WO2015002512A1 - 뎅기 바이러스 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이를 포함하는 뎅기 바이러스 증식 억제용 조성물 - Google Patents

뎅기 바이러스 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이를 포함하는 뎅기 바이러스 증식 억제용 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a dengue virus-specific siRNA, a double helix oligo RNA structure comprising such a siRNA and a composition for inhibiting dengue virus growth comprising the same, wherein the double helix oligo RNA structure is a double helix in order to be efficiently delivered into cells
  • Both ends of the RNA have a structure in which a hydrophilic material and a hydrophobic material are bonded by using simple covalent bonds or linker-mediated covalent bonds, and hydrophobic interaction of the double-stranded oligo RNA structures in an aqueous solution. Can be converted into nanoparticle form by action.
  • the siRNA included in the double helix oligo RNA structure is preferably siRNA specific to dengue virus.
  • the present invention also relates to a method for producing the double-stranded oligo RNA structure and a pharmaceutical composition for inhibiting dengue virus growth and preventing and treating dengue virus infection comprising the double-stranded oligo RNA structure.
  • Dengue virus belongs to the Flaviviridae family, which has a single stranded RNA and a single envelope with a diameter of 30 nm, and is a member of the Flaviviridae family. It is one of the diseases that occur. Dengue fever is transmitted by a mosquito or infected person, and high fever and rash with muscle pain and joint pain are often caused, and bleeding sometimes occurs, with dengue hemorrhagic fever. The risk is greatly increased. Also, lifelong immunity against infected dengue virus types is prevented, but not protected against other virus types, so people living in epidemic areas can develop all four types of dengue virus infection during their lifetime.
  • Dengue virus shows four serotypes and has a genome size of about 11 kb.
  • the dengue virus genome is translated into a single polyprotein, which is then cleaved by a host or viral endogenous protease and divided into functional proteins.
  • RNA interference interfering RNA
  • 'RNAi' interfering RNA
  • RNA is converted into RNA, hereinafter called siRNA, and siRNA binds to an RNA-induced silencing complex (RISC), whereby the guide (antisense) strand recognizes and degrades the target mRNA to sequence-express the expression of the target gene.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • siRNA against the same target gene is superior to antisense oligonucleotides (ASOs) in inhibiting mRNA expression in vivo and in vitro , and the effect lasts for a long time.
  • ASOs antisense oligonucleotides
  • the siRNA action mechanism complementarily binds to the target mRNA and regulates the expression of the target gene in a sequence-specific manner, thus making it possible to apply targets to conventional antibody-based or small molecule drugs.
  • siRNAs must be effectively delivered to target cells by improving their stability and improving cell delivery efficiency in order for siRNAs to be developed as therapeutic agents (Harnessing in vivo siRNAs). delivery for drug discovery and therapeutic development.Drug Discov Today. 2006 Jan; 11 (1-2): 67-73).
  • nucleotides or skeletons of the siRNA are modified to have nuclease resistance or viral vectors, liposomes or nanoparticles, etc. Research into the use of the carrier is actively attempted.
  • RNAi oligonucleotides Delivery systems using viral vectors, such as adenoviruses and retroviruses, have high transfection efficacy, but high immunogenicity and oncogenicity.
  • non-viral delivery systems containing nanoparticles have lower cell delivery efficiency than viral delivery systems, but have high stability in vivo and target specificity. It is possible to deliver the RNAi oligonucleotides to the cells or tissues and improve the delivery effect such as uptake and internalization, as well as safety with little cytotoxicity and immune stimulation. This has the advantage of being high and is currently being evaluated as a viable delivery method compared to viral delivery systems (Nonviral delivery of synthetic siRNA s in vivo. J Clin Invest. 2007 December 3; 117 (12): 3623-3632) .
  • a method of using a nanocarrier is used to form nanoparticles by using various polymers such as liposomes and cationic polymer complexes, and siRNA is added to these nanoparticles, that is, nanocarriers. It has a form to be supported and delivered to the cell.
  • polymer nanoparticles, polymer micelles, lipoplexes, etc. are mainly used.
  • lipoplexes are composed of cationic lipids. It interacts with the anionic lipids of the endosome of endosome, induces the destabilizing effect of the endosome and delivers it into cells (Proc. Natl. Acad. Sci. 15; 93 (21): 11493-8, 1996).
  • siRNAs in the form of conjugated polymer compounds such as polyethylene glycol (PEG)
  • PEG polyethylene glycol
  • micelles composed of polymer complexes are extremely uniform in size and spontaneously formed, compared to other systems used as drug delivery vehicles, such as microspheres or nanoparticles. There is an advantage that it is easy to ensure the quality control and reproducibility of the formulation.
  • siRNA conjugate conjugated to a technique for securing the stability of the siRNA and efficient cell membrane permeability has been developed (Korean Patent No. 883471).
  • PEGylation polyethylene glycol
  • the chemical modification of siRNA and the conjugation of polyethylene glycol (PEGylation) alone (PEGylation) still have the disadvantages of low stability in vivo and delivery to the target organ is not smooth.
  • a double-stranded oligo RNA structure in which a hydrophilic and hydrophobic material is bound to oligonucleotides, especially a double-stranded oligo RNA such as siRNA.
  • Self-assembled nanoparticles called Micelle Inhibitory RNA (see Korean Patent No. 1224828), SAMiRNA TM technology yields very small and homogenous nanoparticles compared to conventional delivery technologies. It has the advantage of being able to.
  • polyethylene glycol is used as a hydrophilic substance, which is a synthetic polymer, which is often used to increase the solubility of pharmaceuticals, especially proteins, and to control pharmacokinetics.
  • PEG polyethylene glycol
  • one batch of polymers is made up of the sum of different numbers of monomers, resulting in a Gaussian shape with a molecular weight of polydisperse (Mw / Mn). Expresses the degree of homogeneity of the substance.
  • PEG exhibits a polydispersity index of about 1.01 when the molecular weight is low (3 to 5 kDa) and a high polydispersity index of about 1.2 when the molecular weight is high (20 kDa) .
  • the higher the molecular weight, the lower the homogeneity of the material. FM Veronese.Peptide and protein PEGylation: a review of problems and solutions.Biomaterials (2001) 22: 405-417). Therefore, when PEG is bound to pharmaceuticals, the polydispersity of PEG is reflected in the conjugates, which makes it difficult to verify a single substance. Therefore, the production of substances having low polydispersity index through the synthesis and purification of PEG is improved.
  • the hydrophilic material of the double-stranded RNA structure constituting SAMiRNATM is a uniform 1 to 15 monomers having a constant molecular weight and linkers as necessary
  • a new type of carrier technology having a smaller size and dramatically improved polydispersity compared to the existing SAMiRNA TM This was developed.
  • siRNA candidate group derived from the conserved sequence of dengue virus inhibits the proliferation of all dengue virus serotypes with excellent efficiency, and has completed the present invention.
  • an object of the present invention is a novel siRNA and a double helix oligo RNA construct comprising the same, which are specific for the dengue virus of serotypes 1, 2, 3 and 4 and capable of inhibiting its expression with very high efficiency, and such a double helix
  • a novel siRNA and a double helix oligo RNA construct comprising the same, which are specific for the dengue virus of serotypes 1, 2, 3 and 4 and capable of inhibiting its expression with very high efficiency, and such a double helix
  • Another object of the present invention is to inhibit dengue virus growth and / or ultimately to prevent and treat dengue virus infection comprising the dengue virus-specific siRNA or a double-stranded oligo RNA structure comprising such siRNA as an active ingredient It is to provide a pharmaceutical composition.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for propagating dengue virus and / or ultimately preventing and treating a dengue virus infection using the dengue virus specific siRNA or a double-stranded oligo RNA structure comprising such siRNA. will be.
  • a dengue virus specific composition comprising a first oligonucleotide having a sense strand having any one sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 88 and a second oligonucleotide having an antisense strand having a complementary sequence thereto.
  • siRNA siRNA
  • the siRNA in the present invention is a concept including all substances having a general RNAi (RNA interference) action, the dengue virus-specific siRNA is to include a dengue virus-specific shRNA, etc. It is common knowledge in the art It is self-evident to those who have.
  • SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 88 is the sense strand sequence of the siRNA specific to dengue virus, targeting the conserved region present in all dengue virus serotypes, inhibits the proliferation of all dengue virus regardless of serotypes Ultimately, it has the characteristics of preventing and / or treating a dengue virus infection.
  • SiRNA according to the present invention is preferably SEQ ID NO: 4 to 8, 13, 16, 20, 22, 23, 29, 32, 34, 39 to 42, 44 to 47, 51, 52, 70 to 72, 76, 77 And a sense strand of the dengue virus specific siRNA according to any one of Nos. 80 to 82,
  • Most preferably it comprises a sense strand of a dengue virus specific siRNA according to any one of SEQ ID NOs: 51, 52, 71 and 82.
  • the sense strand or antisense strand of the siRNA according to the present invention is preferably composed of 19 to 31 nucleotides, and includes the sense strand of any one of the siRNAs selected from SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 88 and antisense strands complementary thereto. .
  • the sense strand or antisense strand of the siRNA according to the invention is characterized in that it is a dengue virus specific siRNA, which is capable of binding to the sequences of serotypes 1, 2, 3 and 4 dengue virus.
  • Dengue virus-specific siRNA provided in the present invention has a base sequence designed to complementarily bind to the mRNA encoding the gene, it is characterized in that it can effectively suppress the expression of the gene.
  • the siRNA may include an overhang, which is a structure having one or more unpaired nucleotides at the 3 ′ end of the siRNA,
  • Modifications of the first or second oligonucleotides constituting the siRNA may comprise -OH groups at the 2 ′ carbon position of the sugar structure in one or more nucleotides, -CH 3 (methyl), -OCH 3 (methoxy), -NH 2 , -F (Fluorine), -O-2-methoxyethyl -O-propyl, -O-2-methylthioethyl, -O-3-aminopropyl, -O-3-dimethylaminopropyl,- Modification by substitution with ON-methylacetamido or -O-dimethylamidooxyethyl; Modification in which oxygen in a sugar structure in nucleotides is replaced with sulfur; Or a combination of one or more modifications selected from nucleotide-linked phosphorot
  • Dengue virus-specific siRNA provided in the present invention not only reduces the expression of the gene, but also significantly inhibits the expression of the protein, thereby inhibiting the proliferation of progeny in the cell culture.
  • a conjugate in which a hydrophilic material and a hydrophobic material are conjugated at both ends of a siRNA for efficient delivery and stability of a dengue virus-specific siRNA in vivo.
  • siRNA conjugates in which a hydrophilic substance and a hydrophobic substance are bound to siRNA form self-assembled nanoparticles by hydrophobic interaction of hydrophobic substances (see Korean Patent Registration No. 1224828).
  • the delivery efficiency and stability in the body extremely excellent, but also the particle size is uniform, so that the QC (Quality Control) is easy, so there is an advantage that the manufacturing process as a drug is simple.
  • the double-stranded oligo RNA structure comprising the dengue virus-specific siRNA according to the present invention preferably has a structure as shown in the following structural formula (1).
  • A represents a hydrophilic substance
  • B represents a hydrophobic substance
  • X and Y each independently represent a simple covalent bond or a linker-mediated covalent bond
  • R represents a dengue virus-specific siRNA.
  • the double-stranded oligo RNA structure comprising the dengue virus specific siRNA according to the present invention has the structure of the following structural formula (2).
  • A, B, X and Y are the same as the definitions in the above formula (1), S means the sense strand of the dengue virus-specific siRNA, AS means the antisense strand of the dengue virus-specific siRNA .
  • the double-stranded oligo RNA structure comprising dengue virus specific siRNA has the structure of the following structural formula (3) or (4).
  • One to three phosphate groups may be bonded to the 5 ′ end of the antisense strand of the double-stranded oligo RNA structure comprising the dengue virus-specific siRNA in the above formulas (1) to (4), and siRNA It is apparent to those skilled in the art that shRNA may be used instead.
  • the hydrophilic materials in the above formulas (1) to (4) are preferably cationic or nonionic polymer materials having a molecular weight of 200 to 10,000, and more preferably 1,000 to 2,000 nonionic polymer materials.
  • nonionic hydrophilic polymer compounds such as polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, and polyoxazoline as the hydrophilic polymer compound, but is not necessarily limited thereto.
  • the hydrophilic material (A) in the formulas (1) to (4) may be used in the form of a hydrophilic material block in the form of the following formula (5) or formula (6), which block
  • n in Structural Formula (5) or Structural Formula (6) it is possible to greatly improve the problem due to polydispersity that may occur when using a general synthetic polymer material or the like.
  • a ' is a hydrophilic monomer
  • J is a linker that connects between m hydrophilic monomers or m hydrophilic monomers and siRNA
  • m is 1 to 15
  • An integer, n, means an integer of 1 to 10
  • the repeating unit represented by (A ' m -J) or (J-A' m ) corresponds to the basic unit of the hydrophilic material block.
  • the double-stranded oligo RNA structure comprising the dengue virus-specific siRNA according to the present invention is a structure such as the following formula (7) or (8) It can have
  • the hydrophilic material monomer (A ') can be used without limitation as long as it meets the object of the present invention among monomers of the nonionic hydrophilic polymer, and preferably the compound (Table 1) 1) to the compound (3) is selected, the monomer, more preferably a monomer of the compound (1) may be used in which, G is preferably in the compound (1) may be selected from CH 2, O, S and NH.
  • the monomer represented by the compound (1) can introduce various functional groups, and has excellent bio-compatibility such as good in vivo affinity and induces an immune response, It has the advantage of increasing the in vivo stability of the siRNA included in the structure according to the structure (7) or the structure (8) and the delivery efficiency, which is very suitable for the preparation of the structure according to the present invention.
  • the hydrophilic substance (hydrophilic substance block) in Structural Formulas (5) to (8) has a total molecular weight in the range of 1,000 to 2,000.
  • hexaethylene glycol according to compound (1) in the formulas (7) and (8) ie, a substance in which G is O and m is 6, hexaethylene glycol spacer ( Since the molecular weight of the spacer) is 344, it is preferable that the number of repetitions n is 3 to 5.
  • the present invention if necessary, repeating units of the hydrophilic group represented by (A ' m -J) or (J-A' m ) n in the formulas (5) and (6), that is, a hydrophilic material block It can be used as an appropriate number denoted by n.
  • the hydrophilic material monomer A 'and the linker J included in each of the hydrophilic material blocks may be the same as or different from each of the hydrophilic material blocks independently.
  • the first block contains the hydrophilic monomer according to compound (1)
  • the second block contains the hydrophilic monomer according to compound (2)
  • the third block contains Other hydrophilic material monomers may be used for every hydrophilic material block, such as a hydrophilic material monomer according to compound (3), and any hydrophilic material monomer selected from compounds (1) to (3) may be used for every hydrophilic material block.
  • One hydrophilic monomer may equally be used.
  • the linker that mediates the binding of the hydrophilic material monomer may be the same linker for each hydrophilic material block, or different linkers may be used for each hydrophilic material block.
  • the linker (J) is preferably selected from the group consisting of PO 3 ⁇ , SO 3, and CO 2 , but is not limited thereto.
  • the linker (J) may meet the object of the present invention according to the monomer of the hydrophilic material used. As long as any linker can be used, it will be apparent to those skilled in the art.
  • hydrophobic substances (B) in the above formulas (1) to (4), (7) and (8) are represented by the formulas (1) to (4), (7) and (7) through hydrophobic interactions. It serves to form a nanoparticle consisting of the oligonucleotide structure according to 8).
  • the hydrophobic material has a molecular weight of 250 to 1,000, a steroid derivative, a glyceride derivative, a glycerol ether, a polypropylene glycol, an unsaturated of C 12 to C 50 or Saturated hydrocarbons, diacylphosphatidylcholine, fatty acids, phospholipids, lipopolyamines, and the like may be used, but are not limited thereto, and may be used as long as they meet the object of the present invention. It is obvious to those skilled in the art that hydrophobic materials can also be used.
  • the steroid derivative may be selected from the group consisting of cholesterol, colistanol, cholic acid, cholesterylformate, cotestanylmormate and colistanylamine, and the glyceride derivatives are mono-, di- and Tri-glyceride and the like, wherein the fatty acid of the glyceride is preferably C 12 to C 50 unsaturated or saturated fatty acid.
  • saturated or unsaturated hydrocarbons or cholesterols are preferable in that they have an advantage of being easily bonded in the synthesis step of the oligonucleotide structure according to the present invention, and tetramethyl containing C 24 hydrocarbons, especially disulfide bonds, is preferable.
  • dodosan tetradocosane
  • the hydrophobic material is bound to the distal end of the hydrophilic material and may be bonded at any position of the sense strand or the antisense strand of the double stranded oligo.
  • the hydrophilic or hydrophobic material and the dengue virus specific siRNA in the structural formulas (1) to (4) in the structural formulas (7) and (8) according to the present invention are simple covalent bonds or linker-mediated covalent bonds (X or Y). Combined by).
  • the linker that mediates the covalent bond is not particularly limited as long as it provides covalent bonds at the ends of the hydrophilic material or the hydrophobic material and the dengue virus-specific siRNA, and can be decomposed in a specific environment as necessary.
  • the linker may be used any compound that binds to activate dengue virus-specific siRNA and / or hydrophilic material (or hydrophobic material) during the preparation of the double-stranded oligo RNA structure according to the present invention.
  • the covalent bonds may be either non-degradable bonds or degradable bonds.
  • the non-degradable bonds include amide bonds or phosphorylation bonds
  • the degradable bonds include disulfide bonds, acid decomposable bonds, ester bonds, anhydride bonds, biodegradable bonds or enzymatic bonds, but are not limited thereto. .
  • siRNA represented by R (or S and AS) in the above formulas (1) to (4), formula (7) and formula (8) is a siRNA having a characteristic that can specifically bind dengue virus All of them can be used without limitation, and the present invention preferably comprises a sense strand comprising any sequence selected from SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 88 and an antisense strand having a complementary sequence thereto.
  • SiRNA according to the present invention is preferably SEQ ID NO: 4 to 8, 13, 16, 20, 22, 23, 29, 32, 34, 39 to 42, 44 to 47, 51, 52, 70 to 72, 76, 77 And a sense strand of the dengue virus specific siRNA according to any one of Nos. 80 to 82,
  • Most preferably it comprises a sense strand of a dengue virus specific siRNA according to any one of SEQ ID NOs: 51, 52, 71 and 82.
  • the present invention also provides a double-stranded oligo RNA structure comprising a dengue virus-specific siRNA according to the present invention, wherein an amine group or a polyhistidine group is additionally introduced at the opposite end portion of the structure in which the hydrophilic substance is bound to the siRNA. Can be.
  • This is for facilitating intracellular introduction and endosomal escape of a carrier comprising a double-stranded oligo RNA construct comprising a dengue virus specific siRNA according to the present invention, and already within the cell of a carrier such as Quantum dot, Dendrimer, liposome, etc. It has been reported that the introduction of amine groups and polyhistidine groups can be used to facilitate the introduction and endosomal escape, and their effects have been reported.
