KR101862247B1 - serpinb5에 대한 약물반응성을 가지는 마이크로 RNA를 함유하는 암치료용 의약조성물 및 이의 적용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 serpinb5에 대하여 약물반응성을 가지고, 암세포의 증식을 억제하거나 자발적 사멸을 유도할 수 있는 miRNA 또는 siRNA를 함유하는 암치료용 의약조성물 및 serpinb5을 바이오마커 용도로 사용하여, 상기 serpinb5를 이용한 치료대상을 결정하기 위한 정보를 제공하는 방법 및 serpinb5에 대한 약물반응성 예측용 키트에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 우수한 항암 효능을 보이는 miR-3670, miR-4477a 및 miR-8078 등의 miRNA을 적용하는데 적합한 치료군의 환자를 높은 정확도로 선별할 수 있다.

Description

serpinb5에 대한 약물반응성을 가지는 마이크로 RNA를 함유하는 암치료용 의약조성물 및 이의 적용{Pharmaceutical Composition for Treating Cancer Comprising miRNA having Drug Response to serpinb5 and Application Thereof}

본 발명은 serpinb5에 대하여 약물반응성을 가지고, 암세포의 증식을 억제하거나 자발적 사멸을 유도할 수 있는 암치료용 의약조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 serpinb5에 대하여 약물반응성을 가지고, 암세포의 증식을 억제하거나 자발적 사멸을 유도할 수 있는 miRNA 또는 siRNA를 함유하는 암치료용 의약조성물 및 serpinb5을 바이오마커 용도로 사용하여, 상기 serpinb5를 이용한 치료대상을 결정하기 위한 정보를 제공하는 방법 및 serpinb5에 대한 약물반응성 예측용 키트에 관한 것이다.

유전자의 정상적인 제어가 이루어지지 않아 발생하는 질병, 대표적으로 암으로 통칭되는 질환에 대한 효과적이고 전통적인 치료 방법은 외과적으로 종양을 절제하여 제거하는 방법이 사용되었으나, 원발성 암이 타 기관으로 전이가 되는 경우는 외과적 수술이 불가하여 항암 약물 치료 요법이 사용되었다. 약물 치료로 사용되는 항암제는 주로 단분자 물질을 유기적 또는 무기적 방법으로 합성하여 사용하였는데, 이는 암 질환이 주로 신호 전달 체계에 포함된 인산 활성 인자 단백질의 과발현 등에 의하여 신호 체계를 교란 시키는 단백질에 효과적으로 결합하여 단백질의 활성을 억제하는 용도로 개발 되어 사용 되었다. 이러한 방식의 전통적 약물 치료법은 많은 부작용을 수반하는데, 그 중 한 가지는 약물로 사용되는 물질이 인위적으로 합성된 생체 외부 유래 물질이라는 것과 항암 물질의 작용점이 이미 과다 발현된 단백질을 목적으로 한다는 점이다.

상기 전통적인 약물 치료 방법을 대체하기 위한 약물 치료제의 개발이 여러 방면으로 진행 되었는데, 그 중 하나가 작은 간섭 RNA (small interfering RNA, 이하 siRNA 으로 표기) 의 이용이다(Iorns, E., Lord, C.J., Turner, N. & Ashworth, A. Nat Rev Drug Discov 6, 556-68. 2007). siRNA는 16에서 27사이의 뉴클레오티드로 구성된 단일 가닥 RNA 로서, 세포 내에서 리스크(RNA Induced Silencing Complex, RISC)라 알려진 리보핵산단백질 결합체 (ribonucleoprotein)의 구성 성분으로서 활동을 한다(Tomari, Y. & Zamore, P.D., Genes Dev 19, 517-29, 2005; Chu, C.Y. & Rana, T.M., Rna 14, 1714-9, 2008, Mittal, V., Nat Rev Genet 5, 355-65, 2004; Reynolds, A. et al., Nat Biotechnol 22, 326-30. 2004). RISC는 RNA 효소 가위로서 기능을 하는데, 메신저 RNA (messenger RNA, 이하 mRNA 로 표기)를 절단하여 mRNA로부터 단백질이 생성되는 것을 저해한다. RISC에 포함된 siRNA는 siRNA 서열과 상보적인 서열을 갖는 mRNA와 결합하여 이중가닥 RNA를 형성하고, RISC는 RNA 효소 가위로 작용하여 목표가 되는 mRNA를 절단하여 mRNA가 더 이상 단백질을 반복 생성하는 형판 (template)으로서의 기능을 수행할 수 없도록 한다.

이처럼 siRNA 기반의 항암 치료제는 단백질 생성 단계 이전의 mRNA를 차단한다는 점, 그리고 RNA 와 세포 내재적인 RISC 시스템을 활용한다는 점에 있어서 상기 단분자 물질의 항암제보다 진보한 기술로 평가되나, siRNA 기반의 기술로도 해결하지 못하는 부작용이 있는데, 이는 비표적 효과 (off-target effect)로 불리는 현상이다(Jackson, A.L. et al., Rna 12, 1179-87, 2006; Jackson, A.L. et al., Rna 12, 1197-205, 2006; Jackson, A.L. et al., Nat Biotechnol 21, 635-7, 2003; Nielsen, C.B. et al., Rna 13, 1894-910, 2007; Peek, A.S. & Behlke, M.A., Curr Opin Mol Ther 9, 110-8, 2007). 상기 기술한 바와 같이 siRNA 서열과 상보적으로 결합하는 mRNA를 분해하는데, siRNA 서열 전체와 상보적이지 않고 일부분만 상보적인 mRNA와도 결합하여 분해를 유발하는데 이를 표적이 아닌 mRNA의 분해를 유발한다 하여 비표적 효과라 불린다.

