KR102141124B1

KR102141124B1 - 이중 가닥 miRNA를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102141124B1
Application number: KR1020190002800A
Authority: KR
Inventors: 이태우; 류지원; 임은지
Original assignee: (주)바이오니아
Priority date: 2018-01-30
Filing date: 2019-01-09
Publication date: 2020-08-04
Also published as: WO2019151738A1; US20240076672A1; EP3757212A4; EP3757212A1; CN111801418B; CN111801418A; JP7113901B2; US20210032628A1; US11820984B2; JP2021512108A; KR20190092267A

Abstract

본 발명은 이중 가닥 miRNA를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 암 세포의 증식을 효과적으로 억제하거나 암 세포의 자발적 사멸을 유도하는 방식을 특징으로 하는 miR-544a를 포함한 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체 및 상기 구조체를 포함하는 항암 조성물에 관한 것이다.

Description

이중 가닥 miRNA를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체 및 이의 용도{Double-stranded Oligonucleotide Complex comprising Double― stranded miRNA and Uses thereof}

본 발명은 이중 가닥 miRNA를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 암 세포의 증식을 효과적으로 억제하거나 암 세포의 자발적 사멸을 유도하는 miR-544a를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체 및 상기 구조체를 포함하는 항암 조성물에 관한 것이다.

유전자의 정상적인 제어가 이루어지지 않아 발생하는 질병, 대표적으로 암으로 통칭되는 질환에 대한 효과적이고 전통적인 치료 방법은 외과적으로 종양을 절제하여 제거하는 방법이 사용되었으나, 원발성 암이 타 기관으로 전이가 되는 경우는 외과적 수술이 불가하여 항암 약물 치료 요법이 사용되었다. 약물 치료로 사용되는 항암제는 주로 단분자 물질을 유기적 또는 무기적 방법으로 합성하여 사용하였는데, 이는 암 질환이 주로 신호 전달 체계에 포함된 인산 활성 인자 단백질의 과발현 등에 의하여 신호 체계를 교란 시키는 단백질에 효과적으로 결합하여 단백질의 활성을 억제하는 용도로 개발 되어 사용 되었다.

최근 항암제 개발 추세는 암을 유발하는 핵심 유전자 변이 (Driver Mutation) 을 표적으로 하여 핵심 유전자 변이에 의하여 생성된 단백질의 활성을 선택적으로 저해하는 방식으로 표적 치료제가 개발되고 있다. 폐암의 경우, 85-90% 가 비소세포폐암이며, 이는 또 편평세포암종 (squamous cell carcinoma) 와 선암 (adenocarcinoma) 등으로 나눌 수 있다. 선암의 생존에 주요한 유전자 변이로서는 대략 30% 를 차지하는 KRAS 변이와 15% 를 차지하는 EGFR 변이 등이 알려져 있다. 특히, 변이된 EGFR 단백질을 표적으로 하는 표적치료제가 개발되어 임상적으로 사용되고 있는데, Erlotinib (상품명: Tarceva) 와 Gefitinib (상품명: Iressa) 등이 출시되어 있다. 이들 표적 치료제는 EGFR 변이가 있는 폐암 환자들로부터 높은 반응률을 보이기는 하지만 대부분 1년이내에 이들 약물에 대한 내성을 유발하는 것으로 보고되어 있다. 내성 발생 원인으로서는 기존의 EGFR 변이에 더하여 EGFR 단백질에 T790M 변이가 추가로 발생하거나, EGFR 신호 전달 체계의 하위 단계에 포함된 RAF 및 PI3K 등의 유전자에 변이가 유발되어 내성이 생기는 것으로 보고 되고 있다. 이와 같이 단분자를 이용한 폐암 치료제의 경우, 내성 유발 등의 치명적 한계를 노출시키고 있다.

상기 전통적인 약물 치료 방법을 대체하기 위한 약물 치료제의 개발이 여러 방면으로 진행 되었는데, 그 중 하나가 작은 간섭 RNA (small interfering RNA, 이하 siRNA 으로 표기) 의 이용이다(Iorns, E et al., Nat Rev Drug Discov Vol. 6, pp. 556-68. 2007.). siRNA는 16에서 27사이의 뉴클레오티드로 구성된 단일 가닥 RNA 로서, 세포 내에서 리스크(RNA Induced Silencing Complex, RISC)라 알려진 리보핵산단백질 결합체 (ribonucleoprotein)의 구성 성분으로서 활동을 한다(Tomari, Y et al., Genes Dev Vol. 19, pp. 517-29, 2005, Chu, C.Y et al., Rna Vol. 14, pp. 1714-9, 2008, Mittal, V. Nat Rev Genet Vol. 5, pp. 355-65, 2004, Reynolds, A. et al. Nat Biotechnol Vol. 22, pp. 326-30. 2004). RISC는 RNA 효소 가위로서 기능을 하는데, 메신저 RNA (messenger RNA, 이하 mRNA 로 표기)를 절단하여 mRNA로부터 단백질이 생성되는 것을 저해한다. RISC에 포함된 siRNA는 siRNA 서열과 상보적인 서열을 갖는 mRNA와 결합하여 이중가닥 RNA를 형성하고, RISC는 RNA 효소 가위로 작용하여 목표가 되는 mRNA를 절단하여 mRNA가 더 이상 단백질을 반복 생성하는 형판 (template)으로서의 기능을 수행할 수 없도록 한다.

이처럼 siRNA 기반의 항암 치료제는 단백질 생성 단계 이전의 mRNA를 차단한다는 점, 그리고 RNA 와 세포 내재적인 RISC 시스템을 활용한다는 점에 있어서 상기 단분자 물질의 항암제보다 진보한 기술로 평가되나, siRNA 기반의 기술로도 해결하지 못하는 부작용이 있는데, 이는 비표적 효과 (off-target effect)로 불리는 현상이다(Jackson, A.L. et al., Rna Vol. 12, pp. 1179-87, 2006., Jackson, A.L. et al., Rna Vol. 12, pp. 1197-205, 2006., Jackson, A.L. et al., Nat Biotechnol Vol. 21, pp. 635-7, 2003., Nielsen, C.B. et al., Rna Vol. 13, pp. 1894-910, 2007., Peek, A.S. & Behlke, M.A. Curr Opin Mol Ther Vol. 9, pp. 110-8, 2007.). 상기 기술한 바와 같이 siRNA 서열과 상보적으로 결합하는 mRNA를 분해하는데, siRNA 서열 전체와 상보적이지 않고 일부분만 상보적인 mRNA와도 결합하여 분해를 유발하는데 이를 표적이 아닌 mRNA의 분해를 유발한다 하여 비표적 효과라 불린다.

