KR20220141593A - 자성 나노입자를 함유하는 세포-약물 전달용 다공성 마이크로 입자 및 이의 제조방법 - Google Patents

자성 나노입자를 함유하는 세포-약물 전달용 다공성 마이크로 입자 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포-약물을 전달하기 위한 자성 나노입자를 함유하는 다공성 마이크로 입자(microspheres) 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 생분해성 고분자를 이용하여 초상자성 산화철 나노입자(superparamagnetic iron oxide nanoparticles)를 함유한 다공성 마이크로 입자를 제조하여 다공성 부위에 세포를 부착할 수 있을 뿐만 아니라, 다공성 마이크로 입자의 표면에 약물 담지체를 결합하여 단순한 혼합만으로 약물을 로딩할 수 있고, 외부 자기 구동 장치에 의해 세포-약물을 동시에 함유한 다공성 마이크로 입자를 병소 부위에 정확하게 전달함으로써 현재보다 그 치료효과를 크게 높일 수 있고, 세포와 약물이 비침습적으로 국소적 병소 부위로 축적 가능하므로, 이를 효과적으로 관절염을 포함하는 다양한 국소적 염증 질환의 치료 및 조직 재생 유도에 이용할 수 있다.

Description

자성 나노입자를 함유하는 세포-약물 전달용 다공성 마이크로 입자 및 이의 제조방법{Porous microspheres containing magnetic nanoparticles for delivery of a cell and a drug and manufacturing method thereof}
본 발명은 세포-약물을 동시에 전달하기 위한 자성 나노입자를 함유하는 다공성 마이크로 입자(microspheres) 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 생분해성 고분자에 초상자성 산화철 나노입자(superparamagnetic iron oxide nanoparticles)를 혼합하여 다공성 마이크로 입자를 제조하고 그 표면에 약물 담지체를 결합시킴으로써, 외부 자기장에 의해 병소 부위로 정밀하게 이송할 수 있을 뿐 아니라 기공에 세포를 부착하여 배양할 수 있고 동시에 약물을 전달할 수 있으므로, 일관된 치료 효과를 보장할 수 있는 세포-약물 전달체에 관한 것이다.
국내 퇴행성 관절염 환자 수는 2020년 기준 약 700만 명을 넘어설 것으로 전망되고 있다. 건강보험심사평가원의 보고에 의하면, 2019년 연령별 환자 비율은 20대가 0.9%, 30대는 1.6%, 40대는 5.6%, 50대는 21.0%, 60대는 32.9%, 70대가 26.8%, 80세 이상은 11.0%로 나타났다.
현재까지 관절염 치료는 통증의 완화를 유도할 뿐, 기능 개선 및 구조적 질병 진행 억제를 통한 근본적인 골관절염 치료제로 인정받은 제품은 없는 실정이다. 최근 들어, 수술 없이 줄기세포 주사만으로 말기 관절염을 치료하는 방법도 개발되는 등 퇴행성 관절염 치료의 패턴이 바뀌고 있다.
이러한 치료법도 몇 가지 한계점을 가지고 있다. 예를 들어, 자가연골세포 이식 수술의 경우 세포만을 단독적으로 사용하는 치료는 세포의 이식 후에 해당 세포의 생착률 문제와 병변 부위에 고르지 않게 분포되는 등의 단점을 극복하기 위한 접근법이 필요하다. 또한 세포뿐 아니라 약물을 관절염 질환 병소 부위로 정확하고 균일하게 전달함으로써 치료의 효과를 높이는 새로운 패러다임의 치료법이 필요하다.
한편, 외부 자기장 줄기세포 전달 장치(Stem cell navigator®)를 이용할 경우, 자기미세입자의 이동을 조절할 수 있고 병소 부위로 전달할 수 있다. 따라서, 지금까지의 관절염 치료의 문제점을 해결하고 관절염 치료의 효과를 높이기 위해 관절염 부위에 외부 자기장 줄기세포 전달 장치를 통해 정확하게 세포와 약물을 전달하기 위한 다공성 마이크로 입자를 개발할 필요가 있다.
