WO2014010985A1 - 세포내 단백질의 고효율 도입 및 유지용 펩타이드 - Google Patents

세포내 단백질의 고효율 도입 및 유지용 펩타이드 Download PDF

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WO2014010985A1
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diabetic
protein
composition
smts
cells
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PCT/KR2013/006260
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김용희
임광석
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한양대학교 산학협력단
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    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K2319/07—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a mitochondrial localisation signal
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    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22

Definitions

  • the present invention relates to a method for introducing an intracellular protein with high efficiency, and more particularly, by using a specific short mitochondrial target peptide sMTS, the efficiency of intracellular introduction and maintenance of biofunctional substances such as proteins, nucleic acids, drugs, etc.
  • hydrophilic or high molecular weight substances cannot enter the cell by the barrier of the cell membrane.
  • Cell membranes prevent macromolecules such as peptides, proteins and nucleic acids from entering the cell and fuse with the lysosomal compartment of the cell even when they enter the cell through a physiological mechanism called endocytosis by cell membrane receptors.
  • endocytosis a physiological mechanism called endocytosis by cell membrane receptors.
  • anti-cancer drugs must overcome obstacles such as multidrug resistance in order to deliver drugs into cells. In order to prevent drug degradation, a number of methods for delivering a variety of macromolecules and drug-containing transporters directly into cells without endocytosis have been proposed.
  • CPPs cell penetrating peptides
  • PTDs protein transduction domains
  • Such membrane-penetrating peptides include peptides consisting of 47th to 57th amino acids of Tat protein, which is a transcription factor of human immunodeficiency virus (Schwarze SR et al., Science, 285: 1569-1572, 1999), Drosophila antennae (antennapedia) Peptides consisting of amino acids 339 to 355 (Joliot A. et al., Proc Natl Acad Sci, 88: 1864-1868, 1991) are known.
  • the present inventors introduced a sMTS, which is a short peptide of a specific amino acid sequence derived from a mitochondrial target peptide, using a vector expressing a PTD-sMTS-MT fusion protein in using a protein transduction region (PTD) and an antioxidant fusion protein.
  • PTD protein transduction region
  • the main object of the present invention is to provide a use of the peptide sMTS to significantly increase the rate of intracellular introduction and maintenance of the antioxidant fusion protein composed of metallothionein (MT) and protein transduction region (PTD).
  • MT metallothionein
  • PTD protein transduction region
  • Another object of the present invention to provide a composition for treating diabetes containing a carrier of the PTD-sMTS-MT fusion protein and a method for treating diabetes using the same.
  • the present invention provides a novel use of the sMTS peptide consisting of amino acids of MVSAL, which significantly increases the protein introduction rate and maintenance rate.
  • the present invention relates to a novel use of the sMTS peptide containing the amino acid sequence of MVSAL as some peptide sequence (short mitochondrial target peptide) derived from the mitochondrial target peptide, and in addition to the mitochondrial target ability disclosed in previous studies,
  • the present invention relates to a function of remarkably improving intracellular introduction and maintenance ability of a protein.
  • the protein to be introduced into the cell preferably comprises a protein transduction region (PTD), more preferably may be an antioxidant fusion protein composed of metallothionein (MT) and protein transduction region (PTD).
  • PTD protein transduction region
  • MT metallothionein
  • PTD protein transduction region
  • the sMTS consisting of the amino acids of MVSAL is malate dehydrogenase, human cytochrome c subunit oxidase VIII, PI subtype of human ATP synthase subunit c, aldehyde dehydrogenase targeting sequence, human ATP synthase subunit FI Those derived from beta and BCS1 proteins and the like can be used.
  • SMTS peptide consisting of the amino acids of MVSAL; Metallothionein (MT); And a protein transduction region (PTD), a high efficiency cell introduction and maintenance fusion (PTD-sMTS-MT) composition.
  • the metallothionein may be preferably selected from one consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, wherein the protein transduction region is a Tat (Trans Activator of Transcription) protein of HIV-1 virus, polyarginine ( Arginine 6 or more), penetratin (Penetratin), HSV-1 structural protein VP22 transcriptional regulator protein, Pep-1 peptide, Pep-2 peptide and the like can be selected and used.
  • Tat Trans Activator of Transcription
  • polyarginine Arginine 6 or more
  • penetratin penetratin
  • HSV-1 structural protein VP22 transcriptional regulator protein Pep-1 structural protein VP22 transcriptional regulator protein
  • Pep-1 peptide Pep-2 peptide and the like
  • Tat is Tat represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 or polyarginine represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • composition of the present invention has the effect of reducing the concentration of free radicals (ROS) in the cell
  • the present invention provides a composition for delivering a therapeutic gene or therapeutic drug using the protein high efficiency cell introduction and maintenance fusion (PTD-sMTS-MT), and a method of using the same.
  • PTD-sMTS-MT protein high efficiency cell introduction and maintenance fusion
  • cardiomyocytes As cells to be delivered, most preferably, cardiomyocytes, pancreas cells, nerve cells, vascular endothelial cells, etc., in which an antioxidant fusion protein composed of metallothionein (MT) and protein transduction region (PTD) can be used.
  • MT metallothionein
  • PTD protein transduction region
  • the fusion composition an expression vector expressing such a fusion or a microorganism transformed therewith;
  • a pharmaceutical composition for preventing and treating diabetes mellitus or diabetic cardiomyopathy comprising these as an active ingredient. That is, it is useful for more effectively protecting pancreatic beta cells and cardiomyocytes from glucolipotoxicity or hyperglycemic stress.
  • the diabetes in the present invention includes a systemic or localized disease that causes diabetes complications and diabetes (preferably insulin-independent type 2 diabetes) as a direct or indirect factor, and specifically, diabetic acidosis ( diabetic acidosis, diabetic xanthoma, diabetic amyotrophy, diabetic ketosis, diabetic coma, diabetic gastric disorder, diabetic Diabetic gangrene, diabetic ulcer, diabetic complications, diabetic diarrhea, diabetic microangiopathy, diabetic uterine body sclerosis, diabetic Myocardial infarction (diabetic cardiomyopathy), diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic blisters (bullosis diabeticorum), sugar Diabetic cataract, diabetic dermopathy, diabetic scleredema, diabetic retinopathy, diabetic necrobiosis necrobiosis lipoidica diabeticorum, diabetic blood circulation disorder (diabetic blood circulation disorder) and the like can be exemplified.
  • SMTS which is a short peptide derived from the mitochondrial target peptide of the present invention, significantly increases the intracellular introduction rate and maintenance rate of the antioxidant fusion protein composed of metallothionein (MT) and protein transduction region (PTD), and therefore, treatment with these Effective delivery of the gene or therapeutic drug into cells is possible.
  • MT metallothionein
  • PTD protein transduction region
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a vector for expression of the fusion protein of the present invention.
  • Figure 4 is a comparison of the transduction efficiency of Tat-GFP and Tat-sMTS-GFP with or without the culture medium wash step.
  • TGFP 5 is a result of transduction efficiency of Tat-GFP (TG) and Tat-sMTS-GFP (TMG) after culture medium washing.
  • TM Tat-MT
  • TMS Tat-sMTS-MT
  • FIG. 7 shows (a) hyperglycemia (HG) (b) hypoxia (HP), (c) Tat-MT (TM) and Tat-sMTS-MT (TMM) in H9c2 cells. The result of confirming the cell viability effect.
  • FIG. 8 shows the effect on reactive oxygen species (ROS) under (a) hyperglycemia (HG), (b) hypoxia (HP), (c) hyperglycemia and hypoxic conditions in H9c2 cells.
  • ROS reactive oxygen species
  • FIG. 9 is a graph showing blood glucose level changes following injection of 3 ⁇ M TMM in STZ-induced diabetic mouse model.
  • Subject or “patient” means any single individual in need of treatment, including humans, cattle, dogs, guinea pigs, rabbits, chickens, insects, and the like. Also included are any subjects who participated in clinical research trials showing no disease clinical findings or subjects who participated in epidemiologic studies or who used as controls.
  • tissue or cell sample means a collection of similar cells obtained from a tissue of a subject or patient.
  • Sources of tissue or cell samples may include solid tissue from fresh, frozen and / or preserved organ or tissue samples or biopsies or aspirates; Blood or any blood component; Cells at any time of pregnancy or development in the subject. Tissue samples may also be primary or cultured cells or cell lines.
  • Gene means any nucleic acid sequence or portion thereof that has a functional role in protein coding or transcription or in the regulation of other gene expression.
  • the gene may consist of any nucleic acid encoding a functional protein or only a portion of a nucleic acid encoding or expressing a protein.
  • Nucleic acid sequences may include gene abnormalities in exons, introns, initiation or termination regions, promoter sequences, other regulatory sequences, or unique sequences adjacent to genes.
  • Fusion or linking, binding of a sequence refers to a single polypeptide chain comprising fused components.
  • the fused components can be connected directly or indirectly.
  • other sequences ie, linkers or functional domains
  • sMTS peptide consisting of amino acids of MVSAL; Metallothionein (MT); And protein transduction regions (PTD) can be fused.
  • “Expression” refers to the biological production of a product encoded by a coding sequence.
  • DNA sequences including coding sequences, are transcribed to form messenger RNA (mRNA).
  • Messenger RNAs are translated to form polypeptides with biological activity.
  • an RNA product will be considered a gene product because it may have associated activity.
  • Expression can include additional processing steps of the transcriptional RNA product, such as splicing for intron removal and / or post-translational processing of the polypeptide product.
  • a “coding region” or “coding sequence” refers to a nucleic acid sequence, complement thereof, or portion thereof that encodes a particular gene product or fragment thereof that requires expression, depending on the conventional base pair and codon usage relationship. Coding sequences include exons in genomic DNA or immature primary RNA transcripts that are linked together by a cell's biochemical machinery to provide mature mRNA. Antisense strands are complements of the nucleic acids, and coding sequences can be estimated from them. The coding sequence is placed in relation to transcriptional regulatory elements and translation initiation and termination codons such that transcripts of the appropriate length are produced and translated in the appropriate reading frame to produce the desired functional product.
  • nucleotide or “nucleic acid” refers to nucleotide polymers of all lengths, such as ribonucleotides as well as deoxyribonucleotides. This term refers only to the primary structure of a molecule and therefore to double or single chain DNA or RNA.
  • a label, methylation, "caps” known in the art one or more naturally occurring nucleotide substitutions, debonding (eg methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoamidate, carbarnate) Including attachments (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.), proteins (eg nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, poly-Llysine, etc.) Examples include those with acridine, Psolalen, etc., those with chelates (e.g. metal elements, radioactive metal elements, boron, metal oxide elements, etc.), those with alkyl compounds, modified bonds (e.g.
  • nucleic acid moieties provided by the present invention are regulatory elements derived from fragments of the genome and short oligonucleotide binders or a series of oligonucleotides, microorganisms or viral operons or eukaryotic genes. Will be aggregated into unique nucleotides that provide a synthetic nucleic acid that can be expressed in a recombinant transcription unit comprising a
  • the term "functional equivalent” refers to, for example, one or more substitutions, deletions or additions from a reference sequence, the actual effect of not producing various functional dissimilarities between the reference sequence and the subject sequence ( It refers to both the nucleotide and nucleic acid sequence of the changed mutant sequence, such as net effect).
  • Substantial equivalents according to the invention for example mutations, amino acid sequences, preferably have at least 80% sequence identity, more preferably at least 90% sequence identity with the listed amino acid sequences.
  • Substantial equivalents of the nucleotide sequences of the present invention may have a lower percentage of sequence identity, for example when considering redundancy or degeneracy of the genetic code.
  • the nucleotide sequence should have at least about 65% identity, more preferably at least about 75% identity, and most preferably about 95% identity.
  • sequences having synthetic characteristics that are substantially equivalent to biological activity that are substantially equivalent are treated as substantially equivalent.
  • vector refers to a nucleic acid molecule capable of carrying another nucleic acid to which it is associated.
  • expression vector includes plasmids, cosmids or phages capable of synthesizing fusion proteins encoded by each recombinant gene carried by the vector.
  • transduction refers to the insertion of genes from a host cell into the genome of a virus during infection and transfer to another host cell during another virus infection cycle. In general transduction, any gene in the host cell can be transferred by this process, but in a particular transduction only a few specific genes are transduced. Transduction is used as a microbiological technique that is useful for many other genetic experiments, to create strains of new bacteria or to locate genes.
  • amino acid and amino acid residue refer to natural amino acids, unnatural amino acids, and modified amino acids. Unless stated otherwise, all references to amino acids include references to both D and L stereoisomers (where the structure allows such stereoisomeric forms), either generically or by name.
  • Natural amino acids include alanine (Ala), arginine (Arg), asparagine (Asn), aspartic acid (Asp), cysteine (Cys), glutamine (Gln), glutamic acid (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), Leucine (Leu), Lysine (Lys), Methionine (Met), Phenylalanine (Phe), Proline (Pro), Serine (Ser), Threonine (Thr), Tryptophan (Trp), Tyrosine (Tyr) and Valine (Val) is included.