상기 기술된 siRNA 기반의 항암 치료제의 기술적 난점을 극복하기 위하여 마이크로 RNA (microRNA, 이하 miRNA로 표기)를 치료제로 사용하려는 연구가 진행 중이다(Agostini, M. & Knight, R.A. Oncotarget Vol. 5, pp. 872-81, 2014., van Rooij, E. et al., Circulation Research Vol. 110, pp. 496-507, 2012., Burnett, J.C. & Rossi, J.J. Chem Biol Vol. 19, pp. 60-71, 2012., Dangwal, S. & Thum, T. Annu Rev Pharmacol Toxicol Vol. 54, pp. 185-203, 2014.). miRNA는 16에서 27사이의 뉴클레오티드로 구성된 RNA로서 단백질로 번역되는 메신저 RNA(mRNA)에 대비하여 단백질 비생성 RNA(protein non-coding RNA)로 분류된다(Carthew, R.W. & Sontheimer, E.J. Cell Vol. 136, pp. 642-55, 2009., MacFarlane, L.-A. & Murphy, P.R. Current Genomics Vol. 11, pp. 537-561, 2010., Bartel, D.P. Cell Vol. 136, pp. 215-33, 2009.). miRNA는 고등 동식물 세포의 유전체에 기록 되어 있으며 세포의 생성, 성장, 분화, 사멸을 포함한 세포의 대사 및 기능을 조절하는데 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 현재까지 인간의 유전체에서는 2000 여종의 miRNA가 알려져 있으며 이 중 상당수의 miRNA의 기능은 아직 알려져 있지 않다.

miRNA는 유전체로부터 Pol II라 불리는 RNA 폴리머라제(polymerase)에 의해 RNA로 전사되는데, 초기 길이는 특정할 수 없이 다양하다(Carthew, R.W. & Sontheimer, E.J. Cell Vol. 136, pp. 642-55, 2009., Brodersen, P. & Voinnet, O. Nat Rev Mol Cell Biol Vol. 10, pp. 141-148, 2009.). 이는 miRNA가 유전체에 포함된 위치의 다양성에 기인하는데, mRNA의 단백질 생성 비관여 부분인 인트론 (intron)에 위치하여 mRNA 생성 동일 시점에 전사되는 경우 및 유전체상에서 유전자간 빈 공간 (inter-genic region)에 위치하여 독자적으로 전사되는 경우 등 다양한 방식으로 생성되기 때문이다(Malone, C.D. & Hannon, G.J. Cell Vol. 136, pp. 656-68, 2009.). 이와 같이 초기에 생성된 miRNA 모체를 일차 miR(primary microRNA)라 하는데, 일차 miR는 핵 속의 드로셔(Drosha)라 불리는 RNA 절단 효소(RNase) 등에 의하여 전구체 miR(precursor miRNA, pre-miR) 로 편집된다(Bartel, D.P. Cell Vol. 136, pp. 215-33, 2009.). Pre-miR는 RNA 헤어핀 구조(RNA hair-pin structure)를 이루며 대략 70-80 개의 뉴클레오티드로 구성된다. 세포 핵 내부의 Pre-miR는 exportin 단백질 등에 의해 핵에서 세포질로 이동되며, 세포질 내에서 다이서(Dicer)라 불리는 또 다른 RNA 절단 효소(RNase)에 의하여 이차 가공이 되어 16-27 개의 뉴클레오티드로 구성되는 이중 가닥의 성숙 miR(mature microRNA, 이하 다른 수식어 없이 miR 로 기술하는 경우는 성숙 miR를 의미함)를 생성한다. 이중 가닥 miR 중 한 가닥의 RNA 가 선택적으로 선정되어 상기 리보핵산단백질 결합체(ribonucleoprotein complex)인 RISC와 결합하여 활성을 가지게 되고, miR의 서열을 이용하여 목표 mRNA와 결합한다.

일반적으로 mRNA는 단백질 생성 관여 여부를 기준으로 크게 세 부분으로 나눌 수 있는데, 단백질 번역 정보를 담고 있는 코딩 부분(coding region)과 코딩 부분의 각각 5' 과 3' 부분으로서 단백질 번역 정보를 가지지 않는 5'-UTR(Un-Translated Region)과 3'-UTR로 구분할 수 있다. mRNA와의 상보적 서열을 이용, 목표 mRNA의 분해를 유발하는 siRNA는 mRNA 의 5'-, 3'-UTR 및 코딩 부분에 상관 없이 작용을 하는 반면, miR는 주로 3'-UTR과 결합을 한다((Carthew, R.W. & Sontheimer, E.J. Cell Vol. 136, pp. 642-55, 2009., Bartel, D.P. Cell Vol. 136, pp. 215-33, 2009.).

mRNA와의 결합 위치 차이와 더불어 siRNA와 다른 miRNA의 독특한 특징은 siRNA는 siRNA 전체 서열과 상보적인 서열을 포함한 mRNA와 주로 결합하는 반면, miRNA는 miRNA의 5' 끝으로부터 2-8 뉴클레오티드 자리에 위치한, 한정된 크기의 씨앗부분(seed region)서열이 주로 목표 mRNA 인식에 사용되는 점이 다르며, 따라서 전체 miRNA의 서열이 목표 유전자와 완벽한 상보적인 서열을 가지지 않고 일정 부분 비상보적 서열이 포함되어도 miRNA 활성에 영향을 주지 않는다(Bartel, D.P. Cell Vol. 136, pp. 215-33, 2009.). 씨앗 부분의 서열 크기가 6-8 뉴클레오티드인 만큼 이와 상보적인 서열을 3' UTR에 가지는 mRNA 종류는 다양하며, 이러한 이유로 한 종의 miRNA로 여러 종의 mRNA를 동시에 제어할 수 있다. 이러한 miRNA의 성질은 miRNA가 세포의 분열, 성장, 분화, 사멸에 이르는 많은 부분의 세포 생리학적 측면의 제어에 관여하는 효율적인 조절인자(regulator)로서의 기능을 부과한다. 또한, 조절인자로서의 miRNA 의 기능은 효과적인 항암 효과를 구현하는데 장점으로서 작용하는데, siRNA 의 경우 단일 유전자 발현의 억제를 목표로 하는데 반하여, miRNA 는 암 유발 유전자 다수의 발현을 동시에 저해할 수 있기 때문이다.

