体和溶酶体中的缓冲能力，使得组氨酸表达可以用于增加从非病毒基因载体(包括脂质体)中核内体的逃脱效率(Novel histidine-conjugated galactosylatedcationic liposomes for efficient hepatocyte selective gene transfer in humanhepatoma HepG2cells.J.Controlled Release118,pp262-270)。
可以通过至少一个接头将胺基基团或多组氨酸基团连接至亲水性材料或亲水性材料嵌段。
当将胺基基团或多组氨酸引入至结构式(1)所代表的双螺旋寡RNA结构的亲水性材料中时，双螺旋寡RNA结构可以具有如下结构式(9)所代表的结构：
结构式(9)
P-J1-J2-A-X-R-Y-B
在结构式(9)中，A，B，R，X和Y与结构式(1)中所定义的一样，
P是胺基基团或多组氨酸基团。J1和J2是接头并且可各自独立地选自简单共价键，PO3 -，SO3，CO2，C2-12烷基、烯基和炔基，但本发明不局限于此。对本领域技术人员显而易见的是，依赖于所使用的亲水性材料可以使用任何接头如J1和J2，只要其符合本发明的目的。
优选地，当引入胺基基团时，J2优选为简单共价键或PO3-，而J1优选为C6烷基，但本发明不局限于此。
此外，当引入多组氨酸基团后，在结构式(9)中，J2优选为简单共价键或PO3 -，而J1优选为如下的化合物(4)，但本发明不局限于此。
化合物(4)
此外，当结构式(9)代表的双螺旋寡RNA结构的亲水性材料是结构式(5)或(6)代表亲水性材料嵌段，且引入了胺基基团或多组氨酸基团时，双螺旋寡RNA结构可以由结构式(10)或(11)代表：
结构式(10)
P-J1-J2-(A'm-J)n-X-R-Y-B
结构式(11)
P-J1-J2-(J-A'm)n-X-R-Y-B
在结构式(10)或(11)中，X，R，Y，B，A’，J，m和n与结构式(5)或(6)中所定义的相同，并且P，J1和J2与结构式(9)中所定义的相同。
具体而言，在结构式(10)或(11)中，亲水性材料优选结合至CTGF，Cyr61或Plekho1特异性siRNA的有义链的3’端，并且在这种情况下，结构式(9)至(11)可以由如下结构式(12)至(14)代表：
结构式(12)
P-J1-J2-A-X-3'S5'-Y-B
AS
结构式(13)
P-J1-J2-(A'm-J)n-X-3'S5'-Y-B
AS
结构式(14)
P-J1-J2-(J-A'm)n-X-3'S5'-Y-B
AS
结构式(12)至(14)中，X，R，Y，B，A，A’J，m，n，P，J1和J2与结构式(9)至(11)中所定义的相同，而5’和3’意指CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA的有义链的5’端和3’端。
可引入本发明的胺基基团可以是伯胺至叔胺基，而伯胺基是特别优选的。引入的胺基基团可作为胺盐存在。例如，伯胺基的盐可以NH3+的形式存在。
此外，可引入本发明的多组氨酸基团优选包含3-10个组氨酸，更优选5-8个组氨酸，而最优选6个组氨酸。除组氨酸外，还可以额外包含至少一个半胱氨酸(cystein)。
同时，当靶向的部分提供于含有本发明的CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA的双螺旋寡RNA结构及由此形成的纳米颗粒中时，其有效促进了向靶细胞的递送，从而以甚至相对较低的剂量浓度实现向靶细胞的递送，由此显示出对靶基因表达的高控制功能，并由此避免CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA被非特异性递送进入其他器官和细胞。
因而，本发明提供双螺旋寡RNA结构，其中配体(L)，具体而言是特异性结合至受体通过受体介导的胞吞(RME)促进靶细胞内化的配体，其额外地结合至根据结构式(1)至(4)、(7)和(8)的结构。例如，配体结合至根据结构式(1)双螺旋寡RNA结构的形式具有如下结构式(15)代表的结构：
结构式(15)
(Li-Z)-A-X-R-Y-B
在结构式(15)中，A，B，X和Y与结构式(1)中所定义的相同，L是配体，其特异性地结合至通过受体介导的胞吞(RME)促进靶细胞内化的受体，而i代表1-5的整数，优选为1-3的整数。
结构式(15)的配体可优选选自下组：靶受体特异性的抗体或适配体，具有RME用于以靶细胞特异性的方式促进细胞内化的性质的肽；或叶酸(盐)(通常叶酸盐(folate)和叶酸(folic acid)交叉使用，且本发明中的叶酸(盐)意指自然状态或人体中活化状态下的叶酸(盐))，化学品如糖、碳水化合物等等，包括六胺类(hexoamines)如N-乙酰半乳糖胺(NAG)等等，葡萄糖，甘露糖，但本发明不局限于此。
此外，结构式(15)中的亲水性材料A可以结构式(5)或(6)代表的亲水性材料嵌段的形式使用。
本发明还提供用于产生含有CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA的双螺旋寡RNA结构的方法。
本发明用于产生含有CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA的双螺旋寡RNA结构的方法可以包括如下步骤：
(1)基于固体支持物结合亲水性材料；
(2)基于含有与其结合的亲水性材料的固体支持物合成RNA单链；
(3)将疏水性材料共价结合至RNA单链的5’端；
(4)合成RNA单链，其具有与所述RNA单链的序列互补的序列；
(5)当完成RNA单链合成时，从固体支持物分离和纯化RNA-聚合物结构和RNA单链；及
(6)通过使RNA-聚合物结构和具有与其互补序列的RNA单链退火而产生双螺旋寡RNA结构。
本发明中的固体支持物优选为可控孔径玻璃(CPG)，但本发明并不局限于此，但可为聚苯乙烯，硅胶，纤维素纸等。在CPG中，直径优选为40至180μm，而孔径优选为500至在上述步骤(5)后，当生产完成时，可通过MALDI-TOF质谱仪测量分子量来证实纯化的RNA-聚合物结构和纯化的RNA单链是否是作为合意的RNA-聚合物结构和合意的RNA单链生产的。在生产方法中，步骤(4)是合成具有与步骤(2)中合成的RNA单链序列互补的序列的RNA单链的步骤，其可以在步骤(1)之前进行或在步骤(1)至(5)的任一步骤过程中进行。
此外，具有与步骤(2)中合成的RNA单链互补的序列的RNA单链可以含有与其5’端结合的磷酸基。
同时，本发明提供用于产生双螺旋寡RNA结构的方法，其中配体额外地与含有CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA的双螺旋寡RNA结构结合。
产生含有本发明与配体结合的CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA的双螺旋寡RNA结构的方法可以包括如下步骤：
(1)将亲水性材料结合至含有与其结合的官能团的固体支持物；
(2)基于含有与其结合的官能团-亲水性材料的固体支持物合成RNA单链；
(3)将亲水性材料共价结合至RNA单链的5’端；
(4)合成具有与所述RNA单链序列互补的序列的RNA单链；
(5)当完成RNA单链合成时，从固体支持物分离具有互补序列的RNA单链和官能团-RNA-聚合物结构；
(6)通过使用官能团将配体结合至亲水性材料的末端以产生配体-RNA-聚合物结构单链；及
(7)通过使配体-RNA-聚合物结构和具有与其互补序列的RNA单链退火以产生配体-双螺旋寡RNA结构。
在上述步骤(6)之后，当生产完成时，是否制备了合意的配体-双螺旋寡RNA结构和合意的具有与之互补序列的RNA单链，这可以通过分离和纯化配体-RNA-聚合物结构和具有与之互补序列的RNA单链、并通过MALDI-TOF质谱仪测量分子量来予以确认。配体-双螺旋寡RNA结构可以通过使制备的配体-RNA-聚合物结构和具有与其互补序列的RNA单链退火来产生。在所述生产方法中，步骤(4)是合成具有与步骤(3)中合成的RNA单链序列互补的序列的RNA单链的步骤，步骤(4)是独立的合成过程，并且可以在步骤(1)之前进行或在步骤(1)至(6)的任一步骤过程中进行。
本发明还提供包含双螺旋寡RNA结构的纳米颗粒，所述双螺旋寡RNA结构含有CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA。
如上所述，含有CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA的双螺旋寡RNA结构是含有疏水性材料和亲水性材料的两亲性结构，其中所述亲水性材料通过相互作用(如氢键等)而与体内存在的水分子具有亲和力从而朝向外部，而疏水性材料通过其间的疏水相互作用而朝向内部，由此形成热力学稳定的纳米颗粒。即，疏水性材料置于纳米颗粒的中心，而亲水性材料置于CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA的外部方向，以形成保护CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA的纳米颗粒。这些形成的纳米颗粒改进CTGF、Cyr61和/或Plekho1特异性siRNA的细胞内递送并改进siRNA的效果。
本发明的纳米颗粒可仅由含有各自具有彼此相同的序列的siRNA的双螺旋寡RNA结构形成，或可由含有各自具有不同序列的siRNA的双螺旋寡RNA结构形成，其中本发明中可以理解的是，各自具有不同的序列的siRNA包含具有不同靶基因的siRNA，例如CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA，或具有相同靶基因特异性但具有不同序列的siRNA。
此外，除CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA外，含有其他呼吸疾病相关基因特异性siRNA的双螺旋寡RNA结构也可包括在本发明的纳米颗粒中。
此外，本发明提供用于预防或治疗呼吸疾病的组合物，所述呼吸疾病具体为特发性肺纤维化和COPD，包括CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA，含有所述siRNA的双螺旋寡RNA结构，和/或由所述双螺旋寡RNA结构形成的纳米颗粒。
包含本发明的CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA、含有所述siRNA的双螺旋寡RNA结构，和/或由所述双螺旋寡RNA结构形成的纳米颗粒作为有效成分的组合物，抑制肺动脉重构(pulmonary artery remodeling)和气道重构(airway remodeling)，从而使CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA或含有siRNA的组合物具有预防或治疗呼吸疾病的效果。
具体而言，包含本发明的双螺旋寡RNA结构的用于预防或治疗呼吸疾病的组合物可以包括：
包含CTGF特异性siRNA的双螺旋寡RNA结构，所述CTGF特异性的siRNA包含有义链以及包含与其互补的序列的反义链，所述有义链包含选自下组的任一序列：SEQ ID NO:1至100或602至604和301至400，优选为选自下组的任一序列：SEQ ID NO:1至10，35，42，59，602至604，301至303，305至307，309，317，323和329，更优选的是选自下组的任一序列：SEQ IDNO:4，5，8，9，35，42，59，602至604，301，303，307和323，最优选的是选自下组的任一序列：SEQ ID NO:42，59，602或323；
包含Cyr61特异性siRNA的双螺旋寡RNA结构，所述Cyr61特异性的siRNA包含有义链以及包含与其互补的序列的反义链，所述有义链包含选自下组的任一序列：SEQ ID NO:101至200和401至500，优选为选自下组的任一序列：SEQ ID NO:101至110，124，153，166，187，197，409，410，415，417，418，420，422，424，427和429，更优选为选自下组的任一序列：SEQ ID NO:102，104，107，108，124，153，166，187，197，410，422和424，最优选为选自下组的任一序列：SEQ ID NO:124，153，187，197或424；或