상기 기술된 siRNA 기반의 항암 치료제의 기술적 난점을 극복하기 위하여 마이크로 RNA (microRNA, 이하 miRNA로 표기)를 치료제로 사용하려는 연구가 진행 중이다(Agostini, M. & Knight, R.A., Oncotarget 5, 872-81, 2014; van Rooij, E., Purcell, A.L. & Levin, A.A., Circulation Research 110, 496-507, 2012; Burnett, J.C. & Rossi, J.J. ,Chem Biol 19, 60-71, 2012; Dangwal, S. & Thum, T., Annu Rev Pharmacol Toxicol 54, 185-203, 2014). miRNA는 16에서 27사이의 뉴클레오티드로 구성된 RNA로서 단백질로 번역되는 메신저 RNA(mRNA)에 대비하여 단백질 비생성 RNA(protein non-coding RNA)로 분류된다(Carthew, R.W. & Sontheimer, E.J., Cell 136, 642-55, 2009; MacFarlane, L.-A. & Murphy, P.R., Current Genomics 11, 537-561, 2010; Bartel, D.P., Cell 136, 215-33, 2009). miRNA는 고등 동식물 세포의 유전체에 기록 되어 있으며 세포의 생성, 성장, 분화, 사멸을 포함한 세포의 대사 및 기능을 조절하는데 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 현재까지 인간의 유전체에서는 2000 여종의 miRNA가 알려져 있으며 이 중 상당수의 miRNA의 기능은 아직 알려져 있지 않다.

miRNA는 유전체로부터 Pol II라 불리는 RNA 폴리머라제(polymerase)에 의해 RNA로 전사되는데, 초기 길이는 특정할 수 없이 다양하다(Carthew, R.W. & Sontheimer, E.J, Cell 136, 642-55, 2009., Brodersen, P. & Voinnet, O., Nat Rev Mol Cell Biol 10, 141-148, 2009). 이는 miRNA가 유전체에 포함된 위치의 다양성에 기인하는데, mRNA의 단백질 생성 비관여 부분인 인트론 (intron)에 위치하여 mRNA 생성 동일 시점에 전사되는 경우 및 유전체상에서 유전자간 빈 공간 (inter-genic region)에 위치하여 독자적으로 전사되는 경우 등 다양한 방식으로 생성되기 때문이다(Malone, C.D. & Hannon, G.J., Cell 136, 656-68, 2009). 이와 같이 초기에 생성된 miRNA 모체를 일차 miR(primary microRNA)라 하는데, 일차 miR는 핵 속의 드로셔(Drosha)라 불리는 RNA 절단 효소(RNase) 등에 의하여 전구체 miR(precursor miRNA, pre-miR) 로 편집된다(Bartel, D.P., Cell 136, 215-33, 2009). Pre-miR는 RNA 헤어핀 구조(RNA hair-pin structure)를 이루며 대략 70-80 개의 뉴클레오티드로 구성된다. 세포 핵 내부의 Pre-miR는 exportin 단백질 등에 의해 핵에서 세포질로 이동되며, 세포질 내에서 다이서(Dicer)라 불리는 또 다른 RNA 절단 효소(RNase)에 의하여 이차 가공이 되어 16-27 개의 뉴클레오티드로 구성되는 이중 가닥의 성숙 miR(mature microRNA, 이하 다른 수식어 없이 miR 로 기술하는 경우는 성숙 miR를 의미함)를 생성한다. 이중 가닥 miR 중 한 가닥의 RNA 가 선택적으로 선정되어 상기 리보핵산단백질 결합체(ribonucleoprotein comple)인 RISC와 결합하여 활성을 가지게 되고, miR의 서열을 이용하여 목표 mRNA와 결합한다.

일반적으로 mRNA는 단백질 생성 관여 여부를 기준으로 크게 세 부분으로 나눌 수 있는데, 단백질 번역 정보를 담고 있는 코딩 부분(coding region)과 코딩 부분의 각각 5' 과 3' 부분으로서 단백질 번역 정보를 가지지 않는 5'-UTR(Un-Translated Region)과 3'-UTR로 구분할 수 있다. mRNA와의 상보적 서열을 이용, 목표 mRNA의 분해를 유발하는 siRNA는 mRNA 의 5'-, 3'-UTR 및 코딩 부분에 상관 없이 작용을 하는 반면, miR는 주로 3'-UTR과 결합을 한다(Carthew, R.W. & Sontheimer, E.J., Cell 136, 642-55, 2009; Bartel, D.P., Cell 136, 215-33, 2009).

