WO2014171646A1 - 지방세포 표적 비바이러스성 유전자 전달체 - Google Patents

지방세포 표적 비바이러스성 유전자 전달체 Download PDF

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WO2014171646A1
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ats
adipocytes
obesity
gene
cells
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PCT/KR2014/002718
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김용희
원영욱
임광석
김장경
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한양대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a non-viral gene carrier that targets adipocytes and a system for treating obesity and obesity-derived metabolic syndrome using the same, and more specifically, the present invention includes an adipose target sequence (ATS) -R9 (arginine) peptide. It is an invention for a non-viral gene carrier that directly targets differentiated obese (mature) fat cells.
  • ATS adipose target sequence
  • arginine adipose target sequence
  • Gene therapy systems can be broadly classified into viral vector-mediated systems and non-viral vector-mediated systems.
  • Viral vectors made using retroviruses or adenoviruses have the advantage of high transfection efficiency into cells, but have problems with immunogenicity and genes in vivo . Inherent problems such as recombination.
  • various polymeric gene delivery systems have been developed as an alternative to traditional viral vector-based gene delivery methods.
  • polymeric vectors have the problem of having intracellular trafficking barriers such as endosomal escape and nuclear localization.
  • Gene delivery systems based on synthetic peptides can condense DNA by causing leakage in endosomal membranes at low pH, and also promote endosomal escape, thereby overcoming the above problems associated with polymeric gene delivery systems. .
  • various synthetic peptides have been developed to promote gene transfer in different cell lines in vitro .
  • problems such as toxicity and serum instability in in vivo applications.
  • viral vectors have problems such as immune response, self-replicating, and stability in the body, and in general, polymeric polymer vectors have low biocompatibility, resulting in high cellular and biotoxicity and low nucleic acid delivery efficiency. There is this.
  • adipocytes especially mature mast fat cells
  • transfection transfection
  • electroporation has been used, but transfection efficiencies have been reported to be only about 10%.
  • the method in an in vivo gene delivery system has not been attempted for adipose tissue selective target delivery.
  • the present inventors while studying a non-viral gene delivery system, by combining a specific peptide and adipocyte targeting sequence (ATS) peptide complex with prohibitin expressed in mature fat cells, By promoting the expression of genes delivered by directly targeting, the mechanism for treating obesity and obesity-derived metabolic syndrome, etc. was first identified and completed the present invention.
  • ATS adipocyte targeting sequence
  • Another object of the present invention is to deliver a gene for the treatment of obesity and obesity-derived metabolic syndrome using the gene carrier.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of obesity and obesity-derived metabolic syndrome.
  • the present invention provides an adipocyte target gene transporter containing an adipocyte target sequence (ATS) and an R9 (arginine) peptide.
  • ATS adipocyte target sequence
  • R9 arginine
  • the adipocyte target sequence and R9 (arginine) peptide is characterized in that it is combined with prohibitin (prohibitin) to be internalized into adipocytes.
  • the R9 (arginine) peptide preferably has a Cys- (D-R) 9-Cys structure
  • the adipocyte target sequence may consist of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the adipocytes are characterized in that they are differentiated mature obese adipocytes, in particular, preferably mature mast fat cells 9 to 11 days from the start of differentiation.
  • the present invention provides an adipocyte target sequence; R9 (arginine) peptides; And a complex containing obesity and obesity-derived metabolic syndrome therapeutic genes as adipocyte target genes.
  • the therapeutic gene is most preferably iRNA such as siRNA or shRNA.
  • the obesity and obesity-derived metabolic syndrome therapeutic gene complex is a nano-sized having a diameter of less than 200 nm, especially, having a charge ratio (+ /-) of 3: 1 to 8: 1 has an excellent transfection efficiency And more preferably has a charge ratio (+/ ⁇ ) of 5: 1 to 8: 1. Since the cell membrane is negatively charged, the transfer efficiency is excellent when the gene transfer complex is positively charged as a whole. When the complex is negatively charged it does not pass easily through the cell membrane, while the positive charge is easily passed through the cell membrane by a charge-to-charge reaction. In addition, the amount of charge affects cell membrane permeability, and the higher the amount of charge, the greater the ability to pass through the cell membrane.
  • the present invention provides an adipocyte target sequence; R9 (arginine) peptides; And it provides a composition for the treatment of obesity and obesity-derived metabolic syndrome, comprising a complex containing the obesity and obesity-derived metabolic syndrome treatment gene as an active ingredient.
  • DNA or iRNA such as siRNA, shRNA and the like can be used as a gene for treating obesity and obesity-derived metabolic syndrome.
  • the ATS-R9 of the present invention binds with prohibitin in adipose tissue inflow vessels and then internalizes into adipocytes.
  • the ATS-R9 first targets and binds to mature adipose tissue inflow vessels through prohibitin, followed by blood vessels. It passes through and internalizes into fat cells. Therefore, the target genes can be delivered by targeting specific targets of differentiated mature obese adipocytes expressing adipose cells, especially prohibitin.
  • the present invention also has high transfection efficiency, low cytotoxicity, high target gene expression efficiency and thus can be used as an effective non-viral adipocyte target gene delivery system.
  • the ATS-R9 peptide construct according to the present invention has a specific function and effect of directly targeting mature obese adipocytes through gene overexpression of prohibitin in adipocytes after differentiation. This can be very useful for.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the gene transfer mechanism to adipocytes by the ATS-R9 oligo-peptoplex of the present invention.
  • Figure 2 is a graph of Oil Red O staining and quantitative analysis results for the degree of differentiation of 3T3-L1 adipocytes.
  • 3 and 4 show the results of confirming the intracellular distribution (internalization) of ATS-R9 over time to confirm the specific binding affinity of ATS-R9 for adipocytes.
  • Figure 9 shows the cell viability assay for toxicity evaluation of ATS-R9 / DNA oligo-peptoplexes.
  • Figure 11 shows the results of confirming the targeting effect of ATS-R9 on adipose tissue using diet-induced obesity (DIO) mice.
  • Figure 16 shows the results of confirming the weight loss after sh-FABP4-ATS-R9 oligo-peptoplex treatment.
  • FIG. 17 and FIG. 18 show the change in insulin and glucose tolerance after sh-FABP4-ATS-R9 oligo-peptoplex treatment.
  • FIG. 19 is a graph comparing gene transfer ability of ATS-R9 of the present invention with PEI and lipofectamin as a comparison group.
  • 20 is a graph comparing gene transfer efficacy before and after differentiation of adipocytes.
  • Gene means any nucleic acid sequence or portion thereof that has a functional role in protein coding or transcription or in the regulation of other gene expression.
  • the gene may consist of any nucleic acid encoding a functional protein or only a portion of a nucleic acid encoding or expressing a protein.
  • Nucleic acid sequences may include gene abnormalities in exons, introns, initiation or termination regions, promoter sequences, other regulatory sequences, or unique sequences adjacent to genes.
  • nucleotide or “nucleic acid” refers to nucleotide polymers of all lengths, such as ribonucleotides as well as deoxyribonucleotides. This term refers only to the primary structure of a molecule and therefore to double or single chain DNA or RNA.
  • a label, methylation, "caps” known in the art one or more naturally occurring nucleotide substitutions, debonding (eg methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoamidate, carbarnate) Including adjuncts (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.), proteins (eg, nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, poly-Llysine, etc.), inserts (eg, Having a chlorine (eg, a metal element, a radioactive metal element, boron, a metal oxide element, etc.), an alkyl compound, a modified bond (eg an alpha anomeric nucleic acid) Having, also refers to internucleotide modifications, including unmodified polynucleotides.
  • debonding eg methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoamidate, carbarnate
  • adjuncts eg, phosphorothioate, phosphorod
  • nucleic acid moieties provided by the present invention are regulatory elements derived from fragments of the genome and short oligonucleotide binders or a series of oligonucleotides, microorganisms or viral operons or eukaryotic genes. Will be aggregated into unique nucleotides that provide a synthetic nucleic acid that can be expressed in a recombinant transcriptional unit comprising a.
  • vector refers to a nucleic acid molecule capable of carrying another nucleic acid to which it is associated.
  • expression vector refers to a plasmid, cosmid or phage capable of synthesizing neuritin (CPG15) protein encoded by each recombinant gene carried by the vector. Include. Preferred vectors are those capable of self replication and expression of the associated nucleic acid.
  • Transfection refers to a method of expressing genotype in a cell by directly introducing nucleic acid (DNA, PNA, etc.) into the culture animal cell.
  • nucleic acid DNA, PNA, etc.
  • the cell wall is often removed and introduced into the protoplast.
  • various problems of medicine and biology such as carcinogens, infections, immunity, development, and communication, can be accessed at the cellular level.
  • the introduced gene was stabilized in cells, it was often interrupted by chromosomes.
  • a cell into which a nucleic acid is introduced is called a transducer. Since the transfection efficiency is very low, several methods have been developed to increase the efficiency. Among them, calcium phosphate coprecipitation and DEAE-textlan treatment. Electroporation, redistribution (fusion method with cells that make artificial membranes and DNA complexes called liposomes).
  • zeta potential is meant an electrodynamic potential difference resulting from the difference in positive charge density in the diffusion bilayer of immobilized moisture that is easily attached to the charged particle surface and movable moisture that is easily separated from the particle.
  • electrical potential difference sometimes referred to as the electrical potential difference or zeta potential between the cell surface and the surrounding culture.
  • Charge rate refers to the proportion of each charge used in a complex that functions as a gene carrier, in which negatively charged DNA binds to a positively charged carrier or carrier through electrostatic attraction. After the complex is formed, the transfer efficiency is good when the overall charge is positive, because the cell membrane is negatively charged.
  • amino acid and amino acid residue refer to natural amino acids, unnatural amino acids, and modified amino acids. Unless stated otherwise, all references to amino acids include references to both D and L stereoisomers (where the structure allows such stereoisomeric forms), either generically or by name.
  • Natural amino acids include alanine (Ala), arginine (Arg), asparagine (Asn), aspartic acid (Asp), cysteine (Cys), glutamine (Gln), glutamic acid (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), Leucine (Leu), Lysine (Lys), Methionine (Met), Phenylalanine (Phe), Proline (Pro), Serine (Ser), Threonine (Thr), Tryptophan (Trp), Tyrosine (Tyr) and Valine (Val) is included.
  • Non-natural amino acids include modified amino acid residues that are chemically modified on the N-terminal amino group or side chain group, or that are reversibly or irreversibly chemically blocked, such as N-methylated D and L amino acids or side chain functional groups as another functional group. Chemically modified residues are included.
  • a “progenitor cell” is an undifferentiated cell with self replication and differentiation potency, but ultimately a differentiated cell in which the type of cells to differentiate eventually is determined.
  • Progenitor cells have a predetermined differentiation pathway, but generally do not express markers of mature fully differentiated cells or function as mature fully differentiated cells. Thus, progenitor cells differentiate into related cell types but cannot form a wide variety of cell types under normal conditions.
  • fat precursor cells to be differentiated into fat cells are used.
  • “Differentiation” refers to a phenomenon in which the structure or function of each other is specialized during the division, proliferation, and growth of cells, that is, the shape or function of an organism's cells, tissues, etc. changes in order to perform a given task.
  • the present invention is directed to matured fat cells that have been differentiated.
  • Luciferase is an enzyme that promotes the oxidation of luciferin and converts chemical energy into light energy to emit light. It is used to measure expression continuously and in real time in vivo. It functions as a reporter gene that allows you to verify the effect. It can be obtained directly from insects such as firefly or glow-worm or by expression from microorganisms comprising recombinant DNA fragments encoding such enzymes.
  • a “carrier” or “carrier” refers to a polymer material that is responsible for transporting a carrier when an active substance in an organism is present in combination with another substance or when a substance is transported through a cell membrane.
  • carriers include, but are not limited to, buffers such as phosphate, citrate and other organic acids, antioxidants such as ascorbic acid, low molecular weight polypeptides (less than about 10 residues), proteins such as serum albumin, gelatin or immunoglobulins, polyvinylpyrrolidone Hydrophilic polymers such as glycine glutamine, amino acids such as asparagine, arginine or lysine, monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates including glucose, mannose or dextrins, chelating agents such as EDTA, sugar alcohols such as mannitol or sorbitol, salts such as sodium Salt-forming counterions, and / or nonionic surfactants such as TWEEN, polyethylene glycol (PEG) and PLU
  • Treatment is an approach for obtaining beneficial or desired results, including clinical results.
  • Treatment or “mitigation” of a disease, disorder or condition is a progression of progression with less and / or lesser extent of the condition, disorder or disease state and / or undesirable clinical signs compared to not treating the disorder. Means slowing down or getting longer.
  • weight loss eg at least 5% weight loss
  • beneficial or desirable clinical outcomes may alleviate or ameliorate one or more symptoms, reduce the extent of disease, or stabilize (ie, not worsen) a disease.
  • Treatment can also mean prolonging survival as compared to expected survival if untreated.
  • treatment does not need to occur by administration of a single dose and often occurs upon administration of a series of doses.
  • a therapeutically effective amount, an amount sufficient to alleviate, or an amount sufficient to treat a disease, disorder or condition may be administered in one or more administrations.
  • disorder is any condition that would benefit from treatment with molecules identified using the transgenic animal model of the present invention. This includes chronic and acute diseases or conditions, including pathological conditions that make mammals susceptible to mysterious diseases. Examples of diseases to be addressed herein include, but are not limited to, obesity, metabolic syndrome symptoms, and the like.
  • a “therapeutically effective amount” means an active compound in a composition that will elicit a biological or medical response in a tissue, system, subject or human being sought by a researcher, veterinarian, physician or other clinician, which includes alleviating the symptoms of the disorder to be treated. Means the amount of.
  • a “prophylactically effective amount” is a tissue pursued by a researcher, veterinarian, doctor or other clinician to prevent the development of obesity or obesity-related disorders, conditions or diseases in a subject at risk of obesity or obesity-related disorders, conditions or diseases. , Amount of active compound in a composition that will elicit a biological or medical response in a system, subject or human.
  • Geneology refers to treating a genetic disease by correcting a mutated gene or treating a disease by controlling protein expression using a gene or RNAi. In other words, it is a method of treating a disease by transplanting a normal gene to a patient's cell and changing the phenotype of the cell.
  • gene therapy for human sperm, egg and fertilized egg has raised ethical issues all over the world.However, since the guidelines for gene therapy clinical research were designated in the 1993s, it has entered the era of gene therapy. Gene therapy requires the study of gene vectors and systems that introduce genes into the body.
  • “About” means 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 for reference quantities, levels, values, numbers, frequencies, percentages, dimensions, sizes, quantities, weights, or lengths. , Amount, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length, varying by about 3, 2 or 1%.