이에 본 발명자들은 초상자성 산화철 나노입자(superparamagnetic iron oxide nanoparticles)를 포함하는 다공성 마이크로 입자(microspheres) 표면에 약물 담지체를 결합함으로써, 시술 전에 세포를 부착한 다공성 마이크로 입자 용액과 약물 용액을 단순히 혼합하는 과정을 통해 다공성 마이크로 입자에 약물을 담지할 수 있으며, 이를 환자에게 시술할 경우 세포와 함께 약물을 담지한 다공성 마이크로 입자를 병소로 전달함으로써 그 치료 효과를 높일 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 자성 나노입자를 포함하는 생분해성 고분자 기반의 세포-약물을 동시에 전달할 수 있는 다공성 마이크로 입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 다음 단계를 포함하는 세포-약물 전달용 다공성 마이크로 입자의 제조방법을 제공하는 것이다:
생분해성 고분자 및 자성 나노입자의 혼합물로 다공성 마이크로 입자를 제조하는 다공성 구조 형성 단계; 및
다공성 마이크로 입자의 표면에 약물 담지체를 도입하는 약물 담지체 도입 단계.
본 발명의 또 다른 목적은 자성 나노입자를 포함하는 생분해성 고분자 기반의 다공성 마이크로 입자를 이용한 세포-약물 전달 용도에 관한 것이다.
본 발명은 자성 나노입자를 함유하는 세포-약물 전달용 다공성 마이크로 입자(microspheres) 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 마이크로 입자는 자기장을 이용하여 정밀하게 이송할 수 있고 세포 및 약물을 동시에 병소에 전달할 수 있다.
본 발명자들은 상기의 목적을 달성하기 위하여 a) 외부 자기장에 의해 이동이 가능하도록 초상자성 산화철 나노입자(superparamagnetic iron oxide nanoparticles)를 함유하고, b) 세포를 부착할 수 있으며, c) 약물을 단순한 혼합만으로 담지할 수 있는 마이크로 입자를 구현하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 자성 나노입자를 포함하는 생분해성 고분자 기반의 세포-약물 전달용 다공성 마이크로 입자이다.
본 발명에 있어서 생분해성 고분자는 폴리락틱엑시드(polylactic acid), 폴리락틱글리콜엑시드(poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리카프로락톤(poly(ε-carprolactone)), 폴리디옥산논(polydioxanone), 폴리하이드록시부틸레이트(poly(β-hydroxybutyrate)) 및 폴리메틸시아노아크릴레이트(poly(methyl 2-cyanoacylate))로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 명세서상의 용어 “폴리락틱엑시드”는 옥수수에서 녹말을 분리하여 포도 당 발효를 통해 젖산을 생산하고 중합하여 제조되는 생분해성 고분자이다. 폴리락틱 엑시드는 생분해성이 우수하며 미생물에 의해 완전히 분해되어 이산화탄소와 물을 형성한다. 가공성이 우수하고 대부분의 합성 플라스틱 용도에 적합하고 의료용 소재로도 널리 활용된다.
본 발명에 있어서 자성 나노입자는 초상자성, 반자성, 상자성 또는 강자성 물질인 것일 수 있고, 예를 들어, 초상자성 산화철 나노입자인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 다공성 마이크로 입자는 표면에 약물 담지체를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
상기 약물 담지체는 아미노-베타-사이클로덱스트린(amino-β-cyclodextrin) 또는 사이클로덱스트린 유도체인 것일 수 있다.
상기 약물 담지체는 정전기적 인력에 의하여 다공성 마이크로 입자 표면에 도입되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 다음 단계를 포함하는 세포-약물 전달용 다공성 마이크로 입자 제조방법이다:
생분해성 고분자 및 자성 나노입자의 혼합물로 다공성 마이크로 입자를 제조하는 다공성 구조 형성 단계; 및
다공성 마이크로 입자의 표면에 약물 담지체를 도입하는 약물 담지체 도입 단계.
본 발명에 있어서 생분해성 고분자는 폴리락틱엑시드, 폴리락틱글리콜엑시드, 폴리카프로락톤, 폴리디옥산논, 폴리하이드록시부틸레이트 및 폴리메틸시아노아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법에 따라 제조된 다공성 마이크로 입자는 구조적으로 자성 나노입자가 분포되어 내재된 형태로 구현되었다.
본 발명에 있어서 다공성 구조 형성 단계는 기포발포법의 사용 또는 친수성 고분자의 첨가를 통해 다공성 마이크로 입자에 기공을 형성하여 수행되는 것일 수 있다.
상기 기포발포법은 생분해성 고분자 및 자성 나노입자의 혼합물에 대한 소듐바이카보네이트(sodium bicarbonate)의 첨가를 통해 수행되는 것일 수 있다.
