KR101445921B1 - ｍｉＲ-185의 항암적 용도 - Google Patents

ｍｉＲ-185의 항암적 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101445921B1
KR101445921B1 KR1020120084847A KR20120084847A KR101445921B1 KR 101445921 B1 KR101445921 B1 KR 101445921B1 KR 1020120084847 A KR1020120084847 A KR 1020120084847A KR 20120084847 A KR20120084847 A KR 20120084847A KR 101445921 B1 KR101445921 B1 KR 101445921B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
expression
dnmt1
mir
gkn1
ezh2
Prior art date
Application number
KR1020120084847A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140017930A (ko
Inventor
박원상
윤정환
Original Assignee
가톨릭대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가톨릭대학교 산학협력단 filed Critical 가톨릭대학교 산학협력단
Priority to KR1020120084847A priority Critical patent/KR101445921B1/ko
Publication of KR20140017930A publication Critical patent/KR20140017930A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101445921B1 publication Critical patent/KR101445921B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Abstract

본 발명은 메틸화 전환효소 DNMT1(DNA methyltransferase 1)의 발현 및 활성을 억제하는 항암 유전자 GKN1(Gastrokine 1)의 기능을 조절하는 특정 miRNA인 miR 185의 용도에 관한 것으로, miR-185의 상향-조절작용(up-regulating)을 통해서 DNA 메틸화에 관여하는 DNMT1의 활성이 억제되고, 나아가 종양 억제 유전자 GKN1의 활성이 촉진되는 분자적 메커니즘을 기초로 하는 miR-185의 세포주기 조절능 및 종양 성장 저해능에 따른 항암적 용도에 관한 것이다.

Description

ｍｉＲ-185의 항암적 용도{A Use of micro RNA 185 for Treating Cancers}
본 발명은 메틸화 전환효소 DNMT1(DNA methyltransferase 1) 또는 EZH2(Enhancer of Zeste homolog 2)의 발현 및 활성을 억제하는 항암 유전자 GKN1(Gastrokine 1)의 기능에 의해 조절되는 특정 miRNA인 miR 185의 용도에 관한 것으로, GKN1에 의한 miR-185의 상향-조절작용(up-regulating)을 통해서 메틸화에 관여하는 DNMT1 또는 EZH2의 활성이 억제되고, 나아가 종양 억제 유전자 GKN1에 의해 활성이 촉진되는 분자적 메커니즘을 기초로 하는 miR-185의 세포주기 조절능 및 종양 성장 저해능에 따른 항암적 용도에 관한 것이다.
위암은 대한민국과 동남아시아 일부에서 가장 흔한 악성종양이며, 세계적으로도 암 사망 원인 두 번째에 해당한다(Parkin DM, Pisani P, Ferlay J: Estimates of the worldwide incidence of 25 major cancers in 1990.Int J Cancer 80:827-841, 1999.). 하지만, 위암의 발달(development) 및 진전(progression)에 관한 기작은 아직 정확히 밝혀져 있지 않다.
발암(carcinogenesis)은 정상세포가 종양세포로 전환에 필요한 세포내 종양유전자(oncogenes)와 종양 억제유전자(tumor suppressor genes)의 변화와 관련이 있는 다단계의 과정이다(Parkin DM, Pisani P,Ferlay J: Global cancer statistics. CA Cancer J Clin 49:33-64, 31, 1999., Fearon ER, Vogelstein B: A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell 61:759-767, 1990., Kinzler KW, Vogelstein B: Life (and death) in a malignant tumour. Nature 379:19-20, 1996.). 위암 발생에 있어서, 다양한 유전적 변화가 위암의 발달 및 진행의 원인이며, 세포부착, 신호전달, 분화, 발달 및 DNA 복구 등과 같은 다양한 세포 활동에서 중요한 역할을 하는 특정 유전자들의 변화를 일으킨다. 따라서 이러한 기능을 하는 유전자들이 동정 되고 있지만(Park WS, Lee JH, Shin MS, et al.:Inactivating mutations of the caspase-10 gene in gastric cancer. Oncogene 21:2919-2925, 2002., Park WS, Oh RR, Park JY, et al.: Somatic mutations of the trefoil factor family 1 gene in gastric cancer. Gastroenterology 119:691-698, 2000., Werner M, Becker KF, Keller G, Hofler H: Gastric adenocarcinoma: Pathomorphology and molecular pathology. J Cancer Res Clin Oncol 127:207-216, 2001., Fuchs CS, Mayer RJ: Gastric carcinoma. N Engl J Med 333:32-41, 1995.), 장래 위암 치료의 표적으로서 이러한 잠정적인 종양유전자 또는 종양 억제유전자들을 더 많이 연구할 필요가 있다.
최근 들어 전 세계적으로 암의 생성 및 치료와 관련된 유전자의 기능 연구를 통해 치료용 표적을 발굴하고 이들을 진단 및 치료제 개발에 이용하기 위한 치열한 경쟁이 불붙고 있다.
그러나, 게놈 연구의 활성화와 함께 인간 유전자 DNA 칩 또는 프로테옴 분석 연구가 활발하게 이루어지고 암과 관련된 유전자가 대량 발굴됨에 따라 많은 유전자들의 목록과 관련 데이터베이스는 구축되어 있으나 대부분 이들 유전자들에 대한 세포 내에서의 구체적 생물학적 기능 및 암 관련성은 아직 연구되지 않았거나 불확실하여 실제 암 관련성 또는 진단 및 표적 유전자로서의 활용과 함께 나아가 암을 효과적으로 치료할 수 있는 유전자의 발굴에 상당한 어려움이 있는 실정이다.
특히, 암의 발생과 진행은 몇몇 특정 유전자들에 의해 이루어지는 것이 아니라 암의 악성화가 진행되면서 발생하는 세포내 다양한 신호전달과 조절기작에 관여하는 많은 유전자들의 복합적인 상호작용에 의한 것임을 알 수 있고, 최근에는 유전자 서열에 영향을 주지 않으면서 유전자의 발현을 억제하는 유전자 변조기전인 후성학적 변화 (epigenetic alteration) 즉, DNA 메틸화 등도 최근 발암의 중요한 기전으로 부각되고 있는 바, 암 관련 유전자 이외에도 이들 유전자들의 신호전달, 조절 기작 등과 관련한 다양한 분자적 메커니즘을 규명할 필요가 있다.
이에, 본 발명자들은 위암 조직에서 GKN1의 발현수준을 분석함과 더불어, GKN1에 의해 조절되는 특정 miRNA를 발견하고, 상기 miRNA의 세포주기 조절능 및 메틸화 효소 DNMT1 또는 EZH2 억제능에 따른 종양 성장 저해 효과를 확인함으로써, 후성학적 변화 관련 질환 치료효과를 가지는 특정 miRNA 용도에 관한 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허 10-2010-0084619
본 발명의 목적은 항암 유전자 GKN1 기능 및 메틸화 전환효소 DNMT1 및 EZH2 기능을 조절하는 특정 miRNA인 MiR-185의 신규 항암 용도를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 MiR-185 발현 또는 작용 촉진제를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 및 이를 이용하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 MiR-185, DNMT1 및 EZH2 발현을 억제하는 위암 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 miR-185의 항암적 용도를 제공하는데, 일 구체예로, miR-185 발현 또는 작용 촉진제를 유효성분으로 포함하는, DNMT1 또는 EZH2가 활성화되는 암에 대한 항암용 조성물을 제공한다.
이때, 상기 DNMT1 또는 EZH2가 활성화되는 암은 DNA 메틸화에 의해 암의 기작이 영향을 받는 질환으로서, 예를 들어, 유방암, 피부암, 골암, 전립선암, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 뇌암, 후두암, 담낭암, 췌장암, 직장암, 부갑상선암, 갑상선암, 부신암, 신경조직암, 두경부암, 결장암, 위암, 기관지암, 신장암, 기저세포암종, 궤양성 및 유두상 유형 편평세포 암종, 전이성 피부 암종, 골 육종, 유잉스(Ewing) 육종, 세망세포 육종,골수종, 거대세포 종양, 소세포 폐 종양, 담석, 섬세포 종양, 원발성 뇌종양, 급성 및 만성 림프구 및 과립구 종양, 모상세포 종양, 선종, 과다형성증, 수질 암종, 크롬친화세포종, 점막 신경종, 장 신경절신경종, 과다형성 각막 신경 종양, 마르파노이드 체질 종양, 윌름(Willm) 종양, 정상피종, 난소 종양, 평활근 종양, 자궁경부 이형성 및 상피내 암종, 신경아세포종, 망막아세포종, 연조직 육종, 악성 카르시노이드, 국소 피부 병변, 균상 식육종, 횡문근육종, 카포시(Kaposi) 육종, 골원성 육종, 악성 고칼슘혈증, 신장세포 종양, 진성 다혈구증, 선암종, 다형성 신경교아종, 백혈병, 림프종, 악성 흑색종, 및 표피양 암종 등을 포함한다.
가장 바람직하게는 위암일 수 있고, 본 발명의 일실시 예에서도 위암에 대해 실험하였다.
한편, miR-185는 서열번호 1인 것을 사용할 수 있으나, 그 기능이 유지된다면 핵산의 변이가 일부 포함되어도 무방할 것이다.
miR-185 발현 또는 작용 촉진제는 세포 내 miR-185가 효과적으로 발현되어 활성화될 수 있게 하는 것이면 제한이 없고, 예를 들어, miR-185가 발현토록 도입된 벡터; 메틸화(hypermethylation) 억제 물질; 또는 p16 활성화 물질일 수 있다.