  • the primary amine group modified at the end or the outside of the transporter forms a conjugate by electrostatic interaction with negatively charged genes while being protonated at pH in vivo, and has a buffering effect at the low pH of the endosome after inflow. It is known that internal tertiary amines can protect the transporter from degradation of lysosomes by facilitating escape of the endosomes (inhibition of gene transfer and expression using polymer-based hybrid materials. Polymer Sci. Technol. , Vol. 23, No. 3, pp254-259),
  • Histidine one of the non-essential amino acids, has imidazoling (pKa3 6.04) at residue (-R), which increases the buffering capacity in endosomes and lysosomes. It is known that histidine modifications can be used to enhance endosomal escape efficiency in non-viral gene carriers (Novel histidine-conjugated galactosylated cationic liposomes for efficient hepatocyte selective gene transfer in human hepatoma HepG2 cells.J. Controlled Release 118, pp 262-270).
  • the amine group or polyhistidine group may be linked with a hydrophilic material or a hydrophilic block through one or more linkers.
  • P means an amine group or a polyhistidine group
  • J 1 and J 2 is a linker independently a simple covalent bond
  • PO 3 -, SO 3, CO 2 the C 2-12 alkyl, alkenyl, alkynyl in can be selected, but not limited to this, can be any linker J 1 and J 2 to meet the object of the present invention in accordance with the hydrophilic material used is apparent to those of ordinary skill.
  • J 2 is a simple covalent bond or a PO 3 -
  • J 1 is preferably a C 6 alkyl, but is not limited to this.
  • J 2 is preferably a simple covalent bond or PO 3 ⁇
  • J 1 is preferably Compound (4) in the formula (9), but is not limited thereto.
  • hydrophilic material of the double-stranded oligo RNA structure according to formula (9) is a hydrophilic substance block according to formula (5) or formula (6), and when an amine group or polyhistidine group is introduced thereto, 10) or structure (11).
  • the hydrophilic substance is preferably in the form bound to the 3 'end of the dengue virus-specific siRNA sense strand, in this case the formulas (9) to (11) May have the form of the following formulas (12) to (14).
  • amine groups that can be introduced in the present invention primary to tertiary amine groups may be used, and primary amine groups are particularly preferably used.
  • the introduced amine group may be present as an amine salt, for example the salt of the primary amine group may be present in the form of NH 3 + .
  • polyhistidine groups which can be introduced in the present invention preferably include 3 to 10 histidines, and particularly preferably 5 to 8, most preferably 6 histidines.
  • one or more cysteines may be included.
  • Active targeting using nanoparticles is a technique that binds a targeting moiety to nanoparticles, which promotes the accumulation of nanoparticles in target tissues or delivers them into target cells.
  • has been reported to improve internalization Does a targeting ligand influence nanoparticle tumor localization or uptake Trends Biotechnol. 2008 Oct; 26 (10): 552-8. Epub 2008 Aug 21).
  • Active targeting uses target cell surface specific or overexpressed carbohydrates, receptors, and antigens (targeting moieties) that have the ability to bind to antigens (Nanotechnology in cancer). therapeutics: bioconjugated nanoparticles for drug delivery.Mol Cancer Ther 2006; 5 (8): 1909-1917).
  • the double-stranded oligo RNA structure comprising the dengue virus-specific siRNA according to the present invention and the nanoparticles formed therefrom are provided with a targeting moiety, it efficiently promotes delivery to a target cell, and at a relatively low dosage. It can also be delivered to target cells to exhibit a high target gene expression regulation function, and can prevent delivery of non-specific dengue virus specific siRNA to other organs and cells.
  • the present invention targets the ligands (L), in particular receptor-mediated endocytosis (RME), to the structures according to the above formulas (1) to (4), (7) and (8).
  • L receptor-mediated endocytosis
  • It provides a double-stranded oligo RNA, a structure additionally bound to a ligand having a characteristic of specifically binding to a receptor that promotes cell internalization, for example, a double-stranded oligo RNA structure according to formula (1)
  • the form in which the ligand is bound to has the structure shown in the following structural formula (15).
  • L is the target cell internalization through receptor-mediated endocytosis (RME) Ligand having the property of specifically binding to a receptor to be enhanced
  • Z means a linker which mediates the binding of the ligand with a hydrophilic monomer in a covalent or hydrophilic block of material
  • i is an integer from 1 to 5, preferably It is an integer of 1-3.
  • Ligand in the formula (15) is preferably a target receptor specific antibody, aptamer, peptide having RME properties to enhance the target cell-specific internalization (internalization); Or folic acid (Folate, in general, folate and folic acid are used interchangeably with each other, folic acid in the present invention means folate that is active in the natural state or human body), N-acetyl galactosamine (N-acetyl Galactosamine, NAG Hexamine (hexoamine), glucose (glucose), mannose, and other chemicals such as sugar or carbohydrate (carbohydrate), such as, but is not limited thereto.
  • folic acid in the present invention means folate that is active in the natural state or human body), N-acetyl galactosamine (N-acetyl Galactosamine, NAG Hexamine (hexoamine), glucose (glucose), mannose, and other chemicals such as sugar or carbohydrate (carbohydrate), such as, but
  • hydrophilic material A in the formula (15) may be used in the form of a hydrophilic material block according to formula (5) and formula (6).
  • the present invention provides a method for producing a double-stranded oligo RNA structure comprising the dengue virus-specific siRNA.
  • Solid support in the present invention is preferably Controlled Pore Glass (CPG), but is not limited thereto.
  • CPG Controlled Pore Glass
  • Polystyrene, silica gel, cellulose paper, or the like may be used.
  • the diameter is preferably 40 to 180 ⁇ m, and preferably has a pore size of 500 to 3000 ⁇ m.
  • RNA single strand comprising the RNA single strand and the complementary sequence synthesized in step (2) may be a manufacturing method characterized in that used in the form of a phosphate group bonded to the 5 'end.
  • the present invention provides a method for producing a double-stranded oligo RNA structure in which a ligand is further coupled to a double-stranded oligo RNA structure comprising a dengue virus-specific siRNA of the present invention.
  • the ligand-RNA-polymer structure and the RNA single strand of the complementary sequence are separated and purified, and then the desired ligand-RNA-polymer structure and complement by measuring the molecular weight by MALDI-TOF mass spectrometer. You can check whether the RNA is prepared.
  • Ligand-double-stranded oligo RNA structures can be prepared by annealing RNA single strands of sequences complementary to the prepared ligand-RNA-polymer constructs.
  • the step (4) of synthesizing the RNA single strand of the sequence complementary to the sequence of the RNA single strand synthesized in step (3) is an independent synthesis process before (1) or (1) to ( 6) may be performed during any of the steps.
  • a nanoparticle comprising a double helix oligo RNA construct comprising a dengue virus specific siRNA.
  • the double-stranded oligo RNA structure including the dengue virus gene-specific siRNA is amphiphilic containing both hydrophobic and hydrophilic substances, and the hydrophilic portion interacts with water molecules in the body and hydrogen bonds. They have an affinity towards them and are directed outwards, and hydrophobic materials are directed inwards through hydrophobic interactions between them to form thermodynamically stable nanoparticles. That is, the hydrophobic material is located in the center of the nanoparticles, and the hydrophilic material is located outside of the dengue virus-specific siRNA to form a nanoparticle that protects the dengue virus-specific siRNA.
  • the nanoparticles thus formed improve the intracellular delivery of dengue virus-specific siRNA and improve siRNA efficacy.
  • Nanoparticles according to the invention is characterized in that it consists of a double-stranded oligo RNA structure comprising siRNA having a different sequence, siRNA having a different sequence in the present invention may be siRNA other target gene specific of the dengue virus And the same target gene specificity but different sequences are interpreted.
  • a double-stranded oligo RNA structure comprising a target gene-specific siRNA for treatment of other diseases in addition to dengue virus-specific siRNA may be included in the nanoparticles according to the present invention.
  • the present invention provides a dengue virus specific siRNA, a composition for inhibiting dengue virus growth, and / or a dengue virus infection comprising a double-stranded oligo RNA structure comprising the same and / or nanoparticles comprising the double-stranded oligo RNA structure.
  • a dengue virus specific siRNA a composition for inhibiting dengue virus growth, and / or a dengue virus infection comprising a double-stranded oligo RNA structure comprising the same and / or nanoparticles comprising the double-stranded oligo RNA structure.
  • pharmaceutical compositions for prophylaxis and / or treatment are provided.
  • composition for inhibiting dengue virus growth comprising a double-stranded oligo RNA structure according to the present invention
  • any one sequence selected more preferably any one selected from SEQ ID NOs: 4, 16, 22, 51, 52, 71, and 82, most preferably any one of SEQ ID NOs: 51, 52, 71, and 82
  • a double helix oligo RNA structure comprising a dengue virus-specific siRNA comprising a sense strand having a sequence of and an antisense strand having a sequence thereof may be included.
  • the double-stranded oligo RNA structure including the dengue virus-specific siRNA may be included in a mixed form.
  • a dengue virus proliferation inhibiting composition comprising two or more double-stranded oligo RNA structures comprising dengue virus-specific siRNAs having different sequences as described above, synergistic effects are achieved, such as combination therapy. Can be.
  • any one of the structures selected from the double-stranded oligo RNA structure comprising dengue virus-specific siRNA is also included in the pharmaceutical composition according to the invention comprising a nanoparticle consisting of a double-stranded oligo RNA structure according to the present invention It may be composed purely only, or may be composed of a mixture of two or more double-stranded oligo RNA structure comprising a dengue virus-specific siRNA.
  • composition of the present invention may be prepared by including at least one pharmaceutically acceptable carrier in addition to the above-mentioned effective ingredient.
  • Pharmaceutically acceptable carriers should be compatible with the active ingredients of the present invention and include saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components. It can mix and use, and if needed, other conventional additives, such as antioxidant, buffer, and bacteriostatic agent, can be added.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may be additionally added to formulate injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • a formulation in the form of a lyophilized form it is desirable to formulate and provide a formulation in the form of a lyophilized form.
  • Methods commonly known in the art may be used for the preparation of lyophilized formulations, and stabilizers for lyophilization may be added.
  • it may be preferably formulated according to each disease or component by a suitable method in the art or using a method disclosed in Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA.
  • composition of the present invention can be determined by a person of ordinary skill in the art based on the symptoms and severity of the disease of a typical patient. It may also be formulated in various forms, such as powders, tablets, capsules, solutions, injections, ointments, syrups, etc., and may also be provided in unit-dose or multi-dose containers, such as sealed ampoules and bottles.
  • composition of the present invention can be administered orally or parenterally.
  • Routes of administration of the compositions according to the invention are not limited to, for example, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intestinal, sublingual Or topical administration is possible.
  • the dosage of the composition according to the present invention may vary in the range depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method, excretion rate or severity of the disease, etc. Can decide.
  • the compositions of the present invention can be formulated into suitable formulations using known techniques for clinical administration.
  • the present invention also provides a method of dengue virus infection comprising administering a double helix oligo RNA construct, a nanoparticle comprising the same, and the double helix oligo RNA construct or the nanoparticle to a patient in need thereof. Provide prevention and treatment.
  • Dengue virus-specific siRNA according to the present invention, the composition for the prevention and treatment of dengue virus infection comprising a double-stranded oligo RNA structure comprising the same can suppress the expression of dengue virus with high efficiency without side effects, currently suitable therapeutic agents It can be very useful for the prevention and treatment of no dengue virus infection.
  • Fig. 2 shows the results of multiple alignments of the dengue virus genome sequence 3′-UTR site.
  • FIG. 3 shows the relative positions of the universal siRNAs in the viral genome.
  • Figure 4 is a graph showing the replication kinetics of dengue virus for each serotype in C6 / 36 cell line
  • 5 is a graph showing replication kinetics of dengue virus for each serotype in VeroE6 cell line.
  • FIG. 6 is a diagram showing the proliferation inhibitory effect of dengue virus serotype 4 of 56 siRNA candidate groups selected as primary
  • FIG. 7 is a diagram showing the proliferation inhibitory effect of dengue virus serotype 4 of five siRNA candidate groups selected as primary
  • FIG. 9 is a diagram showing the proliferation inhibitory effect of dengue virus serotypes of five siRNA candidate groups selected as primary
  • FIG. 10 is a view showing relative positions of secondary general purpose siRNA positions designed by single nucleotide sliding window scanning in conventional general purpose SiRNA # 51 and SiRNA # 52 selected at sites showing high homology.
  • Figure 11 shows the proliferation inhibitory effect of dengue virus serotype 2 and serohung 3 of the second universal 32 siRNA candidate group designed by single nucleotide sliding window scanning for the first screened universal SiRNA # 51 and SiRNA # 52 graph
  • FIG. 13 is a graph showing the proliferation inhibitory effect of dengue virus serotype 2 to serotype 4 and dengue virus JB2 by using a combination of two selected siRNAs, siRNA ⁇ 51-15 and SiRNA # 52-10.
  • Figure 16 is a schematic view of the nanoparticles consisting of a double helix oligomeric polymer structure according to the present invention.
  • 17 is a diagram showing the proliferation inhibitory effect of dengue virus serotype 4 using SAMiRNA containing U1 siRNA according to the present invention.
  • FIG. 18 is a graph showing the proliferation inhibitory effect on all dengue virus serotypes 1 to serotype 4 and dengue virus JB2 of the mono-HEG-SAMiRNA comprising a combi-siRNA according to the present invention.
  • 19 is a graph showing the effect of inhibiting the growth according to the concentration of all dengue virus serotypes 1 to serotype 4 and dengue virus JB2 of the mono-HEG-SAMiRNA comprising a combi-siRNA according to the present invention
  • Dengue virus serotype 4 (Bank Registration No. KBPV-VR-31) obtained from Korea Bank for Pathogenic Viruses (Korea) was infected with Vero E6 cells (VeroE6 cells) and 4 days later. The pellet was recovered. RNA was prep using Qiagen RNA prep kit, and after quantification, cDNA was synthesized using AccuPower Rocketscript TM RT Premix (Bioneer, Korea) based on 2 ⁇ g total mRNA (sequencing), and sequencing of the obtained cDNA was performed. As a result, it was confirmed that the dengue virus serotype 4 strain H241 (GenBank: AY947539.1) was identical except for 11 nucleotides and 6 amino acids.
  • siRNAs of the top scores and the siRNAs additionally selected to be evenly distributed to each functional protein are combined. 50 siRNAs were designed as described in Table 2.
  • siCONT SEQ ID NO: 89 having a sense strand
  • siRNA siRNA having a sequence that does not inhibit the expression of any gene
  • the siRNA was prepared by linking phosphodiester bonds forming an RNA backbone structure using ⁇ -cyanoethyl phosphoramidite (Nucleic Acids Research, 12: 4539-4557, 1984).
  • RNA synthesizer 384 Synthesizer, BIONEER, KOREA
  • a series of processes consisting of deblocking, coupling, oxidation, and capping on a solid support to which nucleotides are attached was repeated to obtain a reaction containing RNA of the desired length.
  • the reaction was isolated and purified by HPLC LC918 (Japan Analytical Industry, Japan) equipped with Daisogel C18 (Daiso, Japan) column and matched with target sequence using MALDI-TOF mass spectrometer (Shimadzu, Japan). Confirmed. Then, by combining the sense and antisense RNA strand was prepared a double-stranded siRNA comprising the sequence selected from SEQ ID NO: 1 to 56 and SEQ ID NO: 89 as the sense strand.
  • 12-well plates were seeded with C6 / 36 cells (2.5 ⁇ 10 5 / well) and Vero E6 cells (1 ⁇ 10 5 / well), and DPBS immediately before infection with dengue virus. Washing out.
  • virus cultures were recovered at 24 hour intervals and centrifuged (6000 rpm, 5 mins, 4 ° C.). 400 ⁇ l of the culture was preprepared with the ExiPrep TM 16DX RNA prep equipment. 19.5 ⁇ l was used for cDNA synthesis and 5 ⁇ l of a total of 20 ⁇ l cDNA was used for qPCR.
  • serotypes 2 to 4 were serotypes from the Korean Bank for Pathogenic Viruses (Korea Bank) and serotype 1 from the Department of Neurology and Virology.
  • DN1234_S, DN123_AS and DN123_probe were used for detection of serotypes 1 to 3 for qPCR, and DN1234_S, DN4_AS and DN4_probe were used for detection of serotype 4.
  • VeroE6 cells were transformed using 56 kinds of siRNAs prepared in Example 1, and the siRNA performance was confirmed by analyzing the copy number of the virus produced in the transformed cell line.
  • VeroE6 cells are seeded in 12 ⁇ well plates (Nunc, USA) at 1 ⁇ 10 5 cells / well.
  • DMEM Hyclone, USA
  • Complete medium Complete medium was used as a culture medium of the cells were treated with 1 ml per well to culture the cells at 37 °C, 5% CO 2 conditions.
  • the complete medium composition was set to 500 ml of Dulbeccos Modified Eagles Medium (pH 7.4) at a final 10% concentration of 4.00 mM L-Gutamine and 4500 mg / L Glucose, sodium pyruvate, and Fetal Bovine Serum (Hyclone, USA).
  • the culture medium was removed in a 12-well plate for transfection of siRNA, exchanged with 500 ⁇ l of OPTI-MEM (GIBCO, USA), and the cells were preincubated intact in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. Pre-incubation).
  • OPTI-MEM OPTI-MEM
  • reagent in 250 ⁇ l of OPTI-MEM and 250 ⁇ l of OPTI-MEM diluted siRNA to a certain concentration, set aside at RT for 5 minutes, and then siRNA included. Diluted OPTI-MEM was added to OPTI-MEM with LipofectamineRNAimax and incubated at RT for 20 minutes before treatment to cells.
  • a screening experiment was performed by first treating siRNA at a concentration of 20 nM to select candidate groups with inhibitory activity against dengue virus serotype 4 from a total of 56 designed siRNA candidate groups (Tables 2 and 3). It was.
  • the residual virus value of the siRNA siCONT control group was set to 100 percent, and the residual virus value of other siRNA candidate groups was expressed as a relative percentage thereof, and was corrected to be compared with each other.
  • the residual virus value of the siRNA siCONT control group was set to 100 percent, and the residual virus value of other siRNA candidate groups was expressed as a relative percentage thereof, and was corrected to be compared with each other.
  • As a result as shown in [FIG. 6], less than 15% of residual virus was present in more than 30 siRNAs, and it was confirmed that it possessed high dengue virus inhibitory ability.
  • siRNA candidate groups SiRNASi4, SiRNA # 5, SiRNA # 6, SiRNA # 7, SiRNA # 8, SiRNA # 13, SiRNA # 16, SiRNA #
  • SiRNA # 20 SiRNA # 22, SiRNA # 23, SiRNA # 29, SiRNA # 32, SiRNA # 34, SiRNA # 39, SiRNA # 40, SiRNA # 41, SiRNA # 42, SiRNA # 44, SiRNA # 45, SiRNA # 46, SiRNA # 47, SiRNA # 51, SiRNA # 52
  • siRNA candidate groups were sequenced 4 to 8, 13, 16, 20, 22, 23, 29, 32, 34, 39 to 42, 44 to 47, 51 and 52, respectively, in the order described above.
  • SiRNA having a sense strand (Table 2 and Table 3).
  • siRNA of “SiRNA # X” means siRNA having a sense strand as a sequence represented by SiRNA # X in Tables 2, 3, and 6, and the like.
  • siRNA # 4 SiRNA # 16, SiRNA # 22, SiRNA # 51, SiRNA # 52
  • siRNA UnisiRNA-sh
  • siRNA having the same sequence as the shRNA described in (Korrapati AB et al., PLoS Negl Trop Dis . 6 (7): e1735, 2012) was used together as a positive control.