  • the present invention relates to intracellular transfection of nucleic acid.
  • the present invention relates to gene delivery for treating obesity and obesity-derived metabolic syndrome, such as DNA, siRNA and shRNA, as adipocyte target genes, using a carrier that directly targets (targets) adipocytes.
  • the present invention relates to an adipocyte targeting gene transporter, which in one aspect comprises an adipocyte targeting sequence (ATS) and a poly (oligo-arginine), in particular an R9 (arginine) peptide. That is, the present invention is an invention for a non-viral gene transfer vector comprising an adipocyte target sequence (ATS) and a reducing poly (oligo-arginine).
  • ATS adipocyte targeting sequence
  • oligo-arginine poly (oligo-arginine) peptide
  • a non-viral gene transfer vector is a generic term for a carrier that carries a gene into a cell without using a virus.
  • the non-viral gene transfer vector uses a negative charge property of the nucleic acid constituting the gene.
  • Vectors in the form of coating nucleic acids using interactions are representative examples.
  • the poly (oligo-arginine) of the present invention includes poly (oligo-L-arginine) and poly (oligo-D-arginine), and among them, poly (oligo-D-arginine) is preferable.
  • High molecular weight poly (oligo-D-arginine) effectively promotes condensation of DNA to form stable complexes and internalization of DNA into cells, and after internalization the complexes escape from the endosome to the cytoplasmic space by reduction of disulfide bonds. do.
  • the reducing poly (oligo-D-arginine) of the present invention is preferably composed of a cationic oligomer including terminal cysteine crosslinked with disulfide, but is not limited thereto.
  • Cysteine is the only amino acid that contains sulfhydryl groups that form disulfide cross-linking with other adjacent cysteine molecules, and the protein delivery domain (PTD) moiety other than the disulfide-crosslinked terminal cysteine is any cationic peptide.
  • the reducing poly (oligo-D-arginine) of the present invention may consist of Cys- (D-R) 9-Cys repeat units.
  • Such a reducing poly may be prepared by DMSO oxidation of the terminal cysteine-thiol group of the Cys- (DR) 9-Cys repeating unit, and the Cys- (DR) 9-Cys as a reducing reagent. Can be fragmented.
  • the reducing poly (oligo-arginine) of the present invention is characterized by having nine arginine (R9), more preferably having a Cys- (D-R) 9-Cys structure. Cys is located at both ends such that the effective condensation of the oligo peptoplex (peptoplex) and thus the neutral charge properties of the complex can be retained.
  • Gene carrier of the present invention comprises the R9 (arginine) and adipocyte targeting sequence (ATS). That is, it contains a structure in which R9 (arginine) binds to an adipocyte target sequence (ATS) (ATS-R9).
  • the adipocyte targeting sequence may be a known ATS sequence [Nature medicine, 2004 June], but may be preferably composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • ATS-R9 of the present invention is characterized by binding to prohibitin in adipocytes.
  • Prohibitin is a receptor that is overexpressed in the endothelial cells of blood vessels that support adipocytes, and is an ATS receptor present in both mature adipocytes and progenitor adipocytes. Therefore, the ability to bind to ATS instead of its antibody can be measured to confirm prohibitin expression location and expression level.
  • Prohibitin plays a particularly important role in obesity, which is highly expressed in blood vessels of adipose tissue and is distributed to the plasma membrane in the nucleus and mitochondria compared to predifferentiation in differentiated adipocytes. Suggests a potential biomarker for this.
  • the prohibitin is less distributed in the plasma membrane in the progenitor cells and relatively higher in the nucleus and mitochondria, but in the differentiated adipocytes, the prohibitin, which is located in the nucleus and the mitochondria, moves to the plasma membrane and is higher. Expressed. That is, prohibitin is overexpressed as the differentiation progresses.
  • the ATS-R9 of the present invention is placed into adipocytes via a prohibitin-mediated mechanism. That is, ATS plays an important role in adipocyte targeting, and the degree of target gene expression depends on the level of prohibitin expression in adipocytes.
  • ATS-R9 of the present invention has a function of directly targeting differentiated mature obese adipocytes. This can be confirmed in Experimental Example 1. In particular, the best targeting ability to mature mast fat cells 9 to 11 days from the start of differentiation.
  • mature fat cells and “obesity fat cells” are used interchangeably with terms having the same meaning.
  • the present invention relates to methods and related systems for efficiently delivering specific genes in adipocytes using gene carriers that target (target) mast fat cells.
  • target target
  • specific genes targeting such obese fat cells known obesity and obesity-derived metabolic syndrome therapeutic genes can be used.
  • the present invention provides an adipocyte target sequence (ATS); R9 (arginine) peptides; And it relates to a complex containing the obesity and obesity-derived metabolic syndrome treatment genes as adipocyte target genes, and relates to the configuration in which the gene of interest is coupled to the gene carrier.
  • ATS adipocyte target sequence
  • R9 arginine
  • a target cell of the present invention cells corresponding to progenitor fat cells capable of differentiating into adipocytes may be used, but most preferably, the target cells are used to target mature fat cells (obesity fat cells, white fat cells, brown fat cells, etc.). It is good.
  • Progenitor cells include mesenchymal stem cells or stromal cells that maintain the ability to differentiate into a variety of cells including fat cells, as well as cells that can directly differentiate into adipocytes.
  • Each of the cells may be an initial cultured cell obtained from adipose tissue or the like of human or non-human mammal, or may be a cultured cultured cell line.
  • Subcutaneous fat and visceral fat are exemplified as a sampling source of adipose tissue, but are not limited thereto.
  • Adipose tissue is very suitable as a source of harvest of target cells because of the low risk of dysfunction to the individual by being collected.
  • mesenchymal stem cells and stromal cells can be obtained from bone marrow or other tissues.
  • the obesity and obesity-derived metabolic syndrome therapeutic gene delivered by the complex of the present invention can insert any gene that is desired to be expressed in the adipocytes of interest, and encompasses DNA and RNA and synthetic homologs thereof.
  • genes encoding polypeptides enzymes, hormones, growth factors, cytokines, receptors, structural proteins, etc.
  • antisense RNAs ribozymes, decoys, RNAs causing RNA interference, and the like are exemplified. Examples thereof include gDNA, cDNA, pDNA, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, miRNA, antigomere and the like.
  • oligonucleotides may be present or synthesized in nature and may exist in various sizes, from oligonucleotides to chromosomes, in size. These genes come from humans, animals, plants, bacteria, viruses and the like. These can be obtained using methods known in the art.
  • Polypeptides encoded by the gene may include various hormones, tissue-adhesive antigens, cell adhesion proteins, cytokines, various antibodies, cell receptors, intracellular or extracellular enzymes and fragments thereof.
  • Obesity and obesity-derived metabolic syndrome treatment gene expression regulators such as transcriptional promoters, enhancers, silencers, operators, terminators, attenuators and other expression regulators and the like can also be included.
  • the obesity and obesity-derived metabolic syndrome treatment gene preferably comprises a gene encoding a polypeptide associated with the treatment or diagnosis of obesity and obesity-derived metabolic syndrome.
  • the obesity and obesity-derived metabolic syndrome treatment gene is preferably RNA interference (RNAi) having a gene therapy effect on obesity diseases.
  • RNA interference is a natural mechanism that involves specifically down-regulating the expression of genes of interest by double-helix short interfering RNA (siRNA).
  • siRNA siRNA or miRNA (microRNA) or small hairpin RNA (shRNA).
  • the present invention relates to an obese or obese derived metabolic syndrome composition
  • a complex containing an adipocyte target sequence (ATS), an R9 (arginine) peptide and an obesity and obesity-derived metabolic syndrome treatment gene comprising a complex containing an adipocyte target sequence (ATS), an R9 (arginine) peptide and an obesity and obesity-derived metabolic syndrome treatment gene.
  • ATS adipocyte target sequence
  • R9 arginine
  • the obesity and obesity-derived metabolic syndrome treatment gene is preferably a gene having a gene therapy effect on obesity diseases, for example RNAi.
  • Effective dosages and schedules for the administration of RNAi can be determined empirically and can be readily determined by one skilled in the art. Single or multiple doses may be used.
  • “obesity or obesity-derived metabolic syndrome” is generally defined as having a body mass index (BMI) of greater than 30, but for the purposes of the present application, weight gain prevention is included, including subjects having a BMI of less than 30. All objects needed or desired are included in the category of "obesity”.
  • ATS-R9 is used to form a nanoscale complex through electrostatic interaction with the gene.
  • the biodegradable bond used here refers to a bond that can be converted into a less complex intermediate or final product by solubilization hydrolysis or by the action of an enzyme or organism.
  • ATS-R9 of the present invention which has a disulfide bond, is broken into small molecules when introduced into adipocytes, thereby releasing the target gene.
  • the carrier and the complex of the present invention for delivering the substance in adipocytes have the following advantages.
  • ATS plays an important role in "ATS-R9" of the present invention in adipocyte targeting.
  • the ATS-R9 transporter of the present invention targets to adipose tissue endothelial cells through binding to "prohibotin" expressed in adipocytes. That is, ATS targets adipocytes and internalizes into adipocytes via prohibitin-mediated mechanisms. In particular, mature mast cells after differentiation with overexpression of prohibitin are most preferred for the subject.
  • ATS-R9 oligo-peptoplexes enter cells through binding to prohibitin.
  • ATS-R9 of the present invention showed better transfection and gene expression efficiency than PEI and R9.
  • ATS-R9 quickly passes through the nucleus due to the high expression of prohibitin in the nucleus of mature adipocytes. This strongly suggests that ATS, a prohibitin targeting moiety, is very important for efficient targeting and selective gene expression in adipocytes. In other words, prohibitin is a potential target for the selective transformation of mature adipocytes.
  • the transfection efficiency of the ATS-R9 of the present invention is that the condensation of the ATS-R9 and the gene occurs well above the charge ratio of 3: 1, so that the charge ratio (+/-) of 3: 1 to 8: 1 is more preferable. Preferably, it has a charge ratio (+/-) of 5: 1 to 8: 1. In particular, in one embodiment the carrier of the present invention showed the highest gene transfection efficiency at a charge ratio of 5: 1.
  • the charge ratio refers to the amount of the carrier to be reacted after phosphate is negatively charged and the arginine is positively charged among the components of the gene based on the negative charge of the gene.
  • a factor of 8 to 8 times higher means the reaction rate. That is, having a charge ratio of 3: 1 to 8: 1 means that the amount of the carrier is 3 to 8 times larger than the target gene.
  • the cell membrane is negatively charged, so that when the gene transfer complex is positively charged as a whole, the transfer efficiency is excellent.
  • the complex When the complex is negatively charged, it does not easily pass through the cell membrane, whereas when the complex is positively charged, it can easily pass through the cell membrane by a charge-to-charge reaction.
  • the amount of charge affects cell membrane permeability, and the higher the amount of charge, the greater the ability to pass through the cell membrane.
  • ATS-R9 of the present invention gradually increases the transfection efficiency up to 10 days of differentiation.
  • prohibitin is upregulated to enhance transfection efficiency of ATS-R9.
  • One embodiment confirmed that the highest transfection efficiency for mature mast fat cells 9 to 11 days from the start of differentiation.
  • the complex of the present invention expresses a gene of interest depending on the level of prohibitin expression in adipocytes.
  • ATS-R9 of the present invention has a much higher gene expression efficiency compared to the commonly used cationic carrier PEI.
  • ATS-R9 shows more effective DNA condensation ability and protects DNA from degradation in serum at an appropriate charge ratio.
  • ATS-R9 of the present invention binds to DNA to form a nano-sized complex and has a positive zeta potential value.
  • ATS-R9 has the advantage of more efficient DNA concentration by electrostatic interaction at relatively low N / P ratio (polymer nitrogen (+) / pDNA phosphate (-)), for example when bound to DNA. . That is, it can exhibit positive charge in neutral conditions, effectively concentrating DNA to nanosize size (about 200 nm or less), and having a positive zeta potential of one or more charge ratios. This is because the oligopeptide of the present invention contains a Cys structure at both ends.
  • the negative electrode cannot easily pass through the cell membrane having the same negative charge, while the positively charged complex can easily pass through the cell membrane by a charge-to-charge reaction, thereby providing a positive amount of the present invention.
  • the property of having a zeta potential value means that the gene transfer efficiency is excellent.
  • ATS-R9 of the present invention shows significantly lower cytotoxicity.
  • ATS-R9 showed non-toxicity up to charge ratio 9 compared to toxic PEI, and cell viability was 90% or more at all charge ratios performed.
  • the ATS-R9 of the present invention binds with prohibitin in adipose tissue vessels and then effectively internalizes into adipocytes, especially differentiated mature obese adipocytes. That is, in vivo localization of ATS-R9 may include targeting and binding of adipose tissue vessels through prohibitin; Passage of blood vessels; And three stages of internalization into adipocytes.
  • the present invention has high transfection efficiency, low cytotoxicity, high target gene expression efficiency and thus can be used as an effective non-viral obesity and obesity-derived metabolic syndrome treatment gene delivery system.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • glucose FBS were purchased from WelGENE (Korea)
  • insulin and 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) were obtained from Wako (Japan)
  • dexamethasone and Oil Red O were obtained from Sigma-Aldrich ( From the United States).
  • 3T3-L1 precursor adipocytes preadipocytes were purchased from Korean cell line banks to induce differentiation.
  • Progenitor cells were cultured in 37%, 5% CO 2 atmosphere in complete medium supplemented with glucose, 10% FBS, 1% penicillin and streptomycin. Cells were passaged three times a week.
  • differentiation induction medium containing complete medium, 10 ⁇ g / mL insulin, 1 ⁇ M Dexamethasone and 0.5 mM IBMX.
  • Differentiation medium was replaced with adipocyte maintenance medium containing complete medium and 10 ⁇ g / mL insulin. Medium was changed every two days.
  • Rhodamine B-linked ATS CKGGRAKDC
  • FITC-bound ATS-R9 CKGGRAKDRRRRRRRRR
  • R9 CRRRRRRRRRC
  • Adipocyte differentiation was confirmed by Oil Red O staining.
  • Oil Red O solution 0.7 g of Oil Red O powder was dissolved in 200 mL isopropanol, stirred overnight and filtered through a 0.22 ⁇ m syringe filter.
  • the Oil Red O solution was mixed with deionized water in a ratio of 6: 4 to make an Oil Red O working solution and filtered through a 0.22 ⁇ m syringe filter.
  • cells were rinsed with PBS (Phosphate Buffered Saline) and fixed in PBS containing 3.7% formaldehyde for 1 hour at room temperature. After fixation, cells were washed with 60% isopropanol and dried on a clean bench. After complete drying, cells were stained with Oil Red O working solution and incubated for 15 minutes.