많은 수의 mRNA가 3' UTR에 한 종 이상의 miRNA가 결합할 가능성이 있는 부분을 포함하고 있으며, 한 생물정보학적인 계산에 따르면 전체 mRNA의 대략 30%가 miRNA에 의해 단백질 생성이 조절되고 있는 것으로 알려져 있다.

miRNA의 이러한 신호 전달 체계 내의 주요 조절인자로 작용하는 사실은 암을 포함한 주요 질환에서도 중요한 역할을 수행한다는 점에서 알 수 있다(MacFarlane, L.-A. & Murphy, P.R. Current Genomics Vol. 11, pp. 537-561. 2010., Malone, C.D. & Hannon, G.J. Cell Vol. 136, pp. 656-68. 2009., Nicoloso, M.S. et al., Nat Rev Cancer Vol. 9, pp. 293-302. 2009., Landi, D. et al., Mutagenesis Vol. 27, pp. 205-10. 2012.). 실제로 여러 연구를 통하여 암 세포에서의 miRNA들의 발현 양식은 정상 세포에서의 발현 양식과 큰 차이를 보이는 것이 드러났다. 뿐만 아니라 암이 발생한 원발 장기에 따라서도 miRNA 발현 양식이 큰 차이가 있는데 폐암, 간암, 피부암, 혈액암 등 다양한 암들이 원발 장기에 따른 독특한 miRNA 발현 양식을 보이고, 이를 통하여 miRNA가 암 생물학에 있어 주요한 역할을 한다는 것이 알려져 있다. 특히, 암 종에서 발현되는 miRNA들이 그들의 정상 세포에서의 발현양에 대비하여 일반적으로 낮은 것이 알려져 있다.

상기 암에 있어서의 miRNA의 깊은 연관성을 바탕으로 miRNA를 항암 치료제로 이용하려는 시도가 최근에 시작되었으며, 그 일례로 miR-34a라 명명된 miRNA의 암 세포 증식 억제 및 사멸 유도 능력을 검증하기 위한 임상 실험을 실시한 예가 있다. (Wiggins, J.F. et al. Cancer Res Vol. 70, pp. 5923-30. 2010., WO2008/154333, Hermeking, H. Cell Death Differ Vol. 17, pp. 193-9. 2010., Chang, T.C. et al. Mol Cell Vol. 26, pp. 745-52. 2007.).

miRNA를 항암 치료제로 사용하기 위하여 생체 외부에서 주입된 miRNA 가 생체 내부에서 분해되지 않고 병리 조직으로 전달하기 위한 효과적인 방법이 필요하다. 이를 위하여 miRNA 서열을 포함하는 RNA 올리고뉴클레오타이드 구조체를 사용할 수 있다. RNA 올리고의 말단 부위에 화학물질 등을 연결하여 증진된 약동력학(pharmacokinetics)적 특징을 갖도록 하여 생체 내(in vivo)에서 높은 효율을 유도할 수 있다는 것이 알려져 있다(Soutschek. J. et al., Nature Vol. 432 Issue. 7014 pp. 173-8, 2004). 이 때 RNA 올리고의 센스(sense; 패신저(passenger)) 또는 안티센스 (antisense; 가이드(guide)) 가닥의 말단에 결합된 화학 물질의 성질에 따라 RNA 올리고의 안정성이 달라진다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 같은 고분자 화합물이 접합된 형태의 RNA 올리고는 양이온성 물질이 존재하는 조건에서 올리고와의 음이온성 인산기와 상호작용하여 복합체를 형성함으로써, 개선된 올리고 안정성을 가진 전달체가 된다(Kim SH et al., J Control Release Vol. 129(2) pp. 107-16, 2008). 특히 고분자 복합체로 구성된 미셀(micelle)들은 약물 전달 운반체로 쓰이는 다른 시스템인, 미소구체(microsphere) 또는 나노입자(nanoparticle) 등에 비해 그 크기가 극히 작으면서도 분포가 매우 일정하고, 자발적으로 형성되는 구조이므로 제제의 품질 관리 및 재현성 확보가 용이하다는 장점이 있다.

또한, RNA 올리고의 세포 내 전달 효율성을 향상시키기 위해, RNA 올리고에 생체 적합성 고분 자인 친수성 물질(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG))을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합으로 접합시킨 올리고 접합체를 통해, 올리고의 안정성 확보 및 효율적인 세포막 투과성을 위한 기술이 개발되었다(대한민국 등록특허 제10-0883471호). 하지만 올리고의 화학적 변형 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 접합시키는 것(PEGylation)만으로는 생체 내에서의 낮은 안정성과 타깃 장기로의 전달이 원활하지 못하다는 단점은 여전히 가진다. 이러한 단점을 해결하기 위하여 이중나선 올리고 RNA에 친수성 및 소수성 물질이 결합된 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체가 개발되었는데, 상기 구조체는 소수성 물질의 소수성 상호작용에 의하여 SAMiRNA^TM(self-assembled micelle inhibitory RNA) 라고 명명된 자가조립 나노입자를 형성하게 되는데 (대한민국 등록 특허 제10-1224828호 참조), SAMiRNA^TM 기술은 기존의 전달기술들에 비해 매우 사이즈가 작으면서도 균일한(homogenous) 나노입자를 수득할 수 있다는 장점을 가진다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 암 세포 증식 억제 및 암 세포 사멸 유도 능력이 뛰어난 miRNA를 발굴하고자 노력한 결과, 항암 효능이 뛰어난 miR-544a를 발굴하였고, 이것을 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체가 암 유발 유전자로 알려진 다수의 유전자 발현을 효과적 차단함으로써 항암 효과를 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 EGFR 변이가 있는 폐암 세포에서 폐암 치료제로 사용중인 Erlotinib에 대한 약물 내성을 극복할 수 있으며 암 세포 증식 억제 및 암 세포 사멸 유도 능력이 뛰어난 miRNA를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체 및 이를 유효 성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 구조식 (1)의 구조를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체를 제공한다:

A-X-R-Y-B 구조식 (1)

상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 miR-544a 서열을 의미한다.

본 발명은 또한, 상기 올리고뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체 및 이를 포함하는 암 치료용 조성물은 miR-544a를 포함함으로써, EGFR 변이가 있는 폐암에서 임상에서 사용되는 약물인 Erlotinib 대비 개선된 항암 효과를 보이는 바 항암 치료제로서 널리 활용될 수 있다.