mRNA와의 결합 위치 차이와 더불어 siRNA와 다른 miRNA의 독특한 특징은 siRNA는 siRNA 전체 서열과 상보적인 서열을 포함한 mRNA와 주로 결합하는 반면, miRNA는 miRNA의 5' 끝으로부터 2-8 뉴클레오티드 자리에 위치한, 한정된 크기의 씨앗부분(seed region)서열이 주로 목표 mRNA 인식에 사용되는 점이 다르며, 따라서 전체 miRNA의 서열이 목표 유전자와 완벽한 상보적인 서열을 가지지 않고 일정 부분 비상보적 서열이 포함되어도 miRNA 활성에 영향을 주지 않는다(Bartel, D.P.,. Cell 136, 215-33, 2009). 씨앗 부분의 서열 크기가 6-8 뉴클레오티드인 만큼 이와 상보적인 서열을 3' UTR에 가지는 mRNA 종류는 다양하며, 이러한 이유로 한 종의 miRNA로 여러 종의 mRNA를 동시에 제어할 수 있다. 이러한 miRNA의 성질은 miRNA가 세포의 분열, 성장, 분화, 사멸에 이르는 많은 부분의 세포 생리학적 측면의 제어에 관여하는 효율적인 조절인자(regulator)로서의 기능을 부과한다. 또한, 조절인자로서의 miRNA 의 기능은 효과적인 항암 효과를 구현하는데 장점으로서 작용하는데, siRNA 의 경우 단일 유전자 발현의 억제를 목표로 하는데 반하여, miRNA 는 암 유발 유전자 다수의 발현을 동시에 저해할 수 있기 때문이다.

많은 수의 mRNA가 3' UTR에 한 종 이상의 miRNA가 결합할 가능성이 있는 부분을 포함하고 있으며, 한 생물정보학적인 계산에 따르면 전체 mRNA의 대략 30%가 miRNA에 의해 단백질 생성이 조절되고 있는 것으로 알려져 있다.

miRNA의 이러한 신호 전달 체계 내의 주요 조절인자로 작용하는 사실은 암을 포함한 주요 질환에서도 중요한 역할을 수행한다는 점에서 알 수 있다(MacFarlane, L.-A. & Murphy, P.R., Current Genomics 11, 537-561. 2010; Malone, C.D. & Hannon, G.J., Cell 136, 656-68. 2009; Nicoloso, M.S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S. & Calin, G.A., Nat Rev Cancer 9, 293-302. 2009; Landi, D., Gemignani, F. & Landi, S. ,Mutagenesis 27, 205-10. 2012). 실제로 여러 연구를 통하여 암 세포에서의 miRNA들의 발현 양식은 정상 세포에서의 발현 양식과 큰 차이를 보이는 것이 드러났다. 뿐만 아니라 암이 발생한 원발 장기에 따라서도 miRNA 발현 양식이 큰 차이가 있는데 폐암, 간암, 피부암, 혈액암 등 다양한 암들이 원발 장기에 따른 독특한 miRNA 발현 양식을 보이고, 이를 통하여 miRNA가 암 생물학에 있어 주요한 역할을 한다는 것이 알려져 있다. 특히, 암 종에서 발현되는 miRNA들이 그들의 정상 세포에서의 발현양에 대비하여 일반적으로 낮은 것이 알려져 있다.

상기 암에 있어서의 miRNA의 깊은 연관성을 바탕으로 miRNA를 항암 치료제로 이용하려는 시도가 최근에 시작되었으며, 그 일례로 miR-34a라 명명된 miRNA의 암 세포 증식 억제 및 사멸 유도 능력을 검증하기 위한 임상 실험 중에 있다(Wiggins, J.F. et al., Cancer Res 70, 5923-30. 2010; Bader, A.G. et al. ,Intervention. Google Patents, 2009; Hermeking, H. ,Cell Death Differ 17, 193-9. 2010; Chang, T.C. et al., Mol Cell 26, 745-52. 2007).

본 발명자들은 임상 실험 중인 miR-34a의 암 세포 증식 억제 및 암 세포 사멸 유도 능력 보다 효능이 뛰어난 miRNA를 발굴하고자 노력한 결과, 항암 효능이 뛰어난 miR-3670, miR-4477a, miR-8078 를 발굴하였다(대한민국 특허출원 10-2016-0022462호, PCT/KR2016/001828).

유전자의 변이를 특징으로 하는 질환 중 특히 암의 경우는 염색체의 변이 및 세포 증식 및 성장에 관여하는 단백질의 이상 발현 등으로 단일 치료제 치료가 지극히 어려운 질병이다. 따라서, 특정 암종을 가진 환자에서 특이적으로 우수한 약물 효능이 관찰되는 약물의 경우도, 동일 암종을 가진 또 다른 환자에서는 전혀 효과를 볼 수 없는 경우가 빈번히 발생하게 되는 바, 이는 개별 환자의 특성뿐 아니라 암종의 유전적 변이의 다양성 및 이상 발현되는 단백질의 발현 정도에 크게 기인하기 때문이다. 이와 같은 이유로 특정 약물에 대한 암종의 반응성을 미리 예측하기 위한 방법의 개발이 절실한 상황이다.

이에, 본 발명자들은 항암효능이 뛰어난 miRNA인 miR-3670, miR-4477a 및 miR-8078에 의하여, 암세포에서 발현이 조절되는 유전자를 바이오마커로 발굴하는 경우, 적합한 치료대상을 효과적으로 선택할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 serpinb5에 대하여 약물반응성을 가지는 miRNA 또는 siRNA를 함유하는 암치료용 의약조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 serpinb5 유전자를 이용하여 miRNA 치료제에 대한 치료대상을 결정하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 serpinb5에 대하여 약물반응성을 가지는 miRNA 또는 siRNA를 함유하는 암치료용 의약조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 암 의심 조직 또는 세포 샘플의 serpinb5 발현 패턴을 확인하는 단계; 및 (b) 정상 조직 또는 세포 보다 serpin5의 발현이 증가된 샘플을 치료 대상으로 선택하는 단계를 포함하는 miR-3670, miR-4477a, miR-8078로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA을 사용하는 serpinb5 유전자를 이용하여 miRNA 치료제에 대한 치료대상을 결정하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, Serpinb5 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 프로브 및 프라이머쌍을 함유하는 miR-3670, miR-4477a, miR-8078로 구성된 군에서 선택되는 miRNA 항암 치료제에 대한 약물반응성 예측용 키트를 제공한다.