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • the cells were washed four times with deionized water and images were captured under the microscope.
  • Oil Red O accumulated with 100% isopropanol was removed from the cells and absorbance was measured at 520 nm.
  • Cellmask Deep Red was purchased from Invitrogen and DAPI-Fluoromount-G was purchased from Southern Biotech. 3T3-L1 precursor adipocytes, H9c2 and HEK293 cells were grown and differentiated on coverslips placed in 6 well plates.
  • cells were treated with FITC binding ATS-R9 (25 ⁇ g / mL) and incubated in a time dependent manner ranging from 15 minutes to 72 hours.
  • 3T3-L1 precursor adipocytes and mature adipocytes were treated with free ATS (100 ⁇ g / mL). After 6 hours of culture, cells were treated with FITC-ATS-R9 oligo-peptoplexes and incubated for 24 hours. H9c2 and HEK293 cell lines were used as controls. H9c2 and HEK293 cells were treated with FITC bound ATS-R9 (25 ⁇ g / mL) oligo-peptoplexes and incubated for 24 hours.
  • Oligo-peptoplexe was prepared by incubating at room temperature, and electrophoresis was performed for 25 minutes under 0.5% TBE buffer on a 0.8% agarose gel (100 V).
  • oligopeptoplex 5 ⁇ g luciferase plasmid DNA (p- ⁇ -Luci), deionized water and ATS-R9 (charge ratios: 0.5, 1, 3, 5, 7, and 9) were incubated for 30 minutes at room temperature to obtain an oligopeptoplex ( oligo-peptoplexe) was produced.
  • the average diameter and surface zeta potential of the oligo peptoplexes were determined using a DLS with Zetasizer-Nano ZS (Malvern Instruments, UK).
  • Luciferase assay kit was purchased from Promega (USA) and DC protein assay kit and bovine serum albumin standard were purchased from Bio-Rad Laboratories (USA). Preadipocytes 3T3-L1 and differentiated adipocytes were seeded in 24 well plates.
  • Oligo-peptoplexes were prepared by mixing ATS-R9 and 2 ⁇ g luciferase plasmid DNA at charge ratio 5. R9 and PEI polyplexes were used as controls at charge ratio 5. Cells were transfected 24 hours after seeding.
  • the luminescence of the cell lysates was measured by a 96-well plate photometer (Berthold Detection Systems, Germany) by 20 seconds integration and expressed as relative luminescence units (RLU) per mg of cell protein. Proteins were determined with a DC protein assay kit using bovine serum albumin standard.
  • 3T3-L1 differentiated adipocytes were cultured in 24 well plates and adipocytes (day 10) were treated with oligo-peptoplexes made with luciferase plasmid DNA, plain DMEM, ATS-R9 at a defined charge rate. . PEI polyplex was used as a control.
  • mice Three week old C57BL / 6J mice were purchased from Central Lab Animal Inc. (Korea). During the first two weeks, 60 kcal% rodent diet was raised from 50% normal diet and fat. Gradually increased high fat diet ratio for mice and started at 7 weeks; The mice were only reared in a high fat diet at 60 kcal% from fat. After 14 weeks mice became obese (weight> 45 g).
  • FITC bound ATS-R9 (10 mg / mL) and FITC-R9 (10 mg / mL) were diluted in PBS to a final concentration of 1.5 mg / mL and 100 ⁇ l peptide was injected by tail vein injection into obese mice. .
  • ATS-R9 To monitor the degree of internalization of ATS-R9 into cells, mature adipocytes and precursor adipocytes were treated with FITC-labeled ATS-R9 (FITC-ATS-R9) and intracellular delivery of carriers was confirmed.
  • 3T3-L1 differentiated into adipocytes was treated with FITC-conjugated ATS-R9 (25 ⁇ g / mL) and incubated until defined time. Plasma membranes were stained with Cellmask Deep Red and nuclei were counterstained with DAPI. The blue channel (for DAPI) is depicted in white, demonstrating nuclear localization of ATS-R9. Images were captured with a confocal laser scanning microscope. Scale Bar: 10 ⁇ m.
  • ATS-R9 internalized very rapidly into 3T3-L1 adipocytes. Within 15 minutes and 1 hour, they reached the cytoplasm and nucleus, respectively, and maintained a strong fluorescence signal until 48 hours.
  • ATS-R9 was delivered to cells very quickly.
  • the intracellular distribution of ATS-R9 over time is shown in FIG. 3.
  • ATS-R9 reached the cytoplasm within 15 minutes and the nucleus within 1 hour and remained stationary for 48 hours. On the other hand, ATS-R9 remained in a steady state after 24 hours and progenitor cell migration was observed after 48 hours.
  • 3T3-L1 precursor adipocytes and mature adipocytes were treated with free-ATS on day 10 and blocked receptors for 6 hours.
  • FITC-ATS-R9 / pLuc complex FITC-ATS-R9 / pLuc complex referred to as oligo-peptoplex (oligo-peptide / DNA complex)
  • HEK293 and H9c2 cells that do not express prohibitin on the plasma membrane were used as controls. Cells were treated with FITC bound ATS-R9 oligo-peptoplexes and incubated for 24 hours.
  • ATS-R9 targets adipocytes, recognizes adipocytes, and internalizes them intracellularly through prohibitin-mediated mechanisms regardless of their differentiation status. That is, the binding affinity of ATS-R9 was confirmed to be adipocyte specific through these results.
  • adipocytes Two types of adipocytes were treated with rhodamine B-labeled ATS (RhoB-ATS) to confirm the location and amount of prohibitin expression according to the degree of adipocyte differentiation. Because of the high prohibitin binding ability of ATS, ATS can be used instead of antibodies to identify prohibitin.
  • adipocytes progenitor adipocytes
  • adipocytes probesity adipocytes
  • Prohibitin bound ATS was confirmed by immunoprecipitation assay (FIG. 5A), and prohibitin distribution in 3T3-L1 precursor adipocytes and mature adipocytes was confirmed by staining results (FIGS. 5B and 5C, respectively). ). It can be confirmed that the ATS is effectively delivered to differentiated obese fat cells through FIG. 5B, and the difference in expression of prohibitin, which is a ligand of ATS, can be confirmed through FIG. 5C.
  • prohibitin was highly expressed in plasma membrane, cytoplasm and nucleus in mature adipocytes, and low expression level in cytoplasm was primarily expressed in progenitor cells. This difference in prohibitin distribution means that intracellular ATS-R9 delivery and distribution mechanisms differ in mature adipocytes and progenitor adipocytes.
  • the adipocyte targeting efficiency by ATS is not very high in adipocytes before differentiation, but the adipocyte targeting efficiency by ATS is very high in mast cells after differentiation.
  • Comparative Example 1 Confirmation of prohibitin expression in non-obese (mature) adipocytes and muscle cells
  • biochemical properties of cationic polymer / DNA complexes are one of the major factors affecting cellular uptake, cargo stability, cytotoxicity and transgene expression. DNA condensation and protection of ATS-R9 was tested by gel delay assay and degradation test in mouse serum.
  • Oligo-peptoplexes were prepared by luciferase plasmid DNA (p- ⁇ -Luci), deionized water and ATS-R9 or PEI at a defined charge rate and incubated at room temperature for 30 minutes.
  • oligo-peptoplexes were prepared at defined charge ratios, mouse serum was added to the polyplex at a final concentration of 50% (vol / vol) and the samples were incubated at 37 ° C. for 2 hours.
  • heparin in phosphate-buffered saline pH 7.4, 0.5 mol / L NaCl was added to the sample in the presence of 0.01 mol / L EDTA and incubated for 1 hour. . Samples were loaded on 0.8% agarose gel.
  • ATS-R9 can efficiently condense plasmid DNA and is protected from serum degradation. After formation of the complex with DNA, a smaller complex that is positively charged can be efficiently internalized by the cell.
  • the zeta potential at the charge ratio 3 or higher showed a positive value, and at the charge ratio 1 or higher, the average diameter was less than 200 nm.
  • the differentiated adipocytes showed cell viability of 90% or more up to the charge ratio 9, which means that the oligo-peptoplexes are nontoxic to the differentiated adipocytes compared to the toxic PEI.
  • Mature adipocytes were transfected with ATS-R9, R9 and PEI at charge ratio 5 with p- ⁇ -Luci on day 10 of differentiation and after 72 hours luciferase gene expression was measured with a luciferase assay kit.
  • ATS-R9 has a high transformation efficiency compared to R9 and PEI at the same charge ratio, the transformation and gene expression efficiency increased with adipocyte differentiation time.
  • 3T3-L1 differentiated adipocytes were transfected by ATS-R9 and PEI at charge ratio 5 with luciferase plasmid DNA (p-Luci) at different differentiation dates to determine the optimal time for transfection. Luciferase gene expression was measured after 72 hours by the Luciferase Assay Kit.
  • FITC-ATS-R9 was administered via tail vein to obese mice to observe targeting of ATS-R9 to adipose tissue. Tracking was visualized using a probe based confocal laser endomicroscope (pCLE, Cell Pascalo).
  • ATS-R9 aggregated in the fat pad vasculature.
  • ATS-R9 only floated along the vessel and no aggregation was observed (FIG. 11).
  • ATS-R9 treatment produced highly accumulated fluorescence intensity at the endothelial edge, whereas R9 treatment produced fluorescence intensity over the entire vascular area (FIG. 13). That is, as compared to the fat targeting of FITC-conjugated ATS-R9 and R9 in fat pad microvessels, ATS-R9 binds in fat pad microvessels but in the case of R9 This was not observed.
  • ATS-R9 binds with adipose vessels and forms agglomerates in the endothelium of the vessels. In contrast, ATS-R9 continues to move along blood vessels without representative binding or aggregation of ATS-R9-endothelial interactions in the liver and kidney.
  • ATS-R9 can selectively bind to adipose tissue vasculature, which aggregates only in microvessels of blood vessels and adipose tissue, but not in other organs such as liver or kidney.
  • ATS-R9 binding pattern in adipose tissue is completely different from conventional simple arginine binding constructs.
  • ATS-R9 is internalized into adipose tissue in vivo .
  • C57BL / 6J obese mice were injected with FITC-conjugated ATS-R9 through the tail vein, and angiostained by injecting Rhodamine-conjugated lectin.
  • Immobilized adipose tissue was observed by imaging using a multiphoton confocal laser scanning microscope. As a result, it was observed that ATS-R9 penetrated through blood vessels and gradually internalized into adipocytes (FIG. 14A). White arrows indicate FITC-ATS-R9 internalizing into adipocytes (Scale Bar: 50 ⁇ m).
  • FITC-ATS-R9 induction ability was confirmed in adipose tissue through immunofluorescence analysis.
  • FITC-conjugated ATS-R9 was injected into obese mouse C57BL / 6J and the immobilized adipose tissue was incubated with a biotin-conjugated anti-FITC antibody. Cy3-conjugated ExtrAvidin was used for its signal amplification. As a result of imaging using a multiphoton confocal laser scanning microscope, it was confirmed that FITC-ATS-R9 was induced into adipose tissue as shown in FIG. 14B.
  • ATS-R9 of the present invention has an excellent effect on sh-RNA delivery and silent gene delivery to adipocytes in vitro and in vivo .
  • fabp4 sh-RNA was transfected into 3T3-L1 mature adipocytes by ATS-R9, PEI and lipofectamine, and gene silencing efficiency was measured by RT-PCR. GAPDH was used as an endogenous control. As a result, Fabp4 gene silencing efficiency was 70% or more (FIG. 15).
  • C57BL / 6J mice were treated with ATS-R9 with 30 ⁇ g of sh-FABP4 twice weekly for 8 weeks and injected subcutaneously with oligo-peptoplexes.
  • sh-Luci was used as a control.
  • sh-FABP4-ATS-R9 oligo-peptoplex treated group lost about 20% of body weight after 8 weeks.
  • C57BL / 6J mice were treated with sh-FABP4-ATS-R9 oligo-peptoplexes twice weekly for 8 weeks. Oligo-peptoplexes were administered by subcutaneous administration. sh-Luci was used as a control.
  • the ATS-R9 of the present invention is not only effective for sh-RNA delivery and silent gene delivery to adipocytes in vitro and in vivo , but also to reduce body weight when delivering genes for treating obesity and obesity-derived metabolic syndrome. Insulin and glucose sensitivity were improved.
  • ATS-R9 was superior to other fat carriers in delivering fat to fat cells compared to PEI and lipofectamin.
  • Luciferase was used as a transfer gene and Scrambled ATS was used as a fat targeting sequence to compare gene transfer efficacy to mast fat cells.
  • ATS-R9 peptide construct of the present invention can directly target mature "obesity fat cells” and deliver genes through the mechanism of overexpression of prohibitin in adipocytes after differentiation. Since it can be confirmed, it can be very useful for gene therapy methods for obesity.

Abstract

본 발명은 지방세포를 표적으로 하는 유전자 전달 및 이를 이용한 비만 및 비만유래 대사증후군 치료 시스템에 대한 발명으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 지방 표적 서열(ATS)-R9(arginine) 펩타이드를 포함하는, 분화된 비만(성숙) 지방 세포를 직접적으로 타겟팅하는 비바이러스성 유전자 전달 시스템에 대한 발명이다.

Description

지방세포 표적 비바이러스성 유전자 전달체
본 발명은 지방세포를 표적으로 하는 비바이러스성 유전자 전달체 및 이를 이용한 비만 및 비만유래 대사증후군 치료 시스템에 대한 발명으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 지방 표적 서열(ATS)-R9(arginine) 펩타이드를 포함하는, 분화된 비만(성숙) 지방 세포를 직접적으로 타겟팅하는 비바이러스성 유전자 전달체에 대한 발명이다.
통상적인 단백질 치료의 대용으로서 다양한 유전자 치료 기법이 발달되어 왔으나, 이에는 여전히 해결되어야 할 중요한 과제들이 존재한다. 유전자 치료의 주요한 과제 중 하나는 최소 세포독성을 가지고 원형질막(동물세포) 및 핵막을 통한 효율적인 유전자 유입(influx)을 달성하는 것이다.
유전자 치료 시스템은 크게 바이러스성 벡터-매개 시스템 및 비바이러스성 벡터-매개 시스템으로 분류될 수 있다. 레트로바이러스(retrovirus) 또는 아데노바이러스(adenovirus) 등을 이용하여 만든 바이러스성 벡터는 세포 내로의 높은 형질 주입(트랜스펙션, transfection) 효율을 갖는다는 장점이 있으나, in vivo에서 면역원성의 문제 및 유전자 재조합과 같은 내재적 문제점 등을 갖는다. 이러한 바이러스성 벡터의 안정성 문제를 극복하기 위하여, 다양한 중합체성 유전자 전달 시스템이 전통적인 바이러스성 벡터-기재 유전자 전달 방법에 대한 대안으로서 발달되어 왔다. 그러나, 중합체성 벡터는 엔도좀 탈출(endosomal escape) 및 핵 편재화(nuclear localization)와 같은 세포내 트래피킹(trafficking) 장벽을 갖는다는 문제점이 있다.