  • Non-natural amino acids include modified amino acid residues that are chemically modified on the N-terminal amino group or side chain group, or that are reversibly or irreversibly chemically blocked, such as N-methylated D and L amino acids or side chain functional groups as another functional group. Chemically modified residues are included.
  • disorder is any condition that would benefit from treatment with molecules identified using the transgenic animal model of the present invention. This includes chronic and acute diseases or conditions, including pathological conditions that make mammals susceptible to mysterious diseases. Examples of diseases to be addressed herein include, but are not limited to, diabetes, obesity, metabolic syndrome symptoms, and the like.
  • Treatment is an approach for obtaining beneficial or desired results, including clinical results.
  • Treatment or “mitigation” of a disease, disorder or condition is a progression of progression with less and / or less clinical signs and / or undesirable clinical signs of the condition, disorder or disease state as compared to not treating the disorder. Means slowing down or getting longer.
  • a “therapeutically effective amount” means an active compound in a composition that will elicit a biological or medical response in a tissue, system, subject or human being sought by a researcher, veterinarian, physician or other clinician, which includes alleviating the symptoms of the disorder to be treated. Means the amount of.
  • a “prophylactically effective amount” is a biological or medical condition in a tissue, system, subject or human being sought by a researcher, veterinarian, doctor or other clinician to prevent the development of the disease in a subject at risk of a related disorder, condition or disease.
  • the amount of active compound in the composition that will elicit a response.
  • Geneology refers to treating a genetic disease by correcting a mutated gene or treating a disease by controlling protein expression using a gene or RNAi. In other words, it is a method of treating a disease by transplanting a normal gene to a patient's cell and changing the phenotype of the cell. Gene therapy requires the study of gene vectors and systems that introduce genes into the body.
  • “About” means 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 for reference quantities, levels, values, numbers, frequencies, percentages, dimensions, sizes, quantities, weights, or lengths. , Amount, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length, varying by about 3, 2 or 1%.
  • the present invention relates to intracellular biomaterial delivery systems, and in particular, to novel uses of short mitochondrial target peptides (sMTSs) containing the amino acid sequence of MVSAL used at this time.
  • sMTSs short mitochondrial target peptides
  • the function of sMTS containing the amino acid sequence of MVSAL which significantly improves the rate of intracellular introduction and maintenance of antioxidant fusion proteins that can protect the destruction of pancreatic beta cells and cardiomyocytes from glycation and glycolipid stress. It is about.
  • an sMTS peptide consisting of amino acids of MVSAL; Metallothionein (MT); And recombinant polynucleotide constructs (collectively referred to as "expression vectors"), such as high efficiency cell transduction and maintenance fusion (PTD-sMTS-MT) compositions, and recombinant expression vectors containing them, comprising a protein transduction region (PTD).
  • expression vectors such as high efficiency cell transduction and maintenance fusion (PTD-sMTS-MT) compositions, and recombinant expression vectors containing them, comprising a protein transduction region (PTD).
  • the present invention relates to an intracellular introduction and maintenance system of the PTD-sMTS-MT fusion, which can be embodied as an aspect of a composition for treating diabetic diseases, the microorganisms transformed with the expression vector.
  • the present invention relates to a test tube using sMTS peptide consisting of amino acids of MVSAL, fused with metallothionein (MT) -PTD sequence and using standard cloning techniques and conventional methods known to those of ordinary skill in the art. And by expressing the fusion protein in vivo.
  • sMTS peptide consisting of amino acids of MVSAL, fused with metallothionein (MT) -PTD sequence and using standard cloning techniques and conventional methods known to those of ordinary skill in the art.
  • MT metallothionein
  • the present invention relates to a novel function of enhancing the intracellular protein transduction ability and the maintenance ability of the sMTS peptide consisting of amino acids of MVSAL.
  • the present invention aims at improving the introduction ability and the maintenance ability of the conventionally known sMTS, not simply using the target ability into the mitochondria.
  • M methionine
  • V valine
  • S serotonine
  • A SMTS (short (Mitochondrial Targeting Sequence) peptide
  • L leucine
  • the sMTS sequence MVSAL is not particularly limited in the present invention as long as it is derived from a mitochondrial protein.
  • mitochondrial targeting sequences include malate dehydrogenase, human cytochrome c subunit oxidase VIII, PI subtypes of human ATP synthase subunit c, aldehyde dehydrogenase targeting sequence, human ATP synthase subunit FI beta And it may be derived from one protein selected from the group consisting of BCS1 protein. Preferably from malate dehydrogenase.
  • the sMTS peptide consisting of the MVSAL amino acids of the present invention significantly increases the ability to introduce and maintain proteins into cells of interest, such as cardiomyocytes, pancreas cells, nerve cells, vascular endothelial cells, or skin cells. There is a function to let.
  • an antioxidant fusion protein composed of talochionein (MT) and protein transduction region (PTD) binds to sMTS of MVSAL to significantly increase the ability to enter and maintain the cells of interest.
  • Antioxidant fusion protein used in one embodiment of the present invention is a protein-transduction domain (Protein Tranduction Domain) peptide binding to the amino terminal of the metallothionein (pancreatic beta cells and myocardial muscle from glycosylation and glycolipid stress) Includes the function of protecting the destruction of cells.
  • Protein Tranduction Domain Protein Tranduction Domain
  • the metallothionein can be any of the types I, II, III and IV, isoforms thereof, as long as they are of human origin.
  • those represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 may be used.
  • protein transduction region can be fused with metallothionein and penetrated into cells, and any one known in the art can be used without limitation.
  • Tat protein of HIV-1 virus polyarginine (6 or more arginines), penetratin (Penetratin), HSV-1 structural protein VP22 transcriptional regulator protein, Pep-1 peptide, or Pep-2 peptide It is possible.
  • Tat Trans Activator of Transcription
  • polyarginine represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6
  • an sMTS peptide consisting of amino acids of MVSAL; Metallothionein (MT); And a high efficiency cell transduction and maintenance fusion (PTD-sMTS-MT) composition composed of a protein transduction region (PTD).
  • the sMTS peptide is positioned between the protein transduction region (PTD) and the metallothionein (MT) protein.
  • the fusion composition may have a polyhistidine (poly-His) region coupled to the amino terminus of the protein transduction region.
  • the polyhistidine (poly-His) region is one of the labeling peptides, and may be used to separate and purify the fusion protein of the present invention by binding to histidine binding resin.
  • hexahistidine is used as the polyhistidine region.
  • the cDNA encoding the protein transduction region is bound to the 5 'end of the cDNA encoding the metallothionein protein, and includes a recombinant polynucleotide encoding the antioxidant fusion protein of the present invention.
  • Such polynucleotides can be prepared according to conventional methods from known nucleic acid sequences encoding metallocionein, protein transduction regions, mitochondrial targeting sequences.
  • the present invention provides an expression vector expressing a high efficiency cell introduction and maintenance fusion (PTD-sMTS-MT).
  • the vector is not particularly limited as long as it can be used as a cloning vector.
  • pRSET pET3, pET11, pBAD, pThioHis, pTrcHis and the like are possible.
  • the vector a vector into which DNA encoding a poly-His region is inserted can be used.
  • Such a vector can be prepared by inserting a gene encoding the fusion protein into a cloning vector digested with an appropriate restriction enzyme by a conventional method known in the art.
  • the present invention can provide a microorganism transformed with the vector.
  • the microorganism may be anything as long as the fusion protein can be effectively expressed.
  • E. Coli Pichia genus strains, and the like can be exemplified.
  • the fusion composition of the present invention can be prepared, for example, by the following method:
  • the transformation step can be carried out by transporting the expression vector into a host cell.
  • the transformation method may be carried out by the CaCl 2 method, Hanahan method and electroporation method when the host cell is a prokaryotic cell.
  • the expression vector is injected into the host cell microorganism by micro injection, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposome-mediated transfection, DEAE-dextran treatment and gene bombardment. can do.
  • the expression vector injected into the microorganism is expressed in the microorganism to obtain the desired fusion protein.
  • the expressed fusion protein can be purified in a denatured or natural state through common purification methods known in the art. Purification methods include, for example, fractionation with ammonium sulfate, size differential filtration (ultrafiltration) and metal chelating affinity chromatography.
  • the present invention provides the use of a fusion composition for high efficiency cell introduction and maintenance of a protein containing sMTS consisting of amino acids of MVSAL.
  • Preferred examples include sMTS of MVSAL; Metallothionein (MT); And a protein transduction region (PTD), for the prevention or therapeutic use of diabetes or diabetic cardiomyopathy. That is, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating or preventing diabetes or diabetic cardiomyopathy or a treatment method using the same.
  • the diabetes in the present invention includes a systemic or localized disease that causes diabetes complications and diabetes (preferably insulin-independent type 2 diabetes) as a direct or indirect factor, and specifically, diabetic acidosis ( diabetic acidosis, diabetic xanthoma, diabetic amyotrophy, diabetic ketosis, diabetic coma, diabetic gastric disorder, diabetic Diabetic gangrene, diabetic ulcer, diabetic complications, diabetic diarrhea, diabetic microangiopathy, diabetic uterine body sclerosis, diabetic Myocardial infarction (diabetic cardiomyopathy), diabetic neuropathy, diabetic nephropathy, diabetic blisters (bullosis diabeticorum), sugar Diabetic cataract, diabetic dermopathy, diabetic scleredema, diabetic retinopathy, diabetic necrobiosis necrobiosis lipoidica diabeticorum, diabetic blood circulation disorder (diabetic blood circulation disorder) and the like can be exemplified.
  • MT Metallothionein
  • PTD protein transduction region
  • the pharmaceutical composition of the present invention in addition to the above-described active ingredient for administration can be prepared containing one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components, if necessary, as antioxidants, buffers And other conventional additives such as bacteriostatic agents can be added.
  • Diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • it may be preferably formulated according to each disease or component by an appropriate method in the art or using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA.
  • composition according to the present invention can be administered orally or parenterally during clinical administration, and can be used in the form of general pharmaceutical preparations, and when formulated, commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc. Diluents or excipients may be used.
  • Solid preparations for oral administration may be prepared by mixing at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose or gelatin in the fusion protein according to the present invention.
  • excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose or gelatin
  • lubricants such as magnesium stearate and talc may be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solvents, emulsions or syrups, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc. can be used in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent or the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, etc.
  • the bases of the suppositories may include Utopepsol, macrogol, Tween 61, Cacao butter, laurin butter, glycerol, gelatin and the like can be used.
  • composition of the present invention can be administered parenterally (eg, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) or orally, depending on the desired method, and the dosage is in the range of 0.01 to 1000 mg per kg of body weight. Administration may be divided into several times or several times. In this case, the dosage may be adjusted according to the weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate and severity of the patient.
  • pRSET vectors were purchased from Invitrogen (La Jolla, Calif.). All restriction enzymes and PCR cloning kits were obtained from Takara (Tokyo, Japan). An immobilized Ni-affinity chromatography column (IMAC) was purchased from Bio-Rad (Hercules, Calif.) And NaAsO 2 (Sodium arsenite) and glucose from Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo.). H2DCFDA (2 ', 7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate) was purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA).
  • MT, TM and TMM fusion proteins were cloned, expressed and purified.
  • Plasmid vectors expressing Tat-MT fusion proteins were constructed using pRSET vectors designed for high level protein expression and purification in E. coli. Tat-MT fusion constructs were prepared with reference to the prior art [K. Lim, Y. Won, Y. Park, Y. Kim, Preparation and functional analysis of recombinant protein transduction domain-metallothionein fusion proteins, Biochimie, 92 (2010) 964-970]
  • Tat oligonucleotide and MT cDNA were inserted into pRSET bacterial expression vector (Invitrogen, La Jolla, Calif.) To prepare a Tat-MT fusion protein expression vector.
  • Tat (TAG GGC AGG AAG AAG CGG AGA CAG CGA CGA) was annealed and cloned into the pRSET vector to generate the pRSET-Tat vector.
  • sMTS short malate dehydrogenase
  • Tat-MT expression vector was prepared. Purified sMTS fragment was cloned into Tat-MT expression vector at Xho I position. Tat-sMTS-MT constructs were confirmed by DNA sequence analysis (Cosmogene Tech, Seoul, Korea).
  • Tat-GFP and Tat-sMTS-GFP DNA sequences were cloned into the pRSET-A vector and the retention time and transduction efficiency of Tat and Tat-sMTS fusion proteins were measured.
  • Nucleotide sequences of Tat-GFP (TG) and Tat-sMTS-GFP (TMG) were confirmed by DNA sequencing (Consmogenetech, Seoul, Korea). The structural schematic diagram of the produced expression vector is shown in FIG.