包含Plekho1特异性siRNA的双螺旋寡RNA结构，所述Plekho1特异性的siRNA包含有义链以及包含与其互补的序列的反义链，所述有义链包含选自下组的任一序列：SEQ IDNO:201至300和501至600，优选为选自下组的任一序列：SEQ ID NO:201至210，212，218，221，223，504至507，514，515和522至525，更优选为选自下组的任一序列：SEQ ID NO:206至209，212，218，221，223，507，515，和525，最优选为选自下组的任一序列：SEQ ID NO:212，218，221，223或525。
此外，包含本发明的双螺旋寡RNA结构的用于预防或治疗呼吸疾病的组合物可包括：包含CTGF特异性的siRNA的双螺旋寡RNA结构，所述CTGF特异性的siRNA包含根据SEQ IDNO:6或8、优选为SEQ ID NO:6的序列的人或小鼠CTGF特异性的siRNA的有义链，以及包含其互补序列的反义链；
包含Cyr61特异性的siRNA的双螺旋寡RNA结构，所述Cyr61特异性的siRNA包含根据SEQ ID NO:102，104和105任一者、优选为SEQ ID NO:102的序列的人或小鼠Cyr61特异性的siRNA的有义链，以及包含其互补序列的反义链；或
包含Plekho1特异性的siRNA的双螺旋寡RNA结构，所述Plekho1特异性的siRNA包含根据SEQ ID NO:204，207和208任一者、优选为SEQ ID NO:207的序列的人或小鼠Plekho1特异性的siRNA的有义链，以及包含其互补序列的反义链。
此外，含有CTGF特异性siRNA的双螺旋寡RNA结构、含有Cyr61特异性siRNA的双螺旋寡RNA结构、和/或含有Plekho1特异性siRNA的双螺旋寡RNA结构可以混合并包含于组合物中，并且此外，特异性针对除CTGF、Cry61或Plekho1之外的其他呼吸疾病相关基因的siRNA或含有其他呼吸疾病相关基因特异性的siRNA的双螺旋寡RNA结构也可包含于本发明的组合物中。
在将组合物用于预防或治疗呼吸疾病时，可获得类似联合治疗的协同效应，所述组合物额外包含双螺旋寡RNA结构，其含有其他呼吸疾病相关基因特异性的siRNA连同CTGF、Cyr61和/或Plekho1特异性siRNA；或是包含双螺旋寡RNA结构，其含有CTGF、Cyr61和/或Plekho1特异性的siRNA。
能通过本发明的组合物预防或治疗的呼吸疾病的例子包括特发性肺纤维化、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性或慢性支气管炎、过敏性鼻炎、咳嗽和痰、急性下呼吸道感染、支气管炎、和细支气管炎、急性上呼吸道感染、咽炎、扁桃体炎、喉炎，等等，但本发明不局限于此。
此外，所述组合物中包含的用于预防或治疗呼吸疾病的纳米颗粒，包括由本发明的双螺旋寡RNA结构形成的纳米颗粒，可以仅由选自含有CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA的双螺旋寡RNA结构的任一结构组成，或可以以这样的形式配置，其中两种或更多种包含CTGF、Cyr61或Plekho1特异性siRNA的双螺旋寡RNA结构互相混合。
本发明的组合物可通过在有效组分之外额外包含至少一种药学上可接受的载体而制备。所述药学上可接受的载体需要与本发明的有效成分相适配，并可以通过混合选自如下的一种或多种组分来使用：盐水、无菌水、林格氏溶液(Ringer’s solution)、缓冲盐水、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油和乙醇，而其他常规添加剂如抗氧化剂、缓冲剂、抑真菌剂等可根据需要添加至其中。此外，所述组合物可以制备为用于注射的制剂，如水溶液、悬液、乳剂等，所述制备通过额外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂至其中而进行。具体而言，优选提供制备为冻干制剂的组合物。为了制备冻干制剂，可使用本发明所属技术领域一般已知的任何方法，其中用于冻干的稳定剂可以添加至其中。此外，本领域适当的方法或Remington的药物科学(Remington's pharmaceutical Science)，Mack出版社或或Easton PA中公开的方法可优选用于制剂，其取决于各疾病或成分。
本发明的药物组合物中所含的有效成分的剂量和施用方法等可基于一般患者的症状和疾病的严重程度由本领域普通专家来确定。此外，组合物可以多种类型来配制，如粉剂、片剂、胶囊、溶液、注射剂、软膏剂(ointment)、糖浆等，并可作为单位剂量或多剂量容器提供，例如密封安瓿、瓶子等等。
本发明药物组合物可口服或胃肠外施用。根据本发明的药物组合物的施用途径的例子可包括口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、硬膜内、心内、经皮、皮下、腹膜内、经肠、舌下或局部施用，但本发明不局限于此。具体而言，施用途径还可以包括通过呼吸器官内滴注施用入肺用于呼吸疾病的治疗。组合物的施用量可以具有多种范围，其取决于患者的重量、年龄、性别、健康状态、饮食、施用时间、方法、排泄率，疾病严重程度等，并且可以由本领域普通专家容易地确定。此外，本发明的组合物可通过使用临床施用已知的技术来配制于合适的剂型中。
此外，本发明提供用于预防或治疗呼吸疾病(具体是特发性肺纤维化和COPD)的方法，包括：对需要此种治疗的患者施用本发明的双螺旋寡RNA结构和包含所述双螺旋寡RNA结构的纳米颗粒。
实施例
下文通过参考如下实施例详细描述了本发明。这些实施例仅用于例示本发明，并且对于本领域技术人员显而易见的是，本发明的范围不应理解为限于这些实施例。
实施例1：CTGF、Cyr61或Plekho1的靶序列设计和siRNA的产生
设计了能与CTGF(人)基因的mRNA序列(NM_001901)、Cyr61(人)基因的mRNA序列(NM_001554)、Plekho1(人)基因的mRNA序列(NM_016274)、CTGF(小鼠)基因的mRNA序列(NM_010217)、Cyr61(小鼠)基因的mRNA序列(NM_010516)、或Plekho1(小鼠)基因的mRNA序列(NM_023320)结合的604种靶序列(有义链)，并且产生了具有与靶序列互补的序列的反义链的siRNA。
首先，使用Bioneer Co.开发的基因设计程序(Turbo si-Designer)来设计siRNA能结合于相应基因的mRNA序列的靶序列。本发明的呼吸疾病相关基因的siRNA具有双链结构，其包含由19个核苷酸组成的有义链和与之互补的反义链。此外，产生了siCONT(具有SEQID NO:601的序列作为有义链)，其是具有这样的序列的siRNA，其中任何基因的表达都不受抑制。siRNA通过如下方法来提供：通过使用β-氰乙基亚磷酰胺，连接磷酸二酯键形成RNA骨架结构(Nucleic Acids Research,12:4539-4557,1984)。具体而言，通过使用RNA合成仪(384Synthesizer,BIONEER,Korea)在核酸所附接的固体支持物上重复去封闭(deblocking)、偶联、氧化和加帽(capping)的一系列过程，获得包含具有合意的长度的RNA的反应产物。通过装载了Daisogel C18(Daiso,Japan)柱的HPLC LC918(Japan AnalyticalIndustry,Japan)分离和纯化反应产物的RNA，并且通过MALDI-TOF质谱仪(Shimadzu,Japan)确认是否纯化的RNA与靶序列匹配。然后，通过将RNA有义链结合至RNA反义链来产生合意的双链siRNA(SEQ ID NO:1至604)。
实施例2：双螺旋寡RNA结构(PEG-SAMiRNA)的产生
本发明中产生的双螺旋寡RNA结构(PEG-SAMiRNA)具有如下结构式(16)代表的结构：
结构式(16)
C24-5'-S-3'-PEG
AS
在结构式(16)中，S是siRNA的有义链；AS是siRNA的反义链；PEG是亲水性材料，即聚乙二醇；C24是疏水性材料和含有二硫键的四二十二烷(tetradocosane)；而5’和3’意指双螺旋寡RNA末端的方向。
结构式(16)的siRNA的有义链通过合成有义链的双螺旋寡RNA-亲水性材料结构而产生，其中聚乙二醇通过上述方法与3’端连接，所述方法中形成RNA骨架结构的磷酸二酯键通过使用β-氰乙基亚磷酰胺来连接，其是基于韩国专利公开公布号10-2012-0119212的实施例1产生的3’聚乙二醇(PEG,Mn＝2,000)-CPG作为支持物，并将含二硫键的四二十二烷连接至5’端，由此产生合意的RNA-聚合物结构的有义链。对于反义链(其中退火以有义链进行)而言，具有与有义链互补的序列的反义链通过上述反应产生。
当合成完成时，通过在60℃水浴中处理28％(v/v)氨而将合成的RNA单链和RNA-聚合物结构从CPG分离，并且通过去保护反应分别从其去除保护模块。用N-甲基吡咯烷酮、三乙胺、三乙胺三氢氟酸盐(triethylaminetrihydrofluoride)以10:3:4的体积比在70℃的烘箱中处理RNA单链和RNA-聚合物结构(保护模块从其去除)，以去除2′TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷基)。
通过装载了Daisogel C18(Daiso,Japan)柱的HPLC LC918(Japan AnalyticalIndustry,Japan)分离和纯化反应产物的RNA，并通过MALDI-TOF质谱仪(Shimadzu,Japan)确认了纯化的RNA是否与靶序列匹配。然后，为了产生各个双螺旋寡RNA结构，各自具有相同量的有义链和反义链互相混合，置于1X退火缓冲液(30mM HEPES，100mM乙酸钾，2mM乙酸镁，pH 7.0～7.5)中，并在90℃恒温水浴中反应3分钟，并在37℃再次反应，由此产生含有siRNA的各双螺旋寡RNA结构，所述siRNA具有SEQ ID NO:42，59，602，124，153，187，197，212，218，221，223，323，424，525或601的序列作为有义链(下文分别称为SAMiRNALP-hCTGF，SAMiRNALP-hCyr，SAMiRNALP-hPlek，SAMiRNALP-mCTGF，SAMiRNALP-mCyr，和SAMiRNALP-mPlek SAMiRNALP-CONT)。通过电泳确认，产生的双螺旋寡RNA结构已退火。
实施例3：改进的双螺旋寡RNA结构(Mono-HEG-SAMiRNA)的产生。
在本发明中产生的改进的双螺旋寡RNA结构通过使用[PO3--六乙二醇]4(下文称“Mono-HEG-SAMiRNA”，参见结构式(17))来获得，该结构为亲水性材料嵌段，而不使用作为亲水性材料的PEG，该结构具有如下结构式(17)：
结构式(17)
C24-5'-S-3'-[(六乙二醇)-PO3’]4
AS
结构式(17)，S是siRNA的有义链；AS是siRNA的反义链；[六乙二醇]4是亲水性材料单体；C24是疏水性材料和包含二硫键的四二十二烷/二十四烷；5’和3’意指双螺旋寡RNA有义链末端的方向。
根据结构式(17)的Mono-HEG SAMiRNA的结构可由如下结构式(18)代表：
结构式(18)