도 1 내지 도 4는 8종의 폐암 세포 주에 miRNA library를 transfection 하여 세포의 증식억제를 측정하는 miRNA library 스크리닝 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 PC9및 PC9/ER 세포 주에서 miR-544a 의 세포사멸 유발 효과를 나타낸 것이다.
도 6은 miR-544a의 EGFR 신호전달체계에 관련된 단백질 조절 효과를 웨스턴 블롯으로 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 PC9, PC9/ER, H1975 및 H596 세포주에서 miR-544a의 EGFR mRNA 저해 효과를 RT-qPCR 분석법을 통하여 분석한 결과이다.
도 8은 루시퍼아제 측정법을 통한 miR-544a의 타겟 서열 검증 결과를 나타낸 것으로, EGFR 3’UTR 서열에서 타겟서열을 제거 하면 miR-544a에 의한 루시퍼아제 활성 저해가 억제됨을 확인할 수 있다.
도 9는 EGFR변이를 갖는 폐암 세포 주에서 Erlotinib과 miR544a에 의한 세포 생존량을 나타낸 것이다.
도 10은 올리고 뉴클레오타이드 구조체로 제조된 miRNA에 의한 폐암 세포 주의 세포사멸 효과를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 EGFR 변이가 있는 폐암 세포에서 EGFR 신호 전달 체계를 억제하여 세포의 증식을 저해하는 방식으로 효능이 뛰어난 miRNA를 발굴하고, 이의 항암 효과를 확인하고자 하였다.

본 발명에서는 1700 여종의 miRNA 스크리닝 라이브러리를 EGFR 변이가 있는 폐암 세포주에 처리하여, 암 세포 성장 억제능을 측정하여, 하기의 염기서열을 갖는 miR-544a를 발굴하고(도 1 내지 도 4), 이들의 항암 효능이 뛰어남을 확인하였다(도 5, 도 6, 도 9).

따라서, 본 발명은 일 관점에서 miR-544a를 포함하고, 하기 구조식 (1)의 구조를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체에 관한 것이다.

A-X-R-Y-B 구조식 (1)

상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 miR-544a 를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 miR-544a는 서열번호 1과 서열번호2 의 염기 서열로 이루어진 이중 가닥 RNA, DNA, RNA-DNA 복합체(hybrid)일 수 있다.

miR-544a

5'- AUUCUGCAUUUUUAGCAAGUUC-3' (서열번호 1)

5'- ACUUGCUAAAAAUGCAGAAUUU-3' (서열번호 2)

상기 배경 기술에서 기술한 바와 같이 miRNA 활성 서열의 두 번째 염기로부터 8-9 번째 염기까지 해당하는 씨드 서열 (seed region)이 활성의 주요한 인자인데, 이중가닥 올리고뉴클레오타이드를 제조할 때 이를 포함하는 긴 이중 가닥을 제조하여 사용할 수도 있다.

본 발명에서 라이브러리 스크린을 통하여 발굴된 상기 miRNA는 EGFR 변이를 가진 폐암 세포주의 EGFR 신호 전달 체계 활성화를 억제함으로서 항암 효능을 나타내는 것을 확인하였다.

이러한 miRNA는 듀플렉스이거나, 단일분자 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 microRNA(miRNAs)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서와 같이 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오타이드에 친수성 물질 및 소수성 물질이 결합된 올리고 접합체의 경우, RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오타이드의 양 말단에 친수성 물질 및 소수성 물질이 접합된 형태의 접합체를 통해, 올리고뉴클레오타이드를 생체 내 효율적으로 전달할 수 있을 뿐 아니라 안정성이 향상될 수 있다.

소수성 물질의 소수성 상호작용에 의하여 자가조립 나노입자를 형성하게 되는데, 이러한 나노입자는 체내로의 전달효율 및 체내에서의 안정성이 극히 우수할 뿐 아니라, 구조의 개선을 통해 입자 크기가 매우 균일하여 QC(Quality control)이 용이하므로 약물로서의 제조 공정이 간단하다는 장점이 있다.

하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 miRNAs를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체에서 친수성 물질로 정의한 A는 (P)_n, (P_m-J)_n 또는 (J-P_m)_n으로 표시되고, P는 친수성 물질 단량체(monomer), n은 1 내지 200, m은 1 내지 15, J는 m개의 친수성 물질 단량체 간 또는 m개의 친수성 물질 단량체와 올리고뉴클레오타이드를 서로 연결하는 링커일 수 있다.

상기 친수성 물질이 A인 경우, 본 발명에 따른 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체는 하기 구조식 (1')의 구조를 가진다.

구조식 (1')

상기 구조식 (1')에서 A, B, X 및 Y는 상기 구조식 (1)에서의 정의와 동일하며, S는 miRNA의 센스가닥, AS는 miRNA의 안티센스 가닥을 의미한다.

하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 miRNAs를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체는 하기 구조식 (2)의 구조를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체일 수 있다.

A-X-5' R 3' Y-B 구조식 (2)

상기 구조식 (2)에서, A, B, X, Y 및 R은 구조식 1에서의 정의와 동일하다.

보다 바람직하게는, 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체는 하기 구조식 (2')의 구조를 가진다.

구조식 (2')

하나의 실시예에서, 상기 친수성 물질은 분자량이 200 내지 10,000인 양이온성 또는 비이온성 고분자 물질일 수 있으며, 바람직하게는 1,000 내지 2,000인 비이온성 고분자 물질일 수 있다. 상기 친수성 물질로 비이온성 친수성 고분자 화합물 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리옥사졸린을 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

다른 실시예에서, 상기 친수성 물질이 (P_m-J)_n 또는 (J-P_m)_n인 경우, 본 발명에 따른 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체는 하기 구조식 (3) 또는 구조식 (4)의 구조를 가진다.

(P_m-J)_n-X-R-Y-B 구조식 (3)

(J-P_m)_n-X-R-Y-B 구조식 (4)

상기 구조식 (3) 및 구조식 (4)에서 P는 친수성 물질 단량체(monomer), n은 1 내지 200, m은 1 내지 15, J는 m개의 친수성 물질 단량체 간 또는 m개의 친수성 물질 단량체와 올리고뉴클레오타이드를 서로 연결하는 링커일 수 있으며, X와 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커(linker)가 매개된 공유결합, R은 본 발명의 특이적 miRNAs일 수 있다. 보다 바람직하게, 본 발명에 따른 miRNA를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체는 하기 구조식 (3')의 구조를 가진다.

구조식 (3')

상기 구조식 (3')에서 P, B, J, m, n, X 및 Y는 상기 구조식 (3)에서의 정의와 동일하며, S는 miRNA의 센스가닥, AS는 miRNA의 안티센스 가닥을 의미한다.