본 발명에 따르면, serpinb5 유전자를 miRNA 기반 치료제에 대한 감수성 예측용 바이오마커로 사용하여, 우수한 항암 효능을 보이는 miR-3670, miR-4477a 및 miR-8078 등의 miRNA을 적용하는데 적합한 치료군의 환자를 높은 정확도로 선별할 수 있다.

도 1은 miR-3670, miR-4477a, miR-8078 에 의하여 암 세포의 증식이 억제됨을 보이기 위하여 각 해당 마이크로 RNA 를 트랜스펙션 기법으로 세포내에 주입하고, 소프트 아가에서 2 주간 배양하여 형성된 군집을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 다양한 폐암 세포주에 miR-34a, miR-3670 또는 miR-8078을 주입하여 세포의 사멸 유도 능력을 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 것으로, A는 반응성이 있는 세포주의 결과를 나타낸 것이고, B는 반응성이 없는 세포주의 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실험에 사용된 각 세포주들의 mRNA 발현 프로파일을 MERAV database 를 miRNA 약물 반응성에 따라 두 그룹으로 분리하여 Gene Pattern Analysis한 결과를 나타낸 것으로, 이 중 serpinb5 의 발현이 두 그룹의 차이를 가장 잘 나타내는 특이적인 유전자임을 보여 주는 Heat Map 이다.
도 4A는 도 3에서 표현된 serpinb5 의 발현량을 상대적 histogram(MERAVE database mRNA 프로파일)로 나타낸 것이고, 도 4B는 12종의 NSCLC의 각 세포 주에서의 SERPIN5의 mRNA 발현량을 비교하기 위하여, qRT-PCR 분석으로 분석한 결과를 나타낸 것이고, 도 4C는 각 세포주에서의 serpinb5 단백질 발현량의 상대적 분석을 위하여 웨스턴 블롯을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 miR-3670을 트랜스펙션 방식으로 폐암 세포주 H460(A)과 H596(B)에 주입하여 Serpinb5 의 단백질 발현량이 miR-3670 의 영향으로 감소되는 것을 보이는 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 miR-3670, miR-8078 등에 반응성을 보이는 세포주 그룹에 포함된 세포주에 대하여 serpinb-5 gene 을 siRNA 를 사용하여 발현을 저해하는 경우, 마이크로 RNA 를 사용하는 경우와 유사한 양상으로 세포 사멸을 유발할 수 있음을 보여 주는 유세포분석 결과를 나타낸 것으로, A는 반응성 있는 세포주 그룹의 결과를 나타낸 것이고, B는 반응성이 없는 세포주 그룹의 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 암 세포 성장에 미치는 영향을 동물 모델에서 평가하기 위하여 폐암 세포주에 각각 음성 대조군, miR-34a, miR-3670 및 si-serpinb5 를 트랜스펙션으로 주입하고, 이러한 세포주를 사용하여 xenograft 동물 모델을 제작하였다. 시일 경과에 따른 동물 모델에서의 종양 크기를 비교한 결과를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

마이크로 RNA 를 함유하는 암 치료용 약학 조성물은 일반적으로 특정 암 세포의 증식 억제 및 사멸을 유발하는 효과가 우수하다. 우수한 약학적 효능을 보이는 암은 그렇지 않은 암 대비 특이적으로 높은 발현량을 보이는 바이오마커를 가지고 있다. 본 발명에서는 항암 치료 조성물의 구성물로 사용될 수 있는 miR-3670, miR-4477a, miR-8078 에 대한 반응성 예측 지표로서의 바이오마커를 발굴하고, 이의 바이오마커로서의 효과를 확인하고자 하였으며, 암 세포주에서 발현이 증가하는 유전자 중, 항암효능이 우수한 miRNA인 miR-3670, miR-4477a, miR-8078를 처리하였을 때, 그 발현이 감소되는 패턴을 가지는 유전자로 serpinb5 (serpin family B member 5, GeneBank 등재번호 NM_002639.4)를 확인하였으며, serpinb5 유전자를 폐암치료제에 대한 감수성 예측용 바이오마커로 사용할 수 있다는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 serpinb5에 대하여 약물반응성을 가지는 miRNA 또는 siRNA를 함유하는 암치료용 의약조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 miRNA는 miR-3670, miR-4477a 및 miR-8078로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 miR-3670은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 이중 가닥 RNA 을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 miR-4477a 는 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기 서열로 이루어진 이중 가닥 RNA 을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 miR-8078 는 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 이중 가닥 RNA을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

즉, 본 발명의 miR-3670 주형 가닥은 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

5'- AGAGCUCACAGCUGUCCUUCUCUA - 3'(MIMAT0018093. 서열번호 1)

생체 내에서 궁극적으로 활성을 보이는 miRNA 는 단일 가닥이지만, RISC 에 결합하기 위하여서는 유사한 염기 크기를 갖는 염기 서열과 함께 이중 가닥 형태로 세포내에 공급되어야 한다. 이때, 상기 서열과 결합하는 반대 서열 (antisense) 는 활성 서열과 상보적인 서열을 가진다. 상보적인 서열은 완벽 상보 서열 (perfect complementary sequence) 를 가지거나, 또는 생체 내재적인 서열 (endogenous sequence ) 을 사용할 수 있다. 이중 가닥으로 구성된 각 서열 모두, 혹은 한 쪽 가닥의 3' 에 위치한 염기는 상대 서열과의 염기 결합을 가지지 않을 수 있는데, 이를 3' 오버행 (overhang) 이라 하며 이를 포함할 수 있다.