특히, 본 발명의 상기 조성물은 세포주기를 G0/G1 및 G2/M 단계에 어레스팅(arresting)하는 것을 특징으로 하고, 항암 유전자 GKN1에 의해 발현 및 활성이 촉진되고, 메틸화 효소 DNMT1와 EZH2의 발현 및 활성을 억제하며, p16 및 E-카드헤린의 메틸화를 조절하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 다른 구체예로서, 다음 단계를 포함하는 DNMT1 또는 EZH2가 활성화되는 암 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) miR-185을 발현하는 동물세포에 항암 후보 물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 동물세포에서 항암 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 miR-185 발현이 촉진되는 경우의 물질을 치료용 물질로 선택하는 단계.
이처럼, 본 발명은 항암 유전자 GKN1에 의해 발현이 촉진되고 메틸화 효소 DNMT1또는 EZH2을 억제하는 miR-185의 항암 적용도에 관한 것이다.
본 발명은 miR-185의 상향-조절작용(up-regulating)을 통해서 DNA 메틸화에 관여하는 DNMT1 및 히스톤의 메틸화에 관여하는 EZH2의 활성이 억제되고, 나아가 종양 억제 유전자 GKN1의 활성이 촉진되는 분자적 메커니즘을 기반으로 하는, miR-185의 항암 적용도에 관한 것으로, DNMT1 또는 EZH2 관련 암의 발생 및 증식활성, 전이의 활성, 또는 세포주기의 전이 활성 조절 기능을 이용하여, DNMT1 또는 EZH2 관련 암질환의 유전적 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 GKN1의 후성적 조절자로서의 기능을 알아보기 위한, DNA 메틸화 유지를 위한 주요 인자들인 DNMT1, EZH2, 메틸 히스톤 H3 (K27) 및 HDAC1의 발현(a) 및 GKN1의 4개의 결실-형태 플라스미드들에 의한 상기 인자들의 발현(b) 결과이다.
도 2는 GKN1 및 GKN1의 4개의 결실-형태 플라스미드들의 DNMT1 활성 저해능을 나타낸 것이다.
도 3은 AGS 위암세포 및 HFE-145 정상 위 점막 세포에서 GKN1 및 GKN1의 4개의 결실-형태 플라스미드들에 의한 DNMT1 및 EZH2 mRNA 발현에 대한 RT-PCR 결과이다.
도 4는 DNMT1 사일런싱이 세포 성장에 미치는 영향을 나타낸 MTT 분석 결과(a) 및 세포주기 정지 효과(b)를 나타낸 것이다
도 5는 정상 위점막 조직 및 위암 조직에서의 GKN1, DNMT1, 및 EZH2의 웨스턴 블럿 결과이다.
도 6은 HFE-145 정상 위 점막 세포 및 10개의 위암 세포주에서 GKN1, DNMT1, 및 EZH2의 웨스텃 블럿 결과이다.
도 7은 NCBI(National Center for Biotechnology Information) GEO(Gene Expression Omnibus) 데이터베이스로부터의 위암 환자 집단으로부터의 GKN1, DNMT1 및 EZH2 유전자 발현 결과이다.
도 8은 GKN1의 miR-185 발현 유도능을 확인한 결과이다.
도 9는 miR-185로 형질 감염시킨 AGS 및 HFE-145 세포에서의 세포 생존능 분석 결과이다.
도 10은 세포 주기 상에서의 miR-185 효과를 분석한 결과이다.
도 11 및 도 12는 miR-185 및 항-miR-185로 각각 형질감염시킨 AGS 및 HFE-145 세포에서 DNMT1, EZH2 및 cyclin D, cyclin E, cyclin B을 포함하는 세포 주기-관련 단백질의 발현 분석 결과이다.
도 13은 통계학적으로 위암조직에서 GKN1-miR-185-DNMT1ㆍEZH2 사이의 발현 연관성을 나타낸 것이다.
도 14는 NCBI(National Center for Biotechnology Information) GEO(Gene Expression Omnibus) 데이터베이스로부터의 위암 집단에서 miR-185 발현 분석결과이다.
도 15는 HFE-145 정상 위 점막 세포 및 10개의 위암 세포주에서 real time RT-PCR에 의해 GKN1, miR-185, EZH2 및 DNMT1의 mRNA 발현 분석 결과이다.
도 16은 GKN1로 형질 감염된 AGS 세포에서 항-miR-185의 처리에 따른 GKN1 AGS 세포의 성장-억제 활성을 관찰한 결과이다.
도 17은 GKN1로 형질 감염된 AGS 세포에서 항-miR-185의 처리에 따른 세포주기상 영향을 관찰한 결과이다.
도 18은 GKN1 형질감염된 AGS 세포에서 항- miR-185의 처리에 따른 miR-185의 사일런싱이 DNMT1, EZH2, 양성 세포주기 조절자, p16 발현에의 영향을 관찰한 결과이다.
도 19는 GKN1로 형질 감염된 AGS 세포에서 항- miR-185의 처리에 따른 콜로니들의 개수 및 크기에 대한 영향을 관찰한 결과이다.
도 20은 GKN1로 형질감염된 AGS 세포에서 항- miR-185의 처리에 따른 miR-185의 사일런싱이 DNMT1 활성 및 DNMT1 , EZH2 mRNA 발현에의 영향을 관찰한 결과이다.
도 21은 E- cadherin (Bis -E- cadherin) 및 CDKN2A (Bis - CDKN2A) 에 대한 바이설피트 게놈 시퀀싱(bisulfite genomic sequencing, BGS) 결과이다.
도 22는 Mock, GKN1, 및 항-miR-185 형질 감염된 AGS 세포에서 E-cadherin과 CDKN2A의 메틸화를 BGS를 통해 확인한 결과이다.
도 23 및 24는 Mock, GKN1, 및 항-miR-185 형질감염된 AGS 세포에서 E-cadherin과 CDKN2A의 메틸화의 시퀀싱 (sequencing) 결과이다.
도 25는 GKN1과 miR-185의 발현에 따른 Tip60, EZH2 및 DNMT1, HDAC1과 E-cadherin 및 CDKN2A 재-발현에 대한 작용 기작을 모식화한 그림이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"암", "종양" 또는 "악성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종, 백혈병, 모세포종 및 육종을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.
"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.
"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.
"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.
"유전자 발현"이란 용어는 일반적으로 생물학적 활성이 있는 폴리펩티드가 DNA 서열로부터 생성되고 세포에서 생물학적 활성을 나타내는 세포 과정을 의미한다. 그런 의미로, 유전자 발현은 전사 및 해독 과정을 포함할 뿐만 아니라, 유전자 또는 유전자 산물의 생물학적 활성에 영향을 끼칠 수 있는 전사후 및 해독후 과정을 포함한다. 상기 과정들은 RNA 합성, 가공 및 수송뿐만 아니라, 폴립펩티드 합성, 수송 및 폴리펩티드의 해독후 변형을 포함하지만, 이들에 국한되는 것은 아니다. 단백질 산물을 암호화하지 않는 유전자, 예컨대, miRNA 유전자의 경우에, "유전자 발현"이란 용어는 전구체 miRNA가 유전자로부터 생성되는 과정을 의미한다. 통상, 상기 과정은, 단백질 암호 유전자에 대해 RNA 폴리머라제 II에 의해 유도되는 전사와는 달리, miRNA 유전자의 전사 산물이 해독되어 단백질을 생성하지 않지만, 전사로 언급된다. 그럼에도 불구하고, miRNA 유전자로부터 성숙 miRNA의 생성은 그 용어가 본원에 사용되는 대로 "유전자 발현"이란 용어에 의해 포함된다.
"코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은, 통상적인 염기쌍과 코돈 용법 관계에 따라, 발현이 요구되는 특정 유전자 생성물 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 서열, 이의 상보체, 또는 이들의 일부분을 지칭한다. 코딩 서열은 성숙 mRNA를 제공하기 위해 세포의 생화학 기구에 의해 함께 연결되는 게놈 DNA 또는 미성숙 1차 RNA 전사체에서의 엑손을 포함한다. 안티센스(antisense) 가닥은 상기 핵산의 상보체이고, 코딩 서열은 이들로부터 추정될 수 있다. 코딩 서열은, 적절한 길이의 전사체가 생성되고 적절한 리딩 프레임에서 번역되어 목적하는 기능 생성물이 생성되도록, 전사 조절 요소 및 번역 개시 및 종결 코돈과의 관계에 놓인다.
"프라이머"는 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.
"단백질"은 또한 기준 단백질과 본질적으로 동일한 생물 활성 또는 기능을 보유하는, 단백질의 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 것이다
"표지" 또는 "라벨"는 직접 또는 간접적으로 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 컨쥬게이팅 되거나 융합되고 컨쥬게이팅 되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매 할 수 있다.
"형질감염 또는 트랜스펙션"은 세포외부 DNA가, 수반물질이 있고 없는 상태로 숙주 세포로 들어가는 과정을 말한다. "트랜스펙션된 세포"란 세포 외부 DNA가 세포 내로 도입되어 세포 외부 DNA를 가지고 있는 세포를 가리킨다. DNA는 세포로 도입되어 핵산이 염색체에 삽입되거나 혹은 염색체 외 물질로 복제될 수 있다. 본 명세서에서는 형질감염 및 트랜스펙션이라는 용어를 혼용하여 사용하고 있다.
"벡터" 라는 용어는 숙주 세포에 삽입되어 숙주 세포 게놈과 재조합되고 이에 삽입되거나, 또는 에피좀으로서 자발적으로 복제하는 컴피턴트 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 의미한다. 이러한 벡터로는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등이 있다.