보다 바람직하게, 본 발명에 따른 miRNA를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체는 하기 구조식 (4')의 구조를 가진다.

구조식 (4')

상기 구조식 (4')에서 P, B, J, m, n, X 및 Y는 상기 구조식 (4)에서의 정의와 동일하며, S는 miRNA의 센스가닥, AS는 miRNA의 안티센스 가닥을 의미한다.

상기 구조식 (3) 및 구조식 (4)에서의 친수성 물질 단량체 (P)는 비이온성 친수성 고분자의 단량체 중에서 본 발명의 목적에 부합하는 것이라면 어느 것이라도 제한없이 사용이 가능하며, 바람직하게는 표 1에 기재된 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에서 선택된 단량체, 더욱 바람직하게는 화합물(1)의 단량체가 사용될 수 있으며, 화합물 (1)에서 G는 바람직하게는 CH₂, O, S 및 NH에서 선택될 수 있다.

특히, 친수성 물질 단량체 중에서도 화합물 (1)로 표시되는 단량체에는 다양한 기능기를 도입할 수 있으며, 생체 내 친화성이 좋고 면역반응을 적게 유도하는 등 생체 적합성(bio-compatibility)이 우수할 뿐 아니라, 구조식 (3) 및 구조식 (4)에 따른 구조체 내에 포함된 올리고뉴클레오타이드의 생체 내 안정성을 증가시키고, 전달 효율을 증가시킬 수 있다는 장점을 가지고 있어 본 발명에 따른 구조체의 제조에 매우 적합하다.

본 발명에서의 바람직한 친수성 물질 단량체 구조

화합물 (1)	화합물 (2)	화합물 (3)
G는 CH₂, O, S 또는 NH

구조식 (3) 및 구조식 (4)에서의 친수성 물질은 총 분자량이 1,000 내지 2,000에 범위 내인 것이 바람직하다. 따라서, 예를 들어, 화합물 (1)에 따른 헥사에틸렌 글리콜(Hexa ethylene glycol), 즉 구조식 (3) 및 구조식(4)에서의 G가 O이고, m이 6인 물질이 사용되는 경우 헥사에틸렌글리콜 스페이서(spacer)의 분자량이 344이므로, 반복 횟수(n)는 3 내지 5인 것이 바람직하다.

본 발명은 필요에 따라 상기 구조식 (3) 및 구조식 (4)에서 (P_m-J) 또는 (J-P_m)으로 표시되는 친수성 그룹의 반복 단위, 즉 친수성 물질 블록(block)이 n으로 표시되는 적절한 개수로 사용될 수 있음을 특징으로 한다. 상기 각 친수성 물질 블록 내에 포함되는 친수성 물질 단량체인 P와 링커인 J는 독립적으로 각 친수성 물질 블록간에 동일할 수도 있고, 상이할 수도 있다. 즉, 친수성 물질 블록이 3개 사용될 경우(n=3), 첫 번째 블록에는 화합물 (1)에 따른 친수성 물질 단량체가, 두 번째 블록에는 화합물 (2)에 따른 친수성 물질 단량체가, 세 번째 블록에는 화합물 (3)에 따른 친수성 물질 단량체가 사용되는 등, 모든 친수성 물질 블록별로 다른 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있고, 모든 친수성 물질 블록에 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에 따른 친수성 물질 단량체에서 선택된 어느 하나의 친수성 물질 단량체가 동일하게 사용될 수도 있다. 마찬가지로, 친수성 물질 단량체의 결합을 매개하는 링커 역시 각 친수성 물질 블록별로 모두 동일한 링커가 사용될 수도 있고, 각 친수성 물질 블록별로 상이한 링커가 사용될 수도 있다. 또한, 친수성 물질 단량체의 개수인 m 역시 각 친수성 물질 블록간에 동일할 수도 있고, 상이할 수도 있다. 즉, 첫 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 3개 연결(m=3)되고, 두 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 5개(m=5), 세 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 4개 연결(m=4)되는 등, 서로 다른 개수의 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있고, 모든 친수성 물질 블록에서 동일한 개수의 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있다.

본 발명에서 상기 링커(J)는 PO₃ ^-, SO₃및 CO₂로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 사용되는 친수성 물질의 단량체 등에 따라 본 발명의 목적에 부합하는 한 어떠한 링커라도 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.

상기 친수성 물질 단량체의 전부 또는 일부는 필요에 따라 타겟 특이적 리간드와 같은 다른 물질과의 결합을 위해 필요한 기능기를 갖도록 변경되어도 무방하다.

경우에 따라서, 상기 유전자에 특이적 miRNA를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체의 안티센스 가닥의 5´말단에 인산기(phosphate group)가 한 개 내지 세 개 결합될 수 있다.

예를 들어, miRNA를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체는 하기 구조식 (3'') 또는 구조식 (4'')의 구조를 가진다.

구조식 (3'')

구조식 (4'')

상기 소수성 물질(B)은 소수성 상호작용을 통해 구조식 (1)에 따른 올리고뉴클레오티드 구조체로 구성된 나노입자를 형성하는 역할을 수행한다.

상기 소수성 물질은 분자량이 250 내지 1,000인 것이 바람직하며, 스테로이드(steroid) 유도체, 글리세라이드(glyceride) 유도체, 글리세롤 에테르(glycerol ether), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), C₁₂ 내지 C₅₀의 불포화 또는 포화 탄화수소(hydrocarbon), 디아실포스파티딜콜린 (diacylphosphatidylcholine), 지방산(fatty acid), 인지질(phospholipid), 리포폴리아민(lipopolyamine) 등이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 목적에 부합하는 것이라면 어떠한 소수성 물질도 사용 가능하다는 점은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.

상기 스테로이드(steroid) 유도체는 콜레스테롤, 콜레스탄올, 콜산, 콜리스테릴포르메이트, 코테스타닐 포르메이트 및 콜리스타닐아민으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 글리세라이드 유도체는 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드 등에서 선택될 수 있는데 이때, 글리세라이드의 지방산은 C₁₂ 내지 C₅₀의 불포화 또는 포화 지방산이 바람직하다.

특히, 상기 소수성 물질 중에서도 포화 또는 불포화 탄화수소나 콜레스테롤이 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 구조체의 합성 단계에서 용이하게 결합시킬 수 있는 장점을 가지고 있다는 점에서 바람직하다.

상기 소수성 물질은 친수성 물질의 반대쪽 말단(distal end)에 결합되며, miRNA의 센스가닥 또는 안티센스 가닥의 어느 위치에 결합되어도 무방하다.