상기 친수성 고분자는 젤라틴(geltain), 히알우로산(hyaluronic acid), 알부민(albumin), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 플루란(pullulan), 알지네이트(alginate) 및 키토산(chitosan)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 세포-약물 전달용 다공성 마이크로 입자 제조방법은 다공성 마이크로 입자에 형성된 기공에 세포를 배양하는 세포 배양 단계를 추가적으로 포함하는 것일 수 있고, 예를 들어, 상기 세포는 줄기세포인 것일 수 있다.
상기 약물 담지체는 아미노-베타-사이클로덱스트린 또는 사이클로덱스트린 유도체인 것일 수 있다.
상기 약물 담지체는 정전기적 인력에 의하여 다공성 마이크로 입자 표면에 도입되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 다공성 마이크로 입자와 목표 약물을 단순히 혼합하는 공정만으로도 다공성 마이크로 입자 표면에 도입된 약물 담지체에 약물을 로딩할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 약물 담지체로 아미노-베타-사이클로덱스트린이 도입된 다공성 마이크로 입자는 분산액 내에서 목표 약물인 메소트렉세이트(methotrexate)를 첨가하여 혼합하는 간단한 방법을 통하여 관절염 약물을 담지하여 의료기기 조성물로 사용 가능한 다공성 마이크로 입자로서 준비되었다.
본 발명의 세포-약물 전달용 다공성 마이크로 입자를 질환의 치료 및 국소 조직 재생 용도로 사용하게 되는 경우, 예를 들어, 목표 약물은 관절염을 포함하는 다양한 국소적 질환에 적용할 수 있고 비침습적인 치료 방법에 사용됨에 있어서 외부 자기 구동 장치를 이용해 병소 부위로 세포와 약물을 정확하게 전달할 수 있다. 특히 다공성 마이크로 입자에는 약물을 담지할 수 있을 뿐만 아니라 세포를 부착 및 배양할 수 있어 관절염의 치료효과를 극대화시킬 수 있다.
본 발명은 세포-약물을 전달하기 위한 자성 나노입자를 함유하는 다공성 마이크로 입자(microspheres) 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 생분해성 고분자를 이용하여 초상자성 산화철 나노입자(superparamagnetic iron oxide nanoparticles)를 함유한 다공성 마이크로 입자를 제조하여 다공성 부위에 세포를 부착할 수 있을 뿐만 아니라, 다공성 마이크로 입자의 표면에 약물 담지체를 결합하여 단순한 혼합만으로 약물을 로딩할 수 있고, 외부 자기 구동 장치에 의해 세포-약물을 동시에 함유한 다공성 마이크로 입자를 병소 부위에 정확하게 전달함으로써 현재보다 그 치료효과를 크게 높일 수 있고, 세포와 약물이 비침습적으로 국소적 병소 부위로 축적 가능하므로, 이를 효과적으로 관절염을 포함하는 다양한 국소적 염증 질환의 치료 및 조직 재생 유도에 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 초상자성 산화철 나노입자(superparamagnetic iron oxide nanoparticles)를 함유한 폴리락틱엑시드(polylactic acid) 다공성 마이크로 입자(microspheres)의 전계 방사형 주사전자현미경(Field emission scanning electromicroscope; FE-SEM) 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 초상자성 산화철 나노입자를 함유한 다공성 마이크로 입자 용액(좌, OFF)과 영구자석에 끌려온 일부(우, ON)를 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 초상자성 산화철 나노입자를 함유한 폴리락틱엑시드 다공성 마이크로 입자의 표면에서 약물 담지체의 결합 전후 제타 포텐셜(zeta potential)을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포-약물 동시 전달을 위한 다공성 마이크로 입자의 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 세포-약물 동시 전달을 위한 다공성 마이크로 입자로부터 약물인 메소트렉세이트의 방출 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1: 초상자성 산화철 나노입자를 함유한 다공성 마이크로 입자의 제조
폴리락틱엑시드(polylactic acid, Sigma-aldrich Co., USA)를 디클로로메탄(dichloromethane)에 6.25%(w/v)으로 용해한 용액 4 mL에 80 mg의 초상자성 산화철 나노입자(superparamagnetic iron oxide nanoparticles, Sigma-aldrich Co., USA)를 첨가한 후 볼텍스(vortex) 믹서로 충분하게 혼합하였다. 소듐바이카보네이트(sodium bicarbonate, Sigma-aldrich Co., USA)를 물에 용해하여 위의 용액에 5%(v/v)가 되도록 첨가한 후 호모게나이저(homogenizer)로 11,000 rpm으로 3분간 혼합하였다. 제조한 용액을 0.1%(w/v) 폴리비닐알코올(poly vinylalcohol) 용액에 떨어뜨리고 4시간 동안 교반하였다. 마지막으로 다공성 구조를 형성하기 위해 0.2 M 소듐하이드록사이드(sodium hydroxide, Sigma-aldrich Co., USA)에 30분 동안 담근 후 물로 세척하고 동결건조하여 샘플을 얻었다.