세포의 "증식(proliferation)" 또는 "성장(growth)'이라는 용어는 세포가 분열되어 동질의 것이 불어나는 것으로서 보통 다세포생물의 체내에서 세포수가 증가되어 가는 것을 말한다. 세포수가 증식(증폭)되어 어느 시기에 이르면, 형질이 변화(분화)되어 가는 것과 동시에 제어되고 있는 것이 보통이다. 체내에서 세포가 증가되어 가는 것과, 또 세포 내에서 세포질이 신생(新生)되어 가는 경우에는 생장으로 구별하는 경우가 많다. 그러나 생물학적으로 세포수가 증가된다는 점에서 보면, 다세포생물의 발생기에서 분화가 일어나지 않는 시기는 증식 또는 성장으로 보는 것이 정당하다. 본 발명에서는 상기 두 용어가 혼용되어 쓰이고 있다.
"세포사멸"은 넓은 의미로 사용되고, 일반적으로 세포질 압축, 형질막 미세융모의 상실, 핵의 분할, 염색체 DNA의 분해 또는 미토콘드리아 기능의 상실을 포함하는 하나 이상의 특징적인 세포 변경이 수반되는 포유동물의 규칙에 따르거나 조절된 세포 치사를 의미한다.
"상향조절(up-regulation)"이라는 표현은, 정상조직세포에 비하여, 활성화된 세포에서 세포내 전사(gene transcription) 또는 번역(gene translation)에 의해서 특정 유전자의 mRNA로의 발현 또는 단백질로 발 현량이 현저하게 증가된 것을 의미한다.
"억제제 또는 저해제(inhibitor)"는 KRT19의 발현 또는 활성을 억제, 차단 또는 감소시키는 물질을 의미한다. 억제제의 활성 메커니즘은 특별히 제한되지 않는다. 예로서는 유기 또는 무기 화합물, 단백질, 탄수화물, 지질과 같은 폴리머 화합물, 다양한 화합물의 컴포지트(composite)를 포함한다. 예를 들어, 'KRT19 억제제'는 종양발생(tumorigenesis)에서 KRT19 단백질의 활성을 억제, 차단 또는 감소시키는 물질을 포함할 수 있다.
"조절자 (modulator)"란 용어는 폴리펩티드, 핵산, 거대 분자, 복합체, 분자, 소분자, 화합물, 종 등 (자연 발생적 또는 비자연 발생적), 또는 조절을 일으킬 수 있는 박테리아, 식물, 곰팡이, 또는 동물 세포 또는 조직과 같은 생물학적 물질로부터 만들어지는 추출물을 의미한다. 조절자는 분석에 포함되어 기능적 성질, 생물학적 활성 또는 과정의 억제제 또는 활성화제 (직접 또는 간접), 또는 그 조합물 (예컨대, 작동물질, 부분적 길항물질,부분적 작동물질, 역 작동물질, 길항물질, 항-미생물제, 미생물 감염 또는 증식의 억제제 등)로서의 잠재적인 활성에 대해 평가할 수 있다. 그러한 분석에서, 다수의 조절자는 한번에 구분될 수 있다. 조절자의 활성은 공지되었거나, 미지이거나 부분적으로 공지된 것일 수 있다.
조절자는 선택적 또는 비선택적일 수 있다. 본원에 사용된 "선택적"이란 용어는 조절자 (예컨대, 억제제)과 관련하여 사용할 때 조절자가 하나의 분자 (예컨대, 당해 표적 RNA) 대 또 다른 유사하나 동일하지 않은 분자 (예컨대, 당해 표적 RNA와 동일한 유전자군의 멤버로부터 유래된 RNA)와 상호작용하는 방식으로 측정 가능하거나 생물학적으로 관련된 차이를 의미한다.
"항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 무손상 모노클로날(단일클론) 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 보이는 항체 단편을 포함한다.
"RNAi"는 RNA Interference를 지칭하는 말로, 우리말로 풀이하면 RNA 간섭이라는 뜻을 지니고 있다. RNA 간섭은 대부분의 생물체 사이에서 잘 보존되어 있는 특이적 유전자억제 현상이다. 특히, small RNA에 의한 유전자 억제현상을 넓은 의미에서 RNA간섭이라 하고, 'small RNA'는 생체 내에서 유전자 발현을 조절하는 역할을 하는 17~25 뉴클레오티드 정도 길이의 리보핵산을 지칭한다. small RNA는 그 생성되는 방식에 따라 크게 microRAN(줄여서 miRNA)와 small interfering RNA(줄여서 siRNA)로 분류한다. miRNA는 부분적으로 이중나선을 이루는 RNA(hairpin RNA)로부터 생성되고, siRNA는 긴 이중나선 RNA(dsRNA)로부터 유래한다. 일반적으로 정의할 때, 생체 내의 여러 조절과정에서 중요한 역할을 하는 small RNA는 microRNA로, 실험 기술적으로 특정 유전자의 발현을 조절하는데 사용되는 small RNA는 siRNA로 분류한다. miRNA는 세포 내에서 자연적으로 만들어지며, 특정 mRNA에 특이적으로 결합하여 mRNA로부터 단백질이 합성되는 과정을 억제한다. siRNA는 인위적으로 세포내로 도입시키는 small RNA로서, 상보적인 서열을 가지고 있는 특정 mRNA에 결합하여 그 mRNA를 분해하는 역할을 한다.
"후성학(Epigenetics)"이란 DNA 염기서열의 변화 없이 유전자 발현의 양상이 변하여 자손에게 유전되는 것을 말한다. 주로 4가지 염기서열의 변화(소실, 치환, 증폭 등)에 의한 비정상적인 유전 정보가 종양형성 유전자나 종양억제 유전자에 축적되어 그 기능이 증폭 혹은 소실되어 암 발생에 영향을 미친다는 개념의 연구가 주를 이루어 왔으나 이것만으로 암의 발생이나 성장, 전이 과정을 설명하기는 부족하였다. 최근 들어 돌연변이 없이 유전자의 발현양상만을 조절하는 후성학이 암 관련 연구의 새로운 분야로 발전해 나가고 있다. 후성적 변화는 DNA 메틸화(methylation), 히스톤 변환(histone modification)과 게놈 임프린팅(genomic imprinting) 등의 과정을 통해 일어난다.
"유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 저해제 화합물의 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.
"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. 치료는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
<GKN1-miR 185-DNMT1EZH2 분자적 메커니즘>
본 발명은 메틸화 전환효소 DNMT1(DNA methyltransferase 1) 및/또는 EZH2(Enhancer of Zeste homolog 2)의 발현 및 활성을 억제하는 유전자 GKN1(Gastrokine 1)이 특정 miRNA의 발현 조절에 관한 것이다.
GKN 1(Gastrokine 1)은 AMP-18(antrum mucosal protein-18) 또는 CA11로도 알려져 있으며, 위 전정부에서 발현되어 있는 것으로 알려져 있고, 전정부 점막을 보호하고, 상처 후 회복과 증식을 용이하게 함으로써 치유를 촉진시키는 활성이 있다고 알려진 바 있다(Toback. F. G. et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 285: G344-353, 2003).
본 발명자들은 정상세포와는 달리 암세포에서 GKN 1 유전자의 발현이 감소되어 있다는 사실을 확인함으로써, GKN 1 유전자가 항암 활성을 갖는다는 사실을 최초로 규명하였다. 즉, 상기 GKN 1은 암 세포의 증식을 억제하고 사멸을 유발하는 특징이 있다.
이러한 GKN 1의 항암 기능 조절과 관련하여, GKN1는 miR-185 발현을 상향 조절함으로써 DNMT1 발현을 억제함을 특징으로 한다.
암 유발 과정 동안, 프로모터 CpG 섬(island)에서는 메틸화가 발견되는데, DNA 메틸화는 DNMT(DNA methyl transferase)에 의해 CpG의 5탄소 부위에 메틸기(CH3)가 결합된 것이다. 이러한 DNA 메틸화는 세포 주기 또는 세포자살(apoptosis)을 조절하고, DNA를 복구하며, 세포 부착 및 세포간의 상호작용에 관여한다.
CpG 섬은 C+G 함유량이 50%이상이고, CpG 비율이 3.75% 이상인 0.2~3kb 길이의 부위를 말한다. 인간 게놈에는 약 45,000개의 CpG 섬이 있으며, 이들 대부분이 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에서 발견된다. 실제로, 상기 CpG 섬은 인간 유전자의 약 50%에 달하는 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 프로모터에서 발견된다(Cross, S. and Bird, A., Curr. Opin. Gene Develop.,5:309, 1995). 상기 CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후성성 변화가 자주 일어나는 부위이다.
특히, 세포 침입 및 전이를 억제하는 종양 억제 유전자, 본 발명의 GKN1 프로모터 CpG 섬이 메틸화되면, 이러한 메틸화는 코딩 서열의 돌연변이와 같은 방식으로 상기 유전자의 발현과 기능을 억제하게 되고, 이에 의하여 암의 발달과 진행이 촉진되게 된다.
본 발명자들은 위암 조직에서 GKN1의 발현에 의해 miR-185의 상향-조절작용(up-regulating)을 통해서 DNA 메틸화 전환효소 DNMT1의 활성 및 히스톤 메틸화 전환효소 EZH2 활성이 억제되고, 나아가 종양 억제 유전자 GKN1의 활성이 촉진되는 분자적 메커니즘을 처음으로 규명하였다.