본 발명에서, 친수성 물질, 친수성 물질 블록 또는 소수성 물질과 올리고뉴클레오타이드는 단순 공유 결합 또는 링커가 매개된 공유결합(X 또는 Y)에 의해 결합된다. 상기 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합 중 어느 것이어도 무방하다. 이때, 비분해성 결합으로는 아미드 결합 또는 인산화 결합이 있고, 분해성 결합으로는 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명에 따른 miRNA 올리고뉴클레오타이드 구조체를 제조하여 폐암 세포주를 처리하고, 세포주를 아넥신V로 염색하여 유세포 분석기를 사용하여 분석하였다. 그 결과, 도 9에 개시된 바와 같이, RNA 구조체를 사용하여 생체내에서의 안정성 증가를 위한 나노입자를 사용하는 경우, 농도 의존적으로 세포주의 자가 사멸 효과를 유발할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 다른 과점에서 상기 올리고뉴클레오타이드 구조체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 올리고뉴클레오타이드 구조체를 투여하는 단계를 포함하는 암 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 암은 폐암, 간암, 위암, 대장암, 췌장암, 담낭 및 담도암, 유방암, 백혈병, 식도암, 비호치킨 림프종, 갑상선암, 자궁경부암, 피부암의 원발성 암과 이로부터 기타 장기로 전이되어 유발되는 전이암 및 비정상적인 과다 세포 분열을 촉진하여 생성되는 종양성 세포 질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 암인 것을 특징으로 하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 제공하는 암 치료용 조성물의 유효성분으로서 사용 가능한 miRNA 서열은 인간 유전체 유래의 서열이나, miRNA의 유래 유전체를 인간 유전체로 한정하지 않고 다른 동물 유래 유전체부터 구해진 miRNA 서열 역시 사용할 수 있다.

상기 miRNA는 miRNA의 생물학적 등가 효능을 발생시키는 다양한 miRNA 유도체(miRNA mimic)의 형태로 사용할 수 있는데, 동일한 씨앗 부분 (seed region)을 포함하는 miRNA 서열을 포함하는 변형된 miRNA를 사용할 수 있다. 이 때 서열 1 또는 서열 2의 길이를 줄일 수 있는데, 길이가 15개 의 뉴클레오티드로 구성된 짧은 유도체 사용도 가능하다.

상기 miRNA에 대한 miRNA 유도체로서는 RNA 인산 뼈대 구조 (phosphate backbone structure)를 황 등의 다른 원소로 치환한 형태인 포스포로사이오에이트 (phosphorothiolate) 구조를 부분적으로 포함할 수 있으며, RNA 대신 DNA, PNA(petide nucleic acids) 및 LNA(locked nucleic acid) 분자로의 전체 또는 부분적으로 치환한 형태로 사용 가능하고, 또한, RNA 당의 2'수산화기를 다양한 기능성 구조로 치환한 형태로 사용이 가능한데, 이는 메틸화, 메톡시화, 플르오르화 등을 포함하나 이러한 변형에 한정되는 것은 아니다.

상기 miRNA는 성숙 miRNA(mature miRNA)와 이로부터 유도된 상기 miRNA 유도체의 이중 가닥 RNA에 한정하는 것이 아니고, miRNA 전구체의 형태로 사용될 수 있으며, miRNA 전구체 또한 상기 기술된 RNA 인산 뼈대 구조, RNA 핵산의 DNA, PNA 및 LNA 등으로의 부분 또는 전체 치환, RNA 당 분자의 2'수산화기의 변형이 가능하다.

상기 miRNA는 miRNA 전구체 또는 일차 miRNA (pri-miRNA) 형태로 사용 가능한데 이를 화학적인 방법으로 합성하거나 또는 플라스미드 (plasmid)의 형태로 세포로 전달하여 발현하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서, miRNA를 배양 접시에서 배양한 세포로 전달하는 방법은 양이온성 지질과의 혼합물 사용하는 방법, 전기적인 자극으로 전달하는 방법 및 바이러스를 이용하는 방법 등을 사용할 수 있으나 이러한 방법에 제한을 두는 것은 아니다.

상기 miRNA를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학 조성물일 수 있으며, 담체와 함께 제제화 될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

상기 miRNA 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입 (inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: miRNA library를 사용한 miRNA 스크리닝

특허 출원 번호 10-2016-0022462에서 사용한 동일한 miRNA library를 사용하여 폐암 세포주의 사멸을 유도하는 miRNA를 선별하는 실험을 진행하였다. 실험에 사용된 폐암 세포주는 다음과 같다; H2009, H596, H1650, PC9, PC9/GR, H1975, HCC827, A549(ATCC 또는 한국세포주은행에서 구입). 각 세포주를 96 well-plate에 분주하여 배양하고, 이에 40nM의 농도로 miRNA를 transfection 시약인 RNAiMax(Invitrogen)와 함께 처리하여 miRNA를 세포 안으로 전달하였다. 추가적으로 96 시간을 배양한 후, CellTiter-Glo 시약 (Promega) 을 사용하여 세포의 상대적인 성장을 측정하였다 (도 1 내지 도 4). 이 중 사용된 세포주에 효능이 우수한 miRNA으로서 miR-544a를 선정하였다.

실시예 2: miRNA 에 의한 세포 사멸 효과 분석

실시예 1 에서 진행된 실험은 miRNA에 의한 세포의 증식 억제 효과를 측정하는 방법으로 진행이 되었다. 세포의 증식을 억제할 수 있는 방법으로는 크게 두 가지로 나누어 볼 수 있는데, 하나는 세포 성장 싸이클(cell cycle) 중 특정 단계에서 다음 단계로 전이되지 못하게 하는 방법이 있으며, 또 다른 하나는 세포의 사멸을 유도하는 방법이다. 실시예 1에서 선별된 miRNA가 어느 방식으로 세포 증식 억제 효과를 발생시키는지 알아보기 위하여 PC9 및 PC9/ER 세포주를 대상으로 실험을 진행하였다. 상기의 세포주를 6-well plate에 분주하여 배양한 후 miRNA control 및 miR-544a를 각각 40 nM의 농도가 되도록 transfection 시약인 RNAiMax(Invitrogen)을 사용하여 세포 내로 전달하였다. 추가로 48시간을 배양한 후, 세포들을 FITC 형광 염료가 표지된 아넥신 V(annexin V) 와 PI(Propidium iodine)으로 처리하여 유세포분석기(FACS)로 분석하였다.