通过装载有Daisogel C18(Daiso，Japan)柱的HPLC LC918(Japan AnalyticalIndustry，Japan)分离和纯化反应产物的RNA，并通过MALDI-TOF质谱仪(Shimadzu，Japan)确认了纯化的RNA是否与靶序列匹配。然后，为了产生各双螺旋寡RNA结构，将各自具有相同量的有义链和反义链互相混合，置于1X退火缓冲液(30mM HEPES，100mM乙酸钾，2mM乙酸镁，pH 7.0～7.5)中，并在90℃常温水浴中反应3分钟，并在37℃再次反应，由此产生各含有具有SEQ ID NO:42，59，602，124，153，187，197，212，218，221，223，323，424，525或601的序列作为有义链的siRNA的双螺旋寡RNA结构(下文分别称为Mono-HEG-SAMiRNALP-hCTGF，Mono-HEG-SAMiRNALP-hCyr，Mono-HEG-SAMiRNALP-hPlek，Mono-HEG-SAMiRNALP-mCTGF，Mono-HEG-SAMiRNALP-mCyr，Mono-HEG-SAMiRNALP-mPlek，和Mono-HEG-SAMiRNALP-CONT)。通过电泳确认，产生的双螺旋寡RNA结构已退火。
实施例4：由改进的双螺旋寡RNA结构(Mono-HEG-SAMiRNA)形成的纳米颗粒的产生及其尺寸的测量
实施例3产生的双螺旋寡RNA结构(Mono-HEG-SAMiRNA)形成纳米颗粒，其为通过与双螺旋寡RNA末端结合的疏水性材料之间的疏水作用的胶束(图1)。
经证实，由相应的Mono-HEG-SAMiRNA形成的纳米颗粒(SAMiRNA)是通过分析由Mono-HEG-SAMiRNA-hCTGF，Mono-HEG-SAMiRNA-hCyr，Mono-HEG-SAMiRNA-hPlek，Mono-HEG-SAMiRNA-mCTGF，Mono-HEG-SAMiRNA-mCyr，Mono-HEG-SAMiRNA-mPlek和Mono-HEG-SAMiRNA-CONT形成的纳米颗粒的PDI(多分散指数)而形成的。
实施例4-1：纳米颗粒的产生
将Mono-HEG-SAMiRNA-hCTGF以50μg/ml的浓度溶解于1.5ml DPBS(Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水)中，将所得的混合物在-75℃和5mTorr条件处冻干48小时以产生纳米颗粒粉，并将纳米颗粒粉溶解于DPBS中，所述DPBS是用于产生的均匀化纳米颗粒的溶剂。通过相同方法制成了由Mono-HEG-SAMiRNA-hCyr，Mono-HEG-SAMiRNA-hPlek，Mono-HEG-SAMiRNA-mCTGF，Mono-HEG-SAMiRNA-mCyr，Mono-HEG-SAMiRNA-mPlek和Mono-HEG-SAMiRNA-CONT形成的纳米颗粒。
实施例4-2：纳米颗粒尺寸和多分散指数的测量
通过ζ电位(zeta-potential)测量法来测量纳米颗粒的尺寸。通过实施例4-1产生的均匀化的纳米颗粒的尺寸通过ζ电位测量法(Nano-ZS，MALVERN,England)在这样的条件下来测量，其中材料的折射指数(refractive index)为1.459，吸收指数为0.001，溶剂温度：DPBS为25℃，而对应的粘度和折射指数分别为1.0200和1.335。当测量通过尺寸测量法来进行时，其包括重复15次以及随后重复6次。
随着PDI值降低，相应的颗粒变得均匀分布，因此可理解本发明的纳米颗粒具有显著统一的尺寸。
实施例5：在人成纤维细胞系(MRC-5)中用人的靶基因特异性siRNA确认对靶基因表达的抑制
人成纤维细胞(MRC-5)是一种成纤维细胞系，用具有实施例1中产生的SEQ ID NO:1至10，101至110，201至210和601的序列作为有义链的siRNA对其进行转化，并在经转化的成纤维细胞系(MRC-5)中分析靶基因的表达方面。
实施例5-1：人成纤维细胞系的培养
将获取自韩国细胞系库(KCLB)的人成纤维细胞系的培养(MRC-5)置于RPMI-1640培养基(GIBCO/Invitrogen，USA，10％(v/v)胎牛血清，青霉素100单位/ml和100μg/ml的链霉素)中在37℃和5％(v/v)CO2的条件下进行培养。
实施例5-2：将靶siRNA转染至人成纤维细胞系中
将1.8×105个通过实施例5-1培养的成纤维细胞(MRC-5)在6孔板中的RPMI 1640培养基中在37℃和5％(v/v)CO2的条件下培养18小时，并去除培养基，并向各孔添加500μl的Opti-MEM培养基(GIBCO，USA)。
同时，将3.5μl的LipofectamineTMRNAi Max(Invitrogen，USA)与246.5μl的Opti-MEM培养基混合以制备混合溶液，并在室温将混合溶液反应5分钟。通过添加5或20μl的具有实施例1中的SEQ ID NO:1至10，101至110，201至210和601的序列作为有义链的siRNA(1皮摩/μl)至230μl的Opti-MEM培养基而制备终浓度分别为5或20nM的siRNA溶液。将LipofectamineTMRNAi Max混合物和siRNA溶液混合并在室温下反应15分钟，由此制备用于转染的溶液。
然后，向含有分配于其中的Opti-MEM的肿瘤细胞系的各孔中分配各500μl的转染溶液，并培养6小时，然后去除Opti-MEM培养基。此处，将1ml的RPMI 1640培养基分配于其中，并在37℃和5％(v/v)CO2的条件下培养24小时。
实施例5-3：靶基因mRNA的定量分析
通过从实施例5-2的转染的细胞系提取总RNA产生cDNA，并通过实时PCR对靶基因的mRNA表达量进行相对定量。
实施例5-3-1：从转染的细胞分离RNA及产生cDNA
通过RNA提取试剂盒(AccuPrep Cell total RNA extraction kit,BIONEER,Korea)从实施例5-2的经转染的细胞系提取总RNA，并根据如下方法通过RNA逆转录酶(AccuPower CycleScript RT Premix/dT20,Bioneer,Korea)使用提取的RNA产生cDNA。具体地，将每管1μg的提取的RNA添加于0.25ml Eppendorf管中所含的AccuPowerCycleScript RT Premix/dT20(Bioneer,Korea)，并向其添加用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理的蒸馏水以具有20μl总体积。通过基因扩增仪(MyGenieTM96Gradient Thermal Block,BIONEER,Korea)将RNA和引物在30℃杂交1分钟的过程和在52℃产生cDNA的4分钟过程重复6次，然后通过在90℃灭活酶5分钟来完成扩增反应。
实施例5-3-2：靶基因mRNA的相对定量分析
呼吸疾病相关基因mRNA的相对量通过如下方法由实时PCR进行定量，所述实时PCR具有由实施例5-3-1所产生的cDNA作为模板。在96孔板的每个孔中用蒸馏水将由实施例5-3-1所产生的cDNA稀释5倍。然后，将3μl的稀释后的cDNA、25μl的2×GreenStarTMPCR MasterMix(BIONEER,Korea)、19μl的蒸馏水和3μl的qPCR引物(表2；F和R各具有10皮摩/μl；BIONEER，Korea)添加至其中，以制备各混合溶液。同时，RPL13A(核糖体蛋白L13a)是一种看家基因(下文称HK基因)，其被确定为用于将靶基因mRNA的表达量标准化的基准基因。如下反应在含有混合物的96孔板上通过ExicyclerTM96Real-Time Quantitative ThermalBlock(BIONEER,Korea)进行。在95℃反应15分钟以激活酶并去除cDNA的二级结构，然后将4个过程重复42次，所述4个过程包括：94℃变性30秒的过程，58℃退火30秒的过程，72℃延伸30秒的过程，和SYBR Green扫描的过程，并在72℃最终延伸3分钟。然后，将温度在55℃维持1分钟，并从55℃直至95℃分析溶解曲线。完成PCR后，对于每个获得的靶基因的Ct(阈值循环)值，计算通过GAPDH基因校正的靶基因的Ct值，然后通过使用用siRNA(SEQ ID NO:601,siCONT)处理的测试组来获得差值(ΔCt)，所述siRNA具有防止基因表达抑制的对照序列，作为对照组。
用CTGF(人)特异性siRNA(具有SEQ ID NO:1至10的序列作为有义链)处理的细胞的靶基因的表达量通过使用ΔCt值和计算公式2(-ΔCt)×100来进行相对定量(图2A)。此外，用Cyr61(人)特异性siRNA(具有SEQ ID NO:101至110的序列作为有义链)处理的细胞的靶基因的表达量进行相对定量(图2B)，用Plekho1(人)特异性siRNA(具有SEQ ID NO:201至210的序列作为有义链)处理的细胞的靶基因的表达量进行相对定量(图2C)。
结果可以确认，本发明的一些种类的siRNA显示出对靶基因表达的高抑制水平。此外，为了高效地选择siRNA，选择了具有SEQ ID NO:1，3，4，8，9，10，102，104，105，106，107，108，109，204，206，207，208，209和210的序列作为有义链的siRNA，其中每个基因在5nM浓度的mRNA表达量显著降低。
表2：qPCR引物序列
(m,小鼠；h,人；F,正向引物；R-反向引物)
实施例6：在人成纤维细胞系(MRC-5)中选择具有高效的人的靶基因特异性siRNA
通过使用siRNA来转化人成纤维细胞系(MRC-5)，所述siRNA具有由实施例5-3-2选择的SEQ ID NO:1，3，4，8，9，10，102，104，105，106，107，108，109，204，206，207，208，209，210和601的序列作为有义链，并在转化的成纤维细胞系(MRC-5)中分析靶基因的表达方面以选择具有高效的siRNA。
实施例6-1：人成纤维细胞系的培养
获取自韩国细胞系库(KCLB，Korea)的人成纤维细胞系(MRC-5)在与实施例5-1相同的条件下进行培养。
实施例6-2：将靶siRNA转染入成纤维细胞系
实施例6-1培养的1.8×105个成纤维细胞系(MRC-5)在6孔板中的RPMI1640培养基中在37℃和5％(v/v)CO2的条件下培养18小时，并去除培养基，并向各孔分配500μl的Opti-MEM培养基(GIBCO，USA)。
同时，将3.5μl的LipofectamineTMRNAi Max(Invitrogen，USA)与246.5μl的Opti-MEM培养基混合以制备混合溶液，并将混合溶液在室温反应5分钟。各自具有0.2或1nM的终浓度的siRNA溶液通过添加0.2或1μl的siRNA(1皮摩/μl)至230μl的Opti-MEM培养基而制备，所述siRNA具有实施例1的SEQ ID NO:1，3，4，8，9，10，102，104，105，106，107，108，109，204，206，207，208，209，210和601的序列作为有义链。将LipofectamineTMRNAi Max混合物和siRNA溶液混合并在室温反应15分钟，由此制备用于转染的溶液。
然后，将500μl的各转染溶液分配至含有分配于其中的Opti-MEM的肿瘤细胞系的各孔中，培养6小时，并去除Opti-MEM培养基。此处，将1ml的RPMI1640培养基分配于其中，并在37℃和5％(v/v)CO2的条件下培养24小时。
实施例6-3：靶基因mRNA的定量分析
通过从实施例6-2的转染的细胞系按照实施例4-3的方法提取总RNA产生cDNA，并通过实时PCR对靶基因的mRNA表达量进行相对定量。观察低浓度siRNA治疗对靶基因表达的抑制量，以明确确认各siRNA效力，并确认具有SEQ ID NO:8、107和206的序列作为有义链的siRNA显示出对靶基因表达的相对高水平的抑制，即使是在显著低浓度处(图3)。
实施例7：在人肺癌细胞系(A549)中用人的靶基因特异性siRNA来确认靶基因表达的抑制
人肺癌细胞系(A549)是由siRNA转化的肺癌肿瘤细胞系，所述siRNA具有实施例1的SEQ ID NO:35，42，59，602，603，604，124，153，166，187，197，212，218，221，223和601的序列作为有义链，并在转化的肺癌细胞系(A549)中分析靶基因的表达方面。
实施例7-1：人肺癌细胞系的培养