  • MT Tat-MT
  • TMM Tat-sMTS-MT
  • fusion protein expression vectors were transduced into Escherichia coli strain BL21 (DE) pLysS (Novagen, Madison, Wis.) And incubated for 4 hours at 37 ° C. in LB medium (Becton Dickinson and company, MD).
  • IPTG isopropyl beta-D-thiogalactoside
  • ZnSO 4 (1 mM) were added to induce expression and stabilization of each protein.
  • Cell pellets were collected by centrifugation and suspended in lysis buffer (300 mM KCl, 49 mM KH 2 PO 4, 4.9 mM Imidazole). The suspended pellets were sonicated and filtered through a 0.45-um filter. The proteins were then purified by immobilized metal affinity chromatography (IMAC) with FPLC (Bio-Rad, Hercules, CA) using a Ni-NTA resin column. Finally, the protein solution was dialyzed against a pH 7.4 phosphate buffered saline (PBS) using a 3,500 molecular weight cut off membrane (Spectrum Laboratories, Calif.).
  • IMAC immobilized metal affinity chromatography
  • Tat-GFP TG
  • Tat-sMTS-GFP TMG
  • the expressed Tat-GFP and Tat-sMTS-GFP fusion proteins were purified using IMAC and dialyzed against pH 7.4 PBS using 12,000-14,000 MWCO membranes. All fusion proteins were subjected to electrophoresis on a 12% SDS-PAGE gel and stained with Coumashin Brilliant Blue (Bio-Rad, Hercules, CA) for 60 minutes for MT detection.
  • Heart-derived mouse H9c2 cardiomyocytes (Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea), DMEM (Dulbecco's modified Eagle's) containing 10% fetal bovine serum (FBS) supplemented with 100 U / ml penicillin and 100 mg / ml streptomycin medium) incubated at 37 ° C. under humid conditions (5% CO 2 atmosphere).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's
  • FBS fetal bovine serum
  • H9c2 cells were seeded on 6-well plates at a density of 2 ⁇ 10 5 cells per well. Cells were treated with TG and TMG at 1 and 3 ⁇ M for 10 min to 60 min, then the cells were trypsinized and washed twice with pH 7.4 PBS. Cells were fixed with fixed buffer containing FACS buffer with FBS
  • Transduction efficiency was measured using FACSCalibur (BD Biosciences, San Diego, Calif.), And data analysis was performed with CellQuest software (BD PharMingen, San Jose, Calif.).
  • TG and TMG were incubated for 1 h with H9c2, replaced with fresh medium and the cells fixed after 2 hours. Delay times of TG and TMG were measured using FACS.
  • H9c2 cells were seeded on 60-mm dishes at a density of 1 ⁇ 10 4 cells / dish. Cells were cultured for one day and fusion protein transduction was performed.
  • TG and TMG were treated with TG and TMG at 3 ⁇ M for 1 h before the medium was fresh. The cells were washed three times with PBS after 2 hours and fixed for 49 minutes with 4% formaldehyde solution. After fixation, cells were washed twice with PBS and mounted on slide glass with DAPI-fluoromount G (Southern Biotech, Birmingham, AL) for nuclear staining. Intracellular TG and TMG were analyzed using multi-photon confocal laser scanning microscopy (LSM780 META NLO; Carl Zeiss Jena, Germany; Korea Basic Science Institute, Chuncheon Center, Chuncheon-city, Korea). Visualization.
  • H9c2 cells were treated with TG and TMG 3 ⁇ M for 1 h and the medium washed. After medium replacement the cells were washed twice with PBS and stained nuclei for 15 min by Pentahydrate (bis-Benzimise) (Molecular Probes, Carlsbad, Calif.).
  • Intracellular TG and TMG were detected using a multi-proton confocal laser scanning microscope (LSM510 META NLO; Carl Zeiss Jena, Germnay, Korea Basic Science Institute, Chuncehon Center, Chuncheon, Korea).
  • MT was replaced with GFP in the same plasmid vector and transduction efficiency was measured by FACS.
  • GFP alone showed negative transduction results without the help of Tat or Tat-sMTS, while transducing Tat-GFP (TG) and Tat-sMTS-GFP (TMG).
  • TG Tat-GFP
  • TMG Tat-sMTS-GFP
  • the efficiency was significantly increased in dose- and incubation time dependent methods.
  • the transduction efficiency of TG ranged from 8.78 ⁇ 12.28% to 73.4 ⁇ 9.54% at 1 ⁇ M over 10 min to 1 h incubation time, and reached 92.90 ⁇ 7.18% after 1 hour incubation at 3 ⁇ M.
  • sMTS peptides derived from mitochondrial malate dehydrogenase (mMDH) signal sequences enhanced protein transduction ability. Since the addition of sMTS to the fusion protein significantly improves GFP transduction capacity and shortens the transduction time, the present inventors anticipated and confirmed that the sMTS peptide could increase the retention time of the fusion protein in cells.
  • mitochondrial malate dehydrogenase mMDH
  • H9c2 cells were treated with GFP, TG, and TMG for 1 h, the medium was replaced with fresh, the cells were fixed with fixed buffer after 2 h and the transduction efficiency was compared with cells that did not undergo washing step 3 One result is shown in FIGS. 4 and 5.
  • GFP did not show transduction into cells at 1 and 3 ⁇ M. While the transduction capacity of TG was significantly reduced from 92.9 ⁇ 7.18% to 40.08 ⁇ 3.94%, no obvious reduction of TMG was seen at TMG at 3 ⁇ M. However, when cells were treated with TG and TMG for 3 h without washing step, the transduction efficiencies of TG and TMG were both 94.89 ⁇ 5.87% and 98.08 ⁇ 0.63%, respectively (FIG. 4).
  • Live cell images without immobilization showed the same results, showing that the difference between TG and TMG was not due to differences in immobilization process.
  • the ability of mitochondrial localization by sMTS was confirmed by CLSM, but sMTS was also not sufficient to localize in mitochondria (data not shown).
  • H9c2 cells were seeded in two groups on glass covers in 6-well plates and subjected to 1 + 2 h and 3 h culture protocols.
  • MT, Tat-MT (TM) and Tat-sMTS-MT (TMM) were treated with H9c2 cells at 1 ⁇ M for 1 + 2 h and 3 h, respectively. Then, samples were prepared for immunohistochemical analysis and the following protocol was performed.
  • the cells were washed and probed at room temperature for 1 hour with a suitable secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488 (1: 1000, Molecular Probes, Eugene, OR). Nuclei were stained with Hoechst (2 ⁇ g / ml, Molecular Probes, Eugene, OR) at room temperature for 5 min in PBS. The slides were washed twice with PBS and mounted using DAKO fluorescent mounting medium (DAKO corporation, Carpinteria, Calif.). Samples were measured at 405 nm, 488 nm and 555 nm for Hoechst, 6x-His, and Mitotracker, respectively, using a confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Germany).
  • Tat-sMTS-MT TMM And intracellular trafficking of Tat-MT (TM) with Alexa Fluor 488-conjugated antibody using CLSM is shown in FIG. 6.
  • TMM As shown in FIG. 6, after 1 + 2 h wash step, the TMM remained in the cells and showed strong fluorescence intensity in the cytosol even after culture medium change. However, Tat-MT (TM) showed significantly reduced strength, indicating less efficient retention activity compared to TMM.
  • the MT and PBS treated groups showed fluorescence intensity in the nucleus. It was also interesting to note that although the sMTS sequence is derived from the mitochondrial targeting sequence, it is not able to localize the fusion protein into the mitochondria. These results suggest that fusion of the sMTS peptide promotes the enhancement of intracellular retention time of the fusion protein.
  • the cells were exposed to hyperglycemic conditions by incubating for 24 h in 350 mM glucose (Sigma, St. Louis, MO) solution. Hyperglycemic-exposed cells were also incubated for 24 h under hypoxic conditions (1% O 2 and 5% CO 2). Cell viability in H9c2 cells exposed to these conditions was measured by Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan).
  • hyperglycemia and hypoxia are closely related to causing type 1 and 2 diabetes by increasing ROS production and oxidative stress. Therefore, to determine the protective effect of MT protein on hyperglycemia, cells were exposed to hyperglycemia by incubating for 24 hours in 350 mM glucose solution.
  • H9c2 cell viability was reduced by 43.9 ⁇ 1.9% under hyperglycemic conditions (FIG. 7A).
  • TM and TMM fusion proteins also showed a protective effect against hypoxic stress (FIG. 7B).
  • FIG. 7c they showed cell viability in hypoxic and hyperglycemic conditions from 48.7 ⁇ 10.4% for TM to 63.3 ⁇ 6.9%, 73.1 ⁇ 3.2% for TMM.
  • MT was less efficient at increasing cell viability due to lower transduction efficiency.
  • ROS reactive oxygen species
  • NaAsO2 sodium arsenite
  • H9c2 cells were exposed to 10 ⁇ NaAsO2 for 24 h. After removing the medium from the cells, H9c2 cells were washed twice with PBS. Cell-permeable H2DCFDA probe (10 ⁇ M) was added to each well of the plate and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Fluorescence intensity was measured at 499 nm excitation and 522 nm emission wavelengths with a UV / Vis fluorescence spectrophotometer (SpectraMax M2e; Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.). ROS levels in H9c2 cells exposed to hyperglycemia and hyperglycemia / hypoxia were also measured by the same method.
  • ROS reactive oxygen species
  • ROS levels in cells exposed to oxidative stress-induced conditions without protein increased to 9.3 ⁇ 7.3% (FIG. 8-a).
  • the ROS intensity decreased to 5.1 ⁇ 4.8% for TM and 0.6 ⁇ 1.5% for TMM.
  • ROS intensity increased by 10 ⁇ 1% relative to the control group (FIG. 8-b).
  • TMM-treated cells showed a significant decrease in ROS levels after 24 hours.
  • TM and TMM also reduced ROS intensity from 10.3 ⁇ 1.5% of the untreated group to 7.9 ⁇ 1.4% and 4.5 ⁇ 1.9%, respectively, under hyperglycemic and hypoxic combination conditions (Figure 8-c).
  • the hyperglycemic and hypoxic combinations did not show synergistic effects on ROS increase. The difference was not large, but TMM apparently reduced ROS levels in the cells.
  • NaAsO 2 is known as a chemical ROS inducer and is widely used in oxidative stress-related studies. TMM co-administered H9c2 cells with 10 ⁇ M NaAsO 2 for 24 h and reduced ROS intensity by 9.7 ⁇ 2.3%. In contrast, MT did not induce a statistically significant decrease in ROS levels (FIG. 8-d).
  • STZ was dissolved in 50 mM citrate buffer (pH 4.5) and injected intraperitoneally (IP, intraperitoneal). Diabetes was induced by injecting STZ at a dose of 80 mg / kg into 5-week old balb / c mice of 18-21 g. Diabetes was caused by STZ within 3 days by beta cell destruction. TM and TMM 3 ⁇ M (48 ⁇ l) were administered to 4 mice in each group before and after infusion of STZ daily for 5 days. Blood glucose was monitored using retro-orbital blood collection and measured using an automated glucose analyzer (Roche, Basel, Switzerland). Blood glucose levels were above 300 mg / dl in diabetic mice.
  • TMM was injected into STZ-induced diabetic mice and H2DCFDA was also injected into the STZ-induced diabetic mouse model intraperitoneally.
  • STZ-induced diabetic animal models were made by inducing diabetes by injecting STZ at a dose of 80 mg / kg intraperitoneally in the manner described above. Three days after infusion, blood glucose levels reached 300 mg / dl or more. To determine effective dosing timing of MT fusion proteins to lower blood glucose levels, TMM was injected intraperitoneally at 3 ⁇ M before and after STZ administration.
  • BGL Blood glucose levels
  • the MT- and TM-treated groups reached 300 mg / dl after 5 and 7 days, respectively, while the TMM-treated groups were below or near 200 mg / dl for 9 days.
  • TMM pancreas extracted from STZ-induced diabetic mice.
  • the level of ROS was high in the pancreas of untreated mice after STZ administration, but the Tat-sMTS-MT treated group showed reduced ROS intensity (FIG. 10-a).
  • TMM treatment significantly reduced ROS intensity by 94 ⁇ 5%.
  • the introduction of the sMTS of the present invention enhances the cellular influx of the fusion protein and enhances the intracellular sustaining effect. Therefore, this function of sMTS is possible to apply to drug delivery systems such as fusion proteins, gene carriers and nanoparticles, suggesting that it can increase the therapeutic efficacy.

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Abstract

본 발명은 높은 효율로 세포내 단백질을 도입하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 특정의 짧은 미토콘드리아 표적 펩타이드, sMTS를 이용하여 단백질, 핵산, 약물 등과 같은 생체 기능성 물질의 세포내 도입 및 유지 효율을 현저히 향상시키기 위한 방법 및 이에 사용되는 융합체 조성물에 관한 것이다.

