KR20160105112A - 자기장 회전 나노 입자를 이용한 약물의 세포 내 전달 방법 - Google Patents

자기장 회전 나노 입자를 이용한 약물의 세포 내 전달 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 등 고분자 약물을 자성을 띤 나노 입자에 부착한 후 자장의 회전을 이용하여 세포내로 전달하는 방법에 관한 것이다.

Description

자기장 회전 나노 입자를 이용한 약물의 세포 내 전달 방법{Method of delivering therapeutic agents into cells with magnetic circulating-nano particles}
본 발명은 임의의 고분자 약물을 세포 내에 전달하는 방법에 관한 것으로 더욱 상세하게는 자기장을 띄는 코어를 가진 나노 입자의 껍질에 고분자 약물을 결합시킨 후 자기장의 회전 또는 진동을 이용하여 세포 내로 용이하게 전달하는 방법에 관한 것이다.
세포막은 반투과성 지질의 이중막으로서 세포내 구성요소(intracellular components)와 세포 외부 환경 (extracellular environment) 사이의 물리적 장벽으로 작용한다. 세포막은 선택적 투과성을 가지며, 특정 물질에 대해 세포내로 들어가게 할 것인가 아니면 세포 밖으로 나가게 할 것인가를 조절한다. 작은 분자이거나 지용성 물질, 즉 소수성이면서 비극성인 물질은 빠르게 지질의 이중막을 통과하여 세포내로 확산되지만, 대전된 분자, 즉 이온은 세포막의 통과가 어렵다. 특히, 신약개발에 있어서 관심 대상이 되는 펩타이드, 단백질, DNA, RNA, 등 분자량이 큰 약물들은 세포내로 전달되기 더욱 어렵다. 이는 결국 이들을 치료목적으로 사용하기 어렵게 제한하는 요소가 된다.
고분자 약물을 세포내로 전달하는 방법은 특정 기능을 가진 단백질, 펩타이드 또는 고분자 화학물질들을 의약학적으로 활용 할 수 있는 가능성을 높여줄 수 있다. 최근 여러 개의 단백질을 이용하여 유도만능 줄기세포를 제조하는 기술이 보고된 바 있다(Kim 등, Cell Stem Cell. 2009. 4: 472-476). 이러한 기술을 이용하여 환자 치료용 줄기세포를 제조하기 위하여는 단백질의 효율적인 세포내 전달 방법을 필요로 한다. 이외에도 고분자 약물들을 세포내로 잘 전달하는 새로운 방법은 항암제와 같은 난치성 질병의 치료제 개발에도 활용될 수 있으며, 고분자 단백질의 세포 내부 또는 조직 내부로의 전달 방법은 주름 개선 화장품 개발에도 활용될 수 있다. 따라서 고분자 약물을 세포 내로 전달하는 기술은 의료적, 학술적 측면에서 중요하다.
고분자 약물의 세포내 전달을 위해 종래에 개발된 방법들로는 PEG를 붙이거나 또는 리포솜을 이용하는 방법 (Pisal 등, 2010, J Pharm Sci. 99: 2557-2575), 세포 침투 펩타이드(cell-penetrating peptide)를 이용하는 방법 (김 등, 2014, Scientific Reports 4: 4378, 김 등, 2014, PCT/KR2013/006260), 자기장 나노입자를 이용하는 방법 (Mao 등, 2014, WO2014145573 A1) 등 다양한 방법들이 개발되었다. 그러나 이들 방법들을 이용한 단백질의 세포내 전달 효율은 매우 낮았다. 이에 본 발명자들은 종래보다 자기장 회전 나노입자를 이용해 고분자 약물을 세포 내로 유효하게 전달하는 새로운 방법을 개발하게 되었다.
[문헌 1] 허 등, 한국특허 10-1064353 (2011) [문헌 2] 김 등, PCT/KR2013/006260 (2014) [문헌 3] Mao 등, WO2014145573 A1 (2014)
[문헌 1] Kim 등, Cell Stem Cell. 4: 472-476 (2009) [문헌 2] Pisal 등, J Pharm Sci. 99: 2557-2575 (2010) [문헌 3] 김 등, Scientific Reports 4: 4378 (2014 )
본 발명은 전술한 것과 같은 종래의 고분자 약물 전달 방법의 문제점인 전달 효율을 높이는데 그 목적이 있는 것으로, 나노입자와 단백질의 결합 방법과 자기장 회전 나노 입자를 이용한 고분자 약물의 전달 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 기술은 고분자 약물을 나노 입자와 결합시킨 후 회전하는 자기장을 이용하여 세포에 전달하는 새로운 방법이다. 본 기술에서 사용된 나노입자는 코어와 껍질의 구조로 되어 있고, silica 껍질에 RITC 형광 염색약을 포함하고 있는 형태로 구성되어 있다. 또한 약물과 결합할 수 있도록 나노입자의 표면은 카르복실기로 코팅되었다