따라서, 본 발명은 이러한 GKN1-miR 185-DNMT1EZH2사이의 분자적 메커니즘을 포함한다.
<miR-185>
그러므로 본 발명은 일 관점에서, 상기 분자적 메커니즘을 기초로 하는, GKN1 항암 유전자의 활성에 의해 조절될 수 있는 특정 miRNA miR-185에 관한 것이다.
miRNA(microRNA)는 21-25 뉴클레오티드(nt)의 단일 가닥 RNA 분자로써, 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 조절물질로서, miRNA는 두 단계의 프로세싱으로 이루어진다. 최초의 miRNA 전사체(primary miRNA)가 핵 안에서 Drosha라는 RNaseⅢ type 효소에 의해 70-90 nt 정도의 stem-loop 구조, 즉 pre-miRNA로 만들어지고, 이후 세포질로 이동하여 Dicer라는 효소에 의해 절단되어 21-25 nt의 mature miRNA로 만들어진다. 성숙(mature) miRNA는 더 긴 전사체로부터 가공되어 ~22개 뉴클레오티드 (nt)의 길이를 가진다. 1차-miRNA (pri-miRNA)는 독립 전사 단위로서 RNA Pol II에 의해 전사되거나 또는 숙주 유전자의 접속된 인트론으로부터 발생할 수 있다. 현재 300개가 넘는 인간 miRNA가 알려져 있지만, 어떤 할당된 생물학적 기능을 가진 것은 단지 몇 개밖에 안된다. 특정 miRNA의 연구는 발생 및 병리학에서 miRNA-매개의 조절의 유행 및 중요성을 이해하는 데 필요하다. 본 발명에서는 위암 형성 및 발달을 저해하는 GKN1 에 의해 조절되는 특정 miRNA에 대한 역할을 최초로 제시한다.
본 발명에서의 miR-185는 이들의 pri-miRNA, pre-miRNA, mature-miRNA 또는 기능적 등가물로부터 생성되는 약 17 내지 24개 뉴클레오티드의 핵산 분자를 포함한다. 서열번호 1의 miRNA 서열을 예로 들 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 microRNA miR-185는 이하와 같은 기능을 가진다.
(1) miR-185는 GKN1와 정상관관계를 가지고 DNMT1EZH2와 역상관관계를 가진다.
본 발명의 microRNA의 발현은 후성학적(epigenetic) 요소에 의해서도 조절되는데, 특히, 메틸화에 의해서 조절된다. 즉, 본 발명의 miR-185는 DNA 메틸화 유지를 위한 주요 인자들인 DNMT1, 히스톤 메틸화에 관여하는 EZH2의 활성을 억제시킨다.
DNA의 메틸화(methylation)는 종양에서 발견되는 가장 흔한 유전자 변화 중 하나로서, 염기서열이 주로 사이토신과 구아닌으로 이루어진 CpG island에 잘 발생하며, 메틸기가 메틸전이효소에 의해 5사이토신에 붙음으로써 이루어진다. 이러한 5'-m5 CpG-3' 서열내 시토신 잔기의 C-5 위치에서 메틸화는 유전자 침묵에 의해 유전자 발현에 주요한 역할을 한다(Smith, A. F. A. Curr. Opin. Genet. Devel., 1999, 9, 657). DNA 메틸화은 프로모터 부위에서 유전자의 전사(transcription)를 억제하는 기능을 한다. 복제시 이들 메틸화 패턴의 유지에 책임이 있는 주요 효소는 DNA 메틸트란스페라제 DNMT1이고, 그러므로, 메틸화 유지에 요구되는 효소인 DNMT1을 특이적으로 억제함으로써, 종양 형성 과정에서 발현이 억제되는 유전자 E-cadherin과 CDKN2A의 비정상적인 메틸화가 예방될 수 있다.
DNA 메틸화가 유전자 발현을 조절하는 것처럼 히스톤 메틸화도 유전자의 발현을 조절한다. 히스톤 단백질은 H1, H2, H2A, H2B, H3, H4 등의 하위 단백질로 구성된다. 히스톤 단백질 구조도 이중 H3 단백질의 4번째 라이신(Lys, 아미노산의 일종)의 메틸화는 유전자의 발현을 유도하며 H3의 27번째 라이신의 메틸화는 유전자의 억제를 유도한다. 그러므로, Histone-lysine N-methyltransferase인 EZH2을 특이적으로 억제함으로써, 종양 억제 유전자들의 비정상적인 메틸화가 예방될 수 있다.
따라서, 상기 miRNA는 표적 DNMT1 mRNA 및/또는 EZH2 mRNA 3`-UTR에 상보적으로 결합하여 전사 후 유전자 억압자(post-transcriptional gene suppressor)로써 작용할 수 있다. 본 발명 miRNA, miR-185는, DNMT1 또는 EZH2의 간섭 RNA (예를 들어, shRNA)와 대조될 수 있다. DNMT1 shRNA, EZH2 shRNA가 그랬던 것처럼, miR-185는 DNMT1 및/또는 EZH2 발현 및 활성을 억제할 수 있다.
(2) miR-185는 세포주기의 G0/G1 및 G2/M 사이의 정지(arrest)를 유도함으로써 암세포의 성장을 저해한다.
특히, 본 발명의 miRNA는 GKN1 유전자에 의해 조절되며 세포 주기에 영향을 끼쳐 위암 세포의 성장을 조절한다.
'세포주기(cell cycle)'는 일정순서에 의하여 이루어지고 있고, 만약 이러한 순서가 뒤바뀐다면 세포주기의 유지는 어려워질 것이다. 이것을 바로잡고 순서를 잡아주는 것이 바로 Cyclin과 Cdk이다.
세포주기 G1기 초기에서는 세포의 종류에 따라서 Cdk4, 6, 8등이 활성화되어 작용하고 G1기 후기와 S기 초기에서는 Cdk2가 작용한다. G2에서 M으로의 진행에는 Cdk1 (Cdc2)의 작용이 필요하다. Cdk의 활성에는 Cyclin과의 결합이 필수적인데 Cdk4, 6, 8은 Cyclin D와의 결합에 의하여 활성화되며 Cdk2는 Cyclin A 및 E와 결합한다. Cdk1은 Cyclin B 및 A와 결합한다. 이외에도 Cyclin G, F 등이 알려져 있지만 세포주기 진행에 있어서의 역할은 아직 불분명하다. 세포주기의 각 시기에 특이적인 Cyclin-Cdk 복합체가 활성화되고 각각의 Cdk에 특이적으로 인산화되는 단백질들이 세포주기의 진행을 담당하게 되므로 세포주기를 Cdk 주기로 명명할 수도 있다. Cdk는 Cyclin활성에 필수적이다. 활성화된 Cdk-Cyclin은 Cyclin의 조절단위와 Cdk의 활성단위로 나뉘어져 있는 것이다. Cyclin의 Cdk조절방법은 두 가지로 볼 수 있는데 첫 번째가 Cyclin과 Cdk가 결합하여 단백질의 구조변화를 유도하여 ATP phosphate group의 배치가 substrate 단백질에 전달하기 쉽게 변한다. 또한 단백질 substrate가 Cdk에 접근할 수 없도록 막고 있는 T loop의 위치가 변하여 substrate의 접근이 용이해진다. Cdk의 활성이 세포주기의 특정 시기에만 활성화되는 것은 세포주기 특이적으로 일어나는 Cyclin에 합성 때문이다.
이러한 세포주기 조절 단백질로서, 예를 들어, 특히, p53, p21, p16, p15, CDK4, cyclin D1 및 E2F 등은 G0/G1 단계를 조절하는 단백질이고, cdc2, cyclin B, cdc25A, cdc25C, aurora A 및 Plk1 등은 G2/M 단계를 조절하는 단백질이다.
그 중에서도, 본 발명 miR-185은 GKN1 유전자 발현 및 활성에 의해 상향조절 (Up-regulation)됨으로써 p16 및 p21을 상향 조절하고 p-cdc2, PLK1, CDK2, cdc25a, cdc25c 및 cyclin B의 발현을 하향 조절한다. 즉, GKN1는 G1/S 및 G2/M 단계 전이를 조절하는 기능을 가지고 있는데, 보다 구체적으로, 고메틸화된 p16 및 E-cadherin을 비메틸화 형태로 전환시켜, 세포 주기를 G0/G1 및 G2/M 단계에서 정지(arrest)시킨다. 그리고, 이러한 세포주기 정지를 통해 종양 세포의 성장을 저해하는 것이다.
p16 유전자는 사이클린 의존성 키나아제 억제제로서 활성화되면 세포주기조절 Cyclin D-CDK 4,6-pRB 경로가 불활성화되므로, p16의 비메틸화를 통해 p16을 활성화시킴으로써 세포주기를 정지할 수 있는 것이다. 또한, 암조직에서 프로모터 과메틸화가 나타나는 E-카드헤린은 Trans-membrane glycoprotein으로 세포사이의 부착능에 관여하며 발현이 소실된 경우 종양의 침투성이나 전이와 연관이 있는데, E-카드헤린 비메틸화를 통해 E-카드헤린 발현을 촉진시켜 종양의 침투성을 저해할 수 있다.
앞서 살핀 바와 같이, 본 발명의 miR-185은 GKN1에 의해 조절되며 DNMT1EZH2 발현 및 활성에 대한 조절자임을 알 수 있고, 따라서, 메틸화와 관련된 질환, 예를 들어 위암 등의 형성에 있어 DNMT1EZH2의 직접적 억제자이고 위암 등의 암 형성에서 종양 억제자로서 기능할 수 있음을 시사한다.