  • the proliferation inhibitory effect on the concentration-dependent dengue virus serotype 4 of the five selected siRNA candidate groups (SiRNA # 4, SiRNA # 16, SiRNA # 22, SiRNA # 51, SiRNA # 52) Screening experiments were performed at four concentrations of 20 nM, 10 nM, 5 nM, and 1 nM.
  • siRNA # 51 and SiRNA # 52 showed high inhibitory activity in most serotypes, and the other three siRNAs were detected in serotypes except for serotype 4. As a result, it was confirmed that the inhibitory effect was not large ([FIG. 9]).
  • SiRNA # 51 and SiRNA # 52 were selected by single nucleotide sliding window scanning to find a more efficient universal siRNA candidate. Screening experiments were conducted to compare the inhibitory activity against serotypes 2 and 3 viruses against existing primary siRNA candidates at a concentration of 10 nM using 32 newly designed siRNA candidates based on the sequences of # 51 and SiRNA # 52. Was performed.
  • SiRNA # 51-14 (SEQ ID NO: 70), SiRNA # 51-15 (SEQ ID NO: 71), SiRNA # 51-16 (SEQ ID NO: 72), SiRNA # 52-4 (SEQ ID NO: 76), SiRNA # 52 -5 (SEQ ID NO: 77), SiRNA # 52-8 (SEQ ID NO: 80), SiRNA # 52-9 (SEQ ID NO: 81), and SiRNA # 52-10 (SEQ ID NO: 82) in the experimental group treated with less than 1% It was confirmed that only the virus of remained and exhibited a very strong inhibitory ability. This is much better inhibitory value than the existing SiRNA # 51 and SiRNA # 52 efficacy [FIG. 11].
  • SiRNA si51-15 SEQ ID NO: 71
  • SiRNA # 52-10 SEQ ID NO: 82
  • SiRNA # 51 and SiRNA # 52 sequences among siRNA candidate groups showing strong inhibitory ability were finally selected and their inhibitory effect on the proliferation of dengue virus serotypes 2 to 4 was assayed again at a concentration of 10 nM.
  • siRNA # 51-15 and SiRNA # 52-10 which had better inhibition of the proliferation of dengue virus serotypes 2, 3, and 4 were selected, but with only one siRNA.
  • SiRNA # 51-15 does not show strong inhibition against dengue virus serotype 4
  • a siRNA mixture (hereinafter referred to as 'Combi-siRNA') in which SiRNA # 51-15 and SiRNA # 52-10 were mixed at a molar ratio of 1: 1 was prepared, and for the proliferation of all serotype dengue viruses Screening experiments were carried out at a concentration of 10 nM to see whether the universally strong inhibitory effect by the complementary effect (reinforcement effect) can be shown.
  • Combi-siRNA showed a strong inhibitory effect on the proliferation of all dengue virus of the serotype [Fig. 13].
  • the virus was first infected with the cultured cells, and then siRNA was treated to find out whether the siRNA could show efficacy as a therapeutic agent.
  • siRNAs of finally selected SiRNA # 51-15 and SiRNA # 52-10 were added by 5nM, respectively, and siCONT 5nM was added thereto, and the final siRNA concentration was adjusted to 10nM.
  • Combi-siRNA treatment showed strong proliferation against dengue virus proliferation of all serotypes. It was confirmed that the inhibitory ability [Fig. 14].
  • Combi-siRNA can function as a universal therapeutic for all serotype viruses.
  • siRNA and Combi-siRNA Two types of siRNA and Combi-siRNA, which were finally selected, were siRNA and Combi-siRNA, which were concentration-dependently selected from all serotypes of dengue virus JB (serum type 2, Chonbuk National University isolate) and dengue virus serotypes 1 to serum. Screening experiments were performed at four concentrations of 10 nM, 1 nM, 200 pM, and 50 pM to verify the effect of growth inhibition on type 4).
  • each siRNA candidate group showed a different concentration-dependent effect on all serotype dengue virus [FIG. 15],
  • the double-stranded oligo RNA structure (SAMiRNA) prepared in the present invention has a structure as shown in the following structural formula (16).
  • S is the sense strand of the siRNA
  • AS is an antisense strand of siRNA
  • PEG is a hydrophilic material
  • polyethylene glycol is a hydrophobic material tetradocosane containing disulphide
  • 5 'and 3' means the orientation of the double helix oligo RNA terminus.
  • the double-stranded oligo RNA of the sense strand in which polyethylene glycol is bound to the 3 'end After synthesis of the hydrophilic material structure, tetradocosan containing disulfide bonds was bound to the 5 'end to prepare a sense strand of the desired RNA-polymer structure.
  • the antisense strand to be annealed with the strand, the antisense strand of the sequence complementary to the sense strand was prepared through the reaction mentioned above.
  • RNA single strand and RNA polymer construct synthesized by treating 28% (v / v) ammonia in a 60 ° C. water bath were separated from the CPG, and then deprotected. The protective residue was removed through.
  • RNA single-stranded and RNA-polymerized structures with no protective residues were added in a volume ratio of N-methylpyrolidon, triethylamine and triethylaminetrihydrofluoride in an oven at 70 ° C. Treatment was performed at a ratio of 10: 3: 4 to remove 2'TBDMS (tert-but ⁇ ldimethylsilyl).
  • reaction was isolated and purified by HPLC LC918 (Japan Analytical Industry, Japan) equipped with Daisogel C18 (Daiso, Japan) column and matched with target sequence using MALDI-TOF mass spectrometer (Shimadzu, Japan). Confirmed.
  • the same amount of the sense strand and the antisense strand were mixed in a 1 ⁇ annealing buffer (30 mM HEPES, 100 mM potassium acetate), 2 mM magnesium acetate, pH 7.0 to 7.5), and then reacted for 3 minutes in a 90 ° C constant temperature water bath and then again at 37 ° C, and finally selected five siRNA candidate groups (SiRNASi4, SiRNA # 16, SiRNA # 22, SiRNA # 51, SiRNA #).
  • siRNA candidate groups SiRNA candidate groups
  • the prepared double-stranded oligo RNA structure is to form nanoparticles, that is, micelles (micelles) by the hydrophobic interaction between the hydrophobic material bound to the terminal of the double-stranded oligo RNA (Fig. 16).
  • the prepared SAMiRNA was dissolved in 1.5 ml DPBS (D ⁇ lbecco's Phosphate Buffered Saline) at a concentration of 50 ⁇ g / ml, and then nanoparticle powder was prepared by lyophilization at -75 ° C. and 5 mTorr for 48 hours. Melted homogenized nanoparticles were prepared and used in the examples of the present invention.
  • Dengue virus serotypes using SAMiRNA prepared to include five siRNA candidate groups (SiRNA # 4, SiRNA # 16, SiRNA # 22, SiRNA # 51, SiRNA # 52) that were primary selected by the method of Example 5.1. Proliferation inhibitory effect on 3 and serotype 4 was confirmed.
  • Example a is a hydrophilic material different from the SAMiRNA form in 5.2 hydrophilic substances block the PEG rather than [PO 3 - - hexamethylene glycol; 4 (see hereinafter referred to as 'Mono-HEG SAMiRNA', Structure 17)
  • SiRNA ⁇ 51-15 and SiRNA # 52-10 were included in the SAMiRNA having improved stability.
  • S is a sense strand of dengue virus specific siRNA
  • AS is an antisense strand of dengue virus specific siRNA
  • Hexa ethylene glycol is a hydrophilic substance
  • C 24 is a hydrophobic material tetradocosane containing disulfide
  • 5 'and 3' means the orientation of the sense strand ends in the double helix oligo RNA.
  • siRNA # 51-15 and SiRNA # 52-10 which were selected at a molar ratio of 1: 1, was synthesized in a SAMiRNA form. Effectiveness evaluation as an actual therapeutic agent was performed by verifying whether the concentration effectively inhibits the proliferation of dengue virus by 50%.
  • screening experiments were performed to include SiRNA # 51-15 and SiRNA # 52-10 together in Mono-HEG-SAMiRNA, and to verify the effect of suppressing proliferation in all dengue virus serotypes at concentrations of 500nM, 200nM, and 50nM. It was.
  • the amine is newly modified by conjugating the amine group to the 3 'end of the sense strand as shown in the structural formula (18).
  • -Mono-HEG-SAMiRNA was synthesized.
  • S is a sense strand of dengue virus specific siRNA
  • AS is an antisense strand of dengue virus specific siRNA
  • Hexa ethylene glycol is a hydrophilic substance
  • C 6 is a linker which is C 6 alkyl connecting an amine group with [Hexa Ethylene Glycol] 4
  • C 24 is a tetradocosane containing a disulfide as a hydrophobic material
  • 5 'and 3' means the orientation of the sense strand ends in the double helix oligo RNA.
  • the newly synthesized amine-Mono-HEG-SAMiRNA binds the FITC fluorescent substance to the 3 'end portion of the antisense strand by the introduction of an amine group compared to the conventional Mono-HEG-SAMiRNA through fluorescence microscopy.
  • the final production was made to visually measure whether there is an increase in the transfer efficiency.
  • we compared the time-based transfer efficiency of Mono-HEG-SAMiRNA and amine-Mono-HEG-SAMiRNA with image data obtained using a confocal microscope and randomly captured images. The purpose of this study was to determine the effect of increasing the SAMiRNA delivery efficiency.
  • HeLa cells were dispensed at 2 ⁇ 10 5 cells / ml in 2-chamber polystyrene vessels (BD Falcon TM cultureslides).
  • DMEM Hyclone, USA
  • Complete medium Complete medium was used as a culture medium of the cells were treated with 1 ml per chamber to culture the cells at 37 °C, 5% CO 2 conditions.
  • the complete medium composition was set to 500 ml of Dulbeccos Modified Eagles Medium (pH 7.4) at a final 10% concentration of 4.00 mM L-Gutamine and 4500 mg / L Glucose, sodium pyruvate, and Fetal Bovine Serum (Hyclone, USA). After 15 hours of cell culture, the culture medium in the chamber was removed, the medium was changed to 1 ml of OPTI-MEM (GIBCO, USA), and the SAMiRNA- was performed so that IFA (ImmunoFluorescence Assay) could be performed simultaneously. FITC was treated at 1000 nM concentration at each defined time (0 hr, 0.5 hr, 1 hr, 3 hr, 12 hr) under conditions that were not exposed to light.
  • IFA was performed in the experimental space where the light was blocked as much as possible.
  • the culture medium of cells treated with SAMiRNA-FITC in a 2-chamber polystyrene vessel was removed with a 1000p pipettor, and washed twice with 1 ml of OPTI-MEM. Thereafter, the cells were washed once with 3 ml of 1X PBS for 3 minutes, and then treated with 500% of 2% PFA (Paraformaldehyde), and the cells were fixed at room temperature for 30 minutes. The 2% PFA used at this time was freshly prepared, filtered and stored frozen. After cell fixation, washing was performed twice with 3 ml of 1X PBS for 3 minutes each.
  • Blocking solution containing 0.1% Triton X-100 (USB) and 10% BSA (Albumin, Bovine, pH 7.0) was added to 1X PBS. After treatment by 500ul for 30 minutes at room temperature, the solution was briefly washed with 1X PBS after removing the blocking solution. Then, the primary antibody (EEA1 (H-300), staining the intracellular endosome in a solution containing 0.1% Triton X-100 (USB) and 3% BSA (Albumin, Bovine, pH7.0) in 1X PBS, Santa Cruz, sc-33585) was diluted at a ratio of 500 to 1 (v / v), and then treated with 500 ul for each cell and wrapped in foil for 90 minutes to perform primary staining.
  • ESA1 H-300
  • DAPI DAPI, Dilactate, Sigma, D-9564
  • 10mg / ml in DW was added to 1X PBS at 1000 to 1 (v /
  • the diluted solution at the ratio of v) was dispensed into each cell with 500ul, and the staining was carried out for 20 minutes at room temperature. Thereafter, washing was performed three times for 3 minutes each with 1 ml of 1X PBS, and after removing the chamber wall, one drop of the mounting medium (IMMU-MOUNT, Thermo Scientific Shandon, cat.NO.9990402) was bubbled up to the maximum. After dropping on the cells so as not to go, carefully cover the cover glass and dried at room temperature for at least 20 minutes with the light blocked using a foil until the mounting medium solidified. After detecting and observing the FITC signal (Green) and Alexa546 (Red) signals through a confocal microscope (LSM700, Carl Zeiss), image data analysis was performed.
  • FITC signal Green
  • 2D images were obtained at 400X magnification for each sample (0hr, 0.5hr, 1hr, 3hr, 12hr) at each time zone, and 3D images of cells were obtained by z-stacking at 1000X magnification.
  • 2D and 3D image analysis confirmed the presence of a signal that merges the FITC signal with Alexa546's signal (co-localization with the endosome of the SAMiRNA-FITC nanoparticle), and also the FITC signal. It was confirmed that is located in the cytoplasm inside the cell. Images obtained through confocal microscopy were analyzed and edited with the ZEN 2009 light edition (Carl Zeiss) software.
  • the amine-Mono-HEG-SAMiRNA containing the amine group appeared as a small spot, which was initially shown as a large spot over time after treatment than the Mono-HEG-SAMiRNA, and was present more in the cytoplasm. It was confirmed that [FIG. 20].

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Abstract

본 발명은 뎅기 바이러스 특이적 siRNA 및 이를 포함하는 고효율 이중나선 올리고 RNA 구조체에 관한 것으로, 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체는 세포 내로 효율적으로 전달되도록 하기 위하여 이중나선 RNA(siRNA)의 양 말단에 친수성 물질 및 소수성 물질을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합을 이용하여 접합된 형태의 구조를 가지며, 수용액에서 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체들의 소수성 상호작용에 의해 나노입자 형태로 전환될 수 있다. 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체에 포함된 siRNA는 모든 뎅기 바이러스의 혈청형에 특이적으로 작용하는 특성을 가진다. 또한 본 발명은 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조방법 및 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 뎅기 바이러스 감염을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

뎅기 바이러스 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이를 포함하는 뎅기 바이러스 증식 억제용 조성물
본 발명은 뎅기 바이러스 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이를 포함하는 뎅기 바이러스 증식 억제용 조성물에 관한 것으로, 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체는 세포 내로 효율적으로 전달되도록 하기 위하여 이중나선 RNA(siRNA)의 양 말단에 친수성 물질 및 소수성 물질을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합을 이용하여 접합된 형태의 구조를 가지며, 수용액에서 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체들의 소수성 상호작용에 의해 나노입자 형태로 전환될 수 있다. 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체에 포함된 siRNA는 뎅기 바이러스에 특이적인 siRNA인 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조방법 및 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 뎅기 바이러스 증식 억제 및 뎅기 바이러스 감염을 예방 및 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
뎅기 바이러스(Dengue virus)는 단일 가닥(single strand) RNA와 직경 30㎚ 크기의 단일 외피를 갖으며, positive polarity를 나타내는 플라비비리대(Flaviviridae) 과에 속하는 바이러스로, 전 세계에서 가장 많은 감염자가 발생하는 질병의 하나이다. 뎅기열은 매개 모기 또는 감염자에 의해 전염되며, 근육통, 관절통을 동반한 고열과 발진이 일어나는 것이 증세이며 경우에 따라 출혈이 일어나기도 하는데, 뎅기 출혈열(dengue hemorrhagic fever)을 동반하는 경우 사람이 목숨을 잃을 위험이 크게 높아진다. 또한 감염된 뎅기 바이러스형에 대해서는 평생 면역이 생기지만, 다른 바이러스형에 대해서는 방어되지 않기 때문에 유행 지역에 사는 사람들의 경우 일생 동안 4가지 형태의 뎅기 바이러스 감염이 모두 일어날 수 있다.
세계보건기구는 전 세계에서 매년 5천만 명 이상의 감염자와 1백만명 이상의 환자가 발생하는 것으로 추산하고 있어, 핵심 공중 보건 문제 중 하나로 여겨지고 있으나 아직까지 예방백신은 없는 실정이다. 동남아시아는 지역적으로 뎅기열의 최대 유행지역이며 여러 혈청형의 뎅기 바이러스에 의한 재감염이 쉽게 이루어지는데 2차 감염시에는 뎅기출혈열(Dengue hemorrhagic fever, DHF)과 뎅기쇼크증후군(Dengue shock syndrome, DSS) 등이 주요 사망원인이 되고 있다(Qiu FX et al., Bull World Health Organ, 71:349-359, 1993; Tassniyom S et al., Pediatrics, 92:111-115, 1993). 국내의 경우 현재까지 뎅기열이 직접 발생한 사례는 없지만 유행지역과의 교역의 확대 및 해외여행, 해외거주 등으로 인하여 앞으로 한국인의 뎅기 바이러스 감염자는 증가할 것으로 예상된다. 또한 오지여행과 같은 여행행태의 변화, 유행지역에 대한 반복 방문 등 개인의 감염기회 증가는 뎅기 바이러스 재감염의 가능성을 증가시키며 2차 감염에 의한 DHF나 DSS의 발생 위험도 증가 시킬 수 있다. 실제로 국립보건연구원에서는 2001-2003년 6월까지 해외여행에서 귀국하여 뎅기열 의심증상을 보이는 99명에 대한 혈청학적시험을 실시하여 33명의 뎅기 바이러스 항체 양성자를 확인하였다.
뎅기 바이러스는 4개의 혈청형(serotype)을 나타내며, 약 11 kb가량의 게놈 크기(genome size)를 가진다. 뎅기 바이러스 게놈은 하나의 폴리프로테인(single polyprotein)으로 번역(translation)되며 이후 숙주 혹은 바이러스 내재 프로테아제(protease)에 의해 절단(cleavage)되면서 기능성 단백질(functional protein)로 나뉘어진다.
기존의 백신 전략으로는 유사한 4개의 혈청형에 대해 범용적인 다가백신으로서 효과적인 보호(protection)를 유도하지 않아 뎅기 바이러스의 증식 억제에 큰 어려움이 있었다. 하지만 바이러스 게놈(viral genome)에 대한 유전공학적인 접근으로 4개의 혈청형 모두에 효과적인 백신에 대한 연구가 진행 중이며 현재 특정 다국적 제약 회사를 통해 최종 임상이 진행 중이다. 그러나 일반적으로 1차 감염(primary infection)의 경우는 치명적이지 않으나 서로 다른 혈청형에 의한 이차감염이 일어나게 되면 기존에 형성된 항체에 의해 효과적인 보호(protection)가 진행되지 않고 오히려 ADCC(Antibody Depentent Cell Cytotoxicity)에 의한 바이러스 감염을 증가시켜 생명에 큰 위협을 가할 수 있으며, 현재까지는 이러한 환자에 대해 사이토카인(cytokine)을 처방하는 수준의 일차적인 접근 밖에 하지 못하고 있다. 한편, 유전자의 발현을 억제하는 기술은 질병치료를 위한 치료제 개발 및 표적 검증에서 중요한 도구이다. 이 기술 중, 간섭 RNA(RNA interference, 이하 ‘RNAi’라고 한다)는 그 역할이 발견된 이후로, 다양한 종류의 포유동물 세포(mammalian cell)에서 서열 특이적 mRNA에 작용한다는 사실이 밝혀졌다 (Silence of the transcripts: RNA interference in medicine. J Mol Med (2005) 83: 764-773). 긴 사슬의 RNA 이중가닥이 세포로 전달되면, 전달된 RNA 이중가닥은 Dicer라는 엔도뉴클라아제(endonuclease)에 의하여 21 내지 23개의 이중가닥(base pair, bp)으로 프로세싱된 짧은 간섭 RNA (small interfering RNA, 이하 ‘siRNA’라고 한다)로 변환되며, siRNA는 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합하여 가이드(안티센스) 가닥이 타겟 mRNA를 인식하여 분해하는 과정을 통해 타겟 유전자의 발현을 서열 특이적으로 저해한다 (NUCLEIC-ACID THERAPEUTICS: BASIC PRINCIPLES AND RECENT APPLICATIONS. Nature Reviews Drug Discovery. 2002. 1, 503-514).