즉, miR-3670 의 완벽 상보 서열 (perfect complementary sequence)은 서열번호 2으로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

5' - GAGAAGGACAGCUGUGAGCUCUUU - 3' (서열번호 2)

또한, miR-3670 의 내재적 상보 서열 (endogenous complementary sequence)은 서열번호 3로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

5' - GACUGGUAUAGCUGCUUUUGGAGCCUCA - 3' (서열번호 3)

상기 배경 기술에서 기술한 바와 같이 miRNA 활성 서열의 두 번째 염기로부터 8-9 번째 염기까지 해당하는 씨앗 서열 (seed region) 이 활성의 주요한 인자인데, 이중 가닥 RNA 를 제조할 때 이를 포함하는 긴 이중 가닥을 제조하여 사용할 수도 있다.

miR-3670 과 마찬가지로 miR-4477a 및 miR-8078 의 활성 서열 및 이들과 이중 가닥을 이루기 위한 상보 서열은 아래에 기재된 바와 같이 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다. 이들 이중 가닥도 전술한 바와 같이 3' 오버행을 포함하여 이중 가닥을 구성할 수 있으며, 또한 씨앗 지역 (seed region) 을 포함한 긴 서열의 이중 가닥을 구성하여 사용할 수 있다.

miR-4477a

5' - CUAUUAAGGACAUUUGUGAUUC -3' (MIMAT0019004 서열번호 4)

miR-4477a 의 완벽 상보 서열 (perfect complementary sequence)

5'- AUCACAAAUGUCCUUAAUAGUU -3' (서열번호 5)

miR-4477a 의 내재 상보 서열 (endogenous complementary sequence)

5'- AUCACAAAUGUCCUUAAUGGCA -3' (서열번호 6)

miR-8078

5'- GGUCUAGGCCCGGUGAGAGACUC (MIMAT0031005, 서열번호 7)

miR-8078 의 완벽 상보 서열 (perfect complementary sequence)

5'- GUCUCUCACCGGGCCUAGACCUU (서열번호 8)

miR-8078 의 내재 상보 서열 (endogenous complementary sequence)

5'- CUCCACCGGGCUGACCGGCCUG -3' (서열번호 9)

본 발명에서 라이브러리 스크린을 통하여 발굴된 상기 miRNA 는 암의 유발, 생성 및 성장에 주요한 역할을 하는 것으로 통상적으로 알려진 유전자를 제어함으로써 항암 효능을 발생시키는 것을 확인하였다. 한 종의 miRNA 가 다수의 mRNA 발현을 동시에 제어 할 수 있는 것이 miRNA 의 특징인데, 이러한 성질은 본 발명에서도 확인 되었으며, 올리고 기반의 항암 신약 개발에 유용한 성질이다.

본 발명에 있어서, 상기 세포는 암 세포인 것을 특징으로 할 수 있다

본 발명에 있어서, 상기 암은 폐암, 간암, 위암, 대장암, 췌장암, 담낭 및 담도암, 유방암, 백혈병, 식도암, 비호치킨 림프종, 갑상선암, 자궁경부암, 피부암의 원발성 암과 이로부터 기타 장기로 전이되어 유발되는 전이암 및 비정상적인 과다 세포 분열을 촉진하여 생성되는 종양성 세포 질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 암인 것을 특징으로 하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 miRNA는 miRNA의 생물학적 등가 효능을 발생시키는 다양한 miRNA 유도체(miRNA mimic)의 형태로 사용할 수 있는데, 동일한 씨앗 부분 (seed region)을 포함하는 miRNA 서열을 포함하는 변형된 miRNA를 사용할 수 있다. 이 때 서열 1 또는 서열 2의 길이를 줄일 수 있는데, 길이가 15개 의 뉴클레오티드로 구성된 짧은 유도체 사용도 가능하다.

본 발명에서 상기 miRNA에 대한 miRNA 유도체로서는 RNA 인산 뼈대 구조 (phosphate backbone structure)를 황 등의 다른 원소로 치환한 형태인 포스포로사이오에이트 (phosphorothiolate) 구조를 부분적으로 포함할 수 있으며, RNA 대신 DNA, PNA(petide nucleic acids) 및 LNA(locked nucleic acid) 분자로의 전체 또는 부분적으로 치환한 형태로 사용 가능하고, 또한, RNA 당의 2'수산화기를 다양한 기능성 구조로 치환한 형태로 사용이 가능한데 , 이는 메틸화, 메톡시화, 플르오르화 등을 포함하나 이러한 변형에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 miRNA는 성숙 miRNA(mature miRNA)와 이로부터 유도된 상기 miRNA 유도체의 이중 가닥 RNA에 한정하는 것이 아니고, miRNA 전구체의 형태로 사용될 수 있으며, miRNA 전구체 또한 상기 기술된 RNA 인산 뼈대 구조, RNA 핵산의 DNA, PNA 및 LNA 등으로의 부분 또는 전체 치환, RNA 당 분자의 2'수산화기의 변형이 가능하다.