<항암 용도>
그러므로, 본 발명은 다른 관점에서, miR-185 발현 또는 활성 촉진을 통해 DNMT1EZH2의 활성을 억제시킴으로써 GKN1의 항암 활성을 촉진시키는, DNMT1EZH2 관련 암에 대한 항암적 용도에 관한 것이다. 즉, 세포내 메틸트란스페라제 DNMT1 및/또는 EZH2의 활성을 선택적으로 억제하는 용도에 관한 것이다.
본 발명에서 치료 대상으로 하는 암은, 메틸화와 관련된 질환, 특히 DNMT1 또는 EZH2이 활성화되는 암 질환으로써, 일부 구현 예에서, 유방암, 피부암, 골암, 전립선암, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 뇌암, 후두암, 담낭암, 췌장암, 직장암, 부갑상선암, 갑상선암, 부신암, 신경조직암, 두경부암, 결장암, 위암, 기관지암, 신장암, 기저세포암종, 궤양성 및 유두상 유형 편평세포 암종, 전이성 피부 암종, 골 육종, 유잉스(Ewing) 육종, 세망세포 육종,골수종, 거대세포 종양, 소세포 폐 종양, 담석, 섬세포 종양, 원발성 뇌종양, 급성 및 만성 림프구 및 과립구 종양, 모상세포 종양, 선종, 과다형성증, 수질 암종, 크롬친화세포종, 점막 신경종, 장 신경절신경종, 과다형성 각막 신경 종양, 마르파노이드 체질 종양, 윌름(Willm) 종양, 정상피종, 난소 종양, 평활근 종양, 자궁경부 이형성 및 상피내 암종, 신경아세포종, 망막아세포종, 연조직 육종, 악성 카르시노이드, 국소 피부 병변, 균상 식육종, 횡문근육종, 카포시(Kaposi) 육종, 골원성 육종, 악성 고칼슘혈증, 신장세포 종양, 진성 다혈구증, 선암종, 다형성 신경교아종, 백혈병, 림프종, 악성 흑색종, 및 표피양 암종으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있고, 가장 바람직하게는 위암이다.
본 발명의 일 구체예로서, DNMT1 또는 EZH2이 활성화되는 암세포를 GKN1, miR-185 또는 이의 유사체로 형질감염시켜 DNMT1 또는 EZH2발현을 감소시킴으로써, DNMT1 또는 EZH2 활성 관련 암, 예를 들어, 위암 등을 치료하는 방법을 제공한다.
"형질감염 또는 트랜스펙션"은 바이러스 벡터 또는 기타 전달 수단을 이용하여 외부물질을 진핵 세포 내로 도입하는 것을 의미한다. 동물 세포의 형질감염은 전형적으로 세포 원형질막 내 일시적인 구명 또는 "홀"을 개방하여 물질이 흡수되도록 하는 것을 수반한다. 유전자 물질 또는 항체와 같은 단백질을 형질 감염시킬 수 있다. 전기천공법 외에, 양이온성 지질을 상기 물질과 혼합하여, 세포 원형질막과 융합하고 내부에 카르고를 침적하는 리포솜을 생산함으로써 형질감염을 수행할 수 있다.
일 예로, 인산 칼슘을 이용할 수 있다. 인산 이온을 함유하는 HEPES-완충 식염수(HeBS)를 형질감염될 물질을 함유하는 염화칼슘 용액과 혼합한다. 두 가지가 혼합되면, 양으로 대전된 칼슘과 음으로 대전된 인산염의 미세 침전이 형성되어 형질 감염될 물질을 그 표면에 결합시킨다. 다음, 침전물의 현탁액을 형질 감염될 세포에 첨가한다. 상기 세포는 침전물 일부와 함께 형질 감염될 물질을 흡수한다. 다른 예로, 고도 분기된 유기 화합물(예를 들어, 덴드리머)을 이용하여 본 발명의 유전자 물질(miRNA)과 결합시키고 이를 세포 내로 들어가도록 한다. 다른 방법은 리포솜, 즉, 어떤 점에서는 세포의 구조와 유사하고 세포막과 실제로 융합할 수 있는 작은 막-결합체 내에 형질 감염될 유전자 물질의 혼입, 세포 내로 유전자 물질을 배출시키는 것을 포함한다. 진핵세포의 경우, 지질-양이온에 근거한 형질감염이 보다 전형적으로 사용되는데, 이는 세포가 보다 민감성이기 때문이다. 또 다른 예로, DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민과 같은 양이온성 폴리머를 사용한다. 음으로 대전된 유전자 물질은 다양이온(polycation)에 결합하고, 그 복합체는 내표작용(endocytosis)을 통하여 세포에 의하여 흡수된다.
형질감염에 대한 직접적인 접근은 유전자 물질이 불활성 고체 (통상적으로 금) 나노입자와 커플링된 다음 표적세포의 핵 내로 직접적으로 "샷"되는 유전자 총(gene gun)이다. 유전자 물질은 또한 바이러스를 매개체로 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 경우, 그 기법은 바이러스 형질도입(transduction)으로 불리우며, 세포는 형질도입되는 것으로 말하여진다. 형질감염의 다른 방법은 뉴클레오펙션(nucleofection), 전기천공법(electroporation), 열충격(heat shock), 마그네토펙션(magnetofection) 및 Lipofectamine, Dojindo Hilymax,Fugene, jetPEI, Effectene 또는 DreamFect과 같은 등록상표의 형질감염 시약을 포함한다
형질감염된 세포 내에서, miRNA의 결합을 통한 이중 가닥 RNA의 형성은 RNA 간섭 (RNAi)과 유사한 과정을 통하여 DNMT1 또는 EZH2 mRNA 전사체의 분해를 유발하면서 단백질 번역 시스템을 블록킹하거나, 또는 DNMT1 또는 EZH2 mRNA의 분해를 야기하지 않으면서 단백질 번역을 억제함으로써, 궁극적으로 DNMT1 또는 EZH2 발현을 저해한다.
또한, 본 발명의 항암적 용도의 다른 구체예로서, miR-185 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 포함하는, DNMT1 또는 EZH2 관련 암, 즉, DNMT1 또는 EZH2가 활성화되는 암에 대한 항암용 조성물을 제공할 수 있다.
"촉진제"는 목적 유전자의 발현 또는 활성을 촉진, 강화 또는 증가시키는 물질을 의미한다. 촉진제의 활성 메커니즘은 특별히 제한되지 않는다. 예로서는 유기 또는 무기 화합물, 단백질, 탄수화물, 지질과 같은 폴리머 1023720화합물, 다양한 화합물의 컴포지트(composite)를 포함한다. 예를 들어, 'miR-185' 촉진제'는 이들 miRNA의 발현 또는 활성을 촉진, 강화 또는 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 화학적으로 또는 생화학적으로 개질 될 수 있거나, 조성물로 제형화되어 표적 세포에 임의의 다수 수단으로 투여되거나 발현 구조체를 통해 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, miRNA 분자 또는 miRNA 전구체 분자는 핵산 벡터 (일반적으로 재조합 벡터 또는 발현 벡터로 언급되기도 함) 내로 삽입된 전사 단위로부터 발현된다. 벡터를 사용하여 miRNA를 암호화하는 핵산 분자를 세포 내로 전달하여 특이 유전자를 표적화할 수 있다. 재조합 벡터의 예로는 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 들 수 있다. 다양한 발현 벡터가 당해 분야에 공지되어 있다. 적합한 발현 벡터의 선택은 발현을 의도하는 세포 유형을 비롯하여 (이에 국한되는 것은 아님) 여러 인자에 근거하여 이루어질 수 있다.
이 외에도, 적합한 다수의 방법이 본 기술분야에서 공지되어 있다. 일반적으로, 표적 유전자를 발현하는 세포에 형질감염시키는데, 형질감염을 위해서는 예를 들어, 일렉트로포레이션 (electroporation), 형질감염을 위한 헬퍼로서 양이온성 리피드 또는 양이온성 폴리머의 사용과 같은 다양한 방법이 사용될 수 있다. 그 후, 세포를 표적 유전자의 발현을 가능하게 하는 적합한 조건 하에서 배양한다. 이어서 표적 유전자의 발현을 예를 들어, RT-PCR 또는 리포터 유전자의 양의 측정과 같은 적합한 기술을 사용하여 측정한다. 기본적으로, 어떤 종류의 세포라도 형질감염전환을 위해서 사용될 수 있지만, 바람직한 구체예에서 세포는 진핵세포, 바람직하게는 동물 세포, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포, 가장 바람직하게는 인간 세포이다.
본 발명에 따른 조성물은 DNMT1이 하향 조절되도록 치료적 유효량의 miR-185; 또는 이들의 미믹(mimics, 유사체)를 포함하여야 한다. 치료적 유효량은 공지의 투여 경로에 의하여 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 구현 예는 miR-185; 또는 이들의 미믹을 DNMT1이 관여하는 암세포 내로 형질감염시킬 수 있도록 적용된다. 본 발명의 조성물은 이에 제한되지 않으나 유전자 물질을 표적 세포 내로 형질감염시키기 위한 상기한 수단들 중 임의의 것을 포함 또는 이용할 수 있다. 바람직하게는 상기 조성물은 양이온성 지질을 포함할 수 있고, 상기 miRNA 및 이들의 유사체가 암세포 내로 방출될 수 있도록 양이온성 양친매성 물질을 추가로 포함할 수도 있다.