베르트랑(Bertrand) 연구진에 따르면 동일한 타겟 유전자에 대한 siRNA 가 안티센스 올리고뉴클레오티드(Antisense oligonucleotide, ASO)에 비하여 생체 내/외(in vivo 및 in vitro)에서 mRNA 발현의 저해효과가 뛰어나고, 해당 효과가 오랫동안 지속되는 효과를 가지는 것으로 밝혀졌다(Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem. Biophys. Res.Commun. 2002. 296: 1000-1004). 또한 siRNA의 작용 기작은 타겟 mRNA와 상보적으로 결합하여 서열 특이적으로 타겟 유전자의 발현을 조절하기 때문에, 기존의 항체 기반 의약품이나 화학물질 의약품(small molecule drug)에 비하여 적용할 수 있는 대상이 획기적으로 확대될 수 있다는 장점을 가진다(Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECΜLAR THERAPY. 2006 13(4):664-670).
siRNA의 뛰어난 효과 및 다양한 사용범위에도 불구하고, siRNA가 치료제로 개발되기 위해서는 체내에서의 siRNA의 안정성(stability) 개선과 세포 전달 효율 개선을 통해 siRNA가 타겟 세포에 효과적으로 전달되어야 한다(Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development. Drug Discov Today. 2006 Jan; 11(1-2):67-73).
상기 문제를 해결하기 위하여, 체내 안정성 개선을 위하여 siRNA의 일부 뉴클레오티드 또는 골격(boackbone)을 핵산분해효소 저항성을 가지도록 변형(modification)하거나 바이러스성 벡터(viral vector), 리포좀 또는 나노입자(nanoparticle) 등의 전달체의 이용 등에 대한 연구가 활발하게 시도되고 있다.
아데노바이러스나 레트로바이러스 등의 바이러스성 벡터를 이용한 전달 시스템은 형질주입 효율(transfection efficacy)이 높지만, 면역원성(immunogenicity) 및 발암성(oncogenicity)이 높다. 반면에 나노입자를 포함하는 비바이러스성(non-viral) 전달 시스템은 바이러스성 전달 시스템에 비하여 세포전달효율은 낮은 편이지만, 생체 내(in vivo)에서의 안정성(stability)이 높고, 타겟 특이적으로 전달이 가능하며, 내포되어 있는 RNAi 올리고뉴클레오타이드를 세포 또는 조직으로 흡수(uptake) 및 내재화(internalization) 등의 개선된 전달 효과가 높을 뿐 아니라, 세포독성 및 면역 유발(immune stimulation)이 거의 없어서 안전성이 높다는 장점을 가지고 있어, 현재는 바이러스성 전달 시스템에 비해 유력한 전달방법으로 평가되어지고 있다 (Nonviral delivery of synthetic siRNA s in vivo. J Clin Invest. 2007 December 3; 117(12): 3623-3632).
상기 비바이러스성 전달 시스템 중에서 나노전달체(nanocarrier)를 이용하는 방법은 리포좀, 양이온 고분자 복합체 등의 다양한 고분자를 사용함으로써 나노입자를 형성하고, siRNA를 이러한 나노입자(nanoparticle), 즉 나노전달체(nanocarrier)에 담지하여 세포에 전달하는 형태를 가진다. 나노전달체를 이용하는 방법 중 주로 활용되는 방법은 고분자 나노입자(polymeric nanoparticle), 고분자 미셀(polymer micelle), 리포플렉스(lipoplex) 등이 있는데, 이 중에서 리포플렉스를 이용한 방법은 양이온성 지질로 구성되어 세포의 엔도좀(endosome)의 음이온성 지질과 상호작용하여 엔도좀의 탈 안정화 효과를 유발하여 세포 내로 전달하는 역할을 한다(Proc. Natl. Acad. Sci. 15; 93(21):11493-8, 1996).
또한, siRNA 패신저(passenger; 센스(sense)) 가닥의 말단 부위에 화학물질 등을 연결하여 증진된 약동력학(pharmacokinetics)적 특징을 갖도록 하여 생체 내(in vivo)에서 높은 효율을 유도할 수 있다는 것이 알려져 있다(Nature 11; 432(7014):173-8, 2004). 이 때 siRNA 센스(sense; 패신저(passenger)) 또는 안티센스(antisence; 가이드(guide)) 가닥의 말단에 결합된 화학 물질의 성질에 따라 siRNA 의 안정성이 달라진다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 같은 고분자 화합물이 접합된 형태의 siRNA는 양이온성 물질이 존재하는 조건에서 siRNA의 음이온성 인산기와 상호작용하여 복합체를 형성함으로써, 개선된 siRNA 안정성을 가진 전달체가 된다(J Control Release 129(2):107-16, 2008). 특히 고분자 복합체로 구성된 미셀(micelle)들은 약물 전달 운반체로 쓰이는 다른 시스템인, 미소구체(microsphere) 또는 나노입자(nanoparticle) 등에 비해 그 크기가 극히 작으면서도 분포가 매우 일정하고, 자발적으로 형성되는 구조이므로 제제의 품질 관리 및 재현성 확보가 용이하다는 장점이 있다.
또한, siRNA 의 세포 내 전달 효율성을 향상시키기 위해, siRNA에 생체 적합성 고분자인 친수성 물질(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG))을 단순 공유결합 또는 링커-매개(linker-mediated) 공유결합으로 접합시킨 siRNA 접합체를 통해, siRNA 의 안정성 확보 및 효율적인 세포막 투과성을 위한 기술이 개발되었다(대한민국 등록특허 제883471호). 하지만 siRNA의 화학적 변형 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)을 접합시키는 것(PEGylation)만으로는 생체 내에서의 낮은 안정성과 타깃 장기로의 전달이 원활하지 못하다는 단점은 여전히 가진다. 이러한 단점을 해결하기 위하여 올리고뉴클레오티드, 특히 siRNA와 같은 이중나선 올리고 RNA에 친수성 및 소수성 물질이 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체가 개발되었는데, 상기 구조체는 소수성 물질의 소수성 상호작용에 의하여 SAMiRNA™ (Self Assembled Micelle Inhibitory RNA) 라고 명명된 자가조립 나노입자를 형성하게 되는데(대한민국 등록 특허 제1224828호 참조), SAMiRNA™ 기술은 기존의 전달기술들에 비해 매우 사이즈가 작으면서도 균일한(homogenous) 나노입자를 수득할 수 있다는 장점을 가진다.
SAMiRNA™ 기술의 구체적인 예로서, 친수성 물질로서 PEG(polyethylene glycol)가 사용되는데, PEG는 합성폴리머(synthetic polymer)로 흔히 의약품 특히 단백질의 수용성(solubility) 증가 및 약물동태학(pharmacokinetics)의 조절을 위해 사용된다. PEG는 다분산계(polydisperse) 물질로, 한 배치(batch)의 폴리머는 다른 개수의 단량체(monomer)의 총 합으로 이루어져 분자량이 가우스곡선 형태를 나타내며, 다분산지수(polydisperse value, Mw/Mn)로 물질의 동질성 정도를 표현한다. 즉, PEG가 낮은 분자량(3~5kDa)일 때 약 1.01의 다분산지수를 나타내며 높은 분자량(20 kDa)일 때 약 1.2라는 높은 다분산지수를 나타내어, 높은 분자량일수록 물질의 동질성이 상대적으로 낮은 특징을 보인다 (F.M. Veronese. Peptide and protein PEGylation: a review of problems and solutions. Biomaterials (2001) 22:405-417). 따라서, PEG를 의약품에 결합시킨 경우 접합체에 PEG의 다분산적 특징이 반영되어 단일물질의 검증이 쉽지 않다는 단점이 있어 PEG의 합성 및 정제과정의 개선을 통해 낮은 다분산지수를 가지는 물질을 생산하는 추세이지만, 특히 분자량이 작은 물질에 PEG를 결합시킨 경우 결합이 용이하게 이루어졌는지 확인이 용이하지 않은 불편한 점이 있는 등 물질의 다분산성 특징에 따른 문제점들이 존재한다 (Francesco M. Veronese and Gianfranco Pasut. PEGylation, successful approach to drug delivery. DRUG DISCOVERY TODAY(2005) 10(21):1451-1458).
이에 따라 최근에는 기존 자가조립 나노입자인 SAMiRNA™ 기술의 개량된 형태로, SAMiRNATM 를 구성하는 이중나선 RNA 구조체의 친수성 물질을 일정한 분자량을 갖는 균일한 1~15개의 단량체(monomer)와 필요에 따라 링커(linker)를 포함하는 기본단위를 블록(block)화 하여, 이를 필요에 따라 적절한 개수를 사용함으로써, 기존의 SAMiRNA™에 비해 보다 작은 크기를 가지며 또한 다분산성이 획기적으로 개선된 새로운 형태의 전달체 기술이 개발되었다.
이상 살핀 바와 같이, 뎅기 바이러스의 대부분의 혈청형에 대한 우수한 치료효과를 가지는 치료제는 현재 존재하지 않으며, 기존의 백신 치료법은 한계를 가지고 있어 새로운 형태의 치료제의 개발이 절실한 상황이다. RNAi 기술에 기반한 뎅기 바이러스 감염 치료제가 그 대안이 될 가능성은 있지만, 아직 RNAi 기술에 기반한 효과적인 치료제, 특히 모든 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 치료효과를 갖는 치료제에 대한 개발은 이루어지지 않고 있는 상황이다.
발명의 내용
해결하고자 하는 과제
상기와 같은 문제점을 해결하고자 예의 노력한 결과, 본 발명자들은 뎅기 바이러스의 보존 서열로부터 도출된 siRNA 후보군이 모든 뎅기 바이러스 혈청형의 증식을 뛰어난 효율로 억제하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
이에 따라 본 발명의 목적은 혈청형 1, 2, 3 및 4의 뎅기 바이러스에 특이적이면서 매우 높은 효율로 그 발현을 저해할 수 있는 신규 siRNA 및 이를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체, 그리고 그러한 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 뎅기 바이러스 특이적인 siRNA 또는 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체를 유효성분으로 포함하는 뎅기 바이러스 증식 억제 및/또는, 궁극적으로 뎅기 바이러스 감염을 예방 및 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 뎅기 바이러스 특이적인 siRNA 또는 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체를 이용하여 뎅기 바이러스의 증식 방법 및/또는, 궁극적으로 뎅기 바이러스 감염을 예방 및 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
과제의 해결 수단
본 발명에서는 서열번호 1 내지 서열번호 88번에서 선택된 어느 하나의 서열을 가지는 센스가닥(sense strand)인 제1 올리고뉴클레오티드와 그에 상보적 서열을 갖는 안티센스 가닥인 제2 올리고뉴클레오티드로 이루어진 뎅기 바이러스 특이적 siRNA를 제공한다.
본 발명에서의 siRNA는 일반적인 RNAi(RNA interference) 작용을 가지는 모든 물질을 포함하는 개념으로, 상기 뎅기 바이러스 특이적 siRNA에는 뎅기 바이러스 특이적 shRNA 등도 포함되는 것임은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.
상기 서열번호 1 내지 서열번호 88번은 뎅기 바이러스에 특이적인 siRNA의 센스가닥 서열로, 모든 뎅기 바이러스 혈청형에 존재하는 보존적 영역을 타겟으로 하고 있어, 혈청형과 무관하게 모든 뎅기 바이러스의 증식을 억제하여 궁극적으로 뎅기 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료효과를 나타내는 특성을 가진다.
본 발명에 따른 siRNA는 바람직하게는 서열변호 4 내지 8, 13, 16, 20, 22, 23, 29, 32, 34, 39 내지 42, 44 내지 47, 51, 52, 70 내지 72, 76, 77 및 80 내지 82번 중 어느 하나에 따른 뎅기 바이러스 특이적인 siRNA의 센스가닥을 포함하며,
더욱 바람직하게는 서열번호 4, 16, 22, 51, 52, 71 및 82번 중 어느 하나에 따른 뎅기 바이러스 특이적인 siRNA의 센스가닥을 포함하고,
가장 바람직하게는 서열번호 51, 52, 71 및 82번 중 어느 하나에 따른 뎅기 바이러스 특이적인 siRNA의 센스가닥을 포함한다.
본 발명에 따른 siRNA의 센스가닥 또는 안티센스 가닥은 19 내지 31개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 것이 바람직하며, 상기 서열번호 1 내지 서열번호 88번에서 선택된 어느 하나의 siRNA의 센스가닥 및 이에 상보적인 안티센스 가닥을 포함한다.
본 발명에 따른 siRNA의 센스가닥 또는 안티센스 가닥은 혈청형 1, 2, 3 및 4 뎅기 바이러스의 서열에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 뎅기 바이러스 특이적 siRNA인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 제공되는 뎅기 바이러스 특이적 siRNA는 해당 유전자를 암호화하는 mRNA와 상보적으로 결합할 수 있도록 설계된 염기서열을 가지므로, 해당 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 것이 특징이다. 또한, 상기 siRNA 의 3’ 말단에 하나 또는 두 개 이상의 비결합(unpaired)된 뉴클레오티드를 갖는 구조인 오버행(overhang)을 포함할 수 있으며,
또한, 상기 siRNA 의 생체 내 안정성 향상을 위해, 핵산 분해효소 저항성 부여 및 비 특이적 면역반응 감소를 위한 다양한 변형(modification)을 포함할 수 있다. 상기 siRNA 를 구성하는 제1 또는 제2 올리고뉴클레오티드의 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2´ 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸), -OCH3(methoxy), -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형; 뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 또는 뉴클레오티드결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphophate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형에서 선택된 하나 이상의 변형이 조합되어 사용될 수 있으며, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형도 사용이 가능하다(Ann. Rev. Med. 55, 61-65 2004; US 5,660,985; US 5,958,691; US 6,531,584; US 5,808,023; US 6,326,358; US 6,175,001; Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:1139-1143, 2003; RNA, 9:1034-1048, 2003; Nucleic Acid Res. 31:589-595, 2003; Nucleic Acids Research, 38(17) 5761-5773, 2010; Nucleic Acids Research, 39(5) 1823-1832, 2011).
본 발명에서 제공되는 뎅기 바이러스 특이적 siRNA는 해당 유전자의 발현을 저하시킬 뿐만 아니라, 해당 단백질의 발현을 현저하게 저해 시켜서 결국 세포배양액에 자손바이러스(progeny)가 배출되는 것을 억제한다.
본 발명의 다른 양태로서, 뎅기 바이러스 특이적 siRNA의 생체 내로의 효율적인 전달 및 안정성 향상을 위하여 siRNA의 양 말단에 친수성 물질 및 소수성 물질이 접합된 형태의 접합체를 제공한다.
상기와 같이 siRNA에 친수성 물질 및 소수성 물질이 결합된 siRNA 접합체의 경우 소수성 물질의 소수성 상호작용에 의하여 자기조립 나노입자를 형성하게 되는데(대한민국 특허 등록번호 제 1224828 호 참조), 이러한 접합체는 체내로의 전달효율 및 체내에서의 안정성이 극히 우수할 뿐 아니라, 입자 크기가 균일성이 우수하여 QC(Quality control)이 용이하므로 약물로서의 제조 공정이 간단하다는 장점이 있다.
하나의 바람직한 구체예로서, 본 발명에 따른 뎅기 바이러스 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체는 하기 구조식 (1)과 같은 구조를 가지는 것이 바람직하다.
구조식 1
Figure PCTKR2014006032-appb-I000001
상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 뎅기 바이러스 특이적 siRNA를 나타낸다.
보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 뎅기 바이러스 특이적 siRNA 를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체는 하기 구조식 (2)의 구조를 가진다.
구조식 2
Figure PCTKR2014006032-appb-I000002
상기 구조식 (2)에서 A, B, X 및 Y는 상기 구조식 (1)에서의 정의와 동일하며, S는 뎅기 바이러스 특이적 siRNA의 센스가닥, AS는 뎅기 바이러스 특이적 siRNA의 안티센스 가닥을 의미한다.
보다 바람직하게는 뎅기 바이러스 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체는 하기 구조식 (3) 또는 (4)의 구조를 가진다.
구조식 3
Figure PCTKR2014006032-appb-I000003
구조식 4
Figure PCTKR2014006032-appb-I000004
상기 구조식 (3) 및 구조식 (4)에서 A, B, S, AS, X 및 Y는 상기 구조식 (1)에서의 정의와 동일하며, 5’ 및 3’ 은 뎅기 바이러스 특이적 siRNA 센스가닥의 5’ 말단 및 3’ 말단을 의미한다.
상기 구조식 (1) 내지 구조식 (4)에서의 뎅기 바이러스 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체의 안티센스 가닥의 5´ 말단에 인산기(phosphate group)가 한 개 내지 세 개 결합될 수 있으며, siRNA 대신에 shRNA가 사용될 수도 있음은 본 발명의 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.
상기 구조식 (1) 내지 구조식 (4)에서의 친수성 물질은 분자량이 200 내지 10,000 인 양이온성 또는 비이온성 고분자 물질인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1,000 내지 2,000인 비이온성 고분자 물질이다. 예를 들어, 친수성 고분자 화합물로는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리옥사졸린 등의 비이온성친수성 고분자 화합물을 사용하는 것이 바람직하지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
특히, 구조식 (1) 내지 구조식 (4)에서의 친수성 물질(A)은 하기 구조식 (5) 또는 구조식 (6)과 같은 형태의 친수성 물질 블록(block) 형태로 이용될 수 있는데, 이러한 친수성 물질 블록을 필요에 따라 적절한 개수(구조식 (5) 또는 구조식 (6)에서의 n)를 사용함으로써, 일반 합성 고분자 물질 등을 사용하는 경우에 발생할 수 있는 다분산성으로 인한 문제점을 크게 개선할 수 있다.
구조식 5
Figure PCTKR2014006032-appb-I000005
구조식 6
Figure PCTKR2014006032-appb-I000006
상기 구조식 (5) 및 구조식 (6)에서 A’은 친수성 물질 단량체(monomer)를, J는 m개의 친수성 물질 단량체 간 또는 m개의 친수성 물질 단량체와 siRNA를 서로 연결하는 링커, m은 1 내지 15의 정수, n은 1 내지 10의 정수를 의미하며, (A’m-J) 또는 (J-A'm)로 표시되는 반복단위가 친수성 물질 블록의 기본단위에 해당된다.
상기 구조식 (5) 또는 구조식 (6)과 같은 친수성 물질 블록을 가질 경우, 본 발명에 따른 뎅기 바이러스 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체는 하기 구조식 (7) 또는 구조식 (8)과 같은 구조를 가질 수 있다.