Description

세포내 단백질의 고효율 도입 및 유지용 펩타이드
본 발명은 높은 효율로 세포내 단백질을 도입하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 특정의 짧은 미토콘드리아 표적 펩타이드 sMTS를 이용하여 단백질, 핵산, 약물 등과 같은 생체 기능성 물질의 세포내 도입 및 유지 효율을 현저히 향상시키기 위한 방법 및 이에 사용되는 융합체 조성물과 이의 용도에 관한 것이다.
일반적으로 친수성이거나 분자량이 크고 거대한 물질들은 세포막이라는 장벽에 의해 세포 안으로 들어갈 수 없다. 세포막은 펩타이드나 단백질, 핵산과 같은 거대 분자가 세포 내로 들어오지 못하게 막고, 세포막 수용체에 의한 엔도사이토시스(endocytosis)라는 생리적 기작을 통해 세포 내로 들어오더라도 세포의 용해소체 분획(lysosomal compartment)과 융합되어 결국 분해되므로, 상기 거대 분자들을 이용한 질병의 치료 및 예방에 있어서 많은 제약이 따른다. 또한 항암제의 경우 세포 내로 약물을 전달하기 위해선 다약제 저항성(multidrug resistance)과 같은 장애물을 극복해야만 한다. 이에 약물 분해를 막기 위해 다양한 거대 분자 및 약물이 함유된 전달체를 엔도사이토시스 과정을 통하지 않고, 직접 세포 내로 전달하는 많은 방법이 제시되었다. 이러한 방법들에는 마이크로 주입(microinjection), 전기적 자극(electroporation) 등이 있는데, 이는 세포막에 손상을 줄 가능성이 있다. 또 다른 방법들로 pH 민감성 리포좀과 세포투과성 물질을 이용하는 방법이 있다. 하지만 이러한 방법을 통하여 세포 내로 약물들을 전달하였다 하더라도 약효를 발휘하기 위해서는 특정한 기관으로 이동되어야 하는 문제가 있다.
새로운 대안들 중 하나로, 세포막 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide,CPP) 또는 단백질 전달 도메인(protein transduction domain, PTD)들이 지금까지 낮은 세포막 투과성 및 빠른 생체 내 반감기로 인하여, 약물로 사용하기 어려웠던 치료용 단백질 및 유전자와 같은 거대 분자들의 이용가치를 높일 수 있어 많은 각광을 받고 있다. 세포투과성 펩타이드들이 단백질뿐만 아니라 여러 물질들과 화학적으로 결합하여 세포 내로 상기 물질들을 투과시킬 수 있다는 것은 이미 많이 보고되었다(Maarja and Ulo, Current Opinion in Pharmacology, 6:509-514, 2006).
이러한 세포막 투과성 펩타이드에는 대표적으로 인간 면역 결핍 바이러스의 전사인자인 Tat 단백질의 47번째 아미노산부터 57번째 아미노산으로 구성된 펩타이드(Schwarze SR et al., Science, 285:1569-1572, 1999), 초파리의 안테나페디아(antennapedia) 단백질의 339번째 아미노산부터 355번째 아미노산으로 이루어진 펩타이드(Joliot A. et al., Proc Natl Acad Sci, 88:1864-1868, 1991)등이 알려져 있다.
이러한 펩타이드에 의한 거대분자의 생체 내 운반 가능성에 대해서도 많은 연구가 되어왔다. Tat 펩타이드에 의해 베타갈락토시데이스의 생체내 운반(Schwarze SR et al.,Science, 285:1569-1572, 1999), 알지닌 올리고머(arginine oligomer)에 의한 사이클로스포린 A(cyclosporin A)의 국소적 적용 및 그에 따른 항염증효과(Jonathan B. Rothbard. et al., Nature Medicine, 6:1253-1257, 2000), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor)의 시그날 펩타이드로부터 유래한 sMTS 펩타이드에 의한 SOC3 단백질의 생체 내 침투 및 항염증 및 항세포사멸 효과(DaeWoong Jo et al., Nature Medicine, 11:892-898, 2005), 인간의 전사인자(transcription factor)의 시그날 펩타이드로부터 유래된 Hph-1 펩타이드에 의한 CTL-4 부분의 코점막 적용에 따른 알러지 염증반응의 억제효과(JM Choi et al., Nature Medicine, 12:574-579,2006) 등이 보고되어 있다.
특히, 본 발명자들의 이전 연구에서는 메탈로치오네인(metallothionein)의 아미노 말단에 단백질 형질 도입 영역(Protein Tranduction Domain)이 펩타이드 결합된 항산화 융합 단백질을 이용하여 당뇨병 등의 치료제를 세포 내로 효과적으로 도입하는 방법을 고안하였었지만, 이러한 단백질 형질 도입 영역(PTD)를 이용한 융합단백질은 여전히 세포내 도입 후 세포 밖으로 다시 유출되어 약효가 떨어지는 등의 문제를 지니고 있었다.
이에 본 발명자들은 단백질 형질 도입 영역(PTD)와 항산화 융합단백질을 이용함에 있어서, 미토콘드리아 표적 펩타이드에서 유래한 특정 아미노산 서열의 짧은 펩타이드인 sMTS를 도입하여 PTD-sMTS-MT 융합 단백질을 발현하는 벡터를 이용함으로써, 단백질의 세포 유입 및 유지 효율이 현저히 향상됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주요 목적은 메탈로치오네인(MT) 및 단백질 형질 도입 영역(PTD)으로 구성된 항산화 융합단백질의 세포내 도입율 및 유지율을 현저히 높이는 펩타이드 sMTS의 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 PTD-sMTS-MT 융합 단백질의 전달체를 함유하는 당뇨병 치료용 조성물 및 이를 이용한 당뇨병 치료방법을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 단백질의 세포내 도입율 및 유지율을 현저히 높이는, MVSAL의 아미노산으로 구성된 sMTS 펩타이드의 신규 용도를 제공한다.
즉, 본 발명은 미토콘드리아 표적 펩타이드에서 유래한 일부 펩타이드 서열(짧은 미토콘드리아 표적 펩타이드)로서, MVSAL의 아미노산 서열을 함유하는 sMTS 펩타이드의 신규 용도에 관한 것으로, 이전 연구에서 밝힌 미토콘드리아 타겟능 이외에도 상기 sMTS 펩타이드가 단백질의 세포내 도입능 및 유지능을 현저히 향상시키는 기능에 관한 것이다.
특히, 세포내 도입되는 단백질은 단백질 형질 도입 영역(PTD)을 포함하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 메탈로치오네인(MT) 및 단백질 형질 도입 영역(PTD)으로 구성된 항산화 융합 단백질일 수 있다.
상기 MVSAL의 아미노산으로 구성된 sMTS는 말레이트 디하이드로게나아제, 인간 시토크롬 c 서브유닛 옥시다제 VIII, 인간 ATP 신타아제 서브유닛 c의 PI 아형, 알데히드 디하이드로게나제 타겟팅 서열, 인간 ATP 신타아제 서브유닛 FI 베타 및 BCS1 단백질 등으로부터 유래한 것을 사용할 수 있다.
본 발명은 일 구체예로서,
MVSAL의 아미노산으로 구성된 sMTS 펩타이드; 메탈로치오네인(MT); 및 단백질 형질 도입 영역(PTD)으로 구성된, 고효율 세포도입 및 유지용 융합체(PTD-sMTS-MT) 조성물를 제공한다.
이 때, 상기 메탈로치오네인은 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 것에서 선택될 수 있고, 상기 단백질 형질 도입 영역은 HIV-1 바이러스의 Tat(Trans Activator of Transcription) 단백질, 폴리아르기닌(아르기닌 6개 이상), 페너트라틴(Penetratin), HSV-1 구조단백질 VP22의 전사조절단백질, Pep-1 펩타이드, 및 Pep-2 펩타이드 등에서 선택하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 Tat 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 폴리아르기닌이다.
본 발명의 조성물은 세포내 활성산소종(ROS)의 농도를 감소시키는 효과가 있다
그러므로, 본 발명은 다른 구체예로서 상기 단백질 고효율 세포도입 및 유지용 융합체(PTD-sMTS-MT)를 이용한 치료 유전자 또는 치료 약물 전달용 조성물 및 이의 이용 방법을 제공한다.
전달 대상이 되는 세포로서는, 가장 바람직하게는, 메탈로치오네인(MT) 및 단백질 형질 도입 영역(PTD)으로 구성된 항산화 융합단백질을 이용할 수 있는, 심근 세포, 췌장 세포, 신경 세포, 혈관내피 세포 등으로의 전달에 이용할 수 있다.
일 예로서, 상기 융합체 조성물, 이러한 융합체를 발현하는 발현벡터 또는 이로 형질전환된 미생물; 또는 이들을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병성 심근병증 예방 및 치료용 약학 조성물을 들 수 있다. 즉, 당지질 독성(glucolipotoxicity) 또는 고혈당 스트레스로부터 췌장 베타세포 및 심근세포를 더욱 효과적으로 보호하는데 유용하다.
본 발명에서의 상기 당뇨병은, 당뇨병 합병증과 당뇨병 (바람직하게는 인슐린 비의존성 제2형 당뇨병)을 직접 또는 간접적인 요인으로 발병하는 전신성 혹은 국소성의 질병을 포함하는데, 구체적으로, 당뇨병성 산성증(diabetic acidosis), 당뇨병성 황색종 (diabetic xanthoma), 당뇨병성 근육 위축(diabetic amyotrophy), 당뇨병성 케토시스(diabetic ketosis), 당뇨병성 혼수(diabetic coma), 당뇨병성 위장 장애(diabetic gastric disorder), 당병성 괴저(diabetic gangrene), 당뇨병성 궤양(diabetic ulcer), 당뇨병성 합병증, 당뇨병성 설사증(diabetic diarrhea), 당뇨병성 미세혈관병증(diabetic microangiopathy), 당뇨병성 자궁 체 경화증(diabetic uterine body sclerosis), 당뇨병성 심근 경색증(diabetic cardiomyopathy), 당뇨병성 신경병(diabetic neuropathy), 당뇨병성 신부전(diabetic nephropathy), 당뇨병성 물집(bullosis diabeticorum), 당뇨병성 백내장(diabetic cataract), 당뇨병성 피부 질병(diabetic dermopathy), 당뇨병성 경화부종(diabetic scleredema), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 당뇨병성 리포이드류 괴사증(necrobiosis lipoidica diabeticorum), 당뇨병성 혈액 순환 장애(diabetic blood circulation disorder) 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 미토콘드리아 표적 펩타이드에서 유래한 짧은 펩타이드인 sMTS는 메탈로치오네인(MT) 및 단백질 형질 도입 영역(PTD)으로 구성된 항산화 융합단백질의 세포내 도입율 및 유지율을 현저히 높이므로, 이들을 이용하여 치료 유전자 또는 치료 약물의 세포내로의 효과적인 전달이 가능하다.
도 1은 본 발명의 융합단백질 발현을 위한 벡터의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 융합단백질을 SDS-PAGE에 의해 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 융합단백질의 세포 독성을 확인한 결과이다.
도 4는 배양배지 세척단계 유무에 따른 Tat-GFP 및 Tat-sMTS-GFP의 형질도입 효율 비교 결과이다.
도 5는 배양배지 세척 후 Tat-GFP (TG) 및 Tat-sMTS-GFP (TMG)의 형질도입 효율 비교 결과이다.
도 6은 Tat-MT (TM) 및 Tat-sMTS-MT (TMM)의 세포내 지연시간(intracellular retention time) 비교 결과이다.
도 7은 H9c2 세포에서 (a) 과혈당(hyperglycemia,HG) (b)저산소(hypoxia,HP), (c) 과혈당 및 저산소 조건 하, Tat-MT (TM) 및 Tat-sMTS-MT (TMM) 의 세포 생존능 효과를 확인한 결과이다.
도 8은 H9c2 세포에서 (a) 과혈당(hyperglycemia,HG) (b)저산소(hypoxia,HP), (c) 과혈당 및 저산소 조건 하, 활성산소종(ROS)에 대한 영향을 나타낸다.
도 9는 STZ-유도된 당뇨병 마우스 모델에서 3 μM TMM의 주입에 따른 혈당 수준 변화를 나타낸 그래프이다.
도 10은 STZ-유도된 당뇨병 마우스에서 추출한 췌장에서의 3 μM TMM의 주입에 따른 활성산소종의 수준 변화를 확인한 결과이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.
"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.
"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.
"융합 또는 서열의 연결, 결합"은 융합된 구성요소를 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬을 말한다. 융합된 구성요소들은 직접적 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 다른 서열(즉, 링커 혹은 기능도메인)이 융합된 요소들 사이에 위치할 수 있다. 본 발명에서는 MVSAL의 아미노산으로 구성된 sMTS 펩타이드; 메탈로치오네인(MT); 및 단백질 형질 도입 영역(PTD)이 융합될 수 있다.