그리고, 본 발명의 핵산 분자 및 촉진제는 통상적인 약학 합성 기법에 따라 제조되는 항암용 약학 조성물로 제형화 될 수도 있다.
조성물은 활성 제제 또는 활성 제제의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 동시적, 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 하나의 활성 물질 이외에, 당업계에 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 버퍼, 안정화제 또는 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질들은 비독성이어야 하며 활성 성분의 효능을 방해해서는 안된다. 담체는 투여를 위해 바람직한 제제 형태, 예를 들어, 국소형, 정맥내, 경구, 뇌막, 신경상막 또는 비경구인지에 따라 다양한 형태를 취할 수 있다. 일반적으로 충진제, 확장제, 결합제, 습윤제(wetting agent), 붕해제(disintegrating agent), 계면 활성제와 같은 희석제, 부형제와 혼합함으로써 경구 또는 비경구 투여용으로 제조할 수 있다. 투여에 효과적인 투여량 및 계획은 경험적으로 결정할 수 있고, 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 단일 또는 다중 투여량을 사용할 수 있다.
나아가, 추가의 요법을 본 발명의 방법에 사용할 수 있음이 고려된다. 하나 이상의 다른 요법제는 당업계에 공지되고 특히 상기에서 추가로 정의된 방사선요법, 수술요법, 면역요법, 사이토킨(들), 성장억제제(들), 화학요법제(들), 세포독성제(들), 티로신 키나제 억제제, ras 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 혈관 형성 억제제, 및 사이클린 의존성 키나제 억제제를 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 그 중에서 화학요법 약물은 알킬화제, 항대사화제, 식물 알칼로이드, 토포아이소머라아제 저해제, 및 항종양제로 나눌 수 있다. 이 모든 약물은 세포 분열 또는 DNA 합성 및 일부 경로에서의 기능에 영향을 준다. 일부 제제는 티로신 키나아제 억제제(Gleevec　)와 같이 DNA에 직접적으로 간섭하지 않는다.
본 발명의 용도는 GKN1의 상향 조절 또는 하향 조절에 따른 miR-185의 발현조절과 관련하는 유전적 접근까지 확장한다.
유사한 관점에서, 본 발명은 miR-185을 이용하여 메틸화 효소 DNMT1 및 EZH2의 발현을 조절하는 방법에 관한 것으로, 일 구현 예에서, 상기 방법은 상기 miRNA를 암호화하는 벡터와 암세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. DNMT1 및 EZH2를 표적화함으로써 항암 유전자 GKN1의 기능 또는 활성을 조작할 수 있게 된다.
즉, DNMT1 RNA의 번역(translation)을 억제하거나 파괴시켜 전사후 조절(post-transciptional gene silencing)에 관여함으로써 DNMT1 mRNA의 발현을 억제시킴으로써 GKN1 활성을 촉진시킬 수 있고, 이를 통해 암 세포의 성장을 저해시킬 수 있다.
<스크리닝>
한편, 다른 관점에서 본 발명은 앞서 설명한 사실을 기반으로 하여, GKN1의 활성을 촉진시키고 DNMT1 발현을 억제시키는 암 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법은 일 구체예로,
(a) miR-185을 발현하는 동물세포에 항암 후보 물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 동물세포에서 항암 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 miR-185 발현이 촉진되는 경우의 물질을 위암 치료용 물질로 선택하는 단계.
miR-185을 발현하는 동물세포로서는, 예를 들면 위암 세포, 또는 인위적으로 제조한 암세포 등을 들 수 있고, 바람직하게는 인간 위암 세포이다. 배양은 당업자의 통상적인 지식에 따라서 선택할 수 있는 배지 및 배양 조건에서 배양한다.
본 방법에서, miR-185의 발현을 측정하는 것은 이들과 관련된 RNA, DNA, 단백질 등 그 바이오마커 대상의 형태를 제한하지 않는다.
샘플에서 다양한 바이오마커의 발현은 면역조직화학적 및/또는 웨스턴 분석, 정량적 혈액기반 분석 (예를 들어 혈청 ELISA) (예를 들어 단백질 발현 수준을 조사하기 위해), 생화학적 효소 활성 분석, mRNA의 계내 혼성화, 노던 블럿 분석 및/또는 PCR 분석, 및 게놈 웨스턴 블럿 분석 (예를 들어 유전자 결실 또는 증폭을 조사하기 위해), 및 유전자 및/또는 조직 어레이 분석에 의해 수행될 수 있는 매우 다양한 분석 중의 임의의 하나를 포함하여 이로 제한되지 않는 많은 방법에 의해 분석할 수 있고, 상기 방법 중 많은 방법은 당업계에 공지되고 당업자에게 이해되고 있다.
예를 들어, 상기 방법은 조직 또는 세포 샘플에서 mRNA 발현을 조사하는 프로토콜을 포함할 수 있다. 세포 내의 mRNA의 평가 방법은 공지되어 있고, 예를 들어, 상보성 DNA 프로브를 사용하는 혼성화 분석 및 다양한 핵산 증폭 분석 (예를 들어 상보성 프라이머를 사용하는 RT-PCR 등)을 포함한다. 또한, 상기 방법은 마이크로어레이 기술에 의해 조직 또는 세포 샘플에서 mRNA를 조사 또는 검출하는 프로토콜을 포함할 수 있다. 마이크로어레이 기술은 단일 실험 내에서 수천개의 유전자의 mRNA 발현 프로필을 평가하기 위해서 핵산 혼성화 기술 및 컴퓨터 기술을 이용한다
이와 같이, 본 발명은 암세포에서 항암 유전자 GKN1 에 의해 발현이 촉진하고 메틸화 전이효소 DNMT1을 억제하는 miR-185에 관한 것으로, 특히, 상기 miRNA의 항암적용도에 관한 것으로, DNMT1 관련 암의 발생 및 증식활성, 전이의 활성, 또는 세포주기의 전이 활성 예측에 대한 정보를 제공받을 수 있는 주요한 분석 대상으로 활용할 수 있을 것이다.
<실시예>
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
각 분석들 결과는 평균±표준편차 값으로 계산하여 분석하고, P< 0.05은 통계학적으로 유의미한 것으로 간주하였다.
실험 준비 : 세포 배양 및 GKN1 과 shGKN1 의 트랜스펙션
AGS 위암 세포주 및 HFE-145 정상 위점막 세포를 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) 및 Dr. Hassan (Washington, DC, USA)로부터 수득하였다. 이들 세포주 모두 10% 열-비활성화된 FBS와 함께 RPMI-1640 배지 (Lonza, Basel, Switzerland)에서 5% CO2 및 37℃에서 배양하였다.
GKN1 cDNA 및 shGKN1를 pcDNA3.1 발현 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 클로닝하였다. AGS 및 HFE-145 세포들을 60 mm-직경의 디쉬에서 발현 플라스미드(2 μg total DNA)로 Lipofectamine Plus transfection reagent (Invitrogen)을 이용하여 형질감염시켰다.
실시예 1 : 후성적 조절자 GKN1 발현
GKN1 형질감염 후 24시간 및 48시간 때 AGS 세포 및 shGKN 로 형질감염된 HFE-145 세포에서 후성적 프로세스에 관여하는 EZH2, DNMT1 및 HDAC1의 발현 수준을 분석하였다. 30개의 동결 위암 및 상응하는 비암성 위 점막 조직에서 EZH2, DNMT1 및 HDAC2의 발현 역시 웨스턴 블럿 분석에 의해 조사하였다.
상기 샘플들은 막자 및 막자사발을 이용하여 액체 질소에서 매우 미세한 분말로 분쇄하였고 1X 프로테아제 저해 믹스(Roche)가 보충된 ice-cold Nonidet P-40 용해 버퍼에 현탁하였다.
세포 용해물을 10% 폴리아크릴아마이드 겔 상에 분리하여 Hybond-PVDF 트랜스퍼 멤브레인(Amersham) 상에 블럿팅하였고, 연속적으로 항-DNMT1, 항-EZH2, 항-메틸 히스톤 H3, 및 anti-HDAC1 모노클로날 항체(BD bioscience)로 프로브화한 후, horseradish peroxidase가 컨쥬게이트된 항-마우스 IgG와 배양하였다. 강화된 화학발광 웨스턴 블럿팅 검출 시약(Amersham)을 이용하여 단백질 밴드들을 검출하였다. 카톨릭 의과대학의 임상시험 심사위원회로부터 승인을 받았다(CUMC09U089).
GKN1는 세포주기-관련 단백질 발현을 조절함으로써 세포 주기를 유도하는 사실을 기초로, 본 발명자들은 GKN1이 DNA 메틸화 유지를 위한 주요 인자들인 DNMT1, EZH2 및 메틸 히스톤 H3 (K27), HDAC1의 발현수준과 관계하는지 여부를 관찰한 결과, 도 1 a에 나타난 바와 같이, GKN1의 이소성 발현(ectopic expression)은 DNMT1 을 아세틸화시키는 Tip60 발현을 유도하였고, DNMT1, EZH2, 메틸 히스톤 H3, 및 HDAC1의 발현은 감소시켰지만, HFE-145 세포에서의 GKN1 사일런싱은 이들 단백질의 발현을 상향-조절시켰다. 추가로, GKN1로부터 유래된 pGKN1D13N, pGKN168 -199, pGKN11 -67, 165-199, 및 pGKN11-67 역시 DNMT1 및 EZH2 단백질 발현을 감소시켰다(도 1 b)
또한, GKN1 형질감염 후 AGS세포 및 shGKN1 형질감염 후 HFE-145 세포에서 DNMT1 활성을 조사하였을 때, 각각 감소된 DNMT1 활성 및 증가된 DNMT1 활성이 관찰되었다(도 2a). 게다가, pGKN1D13N, pGKN168-199, pGKN11 -67, 165-199, 및pGKN11 -67 는 AGS세포에서 DNMT1 활성을 감소시켰다(도 2b)
또한, real time RT-PCR에 의해 AGS세포 및 HFE-145 세포에서 DNMT1 mRNA 발현을 조사하였고, 그 결과, GKN1이 DNMT1 및 EZH2 mRNA 발현을 저해함을 확인하였다(도 3a). 그리고, pGKN1D13N, pGKN168 -199, pGKN11 -67, 165-199, 및 pGKN11 -67 는 AGS세포에서 DNMT1 및 EZH2 mRNA 발현을 감소시켰다(도 3b). 이는 상기 결과들과 일치하였다. 또한, 와일드 타입 GKN1, pGKN1D13N, pGKN168 -199, pGKN11 -67, 165-199, 및 pGKN11-67는 CDKN2A mRNA 발현을 증가시켰다(도 3c 및 도 3c).