한편, 합성 펩타이드에 기초한 유전자 전달 시스템은, 낮은 pH에서 엔도좀 막 내에서의 누출을 야기시킴으로써 DNA를 응축시키고, 또한 엔도좀 탈출을 촉진하므로 중합체성 유전자 전달 시스템과 관련된 상기 문제점들을 극복할 수 있다. 이러한 이유로, 다양한 합성 펩타이드가 in vitro에서 여러 세포주에서의 유전자 전달을 촉진하는 것으로 개발되어 왔다. 그러나, 이 역시 in vivo 적용에 있어서 독성 및 혈청 불안정성 등의 문제점이 존재한다.
상기 언급된 바와 같이 바이러스성 벡터의 경우 면역반응, 자가복제, 체내 안정성과 같은 문제점이 있으며, 일반적인 중합체성 고분자 벡터의 경우 생체 적합성이 떨어지고 이로 인하여 세포 및 생체 독성이 크고 핵산 전달 효율이 낮다는 문제점이 있다.
이와 관련하여 짧은 양이온성 펩타이드를 이용한 벡터에 대한 연구가 진행되고 있으나, 이 경우 세포외 공간에서 DNA가 불안정하다는 문제점이 있으며, 또한 DNA와의 복합체의 안정성 및 유전자 발현의 수준 등이 불충분하다는 문제점이 존재한다.
더욱이, 특정 세포로의 타겟팅 능력을 보유하여 DNA의 표적 세포 내로의 유입 및 복합체로부터의 DNA의 유리를 원활히 하여 목적 유전자 발현의 수준을 높일 수 있는, 특정 세포 특이적인 유전자 전달 벡터의 개발이 필요하다.
이와 관련하여, 지방세포, 특히 성숙(mature)된 비만 지방세포는 최종적으로 분화된 세포이므로 형질주입(트랜스펙션)이 매우 어렵다. 이전 연구에서, 전기천공이 사용되어 왔으나, 트랜스펙션 효율은 겨우 약 10% 정도로 보고되고 있다. 게다가, in vivo 유전자 전달 시스템에서의 상기 방법은 지방 조직 선택적 표적 전달이 시도된 바 없다.
이에 본 발명자들은 비바이러스성 유전자 전달 시스템을 연구하던 중, 특정 펩타이드 및 지방세포 표적 서열(adipocyte targeting sequence, ATS) 펩타이드 복합체가 성숙 지방 세포내 발현되어 있는 프로히비틴과 결합함으로써, 비만 지방 세포를 직접적으로 타겟팅하여 전달한 유전자들의 발현을 촉진시킴으로써 비만 및 비만 유래 대사증후군 등을 치료할 수 있는 기작을 최초로 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주요 목적은 지방세포를 표적(타겟팅)으로 하는 유전자 전달체 및 이에 목적하는 유전자가 결합된 복합체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자 전달체를 이용하여 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료용 유전자를 전달하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 비만 및 비만 유래 대사증후군의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 지방세포 표적 서열(ATS) 및 R9(arginine) 펩타이드를 함유하는, 지방세포 표적 유전자 전달체를 제공한다.
이 때, 상기 지방세포 표적 서열 및 R9(arginine) 펩타이드는 프로히비틴(prohibitin)과 결합되어 지방세포 내로 내재화되는 특징을 가진다.
특히, 상기 R9(arginine) 펩타이드는 Cys-(D-R)9-Cys 구조를 가지는 것이 바람직하고, 상기 지방세포 표적 서열은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
상기 지방세포는 분화된 성숙 비만 지방세포인 것을 특징으로 하는데, 특히, 분화 개시 9 내지 11일 된 성숙된 비만 지방세포인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 지방세포 표적 서열; R9(arginine) 펩타이드; 및 지방세포 표적 유전자로서 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자를 함유하는 복합체를 제공한다.
즉, 상기 유전자 전달체에 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자로서, 예를 들어, DNA, siRNA, shRNA 등이 결합된 형태에 관한 것이며, 각 구성에 대한 설명은 유전자 전달체의 경우와 동일하나, 이 때, 상기 비만 치료 유전자로서 치료 유전자로는 siRNA 또는 shRNA 등의 iRNA인 것이 가장 바람직하다.
상기 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자 복합체는 200 nm 이하의 직경을 가지는 나노크기의 것으로, 특히, 3 : 1 내지 8 : 1의 전하비율(+/-)을 가지는 경우 우수한 트랜스펙션 효율을 가진다, 더욱 바람직하게는 5 : 1 내지 8 : 1의 전하비율(+/-)을 가진다. 세포막이 음전하를 띠고 있기 때문에, 유전자 전달 복합체가 전체적으로 양전하를 띠고 있을 때, 전달효율이 우수하다. 복합체가 음전하를 띠는 경우는 세포막을 쉽게 통과하지 못하는 반면 양전하를 띠는 경우는 전하대 전하 반응으로 쉽게 세포막을 통과할 수 있기 때문이다. 또한, 전하량은 세포막 투과능에 영향을 끼치는데, 전하량이 높을수록 세포막을 통과할 수 있는 능력도 커지게 된다.
또한, 본 발명은 지방세포 표적 서열; R9(arginine) 펩타이드; 및 지방세포 표적 유전자로서 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자를 함유하는 복합체를 유효성분으로 함유하는, 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료용 조성물을 제공한다. 이 때도 역시, 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자로서는 DNA 또는 iRNA, 예를 들어 siRNA, shRNA 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 ATS-R9는 지방 조직 유입혈관에서 프로히비틴과 결합하고 이어서 지방세포 내로 내재화시키는데, 이를 간략히 설명하면, 우선 프로히비틴을 통해 성숙 지방 조직 유입혈관의 타겟팅 및 결합이 이루어진 후, 혈관을 통과하여 지방세포 내로의 내재화가 이루어지는 것이다. 그러므로 지방세포, 특히 프로히비틴을 많이 발현하고 있는 분화된 성숙 비만 지방세포를 특정 표적으로 타겟팅하여 목적 유전자를 전달할 수 있는 것이다.
본 발명은 또한 높은 트랜스펙션 효율, 낮은 세포독성, 높은 목적 유전자 발현 효율을 가지므로 효과적인 비바이러스성 지방세포 표적 유전자 전달 시스템으로 사용될 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 ATS-R9 펩티드 구조체는 분화 후 지방 세포에서의 프로히비틴의 과발현 기작을 통해서 성숙한 비만 지방세포를 직접적으로 타겟팅하여 유전자를 전달할 수 있는 특이적 기능 및 효과가 있어 비만에 대한 유전자 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 ATS-R9 올리고-펩토플렉스에 의한 지방세포로의 유전자 전달 메커니즘을 나타낸 모식도이다.
도 2는 3T3-L1 지방세포 분화정도에 대한 Oil Red O 염색 결과 및 정량분석 결과 그래프이다.
도 3 및 도 4는 지방세포에 대한 ATS-R9의 특이적인 결합 친화도를 확인하기 위해 시간에 따른 ATS-R9의 세포내 분포(내재화)를 확인한 결과이다.
도 5는 3T3-L1 지방세포 분화정도에 따른 프로히비틴 분포 결과이다.
도 6은 비만 마우스와 비교하여, 비-비만 마우스와 근육세포에 대한 프로히비틴 발현 결과를 비교한 웨스턴 블럿 결과이다.
도 7은 ATS-R9의 DNA 응축 및 보호 능력에 대한 겔 지연 분석 및 마우스 혈청에서의 분해(degradation) 테스트 결과이다.
도 8은 ATS-R9/DNA 올리고-펩토플렉스의 제타 포텐셜 및 평균 직경을 측정한 결과이다.
도 9는 ATS-R9/DNA 올리고-펩토플렉스의 독성 평가를 위한 세포 생존능 분석결과이다.
도 10은 올리고-펩토플렉스의 트랜스펙션 효율의 비교결과이다.
도 11은 식이 유도 비만(diet-induced obesity, DIO) 마우스를 이용하여 지방 조직에 대한 ATS-R9의 타겟팅 효과를 확인한 결과이다.
도 12 내지 도 13는 ATS-R9의 표적 효율(homing ability)을 R9의 경우와 비교하여, in vivo에서 ATS-R9의 표적 효율을 효과를 확인한 결과이다.
도 14는 ATS-R9의 in vivo 내의 유전자 발현 효과를 확인한 결과이다.
도 15는 ATS-R9의 in vitro 및 in vivo에서 sh-RNA 전달과 지방세포에 사일런트 유전자 전달능을 확인한 결과이다.
도 16은 sh-FABP4-ATS-R9 올리고-펩토플렉스 처리 후 체중 감소 효과를 확인한 결과이다.
도 17 및 도 18은 sh-FABP4-ATS-R9 올리고-펩토플렉스 처리 후 인슐린 및 글루코스 내성(tolerance) 변화를 확인한 결과이다.
도 19는 PEI와 리포펙타민(lipofectamin)을 비교군으로 하여 본 발명의 ATS-R9의 유전자 전달능을 비교한 그래프이다.
도 20은 지방세포의 분화 전과 후의 유전자 전달 효능을 비교한 그래프이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.
"폴리뉴클레오티드(polynucleotide)" 또는 "핵산(nucleic acid)"이라는 용어는 리보뉴클레오티드 뿐만 아니라 디옥시리보뉴클레오티드 등 온갖 길이의 뉴클레오티드 중합체를 의미한다. 이 용어는 분자의 1차적 구조만을 의미하고, 따라서 이중 또는 단일 사슬의 DNA 또는 RNA를 의미한다. 이것은 또한 변형의 알려진 유형, 예를 들어 당해 분야에서 알려진 표지(label), 메틸화, "caps", 유사체의 하나 혹은 그 이상의 자연 발생의 뉴클레오티드 치환, 탈결합(예: methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoamidate, carbarnate 등)과 결합(예: phosphorothioate, phosphorodithioate 등), 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드(signal peptide), poly-Llysine 등) 등의 부속물을 포함하는 것, 삽입물(예: 아크리딘, Psolalen 등)을 가지는 것, 킬레이트(예: 금속원소, 방사성 금속원소, 붕소, 산화 금속원소 등)을 가지는 것, 알킬화합물을 가지는 것, 변형된 결합(예: alpha anomeric 핵산 등)을 가지는 것, 또한 폴리뉴클레오티드의 비변형을 포함한 뉴클레오티드간 변형을 의미한다. 일반적으로, 본 발명에 의해 제공되는 핵산 부분은 지놈(genome)의 파편과 짧은 올리고뉴클레오티드 결합자 또는 일련의 올리고뉴클레오티드, 미생물 또는 바이러스 오페론(operon)이나 진핵세포 유전자로부터 유도된 조절인자(regulatory element)를 포함하는 재조합 전사 단위로 발현될 수 있는 합성 핵산을 제공하는 특유의 뉴클레오티드들로 뭉쳐질 것이다.
"벡터(vector)"라는 용어는 다른 핵산을 그것이 연관된 곳으로 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. "발현베터(expression vector)"라는 용어는 벡터에 의해 운반된 각각의 재조합 유전자에 의해 암호화된 뉴리틴(Neuritin, CPG15) 단백질을 합성할 수 있는 플라스미드, 코스미드(cosmid) 또는 파지(phage)를 포함한다. 바람직한 벡터는 연관된 핵산의 자가복제와 발현이 가능한 것이다.
"트랜스펙션(transfection)"은 배양동물 세포에 핵산(DNA, PNA 등)을 직접 도입하여 세포 내에서 유전형질을 발현시키는 방법을 의미한다. 대상이 식물세포일 때는 세포벽을 제거하고 원형질체로 도입하는 경우도 많다. 이 방법으로 발암기구, 감염, 면역, 발생, 정보전달 등 의학, 생물학의 여러 가지 문제에 세포 수준에서 접근할 수 있게 되었다. 도입한 핵산은 목적으로 하는 유전자를 플라스미드 등의 매개체에 넣어 도입하는 것이 일반적인 방법이다. 도입한 유전자가 세포에서 안정화된 경우는 염색체에 끼어들어간 경우가 많았다. 핵산을 도입한 세포를 형질도입체라고 한다. 형질주입 효율이 매우 낮기 때문에 효율을 높이기 위해서 여러 가지 방법을 개발되었다. 그 중에서도 인산칼슘공침법, DEAE-텍스트란처리법. 전기천공법, 재분포법(리포솜이라는 인공막과 DNA복합체를 만들게 하는 세포와 융합시키는 방법) 등이 있다.
"제타 포텐셜(zeta potential)"이란 대전된 입자표면에 붙어 있는 불가동수분과 입자로부터 쉽게 떨어져 나갈 수 있는 가동수분의 확산 이중층에서의 양전하 밀도차이에서 유래되는 전기역학적인 전위차를 의미한다. 세포표면과 주변 배양액 사이의 전기적 전위차 또는 제타전위로 나타내기도 한다.
"전하 비율"은 유전자 전달체로서 기능하고 있는 복합체에 있어서, 음전하를 지닌 DNA가 정전기적 인력을 통해 양전하의 담체 또는 캐리어(carrier)와 결합함에 있어서 사용된 각 전하량의 비율을 의미한다. 복합체가 만들어진 후 전체적인 전하가 양전하일 때 전달효율이 좋은데, 이는 세포막이 음전하를 띠고 있기 때문이다.
"아미노산" 및 "아미노산 잔기"는 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 및 변형된 아미노산을 의미한다. 달리 언급되지 않는 한, 아미노산에 대한 모든 언급은, 일반적으로 또는 명칭에 따라 특이적으로, D 및 L 입체이성질체(구조가 이같은 입체이성질체 형태를 허용하는 경우) 양쪽 모두에 대한 언급을 포함한다. 천연 아미노산에는 알라닌 (Ala), 아르기닌 (Arg), 아스파라긴 (Asn), 아스파르트산 (Asp), 시스테인 (Cys), 글루타민 (Gln), 글루탐산 (Glu), 글리신 (Gly), 히스티딘 (His), 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 라이신 (Lys), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 트립토판 (Trp), 타이로신 (Tyr) 및 발린(Val)이 포함된다. 비천연 아미노산에는 N-말단 아미노기 또는 측쇄 기 상에서 화학적으로 변형된, 또는 가역적또는 비가역적으로 화학적으로 차단된 변형 아미노산 잔기, 예를 들어, N-메틸화 D 및 L 아미노산 또는 측쇄 관능기가 또다른 관능기로 화학적으로 변형된 잔기가 포함된다.