그 결과, miR-544a로 처리한 세포주의 경우는 miRNA control로 처리한 세포주 대비하여 사멸되는 세포의 수가 월등히 많은 것을 확인하였다. 이는 miR-544a는 세포의 사멸을 유발함으로서 세포 증식 억제 효과를 발휘하는 것을 의미한다(도 5).

실시예 3: 세포 사멸을 유도하는 miR-544a의 작용 기전 분석

실시예 1 및 2에서 확인한 miR-544a의 폐암 세포주 사멸유도 메커니즘을 확인하기 위하여 사용된 세포주들의 신호 전달 체계에 미치는 영향을 측정하였다. 실시예에서 사용된 폐암 세포주들은 EGFR 단백질에 변이가 존재하여 EGFR 신호 전달 체계가 활성화 되어 있으며, 이것이 세포주들의 생존에 중요한 역할을 한다는 것이 알려져 있다.

따라서, miR-544a에 의한 세포주 사멸 작용 기전이 EGFR 신호 전달 체계를 조절할 것으로 예상되었으므로, EGFR 신호 전달 체계에 관여하는 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과가 도 6에 기록된 바와 같다. miR-544a를 처리한 시료의 경우, 대조군 대비하여 EGFR 단백질의 발현량이 현저히 감소된 것을 확인할 수 있으며, EGFR 단백질의 활성을 나타내는 지표인 인산화 EGFR 의 경우도 대조군 대비하여 감소되어 있는 것을 확인할 수 있다.

세포의 성장을 촉진하는 신호 전달 체계인 ERK 신호 전달 체계는 EGFR의 하위 체계에 위치하고 있는데, miR-544a에 의하여 EGFR 신호 전달 체계가 억제된 관계로 인하여 ERK 단백질의 활성화된 형태인 인산화 ERK의 양이 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 6).

실시예 4: miR-544a가 EGFR mRNA 발현을 저해함을 확인

도 6 에서 제시된 데이터와 같이 miRNA에 의하여 단백질의 발현이 감소되는 경우, mRNA 역시 일반적으로 miRNA에 의하여 발현이 저해되는 것으로 알려져 있다. 이를 확인하기 위하여 폐암 세포주 PC9, PC9/ER, H1975 및 H596에 miR-544a 또는 negative control을 처리한 후, EGFR mRNA의 상대적 발현량을 분석하였다.

그 결과, 실험에 사용된 모든 세포주에서 EGFR mRNA의 발현량이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 7).

실시예 5: 루시퍼아제 측정 방법을 사용하여 miR-544a의 직접 타겟 mRNA 확인

miRNA는 타겟 mRNA의 3' UTR (untranslated region)에 결합함으로써 타겟 mRNA에서의 단백질 생성을 저해하기 때문에 miRNA와 타겟 mRNA와의 관계를 직접적으로 측정하는 방법으로서 루시퍼아제 측정법을 통상적으로 사용한다. 타겟스캔 (TargetScan) 소프트웨어에서 miRNA 결합 서열이 포함된 3' UTR 서열을 제공하는데 이를 파이어플라이 루시퍼아제 (firefly luciferase)의 3' UTR에 유전자 클로닝 (gene cloning) 기법으로 삽입하고, 이러한 방식으로 제작된 벡터를 해당 miRNA와 동시에 Human Embryonic Kidney (HEK) 세포에 트랜스펙션하여 벡터의 루시퍼아제 발현량을 측정하였다. EGFR mRNA 가 miR-544a의 타겟이 되는지 여부를 확인하고자 EGFR mRNA의 3' UTR을 a, b로 나누어 각각 파이어플라이 루시퍼아제 벡터에 삽입하였다. 이 때 트랜스펙션 효율을 보정하기 위하여 레닐라 루시퍼아제(renilla luciferase)도 동시에 트랜스펙션하여 측정치를 보정하였다. miRNA, 파이어플라이 루시퍼아제, 레닐라 루시퍼아제를 동시에 주입하고 48시간 동안 배양한 후 루미노미터(Luminometer)로 측정하였다

그 결과, 도 8에 개시된 바와 같이 각 타겟 mRNA가 해당 miRNA에 의하여 직접적으로 제어된다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 EGFR 3'UTR에서 miRNA가 작용하는 서열을 예측하여 해당 부위에 돌연변이(EGFR 3'UTR 250-256, 2288-2295, 3476-3482nt)를 유발하였을 때 miRNA에 의한 발현 억제 현상이 사라지는 것을 확인하였다. 따라서 타겟 mRNA는 miRNA가 작용부위에 직접적으로 결합하여 제어된다는 것을 확인하였다.

실시예 6: miR-544a의 약물 내성 극복 평가

EGFR 변이를 갖는 폐암에 대한 치료제로서 임상에서 사용하는 Erlotinib 과의 효능을 miR-544a와 비교하여 평가를 진행하였다. EGFR 변이가 있는 세포주 PC9, PC9/GR, PC9/ER, H1975, H596, H1650을 96-well plate 에 분주하여 배양한 후, 도 9에 표시되어 있는 농도로 Erlotinib을 처리하고 추가적으로 96 시간동안 배양한 후 세포의 상대적 생존량을 측정하였다. 이들 세포주는 다음과 같은 유전자적 특성 및 약물 저항성이 있는 관계로 사용되었다. PC9 은 delE764-A750 변이를 가지며, Erlotinib에 우수한 반응성이 있어 Erlotinib 처리시 세포주를 효과적으로 사멸시킬 수 있다. 반면, PC9/GR, PC9/ER 은 PC9 과 같이 delE764-A750 변이를 포함하고, 추가적으로 T790M 변이를 지니고 있다. 이로 인하여 Erlotinib 에 대한 저항성을 가지는 세포주이다. H1975는 L858R, T790M 변이를, H596 은 과발현된 EGFR 을, H1650은 delE764-A750 변이를 가지고 있으며 모두 Erlotinib에 대한 저항성이 있는 세포주이다. 생존량은 실시예 1 에서 사용한 CellTiter-Glo를 사용하여 측정하였다. 마찬가지로 miR control, miR-544a 를 도 9에 표시되어 있는 농도로 RNAiMax transfection 시약으로 처리하고 Erlotinib 처리군과 동일한 조건에서 상대적 생존량을 측정하였다.