다음으로, DNMT1가 위암 형성에 관여하는지를 조사하기 위해, shDNMT1에 의해 AGS세포에서 DNMT1를 녹다운시킴으로써 DNMT1 사일런싱이 세포 성장을 현저히 감소시키고(도 4a), G0/G1 및 G2/M 세포주기 정지를 유도함을 확인하였다(도 4b).
이러한 결과들을 인간 위암 조직에서 확인하기 위하여, 30개의 정상 위점막 조직과 위암조직에서 GKN1 발현을 DNMT1 및 EZH2와 웨스턴 블럿으로 비교하였다.
예상대로, GKN1-음성 암 조직은 DNMT1 및 EZH2 단백질의 과발현을 보여주었지만, GKN1-양성 암은 이들 단백질의 저발현을 보여주었다(도 5). 그 결과, 위점막 조직의 경우와 비교하여, 위암 조직 중 22개(73.3%)에서 GKN1의 발현이 감소하였고, DNMT1 (76.7%) 및 EZH2 (90%) 단백질의 발현이 증가하였다. 이를 표 1에 기재하였다.
Figure 112012062017171-pat00001
또한, GKN1, DNMT1, 및EZH2 단백질 발현 역시 HFE-145 정상 위세포 및 10개의 위암 세포주에서 웨스턴 블럿으로 확인하였다.
HFE-145 정상 위 점막 세포는 GKN1 단백질 발현을 보였지만, 10개의 위암 세포주는 GKN1 단백질을 발현하지 않았다. 반대로, HFE-145 위 세포에서는 DNMT1 및 EZH2 발현이 나타나지 않았지만, 10개의 위암 세포주에서는 DNMT1 및 EZH2의 강한 발현이 나타났다(도 6).
그러므로, 위암 조직에서는 GKN1은 하향 조절되는 반면 DNMT1 및 EZH2는 과발현 함을 알 수 있었다.
상기 결과들을 확인하기 위해, NCBI(National Center for Biotechnology Information) GEO(Gene Expression Omnibus) 데이터베이스(accession numbers GSE27342)로부터 사용가능한 위암 환자 집단으로부터 GKN1, DNMT1 및 EZH2 유전자 발현을 살폈다. 마찬가지로, GKN1 유전자 발현은 현저히 하향 조절된 반면, DNMT1 및 EZH2 유전자 발현은 현저히 상향 조절되었다. (도 7)
이러한 결과들은 위암 조직에서 GKN1 발현과 DNMT1 및 EZH2 발현 사이에는 분명한 역상관관계가 나타남을 보여주고, 이는 DNMT1 및 EZH2 억제자로서 GKN1 기능을 시사한다.
실시예 2 : GKN1 , DNMT1 및 miR - 185발현 상관성
SYBR Green Q-PCR Master Mix (Stratagene, La Jolla, CA, USA) 을 이용하여 Real time RT-PCR 을 수행하였다. miR-185 발현은 인간 U6 snRNA에 의해 정상화하였다. GKN1 및 DNMT1 mRNA는 SYBR Green Q-PCR에 의해 정량화하고, 하우스키핑 유전자 GAPDH로 정상화하였다. 2-△△ CT 방법 (Pfaffl MW, Nucleic Acid Res 2001)을 이용하여 데이터들은 내부 측정기에 따라 상대적 양으로 기록하였다 프라이머들의 서열은 표 2에 기재된 바와 같다. 모든 PCR은 3회씩 수행하였다.
Figure 112012062017171-pat00002
그 결과, GKN1는 miR-185 발현을 상향 조절함으로써 DNMT1발현을 억제함을 확인하였다(도 8 내지 15).
DNMT1 발현 상 GKN1 효과를 입증하기 위해, GKN1가 DNMT1를 직접적으로 타겟팅하는 miR-185(Zhang et al., 2011)의 발현을 유도하는지 여부를 조사하였다.
그 결과, GKN1로 트랜스펙트된 AGS 세포에서 현저히 증가된 miR-185 수준이 관찰되었고 (도 8), HFE-145 세포에서 GKN1 사일런싱은 miR-185 발현을 현저히 감소시켰다(도 8). 또한, AGS 및 HFE-145 세포에서 miR-185로 형질감염 후 세포 생존능을 조사한 결과, miR-185가 세포 생존능을 감소시킴을 확인하였다(도 9).
다음으로, 세포 주기 상에서의 miR-185 효과를 조사한 결과 miR-185 는 sub-G0 세포 군집을 증가시키고 세포주기 어레스트(cell cycle arrest)를 유도함, 특히 G2/M 단계에서 어레스트함을 확인하였다(도 10).
또한, miR-185에 의한 세포주기 및 후성적 조절자에서 관여되는 잠재적 분자들을 확인하기 위해, miR-185 및 항- miR-185로 각각 형질감염시킨 AGS 및 HFE-145 세포에서 DNMT1, EZH2 및 cyclin D, cyclin E, cyclin B 를 포함하는 세포 주기-관련 단백질의 발현을 웨스턴 블럿 분석에 의해 확인하였다.
AGS 세포에서, miR-185의 과발현은 DNMT1 및 EZH2의 발현을 감소시켰을 뿐만 아니라, cyclin D, cyclin E 및 cyclin B 를 포함하는 세포주기-관련 단백질의 발현도 감소시켰다(도 11). HFE-145 세포에서, miR-185 사일런싱은 DNMT1; EZH2; 및 cyclin D, cyclin E, cyclin B를 포함하는 양성 세포주기 조절자의 상향 조절을 유도하였다(도11). 또한, miR-185는 감소된 DNMT1 활성, DNMT1 및 EZH2 mRNA 발현을 보였고, CDKN2A mRNA 발현을 증가시켰다(도 12). 그러나, 항-miR-185 처리를 한HFE-145 세포는 이들의 발현 및 활성을 각각 증가시키거나 감소시켰다(도 12)
이러한 관찰결과들을 확인하기 위해, 30개 위암조직에서 GKN1, miR-185, EZH2 및 DNMT1의 mRNA 발현을 real time RT-PCR에 의해 분석하였다.
상응하는 정상 위점막과 비교하여, miR-185 및 GKN1의 발현이 30 예의 위암 조직 중 26에서 감소하였고, DNMT1, EZH2 발현이 24, 25 암 조직에서 각각 증가하였다.
통계학적으로, 위암조직에서 GKN1 및 miR-185 발현 사이에 밀접한 관계가 있음을 확인하였고, miR-185 및 DNMT1, EZH2 사이의 역상관관계가 있음을 확인하였다(도 13).
추가로, 상기 결과들을 확인하기 위해, NCBI(National Center for Biotechnology Information) GEO(Gene Expression Omnibus) 데이터베이스(accession numbers GSE27342)로부터 사용가능한 위암 환자 집단으로부터 miR-185 발현을 살폈다. 위암 집단에서 miR-185 발현이 현저히 하향 조절됨을 확인하였다 (도 14).
또한, HFE-145 정상 위세포 및 10개의 위암 세포주에서 real time RT-PCR에 의해 GKN1, miR-185, EZH2 및 DNMT1의 mRNA 발현을 분석하였다. 그 결과, miR-185, GKN1의 감소된 발현 및 DNMT1, EZH2의 증가된 발현이 10 개의 위암 세포주에서 나타남을 확인하였다(도 15).
이러한 결과들을 통해, 통계학적으로 위암조직에서 GKN1 및 miR-185 발현 사이에 밀접한 관계가 있음을 확인하였고, miR-185 및 DNMT1 사이의 역상관관계가 있음을 확인하였다.
실시예 3 : DNMT1 활성 측정
세포들을 수집하고 PBS에 현탁하였다. 원심분리 후, 상청액을 제거하고 펠렛들을, 프로테아제 저해 혼합물(Complete; Roche Molecular Biochemicals)을 함유하는 용해 버퍼(10 mM Tris-Hcl pH 7.5, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl2)에 용해한 후, 4℃에서 5분 동안 배양하였다. 그 후, 6 ul 20% NP-40를 첨가하고 혼합물을 4℃에서 10분 동안 배양한 후, 3000rpm에서 5분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 수집하고 핵을 함유하는 펠렛들을 50 ul의 추출 버퍼(20 mM Hepes pH 7.9, 420 mM NaCl, 1.5 mM Mgcl2, 0.2 mM EDTA and 10 % glycerol)에 재현탁하고 4℃에서 30분 동안 배양한 후, 원심분리에 의해 핵 추출물을 수집하였다.