"전구세포(progenitor cell)"는 자기 복제능 및 분화능(differentiation potency)을 가진 미분화 세포이지만, 최종적으로 분화하는 세포의 종류가 이미 결정되어 있는 궁극적으로 분화된 세포이다. 전구세포는 분화 경로가 예정되어 있지만, 일반적으로 성숙한 완전히 분화된 세포의 마커를 발현하지 않거나, 성숙한 완전히 분화된 세포로서는 기능하지 않는다. 따라서, 전구세포는 관련 세포 타입으로 분화되지만 정상적인 상태에서는 매우 다양한 세포 타입을 형성할 순 없다. 본 발명에서는 지방 세포로 분화될 지방 전구세포를 사용한다.
"분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 본 발명에서는 분화가 이루어진 성숙된(matured) 지방 세포를 대상으로 한다.
"루시페라제(luciferase)"는 루시페린의 산화를 촉진하여 화학에너지를 빛에너지로 전환시켜 광을 발산하게하는 효소로, 생체 내에서 연속적, 실시간적으로 발현을 측정하고, 목적의 물질들에 대한 효과를 검증할 수 있게 하는 리포터 유전자(reporter gene) 기능을 한다. 반딧불이(firefly; 개똥벌레) 또는 딱정벌레(glow-worm)와 같은 곤충체로부터 직접 수득하거나 이러한 효소를 암호화하는 재조합 DNA 절편을 포함하는 미생물로부터의 발현에 의해 수득할 수 있다.
"담체 또는 캐리어(carrier)"는 생물체 내에 있는 활성물질이 다른물질과 결합하여 존재하는 경우, 또는 세포막을 통한 물질의 이동인 운반체수송을 담당하는 고분자 물질을 총칭한다. 담체의 예로는 비제한적으로 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충제, 아스코르브산과 같은 항산화제, 저분자량 폴리펩티드(약 10 잔기 미만), 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질, 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머, 글리신 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산, 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물, EDTA와 같은 킬레이트화제, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당알코올, 나트륨과 같은 염-형성 반대이온(salt-forming counterion), 및/또는 TWEEN, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 PLURONICS 같은 무이온 계면활성제를 포함한다.
"치료"는 임상 결과를 포함하여 이로운 또는 원하는 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 질환, 장애 또는 병태의 "치료" 또는 "완화"는, 장애를 치료하지 않는 것과 비교하여, 병태, 장애 또는 질환 상태의 정도 및/또는 바람직하지 않은 임상 징후가 적어지고/적어지거나 경시적인 진행 추이가 느려지거나 길어지는 것을 의미한다. 예를 들어, 비만 치료에서, 체중 감소, 예를 들어, 적어도 5%의 체중 감소는 바람직한 치료 결과의 예이다. 본 발명의 목적을 위하여, 이롭거나 바람직한 임상 결과는, 검출가능 또는 검출불능 여부와 상관없이, 1가지 이상의 증상의 경감 또는 개선, 질환 정도의 축소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 감속, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 (부분적 또는 전체적)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. "치료"는 치료를 받지 않은 경우에 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장시키는 것을 또한 의미할 수 있다. 또한, 치료는 1회 용량의 투여에 의해 발생할 필요가 없고, 일련의 용량의 투여 시에 종종 발생한다. 따라서, 치료상 유효량, 완화에 충분한 양, 또는 질환, 장애 또는 병태의 치료에 충분한 양이 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
"질환(disorder)"이라는 용어는 본 발명의 유전자도입 동물 모델을 사용하여 동정되는 분자를 이용하여 치료하는 것으로부터 이익을 얻을 수 있는 어떤 상태이다. 이것은 포유류를 의문의 질환에 걸리기 쉽게 하는 병리학적 조건들을 포함한 만성과 급성 질환들 또는 질병들을 포함한다. 본 명세서에서 다루어질 질병들의 예들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 비만, 대사 증후군 증상 등이다.
"치료상 유효량"은 치료될 장애의 증상의 경감이 포함되는, 연구원, 수의사, 의사 또는 기타 임상의학자에 의해 추구되는 조직, 시스템, 대상 또는 인간에서의 생물학적 또는 의학적 응답을 도출할 조성물 내의 활성 화합물의 양을 의미한다.
"예방적 유효량"은 비만 또는 비만 관련 장애, 병태 또는 질환 위험이 있는 대상에서 비만 또는 비만 관련 장애, 병태 또는 질환의 발병을 방지하기 위해, 연구원, 수의사, 의사 또는 기타 임상의학자에 의해 추구되는 조직, 시스템, 대상 또는 인간에서의 생물학적 또는 의학적 응답을 도출할 조성물 내의 활성 화합물의 양을 의미한다.
"유전자 치료(gene therapy)"는 돌연변이를 일으킨 유전자를 정정하여 유전병을 치료하거나, 유전자 혹은 RNAi를 이용하여 단백질 발현을 조절하여 질병을 치료하는 것을 말한다. 즉 환자의 세포에 외부에서 정상유전자를 이식하여 그 세포의 표현형을 변화시킴으로써 병을 치료하는 방법이다. 현재 사람의 정자, 난자, 수정란에 대한 유전자치료는 전 세계적으로 윤리문제가 제기되고 있으나,1993년대에 유전자치료 임상연구에 관한 지침을 지정한 후부터 유전자치료시대로 돌입하였다. 유전자 치료에는 체내에 유전자를 이입하는 유전자 벡터, 시스템의 연구가 필수적이다.
"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 핵산(nucleic acid)의 세포 내 전달(transfection)에 관한 것이다. 특히, 지방세포를 직접적으로 표적(타겟팅)하는 전달체를 이용하여, 지방세포 표적 유전자로서 DNA, siRNA 및 shRNA와 같은 비만 및 비만 유래 대사 증후군 치료용 유전자 전달에 관한 것이다.
본 발명은 일 관점에서 지방세포 표적 서열(adipocyte targeting sequence, ATS) 및 폴리(올리고-아르기닌), 특히 R9(arginine) 펩타이드를 포함하는, 지방세포 표적 유전자 전달체에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 지방세포 표적 서열(ATS) 및 환원성 폴리(올리고-아르기닌)을 포함하는 비바이러스성 유전자 전달 벡터에 대한 발명이다.
비바이러스성 유전자 전달 벡터는 바이러스를 이용하지 않고 유전자를 세포내로 운반하는 캐리어를 총칭하는 의미로서, 유전자를 구성하는 핵산이 음전하를 띠는 성질을 이용하여 양이온상의 양이온 부위와 핵산상의 음이온 부위의 전기적 상호작용을 이용하여 핵산을 코팅하는 형태의 벡터가 대표적인 예이다.
본 발명의 폴리(올리고-아르기닌)은 폴리(올리고-L-아르기닌)과 폴리(올리고-D-아르기닌)을 포함하며, 그 중에서도 폴리(올리고-D-아르기닌)인 것이 바람직하다. 고분자량 폴리(올리고-D-아르기닌)은 DNA 의 응축을 효과적으로 촉진하여 안정한 복합체 및 DNA 의 세포 내로의 내재화를 형성하고, 내재화 후에는 복합체가 이황화결합의 환원에 의하여 엔도좀으로부터 세포질 공간으로 탈출하게 된다.
본 발명의 환원성 폴리(올리고-D-아르기닌)은 이황화물로 가교된 말단 시스테인을 포함하는 양이온성 올리고머로 구성된 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 시스테인은 인접하는 다른 시스테인 분자와 이황화 가교(cross-linking)를 형성하는 설프하이드릴기를 함유하는 유일한 아미노산으로서, 이황화물로 가교된 말단 시스테인 이외의 단백질 전달 도메인(PTD) 부분은 임의의 양이온성 펩타이드가 될 수 있다. 더욱, 바람직하게는 본 발명의 환원성 폴리(올리고-D-아르기닌)은 Cys-(D-R)9-Cys 반복 단위로 구성될 수 있다. 이러한 환원성 폴리(올리고-D-아르기닌)은 Cys-(D-R)9-Cys 반복 단위의 말단 시스테인-티올기의 DMSO 산화 과정에 의하여 제조될 수 있으며, 환원시약으로써 Cys-(D-R)9-Cys 로 단편화될 수 있다.
즉, 본 발명의 환원성 폴리(올리고-아르기닌)은 9개의 아르기닌(R9)으로 구성된, 더욱 바람직하게는 Cys-(D-R)9-Cys 구조를 가지는 것을 특징으로 한다. 이처럼 Cys가 양쪽 말단에 위치함으로써 올리고 펩토플렉스(펩타이드 복합체, peptoplex)의 효과적인 응축 및 이에 따른 복합체의 중성 전하 특성을 보유할 수 있게 되는 것이다.
본 발명의 유전자 전달체는 상기 R9(arginine) 및 지방세포 표적 서열(adipocyte targeting sequence, ATS)를 포함한다. 즉, R9(arginine)이 지방세포 표적 서열(ATS)과 결합하고 있는 구조를 포함한다(ATS-R9).
지방세포 표적 서열(adipocyte targeting sequence, ATS)은 공지의 ATS 서열을 이용[Nature medicine, 2004 June]해도 무방하나, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다.
서열번호 1 : CKGGRAKDC
본 발명의 ATS-R9은 지방 세포 내 프로히비틴(prohibitin)과 결합하는 것을 특징으로 한다.
프로히비틴(Prohibitin)은 지방세포를 지지하는 혈관의 내피세포에서 과발현되는 수용체로서, 성숙 지방세포 및 전구 지방세포 모두에 존재하는 ATS 수용체이다. 그러므로, 프로히비틴 발현 위치 및 발현 수준을 확인하기 위해 이의 항체 대신 ATS와의 결합능을 측정할 수 있다.
프로히비틴은 특히 비만에서 중요한 역할을 하는데, 지방 조직 혈관에서 높게 발현되고, 분화된 지방세포에서 분화전과 비교하여 핵 및 마이토콘드리아에서 원형질막으로 이동하여 분포하는 특성은 프로히비틴이 비만에 대한 잠재적인 바이오마커가 될 수 있음을 시사한다. 상기 프로히비틴은 전구 지방세포에서 원형질막에 적게 분포하며 상대적으로 핵 및 마이토콘드리아에 높게 위치하지만, 분화된 지방세포에서는 핵 및 마이토콘드리아에 위치하던 프로히비틴이 원형질막으로 이동하여 높게 발현된다. 즉, 프로히비틴은 분화가 진행됨에 따라 과발현된다.
본 발명의 ATS-R9는 프로히비틴-매개 메커니즘을 통해 지방 세포 내로 위치하게 된다. 즉, 지방세포 타겟팅에서는 ATS가 중요한 역할을 하고, 목적 유전자 발현 정도는 지방세포 내에서의 프로히비틴 발현 수준에 의존적이다.
특히, 상기 프로히비틴은 분화 전 지방세포보다 분화 후 성숙 지방세포에서 과다 발현되므로, 본 발명의 ATS-R9는 분화된 성숙 비만 지방세포를 직접적으로 타겟팅하는 기능을 가진다. 실험예 1에서 이를 확인할 수 있다. 특히, 분화 개시 9 내지 11일 된 성숙된 비만 지방세포에 대한 타겟팅능이 가장 우수하다. 본 발명에서 "성숙 지방세포"와 "비만 지방세포"는 동일한 의미를 가지는 용어로 혼용되어 사용되고 있다.
따라서, 본 발명은 비만 지방세포를 표적(타겟팅)하는 유전자 전달체를 이용하여 지방 세포 내 특정 유전자를 효율적으로 전달하는 방법 및 관련 시스템에 관한 것이다. 이러한 비만 지방세포를 표적하는 특정 유전자로서, 공지된 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 다른 관점에서 지방세포 표적 서열(ATS); R9(arginine) 펩타이드; 및 지방세포 표적 유전자로서 비만 및 비만유래 대사증후군 치료 유전자를 함유하는 복합체에 관한 것으로, 상기 유전자 전달체에 목적 유전자가 결합된 구성에 관한 것이다.
본 발명의 표적 세포로는 지방세포로 분화할 수 있는 전구 지방세포에 해당하는 세포를 사용할 수도 있으나, 가장 바람직하게는 성숙 지방세포(비만 지방세포, 백색 지방세포, 갈색 지방세포 등)를 타겟팅 하는 것이 좋다.
전구 지방세포로는 직접 지방세포로 분화할 수 있는 세포 외, 지방세포를 포함한 다종의 세포로의 분화능을 유지하고 있는 중간엽간세포(mesenchymal stem cell)나 간질계 세포(stromal cell)가 포함된다. 상기 각 세포는 인간 또는 비인간포유동물의 지방조직 등으로부터 채취한 초기 배양 세포일 수도 있고, 주화된 배양 세포주일 수도 있다.
지방조직의 채취원으로서는 피하지방이나 내장 지방이 예시되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 지방조직은 채취되는 것에 의해 개체에게 주는 기능 장해의 우려가 작은 것이 표적 세포의 채취원으로서 매우 적합하다. 또한, 중간엽간세포나 간질계 세포는 골수나 그 외의 조직에서 채취할 수 있다.
한편, 본 발명의 복합체가 전달하는 비만 및 비만유래 대사증후군 치료 유전자는 목적의 지방세포내에서 발현시키는 것이 바람직한 임의의 유전자를 삽입할 수 있고, DNA와 RNA 및 이들의 합성동종체를 포괄한다. 예를 들어, 폴리펩티드(효소, 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 리셉터, 구조 단백질 등), 안티센스 RNA, 리보자임, 디코이, RNA 간섭을 일으키는 RNA 등을 코딩하는 유전자가 예시된다. 이의 예로서는 gDNA, cDNA, pDNA, mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, miRNA, 안티고미어 등을 들 수 있다. 이들은 자연에 존재하거나 합성될 수 있으며, 크기에 있어서 올리고뉴클레오티드에서 크로모좀까지 다양한 크기로 존재할 수 있다. 이들 유전자는 인간, 동물, 식물, 박테리아, 바이러스 등으로부터 기원된다. 이들은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 획득될 수 있다.
상기 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드에는 각종 호르몬, 조직접합성 항원, 세포부착단백질, 사이토카인, 각종 항체, 세포 수용체, 세포내 또는 세포외 효소 및 이들의 절편 등을 포함할 수 있다. 또한 비만 및 비만유래 대사증후군 치료 유전자 발현조절인자, 예를 들면 전사프로모터, 인헨서, 사일렌서, 오퍼레이터, 터미네이터, 어테뉴에이터 및 기타 발현조절인자 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 비만 및 비만유래 대사증후군 치료 유전자로는 바람직하게는 비만 및 비만 유래 대사증후군의 치료 또는 진단과 관련된 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 포함한다. 특히, 비만 및 비만유래 대사증후군 치료 유전자는 비만 질환에 대한 유전자 치료효과를 가지는 RNA 간섭(RNAi)인 것이 바람직하다.