구조식 7
Figure PCTKR2014006032-appb-I000007
구조식 8
Figure PCTKR2014006032-appb-I000008
상기 구조식 (7) 및 구조식 (8)에서, X, R, Y 및 B는 구조식 (1)에서의 정의와 동일하고, A’, J, m 및 n은 구조식 (5) 및 구조식 (6)에서의 정의와 동일하다.
상기 구조식 (5) 내지 구조식 (8)에서 친수성 물질 단량체(A’)는 비이온성 친수성 고분자의 단량체 중에서 본 발명의 목적에 부합하는 것이라면 제한없이 사용이 가능하며, 바람직하게는 표 1에 기재된 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에서 선택된 단량체, 더욱 바람직하게는 화합물(1)의 단량체가 사용될 수 있으며, 화합물 (1)에서 G는 바람직하게는 CH2, O, S 및 NH에서 선택될 수 있다.
특히, 친수성 물질 단량체 중에서도 특히 화합물 (1)로 표시되는 단량체는 다양한 기능기를 도입할 수 있으며, 생체 내 친화성이 좋고 면역반응을 적게 유도하는 등 생체 적합성(bio-compatibility)이 우수할 뿐 아니라, 구조식 (7) 또는 구조식 (8)에 따른 구조체 내에 포함된 siRNA의 생체 내 안정성을 증가시키고, 전달 효율을 증가시킬 수 있다는 장점을 가지고 있어 본 발명에 따른 구조체의 제조에 매우 적합하다.
표 1
Figure PCTKR2014006032-appb-T000001
구조식 (5) 내지 구조식 (8)에서의 친수성 물질(친수성 물질 블록)은 총 분자량이 1,000 내지 2,000에 범위 내인 것이 바람직하다. 따라서, 예를 들어, 구조식 (7) 및 구조식 (8)에서 화합물 (1)에 따른 헥사에틸렌 글리콜(Hexaethylene glycol), 즉 G가 O이고, m이 6인 물질이 사용되는 경우 헥사에틸렌글리콜 스페이서(spacer)의 분자량이 344이므로, 반복 횟수(n)는 3 내지 5인 것이 바람직하다.
특히, 본 발명은 필요에 따라 상기 구조식 (5) 및 구조식 (6)에서 (A’m-J)또는 (J-A’m)n으로 표시되는 친수성 그룹의 반복단위, 즉 친수성 물질 블록(block)이 n으로 표시되는 적절한 개수로 사용될 수 있음을 특징으로 한다. 상기 각 친수성 물질 블록 내에 포함되는 친수성 물질 단량체인 A’와 링커인 J는 독립적으로 각 친수성 물질 블록간에 동일할 수도 있고, 상이할 수도 있다. 즉, 친수성 물질 블록이 3개 사용될 경우(n=3), 첫 번째 블록에는 화합물 (1)에 따른 친수성 물질 단량체가, 두 번째 블록에는 화합물 (2)에 따른 친수성 물질 단량체가, 세 번째 블록에는 화합물 (3)에 따른 친수성 물질 단량체가 사용되는 등, 모든 친수성 물질 블록별로 다른 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있고, 모든 친수성 물질 블록에 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에 따른 친수성 물질 단량체에서 선택된 어느 하나의 친수성 물질 단량체가 동일하게 사용될 수도 있다. 마찬가지로, 친수성 물질 단량체의 결합을 매개하는 링커 역시 각 친수성 물질 블록별로 모두 동일한 링커가 사용될 수도 있고, 각 친수성 물질 블록별로 상이한 링커가 사용될 수도 있다. 또한, 친수성 물질 단량체의 개수인 m 역시 각 친수성 물질 블록간에 동일할 수도 있고, 상이할 수도 있다. 즉, 첫 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 3개 연결(m=3)되고, 두 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 5개(m=5), 세 번째 친수성 물질 블록에서는 친수성 물질 단량체가 4개 연결(m=4)되는 등, 서로 다른 개수의 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있고, 모든 친수성 물질 블록에서 동일한 개수의 친수성 물질 단량체가 사용될 수도 있다.
또한, 본 발명에서 상기 링커(J)는 PO3 -, SO3 및 CO2로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 사용되는 친수성 물질의 단량체 등에 따라 본 발명의 목적에 부합하는 한 어떠한 링커라도 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
상기 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8)에서의 소수성 물질(B)은 소수성 상호작용을 통해 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8)에 따른 올리고뉴클레오티드 구조체로 구성된 나노입자를 형성하는 역할을 수행한다. 상기 소수성 물질은 분자량이 250 내지 1,000인 것이 바람직하며, 스테로이드(steroid) 유도체, 글리세라이드(glyceride) 유도체, 글리세롤 에테르(glycerol ether), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), C12 내지 C50의 불포화 또는 포화 탄화수소(hydrocarbon), 디아실포스파티딜콜린 (diacylphosphatidylcholine), 지방산(fatty acid), 인지질(phospholipid), 리포폴리아민(lipopolyamine) 등이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 목적에 부합하는 것이라면 어떠한 소수성 물질도 사용 가능하다는 점은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.
상기 스테로이드(steroid) 유도체는 콜레스테롤, 콜리스탄올, 콜산, 콜리스테릴포르메이트, 코테스타닐모르메이트 및 콜리스타닐아민으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 글리세라이드 유도체는 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드 등에서 선택될 수 있는데 이때, 글리세라이드의 지방산은 C12 내지 C50의 불포화 또는 포화 지방산이 바람직하다.
특히, 상기 소수성 물질 중에서도 포화 또는 불포화 탄화수소나 콜레스테롤이 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 구조체의 합성 단계에서 용이하게 결합시킬 수 있는 장점을 가지고 있다는 점에서 바람직하며, C24 탄화수소, 특히 disulfide bond를 포함하는 테트라도코산(tetradocosane)이 가장 바람직하다.
상기 소수성 물질은 친수성 물질의 반대쪽 말단(distal end)에 결합되며, 이중가닥 올리고의 센스가닥 또는 안티센스 가닥의 어느 위치에 결합되어도 무방하다.
본 발명에 따른 구조식 (1) 내지 구조식 (4) 구조식 (7) 및 구조식 (8)에서의 친수성 물질 또는 소수성 물질과 뎅기 바이러스 특이적 siRNA는 단순 공유 결합 또는 링커가 매개된 공유결합(X 또는 Y)에 의해 결합된다. 상기 공유결합을 매개하는 링커는 친수성 물질, 또는 소수성 물질과 뎅기 바이러스 특이적 siRNA의 말단에서 공유결합하며, 필요에 따라 특정 환경에서 분해가 가능한 결합을 제공하는 한 특별히 한정되는 것은 아니다. 따라서, 상기 링커는 본 발명에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조과정 중 뎅기 바이러스 특이적 siRNA 및/또는 친수성 물질(또는 소수성 물질)을 활성화하기 위해 결합시키는 어떠한 화합물도 사용될 수 있다. 상기 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합 중 어느 것이어도 무방하다. 이때, 비분해성 결합으로는 아미드 결합 또는 인산화 결합이 있고, 분해성 결합으로는 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8)에서의 R(또는 S 및 AS)로 표시되는 siRNA는 뎅기 바이러스 특이적으로 결합할 수 있는 특성을 지니는 siRNA라면 모두 제한없이 사용가능하며, 바람직하게는 본 발명에서는 서열번호 1 내지 서열번호 88에서 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 센스가닥(sense strand)과 그에 상보적 서열을 갖는 안티센스 가닥으로 구성된다.
본 발명에 따른 siRNA는 바람직하게는 서열변호 4 내지 8, 13, 16, 20, 22, 23, 29, 32, 34, 39 내지 42, 44 내지 47, 51, 52, 70 내지 72, 76, 77 및 80 내지 82번 중 어느 하나에 따른 뎅기 바이러스 특이적인 siRNA의 센스가닥을 포함하며,
더욱 바람직하게는 서열번호 서열번호 4, 16, 22, 51, 52, 71, 및 82번 중 어느 하나에 따른 뎅기 바이러스 특이적인 siRNA의 센스가닥을 포함하고,
가장 바람직하게는 서열번호 51, 52, 71 및 82번 중 어느 하나에 따른 뎅기 바이러스 특이적인 siRNA의 센스가닥을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 뎅기 바이러스 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체에 있어서, 상기 구조체 내의 친수성 물질의 siRNA와 결합된 반대편 말단 부위에 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 추가적으로 도입될 수 있다.
이는 본 발명에 따른 뎅기 바이러스 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 전달체의 세포내 도입과 엔도좀 탈출을 용이하게 하기 위한 것으로, 이미 Quantum dot, Dendrimer, liposome 등의 전달체의 세포내 도입과 엔도좀 탈출을 용이하게 하기 위해서 아민 그룹의 도입과 폴리히스티딘 그룹이 이용될 수 있다는 점 및 그 효과가 보고된 바 있다.
구체적으로 전달체의 말단 혹은 바깥쪽에 수식된 일차 아민기는 생체 내 pH에서 양성자화 되면서 음전하를 띠는 유전자와 정전기적 상호작용에 의해 결합체를 형성하며, 세포내 유입 후에 엔도좀의 낮은 pH에서 완충 효과를 갖는 내부 삼차 아민으로 인해 엔도좀의 탈출이 용이해 짐에 따라 라이소좀의 분해로부터 전달체를 보호할 수 있다고 알려져 있고(고분자 기반 하이브리드 물질을 이용한 유전자 전달 및 발현 억제. Polymer Sci. Technol., Vol. 23, No.3, pp254-259),
비필수 아미노산의 하나인 히스티딘은 잔기(-R)에 이미다졸링(pKa3 6.04)을 가지므로 엔도좀과 라이소좀에서 완충능력(buffering capacity)을 증가시키는 효과가 있어, 리포좀을 비롯한 비바이러스성 유전자전달체(non-viral gene carrier)들에서 엔도좀 탈출효율을 높이기 위해서 히스티딘 수식을 이용할 수 있다는 점이 알려져 있다 (Novel histidine-conjugated galactosylated cationic liposomes for efficient hepatocyte selective gene transfer in human hepatoma HepG2 cells. J. Controlled Release 118, pp262-270).
상기 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹은 하나 이상의 링커를 통해 친수성 물질 또는 친수성 블록과 연결될 수 있다.
본 발명의 구조식 (1)에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체의 친수성 물질에 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 도입되는 경우에는 구조식 (9)과 같은 구조를 가질 수 있다.
구조식 9
P-J1-J2-A-X-R-Y-B
상기 구조식 (9)에서 A, B, R, X 는 Y 구조식 (1)에서의 정의와 동일하고,
P는 아민기 또는 폴리히스티딘 그룹을 의미하며, J1과 J2는 링커로서, 독립적으로 단순 공유결합, PO3 -, SO3, CO2, C2-12의 알킬, 알케닐, 알키닐에서 선택될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며, 사용되는 친수성 물질에 따라 본 발명의 목적에 부합하는 J1과 J2는 어떠한 링커라도 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다.
바람직하게는 아민기가 도입된 경우에는, J2는 단순 공유결합 또는 PO3 -, J1은 C6 알킬인 것이 바람직하지만, 이에 한정되지는 않는다.
또한, 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 도입된 경우에는 구조식 (9)에서는 J2는 단순 공유결합 또는 PO3 -, J1은 화합물 (4)가 바람직하지만, 이에 한정되지는 않는다.
화합물 (4)
Figure PCTKR2014006032-appb-I000009
또한, 구조식 (9)에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체의 친수성 물질이 구조식 (5) 또는 구조식 (6)에 따른 친수성 물질 블록이고, 이에 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 도입되는 경우에는 구조식 (10) 또는 구조식 (11)과 같은 구조를 가질 수 있다.
구조식 10
Figure PCTKR2014006032-appb-I000010
구조식 11
Figure PCTKR2014006032-appb-I000011
상기 구조식 (10) 및 구조식 (11)에서, X, R, Y, B, A’, J, m 및 n은 구조식 (5) 또는 구조식 (6)에서의 정의와 동일하며, P, J1 및 J2는 구조식 (9)에서의 정의와 동일하다.
특히, 상기 구조식 (10) 및 구조식 (11)에 있어서, 친수성 물질은 뎅기 바이러스 특이적 siRNA 센스가닥의 3’ 말단에 결합된 형태인 것이 바람직하며, 이 경우 상기 구조식 (9) 내지 구조식 (11)은 다음 구조식 (12) 내지 구조식 (14)의 형태를 가질 수 있다.
구조식 12
Figure PCTKR2014006032-appb-I000012
구조식 13
Figure PCTKR2014006032-appb-I000013
구조식 14
Figure PCTKR2014006032-appb-I000014
상기 구조식 (12) 내지 구조식 (14)에서 X, R, Y, B, A, A’ J, m, n. P, J1 및 J2는 상기 구조식 (9) 내지 구조식 (11)에서의 정의와 동일하며, 5’ 및 3’ 은 뎅기 바이러스 특이적 siRNA 센스가닥의 5’ 말단 및 3’ 말단을 의미한다.
본 발명에서 도입될 수 있는 아민기로는 1차 내지 3차 아민기가 사용될 수 있으며, 1차 아민기가 사용되는 것이 특히 바람직하다. 상기 도입된 아민기는 아민염으로 존재할 수도 있는데, 예를 들어 1차 아민기의 염은 NH3 + 의 형태로 존재할 수 있다.
또한, 본 발명에서 도입될 수 있는 폴리히스티딘 그룹은 3 내지 10개의 히스티딘을 포함하는 것이 바람직하며, 특히 바람직하게는 5 내지 8개, 가장 바람직하게는 6개의 히스티딘을 포함할 수 있다. 추가적으로 히스티딘 이외에 하나 이상의 시스테인이 포함될 수 있다.
나노입자를 사용한 능동적 타겟팅(active targeting)은 표적물질(targeting moiety)을 나노입자에 결합시키는 기술로, 나노입자를 타겟 조직에서의 축적을 증진(preferential accumulation)시키거나, 타겟 세포 안으로 나노입자가 전달되는 내재화(internalization)를 개선하는 것이 보고되었다 (Does a targeting ligand influence nanoparticle tumor localization or uptake Trends Biotechnol. 2008 Oct; 26(10):552-8. Epub 2008 Aug 21). 능동적 타겟팅은 타겟 세포 표면 특이적 또는 과 발현되어 있는 탄수화물(carbohydrate), 수용체(receptor), 항원 (antigen)과 결합할 수 있는 능력을 가진 물질(타겟팅 모이어티, targeting moiety)을 이용한다(Nanotechnology in cancer therapeutics: bioconjugated nanoparticles for drug delivery. Mol Cancer Ther 2006; 5(8): 1909-1917).
따라서 본 발명에 따른 뎅기 바이러스 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이로부터 형성된 나노입자에 타겟팅 모이어티가 구비된다면, 효율적으로 타겟 세포로의 전달을 촉진하여, 비교적 낮은 농도의 투여량으로도 타겟 세포로 전달되어 높은 타겟 유전자 발현 조절 기능을 나타낼 수 있으며, 타 장기 및 세포로의 비 특이적인 뎅기 바이러스 특이적 siRNA의 전달을 방지할 수 있다.
이에 따라 본 발명은 상기 구조식 (1) 내지 구조식 (4), 구조식 (7) 및 구조식 (8)에 따른 구조체에 리간드(L), 특히 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드(ligand)가 추가적으로 결합된 이중나선 올리고 RNA, 구조체를 제공하며, 예를 들어 구조식 (1)에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체에 리간드가 결합된 형태는 하기 구조식 (15)와 같은 구조를 가진다.
구조식 15
Figure PCTKR2014006032-appb-I000015
상기 구조식 (15)에서, A, B, X 및 Y는 상기 구조식 (1)에서의 정의와 동일하며, L은 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드, Z는 단순 공유결합 또는 친수성 물질 블록 내의 친수성 물질 단량체와 리간드의 결합을 매개하는 링커를 의미하며, i는 1 내지 5의 정수, 바람직하게는 1 내지 3의 정수이다.
상기 구조식 (15)에서의 리간드는 바람직하게는 타겟세포 특이적으로 세포내재화 (internalization)을 증진시키는 RME 특성을 가진 타겟 수용체 특이적 항체나 앱타머, 펩타이드; 또는 엽산(Folate, 일반적으로 folate와 folic acid는 서로 교차 사용되고 있으며, 본 발명에서의 엽산은 자연 상태 또는 인체에서 활성화 상태인 folate를 의미한다), N-아세틸 갈락토사민(N-acetyl Galactosamine, NAG) 등의 헥소아민(hexoamine), 포도당(glucose), 만노스(mannose)를 비롯한 당이나 탄수화물(carbohydrate) 등의 화학물질 등에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 구조식 (15)에서의 친수성 물질 A는 구조식 (5) 및 구조식 (6)에 따른 친수성 물질 블록의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 뎅기 바이러스 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 뎅기 바이러스 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 과정은 예를 들어,
(1) 고형지지체(solid support)를 기반으로 친수성 물질을 결합 시키는 단계;
(2) 상기 친수성 물질이 결합된 고형지지체를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;
(3) 상기 RNA 단일가닥 5´ 말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 단계;
(4) 상기 RNA 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;
(5) 합성이 완료되면 고형지지체로부터 RNA-고분자 구조체 및 RNA 단일 가닥을 분리 정제하는 단계;
(6) 제조된 RNA-고분자 구조체와 상보적인 서열의 RNA 단일가닥의 어닐링을 통해 이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 단계;
를 포함하여 이루어질 수 있다.
본 발명에서의 고형지지체(solid support)는 Controlled Pore Glass(CPG)가 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 폴리스티렌, 실리카겔, 셀룰로오스 페이퍼 등이 사용될 수 있다. CPG인 경우 직경은 40~180 ㎛인 것이 바람직하며, 500~3000Å의 공극 크기를 가지는 것이 바람직하다. 상기 단계 (5) 이후, 제조가 완료 되면 정제된 RNA-고분자 구조체 및 RNA 단일가닥은 MALDI-TOF 질량분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 RNA-고분자 구조체 및 RNA 단일가닥이 제조되었는지를 확인할 수 있다. 상기 제조방법에 있어서 (2) 단계에서 합성된 RNA 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 합성하는 단계 (4)는 (1) 단계 이전 또는 (1) 단계 내지 (5) 단계 중 어느 한 과정 중에 수행되어도 무방하다.
또한, (2) 단계에서 합성된 RNA 단일가닥과 상보적 서열을 포함하는 RNA 단일가닥은 5´ 말단에 인산기가 결합된 형태로 이용된 것을 특징으로 하는 제조방법도 될 수 있다.
한편, 본 발명의 뎅기 바이러스 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체에 추가적으로 리간드가 결합된 이중나선 올리고 RNA 구조체의 제조방법을 제공한다.
리간드가 결합된 뎅기 바이러스 특이적 siRNA를 포함하는 올리고 RNA 구조체를 제조하는 방법은 예를 들어,
(1) 기능기가 결합되어 있는 고형지지체에 친수성 물질을 결합시키는 단계;
(2) 기능기-친수성 물질이 결합되어있는 고형지지체를 기반으로 RNA 단일가닥을 합성하는 단계;
(3) 상기 RNA 단일가닥의 5´ 말단에 소수성 물질을 공유결합 시키는 과정으로 합성하는 단계;
(4) 상기 RNA 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 RNA 단일 가닥을 합성하는 단계;
(5) 합성이 완료되면 고형지지체로부터 기능기-RNA-고분자 구조체 및 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 분리하는 단계;
(6) 상기 기능기를 이용하여 친수성 물질 말단에 리간드를 결합하여 리간드-RNA-고분자 구조체 단일가닥을 제조하는 단계;
(7) 제조된 리간드-RNA-고분자 구조체와 상보적인 서열의 RNA 단일가닥의 어닐링을 통해 리간드-이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조하는 단계;
를 포함하여 이루어질 수 있다.