将获取自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)的人肺癌细胞系(A549)在37℃和5％(v/v)CO2的条件下培养于DMEM培养基(GIBCO/Invitrogen，USA，10％(v/v)胎牛血清，青霉素100单位/ml和100μg/ml的链霉素)中。
实施例7-2：将靶siRNA转染至人肺癌细胞系中
将实施例7-1培养的1.2×105个肺癌细胞系(A549)在6孔板中的DMEM培养基中在37℃和5％(v/v)CO2的条件下培养18小时，并去除培养基，并向各孔分配500μl的Opti-MEM培养基(GIBCO，USA)。
同时，将3.5μl的LipofectamineTMRNAi Max(Invitrogen，USA)与246.5μl的Opti-MEM培养基混合以制备混合溶液，并使混合溶液在室温反应5分钟。通过向230μl的Opti-MEM培养基添加1μl的(1皮摩/μl)具有实施例1的SEQ ID NO:35，42，59，602，603，604，124，153，166，187，197，212，218，221和223的序列作为有义链的siRNA，从而制备各具有5nM，1nM，0.5nM，0.2nM或0.04nM的终浓度的siRNA溶液。将LipofectamineTMRNAi Max混合物和siRNA溶液混合并在室温反应15分钟，由此制备用于转染的溶液。
向含有分配于其中的Opti-MEM的每个孔的肿瘤细胞系分配500μl的每种转染溶液，培养6小时，并去除Opti-MEM培养基。此处，向其中分配1ml的RPMI 1640培养基并在37℃和5％(v/v)CO2的条件下培养24小时。
实施例7-3：靶基因mRNA的定量分析
通过从实施例7-2的转染的细胞系提取总RNA产生cDNA，并通过实时PCR对靶基因的mRNA表达量进行相对定量。
实施例7-3-1：从转染的细胞分离RNA和产生cDNA
通过RNA提取试剂盒(AccuPrep Cell总RNA提取试剂盒，BIONEER，Korea)从实施例5-2的转染的细胞系提取总RNA，并通过RNA逆转录酶(AccuPower CycleScript RT Premix/dT20，Bioneer，Korea)根据如下方法将提取的RNA用于产生cDNA。具体而言，将每管1μg的提取的RNA添加至0.25ml Eppendorf管中含有的AccuPower CycleScript RT Premix/dT20(Bioneer，Korea)，并向其中添加用DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的蒸馏水以达到20μl的总体积。将通过基因扩增仪(MyGenieTM96Gradient Thermal Block，BIONEER，Korea)将RNA和引物在30℃杂交1分钟的过程和在52℃产生cDNA4分钟的过程重复6次，然后通过在90℃将酶灭活5分钟来完成扩增反应。
实施例7-3-2：对靶基因mRNA的相对定量分析
通过如下方法通过具有实施例7-3-1产生的cDNA作为模板的实时PCR对呼吸疾病相关基因mRNA的相对量进行定量。在96孔板的每个孔中用蒸馏水将由实施例6-3-1所产生的cDNA稀释5倍。然后，将3μl的稀释的cDNA、25μl的2×GreenStarTMPCR Master Mix(BIONEER,Korea)、19μl的蒸馏水和3μl的qPCR引物(表2；F和R各具有10皮摩/μl；BIONEER，Korea)添加至其中以制备各混合溶液。同时，RPL13A(核糖体蛋白L13a)是一种看家基因(下文称HK基因)，其被认定为用于将靶基因mRNA的表达量标准化的基准基因。如下反应在含有混合物的96孔板上通过ExicyclerTM96Real-Time Quantitative Thermal Block(BIONEER,Korea)进行。在95℃反应15分钟以激活酶并去除cDNA的二级结构，然后将4个过程重复42次，所述4个过程包括：94℃变性30秒的过程，58℃退火30秒的过程，72℃延伸30秒的过程，和SYBR Green扫描的过程，并在72℃最终延伸3分钟。然后，将温度在55℃维持1分钟，并从55℃直至95℃分析溶解曲线。完成PCR后，对于每个获取的靶基因的Ct(阈值循环)值而言，计算通过GAPDH基因进行校正的靶基因的Ct值，然后通过使用用siRNA(SEQ ID NO:601,siCONT)处理的测试组来获得差值(ΔCt)，所述siRNA具有防止基因表达抑制的对照序列，作为对照组。
用CTGF(人)特异性siRNA(具有SEQ ID NO:132，42，59，602，603，604作为有义链的序列)处理的细胞的靶基因的表达量通过使用ΔCt值和计算公式2(-ΔCt)×100来进行相对定量(图4A)。此外，用Cyr61(人)特异性siRNA(具有SEQ ID NO:124，153，166，187和197作为有义链的序列)处理的细胞的靶基因的表达量进行相对定量(图4B)，用Plekho1(人)特异性siRNA(具有SEQ ID NO:212，218，221和223作为有义链的序列)处理的细胞的靶基因的表达量进行相对定量(图4C)。
结果可以确认，本发明的一些种类的siRNA显示出对靶基因表达的高抑制水平。此外，为了高效地选择siRNA，选择了具有SEQ ID NO:42，59，602，124，153，187，197，212，218，221和223的序列作为有义链的siRNA，其中每个基因在5nM浓度处的mRNA表达量显著降低。
实施例8：由双螺旋寡聚物结构形成的纳米颗粒(SAMiRNA)在人肺癌细胞系(A549)中对靶基因表达的抑制
用由SAMiRNA LP形成的纳米颗粒转化人肺癌细胞系(A549)，所述SAMiRNA LP包含具有由实施例7-3-2选择的SEQ ID NO:42，59，602，124，153，187，197，212，218，221和223的序列作为有义链的siRNA，并在转化的肺癌细胞系(A549)中分析靶基因的表达方面。
实施例8-1：人肺癌细胞系的培养
将获取自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)的人肺癌细胞系(A549)在与实施例7-1相同的条件下培养。
实施例8-2：将靶SAMiRNA转染入人肺癌细胞系
将实施例8-1培养的1.2×105个肺癌细胞系(A549)在12孔板中的RPMI1640培养基中在37℃和5％(v/v)CO2的条件下培养18小时，并去除培养基，并向各孔添加等量的Opti-MEM培养基(GIBCO，USA)。将100μl的Opti-MEM培养基和实施例4-2产生的monoSAMiRNALP和SAMiRNALP以50μg/ml的浓度添加至DPBS，将所得的混合物在-75℃和5mTorr条件中通过与实施例5-1相同的方法冻干48小时以产生均质化的纳米颗粒。然后，其中添加了Opti-MEM的各孔的肿瘤细胞系用浓度为200nM的转染溶液进行处理，并在37℃和5％(v/v)CO2培养总共48小时。
实施例8-3：靶基因mRNA的相对定量分析
按照与实施例6-3相同的方法通过从实施例8-2的转染的细胞系提取总RNA产生cDNA，并通过实时PCR对靶基因的mRNA表达量进行相对定量。观察到根据低浓度siRNA处理对于靶基因表达的抑制量明确验证了各siRNA效力，并确认了具有SEQ ID NO:42，59和602的序列作为有义链的siRNA显示出对靶基因表达的相对高水平的抑制，即使是在显著低浓度处(图5)。
实施例9：在小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)中用小鼠的靶基因特异性的siRNA来验证对靶基因表达的抑制
小鼠成纤维细胞(NIH3T3)是一种成纤维细胞系，用具有实施例1中产生的SEQ IDNO:301至330，401至430，501至530和601的序列作为有义链的siRNA对其进行转化，并在经转化的成纤维细胞系(NIH3T3)中分析靶基因的表达方面。
实施例9-1：小鼠成纤维细胞系的培养
将获取自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)的小鼠成纤维细胞系的培养(NIH3T3)置于RPMI-1640培养基(GIBCO/Invitrogen，USA，10％(v/v)胎牛血清，青霉素100单位/ml和100μg/ml的链霉素)中在37℃和5％(v/v)CO2的条件进行培养。
实施例9-2：将靶细胞siRNA转染进小鼠成纤维细胞系中
将实施例9-1培养的1×105个成纤维细胞(NIH3T3)在12孔板中的RPMI1640培养基中在37℃和5％(v/v)CO2的条件下培养18小时，并去除培养基，并向每个孔分配500μl的Opti-MEM培养基(GIBCO，USA)。
同时，将1.5μl的LipofectamineTMRNAi Max(Invitrogen，USA)与248.5μl的Opti-MEM培养基混合以制备混合溶液，并在室温将混合溶液反应5分钟。通过添加5或20μl的siRNA(1皮摩/μl)至230μl的Opti-MEM培养基而制备各具有5或20nM的终浓度的siRNA溶液，所述siRNA具有实施例1中的SEQ ID NO:301至330，401至430，501至530和601的序列作为有义链。将LipofectamineTMRNAi Max混合物和siRNA溶液混合并在室温下反应20分钟，由此制备用于转染的溶液。
然后，向含有分配于其中的Opti-MEM的肿瘤细胞系的各孔中分配各500μl的转染溶液，培养6小时，并去除Opti-MEM培养基。此处，将1ml的RPMI1640培养基分配于其中，并在37℃和5％(v/v)CO2的条件下培养24小时。
实施例9-3：靶基因mRNA的定量分析
根据与实施例5-3相同的方法通过从实施例9-2的转染的细胞系提取总RNA来产生cDNA，并通过实时PCR对靶基因的mRNA表达量进行相对定量。
对用CTGF(小鼠)特异性的siRNA(具有SEQ ID NO:301至330的序列作为有义链)处理的细胞靶基因的表达量进行相对定量(图6A)。此外，对用Cyr61(小鼠)特异性的siRNA(具有SEQ ID NO:401至430的序列作为有义链)处理的细胞靶基因的表达量进行相对定量(图6B)，以及对用Plekho1(小鼠)特异性的siRNA(具有SEQ ID NO:501至530的序列作为有义链)处理的细胞靶基因的表达量进行相对定量(图6C)。
结果可以确认，本发明的一些种类的siRNA显示出对靶基因表达的高抑制水平。此外，为了高效地选择siRNA，选择了具有SEQ ID NO:301，302，303，305，306，307，309，317，323或329的序列作为有义链的siRNA，其中CTGF(小鼠)在20nM浓度处的mRNA表达量显著降低，选择了具有SEQ ID NO:409，410，415，417，418，420，422，424，427或429的序列作为有义链的siRNA，其中Cyr61(小鼠)在20nM浓度处的mRNA表达量显著降低，选择了具有SEQ IDNO:504，505，506，507，514，515，522，523，524或525的序列作为有义链的siRNA，其中Plekho1(小鼠)在20nM浓度处的mRNA表达量显著降低。
此外，为了选择具有更优选的效力的siRNA，选择了具有SEQ ID NO:301，303，307或323的序列作为有义链的siRNA，其中CTGF(小鼠)在5nM浓度处的mRNA表达量显著降低，选择了具有SEQ ID NO:410，422或424的序列作为有义链的siRNA，其中Cyr61(小鼠)在5nM浓度处的mRNA表达量显著降低，选择了具有SEQ ID NO:507，515或525的序列作为有义链的siRNA，其中Plekho1(小鼠)在5nM浓度处的mRNA表达量显著降低(图7)。
实施例10：在小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)中选择具有高效的小鼠的靶基因特异性siRNA