본 발명에서 miRNA는 miRNA 전구체 또는 일차 miRNA (pri-miRNA) 형태로 사용 가능한데 이를 화학적인 방법으로 합성하거나 또는 플라스미드 (plasmid)의 형태로 세포로 전달하여 발현하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서, miRNA를 배양 접시에서 배양한 세포로 전달하는 방법은 양이온성 지질과의 혼합물 사용하는 방법, 전기적인 자극으로 전달하는 방법 및 바이러스를 이용하는 방법등을 사용할 수 있으나 이러한 방법에 제한을 두는 것은 아니다.

본 발명에서는 상기 serpinb5를 타겟으로 하는 siRNA 를 사용하여 세포내 함량을 저하시키면 miR-3670, miR4477a, miR-8078 을 사용하는 경우와 마찬가지로 세포의 성장이 저하되는 것을 확인하였다(도 6).

본 발명의 상기 miRNA를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 함체와 함께 제제화 될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 상기 miRNA 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입 (inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

본 발명에서 발굴된 바이오마커로서의 serpinb5 는 바이오마커로서의 기능 뿐 아니라 serpinb5 를 타겟으로 하는 siRNA 를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물 제조에 사용될 수 있다. 또한, 이를 이용한 약학 조성물 제조에 있어 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 함체와 함께 제제화 될 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 암 의심 조직 또는 세포 샘플의 serpinb5 발현 패턴을 확인하는 단계; 및 (b) 정상 조직 또는 세포 보다 serpin5의 발현이 증가된 샘플을 치료 대상으로 선택하는 단계를 포함하는 miR-3670, miR-4477a, miR-8078로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA를 함유하는 치료제에 대한 치료대상을 결정하기 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 serpinb5 발현 패턴 확인은 RT-qPCR 또는 웨스턴 블럿으로 확인할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 Serpinb5 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 프로브 및 프라이머쌍을 함유하는 miR-3670, miR-4477a, miR-8078로 구성된 군에서 선택되는 miRNA 항암 치료제에 대한 약물반응성 예측용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 serpinb5의 단편을 증폭시킬 수 있는 프라이머쌍 및 상기 증폭된 산물로부터 serpinb5 발현량을 측정하기 위한 프로브를 포함할 수 있으며, 상기 프로브와 프라이머를 보관하는 용기 또는 튜브를 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 마이크로 RNA 에 의한 폐암 사멸 유도 효능 평가

본 발명자들은 선행특허(대한민국 특허출원 10-2016-0022462)에서 폐암에 효능을 보이는 마이크로 RNA를 선별하였다. 선별된 마이크로 RNA 의 폐암 증식 억제 효능을 평가하기 위하여 소프트 아가 실험을 진행하였으며, 소프트 아가를 이용하여 종양 세포를 배양함으로써 종양 세포로서의 특질을 측정할 수 있다. 정상 세포의 경우 성장하기 위하여 배양접시와 같은 지지대가 필요한 반면 종양 세포는 소프트 아가와 같이 물리적으로 견고한 지지대가 없는 환경에서도 성장하는 특징을 가지고 있다. 이러한 종양 특이적 성질을 사용하여 소프트 아가에서의 세포 군집 능력을 파악하였다. NCI-H460 폐암 세포주를 control miRNA, miR-34a, miR-8078, miR-3670, miR-4477a, miR-4765 로 각각 처리하여 24 시간 배양한 후, 이를 소프트 아가와 혼합하여 6 well-plate 에서 2주간 배양하였다. 세포를 크리스탈 비올렛 (crystal violet) 염료로 염색하여 각 군집의 개수를 측정하였다 (도1). 그 결과, miR-8078 및 miR-3670 으로 처리한 세포는 거의 군집을 형성하지 못하였고, miR-4477a 로 처리한 세포군의 경우는 대조군 대비 대략 30% 정도의 군집 형성 능력을 보이는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 다양한 폐암 세포주에서의 마이크로 RNA 효능 평가

마이크로 RNA 는 세포내에서 다양한 단백질의 발현을 조절하는 방식으로 신호 전달 체계를 제어한다. 따라서, 정상적인 세포에서의 마이크로 RNA 작용 방식이 암과 같은 질환의 세포에서 동일한 방식으로 작용할 것을 기대하기는 힘들다. 암 질환의 특성상 매우 많은 유전자 변이를 포함하고 있기 때문이다. 실시예 1 에서 발굴된, 항암 작용이 탁월한 마이크로 RNA 를 사용하는 경우도, 암 종이 같다고 해도 동일한 항암 효능을 기대하는 것은 어렵다. 이러한 이유로, 발굴된 마이크로 RNA 가 효능을 보이는 암 종에서의 표지자를 확인하기 위하여 폐암 세포주 18종에 대하여 마이크로 RNA 를 처리한 후 결과를 관찰하였다. 구체적인 실험 방법은 각 종의 폐암 세포주를 6-well 배양 접시에서 배양하고 마이크로 RNA 를 100 nM 의 농도로 트랜스펙션을 한 후 48h 추가 배양을 진행한 뒤, 세포를 PI 염료와 아넥신 V (annexin V) 를 사용하여 세포들을 표지하고 이들에 대하여 유세포 분석을 실시하였다 (도 2).

그 결과, 특정 세포주들은 miR-3670 및 miR-8078 에 반응성으로 보여 세포 사멸 기전이 작동한 반면, 또 다른 특정 세포주에서는 miR-3670 및 miR-8078 에 대한 반응성이 관찰되지 않았다. miR-3670 및 miR-8078 에 대하여 반응성이 있는 세포주와 반응성이 없는 세포주 각각을 표 1 에 기재 하였다.