RNA 간섭(RNAi)은 이중 나선의 짧은 간섭 RNA(siRNA)에 의해 대상 유전자의 발현을 특이적으로 하향 조절시키는 것을 포함하는 자연적인 기작이다. RNAi를 매개하는 RNAi 시약의 타입에 대한 예로는 예를 들어, siRNA 또는 miRNA (마이크로RNA) 또는 소형 헤어핀 RNA (shRNA)가 있다.
그러므로, 본 발명은 또 다른 관점에서 지방세포 표적 서열(ATS), R9(arginine) 펩타이드 및 비만 및 비만유래 대사증후군 치료 유전자를 함유하는 복합체를 함유하는 비만 또는 비만 유래 대사증후군 조성물에 관한 것이다.
앞서 설명한 바와 같이, 상기 비만 및 비만유래 대사증후군 치료 유전자는 비만 질환에 대한 유전자 치료효과를 가지는 유전자, 예를 들어 RNAi인 것이 바람직하다.
상기 RNAi의 투여에 효과적인 투여량 및 계획은 경험적으로 결정할 수 있고, 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 단일 또는 다중 투여량을 사용할 수 있다.
한편, 본 발명에서 "비만 또는 비만 유래 대사증후군"은 일반적으로 신체 질량 지수 (BMI)가 30을 초과하는 것으로 정의되지만, 본 출원의 목적을 위해서는, BMI가 30 미만인 대상들을 포함하여 체중 증가 방지가 필요하거나 이를 원하는 모든 대상이 "비만"의 범주에 포함된다.
상기 유전자는 음이온으로 대전된 거대한 고분자 사슬의 형태로 존재하므로 유전자 단독으로 존재할 때는 비교적 부피가 큰 랜덤코일의 형태를 띠고 있어 유전자의 세포내로의 전달이 어렵고, 크기가 작은 나노입자의 형태로 만들어 주어야 한다. 이를 위해, 본 발명에서는 ATS-R9을 이용하여 상기 유전자와 정전상호작용을 통해 나노크기의 복합체를 형성하고 있다. 이 때 사용되는 생분해성 결합은 용해화 가수분해(solubilization hydrolysis), 또는 효소 또는 생물체 등의 작용에 의해 덜 복잡한 중간 물질 또는 최종 산물로의 전환이 가능한 결합을 말한다. 특히, 이황화 결합을 하고 있는 본 발명의 ATS-R9은 지방 세포내로 유입되면 저분자로 끊어져서 목적 유전자를 유리시킬 수 있게 된다.
지방세포 내 상기 물질을 전달하기 위한 본 발명의 전달체 및 복합체는 다음과 같은 장점을 가진다.
(1) 지방세포 타겟팅에서 본 발명의 "ATS-R9" 중 ATS가 중요한 역할을 한다.
본 발명의 ATS-R9 전달체는 지방세포에서 발현하는 "프로히비틴(prohibotin)"과의 결합을 통해 지방 조직 내피세포로 타겟팅한다. 즉, ATS가 지방세포를 타겟팅하고 프로히비틴-매개 메커니즘을 통해 상기 지방세포 내로 내재화한다. 특히, 프로히비틴이 과다 발현하는 분화 후 성숙 비만 세포가 대상으로 가장 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서는 free-ATS를 전처리한 경우 루시퍼라아제 유전자 발현이 감소함을 확인하였다. 이는 ATS-R9 올리고-펩토플렉스가 프로히비틴과의 결합을 통해 세포 내로 들어감을 의미한다. 본 발명의 ATS-R9는 PEI 및 R9보다 더 우수한 트랜스펙션 및 유전자 발현 효율을 보였다.
효율적인 유전자 전달 시스템을 위해서, 담체는 핵막(nuclear membrane)을 통과할 수 있어야 하며 핵에 유전자의 카고(cargo)를 전달할 수 있어야 한다. ATS-R9은 성숙 지방세포의 핵에서 프로히비틴의 높은 발현 때문에 빠르게 핵을 통과한다. 이는 프로히비틴 타겟팅 모이에티(moiety)인 ATS가 지방세포에서 효율적인 타겟팅 및 선택적 유전자 발현에 매우 중요함을 강하게 시사한다. 즉, 프로히비틴은 성숙 지방세포의 선택적인 형질전환을 위한 잠재적인 타겟이 되는 것이다.
(2) 본 발명의 "ATS-R9"는 전달된 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자의 발현 효율(transgene expression efficiency)을 향상시킨다.
본 발명의 ATS-R9의 트랜스펙션 효율은 3 : 1의 전하 비율 이상에서 ATS-R9과 유전자의 응축이 잘 일어나기 때문에, 3 : 1 내지 8 : 1의 전하비율(+/-), 더욱 바람직하게는 5 : 1 내지 8 : 1의 전하비율(+/-)을 가지는 것이 좋다. 특히, 일 구체예에서 본 발명의 전달체는 전하비율 5 : 1에서 가장 높은 유전자 트랜스펙션 효율을 보였다.
본 발명에서 상기 전하비율이란 유전자의 구성성분 중 인산(phosphate)이 음전하를 띠고 있고 전달체의 구성성분 중 아르기닌이 양전하를 띠고 있는데 유전자가 가지고 있는 음전하를 1로 기준한 다음 반응시킬 전달체의 양을 3배 내지 8배 높여서 유전자와 반응시키는 비율을 의미한다. 즉, 3 : 1 내지 8 : 1의 전하비율을 가지는 것은 목적 유전자보다 전달체의 양을 3배 내지 8배로 크게 구성하는 것을 말한다.
이는 세포막이 음전하를 띠고 있기 때문에, 유전자 전달 복합체가 전체적으로 양전하를 띠고 있을 때, 전달효율이 우수하기 때문이다. 복합체가 음전하를 띠는 경우는 세포막을 쉽게 통과하지 못하는 반면 양전하를 띠는 경우는 전하대 전하 반응으로 쉽게 세포막을 통과할 수 있는 것이다. 또한, 전하량은 세포막 투과능에 영향을 끼치는데, 전하량이 높을수록 세포막을 통과할 수 있는 능력도 커지게 된다.
한편, 지방세포의 분화정도가 트랜스펙션 효율에 영향을 미칠 수 있는데, 본 발명의 ATS-R9은 분화 10일까지 점진적으로 트랜스펙션 효율을 증가시킨다. 분화 정도 및 분화된 지방세포 수가 증가할수록 프로히비틴이 상향 조절되므로 ATS-R9의 트랜스펙션 효율을 강화시키는 것이다. 일 실시예를 통해 분화 개시 9 내지 11일 된 성숙된 비만 지방세포에 대한 트랜스펙션 효율이 가장 높음을 확인하였다.
이처럼, 본 발명의 복합체는 지방세포 내에서 프로히비틴 발현 수준에 의존하여 목적 유전자를 발현한다.
특히, 통상적으로 사용되고 있는 양이온 담체 PEI와 비교하여 본 발명의 ATS-R9는 훨씬 높은 유전자 발현 효율을 가진다. 즉, ATS-R9에 의해 더욱 효과적인 DNA 응축 능력을 나타내고, 적정 전하 비율에서 혈청에서 DNA가 분해(degradation)되지 않도록 보호한다.
(3) 본 발명의 "ATS-R9"는 DNA와 결합하여 나노 사이즈 크기의 복합체를 형성하고 양(positive)의 제타 포텐셜 값을 가진다.
ATS-R9은 예를 들어, DNA와 결합하는 경우, 상대적으로 낮은 N/P 비율(polymer nitrogen(+)/pDNA phosphate(-))에서 정전기적 상호작용에 의해 보다 효과적으로 DNA를 농축하는 장점이 있다. 즉, 중성 조건에서 양성 전하를 나타내어 효과적으로 DNA를 나노크기 사이즈로 농축할 수 있고(약 200 nm 이하), 전하 비율 1 이상의 양(positive)의 제타 포텐셜을 가질 수 있다. 이는 본 발명의 올리고 펩타이드가 양 말단에 Cys 구조를 포함하고 있기 때문이다.
앞서 설명한 바와 같이, 복합체가 음전하를 띠는 경우는 같은 음전하를 가지는 세포막을 쉽게 통과하지 못하는 반면 양전하를 띠는 경우는 전하대 전하 반응으로 쉽게 세포막을 통과할 수 있으므로, 본 발명의 양(positive)의 제타 포텐셜 값을 가지는 특성은 유전자 전달효율이 우수함을 의미한다.
(4) 본 발명의 "ATS-R9"는 세포독성이 낮다.
통상의 고분자 양이온 담체 PEI 등과 비교하여, 본 발명의 ATS-R9는 현저히 낮은 세포 독성을 나타낸다. 본 발명의 일 실시예에서는 ATS-R9은 독성의 PEI와 비교하여 전하비율 9까지 비독성을 나타냈고, 실시했던 모든 전하비율에서 세포 생존능은 90% 이상을 보였다.
요컨대, 본 발명의 ATS-R9은 지방 조직 혈관에서 프로히비틴과 결합하고 이어서 지방세포, 특히 분화된 성숙 비만 지방세포 내로 효과적으로 내재화시킨다. 즉, ATS-R9의 in vivo 위치화는, 프로히비틴을 통한 지방 조직 혈관의 타겟팅 및 결합; 혈관 통과; 및 지방세포 내로의 내재화의 3단계로서 간단히 설명될 수 있다.
또한 본 발명은 높은 트랜스펙션 효율, 낮은 세포독성, 높은 목적 유전자 발현 효율을 가지므로 효과적인 비바이러스성 비만 및 비만유래 대사증후군 치료 유전자 전달 시스템으로 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
세포 배양
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), 글루코스, FBS을 WelGENE(한국)으로부터 구입하고, 인슐린 및 및 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)을 Wako(일본)으로부터, 덱사메타손 및 Oil Red O을 Sigma-Aldrich(미국)으로부터 구입하였다. 3T3-L1 전구 지방세포(preadipocyte)를 한국 세포주 은행으로부터 구입하여 분화를 유도하였다.
전구 지방세포를 글루코오스, 10% FBS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신 보충된 완전 배지에서 37 ℃, 5% CO2 대기 하 배양하였다. 세포들을 일주일에 3회 계대 배양하였다.
지방세포 분화를 위해 씨딩 후 4일째 세포들을 완전 배지, 10 ㎍/mL 인슐린, 1 μM 덱사메타손(Dexamethasone) 및 0.5 mM IBMX를 함유하는 분화 유도 배지로 72시간 동안 처리하였다. 분화배지를 완전배지 및 10 ㎍/mL 인슐린을 함유하는 지방세포 유지 배지로 대체하였다. 배지는 2일마다 교체하였다.
펩타이드 준비
로다민 B 결합된 ATS(CKGGRAKDC) 펩타이드, FITC 결합된 ATS-R9(CKGGRAKDRRRRRRRRRC) 및 R9(CRRRRRRRRRC) 펩타이드를 Peptron(Daejoen, Korea)사로부터 입수하였다. 동결 건조된 펩타이드를 탈이온수에 녹인 후 사용 전까지 -20 ℃에서 보관하였다.
펩타이드 분자량은 이하와 같았다 : ATS: 937, Rhodamine B ATS: 1361, ATS-R9: 2341, FITC-ATS-R9: 2844, R9: 1628
Oil Red O 염색
지방세포 분화를 Oil Red O 염색으로 확인하였다.
Oil Red O 용액 준비를 위해, 0.7 g의 Oil Red O 파우더를 200 mL 이소프로판올에 녹이고 밤새 교반한 후 0.22 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다. Oil Red O 용액을 탈이온수와 6:4의 비율로 혼합하여 Oil Red O 워킹 용액을 만들고 0.22 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다.
세포 염색을 위해, 세포들을 PBS(Phosphate Buffered Saline)으로 헹구고 3.7% 포름알데히드를 함유하는 PBS로 상온에서 1시간 동안 고정시켰다. 고정 후, 세포들을 60% 이소프로판올로 세척하고 깨끗한 벤치에서 건조시켰다. 완전히 건조시킨 후, 세포들을 Oil Red O 워킹 용액으로 염색하고 15분 동안 배양하였다.
세포들을 탈이온수로 4회 세척하고 이미지를 현미경으로 캡쳐하였다.
지방세포 분화의 정량 분석을 위해, 100% 이소프로판올로 축적된 Oil Red O를 세포로부터 제거하고 520 nm에서 흡광도를 측정하였다.
공초점 현미경용 샘플제작
Cellmask Deep Red를 Invitrogen로부터 구입하고 DAPI-Fluoromount-G를 Southern Biotech로부터 구입하였다. 3T3-L1 전구 지방세포, H9c2 및 HEK293 세포들을 6 웰 플레이트에 둔 커버슬립상에서 성장 및 분화시켰다.
씨딩 24시간 후, 세포들에 FITC 결합 ATS-R9 (25 ㎍/mL)를 처리하고 15분 내지 72시간 범위에서 시간 의존적 방식으로 배양하였다.
배양 후, 배양배지를 대체하고 세포들을 PBS로 3회 세척한 후 3.7% 포름알데히드로 고정시켰다. 플라즈마 멤브레인을 Cellmask Deep Red로 염색하고 세포들을 다시 PBS로 세척한 다음, 핵염색을 위해 DAPI의 존재하 마운팅시켰다. 이미지들을 Carl Zeiss 공초점 현미경으로 캡쳐하였다.
경쟁 분석(competition assay)
경쟁 분석(competition assay)을 위해, 3T3-L1 전구 지방세포와 성숙 지방세포(10일째)에 자유 ATS(free-ATS)(100 ㎍/mL)를 처리하였다. 배양 6시간 후, 세포들을 FITC-ATS-R9 올리고-펩토플렉스로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. H9c2 및 HEK293 세포주들을 대조군으로 사용하였다. H9c2 및 HEK293 세포에 FITC 결합된 ATS-R9 (25 ㎍/mL) 올리고-펩토플렉스를 처리하고 24시간 동안 배양하였다.
겔 지연 분석(Gel retardation assay)
1 ㎍ 루시퍼라아제 플라스미드 DNA(p-β-Luci, Promega(USA)로부터 입수), 탈이온수 및 ATS-R9 (전하비율: 0.25, 0.5, 1, 3, 5, 7, 및 9)를 30분 동안 상온에서 배양하여 올리고 펩토플렉스(oligo-peptoplexe)를 제작하고 0.8% 아가로오스 겔에서 0.5% TBE 완충용액 하 25분동안 전기영동을 수행하였다(100 V).
Naked DNA를 대조군으로 사용하였고, DNA 응축 효율을 분지형 PEI (25 KDa, Sigma, USA)와 비교하였다.