"발현"은 코딩 서열에 의해 코딩되는 생성물의 생물학적 생성을 지칭한다. 대부분의 경우에서, 코딩 서열을 비롯한 DNA 서열은 전사되어 전령 RNA (mRNA)를 형성한다. 전령 RNA는 번역되어 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 형성한다. 그러나 일부 경우에서는, RNA 생성물이 관련 활성을 가질 수 있으므로 유전자 생성물로서 간주될 것이다. 발현은 전사 RNA 생성물의 추가 처리 단계, 예컨대 인트론 제거를 위한 스플라이싱(splicing) 및/또는 폴리펩티드 생성물의 번역후 처리를 포함할 수 있다.
"코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은, 통상적인 염기쌍과 코돈 용법 관계에 따라, 발현이 요구되는 특정 유전자 생성물 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 서열, 이의 상보체, 또는 이들의 일부분을 지칭한다. 코딩 서열은 성숙 mRNA를 제공하기 위해 세포의 생화학 기구에 의해 함께 연결되는 게놈 DNA 또는 미성숙 1차 RNA 전사체에서의 엑손을 포함한다. 안티센스(antisense) 가닥은 상기 핵산의 상보체이고, 코딩 서열은 이들로부터 추정될 수 있다. 코딩 서열은, 적절한 길이의 전사체가 생성되고 적절한 리딩 프레임에서 번역되어 목적하는 기능 생성물이 생성되도록, 전사 조절 요소 및 번역 개시 및 종결 코돈과의 관계에 놓인다
"폴리뉴클레오티드(polynucleotide)" 또는 "핵산(nucleic acid)"이라는 용어는 리보뉴클레오티드 뿐만 아니라 디옥시리보뉴클레오티드 등 온갖 길이의 뉴클레오티드 중합체를 의미한다. 이 용어는 분자의 1차적 구조만을 의미하고, 따라서 이중 또는 단일 사슬의 DNA 또는 RNA를 의미한다. 이것은 또한 변형의 알려진 유형, 예를 들어 당해 분야에서 알려진 표지(label), 메틸화, "caps", 유사체의 하나 혹은 그 이상의 자연 발생의 뉴클레오티드 치환, 탈결합(예: methyl phosphonate, phosphotriester, phosphoamidate, carbarnate, 등)과 결합(예:phosphorothioate, phosphorodithioate, 등), 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드(signal peptide), poly-Llysine,등) 등의 부속물을 포함하는 것, 삽입물(예: 아크리딘, Psolalen, 등)을 가지는 것, 킬레이트(예: 금속원소, 방사성 금속원소, 붕소, 산화 금속원소, 등)을 가지는 것, 알킬화합물을 가지는 것, 변형된 결합(예: alpha anomeric 핵산, 등)을 가지는 것, 또한 폴리뉴클레오티드의 비변형을 포함한 뉴클레오티드간 변형을 의미한다. 일반적으로, 본 발명에 의해 제공되는 핵산 부분은 지놈(genome)의 파편과 짧은 올리고뉴클레오티드 결합자 또는 일련의 올리고뉴클레오티드, 미생물 또는 바이러스 오페론(operon)이나 진핵세포 유전자로부터 유도된 조절인자(regulatory element)를 포함하는 재조합 전사 단위로 발현될 수 있는 합성 핵산을 제공하는 특유의 뉴클레오티드들로 뭉쳐질 것이다
"기능적 등가물"이라는 용어는 예를 들어, 기준(reference) 서열로부터 하나 또는 그 이상의 치환, 결실 또는 부가, 기준(reference) 서열과 실험(subject) 서열 사이의 다양한 기능적 비유사성을 낳지 않는 실제 효과(net effect) 등 변화된 돌연변이 서열의 뉴클레오티드와 핵산서열 모두를 의미한다. 본 발명에 따른 실질적 등가물인, 예를 들어 돌연변이, 아미노산 서열은 나열된 아미노산 서열과 바람직하게는 최소한 80%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 최소한 90%의 서열 동일성을 갖는다. 실질적 등가물인 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 유전자 암호의 중복(redundancy) 또는 축퇴(degeneracy)를 고려할 때, 더 낮은 백분율의 서열 동일성을 가질 수 있다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 최소한 약 65%의 동일성, 보다 바람직하게는 최소한 약 75%의 동일성, 가장 바람직하게는 약 95%의 동일성을 가져야 한다. 본 발명의 목적을 위해서는, 실질적으로 등가적인 생물학적 활성과 실질적으로 등가적인 합성 특징을 가지는 서열들은 실질적 등가물로 취급된다.
"벡터(vector)"라는 용어는 다른 핵산을 그것이 연관된 곳으로 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. "발현벡터(expression vector)"라는 용어는 벡터에 의해 운반된 각각의 재조합 유전자에 의해 암호화된 융합체 단백질을 합성할 수 있는 플라스미드, 코스미드(cosmid) 또는 파지(phage)를 포함한다.
"형질도입(transduction)"이라는 용어는 감염과정에서 숙주세포의 유전자가 바이러스의 게놈(genome) 내로 삽입되었다가 바이러스의 또다른 감염주기 때 다른 숙주세포로 옮겨지는 것을 말한다. 일반적인 형질도입에서는 숙주세포의 어떠한 유전자도 이 과정에 의해 전달될 수 있지만, 특수한 형질도입에서는 단 몇 가지의 특정 유전자만이 형질도입된다. 형질도입은 새로운 세균의 균주를 만들거나 유전자 위치를 알기 위해서, 그밖의 수많은 유전실험에 유용한 미생물학적 기법으로서 이용된다.
"아미노산" 및 "아미노산 잔기"는 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 및 변형된 아미노산을 의미한다. 달리 언급되지 않는 한, 아미노산에 대한 모든 언급은, 일반적으로 또는 명칭에 따라 특이적으로, D 및 L 입체이성질체(구조가 이같은 입체이성질체 형태를 허용하는 경우) 양쪽 모두에 대한 언급을 포함한다. 천연 아미노산에는 알라닌 (Ala), 아르기닌 (Arg), 아스파라긴 (Asn), 아스파르트산 (Asp), 시스테인 (Cys), 글루타민 (Gln), 글루탐산 (Glu), 글리신 (Gly), 히스티딘 (His), 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 라이신 (Lys), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 트립토판 (Trp), 타이로신 (Tyr) 및 발린(Val)이 포함된다. 비천연 아미노산에는 N-말단 아미노기 또는 측쇄 기 상에서 화학적으로 변형된, 또는 가역적또는 비가역적으로 화학적으로 차단된 변형 아미노산 잔기, 예를 들어, N-메틸화 D 및 L 아미노산 또는 측쇄 관능기가 또다른 관능기로 화학적으로 변형된 잔기가 포함된다.
"질환(disorder)"이라는 용어는 본 발명의 유전자도입 동물 모델을 사용하여 동정되는 분자를 이용하여 치료하는 것으로부터 이익을 얻을 수 있는 어떤 상태이다. 이것은 포유류를 의문의 질환에 걸리기 쉽게 하는 병리학적 조건들을 포함한 만성과 급성 질환들 또는 질병들을 포함한다. 본 명세서에서 다루어질 질병들의 예들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 당뇨, 비만, 대사 증후군 증상 등이다.
"치료"는 임상 결과를 포함하여 이로운 또는 원하는 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 질환, 장애 또는 병태의 "치료" 또는 "완화"는, 장애를 치료하지 않는 것과 비교하여,병태, 장애 또는 질환 상태의 정도 및/또는 바람직하지 않은 임상 징후가 적어지고/적어지거나 경시적인 진행 추이가 느려지거나 길어지는 것을 의미한다.
"치료상 유효량"은 치료될 장애의 증상의 경감이 포함되는, 연구원, 수의사, 의사 또는 기타 임상의학자에 의해 추구되는 조직, 시스템, 대상 또는 인간에서의 생물학적 또는 의학적 응답을 도출할 조성물 내의 활성 화합물의 양을 의미한다.
"예방적 유효량"은 관련 장애, 병태 또는 질환 위험이 있는 대상에서 질환의 발병을 방지하기 위해, 연구원, 수의사, 의사 또는 기타 임상의학자에 의해 추구되는 조직, 시스템, 대상 또는 인간에서의 생물학적 또는 의학적 응답을 도출할 조성물 내의 활성 화합물의 양을 의미한다.
"유전자 치료(gene therapy)"는 돌연변이를 일으킨 유전자를 정정하여 유전병을 치료하거나, 유전자 혹은 RNAi를 이용하여 단백질 발현을 조절하여 질병을 치료하는 것을 말한다. 즉 환자의 세포에 외부에서 정상유전자를 이식하여 그 세포의 표현형을 변화시킴으로써 병을 치료하는 방법이다. 유전자 치료에는 체내에 유전자를 이입하는 유전자 벡터, 시스템의 연구가 필수적이다.
"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 세포내 생체물질 전달 시스템에 관한 것으로, 특히, 이 때 사용되는, MVSAL의 아미노산 서열을 함유하는 짧은 미토콘드리아 표적 펩타이드(sMTS)의 신규 용도에 관한 것이다.
바람직하게는, 당산화 및 당지질 스트레스로부터 췌장 베타세포 및 심근세포의 파괴를 보호할 수 있는 항산화 융합 단백질의 세포내 도입율 및 유지율을 현저하게 향상시키는, MVSAL의 아미노산 서열을 함유하는 sMTS의 기능에 관한 것이다.
구체적 태양으로, MVSAL의 아미노산으로 구성된 sMTS 펩타이드; 메탈로치오네인(MT); 및 단백질 형질 도입 영역(PTD)으로 구성된, 고효율 세포도입 및 유지용 융합체(PTD-sMTS-MT) 조성물, 이를 함유하는 재조합 발현 벡터 등의 재조합 폴리뉴클레오티드 구조물(총칭적으로 "발현 벡터"로 지칭), 상기 발현 벡터로 형질전환된 미생물, 이들 중 하나를 포함하는 당뇨성 질환 치료용 조성물의 태양으로 실시가능한, 상기 PTD-sMTS-MT 융합체의 세포내 도입 및 유지 시스템에 관한 것이다.
본 발명은, MVSAL의 아미노산으로 구성된 sMTS 펩타이드를, 메탈로치오네인(MT)-PTD 서열과 융합시키고, 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 표준 클로닝 기술 및 통상적인 방법을 이용하여 시험관 및 생체 내에서 상기 융합 단백질을 발현시킴으로써 구현할 수 있다.
MVSAL로 구성된 sMTS 펩타이드
본 발명은 일 관점에서, MVSAL의 아미노산으로 구성된 sMTS 펩타이드의 세포내 단백질 도입능 및 유지능을 향상시키는 신규 기능에 관한 것이다.
즉, 본 발명에서는 종래 알려진 sMTS의 단순히 미토콘드리아 내로의 타겟능을 이용하는 것이 아닌, 세포로의 도입능 및 유지능의 향상을 목적으로 한다.
세포로의 도입능 및 유지능을 현저히 증가시키기 위해, 미토콘드리아 표적 펩타이드에서 유래한 일부 특정 펩타이드 서열, 가장 바람직하게는 "메티오닌(M)-발린(V)-세린(S)-알라닌(A)-류신(L)"로 구성된 sMTS(short (Mitochondrial Targeting Sequence) 펩타이드를 사용하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 명세서에서는 상기 아미노산들의 약어인 "MVSAL"로 기재하도록 한다.
이 때, 상기 sMTS 서열 MVSAL은 미토콘드리아 단백질로부터 유래된 것이라면 본 발명에서 특별히 제한하지 않는다.
대표적으로, 미토콘드리아 타겟팅 서열은 말레이트 디하이드로게나아제, 인간 시토크롬 c 서브유닛 옥시다제 VIII, 인간 ATP 신타아제 서브유닛 c의 PI 아형, 알데히드 디하이드로게나제 타겟팅 서열, 인간 ATP 신타아제 서브유닛 FI 베타 및 BCS1 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 단백질로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는 말레이트 디하이드로게나아제로부터 유래될 수 있다.
PTD-sMTS-MT 조성물
앞서 설명한 바와 같이, 본 발명의 MVSAL 아미노산으로 구성된 sMTS 펩타이드는 목적하는 세포, 예를 들어, 심근 세포, 췌장 세포, 신경 세포, 혈관내피 세포 또는 피부 세포 등으로의 단백질 도입능 및 유지능을 현저히 증가시키는 기능이 있다.
바람직한 예로써, 탈로치오네인(MT) 및 단백질 형질 도입 영역(PTD)으로 구성된 항산화 융합 단백질이 MVSAL의 sMTS와 결합함으로써 목적하는 세포로의 도입능 및 유지능을 현저히 증가한다.
본 발명의 일 실시예에서 사용하였던 항산화 융합 단백질은 메탈로치오네인(metallothionein)의 아미노 말단에 단백질 형질 도입 영역(Protein Tranduction Domain)이 펩타이드 결합되어 있는데, 당산화 및 당지질 스트레스로부터 췌장 베타세포 및 심근세포의 파괴를 보호하는 기능을 포함한다.