반응성 있는 세포주	반응성 없는 세포주
H460, H1650, H1666, H1437, H358, H596, H1975	A427, A549, H1299, Calu-1, H2087, H23, H727, H2009, H522, HCC827, PC-9

실시예 3: 마이크로 RNA 에 의한 반응성 예측용 바이오마커 분석

마이크로 RNA 에 대한 반응성 예측 바이오마커 분석을 위하여 실험에 사용된 각 세포주들의 mRNA 발현 프로파일을 MERAV database (http://merav.wi.mit.edu/, Shaul, Y.D., et al (2015) MERAV: a tool for comparing gene expression across human tissues and cell types. Nucleic Acids Res. 44 (560-566)) 를 통하여 확보하였다. MERAV database 는 다수의 실험자들에 의하여 독립적으로 수집된 마이크로어레이 분석자료를 축적하고 mRNA 발현 프로파일을 체계적인 방법으로 정리하여 제공한다. 따라서, MERAV database 에서는 동일한 세포주에 대한 중복된 자료도 존재하는데, 아래의 Gene Pattern Analysis 를 실시하는데 있어 특정 세포주에 대한 중복된 데이터는 해당 세포주의 결과를 강조하는 weighting factor 로 작용하여 Gene Pattern Analysis 를 왜곡시킬 수 있다. 따라서 본 실시예에서는 특정 세포주에서의 mRNA 프로파일이 중복 발생하는 경우, 이들간의 중간값을 취하여 분석을 진행하였다. 또한, 실시예 2 에서 사용된 18종의 폐암 세포주 중 MERAV database 에 포함되지 않은 세포주들은 Gene Pattern Analysis 분석에서 제외하였다.

표 1에서 제시한 바와 같이 마이크로 RNA 약물 반응성에 따라 두 그룹으로 분리하여 Gene Pattern Analysis 라는 생물 정보학적인 방법을 사용 (http://software.broadinstitute.org/cancer/software/genepattern/, Reich M, et al., GenePattern 2.0 Nature Genetics 38 no. 5 (2006): pp500-501 ) 하여 약물 반응성이 우수한 그룹에서 상대적으로 과다 발현된 mRNA 종을 발굴하였다. 이 중 serpinb5 의 발현이 두 그룹의 차이를 가장 잘 나타내는 특이적인 유전자임을 보여 주는 Heat Map 이다(도 3).

따라서, 상기 제시된 miRNA 치료제는 serpinb5 의 발현량이 높은 폐암 세포에서 특이적으로 약리 효능을 발휘할 수 있기에 serpinb5 가 상기 miRNA 치료제 적용을 위한 바이오마커로서 기능함을 보여준다.

실시예 4: 바이오마커의 실험적 검증

실시예 3 에서 제시하는 각 세포주에서의 바이오마커 serpinb5 의 mRNA 발현량 (도 4, A) 을 본 연구진이 RT-qPCR 방식으로 상대적인 발현량을 검증하였다. 각 세포주가 배양 접시내에서 70-80% 정도에 도달하였을 때, 전체 RNA 를 트라이졸 시약을 사용하여 업계에서 통상적으로 진행하는 방식으로 추출하였다. 동일한 양의 전체 RNA 를 사용하여 역전사하여 cDNA 를 생성하고 이를 바탕으로 상대적인 mRNA 발현량을 비교하였다 (도 4B). serpinb5 발현량은 MERAV database 의 결과와 유사한 특성을 보이며, 두 그룹에서의 발현량에 있어서 특이적인 차이가 있음을 보였다. 마이크로 RNA 에 대한 반응성 세포주 그룹은 H460-H596 이며, 비반응성 세포주 그룹은 A549-H2009이었다.

또한, 각 세포주에서 바이오마커로서의 serpinb5 단백질의 발현량을 상대적으로 측정하기 위하여 웨스턴 블롯을 업계에서 사용하는 통상의 방법으로 실시하였다. 웨스턴 블롯 분석 결과, mRNA 의 상대적 발현량 변화 추이와 유사하게 단백질도 발현된다는 것을 확인할 수 있었다 (도 4C).

실시예 5: miRNA-3670 에 의한 serpinb5 발현 조절

바이오마커로서 serpinb5 의 유용성을 확인하기 위하여 miR-3670 및 miR-8078 에 반응하는 세포주 중 대표적으로 두 가지 세포주를 선정하여 miR-3670 에 처리에 따른 serpinb5 의 단백질 발현량 변화가 유발되는지 여부를 측정하였다. 세포주 H460 과 H596을 6-well 배양 접시에서 배양 한 후 마이크로 RNA 를 100 nM 의 농도로 트랜스펙션을 실시하였다. 트랜스펙션 후 각 2, 4, 8 시간을 배양한 후 단백질을 정제하여 웨스턴 블롯을 통한 단백질 발현량의 상대적 정량을 실시하였다. 결과로, 실험에 사용된 두 세포주 모두에게서 miR-3670 처리 후 시간에 따른 serpinb5 단백질의 감소를 관찰하였다 (도 5). 이는 serpinb5 가 miR-3670 에 의한 세포 사멸 유도 기전에 관여함을 보임과 동시에 miR-3670 처리에 따른 효능 예측을 위한 바이오마커로서의 기능을 수행함을 명백히 보이는 예이다.