通过使用具有由实施例9-3选择的SEQ ID NO:301，303，307，323，410，422，424，507，515，525和601的序列作为有义链的siRNA，在小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)中分析靶基因的表达方面，从而选择具有高效的siRNA。
实施例10-1：小鼠成纤维细胞系的培养
将获取自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)的小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)在与实施例9-1相同的条件下培养。
实施例10-2：将靶siRNA转染进小鼠成纤维细胞系中
将实施例10-1培养的1×105个成纤维细胞(NIH3T3)在12孔板中的RPMI1640培养基中在37℃和5％(v/v)CO2的条件下培养18小时，并去除培养基，并向每个孔分配500μl的Opti-MEM培养基(GIBCO，USA)。
同时，将1.5μl的LipofectamineTMRNAi Max(Invitrogen，USA)与248.5μl的Opti-MEM培养基混合以制备混合溶液，并在室温将混合溶液反应5分钟。将0.2、1或5μl的siRNA(1皮摩/μl)添加至230μl的Opti-MEM培养基由此制备各具有0.2、1或5nM的终浓度的siRNA溶液，所述siRNA具有由实施例1产生的SEQ ID NO:301，303，307，323，410，422，424，507，515，525和601的序列作为有义链。将LipofectamineTMRNAi Max混合物和siRNA溶液混合并在室温下反应20分钟，由此制备用于转染的溶液。
然后，向含有分配于其中的Opti-MEM的肿瘤细胞系的各孔中添加各500μl的转染溶液，培养6小时，并去除Opti-MEM培养基。此处，将1ml的RPMI1640培养基分配于其中，并在37℃和5％(v/v)CO2的条件下培养24小时。
实施例10-3：靶基因mRNA的定量分析
通过从实施例10-2的转染的细胞系按照实施例5-3的方法提取总RNA产生cDNA，并通过实时PCR对靶基因的mRNA表达量进行相对定量。对用CTGF(小鼠)特异性的siRNA(具有SEQ ID NO:301，303，307和323的序列作为有义链)处理的细胞靶基因的表达量进行相对定量(图8A)。此外，对用Cyr61(小鼠)特异性的siRNA(具有SEQ ID NO:410，422和424的序列作为有义链)处理的细胞靶基因的表达量进行相对定量(图8B)，以及对用Plekho1(小鼠)特异性的siRNA(具有SEQ ID NO:507，515和525的序列作为有义链)处理的细胞靶基因的表达量进行相对定量(图8C)。
结果确认，每个靶基因特异性的siRNA都以浓度依赖性的方式抑制靶基因的表达，并且确认具有SEQ ID NO:307，424和525的序列作为有义链的siRNA显示出对靶基因表达相对高水平的抑制，即使是在显著低水平，从而选择具有高效的siRNA。
实施例11：在小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)中用人的靶基因特异性的siRNA来确认对靶基因表达的抑制
由于生物技术药品具有物种特异性作用位点，如蛋白质结构或基因结构，因此对治疗药物的鉴定在生物制药新药物开发中对于确保效率非常重要。分析实施例1中设计的人的靶基因特异性的siRNA和小鼠的靶基因特异性的siRNA之间的基因序列同源性，从而在小鼠成纤维细胞中选择可以确认对靶基因表达的抑制效果的siRNA序列。
选择的siRNA序列是具有SEQ ID NO:4，5，6，8，9，102，104，105，107，108，109，202，204，206，207，208和209的序列作为有义链的siRNA(所述siRNA是实施例1产生的人的靶基因特异性siRNA)，具有SEQ ID NO:307，424和525的序列作为有义链的siRNA(所述siRNA是小鼠的靶基因特异性siRNA)，和具有SEQ ID NO:601的序列作为有义链的siRNA(所述siRNA是对照组)。用这些选择的siRNA在小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)中分析靶基因的表达方面，并在基于人基因设计的siRNA的小鼠细胞中确认其效力。
实施例11-1：小鼠成纤维细胞系的培养
将获取自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)的小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)在与实施例9-1相同的条件下培养。
实施例11-2：将靶siRNA转染入小鼠成纤维细胞系中
将1.8×105个通过实施例11-1培养的成纤维细胞(NIH3T3)在6孔板中的RPMI1640培养基中在37℃和5％(v/v)CO2的条件下培养18小时，并去除培养基，并向各孔分配500μl的Opti-MEM培养基(GIBCO，USA)。
同时，将3.5μl的LipofectamineTMRNAi Max(Invitrogen，USA)与246.5μl的Opti-MEM培养基混合以制备混合溶液，并在室温将混合溶液反应5分钟。通过添加5或20μl的siRNA(1皮摩/μl)至230μl的Opti-MEM培养基而制备各具有5或20nM的终浓度的siRNA溶液，所述siRNA具有实施例1中的SEQ ID NO:4，5，6，8，9，102，104，105，107，108，109，202，204，206，207，208，209，307，424，525和601的序列作为有义链。将LipofectamineTMRNAi Max混合物和siRNA溶液混合并在室温下反应15分钟，由此制备用于转染的溶液。
然后，向含有分配于其中的Opti-MEM的肿瘤细胞系的各孔中分配各500μl的转染溶液，培养6小时，并去除Opti-MEM培养基。此处，将1ml的RPMI1640培养基添加至其中，并在37℃和5％(v/v)CO2的条件下培养24小时。
实施例11-3：靶基因mRNA的定量分析
通过从实施例11-2转染的细胞系按照实施例5-3的方法提取总RNA产生cDNA，并通过实时PCR对靶基因的mRNA表达量进行相对定量。对用CTGF(小鼠)特异性的siRNA(SEQ IDNO:307)处理的或用CTGF(人)特异性的siRNA(SEQ ID NO:4，5，6，8或9)处理的细胞靶基因的表达量进行相对定量(图9A)。对用Cyr61(小鼠)特异性的siRNA(具有SEQ ID NO:424的序列作为有义链)处理的或用Cyr61(人)特异性的siRNA(具有SEQ ID NO:102，104，105，107，108或109的序列作为有义链)处理的细胞靶基因的表达量进行相对定量(图9B)，以及对用Plekho1(小鼠)特异性的siRNA(具有SEQ ID NO:525的序列作为有义链)处理的或用Plekho1(人)特异性的siRNA(具有SEQ ID NO:202，204，206，207，208或209的序列作为有义链)处理的细胞靶基因的表达量进行相对定量(图9C)。
结果确认，人的各靶基因特异性siRNA基于序列同源性抑制靶基因的表达，并且确认具有SEQ ID NO:6，8，102，104，105，204，207和208的序列作为有义链的siRNA在20nM处显示对靶基因表达相对高水平的抑制，并且在其中，即使在小鼠细胞系中，在具有SEQ ID NO:6,102和207的序列的siRNA中IC50(抑制浓度50％)低于20nM。因此，确认对靶基因表达的相对高水平抑制甚至在低浓度得以维持，即这些siRNA具有高效力(图10)。
有利效果
本发明的用于治疗的CTGF、Cyr61或Plekho1特异性的siRNA、含有所述siRNA的双螺旋寡RNA结构、和含有所述双螺旋寡RNA结构的药物组合物能够高效抑制CTGF、Cyr61或Plekho1的表达而没有副作用，从而提供对于呼吸疾病(尤其是特发性肺纤维化和慢性阻塞性肺病(COPD))的治疗效果，其显著有用地用于治疗呼吸疾病，所述呼吸疾病(尤其是特发性肺纤维化和慢性阻塞性肺病(COPD))目前尚未有合适的治疗剂。
本领域所属领域的技术人员从上述内容可理解的是，本发明可以在其他具体实施方案中实施，而不改变其技术精神或实质特征。就此而言，应理解的是，前述的实施例是在所有方面均为解释性的而非限制。本发明的范围应理解为包含所附的权利要求书的范围和涵义，以及由其等同概念得到的所有的改变和修饰形式，而不是其具体的描述。
序列表
<110> 柏业公司(BIONEER CORPORATION)
洋行公司(YUHAN CORPORATION)
<120> 呼吸疾病相关基因特异性siRNA、含有siRNA的双螺旋寡RNA结构及其用途
<130> PF-B1676
<140> PCT/KR2014/006033
<141> 2014-07-04
<150> 10-2013-0079311
<151> 2013-07-05
<160> 604
<170> PatentIn版本3.2
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 48
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<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 49
tctgaacacc ataggtagaa tgt 23
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 50
agtgtccttg gcaggctgat ttc 23
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 51
catgtttgca cctttctagt tga 23
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 52
tgctcactga cctgcctgta gcc 23
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 53
ctccctgcat cttcggtggt acg 23
<210> 54
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 54
agcctcaatt tctgaacacc ata 23
<210> 55
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 55
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<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 56
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 57
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 58
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 59
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 60
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 61
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 62
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 63
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 64
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 65