상기 메탈로치오네인(metallothionein)은 인간으로부터 유래되는 것이라면 유형 I, II, III 및 IV, 이의 아형(isoform) 어떠한 것이라도 가능하다. 바람직하게는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시된 것을 사용할 수 있다.
서열번호 1 : Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ser Thr Gly Gly Ser Cys Thr Cys Thr Ser Ser Cys Ala Cys Lys Asn Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ser Lys Cys Ala Gln Gly Cys Val Cys Lys Gly Ala Ala Asp Lys Cys Thr Cys Cys Ala
서열번호 2 : Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Ala Gly Asp Ser Cys Thr Cys Ala Gly Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala Gln Gly Cys Ile Cys Lys Gly Ala Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys Ala
서열번호 3 : Met Asp Pro Glu Thr Cys Pro Cys Pro Ser Gly Gly Ser Cys Thr Cys Ala Asp Ser Cys Lys Cys Glu Gly Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser Cys Cys Ser Cys Cys Pro Ala Glu Cys Glu Lys Cys Ala Lys Asp Cys Val Cys Lys Gly Gly Glu Ala Ala Glu Ala Glu Ala Glu Lys Cys Ser Cys Cys Gln
서열번호 4 : Met Asp Pro Arg Glu Cys Val Cys Met Ser Gly Gly Ile Cys Met Cys Gly Asp Asn Cys Lys Cys Thr Thr Cys Asn Cys Lys Thr Cys Arg Lys Ser Cys Cys Pro Cys Cys Pro Pro Gly Cys Ala Lys Cys Ala Arg Gly Cys Ile Cys Lys Gly Gly Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys Pro
또한, 상기 단백질 형질 도입 영역(PTD)은 메탈로치오네인과 융합되어 세포 내로 투과시킬 수 있는 것으로, 이 분야에서 알려진 것이라면 제한 없이 사용가능하다.
일 예로, HIV-1 바이러스의 Tat 단백질, 폴리아르기닌(아르기닌 6개 이상), 페너트라틴(Penetratin), HSV-1 구조단백질 VP22의 전사조절단백질, Pep-1 펩타이드, 또는 Pep-2 펩타이드 등이 가능하다.
바람직하게는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 Tat(Trans Activator of Transcription) 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 폴리아르기닌을 사용할 수 있다.
서열번호 5 : Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
서열번호 6 : Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
이 때, 상기 구성 성분들을 화학적 또는 생물학적으로 융합시키는 방법들은 당 업계에서 널리 알려진 공지 기술이므로, 본 명세서에서 더욱 자세한 설명은 생략하기로 한다.
그러므로, 본 발명의 구체적 일 태양으로, MVSAL의 아미노산으로 구성된 sMTS 펩타이드; 메탈로치오네인(MT); 및 단백질 형질 도입 영역(PTD)으로 구성된, 고효율 세포도입 및 유지용 융합체(PTD-sMTS-MT) 조성물을 제공할 수 있다. 바람직하게는 단백질 형질 도입 영역(PTD)과 메탈로치오네인(MT) 단백질 사이에 sMTS 펩타이드가 위치하는 구성을 가진다.
상기 융합체 조성물은 단백질 형질 도입 영역 아미노 말단에 폴리히스티딘(poly-His) 영역이 결합될 수 있다.
상기 폴리히스티딘(poly-His) 영역은 표지 펩타이드 중 하나로, 히스티딘 결합 수지와 결합하여 본 발명의 융합 단백질을 분리 및 정제하는 데 사용할 수 있다. 바람직하기로 폴리히스티딘 영역으로 헥사히스티딘을 사용한다.
이 때, 메탈로치오네인 단백질을 코딩하는 cDNA의 5' 말단에 단백질 형질 도입 영역을 코딩하는 cDNA가 결합되어 있고, 본 발명의 항산화 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
이러한 폴리뉴클레오티드는 메탈로치오네인, 단백질 형질 도입 영역, 미토콘드리아 타겟팅 서열을 코딩하는 공지의 핵산 서열로부터 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명은 또한, 다른 구체적인 태양으로써, 고효율 세포도입 및 유지용 융합체(PTD-sMTS-MT)를 발현하는 발현벡터를 제공한다.
상기 벡터는 클로닝 벡터로 사용가능한 것이라면 본 발명에서 특별히 한정하지는 않는다. 일예로, pRSET, pET3, pET11, pBAD, pThioHis, pTrcHis 등이 가능하다. 상기 벡터로 폴리히스티딘(poly-His) 영역을 코딩하는 DNA가 삽입되어 있는 벡터를 사용할 수 있다.
이러한 벡터는 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 적절한 제한효소로 절단한 클로닝 벡터에 공지된 통상의 방법으로 삽입하여 제조할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 미생물을 제공할 수 있다.
상기 미생물은 상기 융합 단백질이 효과적으로 발현될 수 있는 것이라면 어떠한 것이라도 가능하다. 대표적으로, E. Coli, 피키아 속(Pichia genus) 균주 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 융합체 조성물은, 예를 들어 다음과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다:
(a) 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 1종의 아미노산 서열로 표시되는 메탈로치오네인, MVSAL의 아미노산으로 구성된 sMTS, 및 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 단백질 형질 도입 영역(PTD)이 결합되어 있고, 본 발명의 융합체를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터로 미생물을 형질전환하는 단계;
(b) 상기 형질전환된 미생물을 배양하여 항산화 융합체를 발현하는 단계; 및
(c) 발현된 항산화 융합체를 정제하는 단계.
상기 방법에 있어서, 상기 형질전환 단계는 발현 벡터를 숙주 세포 내로 운반시켜 실시될 수 있다. 상기 형질전환 방법은 숙주 세포가 원핵세포인 경우, CaCl2 방법, Hanahan 방법 및 전기 천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 및 유전자 봄바드먼트 등에 의해 발현 벡터를 숙주 세포인 미생물 내로 주입 할 수 있다. 미생물 내로 주입된 발현 벡터는 미생물 내에서 발현되어 목적의 융합 단백질을 얻게 된다.
발현된 융합 단백질은 변성상태 또는 자연 상태에서, 당 업계에 공지된 일반적인 정제방법을 통해 정제될 수 있다. 정제방법은, 예컨대, 암모늄 설페이트에 의한 분획화 (fractionation), 크기 구별 여과 (한외여과) 및 금속 킬레이팅 친화 크로마토그래피를 포함한다.
약학적 조성물
본 발명은 MVSAL의 아미노산으로 구성된 sMTS를 함유하는 단백질의 고효율 세포도입 및 유지용 융합체 조성물의 용도를 제공한다.
바람직한 예로써, MVSAL의 sMTS; 메탈로치오네인(MT); 및 단백질 형질 도입 영역(PTD)으로 구성된 조성물의 당뇨병 또는 당뇨병성 심근병증의 예방 또는 치료적 용도를 제공한다. 즉, 당뇨병 또는 당뇨병성 심근병증의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물 또는 이를 이용한 치료방법을 제공한다.
본 발명에서의 상기 당뇨병은, 당뇨병 합병증과 당뇨병 (바람직하게는 인슐린 비의존성 제2형 당뇨병)을 직접 또는 간접적인 요인으로 발병하는 전신성 혹은 국소성의 질병을 포함하는데, 구체적으로, 당뇨병성 산성증(diabetic acidosis), 당뇨병성 황색종 (diabetic xanthoma), 당뇨병성 근육 위축(diabetic amyotrophy), 당뇨병성 케토시스(diabetic ketosis), 당뇨병성 혼수(diabetic coma), 당뇨병성 위장 장애(diabetic gastric disorder), 당병성 괴저(diabetic gangrene), 당뇨병성 궤양(diabetic ulcer), 당뇨병성 합병증, 당뇨병성 설사증(diabetic diarrhea), 당뇨병성 미세혈관병증(diabetic microangiopathy), 당뇨병성 자궁 체 경화증(diabetic uterine body sclerosis), 당뇨병성 심근 경색증(diabetic cardiomyopathy), 당뇨병성 신경병(diabetic neuropathy), 당뇨병성 신부전(diabetic nephropathy), 당뇨병성 물집(bullosis diabeticorum), 당뇨병성 백내장(diabetic cataract), 당뇨병성 피부 질병(diabetic dermopathy), 당뇨병성 경화부종(diabetic scleredema), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 당뇨병성 리포이드류 괴사증(necrobiosis lipoidica diabeticorum), 당뇨병성 혈액 순환 장애(diabetic blood circulation disorder) 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 메탈로치오네인(MT); 및 단백질 형질 도입 영역(PTD)으로 구성된 항산화 융합 단백질은 MVSAL의 sMTS에 의해 세포 내로 매우 효율적으로 도입되고 유지되어 메탈로치오네인의 항산화 활성 및 항-아포토시스 효과를 발휘함으로써, 고혈당 또는 당지질 독성으로부터 췌장 베타세포와 심근세포를 보호한다. 특히, 세포내 활성산소종(ROS)의 농도를 감소시킴으로써 이러한 효과를 발휘한다.
한편, 본 발명의 약학적 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명에 의한 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하고 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용할 수 있으며, 제제화 할 경우에는 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제는 본 발명에 따른 융합 단백질에 적어도 하나의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 혼합하여 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등의 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제에는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 포함되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 상기 비수성용제 또는 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있으며, 상기 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여용량은 체중 1kg 당 0.01 내지 1000 mg 의 양을 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 이때 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 조절될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
재료
pRSET 벡터를 Invitrogen (La Jolla, CA)사로부터 구입하였다. 모든 제한 효소 및 PCR 클로닝 키트를 Takara (Tokyo, Japan)로부터 구하였다. IMAC(immobilized Ni-affinity chromatography column)를 Bio-Rad (Hercules, CA)로부터 구입하였고, NaAsO2(Sodium arsenite) 및 글루코오스를 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. H2DCFDA(2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 Invitrogen (Carlsbad, CA)으로부터 구입하였다.
통계학적 분석
모든 데이터들을 평균± standard deviation (n = 4)로 나타내었다. 통계학적 분적을 Student’s t-test를 이용하여 수행하였다. P-values < 0.05 및 < 0.01 는 통계학적으로 유의미한 것으로 간주하였다.
실시예 1: TM 및 TMM 재조합 융합 단백질의 제작
MT, TM 및 TMM 융합 단백질을 클론화하고, 발현시키고 정제하였다.
1-1 클로닝
Tat-MT 융합 단백질을 발현하는 플라스미드 벡터를, E.coli.에서의 고수준 단백질 발현 및 정제를 위해 고안한 pRSET 벡터를 이용하여 제작하였다. Tat-MT 융합 구조체를 선행기술을 참조하여 제작하였다[K. Lim, Y. Won, Y. Park, Y. Kim, Preparation and functional analysis of recombinant protein transduction domain-metallothionein fusion proteins, Biochimie, 92 (2010) 964-970]
Tat 올리고뉴클레오티드 및 MT cDNA를 pRSET 박테리아 발현 벡터(Invitrogen, La Jolla, CA)에 삽입하여 Tat-MT 융합 단백질 발현 벡터를 제작하였다. Tat (TAG GGC AGG AAG AAG CGG AGA CAG CGA CGA CGA)를 어닐링하고 pRSET 벡터 내로 클론화하여 pRSET-Tat 벡터를 생성하였다. MT 코딩 서열을 PCR로 증폭하고 pRSET-Tat 벡터내로 클론화한 후, sMTS를 연속적으로 어닐링하여 sMTS(short malate dehydrogenase) (ATG GTG TCC GCT CTC, Met-Val-Ser-Ala-Leu 아미노상 서열에 상응)를 함유하는 발현 벡터를 제작하였다. 정제된 sMTS 프래그먼트를 Xho I 위치에서 Tat-MT 발현 벡터 내로 클론화하였다. Tat-sMTS-MT 구조물을 DNA 서열 분석(Cosmogene Tech, Seoul, Korea)에 의해 확인하였다.
유사한 방법으로, Tat-GFP 및 Tat-sMTS-GFP DNA 서열을 pRSET-A 벡터 내로 클론화하고 Tat 및 Tat-sMTS 융합 단백질의 지연시간(retention time) 및 형질도입 효율(transduction efficiency)을 측정하였다. Tat-GFP (TG) 및 Tat-sMTS-GFP (TMG)의 뉴클레오티드 서열을 DNA 서열 분석 (Consmogenetech, Seoul, Korea)에 의해 확인하였다. 제작한 발현 벡터의 구조 모식도를 도 1에 도시하였다.
1-2 융합단백질의 발현 및 정제
MT, Tat-MT (TM), 및 Tat-sMTS-MT (TMM)를 선행기술을 참조하여 제작하였다.