상기 (6) 단계 이후, 제조가 완료되면 리간드-RNA-고분자 구조체 및 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 분리 정제한 뒤 MALDI-TOF 질량 분석기로 분자량을 측정하여 목적하는 리간드-RNA-고분자 구조체 및 상보적인 RNA가 제조되었는지를 확인 할 수 있다. 제조된 리간드-RNA-고분자 구조체와 상보적인 서열의 RNA 단일가닥의 어닐링을 통해 리간드-이중나선 올리고 RNA 구조체를 제조할 수 있다. 상기 제조방법에 있어서 (3) 단계에서 합성된 RNA 단일가닥의 서열과 상보적인 서열의 RNA 단일가닥을 합성하는 단계 (4)는 독립적인 합성과정으로서 (1) 단계 이전 또는 (1) 단계 내지 (6) 단계 중 어느 한 과정 중에 수행되어도 무방하다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 뎅기 바이러스 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 나노입자를 제공한다.
이미 앞서 설명한 바와 같이 뎅기 바이러스 유전자 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체는 소수성 및 친수성 물질을 모두 포함하고 있는 양친매성이며, 친수성 부분은 체내에 존재하는 물 분자들과 수소결합 등의 상호작용을 통해 친화력을 가지고 있어 바깥쪽으로 향하게 되고, 소수성 물질들은 그들 간의 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)을 통해 안쪽으로 향하게 되어 열역학적으로 안정한 나노입자를 형성하게 된다. 즉, 나노입자의 중심에 소수성 물질이 위치하게 되고, 뎅기 바이러스 특이적 siRNA의 바깥쪽 방향에 친수성 물질이 위치하여 뎅기 바이러스 특이적 siRNA를 보호하는 형태의 나노입자를 형성한다. 이렇게 형성된 나노입자는 뎅기 바이러스 특이적 siRNA 의 세포 내 전달 향상 및 siRNA 효능을 향상시킨다.
본 발명에 따른 나노입자는 서로 다른 서열을 가지는 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체로 구성됨을 특징으로 하는데, 본 발명에서의 서로 다른 서열을 가지는 siRNA는 뎅기 바이러스의 다른 타겟 유전자 특이적인 siRNA일수도 있고, 동일한 타겟 유전자 특이성을 가지면서 그 서열이 다른 경우도 포함되어 해석된다.
또한, 뎅기 바이러스 특이적인 siRNA 이외에 다른 질환 치료를 위한 타겟 유전자 특이적인 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체가 본 발명에 따른 나노입자에 포함될 수도 있다.
또한, 본 발명은 또 다른 양태로서, 뎅기 바이러스 특이적 siRNA, 이를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및/또는 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자를 포함하는 뎅기 바이러스 증식 억제용 조성물 및 뎅기 바이러스 감염 예방 및/또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
특히, 본 발명에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 뎅기 바이러스 증식 억제용 조성물에는,
서열변호 4 내지 8, 13, 16, 20, 22, 23, 29, 32, 34, 39 내지 42, 44 내지 47, 51, 52, 70 내지 72, 76, 77 및 80 내지 82번에 따른 서열에서 선택된 어느 하나의 서열, 더욱 바람직하게는 서열번호 4, 16, 22, 51, 52, 71 및 82번에서 선택된 어느 하나의 서열, 가장 바람직하게는 서열번호 51, 52, 71 및 82번 중 어느 하나의 서열을 가지는 센스가닥 및 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 가닥을 포함하는 뎅기 바이러스 특이적인 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체가 포함될 수도 있고,
상기 뎅기 바이러스 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체가 혼합된 형태로 포함될 수도 있다.
상기와 같이 서로 다른 서열을 가지는 뎅기 바이러스 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체를 2종 이상 포함하는 뎅기 바이러스 증식 억제용 조성물을 이용할 경우, 병용 요법(combination therapy)과 같이 상승적인 효과를 거둘 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자를 포함하는 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 나노입자도 뎅기 바이러스 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체에서 선택된 어느 하나의 구조체로만 순수하게 구성될 수도 있고, 뎅기 바이러스 특이적 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체가 2종 이상 혼합된 형태로 구성될 수도 있다.
본 발명의 조성물에는 상기의 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 특히, 동결건조(lyophilized)된 형태의 제형으로 제제화하여 제공하는 것이 바람직하다. 동결건조 제형 제조를 위해서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 방법이 사용될 수 있으며, 동결건조를 위한 안정화제가 추가될 수도 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍톤 약학 과학(Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질병에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분 등의 함량 및 투여방법은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공 될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 또는 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 임상 투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 본 발명의 조성물을 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체, 이를 포함하는 나노입자 및 상기 이중나선 올리고 RNA 구조체 또는 상기 나노입자를 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 뎅기 바이러스 감염의 예방 및 치료방법을 제공한다.
발명의 효과
본 발명에 따른 뎅기 바이러스 특이적 siRNA, 이를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체를 포함하는 뎅기 바이러스 감염의 예방 및 치료용 조성물은 부작용 없이 높은 효율로 뎅기 바이러스의 발현을 억제할 수 있으므로, 현재 적절한 치료제가 없는 뎅기 바이러스 감염의 예방 및 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 뎅기 바이러스 게놈 서열 5’-UTR 부위의 다중 정렬 결과를 나타내는 도면
A : U1 부위의 다중 정렬 결과
B : U2 부위의 다중 정렬 결과
도 2는 뎅기 바이러스 게놈 서열 3’-UTR 부위의 다중 정렬 결과를 나타내는 도면
A : 3’-UTR 상류 부분
B : U3 내지 U5 부분 부위의 다중 정렬 결과
B : U5 부분 내지 U6 부위의 다중 정렬 결과
도 3은 범용(universal) siRNA 들의 바이러스 게놈상의 상대적인 위치를 나타내는 도면
도 4는 C6/36 세포주에서의 각 혈청형 별 뎅기 바이러스의 복제 특성(replication kinetics)을 나타내는 그래프
A : 뎅기 바이러스 혈청형 2의 복제 특성을 나타내는 그래프
B : 뎅기 바이러스 혈청형 3의 복제 특성을 나타내는 그래프
C : 뎅기 바이러스 혈청형 4의 복제 특성을 나타내는 그래프
도 5는 VeroE6 세포주에서의 각 혈청형 별 뎅기 바이러스의 복제 특성(replication kinetics)을 나타내는 그래프
A : 뎅기 바이러스 혈청형 2의 복제 특성을 나타내는 그래프
B : 뎅기 바이러스 혈청형 3의 복제 특성을 나타내는 그래프
C : 뎅기 바이러스 혈청형 4의 복제 특성을 나타내는 그래프
도 6은 1차 선별된 56 종류의 siRNA 후보군의 뎅기 바이러스 혈청형 4의 증식 억제효과를 나타내는 도면
도 7은 1차 선별된 5 종류의 siRNA 후보군의 뎅기 바이러스 혈청형 4의 증식 억제효과를 나타내는 도면
도 8은 1차 선별된 5 종류의 siRNA 후보군의 농도 의존적 뎅기 바이러스 혈청형 4의 증식 억제효과를 나타내는 도면
도 9는 1차 선별된 5 종류의 siRNA 후보군의 뎅기 바이러스 혈청형별 증식 억제효과를 나타내는 도면
도 10은 높은 상동성을 나타내는 부위에서 선정된 기존의 범용 SiRNA＃51과 SiRNA＃52에서 single nucleotide sliding window scanning을 통해 디자인된 2차 범용 siRNA 위치의 상대적인 위치를 나타내는 도면
도 11은 1차 선별된 범용적인 SiRNA＃51과 SiRNA＃52에 대해서 single nucleotide sliding window scanning을 통해 디자인된 2차 범용 32개 siRNA 후보군의 뎅기 바이러스 혈청형 2 및 혈청헝 3의 증식 억제효과를 나타내는 그래프
A : SiRNA＃51 기반 siRNA의 증식 억제 효과
B : SiRNA＃52 기반 siRNA의 증식 억제 효과
도 12는 최종 선별된 2종류의 siRNA인 SiRNA＃51-15 및 SiRNA＃52-10의 뎅기 바이러스 혈청형 2 내지 혈청형 4의 증식 억제 효과를 나타내는 그래프
A : SiRNA＃51-15의 증식 억제 효과
B : SiRNA＃52-10의 증식 억제 효과
도 13은 최종 선별된 2 종류의 siRNA인 SiRNA＃51-15 및 SiRNA＃52-10의 조합 사용에 의한 뎅기 바이러스 혈청형 2 내지 혈청형 4 및 뎅기바이러스 JB2의 증식 억제 효과를 나타내는 그래프
도 14는 실제 뎅기 환자 치료 적용 가능성 검증을 위하여 Pre-virus infection condition에서 최종 선별된 2 종류의 siRNA인 SiRNA＃51-15 및 SiRNA＃52-10의 조합 사용에 의한 뎅기 바이러스 혈청형 2 내지 혈청형 4 및 뎅기바이러스 JB2의 증식 억제 효과를 나타내는 그래프
도 15는 최종 선별된 2 종류의 siRNA인 SiRNA＃51-15 및 SiRNA＃52-10를 각각 또는 조합 사용한 경우의 뎅기 바이러스 혈청형 1 내지 혈청형 4 및 뎅기바이러스 JB2 에 대한 농도별 증식 억제 효과를 나타내는 그래프
A : 뎅기 바이러스 혈청형 1
B : 뎅기 바이러스 혈청형 2
C : 뎅기 바이러스 JB2
D : 뎅기 바이러스 혈청형 3
E : 뎅기 바이러스 혈청형 4
도 16은 본 발명에 따른 이중나선 올리고 고분자 구조체로 구성된 나노입자의 모식도.
도 17은 본 발명에 따른 U1 siRNA를 포함하는 SAMiRNA를 이용한 뎅기 바이러스 혈청형 4의 증식 억제효과를 나타내는 도면.
도 18은 본 발명에 따른 combi-siRNA를 포함하는 Mono-HEG-SAMiRNA의 모든 뎅기 바이러스 혈청형 1 내지 혈청형 4 및 뎅기 바이러스 JB2에 대한 증식 억제 효과를 나타내는 그래프
도 19는 본 발명에 따른 combi-siRNA를 포함하는 Mono-HEG-SAMiRNA의 모든 뎅기 바이러스 혈청형 1 내지 혈청형 4 및 뎅기 바이러스 JB2에 대한 농도에 따른 증식 억제 효과를 나타내는 그래프
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 뎅기 바이러스의 목표 염기서열 디자인 및 siRNA의 제조
병원성바이러스 은행(Korea Bank for Pathogenic Viruses, Korea)으로부터 분양받은 뎅기 바이러스 혈청형(Dengue virus serotype) 4(은행등록번호 KBPV-VR-31)를 베로 E6 세포(VeroE6 cell)에 감염시키고 4일 후 세포 펠릿(cell pellet)을 회수하였다. Qiagen RNA prep kit을 이용하여 RNA를 prep하였으며 정량 후 2 μg의 총 mRNA(total mRNA)를 토대로 AccuPower Rocketscript™ RT Premix(Bioneer, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성하였고, 획득한 cDNA의 서열 분석(sequencing) 결과 뎅기 바이러스 혈청형 4 균주(strain) H241 (GenBank: AY947539.1)의 총 염기서열 중에 11개의 염기(nucleotides), 6개 아미노산(amino acids) 서열을 제외하고는 일치한다는 것을 확인하였다.
이러한 염기서열 분석결과를 토대로 H241 염기서열을 대상으로 하기 네 곳의 바이오 기업의 siRNA 디자인 알고리즘을 사용하여 상위 score의 siRNA와 각 기능성(functional) 단백질에 고루 분포가 되도록 추가로 선정된 siRNA를 합쳐 총 50종의 siRNA를 [표 2]에 기재된 바와 같이 디자인 하였다.
Bioneer: http://10.10.10.46:8080/siRNA2/menuDesigner.jsf;
Invitrogen: https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress;
Genscript: https://www.genscript.com/ssl-bin/gs_login;
ThermoScientific: http://www.thermoscientificbio.com/design-center/-redirect=true)
이후, 4종의 혈청형에 속하는 약 60여종의 뎅기 바이러스 균주(Dengue virus strain)들의 Genebank에 등재된 게놈 서열(genome sequence)들의 5`-UTR 부위와 3`-UTR 부위 서열의 다중정렬(multialign)을 통해서 상동성(homology)을 비교하여 상동성이 높은 보존적 서열(conserved sequence) 부분을 도출하였다(도 1 및 도 2). 이에 따라 이 부분을 타겟으로 하는 새로운 범용(universal) siRNA 6 개를 [표 3]에 기재된 바와 같이 추가로 제작하였으며, 이들 siRNA들의 상대적인 위치를 [도 3]에 나타내었다.
표 2
Figure PCTKR2014006032-appb-T000002
표 3
Figure PCTKR2014006032-appb-T000003
또한 어떠한 유전자의 발현을 저해하지 않는 서열의 siRNA인 siCONT(서열번호 89를 센스가닥으로 가짐)을 제조하였다 [표 4]. 상기 siRNA는 β-시아노에틸 포스포라미다이트(β-cyanoethyl phosphoramidite)를 이용하여 RNA 골격 구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결하여 제조하였다 (Nucleic Acids Research, 12:4539-4557, 1984). 구체적으로, RNA 합성기(384 Synthesizer, BIONEER, KOREA)를 사용하여, 뉴클레오티드가 부착된 고형 지지체 상에서, 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 산화(oxidation) 및 캐핑(capping)으로 이루어지는 일련의 과정을 반복하여 원하는 길이의 RNA를 포함하는 반응물을 수득하였다. 상기 반응물을 Daisogel C18(Daiso, Japan) 칼럼이 장착된 HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan)로 RNA를 분리 및 정제하고 이를 MALDI-TOF 질량 분석기(Shimadzu, Japan)를 이용하여 목표 염기서열과 부합하는지 확인하였다. 이후, 센스와 안티센스 RNA가닥을 결합시켜 서열번호 1 내지 56 및 서열번호 89에서 선택된 서열을 센스가닥으로 포함하는 이중가닥 siRNA를 제조하였다
표 4
Figure PCTKR2014006032-appb-T000004
실시예 2. 뎅기 바이러스 혈청형 2, 3, 4의 배양 및 증식
2.1 세포의 감염 및 배양
12-웰 플레이트(well plate)에 C6/36 cell(2.5×105/well)과 Vero E6 cell(1× 105/well)을 접종(seeding)하였으며, 뎅기 바이러스로 감염(Infection)시키기 직전 DPBS로 세척(washing out) 하였다.
뎅기 바이러스 감염 후 24 시간 간격으로 바이러스 배양액을 회수하여 원심분리(6000rpm, 5mins, 4℃)를 하고 배양액 중 400 μl를 ExiPrep™16DX RNA prep 장비로 RNA prep을 하였으며, 총 50 μl로 용출된 RNA중 19.5 μl를 cDNA 합성에 사용하였고, 총 20 μl의 cDNA 중 5 μl를 qPCR에 사용하였다.
사용된 뎅기 바이러스 혈청형 중 혈청형(serotype) 2 내지 혈청형 4 은 병원성바이러스은행(Korea Bank for Pathogenic Viruses, Korea)에서, 혈청형 1은 질병관리본부 신경계바이러스과로부터 분양받았다.
2.2 바이러스 카피(copy) 수 확인
회수한 총 400 μl의 배양액(culture media)으로부터 Exiprep Dx™ (Bioneer, Korea) 장비를 활용하여 RNA를 추출하였다. 이 장비를 활용하여 배양액 400 μl당 용출(elution)된 약 50 μl의 RNA를 얻었다.
그 후 바이러스의 혈청형에 따른 cDNA의 합성을 위해서 사용된 [표 5]에 나타낸 프라이머(primer)의 안티센스 프라이머(antisense primer) (100pM/μl) 0.5 μl와 준비(prep.)된 바이러스 RNA 19.5 μl를 AccuPower ® CycleScript RT PreMix (Bioneer, Korea)를 사용해 50℃ 1hr, 95℃ 5min의 반응시간을 주어 총 20 μl의 cDNA 샘플을 최종적으로 확보하였다. 그 후 qPCR의 수행을 위해서 혈청형 1 내지 3의 검출은 DN1234_S, DN123_AS, DN123_probe를 사용하고, 혈청형 4의 검출을 위해서는 DN1234_S, DN4_AS, DN4_probe를 사용하였다.
qPCR 반응은 AccuPower ® Plus DualStar™ qPCR PreMix (Bioneer, Korea)를 사용하고 total 50 μl의 반응 부피에 해당 프라이머와 프로브가 0.3 μl 씩(100　pM/μl 스탁(stock) 기준), cDNA 5 μl, 44.1 μl의 dH2O를 넣어주며 약 3~5분간 보텍싱(vortex)하여 혼합하며 Exicycler™ 96 Real-Time Quantitative Thermal Block (Bioneer, Korea)을 이용하여 95℃ 10min, (95℃ 5sec, 60℃ 5sec)x45 cycle로 반응을 하고 각 사이클(cycle)마다 형광 값이 검출(detection)되는 프로토콜을 사용하였다. qPCR array후 나온 결과를 통해 각 샘플의 바이러스 카피 수 및 잔여 바이러스(residual virus)의 상대적인 양(%)을 계산하였다.
표 5
Figure PCTKR2014006032-appb-T000005
2.3 바이러스 증식 특성
각 일수마다 두 개의 샘플을 Duplicate로 진행하여 네 개 값의 평균값으로 qPCR 결과를 그래프로 도출하였다. 그 결과, 혈청형 2, 3 및 4 모두 C6/36 세포주(Cell line)에서 감염 후 72 시간까지 카피(copy) 수가 급격히 증가한 후 유지됨을 확인하였다[도 4]. VeroE6 세포주의 경우, 혈청형 2 및 3은 감염 후 72 시간까지 카피 수가 급격히 증가한 후 유지되고, 혈청형 4는 144 시간까지 점진적으로 카피 수가 증가하는 것을 관찰하였다[도 5]. 따라서 바이러스 증식을 위해서 감염 후 7일째에 바이러스를 회수하고, siRNA 효능 평가 시에는 바이러스 증식이 대부분 최고점에 달하는 최소 3일째에 배양액을 수거하여 실시예에 사용하였다. 혈청형 1의 경우, 일수에 따른 카피수의 정량 측정 실험 결과는 본 명세서에 명시하지는 않았으나 다른 혈청형과 똑같은 조건과 방법으로 실시예에 사용되었다.