본 발명은 나노입자와 단백질이 결합하는 단계, 세포의 배지량을 최소화하여 단백질과 세포의 접촉면적을 확대하는 단계, 로테이션하는 자기장을 주어 나노입자 내부의 FeCoO3가 운동성을 띄어 세포막을 물리적으로 통과하는 단계로 이루어진 것에 특징이 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 고분자 약물을 자성을 띤 나노 입자 표면에 부착시킨 후 회전하는 자기장을 이용하여 약물이 부착된 나노 입자를 매우 높은 효율로 세포내로 전달함으로써 약물의 효율성과 유효성을 증대시키는 이점이 있다.
(b) 본 발명은 고분자 약물의 세포내 직접 전달을 필요로 하는 특정 암표적 항암제의 개발, 환자 맞춤형 유도만능 줄기세포의 제조와 같은 다양한 의약품 또는 세포치료제 개발에 활용될 수 있다.
도 1은 자석의 회전을 이용한 단백질의 세포내 전달 모식도
도 2는 자석의 회전 속도에 따른 GFP 단백질의 세포내 전달 효율
(A) GFP 단독, (B) NP-GFP 단독 (C~F) NP-GFP 0, 200, 400, 600 rpm
나노 입자 표면에 단백질 또는 펩타이드를 부착시킬 경우에는 펩타이드 결합을 만들어 주는 것이 바람직하다. 따라서 입자 표면에 카르복실기 또는 아미노기를 띄고 있는 입자를 사용하는 것이 좋다. DNA나 또는 RNA는 음성 전하를 띄고 있기 때문에 Ca++ , Mg++ 또는 Al+++ 를 갖는 입자를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 표면에 카르복실기를 갖는 나노 입자 표면에 EDC 반응을 이용하여 GFP 단백질을 부착하였다. 인체 피부 세포인 Fibroblast를 키운 배양 접시의 세포 배양액에 단백질 부착 나노 입자를 넣고, 자기장을 아래 방향에서 회전 시키면 단백질 부착 나노 입자가 자기장을 따라 회전하면서 세포막을 뚫고 들어가게 된다. 자기장의 회전 속도에 따라서 나노 입자와 그에 부착된 고분자 약물의 세포내 전달효율이 달라지게 된다. 이 때 자기장의 회전 속도가 너무 크면 세포막에 손상을 줄 수 있으므로 적절한 회전 속도를 사용하여야 한다.
<실시예>
실시예 1: 자성을 띤 나노 입자에 GFP 단백질의 부착
동물세포 내부로 전달되기 어려운 단백질로서 해양생물 유래 단백질인 녹색형광단백질 (GFP)을 사용하였으며, 나노 입자로는 중심부에 iron(III) oxide를 갖고 있어서 자성을 띄는 NEO-STEM™을 구입하여 사용하였다. 나노 입자는 표면에 -COOH기를 갖고 있는 것을 사용하였으며, EDC/NHS를 이용하여 단백질의 아미노기와 공유결합을 만들어 GFP 단백질을 나노 입자 표면에 부착하였다.
실시예 2: 단백질 부착 나노입자의 세포내 전달
위의 방법으로 단백질을 부착시킨 나노 입자를 세포배양 접시에서 배양된 인체 섬유아세포 배양액에 넣었다. 이 때 나노 입자의 전달 효율을 높이기 위하여 배양액을 피펫으로 덜어내어 양을 최소화하였다. 그후 도 1에 나타낸 바와 같이 배양 접시를 마그네틱 교반기 위에 올려 놓고 회전 하면서 나노 입자와 단백질의 세포내 전달 효율을 조사하였다. 도 2는 자기장이 없을 때와 자석을 회전했을 때 각 회전수에 따른 세포내 단백질의 전달 정도를 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 보여주는 것이다. 자석의 회전수가 증가할수록 GFP 단백질의 세포내 전달이 증가하는 것을 알 수 있다. 회전수에 따른 GFP 단백질의 세포내 전달 정도를 공초점 현미경의 488 nm 강도로 표시한 결과는 아래의 표 1과 같다. 하기 표 1은 자기장의 회전에 따른 GFP 단백질의 세포내 전달 효율을 비교한 것이다.
실험조건 GFP only 0 rpm 200 rpm 400 rpm 600 rpm
강도
(488 nm)		 0 27.1 59.5 75.3 295.7
본 발명에서 개발된 고분자 약물의 세포내 전달 방법은 단백질 전달을 이용한 유도 만능 줄기세포의 제조, 세포의 활성 증진이나 세포의 성장 조절을 이용한 의약품, 화장품 등 다양한 제품 개발에 이용될 수 있다.

Claims (4)

  1. 단백질 등 고분자 약물을 자성을 띤 나노 입자에 부착한 후 자장의 회전을 이용하여 세포내로 전달하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 단백질의 세포내 전달을 이용하여 유도 만능 줄기세포(induced plur t stem cell) 를 제조하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 고분자 약물의 세포내 전달을 이용한 항암제 등 난치성 질병 치료 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 고분자 약물의 고효율 전달을 이용한 신규한 화장품으로서의 용도.
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