DNMT1 활성 분석 키트 (abcam)를 이용하여 DNMT1활성 분석을 수행하였다. 450 nm 에서 흡광도를 측정하고, DNMT1 활성 계산을 DNMT1 활성 분석 키트로 수행하였다. 모든 반응들을 3회로 수행되었다.
그 결과, GKN1로 형질감염된 AGS 세포에서 항- miR-185의 처리는 GKN1 성장-억제 활성의 완만한 제거를 보였고(도 16), 세포 주기의 정지를 나타냈다(도 17).
항-miR-185로의 miR-185 사일런싱은 DNMT1, EZH2, 양성 세포주기 조절자(p-CDC2, cyclin D, cyclin A 및 cyclin B 포함)의 발현을 회복시켰고, p16의 발현을 감소시켰다(도 18).
또한, GKN1로 형질감염된 AGS 세포에서 항- miR-185의 처리는, 공벡터-형질감염된 대조군 세포(mock)와 비교하여, 살아있는 콜로니들의 개수 및 크기를 증가시켰다(도19) 항-miR-185으로의 miR-185 사일런싱은 DNMT1 활성 및DNMT1 , EZH2 mRNA 발현을 증가시켰고, CDKN2A mRNA 발현을 감소시켰다 (도 20).
이러한 결과는 GKN1의 종양 억제자 활성이 miR-185 발현에 의존함을 나타낸다. 즉, miR-185 는 GKN1의 발현에 의해 종양 억제자 활성 및 발현이 조절된다.
실시예 4 : 메틸레이션 -특이적 PCR ( MSP ) 및 바이설피트 게놈 시퀀싱 ( BGS )
mock- 또는 GKN1-형질감염된 AGS 세포에서, 메틸레이션-특이적 PCR (MSP)에 따른 DNA의 소듐 바이설피트 처리를 이용하여 p16 및 E-cadherin 유전자의 프로모터 영역의 메틸화 위치를 조사하였다(Yoon et al, 2011).
메틸화 및 비메틸화 특이적 프라이머의 2세트의 프라이머를 이용하여 5 μl 바이설피트-변형된 DNA로 MSP를 수행하였다. 프라이머 서열은 상기 표 2에 기재되어 있다. 5 μl의 주형 DNA, 0.5 μM의 각 프라이머, 0.2 μM의 각 dNTP, 1.5 mM MgCI2, 0.4 유닛의 Ampli Taq gold polymerase (Perkin-Elmer) 및 3 μl의 10X 버퍼를 함유하는, 전체 부피 30μl에서 PCR을 수행하였다. 각 반응 용액은 처음에는 95℃에서 1분 동안 변성시켰다. 95℃에서 30초, 58℃에서 30초 및 72℃에서 30초의 40 사이클, 72℃에서 5분동안 최종 신장으로 증폭단계를 수행하였다. 각 PCR 산물들을 2% 아가로스 겔 상에 직접적으로 로딩하고 EtBr(ethidium bromide)으로 염색하여 UV광 아래서 가시화하였다. 바이설피트-처리된 DNA를 BGS을 위해 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 그리고 PDR 산물의 시퀀싱을 사이클릭 시퀀싱 키트(Perkin-Elmer, Foster City, CA)을 이용하여 수행하였다.
E- cadherin (Bis -E- cadherin) 및 CDKN2A (Bis - CDKN2A) 프로모터 영역의 번역 개시 사이트 주변 및 프로모터의 상부 영역(upstream region)에서 17 및 34 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 218bp 프래그먼트를, 소듐 바이설피트 변형 후 시퀀싱하였다(도 21). mock, GKN1, 및 항-miR-185 형질감염된 AGS 세포에서 BGS에 의해 메틸화되었음을 확인하였다 (도 22).
E- cadherin 유전자의 경우, GKN1 형질감염된 세포에서 7개의 메틸화된CpG 위치들이 완전히 비메틸화되었지만, 항-miR-185와 함께 GKN1을 처리하면 이러한 저메틸화가 되돌아갔다. CDKN2A 유전자의 경우, 34 CpG 아일랜드의 30(88.24%)이 mock-형질감염된 AGS 세포에서 메틸화되었다. 이소성 GKN1 발현은 26 메틸화된 CpG 위치를 비메틸화된(unmethylated) CpG로 바꾸었지만, 항-miR-185 처리는 GKN1의 저메틸화 활성을 억제하였다 (도22~24).
그러므로, E-cadherin 및 CDKN2A 재-발현은 Tip60의 상향 조절에 의해 EZH2 및 DNMT1의 억제로 인해 탈-메틸화(de-methylation)를 유도하였고, GKN1 발현 또는 GKN1-유도된 miR-185에 의해 HDAC1 를 감소시켰다(도 25). 즉, GKN1는 p16 및 E-카드헤린의 메틸화 위치를 조절함을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> A Use of micro RNA 185 for Treating Cancers <130> pn1207-352 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA 185 sequence <400> 1 uggagagaaa ggcaguuccu ga 22

Claims (11)

  1. 서열번호 1로 표시되는 miR-185 유전자를 유효성분으로 포함하는, DNMT1 또는 EZH2가 활성화되는 위암에 대한 항암용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 세포주기를 G0/G1 및 G2/M 단계에 어레스팅(arresting)하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 메틸화 전환효소 DNMT1 및 EZH2의 발현 및 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 p16 및 E-카드헤린의 메틸화를 조절하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 다음 단계를 포함하는 DNMT1 또는 EZH2가 활성화되어 있는 위암 치료용 물질의 스크리닝 방법:
    (a) DNMT1 또는 EZH2가 활성화되어 있는 위암세포에 항암 후보 물질을 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 위암세포에서 항암 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 miR-185 발현이 촉진되는 경우의 물질을 치료용 물질로 선택하는 단계.
  10. 삭제
  11. 삭제
KR1020120084847A 2012-08-02 2012-08-02 ｍｉＲ-185의 항암적 용도 KR101445921B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120084847A KR101445921B1 (ko) 2012-08-02 2012-08-02 ｍｉＲ-185의 항암적 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120084847A KR101445921B1 (ko) 2012-08-02 2012-08-02 ｍｉＲ-185의 항암적 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140017930A KR20140017930A (ko) 2014-02-12
KR101445921B1 true KR101445921B1 (ko) 2014-10-06

Family

ID=50266278

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120084847A KR101445921B1 (ko) 2012-08-02 2012-08-02 ｍｉＲ-185의 항암적 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101445921B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116350755A (zh) * 2022-12-22 2023-06-30 唐颢 m5C甲基化调节因子DNMT1、NSun2在肿瘤中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. CANCER RES. CLIN. ONCOL., Vol.137, pp.1697-1704 (2011년 공개) *
Molecular cancer, 10(124), pp.1-16 (2011년 공개) *
Oncogene, Vol.29, pp.4971-4979 (2010년 공개) *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140017930A (ko) 2014-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ryu et al. Suppression of miRNA-708 by polycomb group promotes metastases by calcium-induced cell migration
Liffers et al. MicroRNA-148a is down-regulated in human pancreatic ductal adenocarcinomas and regulates cell survival by targeting CDC25B
Hou et al. MicroRNA-519d targets MKi67 and suppresses cell growth in the hepatocellular carcinoma cell line QGY-7703
Ma et al. Long non‐coding RNA LOC 554202 modulates chordoma cell proliferation and invasion by recruiting EZH 2 and regulating miR‐31 expression
Tao et al. microRNA-133 inhibits cell proliferation, migration and invasion in prostate cancer cells by targeting the epidermal growth factor receptor
Sun et al. MicroRNA-9 enhances migration and invasion through KLF17 in hepatocellular carcinoma
Zhao et al. MiR-26a inhibits prostate cancer progression by repression of Wnt5a
JP2018507866A (ja) マイクロｒｎａを有効成分として含む癌治療用医薬組成物
Zhang et al. MicroRNA‐146a targets PRKCE to modulate papillary thyroid tumor development
Zeng et al. FEN1 mediates miR‐200a methylation and promotes breast cancer cell growth via MET and EGFR signaling
Wang et al. Overexpression of hiwi promotes growth of human breast cancer cells
CN111575372B (zh) 长非编码rna letn作为肿瘤标志物及治疗靶点
Zhi et al. Oncogenic miR-544 is an important molecular target in gastric cancer
JP2016530232A (ja) Ｍｉｒ−３４活性のバイオマーカー
Chen et al. MicroRNA-1976 functions as a tumor suppressor and serves as a prognostic indicator in non-small cell lung cancer by directly targeting PLCE1
Zhang et al. RETRACTED ARTICLE: microRNA-877 inhibits malignant progression of colorectal cancer by directly targeting MTDH and regulating the PTEN/Akt pathway
CA2691510A1 (en) Compositions and methods of treating cancer
JP2014527807A (ja) 骨肉腫のためのマイクロｒｎａに基づく方法およびアッセイ
Miyamoto et al. Kinesin family member 14 in human oral cancer: A potential biomarker for tumoral growth
US20140045924A1 (en) Melanoma treatments
KR101667169B1 (ko) 암 치료제
WO2017207623A1 (en) Mirna as biomarkers and regulators of cancer stem cells
JP7406278B2 (ja) 腫瘍マーカー及び治療ターゲットとしての長鎖ノンコーディングｒｎａ ｌｅｔｎ
JP5812491B2 (ja) 腫瘍治療剤
Xie et al. LncRNA GAS5 Suppresses Colorectal Cancer Progress by Target miR-21/LIFR Axis

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170829

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180917

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190902

Year of fee payment: 6