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 66
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 67
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 68
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 69
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 70
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 71
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF 72
<400> 72
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF 73
<400> 73
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 74
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<210> 75
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 75
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<212> DNA
<213> 人工的
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<223> hCTGF
<400> 76
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 79
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 80
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 81
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 82
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 85
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
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<212> DNA
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<220>
<223> hCTGF
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 88
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 89
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 90
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 91
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 92
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 93
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<210> 94
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 94
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 95
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<210> 96
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 96
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 97
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 98
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 99
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<210> 100
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 100
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 101
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 102
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 103
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 104
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 105
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 106
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 107
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 108
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 109
ttggagcaca tgttactgct tca 23
<210> 110
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 110
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 111
tcccagtgct caaagacctg tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 112
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 113
tggacactaa tgcagccacg att 23
<210> 114
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 114
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<210> 115
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 115
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 116
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 117
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<212> DNA
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<220>
<223> hCyr61
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<212> DNA
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<220>
<223> hCyr61
<400> 119
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 120
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<212> DNA
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<220>
<223> hCyr61
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<211> 23
<212> DNA
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<220>
<223> hCyr61
<400> 122
cccgaaccag tcaggtttac tta 23
<210> 123
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 123
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<210> 124
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 126
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 127
gtgtatgcca ttcggtattt tta 23
<210> 128
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 128
ctgagtgtat gccattcggt att 23
<210> 129
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 129
accctcggct ggtcaaagtt acc 23
<210> 130
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 130
cccccgaacc agtcaggttt act 23
<210> 131
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 131
ttccaagaac gtcatgatga tcc 23
<210> 132
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 132
gtgatgggac tcattgtaga aag 23
<210> 133
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 133
gccacgattg gagaatactt tgc 23
<210> 134
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 134
aagcttttat tcgtcctttg aca 23
<210> 135
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 135
ggacactaat gcagccacga ttg 23
<210> 136
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 136
ttcatggtcc cagtgctcaa aga 23
<210> 137
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 137