실시예 2: 다공성 마이크로 입자의 형태 분석
제조된 초상자성 산화철 나노입자를 함유한 다공성 마이크로 입자의 형태를 관찰하기 위해 전계 방사형 주사전자현미경(Field emission scanning electromicroscope; FE-SEM)을 이용하여 분석하였다.
도 1에서 확인할 수 있듯이, 다공성 마이크로 입자는 약 250~300 μm이고, 다공성 구조의 형태를 보이며, 다공성 마이크로 입자 내의 소듐 바이카보네이트가 잘 제거되어 다공성 구조가 형성되었음을 알 수 있었다. 제조된 다공성 마이크로 입자의 크기 및 형태는 폴리비닐알콜과 폴리락틱엑시드의 비율을 조정하여 수십 나노미터 내지 수십 마이크로미터 크기 범위까지 다양하게 조절할 수 있다. 다공성 구조를 이루는 기공의 크기는 소듐 바이카보네이트의 양과 소듐하이드록사이드 용액에 담그는 시간에 따라 조절될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다공성 마이크로 입자를 이용하여, 다공성 영역에 약물을 결합시키고 줄기세포를 함유시킬 수 있는 가능성을 입증하였다.
실시예 3: 다공성 마이크로 입자의 자기 특성 평가
실시예의 다공성 마이크로 입자의 자성 특성을 확인하기 위해, 다공성 마이크로 입자를 PBS(phosphate buffer saline) 용액 내에 분산시킨 후, 외부의 영구자석에 대한 반응성을 육안으로 확인하였다.
도 2에서 확인할 수 있듯이, 자기장을 가하기 전(좌, OFF)에는 다공성 마이크로 입자가 PBS 용액 내에서 분산된 상태로 유지되어 있지만, 반대로 자기장이 가해지면(우, ON) 자기장이 있는 부분을 따라 반응하여 영구 자석 쪽으로 이동하는 것을 확인하였다.
상기와 같은 결과는 초상자성 산화철 나노입자를 함유한 다공성 마이크로 입자가 외부의 자기장에 반응할 수 있음을 뒷받침하는 것으로, 비침습적으로 상기 다공성 마이크로 입자의 이동을 조절할 수 있고 또한 병소 부위로 선택적으로 전달할 수 있으므로 치료 효과를 높일 수 있음을 예상할 수 있다.
실시예 4: 다공성 마이크로 입자에 도입된 약물 담지체의 특성 평가
초상자성 산화철 나노입자를 함유한 다공성 마이크로 입자에 아미노-베타-사이클로덱스트린(amino-β-cyclodextrin)을 정전기적 인력에 의해 표면에 결합시킨 후, 제타 포텐셜(zeta potential) 값의 변화를 측정하였다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, 다공성 마이크로 입자는 -30.9 mV로 음의 전하(negative charge)를 띄었고, 아미노-베타-사이클로덱스트린(@β-CD)을 함유한 다공성 마이크로 입자는 +6.9 mV로 측정되었다. 상대적으로 양의 전하(positive charge) 값을 나타내는 상기와 같은 결과는 다공성 마이크로 입자 표면에 아미노-베타-사이클로덱스트린이 정전기적 인력으로 상호작용함을 의미한다.
제조한 다공성 마이크로 입자를 PBS 용액에 분산시킨 후, 아미노-베타-사이클로덱스트린을 분산액에 첨가하고, 정전기적 인력을 이용하여 다공성 마이크로 입자 표면에 결합시켰다. 그 후, 원심분리 및 세척과정을 거쳐 모델 약물인 메소트렉세이트(methotrexate, Sigma-aldrich Co., USA) 40 μg/200 μL를 상기 분산액에 단순 혼합하여 관절염 약물 세포 동시 치료용 마이크로 입자 의료기기 조성물을 도 4와 같이 제조하였다.
실시예 5: 다공성 마이크로 입자에 도입된 약물 담지체의 특성 평가
메소트렉세이트 2 mg을 초상자성 산화철 나노입자를 함유한 아미노-베타사이클로덱스트린-다공성 마이크로 입자 용액에 첨가한 후 2시간 동안 교반하여 로딩하였다. 이후 결합되지 않은 메소트렉세이트를 제거하기 위해 원심분리하고 세척하였다. 메소트렉세이트가 로딩된 다공성 마이크로 입자를 pH 5.5, 6.5 및 7.4의 PBS 용액에 분산하고 37℃에서 12시간 동안 방출을 시행하였고, 방출된 메소트렉세이트의 방출량은 345 nm에서 UV 분광광도계로 측정하여 계산하였다.