제타 포텐셜 및 크기 측정
5 ㎍ 루시퍼라아제 플라스미드 DNA(p-β-Luci), 탈이온수 및 ATS-R9 (전하비율: 0.5, 1, 3, 5, 7, 및 9)를 30분 동안 상온에서 배양하여 올리고 펩토플렉스(oligo-peptoplexe)를 제작하였다. 상기 올리고 펩토플렉스의 평균 직경 및 표면 제타 포텐셜을 Zetasizer-Nano ZS (Malvern Instruments, UK) 구비 DLS를 사용하여 측정하였다
in vitro 트랜스펙션 효율
루시퍼라아제 분석 키트를 Promega(USA)로부터 구입하고, DC 단백질 분석 키트 및 소혈청 알부민 스탠다드를 Bio-Rad Laboratories(USA)로부터 구입하였다. 전구 지방세포 3T3-L1 및 분화된 지방세포를 24 웰 플레이트에 씨딩하였다.
전하 비율 5에서 ATS-R9 및 2 ㎍ 루시퍼라아제 플라스미드 DNA를 혼합함으로써 올리고-펩토플렉스를 제작하였다. R9 및 PEI 폴리플렉스들을 전하 비율 5에서 대조군으로 사용하였다. 세포들을 씨딩 24시간 후 트랜스펙션하였다.
배양 72시간 후, 세포들을 PBS로 세척하고 150 ㎕의 1×cell 용해 버퍼 시약을 20분 동안 처리하였다. 세포 용해물을 긁어내어 수득하고 1.5 mL 마이크로 튜브로 옮긴 후 13,000 rpm에서 3분 동안 원심분리하였다.
세포 용해물의 형광도(luminescence)를 20초 integration으로 96-웰 플레이트 광도계(Berthold Detection Systems, Germany)로 측정하고 세포 단백질의 mg 당 RLU(relative luminescence units)값으로 표현하였다. 소혈청 알부민 스탠다드를 사용하는 DC 단백질 분석키트로 단백질을 결정하였다.
in vitro 세포독성 분석
세포 생존능을 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 분석법으로 측정하였다.
3T3-L1 분화된 지방세포들을 24 웰 플레이트에서 배양시키고, 지방세포(10일째)들을, 규정된 전하비율에서 루시퍼라아제 플라스미드 DNA, 플레인 DMEM, ATS-R9로 제작한 올리고-펩토플렉스로 처리하였다. PEI 폴리플렉스를 대조군으로 사용하였다.
트랜스펙션 48시간 후, 50 ㎕ MTT 시약 및 500 ㎕ 배지를 각 웰에 첨가하고 3시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 상기 배양 배지들을 제거하고, 500 ㎕ 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 각 웰에 첨가하고 상온에서 20분 동안 배양하였다. 흡광도를 570 nm에서 측정하였다.
마우스 모델에서의 비만 유도
3주령의 C57BL/6J 마우스를 Central Lab Animal Inc.(Korea)로부터 구입하였다. 처음 2주 동안은 50% 정상 식이 및 지방으로부터 60 kcal% 로덴트 식이(rodent diet)로 사육하였다. 마우스에 대한 고지방 식이 비율을 점차 증가시키고 7 주에 시작하였다; 상기 마우스들을 지방으로부터 60 kcal%로 고지방 식이로 오직 사육하였다. 14주 후에 마우스들은 비만이 되었다(체중>45g).
in vivo 지방 표적(fat homing)
FITC 결합된 ATS-R9 (10 mg/mL) 및 FITC-R9 (10 mg/mL)를 PBS에 희석하여 최종 농도를 1.5 mg/mL로 만들고, 비만 마우스에 꼬리 정맥 주사로 100 ㎕ 펩타이드를 주입하였다.
Cellvizio (Mauna KeaTechnologies, France)에 의해, 주입 즉시 다른 기관의 혈관에서 펩타이드 위치화(localization)가 관찰되었다.
실시예 1: 3T3-L1 전구 지방세포의 분화
3T3-L1 지방세포 분화과정을 도 2에 도시하였다.
3T3-L1 전구 지방세포들을 지방세포 분화용 배지에서 배양하였을때, 세포 형태는 점점 세포질에서 보이는 둥근 모양 및 큰 지질 드롭렛(droplet)의 지방세포 형태로 변하였다. 상기 세포 영역의 약 90%가 지질 드롭렛으로 채워졌다(도 2 b).
그리고, 중성 지질을 선택적으로 염색할 수 있기 때문에 지방세포 분화를 확인하기 위해 널리 사용되는 Oil red O 염색 결과, 세포 배양 군집의 95%가 성숙 지방세포로 분화됨을 관찰하였다(도 2 c). 높은 Oil Red O 축적은 보다 높은 지방세포 분화를 나타낸다.
나아가, 정량 분석을 위해, 분화된 지방세포들을 5~14일 동안 Oil Red O로 염색하였다. 축적된 Oil Red O를 용출시키고 분광 광도계로 520 nm에서 정량하였다. 그 결과를 도 2 d에 도시하였다.Oil Red O 축적은 세포 분화 시간에 따라 증가하였다. 시간 의존적 방법에서 증가하는 Oil Red O의 양은 전구 지방세포가 시간에 따라 계속적으로 성숙 지방세포로 분화되고 있음을 의미한다.
실시예 2 : ATS-R9의 지방세포 내로의 내재화능
ATS-R9의 세포내로의 내재화 정도를 모니터하기 위해, FITC-표지된 ATS-R9 (FITC-ATS-R9)로 성숙 지방세포 및 전구 지방세포를 처리하고 담체의 세포내 전달을 확인하였다.
10일째 지방세포로 분화된 3T3-L1에 FITC-컨쥬게이트된 ATS-R9 (25 ㎍/mL)를 처리하고 규정된 시간이 될 때까지 인큐베이션하였다. 플라즈마 멤브레인을 Cellmask Deep Red로 염색하고, 핵을 DAPI로 카운터 염색하였다. 블루 채널(for DAPI)을 하얀색으로 묘사하여 ATS-R9의 핵 위치화를 보여주었다. 이미지를 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 캡쳐하였다. 스케일 바(Scale Bar): 10 ㎛.
그 결과, ATS-R9는 3T3-L1 지방세포 내로 매우 빠르게 내재화하였다. 15분 및 1시간 이내에, 각각 세포질 및 핵 내로 도달하였고, 48시간까지 강한 형광신호를 유지하였다.
이는 앞서 설명한 프로히비틴을 통해 지방세포를 타겟팅하는 능력에 의한 것이다. 3T3-L1 성숙 지방세포로의 내재화(internalization) 상에서, 상기 융합 펩티드는 핵막을 빠르게 통과한다. 즉, ATS-R9은 매우 빠르게 세포들에 전달되었다. 시간에 따른 ATS-R9의 세포내 분포를 도 3에 도시하였다.
성숙 지방세포에서 ATS-R9은 15분 이내에 세포질에, 1시간 이내에 핵에 도달하였으며 48시간 동안 정류상태를 유지하였다. 반면, 전구지방세포에서는 ATS-R9은 24시간 후 정류상태를 유지하며 핵으로 이동은 48시간 이후에 관찰되었다.
이러한 성숙 지방세포 및 전구 지방세포에서의 ATS-R9 흡수 패턴 및 분배의 차이는 프로히비틴 수준 및 위치의 차이와 관련이 있음을 알 수 있다.
실시예 3: 경쟁분석(Competition assay)
ATS-R9의 지방세포 타겟팅에 대한 ATS의 영향을 확인하기 위해 경쟁 분석을 수행하였다.
3T3-L1 전구 지방세포 및 성숙 지방세포들을 10일째 free-ATS로 처리하고 6시간 동안 수용체를 차단시켰다.
세포들을 free-ATS 존재 또는 부존재하에 배양하였다. 모든 세포들을 FITC-ATS-R9/pLuc 복합체로 처리하였다[FITC-ATS-R9/pLuc 복합체를 올리고-펩토플렉스로 칭함(올리고-펩타이드/DNA 복합체)].
이 때, 지방세포에 대한 ATS-R9의 특이적인 결합 친화도를 확인하기 위해, 플라즈마 멤브레인 상 프로히비틴을 발현하지 않는 HEK293 및 H9c2 세포들을 대조군으로 사용하였다. 세포들을 FITC 결합된 ATS-R9 올리고-펩토플렉스로 처리하고 24시간 동안 배양하였다.
그 결과를 도 4에 도시하였다. free-ATS(ATS 부존재)의 전처리로, ATS-R9 올리고-펩토플렉스 내재화가 억제되었다; 이는 ATS-R9 올리고-펩토플렉스가 프로히비틴을 통해 세포 내로 내재화함을 시사한다.
3T3-L1 전구 또는 성숙 지방세포에서, free-ATS 존재 하 배양한 그룹은 free-ATS 부존재 하 배양한 그룹과 비교하여 현저히 낮은 수준의 FITC 강도를 보였다(도 4a 및 도 4c). 이는 적은 양의 FITC-ATS-R9가 세포막을 투과할 수 있기 때문에 세포 내로 내재화되기 때문이다. 두 그룹간 FITC 강도에서의 차이는 free-ATS 존재 하 전-배양에 의해 프로히비틴의 차단에서 비롯된다. free-ATS와 결합하는 프로히비틴은 자유롭게 ATS-R9/pLuc 올리고-펩토플렉스와 상호작용하지 않으므로 결과적으로 올리고-펩토플렉스의 내재화가 감소한다. 유사한 결과가 전구 지방세포에서 관찰되었다. 그러나, 형광도 강도의 차이는 성숙 지방세포에서 관찰되는 차이보다 적었다. 이러한 결과는 성숙 지방세포에서 발견되는 프로히비틴 수준과 전구 지방세포에서 발견되는 프로히비틴 수준의 다르기 때문에서 비롯된 것이다.
또한, 프로히비틴을 발현하지 않는 HEK293 및 H9c2 세포에서는, 동일 양의 펩타이드 및 동일 배양시간으로 처리한 지방세포와 비교하여, 적은 양의 펩타이드들이 HEK293 및 H9c2 세포 내로 위치하였다(도 4b). 약한 FITC 강도가 상기 각 세포주에서 관찰되었기 때문에, 매우 적은 양의 ATS-R9/DNA 올리고-펩토플렉스가 이들 세포에 내재화되는 것으로 보인다.
더욱이, 이러한 결과들은 ATS-R9이 분화 상태에 무관하게 지방세포들을 타겟팅하고 지방세포들을 인지하며, 프로히비틴-매개 메커니즘을 통해 세포내로 내재화함을 보여주었다. 즉, 이와 같은 결과들을 통해 ATS-R9 의 결합 친밀도는 지방세포 특이적이라는 특성을 확인할 수 있었다.
실험예 1: 분화정도에 따른 지방세포 타겟팅능의 확인
지방세포의 분화정도에 따른 프로히비틴 발현의 위치 및 양을 확인하기 위해 두 타입의 지방세포들을 로다민B-표지된 ATS(RhoB-ATS)로 처리하였다. ATS의 높은 프로히비틴 결합 능력때문에 프로히비틴을 확인하기 위한 항체 대신 ATS를 사용할 수 있다.
해당 실험을 통해 성숙 지방세포 및 전구 지방세포에 존재하는 ATS 수용체인 프로히비틴이 분화 정도에 따라 상이한 양상으로 분포하는 것으로 발견되었다.
구체적 결과를 도 5에 도시하였다. 즉, 분화 전 지방세포(전구 지방세포)와 분화 후 지방세포(비만 지방세포)에서 ATS의 타겟팅능을 확인할 수 있었다.
프로히비틴 결합된 ATS를 면역침강분석법에 의해 확인하였고(도 5a), 3T3-L1전구 지방세포 및 성숙 지방세포에서의 프로히비틴 분포화를 염색결과를 통해 확인하였다 (각각 도 5b 및 도 5c). 도 5b를 통해 분화된 비만 지방세포에 ATS가 효과적으로 전달됨을 확인할 수 있고, 도 5c를 통해 ATS의 리간드인 프로히비틴의 발현 차이를 확인할 수 있다.
이와 같이, 성숙 지방세포에서 프로히비틴은 원형질막, 세포질, 핵에서 높이 발현되고, 전구 지방세포에서는 일차적으로 세포질에서 낮은 발현 수준을 나타내었다. 이러한 프로히비틴 분포의 차이는 성숙 지방세포 및 전구 지방세포에서 세포내 ATS-R9 전달 및 분포 메커니즘이 상이함을 의미한다.
따라서, 분화 전 지방세포에서는 ATS에 의한 지방세포 타겟팅 효율이 많이높지 않지만, 분화 후 비만 세포에서는 ATS에 의한 지방세포 타겟팅 효율이 아주 높게 나타난다.
비교예 1: 비-비만(성숙) 지방세포 및 근육세포에서의 프로히비틴 발현확인
본 발명의 융합 올리고-펩토플렉스가 비만 지방세포 특이적인 특성을 가지고 있음을 보다 명백히 확인하기 위해, 비-비만 마우스에서의 프로히비틴 발현 양상과, 근육세포에서의 프로히비틴 발현 양상을 비교 분석하였다. 이 때, 웨스턴 블럿 방법을 이용하였다. 그리고, 그 결과를 도 6에 도시하였다.
특히, 도 6a에서 알 수 있는 것처럼 비-비만 마우스와 비만 마우스에서의 프로히비틴 발현 양상에서도 큰 차이를 보였고, 도 6b에서 알 수 있는 것처럼 근육세포에서의 프로히비틴 발현 양상도 명백히 큰 차이를 나타냈다. 즉, 비-비만 지방세포에서보다 비만 지방세포에서 프로히비틴의 발현이 증가하였고, 근육조직과는 달리, 비만 지방세포에서는 프로히비틴이 세포막 특이적으로 발현된다는 것도 확인하였다. 그러므로, 세포막에서의 프로히비틴 발현이 특이적으로 증가하는 경우 본 발명의 지방세포로의 타겟팅 효율도 함께 증가할 것임을 알 수 있었다.
실시예 5 : 올리고-펩토플렉스의 물리적 및 생물적 특성
양이온성 폴리머/DNA 복합체의 생화학적 특성은 세포 흡수능, 카고(cargo) 안정성, 세포독성 및 트랜스유전자 발현에 영향을 미치는 주요한 요소 중 하나이다. ATS-R9의 DNA 응축 및 보호 능력을 겔 지연분석 및 마우스 혈청에서의 분해(degradation) 테스트에 의해 시험하였다.
5-1. 겔 지연분석 및 혈청 보호 분석(Serum protection assay)
ATS-R9의 응축 효능을 분지형 PEI (25 kDa)의 경우와 비교하였다.