실시예 6: 바이오마커의 항암 치료제 타겟 기능 검증

Serpinb5 발현량이 miR-3670 및 miR-8078 의 효능 예측용 바이오마커로서의 기능을 수행함과 더불어 세포 사멸 기전 유발에 의한 항암 효능 관여 여부를 직접적으로 파악하기 위하여, 각 세포주에 serpinb5 를 타겟으로 하는 siRNA를 트랜스펙션하였다. 48시간 동안 추가적으로 세포주를 배양한 후, 세포주를 PI 염료와 아넥신 V 를 사용하여 형광 표지한 후 유세포 분석을 통한 세포 사멸 효과를 측정 하였다 (도 6). 결과로서, serpinb5 가 상대적으로 많이 분포하는 세포주들에서 세포의 사멸이 관찰되었으며, serpinb5 의 발현량이 낮은 세포주에서는 세포 자살 기전이 유도되지 않았다.

이는 Serpinb5가 miRNA 치료제 적용을 위한 바이오마커로서의 기능 외에 직접적인 타겟으로 사용될 수 있다는 것을 보여주는 것이다.

SiRNA-Antisense 서열 : UGAUAUCGGCUAUUGUGAG(서열번호 10)

SiRNA-Sense 서열 : CUCACAAUAGCCGAUAUCA(서열번호 11)

실시예 7: 동물 모델을 이용한 효능 검증

마이크로 RNA 및 바이오마커의 항암 타겟 능력을 동물 모델에서 재현되는지 여부를 판단하기 위하여 xenograft 동물 모델을 사용하여 검증하였다. H460 세포주를 100 mm 직경의 배양 접시를 사용하여 배양한 후, 음성 대조군, miR-34a, miR-3670, 또는 serpinb5 를 타겟으로 하는 siRNA 를 각각 50 nM 농도로 트랜스펙션하고 추가적으로 24시간 동안 배양하였다. miR-34a 는 항암 치료제로서 임상 실험이 진행되는 마이크로 RNA 로서, 효능 비교를 위하여 포함하였다. 배양 후, 세포를 수거하여 매트리젤 (matrigel) 과 혼합하여 각 2 x 10^6 개의 세포를 마우스에 피하 주사로 주입하였다. 각 군당 3 마리의 마우스를 사용하였으며, 종양의 크기를 측정하여 기록하였다. 결과로, 음성 대조군 및 miR-34a 를 사용한 세포주들은 시일 경과에 따른 종양의 크기가 증가 하였으나, miR-3670 또는 serpinb5를 타겟으로 하는 siRNA 를 사용한 그룹에서는 음성 대조군 또는 miR-34a를 주입한 세포주 대비 현저히 작은 종양을 형성함을 확인하여, 종양의 성장이 획기적으로 억제되는 것을 알 수 있었다 (도 7).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> BIONEER CORPORATION <120> Pharmaceutical Composition for Treating Cancer Comprising miRNA having Drug Response to serpinb5 and Application Thereof <130> P16-B305 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-3670 <400> 1 agagcucaca gcuguccuuc ucua 24 <210> 2 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> perfect complementary sequence of miR-3670 <400> 2 gagaaggaca gcugugagcu cuuu 24 <210> 3 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> endogenous complementary sequence of miR-3670 <400> 3 gacugguaua gcugcuuuug gagccuca 28 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-4477a <400> 4 cuauuaagga cauuugugau uc 22 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> perfect complementary sequence of miR-4477a <400> 5 aucacaaaug uccuuaauag uu 22 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> endogenous complementary sequence of miR-4477a <400> 6 aucacaaaug uccuuaaugg ca 22 <210> 7 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-8078 <400> 7 ggucuaggcc cggugagaga cuc 23 <210> 8 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> perfect complementary sequence of miR-8078 <400> 8 gucucucacc gggccuagac cuu 23 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> endogenous complementary sequence of miR-8078 <400> 9 cuccaccggg cugaccggcc ug 22 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> serpinb5 SiRNA-Antisense <400> 10 ugauaucggc uauugugag 19 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> serpinb5 SiRNA-Sense <400> 11 cucacaauag ccgauauca 19

Claims (14)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 다음 단계를 포함하는 miR-3670, miR-4477a, miR-8078로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA를 함유하는 치료제에 대한 치료대상을 결정하기 위한 정보를 제공하는 방법;
   (a) 암 의심 조직 또는 세포 샘플의 serpinb5 발현 패턴을 확인하는 단계; 및
   (b) 정상 조직 또는 세포 보다 serpin5의 발현이 증가된 샘플을 치료 대상으로 선택하는 단계.
   
7. 제6항에 있어서, serpinb5 발현 패턴 확인은 RT-qPCR 또는 웨스턴 블럿으로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
8. 제6항에 있어서, 상기 miR-3670은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 이중가닥 RNA을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법
   
9. 제6항에 있어서, 상기 miR-4477a 는 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 이중가닥 RNA을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법
   
10. 제6항에 있어서, 상기 miR-8078 는 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 이중가닥 RNA을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
11. Serpinb5 유전자의 발현 수준을 측정하기 위한 프로브 및 프라이머쌍을 함유하는 miR-3670, miR-4477a, miR-8078로 구성된 군에서 선택되는 miRNA 항암 치료제에 대하여 감수성이 있는 암환자 샘플을 선별하기 위한 키트.
    
12. 제11항에 있어서, 상기 miR-3670은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 이중가닥 RNA을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
    
13. 제11항에 있어서, 상기 miR-4477a 는 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 이중가닥 RNA을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
    
14. 제11항에 있어서, 상기 miR-8078 는 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 이중가닥 RNA을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
    

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