실시예 3. 1차 선별된 siRNA의 뎅기 바이러스 증식 저해능 확인
3.1 siRNA의 형질감염(transfection) 및 바이러스 감염(virus infection)
상기 실시예 1에서 제작한 56 종류의 siRNA를 이용하여 VeroE6 세포를 형질전환시키고, 상기 형질전환된 세포주에서 생산되는 바이러스의 카피 수를 분석하여 siRNA 성능을 확인하였다.
siRNA 형질감염(transfection) 24 시간 전에, VeroE6 세포를 12-웰 플레이트(well plate)(Nunc, USA)에 1×105 cells/well로 접종한다. DMEM(Hyclone, USA) 완전배지(Complete medium)를 세포의 배양액으로 사용하여 1 well당 1 ml씩 처리하여 37℃, 5% CO2의 조건으로 세포를 배양하였다. 완전배지 조성은 Dulbeccos Modified Eagles Medium 500ml(pH 7.4)에 4.00mM의 L-Gutamine 및 4500mg/L의 Glucose, sodium pyruvate, Fetal Bovine Serum(Hyclone, USA)을 최종 10%의 농도로 맞춘 것이다. 24 시간 후 siRNA의 형질감염을 위해서 12-웰 플레이트에 배양액을 제거하고, OPTI-MEM (GIBCO, USA) 500μl로 교환한 후 세포를 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)에 그대로 사전 인큐베이션(Pre-incubation) 하였다. LipofectamineRNAimax (Invitrogen, USA) 시약 3.5 μl를 250 μl의 OPTI-MEM에 섞은 것과 siRNA를 일정 농도대로 희석한 250 μl의 OPTI-MEM을 각각 준비 한 후 5분 동안 RT에서 따로 놓아둔 후, siRNA가 포함된 희석한 OPTI-MEM을 LipofectamineRNAimax가 첨가된 OPTI-MEM에 첨가하여 20분 동안 RT에서 인큐베이션 한 후에 세포에 처리하였다. 약 6시간 경과 된 뒤, 세척(washing out)하고 DMEM에 10% FBS가 첨가된 완전 배지(complete media)로 교환하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 배양하였다. 24 시간 뒤, 배지를 washing out한 후 준비된 virus soup (약 1.0×108 copy/ml)을 두 배로 희석 하고 200 μl당 1×107 copies가 넘도록 조정하였다. 200 μl씩 각 웰에 처리 후 2시간 동안 30분 마다 rocking하여 바이러스가 잘 도포되도록 하여 감염시키고 1 ml의 2% FBS가 첨가된 DMEM 배지(virus growth media)를 첨가하여 assay하기 전까지 인큐베이션(incubation)을 진행하였다. 3일 경과 후 수획한 세포 배양액(cell culture media)으로부터 RNA를 추출하여 바이러스 카피 수를 측정 하였다
3.2 뎅기 바이러스 혈청형 4에 대한 56 종류 siRNA의 저해능 확인
디자인 된 총 56종의 siRNA 후보군([표 2 및 표 3])에서 뎅기 바이러스 혈청형 4의 증식에 대해 저해능을 가지는 후보군을 선별하기 위해 먼저 20nM 농도의 siRNA를 처리하여 스크리닝(screening) 실험을 수행하였다.　각 실험마다 siRNA siCONT 대조군의 잔존 바이러스(residual virus) 값을 100 퍼센트로 정하고 다른 siRNA 후보군의 잔존 바이러스 값을 그에 대한 상대적인 퍼센트로 나타내어 서로 비교할 수 있도록 보정하였다. 그 결과 [도 6]에 도시된 바와 같이 30종 이상의 siRNA에서 15% 미만의 잔존 바이러스만이 존재하는 것으로 나타나, 높은 뎅기 바이러스 저해능을 보유하고 있음을 확인 하였다.
이에 따라, 20nM의 농도에서 높은 뎅기 바이러스 증식 저해능을 보이는 23종의 siRNA 후보군(SiRNA＃4, SiRNA＃5, SiRNA＃6, SiRNA＃7, SiRNA＃8, SiRNA＃13, SiRNA＃16, SiRNA＃20, SiRNA＃22, SiRNA＃23, SiRNA＃29, SiRNA＃32, SiRNA＃34, SiRNA＃39, SiRNA＃40, SiRNA＃41, SiRNA＃42, SiRNA＃44, SiRNA＃45, SiRNA＃46, SiRNA＃47, SiRNA＃51, SiRNA＃52)을 1차적으로 선별하였다.
상기 1차적으로 선별된 siRNA 후보군은 상기 기재된 순서대로 각각 서열변호 4 내지 8, 13, 16, 20, 22, 23, 29, 32, 34, 39 내지 42, 44 내지 47, 51 및 52번의 서열을 센스가닥으로 가지는 siRNA이다([표 2 및 표 3]).
본 발명에 있어서, “SiRNA＃X”의 siRNA는 표 2, 표 3 및 표 6 등에서SiRNA＃X로 표시되는 서열을 센스가닥으로 가지는 siRNA를 의미한다.
3.3 1차 선별된 5개 siRNA 후보군의 뎅기 바이러스 혈청형 4에 대한 저해능 분석
상기 실시예 3.2에서 선별된 23개 siRNA 후보군을 이용하여, 뎅기 바이러스 혈청형 4의 증식억제　효과를　가지는지　검정하기 위해 5nM의 농도의 siRNA 처리를 통한 스크리닝 실험을 수행하였으며, 이로부터 5 개의 siRNA 후보군(SiRNA＃4, SiRNA＃16, SiRNA＃22, SiRNA＃51, SiRNA＃52)을 선별하였다.
이후, 상기 선별된 5 종의 siRNA가 모든 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 증식 억제 효과를 가지는지 여부를 확인하기 위하여, 10nM의 농도의 siRNA 처리를 통한 뎅기 바이러스 혈청형 4에 대한 증식 억제 효과를 확인하였다. 이때, (Korrapati AB et al., PLoS Negl Trop Dis. 6(7):e1735, 2012)에 기재된 shRNA와 동일한 서열의 siRNA(UnisiRNA-sh)를 양성 대조군(positive control)으로 함께 사용하였다.
그 결과 선별된 5종의 siRNA 후보군(SiRNA＃4, SiRNA＃16, SiRNA＃22, SiRNA＃51, SiRNA＃52)이 UnisiRNA-sh에 비해 우수한 뎅기 바이러스 증식 저해능을 가지고 있음이 확인되었다 ([도 7]).
또한, 최종 선별된 5 개의 siRNA 후보군(SiRNA＃4, SiRNA＃16, SiRNA＃22, SiRNA＃51, SiRNA＃52)의 농도 의존적(dose-dependent)인 뎅기 바이러스 혈청형 4에 대한 증식　억제효과가　있는지 알아보기 위해 20nM,　10nM, 5nM, 1nM 네 가지의 농도로 스크리닝 실험을 수행하였다.
그 결과 5개 siRNA 후보군 모두 기존의 5 nM 이상의 농도에서 특히 10 nM이상에서는 대부분의 siRNA가 10% 내외의 잔존 바이러스를 나타내는　저해능을 보였다. 반면, 1 nM로 농도를 낮추었을 때에는 그 저해능이 유지되지 않고 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이 실험을 통해 다섯 종류의 siRNA 모두 10nM 이상 정도의 농도로 처리를 했을 때 높은 저해능을 나타냄을 확인할 수 있었다([도 8])
3.4 1차 선별된 5 종류의 siRNA의 혈청형별　뎅기 바이러스 증식 억제 효능 분석
1차 선별된 5 개 siRNA 후보군이 각 뎅기 바이러스 혈청형 별로 저해능을 나타내는지 알아보기 위해 4 종류 혈청형의 뎅기 바이러스를 사용하여 각각 스크리닝 실험을 수행하였다.
그 결과 10 nM의 siRNA를 처리하여 시험한 결과, SiRNA＃51과 SiRNA＃52가 대부분의 혈청형에서 저해능이 높게 나타나는 것으로 확인되었고, 나머지 세 종류의 siRNA는　혈청형 4를 제외하고는 혈청형에 따라 전반적으로 저해능 효능이 크지 않은 것으로 확인되었다([도 9]).
실시예 4. Single nucleotide sliding window scanning을 통한 2차 범용 siRNA의 제조
4.1 2차 siRNA 디자인 및 제조
2차로 뎅기 바이러스 게놈의 5`-UTR 부위와 Cp 부위의 상동성이 높은 보존적 서열(conserved sequence) 부분을 타겟으로 제작된 각각의 SiRNA＃51과 SiRNA＃52의 sequence를 바탕으로 single nucleotide sliding window scanning 디자인 방법을 통해, 각각 16개의 새로운 범용 (universal) siRNA를 (총 32종류) 표 6에 기재된 바와 같이 추가로 제작하였으며, 이들 siRNA들의 상대적인 위치를 [도 10]에 나타내었다.
표 6
Figure PCTKR2014006032-appb-T000006
4.2 뎅기 바이러스 혈청형 2 및 혈청형 3 에 대한 2차 선별된 32 종류 siRNA의 저해능 확인
1차 선별된 SiRNA＃51과 SiRNA＃52의 저해능이 대부분의 혈청형에서 10nM의 농도로 처리했을 때 높게 나오기 때문에 더 효율이 좋은 범용 siRNA후보군의 발굴을 위해, single nucleotide sliding window scanning 방법을 통해 SiRNA＃51과 SiRNA＃52의 서열을 기반으로 2차로 새롭게 디자인된 32종류의 siRNA 후보군을 이용하여 10nM의 농도에서 기존의 1차 siRNA 후보군과 혈청형 2, 3바이러스에 대한 저해능을 비교하는 스크리닝 실험을 수행하였다.
그 결과, SiRNA＃51-14(서열번호 70), SiRNA＃51-15(서열번호 71), SiRNA＃51-16(서열번호 72), SiRNA＃52-4(서열번호 76), SiRNA＃52-5(서열번호 77), SiRNA＃52-8(서열번호 80), SiRNA＃52-9(서열번호 81) 및 SiRNA＃52-10(서열번호 82)의 siRNA를 처리한 실험군에서 1% 미만의 바이러스만이 잔존하여, 매우 강한 저해능을 나타내는 것을 확인하였다. 이는 기존의 SiRNA＃51과 SiRNA＃52의 효능보다 훨씬 좋은 저해능 수치이다 [도 11].
4.3 뎅기 바이러스 혈청형 2 내지 혈청형 4의 증식에 대한 최종 선별된 2종류 siRNA의 저해능 확인
다음으로, 강한 저해능을 보이는 siRNA 후보군들 중에서 SiRNA＃51과 SiRNA＃52 서열을 기반으로 제작된 siRNA 중에서 재현성이 우수한 SiRNA＃51-15(서열번호 71) 와 SiRNA＃52-10(서열번호 82)를 최종적으로 선정하였고, 이들의 뎅기 바이러스 혈청형 2 내지 혈청형 4의 증식에 대한 저해능 효과를 10 nM의 농도에서 다시 검정하였다.
그 결과, SiRNA＃51-15와 SiRNA＃52-10는 기존의 SiRNA＃51과 SiRNA＃52에 비해 더 높은 저해능 효과를 나타내는 것을 재확인 할 수 있었다 [도 12].
4.4 뎅기 바이러스 혈청형 2 내지 혈청형 4의 증식에 대한 SiRNA＃51-15와 SiRNA＃52-10의 조합 사용(Combination)에 의한 저해능 효과 검정
앞선 single nucleotide sliding windows scanning 실험을 통해 뎅기 바이러스 혈청형 2, 3, 4의 증식에 대해 더 좋은 저해능을 가지는 두개의 siRNA인 SiRNA＃51-15 와 SiRNA＃52-10를 선별하였으나, 하나의 siRNA 만으로 모든 혈청형의 뎅기 바이러스의 증식을 억제하는 범용적인 치료제로 적용하기에는 충분하지 않을 수 있다는 점에 착안하여(SiRNA＃51-15의 경우, 뎅기 바이러스 혈청형 4에 대해서 강한 저해능을 보이지 않음),
SiRNA＃51-15 와 SiRNA＃52-10를 1:1의 몰비(molar ratio)로 혼합된 siRNA혼합물(이하 ‘Combi-siRNA’라 함)을 제조하고, 모든 혈청형의 뎅기 바이러스의 증식에 대해 complementary effect(보강 효과)에 의한 범용적으로 강한 저해능 효과를 나타낼 수 있는지 10nM의 농도에서 스크리닝 실험을 진행하였다.
그 결과, Combi-siRNA에서 모든 혈청형의 뎅기 바이러스의 증식에 대해서 강한 저해능 효과를 보이는 것을 확인 할 수 있었다 [도 13].
4.5 자연에서의 감염에 따른 치료제 적용 환경을 만들기 위하여 먼저 바이러스를 감염시킨 상태(pre-virus infection condition) 에서의 뎅기 바이러스 혈청형 2 내지 혈청형 4 증식에 대한 SiRNA＃51-15와 SiRNA＃52-10의 조합 사용에 의한 저해능 효과 검정
다음으로 실제 모기에 의한 바이러스 감염 상태를 고려하여 배양된 세포에 바이러스 infection을 먼저 시킨 후에 siRNA를 처리하였을 때, siRNA가 치료제로서의 효능을 나타낼 수 있는지 알아보았다.
최종 선별된 SiRNA＃51-15와 SiRNA＃52-10의 두 종류 siRNA를 각각 5nM씩 추가하고, 여기에 각각 siCONT 5nM를 추가하여, 최종 siRNA 농도를 10nM로 조정하여 처리하였다. 또한 SiRNA＃51-15와 SiRNA＃52-10의 두 종류 siRNA를 각각 5nM씩 포함하는 Combi-siRNA를 처리하여 저해능을 확인해 본 결과, Combi-siRNA처리가 모든 혈청형의 뎅기 바이러스 증식에 대해서 강한 증식 저해능을 보이는 것을 확인하였다 [도 14].
이를 통해 Combi-siRNA가 모든 혈청형의 바이러스에 대해서 범용적인 치료제로서의 기능을 할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
4.6 모든 혈청형의 뎅기 바이러스 증식에 대한 Combi-siRNA의 저해능 효과및 IC50 값 결정
최종 선별된 SiRNA＃51-15와 SiRNA＃52-10의 두 종류 siRNA와 Combi-siRNA가 농도 의존적으로 모든 혈청형의 뎅기 바이러스 JB(혈청형 2, 전북대학교 분리주) 및 뎅기 바이러스 혈청형 1 내지 혈청형 4)에 대해서 증식 억제효과를 검증하기 위하여 10nM, 1nM, 200pM, 50pM 네 가지의 농도로 스크리닝 실험을 수행하였다.　
그 결과, 각각의 siRNA 후보군별로 모든 혈청형 뎅기 바이러스 에 대해서 서로 다른 농도 의존적인 효과를 보였으며 [도 15],
뎅기 바이러스 혈청형4를 제외하고 대부분의 바이러스에 대해서 50~200pM 사이의 낮은 농도에서 IC50 값을 보였다. Combi-siRNA의 경우 다른 siRNA보다 더 좋은 IC50값을 보였다 [표 7].
표 7
Figure PCTKR2014006032-appb-T000007
실시예 5. SAMiRNA 나노입자의 뎅기 바이러스 증식 억제능 확인
5.1 이중나선 올리고 RNA 구조체(SAMiRNA)의 제조
본 발명에서 제조된 이중나선 올리고 RNA 구조체(SAMiRNA)는 하기 구조식 (16)과 같은 구조를 갖는다.
구조식 16
Figure PCTKR2014006032-appb-I000016
상기 구조식 (16)에서, S는 siRNA의 센스가닥; AS는 siRNA의 안티센스 가닥; PEG는 친수성 물질로 폴리에텔렌 글리콜(polyethylene glycol); C24는 소수성 물질로 이황화결합(disμlfide) 이 포함된 테트라도코산(tetradocosane); 5’ 및 3’은 이중나선 올리고 RNA 말단의 방향성을 의미한다.
상기 구조식 (16)에서의 siRNA의 센스가닥은 대한민국 공개특허공보 제2012-0119212호의 실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조된 3’ 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG, Mn=2,000)-CPG를 지지체로 하여 앞서 언급한 방식대로 β-시아노에틸포스포아미다이트를 이용하여 RNA 골격구조를 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해가는 방법을 통해 3’말단부위에 폴리에틸렌 글리콜이 결합된 센스가닥의 이중나선 올리고 RNA-친수성 물질 구조체를 합성한 뒤, 이황화 결합이 포함되어있는 테트라도코산을 5’말단에 결합하여 원하는 RNA-고분자 구조체의 센스가닥을 제조하였다. 상기 가닥과 어닐링을 수행할 안티센스 가닥의 경우, 앞서 언급한 반응을 통해 센스가닥과 상보적인 서열의 안티센스 가닥을 제조하였다.
합성이 완료되면 60℃의 온탕기(water bath)에서 28%(v/v) 암모니아(ammonia)를 처리하여 합성된 RNA 단일가닥과 RNA 고분자 구조체를 CPG로부터 떼어낸 뒤, 탈보호(deprotection) 반응을 통해 보호잔기를 제거하였다. 보호잔기가 제거된 RNA 단일가닥 및 RNA-고분자 구조체는 70℃의 오븐에서 엔-메틸피롤리돈(N-methylpyrolidon), 트리에틸아만(triethylamine) 및 트리에틸아민트리하이드로플로라이드 (triethylaminetrihydrofluoride)를 부피비 10:3:4의 비율로 처리하여 2’TBDMS(tert-butμldimethylsilyl)를 제거하였다.
상기 반응물을 Daisogel C18(Daiso, Japan) 칼럼이 장착된 HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan)로 RNA를 분리 및 정제하고 이를 MALDI-TOF 질량 분석기(Shimadzu, Japan)를 이용하여 목표 염기서열과 부합하는지 확인하였다. 이후, 각각의 이중나선 올리고 RNA 고분자 구조체를 제조하기 위하여 센스가닥과 안티센스가닥을 동량 혼합하여 1X 어닐링 버퍼(30 mM HEPES, 100 mM 칼륨 아세테이트(Potassium acetate), 2 mM 마그네슘 아세테이트(Magnesium acetate), pH 7.0∼7.5)에 넣고, 90 ℃ 항온수조에서 3분 반응시킨 후 다시 37 ℃에서 반응시켜, 최종 선별된 5개 siRNA 후보군(SiRNA＃4, SiRNA＃16, SiRNA＃22, SiRNA＃51, SiRNA＃52)을 포함하는 이중나선 올리고 RNA 고분자 구조체를 각각 제조하였다. 제조된 이중나선 올리고 RNA 구조체는 전기영동을 통하여 어닐링 되었음을 확인하였다.
제조된 이중나선 올리고 RNA 구조체(SAMiRNA)는 이중나선 올리고 RNA의 말단에 결합된 소수성 물질 간의 소수성 상호작용에 의하여 나노입자, 즉 미셀(micelle)을 형성하게 된다 ([도 16]). 제조된 SAMiRNA를 1.5 ㎖ DPBS(Dμlbecco's Phosphate Buffered Saline)에 50 ㎍/㎖ 의 농도로 녹인 뒤, -75℃, 5mTorr 조건에서 48시간 동안 동결건조를 통해 나노입자 파우더를 제조한 뒤, 용매인 DPBS에 녹여 균질화된 나노입자를 제조하여 본 발명의 실시예에서 사용하였다.
5.2 SAMiRNA 형태에서 선출된 1차 선별된 5종의 siRNA 후보군의 범용성 저해능 분석
실시예 5.1의 방법에 의해 1차 선별된 5개 siRNA 후보군(SiRNA＃4, SiRNA＃16, SiRNA＃22, SiRNA＃51, SiRNA＃52)을 포함하도록 제조된 SAMiRNA를 이용하여, 뎅기 바이러스 혈청형 3과 혈청형 4에 대한 증식 억제 효능을 확인하였다.