간략히 설명하면, 모든 융합 단백질 발현 벡터들을 Escherichia coli 균주 BL21 (DE) pLysS (Novagen, Madison, WI) 내로 형질도입하고 LB 배지 (Becton Dickinson and company, MD)에서 37 ℃ 하 4시간 동안 배양하였다.
발현 유도자, IPTG(isopropyl beta-D-thiogalactoside) (1 mM), 및 ZnSO4 (1 mM)를 첨가하여 각 단백질의 발현 및 안정화를 유도하였다. 세포 펠렛들을 원심분리에 의해 수집하고 용해 버퍼(300 mM KCl, 49 mM KH2PO4, 4.9 mM Imidazole)에 현탁하였다. 현탁된 펠렛들을 초음파 처리하고 0.45-um 필터로 여과하였다. 그 후, 상기 단백질들을 Ni-NTA 수지 컬럼을 이용하여 FPLC (Bio-Rad, Hercules, CA)로 IMAC(immobilized metal affinity chromatography)에 의해 정제하였다. 마지막으로, 3,500 MWCO(Molecular weight cut off) 멤브레인 (Spectrum Laboratories, CA)을 이용하여 pH 7.4 PBS(phosphate buffered saline)에 대해 단백질 용액을 투석하였다.
Tat-GFP (TG) 및 Tat-sMTS-GFP (TMG)을 유사한 방법으로 준비하였다. 상기발현된 Tat-GFP 및 Tat-sMTS-GFP 융합 단백질을 IMAC을 이용하여 정제하고 12,000 - 14,000 MWCO 멤브레인을 이용하여 pH 7.4 PBS에 대해 투석하였다. 모든 융합 단백질을 12% SDS-PAGE 겔 상에서 전기영동을 수행하고 MT 검출을 위해 쿠마신 브릴리언트 블루(Bio-Rad, Hercules, CA)로 60 분 동안 염색하였다.
1-3 TM 및 TMM 재조합 융합 단백질의 제작 및 세포독성
그 결과를 , 도 2 및 도 3에 나타내었다.
모든 재조합 단백질을 zinc의 존재 하 제작하였는데, 안정화된 폴딩 및 MT의 활성을 요구하였다. 그리고 결과적으로 SDS-PAGE 상에서 싱글 밴드를 수득하였다. TM 및 TMM에 상응하는 융합 단백질 밴드가 각각 12.6 kDa 및 13.2 kDa의 예측되는 크기 근처에서 가시화되었다(도 2).
H9c2 세포들에 1 ~ 10 μM의 범위의 농도에서 MT, TM, 및 TMM로 처리한 결과, 10 μM까지 유의미한 세포 독성은 관찰되지 않았다(도 3). 이후 실험을 3 μM에서 수행하였다.
실시예 2 : 형질도입
2-1. 세포 배양
심장 유래 마우스 H9c2 심근세포(cardiomyocytes)(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea) 를, 100 U/ml 페니실린 및 100 mg/ml 스트렙토마이신 보충된10% FBS(fetal bovine serum) 함유된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지에서 습한 조건(5% CO2 atmosphere) 및 37 ℃ 하 배양하였다
2-2. TG 및 TMG의 형질도입 효율 및 세포 지연 시간(cell retention time)
H9c2 세포들을 웰 당 2×105 세포의 밀도로 6-웰 플레이트 상에 씨딩하였다. 세포들을 TG 및 TMG로 1 및 3 μM에서 10 min ~ 60 min 동안 처리한 후, 상기 세포들에 트립신 처리하고 pH 7.4 PBS로 2회 세척하였다. 세포들을 FBS와 함께 FACS 버퍼 함유의 고정 버퍼로 고정하였다
형질도입 효율을 FACSCalibur (BD Biosciences, San Diego, CA,)를 이용하여 측정하고, 데이터 분석을 CellQuest software (BD PharMingen, San Jose, CA)로 수행하였다. 세포에서 sMTS에 의해 GFP의 강화된 지연 시간을 측정하기 위해, TG 및 TMG를 H9c2로 1 h동안 배양하고, 신선한 배지로 교체한 후 세포들을 2시간 후 고정하였다. TG 및 TMG의 지연 시간을 FACS을 이용하여 측정하였다.
2-3. TG 및 TMG의 세포내 정체 이미지(retention image)
H9c2 세포들을 1×104 cells/dish 밀도로 60-mm 디쉬상에 씨딩하였다. 하루동안 세포들을 배양하고 융합 단백질 형질도입을 수행하였다.
세포들을 TG 및 TMG를 3 μM로 1 h 동안 처리한 후, 배지를 신선한 것으로 하였다. 상기 세포들을 2시간 후 PBS로 3회 세척하고 4% 포름알데히드 용액으로 49분 동안 고정하였다. 고정 후, 세포들을 PBS로 2회 세척하고 핵 염색을 위해 DAPI-fluoromount G(SouthernBiotech, Birmingham, AL)로 슬라이드 글래스 상에 마운팅하였다. 다중 양성자 공초점 레이저 스캐닝 현미경(multi-photon confocal laser scanning microscopy)(LSM780 META NLO; Carl Zeiss Jena, Germany; Korea Basic Science Institute, Chuncheon Center, Chuncheon-city, Korea)를 이용하여 세포내 TG 및 TMG를 가시화하였다. 고정화없이 H9c2 세포에서 TG 및 TMG의 검출하기 위해, H9c2 세포들을 TG 및 TMG 3 μM로 1 h 동안 처리하고 배지를 세척하였다. 배지 교체 후 상기 세포들을 PBS로 2회 세척하고 Pentahydrate (bis-Benzimise) (Molecular Probes, Carlsbad, CA)에 의해 15 min 동안 핵을 염색하였다.
세포내 TG 및 TMG를 다중 양성자 공초점 레이저 스캐닝 현미경(LSM510 META NLO; Carl Zeiss Jena, Germnay, Korea Basic Science Institute, Chuncehon Center, Chuncheon, Korea)을 이용하여 검출하였다.
2-4. 형질 도입 효율에서 Tat 및 Tat-sMTS 의 영향
형질 도입 효율에서 Tat 및 Tat-sMTS의 활성을 비교하기 위해, 동일 플라스미드 벡터에서 MT를 GFP로 대체하고, 형질도입 효율을 FACS에 의해 측정하였다.
그 결과, 표 1에 기재하고 있는 바와 같이, Tat 또는 Tat-sMTS의 도움없이 GFP 단독으로는 음성적 형질도입 결과를 나타낸 반면, Tat-GFP (TG) 및 Tat-sMTS-GFP (TMG)의 형질도입 효율은 용량- 및 배양시간 의존적 방법에서 현저히 증가하였다. TG의 형질도입 효율은 1 μM 에서 10 min ~ 1 h 배양시간에 걸쳐 8.78 ± 12.28% ~ 73.4± 9.54%이었고, 3 μM에서 배양 1시간 후 92.90 ± 7.18% 에 도달하였다
sMTS의 첨가는 더더욱 형질도입 효율을 증가시켰고 형질도입 시간을 단축시켜 1 μM에서 30분 배양 후 91.92 ± 8.17%에 도달하였고, 20분 이내에 3 μM에서 92.91 ± 4.51%에 각각 도달하였다(표 1).
표 1
Figure PCTKR2013006260-appb-I000001
이처럼, mMDH(mitochondrial malate dehydrogenase) 신호 서열로부터 유래한 sMTS 펩타이드는 단백질 형질도입 능력을 강화시켰다. 융합 단백질에 sMTS의 부가는 GFP 형질도입능을 현저히 향상시키고 형질도입 시간을 단축시키기 때문에, 본 발명자들은 sMTS 펩타이드가 세포 내에서 융합 단백질의 정체 시간을 증가시킬 수 있음을 예상하고 확인하고자 하였다.
H9c2 세포에 GFP, TG, 및 TMG를 1 h동안 처리하고, 배지를 신선한 것으로 교체한 후, 세포들을 2 h 후 고정 버퍼를 이용하여 고정시키고 형질도입 효율을 세척 단계 3을 거치지 않은 세포들과 비교한 결과를 도 4 및 도 5에 도시하였다.
1 및 3μM에서 GFP는 세포로의 형질도입능을 나타내지 않았다. TG의 형질도입능이 92.9 ± 7.18% 에서 40.08 ± 3.94%까지 현저히 감소하는 동안, TMG at 3 μM에서 TMG의 명백한 감소는 나타나지 않았다. 그러나 세포들을 TG 및 TMG로 세척 단계 없이 3 h 동안 처리하면, TG 및 TMG의 형질도입 효율은 둘 다 각각 94.89 ± 5.87% 및 98.08 ± 0.63%를 유지하였다(도 4).
그리고, CLSM을 보여주는 도 5에서 나타나는 바와 같이, TMG의 형광 강도가 배양 배지 교체 후에도 세포에서 유지되었고, TG의 경우는 현저히 감소하였다. 이는 sMTS-매개 세포 정체능이 강화되었음을 시사한다.
고정화없는 살아있는 세포 이미지는 TG 및 TMG 사이의 차이가 고정화 공정의 차이 때문이 아님을 보여주는, 동일한 결과를 나타내었다. sMTS에 의한 미토콘드리아 위치화의 능력은 CLSM에 의해 확인되었지만, sMTS 또한 미토콘드리아에 위치화하는데 충분하지는 않았다(데이터 도시 않음)
이러한 결과들은 Tat 이용 단백질에 sMTS 펩티드의 부가가, 형질도입 시간을 단축시키고 세포 내 정체 시간을 증가시킴으로써 형질도입 효율을 증가시킴을 보여준다.
실시예 3 : MT 융합 단백질의 세포 트래피킹(Cellular trafficking)
3-1. Tat-MT 및 Tat-sMTS-MT의 세포 트래피킹
H9c2 세포들을 2그룹으로 6-웰 플레이트에서 글래스 커버 상에 씨딩하고 1+2 h 및 3 h 배양 프로토콜을 수행하였다. 3 μM 에서 MT, Tat-MT (TM) 및 Tat-sMTS-MT (TMM)를 H9c2 세포에 각각 1+2 h 및 3 h 동안 처리하였다. 그리고, 샘플들을 면역조직화학 분석을 위해 준비하고 아래 프로토콜을 수행하였다.
세포들을 PBS로 세척하고 10% FBS를 함유하는 완전 배지에서 MitoTracker Orange (Molecular Probes Eugene, OR) 300 nM로 20 min 동안 염색하였다. 전체 세포들을 아이스에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 0.1 % Triton X-100로 투과시킨 후, TBS(Tris-buffered saline)에서 1시간 동안 상온에서 5% BSA로 커버한 다음 래빗 폴리 클로날 6x-his antibody (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA; 1:500)로 처리하였다.
세포들을 세척하고 Alexa Fluor 488 (1:1000, Molecular Probes, Eugene, OR)로 컨쥬게이트된 적합한 2차 항체로 1시간 동안 상온에서 프로브화하였다. PBS에서 5 min동안 상온에서 Hoechst (2 μg/ml, Molecular Probes, Eugene, OR)로 핵을 염색하였다. 상기 슬라이드를 PBS로 2회 세척하고 DAKO 형광 마운팅 배지(DAKO corporation, Carpinteria, CA)를 이용하여 마운팅하였다. 표본들을 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Carl Zeiss, Germany) 을 이용하여 Hoechst, 6x-His, 및 Mitotracker에 대하여 405 nm, 488 nm 및 555 nm에서 각각 측정하였다.
3-2. 결과
본 발명자들은 비록 sMTS가 GFP 의 세포 유입도(cellular uptake) 및 정체 시간을 향상시킴을 보여주지만, GFP의 블리칭(bleaching)이 이러한 결과에 영향을 미칠 것이라고 예상하고, Tat-sMTS-MT (TMM) 및 Tat-MT (TM)의 세포내 트래피킹을 Alexa Fluor 488-컨쥬게이트된 항체로 CLSM을 이용하여 조사한 결과를 도 6에 도시하였다.
도 6에서 보여주는 것처럼, 1+2 h 세척 단계 후 TMM은 세포 내에 유지되었고 배양 배지 교체 후에도 시토졸에서 강한 형광 강도를 나타내었다. 그러나, Tat-MT (TM)은 TMM과 비교하여 덜 효율적인 정체 활성을 나타내는, 현저히 감소된 강도를 보여주었다.
비록 히스티딘에 대한 일차 항체가 핵 내의 히스티딘 및 이의 태그된 MT 융합 단백질 모두를 인식하였지만, MT 및 PBS 처리된 그룹들은 핵 내의 형광 강도를 보여주었다. 또한, sMTS 서열이 미토콘드리아타겟팅 서열 유래이지만 미토콘드리아 내로 융합단백질을 위치화시킬 수 있지는 않다는 결과도 매우 흥미로운 사실이었다. 이러한 결과들은 sMTS 펩타이드의 융합은 융합단백질의 세포내 정체 시간의 강화를 촉진시킴을 시사한다.