올리고-펩토플렉스를 루시페라아제 플라스미드 DNA(p-β-Luci), 탈이온수 및 ATS-R9 또는 PEI를 규정된 전하 비율로 제작하고 30분동안 실온에서 배양하였다.
또한, 올리고-펩토플렉스를 규정된 전하 비율에서 제조하고, 최종 농도 50%(vol/vol) 에서 마우스 혈청을 상기 폴리플렉스에 첨가하고 샘플을 37 ℃에서 2시간 동안 배양하였다.
혈청 배양 후 폴리플렉스로부터 DNA의 탈착물화(decomplexation)를 위해, 인산-완충된 식염수(pH 7.4, 0.5 mol/L NaCl) 중 헤파린을 0.01 mol/L EDTA 존재 하 샘플에 첨가하고 1시간 동안 배양하였다. 샘플들을 0.8% 아가로스 겔에 로딩하였다.
그 결과, ATS-R9 또는 PEI 어느 쪽에서도 전하 비율 3 이상에서 DNA 이동은 관찰되지 않았다. 이는 DNA의 완전한 응축이 일어남을 의미한다(도 7 a). 그리고, ATS-R9는 적절한 전하 비율에서 혈청에서 분해로부터 DNA를 보호하는 반면, naked DNA는 테스트 조건에서 완전히 분해되었다(도 7 b).
다시 말해, ATS-R9는 플라스미드 DNA를 효율적으로 응축할 수 있고, 혈청 분해로부터 보호된다. 그리고 DNA와 복합체 형성 후에는, 양성으로 대전된 보다 작은 복합체를 형성하여 세포에 의해 효율적으로 내재화할 수 있는 것이다.
5-2 제타 포텐셜 및 크기 측정
다음으로, ATS-R9/DNA 올리고-펩토플렉스의 제타 포텐셜 및 평균 직경을 DLS(dynamic light scattering)을 이용하여 측정하였다.
그 결과 도 8에 나타낸 바와 같이, 전하 비율 3 이상에서 제타 포텐셜은 양(positive)의 값을 나타냈고, 전하 비율 1이상에서 평균 직경은 200 nm 미만이었다.
5-3 세포 생존능 분석
또한, ATS-R9/DNA 올리고-펩토플렉스의 독성을 시험하였다. 10일째 지방세포로 분화된 3T3-L1에 올리고-펩토플렉스를 형질전환하였다. 48시간 후, 세포 생존능MTT 분석으로 측정하였다(n=6).
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 분화된 지방세포들은 전하 비율 9까지 90% 이상의 세포 생존능을 보였고, 이는 독성 PEI와 비교하여 올리고-펩토플렉스가 분화된 지방세포에 대해 비독성임을 의미한다.
실시예 6 : 트랜스펙션 효율
6-1. 최적의 전하 비율
트랜스펙션 효율의 최적을 이루는 전하 비율을 살펴보았다.
성숙 지방세포를 분화 10일째 p-β-Luci로 전하비 5에서 ATS-R9, R9 및 PEI에 의해 트랜스펙션하고, 72시간 후 루시퍼라아제 분석 키트로 루시퍼라아제 유전자 발현을 측정하였다.
그 결과, ATS-R9의 올리고-펩토플렉스의 트랜스펙션 효율이 전하 비율 5에서 R9 및 PEI와 비교하여 더 높게 타나났다(도 10a). 즉, ATS-R9은 동일 전하 비율에서 R9 및 PEI와 비교하여 높은 형질전환 효율을 가진다, 형질전환 및 유전자 발현 효율은 지방세포 분화 시간에 따라 증가하였다.
6-2. 최적의 시기
그리고 트랜스펙션 최적 시기를 알아보기 위해 3T3-L1 분화된 지방세포들을 상이한 분화 날짜에 루시페라아제 플라스미드 DNA (p- -Luci)로 전하 비율 5에서 ATS-R9 및 PEI에 의해 트랜스펙션하였다. 루시페라아제 유전자 발현을 루시페라아제 분석 키트에 의해 72시간 후 측정하였다.
그 결과, 분화 9일 및 10일째 보다 높은 유전자 발현을 나타냈고, 이는 성숙 지방세포의 트랜스펙션에 적합함을 시시한다(도 10b)
실시예 7 : 인 비보(in vivo) 지방 타겟팅(fat homing) 실험
식이 유도 비만(diet-induced obesity, DIO) 마우스를 이용하여 in vivo 실험을 수행하였다. 지방 조직에 대한 ATS-R9의 타겟팅을 관찰하기 위하여 FITC-ATS-R9를 비만 마우스에 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 프로브 기반 공초점 레이저 엔도마이크로스코피(pCLE, Cellvizio )를 이용하여 추적을 가시화하였다.
간, 신장 및 다른 지방 패드 맥관(fat pad vasculature)들에 대해 관찰한 결과, ATS-R9가 지방 패드 맥관(fat pad vasculature)에서 응집되었다. 다른 기관들에서는 ATS-R9는 단지 혈관을 따라 떠다니고 응집은 관찰되지 않았다(도 11).
그리고, 지방 패드 맥관에서 FITC -컨쥬게이트된 ATS-R9 및 R9의 Fat 타겟팅(Fat homing)을 비교한 결과, 오직 ATS-R9(R9은 아님)만이 지방 패드 맥관에서 응집되었다. 즉, R9을 투여하면, 지방 혈관에서 응집은 관찰되지 않았으나 내피(endothelium) 상의 응집은 관찰되었다(도 12).
또한, 수평으로 절단한 혈관의 분석을 위해 지방 패드의 미세혈관 이미지를 프로브로부터 혈관까지 고정된 거리에서 수득하였다. ATS-R9 처리는 높게 축적된 형광 강도를 내피 가장자리에서 생성한 반면, R9 처리는 전체 혈관 영역에 걸쳐 형광 강도를 생성시켰다(도 13). 즉, 지방 패드 미세혈관(fat pad microvessel)에서 FITC -컨쥬게이트된 ATS-R9 및 R9의 Fat 타겟팅 비교한 결과, ATS-R9은 지방 패드 미세혈관(fat pad microvessel)에서 결합하지만 R9의 경우에는 결합이 관찰되지 않았다.
이는 ATS-R9이 지방 혈관과 결합하여 혈관의 내피(endothelium)에서 응집을 형성하였기 때문이다. 반면, ATS-R9는 간 및 신장에서 ATS-R9-내피 상호작용의 대표적인 결합 또는 응집없이 혈관을 따라 계속해서 움직인다.
이러한 결과로부터 알 수 있는 것처럼, ATS-R9은 지방 조직 맥관과 선택적으로 결합할 수 있는데, 오직 혈관 및 지방 조직의 미세혈관에서 응집되고, 간이나 신장 같은 다른 기관에서는 응집되지 않는다. 또한, 지방 조직에서 ATS-R9 결합 패턴은 통상의 단순 아르기닌 결합 구조체와 완전히 상이하다.
실시예 8 : 인 비보( in vivo )에서 유전자 발현
우선, in vivo 상 지방 조직내로 ATS-R9가 내재화함을 확인하였다.
C57BL/6J 비만 마우스에 꼬리정맥을 통해 FITC-컨쥬게이트된 ATS-R9을 주입하고, Rhodamine-컨쥬게이트된 렉틴을 주입하여 혈관염색을 하였다.
고정된 지방 조직 부분을 다광자 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 이용하여 이미지화하여 관찰한 결과, ATS-R9은 혈관을 통해 투과하여 지방세포 내로 점차 내재화함을 관찰하였다(도 14a). 하얀색 화살표가 지방세포 내로 내재화하는 FITC-ATS-R9를 나타낸다(Scale Bar: 50 ㎛).
다음으로 면역형광분석을 통해 지방 조직내로 FITC-ATS-R9 유도능(타겟능, homing)을 확인하였다.
FITC-컨쥬게이트된 ATS-R9를 비만 마우스 C57BL/6J에 주입하고 고정된 지방조직 부분을 비오틴-컨쥬게이된 항-FITC 항체와 함께 배양하였다. Cy3-컨쥬게이드된 ExtrAvidin를 이의 신호 증폭에 사용하였다. 다광자 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 이용하여 이미지화하여 관찰한 결과, 도 14b에 나타난 바와 같이 지방 조직내로 FITC-ATS-R9가 유도(homing)됨을 확인하였다.
마지막으로, in vivo 유전자 발현을 확인하기 위해, Red Fluorescence Protein(RFP) 발현 플라스미드를 FITC-ATS-R9로 농축하고 올리고-펩토플렉스를 비만 마우스 C57BL/6J에 주입하였다. 아무런 처치를 하지 않은 마우스를 대조군으로 사용하였다. 다광자 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 이용하여 이미지화하여 관찰한 결과, RFP 유전자 발현이 뚜렷이 확인되었다(도 14c).
실시예 9 : sh-RNA 및 사일런트 유전자 전달능
본 발명의 ATS-R9가 in vitro 및 in vivo에서 sh-RNA 전달과 지방세포에 사일런트 유전자를 전달하는데 뛰어난 효과를 가지는지 확인코자 하였다.
우선, 2 ㎍의 fabp4 sh-RNA를, ATS-R9, PEI 및 리포펙타민에 의해 3T3-L1 성숙 지방세포에 트랜스펙션시키고, 유전자 사일런싱 효율을 RT-PCR로 측정하였다. GAPDH를 내생성 대조군으로 사용하였다. 그 결과 Fabp4 유전자 사일런싱 효율은 70% 이상이었다(도 15).
9-1. 체중감소 효과
또한, sh-FABP4 처리 후 체중 감소도 확인되었다(도 16).
C57BL/6J 마우스들을 8주동안 매주 2번씩 30 ㎍의 sh-FABP4를 ATS-R9과 함께 처리하고 올리고-펩토플렉스을 피하로 주사하였다. sh-Luci를 대조군으로 사용하였다.
그 결과, sh-FABP4-ATS-R9 올리고-펩토플렉스 처리된 그룹이 8주후 체중의 약 20%가 감소되었다.
9-2.인슐린 및 글루코스 내성(tolerance) 테스트
또한, 인슐린 및 글루코스 내성을 관찰하였다.
8주 동안 주마다 2회로 C57BL/6J 마우스에 sh-FABP4- ATS-R9 올리고-펩토플렉스를 처리하였다. 올리고-펩토플렉스를 피하 투여에 의해 투여하였다. sh-Luci 를 대조군으로 사용하였다.
sh-FABP4-ATS-R9 올리고-펩토플렉스 처리된 그룹이 8주후 인슐린 및 글루코스에 더욱 민감하게 되는 것도 확인되었다(도 17 및 18)
즉, 본 발명의 ATS-R9가 in vitro 및 in vivo에서 sh-RNA 전달과 지방세포에 사일런트 유전자 전달에 효과적일 뿐만 아니라, 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료용 유전자를 전달할 때 체중을 감소시키고, 나아가 인슐린 및 글루코스 민감도를 개선시켰다.
비교예 2: 유전자 전달능의 비교
(1) 다른 전달체의 지방세포로의 유전자 전달능
PEI와 lipofectamin을 비교군으로 하여, 비만지방세포로의 유전자 luciferase 전달 능력을 평가하여 도 19에 도시하였다.
그 결과, 다른 전달체인 PEI와 lipofectamin에 비해 ATS-R9의 경우가 비만 지방세포로의 전달 효능이 뛰어난 것을 확인하였다.
(2) 지방세포의 분화 전 후에 따른 유전자 전달능
지방세포의 분화 전과 후의 유전자 전달 효능 비교한 결과를 도 20에 나타냈다.
이를 통해, 지방세포의 분화가 진행되어 비만 지방세포가 되어감에 따라 본 발명의 ATS-R9의 유전자 전달 효능이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
(3) 서열특이성에 따른 유전자 전달능
전달 유전자로서 luciferase를 사용하고 지방 타겟팅 서열로서 Scrambled ATS를 사용하여 비만 지방세포로의 유전자 전달 효능을 비교하였다.
그 결과, 도 21에서 확인할 수 있는 것처럼, ATS의 서열을 뒤집어서 전달하였을 경우 유전자 전달능력이 확연히 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과들을 통해, 본 발명의 ATS-R9 펩티드 구조체가 분화 후 지방 세포에서의 프로히비틴의 과발현 기작을 통해, 성숙한 "비만 지방세포"를 직접적으로 타겟팅하여 유전자를 전달할 수 있는 특이적 기능 및 효과를 확인할 수 있으므로, 비만에 대한 유전자 치료 방법에 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Claims (17)

  1. 지방세포 표적 서열(ATS) 및 R9(arginine) 펩타이드를 함유하는 지방세포 표적 유전자 전달체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 지방세포 표적 서열 및 R9(arginine) 펩타이드는 프로히비틴(prohibitin)과 결합되는 것을 특징으로 하는 지방세포 표적 유전자 전달체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 R9(arginine) 펩타이드는 Cys-(D-R)9-Cys 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 지방세포 표적 유전자 전달체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 지방세포 표적 서열은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 지방세포 표적 유전자 전달체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 지방세포는 분화된 성숙 비만 지방세포인 것을 특징으로 하는 지방세포 표적 유전자 전달체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 지방세포는 분화 개시 9 내지 11일 된 성숙된 비만 지방세포인 것을 특징으로 하는 지방세포 표적 유전자 전달체.
  7. 지방세포 표적 서열(ATS); R9(arginine) 펩타이드; 및 지방세포 표적 유전자로서 비만 및 비만 유래 대사증후군 치료 유전자를 함유하는 복합체.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 지방세포 표적 서열 및 R9(arginine) 펩타이드는 프로히비틴(prohibitin)과 결합되는 것을 특징으로 하는 복합체.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 R9(arginine) 펩타이드는 Cys-(D-R)9-Cys 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 복합체.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 지방세포 표적 서열은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있는 것을 특징으로 하는 복합체.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 비만 및 비만유래 대사증후군 치료 유전자는 DNA 또는 RNAi인 것을 특징으로 하는 복합체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 RNAi는 siRNA 또는 shRNA인 것을 특징으로 하는 복합체
  13. 제7항에 있어서,
    상기 복합체는 200 nm 이하의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 복합체.
  14. 제7항에 있어서,
    상기 복합체는 3 : 1 내지 8 : 1의 전하비율(+/-)을 가지는 것을 특징으로 하는 복합체.
  15. 제7항에 있어서,
    상기 지방세포는 분화된 성숙 비만 지방세포인 것을 특징으로 하는 복합체.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 지방세포는 분화 개시 9 내지 11일 된 성숙된 비만 지방세포인 것을 특징으로 하는 복합체.
  17. 제7항의 복합체를 유효성분으로 함유하는 비만 또는 비만 유래 대사증후군 치료용 조성물.
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