상기 실시예에서 사용한 모든 뎅기 바이러스 혈청형에 대해 전반적으로　저해능이 높은 SiRNA＃51과 SiRNA＃52를 포함하는 SAMiRNA를 이용할 경우, 약 200 nM 이상에서 세포 내로 전달되어 높은 저해능(70~75%)이 나타나는 것을 확인하였다([도 17]).
5.3 Mono-HEG-SAMiRNA 형태에서 최종적으로 선출된 Combi-siRNA 후보군의 범용적 저해능에 대한 재현성 분석
상기 실시예 5.2에서 사용된 SAMiRNA 형태와는 다르게 친수성 물질을 PEG 대신에 친수성 물질 블록인 [PO3 --헥사 에틸렌 글리콜]4 (이하, ‘Mono-HEG SAMiRNA’라 함, 구조식 (17) 참조)을 사용하여, 안정성을 제고한 형태의 SAMiRNA에 SiRNA＃51-15와 SiRNA＃52-10가 함께 포함되도록 하였다.
구조식 17
Figure PCTKR2014006032-appb-I000017
상기 구조식 (17) 에서 S는 뎅기 바이러스 특이적 siRNA의 센스가닥; AS는 뎅기 바이러스 특이적 siRNA의 안티센스 가닥; Hexa ethylene glycol은 친수성 물질; C24는 소수성 물질로 이황화결합(disulfide)이 포함된 테트라도코산(tetradocosane); 5’ 및 3’은 이중나선 올리고 RNA 내의 센스가닥 말단의 방향성을 의미한다.
제작된 Mono-HEG SAMiRNA가 뎅기 바이러스의 각 혈청형 별로 재현성 있게 비슷한 저해능을 가지는지 확인하기 위해 500nM의 농도에서 스크리닝을 실시하였다. 그 결과, Mono-HEG SAMiRNA 처리에 의해 각 혈청형 별로 모두 재현성 있게 비슷한 저해능을 보이는 것을 확인 할 수 있었다 [도 18].
5.4 Mono-HEG-SAMiRNA 형태에서 최종적으로 선출된 Combi-siRNA 후보군의 농도별 범용적 저해능 분석 및 IC50 결정
최종적으로 선출된 에 SiRNA#51-15와 SiRNA＃52-10 두 종류의 siRNA 후보군을 1:1의 몰비(molar ratio)로 혼합한 Combi-siRNA를 SAMiRNA 형태로 합성하여 결과적으로 in vitro에서 얼마나 낮은 농도에서도 효율적으로 뎅기 바이러스의 증식을 50%까지 억제하는지 여부를 검증함으로써 실제 치료제로서의　유효성　평가를 수행하였다.
구체적으로 Mono-HEG-SAMiRNA에 SiRNA＃51-15와 SiRNA＃52-10가 함께 포함되도록 하고, 500nM, 200nM, 50nM의 농도에서 모든 뎅기 바이러스 혈청형에서의　증식 억제효과를 검증하는 스크리닝 실험을 수행하였다.
그 결과 뎅기 바이러스 혈청형 4를 제외한 나머지 혈청형에서는 대부분 50~200nM 사이의 농도에서 재현성 있는 IC50 값이 나타남을 확인 할 수 있었다 ([도 19] 및 [표 8]).
표 8
Figure PCTKR2014006032-appb-T000008
실시예 6. SAMiRNA 나노입자의 아민 그룹 도입에 따른 SAMiRNA 전달체의 세포내 도입과 엔도좀 탈출 효율의 비교 분석
상기 구조식 (17)과 같은 Mono-HEG-SAMiRNA의 세포 내 전달 효율을 높이기 위한 방안으로 구조식 (18)과 같이 센스가닥(sense strand)의 3’ 말단에 아민기를 결합(conjugation)시켜서 새롭게 변형시킨 amine-Mono-HEG-SAMiRNA를 합성하였다.
구조식 18
Figure PCTKR2014006032-appb-I000018
상기 구조식 (18) 에서 S는 뎅기 바이러스 특이적 siRNA의 센스가닥; AS는 뎅기 바이러스 특이적 siRNA의 안티센스 가닥; Hexa ethylene glycol은 친수성 물질; C6는 [Hexa Ethylene Glycol]4와 아민기를 연결하는 C6 알킬인 링커이고, C24는 소수성 물질로 이황화결합(disulfide)이 포함된 테트라도코산(tetradocosane); 5’ 및 3’은 이중나선 올리고 RNA 내의 센스가닥 말단의 방향성을 의미한다.
새롭게 합성된 amine-Mono-HEG-SAMiRNA는 안티센스 가닥(antisense strand)의 3’ end 부분에 FITC 형광물질을 결합시켜서 형광 현미경을 통해 기존의 Mono-HEG-SAMiRNA와 비교하여 아민기의 도입에 의한 그 전달 효율의 증가가 있는지를 가시적으로 측정할 수 있도록 최종적으로 제작하였다. 본 실험에서는 Mono-HEG-SAMiRNA와 amine-Mono-HEG-SAMiRNA의 시간별 전달 효율을 공초점 현미경을 이용해 얻은 이미지 data와 무작위로 이미지를 캡쳐하여 densitometer로 형광도를 정량적으로 측정하여 비교 분석함으로써 아민기의 도입에 따른 SAMiRNA의 전달 효율의 증대 효과를 확인하고자 하였다.
6.1 공초점 현미경을 이용하여 형광이미지 비교관찰을 통해 Mono-HEG-SAMiRNA-FITC의 시간별 처리에 의한 전달효율 비교
Mono-HEG-SAMiRNA-FITC를 처리하기 15시간 전에, HeLa 세포를 2-chamber polystyrene vessel (BD Falcon™ cultureslides)에 2×105 cells/ml로 분주하였다. DMEM(Hyclone, USA) 완전배지(Complete medium)를 세포의 배양액으로 사용하여 1 chamber 당 1 ml씩 처리하여 37℃, 5% CO2의 조건으로 세포를 배양하였다. 완전배지 조성은 Dulbeccos Modified Eagles Medium 500ml(pH 7.4)에 4.00mM의 L-Gutamine 및 4500mg/L의 Glucose, sodium pyruvate, Fetal Bovine Serum(Hyclone, USA)을 최종 10%의 농도로 맞춘 것이다. 세포배양 15시간 배양 후 chamber 내의 배양액을 제거하고, OPTI-MEM (GIBCO, USA) 1ml로 배지를 교체한 후, IFA (ImmunoFluorescence Assay; 면역형광어세이) 를 한거번에 동시에 수행할 수 있도록 SAMiRNA-FITC를 1000nM 농도로 각각의 정해진 시간에 (0hr, 0.5hr, 1hr, 3hr, 12hr) 맞추어 빛에 노출이 안 되는 조건하에서 처리하였다.
6.2 공초점 현미경 실험을 위한 Immunofluorescence assay (IFA) 수행
빛이 최대한 차단된 실험 공간 하에서 IFA를 수행하였다. 2-chamber polystyrene vessel에 SAMiRNA-FITC를 처리한 세포의 배양액을 1000p pipettor로 제거한 후, OPTI-MEM 1ml로 2회 세척(washing out)을 하였다. 그 후, 1X PBS 1ml로 3분 동안 한번 세척 한 후, 2% PFA (Paraformaldehyde)를 500u씩 처리한 후 실온에서 30분 동안 세포를 고정 (Fixation) 시켰다. 이 때 사용된 2% PFA 는 fresh하게 제조하여 filtering 한 후 냉동 보관 하여 사용하였다. 세포 고정 후 1X PBS 1ml로 각각 3분씩 2회 세척(washing out)을 하였고, 1X PBS에 0.1% Triton X-100 (USB)과 10% BSA(Albumin, Bovine, pH 7.0)가 포함된 Blocking solution을 500ul씩 처리하여 실온에서 30분 동안 blocking한 후, blocking solution을 제거 후 간략하게 1X PBS로 1회 세척하였다. 그 후, 1X PBS에 0.1% Triton X-100 (USB)과 3% BSA(Albumin, Bovine, pH7.0)가 포함된 용액에 세포내 endosome을 염색하는 1차 항체(EEA1(H-300), Santa Cruz, sc-33585)를 500대 1(v/v)의 비율로 희석한 후 각 세포에 500ul씩 처리하여 90분 동안 Foil로 싸서 1차 염색을 수행 하였다. 1차 염색 후, 1X PBS 1ml로 각각 3분씩 3회 세척(washing out)을 하였고 1X PBS에 0.1% Triton X-100 (USB)과 3% BSA(Albumin, Bovine, pH7.0)가 포함된 용액에 Red계열의 형광을 보이는 2차 항체(Alexa Fluor 546 Goat anti-mouse IgG (H+L), Invitrogen Molecular Probes)를 1000대 1(v/v)의 비율로 희석한 후, 각 세포에 500ul씩 처리하여 90분 동안 Foil로 싸서 2차 염색을 수행 하였다. 2차 염색 후, 1X PBS 1ml로 각각 3분씩 3회 세척(washing out)을 하였고 1X PBS에 DAPI(DAPI , Dilactate, Sigma, D-9564), 10mg/ml in D.W)를 1000대 1 (v/v)의 비율로 희석한 용액을 각 세포에 500ul씩 분주하여 실온에서 20분 동안 핵 염색을 실시하였다. 그 후, 1X PBS 1ml로 각각 3분씩 3회 세척(washing out)을 하였고, chamber wall를 떼어낸 후 Mounting medium(IMMU-MOUNT, Thermo Scientific Shandon, cat.NO.9990402) 1방울을 기포가 최대한 들어가지 않도록 세포 위에 떨어뜨린 후 cover glass를 조심스럽게 덮고 Mounting medium이 굳을 때까지 호일을 이용하여 빛이 차단된 상태로 20분 이상 실온에서 말렸다. 그 후 공초점 현미경 (LSM700, Carl Zeiss)을 통해 FITC signal (Green)과 Alexa546 (Red) signal을 detection하여 관찰한 후 이미지 data 분석을 수행하였다.
6.3 공초점 현미경을 통한 Mono-HEG-SAMiRNA-FITC 이미지 Data 분석 수행
공초점 현미경을 이용하여 각 시간대의 샘플 (0hr, 0.5hr, 1hr, 3hr, 12hr) 별로 400X의 배율에서 2D 이미지를 얻고 1000X의 배율에서 z-stacking 을 통한 세포 단위의 3D 이미지를 얻었다. 2D와 3D 이미지 분석을 통해서 FITC 신호(signal)와 Alexa546의 신호(signal)의 병합(Merge)이 일어나는 신호가 있는지 (SAMiRNA-FITC nanoparticle의 endosome과 co-localization) 확인하였고, 또한 FITC 신호(signal)가 세포 내부 세포질에 위치하는지 확인 하였다. 공초점 현미경을 통해 얻은 이미지들은 ZEN 2009 light edition(Carl Zeiss) 소프트 웨어를 통해 분석, 편집하였다.
그 결과, 아민기를 포함하는 amine-Mono-HEG-SAMiRNA가 Mono-HEG-SAMiRNA보다 처리 후 시간이 지날수록 초기에 큰 spot으로 나타나던 FITC 신호(signal)가 작은 spot으로 나타나며, 세포질 내에 더 많이 존재하는 것으로 확인되었다 [도 20].
6.4 Densitometry 소프트 웨어를 이용한 시간별 세포내 존재 FITC 형광값의 정량 분석
FITC-labeled SAMiRNA 처리 후 이른 시간에서 (0min, 15min, 30min, 60min) 각 시간대 별 200X의 배율에서 공초점 현미경을 이용하여 6 컷씩의 2D 이미지를 얻은 후 Image J densitometer software를 이용하여 각 이미지에서 나오는 FITC 형광 값만을 정량하여 각 시간대 별로 아민기의 도입 유무에 따른 SAMiRNA-FITC 전달 효율을 형광값 측정으로 비교 분석하였다. 그 결과, amine-Mono-HEG-SAMiRNA의 형광값이 Mono-HEG-SAMiRNA보다 시간에 따라 더 높은 것을 확인할 수 있었다. [도 21] 위 실험 결과들을 통해 아민기의 도입으로 기존의 Mono-HEG-SAMiRNA의 세포질 내 전달 효율을 더욱 증가 시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.
6.5 Amine-Mono-HEG-SAMiRNA-DN Combi 변형체에 의한 범용적 뎅기 바이러스 증식 저해능 비교 실험
Combi-SAMiRNA에 아민기를 포함하여 새로운 형태의 Mono-HEG-SAMiRNA-DN Combi에 아민기를 도입하여 치료제를 합성하고, 이를 기존의 Combi-SAMiRNA와 비교하여 각 혈청형 별 뎅기 바이러스의 증식 저해능 면에서 월등한 차이가 있는지 확인하기 위해 500nM의 농도에서 스크리닝을 실시하였다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (32)

  1. 서열번호 1 내지 88에서 선택된 어느 하나의 서열을 가지는 센스가닥(sense strand)과 이에 상보적 서열을 갖는 안티센스 가닥으로 이루어진 뎅기 바이러스 특이적 siRNA.
  2. 제1항에 있어서,
    siRNA의 센스가닥 또는 안티센스 가닥은 19 내지 31개의 뉴클레오타이드로 이루어진 것을 특징으로 하는 뎅기 바이러스 특이적 siRNA.
  3. 제1항에 있어서,
    서열번호 4, 16, 22, 51, 52, 71 및 82번으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 서열을 가지는 센스가닥과 이에 상보적 서열을 갖는 안티센스 가닥을 포함하는 뎅기 바이러스 특이적 siRNA.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    siRNA의 센스가닥 또는 안티센스 가닥은 하나 이상의 화학적 변형(chemical modification)을 포함하는 것을 특징으로 하는 뎅기 바이러스 특이적 siRNA.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 화학적 변형은
    뉴클레오티드 내 당 구조의 2´ 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(메틸), -OCH3(methoxy), -NH2, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형;
    뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형;
    뉴클레오티드결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포페이트(boranophosphate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형;
    PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형;
    에서 선택된 하나 이상의 변형임을 특징으로 하는 뎅기 바이러스 특이적 siRNA.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    siRNA의 안티센스 가닥의 5’ 말단에 하나 이상의 인산기(phosphate group(s))가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 뎅기 바이러스 특이적 siRNA.
  7. 하기 구조식 (1)의 구조를 갖는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
    구조식 1
    Figure PCTKR2014006032-appb-I000019
    상기 구조식 (1)에서 A는 친수성 물질, B는 소수성 물질, X 및 Y는 각각 독립적으로 단순 공유결합 또는 링커가 매개된 공유결합을 의미하며, R은 뎅기 바이러스 특이적 siRNA를 의미한다.
  8. 제7항에 있어서,
    하기 구조식 (2)의 구조를 가지는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
    구조식 2
    Figure PCTKR2014006032-appb-I000020
    상기 구조식 (2)에서, S는 제7항에 따른 siRNA의 센스가닥, AS는 안티센스가닥을 의미하며, A, B, X 및 Y는 제7항에서의 정의와 동일하다.
  9. 제8항에 있어서,
    하기 구조식 (3) 또는 구조식 (4)의 구조를 가지는 이중나선 올리고 RNA 구조체.:
    구조식 3
    Figure PCTKR2014006032-appb-I000021
    구조식 4
    Figure PCTKR2014006032-appb-I000022
    상기 구조식 (3) 및 구조식 (4)에서, A, B, X, Y, S 및 AS는 제8항에서의 정의와 동일하며, 5’ 및 3’은 siRNA 센스가닥의 5’ 말단 및 3’ 말단을 의미한다.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    뎅기 바이러스 특이적 siRNA는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 siRNA 임을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    친수성 물질의 분자량은 200 내지 10,000 임을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  12. 제11항에 있어서,
    친수성 물질은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐피롤리돈 및 폴리옥사졸린으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 임을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  13. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    친수성 물질은 하기 구조식 (5) 또는 구조식 (6)의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
    구조식 5
    Figure PCTKR2014006032-appb-I000023
    구조식 6
    Figure PCTKR2014006032-appb-I000024
    상기 구조식 (5) 및 구조식 (6)에서 A’은 친수성 물질 단량체(monomer)를, J는 m개의 친수성 물질 단량체 간 또는 m개의 친수성 물질 단량체와 siRNA를 서로 연결하는 링커, m은 1 내지 15의 정수, n은 1 내지 10의 정수를 의미하며,
    친수성 물질 단량체 A’은 화합물 (1) 내지 화합물 (3)에서 선택된 어느 하나의 화합물이며, 링커(J)는 PO3 -, SO3 및 CO2로 구성된 군에서 선택된다.
    Figure PCTKR2014006032-appb-I000025
  14. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 소수성 물질의 분자량은 250 내지 1,000인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  15. 제14항에 있어서,
    소수성 물질은 스테로이드(steroid) 유도체, 글리세라이드(glyceride) 유도체, 글리세롤 에테르(glycerol ether), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), C12 내지 C50의 불포화 또는 포화탄화수소(hydrocarbon), 디아실포스파티딜콜린(diacylphosphatidylcholine), 지방산(fatty acid), 인지질(phospholipid) 및 리포폴리아민(lipopolyamine)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 스테로이드(steroid) 유도체는 콜레스테롤, 콜리스탄올, 콜산, 콜리스테릴포르메이트, 코테스타닐모르메이트 및 콜리스타닐아민으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 글리세라이드 유도체는 모노-, 디- 및 트리-글리세라이드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  18. 제7항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 X 및 Y로 표시되는 공유결합은 비분해성 결합 또는 분해성 결합인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 비분해성 결합은 아미드 결합 또는 인산화 결합인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 분해성 결합은 이황화 결합, 산분해성 결합, 에스테르 결합, 안하이드라이드 결합, 생분해성 결합 또는 효소 분해성 결합인 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  21. 제7항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    친수성 물질에 수용체 매개 내포작용(receptor-mediated endocytosis, RME)을 통해 타겟 세포 내재화(internalization)를 증진시키는 수용체와 특이적으로 결합하는 특성을 가진 리간드(ligand)가 추가적으로 결합된 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 리간드는 타겟 수용체 특이적 항체나 앱타머, 펩타이드, 엽산(folate), N-아세틸 갈락토사민(N-acetyl Galactosamine, NAG), 포도당(glucose) 및 만노스(mannose)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  23. 제7항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 친수성 물질의 siRNA와 결합된 반대편 말단 부위에 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹이 추가적으로 도입된 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 아민기 또는 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹은 하나 이상의 링커를 통해 친수성 물질 또는 친수성 블록과 연결된 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 1차 내지 3차 아민기 중에서 선택된 어느 하나 임을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  26. 제23항에 있어서,
    상기 폴리히스티딘(polyhistidine) 그룹은 3 내지 10개의 히스티딘을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중나선 올리고 RNA 구조체.
  27. 제7항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체로 이루어진 나노입자(nanoparticle).
  28. 제27항에 있어서,
    서로 다른 서열을 가지는 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체가 혼합되어 구성되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  29. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 siRNA, 제7항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 이중나선 올리고 RNA 구조체, 또는 제27항 또는 제28항에 따른 나노입자를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물.
  30. 제29항에 있어서,
    뎅기 바이러스 감염을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  31. 제29항 또는 제30항에 따른 조성물을 포함하는 동결건조된 형태의 제형.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 siRNA, 이중나선 올리고 RNA 구조체, 나노입자, 조성물 또는 제형을를 예방 또는 치료를 요하는 개체에게 투여하는 것을 특징으로 하는 뎅기 바이러스 감염을 예방 또는 치료하는 방법.
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