실시예 4: 과혈당- 및 저산소-유도된 세포사멸에 대한 보호적 효과
4-1. 과혈당증 및 저산소증 유도
H9c2 세포에서 과혈당-유도된 세포사멸을 감소시키기 위한 융합 단백질의 능력을 알아보기 위해, 세포들을 350 mM 글루코오스 (Sigma, St. Louis, MO) 용액에서 24 h 동안 배양함으로써 과혈당 조건에 노출하였다. 과혈당-노출된 세포들을 또한 저산소 조건하(1% O2 and 5% CO2)에서 24 h시간 동안 배양하였다. 이러한 조건에 노출된 H9c2 세포에서의 세포 생존능을 Cell Counting Kit-8 (CCK-8,Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)에 의해 측정하였다.
4-2. H9c2 세포에서 과혈당- 및 저산소-유도된 세포사멸에 대한 MT 재조합 융합 단백질의 보호적 효과
과혈당 및 저산소 상태는　ROS의 생성 및 산화적 스트레스를 증가시킴으로써 타입 1 및 2 당뇨병을 야기시키는데 밀접한　관련이 있음이 알려져 있다. 따라서, 과혈당에 대한 MT 단백질의 보호적 효과를 알아보기 위해, 세포들을 350 mM 글루코오스 용액에서 24시간 동안 배양함으로써 과혈당에 노출시켰다.
그 결과를 도 7에 도시하였다.
H9c2 세포 생존능이 과혈당 조건 하에서 43.9 ± 1.9%까지 감소하였다 (도 7a). 세포들을 단백질과 함께 과혈당에 노출시키면, 상기 세포 생존능이 TM의 경우 56.4 ± 2.5%까지 증가하고 TMM의 경우 65.0 ± 2.9%까지 증가하였다. TM 및 TMM 융합 단백질은 저산소 스트레스에 대해서도 보호적 효과를 나타내었다(도 7b). 그리고, 도 7c에서 보여주는 바와 같이, 이들은 저산소 조건 및 과혈당 조건에서 세포 생존능을 TM의 경우 48.7 ± 10.4%에서 63.3 ± 6.9%까지, TMM의 경우 73.1 ± 3.2%까지 나타내었다. 과혈당- 및 저산소 유도된 세포사멸에 대해서 MT는, 낮은 형질도입 효율 때문에 세포 생존능의 증가에서 덜 효율적이었다
실시예 5 : MT 재조합 융합 단백질의 항산화 효과
5-1. H2DCFDA 를 이용한 ROS(Reactive oxygen species) 형광 분석
MT 융합 단백질의 항산화 효과를 확인하기 위해, NaAsO2(Sodium arsenite)를 사용하여 세포내 ROS를 증가시켰다.
H9c2 세포들을 24시간 동안 10 μM NaAsO2에 노출시켰다. 세포들로부터 배지를 제거한 후, H9c2 세포들을 PBS로 2회 세척하였다. 세포-투과성 H2DCFDA 프로브(10 μM)를 플레이트의 각 웰에 첨가하고 30분 동안 37 ℃ 하 배양하였다. UV/Vis fluorescence spectrophotometer (SpectraMax M2e; Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 499 nm 여기 및 522 nm 방출 파장에서 형광 강도를 측정하였다. 과혈당 및 과혈당/저산소에 노출된 H9c2 세포에서 ROS 수준 또한 동일한 방법에 의해 측정하였다.
5-2. H9c2 세포에서 MT 재조합 융합 단백질의 항산화 효과
MT 융합 단백질의 항산화 효과를, 화학적인 ROS 유도자(NaAsO2), 과혈당, 저산소, 과혈당+저산소에 노출시킨 H9c2세포에서 활성 산소종(ROS)의 수준을 측정함으로써 관찰하였다.
그 결과를 도 8에 나타내었다.
단백질 없이 산화적 스트레스-유도된 조건에 노출시킨 세포에서의 ROS 수준은 9.3 ± 7.3%까지 증가하였다 (도 8-a). 상기 ROS 강도는 TM의 경우 5.1 ± 4.8%까지 감소하였고, TMM의 경우 0.6 ± 1.5%까지 감소하였다. H9c2 세포를 24시간 동안 저산소 조건에 노출시킨 후, ROS 강도는 대조군에 비해 10 ± 1%까지 증가하였다(도 8-b). TMM-처리된 세포들은 24시간 후 ROS 정도가 현저히 감소함을 보였다. TM 및 TMM 또한, 과혈당 및 저산소 조합 조건 하 미처리된 그룹의 10.3 ± 1.5%로부터 각각 7.9 ± 1.4% 및 4.5 ± 1.9%까지 ROS 강도가 감소하였다(도 8-c). 과혈당 및 저산소 조합은 ROS 증가에 대한 시너지 효과를 나타내지는 않았다. 그 차이는 크지 않았지만, TMM이 세포에서 명백히 ROS 수준을 감소시켰다.
NaAsO2 는 화학적 ROS 유도자로 알려져 있고 산화적 스트레스-관련 연구에 널리 사용되고 있는데, H9c2 세포에 10 μM NaAsO2로 24 h동안 처리한 후 공동 투여된 TMM은 ROS 강도를 9.7 ± 2.3%까지 감소시켰다. 반면, MT는 ROS 수준에서 통계학적으로 유의미한 감소를 유도하지는 않았다 (도 8-d).
실시예 6 : 당뇨병 마우스 모델에서의 보호적 효과
6-1. 스트렙토조토신(STZ)-유도된 당뇨병 마우스 모델
STZ를 50 mM 시트레이트 버퍼(pH4.5)에 용해하고 복강내(IP, intraperitoneal) 주입하였다. STZ를 18~21g의 5주령 balb/c 마우스에 80 mg/kg 용량으로 주입하여 당뇨를 유발하였다. 당뇨병은 베타 세포 파괴에 의해 3일 이내에 STZ에 의해 유발되었다. 5일 동안 매일 STZ의 주입 전 후에 TM 및 TMM 3 μM (48 μl)를 각 그룹에서 4마리의 마우스에 투여하였다. 혈당을 retro-orbital blood collection을 이용하여 모니터링하고 자동화된 글루코스 분석기(Roche, Basel, Switzerland)를 이용하여 측정하였다. 당뇨병 마우스에서 혈당 수준은 300 mg/dl 이상이었다.
6-2. 당뇨병 마우스 췌장으로부터 Ex vivo ROS 측정
췌장에서의 ROS 수준의 검출을 위해, TMM를 STZ-유도된 당뇨병마우스 내로 주입하고 H2DCFDA 또한 STZ-유도된 당뇨병마우스 모델 복강 내로 주입하였다.
1시간 후 췌장을 마우스로부터 추출하였다. Kodak Image Station (Kodak Image Station 4000MM, Eastman Kodak Company, Scientific Imaging Systems; New Haven, CT)을 이용하여 ROS 강도를 즉시 측정하였다.
6-3. 스트렙토조토신(STZ)-유도된 당뇨병 마우스 모델에서의 MT 재조합 융합 단백질의 보호적 효과
상기 설명한 바와 같은 방법으로 STZ을 복강내 80 mg/kg의 용량으로 주입하여 당뇨병을 유발시킴으로써, STZ-유도된 당뇨병 동물 모델을 제작하였다. 주입 후 3일이 지나자 혈당 수준이 300 mg/dl 이상으로 도달하였다. 혈당 수준을 낮추기 위한 MT 융합 단백질의 효과적인 투여 타이밍을 결정하기 위해, TMM을 STZ 투여 전 후에 3 μM에서 복강내로 주입하였다
그 결과, 도 9-a에 나타난 바와 같이, STZ 투여 전 상기 단백질 처리는, 정상적 글루코오스 수준을 유지하는데 효과적이었다.
또한, MT 융합 단백질-처리된 마우스의 혈당 수준(Blood glucose levels, BGL)을, 매일 단백질 투여에 의해 BGL이 300 mg/dl을 초과할 때까지 기간을 연장하여 모니터링하였다.
도 9-b에 나타난 바와 같이, MT- 및 TM-처리된 그룹은 각각 5일 및 7일 후 300 mg/dl에 도달하였지만, TMM-처리된 그룹은 9일동안 200 mg/dl 이하 또는 근처로 BGL을 유지하였다
그리고, TMM의 긍정적 효과는 STZ-유도된 당뇨병 마우스로부터 추출한 췌장에서 또한 관찰되었다.
ROS의 수준은 STZ 투여 후 미처리된 마우스의 췌장에서는 높았지만, Tat-sMTS-MT 처리군은 감소된 ROS 강도를 나타냈다 (도 10-a). 췌장에서의 ROS의 ROI 값은 대조군과 비교하여 145 ± 10% (n=3)까지 증가하였다 (도 10-b). TMM 처리는 94 ± 5%까지 ROS 강도를 현저히 감소시켰다.
이러한 결과들을 통해, 본 발명의 sMTS의 도입은 융합단백질의 세포내 유입을 향상시키고, 세포내 지속 효과를 높여주는 기능을 발휘함을 알 수 있었다. 그러므로, sMTS의 이러한 기능에 의하여 융합단백질, 유전자 전달체 및 나노입자 같은 약물 전달 시스템에의 응용이 가능하며, 이를 통해 치료 효능을 높일 수 있음을 시사한다.

Claims (15)

  1. MVSAL의 아미노산으로 구성된 짧은 미토콘드리아 표적 펩타이드(sMTS)를 함유하는, 단백질의 고효율 세포도입 및 유지용 융합체 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 메탈로치오네인(metallothionein) 및 단백질 형질 도입 영역(Protein Tranduction Domain)으로 구성된 항산화 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 메탈로치오네인은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 1종의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 단백질 형질 도입 영역은 HIV-1 바이러스의 Tat(Trans Activator of Transcription) 단백질, 폴리-아르기닌, 페너트라틴(Penetratin), HSV-1 구조단백질 VP22의 전사조절단백질, Pep-1 펩타이드, 및 Pep-2 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, MVSAL의 아미노산으로 구성된 sMTS는
    말레이트 디하이드로게나아제, 인간 시토크롬 c 서브유닛 옥시다제 VIII, 인간 ATP 신타아제 서브유닛 c의 PI 아형, 알데히드 디하이드로게나제 타겟팅 서열, 인간 ATP 신타아제 서브유닛 FI 베타 및 BCS1 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 단백질로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. MVSAL의 아미노산으로 구성된 sMTS; 메탈로치오네인(MT); 및 단백질 형질 도입 영역(PTD)으로 구성된, 고효율 세포도입 및 유지용 융합체 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 메탈로치오네인은 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 1종의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 단백질 형질 도입 영역은 HIV-1 바이러스의 Tat(Trans Activator of Transcription) 단백질, 폴리아르기닌, 페너트라틴(Penetratin), HSV-1 구조단백질 VP22의 전사조절단백질, Pep-1 펩타이드, 및 Pep-2 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 단백질 형질 도입 영역은 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 Tat 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 폴리아르기닌인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제6항에 있어서, MVSAL의 아미노산으로 구성된 sMTS는 말레이트 디하이드로게나아제, 인간 시토크롬 c 서브유닛 옥시다제 VIII, 인간 ATP 신타아제 서브유닛 c의 PI 아형, 알데히드 디하이드로게나제 타겟팅 서열, 인간 ATP 신타아제 서브유닛 FI 베타 및 BCS1 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 단백질로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제6항에 있어서, 상기 세포는 심근 세포, 췌장 세포, 신경 세포, 혈관내피 세포 및 피부 세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 세포내 활성산소종의 농도를 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제6항의 융합체를 발현하는 벡터 또는 이로 형질전환된 미생물.
  14. 제6항의 융합체 조성물, 제13항의 벡터 또는 미생물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 당뇨병 합병증 예방 및 치료용 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 당뇨병 합병증은
    당뇨병성 산성증(diabetic acidosis), 당뇨병성 황색종(diabetic xanthoma),당뇨병성 근육 위축(diabetic amyotrophy), 당뇨병성 케토시스(diabetic ketosis), 당뇨병성 혼수(diabetic coma), 당뇨병성 위장 장애(diabetic gastric disorder), 당병성 괴저(diabetic gangrene), 당뇨병성 궤양 (diabetic ulcer), 당뇨병성 합병증, 당뇨병성 설사증(diabetic diarrhea), 당뇨병성 미세혈관병증(diabetic microangiopathy), 당뇨병성 자궁 체 경화증(diabetic uterine body sclerosis), 당뇨병성 심근 경색증 (diabetic cardiomyopathy), 당뇨병성 신경병(diabetic neuropathy), 당뇨병성 신부전(diabetic nephropathy), 당뇨병성 물집(bullosis diabeticorum), 당뇨병성 백내장(diabetic cataract), 당뇨병성 피부 질병(diabetic dermopathy), 당뇨병성 경화부종(diabetic scleredema), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 당뇨병성 리포이드류 괴사증(necrobiosis lipoidica diabeticorum), 및 당뇨병성 혈액 순환 장애(diabetic blood circulation disorder)의 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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