cgccttagtc gtcacccttc tcc 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 138
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<210> 139
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 139
cttgctcatt cttgaggagc att 23
<210> 140
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 140
ggccagaaat gtattgttca aac 23
<210> 141
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 141
ccagtgtaca gcagcctgaa aaa 23
<210> 142
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 142
cccaaccctc ggctggtcaa agt 23
<210> 143
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 143
cggatttgtg aggtgcggcc ttg 23
<210> 144
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 144
gccttgtgaa agaaacccgg att 23
<210> 145
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 145
ccctgagtgc cgccttgtga aag 23
<210> 146
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCyr61
<400> 146
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<223> hPlekho1
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<220>
<223> hPlekho1
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<213> 人工的
<220>
<223> hPlekho1
<400> 244
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hPlekho1
<400> 245
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<213> 人工的
<220>
<223> hPlekho1
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hPlekho1
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> hPlekho1
<400> 294
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<212> DNA
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<220>
<223> hPlekho1
<400> 295
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hPlekho1
<400> 296
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> mCTGF
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<220>
<223> mCTGF
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<220>
<223> mCTGF
<400> 307
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<400> 309
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mCTGF
<400> 332
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<210> 333
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<400> 337
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 541
tgtttgacct gagtgacta 19
<210> 542
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 542
cgccctgagt tctgccatt 19
<210> 543
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 543
cattagacct gatccaaga 19
<210> 544
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 544
ggacctggta gcaaggaaa 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
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<223> mPlekho1
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ggaaactgga gaagactca 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
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<400> 546
tggagaagac tcaggagct 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
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<223> mPlekho1
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<211> 19
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<211> 19
<212> DNA
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<223> mPlekho1
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tgaaaggcga ccagctcta 19
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<211> 19
<212> DNA
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<223> mPlekho1
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cgggtcgatc tggacaagt 19
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<211> 19
<212> DNA
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<220>
<223> mPlekho1
<400> 562
ccggaaattc tgcgggaaa 19
<210> 563
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 563
gtgtttgacc tgagtgact 19
<210> 564
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 564
ccgtgagtcc tgaagagaa 19
<210> 565
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 565
ctaaaaaccg tatcttgga 19
<210> 566
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 566
cgttgaggag gacagctat 19
<210> 567
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 567
cctactcgag acagagcaa 19
<210> 568
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 568
cctcttgtgc tgagagctt 19
<210> 569
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 569
ccacaagcac tgaagaagt 19
<210> 570
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 570
cacagtcaat accggaaga 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
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tgactatgag aagtgcgaa 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 572
caggaggtgt ttgacctga 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 573
cctctacctc agatgggat 19
<210> 574
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 574
ggccttggga aaaaccaga 19
<210> 575
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 575
gatgggatgc taacattag 19
<210> 576
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 576
agaaggagtc atggatcaa 19
<210> 577
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 577
acctcccagc acagtcaat 19
<210> 578
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 578
ccgttgagga ggacagcta 19
<210> 579
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 579
ccaccctact cgagacaga 19
<210> 580
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 580
gacaggatcc agccctctt 19
<210> 581