그 결과, 도 9에 개시된 바와 같이 Erlotinib에 잘 반응하는 것으로 알려진 PC9 세포주에서는 Erlotinib의 농도 0.1 uM 에서 세포주를 사멸시킬 수 있으나, EGFR T790M 등의 변이에 의한 Erlotinib 내성이 있는 다른 세포주에서는 PC9 세포주 대비 100배인 10uM 농도로 처리하는 경우에 세포의 사멸을 유도할 수 있는 것을 확인하였다. 반면, miR-544a의 경우, EGFR T790M 변이 여부와 상관없이 0.001-0.01uM 의 처리 농도에서 세포의 사멸을 유도할 수 있다는 것을 확인하였다.

이는 Erlotinib 대비 저농도에서 miRNA 가 효과적이며, 또 EGFR T790M 변이에 의한 Erlotinib 내성과 상관없이 효과적으로 작용할 수 있음을 의미하며, 도 6에 개시된 웨스턴 블롯 결과에서도 같은 결과를 확인할 수 있었다. PC9 세포주에서는 miR-544a 와 Erlotinib이 활성화된 EGFR (pEGFR) 을 억제하고, 하위 신호 전달 인자인 ERK 의 인산화를 저해한다. 결과로 PARP 에서 알 수 있듯이 세포의 사멸을 유도한다. 하지만, EGFR T790M 변이에 의한 Erlotinib 내성이 있는 다른 세포주에서는 오직 miR-544a 만 이와 같은 효과를 보여주고 있다.

실시예 7: RNA 올리고뉴클레오타이드 구조체의 합성

본 발명에서 제조한 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체는 하기 구조식 (5) 과 같은 구조를 가진다.

구조식 (5)

상기 구조식 (5)에서, S는 miRNA의 센스가닥, AS는 miRNA의 안티센스 가닥, PO₄는 인산기, 에틸렌글리콜은 친수성 물질 단량체(monomer)로 헥사에틸렌글리콜(hexa ethylene glycol)이 링커(J)인 인산기(PO₃ ^-)를 통해 결합되고, C₂₄는 소수성 물질로 이황화 결합이 포함되어 있는 테트라도코산 (tetradocosane), 그리고 5' 및 3'은 이중나선 올리고 RNA의 말단 방향을 의미한다.

상기 구조식 (5)에서의 miRNA의 센스가닥은 DMT-헥사에틸린글리콜-CPG를 지지체로 하고 β-시아노에틸포스포아미다이트를 이용하여 올리고 뉴클레오타이드 골격구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해가는 방법을 통해 3' 말단 부위에 헥사에틸렌글리콜이 결합된 센스가닥을 포함하는 올리고 뉴클레오타이드 -친수성 물질 구조체를 합성한 뒤, 이황화 결합이 포함되어있는 테트라도코산을 5' 말단에 결합하여 원하는 올리고뉴클레오타이드 -고분자 구조체의 센스가닥을 제조하였다. 상기 가닥과 어닐링을 수행할 안티센스 가닥의 경우, 앞서 언급한 반응을 통해 센스가닥과 상보적인 서열의 안티센스 가닥을 제조하였다.

실시예 8: miRNA 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 구조체에 의한 세포 사멸 유도

상기 실시예들을 통하여 선별된 miRNA를 생체 내에서의 안정성을 확보하기 위하여 실시예 6의 방법으로 올리고뉴클레오타이드 구조체를 제조하였다. 이러한 방식으로 제조된 나노 입자들 또한 폐암 세포주에서 세포 사멸을 유발하는지 여부를 평가 하기 위하여 폐암 세포주 A549, H1650을 96-well plate에 분주하여 배양하였고, 나노 입자를 1000nM로 배양액에 첨가하였다. 나노 입자를 첨가한 배양액에 세포를 배양한 후, CellTiter-Glo 시약 (Promega) 을 사용하여 세포의 상대적인 성장을 측정하였다.

그 결과, 올리고뉴클레오타이드 구조체로 제조된 miRNA에 의해서 세포사멸이 유도되는 것을 확인하였다(도 10).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> BIONEER CORPORATION <120> Double-stranded Oligonucleotide Complex comprising Double stranded miRNA and Uses thereof <130> P18-B303 <150> KR 10-2018-0011141 <151> 2018-01-30 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-544a_5' <400> 1 auucugcauu uuuagcaagu uc 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-544a_3' <400> 2 acuugcuaaa aaugcagaau uu 22

Claims

하기 구조식 (1)의 구조를 포함하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체를 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 조성물.
A-X-R-Y-B 구조식 (1)
상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 miR-544a를 의미한다.
제1항에 있어서,
상기 친수성 물질 A는 (P)_n, (P_m-J)_n 또는 (J-P_m)_n으로 표시되고, P는 친수성 물질 단량체(monomer), n은 1 내지 200, m은 1 내지 15, J는 m개의 친수성 물질 단량체 간 또는 m개의 친수성 물질 단량체와 올리고뉴클레오타이드를 서로 연결하는 링커인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체를 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 친수성 물질은 분자량이 200 내지 10,000인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체를 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 친수성 물질 단량체(P)는 하기 화합물 (1)의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체를 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 조성물.

화합물 (1)
상기 화합물 (1)에서 G는 CH₂, O, S 및 NH로 이루어진 군에서 선택된다.
제2항에 있어서,
상기 링커(J)는 PO₃ ^-, SO₃및 CO₂로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체를 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 소수성 물질의 분자량은 250 내지 1,000인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체를 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 소수성 물질은 스테로이드(steroid) 유도체, 글리세라이드(glyceride) 유도체, 글리세롤 에테르(glycerol ether), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), C₁₂ 내지 C₅₀의 불포화 또는 포화탄화수소(hydrocarbon), 디아실포스파티딜콜린(diacylphosphatidylcholine), 지방산(fatty acid), 인지질(phospholipid) 및, 리포폴리아민(lipopolyamine)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체를 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 스테로이드(steroid) 유도체는 콜레스테롤, 콜레스탄올, 콜산, 콜리스테릴 포르메이트, 코테스타닐 포르메이트 및 콜리스타닐아민으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오타이드 구조체를 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 조성물.
제7항에 있어서
상기 글리세라이드 유도체는 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체를 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 X 및 Y 로 표시되는 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체를 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 조성물.
제10항에 있어서,
상기 비분해성 결합은 아미드 결합 또는 인산화 결합인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체를 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 조성물.
제10항에 있어서,
상기 분해성 결합은 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체를 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 miR-544a 는 서열번호 1과 서열번호 2 의 염기 서열로 이루어진 이중 가닥 RNA로 구성되는 이중 가닥이 유효성분으로 포함되는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고뉴클레오타이드 구조체를 유효성분으로 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 조성물.
삭제
삭제
삭제