도 5에서 확인할 수 있듯이, pH 값이 산성화될수록 약물의 방출속도가 증가하는 경향을 보였다. 따라서, 정상조직에서의 약물의 방출량보다 pH가 약산성인 암 병소에서의 약물의 방출량이 많을 것으로 예상된다. 폴리락틱엑시드는 산성조건에서 가수분해 속도가 빨라지기 때문에 약물의 방출 속도가 증가한다.

Claims (15)

  1. 자성 나노입자를 포함하는 생분해성 고분자 기반의 세포-약물 전달용 다공성 마이크로 입자(microspheres).
  2. 제1항에 있어서, 생분해성 고분자는 폴리락틱엑시드(polylactic acid), 폴리락틱글리콜엑시드(poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리카프로락톤(poly(ε-carprolactone)), 폴리디옥산논(polydioxanone), 폴리하이드록시부틸레이트(poly(β-hydroxybutyrate)) 및 폴리메틸시아노아크릴레이트(poly(methyl 2-cyanoacylate))로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 다공성 마이크로 입자.
  3. 제1항에 있어서, 자성 나노입자는 초상자성, 반자성, 상자성 또는 강자성 물질인 것인, 다공성 마이크로 입자.
  4. 제1항에 있어서, 다공성 마이크로 입자는 표면에 약물 담지체를 추가적으로 포함하는 것인, 다공성 마이크로 입자.
  5. 제4항에 있어서, 약물 담지체는 아미노-베타-사이클로덱스트린(amino-β-cyclodextrin) 또는 사이클로덱스트린 유도체인 것인, 다공성 마이크로 입자.
  6. 제4항에 있어서, 약물 담지체는 정전기적 인력에 의하여 다공성 마이크로 입자 표면에 도입되는 것인, 다공성 마이크로 입자.
  7. 다음 단계를 포함하는 세포-약물 전달용 다공성 마이크로 입자(microspheres) 제조방법:
    생분해성 고분자 및 자성 나노입자의 혼합물로 다공성 마이크로 입자를 제조하는 다공성 구조 형성 단계; 및
    다공성 마이크로 입자의 표면에 약물 담지체를 도입하는 약물 담지체 도입 단계.
  8. 제7항에 있어서, 생분해성 고분자는 폴리락틱엑시드(polylactic acid), 폴리락틱글리콜엑시드(poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리카프로락톤(poly(ε-carprolactone)), 폴리디옥산논(polydioxanone), 폴리하이드록시부틸레이트(poly(β-hydroxybutyrate)) 및 폴리메틸시아노아크릴레이트(poly(methyl 2-cyanoacylate))로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 다공성 마이크로 입자 제조방법.
  9. 제7항에 있어서, 다공성 구조 형성 단계는 기포발포법의 사용 또는 친수성 고분자의 첨가를 통해 다공성 마이크로 입자에 기공을 형성하여 수행되는 것인, 다공성 마이크로 입자 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 기포발포법은 생분해성 고분자 및 자성 나노입자의 혼합물에 대한 소듐바이카보네이트(sodium bicarbonate)의 첨가를 통해 수행되는 것인, 다공성 마이크로 입자 제조방법.
  11. 제9항에 있어서, 친수성 고분자는 젤라틴(geltain), 히알우로산(hyaluronic acid), 알부민(albumin), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 플루란(pullulan), 알지네이트(alginate) 및 키토산(chitosan)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 다공성 마이크로 입자 제조방법.
  12. 제7항에 있어서, 다공성 마이크로 입자 제조방법은 다공성 마이크로 입자에 형성된 기공에 세포를 배양하는 세포 배양 단계를 추가적으로 포함하는 것인, 다공성 마이크로 입자 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 세포는 줄기세포인 것인, 다공성 마이크로 입자 제조방법.
  14. 제7항에 있어서, 약물 담지체는 아미노-베타-사이클로덱스트린(amino-β-cyclodextrin) 또는 사이클로덱스트린 유도체인 것인, 다공성 마이크로 입자 제조방법.
  15. 제7항에 있어서, 약물 담지체는 정전기적 인력에 의하여 다공성 마이크로 입자 표면에 도입되는 것인, 다공성 마이크로 입자 제조방법.
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