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 581
ctactcgaga cagagcaaa 19
<210> 582
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 582
tcaccttcaa gctgaggaa 19
<210> 583
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 583
cggactcaga caggatcca 19
<210> 584
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 584
ggcttcgacc tctacctca 19
<210> 585
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 585
gagctaaaaa ccgtatctt 19
<210> 586
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 586
ccgtatcttg gatgaggtc 19
<210> 587
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 587
tcaagctgag gaatcccta 19
<210> 588
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 588
tgagagacct gtacaggca 19
<210> 589
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 589
ggacagctat cttgcccac 19
<210> 590
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 590
ctgtggcttc gacctctac 19
<210> 591
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 591
ttttcaggga gatttggaa 19
<210> 592
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 592
accgctatgt ggtgctgaa 19
<210> 593
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 593
tggatcaacg ccctgagtt 19
<210> 594
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 594
aaaaccgtat cttggatga 19
<210> 595
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 595
agacctgatc caagaggaa 19
<210> 596
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 596
acctgatcca agaggaaga 19
<210> 597
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 597
gaggtaaaag atgagaaaa 19
<210> 598
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 598
acgtctccga gaaggaggt 19
<210> 599
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 599
agagaaggag tcatggatc 19
<210> 600
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> mPlekho1
<400> 600
acctctacct cagatggga 19
<210> 601
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> SiCON
<400> 601
cuuacgcuga guacuucga 19
<210> 602
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 602
ttacaactgt cccggagaca atg 23
<210> 603
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 603
aagggcaaaa agtgcatccg tac 23
<210> 604
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> hCTGF
<400> 604
ttgaatcgct gtactacagg aag 23
Claims (37)
1.一种包含双螺旋寡RNA的结构，其由如下结构式(1)代表：
结构式(1)
A-X-R-Y-B
其中A是亲水性材料，B是疏水性材料，X和Y各自独立为简单共价键或接头介导的共价键，且R是Plekhol特异性siRNA，
其中所述亲水性材料具有由如下结构式(5)或结构式(6)代表的结构：
结构式(5)
(A′m-J)n
结构式(6)
(J-A′m)n
其中A’是亲水性材料单体，
J是用于连接m个亲水性材料单体的接头，或用于连接m个亲水性材料单体与siRNA的接头，m是1-15的整数，n是1-10的整数，
亲水性材料单体A’是选自下组化合物(1)至(3)的化合物，
且接头J选自PO3-、SO3和CO2；
2.权利要求1的结构，其中所述包含双螺旋寡RNA的结构由如下结构式(2)代表：
结构式(2)
A-X-S-Y-B
AS
其中S是权利要求1的siRNA的有义链，而AS是权利要求1的反义链，A、B、X和Y与权利要求1中所定义的相同。
3.权利要求2的结构，其中所述包含双螺旋寡RNA的结构由如下结构式(3)或结构式(4)代表：
结构式(3)
A-X-5′S3′-Y-B
AS
结构式(4)
A-×-3′S5′-Y-B
AS
其中A、B、X、Y、S和AS与权利要求2中所定义的相同，而5’和3’意指所述siRNA的有义链的5’和3’端。
4.权利要求1-3任一项的结构，其中所述Plekhol特异性siRNA是包含选自SEQ ID NO：201至300和501至600的有义链和与所述有义链互补的反义链的siRNA。
5.权利要求1-4任一项的结构，其中所述亲水性材料具有200至10,000的分子量。
6.权利要求5的结构，其中所述亲水性材料是选自下组的任一项：聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚噁唑啉(polyoxazoline)。
7.权利要求1-3任一项的结构，其中Plekhol特异性siRNA是包含选自SEQ ID NO：201-210、212、218、221、223、504-507、514、515和522-525的有义链和与所述有义链互补的反义链的siRNA。
8.权利要求1-4任一项的结构，其中所述疏水性材料具有250至1,000的分子量。
9.权利要求8的结构，其中所述疏水性材料是选自下组的一项：甾类衍生物、甘油酯衍生物、甘油醚、聚丙二醇、C12至C50不饱和或饱和烃、二酰基磷脂酰胆碱(diacylphosphatidylcholine)、脂肪酸、磷脂和脂多胺。
10.权利要求9的结构，其中所述甾类衍生物选自下组：胆甾醇、胆甾烷醇、胆酸、胆甾醇甲酸酯、胆甾烷醇甲酸酯和胆甾醇胺。
11.权利要求9的结构，其中所述甘油酯衍生物选自甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯。
12.权利要求1-11任一项的结构，其中所述由X或Y代表的共价键是不可降解的或可降解的键。
13.权利要求12的结构，其中所述不可降解的键是酰胺键或磷酸键。
14.权利要求12的结构，其中所述可降解的键是二硫键、酸可降解键、酯键、酸酐键或生物可降解键。
15.权利要求14的结构，其中所述生物可降解键是酶可降解键。
16.权利要求1-15任一项的结构，其进一步包含与亲水性材料结合的配体，其中所述配体特异性地与受体结合通过受体介导的胞吞作用(RME)促进靶细胞内化。
17.权利要求16的结构，其中所述配体选自下组：靶受体特异性的抗体、适配体(aptamer)、肽、N-乙酰半乳糖胺(NAG)、葡萄糖和甘露糖。
18.根据权利要求1-15任一项的结构，其进一步包含胺基或多组氨酸，所述氨基或多组氨酸被引入至亲水性材料中的与所述siRNA结合的位置的远端。
19.权利要求18的结构，其中所述胺基或多组氨酸与具有多于一个接头的亲水性材料或亲水性嵌段(block)结合。
20.权利要求18的结构，其中所述胺基选自下组之一：伯胺至叔胺基团。
21.权利要求18的结构，其中所述多组氨酸包含3至10个组氨酸。
22.权利要求1的结构，其中所述siRNA的有义链和反义链包含多于一个化学修饰。
23.权利要求22的结构，其中所述化学修饰多于选自下组的任一项：
在核苷酸的糖结构中2’碳处用-CH3(甲基)、-OCH3(甲氧基)、-NH2、-F(氟)、-O-2-甲氧基乙基、-O-丙基、-O-2-甲基硫乙基(methylthioethyl)、-O-3-氨基丙基、-O-3-二甲基氨基丙基、-O-N-甲基乙酰胺基或-O-二甲基氨基氧乙基取代-OH基团；
在核苷酸的糖结构中用硫取代氧；
核苷酸与硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、或甲基磷酸酯之间的结合的修饰；和
核苷酸修饰为肽核酸(PNA)、修饰为锁核酸(LNA)、或修饰为解锁核酸(UNA)。
24.权利要求1的结构，其中多于一个磷酸基团结合至siRNA的反义链的5’端。
25.包含权利要求1-24任一项的结构的纳米颗粒。
26.权利要求25的纳米颗粒，其中所述包含双螺旋寡RNA的结构与纳米颗粒混合，所述双螺旋寡RNA含有具有不同序列的siRNA。
27.一种药物组合物，其包含权利要求1-24任一项的结构，或权利要求25或26的纳米颗粒作为活性成分。
28.权利要求27的药物组合物，其中所述组合物用于预防或治疗呼吸疾病。
29.权利要求28的药物组合物，其中所述呼吸疾病选自下组：哮喘、特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性鼻炎、急性下呼吸道感染、支气管炎、急性上呼吸道感染、咽炎、扁桃体炎、和喉炎。
30.权利要求28的药物组合物，其中所述呼吸疾病是特发性肺纤维化或慢性阻塞性肺病(COPD)。
31.权利要求29的药物组合物，其中所述呼吸疾病是急性或慢性支气管炎，或细支气管炎。
32.权利要求27的药物组合物，其中所述组合物包含包含选自SEQ ID NO:201-210、212、218、221、223、504-507、514、515和522-525的有义链和与所述有义链互补的反义链的siRNA作为活性成分的结构。
33.一种冻干制剂，其包含权利要求27-32任一项的药物组合物。
34.权利要求1-33任一项的包含siRNA的结构、纳米颗粒、药物组合物或制剂在制备用于预防或治疗呼吸疾病的药物中的用途。
35.权利要求34的用途，其中所述呼吸疾病选自下组：哮喘、特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性鼻炎、急性下呼吸道感染、支气管炎、急性上呼吸道感染、咽炎、扁桃体炎和喉炎。
36.权利要求35的用途，其中所述呼吸疾病是特发性肺纤维化或慢性阻塞性肺病(COPD)。
37.权利要求35的用途，其中所述呼吸疾病是急性或慢性支气管炎，或细支气管炎。
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